Diversidade De Bactérias Causadoras De Podridão Mole Em Hortaliças No Estado De Pernambuco

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DE PERNAMBUCO EM FITOPATOLOGIA PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

Tese de Doutorado

Diversidade de bactérias causadoras de podridão mole em hortaliças no estado de Pernambuco

Alessandra Jackeline Guedes de Moraes

Recife – PE 2018

ALESSANDRA JACKELINE GUEDES DE MORAES

DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS CAUSADORAS DE PODRIDÃO MOLE EM HORTALIÇAS NO ESTADO DE PERNAMBUCO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Fitopatologia.

COMITÊ DE ORIENTAÇÃO:

Orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio Siqueira da Gama

Coorientador(a): Profª Drª Elineide Barbosa de Souza

Coorientador(a): Profª Drª Rosa de Lima Ramos Mariano

RECIFE-PE FEVEREIRO - 2018

DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS CAUSADORAS DE PODRIDÃO MOLE EM HORTALIÇAS NO ESTADO DE PERNAMBUCO

ALESSANDRA JACKELINE GUEDES DE MORAES

Tese defendia e aprovada pela Banca Examinadora em: 28/02/2014.

ORIENTADOR: ______Profº Dr. Marco Aurélio Siqueira da Gama (UFRPE)

EXAMINADORES(AS):

Dr. Alexandre Sandri Capucho (UNIVASF)

Dra. Anna Carolina Soares Almeida (UFRPE)

Dra. Rosa de Lima Ramos Mariano (UFRPE)

Dr. Sami Jorge Michereff (UFRPE)

RECIFE-PE FEVEREIRO-2018

Aos meus pais, Francisco e Marilene Moraes, pelo exemplo de vida, amor e dedicação. As minhas irmãs Gabriela e Markilene, meu cunhado Bruno, aos meus sobrinhos Carol, Beatriz, Leticia, Giovanna e Benjamim, pelo carinho, amor e incentivo.

OFEREÇO

Ao meu esposo Paulo, meus filhos Yohan, Lorena e Heitor, pelo incentivo, amor, paciência, e sobretudo por compreender a minha ausência. Ao meu anjo da guarda, Rosana Pinheiro, pela dedicação e carinho com a minha família. DEDICO V

AGRADECIMENTOS

A DEUS por ter me dado amor, perseverança, paciência e força para realizar mais esta etapa na minha vida. À Universidade Federal Rural de Pernambuco pelo apoio institucional, e a CAPES pela concessão da bolsa de estudo. Ao Professor Marco Gama pela orientação, dedicação, atenção e confiança depositada durante o doutorado. Às Professoras Elineide Barbosa de Souza e Rosa de Lima Ramos Mariano pelos ensinamentos, amizade, amor, confiança e por serem exemplos de vida, meus sinceros agradecimentos.

Ao Dr. Adriano Marcio Freire Silva pela amizade, ensinamentos e atenção despendida durante os trabalhos desenvolvidos. Aos professores do Programa de Pós-graduação em Fitopatologia (PPGF) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), pelos conhecimentos compartilhados. Aos funcionários da Área de Fitossanidade: Darci Martins e Romildo Angeiras, pela ajuda e amizade despendida ao longo do curso. À Heidi Lacerda, do Laboratório de Genética da Universidade Federal de Pernambuco pelo apoio, dedicação e amizade. Aos meus queridos amigos Iwanne Coelho, Jessica Silva, Gerusa Santos, Wilson Junior, Beatriz Cruz, Rayanne Morais, Luiz Lopes, Kledson Mendes, Moara Bandeira, Claudeana Souza. Joseane Castro e Bruno Brabo pela amizade, confiança e companheirismo. Aos meus companheiros do Laboratório de Fitobacteriologia da UFRPE: Edilaine Melo, Greecy Miriam, Ana Karolina Leite, Alba Suastes, Ana Dulce Botelho, Bárbara Ribeiro, Willams Oliveira, Gessyka Rodrigues, Lucas Pontes, Antônio Roberto Farias, Emanuel Feitosa, Leandro Silva, Leandro Velez e Pedro Rodrigues, por todos os momentos compartilhados dentro e fora do LAFIBAC, muito obrigado.

Ao senhor Luiz Coelho, pelo apoio durante os trabalhos desenvolvidos em casa de vegetação. A todos que participaram desta caminhada e contribuíram para a minha formação e realização deste estudo, meus sinceros agradecimentos.

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...... V RESUMO GERAL...... VIII GENERAL ABSTRACT ...... IX CAPÍTULO I...... 10 DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS CAUSADORAS DE PODRIDÃO MOLE EM HORTALIÇAS NO ESTADO DE PERNAMBUCO...... 11 INTRODUÇÃO GERAL 111 1. Importância das hortaliças...... 11 2. Podridão mole ...... 12 3. Enterobacteriaceas causadoras de podridão mole...... 14 4. Técnicas moleculares utilizadas para classificação de bactérias e identificação de bactérias...... 17 5. Estrutura genética de população...... 20 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 23 CAPÍTULO II Diversidade de bactérias pectinolíticas causadoras de podridão mole em hortaliças oriundas de diferentes zonas climáticas do Nordeste 38 brasileiro......

Resumo...... 39 Abstract...... 40 Material e Métodos...... 42 Resultados...... 44 Discussão...... 47 Conclusões...... 50 Agradecimentos...... 50 Referências...... 51 CAPÍTULO III First report of Pectobacterium aroidearum and Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis causing soft rot of Cucurbita pepo L. in Brazil...... 79 Referencias...... 80

VII

CAPÍTULO IV Estrutura genética de populações de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis obtidas de hortaliças cultivadas em diferentes zonas climáticas no estado de Pernambuco, Brasil...... 83 Resumo...... 83 Abstract...... 84 Materiais e Métodos...... 85 Resultados...... 89 Discussão...... 91 Conclusões...... 93 Agradecimentos...... 93 Referências...... 93 CONCLUSÕES GERAIS...... 109

VIII

RESUMO GERAL

A podridão mole é uma doença responsável por causar perdas significativas na produção de diversas plantas cultivadas. O presente trabalho teve como objetivos: i) identificar as bactérias causadoras de podridão mole em diferentes hortaliças no estado de Pernambuco por meio da região 16S rDNA e MLSA com os genes gapA, icdA, mdh, proA, gyrA, ropS, recA, dnaX, fusA e rplB e (ii) analisar a estrutura genética da população prevalente em Pernambuco (Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis) utilizando-se a técnica de rep-PCR. Por meio de análises de BLASTn da região 16S rDNA, foi observado que na coleção de 177 isolados, além de espécies e subespécies de Pectobacterium e Dickeya, outros gêneros como Enterobacter, Kluyvera, Klebsiella, Morganella, Providencia, Rahnella e Raoutella também estão associadas a podridão mole no estado de Pernambuco. Por meio da MLSA, 64 isolados foram identificados como P. carotovorum subsp. brasiliensis e 47 como P. aroidearum, demonstrando a prevalência dessas bactérias no estado. Observou-se elevada diversidade de gêneros e espécies da família Enterobacteriaceae causando podridão mole em hortaliças nas diferentes zonas climáticas do estado de Pernambuco. A alface é a hortaliça mais sucetível ao ataque das enterobactérias, incluindo bactérias que são patogênicos ao homem. Foi realizado o primeiro registro da ocorrência de podridão mole causada por P. carotovorum subsp. odoriferum, D. dadantii subsp. dadantii e D. zeae em alface, E. ludwigii, E. massiliensis e E. bugandensis em abobrinha, K. pneumoniae subsp. ozanae em alface, K. michiganensis em alface e repolho, M. morganii subsp. sibonii em couve-chinesa, R. inusitata em coentro japonês, R. terrigena em abobora e alface, L. amnigena em abobrinha e K. georgiana em alface, berinjela e pimentão. A análise da população de P. carotovorum subsp. brasiliensis (n = 64) revelou uma alta variabilidade, elevada riqueza de haplótipos e alta diversidade genética da população. Entretanto, foram observadas evidências de baixo fluxo gênico entre as subpopulações da Zona da Mata, Agreste e Sertão. Foi observada ausência de recombinação nas subpopulações, indicando que possivelmente a mutação tem sido o fenômeno causador da variabilidade genética observada na população estudada. Não houve diferenciação genética entre as subpopulações e a análise de variância molecular demonstrou que grande parte da variação ocorreu dentro das subpopulações.

Palavras-chave: identificação, MLSA, genotipagem, diversidade genética, REP-PCR.

GENERAL ABSTRACT

The soft rot disease is responsible for causing significant losses in the production of several crops around the world. Our objectives were: i) to identify the bacteria causing soft rot in different vegetables from different climatic zones (forest, intermiediary, semiarid) of the Pernambuco state by sequencing of the 16S rDNA region and multilocus sequence analysis (MLSA) with the genes gapA, icdA, mdh, proA, gyrA, ropS, recA, dnaX, fusA and rplB; (ii) to analyze the genetic structure of the population prevalent in the study (Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis) using rep-PCR analysis. BLASTn analysis of the 16S rDNA region showed that the collection of 177 isolates, in addition to species and subspecies of Pectobacterium and Dickeya, other genera such as Enterobacter, Kluyvera, Klebsiella, Morganella, Providencia, Rahnella and Raoutella are also associated with soft rot in the state of Pernambuco. Through the MLSA, 64 isolates were identified as P. carotovorum subsp. brasiliensis and 47 as P. aroidearum, demonstrating the prevalence of these bacteria in the state. It was observed high diversity of genera and species of the family Enterobacteriaceae causing soft rot in vegetables in the different climatic zones of the state of Pernambuco. Lettuce is the most susceptible vegetable to the attack of enterobacteria, including bacteria that are pathogenic to man. The first record of the occurrence of soft rot caused by P. carotovorum subsp. odoriferum, D. dadantii subsp. dadantii and D. zeae in lettuce, E. ludwigii, E. massiliensis and E. bugandensis in zucchini, K. pneumoniae subsp. ozone in lettuce, K. michiganensis in lettuce and cabbage, M. morganii subsp. sibonii in Chinese cabbage, R. inusitata in Japanese coriander, R. terrigena in pumpkin and lettuce, L. amnigena in zucchini and K. georgiana in lettuce, eggplant and peppers. Population analysis of P. carotovorum subsp. brasiliensis (n = 64) revealed high variability, high haplotype richness and high genetic diversity of the population. However, evidence of low gene flow was observed among the subpopulations of Zona da Mata, Agreste and Sertão. It was observed absence of recombination in the subpopulations, indicating that possibly the mutation has been the phenomenon that caused the genetic variability observed in the study population. There was no genetic differentiation between the subpopulations and the analysis of molecular variance showed that much of the variation occurred within the subpopulations.

Keys word: identification, MLSA, genotyping, genetic diversity, REP-PCR.

CAPÍTULO I INTRODUÇÃO GERAL

DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS CAUSADORAS DE PODRIDÃO MOLE EM HORTALIÇAS NO ESTADO DE PERNAMBUCO

INTRODUÇÃO GERAL

1. Importância das hortaliças

A produção de hortaliças é uma atividade agrícola extremamente importante no Brasil, destacando-se pelo fato de ser altamente intensiva, pois as culturas exigem mão de obra desde a semeadura até a comercialização, gerando empregos em toda cadeia produtiva (FILGUERIA, 2008). O setor é responsável por um PIB de mais de 6 bilhões de dólares e pela geração de cerca de 2 milhões de empregos, demostrando que a olericultura é uma atividade altamente rentável e de grande importância para a economia do país (CONFEDERAÇÃO DA AGRICULTURA DO BRASIL, 2017). No cenário nacional, as hortaliças são essenciais na alimentação diária, sendo produzidas centenas de espécies e variedades que asseguram sabor, cor, aroma e nutrição à mesa da população brasileira (CARVALHO et al., 2016). As principais hortaliças plantadas no país são alface alface (Lactuca sativa L.), abobrinha (Cucurbita pepo L.), abóbora (Cucurbita moschata Duch.), alho (Allium sativum L.), batata (Solanum tuberosum L.), beterraba (Beta vulgaris L.), cebola (Allium cepa L.), cenoura (Daucus carota L.), coentro (Coriandrum sativum L.), couve flor (Brassica oleracea var. botrytis L.), pimentão (Capsicum annum L.), tomate de mesa (Solanum lycopersicum L.) e tomate industrial (CONFEDERAÇÃO DA AGRICULTURA DO BRASIL, 2017). A região sudeste (São Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro), e região Sul (Paraná e Rio Grande do Sul) são a maiores produtoras e consumidoras de hortaliças do país. A região nordeste (Bahia, Ceará e Pernambuco) representa cerca de 5% da produção nacional, enquanto que a região centro-oeste (Goiás e o Distrito Federal) são responsáveis por 2% dessa produção (CARVALHO et al., 2016). O estado de Pernambuco está subdividido nas mesorregiões da Zona da Mata, Agreste e Sertão, as quais apresentam características peculiares de clima, condições pluviométricas, tipo de solo e agricultura (CONAB, 2016). A mesorregião da Zona da Mata caracteriza-se por apresentar umidade variando de 30 a 100%, com níveis de precipitação podendo ultrapassar 2500 mm por ano e temperaturas de 15 a 36ºC (APAC, 2017). Nessa mesorregião, a bacia do rio Natuba possui fertilidade e 12 condições climáticas adequadas para a produção de hortaliças, caracterizando-se como o principal centro de produção de hortaliças folhosas do Nordeste, atendendo ao mercado da região metropolitana do Recife e distribuindo para outras regiões do estado (BRAGA 1998; MIRANDA; ARAÚJO; SAMPAIO, 2014). Na mesorregião do Agreste, a umidade varia entre 10 e 100% e a precipitação varia de 300 a 1200 mm por ano, com temperaturas mais amenas, variando de 15 a 32ºC (APAC, 2017). A produção de hortaliças é desenvolvida por agricultores familiares e tem como características principais o uso intensivo de mão de obra (VIEIRA, 2011). Nessa mesorregião, o município de Camocim de São Félix se destaca pelo cultivo de hortaliças utilizando irrigação, principalmente para hortaliças como tomate, repolho (Brassica oleracea L. var. capitata) e pimentão (SILVA et al., 2001). Na mesorregião do Sertão, a umidade varia entre 5 e 90% e a precipitação varia de 400 a 800 mm por ano, com temperatura variando de 15 a 41ºC (APAC, 2017). Embora apresente condições semiáridas, o Sertão pernambucano consegue ser produtivo (CONAB, 2016). Essa mesorregião caracteriza-se pela produção de hortaliças de ciclo curto e os campos de produção localizam-se ao redor no município de Petrolina-PE (BARROSO, 2016). As hortaliças, de um modo geral, são afetadas por diversas doenças causadas por bactérias que podem limitar o desenvolvimento da cultura. Algumas dessas bactérias estão presentes em diversos hospedeiros, como é o caso das espécies dos gêneros Dickeya e Pectobacterium, as quais são responsáveis por causar sintomas de podridão mole, talo oco e canela preta em seus hospedeiros (AREMU; BABALOLA, 2015; BERIAM, 2007).

2. Podridão mole

A podridão mole é uma doença de ocorrência comum no Brasil e no mundo, afetando as hortaliças desde o campo até a fase de pós-colheita (KUROZAWA; PAVAN, 1997). Apresentam grande importância econômica em couve-chinesa (Brassica rapa L. subsp. pekinensis), alface, beterraba, couve comum, pimentão, repolho, tomate, entre outras. No estado de Pernambuco, em levantamento realizado em 2004 a podridão mole apresentou prevalência de 100% em cultivos de couve chinesa e 45,2% em alface (ALVARADO et al., 2011; SILVA, et al., 2007), confirmando esta importância. A doença é causada por bactérias pectinolíticas pertencentes à família Enterobacteriaceae, é responsável por causar perdas significativas na produção de diversas culturas ao redor do mundo (DESS et al., 2017; LEE et al., 2015). Esse sintoma é resultante da 13 dissolução de células e tecidos da planta hospedeira por enzimas pectinolíticas (pectinases), a saber: pectato liase (Pel), pectina liase (Pnl), pectina metil esterase (Pme) e pectina acetil esterase (Pae), que são importantes fatores de patogenicidade dessas bactérias (DESS et al., 2017; KADO, 2010). Essas enzimas são produzidas e exportadas por bactérias que apresentam a capacidade de causar maceração do tecido vegetal, resultando em colapso total da planta (AREMU; BABALOLA, 2015; KADO, 2010; LEE, et al., 2015; MARIANO et al., 2005). Além das enzimas pectinolíticas, as bactérias causadoras de podridão mole também produzem celulases e proteases. Tanto as enzimas pectinolíticas quanto as celulases são secretadas pelo sistema de secreção do tipo II (SSTII), enquanto as proteases são secretadas pelo sistema de secreção do tipo I (SSTI) (HYYTIÄINEN, 2005; KADO, 2010). Coletivamente, estas enzimas fornecem oligômeros na forma de oligossacáridos, açúcares simples, peptídeos e aminoácidos simples que podem ser importados e consumidos pelas bactérias (KADO, 2010). Os sintomas da podridão mole são pequenas lesões encharcadas que aumentam rapidamente e causam uma vasta maceração e apodrecimento do tecido parenquimatoso do órgão vegetal. Em alface e couve-chinesa, os sintomas ocorrem inicialmente na base da nervura das folhas que ficam em contato com o solo infestado. A maceração do tecido progride rapidamente para o caule principal, resultando no colapso de toda planta (REN et al., 2001). Em berinjelas, tomateiros e pimentões, a podridão mole pode ocorrer tanto nos frutos quanto no caule. Nos frutos, a doença ocorre na região do pedúnculo, sendo observadas depressões aquosas (AMORIM; REZENDE; BERGAMIN FILHO, 2012). Quando a penetração bacteriana ocorre por meio de ferimentos provocados por insetos (brocas e traças), o fruto apodrece e fica pendurado na planta, com o aspecto de uma pequena bolsa d’água (LOPES; QUEZADO- SOARES, 1997). Quando a doença ocorre no caule, os sintomas se iniciam nas bifurcações dos ramos, onde aparece um escurecimento externo. Ao pressionar a região escurecida, a mesma é facilmente esmagada devido à desidratação da medula, resultando no sintoma conhecido como “talo oco” (LOPES; QUEZADO-SOARES, 1997; AMORIM; REZENDE; BERGAMIN FILHO, 2012). O talo oco e canela preta podem ocorrer ao mesmo tempo em batata, tomate e pimentão, bem como em outras solanáceas. O sintoma da canela preta é consequência da colonização da casca com produção e acúmulo de melanina e de outros pigmentos escuros na base do caule (ROMEIRO, 2005). Frequentemente os tecidos apodrecidos atraem patógenos oportunistas que contribuem para a maceração do tecido, podendo produzir uma variedade de odores desagradáveis enquanto o patógeno primário continua sua invasão no tecido hospedeiro (BARRAS et al., 1994; KADO, 2010). 14

A podridão mole em hortaliças também ocorre na fase de pós-colheita, pois a bactéria penetra por ferimentos provocados durante as operações de colheita, embalagem e transporte (PEROBELOM, 2002). Essa doença apresenta-se bastante importante em regiões onde são realizados plantios sucessivos, principalmente durante verões chuvosos e quentes, bem como em locais onde há irrigação excessiva em conjunto com ferimentos e nutrição desequilibrada das plantas, principalmente com excesso de nitrogênio (KIMATI et al., 2005; PEROMBELON, 1992). Em solos ácidos e em condições de elevada temperatura e umidade, a podridão mole também se comporta como um fator limitante, principalmente na fase final de cultivo das hortaliças (MARINGONI, 1997). O manejo da podridão mole é difícil devido a elevada gama de hospedeiros, a capacidade de sobrevivência em restos de cultura no solo (REN et al., 2001) e a alta variabilidade genética das bactérias pectinolíticas (FÉLIX, 2012). Além disso, uma vez que os sintomas da doença se desenvolvem, não há métodos de controle disponíveis (MOTYKA et al., 2017). Algumas medidas preventivas podem ser adotadas no manejo da doença, tais como utilizar sementes limpas e adequadamente tratadas, realizar o plantio em solos bem drenados ou em estufas com boa ventilação, utilizar água não contaminada, evitar a irrigação excessiva por aspersão, realizar rotações de cultura (preferencialmente com gramíneas durante no mínimo um ano), controlar as plantas daninhas, evitar ferimentos nas raízes durante o transplante, e realizar tratamento para o controle de nematoides e insetos do solo (MARIANO et al., 2005). Essas práticas culturais podem reduzir a incidência da doença, mas nem sempre são eficientes (PEROMBELON, 1992; REN et al., 2001).

3. Enterobacteriaceas causadoras de podridão mole

As bactérias causadoras de podridão mole pertencem ao domínio Bacteria, filo Proteobacteria (Cavalier; Smith, 2002), classe Gammaproteobacteria (Gariti; Bell; Lilburn, 2015), ordem Enterobacteriales, família Enterobacteriaceae (BRENNER; FARMER, 2015). A ordem Enterobacteriales é grande e diversa, caracterizando-se por abrigar bactérias Gram-negativas, facultativamente anaeróbicas, não formadoras de esporos, em forma de bastonetes, com flagelos peritríquios. Os membros deste grupo habitam distintos nichos ecológicos e são comumente encontrados no solo, na água e em associação com organismos vivos, incluindo plantas, insetos, animais e seres humanos (BRENNER; FARMER, 2005). Nessa ordem destaca-se a família Enterobacteriaceae, a qual abriga 28 gêneros e 75 espécies 15 validamente publicadas (CROXEN e FINLAY, 2010; LIVERMORE, 2012; TZOUVELEKIS et al., 2012). Alguns gêneros dessa família são bem definidos, como Salmonella Lignieres, Escherichia Castellani e Chalmers, Dickeya Samson et al., Pectobacterium Waldee e Brenneria Hauben et al., (SAMSON et al., 2005; HAUBEN et al., 1998; MAES; HUVENNE; MESSENS, 2011; ADELOU et al., 2016) e várias espécies são patógenos de seres humanos e animais, como Escherichia coli (Migula) Castellani e Chalmers, Salmonella enterica (Kauffmann e Edwards) Le Minor e Popoff e Yersinia pestis (Lehmann e Neumann) van Loghem, bem como causam doenças devastadoras em plantas de importância econômica como Dickeya dadantii subsp. dadantii Samson et al.., D. solani Van der wolf et al., Pectobacterium carotovorum Waldee, P. atrosepticum (van Hall 1902) Gardan et al., (MANSFIELD et al., 2012). Os gêneros Pectobacterium spp. e Dickeya spp. são responsáveis por causar perdas econômicas importantes em diferentes culturas, sendo conhecidas por apresentarem espécies que estão listadas entre as 10 bactérias fitopatogênicas mais destrutivas do mundo (MANSFIELD et al., 2012). As espécies desses gêneros foram inicialmente classificadas no gênero Erwinia Winslow et al., que por sua vez foi originalmente proposto por Winslow et al. (1917) para acolher bactérias fermentativas, com flagelos peritríquios, Gram negativas, que poderiam ser subdivididas em três grupos: Amylovora (espécies necrotróficas), Carotovora (espécies pectinolíticas causadoras de podridão mole) e Herbicola (isolados que apresentavam pigmentos amarelos, incluindo saprófitas). Em 1945, Waldee propôs a transferência das espécies pectinolíticas do grupo Carotovora para o gênero Pectobacterium Waldee (DYE, 1969; ROBBS, 1981). No entanto, essa proposta não foi aceita pelos fitobacteriologistas da época devido ao surgimento de espécies intermediárias entre Erwinia e Pectobacterium e pela descoberta de patógenos com características análogas às de Pectobacterium carotovorum (Jones) Hauben et al. (MARIANO et al., 2005). O reposicionamento das espécies de Erwinia foi realizado com base no sequenciamento da região 16S rDNA de 29 isolados representando espécies de Erwinia, Pantoea Gavini et al., e Enterobacter Hormaeche e Edwards, (HAUBEN et al., 1998). Os isolados foram separados em quatro grupos filogenéticos, sendo o primeiro grupo formado pelas “erwínias verdadeiras”: Erwinia amylovora (Burrill) Wislow et al., E. mallotivora Goto, E. persicinus Hao et al., E. psidii (Neto et al.,), E. rhapontici (Millard) Burkholder e E. tracheiphila (Smith) Bergey et al.; o segundo grupo formado pelas “erwínias pectinolíticas”: E. cacticida Alcorn et al., E. carotovora subsp. atroseptica (van Hall) Dye, E. carotovora subsp. betavascularum Thomson et al., E. carotovora subsp. carotovora (Jones) Bergey et al., E. carotovora subsp. odorifera (Gallois et al.), E. carotovora subsp. wasabiae Goto e Matsumoto, E. chrysanthemi Burkholder 16 et al. e E. cypripedii (Hori) Brenner et al., o terceiro grupo formado por E. alni Surico et al., E. nigrifluens Wilson et al., E. paradisiaca Fernandez-Borrero e Lopez-Duque, E. quercina Hildebrand e Schroth, E. rubrifaciens Wilson et al. e E. salicis (Day) Chester; e o quarto grupo formado por E. stewarti (Smith) Dye, E. ananatis (Serrano), E. milletiae (Kawakami e Yoshida) Magrou e E. herbicola (Lohnis). Ainda nesse estudo, as espécies pectinolíticas foram alocadas no gênero Pectobacterium Waldee, sendo classificadas como: P. cacticidium (Alcorn et al.) Hauben et al., P. carotovorum subsp. atrosepticum (van Hall) Gardan et al., P. carotovorum subsp. betavasculorum (Thomson et al.) Gardan et al., P. carotovorum subsp. carotovorum (van Hall) Hauben et al., P. carotovorum subsp. odoriferum (Gallois et al.) Hauben et al., P. carotovorum subsp. wasabiae (Goto and Matsumoto) Hauben et al., P. chrysanthemi (Burkholder et al.) Brenner et al., e P. cypripedii (Hori) Brenner et al. Uma segunda reclassificação foi proposta com base na analise de uma coleção de 42 isolados pertencentes às cinco subespécies de P. carotovorum (atrosepticum, betavasculorum, carotovorum, odoriferum e wasabiae) e onze isolados de P. chrysanthemi, P. cacticidium e Brenneria paradisiaca (Fernandez-Borrero e Lopez-Duque) Hauben et al., por meio de hibridização de DNA-DNA, características fenotípicas e sorológicas e análise filogenética da região 16S rDNA. Na ocasião foi proposta a elevação de P. atrosepticum, P. betavasculorum, P. wasabiae e P. odoriferum ao nível de espécie (GARDAN et al., 2003). Atualmente o gênero Pectobacterium, abriga nove espécies: P. aroidearum (NABHAN et al., 2013), P. atrosepticum, P. betavasculorum, P. wasabiae (GARDAN et al., 2003), P. cacticida (HAUBEN et al., 1998), P. parmentieri (KHAYI et al., 2016), P. carotovorum com as subespécies: P. carotovorum subsp. actinidiae (KHO et al., 2012), P. carotovorum subsp. brasiliensis (DUARTE et al., 2004), P. carotovorum subsp. carotovorum e P. carotovorum subsp. odoriferum (HAUBEN et al., 1998), P. peruviense (WARELON et al., 2017) e P. polaris (DESS et al., 2017). A criação do gênero Dickeya Samson et al., foi proposta com base na análise de uma coleção de 75 isolados de P. chrysanthemi, incluindo biovares, patovares e isolados tipos de B. paradisiaca e P. cypripedii por meio de estudos de hibridização DNA-DNA, taxonomia numérica de características fenotípicas, técnicas sorológicas e análise filogenética da região do 16S rDNA. Nesse estudo foi concluído que P. chrysanthemi e B. paradisiaca formavam um grupo diferente do gênero Pectobacterium e Brenneria, sendo transferidas para o novo gênero Dickeya como as espécies D. chrysanthemi (Burkholder et al.) Samson et al., D. dadantii Samson et al., D. dianthicola Samson et al., D. dieffenbachiae Samson et al., D. paradisiaca (Fernandez-Borrero e Lopez-Duque) Samson et al., e D. zeae Samson et al., (SAMSON et al., 17

2005). Posteriormente, com base em estudos envolvendo o sequenciamento do gene 16S rDNA e análise de sequências multilocus (MLSA) com os genes gyrB, rpoB, infB e atpD, uma reclassificação adicional foi realizada, resultando na transferência de D. dieffenbachiae como subespécie de D. dadantii (BRADY et al., 2012). Em seguida, isolados obtidos de batatas na Europa foram inicialmente classificados como Dickeya spp. biovar 3 (SLAWIAK et al., 2009) foram reclassificados como Dickeya solani van der Wolf et al., (VAN DER WOLF et al., 2014). Além disso, outros três isolados do Reino Unido e Finlândia foram classificados como representantes de uma nova espécie: Dickeya aquatica (PARKINSON et al., 2014). Atualmente o gênero Dickeya abriga oito espécies: D. dadantii, incluindo as subespécies dadantii e dieffenbachiae (SAMSON et al., 2005), D. chrysanthemi (BURKHOLDER et al., 1953), D. solani (VAN DER WOLF et al., 2014), D. aquatica (PARKINSON et al., 2014), D. dianthicola (SAMSON et al., 2005), D. paradisiaca (SAMSON et al., 2005), D. zeae (SAMSON et al., 2005) e, mais recentemente, D. fangzhongdai (Tian et al.), a qual foi relatada causando cancro em pereira (Pyrus pyrifolia Nakai) na China (TIAN et al., 2017). O gênero Enterobacter é um dos maiores gêneros da Enterobacteriaceae e abriga espécies que vivem em quase todos os habitats e apresentam espécies que já foram relatadas como agentes causais de podridão em cebolinha e em rizoma de gengibre (WHANG et al., 2008; SCHROEDER, 2009; ZHU et al., 2011; MOREIRA et al., 2013). Esse gênero historicamente é bastante complexo e atualmente inclui 19 espécies, as quais foram reclassificadas pela análise de sequências multilocus e hibridização DNA-DNA (KUHNERT et al., 2009). Adicionalmente, outro gênero recentemente criado, Lelliottia Brady et al., também apresenta espécies que foram relatadas causando podridão mole em bulbos de cebola na China (LIU et al., 2016). A taxonomia da família Enterobacteriaceae está longe de ser totalmente elucidada, uma vez que se trata de um grupo taxonômico confuso e complexo, com alta variabilidade, composto em sua maioria por bactérias que não apresentam especificidade de hospedeiro (AREMU; BABALOLA, 2015). Adicionalmente, outros estudos moleculares têm sido realizados para identificar e estudar a diversidade dessas bactérias (MA et al., 2007; MORETTI et al., 2016; NABHAN et al., 2012).

4. Técnicas moleculares utilizadas para classificação e identificação de bactérias

O sistema de classificação baseado em análises de características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas criou dúvidas e confusão a respeito da posição taxonômica de muitas 18 fitobactérias (PRAKASH et al., 2007; GEVRES et al., 2005). Entretanto, devido o avanço da biotecnologia, o uso de técnicas moleculares possibilitou uma maior resolução das relações entre esses micro-organismos (GLAESER e KAMPFER, 2015). Nesse sentido, a taxonomia bacteriana tem sido realizada por meio de um conjunto de técnicas como análises da sequência da região 16S do rDNA, estudos de hibridação DNA-DNA e técnicas integradas com vários marcadores moleculares (PRAKASH et al., 2007). A região 16S rDNA tem sido bastante utilizada como marcador universal para análise evolutiva básica de bactérias cultiváveis e não cultiváveis, por ocorrer de forma ubíqua em Bacteria e Archaea e por apresentar função indispensável na síntese proteica (GLAESER e KÄMPFER, 2015). Ao longo dos anos, essa ferramenta tornou-se padrão para determinar relações filogenéticas entre espécies bacterianas, incluindo as bactérias da família Enterobacteriaceae (HAUBEN et al., 1998; GARDAN et al., 2003; SAMSON et al., 2005; MASHAVHA, 2013). Além disso, devido ao aumento no número de sequências da região 16S rDNA disponíveis em bancos de dados públicos, a identificação de diversas fitobactérias ficou mais acessível (HAUBEN et al., 1998). A atual compreensão da filogenia dos membros da ordem Enterobacteriales é baseada principalmente no gene 16S rRNA (Fracino et al. 2006; Hauben et al. 1998; Naum et al. 2008), que é uma técnica muito sensível para detecção e discriminação de vários gêneros e algumas espécies, pois possui como vantagens ser um gene de cópia única, altamente conservado e de fácil amplificação (MA et al., 2007). Estudos realizados a partir do sequenciamento da região 16S rDNA possibilitaram a identificação de diversos grupos taxonômicos, como na Korea, quando 149 isolados de P. carotovorum subsp. brasiliensis provenientes de diversas hortaliças foram identificados por meio de sequenciamentos dessa região e do gene recA (LEE et al., 2014). Em outro estudo, as relações filogenéticas entre os grupos de Erwinia amylovora, P. betavasculorum, P. carotovorum, P. wasabiae, Dickeya spp., E. coli, Pantoea agglomerans (Ewing e Fife) Gavini et al. e Proteus vulgaris (Hauser) ( foram inferidas a partir do gene 16S rDNA, o qual foi capaz de separar as bactérias da família Enterobacteriaceae causadoras de podridão mole em único clado, separando-as das patogênicas a humanos e animais (KWON et al., 1997). Apesar de ser uma ferramenta frequentemente utilizada em estudos filogenéticos dos principais gêneros da família Enterobacteriaceae, a região 16S rDNA apresenta baixo poder de resolução para discriminação de organismos estreitamente relacionados (NABHAN, et al., 2012), como é o caso das enterobactérias. Nesse sentido, árvores filogenéticas baseadas nas 19 sequências dessa região mostraram que alguns gêneros da família Enterobacteriaceae apresentam-se fortemente relacionados e são polifiléticos (ALNAJAR; GUPTA, 2017). A investigação de relacionamentos filogenéticos entre organismos relacionados pode ser realizada por meio de análises de genes que codificam proteínas, os quais devem apresentar uma taxa de evolução lenta, mas constante (GLAESER; KÄMPFER, 2015). Nesse sentido, uma abordagem mais robusta e com maior poder de resolução na identificação e diferenciação de isolados de bactérias é a análise de sequências multilocus (MLSA). A técnica baseia-se na análise das sequências de nucleotídeos de vários genes conservados e essenciais para a manutenção de funções celulares básicas encontradas em qualquer organismo, denominados genes housekeeping (ALMEIDA et al., 2010). Na MLSA as sequências são comparadas por similaridade e, em adição, as análises filogenéticas são realizadas com bases em matrizes de similaridade ou diretamente a partir da sequência. Assim, a técnica de MLSA é mais adequada do que a região 16S rDNA para separação de espécies e subespécie bacterianas (PITMAN et al., 2010; NABHAN et al., 2011). A MLSA tornou-se uma ferramenta rápida e poderosa, frequentemente utilizada para inferir relações filogenéticas a níveis intra e interespecífico de bactérias estreitamente relacionadas (BRADY et al., 2008; LAI et al., 2014; MAIDEN, 2006). Além disso, essa técnica tem se mostrado um método rápido e eficaz em estudos de filogenia e taxonomia de diversas bactérias, entre elas as bactérias pectinolíticas (GLAESER; KÄMPFER, 2015; MA et al., 2007). Diversos genes housekeeping tem sido utilizados em MLSA para análise de bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae, tais como gyrA (subunidade alfa da DNA girase), gyrB (subunidade beta da DNA girase), rpoB (subunidade beta da RNA polimerase), rpoD (fator sigma da RNA polimerase), atpD (subunidade da ATP sintase), infB (fator de iniciação da tradução IF-2), recA (recombinase alfa), mdh (malato desidrogenase), proA (gama-glutamil fosfato redutase), gapA (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase subunidade alfa), icdA (isocitrato desidrogenase, específico para NADP +), mtlD (mannitol-1-fosfato desidrogenase), pgi (glucose-6-fosfato isomerase), fusA (fator de elongação G), rplB (50S ribossomal subunidade L2), dnaX (DNA polimerase III subunidade tau e gama), rpoS (RNA polimerase, fator sigma S - sigma 38), dnaN (DNA polimerase III, subunidade beta), purA (adenilosuccinato sintetase), os quais estão presentes em todos os membros dessa família (BRADY et al., 2008; MA et al., 2007; NABHAN et al., 2011; VAN DER WOLF, et al., 2014). A MLSA tem se caracterizado como uma importante ferramenta para inferir o relacionamento genético dentro dos gêneros Pectobacterium e Dickeya. A recomendação é que 20 o número mínimo de cinco genes housekeeping seja utilizado para superar qualquer divergência filogenética (ROSELLÓ-MÓRA e AMANN, 2015). Nesse sentido, os genes mais utilizados são acnA, gapA, icdA, mdh, mtlD, pgi e proA (MA et al., 2007; NABHAN, et al., 2012; WARELON, et al., 2013). Adicionalmente, análises realizadas com esses genes demonstraram que os gêneros Dickeya e Brenneria são mais diversificados do que o gênero Pectobacterium (MA et al., 2007).

5. Estrutura genética de populações

Define-se como estrutura genética a quantidade e distribuição da variação existente entre e dentro das populações, sendo resultante da interação entre as forças evolutivas mutação, migração, seleção, deriva e recombinação (MCDONALD; LINDE, 2002; NEI, 1973). A evolução está relacionada às mudanças na frequência alélica ou genotípicas em populações, em escalas de tempo relativamente curtas (MILGROOM, 2015). Logo, o conhecimento sobre a estrutura genética dá uma visão dos processos evolutivos que moldaram uma população no passado, oferecendo o conhecimento sobre o potencial evolutivo dessa população (MILGROOM, 2015). Por sua vez, o conhecimento sobre o potencial evolutivo de um patógeno pode ser útil para aprimorar o uso de genes de resistência, fungicidas e antibióticos, minimizando as perdas que resultam na redução de eficácia destes métodos de controle (MCDONALD; LINDE, 2002). Para avaliar a estrutura populacional de fitopatógenos, diversos marcadores genéticos podem ser utilizados, como rep-PCR, sequências simples repetitivas (SSR), sequências de nucleotídeos e isoenzimas, fornecem informações que possibilitam a avaliação da estrutura populacional de fitopatógenos (LEHNER, 2011).

A técnica de rep-PCR tem sido utilizada amplamente para caracterizar a diversidade genética, identificar isolados e em estudos de taxonomia (TRAVASOLI; MAREFA; HASSANZADEH, 2011; LEE, et al., 2014). Trata-se de uma ferramenta poderosa capaz de analisar genomas bacterianos e avaliar a diversidade de espécies e subespécies (LOUWS et al., 1999). Adicionalmente, a técnica de rep-PCR tem sido comumente utilizada em estudos de diversidade genética de diversas bactérias, caracterizando-se como sendo de fácil execução e de elevado poder de resolução (CZAJKOWSKI et al., 2015). Nessa técnica, primers correspondentes a sequências de DNA pertencentes a elementos altamente conservados, repetitivos e intercalados no genoma bacteriano são utilizados para amplificação por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os elementos repetitivos são chamados de elementos 21

BOX (Box elements - BOX), sequências extragênicas palindrômicas repetitivas (sequence repetitive extragenic palindromic – REP) e sequências repetitivas intergênicas consenso de enterobactérias (enterobacterial repetitive intergenic consensus - ERIC) e a técnica que emprega esses marcadores em conjunto é chamada de rep-PCR (LOUWS et al, 1994; LOUWS; RADEMAKER; DE BRUIJN, 1999; VERSALOVIC et al., 1994). Essa técnica tem se mostrado bastante confiável, reprodutível e altamente discriminatória em estudos de diversidade de P. carotovorum subsp. carotovorum (DANA, KHODAKARAMIAN, ROUHRAZI, 2015). No estudo de estrutura genética, geralmente um levantamento da diversidade genética em várias populações da espécie é realizado por meio de um conjunto de marcadores moleculares. Esses marcadores devem ser capazes de mostrar como a variabilidade está distribuída entre as populações, permitindo que inferências quanto aos padrões de cruzamentos e dispersão, fluxo gênico e histórico biogeográfico da espécie sejam realizados (SCHANABEL e AMAUD, 1998). Em estudos de populações de microrganismos faz-se necessário o emprego de índices de diversidade gênica e genotípica para estimar a diversidade genética (GRÜNWALD et al. 2003). A diversidade genotípica refere-se ao número e a frequência dos genótipos ou indivíduos geneticamente distintos em uma população, enquanto a diversidade gênica refere-se ao número e frequência de alelos em locos individuais numa população (MCDONALD; LINDE, 2002). De um modo geral, os marcadores moleculares podem ser utilizados para descrever a variabilidade genética de uma população por meio de índices de diversidade genética total (Ht); riqueza genotípica E(gn) inferida por meio de curvas de rarefação (Grunwald et al. 2003); o número de haplótipos, o índice de Simpson (Lambda) (HE e HU, 2005) e índice de Shannon- Wiener. Além disso, os marcadores também permitem a realização de várias análises da estrutura populacional por meio do cálculo da diferença genética interpopulacional (Fst),

índices de associação (IA), índice de associação alternativo rbarD (rd), análise discriminante de componentes principais (DAPC) (Jombart et al., 2010) e análise da variância molecular (AMOVA). O índice de diversidade gênica evidencia a distribuição da variabilidade genética dentro de populações subdivididas (NEI, 1973), enquanto o índice de equitabilidade E(gn) infere como os genótipos estão distribuídos nas populações. O desequilíbrio de ligação ou equilíbrio gamético pode ser testado pelo índice de associação IA (SMITH et al., 1993) e caracteriza-se como uma medida tradicional que calcula a distância entre todos os pares de indivíduos da população, ou seja, o número de locos em que eles diferem, comparando a variância dessas 22 distâncias com àquelas esperadas se não houvesse desequilíbrio gamético entre os pares de locos. O desequilíbrio gamético também pode ser estimado pelo índice de associação alternativo rbarD (rd), que é menos sensível à variação no número de locos, facilitando a comparações entre populações. Adicionalmente, valores de IA ou rbarD significativamente diferentes de zero indicam que a população está em desequilíbrio de ligação (AGAPOW; BURT, 2001).

A análise da estrutura genética é estimada por meio do FST ou pela AMOVA, pois ambos geram resultados semelhantes (NYBOM; BARTISH, 2000). O índice FST é um coeficiente que determina a diversidade relativa entre as subpopulações em relação à variância genética total da população (ALLENDORF; LUIKART; AITKEN, 2013), enquanto a AMOVA quantifica a diferenciação genética entre e dentro das populações, gerando estimativas dos componentes de variância que refletem a correlação da diversidade dos haplótipos em diferentes níveis de subdivisão hierárquica (EXCOFFIER et al., 2005). A análise discriminante de componentes principais (DAPC) é um método multivariado utilizado para identificar e descrever grupos de indivíduos geneticamente relacionados. É uma análise que permite caracterizar as populações subdivididas e visualizar as diferenças entre as mesmas, além de evidenciar a contribuição de alelos individuais para a estruturação da população (JOMBART et al., 2010). O conhecimento sobre a diversidade dos fitopatógenos tem aplicação direta na agricultura e na compreensão das relações fitopatógeno-hospedeiro, uma vez que a composição genética e a diversidade populacional desses fitopatógenos afeta diretamente o manejo das doenças (MILGROOM, 2015). Do ponto de vista evolutivo, a variabilidade genética das populações é importante, pois determina o potencial de adaptação do organismo às diferentes condições que o mesmo se encontra (MCDONALD; LINDE, 2002). Nesse sentido, as estratégias de manejo de doenças de plantas são dependentes da compreensão de fatores do fitopatógeno e de sua dinâmica populacional, uma vez que esses fatores revelam como as populações desenvolvem respostas a diferentes estratégias de controle, pois fitopatógenos com maior diversidade genética apresentam um maior risco de suplantar genes de resistência (ALFONSO, et al., 2000; MCDONALD e LINDE, 2002). Apesar da importância da podridão mole para a olericultura em Pernambuco, não existem estudos sobre a diversidade e variabilidade de populações de bactérias pectinolíticas no estado. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivos: (i) identificar as bactérias causadoras de podridão mole em diferentes hortaliças no estado de Pernambuco por meio da 23 região 16S rDNA e MLSA; e (ii) analisar a estrutura genética da população prevalente no estudo (P. carotovorum subsp. brasiliensis) por meio da técnica de rep-PCR.

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CAPÍTULO II DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS PECTINOLÍTICAS CAUSADORAS DE PODRIDÃO MOLE EM HORTALIÇAS CULTIVADAS EM DIFERENTES ZONAS CLIMÁTICAS DO NORDESTE BRASILEIRO Plant Disease

1 Diversidade de bactérias pectinolíticas causadoras de podridão mole em hortaliças 2 cultivadas em diferentes zonas climáticas do Nordeste brasileiro 3 4 Alessandra J. G. Moraes e Rosa L. R. Mariano, Departamento de Agronomia, Universidade 5 Federal Rural de Pernambuco, Recife, 52171-900, Pernambuco, Brasil; Elineide B. Souza, 6 Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 52171-900, 7 Pernambuco, Brasil; Adriano M. F. Silva e Ana R. Peixoto, Universidade Federal Rural de 8 Pernambuco, Recife, 52171-900, Pernambuco, Brasil; Valdir Q. Balbino e Heidi L. A. Cruz, 9 Departamento de Biologia, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 50670-901, 10 Pernambuco, Brasil. Marco A. S. Gama, † Departamento de Agronomia, Universidade Federal 11 Rural de Pernambuco, Recife, 52171-900, Pernambuco, Brasil. 12 13 14 Resumo 15 A podridão mole é considerada uma doença economicamente importante no Brasil e no 16 mundo, sendo relatada em todas as regiões agrícolas e em diversas plantas hospedeiras. O 17 presente estudo utilizou a região 16S rDNA e a técnica de análise de sequências multilocus 18 (MLSA) com os genes gapA, icdA, mdh, proA, gyrA, ropS, recA, dnaX, fusA e rplB para 19 identificar a diversidade de bactérias causadoras de podridão mole em hortaliças cultivadas em 20 diferentes zonas climáticas (Zona da Mata, Agreste e Sertão) do estado de Pernambuco. Com 21 base na região 16S rDNA, 177 isolados foram relacionados a gêneros da família 22 Enterobacteriaceae, a saber: Pectobacterium (114), Dickeya (15), Enterobacter (10), Kluyvera 23 (3), Klebsiella (8), Leliottia (1), Morganela (1) e Rahnella (3). Por meio de MLSA, 64 isolados 24 foram identificados como Pectobaterium carotovorum subsp. brasiliensis, 47 como P. 25 aroidearum, dois como Dickeya chrysanthemi, quatro como D. dadantii subsp. dadantii, um 26 como D. zeae; cinco como Enterobacter cloacae, cinco Enterobacter aerogenes três como 27 Kluyvera georgiana, quatro como Klebsiella oxytoca, quatro como Klebsiella pneumoniae, um 28 como Leliottia amnigena, um como Morganela morganii e um como Rahnella aquatilis. Foi 29 detectada elevada diversidade de gêneros e espécies da família Enterobacteriaceae causando 30 podridão mole em hortaliças nas diferentes zonas climáticas do estado de Pernambuco. A alface 31 é a hortaliça mais sucetível ao ataque das enterobactérias, incluindo bactérias que são 32 patogênicos ao homem. As espécies de P. carotovorum subsp. brasileinsis e P. aroidearum são 33 prevalentes nas mesorregiões estudadas.

† Autor para correspondência: Marco A.S. Gama; E-mail: [email protected] 40

34 Raoutella terrigena em abobora e alface, L. amnigena em abobrinha e K. georgiana em alface, 35 berinjela e pimentão. 36 37 38 Abstract 39 The soft rot is considered an economically important disease in Brazil and worldwide and has 40 been reported in all agricultural regions and in several host plants. We used the 16S rDNA 41 region and multilocus sequence analysis (MLSA) with the gapA, icdA, mdh, proA, gyrA, ropS, 42 recA, dnaX, fusA and rplB genes to identify the diversity of bacteria causing soft rot in 43 vegetables grown in different climatic zones (forest, intermediary zone and semiarid) in the 44 Pernambuco state. Based on the 16S rDNA region, 177 strains were related to different genera 45 of the Enterobacteriaceae family, namely Pectobacterium (114), Dickeya (15), Enterobacter 46 (10), Kluyvera (3), Klebsiella (8), Leliottia (1), Morganela (1) e Rahnella (3). Using MLSA, 47 64 strains were identified as Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, 47 as P. 48 aroidearum, two as Dickeya chrysanthemi, four as D. dadantii subsp. dadantii, one as D. zeae; 49 five as Enterobacter cloacae, five as E. aerogenes, three as Kluyvera georgiana, four as K. 50 oxytoca, two as Klebsiella pneumonia subsp. ozanae, two as K. michiganensis, one as Lelliottia 51 amnigena, one as Morganella morganii, and one as Rahnella aquatilis. We detected high 52 diversity of genera and species of the family Enterobacteriaceae causing soft rot in vegetables 53 in the different climatic zones of the state of Pernambuco. Lettuce is the most susceptible 54 vegetable to the attack of enterobacteria, including bacteria that are pathogenic to man. The 55 species of P. carotovorum subsp. Brasileinsis and P. aroidearum are prevalent in the 56 mesoregions studied. 57 58 59 A podridão mole é considerada uma doença economicamente importante no Brasil e no 60 mundo (Félix et al. 2014; Zhang et al. 2012), tendo sido relatada em todas as regiões agrícolas 61 e em diversas plantas hospedeiras (Ma et al. 2007). No estado de Pernambuco, a podridão mole 62 tem causado perdas consideráveis, principalmente sob condições de temperatura e umidade 63 elevada (Félix et al. 2014). Nesse contexto, levantamentos realizados em 2004 demonstraram 64 uma prevalência de podridão mole em 100% dos campos cultivados com couve-chinesa e em 65 45,2% dos campos cultivados com alface, evidenciando a importância da doença para essas 66 culturas (Silva et al. 2007). A doença pode ser causada por diferentes gêneros e espécies 67 pertencentes à família Enterobacteriaceae, a qual é formada por um grupo grande e diverso de

68 bactérias Gram-negativas, anaeróbicas facultativas, não formadoras de esporos e que habitam 69 diversos nichos ecológicos, podendo ser encontradas no solo, na água e causando doenças em 70 plantas, insetos, animais e no homem (Adeolu et al. 2016). 71 Diversos gêneros fitopatogênicos compõe a família Enterobacteriaceae, os quais 72 destacam-se por serem economicamente devastadores como Dickeya, Pectobacterium, 73 Brenneria, Erwinia e Pantoea, além de importantes patógenos humanos como Escherichia, 74 Klebsiella, Salmonella, entre outras. Os gêneros Pectobacterium spp. e Dickeya spp. tem 75 causado perdas econômicas em diferentes culturas, estão listadas entre as 10 bactérias 76 fitopatogênicas mais devastadoras do mundo (Mansfield et al. 2012). Essas bactérias possuem 77 distribuição global, afetando hortaliças tais como alface, beterraba, cebola, cenoura, couve- 78 chinesa, couve-flor, mandioquinha salsa, pimentão, repolho e tomate (Lopes e Henz 1998; 79 Pérombelon 2002). Além disso, a maioria dessas bactérias não tem especificidade, sendo 80 comum o isolamento de mais de uma espécie a partir de uma planta doente (Mariano et al. 81 2005). 82 A região 16S rDNA tem sido bastante utilizada para diferenciar gêneros bacterianos 83 (Brady et al. 2008) e em estudos filogenéticos dos gêneros e espécies da família 84 Enterobacteriaceae causadores de podridões moles em hortaliças (Gardan et al. 2003; Hauben 85 et al. 1998, Samson et al. 2005). No entanto, apesar de ser utilizada frequentemente nesses 86 estudos, a região 16S rDNA apresenta baixo poder de resolução para discriminação de 87 organismos estreitamente relacionados (Stanley 2006; Nabhan et al. 2012). Nesses casos, uma 88 resolução filogenética mais acurada pode ser obtida através da realização de análises 89 filogenéticas baseadas em genes que codificam proteínas (Glaeser e Kampfer 2015). 90 A técnica de análise de sequências multilocus (MLSA) baseia-se na análise das 91 sequências de nucleotídeos de vários genes housekeeping, os quais são conservados e essenciais 92 para a manutenção de funções celulares básicas encontradas em qualquer organismo (Almeida 93 et al. 2001; Marcelletti et al. 2010). Atualmente essa abordagem tem sido utilizada para estudos 94 taxonômicos e para identificação de procariotos, caracterizando-se como um método rápido e 95 eficiente para classificação e identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae (Young e 96 Park 2007; Brady et al. 2008). Adicionalmente, os genes housekeeping gapA (gliceraldeído-3- 97 fosfato-desidrogenase A), icdA (isocitrato desidrogenase, específica para NADP+), mdh 98 (malato desidrogenase), proA (gama glutamil fosfato redutase), gyrA (girase A), ropS (RNA 99 polimerase fator sigma RpoS), recA (recombinase A), dnaX (DNA polimerase subunidade 100 tau/gama), fusA (fator de elongação G) e rplB (proteína 50S ribossomal L2) têm sido

101 empregados extensamente no estudo dos organismos dessa família (Ma et al. 2007; Warelon et 102 al. 2008; Slawick et al. 2009; van der Wolf et al. 2014). 103 Em Pernambuco, estudos sobre a diversidade de bactérias que causam podridão mole 104 em hortaliças são inexistentes. Portanto, visto que o conhecimento da diversidade dessas 105 bactérias caracteriza-se como essencial para o desenvolvimento de estratégias de manejo da 106 doença (Czarjkowski et al. 2015; Perombelon 2002), o presente estudo utilizou a região 16S 107 rDNA e a técnica de MLSA com os genes gapA, icdA, mdh, proA, gyrA, ropS, recA, dnaX, fusA 108 e rplB para identificar a diversidade das bactérias causadoras de podridão mole em hortaliças 109 cultivadas em diferentes zonas climáticas do estado de Pernambuco. 110 111 Materiais e Métodos 112 Obtenção de isolados. Os isolados bacterianos foram obtidos a partir de hortaliças com 113 sintomas de podridão mole oriundas de plantios comerciais localizados em municípios da Zona 114 da Mata, Agreste e Sertão de Pernambuco (Tabela 1). A identificação preliminar dos isolados 115 foi realizada em meio CPG (1 g caseína hidrolisada, 10 g peptona, 10 g glicose, 18 g ágar, 116 completando-se o volume com água destilada esterilizada (ADE) até 1000 mL), no qual 117 colônias jovens (36-48 h) de bactérias pectinolíticas apresentaram aspecto de “vidro quebrado” 118 quando visualizadas em lupa sob iluminação oblíqua (Kelman e Dickey 1995). Após a 119 identificação preliminar, os isolados foram preservados em ADE e por liofilização e, em 120 seguida, armazenados na Coleção de Culturas Rosa Mariano (CCRM) do Laboratório de 121 Fitobacteriologia (LAFIBAC) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). 122 Testes de patogenicidade em batata, couve-chinesa e pimentão. Para testar a 123 patogenicidade a pimentão e batata, os isolados foram cultivados em meio CPG por 48 h a 124 temperatura de 28°C. Colônias bacterianas foram tocadas com auxílio de palito de dente 125 esterilizado, o qual foi fincado em pimentões e tubérculos de batata (Hyman et al. 2001). 126 Para a patogenicidade em couve-chinesa, foram utilizadas suspensões bacterianas 9 -1 127 [A570 = 0,36 (±1,0 x 10 UFC mL )] preparadas a partir do cultivo em meio CPG por 48 h a 128 temperatura de 28°C. As suspensões foram inoculadas pelo método de picada, que consistiu em 129 ferimento na nervura central da folha com alfinete entomológico a uma profundidade de 1 mm, 130 seguindo-se a deposição de 20 µL da suspensão bacteriana (Mariano et al. 2016). O controle do 131 experimento foi realizado com ADE. 132 Após as inoculações, as plantas, tubérculos e frutos foram submetidos à câmara úmida 133 por 6 h. As avaliações foram realizadas até 48 h após a inoculação.

134 Extração de DNA, condições de PCR e sequenciamento da região 16S rDNA. O 135 DNA dos isolados foi extraído com auxílio do kit Miniprep (Axigen Biosciences, USA) de 136 acordo com as recomendações do fabricante. O DNA foi quantificado usando BioDrop 137 (Cambridge, Reino Unido) e ajustado para concentração final de 10 ng/μl, sendo armazenado a 138 - 20° C. 139 Os isolados patogênicos ao pimentão, batata e couve-chinesa foram selecionados para 140 o sequenciamento da região 16S rDNA. Todas as amplificações de PCR foram compostas por 141 1X de Master Mix 2X (Promega,) (0,05 U/μL de Taq DNA polimerase, tampão de reação 4

142 Mm de MgCl2, 0,4 Mm de cada dNTP), 10 µM de cada primer e 100 ng de DNA. 143 A amplificação da região 16S rDNA foi realizada com os primers yf1 (5’-TGA TGG 144 AGG GGG ATA ACT ACT GGA-3’) e yr1 (5’-CCC CTA CGG TTA CCT TGT TAC GAC- 145 3’) (Hauben et al. 1998) em termociclador Tgradient (Biometra, Goettinggen, Alemanha) com 146 as seguintes etapas: desnaturação inicial a 94° C durante 4 minutos; 35 ciclos de 94° C durante 147 1 minuto, 63° C durante 1 minuto e 72° C durante 2 minutos; e extensão final a 72° C durante 148 7 minutos. As reações foram purificadas utilizando-se 5 μL do produto de PCR acrescidos de 149 3,8 μL de água ultrapura, 0,25 μL de fosfatase alcalina, 0,5 μL de tampão fosfatase alcalina, 150 0,125 μL de exonuclease e 0,5 μL de tampão exonuclease. As amostras foram postas em 151 termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95° C durante 3 min; 30 ciclos 152 de 94° C durante 0,5 min, 52° C durante 0,5 min e 72° C durante 1 min; e extensão final a 72° 153 C durante 6 min. Após a reação de purificação o sequenciamento foi conduzido em 154 sequenciador automatizado ABI3730 pertencente ao Laboratório de Bioinformática e Biologia 155 Evolutiva da Universidade Federal de Pernambuco (LABBE-UFPE). 156 Os isolados foram identificados com base na comparação das sequências de 157 nucleotídeos da região 16S rDNA com as sequências dos isolados tipo dos gêneros e espécies 158 disponíveis no banco de dados do GenBank (National Center for Biotechnology Information - 159 NCBI), usando o software BLASTn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Todas as sequências da 160 região 16S rDNA dos isolados utilizados nesse trabalho foram depositadas no GenBank. As 161 sequências dos isolados identificados como membros da mesma espécie foram utilizadas para 162 construção de redes de haplótipos utilizando-se o software DNASP v. 5.0 (Librado e Rozas 163 2009). 164 Construção de rede de haplótipos. Com base na identificação preliminar realizada por 165 meio da região 16S rDNA, os isolados foram separados em grupos de gêneros e espécies. Foram 166 construídas redes de haplótipos com os isolados do gênero Pectobacterium utilizando-se o gene 167 mdh, para os isolados de Dickeya utilizou-se o gene dnaX e para os demais gêneros e espécies

168 utilizou-se o gene rplB. A construção das redes de haplótipos foi realizada com auxilio do 169 software DNASP v. 5.0 (Librado e Rozas 2009) e, a partir dos dados gerados, os haplótipos de 170 cada espécie foram selecionados para as demais análises. 171 Análise de sequências multilocus. Foram utilizados conjuntos de genes específicos 172 para identificação das espécies de Pectobacterium (icdA, gapA, mdh, proA, recA), Dickeya 173 (dnaX, fusA, gyrA, recA, rplB e rpoS) e das demais espécies identificadas nos diferentes gêneros 174 (dnaX, icdA, gapA, mdh, proA e rplB) por meio do sequenciamento da região 16S rDNA. Os 175 primers utilizados e as condições de amplificação são descritos na Tabela 2. A purificação das 176 amostras e os sequenciamentos foram realizados conforme descrito anteriormente. 177 A análise das sequências de DNA e a montagem dos contigs foram realizadas com o 178 auxílio do Staden Package (Staden et al. 1998). As sequências de nucleotídeos foram 179 comparadas com as sequencias de isolados disponíveis no banco de dados do GenBank usando 180 o software BLASTn. As sequências de isolados tipos dos gêneros e espécies pertencentes à 181 família Enterobacteriaceae foram incluídos no alinhamento em todas analises e estão descritas 182 na Tabela 3. 183 Os alinhamentos das sequências foram realizados através do programa de alinhamento 184 múltiplo para sequências de aminoácidos ou nucleotídeos on-line, MAFFT versão 7 (Katoh e 185 Toh 2013). 186 Análises de Inferência Bayesiana (IB) foram realizadas com auxílio do Mr. Bayes v. 187 3.2.6 (Ronquist et al. 2012) implementado no CIPRES 188 (https://www.phylo.org/portal2/home.action) usando os melhores modelos de substituição de 189 nucleotídeos selecionados de acordo com Aikake’s Information Criterion (AIC) por meio do 190 Mr. Modeltest 2.3 (Nylander 2004), com 1.000.000.000 gerações de Monte Carlo Cadeia de 191 Markov (MCMC), sendo realizadas amostragem a cada 1000 e 10.000 gerações. As 192 probabilidades posteriores foram calculadas após o descarte das primeiras 25% gerações. Todas 193 as árvores obtidas a partir dos genes individuais e concatenados pelo método de IB foram 194 visualizadas com o programa Fig Tree 1.4.1. (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). 195 196 Resultados 197 Isolamentos e testes de patogenicidade. Foram obtidos um total de 676 isolados a 198 partir de tecidos apodrecidos de abobora, abobrinha, alface, berinjela, brócolis, cebola, couve- 199 chinesa, couve comum, pimentão, rabanete, repolho, rúcula e salsa cultivadas em municípios 200 da zona de mata, Agreste e Sertão de Pernambuco. Desses isolados, 177 apresentaram 201 capacidade de causar podridão mole em frutos pimentão, tubérculos de batata e folhas de couve-

202 chinesa. Foram obtidos 79 isolados da Zona da Mata, 55 do Agreste e 43 isolados do Sertão 203 (Tabela 1). 204 Região 16S rDNA. As sequências dos 177 isolados patogênicos a pimentão, batata e 205 couve-chinesa foram comparados com as sequências de nucleotídeos disponíveis no banco de 206 dados do GenBrank por meio da ferramenta BLASTn. Os isolados apresentaram entre 96 e 207 100% de identidade (Tabela 1) com os isolados tipo das espécies descritas a seguir, sendo 208 distribuídos nos gêneros Pectobacterium (64%), com 47 isolados identificados como P. 209 aroidearum, 10 isolados como Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, 64 como P. 210 carotovorum subsp. brasiliensis, e um como P. carotovorum subsp. actinidae; Dickeya (8,4%), 211 com oito isolados identificados como Dickeya chrisanthemi, quatro como D. dadantii subsp. 212 dadantii e um como D. zeae; Enterobacter (5,6%), com cinco isolados identificados como E. 213 cloacae e cinco como Enterobacter aerogens; Kluyvera (1,69%), com três isolados 214 identificados como Kluyvera georgiana; Klebsiella (4,5%), com quatro isolados identificados 215 como Klebsiella oxytoca e quatro como K. pneumoniae; Leliottia (0,5%), com um isolado 216 identificado como Leliottia amnigena; Morganella (0,5%), com um isolado identificado como 217 Morganella morganii e Rahnella (1,6%) com três isolados identificados como Rahnella 218 aquatilis (Figura 1). 219 Construção de rede de haplótipos. Por meio do gene mdh foram determinados quatro 220 haplótipos para P. carotovorum subsp. brasiliensis (CCRM64, CCRM66, CCRM162 e 221 CCRM185), oito para P. aroidearum (CCRM35, CCRM109, CCRM112, CCRM173, 222 CCRM178, CCRM508, CCRM637 e CCRM670), quatro para P. carotovorum subsp. 223 carotovorum (CCRM99, CCRM339, CCRM388 e CCRM628), dois para P. carotovorum 224 subsp. actinidae (CCRM15 e CCRM623). Por meio do gene dnaX foram determinados três 225 haplótipos para D. chrysanthemi (CCRM213, CCRM265 e CCRM654), um para D. zeae 226 (CCRM101), um para D. dadantii subsp. dadantii (CCRM101). Por meio do gene rplB foram 227 encontrados três haplótipos para E. cloacae (CCRM480,CCRM479 e CCRM490), três para E. 228 asburiae (CCRM485,CCRM635 e CCRM640), três para K. pneumoniae (CCRM 111, 229 CCRM117 e CCRM229), dois para K. oxytoca (CCRM234 e CCRM592), um para M. morganii 230 (CCRM44) e um para R. aquatilis (CCRM633). 231 Análise de sequências multilocus. A árvore filogenética construída para identificação 232 das espécies do gênero Pectobacterium por meio de IB com os genes gapA, icdA, madh, proA 233 e recA apresentaram topologias semelhantes tanto para os genes isoladamente quanto para 234 sequência concatenada. Os isolados CCRM15, CCRM64, CCRM66, CCRM162, CCRM185, 235 CCRM399, CCRM623 e CCRM628 foram relacionados ao clado de P. carotovorum subsp.

236 brasiliensis (IBSBF1692TS), o isolado CCRM339 foi identificado como P. carotovorum subsp. 237 odoriferum (LMG17566TS), os isolados CCRM35, CCRM178, CCRM388 e CCRM670 foram 238 agrupados no clado de P. aroidearum (KC20) e os isolados CCRM99, CCRM109, CCRM112, 239 CCRM173, CCRM508, CCRM637 e CCRM644 não se agruparam com nenhuma espécie de 240 Pectobacterium (Figura 2). 241 A árvore filogenética construída para identificação das espécies do gênero Dickeya (5 242 haplótipos) pelo método de IB com os genes dnaX, fusA, gyrA, recA, rplB e rpoS apresentaram 243 topologias semelhantes tanto para os genes isoladamente quanto para sequência concatenada. 244 Utilizando-se esses métodos foi observada a presença de 5 grupos bem definidos no gênero 245 Dickeya (Figura 3). O haplótipo CCRM250 foi relacionado com D. dadanti subsp. dadanti 246 (CFBP1269TS), os haplótipos CCRM213 e CCRM265 foram relacionados a D. chrysanthemi 247 (CFBP2048TS) e o isolado CCRM101 foi relacionado a D. zeae (CFBP2052TS). O isolado 248 CCRM654 não se agrupou com nenhuma espécie de Dickeya. 249 A árvore filogenética construída para identificação das espécies do gênero Enterobacter 250 (6 haplótipos) pelo método de IB com os genes dnaX, icdA, gapA, mdh, proA e rplB 251 apresentaram topologias semelhantes tanto para os genes isoladamente quanto para sequência 252 concatenada. Foi observada a presença de 5 grupos bem definidos no gênero Enterobacter 253 (Figura 4). Os haplótipos CCRM479, CCRM480, CCRM490 foram relacionados a E. mueller 254 (LMG28480TS), E. massiliensis (DSM26120) e E. ludwigii (DSM 16688TS), respectivamente, 255 enquanto os haplótipos CRM485, CRM635 e CRM640 não se relacionaram com nenhuma 256 espécie de Enterobacter. 257 A árvore filogenética construída para identificação das espécies do gênero Klebsiella (5 258 haplótipos) pelo método de IB com os genes dnaX, icdA, gapA, mdh, proA e rplB apresentaram 259 topologias semelhantes tanto para os genes isoladamente quanto para sequência concatenada. 260 Os haplótipos CCRM234 e CCRM592 se relacionaram com K. michiganensis (ATCCBAA- 261 2403TS), os isolados CCRM229 e CCRM111 se relacionaram com K. pneumoniae (ATCC 262 13883 TS) e o isolado CCRM117 não se relacionou com nenhuma espécie do gênero Klebsiella. 263 Foram construídas árvores filogenéticas com vários gêneros para alocar os isolados que 264 apresentaram um baixo número de indivíduos (Figura 5). A árvore filogenética construída pelo 265 método de IB com os genes dnaX, icdA, gapA, mdh, proA e rplB apresentaram topologias 266 semelhantes tanto para os genes isoladamente quanto para sequência concatenada. O isolado 267 CCRM40 foi relacionado à M. morganiii subsp. sibonii (ATCC49948TS), o isolado CCRM75 268 foi relacionado a P. vermicola (DMS 17385TS), o isolado CCRM633 foi relacionado a R. 269 inusitata (LMG2640TS), os isolados CCRM671 e CCRM 660 foram relacionados a R. terrigena

270 (ATCC 33257TS), o isolado CCRM491 foi relacionado a L. nimipressuralis e os isolados 271 CCRM156, CCRM636 e CCRM649 foram relacionados a K. georgiana (ATCC51603TS). 272 273 Discussão 274 Os 177 isolados utilizados no presente estudo foram patogênicos a pimentão, batata e 275 couve chinesa e incitaram os sintomas característicos de podridão mole em até 48 horas após a 276 inoculação. A patogenicidade a três hospedeiros distintos foi avaliada para selecionar isolados 277 comprovadamente patogênicos e capazes de causar podridão mole em diferentes hortaliças, 278 descartando a hipótese de utilização de patógenos oportunistas. 279 Devido a elevada diversidade de bactérias com capacidade de causar podridão mole 280 (Mariano et al. 2005), inicialmente foram realizadas análises da região 16S rDNA para 281 identificação preliminar dos gêneros presentes no estado de Pernambuco. O sequenciamento da 282 região 16S rDNA tem auxiliado na distinção entre diferentes grupos bacterianos (Patwardhan 283 et al. 2014), pois possui regiões variáveis e conservadas exclusivas de grupos filogenéticos 284 distintos (Chen et al. 1989; Pfister et al. 2003). Além disso, por se tratar de um gene presente 285 em todas as bactérias, sequências da região 16S rDNA de bactérias desconhecidas podem ser 286 comparadas com sequências de bactérias depositadas em bancos de dados (Clarridge 2004; 287 Patwardhan et al. 2014). Portanto, por meio de análises de BLASTn da região 16S rDNA, foi 288 observado que além de espécies e subespécies de Pectobacterium e Dickeya, espécies dos 289 gêneros, Enterobacter, Kluyvera, Klebsiella, Morganella, Providencia, Rahnella e Raoutella 290 estavam associados às hortaliças com podridão mole. De modo semelhante, a região 16S rDNA 291 foi utilizada para identificar isolados de Pectobacterium, Klebsiella, Serratia, Enterobacter e 292 Providencia causadores de podridão mole em orquídeas na Indonésia (Joko et al. 2014). 293 Após a utilização da região 16S rDNA para identificação dos gêneros dos isolados 294 analisados, a MLSA foi realizada para identificar acuradamente as espécies envolvidas com a 295 podridão mole nas diferentes zonas climáticas do estado de Pernambuco. A técnica de MLSA 296 realizada com os genes icdA, gapA, mdh, recA e proA (Ma et al. 2007) confirmou como P. 297 carotovorum subsp. brasiliensis os quatro haplótipos formados com base na região 16S rDNA 298 e representativos dos 64 isolados dessa bactéria. Esse resultado indica uma provável prevalência 299 de P. carotovorum subsp. brasiliensis em diferentes hortaliças no estado de Pernambuco. A 300 detecção dessa bactéria no estado é recente (Moraes et al. 2017) e contraria estudos anteriores 301 que atribuíram P. carotovorum subsp. carotovorum como a espécie prevalente no estado 302 (Alvarado et al. 2011, Félix, 2014, Silva, 2005).

303 A análise da região 16S rDNA dos isolados CCRM628 e CCRM388 indicou um maior 304 relacionamento com o isolado tipo de P. carotovorum subsp. carotovorum (ATCC15713TS), 305 assim como indicou um maior relacionamento do isolado CCRM15 com o isolado tipo de P. 306 carotovrum subsp. actinidae (KKH3TS). No entanto, as árvores de IB revelaram uma maior 307 aproximação desses isolados com o isolado tipo (IBSBF1692TM) de P. carotovorum subsp. 308 brasiliensis (CCRM15 e CCRM628) e de um isolado (KC20) de P. aroidearum (CCRM388). 309 Semelhantemente, o isolado CCRM339, oriundo de alface e identificado por meio da região 310 16S rDNA como P. carotovorum subsp. carotovorum, abrigou-se com o isolado tipo de P. 311 carotovorum subsp. odoriferum (LMG 17566TS). Essa bactéria foi identificada inicialmente 312 como agente causal de podridão mole em chicória na França, sendo posteriormente verificada 313 como agente causal de podridão mole em outros hospedeiros como cenoura e batata (Warelon 314 et al. 2014). Para o nosso conhecimento, esse é o primeiro relato de P. carotovorum subsp. 315 odoriferum causando podridão mole em alface no Brasil. 316 O isolado CCRM644, identificado previamente por meio da região 16S rDNA como 317 Pantoea, foi analisado junto com as espécies de Pectobacterium pelo fato dos sequenciamentos 318 com os genes gapA, icdA, mdh, proA e recA terem indicado que esse isolado foi mais 319 relacionado a P. aroidearum. Entretanto, não foi possível confirmar a identificação da espécie 320 do isolado CCRM 99 por meio da MLSA. Isto pode ter ocorrido pelo fato de P. carotovorum 321 apresentar-se como um grupo muito heterogêneo (Dess et al. 2017). 322 O gênero Dickeya engloba um grupo heterogêneo que pode ser delineado por meio de 323 MLSA utilizando-se sequencias dos genes dnaX, fusA, gyrA, recA, rplB e rpoS (van der Wolf 324 et al. 2014). Apenas quatro isolados do gênero Dickeya foram identificados, representando 325 2,8% dos isolados selecionados para esse estudo. Foram encontrados dois isolados de D. 326 chrysanthemi, um de D. zeae e um de D. dadantii subsp. dadantii, todos causando podridão 327 mole em alface. Os relacionamentos revelados pela análise de IB sugeriram que o isolado 328 CCRM250 pertence à espécie de D. dadanti subsp. dadanti, confirmando o resultado obtido a 329 partir da região 16 S rDNA. Essa espécie tem sido relatada causando podridão mole em uma 330 ampla gama de espécies de plantas incluindo konjac (Wei e Wei 2014), banana (Liu et al. 2016) 331 e batata (Delfan et al. 2015). Esse patogeno já foi relatado em diversos paises e é bastante 332 agressivo e desvastador, pricipalmente à cultura da batata (Perombelon 2002). Para o nosso 333 conhecimento, esse é o primeiro relato de D. dadantii subsp. dadantii causando podridão mole 334 em alface no estado de Pernambuco. 335 A análise de IB indicou que os isolados CCRM479, CCRM480, CCRM490, oriundos 336 de abobrinha e do Agreste, foram relacionados a E. bugandensis (LMG 28480 TS), E.

337 massiliensis (DSM 26120 TS), E. ludwigii (DSM 16688 TS), respectivamente, enquanto os 338 isolados CCRM485, CCRM640 e CCRM635 não se agruparam com nenhuma espécie do 339 gênero Enterobacter. Visto que o gênero Enterobacter apresenta elevada diversidade genética 340 e contém vários membros que formam complexos, a lista de espécies tem crescido 341 constantemente conforme novas espécies de Enterobacter tem sido identificadas (Lagier et al. 342 2013). Portanto, estudos polifásicos deverão ser desenvolvidos para verificar a possibilidade de 343 classificação dos isolados CCRM485, CCRM640 e CCRM 635 como espécies novas. 344 Diversas espécies de Enterobacter tem sido frequentemente isoladas de pacientes com 345 pneumonia ou infecções do trato urinário (Lagier et al. 2013; Humann et al. 2011). Contudo, E. 346 cloacae tem sido relatada causando podridão mole em cebola (Schroeder et al. 2010), gengibre 347 (Nishijima et al. 2004), mamão, macadamia (Humann et al. 2011) e pitaia (Masyahit et al. 348 2009). Moreira et al. (2013) detectaram E, cloacae em Minas Gerais causando podridão mole 349 em gengibre e verificaram que os isolados coletados apresentaram níveis elevados de 350 agressividade. A ocorrência de E. muelleri E. massiliensi e E. ludwigii causando podridão mole 351 em abobrinha, é o primeiro relato dessas bactérias causando podridão mole em Pernambuco. 352 As espécies do gênero Klebsiella são conhecidas por serem patogênicas ao homem 353 (Struve et al. 2004). A analise filogenética utilizando a IB alocaram os isolados CCRM234 e 354 CCRM592, oriundos de alface e da Zona da Mata, e de repolho no Agreste, respectivamente, 355 como K. michiganensis (ATCC BAA-2403TS) e os isolados CCRM 229 e CCRM111, ambos 356 oriundos de alface na Zona da Mata, como K. pneumoniae subsp. ozanae (LMG3113ST), a qual 357 é bem conhecida por causar doenças pulmonares e urinárias em seres humanos e animais 358 (Struve e Krogfelt 2008). K. pneumoniae subsp. pneumoniae foi relatada causando podridão 359 mole em cebola (Liu et al. 2015) e outras espécies de Klebsiella também já foram relatadas 360 causando doenças em plantas, como K. variicola, causando podridão mole em banana (Fan et 361 al. 2016) e K. oxytoca, causando podridão mole em rabanete, cebola e tomate (Al-Kharousi et 362 al. 2016). Para o nosso conhecimento, esse é o primeiro relato de K. michiganensis e K. 363 pneumoniae subsp. ozanae causando podridão mole em repolho e alface, respectivamente. 364 Morganella morganii tem sido encontrada comumente no meio ambiente e no trato 365 gastrintestinal de humanos, mamíferos e répteis (Janda et al. 1996) e até o presente momento 366 não existem relatos dessa espécie causando podridão mole em plantas. Contudo, a análise de 367 IB alocou o isolado CCRM44, o qual foi detectado causando podridão mole em couve chinesa 368 na mesorregião do Agreste, junto com a espécie M. morganii subsp. sibonii. Esse o primeiro 369 relato dessa espécie causando podridão mole em couve-chinesa no Brasil e no mundo.

370 As espécies do gênero Rahnella apresentam-se amplamente distribuída no meio 371 ambiente, podendo ser encontrada na água, solo, rizosfera de plantas cultivadas, no trato 372 intestinal de caracóis e ocasionalmente em alimentos e amostras clínicas humanas (Brady et al. 373 2014). A análise de IB relacionou o isolado CCRM633, oriundo de coentro japonês no Sertão, 374 como pertencente a espécie R. inusitata. Até o presente momento, não se tem relato dessa 375 bactéria causando podridão mole em plantas. Portanto, esse é o primeiro relato de R. inusitata 376 causando podridão em coentro no Brasil e no mundo. 377 O gênero Lelliottia foi proposto por Brady et al. e atualmente compreende duas espécies: 378 L. amnigena e L. nimipressuralis (Brady et al. 2013). Essas espécies têm sido encontradas na 379 água, produtos alimentares e tecidos vegetais, sendo L. nimipressuralis relatada como agente 380 causal de cancro em espécies florestais (Nowick et al. 2014). Por sua vez, L. amnigena também 381 foi relatada causando podridão mole em cebola durante a fase de pós-colheita na China (Liu et 382 al. 2016). Adicionalmente, os relacionamentos baseados nas análise de BI indicaram que o 383 isolado CCRM491, obtido de abobrinha e do Agreste, se relacionou com L. nimipressuralis, 384 sendo esse o primeiro relato dessa bactéria causando podridão mole em coentro no Brasil. 385 As espécies do gênero Kluyvera são encontradas no solo, água, frutas, vegetais e 386 produtos de origem animal. A ecologia das espécies desse gênero é variável, bem como o 387 potencial patogênico para homens, animais e plantas (Possuelo e Renne 2015). No presente 388 estudo, os relacionamentos baseados nas análises de IB indicaram que os isolados de oriundos 389 de pimentão na Zona da Mata (CCRM 156), e os isolados de alface (CCRM636) e berinjela 390 (CCRM649) oriundos do Sertão se relacionaram com K. georgiana (ATCC 51603). Para o 391 nosso conhecimento, esse é o primeiro relato de K. georgiana causando podridão mole em 392 pimentão, alface e berinjela. 393 394 Conclusões 395 Foi detectada elevada diversidade de gêneros e espécies da família Enterobacteriaceae 396 causando podridão mole em hortaliças nas diferentes zonas climáticas do estado de 397 Pernambuco. A alface é a hortaliça mais sucetível ao ataque das enterobactérias, incluindo 398 bactérias que são patogênicos ao homem. Os isolados de P. carotovorum subsp. brasileinsis e 399 P. aroidearum são as espécies prevalentes nas mesorregiões de Pernambuco. 400 401 Agradecimentos 402 À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior (CAPES) pela 403 concessão da bolsa de estudos de Alessandra Jackeline Guedes de Moraes.

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571 Nowicki, G., Barylski, J., Kujawa, N., Gozdzicka-Józefiak, A. 2014. Complete genome 572 sequence of Lelliottia podophage phD2B. Genome Announc. 2:6:1046. 573 574 Nylander, J. A. A. 2004. MrModeltest v2. Program distributed by the author. Evolutionary 575 Biology Centre, Uppsala University. 576 577 Patwardhan, A., Ray, S. and Roy, A.2004. Molecular Markers in Phylogenetic Studies-A 578 Review J. Phylogen. Evolution. Biol. 2:2. 579 580 Pérombelon, M.C.M. Potato diseases caused by soft rot Erwinias: overview of pathogenesis. 581 Plant Pathology, v. 51, 1-12. 2002. 582 583 Pfister P., Hobbie, S., Vicens, Q., Böttger, E.C., and Westhof. E. 2003. The molecular basis for 584 A-site mutations conferring aminoglycoside resistance: relationship between ribosomal 585 susceptibility and X-ray crystal structures. Chembiochem 4:1078-1088. 586 587 Possuelo, L. G., and Renner, J. D. P. 2015. Caracterização e identificação microbiológica de 588 Kruyvera sp. e Pantoea sp. J Infect. Control 4:2: 52-53 589 590 Ronquist, F., Teslenko, M., van de Mark, P., Ayres, D. L., Darling, A., Höhna, S., Larget, B., 591 Liu, L., Suchard, M. C., and Huelsenbeck, J. P. 2012. MrBayes 3.2: Efficient Bayesian 592 Phylogenetic Inference and Model Choice Across a Large Model Space Syst. Biol. 593 61:3:539-542. 594 595 Samson, R., Legendre, J. B., Christen, R., Fischer-Le Saux, M., Achouak, W. and Gardan, L. 596 2005. Transfer of Pectobacterium chrysanthemi (Burkholder et al. 1953) Brenner et al. 597 1973 and Brenneria paradisíaca to the genus Dickeya gen. nov. as Dickeya 598 chrysanthemi comb. nov. and Dickeya paradisiaca comb. nov. and delineation of four 599 novel species, Dickeya dadantii sp. nov., Dickeya dianthicola sp. nov., Dickeya 600 dieffenbachiae sp. nov. and Dickeya zeae sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol 55: 1415– 601 1427. 602 603 Silva., A. M. F. 2005. Levantamento da intesidade da podridão-mole da alface e couve-chinesa 604 nas regiões da mata e Agreste de Pernambuco e determinação do tamanho das amostras

605 para avaliação da incidencia da doença. Master Sciences, Universidade Federal Rural 606 de Pernambuco, UFRPE, Recife. 607 608 Silva, A. M. F., Mariano, R. L. R., Michereff, S. J., Silveira, E. B., and Medeiros, F. H. V. 2007. 609 Survey of the intensity of soft rot on lettuce and Chinese cabbage in Pernambuco. 610 Caatinga 20: 84- 93. 611 612 Sławiak, M., van Beckhoven, J.R.C.M., Speksnijder, A.G.C.L., Czajkowski, R. Grabe, G. 613 and van der Wolf, J.M. 2009. Biochemical and genetical analysis reveal a new clade 614 of biovar 3 Dickeya spp. strains isolated from potato in Europe Eur. J. Plant Pathol. 615 125:2: 245-261. 616 617 Somvanshi, V. S., Lang, E., Sträubler, B., Spröer, C., Schumann, P., Ganguly, S., Saxena, A. 618 K., and Stackebrandt. 2006. E. Providencia vermicola sp. nov., isolated from infective 619 juveniles of the entomopathogenic nematode Steinernema thermophilum. Int J Syst Evol 620 Microbiol. 56:629-633. 621 622 Staden, R., Beal, K. F.and Bonfield, J. K. 1998. The Staden Package. Bioinform. Met. Prot. 623 132: 384 115-130. 624 625 Staley, J.T. 2006. The bacterial species dilemma and the genomic-phylogenetic species concept 626 Philos. Trans. R. Soc. B. 361: 1899-1909. 627 628 Stamatakis, A., Hoover, P., and Rougemont, J. 2008. A rapid bootstrap algorithm for the 629 RaxML web servers Syst. Biol. 57:5: 758-771. 630 631 Stamatakis, A. 2014. RaxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of 632 large phylogenies Bioinformatics 30:9:1312-1313. 633 634 Van der Wolf, E. H., Nijhuius, M. J. Kowalewska, G. S., Saddler, G. S., Parkinson, N., 635 Elphinstone, J. G. Pritchard, L., Toth, I. K., Lojkowska, E., Potrykus, M., Waleron, 636 M., De Vos, P. Cleenwerck, I., Pirhonen, M., Garlant, L., Hélias, V., Pothier, J. 637 F., Pflüger, V., Duffy, B., Tsror, L., and Manulis, S. 2014. Dickeya solani sp. nov., a

638 pectinolytic plant-pathogenic bacterium isolated from potato (Solanum tuberosum) Int. 639 J. Syst. Evol. Microbiol., 64:768-774. 640 641 Waleron M., Waleron, K., Geider, K., and Lojkowska, E. 2008. Application of RFLP analysis 642 of recA, gyrA and rpoS gene fragments for rapid differentiation of Erwinia 643 amylovora from Erwinia strains isolated in Korea and Japan. Eur J Plant 644 Pathol. 121:161–172. 645 646 647 Young, J.M., and Park, D.C. 2007. Relationships of plant pathogenic enterobacteria based on 648 partial atpD, carA, and recA as individual and concatenated nucleotide and peptide 649 sequences Syst. Appl. Microbiol. 30: 343-354. 650 651 Zhang, J.X.; Lin, B.R.; Shen, H.F.; Pu, X.M. 2012. First report of bacterial soft rot of potato 652 caused by Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum in Guangdong, Province 653 of China. Plant Dis. 96: 1109. 654 655 Wei, J. F., and Wei, J. H. 2014. First report of bacterial soft rot of konnyaku caused by Dickeya 656 dadantii in China. Plant Dis. 98:5:682. 657 658 Schroeder, B. K., Waters, T. D., and du Toit, L. J. 2010. Evaluation of onion cultivars for 659 resistance to Enterobacter cloacae in storage. Plant. Dis. 94: 236-243. 660 661 Struve, C. and Krogfelt. 2004. Pathogenic potential of environmental Klebsiella 662 pneumoniae isolates Env. Mcrobiol. 6:584-590. 663 664 Struve, C., Bojer, M., and Krogfelt, K., A. 2008. Characterization of Klebsiella pneumoniae 665 type 1 fimbriae by detection of phase variation during colonization and infection and 666 impact on virulence Infect Immun. 76:9:4055-4065. 667 668 Waleron, M., Waleron, K., and Lojkowska, E. 2014. Characterization of Pectobacterium 669 carotovorum subsp. odoriferum causing soft rot of stored vegetables. Eur. J. Plant 670 Pathol. 139:457–469. 671

672 van der Wolf, J. M., Nijhuis, E. H., Kowalewska, M. J., Saddler, G. S., Parkinson, N., 673 Elphinstone, J. G., Pritchard, L., Toth, I. K., Lojkowska, E., Potrykus, M., Waleron, M., 674 de Vos P., Cleenwerck, I., Pirhonen, M., Garlant, L., Hélias, V., Pothier, J. F., Pflüger, 675 V., Duffy, B., Tsror, L., and Manulis, S. 2014. Dickeya solani sp. nov., a pectinolytic 676 plant pathogenic bacterium isolated from potato (Solanum tuberosum). Int. J. Syst. Evol. 677 Microbiol. 64:768-74. 678 679

680 Tabela 1. Relação de bactérias causadoras de podridão mole, obtidas dos principais municípios produtores de hortaliças de Pernambuco. BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMPCB 3 Camocim de São Félix Agreste Brócolis 99-Pcba 99-Pcb - - CCRMPCB15 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 99-Pcc 99-Pcc - - CCRMPCB18 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 100-Pcb 99-Pcb - - CCRMPA20 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 100-Pa CCRMPA23 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 96-Pa 99-Pa - - CCRMPA28 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 100-Pa 99-Pa - - CCRMPCB31 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 99-Pcb CCRMPA35 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 99-Pa 99-Pa - - CCRMPA36 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 96-Pa 99-Pa - - CCRMMM40 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 100-Mm - - 100-Mm CCRMPA44 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 99-Pa 99-Pa CCRMPA48 Camocim de São Félix Agreste Couve Chinesa 99-Pa CCRMPCB55 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb CCRMPCB56 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb 99-Pcb - - CCRMPCB60 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb CCRMPCB63 Vitória de Santo Antão Mata Rabanete 99-Pcb CCRMPCB64 Vitória de Santo Antão Mata Rabanete 99-Pcb 99-Pcb - - CCRMPCB66 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb 99-Pcb - - CCRME70 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Ec CCRMPCB72 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcb CCRMPR75 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pr CCRMPCB77 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb CCRMDZ80 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Dz CCRMCB82 Vitória de Santo Antão Mata Rabanete 99-Cb

Tabela 1. Continuação BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMPCC84 Vitória de Santo Antão Mata Rabanete 100- Pcc 99-Pcc - - CCRMPA92 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pa CCRMPCB95 Vitória de Santo Antão Mata Rabanete 100-Pcb 99-Pcb - - CCRMPCC99 Vitória de Santo Antão Mata Rabanete 99-Pcc 98-Pcc - - CCRMDZ101 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Dz - 99-Dz - CCRMPCC102 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcc CCRMPA104 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pa CCRMPA106 Chã Grande Mata Pimentão 99-Pa 99-Pa - - CCRMCF108 Chã Grande Mata Pimentão 97-Cf CCRMPA109 Chã Grande Mata Pimentão 99-Pa CCRMKP111 Chã Grande Mata Alface 99-Kp CCRMPA112 Chã Grande Mata Alface 99-Pa 99-Pa - - CCRMPCB113 Chã Grande Mata Alface 100-Pcb CCRMK117 Chã Grande Mata Alface 117-Kp CCRMPCB122 Chã Grande Mata Alface 99-Pcb CCRMPA124 Chã Grande Mata Alface 100-Pa 99-Pa - - CCRMPCB128 Chã Grande Mata Alface 99-Pcb CCRMPCB129 Chã Grande Mata Alface 99-Pcb CCRMPA131 Chã Grande Mata Pimentão 99-Pa CCRMPCC140 Chã Grande Mata Pimentão 99-Pcc CCRMDC150 Chã Grande Mata Pimentão 99-Dc - 98-Ds - CCRMKG156 Chã Grande Mata Pimentão 98-Kg - - 99-Kg CCRMPA157 Chã Grande Mata Abobrinha 100-Pa 99-Pa - - CCRMPA158 Chã Grande Mata Abobrinha 100-Pa

Tabela 1. Continuação BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMSM159 Chã Grande Mata Abobrinha 96-Sm CCRMPCB162 Chã Grande Mata Couve 99-Pcb 99-Pcb - - CCRMPCB168 Chã Grande Mata Couve 100-Pcb CCRMPA171 Chã Grande Mata Abobrinha 100-Pa CCRMPA172 Chã Grande Mata Abobrinha 99-Pa CCRMPA173 Chã Grande Mata Abobrinha 99-Pa 99-Pa - - CCRMPA174 Chã Grande Mata Abobrinha 100-Pa CCRMPA178 Chã Grande Mata Abobrinha 100-Pa 99-Pa - - CCRMPCB180 Chã Grande Mata Abobrinha 99-Pcb 99-Pcb - - CCRMPCB184 Chã Grande Mata Abobrinha 99-Pcb CCRMPCB185 Chã Grande Mata Abobrinha 100-Pcb 99-Pcb - - CCRMPCB192 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb CCRMPCC193 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcc CCRMPA195 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pa CCRMPCB196 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb CCRMPCB204 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb 99-Pcb - - CCRMDC213 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Dc - 99-Dc - CCRMPCB215 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcb CCRMPCB228 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb CCRMKP229 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Kp CCRMEEC232 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Ec CCRMKO234 Vitória de Santo Antão Mata Alface 98-Ko CCRMKO249 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Ko CCRMDD250 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Dd - 99-Dd -

Tabela 1. Continuação BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMDC265 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Dc - 99-Dc - CCRMDC266 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Dc CCRMPCB273 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Pcb CCRMPCC275 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcc CCRMKO286 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Ko CCRMPCB293 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcb CCRMPCB295 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcb CCRMPCC296 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcc CCRMPCB298 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Pcb CCRMDD299 Vitória de Santo Antão Mata Alface 100-Dd CCRMDD300 Vitória de Santo Antão Mata Alface 99-Dd CCRMPCB313 Garanhuns Agreste Alface 99-Pcb CCRMPCB317 Garanhuns Agreste Alface 100-Pcb CCRMPCB341 Garanhuns Agreste Alface 100-Pcb CCRMPCB347 Garanhuns Agreste Alface 99-Pcb CCRMPA350 Garanhuns Agreste Alface 98-Pa 99-Pa - - CCRMCF352 Garanhuns Agreste Alface 99-Cf CCRMPCB361 Garanhuns Agreste Alface 99-Pcb CCRMPCB362 Garanhuns Agreste Alface 100-Pcb CCRMPCC388 Garanhuns Agreste Tomate 99-Pcc 99-Pcc - - CCRMPCB389 Garanhuns Agreste Tomate 99-Pcb CCRMEA392 Garanhuns Agreste Tomate 100-Ea CCRMEA394 Bezerros Agreste Tomate 99-Ea CCRMPCB399 Bezerros Agreste Tomate 99-Pcb 99-Pcb - -

Tabela 1. Continuação BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMAA402 Bezerros Agreste Tomate 98-Ac CCRMPA429 Bezerros Agreste Pimentão 99-Pa 99-Pa - - CCRMPCB454 Bonito Agreste Abobrinha 100-Pcb 99-Pcb - - CCRMEC456 Bonito Agreste Abobrinha 99-Ec CCRMEC477 Bonito Agreste Abobrinha 97-Ec CCRMEC479 Bonito Agreste Abobrinha 96-Ec CCRMEC480 Bonito Agreste Abobrinha 99-Ec - - 98-Ea CCRMEL485 Bonito Agreste Abobrinha 99-Ea CCRMPCC489 Bonito Agreste Abobrinha 99-Pcb CCRMEC490 Bonito Agreste Abobrinha 99-Ec CCRMLA491 Bonito Agreste Abobrinha 100-La - - 99-La CCRMPCB494 Bonito Agreste Abobrinha 100-Pcb CCRMPCB495 Bonito Agreste Abobrinha 100-Pcb CCRMPCB496 Bonito Agreste Abobrinha 96-Pcb CCRMPA508 Bonito Agreste Abobrinha 99-Pa 99-Pa - - CCRMCF509 Bonito Agreste Abobrinha 99-Cf CCRMPCB518 Bonito Agreste Alface 100-Pcb CCRMEC520 Bonito Agreste Alface 99-Ec CCRMCF524 Bonito Agreste alface 98-Cf CCRMEL526 Bonito Agreste Alface 99-El 99-Pcc - - CCRMPCB535 Bonito Agreste Alface 97-Pcb CCRMPCB543 Bonito Agreste Alface 98-Pcc CCRMKO552 Gravatá Agreste Alface 99-Ko CCRMPCB558 Gravatá Agreste Alface 100-Pcb

Tabela 1. Continuação BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMPCB585 Gravatá Agreste Alface 99-Pcb CCRMPCB588 Gravatá Agreste Alface 99-Pcb CCRMKO592 Gravatá Agreste Repolho 99-Ko CCRMPCB596 Gravatá Agreste Repolho 99-Pcb CCRMPCB598 Gravatá Agreste Repolho 99-Pcb CCRMDZ614 Recife Metropolitana Cebola 99-Dz CCRMPCB616 Recife Metropolitana Cebola 100-Pcb CCRMPA617 Recife Metropolitana Cebola 100-Pa 99-Pa - - CCRMPCB588 Gravatá Agreste Alface 99-Pcb CCRMPA620 Petrolina Sertão Acelga 98-Pa 99-Pa - - CCRMPA621 Petrolina Sertão Pimentão 99-Pa CCRMPA622 Petrolina Sertão Alface 99-Pa 99-Pa - - CCRMPCA623 Petrolina Sertão Abobrinha 100-Pcb 99-Pcb - - CCRMPA624 Petrolina Sertão Couve 99-Pa CCRMPCB625 Petrolina Sertão Couve 99-Pcb CCRMPA626 Petrolina Sertão Salsa 96-Pa 99-Pa - - CCRMPCB627 Petrolina Sertão Couve 99-Pcb CCRMPCC628 Petrolina Sertão Alface 99-Pcc 99-Pcc - - CCRMPCB629 Petrolina Sertão Couve 99-Pcb CCRMPA630 Petrolina Sertão Beterraba 99-Pa 99-Pa - - CCRMPA631 Petrolina Sertão Berinjela 99-Pa 99-Pa - - CCRMPCB632 Petrolina Sertão Beterraba 100-Pcb CCRMRA633 Petrolina Sertão Coentro 98-Ra - - 99-Ri CCRMPCB634 Petrolina Sertão Cebola 100-Pcb

Tabela 1. Continuação BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMEA635 Petrolina Sertão Alface 100-Ea - - 98-Ea CCRMKG636 Petrolina Sertão Alface 98-Kg - - 99-Kg CCRMPA637 Petrolina Sertão Pimentão 99-Pa 99-Pa - - CCRMDC638 Petrolina Sertão Alface 99-Dc - 98-Dc - CCRMPA639 Petrolina Sertão Tomate 96-Pa 99-Pa - - CCRMEA640 Petrolina Sertão Coentro 99-Ea - - 99-Ea CCRMPA641 Petrolina Sertão Alface 99-Pa CCRMPCB642 Petrolina Sertão Couve 99-Pcb CCRMPCB643 Petrolina Sertão Rúcula 99-Pcb CCRMP644 Petrolina Sertão Couve 98-Pcc 99-Pcc - - CCRMPA645 Petrolina Sertão Alface 100-Pa CCRMPA646 Petrolina Sertão Pimentão 99-Pa CCRMPA647 Petrolina Sertão Beringela 99-Pa 99-Pa - - CCRMDD648 Petrolina Sertão Batata 99-Dd - 99-Dd - CCRMKG649 Petrolina Sertão Berinjela 99-Kg - - 99-Kg CCRMPA650 Petrolina Sertão Batata 100-Pa CCRMPCB651 Petrolina Sertão Couve 100-Pcb CCRMPA652 Petrolina Sertão Alface 99-Pa CCRMDC654 Petrolina Sertão Pimentão 98-Dc - 98-Dd - CCRMPA655 Petrolina Sertão Pimentão 99-Pa CCRMPCB656 Petrolina Sertão Couve 99-Pcb CCRMPA657 Petrolina Sertão Alface 100-Pa CCRMPA658 Petrolina Sertão Pimentão 99-Pa CCRMRT660 Petrolina Sertão Alface 98-Rt - - 99-Rt

Tabela 1. Continuação BLAST ISOLADO LOCAL DE COLETA MESORREGIÃO HOSPEDEIRO 16S rDNA % BLAST MDH BLAST DNAX BLAST RPLB CCRMPA666 Petrolina Sertão Melão 99-Pa 99-Pa - - CCRMPA670 Petrolina Sertão Pimentão 99-Pa CCRMRT671 Mocoto Agreste Alface 98-Rt - - 99-Rt CCRMPCB672 Petrolina Sertão Couve 100-Pcb 681 a Acetobacter aceti (Ac); Citrobcter braakii (Cb); Citrobacter freundi (Cf); D.chrysanthemi (Dc); Dickeya dadantii (Dd); Enterobacter asburiae (Ea); 682 Enterobacter cloacae (Ec); Enterobacter ludwigii (El); Klebsiella oxytoca (Ko); Kluyvera georgiana (Kg); Klebsiella pneumoniae (Kp); Leliotia amnigena (La); 683 Morganella morganii (Mm) Pantoeae sp. (Ps); Pectobacterium aroidearum (Pa); P.carotovorum subsp.actinidae (Pca); Pectobacterium carotovorum subsp. 684 brasiliense (Pcb); Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Pcc); Pectobacterium carotovorum subsp. odoriferum (Pco); Providencia rettgeri (Pr); 685 Rahnella aquatilis (Ra); Raottella terrigena (Rt) e Serratia macerans (Sm). 686 687 688 689 690 691 692 693 694 695 696 697 698 699 700

701 Tabela 2. Primers utilizados na amplificação de fragmentos de genes envolvidos na análise de sequência multilocus TAMANHO DA

NOME COMPLETO GENE SEQUÊNCIA REFERÊNCIA SEQUÊNCIA (PB) Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase gapA326F ATCTTCCTGACCGACGAAACTGC 450 Ma et al. 2007 subunidade alfa gapA845R ACGTCATCTTCGGTGTAACCCAG mdh86F CCCAGCTTCCTTCAGGTTCAGA Malato desidrogenase 460 Ma et al. 2007 mdh628R CTGCATTCTGAATACGTTTGGTCA Isocitrato desidrogenase, específico para icdA400F GGTGGTATCCGTTCTCTGAACG 520 Ma et al. 2007 NADP+ icdA977R TAGTCGCCGTTCAGGTTCATACA proAF1 CGGYAATGCGGTGATTCTGCG Gama glutamil fostato redutase 630 Ma et al. 2007 proAR1 GGGTACTGACCGCCACTTC Dna polimerase III subunidade tau e dnaxf TATCAGGTYCTTGCCCGTAAGTCC 403 Sławiak et al. 2009 gama dnaxr TCGACATCCARCGCYTTGAGATG recAf GGTAAAGGGTCTATCATGGG Recombinase alfa 730 Warelon et al. 2002 recAr CCTTCACCATACATAATTTGGA fusAf CACCGGTGTGAACCACAAAA van der Wolf et al. Fator de elongação G 314 fusAr TAGCCTTTCGGATTTGAGCC 2014 rplbf TTACGMCCTGAGCTGCACAAGG van der Wolf et al. 50S ribossomal subunidade L2 349 rplbr GCGGCGTACGATGAATTTATC 2014 RNA polimerase, fator sigma S - sigma rpoSf ATGAGCCAAAGTACGCTGAA 843 Warelon et al. 2002 38 rpoSr ACCTGAATCTGACGAACACG gyrAf AAATCGGCCGCCCGYATMAA Girase alfa 489 Warelon et al. 2002 gyrAr TCCACCGGTTCAGCVACRCG 702 703 704

705 Tabela 3. Sequências parciais dos genes gapA, icdA, mdh, recA, proA, dnaX, fusA, gyrA, rplB e rpoS de isolados de enterobactérias obtidos no GenBank.

CÓDIGOS NOME DA ESPECIE GAPA ICDA MDH RECA PROA DNAX FUSA GYRA RPLB RPOS

KC20 Pectobactrium aroidearum MF443742 MF443747 MF443744.1 - MF443743.1 - - - - -

SCRI1043 Pectobacterium atrosepticum EU340587 EF550736.1 EF550788 BX950851 EF550945.1 - - - - -

CFBP1526* Pectobacterium atrosepticum JN600350.1 JN600339 JN600342.1 DQ523478.1 KCQ16512 - - - - - Pectobacterium carotovorum KU510128.1 EF550943.1 IBSBF1692* subsp brasiliensis EF550681.1 EF550734.1 EF550786.1 - - - - - Pectobacterium carotovorum ATCC15713* subsp carotovorum CP001657 CP001657 CP001657 CP001657 CP001657 - - - - - Pectobacterium carotovorum subsp SCRI482 odorierum EU340589 EU340589 EU340589 EU340589 EU340589 - - - - -

ATCC43762* Pectobacterium betavasculorum FJ895843 FJ895844 FJ895845 FJ217089 FJ895847 - - - - -

CFBP8475* Pectobacterium pamentieri CP015749 CP015749 CP015749 CP015749 CP015749 - - - - -

ATCC 43316 P. wasabiae FJ895855 FJ895856 FJ895857 DQ859798 FJ895859 - - - - -

NCPPB4580* Dickeya aquatica - - - KT992696 - KT992716 KT992700 KY231141 KT992712 KY283824

CFBP2048* Dickeya chrisanthemi - - - KC844651 - FJ895859 KC844543 KC844597 KC844678 KC844705

CFBP1269* Dickeya dadantii subsp. dadantii - - - KC844652 - JX434940 KC844544 KC844598 KC844679 KC844706 Dickeya dadantii subsp. ICMP1568* dieffenbachiae - - - KC844655 - KC844493 KC844547 KC844601 KC844682 KC844709

CFBP1200 Dickeya dianthicola - - - NZ_CM001841 - JX434942 KC844540 KC844594 KC844675 KC844702

JS5* Dickeya fangzhongdai - - - KT992693 - KT992713 KT992697 CP025003 KT992709 CP025003

CFBP3699 Dickeya paradisiaca - - - KC844657 - KC844493 KC844549 KC844603 KC844684 KC844711

IPO2222* Dickeya solani - - - NZ_CP015137 - NZ_CP015137 NZ_CP015137 NZ_CP015137 NZ_CP015137 NZ_CP015137

IPO2276 Dickeya solani - - - KC844663 - KC844501 KC844555 KC844609 KC844636 KC844690

CFBP2052* Dickeya zeae - - - FJ216967 - KC844502 KC844550 KC844604 KC844685 KC844712

ATCC35953* Enterobacter asburiae CP011863 CP011863 CP011863 - CP011863 CP011863 - - CP011863 -

DSM29888* Enterobacter bugandensis NZ_FYBI01000044 NZ_POUR01000001 NZ_FYBI01000014 - NZ_FYBI01000050 LEDR01000020 - - NZ_FYBI01000053 -

CFBP416* Enterobacter cancerogenus JRUP01000008 JRUP01000018 GG704865 - NZ_POUR01000001 CP025225 - - GG704865 -

ATCC13047* Enterobacter cloacae CP017475 CP011798 CP017475 - CP017475 CP017475 - - CP017475 -

ATCC23373* E. cloacae subsp. dissolvens LVUS01000012 LEDR01000002 LVUS01000045 - CP003678 LEDR01000020 - - CP003678 -

ATCC49162* Enterobacter hormaechei CP011662 CP011662 CP011662 - NIBR01000001 NIBR01000001 - - CP011662 -

CIP103441* E.hormaechei subsp.hormaechei NZ_MKEQ01000001 NZ_CP010377 CP010377 - NZ_CP010377 MKEQ01000001 - - CP010377 -

Tabela 3. Continuação

COLEÇÃO NOME DA ESPECIE gapA icdA mdh recA proA dnaX fusA gyrA rplB rpoS E.hormaechei subsp. ATCC23373* steigerwaltii CP012167 CP012167 CP012167 - CP012167 CP012167 - - CP012167 -

ATCCBAA260* Enterobacter kobei MKEQ01000001 CP017181 FKLS01000001 - NZ_HE578949 CP017181 - - FKLS01000001 -

DSM16688* Enterobacter ludwigii JTLO01000001 JTLO01000001 JTLO01000001 - JTLO01000001 JTLO01000001 - - JTLO01000001 -

DSM26120* Enterobacter massiliensis NZ_HE578945 NZ_HE578949 NZ_HE578946 - NZ_HE578949 NZ_HE578949 - - NZ_HE578948 -

LMG25706* Enterobacter mori NFZM01000027 NFZM01000008 NZ_GL890780 - NFZM01000014 NFZM01000009 - - NFZM01000085 -

LMG28480* Enterobacter muelleri NZ_FXLQ01000062 NZ_FXLQ01000034 NZ_FXLQ01000010 - NZ_FXLQ01000034 NZ_FXLQ01000034 - - NZ_FXLQ01000039 -

LMG27195* Enterobacter xiangfangensis LSTS01000020 NZ_FYBF01000064 LSTS01000020 - NZ_FYBF01000064 NZ_FYBF01000064 - - CP017183 -

ATCC13182* Klebsiella michiganensis CP008841 CP008841 CP008841 - CP008841 CP008841 - - CP008841 -

ATCC13182* Klebsiella oxytca CP011636 CP011636 CP011636 - CP011636 CP011636 - - CP011636 -

ATCC13883* Klebsiella pneumoniae FO834906 FO834906 FO834906 - FO834906 FO834906 - - FO834906 - Klebsiella pneumoniae subsp. LMG3113* ozaenae KU510247 NZ_JULI01000157 NZ_JULI01000157 - NZ_JULI01000157 NZ_JULI01000157 - - NZ_JULI01000157 - Klebsiella pneumoniae subsp. LMG2095* pneumoniae CP009208 CP009208 CP009208 - CP009208 CP009208 - - CP009208 - Klebsiella pneumoniae subsp. LMG3184* rhinoscleromatis FO203501 FO203501 FO203501 - FO203501 FO203501 - - FO203501 - Klebsiella quasipneumoniae DSM28211* subsp. quasipneumoniae CP014156 CP014156 CP014156 - CP014156 CP014156 - - CP014156 - Klebsiella quasipneumoniae DSM28212* subsp. similipneumoniae HG933782 FKLR01000045 CBZR010000026 - FKLR01000045 FKLR01000045 - - FKLR01000008 -

ATCCBAA830* Klebsiella varicola HG933780 KQ089631 KQ089631 - KQ089631 CXOY01000005 - - FLLH01000012 -

ATCC25830* Morganella morganii NZ_CP025933 NZ_CP025933 NZ_CP025933 - NZ_CP025933 NZ_CP025933 - - NZ_CP025933 - Morganella morganella subsp. ATCC49948* sibonii NZ_PDLE01000004 NZ_PDLE01000004 NZ_PDLE01000004 - NZ_PDLE01000004 NZ_PDLE01000004 - - NZ_PDLE01000004 -

LMG23374* Morganella psychrotolerans NZ_PDLE01000004 NZ_LZEW01000001 NZ_LZEY01000061 - NZ_LZEW01000023 - - - LZEY01000018 -

JCM 16940* Providencia burhodogranariea KB233222 KB233222 KB233222 - KB233222 KB233222 - - KB233222 -

ATCC33673* Providencia rustigianii GG703817 GG703819 NZ_GG703818 - ABXV02000042 GG703819 - - GG703823 -

ATCC29914* Providencia stuartii CP008920 CP008920 CP008920 - CP008920 CP008920 - - CP008920 -

LMG27717* Rahnella victoriana NZ_MAEN01000001 NZ_MAEN01000001 NZ_MAEN01000001 - NZ_MAEN01000001 NZ_MAEN01000001 - - NZ_MAEN01000001 -

ATCC31898* Raoultella ornithinolytica CP010557 CP010557 CP010557 - CP010557 CP010557 - - CP010557 -

ATCC33531* Raoultella planticola CP023877 CP023877 CP023877 - CP023877 CP023877 - - CP023877 -

Tabela 3. Continuação

COLEÇÃO NOME DA ESPECIE gapA icdA mdh recA proA dnaX fusA gyrA rplB rpoS

ATCC33257* Raoultella terrigena NZ_LANE01000007 MUBF01000001 NZ_LANE01000007 - MUBF01000001 MUBF01000001 - - NZ_LANE01000004 -

ATCC33072* Lelliottia amingena CP015774 CP015774 CP015774 - CP015774 CP015774 - - CP015774 -

ATCC9912* Lelliottia nimipressuralis MKER01000005 MKER01000005 MKER01000015 - NZ_MKER01000017 NZ_LANE01000004 - - MKER01000009 -

ATCC33435* Kluyvera cryocrescens NZ_LGHZ01000038 NZ_LGHZ01000003 NZ_LGHZ01000004 - NZ_LGHZ01000024 NZ_LGHZ01000018 - - NZ_LGHZ01000033 -

ATCC51603* Kluyvera georgiana CP022114 CP022114 CP022114 - CP022114 CP022114 - - CP022114 -

ATCC29281* Brenneria quercina NZ_CM001230 NZ_CM001230 NZ_CM001230 - NZ_CM001230 NZ_CM001230 - - NZ_CM001230 -

NCPPB1846 Pantoea ananatis CP001875 CP001875 CP001875 - CP001875 CP001875 - - CP001875 - 706 *Isolados tipo 707 708 709 710 711 712 713 714 715 716 717 718 719 720 721 722 723

724

64% 70

20 8,4% 4,5% 5,6% 2,8% 10 1,69% 1,6% 1,12% 0,5% 0,5%

725 726 Fig. 1. Identificação por meios da região 16S rDNA da coleção de 177 isolados oriundas de hortaliças com sintoma de podridão mole das mesorregiões da Zona da mata, Agreste 727 e Sertão de Pernambuco.

728 729 730 731 732 733 734 735 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747 748 749 750 751 752 753 754 755 756 757 758 759 760 761 762 763 764 Fig. 2. Árvore filogenética construída por meio de Inferência Baysiana a partir das sequências parciais 765 dos genes gapA, icdA, mdh, proA, e recA. O posicionamento dos isolados obtidos no presente estudo no 766 gênero Pectobacterium é mostrado. A barra indica o número de substituições por sítio. Os valores dos 767 ramos indicam valores de probabilidade posterior. 768

769 770 771 772 773 774 775 776 777 778 779 780 781 782 783 784 785 786 787 788 789 790 791 792 793 794 795 796 797 798 799 800 Fig. 3. Árvore filogenética construída por meio de Inferência Baysiana a partir das sequências parciais 801 dos genes dnaX, fusA gyrA, recA, rplB e rpoS. O posicionamento dos isolados obtidos no presente estudo 802 no gênero Dickeya é mostrado. A barra indica o número de substituições por sítio. Os valores dos ramos 803 indicam valores de probabilidade posterior. 804 805 806 807 808 809

810 811 812 813 814 815 816 817 818 819 820 821 822 823 824 825 826 827 828 829 830 831 832 833 834 835 836 837 838 839 840 841 Fig. 4. Árvore filogenética construída por meio de inferência Baysiana a partir das sequências parciais

842 dos genes dnaX, gapA, icdA, mdh, proA e rplB. O posicionamento dos isolados obtidos no presente estudo 843 no gênero Enterobacter é mostrado. A barra indica o número de substituições por sítio. Os valores dos 844 ramos indicam valores de probabilidade posterior. 845 846 847 848 849 850

851 852 853 854 855 856 857 858 859 860 861 862 863 864 865 866 867 868 869 870 871 872 873 874 875 876 877 878 879 880 881 882 Fig. 5. Árvore filogenética construída por meio de Inferencia Baysiana a partir das sequências parciais 883 dos genes dnaX, gapA, icdA, mdh, proA e rplB. O posicionamento dos isolados obtidos no presente 884 estudo no gênero Klebsiella é mostrado. A barra indica o número de substituições por sítio. Os valores 885 dos ramos indicam valores de probabilidade posterior. 886 887 888 889 890 891

892 893 894 895 896 897 898 899 900 901 902 903 904 905 906 907 908 909 910 911 912 913 914 915 916 917 918 919 920 921 Fig. 6. Árvore filogenética construída por meio de Inferencia Baysiana a partir das sequências parciais 922 dos genes dnaX, gapA, icdA, mdh, proA, e rplB. O posicionamento dos isolados obtidos no presente estudo 923 dos gêneros de Morganella, Kluyvera, Providencia, Rahnella e Raoutella é mostrado. A barra indica o 924 número de substituições por sítio. Os valores dos ramos indicam valores de probabilidade posterior.

CAPÍTULO III FIRST REPORT OF Pectobacterium aroidearum AND Pectobacterium carotovorum SUBSP. brasiliensis CAUSING SOFT ROT OF CUCURBITA PEPO L. IN BRAZIL Plant Disease Note

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80

81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 Fig. 1. Phylogenetic tree constructed by means of Baysian Inference from the partial sequences of the 16s rDNA 94 gene. The positioning of the isolates obtained in the present study of the genus Pectobacterium is shown. The 95 values of the branches indicate posterior probability. 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117

CAPÍTULO IV ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis OBTIDA DE HORTALIÇAS CULTIVADAS EM DIFERENTES ZONAS CLIMÁTICAS NO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL Plant Disease

1 Estrutura genética de populações de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis 2 obtidas de hortaliças cultivadas em diferentes zonas climáticas no estado de 3 Pernambuco, Brasil 4 5 Alessandra J. G. Moraes e Rosa L. R. Mariano, Departamento de Agronomia, Universidade 6 Federal Rural de Pernambuco, Recife, 52171-900, Pernambuco, Brasil; E. B. Souza, 7 Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 52171-900, 8 Pernambuco, Brasil; Valdir Q. Balbino, Departamento de Biologia, Universidade Federal de 9 Pernambuco, Recife, 50670-901, Pernambuco, Brasil; A. M. F. Silva, B. Ribeiro, C. C. Souza 10 e M. A. S. Gama,† Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, 11 Recife, 52171-900, Pernambuco, Brasil. 12 13 14 Resumo 15 A podridão mole é uma doença de ocorrência generalizada, responsável por causar perdas em 16 diversas culturas olerícolas no Brasil e no mundo. Uma coleção de isolados de Pectobacterium 17 carotovorum subsp. brasiliensis oriundos de diferentes zonas climáticas do estado de 18 Pernambuco (Zona da Mata, Agreste e Sertão) foi formada para analisar a estrutura 19 populacional dessa bactéria. Todos os isolados (64) foram identificados por meio de 20 sequenciamentos da região 16S rDNA, do gene mdh e primers específicos Br1/f1, como P. 21 carotovorum subsp. brasiliensis. Com base no marcador REP-PCR, a população dessa bactéria 22 apresentou alta variabilidade, elevada riqueza de haplótipos e alta diversidade genética. Foram 23 observadas evidências de baixo fluxo gênico entre as subpopulações da mata, Agreste e Sertão. 24 A ausência de recombinação nas subpopulações indica que este não foi o principal mecanismo 25 gerador de variabilidade na subespécie estudada. A maior variação estimada pela análise de 26 variância molecular foi observada dentro das subpopulações. A população total não apresentou 27 estruturação genética, pois diversos locos foram compartilhados, evidenciando que as 28 subpopulações se apresentaram intimamente relacionadas, independente da zona climática. 29 Para o nosso conhecimento, este foi o primeiro estudo que analisou a estrutura genética de 30 populações de P. carotovorum subsp. brasiliensis no estado de Pernambuco.

† Autor para correspondência: Marco A.S. Gama; E-mail: [email protected]

31 Abstract 32 Soft rot is a widespread disease responsible for causing losses in various vegetables in Brazil 33 and worldwide. A collection of isolates of Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis 34 from different climatic zones of the state of Pernambuco (forest, intermediary and semiarid) 35 was assembled for population structure analysis of this bacterium. All isolates (64) were 36 identified as P. carotovorum subsp. brasiliensis using 16S rDNA and mdh gene sequencing and 37 with specific primers Br1/f1. Based on the REP-PCR marker, the population of this bacterium 38 showed high variability, high haplotype richness and high genetic diversity. Evidence of low 39 gene flow was observed between subpopulations of the forest, intermediary and semiarid. 40 Absence of recombination in the subpopulations indicated that this was not the main mechanism 41 generating variability in the subspecies studied. The greater variation estimated by analysis of 42 molecular variance was observed within the subpopulations. The total population did not 43 present genetic structuration, since several loci were shared, evidencing that subpopulations 44 were closely related, independently of the climatic zone. To our knowledge, this was the first 45 study that analyzed the genetic structure of populations of P. carotovorum subsp. brasiliensis 46 in the state of Pernambuco. 47 48 49 50 A podridão mole é uma doença de ocorrência comum no Brasil e no mundo, sendo 51 responsável por perdas significativas na produção de diversas culturas (Dess et al. 2017; Lee et 52 al. 2015). No estado de Pernambuco essa doença é considerada um sério problema para a 53 produção de hortaliças, principalmente em alface e couve chinesa, as quais são suscetíveis a 54 essa doença (Alvarado et al. 2011; Félix et al. 2014; Silva et al. 2007). 55 A doença pode ser causada por diferentes espécies dos gêneros Pectobacterium e 56 Dickeya, destacando-se Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis, a qual apresentou-se 57 distribuída na mesorregião da mata, Agreste e Sertão de Pernambuco (Moraes et al. 2018). Essa 58 bactéria foi isolada pela primeira vez a partir de plantas de batata com sintomas de canela preta 59 no Brasil (Duarte et al. 2004) e, desde então, tem sido relatada em diversos países (Choi e Kim. 60 2013; De Boer et al. 2012; Kim et al. 2009) e em associação com diversas espécies de plantas 61 (Lee et al. 2014; Pitman et al. 2008; van der Merwe et al. 2010). 62 O conhecimento sobre a diversidade é um importante pré-requisito para o 63 desenvolvimento de métodos de identificação e detecção de fitobactérias, bem como para

64 estudos epidemiológicos e desenvolvimento de estratégias para o manejo de fitobacterioses 65 (Tasssa e Duarte, 2005). 66 O estudo sobre a estrutura genética de populações de fitopatógenos é uma importante 67 ferramenta para compreensão da biologia populacional de microrganismos (Milgron 2015). 68 Nesse sentido, esses estudos podem ser usados para estimar o impacto relativo das diferentes 69 forças evolutivas (seleção, mutação, deriva, fluxo gênico e recombinação) que influenciam a 70 população de patógenos (McDonald e Linde 2002). Dentro da estrutura genética é fundamental 71 diferenciar dois tipos de diversidade: diversidade gênica e genotípica. A diversidade gênica é 72 um índice calculado em função do número e frequências de alelos em um único loco, enquanto 73 a diversidade genotípica refere-se ao número de indivíduos geneticamente distintos na 74 população (Grünwald et al. 2003). 75 Diversos marcadores podem ser utilizados como ferramenta para descrever padrões de 76 variabilidade genética de uma população natural e avaliar de que forma a variabilidade se 77 encontra distribuída (Telles et al. 2003). Dentre os marcadores empregados no estudo da 78 diversidade genética de Pectobacterium spp. destacam-se RFLP, RAPD, ISSR e rep-PCR como 79 os mais utilizados (Gallelli et al. 2009; Toth et al. 1999; Dana et al. 2015; Faquihi et al. 2015). 80 Desses marcadores, rep-PCR (REP, ERIC e BOX) apresenta-se como uma técnica capaz de 81 gerar perfis genômicos de DNA com base na amplificação de regiões localizadas entre 82 sequências repetitivas, caracterizando-se como uma técnica extremamente confiável, 83 reprodutível, rápida e altamente discriminatória (Louws et al., 1996; Versalovic et al., 1994). 84 Levando-se em consideração a prevalência de isolados de P. carotovorum subsp. 85 brasiliensis em diferentes zonas climáticas do estado de Pernambuco (Moraes 2018), o 86 conhecimento sobre a variabilidade genética de isolados dessa bactéria e de como essa 87 variabilidade pode ser afetada por mecanismos evolutivos, torna-se essencial para otimização 88 de estratégias de controle da podridão mole, particularmente no desenvolvimento de cultivares 89 resistentes (McDonald e Linde 2002). No entanto, como estudos de estrutura genética de 90 populações deste fitopatógeno são inexistentes, o presente trabalho utilizou a técnica de rep- 91 PCR e descritores da diversidade genética para analisar a estrutura das populações de P. 92 carotovorum subsp. brasiliensis causando infecção em hortaliças nas diferentes zonas 93 climáticas do estado de Pernambuco. 94 95 Materiais e Métodos 96 Isolados bacterianos. Sessenta e quatro isolados de P. carotovorum subsp. brasiliensis 97 foram obtidos de diversas hortaliças com sintomas de podridão mole provenientes de áreas de

98 plantio localizadas nas mesorregiões da Zona da Mata (Vitória de Santo Antão e Chã grande), 99 Agreste (Camocim de São Félix, Garanhuns, Bonito, Gravatá e Bezerros) e Sertão (Petrolina) 100 do estado de Pernambuco, Brasil (Fig.1). A mesorregião da mata apresenta umidade variando 101 de 30 a 100% com níveis de precipitação podendo ultrapassar 2500 mm e temperaturas de 15 a 102 36ºC. Na mesorregião do Agreste, a umidade varia entre 10 e 100% e precipitação de 300 a 103 1200 mm com temperaturas mais amenas, variando de 15 a 32ºC. Por sua vez, na mesorregião 104 do Sertão, a umidade varia de 5 a 90%, com precipitação entre 400 e 800 mm e temperatura de 105 15 a 41ºC (Agência Pernambucana de Águas e Clima - APAC, 2017). 106 Tecidos apodrecidos das hortaliças coletadas das diferentes zonas climáticas foram 107 tocados com palitos de dente esterilizados os quais foram fincados em frutos de pimentão, que 108 foram mantidos em câmara úmida por 48 h (Takatsu et al. 1981). Posteriormente, foi realizado 109 o isolamento a partir dos pimentões com sintomas de podridão mole em placas de Petri 110 contendo o meio de cultura CPG (1 g caseína hidrolisada, 10 g peptona, 10 g glicose, 18 g ágar, 111 1000 mL de água). Nesse meio, as colônias jovens (36 - 48 h) de bactérias pectinolíticas 112 visualizadas em lupa sob iluminação oblíqua apresentaram aspecto de “vidro quebrado” 113 (Kelman e Dickey 1995). Os isolados obtidos foram submetidos aos testes de Ryu e de 114 capacidade de maceração em frutos de pimentão e tubérculos de batata (Hyman et al. 2001). Os 115 isolados foram preservados em água destilada esterilizada (ADE) e por liofilização, sendo, em 116 seguida, depositados na Coleção de Culturas Rosa Mariano (CCRM) do Laboratório de 117 Fitobacteriologia (LAFIBAC) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). 118 Extração e quantificação de DNA. A extração do DNA genômico foi realizada com 119 auxílio do kit MiniPrep (AxygenBioscienses, USA), seguindo as instruções do fabricante. A 120 quantificação do DNA foi realizada em espectofotômetro (BioChrome WPA, Biowave DNA 121 Spectrophotometer, Harvard, USA) utilizando-se uma alíquota de 1,5 µl do DNA concentrado. 122 Após a quantificação, as amostras foram diluídas para uma concentração final de 10 ng/µL de 123 DNA e armazenadas a -20°C. 124 Identificação molecular. A identificação dos isolados foi realizada por meio do 125 sequenciamento da região 16S rDNA (Hauben et al. 1998) e do gene mdh (malato 126 dehidrogenase) (Ma et al. 2007), seguindo-se o BLASTn e análise filogenética dos genes 127 isoladamente por meio de análises de Neighbor-Joining com o modelo Kimura 2 parâmetros. 128 Adicionalmente, a amplificação do DNA dos isolados foi realizada por meio dos primers 129 específicos Br1f/L1r para sub-espécie Duarte et al. (2004). 130 As reações foram compostas por uma mistura contendo 1X de Master Mix 2X (Promega,

131 USA) (0,05 U/μL de Taq DNA polimerase, tampão de reação, 4 mM de MgCl2, 0,4 mM de

132 cada dNTP), 0,50 µM de cada primer e 100 ng de DNA. As amostras foram amplificadas em 133 termociclador modelo SimpliAmp (Massachusetts, EUA). As condições de amplificação foram 134 realizadas de acordo com Hauben et al. (1998), Ma et. al. (2007) e Duarte et al. (2004) para a 135 região 16S rDNA, gene mdh e para os primers Br1f/L1r, respectivamente. Após as 136 amplificações, 5 µL do produto de PCR foram corados com SyBr Gold (Life Technologies, 137 Brasil), submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5% por 1 h e visualizados em 138 fotodocumentador (Analítica, Brasil) para verificação da presença de bandas. Controles 139 negativos foram incluídos para verificar a presença de contaminantes. 140 Para os sequenciamentos, as reações foram purificadas utilizando-se 5 μL do produto 141 de PCR acrescidos de 3,8 μL de água ultrapura, 0,25 μL de fosfatase alcalina, 0,5 μL de tampão 142 fosfatase alcalina, 0,125 μL de exonuclease e 0,5 μL de tampão exonuclease. As amostras foram 143 postas em termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95° C durante 3 min; 144 30 ciclos de 94° C durante 0,5 min, 52° C durante 0,5 min e 72° C durante 1 min; e extensão 145 final a 72° C durante 6 min. Após a reação de purificação o sequenciamento foi conduzido em 146 sequenciador automatizado ABI3730 pertencente ao Laboratório de Bioinformática e Biologia 147 Evolutiva da Universidade Federal de Pernambuco (LABBE-UFPE). 148 rep-PCR. O perfil genômico dos isolados foi obtido por meio da técnica de rep-PCR 149 utilizando-se os marcadores REP (REPIR-I 5’IIICGICGICATCIGGC3’ e REP2I 150 5’ICGICTTATGIGGCCTAC3’), ERIC (ERIC1R 5’ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC3’ e 151 ERIC2R 5’AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3’) e BOX (5'- 152 CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3'). 153 As reações foram compostas por uma mistura contendo 1X de Master Mix 2X, 0,50 µM 154 de cada primer e 100 ng de DNA. As amostras foram amplificadas em termociclador modelo 155 SimpliAmp, sendo submetidas às seguintes condições: desnaturação inicial por 7 minutos à 156 95ºC; 30 ciclos de 1 minuto a 94º C para desnaturação, 1 minuto a 53º C para anelamento e 8 157 minutos a 65º C para extensão; e extensão final por 15 minutos a 65º C. Após as amplificações, 158 10 µL do produto de PCR foram corados com SyBr, submetidos à eletroforese em gel de 159 agarose a 1,5% por 3 horas e visualizados em fotodocumentador. Controles negativos foram 160 incluídos para verificar a presença de contaminantes. 161 As análises dos perfis de amplificação gerados com os marcadores REP, ERIC e BOX 162 foram realizadas visualmente de acordo com a presença (1) ou ausência de bandas (0) de 100 a 163 5000 pb, sendo registradas apenas bandas reprodutíveis (presentes em duas análises). Foram 164 utilizadas duas réplicas biológicas (amostras de DNA oriundas de duas extrações distintas para

165 confirmação da reprodutibilidade dos perfis gerados) e todas as reações foram repetidas duas 166 vezes. 167 Análise de estrutura genética. A diversidade e estrutura genética da população para as 168 diferentes zonas climáticas (Mata, Agreste e Sertão) foram estudadas por meio de parâmetros 169 que avaliaram a diversidade genética natural baseada em REP-PCR, a saber: diversidade 170 genotípica (G), estimada pelo índice G de Stoddart e Taylor (1988), com bootstrap de 1000 171 repetições; diversidade gênica (He), calculada pelo índice de Shannon-Weaver (Shannon e 172 Weaver 1949); fração clonal, estimada pela fórmula (1- (G/N), em que N é o tamanho da

173 amostra e G é o número de genótipos (Zhan et al. 2002); riqueza genotípica E(gn), utilizando-

174 se curvas de rarefação (Grunwald et al. 2003); equitabilidade genotípica (E5), que avalia como 175 os genótipos estão distribuídos na amostra (Alatalo 1981; Grunwald et al. 2003; Ludwig e 176 Reynolds 1988); número de haplótipos e índice de diversidade de Simpson (Lambda) (He e Hu 177 2005). 178 Foi realizada análise discriminante de componentes principais (DAPC) (Jombart et al. 179 2010) e construida uma rede de haplótipos. Para analisar o desequilíbrio de ligação em todas 180 as subpopulações foram calculados os índices de associação (Ia) (Smith et al. 1993) e de

181 associação alternativo rbarD (rd), o qual é menos sensível à variação do número de locus 182 (Agapow e Burt 2001). Para analisar a capacidade de detecção da diversidade total da população 183 e de quantos locus foram necessários para detectá-la utilizando-se o marcador REP-PCR, foi 184 construída uma curva de acumulação de genótipos. A diferenciação genética entre as

185 subpopulações foi estimada por meio do índice de FST (Wright 1931), o qual indica se há 186 diferenciação genética. Todas as análises de subpopulações foram executadas pelo programa R 187 versão 2.15.0. (R Development Core Team 2011). 188 Para estimar a percentagem de variação entre e dentro das subpopulações foi realizada 189 a análise de variância molecular (AMOVA) com o auxílio do software Arlequin versão 3.5.2.2 190 (Excoffier et al. 2005). 191 Agressividade à couve-chinesa. A agressividade dos isolados foi avaliada em mudas 192 de couve-chinesa (híbrido Natsume) com 44 dias. Para o preparo das suspensões bacterianas, 193 os isolados foram cultivados em meio CPG por 48 h durante 28° C, sendo as concentrações

194 ajustadas com auxílio de espectrofotômetro Analyser (São Paulo, Brasil) para A570 = 0,36 (1 x 195 109 UFC/ml). 196 Sementes de couve-chinesa foram semeadas em bandejas de poliestireno expandido 197 com 200 células contendo substrato comercial (Basaplant, Brasil). Após 20 dias, as mudas 198 foram transplantadas para copos descartáveis com capacidade de 700 mL contendo substrato e

199 solo 1:2 (v/v), sendo mantidas em casa de vegetação com irrigação diária até a montagem do 200 experimento. As plantas foram inoculadas na base do pecíolo pelo método da picada (Silva 201 2007), que consistiu na realização de um ferimento na nervura central da folha com alfinete 202 entomológico a uma profundidade de 1 mm. Em seguida, de 20 μL de suspensão bacteriana 203 foram depositados com auxílio de um micropipetador. Após as inoculações, as plantas foram 204 submetidas à câmara úmida durante 6 h em casa de vegetação. 205 Avaliações da severidade da podridão mole foram realizadas em intervalos de 6 h até 206 completar 48 h com o auxílio de uma escala descritiva que varia de 1 a 9 (Ren et al. 2001), em 207 que: 1 = sem lesão no ponto de inoculação; 2 = lesões menores que 5 mm; 3 = lesões entre 5 e 208 10 mm; 4 = lesões maiores que 10 mm, porém não atingindo a folha; 5 = lesão alcançando o 209 limbo foliar e o caule; 6 = caule infectado, porém sem atingir as folhas não inoculadas, 7 = 210 caule e folhas não inoculadas infectadas; 8 = planta inteira próxima à morte e; 9 = planta morta. 211 Após a avaliação foi determinada a severidade final da doença (SEVF), determinada às 48 h 212 após a inoculação. 213 O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 27 repetições, sendo 214 cada repetição constituída por uma planta. Os pressupostos da análise de variância (ANOVA) 215 foram checados pelos testes de Shapiro-Wilk e Levene com auxílio do software Statistix 9 216 (Tallahassee, Flórida, Estados Unidos). Os dados foram submetidos à análise de variância 217 (ANOVA) e a comparação de médias pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade 218 utilizando-se o software SISVAR (Ferreira 2011). 219 220 Resultados 221 Identificação dos isolados. Foram obtidos 31 isolados de alface, três de couve-chinesa, 222 um de brócolis, três de rabanete, dez de couve manteiga, dois de tomate, um de rúcula e nove 223 de abobrinha (Tabela 1). Considerando as regiões climáticas, foram obtidos 24 isolados 224 mesorregião da mata, 28 da mesorregião Agreste e 12 da mesorregião do Sertão. Todos os 64 225 isolados provenientes das três zonas climáticas produtoras de hortaliças do estado de 226 Pernambuco foram Gram-negativos e apresentaram capacidade de causar podridão mole em 227 pimentão e batata em até 48 h. 228 Os percentuais de identidade obtidos por meio das análises de BLASTn variaram de 98 229 a 99% e 99 a 100% para a região 16S rDNA e para o gene mdh, respectivamente, em relação 230 ao isolado tipo de P. carotovorum subsp. brasiliensis (IBSBF1692TS) (Tabela 1). As árvores 231 filogenéticas construídas com as sequências da região 16S rDNA e do gene mdh agruparam 232 todos os isolados junto com o isolado tipo de P. carotovorum subsp. brasiliensis

233 (IBSBF1692TS) (não apresentado). Uma banda de 430 pb foi amplificada a partir do DNA de 234 todos os isolados utilizando-se os primers Br1f/L1r. 235 rep-PCR. A amplificação do DNA dos isolados com os marcadores REP, ERIC e BOX 236 revelou a presença de 22, 18 e 20 bandas reprodutíveis variando de 100 a 5000 pb. Dos três 237 marcadores analisados inicialmente, o marcador REP apresentou polimorfismos sutis nos perfis 238 dos isolados pertencentes às subpopulações de P. carotovorum subsp. brasiliensis das 239 diferentes zonas climáticas de Pernambuco, dessa forma foi selecionado para realização das 240 demais análises, cujos resultados serão descritos a seguir. 241 Análise de estrutura genética. A curva de acumulação de genótipos indicou que 100% 242 dos genótipos foram detectados por meio do marcador REP-PCR, com início da formação de 243 um platô curto sendo observado com 21 locos (Fig. 2). 244 Foram observados 56 haplótipos distribuídos entre as mesorregiões da mata (20), 245 Agreste (26) e Sertão (11) (Tabela 2). A diversidade genotípica (G) apresentou índices elevados 246 para as três subpopulações, variando de 10,3 (Sertão) a 11,4 (Agreste). O índice de

247 equitabilidade genotípica (E5) foi elevado para as três subpopulações, sendo observados valores 248 de 0,99 para o Agreste, 0,97 para a Zona da Mata e 0,96 para o Sertão. A diversidade gênica

249 (He) foi elevada para as subpopulações da mesorregião do Agreste (He = 2,44), mata (He = 2,37)

250 e Sertão (He = 2,37). A fração clonal média variou de 7 a 16%, sendo verificado que a 251 subpopulação do Agreste apresentou o menor índice e a região da Zona da Mata o maior. Índice 252 de Simpson variou de 0,90 a 0,91, sendo o maior para a mesorregião do Agreste. A maior

253 riqueza genotípica E(g12) observada foi de 11,7 para a mesorregião do Agreste. O índice de

254 associação (IA= 0,74) e o índice de associação alternativo rbarD (rd=0,034) indicam que a 255 população de P. carotovorum subsp. brasiliensis não se encontra em equilíbrio de ligação, não 256 havendo evidências de eventos de recombinação. 257 Apenas um haplótipo (MLG8) foi compartilhado pelas subpopulações do Agreste e 258 Sertão (Fig. 3). Os demais haplótipos (55) não foram compartilhados, indicando baixo de fluxo 259 gênico entre as subpopulações (Mata, Agreste e Sertão) do estado de Pernambuco. A análise de 260 variância molecular (AMOVA) indicou uma maior variação dentro das subpopulações 261 estudadas (93,1%) e baixa variação entre subpopulações (6,9%) (Tabela 3). A análise de DAPC 262 (Fig.4) indicou ausência de estruturação entre as subpopulações, confirmando os resultados da

263 AMOVA. Esses resultados foram confirmados pelo índice FST, que constatou ausência de 264 diferenciação genética entre as subpopulações avaliadas (Tabela 4). 265 Agressividade em couve-chinesa. Com base na severidade, foi possível observar a 266 formação de seis grupos de agressividade que variaram de 11,0 a 88,89 (Tabela 1). O grupo I,

267 formado pelos isolados CCRM15, CCRM95, CCRM113, CCRM122, CCRM184, CCRM634 268 e CCRM672, apresentou os maiores níveis de agressividade da doença, variando de 74,20 a 269 88,89 enquanto o grupo VI, formado pelos isolados CCRM60, CCRM77, CCRM291, 270 CCRM361, CCRM389, CCRM399, CCRM518, CCRM535, CCRM588, CCRM643 e 271 CCRM651, apresentou os menores níveis de severidade, com valores variando de 11,0 a 22,22. 272 273 Discussão 274 Os 64 isolados de P. carotovorum subsp. brasiliensis oriundos de regiões produtoras de 275 hortaliças da Zona da Mata, Agreste e Sertão de Pernambuco foram obtidos de alface, couve- 276 chinesa, brócolis, rabanete, couve manteiga, tomate, rúcula e abobrinha. A primeira ocorrência 277 no Nordeste brasileiro de isolados de P. carotovorum subsp. brasiliensis causando podridão 278 mole em abobrinha (Moraes et al. 2017) e em couve manteiga (Queiroz et al. 2017) foi realizada 279 recentemente, indicando uma ampla gama de hospedeiros dessa bactéria. Essa característica 280 pode ser caracterizar como uma importante estratégia de sobrevivência, pois do ponto de vista 281 ecológico, a capacidade de colonizar diversas espécies de plantas em várias regiões geográficas 282 pode garantir a sobrevivência do fitopatógeno (Lin et al. 2014). Adicionalmente, os isolados 283 foram testados quanto à patogenicidade a pimentão e batata e induziram sintomas de podridão 284 mole em até 48 horas após a inoculação, indicando que a colonização ocorre de forma rápida, 285 independentemente do tecido do hospedeiro. 286 A análise dos isolados realizada por meio dos sequenciamentos da região 16S rDNA e 287 do gene mdh com auxilio programa BLASTn (National Center for Biotechnology Information 288 - NCBI) identificou os 64 isolados como P. carotovorum subsp. brasiliensis com percentuais 289 de 98% a 100% de identidade de nucleotídeos em relação ao isolado tipo de P. carotovorum 290 subsp. brasiliensis (IBSBF1692TS). A árvores filogenéticas construídas com as sequências da 291 região 16S rDNA e do gene mdh agruparam todos os isolados junto com o isolado tipo de P. 292 carotovorum subsp. brasiliensis (IBSBF1692TS). Esses marcadores têm sido comumente 293 utilizados de forma eficiente para identificação de espécies e subespécies de Pectobacterium 294 (Dadasoglu e Kotan 2017; Moretti et al. 2014). Adicionalmente, todos os isolados também 295 foram identificados com os primers específicos Br1f/L1r, os quais amplificaram um fragmento 296 de 434 pb da região IGS de P. carotovorum subsp. basiliensis (Duarte et al. 2004). 297 A população de P. carotovorum subsp. brasiliensis apresentou alta riqueza genotípica e 298 diversidade gênica e genotípica, indicando que a população dessa bactéria no estado de 299 Pernambuco apresentou alta variabilidade. Essa elevada variabilidade pode ser atribuída à 300 ampla gama de hospedeiros e a oferta dos mesmos durante o ano inteiro (Toth et al. 2003), uma

301 vez que populações de fitopatógenos que se mantêm altas durante o ano inteiro são mais 302 diversificadas (McDonald e Linde 2002). 303 A recombinação gênica é um evento que pode ocorrer frequentemente em populações 304 bacterianas (Smith et al. 2000) por meio de mecanismos de troca genética, como a 305 transformação, transdução e conjugação (Feil e Spratt, 2001). No entanto, foi demonstrado

306 pelos índices de associação (IA) (0,74) e de associação alternativo rbarD (0,34) que eventos de 307 recombinação nas subpopulações de P. carotovorum subsp. brasiliensis oriundos das diferentes 308 zonas climáticas do estado de Pernambuco foram relativamente raros, indicando que outros 309 mecanismos estão envolvidos no processo de geração de variabilidade desses isolados. 310 Resultados semelhantes foram encontrados por Melo (2016), que verificou ausência de 311 recombinação em Xanthomonas campestris pv. campestris e Lin et al. (2014), que também 312 observam a ausência do mesmo processo biológico na população de Ralstonia solancaerarum 313 em Taiwan. 314 Apesar de não haver indícios de recombinação e, consequentemente, da ocorrência de 315 baixo fluxo gênico, conforme observado pela rede de haplótipos, a variabilidade dos isolados 316 de P. carotovorum subsp. brasiliensis em Pernambuco foi alta. Tal fato pode ser atribuído ao 317 efeito de mutações na população desta bactéria, pois em populações brasileiras de Ralstonia 318 solanacearum, uma bactéria habitante do solo assim como P. carotovorum subsp. brasiliensis, 319 a mutação também parece ser o principal fator gerador de variabilidade genética (Santiago et 320 al. 2016). De acordo com McDonald e Linde (2002), a mutação caracteriza-se como a principal 321 fonte de variação genética em microrganismos, levando diretamente a mudanças nas sequencias 322 de DNA, criando alelos na população e levando ao surgimento de isolados com maior 323 agressividade que podem quebrar a resistência de cultivares resistentes. 324 As análises de DAPC, AMOVA e diferenciação entre populações por Fst demostraram 325 que não houve estruturação entre as subpopulações estudadas, apesar da provável ausência de 326 fluxo gênico. Esses resultados demonstraram que cada subpopulação apresentou características 327 genéticas próprias, mas com o compartilhamento de uma grande quantidade de locos que as 328 aproximaram, não permitindo a ocorrência de estruturação entre as mesmas. Resultados 329 semelhantes foram observados por Dana et al. (2015), os quais estudaram a estrutura genética 330 dos isolados de P. carotovorum subsp. carotovorum de diferentes regiões do Iran por meio de 331 REP-PCR e verificaram que os isolados apresentaram diversos locos em comum com todos os 332 indivíduos da população, indicando que os indivíduos estavam intimamente relacionados, 333 independente da origem geográfica.

334 A severidade dos isolados induzida por P. carotovorum subsp. brasiliensis variou de 335 11,0 a 88,89 indicando elevada variabilidade com relação a agressividade dos isolados. Não foi 336 observada relação entre os dados de agressividade e os hospedeiros de origem ou localização 337 geográfica dos isolados. Semelhantemente, Galleli et al. (2009) quando estudaram isolados de 338 P. carotovorum também não encontraram relação entre agressividade, região geográfica e 339 hospedeiro de origem. Em outro estudo, Faquihi et al. (2015) estudaram 53 isolados de P. 340 carotovorum subsp. carotovorum de diferentes regiões geográficas do Marrocos e não 341 observaram estruturação genética por localização geográfica e hospedeiro de origem. Esses 342 autores também não correlacionaram agressividade com área geográfica. 343 Nesse contexto, o uso de isolados mais agressivos é desejável, pois proporciona maior 344 rigor na seleção e melhor discernimento entre genótipos resistentes e suscetíveis (Nakatani et 345 al. 2009). 346 347 Conclusões 348 Conclui-se que a população de P. carotovorum subsp. brasiliensis em Pernambuco 349 apresentou elevada variabilidade genética e não foi recombinogênica. A principal força 350 evolutiva atuante na população provavelmente é a mutação. A população não apresentou 351 estruturação genética, pois uma grande quantidade de locos aproximou os isolados estudados, 352 evidenciando que os indivíduos das subpopulações estavam intimamente relacionados, 353 independente da zona climática ou do hospedeiro de origem. 354 355 Agradecimentos 356 À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoa de Nível Superior (CAPES) pela 357 concessão da bolsa de estudos de Alessandra Jackeline Guedes de Moraes. 358 359 Referências 360 361 Agapow, P. M., and Burt, A. 2001. Indices of multilocus linkage disequilibrium. Mol. Ecol. 362 Notes 1:101-102. 363 Alatalo, R. V. 1981. Problems in the measurement of evenness in Ecology. Oikos, Copenhagen 364 37:199-204. 365 366 Alvarado, I. C. M., Michereff, S. J., Mariano, R. L. R., Souza, E. B., Quezado-Duval, A. M., 367 Resende, L.V., Cardoso, E., Mizubuti, E. S. G. 2011. Characterization and variability of

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100

566 Tabela 1. Lista de isolados de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis provenientes de diferentes municípios produtores de hortaliças da mesorregião da mata, Agreste 567 e Sertão de Pernambuco, nível de relacionamento com o isolado IBSBF1692PT e agressividade em couve-chinesa BLASTn 16S BLASTn mdh Br1/L1 ISOLADO CULTURA MUNICÍPIO MESORREGIÃO rDNA (%) (%) SEV CCRMPCB3 Brócolis Camocim de São Félix Agreste 99 x 100 x + 55,56 y, z CCRMPCB15 Couve-chinesa Camocim de São Félix Agreste 99 100 + 77,78a CCRMPCB18 Couve-chinesa Camocim de São Félix Agreste 100 99 + 66,6b CCRMPCB31 Couve-chinesa Camocim de São Félix Agreste 99 100 + 51,85c CCRMPCB55 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 100 + 44,44d CCRMPCB56 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 100 + 37,04e CCRMPCB60 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 99 + 33,33e CCRMPCB63 Rabanete Vitória de Santo Antão Zona da Mata 99 99 + 22,22e CCRMPCB64 Rabanete Vitória de Santo Antão Zona da Mata 99 99 + 14,81f CCRMPCB66 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 99 + 11,11f CCRMPCB72 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 99 100 + 11,11f CCRMPCB77 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 99 + 11,11f CCRMPCB95 Rabanete Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 99 + 11,11f CCRMPCB113 Alface Chã Grande Zona da Mata 100 99 + 88,89a CCRMPCB122 Alface Chã Grande Zona da zona 99 99 + 77,78a CCRMPCB128 Alface Chã Grande Zona da Mata 99 100 + 77,78a CCRMPCB129 Alface Chã Grande Zona da Mata 99 100 + 74,08a CCRMPCB162 Couve Chã Grande Zona da Mata 99 99 + 74,20a CCRMPCB165 Couve Chã Grande Zona da Mata 100 99 + 66,67b CCRMPCB168 Couve Chã Grande Zona da Mata 100 100 + 66,67b CCRMPCB180 Abobrinha Chã Grande Zona da Mata 99 99 + 66,67b

101

BLASTn 16S BLASTn mdh Br1/L1 ISOLADO CULTURA MUNICÍPIO MESORREGIÃO rDNA (%) (%) SEV CCRMPCB184 Abobrinha Chã Grande Zona da Mata 99 100 + 66,51b CCRMPCB185 Abobrinha Chã Grande Zona da Mata 100 100 + 66,40b CCRMPCB192 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 100 + 66,25b CCRMPCB196 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 99 + 66,07b CCRMPCB204 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 99 + 66,03b CCRMPCB215 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 99 100 + 55,56c CCRMPCB228 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 99 + 55,56c CCRMPCB273 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 100 100 + 55,56c CCRMPCB291 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 99 100 + 55,56c CCRMPCB293 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 99 100 + 55,56c CCRMPCB298 Alface Vitória de Santo Antão Zona da Mata 99 99 + 55,56c CCRMPCB313 Alface Garanhuns Agreste 99 99 + 55,56c CCRMPCB317 Alface Garanhuns Agreste 100 99 + 55,56c CCRMPCB341 Alface Garanhuns Agreste 100 99 + 55,0c CCRMPCB347 Alface Garanhuns Agreste 99 100 + 48,15d CCRMPCB361 Alface Garanhuns Agreste 99 100 + 48,15d CCRMPCB362 Alface Garanhuns Agreste 100 99 + 44,44d CCRMPCB389 Tomate Garanhuns Agreste 99 99 + 44,44d CCRMPCB399 Tomate Bezerros Agreste 99 100 + 44,44d CCRMPCB454 Abobrinha Bonito Agreste 100 100 + 40,74d CCRMPCB489 Abobrinha Bonito Agreste 99 100 + 40,74d CCRMPCB494 Abobrinha Bonito Agreste 100 100 + 40,74d CCRMPCB495 Abobrinha Bonito Agreste 100 99 + 40,74d CCRMPCB496 Abobrinha Bonito Agreste 99 99 + 40,74d CCRMPCB518 Alface Bonito Agreste 100 100 + 11,0f

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BLASTn 16S BLASTn mdh Br1/L1 ISOLADO CULTURA MUNICÍPIO MESORREGIÃO rDNA (%) (%) SEV CCRMPCB535 Alface Bonito Agreste 100 99 + 37,04d CCRMPCB558 Alface Gravatá Agreste 100 100 + 33,33e CCRMPCB585 Alface Gravatá Agreste 99 100 + 33,33e CCRMPCB588 Alface Gravatá Agreste 99 100 + 33,33e CCRMPCB596 Repolho Gravatá Agreste 99 99 + 33,33e CCRMPCB598 Repolho Gravatá Agreste 99 99 + 33,33e CCRMPCB623 Abobrinha Petrolina Sertão 100 99 + 33,33e CCRMPCB625 Couve Petrolina Sertão 99 99 + 29,63e CCRMPCB627 Couve Petrolina Sertão 99 99 + 29,63e CCRMPCB628 Alface Petrolina Sertão 99 99 + 29,63e CCRMPCB629 Couve Petrolina Sertão 99 99 + 29,63e CCRMPCB632 Beterraba Petrolina Sertão 100 100 + 29,63e CCRMPCB634 Cebola Petrolina Sertão 100 100 + 22,22f CCRMPCB642 Couve Petrolina Sertão 99 99 + 11,29f CCRMPCB643 Rúcula Petrolina Sertão 99 99 + 88,89a CCRMPCB651 Couve Petrolina Sertão 100 100 + 11,0f CCRMPCB656 Couve Petrolina Sertão 99 99 + 11,0f CCRMPCB672 Couve Petrolina Sertão 100 100 + 11,0f

568 x Percentual de similaridade com o isolado tipo de P. carotovorum subsp. brasiliensis (IBSBF1692PT). 569 y Severidade estimada por meio de escala descritiva de 1 a 9 em que: 1 = sem lesão no ponto de inoculação; 2 = lesões menores que 5 mm; 3 = lesões entre 5 e 10 mm; 4 = 570 lesões maiores que 10 mm, porém não atingindo a folha; 5 = lesão alcançando o limbo foliar e o caule; 6 = caule infectado, porém sem atingir as folhas não inoculadas infectadas; 571 8 = planta inteira próxima à morte; e 9 = planta morta (REN et al. 2001). 572 z Médias de 27 repetições. Médias seguidas pela mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Scott-Knott (P ≤ 0,05). 573

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Tabela 2. Índices de diversidade genética entre subpopulações de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis oriundas das mesorregiões da mata, Agreste e Sertão do estado de Pernambuco, Brasil Zona da População a Mata Agreste Sertão Total N 24 28 12 64 Nº de haplótipos 20 26 11 56 G 10,4 11,4 10,3 11,6 (8-12) (9-12) (NA) (10,2-12)

E5 0,97 0,99 0,96 0,99 (0,94- 1) (0,94-1) (NA) (0,96-1)

He 2,37 2,44 2,37 2,45 (2,14 - 2,49) (2,25- 2,49) (NA) (2,37- 2,49)

Fração clonal 0,16 0,07 0,08 0,125 Índice de Simpson 0,90 0,91 0,90 0,91 (0,88-0,92) (0,89- 0,92) (NA) (0,90- 0,92)

E(g12) 11 11,7 11 11,7

b IA 0,74

rbarD (rd) 0,34 b a N = tamanho da amostra; ; Nº haplótipos= Número de haplótipos para cada população; G= Diversidade

genotípica; E5= Índice de equitabilidade genotípica; He=Diversidade gênica de Shannon-Weaver (1949), intervalo de confiança entre parênteses; Fração Clonal= Índice de diversidade genotípica, calculado por (1- (número de diferentes genótipos)/(total de números de isolados)); E(gn)= Riqueza genotípica ou número

esperado de genótipos pelo método de rarefação; IA = índice de associação; rbarD (rd) = índice de associação alternativo. b Significativo a 1% de probabilidade. NA=não aplicável

Tabela 3. Análise de variância molecular (AMOVA) das subpopulações de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis oriundas das mesorregiões da da mata, Agreste e Sertão do estado de Pernambuco, Brasil

Percentual da F.V. G.L. S.Q. C.V. variação (%)

Entre subpopulações 2 17,73 0,25 Va 6,9

Dentro de 61 235,55 3,86 Vb 93,1 subpopulações

Total 63 253,28 2,21

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Tabela 4. Diferenciação genética entre as subpopulações (FST) de Pectobacterium. carotovorum subsp. brasiliensis oriundas das mesorregiões mata, Agreste e Sertão do estado de Pernambuco, Brasil

Mata Agreste Sertão

Mata 0,000

Agreste 0,051 0,000

Sertão 0,049 0,086 0,000 ** Significativo a 1% de probabilidade

Fig. 1. Zonas climáticas (Mata, Agreste e Sertão) do estado de Pernambuco. Zona da Mata, umidade de 30 a 100%, precipitação maior ou igual a 2500 mm e temperaturas de 15 a 36ºC; Agreste, umidade de 10 a 100%, precipitação de 300 a 1200 mm e temperaturas de 15 a 32ºC; Sertão, umidade de 5 a 90%, precipitação de 400 a 800 mm e temperatura de 15 a 41ºC (Agência Pernambucana de Águas e Clima - APAC, 2017).

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Fig. 2. Curva de acumulação de genótipos do marcador REP-PCR para 64 isolados de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis oriundos das mesorregiões da Mata, Agreste e Sertão do estado de Pernambuco, Brasil.

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Mata Agreste Sertão

Fig. 3. Rede de haplótipos das subpopulações de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis oriundas das mesorregiões da Mata, Agreste e Sertão de Pernambuco, Brasil.

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Fig. 4. Análise discriminante de componentes principais (DAPC) subpopulações de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis oriundas das mesorregiões da mata, Agreste e Sertão de Pernambuco, Brasil.

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CONCLUSÕESGERAIS

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CONCLUSÕES GERAIS

• Foi detectada elevada diversidade de gêneros e espécies da família Enterobacteriaceae causando podridão mole em hortaliças nas diferentes zonas climáticas do estado de Pernambuco.

• A alface é a hortaliça mais sucetível ao ataque das enterobactérias, incluindo bactérias que são patogênicos ao homem. Os isolados de P. carotovorum subsp. brasileinsis e P. aroidearum são as espécies prevalentes nas mesorregiões de Pernambuco.

• Foi realizado o primeiro registro da ocorrência de podridão mole causada por P. carotovorum subsp. odoriferum, D. dadantii subsp. dadantii e D. zeae em alface, E. ludwigii, E. massiliensis e E. bugandensis em abobrinha, K. pneumoniae subsp. ozanae em alface, K. michiganensis em alface e repolho, M. morganii subsp. sibonii em couve-chinesa, R. inusitata em coentro japonês, R. terrigena em abobora e alface, L. amnigena em abobrinha e K. georgiana em alface, berinjela e pimentão.

• A população de P. carotovorum subsp. brasiliensis apresentou elevada variabilidade genética, não foi recombinogênica e a principal força evolutiva atuante na população provavelmente é a mutação.

• A população de P. carotovorum subsp. brasiliensis não apresentou estruturação genética e os indivíduos das subpopulações apresentaram-se intimamente relacionados, independente da zona climática ou do hospedeiro de origem.