Centaurea Cyanus L.’N in Sekonder Metabol Itler Inin Ara Ştirilmasi

T.C. EGE ÜN İVERS İTES İ SA ĞLIK B İLİMLER İ ENST İTÜSÜ

CENTAUREA CYANUS L.’N İN SEKONDER METABOL İTLER İNİN ARA ŞTIRILMASI

Farmasötik Botanik Anabilim Dalı Programı

Yüksek Lisans Tezi

Eczacı Gökçen TAN

Danı şman Doç. Dr. Canan KARAALP

İZM İR 2010

ÖNSÖZ

Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Botanik Anabilim Dalı

Ba kanı Sayın Prof. Dr. Ulvi Zeybek’e te ekkür ediyorum.

Bu yüksek lisans tez çalı masında de erli katkıları, ilgisi ve deste inden dolayı tez danı manım Doç.Dr. Canan Karaalp’e, çalı malarım sırasında yakın ilgi ve yardımlarıyla her zaman yanımda olan Ar . Gör. Dr. üra Baykan Erel ve Ar . Gör.

Serdar Demir’e sonsuz te ekkürler.

NMR spektrumlarının yorumlanması sırasında bana de erli vaktini ayıran Prof.

Dr. Erdal Bedir’e te ekkürü bir borç bilirim.

UPSK çalı malarındaki de erli katkıları için Ar . Gör. smail Akgün’e de sonsuz te ekkürler.

Anabilim dalındaki tüm ö retim üyesi hocalarıma ilgilerinden dolayı ayrıca te ekkürler.

Hayatım boyunca bana her zaman destek olan de erli aileme te ekkür ederim.

Bu çalı ma, TÜB TAK SBAG 106S197 no’lu proje kapsamında yürütülmü ve

Ege Üniversitesi 09/ECZ/004 no’lu proje ile desteklenmi tir. Adı geçen kurumlara katkılarından dolayı te ekkür ederim.

İzmir 2010 Ecz. Gökçen TAN

İÇİNDEK İLER ÖNSÖZ ...... I ÇNDEK LER ...... II TABLOLAR D ZN ...... III EK LLER D ZN ...... III RES MLER D ZN ...... III BÖLÜM I ...... 1 GR ve AMAÇ ...... 1 1 GENEL B LG LER ...... 3 1.1 Taksonomik Genel Bilgiler ...... 3 1.1.1 Asteraceae Familyası ...... 3 1.1.2 Centaurea L. Cinsi ...... 3 1.1.3 Centaurea cyanus L...... 3 1.2 Centaurea L. Cinsinin Genel Kimyasal Özellikleri ...... 5 1.3 Centaurea L.Taksonlarının Halk Arasında Tıbbi Amaçla Kullanımları ...... 5 1.4 Centaurea L. Taksonları Üzerinde Yapılan Biyoaktivite Çalı maları ...... 7 BÖLÜM II ...... 8 2 GEREÇ VE YÖNTEM ...... 8 2.1 Kullanılan Gereçler ...... 8 2.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler ...... 9 2.3 Kullanılan Yöntemler ...... 10 2.3.1 Bitkisel Materyal ...... 10 2.3.1.1 Centaurea cyanus L...... 10 2.3.2 Fitokimyasal Çalı malar ...... 11 2.3.3 Kromatografik Yöntemler ...... 11 2.3.3.1 nce tabaka kromatografisi ( TK) ...... 11 2.3.3.2 Vakum sıvı kromatografisi (VSK) ...... 12 2.3.3.3 Silika jel kolon kromatografisi ...... 13 2.3.3.4 Jel filtrasyon (Sephadex) kolon kromatografisi ...... 14 2.3.3.5 Ultra performans sıvı kromatografisi (UPSK) ...... 14 2.3.4 Spektroskopik Yöntemler ...... 15 2.4 C. cyanus üzerinde yapılan ekstraksiyon çalı maları ...... 15 2.5 C. cyanus üzerinde yapılan fraksiyonlama ve izolasyon çalı maları ...... 15 BÖLÜM III ...... 20 3 BULGULAR ...... 20 3.1 C. cyanus ’tan zole Edilen Bile ikler ...... 20 3.1.1 zoramnetin-7-O--D-glukopiranozit ...... 20 3.1.2 Apiin ...... 24 3.2 C. cyanus ’ta TK ile Tesbiti Yapılan Bile ikler ...... 28 3.2.1 Siringin ...... 28 3.2.2 Klorojenik asit ...... 29 3.2.3 Apigenin ...... 30 3.3 UPSK sonuçları ...... 31 BÖLÜM IV ...... 36 TARTI MA ve SONUÇ ...... 36 ÖZET ...... 40 ABSTRACT ...... 41 KAYNAKLAR ...... 42 ÖZGEÇM ...... 51

TABLOLAR D İZİNİ Tablo 1. C. cyanus üzerinde yapılan AKK ve TK çalı malarında kullanılan çözgen sistemleri ...... 16 Tablo 2. C. cyanus ’tan elde edilen ana fraksiyonların (CC) miktarları ...... 17 Tablo 3. zoramnetin-7-O-β-D-glukopiranozit’in 1H ve 13 C-NMR spektral de erleri (DMSO-d6) ...... 23 1 13 Tablo 4. Apiin’in H ve C NMR spektral de erleri (DMSO-d6)...... 26

ŞEK İLLER D İZİNİ ekil 1. zoramnetin-7-O-β−D-glukopiranozit 1H NMR spektrumu ...... 21 ekil 2. zoramnetin-7-Ο-β− D-glukopiranozit 13 C NMR spektrumu ...... 22 ekil 3. Apiin 1H NMR spektrumu ...... 25 ekil 4. Apiin 13 C NMR spektrumu ...... 26 ekil 5. C. cyanus BuOH ekstresi UPSK kromatogramı (285 nm) ...... 32 ekil 6. C. cyanus BuOH ekstresi’nde tesbiti yapılan bile iklerin UV spektrumu .... 33 ekil 7. C. cyanus MeOH ekstresi UPSK kromatogramı (285 nm) ...... 34 ekil 8. C. cyanus MeOH ekstresi’nde tesbiti yapılan bile iklerin UV spektrumları 35

RES İMLER D İZİNİ Resim 1. Centaurea cyanus L...... 10 Resim 2. CC 14-15 / 75-79 no’lu fraksiyonda siringin ...... 28 Resim 3. CC14-15 / 96-108 / 247-314 no’lu fraksiyonda klorojenik asit ...... 29 Resim 4. CC 56 no’lu fraksiyonda apigenin (1: vanilin-sülfirik asit reaktifi ile 2: reaktif uygulandıktan sonra 366 nm’de) ...... 30

III

BÖLÜM I GİRİŞ ve AMAÇ

Asteraceae familyasının Cardueae tribusunda yer alan Centaurea L. cinsi dünyada yakla ık 500 tür ile temsil edilmektedir. Asya, Avrupa, Kuzey Afrika ve

Amerika’da yayılı gösteren bu türlerin büyük bir ço unlu u Batı Asya ve Akdeniz

Bölgesi’nde yo unla mı tır (20, 23). Centaurea L. Türkiye florasında %61.1’i endemik olmak üzere 192 taksonla temsil edilmekte ve özellikle Batı, Güneybatı ve

Orta Anadolu’da do al yayılı göstermektedir (9, 22, 65, 66). Tür sayısının ve endemizm oranının yüksek olması, Anadolu’nun Centaurea cinsi için gen merkezi olabilece ini dü ündürmektedir.

Centaurea türleri, ülkemizde halk arasında peygamber çiçe i, zerdali dikeni,

çoban kaldıran, timur dikeni gibi isimlerle bilinmekte ve çok uzun yıllardır midevi, gö üs yumu atıcı, ate dü ürücü, ishal kesici, adet getirici ve i tah açıcı olarak kullanılmaktadır (4, 8). Bazı türlerin sıtmada, hemoroit, abse ve yara tedavisinde kullanıldı ı da kayıtlıdır (31, 52, 55). Dünyada da çe itli Centaurea türleri geleneksel halk tıbbında çok de iik amaçlarla kullanım bulmaktadır (4, 32).

Yapılan çe itli ara tırmalarla, Centaurea türlerinin antimikrobiyal (13, 33, 50,

64), antioksidan (34, 58, 61, 62), antienflamatuvar (33, 48), antiülserojenik (68), sitotoksik (39) ve antiprotozoal (33, 45) aktivite gösterdi i saptanmı tır.

triterpenler (49), monoterpenler (37), ditiyofenler (63), steroidal glikozitler (51) ve antosiyaninler de (60) izole edilmi tir.

Çalı mamız, ülkemizin tıbbi bitkilerinden olan C. cyanus ’un sekonder metabolitlerinin kromatografik ve spektroskopik yöntemler kullanılarak belirlenmesi amacıyla yürütülmü tür.

1 GENEL B İLG İLER

1.1 Taksonomik Genel Bilgiler

1.1.1 Asteraceae Familyası

Asteraceae familyası çok karakteristik özellikleri ile kolayca ayırt edilebilen,

dünya üzerinde hemen her yerde rastlanabilen, yaklaık 1100 cins ve 2500 kadar türe

sahip geni bir familya olup, Angiosperm alt bölümünün yakla ık %10’unu

olu turmaktadır. Asteraceae familyası, Türkiye florasında 133 cinsle temsil edilen 2.

büyük familyadır. Tür sayısı açısından ise 1156 türle 1. sırada yer alır ve bunların

yakla ık %38’i endemiktir (53).

Asteraceae familyası, 2 alt familyaya [ Asteraceae (Tubuliflorae ),

Cichoriaceae (Liguliflorae )] ve 11 tribusa ayrılmaktadır (21). Bu tribuslar aaıda

belirtilmektedir:

1. Heliantheae 7. Anthemideae

2. Inulae 8. Arctoteae

3. Astereae 9. Cardueae

4. Senecioneae 10. Mutisieae

5. Calenduleae 11. Lactuceae

6. Eupatorieae

1.1.2 Centaurea L. Cinsi

Asteraceae familyasının Cardueae tribusunda yer alan Centaurea L. cinsi, Türkiye florasında %61.1’i endemik olmak üzere 192 taksonla temsil edilmekte ve özellikle Batı,

Güneybatı ve Orta Anadolu’da do al yayılı göstermektedir (9, 22, 64, 66). Tür sayısının ve

endemizm oranının yüksek olması Anadolu’nun Centaurea için gen merkezi olabilece ini dü ündürmektedir.

Centaurea L. cinsinin sistematik durumu a aıda belirtilmi tir:

Bölüm: Spermatophyta

Altbölüm: Angiospermae

Sınıf: Dicotyledonae

Altsınıf: Asteridae

Takım: Asterales

Aile: Asteraceae (Compositae)

Tribus: Cardueae

Genus: Centaurea L.

Türkiye florasında kayıtlı olan Centaurea türleri 34 seksiyonda toplanmı tır (66)

Cyanus seksiyonunda a aıdaki türler bulunmaktadır:

C. cherianthifolia C. germanicopolitana

C. bourgaei C. woronowii

C. reuterana C. thirkei

C. pichleri C. depressa

C. lanigera C. pinardii

C. nigrifimbria C. cyanus

C. triumfettii C. tchihatcheffii

C. mathiolifolia

Yapılardaki çe itlilik ve de ikenliklerden dolayı Centaurea L., taksonomik olarak tanımlanması ve sınıflandırılması çok zor, modern kimyasal ve sitolojik teknikler kullanılarak ileri ara tırmalar yapılması gereken bir cinstir. Centaurea L. cinsini olu turan türler, tek, iki veya çok yıllık otsular, nadiren dikenli dalları olan çalılar veya herdem ye il yapraklı, daha büyük yarı çalılardır.

Centaurea türlerinin taksonomisi ve tanımlanması için di er karakterlerle birlikte ele alındı ında en önemli özellik, involukrum braktelerinin uç kısımlarında bulunan ek yapıların

eklidir. Bununla birlikte bu özellik, popülasyonda, bireylerde, hatta aynı kapitulumda, büyük de ikenlikler göstermektedir (66).

Tür sayısının fazlalı ı, sınıflandırmadaki zorluklar, halk arasındaki yaygın kullanımı ve zengin kimyasal içeri i nedeniyle Centaurea cinsi giderek önem kazanmı ve son yıllarda taksonomik, kimyasal ve biyolojik aktivite açısından oldukça fazla ara tırmaya kaynak olu turmu tur.

1.1.3 Centaurea cyanus L.

C. cyanus , 15-60(-80) cm boyunda, bazen tabandan dallanmı yapıya sahip, tek yıllık bir bitkidir. Yapraklar seyrek olarak tüylü, altta tüysüzdür. Alt yapraklar lirat ve lanseolat, orta ve

üst yapraklar linear-lanseolattan linear-filiforma kadar de iebilen ekillerdedir. Orta yapraklar her iki tarafında genellikle 1-2(-3) uzun, sivri di li olup, üsttekiler tamdır.

nvolukrum 10-16x5-10 mm uzunlu unda, oblong ve huni eklindedir. nvolukrum braktelerinde, kahverengi veya siyahımsı kenarlı, 0.5-1 mm di li ek yapılar bulunmaktadır.

Çiçekler mavi renkte olup, kenarlar kuvvetlice ı ınsal olarak yayılmı , merkezde belirgin yay

eklinde kıvrılmı anter tüpleri bulunmaktadır. Akenler 3-4 mm; papuslar (1.5)2-3(-3.5) mm uzunlu undadır. Çiçeklenme dönemi 4 ve 6. aylar olan bitki, çam ormanları, ta lı yamaçlar, tarla ve yol kenarlarında deniz seviyesinden 1500 m’ye kadar yayılı göstermektedir (66). 3

Kuzeybatı, Batı ve Güneybatı Anadolu ile adalarda yayılı gösterir. A1 (E) Edirne:

Kapıkule, 50 m, Tekirda : Çorlu ve Simen arası, 50 m, A1(A) Çanakkale: Dardanel, A2(E)

stanbul: Belgrad Ormanı, A2(A) stanbul: Bozhane ve Hüseyinli arası, Kocaeli: Gebze,

Cumaköyü, Bursa: So ukpınar’dan Bursa yönüne do ru 2 km, 950 m, B1 Çanakkale:

Edremit’ten Çanakkale yönüne do ru 54 km, 420 m, Balıkesir: Kaz Da ları, Beypınar’dan

Zeytinlik yönüne do ru 15 km, 500 m, zmir: Yamanlar Da ı, Karagöl, B2 Uak: Ya amı lar

Köyü, 1200 m, C1 zmir: zmir’den Ku adası’na, Aydın: Samsun Da ı, Mu la: Marmaris,

300 m, C1/2 Mu la: Marmaris’den Datça’ya, Is: Midilli, Kapı, 400 m, Samos, Nisiros 300 m.

Kuzey ılıman bölgelerde (nadiren Güney Yarımküre’de) yaygın bir ekilde mısır tarlalarında ot olarak yaygındır. Anadolu’da do al yayılı gösteren bitkiler, di er bölgelerdekilere göre daha küçük involukrumlara sahiptir. Bu durum kısmen çevresel

artlardan kaynaklanmakta ve süregelen varyasyonlar ayrı alttürlerin ayrımını gerektirmemektedir (66).

1.2 Centaurea L. Cinsinin Genel Kimyasal Özellikleri

Centaurea türleri ile yapılan fitokimyasal çalı malarda elde edilen ana bile ik grupları farklı türlerde seskiterpenler (10, 11, 12, 15, 35, 36), flavonoitler (3, 32), lignanlar (47, 57) ve bunların glikozitleridir. Bununla birlikte indol alkaloidleri (52), triterpenler (49), monoterpenler (37), ditiyofenler (63), steroidal glikozitler (51) ve antosiyaninler (60) izole edilmi tir.

Seskiterpenler, bugüne kadar yayınlanan pek çok makale ile Centaurea türlerinin karakteristik bile ik grupları olarak ortaya çıkmaktadır (10, 25). Bu çalı maların bir kısmı,

Türkiye’de yayılı gösteren Centaurea türleri üzerinde yapılmı tır (5, 20, 35, 36).

Flavonoitler, Centaurea türlerinden izole edilen sekonder bile iklerin önemli bir kısmını olu turmaktadırlar. Bugüne kadar 80’in üzerinde Centaurea türü flavonoitleri açısından ara tırılmı tır. Ço unlukla yaprak ve çiçeklerden bazı çalı malarda ise köklerinden, flavon ve flavonoller ile bunların metil sübstitüe türevleri ve O ve C-glikozitleri elde edilmi tir (3).

C. cyanus ile ilgili yapılan fitokimyasal çalı malarla bitkinin antosiyaninler, flavonoitler, flavonoit glikozitleri, seskiterpen bile ikleri ve indol alkoloitleri izole edilmi tir

(52).

C. cyanus topraküstü kısımlarından mikrodistilasyonla elde edilen uçucu ya ının GC ve

GC/MS analizi ile ana bile iklerinin karvakrol (%25.5), hekzadekanoik asit (%6.4) ve karyofillen oksit (%2.8) oldu u saptanmı tır (37).

1.3 Centaurea L.Taksonlarının Halk Arasında Tıbbi Amaçla Kullanımları

Ülkemizde yayılı gösteren Centaurea cinsine ait birçok taksonun, geleneksel olarak

çe itli rahatsızlıkların tedavisinde kullanıldı ı kayıtlıdır. Batı ve Güneybatı Anadolu’da

yaygın olan C. cyanus ’un kurutulmu çiçekleri, halk arasında %5’lik infüzyonları halinde ishal kesici, kuvvet verici, i tah açıcı ve gö üs yumu atıcı olarak kullanılmaktadır. Do u

Anadolu’da yeti en C. behen , ak behmen ve zerdali dikeni olarak bilinmekte ve çiçekleri midevi ve adet getirici olarak kullanılmaktadır. Kuzeybatı Anadolu’da yeti en ve

çobankaldıran, timur dikeni olarak bilinen C. calcitrapa ’nın %2-6’lık infüzyonları, dahilen ate dü ürücü olarak, Kuzeydo u Anadolu’da yayılı gösteren ve çayır peygamberi ismiyle bilinen C. jacea ate dü ürücü, adet getirici, kabız yapıcı ve i tah açıcı olarak kullanılmaktadır

(8).

Batı Anadolu’da, yayılı gösteren C. drabifolia ’nın (basurotu) yaprak ve çiçeklerinin, hemoroit tedavisinde kurutulup sigara eklinde sarılarak veya çay olarak tüketildi i belirtilmi tir. Yine aynı yörede sıtma otu, güllüdiken, zerdali dikeni olarak bilinen C. solstitialis subsp. solstitialis çiçekleri, sıtmada ve so uk algınlı ında çay olarak tüketilmektedir. Aynı bitki Kütahya yöresinde çakırdikeni ismi ile bilinmekte ve yine sıtma hastalı ında kullanılmaktadır (31). Bir ba ka çalı mada yine C. solstitialis subsp. solstitialis ’in Samsun, Vezirköprü, Karaköy’de çocukların uçuk yaralarının tedavisi için kullanıldı ı belirtilmi tir (27). Kars yöresinde C. balsamita (kılıçotu) yapraklarının haricen abse tedavisinde, Erzurum ve Erzincan yörelerinde ise C. iberica (çakırdikeni) ve C. pterocaula (çoru bozan) yapraklarının havanda dövülerek haricen yara tedavisinde kullanıldı ı saptanmı tır (54). C. pulchella Ni de’de bo adikeni olarak bilinmekte ve abse tedavisinde kullanılmaktadır (55).

Centaurea türleri dünyada halk arasında yıllardır tek ba ına veya di er bitkilerle kombinasyon halinde antidiyabetik, antidiyareik, antiromatizmal, antienflamatuvar, kolagog, koleretik, midevi, stoma ik, diüretik, adet söktürücü, astrenjan, hipotansif, antipiretik ve antibakteriyel amaçlarla kullanılmaktadır (4).

C. cyanus ’un kurutulmu çiçekleri Avrupa geleneksel tıbbında oküler enflamasyon tedavisinde kullanılan önemli bir drog olup, bitkinin halk arasında kolagog ve diüretik olarak kullanımı da mevcuttur (52).

1.4 Centaurea L. Taksonları Üzerinde Yapılan Biyoaktivite Çalı şmaları

Çe itli Centaurea türlerinin antimikrobiyal (13, 33, 50, 64), antioksidan (34, 58, 61, 62), antienflamatuvar (33, 48), antiülserojenik (68), sitotoksik (39) ve antiprotozoal (33, 45) aktivite gösterdi i saptanmı tır.

C. cyanus ’un in-vivo antienflamatuvar ve immunolojik aktiviteye sahip oldu u yapılan

çalı malarla ortaya konmu tur (28).

BÖLÜM II 2 GEREÇ VE YÖNTEM

2.1 Kullanılan Gereçler

• Hassas terazi (OHAUS Adventurer AR 3130)

• Mekanik ö ütücü (Waring Commercial Blender HGB2WT)

• Ultrasonik su banyosu (Ultrasonic LC-30, Elma)

• Kromatografi tankı (Camag cam küvet)

• UV lamba (Spectroline ENF-260C/FE)

• Vakum pompası (Büchi Vac-500)

• Evaporatör (Büchi RE-111)

• Su banyosu (Büchi 461)

• Fraksiyon toplayıcı (Spectra Chrom CF-1)

• Vakum kontrolörü (Büchi B-721)

• Vakum konsantratör sistemi

o Vakumlu santrifüj (Christ RVC 2-25)

o So utucu (Christ LT-105)

o Vakum pompası (Vacuubrand RZ 2.5)

• Vorteks (IKA Yellow-Line TTS-2)

• Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPSK) düzene i 8

o Thermo Scientific Accela pompa

o Thermo Scientific Accela autosampler

o Thermoscientific Hypersil Gold, 1.9  (50 x 2.1mm) RP C-18 kolon

o Thermo Scientific Accela PDA dedektör

o ChromQuest 4.2.34 program

• Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektrometresi (Varian, 400 MHz)

2.2 Kullanılan Kimyasal Maddeler

Asetik asit: CH 3COOH (Merck)

Diklorometan: CH 2Cl 2 (Merck)

Etanol: EtOH (Merck)

Etilasetat: EtOAc (Merck)

Formik asit: HCOOH (Merck)

Kloroform: CHCl 3 (Merck)

Metanol: MeOH (Merck)

n-butanol: n-BuOH (Merck)

n-hekzan: (Merck)

Sülfürik asit: H2SO 4 (Merck)

Vanilin: (Sigma)

Natural Products Reagent (Naturstoffreagenz A): (Roth)

İnce tabaka Kromatografisi ( İTK) hazır alüminyum plakları :

Silica gel 60 F 254 (Merck, EMD Chemicals Inc.), LiChroprep RP-18 (Merck), Selüloz

(Merck)

Açık Kolon Kromatografisi (AKK) kolon dolgu materyalleri :

Silica gel 60, 40-63m µ (Merck), LiChroprep RP-18, 25-40 m µ (Merck), Sephadex TM

LH-20 (GE Healthcare)

2.3 Kullanılan Yöntemler

2.3.1 Bitkisel Materyal

2.3.1.1 Centaurea cyanus L.

Centaurea cyanus çiçeklenme döneminde (2004-Haziran), Manisa Spil da ı, 709 m’den toplanmı tır (38 o35'15.6''N 027 o25'24.1''E). Bitkinin herbaryum örne i hazırlanarak, Ege

Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Herbaryumu’na kaydedilmi tir ( ZEF 5685) (Resim 1).

Resim 1. Centaurea cyanus L. 10

2.3.2 Fitokimyasal Çalı şmalar

2.3.3 Kromatografik Yöntemler

2.3.3.1 İnce tabaka kromatografisi ( İTK)

Çalı mamız süresince TK yöntemi, izolasyon çalı malarının izlenmesi, ticari standart ile kıyaslayarak fraksiyonlarda maddelerin tespiti amaçları ile kullanılmı tır.

A. İzolasyon çalı şmalarının izlenmesi

Tüm izolasyon ve safla tırma i lemleri süresince normal ve ters faz silika jel ile kaplı hazır plaklardan faydalanılmı tır. Numune tatbiki, kılcal borular yardımı ile plaın alt ucunun

1 cm yukarısına ve tatbik noktaları arasında 1’er cm aralık bırakılarak yapılmı tır. Mobil faz solvanları Merck marka kullanılmı tır.

Adsorbanlar:

1) Normal faz silika jel 60 F 254 hazır alüminyum plak (Merck, 105554)

2) Ters faz silika jel (Lichroprep RP-18) hazır alüminyum plak (Merck, 105559)

Solvan sistemleri:

Adsorban 1 için: Hekzan-EtOAc (90:10, 70:30)

CHCl 3-MeOH (90:10, 85:15, 80:20)

CHCl 3-MeOH-H2O (80:20:2, 70:30:3, 61:32:7, 64:50:10)

EtOAc-MeOH-H2O (100:17.13, 100:20:15)

Adsorban 2 için: MeOH:H 2O (0:100, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30,

80:20, 90:10, 100:0)

Belirteç: TK plaklarında UV aktif maddelere ait leke ve bantlar, UV altında (254 ve 366 nm) belirlenmi tir. Tüm maddelerin gözlenebilmesi amacıyla vanilin-sülfürik asit belirteci kullanılmı tır.

Vanilin-sülfürik asit belirteci : %5 etanolik sülfürik asit (Çözelti I), %1 etanolik vanilin

(Çözelti II). Tabaka üzerine I nolu çözelti, hemen ardından II no’lu çözelti püskürtülür. Plak

5-10 dakika süreyle, 110 ºC’de ısıtılarak lekeler görünür hale getirilir.

B. Standart saf örnek ile kar şıla ştırma

zolasyon çalı maları esnasında elde edilen bazı fraksiyonlarda, flavonoit yapısındaki maddelerin ve fenolik asitlerin varlı ının belirlenebilmesi amacı ile ticari olarak satın alınmı standart numuneler ile kıyaslama yapılmı tır. Numune tatbiki, kılcal borular yardımı ile pla ın alt ucunun 1 cm yukarısına ve tatbik noktaları arasında 1’er cm aralık bırakılarak yapılmı tır. Kullanılan tüm standartlar Extrasynthese markadır.

Adsorbanlar:

1) Normal faz silika jel 60 F 254 hazır alüminyum plak, 20x20 cm (Merck, 105554)

2) Selüloz cam plak, 20x20 cm (Merck 105716)

Solvan sistemleri:

Adsorban 1 için: EtOAc-HCOOH-CH 3COOH-H2O (100:11:11:26)

Adsorban 2 için: BAW (BuOH-CH 3COOH-H2O) (4:1:5)-Üst faz

Belirteç: Natural Products (Roth)-Polietilenglikol Belirteci (NP/PEG) : % 1 metanolik difenilborik asit-etilamino esteri (difenilboriloksietilamin) (NP) (Çözelti I), % 5 etanolik polietilenglikol (PEG 4000) (Çözelti II). TK plak üzerine I nolu çözelti, hemen ardından II nolu çözelti püskürtülür. Hemen veya 15 dak sonra, UV altında, 365 nm’de yapıya ba lı olarak de ien floresans gözlenir. PEG kullanımı, hassasiyeti arttırır.

2.3.3.2 Vakum sıvı kromatografisi (VSK)

VSK, ön fraksiyonlama i lemleri için kullanılmı tır. 5x80 cm’lik cam kolon’un altına pamuk yerle tirilmi , yeterli miktarda MeOH ile süspanse edilmi adsorban (Lichroprep RP-

18) (Merck, 25-40 µm) kolona aktarılmı tır. Elüsyona balanacak solvan sistemi (%100 H 2O) 12

ile kolon artlandırılmı ve hazır hale getirilmi tir. Numune bir miktar adsorban ile karı tırılarak MeOH içerisinde çözülmü ve solvan uzakla tırıldıktan sonra bir havan yardımı ile homojen olana kadar karı tırılmı tır. Kuru ve homojen haldeki adsorban/madde karı ımı kolona tatbik edilmi tir. Adsorban yüzeyinin bozulmaması amacıyla üzerine pamuk yerle tirilmi tir. Elüsyona ba lanmı ve mobil faz polaritesi azalacak ekilde devam edilmi tir. Mobil fazın adsorban yüzeyinde ilerlemesi, bir vakum pompası yardımı ile hızlandırılmı tır.

Solvan sistemi : %100 H 2O %100 MeOH (%10’luk artılar ile)

Fraksiyon hacmi : 100 ml

2.3.3.3 Silika jel kolon kromatografisi

Ana ekstrenin fraksiyonlanması ve elde edilen fraksiyonların safla tırılması amacı ile kullanılmı tır. Yeterli miktar silika jel (Kiesel gel 60 F 254 , 0.040-0.063 mm, Merck Art:

1.09385), elüsyona ba lanacak solvan sistemi ile süspansiyon haline getirilmi ve alt ucuna pamuk yerle tirilmi çe itli boyutlardaki cam kolona aktarılmı tır. Aynı sistem geçirilerek kolon artlandırılmı tır. Numune uygun miktar elüsyona ba lanacak solvan içerisinde

çözülerek veya silikaya emdirilip solvan uçurulduktan sonra kuru ve homojen bir karı ım haline getirilerek kolona tatbik edilmi tir. Yüzeyin bozulmasını önlemek amacıyla üzerine pamuk koyularak yüzeyin bozulması önlenmi tir. Elüsyon, polarite artacak ekilde çe itli solvan sistemleri ile sa lanmı tır. Ayrılan fraksiyonlar tüplere toplanmı tır.

Solvan sistemleri : Solvan sistemleri fraksiyonlama i lemlerinin anlatıldı ı bölümde detaylandırılmı tır.

2.3.3.4 Jel filtrasyon (Sephadex) kolon kromatografisi

Ana ekstrelerden elde edilen fraksiyonların safla tırılması amacı ile kullanılmı tır.

Kolon dolgu materyali olan Sephadex LH-20 (Ge Healthcare 17-0090) kolon hazırlanmadan bir gün önce, uygun miktar MeOH ile karı tırılarak imesi sa lanmı tır. Karı ım, alt ucuna pamuk yerle tirilen cam kolona aktarılmı tır. Kolondan solvan geçirilerek adsorbanın oturması sa lanmı tır. Numune, yeterli miktar solvan içerisinde çözülerek adsorban yüzeyine pastör pipeti ile tatbik edilmi tir. Sabit veya de ien sistemde solvanlar geçirilerek maddeler fraksiyonlanmı tır. Solvan sistemleri: MeOH, MeOH-H2O (50:50), H 2O-MeOH

(%100H 2O%100MeOH), Fraksiyon hacmi: 5 ml.

2.3.3.5 Ultra performanslı sıvı kromatografisi (UPSK)

Çalı ma materyali olarak seçilen Centurea türlerinden elde edilen tüm total ekstrelerin içerikleri UPSK cihazında flavonoit bile ikleri ve klorojenik asit standartları ile kar ıla tırılarak incelenmi tir. Flavonoit kar ıla tırılmasında 19 flavonoit standartı (akasetin, apigenin, apiin, hesperidin, homoorientin, luteolin 3’-O-glukozit, kemferol, izo aftozit, izoviteksin, luteolin 4’-O-glukozit, luteolin, naringenin, orientin, kersetin, kersitrin, rutin, skutellarin, aftozit ve viteksin) kullanılmı tır. Tüm saf örnekler ve numuneler MeOH içerisinde çözülmü tür.

Kolon : Thermo Scientific Hypersil Gold C-18, 1.9 µm 2.1 x 50mm

Solvan sistemi : A: H 2O (%0.25 CF 3COOH ile)

B: Asetonitril (%0.25 CF 3COOH ile)

C: MeOH

Enjeksiyon hacmi : 1µl

Dedeksiyon : 190-800 nm (Kanallar: 212, 272 ve 285 nm)

Gradiyent :

Zaman(dak) %A %B %C Akı (µl/dak) 0 96 4 0 300 3 90 10 0 300 4 86 14 0 300 10 84 16 0 300 15 80 20 0 300 22 65 35 0 300 26 65 35 0 300 26.01 0 0 100 300 29 0 0 100 300 29.01 96 4 0 300 34 96 4 0 300

2.3.4 Spektroskopik Yöntemler

zole edilen maddelerin 1D ve 2D NMR spektrumları, DMSO-d6 içerisinde, tetrametilsilan (TMS) standardı kullanılarak, Varian 400 MHz NMR cihazı ile alınmı tır.

2.4 C. cyanus üzerinde yapılan ekstraksiyon çalı şmaları

C. cyanus ’un n-hekzan (4.6 g), CHCl 3 (5.66 g) ve MeOH (12.14 g) ekstrelerinin TK profilleri farklı sistemlerde incelenmi olup, zengin bulunan MeOH ekstresinin n-butanol ile partisyonlanması yoluna gidilmitir. Bu i lem için MeOH ekstresi, 200 ml distile su ile süspanse edildikten sonra, 2 lt’lik ayırma hunisinde 1000 ml n-butanol ile partisyona tabi tutulmu tur. lem 4 kez tekrarlanarak n-butanol ve su fazları deri tirilmi tir.

2.5 C. cyanus üzerinde yapılan fraksiyonlandırma ve izolasyon ve çalı şmaları

TK (Silika jel ve RP-C18 silika jel) sonuçları incelenerek, 10 g BuOH ekstresi, kuru tatbik eklinde, RP C-18 silika jel kolona (200 g, 5x85 cm) uygulanmı tır. Vakum sıvı

kromatografisi (VSK) ile fraksiyonlama i lemine, çözgen sistemi A, B, C, D, E, F, G, H, I, J,

K (1’er L) eklinde de itirilerek devam edildimi ve sırasıyla M, N, O (200’er ml) çözgen sistemleriyle tamamlanmı tır (Tablo 1). Ayırma i lemi sonucunda toplam 95 fraksiyon elde edilmi tir. Fraksiyonlar, W, X ve Y sistemlerinde, TK ile incelenerek profilleri benzer olan fraksiyonlar birle tirilerek 33 ana fraksiyon elde edilmi tir (Tablo 2).

Tablo 1. C. cyanus üzerinde yapılan AKK ve TK çalı malarında kullanılan çözgen sistemleri Kod Çözgen Sistemi Karı şım Oranı

A. H2O 10 B. MeOH : H 2O 1 : 9 C. MeOH : H 2O 2 : 8 D. MeOH : H 2O 3 : 7 E. MeOH : H 2O 4 : 6 F. MeOH : H 2O 5 : 5 G. MeOH : H 2O 6 : 4 H. MeOH : H 2O 7 : 3 . MeOH : H 2O 8 : 2 J. MeOH : H 2O 9 : 1 K. MeOH 10 L. CHCl 3 10 M. CHCl 3 : MeOH 2 : 8 N. CHCl 3 : MeOH 4 : 6 O. CHCl 3 : MeOH 5 : 5 P. CHCl 3 : MeOH 8 : 2 Q. CHCl 3 : MeOH 9 : 1 R. CHCl 3 : MeOH : H 2O 85 : 15 : 0.5 S. CHCl 3 : MeOH : H 2O 85 : 15 : 1 T. CHCl 3 : MeOH : H 2O 85 : 15 : 1.5 U. CHCl 3 : MeOH : H 2O 85 : 15 : 2 V. CHCl 3 : MeOH : H 2O 80 : 20 : 1 W. CHCl 3 : MeOH : H 2O 80 : 20 : 2 X. CHCl 3 : MeOH : H 2O 70 : 30 : 3 Y. CHCl 3 : MeOH : H 2O 61 : 32 : 7 Z. CHCl 3 : MeOH : H 2O 64 : 50 : 10 AA. CH 2Cl 2 100 BB. CH 2Cl 2: MeOH 95 : 5 CC. CH 2Cl 2: MeOH 90 : 10 DD. CH 2Cl 2: MeOH 80 : 20 EE. CH 2Cl 2: MeOH : H 2O 80 : 20 : 1 FF. CH 2Cl 2: MeOH : H 2O 80 : 20 : 2 GG. CH 2Cl 2: MeOH : H 2O 70 : 30 : 3 HH. CH 2Cl 2: MeOH : H 2O 61 : 32 : 7 . CH 2Cl 2: MeOH : H 2O 64 : 50 : 10

JJ. EtOAc : MeOH : H 2O 100 : 17 : 13 KK. EtOAc : HCOOH : CH 3COOH : H 2O 100 : 11 : 11 : 26 LL. BuOH : Asetik asit : H 2O 4 : 1 : 5 MM. EtOAc : MeOH: H 2O 70 : 30 : 3 NN. EtOAc : MeOH 80 : 20

Tablo 2. C. cyanus ’tan elde edilen ana fraksiyonların (CC) miktarları 1-3:1647mg 32-34:517mg 56:44mg

4-5:4147 mg 35-37:279mg 57:47mg

6-11:702mg 38-40:219mg 58:34mg

12-13:294mg 41-43:134mg 59:31mg

14-15:163mg 44:132mg 60:30mg

16-18:180mg 45:82mg 61-62:50mg

19-20:71mg 46-47:134mg 63:33mg

21-22:183mg 48:56mg 64-65:50mg

23-25:249mg 49-51:99mg 66-67:70mg

26-27:124mg 52:29mg 68-70:80mg

28-31:184mg 53-55:192mg 71-74:87mg

CC 35-37 ve CC 38-40 fraksiyonları birle tirilerek (498 mg) Sefadeks kolona uygulanmı tır. K çözgen sistemiyle elüe edilmi tir. Toplam 249 fraksiyon toplanmı , Y

çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 174-185

No’lu fraksiyon (29 mg) saf halde elde edilmi tir (Bile şik 1 ).

CC 35-40 fraksiyonu (498 mg) Sefadeks kolona uygulanmı tır. K çözgen sistemiyle elüe edilmi ve toplam 249 fraksiyon elde edilmi tir. X çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 125-135 No’lu fraksiyon (27 mg) silika kolona (21 mg) uygulanmı tır. BB çözgen sistemiyle ba lanarak %2.5’luk azalmalarla belirli

aralıklarla elüe edilmi ve toplam 116 fraksiyon elde edilmi tir. Y çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 37-116 No’lu fraksiyon (16 mg) saf halde elde edilmitir. (Bile şik 2 ).

CC 14-15 fraksiyonu (163 mg) Sefadeks kolona (70 g) uygulanarak K çözgen sistemiyle elüe edilmi tir. Toplam 146 fraksiyon toplanmı tır. JJ çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 75-79 No’lu fraksiyon (12 mg) silika plak üzerine uygulanarak, JJ çözgen sistemiyle sürüklenmi tir. UV’de (254-366 nm) incelenmi ve V/S reaktifi uygulanarak, mor renkli majör bir bant gözlenmi tir (Bile şik 3 ).

CC14-15 / 96-108 No’lu fraksiyon (63 mg) silika kolona (42 mg) kuru tatbik eklinde uygulanmı tır. CC çözgen sistemiyle ba lanarak %2’lik azalmalarla belirli aralıklarla elüe edilmi ve toplam 335 fraksiyon elde edilmi tir. Y çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi ve 247-314 No’lu fraksiyon (9 mg) silika plak

üzerine uygulanarak, KK çözgen sistemiyle sürüklenmi tir. UV’de (366 nm) incelenmi ve

NP/PEG reaktifi uygulanarak, mavi floresans renkli bir bant gözlenmi tir (Bile şik 4 ).

CC 56 fraksiyonu (44 mg) hekzan:EtoAc (9:1) çözgen sistemi ile silika plakta sürüklenmi ve V/S reaktifi uygulanarak, kuruduktan sonra UV (254-366 nm) altında sarı bir bant gözlenmi tir. Ayrıca poliamit pla a tatbik edilerek toluen:petrol eteri: n-butanol:MeOH

(18.5:4.5:9:9) çözgen sisteminde sürüklenmi ve plak kurudu unda UV (254-366 nm) altında sarı bant gözlenmi tir. ( Bile şik 5 ).

CC 6-11 fraksiyonu (702 mg ) Sefadeks kolona (70 g) uygulanarak K çözgen sistemiyle elüe edilmi tir. Toplam 163 fraksiyon elde edilmi tir. Y çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 53-57 No’lu fraksiyon (25 mg) silika kolona

(10 g) uygulanmı tır. BB çözgen sistemiyle ba lanarak % 2.5’luk azalmalarla elüsyon gerçekle tirilmi tir. Toplam 87 fraksiyon elde edilmi tir. X çözgen sistemiyle TK profilleri

incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi ve 66-87 No’lu fraksiyon (9 mg) Bile ik 6’yı vermi tir (Bile ik 6).

CC (6-11/53-57) No’lu fraksiyon (25 mg) silika kolona (10 g) tatbik edilmi tir. BB

çözgen sistemiyle ba lanarak %2.5’luk azalmalarla elüsyon sürdürülmü tür. Toplam 87 fraksiyon elde edilmi ve X çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 19-27 No’lu fraksiyon (3 mg ) saf olarak elde edilmi tir. GCC (6-11/49-

52/15-20) No’lu fraksiyon (4 mg) ile GCC (6-11/53-57/19-27) No’lu fraksiyon (3 mg) Y sisteminde silika pla a tatbik edilerek, UV (254-366 nm) ı ıı altında kar ıla tırılmı tır. Aynı oldu u saptanan fraksiyonlar birle tirilerek 7 mg saf olarak elde edilmi tir (Bile ik 7).

CC (6-11/33-36) No’lu fraksiyon (65 mg ) silika kolona (45 mg ) uygulanmı tır.

Elüsyona BB çözgen sistemiyle ba lanarak %2.5’luk azalmalarla devam edilmi tir. Toplam

42 fraksiyon elde edilmi ve X çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 22-33 No’lu fraksiyon (6 mg) saf halde elde edilmi tir. (Bile ik

6). 37-48 No’lu fraksiyon (162 mg) silika kolona (62 g) uygulanmı tır. BB çözgen sistemiyle ba lanarak belirli aralıklarla elüsyon gerçekle tirilmi tir. Toplam 132 fraksiyon toplanmı ve

X çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi tir. 85-100

No’lu fraksiyon (6 mg) saf olarak elde edilmi tir (Bile ik 8).

CC 35-40 / 82-94 No’lu fraksiyon (26 mg) silika kolona (21 mg) uygulanmı tır. BB

çözgen sistemiyle ba lanarak %2’lik azalmalarla elüsyon sürdürülmü tür. Toplam 23 fraksiyon elde edilmi tir. Y çözgen sistemiyle TK profilleri incelenerek uygun fraksiyonlar birle tirilmi ve 8-9 No’lu fraksiyon (4 mg) saf Bile ik 9’u vermi tir (Bile ik 9).

CC 45 fraksiyonu (82 mg) silika kolona tatbik edilmi tir. NN çözgen sistemiyle ba lanarak %10’luk azalmalarla belirli aralıklarla elüsyona devam edilmi tir. Toplam 160 fraksiyon elde edilirken 48-60 No’lu fraksiyon (9 mg ) saf bir bile ik vermi tir (Bile ik 10).

BÖLÜM III 3 BULGULAR

3.1 C. cyanus ’tan İzole Edilen Bile şikler

3.1.1 İzoramnetin-7-O-βββ-D-glukopiranozit

OCH3

3' OH OH 4' 2' 6" 8 1 O 1' 4" 5" O O 7 9 5' HO 2 6' HO 2" OH 1" 3" 6 10 3 OH 5 4 OH O

Kromatografik tekniklerle yapılan safla tırma i lemleri sonucunda izole edilen amorf toz halindeki bile iin (Bile ik 1, 29 mg), spektral analizleri yapılarak 1H ve 13 C-NMR spektrumları elde edilmi tir ( ekil 1 ve ekil 2). 13 C-NMR spektrumunda 22 adet karbon sinyali görülmü tür. 1H-NMR spektrumu incelendi inde 5 adet aromatik proton sinyali görülmü tür. Gözlenen multiplisite ve yarılma sabitlerinden hareketle [H2': 7.8 d (J=2), H5':

6.97 d (J=8.8), H6': 7.75 dd (J= 8.4, 2)] bu protonlardan 3 tanesinin aynı sistem içerisinde oldu u saptanmı tır ve bu veriler 1,3,4-trisübstitüe bir aromatik halkaya i aret etmi tir.

Birbirini meta yaran 2 proton (H6: 6.46 d (J=2.4) ve H8: 6.87 d (J=2.4)) görülmesi ve karbon sinyallerinin de erlendirilmesi sonucunda 3,5,7,4'-tetrahidroksi bir flavonoit iskeleti ile kar ı kar ıya oldu umuz anla ılmı tır. HMBC spektrumunda 3.87 ppm’de 3 protonluk singlet metoksi sinyalinin 149.72 ppm’deki 3’ karbonuyla etkile iminin oldu u görülmü tür. 1H ve

13 C datalarının (Tablo 3) de erlendirilmesi sonucunda bile iin yapısının izoramnetin-7-O-β-

D-glukopiranozit oldu u saptanmı tır (1).

Şekil 1. zoramnetin-7-O−β− D-glukopiranozit 1H NMR spektrumu 21

Şekil 2. zoramnetin-7-O−β− D-glukopiranozit 13 C NMR spektrumu

Tablo 3. zoramnetin-7-O-β-D-glukopiranozit’in 1H ve 13 C-NMR spektral de erleri (DMSO- d6)

1H-δδδ (ppm) 13 C-δδδ (ppm)

2 148.02

3 136.92

4 176.78

5 161.03

6 6.46 (1H, d, J 2.4 Hz) 99.47

7 163.44

8 6.87 (1H, d, J 2.4 Hz) 95.34

9 156.39

10 105.38

1’ 122.53

2’ 7.80 (1H, d, J 2 Hz) 112.52

3’ 149.72

4’ 148.12

5’ 6.97 (1H, d, J 8.8 Hz) 116.26

6’ 7.75 (1H, dd , J 2 -8.4 122.61 Hz)

1” 5.07 (1H, d, J 7.2 Hz) 100.78

2” 73.85

3” 77.19

4” 70.36

5” 77.99

6” 61.36

3’- 3.87 (3H, s, OCH 3) 56.51 OCH 3

3.1.2 Apiin OH 3' OH 6'' 2' 4' 4'' 5'' O 8 1 1' HO O O HO 1'' 7 9 5' 3'' 2'' 2 6' O O 4''' 1''' 6 3 HO 10 3''' 2''' 5 4 5''' OH HO OH O

Kromatografik tekniklerle yapılan safla tırma i lemleri sonucunda izole edilen turuncu renkli amorf toz halindeki bile iin ((Bile ik 2, 16 mg), spektral analizleri yapılarak 1H ve

13 C-NMR spektrumları elde edilmi tir (ekil 3, ekil 4). 13 C-NMR spektrumunda 26 adet karbon sinyali görülmü tür. 1H-NMR spektrumu incelendi inde, AA'BB'simetrisine sahip 4 adet aromatik proton (H2'-H6' ve H3'-H5') para-disübstitüe bir aromatik halkanın varlı ını göstermi tir. Birbirini meta yaran 2 dublet proton (H6 ve H8) ve 1 adet singlet protonun (H3) görülmesi ve karbon sinyallerinin de erlendirilmesi sonucunda bile iin 5,7,4'-trihidroksi bir flavonoit oldu u anla ılmı tır. 13 C dataları incelendi inde; C7 sinyalinin 163.38 ppm’de görülmesi 7 konumunda sübstitüsyon oldu unu göstermi tir. Glukoz ve apioza ait olan karbon sinyalleri, proton dataları ile birlikte de erlendirildi inde apiozun 1 konumundan, glukozun 2 konumuna ve glukozun da 1 konumundan halkanın 7 konumuna ba lı oldu u belirlenmi tir.

1H ve 13 C datalarının literatür verileri ile kar ıla tırılması ile (1) flavonoit yapısında olan bu maddenin apiin [apigenin-7-O-β-D-apiofuranozil (1-2)-β-D-glukopiranozit] oldu u belirlenmi tir.

Şekil 3. Apiin 1H NMR spektrumu

Şekil 4. Apiin 13 C NMR spektrumu 1 13 Tablo 4. Apiin’in H ve C NMR spektral de erleri (DMSO-d6).

1H-δ (ppm) 13 C-δ (ppm) 1 2 164.50 3 6.85 (1H, s) 103.78 4 182.66 5 162.16 6 6.40 (1H, s) 98.83 7 163.38 8 6.79 (1H, s) 95.51 9 157.62 10 106.10 1’ 121.64 2’ 7.93 (1H, d, J 8.8 Hz) 129.29 3’ 6.92 (1H, d, J 8.8 Hz) 116.71 4’ 161.90 5’ 6.92 (1H, d, J 8.8 Hz) 116.71 6’ 7.93 (1H, d, J 8.8 Hz) 129.29 1” 5.14 (1H, d, J 7.6 Hz) 100.10 2” 77.47 3” 76.77 4” 70.50 5” 77.72 6” 61.22 1’’’ 5.33 (1H, d, J 1.2 Hz) 109.42 2’’’ 76.47 3’’’ 79.95 4’’’ 74.67 5’’’ 64.90

3.2 C. cyanus ’ta İTK ile Tesbiti Yapılan Bile şikler

3.2.1 Siringin

OH CH3

O O OH HO HO

OH O

O CH3

CC 14-15/75-79 No’lu fraksiyonda, 100:17:13 (EtOAc:MeOH:H 2O) sisteminde sürüklenerek V/S reaktifi uygulamasından ve ısıtılmasından sonra mor renk veren bile ik 3, .

Baykan Erel’den temin edilen siringin içeren fraksiyona büyük benzerlik göstermi tir.

Fraksiyonların TK kar ıla tırması yapılmı ve bile iminde siringin varlı ı belirlenmi tir

(Resim 2).

Resim 2. CC 14-15 / 75-79 No’lu fraksiyonda siringin

3.2.2 Klorojenik asit

CC14-15 / 96-108 / 247-314 No’lu fraksiyon ve klorojenik asit standardı, silika plak

üzerine tatbik edilerek EtOAc:HCOOH:CH 3COOH:H 2O (100:11:11:26) sisteminde sürüklenmi , NP/PEG reaktifi uygulandıktan sonra 366 nm’de foto raflanmı tır (Resim 3).

Fraksiyonda klorojenik asit varlı ı tesbit edilmi tir (Bile ik 4).

Resim 3. CC14-15 / 96-108 / 247-314 No’lu fraksiyonda klorojenik asit

3.2.3 Apigenin 3' OH 2' 4' 8 1 1' HO 9 O 5' 7 2 6' 3 6 10 5 4 OH O

CC 56 fraksiyonu ve flavonoit standartları silika plak üzerine tatbik edilerek n- hekzan:EtOAc (1:9) sisteminde sürüklenmi , UV (254-366nm) altında kar ıla tırılmı tır.

Vanilin-sülfirik asit reaktifi uygulanarak ısıtılan TK pla ı foto raflanmı tır. Bile ik 5’in apigenin oldu u tesbit edilmi tir (Resim 4).

1 2

Resim 4. CC 56 no’lu fraksiyonda apigenin ( 1: vanilin-sülfirik asit reaktifi ile 2: reaktif uygulandıktan sonra 366 nm’de)

C. cyanus ’tan kromatografik i lemlerle izole edilmi olan di er bile ikler (Bile ik 6-10) için yapılan 1D NMR analizlerinde iyi 1H sonuçları alınabilmi ancak 13 C sonuçları, yapı tayini için yeterli bulunmamı tır.

3.3 UPSK sonuçları

Çalı ma materyali olarak seçilen Centurea türlerinden elde edilen total ekstrelerin

(MeOH, n-butanol ve EtOAc) içerikleri UPSK cihazında standart bile iklerle kar ıla tırılarak incelenmi tir. Çalı mamızda izole edilen bile iklerin büyük ço unlu unun flavonoit grubu bile ikler olması nedeniyle 19 flavonoit bile ii, ayrıca klorojenik asit standart olarak kullanılmı tır.

UPSK analizinde standart maddeler (akasetin, apigenin, apiin, hesperidin, homoorientin, luteolin 3’-O-glukozit, kemferol, izo aftozit, izoviteksin, luteolin 4’-O-glukozit, luteolin, naringenin, orientin, kersetin, kersitrin, rutin, skutellarin, aftozit, viteksin ve klorojenik asit),

0.1 mg/2 ml konstrasyonda MeOH içinde çözülerek 1 µl enjeksiyon ile kolona uygulanmı ve yöntem kısmında belirtilen solvan gradienti ile analizlenmi tir. PDA dedektöründe alıkonma zamanları ve 190-800 nm arasında UV spektrumları elde edilerek standartlara ait bir kütüphane olu turulmu tur. Bitki ekstreleri ile aynı i lem tekrarlanarak ekstrelere ait kromatogramlar elde edilmi tir.

Daha sonra ekstrelere ait kromatogramlar, alıkonma zamanları (RT) ve UV absorbansları açısından standart kütüphanesi ile kar ıla tırılmı tır. Analizde total ekstreler kullanıldı ı için bazı sinyallerin alıkonma zamanlarında kaymalar veya daha önce izole edilen ve tanımlanan maddelerin oranı çok dü ük oldu u için gürültünün altında kaldı ı ve görülmedi i belirlenmi tir. Sinyallerin RT ve UV absorbans e risindeki tepe noktaları birlikte de erlendirilmi tir. Ekstrelere ait UPSK kromatogramları, tesbiti yapılan maddelerin RT, standart RT ve UV absorbans e rileri ile benzerlik oranları a aıda belirtilmektedir ( ekil 5,

ekil 7).

Yapılan çalı malar sonunda n-BuOH ve MeOH ekstrelerinde, 4 flavonoit bile ii ve klorojenik asit varlı ı saptanmı tır ( ekil 6, ekil 8).

Detector 1-285nm C_CYA_BUOH Retention Time Name 700 700

600 600

500 500

400 400

mAU mAU 19,783

300 300

7,400 200 200

(Rutin)

6,600

Apigenin

4,550 Luteolin 7,583 Naringenin 100 5,983 100

Acacetin (Orientin) (Scutellarin)

aftozit)

ş (Lut-3-Gly) 10,883

6,283 8,017

aftozit) 10,333

zoviteksin) zo (Quercitrin) Ş İ 5,167 5,450 İ 6,817 (Homoorientin) ( ( (Quercetin) ( 9,683 4,317 (Kaempferol) 5,683 (Apiin) (Viteksin) 12,500 0,667 9,950 (Lut-4-Gly) 8,317 (Hesperidin)

1,783 17,283 19,417 4,900 18,150 18,683 19,000 21,517 3,550 1,567 1,067 8,967 2,267 15,800 16,133 20,783

9,233 17,750 17,867 18,450 20,517 12,183 20,250 21,933 22,267 22,667 16,600 21,717 2,600 23,067 15,533 23,350 11,700 13,367 13,617 14,250 14,467 14,633 15,100 11,433 23,817 24,167 24,433 13,850 25,583 24,967 0,383 0 0 Klorojenik Asit

3,917

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Minutes Şekil 5. C. cyanus BuOH ekstresi UPSK kromatogramı (285 nm)

Unknown Known

30 30

20 20 mAU mAU 10 10

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 3,82.dk Klorojenik asit (3,93) 0.9555

Unknown Known 200 200

100 100 mAU mAU

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 5,98 dk. Homoorientin (6,08) 0,9776

Unknown Known 150 150

100 100 mAU mAU 50 50

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 8,00 dk Lut-3-Gly (8,00) 0.9976

Unknown Known

100 100

mAU 50 50 mAU

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 10,35 dk Apiin (10,51) 0.9883

Unknown Known

50 50

25 25 mAU mAU

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 10,45 dk Lut-4-Gly (10,61) 0,9835

Şekil 6. C. cyanus BuOH ekstresi’nde tesbiti yapılan bile iklerin UV spektrumu 33

Detector 1-285nm C_CYA_MEOH Retention Time 350 Name 350

300 300

250 250 19,850

200 200 mAU mAU

150 150

100 7,500 100

Homoorientin

Apiin

aftozit)

Apigenin 6,700 ş

50 7,700 50

Acacetin Hesperidin 4,550

zo 6,083

aftozit)

( 8,183 11,067 6,383

10,517 Ş 5,217 (

zoviteksin) 7,000 5,500 (Orientin) (Scutellarin) (Quercetin) 5,717 İ (Lut-4-Gly) 0,650 4,317 (Lut-3-Gly) (Quercitrin) (Viteksin) (Rutin) 9,817 12,683 (Kaempferol) ( (Luteolin) (Naringenin)

8,467 10,117 1,783 17,367 21,567 19,083 19,500

1,583 18,233 18,767 4,917 1,100 12,300 16,267 3,550 9,083

16,017 18,550 20,383 20,850 2,267 9,333 17,850 21,167 21,983 22,317 2,617 16,700 22,717 23,117 15,700 24,250 13,783 14,617 15,233 23,883 13,467 14,400 11,667 24,567 14,000 25,667 0,417 0 0 Klorojenik Asit

3,917

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Minutes

Şekil 7. C. cyanus MeOH ekstresi UPSK kromatogramı (285 nm)

Unknown Known 30 30

20 20 mAU mAU 10 10

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 3,83 dk Klorojenik Asit (3,93) 0,9589

100 Unknown Known 100

50 50 mAU mAU

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 6,08 dk Homoorientin (6,08) 0,9778

Unknown Known

60 60

40 40 mAU mAU 20 20

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 8,15 dk Lut-3-Gly (8,00) 0,9973

75 Unknown Known 75

50 50

mAU 25 25 mAU

0 0

200 300 400 500 600 700 800 nm 10,51 dk Lut-4-Gly (10,61) 0.9921

Şekil 8. C. cyanus MeOH ekstresi’nde tesbiti yapılan bile iklerin UV spektrumları

BÖLÜM IV TARTI ŞMA ve SONUÇ

Çalı mamızda Centaurea cyanus çiçeklenme döneminde (2004-Haziran),

Manisa Spil da ı, 709 m’den toplanmı tır (38 o35'15.6''N 027 o25'24.1''E). Bitkinin herbaryum örne i hazırlanarak, Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Herbaryumu’na kaydedilmi tir Bitkinin açık havada ve gölgede kurutulmu topraküstü kısımları sırasıyla n-hekzan, kloroform ve metanol ile ekstre edilmi tir. Metanol ekstresi, n- butanol ile partisyonlanmıtır. Çeitli kromatografik yöntemler kullanılarak n- butanol ekstresi üzerinde sekonder madde izolasyonları gerçekle tirilmi tir. Elde edilen maddelerin yapı tayinleri 1D ve 2D NMR yöntemleri yardımıyla saptanmı tır.

Bazı fraksiyonlarda ticari saf standartlar ile kar ıla tırma yapılarak tespit çalı maları gerçekle tirilmi tir. C. cyanus ’tan elde edilen n-BuOH ve MeOH ekstrelerinin içerikleri UPSK cihazında flavonoit bile ikleri ve klorojenik asit standartları ile kar ıla tırılarak belirlenmi tir.

C. cyanus ’tan izoramnetin-7-O-β-D-glukopiranozit ve apiin bile ikleri izole edilmi , fraksiyonlarda siringin, klorojenik asit ve apigenin varlı ı TK metodu ile saptanmı tır. Ekstrelerde ise klorojenik asit, homoorientin, luteolin-3-O-glikozit, luteolin-4-O-glikozit ve apiin bulundu u UPSK metodu ile belirlenmi tir.

Daha önce yapılmı olan çalı malarla, C. cyanus tohumlarından, 2 epoksilignan bile ii berkemol ve larisirezinol-4-O-β-D-glukopiranozit (55), bir ba ka çalı mada ise indol alkaloitleri (mo amin, cis -mo amin, sentsiyamin ve cis -sentsiyamin) izole edilmi tir (52). C. cyanus ’un toprak üstü kısımlarından kersetin, kemferol,

izoramnetin, kersetin-7-O-β-D-glukozit, izoramnetin-7-O-β-D-glukozit, kemferol-7-

O-β-D-glukozit, apigenin, luteolin, hispidulin, apigenin-7-O-β-D-glukozit, apigenin-

4'-O-β-D-glukozit, luteolin-7-O-β-D-glukozit, apiin, luteolin-7-apioglukozit, kafeik, klorojenik, neoklorojenik ve izoklorojenik gibi hidroksisinnamik asitler izole edilerek yapıları aydınlatılmı tır (42). zoramnetin-7-O-β-D-glukopiranozit, apiin, apigenin ve klorojenik asit bitkiden daha önce izole edilmi olmakla birlikte, bu

çalı ma ile, C. cyanus ’ta homoorientin, luteolin-3-O-glikozit ve luteolin-4-O-glikozit varlı ı ilk kez rapor edilmektedir.

Asteraceae familyasının Centaureinae subtribusunda yer alan bazı taksonların siringin içeriklerinin ara tırıldı ı bir çalı mada C. cyanus ’ta siringin tesbit edilemedi i belirtilmektedir (19). Yapmı oldu umuz çalı ma ile siringin bu taksonda tarafımızdan ilk kez rapor edilmektedir.

C. cyanus , Centaurea cinsine ait toplam 15 türün dahil oldu u Cyanus seksiyonuna dahil olan bir taksondur. Bu seksiyonda yer alan di er Centaurea türleri

üzerinde az sayıda fitokimyasal çalı ma bulunmaktadır.

C. lanigera uçucu ya ının GC ve GC/MS analizi yapılarak germakren-D ve β- karyofillenin ana komponentler oldu u belirlenmi tir (26).

C. triumfettii ’de 27 flavonoit saptanmı , ana bile enler olarak apigenin, luteolin, krizoeriol ve bunların bazı 2"-O-konjuge türevleri belirlenmi tir (29).

C. depressa toprak üstü kısımlarından skutellarein, skutellarin (skutellarein-7-

O-β-D-glukuronozit), skutellarein-5-O-β-D-glukuronozit, kersetin, izokersitrin ve bir apigenin glikoziti izole edilmi tir (6, 7). C. depressa bitkisinin kurutulmu toprak

üstü kısımlarından hazırlanan metanol ekstresinden kromatografik yöntemler kullanılarak apigenin, luteolin, skutellarin ve β-sitosterol-3-O-β-D-glukopiranozit

izole edilmi tir. Ayrıca TK yöntemi kullanılarak, siringin ve klorojenik asit varlı ı belirlenmi tir (38). ran’da yayılı gösteren C. depressa ’nın toprak üstü kısımlarından elde edilen uçucu ya ın GC-MS analizi ile 26 bile ik tanımlanmı , ana bile enlerin, piperiton (%35.2), elemol (%14.1), β-ödesmol (%6.9), spatulenol (%5), karyofillen oksit (%4) ve hekzadekanoik asit (%4) oldu u belirlenmi tir (24). Bir di er çalı mada ise, Türkiye’de, Denizli, Honaz Da ı’ndan toplanan C. depressa ’nın toprak üstü kısımlarından elde edilen uçucu ya ın GC ve GC/MS analizinde toplam

93 bile ik tanımlanmı tır. Ana bile enlerin, hekzadekanoik asit (%21.3), karvakrol

(%14.2), tetradekanoik asit (%8.8) ve dodekanoik asit (%4.7) oldu u belirlenmi tir

(37).

C. reuterana var. reuterana bitkisinde, 5 flavonoit glikozitinin ( aftozit, izo aftozit, luteolin-7-O-β-D-glukozit, homoorientin ve orientin) varlı ı çe itli TK metodları ile belirlenmi tir (38). C. reuterana var . reuterana topraküstü kısımlarından mikrodistilasyonla elde edilen uçucu ya ı GC ve GC/MS analizinde ana bile enlerin hekzadekanoik asit (%23.8), karvakrol (%14.9), karyofillen oksit

(%6.2), heptakosan (%4.7) ve nonakosan (% 4.3) olduu belirlenmi tir (37).

Cyanus seksiyonunda bulunan di er taksonlar üzerinde de ( C. cherianthifolia,

C. germanicopolitana, C. bourgae, C. woronowii, C. thirkei, C. pichleri, , C. pinardii, C. nigrifimbria, C. tchihatcheffii ve C. mathiolifolia ) kapsamlı fitokimyasal

çalı maların yapılmasına gereksinim duyulmaktadır.

zoramnetin-7-O-β-D-glukopiranozitin antioksidan (17), apiinin östrojenik

(69) ve antienflamatuvar (46), apigeninin ise antioksidan (45), antimikrobiyal (14) antitümöral (41, 59) ve antienflamatuvar (30) etkilere sahip oldu u yapılan

çalı malarla saptanmı tır. Apigenin, H3N2 influenza virüsü üzerinde yüksek antiviral etkiye sahip bir bile iktir (44). Siringin ise biyoaktif bir fenilpropanoit bile ik olup, 38

yapılan çalı malarda, antinosiseptif (18), ba ııklık sistemini düzenleyici (16), antienflamatuvar (40, 18) ve hipotansif (2) etkilere sahip oldu u belirlenmi tir.

Fenolik asitlerden, hidroksisinnamik asit türevi olan klorojenik asit de antioksidan etkisi bilinen bir maddedir (68).

C. cyanus, tarlalarda yabani ot olarak geni yayılı göstermekte ve zirai mücadelesi yapılmaktadır. Biyoaktif sekonder metabolitler içeren bu türün yeni terapötik ajanların geli tirilmesinde önemli bir kaynak olabilece i dü ünülmektedir.

Bitkide bulunan di er sekonder metabolitler ve biyoaktiviteleri yönünde ileri

çalı malar yapılmasına gereksinim duyulmaktadır.

ÖZET

Centaurea cyanus L.’in Sekonder Metabolitlerinin Ara ştırılması

Bu çalı mada, Manisa Spil da ından toplanmı olan Centaurea cyanus ’un kurutularak toz edilmi toprak üstü kısımlarından, n-hekzan, kloroform ve metanol ekstreleri hazırlanmı tır. Çe itli kromatografik yöntemler kullanılarak n-butanol ekstresi üzerinde fraksiyonlama ve izolasyon i lemleri gerçekle tirilmi tir. Saf maddelerin yapı tayinleri spektroskobik yöntemler kullanılarak gerçekle tirilmi tir

(1H ve 13 C NMR). Bazı fraksiyonlarda ticari saf standartlar kullanılarak TK ile tespit

çalı maları yapılmı tır. C. cyanus ’tan elde edilen n-BuOH ve MeOH ekstrelerinin içerikleri UPSK cihazında flavonoit bile ikleri ve klorojenik asit standartları ile kar ıla tırılarak belirlenmi tir.

Sonuç olarak C. cyanus ’tan izoramnetin-7-O-β-D-glukopiranozit ve apiin bile ikleri izole edilmi tir. Siringin, klorojenik asit ve apigenin varlı ı ise TK metodları ile tesbit edilmi tir. Ayrıca, ekstrelerde klorojenik asit, homoorientin, luteolin-3-O-glikozit, luteolin-4-O-glikozit ve apiin bulundu u UPSK metodu ile belirlenmi tir. Bitkide siringin, homoorientin, luteolin-3-O-glikozit ve luteolin-4-O- glikozit varlı ı bu çalı ma ile ilk kez ortaya konmaktadır.

Anahtar sözcükler : Centaurea cyanus , isoramnetin-7-O-β-D-glukopiranozit, apiin, siringin, klorojenik asit, apigenin, homoorientin, luteolin-3-O-glikozit, luteolin-4-O- glikozit, TK, UPSK, NMR.

ABSTRACT

Investigation on secondary metabolites of Centaurea cyanus L.

In this study, n-hexane, CHCl 3 and MeOH extracts from dried and powdered aerial parts of C. depressa Bieb. collected from Manisa, Mountain Spil were prepared. Fractionation and isolation procedures were performed on the n-BuOH extract by using several chromatographical methods. Structure elucidation of the pure compounds were performed by using spectroscopic methods ( 1H and 13 C

NMR). Identification studies were performed with TLC methods by using commercial pure standarts on some fractions. Contents of the n-BuOH and MeOH extracts prepared from C. cyanus were determined by comparing flavonoids and chlorogenic acid standarts on UPLC instrument.

As a result, isorhamnetin-7-O-β-D-glucopyranoside and apiin were isolated from C. cyanus . Syringin, chlorogenic acid and apigenin were identified by using a

TLC method. Furthermore, chlorogenic acid, homoorientin, luteolin-3-O-glycoside, luteolin-4-O- glycoside and apiin were determined in the extracts by using an UPLC method.

Syringin, homoorientin, luteolin-3-O-glycoside and luteolin-4-O-glycoside were reported for the first time in C. cyanus by our work.

Key Words : Centaurea cyanus , isorhamnetin-7-O-β-D-glucopyranoside, apiin, syringin, chlorogenic acid, apigenin, homoorientin, luteolin-3-O-glycoside, luteolin-4-

O- glycoside, TLC, UPLC, NMR.

KAYNAKLAR 1. Agrawal, P.K. (1989). Carbon-13 NMR of Flavonoids, Elsevier Science

Publishers, Amsterdam, Oxford, New York, Tokyo, s:132

2. Ahmad, M., Aftab, K. (1995). Hypotensive action of syringin from Syringa

vulgaris , Phytother Res 9(6 ): 452-454

3. Akkal, S., Benayache, F., Bentamene, A., Medjroubi, K., Seguin, E.,

Tillequin, F., (2003). Flavonoid aglycones from Centaurea napifolia, Chem

Nat Comp , 39(2) : 219-20

4. Arif, R., Küpeli, E., Ergun, F. (2004). The biological activity of Centaurea L .

species, G.U. J Science, 17(4) : 149-64

5. Aslan, Ü., Öksüz, S. (1998). Chemical constituents of Centaurea cuneifolia ,

Turk J Chem, 23 : 15-20

6. Bandyukova, V.A., Khalmatov, Kh.Kh. (1967). Isolation of scutellarin from

Centaurea depressa , Chem Nat Comp, 3(1) : 48-9

7. Bandyukova, V.A., Khalmatov, Kh.Kh., Alimov, Kh.I. (1972). Flavonoids of

Centaurea depressa , Chem Nat Comp, 5(4) : 274-275

8. Baytop, T. (1999). Türkiye’de Bitkilerle Tedavi (Geçmi te ve Bugün), Nobel

Tıp Kitabevleri, stanbul, 2.baskı, s:316

9. Bona, B., Aras, A. (2008). Numerical taxonomic study on some Centaurea L.

species, IUFS J Biol, 67(1) : 55-63

10. Bruno, M., Maggio, A., Paternostro, M.P., Rosselli, S., Arnold, N.A., Herz,

W. (2001). Sesquiterpene lactones and other constituents of three Carduae

from Cyprus, Biochem Syst Ecol, 29(4) : 433-35

11. Bruno, M., Maggio, A., Rosselli, S., Gedris, T.E., Herz, W. (2002).

Sesquiterpene lactones and other constituents of Centaurea paniculata subsp.

castellana , Biochem Sys Ecol, 30(4) : 379-81

12. Bruno, M., Rosselli, S., Maggio, A., Raccuglia, R.A., Arnold, N.A. (2005).

Guaianolides from Centaurea babylonica, Biochem Syst Ecol, 33(8) : 817-25

13. Buruk, K., Sökmen, A., Aydın, F., Ertürk, M. (2006). Antimicrobial activity

of some endemic plants growing in the Eastern Black Sea Region Turkey,

Fitoterapia, 77 : 388-91

14. Bylka, W., Matlawska, I., Pilewski, N.A. (2004). Natural flavonoids as

antimicrobial agents, JANA, 7(2) : 24-31

15. Cardona, M.L., Fernandez, I., Pedro, J.R., Beatriz, P. (1991). Sesquiterpene

lactones and flavonoids from Centaurea aspera, Phytochemistry, 30(7) :

2331-3

16. Cho, J.Y., Nam, K.H., Kim, A.R., Park, J., Yoo, E.S., Baik, K.U., Yu, Y.H.,

Park, M.H. (2001). In-vitro and in-vivo immunomodulatory effects of

syringin, J Pharm Pharmacol , 53(9) : 1287-1294

17. Choi, J.S., Jung, M.J., Park, H.J., Chung, H.Y., Kang, S.S. (2002) Further

isolation of peroxynitrite and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical

scavenging isorhamnetin 7-O-glucoside from the leaves of Brassica juncea L.

Arch Pharm Res, 25(5) : 625-62

18. Choi, J., Shin, K.M., Park, H.J., Jung, H.J., Kim, H.J., Lee, Y.S., Rew, J.H.,

Lee, K.T. (2004). Anti-inflammatory and antinociceptive effects of sinapyl

alcohol and its glucoside syringin, Planta Medica , 70(11) : 1027-1032

19. Cis, J. Nowak, G. Horoszkiewicz-Hassan, M. Kisiel, W. (2003) Syringin in

some species of the subtribe Centaureinae of the Asteraceae, Acta Soc Bot

Polonie , 72(2) ,105-107

20. Çelik, S., Rosselli, S., Maggio, A.M., Raccuglia, R.A., Uysal, I., Kisiel, W.,

Michalska, K., Bruno, M. (2006). Guaianolides and lignans from the aerial

parts of Centaurea ptosimopappa, Biochem Syst Ecol, 34(4) : 349-52

21. Davis, P.H. (1975). Flora of Turkey and The East Aegean Islands, Edinburgh

University Press, Edinburgh, Vol: 5. s: 465-585

22. Davis, P.H. (1988). Flora of Turkey and The East Aegean Islands, Edinburgh

University Press, Edinburgh, Vol: 10. s:431-463

23. Djeddi, S., Argyropoulou, C., Skaltsa, H. (2008). Secondary metabolites from

Centaurea grisebachii subsp. grisebachii , Biochem Sys Ecol, 36 : 336-9

24. Esmaeili, A., Rustaiyan, A., Nadimi, M. (2005). Volatile constituents of

Centaurea depressa M.B. and Carduus pynocephalus L. Two Compositae

herbs growing wild in Iran. J. Essent. Oil Res , 17 : 539-541

25. Flamini, G., Pardini, M., Morelli, I. (2001). A flavonoid sulphate and other

compounds from the roots of Centaurea bracteata , Phytochemistry, 58 : 1229-

1233

26. Flamini, G., Tebano, M., Cioni, P.L., Bagci, Y., Dural, H., Ertugrul, K.,

Uysal, T., Savran, A. (2006). A multivariate statistical approach to Centaurea

classification using essential oil composition data of some species from

Turkey, Plant Syst Evol, 261 : 217-28

27. Fujita, T., Sezik, E., Tabata, M., Yesılada, E., Honda, G., Takeda, Y., Tanaka,

T., Takaıshi, Y. (1995). Traditional medicine in Turkey. VII. Folk medicine

in Middle and West Black Sea Regions, Eco Bot, 49(4): 406-22

28. Garbacki, N., Gloaguen, V., Damas, J., Bodart, P., Tits, M., Angeno, L.

(1999). Anti-inflamatory and immunological effects of Centaurea cyanus

flower-heads, J Ethnopharmacol, 68: 235-41

29. Gonnet, J.F. (1993). Flavonoid glycoside variation in wild specimens of

Centaurea triumfetti (Compositae) and comments on its relationships with

Centaurea montana based on flavonoid fingerprints, Bio Syst Ecol , 21(3) :

389-96

30. Ha, S.K., Lee, P., Park, J.A., Oh, H.R., Lee, S.Y., Park, J.H., Lee, E.H., Ryu,

J.H., Lee, K.R., Kim, S.Y. (2008). Apigenin inhibits the production of NO

and PGE2 in microglia and inhibits neuronal cell death in a middle cerebral

artery occlusion-induced focal ischemia mice model, Neurochem Int, 52 : 878-

886

31. Honda, G., Yesilada, E., Tabata, M., Sezik, E., Fujita, T., Takeda, Y.,

Takaishi, Y., Tanaka, T. (1996). Traditional medicine in Turkey VI. Folk

medicine in West Anatolia: Afyon, Kütahya, Denizli, Mu la, Aydin

provinces, J Ethnopharmacol, 68 : 235-41

32. Kaij-a Kamb, M., Amaros, M., Gire, L. (1992). Chemistry and biological

activity of the genus Centaurea, Pharm Acta Helv, 67(7) : 178 -88

33. Karamenderes, C., Khan, S., Tekwani, B.L., Jacob, M.R., Khan, I.A. (2006).

Antiprotozoal and antimicrobial activities of Centaurea species growing in

Turkey, Pharm Bio , 44(7) : 534-9

34. Karamenderes, C., Konyalıo lu, S., Khan, S., Khan, I.A. (2007). Total

phenolic contents ,free radical scavening activities and inhibitory effects on

the activation of NF-kappa B of eight Centaurea L. species, Phytother Res ,

21 : 488-91

35. Karamenderes, C., Bedir, E., Abou-Gazar, H., Khan, I.A. (2007). Chemical

constituents of Centaurea cadmea , Chem Nat Comp, 43(6) : 694-5

36. Karamenderes, C., Bedir, E., Pawar, R., Baykan, S., Khan, I.A. (2007).

Elemanolide sesquiterpenes and eudesmane sesquiterpene glycosides from

Centaurea hierapolitana , Phytochemistry , 68 : 609-15

37. Karamenderes, C., Demirci, B., Baser, K.H.C. (2008). Composition of

essential oils of ten Centaurea L. taxa from Turkey, J Ess Oil Res , 20(4) :

342-9

38. Karamenderes, C., Alanku Çalı kan, Ö., Baykan Erel, ., Karabay

Yava olu, Ü., Avunduk, S. (2009) Batı Anadolu’da yayılı gösteren bazı

Centaurea L. türlerinin biyoaktif sekonder bile iklerin ara tırılması,

TÜB TAK, 106S197 no’lu ara tırma projesi.

39. Koukoulitsa, E., Skaltsa, H., Karioti, A., Demetzos, C., Dimas, K. (2002).

Bioactive sequiterpene lactones from Centaurea species and their

cytotoxic/cytostatic activity against human cell lines in vitro, Planta Med ,

68(7) : 649-52

40. Lanza, A.M.D., Martinez, M.J.A., Matellano, L.F., Carretero, C.R., Castillo,

L.V., Sen, A.M.S., Benito, P.B. (2001). Lignan and phenylpropanoid

glycosides from Phillyrea latifolia and their in vitro anti-inflammatory

activity, Planta Med , 67(3) : 219-23

41. Lee, S.H., Ryu, J.K., Lee, K.Y., Woo, S.M., Park, J.K., Yoo, J.W. ,Kim, Y.T.,

Yoon, Y.B. (2008). Enhanced anti-tumor effect of combination therapy with

gemcitabine and apigenin in pancreatic cancer Cancer Letters, 259 : 39-49

42. Litvinenko, V.I., Bubenchikova, V.N. (1988). Phytochemical study of

Centaurea cyanus , Khim Pri Soedi , 6: 792-5

43. Liu, A.L., Liu, B, Qin, H.L., Lee, S.M.Y., Wang, Y.T., Du, G.H. (2008) Anti-

influenza virus activities of flavonoids from the medicinal plant Elsholtzia

rugulosa , Planta Med, 74(8) : 847-851

44. Ma, X.,Li, Y.F., Gao, Q., Ye, Z.G., Lu, X.J., Wang, H.P., Jiang, H.D., Bruce,

I.C., Xia, Q. (2008) Inhibition of superoxide anion-mediated impairment of

endothelium by treatment with luteolin and apigenin in rat mesenteric artery,

Life Sci 83 : 110-117

45. Medjroubi, K., Benayache, F., Bermejo, J. (2005). Sesquiterpene lactones

from Centaurea musimomum : Antiplasmodial and cytotoxic activities,

Fitoterapia, 76 : 744-6

46. Mencherini, T., Cau, A., Bianco, G., Della Loggia, R., Aquino, RP., Autore,

G. (2007) An extract of Apium graveolens var. dulce leaves: structure of the

major constituent, apiin, and its anti-inflammatory properties, J

Pharm&Pharmacol , 59(6) : 891-897

47. Middleton, M., Cox, P.J., Jaspars, M., Kumarasamy, Y., Nahar, L., Reid, R.,

Sarker, S.D. (2003). Dibenzylbutyrolactone lignans and indole alkaloids from

the seeds of Centaurea nigra (Asteraceae), Biochem Syst Ecol, 31(6): 653-6

48. Negrete, R.E., Backhouse, N., Cajigal, I., Delporte, C., Cassels, B.K.,

Breitmaier, B., Eckhardt, G. (1993). New antiinflammatory elemanolides

from Centaurea chilensis , J Ethnopharmacol , 40 : 149-53

49. Öksüz, S., Serin, S. (1997). Triterpenes of Centaurea ptosimopappoides,

Phytochemistry, 46(3) : 545-8

50. Özçelik, B., Gürbüz, ., Karao lu, T., Ye ilada, E. (2009). Antiviral and

antimicrobial activities of three sesquiterpene lactones from Centaurea

solstitialis L. subsp. solstitialis, Microbiological Res, 164(5) : 545-52

51. Sarker, S.D., Dinan, L., Sık, V., Rees, H.H. (1998). Moschatine: An unusual

steroidal glycoside from Centaurea moschata, Phytochemistry, 48(6) : 1039-

52. Sarker, S.D., Laird, A., Nahar, L., Kumarasamy, Y., Jaspars, M. (2001).

Indole alkaloids from the seeds of Centaurea cyanus (Asteraceae),

Phytochemistry, 57 : 1273–6

53. Seçmen, Ö., Gemici, Y., Görk, G., Bekat, L., Leblebici, E. (1995). Tohumlu

Bitkiler Sistemati i, E.Ü. Fen Fakültesi Kitaplar Serisi, No:116, E.Ü.

Basımevi, Bornova-zmir

54. Sezik, E., Yesilada, E., Tabata, M., Honda, G., Takaishi, Y., Fujita, T.,

Tanaka, T., Takeda, Y. (1997). Traditional medicine in Turkey VIII. Folk

medicine in East Anatolia; Erzurum, Erzincan, A rı, Kars, I dır provinces,

Econ Bot, 51(3) : 195-211

55. Sezik, E., Yesilada, E., Honda, G., Takaishi, Y., Takeda, Y., Tanaka, T.

(2001). Traditional medicine in Turkey X. Folk medicine in Central Anatolia

J Ethnopharmacol, 75 : 95-115

56. Shoeb, M., Jaspars, M., MacManus, S.M., Mjinda, R.R.T., Sarker, S.D.

(2004). Epoxylignans from the seeds of Centaurea cyanus (Asteraceae),

Biochem Syst Ecol, 32 : 1201-4

57. Shoeb, M., Macmanus, S.M., Kumarasamy, Y., Jaspars, M., Nahar, L., Thoo-

Lin, PK., Nazemiyeh, H., Sarker, S.D. (2006). Americanin, a bioactive

dibenzylbutyrolactone lignan, from the seeds of Centaurea americana ,

Phytochemistry, 67(21) : 2370-5

58. Shoeb, M., Çelik, S., Nahar, L., MacManus, S.M., Kong-Thu-Lin, P., Jaspar,s

M., Sarker, S.D. (2007). Two salonitenolide derivatives from the aerial parts

of Centaurea gigantea inhibit the growth of colorectal cancer cells in vitro,

Nat Prod Com, 2(2) : 121-5

59. Shukla, S., Gupta, S. (2008). Apigenin-induced prostate cancer cell death is

initiated by reactive oxygen species and p53 activation, Free Rad Bio Med,

44 : 1833-1845

60. Takeda,, K., Osakabe, A., Saito, S., Furuyama, D., Tomita, A., Kojima, Y.,

Yamadera, M., Sakuta, M. (2005). Components of protocyanin, a blue

pigment from the blue flowers of Centaurea cyanus , Phytochemistry, 66(13) :

1607-13

61. Tekeli, Y., Sezgin, M. (2007). Centaurea carduiformis (Peygamber

çiçe i)’nin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi, SDÜ Fen Edebiyat Dergisi,

Fen Dergisi, 2(2) : 204-9

62. Tekeli, Y., Sezgin, M., Aktümsek, A. (2008). Antioxidant property of

Centaurea solstitialis L. from Konya, Turkey, Asian J Chem, 20(6) : 4831-5

63. Tesevic, V., Milosavljevic, S., Vajs, V., Janackovic, P., Popsavin, M. (2003).

Ditiophenes and other constituents of roots of Centaurea nicolai, Biochem

Syst Ecol, 31(1) : 89-90

64. Uysal, ., Çelik, S., Oldaçay, M. (2005) Antibacterial activity of Centaurea

species having ethnobotanical features, Pakistan J Bio Sci, 8(12) : 1812-13

65. Uysal, T. (2008). Centaurea ertugruliana (Asteraceae), a new species from

Turkey, Ann Bot Fennici, 45 : 135-7

66. Wagenitz G., Flora of Turkey and the East Aegean Islands ,. ed: Davis P.H.,

Vol: 5, Edinburgh University Press, Edinburgh, (1975). Pp: 465-585.

67. Wu L., Effect of chlorogenic acid on antioxidant activity of Flos Lonicerae

extracts, J Zhejiang Univ Sci B, 8(9), 673-9 (2007).

68. Ye ilada E., Sezik E., Fujita T., Tanaka S., Tabata, M., Screening of some

Turkish medicinal plants for their anti-ulserogenic activities, Phytother Res,

7, 263-5, (1993).

69. Yoshikawa M., Tuemura, T.,Shimoda, H., Kishi, A., Kawahara, Y., Matsuda,

H., Medicinal foodstuffs. XVIII.1) phytoestrogens from the aerial part of

Petroselinum crispum MILL. (PARSLEY) and structures of 60-acetylapiin

and a new monoterpene glycoside, petroside, Chem Pharm Bull, 48(7), 1039-

1044 (2000).

ÖZGEÇM İŞ

2003 yılında ba ladı ım Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi’nden Eylül

2007’de mezun oldum. ubat 2008’de Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

Farmasötik Botanik Anabilim Dalı’nda yüksek lisans çalı malarıma ba ladım. u an

Bodrum Devlet Hastanesi Eczanesi’nde kamu eczacısı olarak çal maktayım.