Untersuchungen Zur Biosynthese Von Foxicin Aus Streptomyces Diastatochromogenes Tü6028 Und Analysen Von Ähnlichen Biosynthese-Genclustern

Untersuchungen zur Biosynthese von Foxicin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 und Analysen von ähnlichen Biosynthese-Genclustern

aus Streptomyces sp.

INAUGURALDISSERTATION

zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

vorgelegt von Denise Deubel aus Karlsruhe

2018

Dekan: Prof. Dr. Manfred Jung Vorsitzender des Promotionsausschusses: Prof. Dr. Stefan Weber Referent: Prof. Dr. Andreas Bechthold Korreferent: Prof. Dr. Thorsten Friedrich Drittprüfer: Prof. Dr. Stefan Günther

Datum der mündlichen Prüfung: 23.04.2018

„It always seems impossible until it’s done.“ Nelson Mandela (1918-2013)

Wissenschaftliche Publikationen

Greule, Anja, Marija Marolt, Denise Deubel, Iris Peintner, Songya Zhang, Claudia Jessen-Trefzer, Christian De Ford, Sabrina Burschel, Shu-Ming Li, Thorsten Friedrich, Irmgard Merfort, Steffen Lüdeke, Philippe Bisel, Michael Müller, Thomas Paululat, Andreas Bechthold. Wide Distribution of Foxicin Biosynthetic Gene Clusters in Streptomyces Strains – an Unusual Secondary Metabolite with Various Properties Front. Microbiol. 8, 1-13. doi:10.3389/fmicb.2017.00221. ,

Klementz, Dennis, Kersten Döring, Xavier Lucas, Kiran K. Telukunta, Anika Erxleben, Denise Deubel, Astrid Erber, Irene Santillana, Oliver S. Thomas, Andreas Bechthold, Stefan ptomeDB 2.0-an Extended Resource of Natural Products Produced by Streptomycetes Nucleic Acids Res. 44 (D1): 509 14. Günther,http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4702922&tool=pmcentrez&r . Stre endertype=abstract.. –

Tagungsbeiträge

Vorträge an unusual nitrogen containing ortho- AAM Workshop 2016, Freiburg 28. -30. September 2016. „Foxicin – quinone, V

Biosynthesis of Foxicin - an unusual nitrogen containing para-quinone ymposium 2017, Freiburg 12. -13. Oktober 2017. , RTG S Poster Denise Deubel -III AM Workshop 2015, Frankfurt am Main 04. -06. September 2015. , Anja Greule, Andreas Bechthold, Overproduction and activity assay of FoxGI of Foxicin biosynthesis, VA Denise Deubel -III ducts 2015, Frankfurt am Main 06. -09. September, Anja 2015. Greule, Andreas Bechthold, Overproduction and activity assay of FoxGI of Foxicin biosynthesis, European Conference on Natural Pro

Denise Deubel RTG1976 Symposium 2015, Freiburg 15. -16.10.2015. , Anja Greule, Linda Zambolin, Andreas Bechthold, Biosynthesis of Foxicin,

Fabienne Gutacker, Yvonne-Isolde Schmidt-Bohli, Suzan Samra, Denise Deubel, Tina Strobel, Milena Pia Schäffer, Thomas Paululat, Andreas Bechthold. Identification of a N-glycosyltransferase of Saccharopolyspora erythraea - and -glycosidic bonds VAAM Workshop 2016, Freiburg 28. -30. September 2016. that catalyzes the formation of ,

Denise Deubel, Foxicin - Incorporation of the unusual extender unit 1,3- Symposium on theHui Biology Hong, ofThomas Actinomycetes Paululat, (ISBA)Peter Leadlay, 2017, Jeju, Andreas Südkorea Bechthold, 23. -27. BiosynthesisMai 2017. of bisphosphoglycerate, International

Inhaltsverzeichnis

I. Actinobakterien - Naturstoffproduzenten ...... 6

I. 1. Streptomyces distatochromogenes Tü6028 ...... 7 I. 2. Streptomyces collinus Tü365 ...... 8

II. Die Biosynthese von Naturstoffen durch modulare Megaenzyme ...... 9

II. 1. Die Polyketidsynthasen ...... 10 II. 1. 1 Die Polyketidsynthasen vom Typ I ...... 11 II. 2. Die nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen ...... 13 II. 3. Die Biosynthese von Naturstoffen durch hybride PKS-NRPS ...... 15 II. 4. Die Biosynthese und Eingliederung ungewöhnlicher Substrate durch Polyketidsynthasen ...... 17

III. Die Identifikation des fox-Clusters und die Biosynthese von Foxicin ...... 21

IV. Siderophore ...... 23

V. Transkriptionelle Regulatoren und die Regulation der Naturstoff-Biosynthese ...... 25

VI. Ziele dieser Arbeit ...... 28

I. Material...... 29

I. 1. Bakterienstämme ...... 29 I. 2. Oligonukleotide ...... 31 I. 3. Plasmide ...... 34 I. 3. 1 Plasmide, die in dieser Arbeit verwendet wurden ...... 34 I. 3. 2 Plasmide, die in dieser Arbeit erstellt wurden ...... 35 I. 4. Nährmedien ...... 36

Inhaltsverzeichnis

I. 5. Chemikalien und weitere Reagenzien ...... 38 I. 5. 1 Chemikalien ...... 38 I. 5. 2 Organische Lösemittel und Säuren ...... 40 I. 5. 3 Antibiotika ...... 40 I. 5. 4 Sonstige Biochemikalien ...... 40 I. 6. Enzyme ...... 41 I. 7. Molekularbiologische Kits ...... 41 I. 8. Marker ...... 41 I. 9. Puffer und andere Lösungen ...... 42 I. 9. 1 Allgemeine Puffer und Lösungen ...... 42 I. 9. 2 Lösungen und Puffer für die Aufreinigung heterolog produzierter Proteine ...... 44 I. 9. 3 Lösungen und Puffer zur Herstellung und Durchführung von SDS-PAGE Gelen ...... 46 I. 9. 4 Lösungen, Puffer und Enzyme für die Analyse von Proteinfunktionen ...... 48 I. 9. 5 Lösungen und Puffer für die Durchführung des NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assays ...... 48 I. 9. 6 Lösungen, Puffer und Enzyme für die Durchführung des in vitro Assays mit der FkbH-ähnlichen Domäne ...... 49 I. 10. Verbrauchsmaterial ...... 49 I. 11. Labor und Analysengeräte ...... 50 I. 12. Säulen ...... 52 I. 13. Computerprogramme und Internetdienste ...... 52

II. Methoden ...... 54

II. 1. Kultivierung und Stammerhaltung von Mikroorganismen ...... 54 II. 1. 1 Kultivierung und Stammerhaltung von Escherichia coli ...... 54 II. 1. 2 Kultivierung und Stammerhaltung von Aktinomyceten ...... 54 II. 1. 3 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae ...... 55 II. 2. Isolierung von DNA und Plasmiden aus Mikroorganismen ...... 55 II. 2. 1 Isolierung von genomischer DNA aus Aktinomyceten ...... 55 II. 2. 2 Isolierung von Plasmiden aus Escherichia coli ...... 56 II. 2. 3 Isolierung von YACs aus Saccharomyces cerevisiae ...... 57 II. 2. 4 Alkoholfällung ...... 58 II. 3. Charakterisierung von DNA ...... 58 II. 3. 1 Agarose-Gelelektrophorese ...... 58 II. 3. 2 Sequenzierung ...... 59 II. 3. 3 Photometrische Konzentrationsbestimmung ...... 59 II. 4. Klonierungsexperimente ...... 59 II. 4. 1 DNA-Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion ...... 59

Inhaltsverzeichnis

II. 4. 2 Restriktionsspaltungen ...... 62 II. 4. 3 Ligation ...... 62 II. 4. 4 DNA-Übertragung in Bakterien ...... 63 II. 4. 5 Geninaktivierung in Aktinomyceten ...... 67 II. 4. 6 Heterologe Genexpression in Aktinomyceten ...... 69 II. 4. 7 Klonierungen dieser Arbeit ...... 70 II. 5. Produktion, Aufreinigung und Analytik von Proteinen ...... 79 II. 5. 1 Heterologe Produktion von Proteinen in Escherichia coli ...... 79 II. 5. 2 Aufreinigung von rekombinanten Proteinen ...... 80 II. 5. 3 Produktion und Aufreinigung von FoxGI, FoxGII und FoxGIII ...... 86 II. 5. 4 Produktion und Aufreinigung der FkbH-ähnlichen Domäne, Tmn16 und Tmn7a . 88 II. 5. 5 Produktion und Aufreinigung der PCP-Domäne aus FoxBIII ...... 89 II. 5. 6 Proteinanalytik ...... 90 II. 6. Produktion, Aufreinigung und Analytik von bakteriellen Naturstoffen ...... 96 II. 6. 1 Produktion von bakteriellen Naturstoffen ...... 96 II. 6. 2 Extraktion von bakteriellen Naturstoffen...... 97 II. 6. 3 Aufreinigung von bakteriellen Naturstoffen ...... 97 II. 6. 4 Analyse von bakteriellen Naturstoffen ...... 100 II. 7. Aktivitätsbestimmungen bakterieller Naturstoffe ...... 101 II. 7. 1 Detektion von Siderophoren mit Chromazurol S (CAS) ...... 101 II. 7. 2 Einfluss verschiedener Faktoren auf die Foxicin Produktion ...... 102 II. 7. 3 UV/Vis Spektroskopie von Foxicin ...... 103 II. 7. 4 Agar Diffusionstest ...... 103 II. 8. Bioinformatik ...... 103 II. 8. 1 StreptomeDB...... 103 II. 8. 2 RAST ...... 104 II. 8. 3 antiSMASH ...... 104

I. Untersuchungen zu Foxicin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 ...... 105

I. 1. FoxGI, FoxGII und FoxGIII synthetisieren 1,3-BPG als Vorstufe für die Foxicin Biosynthese ...... 107 I. 1. 1 Produktion und Aufreinigung von FoxGI, FoxGII und FoxGIII ...... 107 I. 1. 2 Charakterisierung von FoxGI, FoxGII und FoxGIII mit dem NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assay ...... 109 I. 2. Die Unterbrechung von foxGI führt zu einer Verminderung der Foxicin Produktion ... 112 I. 3. Die Deletion von foxGI mit dem CRISPR-Cas9 System führt zu einer

Inhaltsverzeichnis

Foxicin Nullmutante ...... 114 I. 4. Untersuchungen zur FkbH-ähnlichen Domäne foxFLD von FoxBII ...... 116 I. 5. Untersuchungen der PCP-Domäne des fox-Clusters ...... 124 I. 5. 1 In silico Untersuchungen der PCP-Domäne des fox-Clusters ...... 124 I. 5. 2 Produktion und Aufreinigung des PCPs von FoxBIII ...... 126 I. 6. Die Fütterung von 13C-markierten Vorstufen identifiziert den Ursprung der C-Atome im Foxicin Gerüst ...... 127

13 I. 6. 1 Die Fütterung von [ C6]-Glucose ...... 129 I. 6. 2 Die Fütterung von [1-13C]-Acetat ...... 131

II. Untersuchungen zur Regulation der Foxicin Biosynthese in Streptomyces diastatochromogenes ΔpokOIV ...... 132

II. 1. Die Überproduktion der fox-Regulatoren in S. diastatochromogenes pokOIV führt zu einer Veränderung der Foxicin-Produktion ...... 133 Δ II. 2. Analysen des putativen DeoR/GlpR Regulators FoxRV ...... 136

III. Die biologische Rolle von Foxicin ...... 138

III. 1. Metalle beinflussen die Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes pokOIV ...... 138 III. 2. Foxicin bindet Eisen und weitere Metallionen ...... 139 Δ III. 3. Chromazurol S identifiziert Foxicin A und B als Siderophore ...... 141 III. 4. Die Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV unter Eisen-limitierten Bedingungen ...... 142 Δ IV. In silico Untersuchungen ähnlicher BGC aus Streptomyces sp...... 145

IV. 1. Die selektive Isolierung des BGCs 7 aus S. collinus Tü365 durch die Transformations- assoziierte Rekombination in S. cerevisiae VL6-48N ...... 146 IV. 2. Kombinatorische Biosynthese mit der Kernregion von BGC 7 aus S. collinus Tü365 . 147

V. StreptomeDB ...... 148

I. Das para-Quinon Foxicin aus S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 150

II. Untersuchungen der weiteren BGCs und S. collinus Tü365 ...... 164

Inhaltsverzeichnis

I. Abkürzungsverzeichnis ...... 179

II. PCP Sequenz ...... 182

III. Vergleich der Regulator-Überexpressionsmutanten ...... 182

IV. In silico Analysen der BCGs mit Ähnlichkeit zum fox-Cluster ...... 183

V. Spektren der NMR-Analysen ...... 189

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: S. diastatochromogenes Tü6028 produziert Polyketomycin und Foxicin A ...... 8 Abb. 2: S. collinus Tü365...... 8 Abb. 3: Ausgewählte Naturstoffe, die von Polyketidsynthasen vom Typ I und II synthetisiert werden ...... 10 Abb. 4: Schematische Darstellung der Polyketid-Biosynthese durch eine modulare Polyketidsynthase Typ I ...... 12 Abb. 5: Schematische Darstellung der NRP-Biosynthese durch eine modulare NRPS ...... 13 Abb. 6: Ausgewählte nicht-ribosomal synthetisierte Peptide und deren Wirkung ...... 14 Abb. 7: Polyketid-Peptid Hybride produziert von PKS-NRPS Hybriden ...... 15 Abb. 8: Auswahl und Eingliederung neuer, ungewöhnlicher Starter-Einheite in Polyketide ...... 17 Abb. 9: Biosynthese der Verlängerungseinheiten Hydroxymalonyl-ACP und Methoxymalonyl-ACP ...... 18 Abb. 10: Strukturen der Polyketide Oxazolomycin, Geldanamycin, FK520, Tetronomycin, Chlorothricin, Ansamitocin P-3 und Zwittermicin A...... 19 Abb. 11: Das fox-Cluster (57710 bp) aus S. diastatochromogenes Tü6028 ist verantwortlich für die Biosynthese von Foxicin A-D ...... 21 Abb. 13: Postulierte Biosynthese von Foxicin A ...... 22 Abb. 14: Funktionelle Gruppen von Siderophoren und ausgewählte Siderophore ...... 24 Abb. 15: Transformations-assoziierte Rekombination in Saccharomyces cerevisiae VL6-48N ..... 66 Abb. 16: Geninaktivierung durch Insertion mittels single Crossover ...... 67 Abb. 17: Gezielte Deletion durch Cas9 induzierten Doppelstrangbruch und homology-directed repair ...... 68 Abb. 18: Die Plasmidkarten von pET28a-N-fkbH und pET-STN-fkbH ...... 70 Abb. 19: Die Plasmidkarten von pET28a-N-PCP und pET28a-N-PCPmini ...... 71 Abb. 20: Plasmidkarten von pET28a-N-foxGI und pET28a-C-foxGI ...... 72 Abb. 21: Plasmidkarten von pET28a-N-foxGII und pET28a-C-foxGII ...... 73 Abb. 22: Plasmidkarten von pET28a-N-foxGIII und pET28a-C-foxGIII ...... 74 Abb. 23: Plasmidkarten von pKC1132-foxGIint und pUWL-T-foxGI ...... 74 Abb. 24: Plasmidkarte von pCRISPR-Cas9-foxGI ...... 75 Abb. 25: Plasmidkarten der fox Regulatoren in pTESa...... 76 Abb. 26: Plasmidkarte von pCAP01-Sco7...... 77 Abb. 27: Die vier Bereiche (core 1-4) der Kernregion des BGC 7 aus S. collinus Tü365 ...... 78 Abb. 28: Plasmidkarte von pTESa-Sco-core ...... 78 Abb. 29: Schema der Aufreinigung von rekombinanten Proteinen aus Einschlusskörperchen unter Nutzung einer Ni2+-Affinitätschromatographie...... 84 Abb. 30: Teilreaktion der Glykolyse katalysiert durch FBA, TIM und GAP-DH bzw. FoxGI, FoxGII und FoxGIII ...... 94 Abb. 32: SDS-PAGE nach der Aufreinigung von FoxGI mit C-terminalem His6-Tag...... 107 Abb. 33: SDS-PAGE Analyse der C-FoxGII Aufreinigung und ÄKTA-FPLC Chromatogramm der C- FoxGII Aufreinigung ...... 108 Abb. 34: Aufreinigung von N-FoxGIII aus Einschlusskörperchen mittels ÄKTA-FPLC. A| SDS- PAGE Analyse der ÄKTA-FPLC Reinigung der löslichen Fraktion ...... 109 Abb. 35: NAD+/NADH+H+ gekoppeltes Glykolyse Assay mit den Enzymen GAP-DH, TIM, FBA und C-FoxGI, C- FoxGII und N-FoxGIII ...... 110 Abb. 36: Schematische Darstellung der Integration und PCR-Kontrolle der Integration...... 112 Abb. 37: Vergleich der Foxicin A Produktion zwischen S. diastatochromogenes pokOIV den Mutanten S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint A und B ...... 113 Δ Δ und Δ Abbildungsverzeichnis

Abb. 38: Agarosegelelektrophorese der Klonierungsschritte von pCRISPR-Cas9-foxGI ...... 114 Abb. 39: Analyse der Foxicin-Produktion in S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI im Vergleich zu S. diastatochromogenes pokOIVI ...... 115 Abb. 40: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von ChlD1, Tmn16, ΔFoxBII_FLD,Δ BryA (partiell), ZmaN, FkbH, GdmH und OzmB ...... Δ 116 Abb. 41: Sequenzalignment von Proteinen oder Domänen mit HAD-Motiv aus verschiedenen BCGs ...... 117 Abb. 42: SDS-PAGE der Aufreinigung von Tmn16 und Tmn7a mit N-terminalem His6-Tag ...... 118 Abb. 43: Aufreinigung der FkbH-ähnlichen Domäne mit N-terminalem His6-Tag aus E. coli Codon Plus RP x pL1SL2 ...... 119 Abb. 44: HPLC-MS Analyse der in vitro -Phosphopantetheinylierung von apo-Tmn7a zu holo- Tmn7a ...... 121 Abb. 45: Ergebnis der HPLC-MS Analyse der Beladung von holo-Tmn7a zu Glyceryl-S-Tmn7a durch Tmn16a ...... 122 Abb. 46: Ergebnis der HPLC-MS Analyse der FkbH-ähnlichen Domäne des fox-Clusters...... 123 Abb. 47: Ergebnis der HPLC-MS Analyse der Beladung von holo-Tmn7a zu Glyceryl-S-Tmn7a durch foxFLD ...... 124 Abb. 48: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von Tmn7a, ChlD2, FoxBIII_CP, ctg1_944, GdmJ, ZmaD, FkbJ und Asm14. Erstellt durch Neighbour Joining ...... 125 Abb. 49: Sequenzalignment von ACP- bzw. PCP-Domänen mit Spezifität zu Glyceryl-Einheiten aus den BCG von. Foxicin (FoxBIII_CP), (Asm14), Chlorothricin (ChlD2), dem unbekannten Naturstoff aus S. collinus Tü365 (ctg1_944), FK520 bzw. Ascomycin (FkbJ), Geldanamycin (GdmJ), Tetronomycin (Tmn7a) und Zwittermicin A (ZmaD) ...... 125 Abb. 50: SDS-PAGE Analyse der N-PCP Aufreinigung ...... 126 Abb. 51: Quantitativer Vergleich der Foxicin A und Foxicin B Produktion in den Produktionsmedien HA, SG, DNPM, NL4 und NL111...... 127 Abb. 52: Vergleich der Naturstoffproduktion von Polyketomycin und Foxicin in S. diastatochromogenes Tü6028 WT und S. diastatochromogenes ΔpokOIV ...... 128 13 Abb. 53: HPLC Analysen der Aufreinigung von Foxicin der [ C6]-Glucose Fütterung...... 129 Abb. 54: Relative Häufigkeit des Masse-/Ladungsverhältnisses von Foxicin A und Foxicin A aus 13 der [ C6]-Glucose Fütterung...... 130 Abb. 55: Struktur von Foxicin A und die markierten Positionen (rot). *| markierte C-Atome; (*) | möglicherweise markierte C-Atome ...... 130 Abb. 56: analytische DC von Foxicin A und B der [1-13C]-Acetat Fütterung ...... 131 Abb. 57: HPLC Analysen der Aufreinigung von Foxicin A der [1-13C]-Acetat Fütterung...... 131 Abb. 58: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von LanK, ArpA, Aur1R, Sco1712, FoxRI, FoxR10, ActR, SimR und VarR der TetR/AcrR Familie ...... 132 Abb. 59: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von RamA, FoxRIII, FomR, ClmR2, AveR, GdmRI und SlnM der LuxR Familie ...... 132 Abb. 60: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von AbsC, FoxRIV, PenR, PntR, PcaV und Sco4513 der MarR Familie ...... 133 Abb. 61: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von GapR, AdpA, NanR4, FoxRVI und RapG der AraC/XylS Familie ...... 133 Abb. 62: Kontrollen der Regulatormutanten durch PCR mit dem Primerpaar pTESa_check_fw/pTESa_check_rv ...... 134 Abb. 63: Vergleich der Foxicin-Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV::pTESa und den Regulator-Überproduktionsmutanten...... 135 Abb. 64: Alignment von verschiedenen GlpR Regulatoren ...... 136 Abb. 65: Konservierte Aminosäuren des HTH-Motivs der GlpR Regulatoren aus S. diastatochromogenes Tü6028, S. coelicolor A3 (2), H. influenzae, E. coli O25b:H4, B. subtilis und E. coli K12 ...... 137

Abbildungsverzeichnis

Abb. 66: Analyse der Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes pokOIV unter Zugabe von Glycerin ...... 137 Abb. 67: Supplementierte Metalle beeinflussen die Foxicin ProduktionΔ von S. diastatochromogenes pokOIV ...... 138 Abb. 68: UV/Vis Spektroskopie von Foxicin A mit den Metallen Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ und Zn2+ ...... Δ 139 Abb. 69: UV/Vis Spektroskopie von Foxicin B mit den Metallionen Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ und Zn2+ ...... 141 Abb. 71: CAS-Assay mit gereinigtem Foxicin A und gereinigtem Foxicin B...... 141 Abb. 72: Analyse der Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes pokOIV unter Zugabe von FeCl3 und EDTA ...... 142 Abb. 73: Vergleich der UV/Vis Spektren. Peaks bei 14,41 min aus derΔ Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV in NMMP-Medium ohne FeSO4 und MS-Medium...... 143 Abb. 74: Analyse der Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes pokOIV, kultiviert in NMMP-Medium, NMMP-MediumΔ ohne FeSO4 und MS-Medium...... 143 Abb. 75: Vergleich der Morphologie von S. diastatochromogenes Δ pokOIV ...... 144 Abb. 76: Strukturvorhersage des Grundgerüstes des unbekannten Sekundärmetabolites aus S. collinus Tü365 durch antiSMASH...... Tü und Δ 145 Abb. 77: Darstellung des BGC 7 aus S. collinus Tü365 ...... 146 Abb. 78: Kontrollverdau von pCAP01-Sco7 mit SpeI, XhoI...... 146 Abb. 79: Ergebnis der Kontroll-PCR mit dem Primerpaar aap20_04_Fw und aap20_04_Rv ...... 147 Abb. 80: Ergebnis der PCR der Kernbereiche core 1, core 2 und core 3 ...... 147 Abb. 81: Schematische Darstellung der Integration von Information in die StreptomeDB ...... 148 Abb. 82: Fütterungsexperimente identifizierten [U-13C]-Glycerin als Vorläufer der Startereinheit bei Boromycin, Aplasmomycin und Tartrolon B und als Vorläufer der Extendereinheiten bei Bafilomycin A1 und B1 und Concanamycin...... 151 Abb. 83: Biosynthese von 2-DOS aus D-Glucose-6-Phosphat ...... 151 Abb. 84: Strukturen der Ansamycine Geldanamycin, Herbimycin A, Macbecin I und Rifamycin S, sowie der Vorläufer AHBA der mC7N-Einheit...... 152 Abb. 85: Biosynthese von RK-682 ...... 153 Abb. 86: 2,5-Diketopiperazin...... 154 Abb. 87: Analyse der Sekundärstoffproduktion in S. diastatochromogenes pokOIV foxGI ..... 155 Abb. 88: Struktur von 4-Z-Annimycin aus S. calvus att::[bldA, aac(3)IV] ...... 156 Abb. 89: Analyse des fox-Clusters mit antiSMASH ...... Δ , Δ 157 Abb. 90: Einteilung von Quinonen ...... 161 Abb. 91: Die Redox-Stadien von p-Benzoquinon...... 161 Abb. 92: Aminosäuresequenz von FoxBIII...... 182 Abb. 93: HPLC Analyse der Foxicin A Produktion in den Mutanten S. diastatochromogenes pokOIV:: pokOIV::foxRI pokOIV::foxRII, pokOIV::foxRIV, pokOIV::foxRVI, pokOIV::foxRVII, pokOIV::foxRVIII, pokOIV::foxRIX und pokOIV::foxRX...... 182 1 13 Abb. 94Δ: H NMR pTESa,Spektrum Δ von Foxicin, AΔ nach der FütterungΔ von [ C6]-GlucoseΔ und von unmarkiertemΔ FoxicinΔ A als ReferenzΔ ...... Δ 190 13 13 Abb. 95: C NMR Spektrum von Foxicin A nach der Fütterung von [ C6]-Glucose und von unmarkiertem Foxicin A als Referenz ...... 190 Abb. 96: Ergebnis der NMR-Analyse von Foxicin A aus der [1-13C]-Acetat Fütterung...... 191

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Die Proteine für die Eingliederung Glycerin-abgeleiteter Vorstufen in FK520, Ansamitocin P-3, Oxazolomycin, Geldanamycin, Zwittermicin A, Tetronomycin und Chlorothricin ...... 19 Tab. 2: verwendete E. coli Stämme ...... 29 Tab. 3: verwendete Aktinomyceten Stämme ...... 30 Tab. 4: weitere, verwendete Stämme ...... 30 Tab. 5: verwendete Oligonukleotide ...... 31 Tab. 6: Plasmide, die in dieser Arbeit verwendet wurden ...... 34 Tab. 7: Plasmide, die in dieser Arbeit erstellt wurden ...... 35 Tab. 8: verwendete Nährmedien zur Kultivierung von Bakterien ...... 36 Tab. 9: verwendete Chemikalien und deren Bezugsquelle ...... 38 Tab. 10: Organische Lösungsmittel und Säuren...... 40 Tab. 11: verwendete Antibiotika ...... 40 Tab. 12: sonstige, verwendete Biochemikalien ...... 40 Tab. 13: verwendete Enzyme...... 41 Tab. 14: verwendete, molekularbiologische Kits ...... 41 Tab. 15: verwendete Molekulargewichtsmarker ...... 41 Tab. 16: verwendete Puffer und andere Lösungen ...... 42 Tab. 17: Puffer und Lösungen für die Aufreinigung rekombinanter Proteine ...... 44 Tab. 18: Lösungen und Puffer für die Herstellung und Durchführung einer SDS-PAGE ...... 46 Tab. 19: Zusammensetzung der Gele für die Durchführung einer SDS-PAGE ...... 47 Tab. 20: Puffer und Lösungen für die Durchführung einer SDS-PAGE mit Bis-Tris-Gelen ...... 47 Tab. 21: Lösungen für die Durchführung des NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assays ... 48 Tab. 22: Konzentrationen der Stammlösungen für das in vitro Beladungsassay mit ...... 49 Tab. 23: Verbrauchsmaterialien und deren Bezugsquelle ...... 49 Tab. 24: verwendete Geräte und deren Bezugsquelle ...... 50 Tab. 25: verwendete Säulen und deren Bezugsquelle ...... 52 Tab. 26: verwendete Computerprogramme ...... 52 Tab. 27: verwendete Internetdienste ...... 53 Tab. 28: PCR-Ansätze für die jeweilen Polymerasen und deren Anwendung ...... 60 Tab. 29: verwendetes Standard PCR-Programm ...... 60 Tab. 30: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes für die Kolonie-PCR ...... 61 Tab. 31: Zusammensetzung für eine Aktinomyceten Kolonie-PCR ...... 61 Tab. 32: Restriktionsverdau ...... 62 Tab. 33: Zusammensetzung für die Ligation mit einem Zwischenvektor ...... 62 Tab. 34: ...... 82 Tab. 35: ...... 83 Tab. 36: KonditionierungAufreinigung von der His-getaggten HisTrap™ FF Proteinen mL aus Einschlusskörperchen ...... 84 Tab. 37: LösungenSchritte und und Säulenvolumina Säulenvolumina zur Reinigung und zum Beladen der HisTrap™ FF ...... 85 Tab. 38: Aufreinigung von Proteinen mittelsfür die Größenausschlusschromatographie Aufreinigung von Proteinen mittels ...... StrepTrap™ HP 86 Tab. 39: Aufreinigung der fox-FLD, Tmn16 und Tmn7a mittels Ni2+-Agarose ...... 88 Tab. 40: Pipettierschema der Kontrollen ...... 92 Tab. 41: Pipettierschema für die Überprüfung der Enzymfunktionen von FoxGI, FoxGII und FoxGIII ...... 93 Tab. 42: Bestandteile für die Detektion von Proteinen mittels HPLC-MS ...... 94

Tabellenverzeichnis

Tab. 43: Bestandteile des in vitro Assays für die Beladung von Fox-FkbH und Tmn16 mit 1,3-BPG ...... 95 Tab. 44: Bestandteile der in vitro -Phosphopantetheinylierung von apo-Tmn7a ...... 95 Tab. 45: Gradient für die HPLC-MS Analyse von foxFLD, Tmn16 und Tmn7a ...... 95 Tab. 46: Fütterungsschema für die Fütterung mit 13C-6 markierter Glucose ...... 96 Tab. 47: Fütterungsschema für die Fütterung von 13C-1 markiertem Acetat ...... 96 Tab. 48: Schritte der Festphasenextraktion für die Fraktionierung von Foxicin A und B ...... 98 Tab. 49: präparative HPLC Methode zur Aufreinigung der Foxicine ...... 99 Tab. 50: Methoden zur Analyse von Naturstoffen durch HPLC-MS ...... 100 Tab. 51: Parameter der ESI-Quelle ...... 100 Tab. 52: Zusammensetzung des CAS-Reagenz ...... 101 Tab. 53: Postulierte Funktionen der ORFs des fox-Clusters aus S. diastatochromogenes Tü6028 ...... 105 Tab. 54: In silico Analysen der ORFs des BGC 7 aus S. collinus Tü365 ...... 183 Tab. 55: In silico Analysen der ORFs des BGCs aus S. avermitilis MA-4680 ...... 185 Tab. 56: In silico Analysen der ORFs des BGCs aus S. bingchenggensis BCW-1 ...... 187 Tab. 57: NMR-Daten von Foxicin A (600/150/60MHz, CDCl3 ...... 188

Zusammenfassung

Der Gram-positive Stamm Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 ist bekannt als Produzent des tetrazyklischen Quinonglykosids Polyketomycin1,2. Durch die Deletion der FAD-abhängigen Oxygenase PokOIV des Polyketomycin Biosynthese-Genclusters (BGC) kam es zu einer Steigerung der Foxicin Produktion, wodurch nachfolgende Untersuchungen ermöglicht wurden3. Das fox-Cluster wurde durch eine Geninaktivierung identifiziert und die Struktur und Konfigurationen von Foxicin A wurden gelöst4. Aufgrund von in silico Analysen des fox-Clusters wurde ein hypothetisches Biosynthesemodell aufgestellt.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese der zentralen quinoiden Ringstruktur von Foxicin A untersucht. Die Verbindung einer Zuckervorstufe und einer Aminosäure führt zu dem 1,4-Benzoquinon mit zusätzlicher Hydroxylgruppe am C-2. Die Fructose-1,6-bisphosphat- Aldolase FoxGIII, die Triosephosphat-Isomerase FoxGII und die Glycerinaldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase FoxGI wurden heterolog in Escherichia coli produziert und aufgereinigt. Die enzymatischen Funktionen wurden in einem NAD+/NADH+H+ gekoppelten in vitro Assay nachgewiesen. Nach der Inaktivierung von foxGI konnte Foxicin A kaum noch detektiert werden. Die FkbH-ähnliche Domäne foxFLD von FoxBII und das PCP von FoxBIII wurden ebenfalls heterolog in E. coli produziert, aufgereinigt und in einem in vitro Beladungsassay verwendet5. Bei der nachfolgenden HPLC-MS Analyse konnte die Beladung von foxFLD mit 1,3-Bisphosphoglycerat nicht detektiert werden. Die Synthese des 1,4-Benzoquinons aus einem Zucker und einer Aminosäure wurde durch das Ergebnis der Fütterung von 13C markierter Glucose unterstützt. Die zehn Regulatoren des fox-Clusters wurden durch in silico Analysen näher betrachtet und durch die Überproduktion der Regulatoren in S. diastatochromogenes pokOIV wurden FoxRI und FoxRIV als Aktivatoren identifiziert. Tü Δ Foxicin A kann aufgrund seiner quinoiden Struktur unterschiedliche Metalle wie Eisen komplexieren und wirkt dadurch als eine Art Ionophor. Außerdem beeinflusst die Anwesenheit von Metallen die Produktion von Foxicin A.

In S. collinus Tü635, S. avermitilis MA-4680 und S. bingchenggensis BCW-1 wurden fox-ähnliche BGC gefunden, die in silico analysiert wurden. Die Extraktion des BGC aus S. collinus Tü635 durch Transformations-assoziierte Rekombination (TAR) war nicht erfolgreich.

Im Rahmen eines umfassenden Updates der StreptomeDB wurden 157 Publikationen analysiert und relevante Informationen mit Hilfe des CoRSCurators extrahiert. Diese Informationen wurden in die Datenbank der StreptomeDB integriert.

Summary

The Gram-positive strain Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 is known as the producer of the tetracyclic quinone glycoside polyketomycin1,2. The deletion of the FAD-dependent oxygenase PokOIV of the polyketomycin cluster caused an enhancement of the foxicin production3. This effect enabled subsequent investigations of the foxicin biosynthesis and its biological relevance. The fox-cluster was identified by gene inactivation. The structure and absolute configuration of foxicin A was solved by using spectroscopic methods such as NMR, IR and VCD4. A hypothetic biosynthetic model was generated on the basis of in silico analysis and the structural information.

The biosynthesis of the quinone structure of foxicin A was of main interest in this work. It was proposed that the linkage of a sugar-derived precursor and an amino acid leads to the formation of the 1,4-benzoquinone with an additional hydroxyl group at C-2. The enzymes fructose-1,6-bisphosphate-aldolase FoxGIII, the triose-phosphate-isomerase FoxGII and the glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase FoxGI were heterologously produced in E. coli with subsequent purification. Their enzymatic function was demonstrated in the NAD+/NADH+H+ coupled in vitro assay. Additionally, the inactivation of foxGI affected the production of foxicin indicating that the enzyme contributes to the foxicin biosynthesis. The FkbH-like domain foxFLD of FoxBII and the PCP of FoxBIII were likewise produced in E. coli, subsequently purified and used in the in vitro loading assay5. The loading of foxFLD with 1,3-bisphosphoglycerate could not be detected via HPLC-MS analysis. The synthesis of the 1,4-benzoquinone through the linkage of a sugar and an amino acid was supported by the feeding of 13C-labelled glucose. In silico analysis of the regulatory genes gave further insights in their role during foxicin production. Their overexpression in S. diastatochromogenes Tü6028 pokOIV identified FoxRI and FoxRIV as positive regulators. Δ The quinone structure induces ionophoric properties resulting in the ability of foxicin to bind several transition metals like iron or copper. The presence of transition metals during cultivation influences the foxicin production of S. diastatochromogenes Tü6028 pokOIV.

Similar clusters to the fox-cluster were found in S. collinus Tü635,Δ S. avermitilis MA-4680 and S. bingchenggensis BCW-1 that were analysed with in silico methods. Selective isolation of the respective cluster of S. collinus Tü635 by transformation-associated recombination (TAR) was not successful.

The StreptomeDB was the first database focusing on Streptomycetes and their natural products6,7. As part of the database update and extension 157 publications were analysed and relevant information were extracted using the CoRSCurator. These information were included in the extended database of the StreptomeDB.

Einleitung

Mit der Entdeckung des Penicillins im Jahre 1928 durch Sir Alexander Fleming begann die Ära der Naturstoffe, die sich durch antibiotische, antifungale, antitumorale, antiparasitische, insektizide oder immunosuppressive Eigenschaften auszeichnen6. Durch das Antibiotikum Penicillin stieg die Lebenserwartung von 40 Jahren auf heute mehr als 77 Jahre. Im Jahre 1990 waren 80 % der Medikamente auf dem Markt Naturstoffe oder analoge Stoffe, deren Entwicklung durch Naturstoffe inspiriert wurden7. Aus über 7000 bekannten Polyketiden wurden mehr als 20 (0,3 %) kommerzielle Medikamente8. Trotzdem haben viele pharmazeutische Firmen ihre Naturstoffforschung in den letzten Jahren eingestellt, da sich Forschung und Entwicklung als langwierig und teuer herausstellten und Naturstoffe nach Ablauf der Patentrechte für die Firmen nicht mehr profitabel sind7.

Am Anfang des Jahres 2017 veröffentlichte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) eine Liste, die 12 bakterielle Familien, die derzeit die größte Bedrohung der menschlichen Gesundheit darstellen, umfasst1*. Dies soll die Forschung und Entwicklung neuer Antibiotika voranbringen, um gegen die globale, steigende Zahl antimikrobieller Resistenzen vorzugehen. Hinsichtlich der Dringlichkeit für neue antibiotische Medikamente teilt die Liste der WHO die Mikroorganismen in drei Kategorien auf: kritische, hohe und mittlere Priorität. Die erste Gruppe umfasst multi- resistente Bakterien wie Acinetobacter, Pseudomonas und zahlreiche Enterobacteriaceae (darunter Klebsiella, Escherichia coli, Serratia und Proteus), die vor allem in Krankenhäusern, Pflegeeinrichtungen und bei Patienten mit Beatmungsgeräten und Blutkathetern eine große Bedrohung darstellen. Diese Mikroorganismen verursachen häufig tödlich verlaufende Infektionen des Blutstroms und Lungenentzündungen. In der Europäischen Union (EU), in Norwegen und Island bekommen 5-12 % der Krankenhauspatienten während ihres Aufenthaltes eine bakterielle Infektion. Davon sind jährlich ungefähr 400 000 Menschen mit einem resistenten Bakterienstamm infiziert, von denen wiederum im Durchschnitt 25 000 Infektionen tödlich verlaufen2*. Die WHO verdeutlicht damit die Wichtigkeit der Entwicklung neuer antibiotischer Wirkstoffe gegen die steigende Anzahl antimikrobieller Resistenzen.

Antimikrobielle Resistenzen treten natürlicherweise über die Zeit auf und werden durch vertikalen und horizontalen Gentransfer weitergegeben. Antibiotika-Resistenzen sind dabei kein anthropogenes Problem wie die Studie von Bhullar et al. (2012) zeigt9. Die Lechuguilla Caves im Carlsberg Cavern National Park (USA) entstanden vor 4-7 Millionen Jahren und sind mit 200 km

1* http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/bacteria-antibiotics-needed/en aufgerufen am 05.03.2017 2* http://www.euro.who.int/en/health-topics/disease-prevention/antimicrobial-resistance/data-and-statistics aufgerufen am 05.03.2017 5 Einleitung

Länge und 500 m Tiefe ein gigantisches Labyrinth. Bis zur Entdeckung der Lechuguilla Caves 1986 waren die Höhlen vollkommen isoliert und durch ihre Tiefe wurden sie niemals dem anthropogenen Antibiotikagebrauch ausgesetzt. Bhullar et al. isolierten 93 Bakterienstämme (33 % Gram-positive, 63 % Gram-negative) aus den Lechuguilla Caves und analysierten diese hinsichtlich ihrer Antibiotika-Resistenzen. 70 % der Gram-positiven Stämme und 65 % der Gram-negativen Stämme waren resistent gegen 3-4 verschiedene Antibiotika-Klassen. Antimikrobielle Resistenzen sind somit kein anthropogenes Problem, sondern das Ergebnis dynamischer und kompetitiver, mikrobieller Interaktion. Trotzdem zeigt auch dieses Ergebnis wie dringend neue, wirksamere antibiotische Wirkstoffe gebraucht werden um Infektionen, verursacht durch (multi-) resistente Mikroorganismen, bekämpfen zu können.

I. Actinobakterien - Naturstoffproduzenten

Die Actinobacteria bilden die artenreichste Abteilung im Reich der Bakterien und umfassen unter anderem Vertreter der Familien der Streptomycetaceae und der Pseudonocardiaceae (Überblick über die Taxonomie, siehe 10). Charakteristisch für die Gram-positiven, filamentösen Actinobacteria sind ihr hoher GC-Gehalt von über 70 %11 und ihr komplexer Lebenszyklus der unterschiedliche, morphologische Differenzierungsstufen umfasst. Beim vegetativen Wachstum wachsen fädige Hyphen zu einem verzweigten Substratmycel heran. Bei Nährstoffmangel kommt es zur Bildung des reproduktiven Luftmycels aus dessen Hyphen sich neue Sporen abschnüren. Diese Sporen sind Dauerformen und können wiederum auskeimen und ein Substratmycel ausbilden. Actinobakterien können sowohl in terrestrischen als auch in aquatischen Lebensräumen gefunden werden, wobei die meisten Vertreter aerobe Bodenbewohner sind. Diese spielen als Saprophyten eine wichtige ökologische Rolle beim Abbau abgestorbener Pflanzen und Pilze12. Der bicyclische Alkohol Geosmin wird von Actinobakterien produziert und ist für den charakteristischen Geruch von Erde verantwortlich13.

Die Naturstoffproduktion der bekannten Gattung Streptomyces (griechisch streptos = gedreht, mykes = Pilz) ist stark an die Nährstoffsituation der Umwelt und damit auch an die morphologische Differenzierung gebunden. Der autolytische Abbau des vegetativen Mycels resultiert in der Akkumulation von N-Acetylglucosamin, was wiederum Einfluss auf die Produktion von bioaktiven Naturstoffen nimmt14. Aufgrund der enormen Vielfalt an bioaktiven Molekülen, die diese Gattung hervorbringt, bezeichnet David A. Hopwood die Streptomyceten in Streptomyces in Nature and Medicine: The Antibiotic Makers microscopic

15 seinemchemists Buch - „ . Streptomyceten produzieren nicht nur als eine„ einzige 16 17 bioaktive Substanz,mikroskopische allein S. Chemiker coelicolor A3(2) produziert Actinorhodin , Undecylprodigiosin ,

6 Einleitung

Calcium-dependent antibiotic (CDA)18 und Methylenomycin19. Doch das volle Potential der Streptomyceten stellte sich erst nach den ersten Genomsequenzierungen heraus. Die genomische DNA von S. coelicolor A3(2) codiert für mehr als 20 Biosynthese-Gencluster (BGC)20. Untersuchungen von weiteren Genomsequenzen ergaben 30-40 BGC pro Streptomyces Stamm21. BGC, die zwar im Genom codiert sind, aber unter Laborbedingungen nicht zur Synthese von Naturstoffen führen, werden stille oder kryptische Cluster genannt. Es entwickelten sich zahlreiche neue Forschungsmethoden, um diese kryptischen Cluster aufzuwecken (siehe 21 für einen Überblick). Dadurch soll das volle Potential der Streptomyceten ausgeschöpft werden, um neue bioaktive Naturstoffe gegen resistente Mikroorganismen zu finden.

Streptomyceten sind eine der größten Quellen klinisch nutzbarer Antibiotika, die anhand ihrer Struktur in folgende Hauptklassen unterteilt werden können: -Lactame (Penicilline wie z.B.

22 23 24 25 Amoxicillin ), Aminoglykoside (Streptomycin , Neomycin , Kanamycin ), Ansamycine (Geldanamycin26, Rifamycin27), Chloramphenicol28,29, Glykopeptide (Vancomycin30), Makrolide (Erythromycin31,32), Lipopeptide (Daptomycin33), Sulfonamide (Sulfanilamid), Streptogramine (Pristinamycin IA und IIA34), Tetrazykline (Tetrazyklin35), Quinolone (Ciprofloxacin (BAYER AG, 1981)) und Oxazolidinone (Linezolid36). Neben den antibiotischen Eigenschaften können Naturstoffe auch als Chemotherapeutika (Bleomycin37), Immunsuppresiva (Rapamycin38), Herbizide (Phosphinothricin39), Fungizide (Novobiocin40), Insektizide (Piericidin A41), antivirale (Pactamycin42) und antiparasitische (Ivermectin43) Substanzen, sowie Enzyminhibitoren (Lipstatin44) verwendet werden45 47. – Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit den Streptomyceten S. diastatochromogenes Tü6028 und S. collinus Tü365 gearbeitet, auf die in den Kapiteln A. I. 1 und A. I. 2 näher eingegangen wird.

I. 1. Streptomyces distatochromogenes Tü6028

Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 wurde aus einer Bodenprobe der Iguaçu Wasserfälle in Argentinien isoliert und produziert Polyketomycin, das unabhängig davon auch aus S. sp. MK277-AF1 isoliert wurde48 50. Polyketomycin inhibiert das Wachstum von Gram-positiven Bakterien, wie z.B. des Methicillin-resistenten– Staphylococcus aureus (MRSA), sowie das Wachstum verschiedener Tumor-Zelllinien49. Durch NMR und Röntgenstrukturanalyse wurde die Struktur von Polyketomycin aufgeklärt. Eine Polyketidsynthase vom Typ II synthetisiert das tetrazyklische Dekaketid Polyketomycinon, das mit einem Disaccharid, bestehend aus -D- -L-Axenose, verknüpft ist. Die Seitenkette des Disaccharids schließt mit

3,6-DidesmethysalicylsäureAmicetose und ab (Abb. 1, C.). Im Zuge von Untersuchungen der Polyketomycin- Biosynthese deletierte Dr. Iris Peintner die FAD-abhängige Oxygenase PokOIV3. S. diastatochromogenes pokOIV unterscheidet sich morphologisch vom Wildtyp durch

Δ 7 Einleitung ausbleibende Sporulation und beeinträchtigte Melaninproduktion (siehe Abb. 1, A. und B.). Zudem produziert S. diastatochromogenes pokOIV kein Polyketomycin mehr, stattdessen wurden vier, bislang unbekannte Substanzen detektiert,Δ die später von Dr. Anja Greule als Foxicin A-D bezeichnet wurden (vormals IP1, IP2, IP3 und IP4). Durch NMR-, IR- und VCD-Analysen wurde Foxicin A als (S)-2-Hydroxy-3-(Acetylamino)-5- S -trimethyl-hepta- E -dienoyl-

4 amino)-1,4-Benzoquinon identifiziert (siehe Abb., 1). Das ,Kapitel A. III beschäftigt ,sich mit dem postulierten Biosynthesemodell, dem BGC und den bioaktiven Eigenschaften von Foxicin A.

Abb. 1: S. diastatochromogenes Tü6028 produziert Polyketomycin und Foxicin A. A| S. diastatochromogenes Tü6028 Wildtyp; B| S. diastatochromogenes pokOIV; C| Struktur von Polyketomycin; D| Struktur von Foxicin A. Tü Δ

I. 2. Streptomyces collinus Tü365

Streptomyces collinus Tü365 wurde aus einer Bodenprobe des Nigerufers nahe Kouroussa, Guinea isoliert und ist bekannt als der Produzent von Kirromycin51. Das lineare Polyketid besitzt drei intramolekulare Ringsysteme, einen Pyridonring, einen Tetrahydrofuranring und eine Goldinonsäure (siehe Abb. 7). Kirromycin inhibiert die Elongation während der ribosomalen Proteinbiosynthese durch die Blockade des Elongationsfaktors Tu (EF-Tu) und ist antibiotisch aktiv gegen Enterokokken, Streptokokken, Neisseria gonorrhea, Haemofilus influenzae und Plasmodium falciparum52. Durch in silico Analysen der DNA-Sequenz wurden, neben dem BGC für die Kirromycin-Biosynthese (Cluster 3 bzw. 31), 32 weitere, putative BGC gefunden, die unter Laborbedingungen weitestgehend still sind53. Durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen und durch heterologe Expression einiger BGC konnte Dr. Dumitrita Iftime die Syntheseprodukte von sechs BGC identifizieren, darunter Isorenierate, Pentalenolacton, Hopanoide, Desferrioxamin E, Abb. 2: S. collinus Tü365. Deoxydehydrochorismat und das Lanthipeptid Streptocollin53,54.

8 Einleitung

II. Die Biosynthese von Naturstoffen durch modulare Megaenzyme

Der Primärmetabolismus umfasst grundlegende Stoffwechselprozesse, die zum Erhalt zellulärer Grundfunktionen beitragen. Dazu gehören Zellwachstum, Entwicklung und Reproduktion. Die Endprodukte des Primärmetabolismus sind Energie und Intermediate für die Synthese von essentiellen Makromolekülen wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren 55.

Im Unterschied dazu sind die Metabolite des Sekundärstoffwechsels nicht essentiell für Wachstum und Reproduktion. Sekundärmetabolite, auch Naturstoffe genannt, leiten sich aus dem Primärstoffwechsel ab und werden von Mikroorganismen, Pilzen, Pflanzen und Tieren produziert. Substanzen wie Pigmente, Alkaloide, Antibiotika und Terpene stellen solche Naturstoffe dar. Sie weisen nicht nur eine große strukturelle Vielfalt auf, sondern zeichnen sich auch durch eine Vielzahl an biologischen Eigenschaften aus. So können Naturstoffe z.B. antibiotische, antifungale, antitumorale, antiparasitische, insektizide oder immunsuppressive Eigenschaften aufweisen. Von etwa 60 000-80 000 bekannten Naturstoffen, die von Mikroorganismen produziert werden, sind 32 000-34 000 bioaktiv45. Actinobakterien produzieren dabei ungefähr 12 000 verschiedene, bioaktive Substanzen, von denen 10 000 alleine von Streptomyceten produziert werden45. Dabei ist ihre Rolle für den eigentlichen Produzenten ein viel diskutiertes Thema. Sekundärmetabolite können Signalmoleküle für die Differenzierung oder für die Kommunikation sein, oder aber auch eine Waffe gegen Nahrungskonkurrenten darstellen56. In jedem Fall scheinen sie ihrem Produzenten einen Selektionsvorteil zu verschaffen.

Sekundärmetabolite können unterteilt werden in Alkaloide, Terpenoide, Flavonoide, Glykoside, Phenole, Phenanzine, Polyphenole, Fettsäuren, Polyketide und nicht-ribosomale Peptide. Unabhängig von der Substanzklasse kann die Biosynthese von Naturstoffen in drei Schritte eingeteilt werden. Im ersten Schritt werden die Bausteine aus dem Primärmetabolismus abgeleitet (z.B. Malonyl-CoA, Zucker, proteinogene Aminosäuren) oder spezifisch synthetisiert. Anschließend werden die einzelnen Bausteine, meistens durch modulare Megaenzyme, miteinander verknüpft. Durch Methylierung, Hydroxylierung, Glykosylierung, Halogenierung oder Zyklisierung wird das Grundgerüst im letzten Schritt weiter modifiziert57. In Bakterien liegen alle Gene, die für die Synthese eines Sekundärmetabolites benötigt werden, geclustert im Genom vor. Die sogenannten Biosynthese-Gencluster beinhalten alle Enzyme die an der Verknüpfung der Bausteine, an Modifikationen, Transport, Resistenz und Regulation beteiligt sind. Identifiziert - -liegenden

57 manRegionen, ein einzelnes, führt das anzur der Identifizierung Biosynthese desbeteiligtes gesamten Gen BGCs und betrachtet. Die Biosynthese die vonund Naturstoffen, insbesondere von Polyketiden und nicht-ribosomale Peptiden, läuft nach einem komplexen Mechanismus ab.

9 Einleitung

Im Folgenden wird die Biosynthese der Polyketide durch Polyketidsynthasen und die Biosynthese der nicht-ribosomalen Peptide durch nicht-ribosomale Peptidsynthetasen detailliert betrachtet (siehe Kapitel A. II. 1, Kapitel A. II. 1. 1 und Kapitel A. II. 2).

II. 1. Die Polyketidsynthasen

Die Polyketide stellen eine Klasse der Naturstoffe dar, die sich durch große, strukturelle Vielfalt auszeichnet. Darunter befinden sich kleine, einfache Moleküle wie 6-Methylsalicylsäure bis hin zu komplexen Molekülen wie Erythromycin A31,32,58. Die Synthese der Polyketide ist sehr nah verwandt mit der Fettsäuresynthese (FAS) der Vertebraten, sowohl in der Auswahl der Vorstufen als auch in der Art der Enzyme, die zur Kettenverlängerung benötigt werden (Überblick über die Fettsäuresynthese siehe 58).

Abb. 3: Ausgewählte Naturstoffe, die von Polyketidsynthasen vom Typ I und II synthetisiert werden. Makrolide wie Erythromycin A, Polyene wie Amphotericin B oder Polyether wie Tetronomycin werden durch PKS I synthetisiert. Aromatische Polyketide wie Actinorhodin oder Tetrazyklin werden durch PKS II assembliert.

Polyketide werden durch multifunktionale Megaenzyme mit modularer Organisation, den Polyketidsynthasen, synthetisiert. Analog zur FAS werden Coenzym A-aktivierte Carbonsäure- Einheiten (z.B. Malonyl-CoA oder Methymalonyl-CoA) durch Polyketidsynthasen zu bioaktiven Molekülen verknüpft. Im Unterschied zur FAS können in der Polyketidkette alle Reduktionstufen vorkommen. Polyketide können, in Abhängigkeit der Megaenzyme, die für die Assemblierung der C-Kette verantwortlich sind, in drei Klassen unterteilt werden. Polyketidsynthasen vom Typ I (PKS I) oder modulare Polyketidsynthasen besitzen eine modulare Architektur mit multiplen, katalytischen Domänen, die Reaktionen für Kettenverlängerung und Modifikation katalysieren.

10 Einleitung

Makrolide wie Erythromycin A, Polyene wie Amphotericin B59 oder Polyether wie Tetronomycin60 werden durch PKS I synthetisiert (siehe Abb. 3). Polyketidsynthasen vom Typ II (PKS II) oder aromatische PKS sind für die Biosynthese aromatischer Polyketide wie Actinorhodin61,62 oder Tetrazyklin35 verantwortlich (siehe Abb. 3). Die Polyketidsynthasen vom Typ III folgen einer unterschiedlichen Biochemie und sind den Chalcon- und Stilben Synthasen in Pflanzen sehr ähnlich.

Im Kapitel A. II. 1. 1 wird der Mechanismus der Typ I Polyketidsynthasen detailliert erklärt.

II. 1. 1 Die Polyketidsynthasen vom Typ I

Polyketidsynthasen gehören, neben den nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen zu den größten Enzymen der Welt. Aufgebaut aus insgesamt 16 000 Aminosäuren und mit einer Größe von 1,8 Millionen Dalton ist MlsA1 die größte, bekannte Polyketidsynthase vom Typ I63. Wie die FAS ist eine PKS I ein Homodimer64. Polyketidsynthasen sind modular aufgebaut, wobei jedes Modul ein eigenes Set katalytischer Domänen besitzt. Ein Modul verlängert ein Polyketid um zwei Kohlenstoff-Atome durch decarboxylative Kondensation von Thioester aktivierten Acyl-Gruppen. Eine Acyltransferase (AT) Domäne katalysiert die Auswahl einer Acyl-CoA Einheit und deren Verknüpfung mit dem Phosphopantethein-Arm eines holo-Acyl-carrier Proteins (ACP). Anschließend wird diese Einheit kovalent an das Cystein einer Ketosynthase (KS) gebunden. Die KS Domäne katalysiert die Decarboxylierung der Acyleinheit und die Claisen-Kondensation mit der Verlängerungseinheit, -Ketogruppe resultiert. Diese Schritte sind obligatorisch für die Verlängerung derworaus Ketidkette. eine Optionale Domänen können drei weitere, reduktive Reaktionen katalysieren. Eine Ketoreduktase (KR) Domäne reduzi -Ketogruppe zu einer

-Hydroxygruppe. Eine Dehydratase (DH) Domäne katalysiert die Abspaltungert die von H2O und damit -Alkens. Die Doppelbindung kann dann durch eine Enoylreduktase (ER) dieDomäne Entstehung wieder eines reduziert , werden. Am C-Terminus des Megaenzyms ist in der Regel eine Thioesterase (TE) Domäne lokalisiert. Diese katalysiert die Freilassung des Polyketids vom Enzym (schematischer Überblick in Abb. 4) und häufig auch den Ringschluss, der zur Entstehung von Makrolactonen nötig ist (Überblick über Polyketidsynthasen siehe 18, 9, 19).

PKS I können in iterative PKS I und modulare PKS I unterteilt werden. Modulare PKS I sind verantwortlich für die Synthese der meisten, komplexen Polyketidstrukturen. Für jeden Elongationsschritt wird ein eigenes Modul mit bestimmten katalytischen Domänen benötigt. Es gibt folglich eine Kolinearität zwischen der Komposition der katalytischen Domänen und der Länge des Produktes. Die KS, AT und ACP Domänen sind essentiell für den Einbau einer Verlängerungseinheit, während die KR, DH und ER optionale, katalytische Domänen darstellen.

11 Einleitung

Iterative PKS I hingegen stellen die einfachste Variante von Polyketidsynthasen dar. Die katalytischen Domänen werden wie bei der FAS, iterativ verwendet und es werden in der Regel kleine, zyklische Polyketide wie 6-Methylsalicylsäure synthetisiert (siehe Abb. 3). Zwischen der AT und der ACP Domäne besitzen die iterativen PKSI eine weitere katalytische Domäne: die PT (product template) Domäne ist verantwortlich für die Kettenlänge des entstehenden Polyketids57.

Abb. 4: Schematische Darstellung der Polyketid-Biosynthese durch eine modulare Polyketidsynthase Typ I. Die katalytischen Domänen der PKS I sind als Kreise dargestellt, die entsprechenden Module sind gekennzeichnet. A| Die AT Domäne des Lademoduls wählt eine Acyl-CoA Einheit aus und initiiert damit die Polyketidbiosynthese (1). Die Startereinheit wird kovalent über eine Thiolbindung an das ACP des Lademoduls gebunden (2). Die KS des ersten Verlängerungsmoduls (ModulX) wird mit der Acylgruppe des ersten Moduls beladen. Über eine Claisen-Kondensation wird die Startereinheit mit der Verlängerungseinheit von ModulX verknüpft (3) (Abb. modifiziert nach65); B| Schematische Darstellung der Assemblierung eines Polyketids. Die KR von ModulX+1 -Ketogruppe zu einer Hydroxygruppe, in ModulX+2 wird die Hydroxygruppe durch die DH weiter reduziert, in ModulX+3 katalysiert die ER die Reduktion der Doppelbindung. Die TE Domäne des terminalen Moduls entlässt diereduziert Ketidkette die von der PKS I und weitere Modifikationen können stattfnden.

Die strukturelle Vielfalt der Polyketide kommt durch die Modul- und Domänen- Zusammensetzung zu Stande, sowie durch die Auswahl der Starter- und Extendereinheiten. Acetyl-, Propionyl-, Isobutyryl-, Benzoyl-CoA und weitere werden gewöhnlich als Startereinheiten verwendet, während Malonyl-, Methylmalonyl- oder Ethylmalonyl-CoA und andere die Verlängerungseinheiten darstellen. Bis heute sind auch ungewöhnliche Starter- und Extendereinheiten beschrieben, auf die im Kapitel A. II. 4 besonders eingegangen wird.

12 Einleitung

II. 2. Die nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen

Nicht-ribosomale Peptide (NRP) bilden eine große Gruppe biologisch aktiver Naturstoffe mit einer Vielzahl an klinischen Anwendungen und einer großen Diversität chemischer Strukturen. NRPs werden durch große, multimodulare Enzyme, den nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) synthetisiert. Dabei können nicht nur die 20 proteinogenen Aminosäuren zu NRPs verknüpft werden, sondern auch nichtproteinogene Aminosäuren, Fettsäuren oder -Hydroxysäuren, woraus sich die enorme, strukturelle Vielfalt ergibt66. NRPS sind, wie PKS I

(siehe Kapitel A. II. 1. 1), modular aufgebaut, wobei jedes Modul für die Aktivierung und den Einbau einer Aminosäure verantwortlich ist. Wie auch bei der modularen PKS I sind drei Domänen obligatorisch für die Elongation: eine Adenylierungsdomäne (A), ein peptide carrier Protein (PCP) und eine Kondensationsdomäne (C).

Abb. 5: Schematische Darstellung der NRP-Biosynthese durch eine modulare NRPS. Die A-Domäne aktiviert eine

Die C-Domäne katalysiert die Bildung einer Peptidbindung zwischen der Aminosäure am PCP des Lademoduls und der Aminosäure zuam ihrem PCP des Aminoacyladenylat folgenden Moduls. , (Abb. das dannmodifiziert auf den nach Phosphopantethein65) Arm des PCP übertragen wird .

Im ersten Schritt wird das apo- -Phosphopantetheins, an einen hoch

66 konservierten Serin-Rest des GGXS-Motivs,PCP durch Anhängen zum holo eines-PCP aktiviert . Die A-Domäne ist hoch selektiv und besitzt eine offene und eine geschlossene Konformation. In der offenen Konformation bindet die A-Domäne Mg2+, ATP und eine bestimmte Aminosäure. Die Aminosäure wird dann unter ATP-Verbrauch zu ihrem Aminoacyladenylat aktiviert (siehe Abb. 5). Die aktivierte Aminosäure wird auf die prosthetische Gruppe des holo-PCPs übertragen. Die Kondensationsdomäne katalysiert die Bildung einer Peptidbindung zwischen den Aminosäuren zweier, aufeinanderfolgender Module (siehe Abb. 5). Das HHXXDG-Motiv ist im katalytischen Zentrum der C-Domäne zu finden, wobei das zweite Histidin die Base für den nukleophilen Angriff darstellt67,68. Auch bei den NRPS können optionale Domänen als Teil eines Moduls oder in trans vorkommen. Diese modifizierenden Domänen können Epimerisierungs- (E), Formylierungs- (F), Methylierungs- (M), Heterocyclisierungs- (Cy), Reduktions- (R) oder Oxidationsdomänen (Ox) sein (Überblick siehe 68). Die E-Domäne katalysiert die Umwandlung einer L-Aminosäure zur D-

13 Einleitung

Konfiguration, die M-Domäne katalysiert eine N-Methylierung und die Cy-Domäne ist verantwortlich für die Bildung heterozyklischer Ringe. Die R-Domäne sorgt für die reduktive Freigabe des Aldehydes, während die Ox-Domäne das Thiazolin zu einem Thiazol umwandelt. Eine Thioesterase (TE) im terminalen Modul katalysiert die Abspaltung des NRPs und häufig auch dessen Zyklisierung.

Abb. 6: Ausgewählte nicht-ribosomal synthetisierte Peptide und deren Wirkung. Das Glykopeptid Vancomycin, -Lactamantibiotikum Penicillin, Daptomycin, Chloramphenicol und die Cyclopeptide Cyclosporin A und Cyclomarin D sind dargestellt. das

In der Abb. 6 sind einige klinisch genutzte nichtribosomale Peptide gezeigt, wie z.B. das cyclische Lipopeptid Daptomycin, das von Streptomyces roseosporus produziert wird33. Es wirkt bakterizid und wird als Reserveantibiotikum verwendet. Durch den Ca2+ abhängigen Einbau in die Zellmembran von Gram-positiven Organismen werden Membranporen ausgebildet, wodurch Kalium ausströmt, was zu einer Depolarisation des Membranpotentials führt. Weitere bekannte NRPs sind die Antibiotika Chloramphenicol (produziert von S. venezuelae28), Vancomycin (produziert von Amycolatopsis orientalis30), Cyclomarin D (produziert von Salinispora arenicola CNS-20569) und Penicillin (produziert von Penicillinum sp.), sowie das Immunsuppressivum Cyclosporin A (produziert von Tolypocladium inflatum, siehe Sandoz Ltd., Basel, Schweiz).

14 Einleitung

II. 3. Die Biosynthese von Naturstoffen durch hybride PKS-NRPS

Hybride Polyketid-Peptid-Naturstoffe können zum einen durch hybride PKS-NRPS Systeme synthetisiert werden oder aber durch andere Mechanismen, die keine PKS-NRPS Hybride benötigen, wie z.B. bei Cyclosporin oder Daptomycin (siehe Abb. 6).

PKS I und NRPS produzieren Polyketide oder NRPs mit derselben Strategie. Beide sind modulare, multifunktionale Megaenzyme, deren Module mehrere katalytische Domänen umfassen. ACPs und PCPs zeigen eine hohe Sequenzähnlichkeit und beide werden posttranslational durch -Phosphopantetheins vom apo-Enzym zum holo-Enzym aktiviert. Kurze

AnhängenCarboxysäuren des oder Aminosäuren werden kovalent über die Sulfhydrylgruppe des -Phosphopantetheins an ein ACP oder ein PCP gebunden. NRPS- bzw. PKS I-Module können Teil

desselben Polypeptids sein und interagieren spezifisch mit den upstream und downstream liegenden PKS I- bzw. NRPS-Modulen mit Hilfe von Dockingdomänen. Hybride PKS-NRPS Systeme vermitteln den Transfer eines NRPS gebundenen Peptidyl-Intermediats auf ein PKS I Modul oder umgekehrt.

Abb. 7: Polyketid-Peptid Hybride produziert von PKS-NRPS Hybriden. Bleomycin A2 wird aus neun Aminosäuren, zwei Zuckermolekülen und einem Molekül Malonyl-CoA synthetisiert. Zwittermicin A besteht aus drei Aminosäuren, Malonyl-CoA und Hydroxymalonyl- -Alanin gehören zum Grundgerüst des Polyketid-Peptids Kirromycin. Die Aminosäuren, die durch NRPS Module mit Polyketiden verknüpft werden, sind grün markiert. Die Malonyl-CoA Gruppe des NRPsCoA. Glycin Bleomycin und A2, ist in orange markiert.

In der Abb. 7 sind Beispiele für Naturstoffe dargestellt, die durch hybride PKS-NRPS Cluster synthetisiert werden. Das BGC für die Synthese von Bleomycin A2 codiert für neun NRPS Module und ein PKS I Modul37. Zusätzlich zu der Verknüpfung der Aminosäuren L- -Alanin,

L-Asparagin, L-Serin, L-Threonin, L-Alanin, L-Histidin und Glycin wird eine Malonyl-Cystein,CoA Einheit inkorporiert70. Die Aminogruppen in Zwittermicin A werden durch den Einbau von L-Serin,

15 Einleitung

Aminomalonyl-CoA und 2,3-Diaminopropionat eingeführt. Die weiteren Bausteine sind Malonyl-CoA und Hydroxymalonyl-CoA71. Kirromycin ist ein lineares Polyketid mit drei intramolekularen Ringsystemen, das durch ein hybrides System aus 14 PKS I Modulen und zwei NRPS Modulen synthetisiert wird. Die beiden NRPS-Module sind für den Einbau von Glycin und - -Alanin einen Teil der Pyridoneinheit bildet.

DieAlanin Kombination verantwortlich, von PKS- wobei und NRPS-Modulen und ihren katalytischen Domänen trägt erheblich zur strukturellen Diversität und chemischen Komplexität von Naturstoffen bei.

16 Einleitung

II. 4. Die Biosynthese und Eingliederung ungewöhnlicher Substrate durch Polyketidsynthasen

Im Kapitel A. II. 1 wurde die Naturstoffgruppe der Polyketide, sowie deren Biosynthese durch die großen, multifunktionalen und multimodularen PKS I, vorgestellt. Die enorme strukturelle Vielfalt der Polyketide wird durch verschiedene Faktoren wie die Kettenlänge, die Oxidation, die -Ketogruppen oder durch post-PKS modifizierende Enzyme hervorgerufen.

StereochemieEin weiterer Faktor, der der zur chemischen Komplexität beiträgt, ist die Auswahl und Eingliederung ungewöhnlicher Starter- und Verlängerungseinheiten in die Polyketidkette.

Abb. 8: Auswahl und Eingliederung neuer, ungewöhnlicher Startereinheiten in Polyketide. A| Biosynthese der Startereinheit 4-Guanidinobutyryl-CoA aus L-Arginin und ihre Position in Azalomycin F3a (grün). Argininmonooxygenase (AM), Aminohydrolase (AH), Coenzym A Ligase (CoL), Acytransferase (AT); B| Biosynthese der Startereinheit L-Lactyl-ACP aus 1,3-BPG und ihre Position in Bryostatin 1 und FR901464. Bifunktionale Glyceryl-Transferase/Phosphatase (GAT), Dehydratase (DH), Ketoreduktase (KR).

Außergewöhnliche Startereinheiten können durch neuartige Biosynthesewege synthetisiert werden, beispielsweise aus bereits bekannten Startermolekülen72. Viele PKS modifizieren Aminosäuren selektiv durch CoA-Ligasen, um die Thiotemplate-basierte Assemblierung zu starten. Während der Biosynthese der Azalomycine und Clethramycine in S. violaceusniger DSM 4137 wird L-Arginin durch eine FAD-abhängige Monooxygenase zu 4-Guanidinobutyramid decarboxyliert und nachfolgend von einer Aminohydrolase zu 4-Guanidinbutyrat umgewandelt. Durch eine 4-Guanidinobutanoat-CoA-Ligase wird die Startereinheit mit CoA verknüpft, was wiederum die Inkorporation durch die PKS erlaubt (siehe Abb. 8, A)73. Eine andere Möglichkeit bietet die Eingliederung von ungewöhnlichen Molekülen durch neuartige Inkorporationsmechanismen. Viele Polyketide verwenden Startereinheiten aus drei Kohlenstoffatomen, die aus Glycerin-Vorstufen synthetisiert werden. FR901464 wurde aus

17 Einleitung

Pseudomonas sp. no. 2663 isoliert und wirkt antitumoral, indem das splicen eukaryotischer DNA und die nukleare Retention von pre-mRNA inhibiert wird74. Auffallend ist das Startmodul des FR901464 BGC, bestehend aus einer DH-, einer KR- und einer GAT-Domäne, gefolgt von einem ACP. Die GAT-Domäne, auch FkbH-ähnliche Domäne genannt, agiert als bifunktionale Glyceryl-Transferase mit Phosphatasefunktion und überträgt 1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG) bei gleichzeitiger Dephosphorylierung als Glyceryl-Intermediat auf das ACP. Die aktivierten Carboxygruppen von 1,3-BPG ermöglichen dabei die AT-Aktivität. Durch die DH-Domäne entsteht ein Pyruvat-Intermediat am ACP. Die nac -Position generiert die

74 L-Lactyl-ACP Startereinheit (siehe Abb. 8,hfolgende B) . Das Ketoreduktiongleiche Startmodul der findet sich im BGC von Bryostatin 1 aus Candidatus Endobugula sertula, wo ebenfalls Lactyl-ACP als Startereinheit verwendet wird. Vorläufer ist hier ebenfalls 1,3-BPG.

Abb. 9: Biosynthese der Verlängerungseinheiten Hydroxymalonyl-ACP (HM-S-ACP) und Methoxymalonyl-ACP (MM-S-ACP) aus 1,3-BPG am Beispiel von FK520 und Zwittermicin A. ACP: FkbJ/ZmaD; bifunktionale Glyceryl- Transferase/Phosphatase: FkbH/ZmaN; 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydrogenase: FkbK/ZmaG; Acyl-CoA Dehydrogenase: FkbI/ZmaE; O-Methyltransferase: FkbG

Andere Polyketide verwenden Verlängerungseinheiten aus zwei Kohlenstoffatomen oder verzweigten 3-C-Einheiten, die ebenfalls aus Glycerin-Vorstufen synthetisiert werden. Während der Biosynthese von FK520, Zwittermicin A, Ansamitocin, Oxazolomycin und Geldanamycin katalysiert ein Set aus vier bzw. fünf Proteinen die Synthese der ungewöhnlichen Verlängerungseinheiten Hydroxymalonyl (HM)-S-ACP (ZmaDEGN75) oder Methoxymalonyl (MM)-S-ACP aus 1,3-BPG (FkbGHIJK der FK520 Biosynthese5,76, Asm13-14 der Ansamitocin Biosynthese77, OzmBDEFG der Oxazolomycin Biosynthese 78, und GdmGHIJK der Geldanamycin Biosynthese79). In der Tab. 1 ist eine Übersicht der Proteine und ihren Homologen, sowie deren Funktionen dargestellt. Aus Gründen der Vereinfachung wird im Folgenden nur die Nomenklatur des FK520 BGCs verwendet. FkbH erkennt 1,3-BPG als sein Substrat, katalysiert dessen Dephosphorylierung und belädt das holo-ACP FkbJ. Die 3-Hydroxyl-CoA Dehydrogenase FkbK oxidiert das Glyceryl-S-ACP zu 2-Hydroxy-3-Oxopropionyl-ACP. Die Acyl-CoA Dehydrogenase FkbI katalysiert die Umwandlung zu HM-S-ACP, das während der Biosynthese von Zwittermicin A als Verlängerungseinheit verwendet wird. HM-S-ACP wird durch die O-Metyhltransferase FkbG zu MM-S-ACP, das dann während der Biosynthese von FK520, Ansamitocin P-3, Oxazolomycin und Geldanamycin inkorporiert wird5,76 81 (siehe Abb. 9 für die Biosynthese von HM-S-ACP und MM-S-ACP). –

18 Einleitung

Tab. 1: Die Proteine für die Eingliederung Glycerin-abgeleiteter Vorstufen in FK520, Ansamitocin P-3, Oxazolomycin, Geldanamycin, Zwittermicin A, Tetronomycin und Chlorothricin

Glyceryl- 3- ACP Transferase/ Hydroxyacyl- Acyl-CoA O-MT DH Hydrolase/ Phosphatase CoA DH DH AT

FkbJ FkbH FkbK FkbI FkbG - - Asm14 Asm16 Asm13 Asm15 Asm17 - - OzmE OzmB OzmG OzmD OzmF - - GdmJ GdmH GdmK GdmI GdmG - - ZmaD ZmaN ZmaG ZmaE - - - Tmn7a Tmn16 - - - Tmn7 Tmn17 ChlD2 ChlD1 - - - ChlD3 ChlD4

Charakteristisch für die Polyketide Tetronomycin (Tmn) und Chlorothricin (Chl) ist der fünfgliedrige Tetronsäurering (4-Hydroxy-2(5H)-Furanon), dessen Vorläufer 1,3-BPG darstellt5,60,82. Der Mechanismus der Eingliederung unterscheidet sich von dem Mechanismus der FK520 Biosynthese. ChlD1 und Tmn16 der Chlorothricin bzw. Tetronomycin Biosynthese sind zwar FkbH-Homologe, unterscheiden sich aber durch die N-terminale Extension von ungefähr 260 Aminosäuren von den anderen Proteinen der FkbH-Familie5. ChlD2 und Tmn7a zeigen Homologien zu FkbJ. Sun et al. wiesen die Beladung von ChlD2 und Tmn7a durch ChlD1 und Tmn16 mit 1,3-BPG in vitro nach5. Die BGC für Chlorothricin und Tetronomycin enthalten keine Proteine, wie FkbK, FkbG und FkbI, für die Synthese von HM-S-ACP oder MM-S-ACP. Dagegen wird vermutet, dass Tmn7 und ChlD3 die 2,3-Dehydrierung zu Enoylpyruvoyl-S-ACP katalysiert, während Tmn17 und ChlD4 mit putativer Hydrolase- oder Acyltransferasefunktion für die

Abb. 10: Strukturen der Polyketide Oxazolomycin, Geldanamycin, FK520, Tetronomycin, Chlorothricin, Ansamitocin P-3 und Zwittermicin A. Die blauen Markierungen zeigen die 1,3-BPG-abgeleiteten Verlängerungseinheiten.

19 Einleitung

Eingliederung von Enoylpyruvoyl-S-ACP in das Tetronomycin- und Chlorothricin-Aglykon verantwortlich sind82.

Die Strukturen von FK520, Ansamitocin, Oxazolomycin, Geldanamycin, Zwittermicin A, Tetronomycin und Chlorothricin sind in der Abb. 10 abgebildet. Die Glycerin-abgeleiteten Vorläufer sind in blau markiert. Die hier genannten Beispiele für ungewöhnliche Starter- und Verlängerungseinheiten stellen nur einen kleinen Teil der Substratvielfalt für PKS I dar und tragen dabei zur enormen, strukturellen Vielfalt und Komplexität der Polyketide bei.

20 Einleitung

III. Die Identifikation des fox-Clusters und die Biosynthese von Foxicin

Der Stamm S. diastatochromogenes pokOIV produziert das para-Quinon Foxicin A undΔ seine Derivate Foxicin B-D. Im Rahmen der Dissertation von Dr. Anja Greule wurde die Struktur von Foxicin A als (S)-2-Hydroxy-3-(Acetylamino)-5- Abb. 12: Struktur von Foxicin A. (S)-2-Hydroxy-3- (3´´, 5´´S, 7´´-trimethyl-hepta-3´´E, 6´´-dienoyl- (Acetylamino)-5-(3´´, 5´´S, 7´´-trimethyl-hepta-3´´E, 6´´- dienoyl-amino)-1,4-Benzoquinon. amino)-1,4-Benzoquinon, durch verschiedene, spektroskopische Methoden gelöst (siehe Abb. 12). Der 1,4-Benzoquinonring bildet das Zentrum der Struktur von Foxicin A. An der Position C-2 befindet sich eine Hydroxylgruppe und an der Position C-3 ein Aminoacetat. An das C-5 ist eine Seitenkette über eine Aminogruppe verknüpft, die zwei dreifach substituierte Doppelbindungen enthält. Verbunden sind die Doppelbindungen über eine Methingruppe am C-5´´ die ebenfalls methyliert ist. Die erste Doppelbindung steht in Konjugation zur Amid-Carbonyl-Gruppe und besitzt die E-Konfiguration, sowie eine Methylgruppe am C-3´´. Die zweite Doppelbindung liegt zwischen den Positionen C-6´´ und C-7´´. An der Position C-7´´ befinden sich zwei weitere Methylgruppen4.

Das 57,71 kb fox-Cluster ist verantwortlich für die Biosynthese von Foxicin und wurde von Dr. Anja Greule identifiziert (siehe Abb. 11)83. Die Analysen der 41 ORFs des fox-Clusters und die Struktur von Foxicin A führten zur Aufstellung eines möglichen Biosyntheseweges. Die Gene foxBI, foxBII und foxBIII codieren für eine putative, hybride PKS I/NRPS. FoxBII ist aus drei Modulen aufgebaut, mit der Domänenarchitektur ACP-KS1-AT1-DH1-KR1-ACP1-KS2-AT2-DH2-KR2-ACP2-C- FkbH und für die Biosynthese der Seitenkette verantwortlich (siehe Abb. 11, B.). Isobutyryl-CoA wird als Startereinheit erwartet und die AT1 und AT2 zeigen eine Spezifität zu Methylmalonyl-CoA.

21 Einleitung

Die DH1 mit konserviertem HXXXGXXXXP-Motiv ist wahrscheinlich verantwortlich für die -Doppelbindung zwischen der Starter- und der ersten Verlängerungseinheit. Die FkbH-

,ähnlicheγ Domäne (FkbH-like domain; FLD) inkorporiert eine Glyceryl-Einheit in die naszierende Polyketidkette, indem es sein Substrat 1,3-BPG dephosphoryliert, kovalent über ein konserviertes Cystein bindet und anschließend auf das PCP von FoxBIII überträgt. Die drei Gene foxGI, foxGII und foxGIII (siehe Abb. 11, A., hellblau) codieren für eine putative Glycerinaldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase, eine putative Zuckerisomerase und eine putative Fructose-1,6-bisphosphat- Aldolase. FoxGI-III synthetisieren 1,3-BPG, das Substrat für die foxFLD. Die A-Domäne, codiert durch foxBI, ist verantwortlich für die Auswahl und die Aktivierung einer Aminosäure. In silico Analysen ergaben dabei keine besondere Spezifität der A-Domäne. Allerdings wird eine nichtproteinogene Aminosäure mit zwei Amidgruppen erwartet, wie z.B. 2,4-Diaminobutyrat, die dann mit der Glyceryl-Einheit verknüpft wird. Die Polyketidkette, generiert von FoxBII, wird dann mit der Aminosäure-Glyceryl-Verbindung verknüpft und das Molekül wird von der TE abgespalten. Es folgen Modifikationen, wie die Ringbildung, deren Mechanismus bislang unklar ist und die N- Acetylierung durch die putative N-Acetyltransferase FoxA. Die Gene foxTI-TIII und foxTVIII-TX codieren für ABC-Transporter, foxTIV-TVII codieren für Transporter der major-facilitator superfamily (MFS). Das fox-Cluster codiert des Weiteren für zehn putative Regulatoren4 (siehe

Abb. 13: Postulierte Biosynthese von Foxicin A. 1| Synthese der Seitenkette durch FoxBII; ACPS inkorporiert Isobutyryl-CoA als Startereinheit; AT1 und AT2 zeigen Spezifität zu Methylmalonyl-CoA; DH1 ist verantwortlich für die -Doppelbindung; 2| FoxGI, FoxGII und FoxGIII synthetisieren 1,3-BPG; die FkbH-ähnliche Domäne dephosphoryliert 1,3-BPG und läd die Glyceryl-Einheit auf das PCP von FoxBIII; 3| Die A-Domäne von FoxBI aktiviert eine nicht- ,proteinogene γ Aminosäure (AS), wahrscheinlich 2,4-Diaminobutyrat und verknüpft die AS mit der Glyceryl-Einheit am PCP; 4| die Seitenkette, synthetisiert von FoxBII, wird mit der AS verknüpft; 5| die TE entlässt das Molekül und es kommt zur Ringbildung; 6| die AT FoxA führt die N-Acetylierung ein; 7| es folgen weitere Modifikationen resultierend in Foxicin A.

22 Einleitung

Tab. 53 für in silico Analysen der ORFs des fox-Clusters aus S. diastatochromogenes Tü6028). Teile der postulierten Biosynthese sollten im Rahmen dieser Arbeit näher betrachtet und untersucht werden.

Foxicin A zeigt moderate antimikrobielle Aktivität gegen Streptomyces viridochromogenes, Saccharothrix espanaensis und gegen die Cyanobakterien Synechococcus sp. und Synechocystis sp. und inhibiert in vitro die Atmungskette von Escherichia coli. Die Biosynthese von Foxicin A wird

4 in Anwesenheit von FeCl3 und FeSO4 reduziert . Dies legt die Vermutung nahe, dass Foxicin A als

Siderophor fungieren könnte. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss von FeCl3 und FeSO4 auf die Foxicin A Produktion weiter untersucht und die Frage geklärt werden, ob es sich bei Foxicin A um einen Siderophor handelt.

IV. Siderophore

Eisen ist das vierthäufigste Element der Erdkruste und nach Aluminium das am häufigsten vorkommende Metall. Trotz seines hohen Vorkommens ist Eisen unter aeroben Bedingungen und bei neutralem pH nicht bioverfügbar, da es als unlösliches Eisenoxidhydrat vorliegt. Aufgrund seiner günstigen Redox-Chemie und der Beteiligung am Elektronentransport und weiteren Stoffwechselprozessen, ist Eisen essentiell für alle Lebewesen84. Bakterien, Pilze und Pflanzen produzieren und sekretieren Siderophore (griechisch: sídero = Eisen; foréas = Träger), um diese Einschränkungen der Bioverfügbarkeit zu umgehen. Siderophore sind Naturstoffe von niedrigem molekularem Gewicht (500-1500 kDa) und mit hoher Affinität zu Fe3+ (K(f) > 1030), deren Biosynthese über die Eisenkonzentration in der Umgebung reguliert wird84 87. Befindet sich viel freies Eisen in der Umgebung, kann es durch freie Diffusion in die Zelle gelangen.– Unter Eisen- limitierten Bedingungen findet der Transport in die Zelle aktiv und mit der Hilfe von Siderophoren statt85. In Gram-negativen Mikroorganismen erkennt und bindet ein Rezeptor der äußeren Membran (outer membrane receptor; OMR) den Siderophor-Fe3+-Komplex. Der Transport über die äußere Membran ist energieabhängig und wird durch den TonB-Komplex ermöglicht, indem die protonenmotorische Kraft der Cytoplasmamembran (CM) genutzt wird. Im Periplasma binden periplasmatische Bindeproteine (PBP) den Siderophor-Fe3+-Komplex und der Transport über die CM erfolgt anschließend durch einen ABC-Transporter. Durch die Reduktion von Fe3+ zu Fe2+ oder durch die Hydrolyse des Siderophor-Fe3+-Komplexes wird Eisen im Cytoplasma freigesetzt und der Siderophor kann wiederum durch Effluxpumpen sekretiert werden85,88. Gram-positive Mikroorganismen zeichnen sich durch ihre dicke (20-80 nm) Peptidoglykanschicht aus, besitzen allerdings keine äußere Membran89. Deshalb unterscheidet sich die Aufnahme von

23 Einleitung

Siderophor-Fe3+-Komplexen von der Aufnahme in Gram-negativen Organismen. Die PBP und ABC- Transporter sind in Gram-positiven Bakterien ebenfalls beteiligt85.

Die Aufnahme von Siderophor-Fe3+-Komplexen ist durch die Eisen-abhängigen, transkriptionellen Regulatorproteine Fur (ferric uptake regulator) und DtxR (Diphteria-Toxin Repressor) /IdeR (iron dependent regulator) streng reguliert. Fur Proteine findet man hauptsächlich in Gram-negativen und DtxR Proteine findet man hauptsächlich in Gram-positiven, GC-reichen Mikroorganismen wie Streptomyces. Die metalloregulatorischen IdeR-Proteine wurden in Mycobacterium smegmatis identifiziert84,86,90,91. Am N-Terminus der Regulatoren ist die DNA-Bindestelle mit helix-turn-helix-Motiv lokalisiert, während zwei Metallbindestellen am C-Terminus zu finden sind. Eisen bindet an die entsprechende Stelle und erhöht somit die Affinität des Regulators zur Zielsequenz der DNA, wodurch deren Transkription verhindert wird. Unter Eisen-limitierten Bedingungen sind diese Bindestellen frei, der Regulator kann nicht an seine Zielsequenz binden und es kommt zur Transkription. Die Biosynthese von Siderophoren ist somit abhängig von der extrazellulären Eisenkonzentration.

Abb. 14: Funktionelle Gruppen von Siderophoren (A) und ausgewählte Siderophore (B). A| -Hydroxycarboxylat als häufige funktionelle Gruppen; -Hydroxyphenyloxazolon, -Aminocarboxylat und -Hydroxyimidazol als seltene funktionelle Gruppen;Catecholat, B| Mycobactin Hydroxamat und und Enterobactin werden durch NRPS synthetisiert, während Aerobactin und Desferrioxamin E durch NRPS-unabhängige Biosynthesewege produziert werden.

Die strukturell vielfältigen Siderophore können anhand ihrer funktionellen Gruppen in drei -Hydroxycarboxylate. Seltener

Hauptgruppen eingeteilt werden: Catecholate, Hydroxamate und-Aminocarboxylate oder der sind Siderophore der Hydroxyphenyloxazolone, der 24 Einleitung

-Hydroxyimidazole. In der Regel haben Siderophore eine höhere Affinität zu Fe3+ als zu Fe2+,

3+ wobei die Siderophor-Fe -Komplexe von hoher thermodynamischer Stabilität sind. Die meisten Siderophore werden über NRPS biosynthetisiert, während andere sogenannte NRPS-unabhängige Siderophore (NRPS-independet siderophore; NIS) sind. Mycobactin aus M. tuberculosis92 und Enterobactin aus Salmonella typhimurium93 werden NRPS-abhängig synthetisiert, während Aerobactin, isoliert aus verschiedenen pathogenen Gram-negativen Mikroorganismen, oder die Desferrioxamine aus Streptomyces sp. durch einen NIS-Biosyntheseweg synthetisiert werden94,95.

Siderophore finden zahlreiche Anwendungen, z.B. in der Landwirtschaft, wo sie eine umweltfreundlichere Alternative zu Pestiziden darstellten. Die Pyoverdine, produziert von Pseudomonas sp., verbessern das Wachstum von Arabidopsis thaliana durch die Bereitstellung von Eisen96. Für pathogene Bakterien ist Eisen ein wichtiger Virulenzfaktor. Durch die Symbiose von Siderophor-produzierenden Pseudomonas fluorescens AH2 und der Regenbogenforelle Oncorynchus mykiss (Walbaum) wird das Wachstum des Fischpathogenen Vibrio anguillarum inhibiert97. Von großem Interesse sind Sideromycine, die auch als bezeichnet werden können. Hierbei handelt es sich um Siderophore, die mit einem„trojanische Antibiotikum Pferde verbunden sind. Durch die Siderophor-Fe3+-Komplex vermittelte Aufnahme von Sideromycinen in pathogene Mikroorganismen können Antibiotika eingeschleust werden87,98. Albomycin, produziert von Streptomyces sp. ATCC 700974, ist wirksam gegen die humanpathogenen Mikroorganismen Yersinia enterocolitica, ein naher Verwandter von Y. pestis und gegen Streptococccus pneumoniae99. Gosh et al. (2017) synthetisierten ein Konjugat aus einem Siderophor, einem kurzen Linker und dem Lipopeptid Daptomycin. Das synthetische Sideromycin inhibiert das Wachstum mehrerer, multiresistenter Acinetobacter baumannii Stämme im nanomolaren MIC- Bereich100.

Die nahezu universalen Anwendungsbereiche der Siderophore machen sie zu einem spannenden und vielversprechenden Forschungsobjekt.

V. Transkriptionelle Regulatoren und die Regulation der Naturstoff- Biosynthese

Die Produktion bakterieller Naturstoffe ist eng an die morphologische Differenzierung gekoppelt. So tritt auf Festmedien die Produktion von Sekundärmetaboliten mit der Bildung von Luftmycel und Sporen ein. In Flüssigkulturen ist die Bildung von Sekundärstoffen ein Resultat von Nährstoffmangel während der stationären Phase101. Als Sensor für Stickstoffmangel erkennt die Ribosomen-assoziierte ppGpp Synthetase RelA unbeladene tRNAs. Daraufhin wird die Synthese des phosphorylierten Guanosins (p)ppGpp eingeleitet, wodurch die Transkription von rRNA

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Genen verringert und die Transkription von BGCs für die Sekundärstoffproduktion aktiviert wird102. In Bakterien wird die Transkription durch Transkriptionsfaktoren reguliert, die in transkriptionelle Regulatoren, Ein-Komponentensysteme, DNA-bindende response Regulatoren und Sigmafaktoren unterteilt werden können103. Aktivatoren stabilisieren meistens den Promotor-Polymerase-Komplex oder beschleunigen die Öffnung dieses Komplexes104, wohingegen Repressoren mit einem Aktivator um die Bindung konkurrieren, an einen Promotor binden und somit die Bindung der RNA-Polymerase verhindern oder die Elongation inhibieren105. Transkriptionsfaktoren erkennen also einen bestimmten Umweltstimulus und verbinden ihn mit der Transkription von Genen. Transkriptionsregulatoren können, je nach Sequenz und Funktion, verschiedenen Familien zugeordnet werden. Die AraC/XylS Familie der transkriptionellen Regulatoren sind z.B. am Metabolismus von C-Quellen beteiligt und in der Regel Aktivatoren. Mitglieder der AraC/XylS Familie sind durch eine Größe von ungefähr 300 Aminosäuren definiert und besitzen zwei Domänen. Der C-terminale helix-turn-helix Bereich ist für die DNA-Bindung zuständig, während die variable N-terminale Domäne für die Dimerbildung und die Bindung des Liganden verantwortlich ist106,107. AdpA aus S. griseus ist gut untersucht und einer der bekanntesten Vertreter der AraC/XylS Familie. AfsA unterstützt die Biosynthese des A-Faktors (2-Isocapryloyl-3R-Hydroxymethyl- -Butyrolacton), der wiederum an ArpA bindet, woraufhin sich ArpA vom adpA Promotor löst.γ AdpA aktiviert eine Vielzahl an Prozessen in S. griseus, darunter die morphologische Differenzierung und die Biosynthese von Streptomycin und Grixazon108,109. Die Familie der TetR/AcrR Regulatoren, eine der häufigsten Regulatorfamilien in Bakterien, agieren als chemische Sensoren für die zelluläre Umwelt105,110. Das erste Mitglied der TetR/AcrR Familie ist der Repressor TetR der Tetrazyklin-Effluxpumpe TetA und vermittelt somit die Tetrazyklin-Resistenz in E. coli. In Abwesenheit von Tetrazyklin bindet das TetR Dimer an den Operator von tetA und verhindert so die Transkription. Ist Tetrazyklin anwesend, bindet es an TetR und reduziert so dessen Affinität zum tetA Operator, woraufhin tetA transkribiert wird. Die Bindung an die DNA wird durch den ungefähr 50 Aminosäuren großen N-terminalen Bereich (HTH-Motiv) vermittelt. Der variable C-terminale Bereich kann hingegen eine Vielzahl an Liganden binden105,111 -Butyrolacton Rezeptor ArpA gehört zur

105 Familie der TetR/AcrR. AuchFamilie der bereits. Mitglieder beschriebene der MarR γ (multiple antibiotic resistance regulator) Familie können sowohl Aktivatoren als auch Repressoren der Transkription sein. Reguliert wird auch hier durch Liganden-abhängige Bindung an bestimmte DNA-Bereiche112. Die LuxR Regulatoren sind nach dem Aktivator des Lumineszenz-Operons in Vibrio fisheri benannt und Vertreter dieser Familie sind vor allem am Quorum Sensing beteiligt113. Die Familie der ROK (Repressor, ORF, Kinase) Regulatoren kann in zwei Gruppen aufgeteilt werden, die Zuckerkinasen und die Zucker-abhängigen, transkriptionellen Repressoren. Diese Gruppen unterscheiden sich in ihrem N-terminalen Bereich. Die Zuckerkinasen tragen ein ATP-Bindemotiv, während die Repressoren ein HTH-Motiv aufweisen. Eine Gemeinsamkeit aller ROK-Regulatoren sind die

26 Einleitung

ROK-Boxen. Diese bestehen aus zwei charakteristischen Sequenzen, einer Sequenz mit konserviertem EXGH aus 28 AS und einer Sequenz mit konserviertem CXCGXXGCXE aus 14 AS105,113. Eine weitere Familie transkriptioneller Regulatoren ist die DeoR Familie, benannt nach dem Deo Operon in E. coli für den Nukleosid- und Deoxynukleosid-Katabolismus, dessen Transkription von DeoR reprimiert wird. Die Vertreter der DeoR Familie sind überwiegend Repressoren, aber auch einige Aktivatoren befinden sich darunter. Charakteristisch ist eine Größe von ungefähr 250 Aminosäuren, ein N-terminales HTH-Motiv und eine C-terminale Region für die Oligomerisierung und das Binden von, meist phosphorylierten, Effektoren114 117. Die DeoR Regulatoren sind z.B. an Metabolismus von Glycerinphosphat (GlpR), Glucitol (GutR),– Fucose (FucR), L-Ascorbinsäure (UlaR) und Deoxyribonukleosiden (DeoR) beteiligt105. Die Vielzahl an transkriptionellen Regulatoren gibt einen Einblick in die komplexen, zellulären Regulationsprozesse. Umweltveränderungen stellen überwiegend die Effektoren für die transkriptionellen Regulatoren dar. Diese aktivieren oder reprimieren daraufhin die Transkription, was der Zelle eine optimale Anpassung an die Umwelt erlaubt.

Das fox-Cluster codiert für zehn, hauptsächlich transkriptionelle Regulatoren, was auf eine komplexe, vielschichtige Regulation der Biosynthese hinweist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Regulatoren durch in silico und in vivo Analysen näher charakterisiert.

27 Einleitung

VI. Ziele dieser Arbeit

Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit lag in der Untersuchung der Foxicin Biosynthese und deren Regulation, sowie die Charakterisierung der biologischen Rolle von Foxicin.

S. diastatochromogenes pokOIV zeigt, gegenüber dem Wildtyp, eine gesteigerte Foxicin

3,4 Produktion . Die BiosyntheseΔ von Foxicin sollte durch die rekombinanten Proteine FoxGI-GIII, der FkbH-ähnlichen Domäne foxFLD und der PCP-Domäne von foxBIII in verschiedenen in vitro Assays untersucht werden. Durch in silico Analysen und Überexpression der Regulatorgene foxRI-RX sollten weitere Erkenntnisse über die Regulation der Foxicin Biosynthese gewonnen werden. Weiterhin sollte die Aktivität von Foxicin charakterisiert werden und verschiedene Faktoren, die Einfluss auf die Foxicin Biosynthese haben, sollten identifiziert werden.

In Greule et al. (2017) wurden BGC aus Streptomyces sp. mit dem fox-Cluster verglichen4. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die entsprechenden BGC von S. collinus Tü365, S. avermitilis MA-4680 und S. bingchenggensis BCW-1 näher beschrieben. Das BGC 7 aus S. collinus Tü365 sollte, für weitere Untersuchungen, durch die Transformations-assoziierte Rekombination aus dem Genom extrahiert werden.

Außerdem wurden, im Rahmen der Aktualisierung und Erweiterung der StreptomeDB, Informationen zu Streptomyceten und Naturstoffen aus Publikationen extrahiert und kategorisiert.

28 Material und Methoden

Material und Methoden

I. Material

I. 1. Bakterienstämme

In der Tab. 2 sind die verwendeten Escherichia coli Stämme aufgelistet, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Die Tab. 3 beschreibt die verwendeten und modifizierten Aktinomyceten Stämme und die Tab. 4 zeigt weitere Stämme, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Stämme die mit einem Asterisk (*) gekennzeichnet sind, wurden ausschließlich in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay, Department for Biochemistry, University of Cambridge, UK verwendet.

Tab. 2: verwendete E. coli Stämme

Bakterienstamm Genotyp Verwendung Referenz

Escherichia coli endA1 gyrA96 thi-1 recA1 hsdR17 Klonierung Stratagene XL1-Blue supE44 relA1 lac [F' proAB, lacIqZ M15, Tn10 (TetR)]

E. coli BL21 (DE3) F- ompTΔ hsdSB(rB-mB-) gal dcm Heterologe Proteinproduktion Invitrogen Star rne131 (DE3)

E. coli BL21 (DE3) F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm Heterologe Proteinproduktion Invitrogen x pLysS (DE3) pLysS (CamR)

E. coli BL21 (DE3) F- ompT hsdSB(rB-mB-) dcm TetR gal Heterologe Proteinproduktion 118 Codon Plus RP endA Hte [argU proL CamR] x pL1SL2 pL1SL2 (AmpR)

E. coli ET12567 dam13::Tn9 dcm6 hsdM hsdR, Intergenerische Konjugation 119,120 x pUB307 zij201::Tn10 recF143 galK2 galT22 ara14 lacY1 xyl5 leuB6 thi1 tonA31 rpsL136 hisG4 tsx78 mtli glnV44 F- pUB307 (KanR)

E. coli ET12567 dam13::Tn9 dcm6 hsdM hsdR, Intergenerische Konjugation 121 x pUZ2008 zij201::Tn10 recF143 galK2 galT22 ara14 lacY1 xyl5 leuB6 thi1 tonA31 rpsL136 hisG4 tsx78 mtli glnV44 F- pUZ2008 (KanR)

E. coli Rosetta 2 F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm Heterologe Proteinproduktion Novagen pRARE23 (CamR)

E. coli OverExpress F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm Heterologe Proteinproduktion Lucigen C41 (DE3), (*) (DE3)

E. coli BL21 (DE3) x F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm Heterologe Proteinproduktion Takara pGro7 (*) (DE3), pGro7 (CamR, araB Promotor)

29 Material und Methoden

Tab. 3: verwendete Aktinomyceten Stämme

Bakterienstamm Beschreibung Referenz

Streptomyces Polyketomycin-Produzent 9, 10 diastatochromogenes Tü6028

Streptomyces Foxicin-Produzent 3 diastatochromogenes pokOIV deletierte pokOIV Monooxygenase des Polyketomycin- Biosynthesegenclusters ∆ S. diastatochromogenes pokOIV, S. diastatochromogenes pokOIV mit unterbrochenem foxGI Diese Arbeit foxGI::pKC1132-foxGIint (ApraR) ∆ ∆ S. diastatochromogenes pokOIV, S. diastatochromogenes pokOIV mit deletiertem foxGI durch Diese Arbeit foxGI das CRISPR-Cas9 System ∆ ∆ S.∆ diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit pCRISPR-Cas9-foxGI zur Diese Arbeit pokOIV x pCRISPR-Cas9-foxGI Deletion von foxGI mit dem CRISPR-Cas9 Sytem ∆ ∆S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRI foxRI (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRI des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRII foxRII (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRII des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRIV foxRIV (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRIV des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRVI foxRVI (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRVI des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRVII foxRVII (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRVII des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRVIII foxRVIII (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRVIII des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRIX foxRIX (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRIX des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. diastatochromogenes Tü6028 S. diastatochromogenes pokOIV mit integriertem pTESa- Diese Arbeit pokOIV::pTESa-foxRX foxRX (ApraR) zur in vivo Analyse des Regulators foxRX des Foxicin-Biosynthesegencluster∆ ∆ S. collinus Tü365 Biosynthesegencluster #7 besitzt große Ähnlichkeit zum 52 Foxicin-Biosynthesegencluster

Tab. 4: weitere, verwendete Stämme

Bakterienstamm Beschreibung Referenz

Bacillus subtilis COHN Gram-positiver Teststamm ATCC® ATCC6051

30 Material und Methoden

Bakterienstamm Beschreibung Referenz

Saccharomyces cerevisiae Hefestamm für TAR-Klonierung 122 VL6-48N MATα, his3- 200, trp1- ura3- lys2, ade2-101, met14, ciro

∆ ∆, ∆,

I. 2. Oligonukleotide

In der nachfolgenden Tab. 5 sind die verwendeten Oligonukleotide aufgelistet. Alle Oligonukleotide wurden von der Firma Eurofins (Ebersberg) bezogen.

Tab. 5: verwendete Oligonukleotide

Primername Sequenz - mit eingefügter Schnittstelle Verwendung

PCR-Primerpaare zur heterologen Proteinproduktion.

C-GDH_PciI_16 GGCACATGTTATGACTGTCAATGACGACTC Amplifikation von foxGI zur GDHCX AATACTCGAGAGCCACCGGGGCCGGGTAG heterologen Proteinproduktion mit C-terminalem His6-Tag

TPIfw_NcoIC_7 ATATCCATGGGCATGAACAAGCATCAGTG Amplifikation von foxGII zur TPIrev_XhoIC_8 ATATCTCGAGCAGACTCGCCGGGCTGAGG heterologen Proteinproduktion mit C-terminalem His6-Tag

FDAfw_NcoIC_11 ATATCCATGGTGCCACTCGCCGCAACCGGTGAAC Amplifikation von foxGIII zur FDACX ATATACTCGAGGGCCCGTAGGACGCCGATG heterologen Proteinproduktion mit C-terminalem His6-Tag

N-GDH_NdeI_14 GCGGATCATATGACTGTCAATGACGACTCG Amplifikation von foxGI zur N-GDH_XhoI+S_15 GCAATACTCGAGCTACGAGTCAGGCCACC heterologen Proteinproduktion mit N-terminalem His6-Tag

N-TPI_NdeI_18 GCGCCATCATATGAACAAGCATCAGTGG Amplifikation von foxGII zur N-TPI_XhoI+S_19 AATACTCGAGCCGGTTCAGTGACTCG heterologen Proteinproduktion mit N-terminalem His6-Tag

FDAfw_NdeIN_9 ATATCATATGCCACTCGCCGCAACCGGTGAAC Amplifikation von foxGIII zur FDArev_XhoIN_10 ATATCTCGAGCATCAGGCCCGTAGGACG heterologen Proteinproduktion mit

N-terminalem His6-Tag

FkbH_fw ATATCTCGAGTCACGGCTGCCGCCAGGAG Amplifikation von fkbH zur FkbH_rev ATACATATGCCGAAGGTGATCGCGGTGGAC heterologen Proteinproduktion mit N-terminalen His6-Tag

fkbH_strep_rev ATAAGCTTATGCCGAAGGTGATCGCGGTGGAC Amplifikation von fkbH zur heterologen Proteinproduktion mit N-terminalem Strep-II-Tag

PCPmini_fw CTCGAGTCAGAGGGCGGTTCCGGATC Amplifikation der minimalen PCP PCPmini_rv CATATGGCGGCTCCGTACGTG Domäne von foxBIII zur heterologen Proteinproduktion mit N-terminalem His6-Tag

foxCP_fw_XhoI+S CTCGAGTCAGTCCAGCAGCATGTG Amplifikation der PCP Domäne von foxCP_rv_NdeI ATATCATATGCCTGACGTGAACGAC foxBIII zur heterologen Proteinproduktion mit N-terminalem His6-Tag

31 Material und Methoden

Primername Sequenz - mit eingefügter Schnittstelle Verwendung

PCR-Primerpaare für die Inaktivierung und Komplementierung von foxGI

fwGDH_ko CACAGGAAACAGCTATGA Amplifikation des internen Bereichs rvGDH_ko GCGATTAAGTTGGGTAAC von foxGI zur Inaktivierung mittels single crossover

G3P_for GAACCTTCCGGGTGTCTG Amplifikation von foxGI zur G3P_rev GATGAGGGTCGGGTTACG Komplementierung von S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint Δ PCR-Primerpaare für die Sequenzierung

lac-for CACAGGAAACAGCTATGA Sequenzierung von DNA-Fragmenten lac-rev GCGATTAAGTTGGGTAAC in pUC19 oder pBSK-

pET_seq_fw_29 CAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCG Sequenzierung von DNA-Fragmenten pET_seq_rev_30 ATTGTGAGCGGATAACAATTCCC in pET28a

PCR-Primerpaare zur Amplifikation der Regulatoren des Foxicin Biosynthesegencluster.

foxRI_fw ATATGGTCCGCACGACTACTC Amplifikation des Regulatorgens foxRI_rv ATATGAGTACCGCACGAGGG foxRI aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRII_fw ATACGAGCAGTACACGGATCAC Amplifikation des Regulatorgens foxRII_rv ATATCTAGCGTGACCGTCATGG foxRII aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRIII_fw ATATCCGTACGGGTGGTCAC Amplifikation des Regulatorgens foxRIII_rv ATATGCCGTCGAAGGTCGAGGAG foxRIII aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRIV_fw ATATCGGGCTGGTCACACG Amplifikation des Regulatorgens foxRIV_rv ATACATGCGGTCGAGACTAC foxRIV aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRVI_fw ATATGGCCGTCAGGAAGTAGTG Amplifikation des Regulatorgens foxRVI_rv ATATCGCCCATTCACCACTGC foxRVI aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRVII_fw TATGACGCACCATGAACG Amplifikation des Regulatorgens foxRVII_rv ATATGCGGCACTACTTCCTG foxRVII aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRVIII_fw ATATGAGGGCGAGTCTGTC Amplifikation des Regulatorgens foxRVIII_rv ATATCCGGGTGCGTGATG foxRVIII aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRIX_fw ATATGGCAGTACGCCTAGACC Amplifikation des Regulatorgens foxRIX_rv ATATGCGGATCATGACAGACTC foxRIX aus S. diastatochromogenes Tü6028

foxRX_fw TATATCTCCTCGGTGGGATGCGATGG Amplifikation des Regulatorgens foxRX_rv TATATGCATGGCGTGCATGCGATG foxRX aus S. diastatochromogenes Tü6028

pTESa_check_fw ATATCTGTTGTGGGCTGGAC Kontrolle der Exkonjuganten auf pTESa_check_rv ATATACGCAAACCGCCTCTC integrierten pTESa

32 Material und Methoden

Primername Sequenz - mit eingefügter Schnittstelle Verwendung

PCR-Primerpaare für pCRISPR-Cas9

ACGCCTACGTAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC sgRNA-R 123 sgRNA-F CATGCCATGG- N20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC 123 sgRNA2-F CATGCCATGGACGGCTGGTCTCGCGGCCGAGCCGCG 20 Nukleotide inseriert TTTTAGAGCTAGAAATAGC foxGI_3'_F ATATGGCACGGAAAGCGAGGTC Amplifikation - foxGI_3'_R ATATCGTAGGTCTCTGGCAGACAC codierenden Region von foxGI der nicht foxGI_5'_F TATATCTTTCGAGCTAGGCGGTGCTC Amplifikation - foxGI_5'_R ATATGCGGGCTGCTTCCCTGAG codierenden Region von foxGI der nicht crispr_GI_fw TATCACGGTCAGTAAGTCGACCAG Kontrolle der Exkonjuganten auf foxGI crispr_GI_rv ATATGTTCGATGCGTGCGTC Deletion fox_glpR_aac_rv CGAAGGGCGGCGGTGCCCACCCGCCGGGCGGGCACC GTCAAACAAAAGCTGGAGCTC

PCR-Primerpaare für die Transformations-assoziierte Rekombination aap20_04_Fw ATATAGCCCGAAGACCCTGATGG Amplifikation des upstream aap20_04_Re ATATGGCTGATGCCGTTCCTGTTC Fragmentes des Cluster 7 aus S. collinus Tü658

Down_XhoI_24 ATATACTCGAGGAACCGGACACGCCCTAGC Amplifikation des downstream Down_AgeI_25 ATATACCGGTGCCGACCTGCGGTCGCAGTACCC Fragmentes des Cluster 7 aus S. collinus Tü658

PCR-Primerpaare für den Kernbereich des BGC 7 aus S. collinus Tü365

Core1fw_EcoRV ATAGATATCACCGGGCTCTGCAGGTC Amplifikation der Kernregion 1 Core1rev ATATGCACCACGACCCTCAC (core 1)

Core2fw TATAGGAGGGCTTGGTCCTG Amplifikation der Kernregion 2 Core2rev ATATACGGGCACGACGTCC (core 2)

Core3fw ATATCCCGTGCGGGAAGAGC Amplifikation der Kernregion 3 Core3rev ATATCGCTGGAGGACCTGCTCAC (core 3)

Core4fw2 TATATCCCTGACCGGTTCCACCC Amplifikation der Kernregion 4 Core4rev2 ATATCACGCGCAGCTTCCG (core 4)

33 Material und Methoden

I. 3. Plasmide

Im Folgenden sind die Plasmide aufgeführt, die in dieser Arbeit verwendet, bzw. erstellt wurden.

I. 3. 1 Plasmide, die in dieser Arbeit verwendet wurden

Tab. 6: Plasmide, die in dieser Arbeit verwendet wurden

Plasmid Beschreibung Größe Referenz

pBluescript SK (-) bla als AmpR, Vektor zur Zwischenklonierung von PCR- 2958 bp Agilent Produkten durch die blunt end Schnittstellen EcoRV oder Technologies, SmaI in E. coli, lacZα -Komplementierung, hohe Santa Clara, Kopienzahl, ColE1-ori, f1(-)-ori Kalifornien, USA zur pCAP01 Hefeelemente: ARSH4/CEN6 Replikationsursprung, TRP1 9022 bp 124 Auxotrophiemarker; E. coli Elemente: pUC ori; Streptomyces Elemente: oriT, aph(3)III als KanR/NeoR, attP,

pCRISPR-Cas9 pGM1190φC Integrase Derivat, ermE* Promotor für sgRNA, tipA 11265 bp 123 Promotor für Cas9, StuI Schnittstelle für HDR Templates

pET28a T7-Promotor, T7-Terminator, C- und N-terminale His-Tag 5369 bp Novagen Sequenz, lacI, pBR322 origin, f1 origin, KanR

pET-STN-ttha0948 pET21a Derivat, N-terminaler Strep-Tag und TEV- 6459 bp AG Einsle Schnittstelle, bla als AmpR

pKC1132 aac(3) IV als ApraR, lacZα -Komplementierung, 3443 bp 125 pMB1-ori, oriT RK2, Shuttlevektor für E. coli und Streptomyceten, integrativzur in Streptomycetes

pLeere Amplifiktion von aac(3) IV als ApraR für die Redirect® 3893 bp Geneart, Technologie Regensburg

pTESa aac(3) IV als ApraR, pSET152 Derivat, attP flankiert von 5904 bp 126 loxP, ermE Promotor und tfd Terminator

pUWL-oriT pUWL201 Derivat mit oriT RK2 7390 bp 127

pUC19 bla als AmpR, hohe Kopienzahl (100+), Vektor zur 2686 bp 128 Zwischenklonierung von PCR-Produkten durch die blunt end Schnittstelle SmaI in E. coli, lacZα - Komplementierung, hohe Kopienzahl, ColE1-ori, f1(-)-ori zur pYH185 (*) pET28a(+) mit tmn7a des Tetronomycin Clusters zur 5 5 heterologen Proteinproduktion des ACPs Tmn7a mit N-teminalem His6-Tag, KanR

pYH94 (*) pET28a(+) mit tmn16 des Tetronomycin Clusters zur 5 5 heterologen Proteinproduktion des FkbH-ähnlichen Proteins Tmn16 mit N-teminalem His6-Tag, KanR

34 Material und Methoden

I. 3. 2 Plasmide, die in dieser Arbeit erstellt wurden

Tab. 7: Plasmide, die in dieser Arbeit erstellt wurden

Plasmid Beschreibung Größe Kapitel

pCAP01-Sco7 Plasmid für TAR mit flankierenden Bereichen des Clusters 7 11506 bp B.II. 4. 7. 9 aus S. collinus Tü365, KanR, TRP1 Auxotrophiemarker

pCRISPR-Cas9-foxGI Deletion von foxGI mit Hilfe des CRISPR-Cas9 Systems, HDR 12445 bp B.II. 4. 7. 7 durch foxGI flankierende Fragmente, sgRNA innerhalb von foxGI, ApraR, ThioR

pET28a-C-foxGI Plasmid zur heterologen Proteinproduktion von foxGI mit 6681 bp B.II. 4. 7. 3 C-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pET28a-C-foxGII Plasmid zur heterologen Proteinproduktion von foxGII mit 6157 bp B.II. 4. 7. 4 C-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pET28a-C-foxGIII Plasmid zur heterologen Proteinproduktion von foxGIII mit 6085 bp B.II. 4. 7. 5 C-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pET28a-N-PCP Plasmid zur heterologen Proteinproduktion der Peptidyl 6451 bp B.II. 4. 7. 2 carrier Proteindomäne von foxBIII mit N-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pET28a-N-PCPmini Plasmid zur heterologen Proteinproduktion der minimalen 5506 bp B.II. 4. 7. 2 Peptidyl carrier Proteindomäne von foxBIII mit N-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pET28a-N-fkbH Plasmid zur heterologen Proteinproduktion der fkbH-ähnlichen 6322 bp B.II. 4. 7. 1 Domäne von foxBII mit N-terminalem His6-Tag in E. coli, T7- Promotor, KanR

pET28a-N-foxGI Plasmid zur heterologen Proteinproduktion von foxGI mit 6746 bp B.II. 4. 7. 3 N-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pET28a-N-foxGII Plasmid zur heterologen Proteinproduktion von foxGII mit 6214 bp B.II. 4. 7. 4 N-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pET28a-N-foxGIII Plasmid zur heterologen Proteinproduktion von foxGIII mit 6147 bp B.II. 4. 7. 5 N-terminalem His6-Tag in E. coli, T7-Promotor, KanR

pKC1132-foxGIint single crossover Plasmid zur Unterbrechung von foxGI des 4518 bp B.II. 4. 7. 6 Foxicin-Biosynthesegenclusters, ApraR

pTESa-foxRI Überexpression von foxRI in S. diastatochromogenes pokOIV, 6636 bp B.II. 4. 7. 8 ermE Promotor, integrativ, ApraR Δ pTESa-foxRII Überexpression von foxRII in S. diastatochromogenes pokOIV, 7194 bp B.II. 4. 7. 8 ermE Promotor, integrativ, ApraR Δ pTESa-foxRIV Überexpression von foxRIV in S. diastatochromogenes pokOIV, 6457 bp B.II. 4. 7. 8 ermE Promotor, integrativ, ApraR Δ pTESa-foxRVI Überexpression von foxRVI in S. diastatochromogenes pokOIV, 6698 bp B.II. 4. 7. 8 ermE Promotor, integrativ, ApraR Δ pTESa-foxRVII Überexpression von foxRVII in S. diastatochromogenes pokOIV, 7043 bp B.II. 4. 7. 8 ermE Promotor, integrativ, ApraR Δ

35 Material und Methoden

Plasmid Beschreibung Größe Kapitel

pTESa-foxRVIII Überexpression von foxRVIII in S. diastatochromogenes 6634 bp B.II. 4. 7. 8 pokOIV, ermE Promotor, integrativ, ApraR

pTESa-foxRIX ΔÜberexpression von foxRIX in S. diastatochromogenes pokOIV, 7191 bp B.II. 4. 7. 8 ermE Promotor, integrativ, ApraR Δ pTESa-foxRX Überexpression von foxRX in S. diastatochromogenes pokOIV, 6723 bp B.II. 4. 7. 8 ermE Promotor, integrativ, ApraR Δ pUWL-T-foxGI Komplementierung von foxGI in der single crossover Mutante 8923 bp B.II. 4. 7. 6 S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint, ermE Promotor, replikativ, ThioR Δ pUWL-H-foxGI Komplementierung von foxGI in der single crossover Mutante 9321 bp B.II. 4. 7. 6 S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint, ermE Promotor, replikativ, HygR Δ

I. 4. Nährmedien

Alle Nährmedien wurden, falls nicht anders angegeben, mit H20dest. hergestellt und anschließend mit 1 M HCl oder 1 M NaOH auf den gewünschten pH-Wert eingestellt und autoklaviert. Für Festmedien wurden 16g/L Agar-Agar zugegeben. Antibiotika und andere hitzeempfindliche Lösungen wurden steril filtriert und nach dem Autoklavieren zugegeben.

Tab. 8: verwendete Nährmedien zur Kultivierung von Bakterien

Medium Bestandteile Anmerkung

LB 20 g/L LB-Trockenmedium Kultivierung von E. coli

LB 10 g/L Trypton Kultivierung von E. coli Stämmen zur 10 g/L NaCl heterologen Proteinproduktion. 5 g/L Hefeextrakt Auf pH=7.3 einstellen

TSB 30 g/L CASO-Bouillon Kultivierung von Streptomyceten

TB 12 g/L Trypton Kultivierung von E. coli Stämmen zur 24 g/L Hefeextrakt heterologen Proteinproduktion. 12,54 g/L KH2PO4 Auf pH=7 einstellen129 15 g/L K2HPO4 0,004 mL/L Glycerin

2xTY 16 g/L Trypton Kultivierung von E. coli Stämmen zur 10 g/L Hefeextrakt heterologen Proteinproduktion 5 g/L NaCl Auf pH=7 einstellen129

YPAD 20 g/L D-Glucose Kultivierung von S. cerevisiae VL6-48N 10 g/L Hefeextrakt 20 g/L Pepton 100 mg/L Adenin

Top-Agar 91,09 g Sorbitol Nach dem Autoklavieren Vitamin Lösung 5 g (NH4)2SO4 zugeben 15 g Agar-Agar Ad 450ml H2Odest.

36 Material und Methoden

Medium Bestandteile Anmerkung

Vitamin 20 g Glucose Steril filtrieren und zum autoklavierten Top- Lösung 6,8 g Yeast nitrogen base Agar geben 1,54 g Drop out Aminosäuren 0,38 g Leucin Ad 50ml H2Odest.

HA 4 g/L Hefeextrakt Auf pH=7,4 einstellen. 4 g/L Glucose Kultivierung von Actinomyceten zur 10 g/L Malzextrakt Naturstoffproduktion

MS 20 g/L Sojamehl, vollfett Auf pH 7,2 einstellen. 20 g/L Mannitol Für die intergenerische Konjugation wird MgCl2 10 mL/L MgCl2 (1M Stocklösung) durch 10 mL/L 1M CaCl2 Lösung ersetzt

NL4 1 g/L NaCl Auf pH 7,3 einstellen. 1 g/L KH2PO4 Kultivierung von Actinomyceten zur 0,5 g/L MgSO4 x 7 H2O Naturstoffproduktion. Spurenelementlösung 25 g/L Stärke nach dem Autoklavieren zugeben 1,46 g/L L-Glutamin 2 mL Spurenelementlösung

NL111 20 g/L Lab Lemco Fleischextrakt Auf pH 7,2 einstellen. 100 g/L Malzextrakt Kultivierung von Actinomyceten zur 10 g/L CaCO3 Naturstoffproduktion

DNPM 40 g/L Dextrin Auf pH 6,8 einstellen. 7,5 g/L Soyton Kultivierung von Actinomyceten zur 5 g/L Bäckerhefe Naturstoffproduktion 21 g/L MOPS

SG 20 g/L Glucose Auf pH 7,3 einstellen. 1 g/L Pepton Kultivierung von Aktinomyceten zur 0,2 g/L CaCO3 Naturstoffproduktion 100 µL/L 0,1 % CoCl2 x 6 H2O Lösung

Hefe(-Leu)- 180 g Sorbitol Medium zur Kultivierung von Saccharomyces Medium 10 g (NH4)2SO4 cerevisiae VL6-48N zur TAR-Klonierung 0,76 g Leucin In 900 mL H2Odest. lösen. Für Festmedien 3 % Agar-Agar zugeben.

40 g Glucose Steril filtrieren und zum autoklavierten 13,6 g Difco Yeast Nitrogen Base Medium geben ohne Aminosäuren 3 g Leu-/Trp-Aminosäurenmix In 100 mL H2Odest. lösen

SORB(-Leu)- 1 L Hefe(-Leu)-Medium Regeneration von Saccharomyces cerevisiae Medium 180 g/L Sorbitol VL6-48N Spheroblasten.

TOP-Agar- 1 L Hefe(-Leu)-Medium Top-Agar für Saccharomyces cerevisiae Leu 180 g/L Sorbitol VL6-48N Spheroblasten bei der TAR- 1,5 % Agar-Agar Klonierung.

37 Material und Methoden

Medium Bestandteile Anmerkung

NMMP Lösung A: Minimalmedium nach 130. 2 g (NH4)2SO4 Zu 80 mL Lösung A werden 15 mL Lösung B, 5 g Casaminosäuren 1 mL Lösung C und 2,5 mL Glucose-Lösung 0,6 g MgSO4 x 7 H2O (20 %) gegeben. Mit 2,5 mL einer Vorkultur 50 g PEG6000 oder Sporenlösung inokulieren. In 800 mL H2Odest. lösen Für NMMP-Fe wird Lösung C ohne FeSO4 x 7 H2O vorbereitet. Lösung B: 1 M NaH2PO4 1 M K2HPO4

Lösung C: 1 g/L ZnSO4 x 7 H2O 1 g/L FeSO4 x 7 H2O 1 g/L MnCl2 x 4 H2O 1g/L CaCl2 (wasserfrei)

I. 5. Chemikalien und weitere Reagenzien

Im Folgenden sind die verwendeten Chemikalien und Reagenzien, sowie deren Bezugsquelle, aufgeführt. Die mit einem Asterisk (*) gekennzeichneten Chemikalien und Reagenzien wurden ausschließlich in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay, Department for Biochemistry, University of Cambridge, UK verwendet.

I. 5. 1 Chemikalien

Tab. 9: verwendete Chemikalien und deren Bezugsquelle

Chemikalien Bezugsquelle

2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München [1-13C]-Natriumacetat Cambridge Isotopes Laboratories, Inc., USA [6-13C]-Glucose Deutero 2-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl- -D-galactopyranosid (X-Gal) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Acrylamid/Bisacrylamid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Adenosintriphosphat (ATP) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Agar-Agar Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Agarose Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Ammoniumperoxodisulfat (APS) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Ammoniumsulfat Merck KGaA, Darmstadt Bovines Serumalbumin (BSA) Promega, Mannheim Bromphenolblau Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Calciumchlorid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Casaminosäuren Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe CASO Bouillon Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Coomassie Brilliant Blue R250 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe D(+)-Glucose Monohydrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe d-Desthiobiotin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) Peqlab, Erlangen di-Kaliumhydrogenphosphat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe D-Mannitol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe D-Sorbitol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Eisen(II)sulfat Heptahydrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Eisen(III)chlorid Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

38 Material und Methoden

Chemikalien Bezugsquelle

Wasser Biotium, Hayward (USA) Glycerin Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe HefeextraktGelRed™ Nucleic Acid Gel Stain, . x in Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Hefeextrakt Mikrogranulat Imidazol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Kaliumdihydrogenphosphat CarlFormedium™, Roth GmbH Hunstanton, & Co. KG, Karlsruhe UK Kupfersulfat Merck KGaA, Darmstadt L-Arabinose (*) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München LB Medium (Lennox) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Magnesiumchlorid Hexahydrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Magnesiumsulfat Heptahydrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Malzextrakt Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Manganchlorid Merck, Darmstadt Methylenblau Merck KGaA, Darmstadt -Tetramethylethylendiamin (TEMED) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Natriumacetat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe NatriumchloridN,N,N,N Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Natriumchlorid Fisher Scientific, Loughborough, UK Natriumdihydrogenphosphat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Natriumdodecylsulfat (SDS) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Natriumhydroxid Plätzchen Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Natriumphosphat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Ni2+-NTA Agarose Quiagen, Hilden Nickelsulfat Hexahydrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe N-Lauroylsarcosine Natriumsalz Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Polyethylenglykol (PEG) 6000 Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Saccharose Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Sojamehl, vollfett W. Schoenenberger GmbH, Magstadt Tris(2-chlorethyl)phosphat (TCEP) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Tris-HCl Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Trypton Forme Trypton/Pepton aus Casein Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Yeast synthetic Drop-out Medium supplements Sigma-Aldrichdium™, Hunstanton,Chemie GmbH, UK München Yeast-Nitrogen Base ohne Aminosäuren Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Zinksulfat Merck KGaA, Darmstadt

39 Material und Methoden

I. 5. 2 Organische Lösemittel und Säuren

Tab. 10: Organische Lösungsmittel und Säuren

Organische Lösungsmittel und Säuren Bezugsquelle

Aceton Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Acetonitril (ACN) J.T. Baker, Avantor Performance Materials, PA, USA Ameisensäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe N,N-Dimethylformamid (DMF) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Dimethylsulfoxid (DMSO) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Ethylacetat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Ethanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Essigsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Isopropanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Methanol Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Salzsäure Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

I. 5. 3 Antibiotika

Tab. 11: verwendete Antibiotika

Antibiotikum Endkonzentration gelöst in Hersteller [µg/ml]

Ampicillin (Amp) 100 H2Obidest. Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Apramycin (Apra) 50 H2Obidest. AppliChem GmbH, Darmstadt Carbenicillin (Carb) 100 H2Obidest. Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Chloramphenicol (Cam) 30 Ethanol Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Fosfomycin (Fos) 100 H2Obidest. Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Hygromycin (Hyg) 50 H2Obidest. Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Kanamycin (Kan) 50 H2Obidest. Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Nalidixinsäure (Nal) 25 H2Obidest. Fluka, Steinheim Thiostrepton (Thio) 25 DMSO Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

I. 5. 4 Sonstige Biochemikalien

Tab. 12: sonstige, verwendete Biochemikalien

Sonstige Biochemikalien Stammlösung Hersteller

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-glucuronsäure (X-Gal) 1 % Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Adenosintriphosphat (ATP) 10 mM Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Desoxynukleotide (dNTPs) 100 mM Promega GmbH, Mannheim Fructose-1,6-bisphosphat 80 mM Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München 0,03 % Biotium, Inc., Hayward, Kanada Isopropyl- -D-Thiogalactopyranosid (IPTG) 1 M Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe GelRed™-Nicotinamidadenindinukleotid Natriumsalz (NAD+) 25 mM Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München D-(-)-3-Phosphoglycerat 50 mM Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

40 Material und Methoden

I. 6. Enzyme

Tab. 13: verwendete Enzyme

Enzym Hersteller

DNase I New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Triosephosphat-Isomerase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Lysozym (aus Hühnereiweiß) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Lyticase aus Arthrobacter luteus Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München Pfu DNA-Polymerase Eigene Herstellung Phusion DNA-Polymerase Eigene Herstellung Proteinase K Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe T4-DNA-Ligase New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main RNase A QIAGEN GmbH, Hilden Restriktionsendonukleasen New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main

I. 7. Molekularbiologische Kits

Tab. 14: verwendete, molekularbiologische Kits

Molekularbiologisches Kit Hersteller

innuPrep Plasmid Mini Kit Analytik Jena, Jena Promega Corporation, Madison, USA (*) Promega Corporation, Madison, USA WizardPureYield™® Plus Plasmid SV Minipreps Midiprep DNA System Purification System Promega Corporation, Madison, USA WizardPureYield™® SV PlasmidGel and PCRMiniprep Clean-Up System System Promega Corporation, Madison, USA

I. 8. Marker

Tab. 15: verwendete Molekulargewichtsmarker

Molekulargewichtsmarker Hersteller

1 kb DNA Ladder #N3232 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main 100 bp DNA Ladder #N3231 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main 50 bp DNA Ladder #N3236 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main Protein Ladder #P7703 New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main Protein Marker VI (10-245) prestained AppliChem GmbH, Darmstadt Precision Plus Protein Standard (*) BioRad, Hercules, Kalifornien, USA

41 Material und Methoden

I. 9. Puffer und andere Lösungen

Alle Puffer und Lösungen wurden, soweit nicht anders beschrieben, mit bidestilliertem Wasser (H2Obidest) hergestellt. Zur pH-Wert Einstellung wurden falls nötig NaOH (1 M) oder HCl (1 M) verwendet. In der Regel wurden die Lösungen bei Raumtemperatur (RT) gelagert. Ausnahmen sind in den entsprechenden Tabellen vermerkt. Alle Puffer wurden, falls nicht anders vermerkt, autoklaviert. Kleinere Mengen wurden steril filtriert.

I. 9. 1 Allgemeine Puffer und Lösungen

Tab. 16: verwendete Puffer und andere Lösungen

Anwendung Puffer Bestandteile

Herstellung von Dauerkulturen Saccharose-Lösung 25 % Saccharose Glycerin Lösung 87 % Glycerin (V/V)

Lösungen für die Blau-Weiß IPTG-Lösung 1 M IPTG Selektion X-Gal-Lösung 100 mg/mL X-Gal

Lösungen zur Herstellung CaCl2 CaCl2-Lösung 50 mM CaCl2 kompetenter Zellen

Lösungen für die PCR dNTPs-Mischung Je 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Pfu-Puffer 200 mM Tris-HCl (pH 8,8) 100 mM KCl 100 mM (NH4)2SO4 20 mM MgSO4 1 % Triton X-100 0,1 % BSA

Taq-Puffer 100 mM Tris-HCl (pH 9,0) 500 mM KCl 15 mM MgCl2 1 % Triton X-100

Agarose-Gelelektrophorese DNA-Probenpuffer 0,25 % Xylenblau (Probenbande bei 40 % Saccharose 10 kb) pH 7,6, in TE-Puffer

0,03 %

Methylenblau-LösungGelRed™ Lösung 0,02 % MethylenblauGelRed™

TAE-Puffer (50-fach) 40 mM Tris-HCl (pH 7,8) 10 mM Natriumacetat 1 mM EDTA

Lösungen zur Isolierung Lysozym-Lösung 100 mg/mL Lysozym (Lagerung bei -20 °C) genomischer DNA aus Natriumacetat-Lösung 5 M NaOAc (pH 5,5) Actinomyceten Proteinase K-Lösung 20 mg/mL Proteinase K (Lagerung bei -20 °C) SDS-Lösung 10 % SDS (m/V)

42 Material und Methoden

Anwendung Puffer Bestandteile

SET-Puffer 75 mM NaCl 25 mM EDTA 20 mM Tris-HCl pH 8,0

Lösungen zur Plasmidisolierung P1 25 mM Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM EDTA 100 µg/mL RNase A (Zugabe nach Autoklavieren; Lagerung bei 4 °C)

P2 0,2 M NaOH 1 % SDS

P3 3 M Kaliumacetat pH 4,8

Isolierung von BACs aus E. coli EDTA-Lösung 10 mM EDTA (pH 8) 131 NaOH-Lösung 0,2 N NaOH 1 % N-laurylsarcosine SLS

2 M KAc-Lösung 2 M KAc

7,5 M KAc-Lösung 7,5 M KAc

10:50 TE-Puffer 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 50 mM EDTA

50:50 TE-Puffer 50 mM Tris-HCl (pH 7,6) 50 mM EDTA

Lösungen für die TAR Sorbitol-Lösung 1 M Sorbitol Klonierung SPE-Puffer 1 M Sorbitol 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)

STC-Lösung 1 M Sorbitol 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM CaCl2

PEG-Lösung 20 % PEG8000 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM CaCl2

SOS-Lösung 1 M Sorbitol 0,3 x YPD-Medium 10 mM CaCl2

NAD+/NADH gekoppeltes Na3PO4-Lösung 150 mM Na3PO4 Glykolyse Assay 25 mM NAD+

100 mM Tris-HCl (pH 7,6)

43 Material und Methoden

Anwendung Puffer Bestandteile

Spurenelementlösung 20-fach Lösung 100 mg MgSO4 (50 mL) 100 mg ZnSO4 x 7 H2O 100 mg FeSO4 x 4 H2O 100 mg MnCl2 x 4H2O 100 mg CaCl2 x 6H2O 100 mg NaCl 20 mg CuCl2 x 2H2O 20 mg B(OH)3 10 mg Na2MoO4 10 mg CoCl2 110 mg Na3-Citrat-2H2O

I. 9. 2 Lösungen und Puffer für die Aufreinigung heterolog produzierter Proteine

Alle Puffer und Lösungen, die bei der präparativen Aufreinigung an der ÄKTA-FPLC eingesetzt wurden, wurden unter Vakuum filtriert. Die Puffer und Lösungen die mit einem Asterisk (*) gekennzeichnet sind, wurden ausschließlich in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay, Department for Biochemistry, University of Cambridge, UK verwendet.

Tab. 17: Puffer und Lösungen für die Aufreinigung rekombinanter Proteine

Anwendung Puffer Bestandteile Referenz

Lösungen für die Lysepuffer 50 mM Tris-HCl Aufreinigung 500 mM NaCl rekombinanter Proteine pH 7,8 aus E. coli mittels Ni2+- NTA-Agarose Waschpuffer 50 mM Tris-HCl 500 mM NaCl 20 mM Imidazol pH 7,8

Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl 500 mM NaCl 250 mM Imidazol pH 7,8

Waschen und neu 0,5 M NaOH Dr. Hui Hong, Department of beladen der Ni2+-NTA- Biochemistry, University of Agarose (*) 0,5 M EDTA Cambridge, UK pH 8 Persönliche Kommunikation

100 mM NiCl2

Lösungen für die Stripping-Puffer 20mM Na3PO4 Regeneration der 0,5mM NaCl 50mM EDTA pH 7,4 HisTrap™ FF

Ni2+-Lösung 0,1 M NiSO4

44 Material und Methoden

Anwendung Puffer Bestandteile Referenz

Lösungen für die Regenerationspuffer 100 mM Tris-HCl Regeneration der 150 mM NaCl 1 mM EDTA 1 mM HABA StrepTrap™ HF

Lösungen für die Lysepuffer 50 mM Tris-HCl Aufreinigung von C-His6- 500 mM NaCl foxGI mittels Ni2+-Agarose pH 7,8

Waschpuffer 50 mM Tris-HCl 500 mM NaCl 20 mM Imidazol pH 7,8

Elutionspuffer 50 mM Tris-HCl 500 mM NaCl 250 mM Imidazol pH 7,8

Lösungen für die Puffer A 50 mM Tris-HCl Aufreinigung von 250 mM NaCl C-His6-foxGII mittels 10 mM Imidazol ÄKTA-FPLC 1 mM MgCl2 pH 7,8

Puffer B 50 mM Tris-HCl 250 mM NaCl 500 mM Imidazol pH 7,8

Lösungen für die Puffer 1 5 mM Imidazol Puffer 1 + 0,5 % Triton X- Aufreinigung von 500 mM NaCl 100 zum waschen des N-His6-foxGIII mittels 20 mM Na2HPO4 Pellets 132 ÄKTA-FPLC und des pH 7,4 N-His6-PCPs mittels Ni2+- Agarose Puffer 2 500 mM Imidazol 132 500 mM NaCl 20 mM Na2HPO4 pH 7,4

Puffer 3 8 M Harnstoff 132 500 mM NaCl 20 mM Na2HPO4 pH 8

Lösungen für die Puffer A 50 mM Tris-HCl Aufreinigung von 300 mM NaCl N-His6-FkbH 10 mM Imidazol 10 mM MgCl2 pH 7,8

Lösungen für die Puffer A (*) 20 mM Tris-HCl Dr. Hui Hong, Aufreinigung von Tmn7a 500 mM NaCl und Tmn16 10 mM Imidazol Department of pH 8 Biochemistry, University of Cambridge, UK Persönliche Kommunikation

45 Material und Methoden

Anwendung Puffer Bestandteile Referenz

Puffer B (*) 20 mM Tris-HCl 500 mM NaCl 40-500 mM Imidazol pH 8

I. 9. 3 Lösungen und Puffer zur Herstellung und Durchführung von SDS- PAGE Gelen

Im Folgenden sind die Lösungen und Puffer beschrieben, die zur Herstellung und Durchführung einer SDS-PAGE verwendet wurden (siehe Tab. 18). In Tab. 19 befindet sich die Zusammensetzung für ein 15 %-iges Tris-Glycin-Trenngel und ein 4 %-iges Tris-Glycin-Sammelgel. Die Puffer, Lösungen und Bis-Tris-Gele, die in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay am Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK verwendet wurden sind in Tab. 20 aufgelistet. Angaben zur Durchführung einer SDS-PAGE befinden sich im Kapitel B. II. 5. 6. 1.

Tab. 18: Lösungen und Puffer für die Herstellung und Durchführung einer SDS-PAGE

Anwendung Bezeichnung Bestandteile

Lösung zur Probenvorbereitung Laemmli Ladepuffer (4 x) 2 mL 1 M Tris, pH 6,8 133 0,8 g SDS 4 mL Glycerin 0,4 mL -Mercaptoethanol 1 mL 0,5 M EDTA 8 mg BromphenolblauΒ ad 20 mL H2Obidest.

Lösungen für SDS-Gele Trenngel-Puffer 1,5 M Tris, pH 8,8 0,4 % SDS (m/V)

Sammelgel-Puffer 0,5 M Tris, pH 6,8 0,4 % SDS (m/V)

Laufpuffer für die SDS-PAGE Laufpuffer (10 x) 1,92 M Glycin (Tris-Glycin) 1 % SDS (m/V) 0,25 M Tris, pH 8,3

Färbelösung für SDS-Gele Coomassie-Färbelösung 0,25 % Coomassie Brilliant Blue 45 % Ethanol 10 % Essigsäure

Entfärbelösung für SDS-Gele Entfärber 45 % Ethanol 10 % Essigsäure

46 Material und Methoden

Tab. 19: Zusammensetzung der Gele für die Durchführung einer SDS-PAGE

Anwendung Bestandteile

Herstellung von 15 % Trenngelen (2x), pH 8,8 5 mL Acrylamid-Stammlösung 2,5 mL Trenngel-Puffer 2,5 mL H2Obidest. 100 µL APS (10 %) 10 µL TEMED

Herstellung von 4 % Sammelgelen (2x), pH 6,8 1 mL Acrylamid-Stammlösung 1,25 mL Sammelgel-Puffer 2,75 mL H2Obidest. 50 µL APS (10 %) 5 µL TEMED

Tab. 20: Puffer und Lösungen für die Durchführung einer SDS-PAGE mit Bis-Tris-Gelen

Bezeichnung Bezugsquelle

NuPAGE® MES SDS Running Buffer (20 x), (*) Thermo Fisher Scientific NuPAGE® LDS Sample Buffer (4 x), (*) Thermo Fisher Scientific Expedeon -12 % Bis-TrisProtein Gels, 10 mm x 15 wells (*) Thermo Fisher Scientific InstantBlue™ Protein Stain * NuPAGE™

47 Material und Methoden

I. 9. 4 Lösungen, Puffer und Enzyme für die Analyse von Proteinfunktionen

In dieser Arbeit wurden rekombinante Proteine des Foxicin-BGCs mit Hilfe von in vitro Assays hinsichtlich ihrer Funktion untersucht. Die Lösungen, Puffer und Enzyme, die in den in vitro Assays verwendet wurden, sind im Folgenden beschrieben.

I. 9. 5 Lösungen und Puffer für die Durchführung des NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assays

Die Lösungen, Puffer und Enzyme, die für das NAD+/NADH+H+ gekoppelte Glykolyse Assay mit FoxGI, FoxGII und FoxGIII verwendet wurden, sind in Tab. 21 beschrieben. Alle Lösungen wurden, falls nicht anders vermerkt, bei 4 °C gelagert. Die Durchführung des in vitro Assays ist im Kapitel B. II. 5. 6. 3 beschrieben.

Tab. 21: Lösungen für die Durchführung des NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assays

Lösungen und Puffer Bestandteile

K-SH-Puffer (nach Rutter et al., 1964) 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5 0,2 M KaAc 0,05 M -Mercaptoethanol

NAD+-Lösung 0,025 M NAD+ in 0,001 M NaOH

Fructosebisphosphat 0,08 M Fructosebisphosphat

Phosphat-Lösung 0,15 M Na3PO4

Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase Stammlösung: 1 mg in 240 µL Tris-HCl (0,1 M; pH 7,5) verdünnt (Katalognummer: G2267, Sigma-Aldrich)

1,6-Fructosebisphosphat-Aldolase Stammlösung: 10 µL der Suspension wurden mit 240 µL Tris-HCl (Katalognummer: A8811, Sigma-Aldrich, (0,1 M; pH 7,5) verdünnt 10 - 20 units/mg Protein)

Triosephosphat-Isomerase (Katalognummer: Stammlösung: 20 µL der Suspension wurden mit 230 µL Tris-HCl T2391, Sigma-Aldrich, > 4000 units/mg (0,1 M; pH 7,5) verdünnt Protein)

Zink-Lösung 14 mM ZnSO4

48 Material und Methoden

I. 9. 6 Lösungen, Puffer und Enzyme für die Durchführung des in vitro Assays mit der FkbH-ähnlichen Domäne

Die Lösungen, Puffer und Enzyme für das in vitro Beladungsassay mit foxFLD, Tmn16 und Tmn7a sind in Tab. 22 aufgeführt.

Tab. 22: Konzentrationen der Stammlösungen für das in vitro Beladungsassay mit foxFLD, Tmn16 und Tmn7a

Stammlösungen für die Beladung von foxFLD und Tmn16

500 mM Tris-HCl, pH 7,7 100 mM MgCl2-Lösung 50 mM TCEP-Lösung 50 mM ATP 50 mM D-3-Phosphoglycerat 0,5 U Phosphokinase

Stammlösungen für die Generierung von holo-Tmn7a

500 mM Tris-HCl, pH 7,5 100 mM MgCl2-Lösung 100 mM Coenzym A 140 mM Sfp

I. 10. Verbrauchsmaterial

Die in dieser Arbeit verwendeten Verbrauchsmaterialien und deren Bezugsquellen sind in Tab. 23 aufgeführt. Die Labor- und Analysengeräte, die ausschließlich in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay am Department for Biochemistry der University of Cambridge verwendet wurden, sind mit einem Asterisk (*) gekennzeichnet.

Tab. 23: Verbrauchsmaterialien und deren Bezugsquelle

Verbrauchsmaterial Bezugsquelle

Bördelkappe: 11 mm für HPLC-MS Lab Logistics Group GmbH, Meckenheim

DC-Fertigplatten: DC-Fertigfolien ALUGRAM® (SIL G/UV254, 0,20 mm Schicht MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren Kieselgel 60 mit Fluoreszenzindikator UV254) DC-Fertigschichten ADAMANT UV254 20 x 20 cm (Glasplatte Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe 0,25 mm, Fluor-Indikator) Filter: Rotilabo® Spritzenfilter 13 mm; 0,45 µm, PVDF Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe Rotilabo® Spritzenfilter steril, 13 mm; 0,22 µm, PVDF Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Insert für Vial: 9 mm (0,15 mL) Lab Logistics Group GmbH, Meckenheim

Konzentrator: Vivaspin 20 (10 000 MWCO) Sartorius Stedim Biotech GmbH, Göttingen Amicon® Ultra-4, Centrifugational Filters, Ultracel® Merck Millipore Ltd., Carrigtwohill Co. (10000 MWCO und 30 000 MWCO) (*) Cork, Ireland

49 Material und Methoden

Verbrauchsmaterial Bezugsquelle

Leere Plastiksäulen - 12 mL Jena Bioscience, Jena Porengröße Fritte: 20 µm Bed Volumen: 0,5-2 mL

Pasteurpipette: 230 mm Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Pipettenspitzen Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Rotilabo® Einmal-Küvetten Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

Rotilabo® Petrischalen, Ø 90 mm Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe

I. 11. Labor und Analysengeräte

Im Folgenden sind die Labor- und Analysengeräte beschrieben, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Die Labor- und Analysengeräte, die ausschließlich in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay am Department for Biochemistry der University of Cambridge verwendet wurden, sind mit einem Asterisk (*) gekennzeichnet.

Tab. 24: verwendete Geräte und deren Bezugsquelle

Gerät Bezugsquelle

Agarosegel-Elektrophoresekammer, Zubehör und Spannungsgerät Amersham Bioscience, Freiburg Electrophoresis Power Supply EPS301 Äkta-FPLC: Amersham Bioscience, Freiburg Mixer: M925 Valve: INV907 Pumpe: P950 Monitor: UPC-900 Fraktion Collector: Frac 900 Autoklav: Systec 5075 ELV Tuttnauer Europe B.V., Breva, NL Brutschränke Binder GmbH, Tuttlingen CCD-Kamera Eagle Eye, Stratagene, Heidelber Eismaschine: Ice Maker FM-251AFE Hoshizaki Europe B.V., Amsterdam, NL Electroporation: E. coli Bio-Rad Laboratories GmbH, München French® pressure cell press Thermo Spectronic, Rochester, USA Gefrierschrank: Pulser™ Comfort Nofrost CN 3613 (-20 °C) Liebherr, Ochsenhausen Hera freeze (-80 °C) Thermo Scientific, Waltham, USA HPLC-ESI-MS Anlage (1100 Serie): Agilent Technologies, Waldbronn Probengeber: G1313A Säulenofen: G1316A Degaser: G1322A Quarternäre Pumpe: G1311A Detektoren: Diodenarray (DAD) G1315B Quadrupol Massendetektor (MSD) G1946 HPLC-ESI-MS Anlage (1100 Serie) (*) Agilent Technologies, Waldbronn Probengeber: G1313A Säulenofen: G1316A Degaser: G1322A Quarternäre Pumpe: G1311A Detektoren: Diodenarray (DAD) G1315A

50 Material und Methoden

Gerät Bezugsquelle

LCQ Massenspekrometer mit Elektronenspray Ionisierung (*) ThermoFinnigan HPLC-ESI-MS Anlage (1200 Serie) (*) Agilent Technologies G1330B FC/ALS Therm G1367B HiP-ALS Säulenofen: G1316B Degaser: G1322A Quarternäre Pumpe: G1311A Detektoren: Diodenarray (DAD) G1315 LTQ Massenspektrometer mit Elektronenspray Ionisierung (*) ThermoFinnigan Imfbank Gelaire Flow Laboratories (*) Nuaire Biological Safety Cabinets (*) Inkubationsschüttler: Multitron Infors AG, Bottmingen, Schweiz Innova 4330 (*) New Brunswick Scientific Inkubator Binder GmbH, Tuttlingen Lichtmikroskop: AXIO LAB A.I Carl Zeiss, Jena Magnetrührer: MR 3002 Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach PCR-Gerät: Gene Amp PCR System 9700 Thermo Scientific, Waltham, USA Mastercycler epigradient Eppendorf AG, Hamburg pH-Meter: CG 842 Schott Instruments GmbH, Mainz Photometer: Nanodrop 2000 Thermo Scientific, Waltham, USA Ultrospec 2100 pro Amersham Bioscience, Uppsala, Schweden UbiLine 9400 SI Analytics GmbH Pipetten: 2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL Gilson, Middleton, USA präparative HPLC-Anlage: Waters Corporation, Milford, USA Probengeber: 717 plus Autosampler Säulenofen: Column Thermostat Jetstream 2 plus Pumpe 1 und 2: 515 HPLC Pump Detektor: 2998 Photodiode Array SDS-PAGE Zubehör Protein-Elektrophoresekammer Mini-PROTEAN 3 mit Bio-Rad Laboratories GmbH, München Zubehör und Spannungsgeber Power Pac 300 -Cell Electrophoresis System (*) Thermo Fisher Scientific Sonicator SonicatorXCell SureLock™ Ultrasonic Mini Processor XL, Modell: XL2020 (*) Misonix, Inc. Farmingdale, USA mit Ultrasonic Converter, 20 kHz Vibra Cell Processors (*) Sonics & Materials, Inc., Newton, USA mit CV26 Konverter Reinstwassersysteme: TKA GenPure mit Dispenser Thermo Scientific, Waltham, USA Rotationsverdampfer: Vacuubrand GmbH & Co. KG, Wertheim Waterbath B-480 Büchi Labortechnik GmbH, Essen Hei-VAPCVC Value Digital Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Laborota 4000 efficient Schwabach SC 920 KNF Neuberger GmbH, Freiburg UV-Transilluminator: Image Master VDS zur Geldokumentation Amersham Pharmacia, Freiburg Vacuum concentrator: BA-VC300H H. Saur Laborbedarf, Reutlingen Vortex Reax Top Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach Waagen: Denver Instrument GmbH, Göttingen PK 4801 Sartorius AG, Göttingen A210P Mettler Toledo PR2003 DeltaRange® Wasserbad Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach Zentrifugen: 5415R, 5414R und 5418 Eppendorf AG, Hamburg (für 1,5 mL und 2 mL Reaktionsgefäße) Avanti J-20 XP mit JA10 und JA 25.50 Beckman Coulter, Krefeld (für 500 mL bzw. 50 mL Gefäße) Avanti JXN-2C mit JLA8.1000, JA10, JA25.50 (*) Beckman Coulter, Krefeld (für 1 L, 500 mL bzw. 50 mL Gefäße)

51 Material und Methoden

Gerät Bezugsquelle

Rotina 35 R und Rotina 380 R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, (für 15 mL und 50 mL Gefäße) Tuttlingen

I. 12. Säulen

Tab. 25: verwendete Säulen und deren Bezugsquelle

Anwendung Säule Bezugsquelle

ÄKTA-FPLC GE Healthcare GmbH, Solingen GE Healthcare GmbH, Solingen SuperdexStrepTrap™ 200 HP 10/300 mL GL GE Healthcare GmbH, Solingen HisTrap™Säulenmaterial: FF mL Agarose/Dextran Partikelgröße: 13 µm Säulenvolumen: 24 mL HiLoad® 16/60 Superdex® 200 prep grade GE Healthcare GmbH, Solingen Säulenmaterial: Agarose/Dextran Partikelgröße: 34 µm Säulenvolumen: 120-124 mL päparative HPLC Zorbax® SB-C18 Agilent Technologies, Santa Clara, USA Vorsäule: 9,4 mm x 20 mm Partikelgröße: 5 µm Hauptsäule: 9,4 mm x 150 mm Partikelgröße: 5 µm HPLC-MS XBridge® C18 Agilent Technologies, Santa Clara, USA Vorsäule: 4,6 mm x 20 mm Partikelgröße: 3,5 µm Hauptsäule: 4,6 mm x 100 mm Partikelgröße: 3,5 µm Jupiter® C4 (*) Phenomenex, Torrance, USA Partikelgröße: 5 µm Porengröße: 300 Å LC Column 50 mm x 2 mm Festphasenextraktion Oasis HLB 35cc LP Waters GmbH, Eschborn (SPE) Sephadex LH-20 -20 GE Healthcare GmbH, Solingen

Sephadex™ LH

I. 13. Computerprogramme und Internetdienste

In den folgenden Tabellen sind die Computerprogramme und Internetservices aufgelistet, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Die mit (*) gekennzeichneten Programme wurden in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay am Department for Biochemistry, University of Cambridge, UK verwendet.

Tab. 26: verwendete Computerprogramme

Computerprogramm Anwendung Bezugsquelle

ChemStation Rev. B. 04. 03 Steuerung von Agilent HPLC Agilent Technologies, Santa Clara, USA Clone Manager 7 Analyse von DNA und Proteinen, Scientific & Educational Software Primerdesign, Herstellung von graphischen Vektorkarten, Simulation von Klonierungen

52 Material und Methoden

Computerprogramm Anwendung Bezugsquelle

Empower® 3 Steuerung von Waters HPLC Waters Corporation, Milford, USA GraphPad Prism 6 Darstellung von Daten GraphPad Software, Inc. MagTran 1.03b2 (*) Dekonvolution von Masse zu Amgen Inc. 2007, Thousand Oaks, USA135 Ladungsverhältnissen MarvinSketch 15.3.2.0 Zeichnen von chemischen Strukturen ChemAxon Ltd., Mendeley 1.6 Literaturverwaltung Mendeley Ltd. Microsoft Office Word, Excel, Powerpoint Microsoft Office Quad Browser Version 2.0 (*) Analyse der Agilent 1200 HPLC-MS Thermo Electron Corporation, Waltham, Ergebnisse Massachusetts, USA UNICORN 4.11 Steuerung der ÄKTA-FPLC Amersham Bioscience, Freiburg Xcalibur® 2.0.6 (*) Steuerung der Agilent 1200 HPLC-MS Thermo Electron Corporation, Waltham, Anlage Massachusetts, USA

Tab. 27: verwendete Internetdienste

Internetdienst Anwendung

antiSMASH Identifizierung, Annotation und Analyse antismash.secondarymetabolites.org (antibiotics & Secondary von Sekundärmetabolitgencluster 136 138 Metabolite Analysis Shell) – BLAST Datenbankrecherche nach blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 139 (Basic Local Alignment Search Sequenzhomologien auf Nukleotid- oder Tool) Aminosäurebasis Clustal Omega Multiple Sequenzalignments ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo 140 ExPASy Datenbank zur Proteinanalyse expasy.org 141 Galaxy Uni Freiburg Datenbank mit Programmen zur galaxy.uni-freiburg.de 142 Datenanalyse Phylogenetic Analysis Tool Erstellen phylogenetischer Bäume http://www.phylogeny.fr/143,144 RAST Annotation von DNA-Sequenzen und rast.nmpdr.org 145 (Rapid Annotation using Genomen Subsystem Technology) Uniprot Proteindatenbank uniprot.org 146 StreptomeDB Datenbank zur Suche von pharmazeutische- Sekundärmetaboliten aus Streptomyceten bioinformatik.de/streptomedb2 147 StrepDB Streptomyceten Annotations Server strepdb.streptomyces.org.uk NCBI Datenbank ncbi.nlm.nih.gov WebLogo Version 2.8.2 Darstellung von Konsensussequenzen http://weblogo.berkeley.edu/148 (2005-09-08)

53 Material und Methoden

II. Methoden

II. 1. Kultivierung und Stammerhaltung von Mikroorganismen

II. 1. 1 Kultivierung und Stammerhaltung von Escherichia coli

Zur Kultivierung von E. coli wurde, falls nicht anders angegeben, LB-Medium verwendet, dass mit einer Einzelkolonie, einer Vorkultur oder einer Glycerin-Dauerkultur beimpft wurde. Je nach Stamm wurden Antibiotika zur Selektion zugegeben. Die Kultivierung erfolgte in einem Erlenmeyerkolben mit Schikane, in der Regel bei 37 °C und 180 rpm, auf einem Inkubationsschüttler. Für kleinere Kulturvolumina wurden 2 mL Reaktionsgefäße oder 15 mL bzw. 50 mL sterile Zentrifugenröhrchen verwendet. Für die Kultivierung auf Antibiotika-haltigem LB-Festmedium wurde E. coli mit einem Drigalskispatel ausplattiert oder ein Verdünnungsaustrich mit einer Impföse durchgeführt. Die Platten wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert.

E. coli XL1 Blue wurde für Klonierungen und für die Vervielfältigung von Plasmiden verwendet. Die Stämme E. coli ET12567 x pUB307 und E. coli ET12567 x pUZ8002 dienten der intergenerischen Konjugation. E. coli BL21 (DE3) Star, E. coli BL21 (DE3) x pLysS, E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x PL1SL2 und E. coli Rosetta 2 wurden für die heterologe Proteinproduktion benutzt.

Bestimmte Experimente erforderten die Überprüfung des Wachstums einer E. coli Flüssigkultur in regelmäßigen Abständen oder eine Flüssigkultur wurde mit einer bestimmten E. coli Zellmenge beimpft. Für die Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm wurde ein Nullabgleich mit 1 mL des entsprechenden Flüssigmediums, in einer 1 mL Einmalküvette, durchgeführt. Anschließend wurde 1 mL der E. coli Kultur vermessen. Je nach Wachstum wurde die E. coli Kultur zur OD-Messung mit dem entsprechendem Flüssigmedium verdünnt. Bei Erreichen der gewünschten OD wurde mit der Kultur nach dem entsprechenden Protokoll weiterverfahren. Für das Inokulieren mit einer bestimmten Zellmenge z.B. bei der Herstellung CaCl2 kompetenter E. coli, wurde folgende Formel verwendet:

푂퐷퐻푎푟 × 퐻푎푟 푉푟푟 = 푂퐷푉푟푟 Zur dauerhaften Lagerung und Konservierung von E. coli Stämmen wurden 1-2 mL einer gut gewachsenen Übernachtkultur 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert, das Zellpellet wurde in 300-600 µL Glycerin (87 %) resuspendiert und bei -20 °C oder bei -80 °C gelagert

II. 1. 2 Kultivierung und Stammerhaltung von Aktinomyceten

Aktinomyceten wurden in einem Erlenmeyerkolben mit Schikane und Edelstahlspirale in TSB-Medium bei 28 °C und 180 rpm auf einem Inkubationsschüttler kultiviert bis eine dichte Suspension mit feinen Zellpartikeln sichtbar wurde (3-5 Tage). Falls benötigt, wurden Antibiotika hinzugegeben. Für die Kultivierung auf TSB-Festmedium (gegebenenfalls mit Antibiotika) wurden die Zellen vorsichtig ausgestrichen oder mit einem sterilen Zahnstocher überpickt. Die Platten wurden für 3-5 Tage bei 28 °C inkubiert.

Die Kultivierung von Aktinomyceten zur Produktion von Sekundärmetaboliten und für die Durchführung von Fütterungsexperimenten wurde meistens HA-Medium verwendet. Weitere Medien zur Naturstoffproduktion sind in Tab. 8 aufgeführt.

MS-Festmedium wurde zur Kultivierung oder für die intergenerische Konjugation (siehe Kapitel B. II. 4. 4. 4) verwendet. Die Sporulation wurde dabei durch MgCl2 unterstützt. Zur Selektion auf Aktinomyceten- Stämme bei der Konjugation wurden die entsprechenden Antibiotika zu 1 mL TSB-Flüssigmedium gegeben. Die MS-Platten wurden anschließend vorsichtig überschichtet und bei 28 °C für 3-7 Tage inkubiert.

54 Material und Methoden

Zur Isolierung von Aktinomycetensporen wurden die MS-Platten bei 28 °C inkubiert, bis die Sporulation abgeschlossen war. Die Sporen wurden anschließend mit steriler Watte und 3 mL sterilem H2Obidest. abgeschwemmt und mit einer sterilen Spritze durch die Watte filtriert, um die Mycelreste von den Sporen zu trennen. Nach der Zugabe von 100 µl Glycerin (87 %) wurden die Sporen bei -20 °C oder -80 °C gelagert.

Zur dauerhaften Lagerung und Konservierung von Aktinomyceten-Stämmen wurden 30 mL einer gut gewachsenen Aktinomycetenkultur zentrifugiert (5000 rpm, 10 min) und das Zellpellet wurde in 30 mL Saccharose-Lösung (Tab. 16) resuspendiert. Nachdem die Suspension erneut zentrifugiert wurde (5000 rpm, 10 min), wurde das Zellpellet in 10 mL Saccharose-Lösung resuspendiert und bei -20 °C oder -80 °C gelagert.

II. 1. 3 Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae

Der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae VL48-N wurde in YPD- oder YPAD-Medium bei 30 °C und 180 rpm über Nacht kultiviert. Im Zuge der TAR-Klonierung wurden die Spheroblasten in SORB-Medium regeneriert. Um auf Trp-phototophe Hefezellen zu selektionieren, wurde das SORB(-Trp) -Minimalmedium verwendet.

II. 2. Isolierung von DNA und Plasmiden aus Mikroorganismen

II. 2. 1 Isolierung von genomischer DNA aus Aktinomyceten

Die verwendeten Puffer und Lösungen für die Isolierung von genomischer DNA aus Aktinomyceten sind in Tab. 16 aufgeführt.

II. 2. 1. 1 Isolierung von kleinen Mengen genomischer DNA

Zur Isolierung kleiner Mengen an genomischer DNA aus Aktinomyceten, z.B. um eine erfolgreiche Konjugation zu überprüfen, wurden 0,5-1 mL einer gut gewachsenen Aktinomyceten-Kultur zentrifugiert (5 min, 7000 rpm). Das gewonnene Mycel wurde in 500 µL SET-Puffer und 10 µL Lysozym-Lösung (100 mg/mL) resuspendiert und 30 min bei 37 °C inkubiert. Während dieses Inkubationsschrittes wurde mit Hilfe von Lysozym die bakterielle Zellwand hydrolysiert. Es wurden 14 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 50 µL SDS (10 %) zugegeben und zum Abbau von Proteinen wurden die Ansätze 1 h bei 55 °C inkubiert. Es folgte die Zugabe von 200 µL NaOAc und 500 µL Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1). Die Ansätze wurden 2 min kräftig geschüttelt und anschließend zur Phasentrennung zentrifugiert (10 min, 13000 rpm). In der unteren, organischen Phase befanden sich die Zelltrümmer, ausgefallene Proteine fanden sich in der Phasengrenze und die gDNA befand sich in der oberen, wässrigen Phase. Durch die folgende Alkoholfällung konnten mögliche Phenolreste entfernt und die gDNA weiter gereinigt werden. Der Überstand wurde in ein neues 1,5 mL Reaktionsgefäß gegeben, mit 500 µL eiskaltem Isopropanol gemischt und zentrifugiert (10 min, 13000 rpm, 4 °C). Das Pellet wurde mit 1 mL 70 % Ethanol gewaschen und zentrifugiert (5 min, 13000 rpm, 4 °C). Nach der Wiederholung des Waschschrittes wurde das Pellet 10 min bei 60 °C im Trockenschrank getrocknet. Die pelletierte gDNA wurde in 50-200 µL H2Obidest. oder TE-Puffer gelöst. Die gDNA wurde anschließend als PCR-Template verwendet.

II. 2. 1. 2 Isolierung von großen Mengen genomischer DNA

Um große Mengen unfragmentierter, genomischer DNA in hoher Reinheit zu isolieren, wurden 15 mL einer gut gewachsenen Aktinomyceten-Kultur zentrifugiert (10 min, 5000 rpm) und einmal mit 15 mL SET-Puffer gewaschen (10 min, 5000 rpm). Das Pellet wurde anschließend in 15 mL SET-Puffer mit 100 µg/mL Lysozym resuspendiert und zum Abbau der Zellwand 30 min bei 37 °C inkubiert. Es wurden 100 mg/mL

55 Material und Methoden

RNase A zugegeben und es erfolgte eine Inkubation von 2 h bei 37 °C zum weiteren Abbau der Zellwand und zur Degradation der RNA. Durch die anschließende Zugabe von 100 mg/mL Proteinase K und 0,5 % SDS wurden bei der Inkubation üN bei 50 °C Proteine abgebaut. Am nächsten Tag wurde der Ansatz mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) gemischt und bei einer 10-minütigen Inkubation bei RT wird der Ansatz regelmäßig invertiert. Nach der Zentrifugation (20 min, 4000 rpm, 4 °C) fand eine Phasentrennung statt. In der unteren, organischen Phase befanden sich die Zelltrümmer, ausgefallene Proteine fanden sich in der Phasengrenze und die gDNA befand sich in der oberen, wässrigen Phase. Die obere, wässrige Phase wurde abgenommen und die Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol wurde noch zwei weitere Male durchgeführt. Anschließend wurden NaOAc (0,2 M, pH 8) und zwei Volumen Isopropanol (100 %) zur wässrigen Phase gegeben. Die gDNA konnte mit einer sterilen Pasteurpipette aufgewickelt werden und wurde anschließend in Ethanol (70 %) gewaschen. Die gDNA wurde dann in 0,5-1 mL H2Obidest. oder TE-Puffer gelöst und anschließend weiterverwendet.

II. 2. 2 Isolierung von Plasmiden aus Escherichia coli

Die Isolierung von Plasmiden bei E. coli erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse149. Durch die Zugabe von SDS, NaOH und RNase A erfolgen Zelllyse und Degradation der RNA. Ein alkalischer pH-Wert sorgt für die Denaturierung der gesamten DNA. Das anschließende Absenken des pH-Werts führt die Renaturierung der Plasmid-DNA herbei. Durch Zentrifugation können ausgefallene DNA und Proteine entfernt werden. Im Anschluss wird die Plasmid-DNA durch Alkoholfällung oder unter Zuhilfenahme einer Silika-Membran weiter gereinigt.

II. 2. 2. 1 Plasmid Minipräparation

Die Plasmid-Minipräparation (modifiziert nach 149) wurde verwendet um Klonierungen zu überprüfen und um dabei schnell geringe Mengen an Plasmid-DNA zu isolieren. Dazu wurden 1,5 mL einer E. coli üN-Kultur abzentrifugiert (1 min, 13000 rpm) und das Pellet wurde in 300 µL P1-Puffer resuspendiert. Die Zelllyse erfolgte durch die Zugabe von 300 µL P2-Puffer und die Proben wurden 10-mal invertiert. Durch die Zugabe von 300 µL kaltem P3-Puffer wurde der pH-Wert wieder neutralisiert. Um ausgefallene DNA und Proteine abzutrennen, wurden die Proben zentrifugiert (10 min, 13000 rpm). Anschließend wurden 750 µL des Überstandes zu 560 µL eiskaltem Isopropanol gegeben und die Ansätze wurden 5-mal vorsichtig invertiert. Die Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugieren pelletiert (20-45 min, 13000 rpm, 4 °C) und das Pellet im Anschluss mit 500 µL eiskaltem 70 % Ethanol gewaschen (5 min, 13000 rpm, 4 °C). Die Plasmid-DNA wurde bei 65 °C in einem Trockenschrank für 10 min getrocknet und wurde dann in 10-20 µL H2Obidest. gelöst und für einen Restriktionsverdau (siehe Kapitel B. II. 4. 2) verwendet.

II. 2. 2. 2 Plasmid Minipräparation mit dem Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System

Plasmid-DNA in höherer Konzentration und mit größerer Reinheit wurde mit dem Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Tab. 14) gewonnen. Die Aufreinigung erfolgte entsprechend den Herstellerangaben. Die Plasmid-DNA wurde mit 25-50 µL H2Obidest. von der Silika-Matrix eluiert.

II. 2. 2. 3 Plasmid Minipräparation mit dem PureYield™ Miniprep System

Das PureYield Plasmid Miniprep System wurde in der Gruppe von Prof. P. F. Leadlay, Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK verwendet (siehe Tab. 14). Die Aufreinigung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die Plasmid-DNA wurde mit 30-50 µL von der Silika-Matrik eluiert und konnte dann weiterverwendet werden.

56 Material und Methoden

II. 2. 2. 4 Plasmid Midipräparation mit dem PureYield™ Midiprep System

Eine Plasmid-Midipräparation führt zu höheren Konzentrationen als eine Plasmid-Minipräparation. Für die Aufreinigung der Plasmid-DNA wurde Tab. 14) verwendet. Die Aufreinigung erfolgte entsprechend den Herstellerangaben. Die Plasmid-DNA wurde mit 400 µL H2Obidest. von der Silika-Matrix eluiert. das Pure Yield™ Plasmid Midiprep System

II. 2. 2. 5 Isolierung von BAC oder YAC aus Escherichia coli

Für die Isolierung großer DNA-Moleküle wie bacterial- (BAC) oder yeast artificial chromosomes (YAC) wurde das Protokoll von Villalobos et al. (2004) verwendet131, die entsprechenden Puffer und Lösungen wurden in Tab. 16 aufgeführt. Eine E. coli Einzelkolonie wurden in 10 mL LB-Medium mit Antibiotikum zur Selektion üN bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Am nächsten Tag wurde die Kultur zentrifugiert (13000 rpm, 5 min, 4 °C), das Pellet in 400 µL EDTA (10 mM, pH 8) resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Es erfolgte die Zugabe von 800 µL frischem NaOH (0,2 N) mit N-Laurylsarcosin (1 %). Die Zellsuspension wurde vorsichtig invertiert bis die Zelllyse sichtbar war und anschließend 4 min auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 600 µl KAc (2 M) wurde wiederum vorsichtig invertiert und mindestens 5 min auf Eis inkubiert. Nach der Zentrifugation (15 min, 13000 rpm, 4 °C) wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß gegeben, mit einem Volumen Isopropanol (100 %) versetzt und vorsichtig gemischt. Anschließend wurde erneut zentrifugiert (15 min, 5000 rpm) und nach dem Trocknen des Pellets, wurde die DNA zügig und vorsichtig in 180 µL TE-Puffer (10:50) resuspendiert. Im Anschluss wurde die DNA-Lösung mit 90 µL KAc (7,5 M) versetzt und 30 min bei 80 °C inkubiert. Nachdem Auftauen der Lösung, wurde zentrifugiert (10 min, 13000 rpm, 4 °C) und anschließend wurde der Überstand mit dem 2,5-fachen Volumen Ethanol (95 %) versetzt. Bei einer Inkubation– von 30 min bei -20 °C wurde die DNA gefällt, nachfolgend durch zentrifugieren (5 min, 13000 rpm, 4 °C) pelletiert und in 100 µL TE-Puffer (50:50) resuspendiert. Verunreinigungen durch RNA wurden durch die Zugabe von 2 µL RNase (10 mg/mL) und durch 30-minütige Inkubation bei 37 °C und 200 rpm, entfernt. Ein Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) wurde zugegeben, gemischt und zur Phasentrennung zentrifugiert (5 min, 5000 rpm). Die obere, wässrige Phase wurde abgenommen und der Phenol/ Chloroform/ Isoamylalkohol-Schritt wurde wiederholt durchgeführt. Der Überstand wurde mit einem Volumen Isopropanol versetzt und die DNA wurde durch Zentrifugation (5 min, 5000 rpm) pelletiert. Das DNA-Pellet wurde noch einmal mit 500 µL Ethanol (70 %) gewaschen und anschließend für 5-10 min getrocknet. Die DNA wurde in 20 µL TE-Puffer gelöst und weiterverwendet.

II. 2. 3 Isolierung von YACs aus Saccharomyces cerevisiae

Die Isolierung großer DNA-Moleküle wie yeast arificial chromosomes (YAC) aus Saccharomyces cerevisiae erfolgte insbesondere nach der TAR-Klonierung. Die, auf dem Selektionsmedium gewachsenen, Hefekolonien wurden gepickt, in 10 mL Hefe-Selektionsmedium inokuliert und 1-2 Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert. Zur Isolierung der YACs wurden die Hefe-Zellen pelletiert (5 min, 5000 rpm, 4 °C) und in 0,5 mL SPE-Puf -Mercaptoethanol und 20 µL Lyticase resuspendiert. Durch die 2-stündige Inkubation bei 30 °C wurde die Zellwand der Hefe abgebaut. Die YACs wurden anschließend mit dem innuPrep Plasmid ferMini mit Kit (AnalytikµL Jena) nach Herrstellerangaben isoliert und anschließend für weitere Analysen verwendet.

57 Material und Methoden

II. 2. 4 Alkoholfällung

Die Alkoholfällung von DNA in Lösung diente der Aufkonzentrierung und Umpufferung und wurde vor allem zur Reinigung von DNA nach einem Restriktionsverdau verwendet. Dabei wurde NaOAc bis zu einer Endkonzentration von 0,3-0,35 M zu einer DNA-Lösung gegeben. Durch die Zugabe des 3-fachen Volumens an Isopropanol wird der DNA ihre Hydrathülle entzogen. Die so ausgefallene DNA wurde durch Zentrifugation pelletiert (1 h, 13000 rpm, 4 °C). Anschließend wurde das Pellet zweimal mit Ethanol (70 %) gewaschen (10 min, 13000 rpm 4 °C). Das getrocknete DNA-Pellet wurde in einem entsprechenden Volumen TE-Puffer oder H2Obidest. resuspendiert und zur Lösung 2-3 Tage bei 4 °C gelagert, bis die DNA vollständig in Lösung vorlag.

II. 3. Charakterisierung von DNA

II. 3. 1 Agarose-Gelelektrophorese

Für die Analyse, Größenbestimmung oder Reinigung von genomischer DNA und DNA-Fragmenten wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt. Dabei wird die negative Ladung von DNA genutzt um sie ihrer Größe nach, in einer Agarose-Matrix im elektrischen Feld aufzutrennen. Die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA ist, neben der Größe, abhängig von der angelegten Spannung, der Agarose-Konzentration und der DNA-Konformation (superhelikal (ccc, covalently closed circular), offen (oc, open circular) und linear doppelsträngig oder einzelsträngig). Die superhelikale Form der DNA wandert dabei schneller als die lineare Form, während die offene Form wesentlich langsamer wandert als die superhelikale oder die lineare Form.

In der Regel wurden 0,7-1 %-ige Agarose-Gele verwendet, bei sehr kleinen DNA-Fragmenten wurden 1,8 %-ige Agarose-Gele benutzt. Die Agarose wurden in 1x TAE-Puffer (siehe Tab. 16) gelöst und vor der Verwendung aufgekocht. Als Größenstandard wurde ein DNA-Leiter (Tab. 15) nach Herstellerangaben aufgetragen. Die DNA-Proben wurden vor dem Auftrag mit einer entsprechenden Menge an Ladepuffer (6x) versetzt (Tab. 16) und in einer Gelelektrophorese-Kammer bei 90-110 V für 40-70 min in 1x TAE-Puffer aufgetrennt.

Bei analytischen Agarose-Gelen wurden 5-10 µL der Probe aufgetragen und die Agarose-Gele wurden anschließend mit dem Ethidiumbromid- %) gefärbt und unter UV-Licht (312 nm) visualisiert und dokumentiert. Derivat GelRed™ , Bei präparativen Agarose-Gelen wurden 20-100 µL der zu reinigenden Probe aufgetragen. Die präparativen Agarose-Gele wurden 10 min mit Methylenblau (Tab. 16) gefärbt und mit H2Odest. wieder entfärbt. Das gewünschte DNA-Fragment wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten und die DNA wurde mit dem Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System (Tab. 14) nach Herstellerangaben isoliert.

Fragmentlängen des 50 bp DNA Ladder #N3236, NEB (in bp): 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 766, 916, 1350

Fragmentlängen des 100 bp DNA Ladder #N3231, NEB (in bp): 100, 200, 300, 400, 500/517, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1517

Fragmentlängen des 1 kb DNA Ladder #N3232, NEB (in bp): 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000

58 Material und Methoden

II. 3. 2 Sequenzierung

Um die Basenabfolge von PCR-Produkten oder DNA-Bereiche auf ihre Richtigkeit zu überprüfen, wurden diese sequenziert. Die Sequenzierung der entsprechenden Proben wurden bei der Firma Eurofins Genomics (Ebersberg) oder bei der Firma GATC (Konstanz) in Auftrag gegeben. Die Proben wurden entsprechend der Firmenbedingungen vorbereitet und mit vektor- oder genspezifischen Primern versetzt (Tab. 5). Die erhaltenen Sequenzdaten wurden mit dem Computerprogramm Clone Manager 7 (siehe Tab. 26) analysiert.

II. 3. 3 Photometrische Konzentrationsbestimmung

Nach der Aufreinigung von Nukleinsäuren wurden Nukleinsäure-Lösungen photometrisch analysiert. Diese Analyse diente nicht nur zur Bestimmung der DNA-Konzentration einer Probe, sondern auch zur Bestimmung ihrer Reinheit. Zur photometrischen Konzentrationsbestimmung wurde 1 µl einer DNA-Probe mit dem NanoDrop 2000 vermessen. Mit Hilfe der Absorption (A) bei 260 nm und des Lambert- Gesetzes lässt sich die Konzentration von DNA oder RNA in einer Lösung bestimmen. Um weitere Aussagen hinsichtlich der Reinheit einer Probe treffen zu können, wurde zusätzlich die Absoption bei 230 nmBeerschen und bei 280 nm bestimmt. Bei 280 nm können Verunreinigungen durch Proteine oder Phenole detektiert werden. Verunreinigungen durch weitere organische Substanzen, wie z.B. Zucker, werden bei 230 nm detektiert. Aus den Verhältnissen der Absorption bei 260 nm und 280 nm bzw. 230 nm kann die Reinheit der Probe bestimmt werden. Bei einer reinen Nukleinsäure-Lösung sollte das Verhältnis von A260/A280 bei 1,8 und das Verhältnis von A260/A230 zwischen 2,0 und 2,2 liegen.

II. 4. Klonierungsexperimente

Bei der Klonierung wird ein Gen oder ein DNA-Abschnitt durch die Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert und anschließend in einen Vektor integriert. Die klonierten Plasmide können in geeigneten E. coli-Stämmen vermehrt und anschließend in einen geeigneten Wirt eingebracht werden. Dadurch können, unter anderem, rekombinante Proteine produziert werden oder die Funktion von Proteinen kann in vivo untersucht werden.

II. 4. 1 DNA-Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion

Durch die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) können in vitro millionenfache Kopien einer bestimmten Nukleotidabfolge amplifiziert werden150. Eine PCR besteht aus drei Schritten die zyklisch wiederholt werden. Bei der Denaturierung wird die doppelsträngige Template-DNA bei 94 °C getrennt. Durch anschließendes Absenken der Temperatur hybridisieren zwei spezifische Primer an den komplementären Enden des gewünschten DNA-Bereiches. Die DNA-Polymerase bildet, ausgehend von den -Enden der Primer, die neuen DNA-Stränge durch den Einbau von Desoxynukleotiden. Die Konstruktion der Primer wurde mit Clone Manager 7 (Tab. 26) durchgeführt. Dabei konnten Modifikationen wie Schnittstellen, Start- oder Stop- -Enden der Primer angefügt werden.

Die Zusammensetzung eines Codons PCR-Ansatzes an die ist abhängig von der ausgewählten Polymerase. Die verwendeten PCR-Ansätze sind in Tab. 28 dargestellt.

Die Aktinomyceten-DNA zeichnet sich durch einen hohen GC-Gehalt aus. Guanin und Cytosin bilden drei Wasserstoffbrücken aus, während zwischen Adenin und Thymin zwei Wasserstoffbrücken bestehen. Bei der Trennung der doppelsträngigen DNA, können GC-reiche Regionen häufig Sekundärstrukturen ausbilden, was durch die Zugabe von DMSO verhindert werden kann.

59 Material und Methoden

Tab. 28: PCR-Ansätze für die jeweilen Polymerasen und deren Anwendung

Polymerase Bestandteile Verwendung

Phusion-Polymerase 1 µL Template-DNA 2 kb/min je 1 µL Primer Amplifikation von DNA- 1-2 µL dNTPs Fragmenten bis 7 kb 0-5 % DMSO 5 µL 10x Taq-Puffer 1 µL Phusion-Polymerase ad 50 µL H2Obidest.

Pfu-Polymerase 1 µL Template-DNA 500 bp/min je 1 µL Primer Amplifikation von DNA- 1 µL dNTPs Fragmenten bis 4 kb bis 5 % DMSO 5 µL 10x Pfu-Puffer 1 µL Pfu-Polymerase ad 50 µL H2Obidest.

In Tab. 29 ist das Standard PCR-Programm dargestellt. Die Wahl der Annealing-Temperatur ist abhängig von der Schmelztemperatur (Tm) der ausgewählten Primer. In der Regel liegt die optimale Anlagerungstemperatur 5 °C unter der Tm des Primers. Die Extensions-Dauer ist abhängig von der Synthesegeschwindigkeit der verwendeten Polymerase und der Länge des zu amplifizierenden Fragments.

Tab. 29: verwendetes Standard PCR-Programm

PCR-Schritt Dauer [min] Temperatur [ °C]

Denaturierung 5:00 94 Denaturierung 94 Anlagerung 0:45 Abhängig von der Tm der Primer2 30 Zyklen Extension abhängig von der Fragmentlänge 72 und der Polymerase1 abschließende Extension 10 72 Kühlung 4-8

∞ 1 Polymerasegeschwindigkeit und Fragmentlänge 2 Tm der Primer 5 °C

–

60 Material und Methoden

II. 4. 1. 1 Kolonie-PCR mit E. coli Transformanten

Durch eine Kolonie-PCR können nach einer Transformation schnell, viele E. coli Einzelkolonien auf Anwesenheit des klonierten DNA-Fragments getestet werden. Dazu wurde eine Einzelkolonie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze auf eine frischen LB-Agarplatte mit Antibiotikum überpickt und anschließend in einem PCR-Reaktionsgefäße im PCR-Ansatz resuspendiert. Zuletzt wurde die Polymerase zugegeben. Die Zusammensetzung des PCR-Ansatzes für die Kolonie-PCR ist in Tab. 30 aufgeführt. Für die Kolonie-PCR wurden die entsprechenden Primer und Bedingungen wie schon bei der Standard-PCR verwendet.

Tab. 30: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes für die Kolonie-PCR

je 1 µL Primer 2 µL dNTPs 5 µL DMSO 5 µL 10x Polymerase-Puffer 1 µL Polymerase ad 50 µL H2Obidest.

Die Kolonie-PCR, eine Positiv- sowie eine Negativkontrolle wurden im Anschluss mittels Agarose- Gelelektrophorese analysiert.

II. 4. 1. 2 Kolonie-PCR mit Aktinomyceten

Nach der intergenerischen Konjugation mit Aktinomyceten können die genetischen Veränderungen mit Hilfe einer Kolonie-PCR schnell analysiert werden123. Von einer Agarplatte wurde etwas Mycel in 10 µL DMSO (100 %) resuspendiert und unter regelmäßigem Schütteln 10 min bei 100 °C inkubiert. Im Anschluss wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation pelletiert (10 sec, 13000 rpm). Für einen 20 µL PCR-Ansatz (Tab. 31) wurde 1 µL des Überstandes als DNA-Template verwendet. Die Primer und die PCR-Bedingungen erfolgen entsprechend der zu analysierenden, genomischen Bereiche.

Tab. 31: Zusammensetzung für eine Aktinomyceten Kolonie-PCR

1 µL DNA-Template je 1 µL Primer 1 µL dNTPs 2 µL DMSO 2 µL 10x Polymerase-Puffer 1 µL Polymerase ad 20 µL H2Obidest.

Die Kolonie-PCR, eine Positiv- sowie eine Negativkontrolle wurden im Anschluss mittels Agarose- Gelelektrophorese analysiert.

61 Material und Methoden

II. 4. 2 Restriktionsspaltungen

Ein Restriktionsverdau dient der Vorbereitung von DNA für eine Klonierung oder der Analyse einer Klonierung. Restriktionsendonukleasen schneiden dabei die DNA an einer spezifischen Erkennungssequenz. Je nach Restriktionsendonuklease entstehen dabei glatte (blunt) oder klebrige (sticky) Enden, die dann bei der Ligation (siehe Kapitel B. II. 4. 3) mit einem DNA-Fragment mit kompatiblen Enden verküpft werden können. Bei der Kontrolle einer Klonierung wurde die geschnittene DNA nach dem Verdau auf einem Agarose-Gel analysiert. Des Weiteren wurde chromosomale DNA durch Restriktionsendonukleasen in kleinere Fragmente geschnitten (siehe Kapitel B. II. 4. 4. 5). Alle verwendeten Restriktionsenzyme wurden von NEB bezogen. In Tab. 32 sind die Zusammensetzungen und Inkubationszeiten der durchgeführten Restriktionsspaltungen aufgeführt.

Tab. 32: Restriktionsverdau

Anwendung Bestandteile Inkubation

Kontrollverdau 5-8,5 µL DNA 90 min je 0,5 µL Enzym 1 µL 10 x Puffer ad 10 µL H2Obidest.

Präparativer Verdau 20-40 µL DNA 90 min bis üN je 2 µL Enzym 5 µL 10 x Puffer ad 50 µL H2Obidest.

II. 4. 3 Ligation

DNA-Ligasen katalysieren die Bildung einer Phosphodiester-Bindung zwischen einer freien - -OH-Gruppe in dsDNA und dsRNA. Während Ligasen in der Natur an den Prozessen der DNA-Replikation, DNA-Reperatur und DNA-Rekombination beteiligt sind werden sie bei KlonierungsexperimentenPhosphatgruppe und einer zur freien Neukombination von Plasmiden verwendet. Dabei erfolgt die Verknüpfung von kompatiblen sticky ends durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken effizienter als die Verknüpfung von blunt ends. Für die Klonierungsexperimente wurde die T4-DNA-Ligase von NEB verwendet.

II. 4. 3. 1 Zwischenvektor

PCR-Produkte wurden zunächst mit einen Zwischenvektor ligiert. Dies diente nicht nur der Anreicherung des PCR-Produktes, sondern auch der Herstellung kompatibler sticky ends für die weitere Klonierung. Die Ligation mit einem Zwischenvektor wie pUC19 oder pBluescript SK (-) erfolgte über blunt ends, die in der Regel durch einen vorangegangenen Restriktionsverdau mit SmaI oder EcoRV entstanden. In Tab. 33 ist die Zusammensetzung von Ligationsansätzen aufgeführt. Die Inkubation der Ligation erfolgte für 2 h bei RT oder üN bei 4 °C. Anschließend wurde der Ligationsansatz in CaCl2-kompetente E. coli XL1-Blue transformiert.

Tab. 33: Zusammensetzung für die Ligation mit einem Zwischenvektor

PCR-Produkt 7 µL 5 µL Zwischenverktor (blunt) 1 µL 2 µL 10x T4-Ligase-Puffer 1 µL 2 µL T4-DNA-Ligase 1 µL 1 µL H2Obidest. - 10 µL

62 Material und Methoden

Zur schnellen Identifikation transgener E. coli wurde die Blau-Weiß-Selektion verwendet. In pUC19 und pBluescript SK (-) befindet sich innerhalb der multiple cloning site -Untereinheit -Galactosidase (lacZa). LacZ spaltet den gelben Farbstoff X-Gal zu Galactose und dem blauen Farbstoff 5,5'-Dibromo-4,4'-Dichloro-Indigo. Blaue Einzelkolonien besitzenMCS ein religiertes als Reportergen Plasmid die mit funktioneller der-Untereinheit die, zusammen mit der chromosomal- -Untereinheit, ein funktionelles Protein bilden. In weißen Einzelkolonien wurde lacZa durch das ligierte PCR-Produkt unterbrochen. Bei der Blau-Weiß-Selektion wurden LB-Agarplatten mit Ampicillincodierten oder σ Carbenicillin (100 µg/mL), IPTG (1 mM) und X-Gal (100 µg/mL) überschichtet.

II. 4. 3. 2 Zielvektor

Nach der Klonierung in einen Zwischenvektor wurde eine, durch einen Kontrollverdau als richtig identifizierte Einzelkolonie in 8-20 mL LB-Medium (mit Amp oder Carb) bei 37 °C und 180 rpm üN kultiviert. Nach der Plasmidisolierung (siehe Kapitel B. .II. 2. 2) wurde ein präparativer Restriktionsverdau (siehe Kapitel B. .II. 4. 2) durchgeführt und das ausgeschnittene DNA-Fragment wurde aus einem präparativen Agarose-Gel extrahiert (siehe Kapitel B. II. 3. 1). Das so vorbereitete DNA-Fragment wurde dann über kompatible sticky ends mit dem Zielvektor ligiert. Der Ligationsansatz wurde in E. coli XL1-Blue transformiert und auf LB-Agarplatten mit Antibiotikum ausgestrichen und üN bei 37 °C inkubiert. In der - - -Komplementierung und die Ligation wurde durch Plasmid-Minipräparation (siehe Kapitel B. II. 2. 2. 1) und anschließenden RegelKontrollverdau besitzen Zielvektoren(siehe Kapitel keine B. II. 4.Untereinheit 2), sowie durch der Sequenzierung Galactosidase (siehe zur Kapitel B. II. 3. 2) überprüft. Erfolgreich klonierte Plasmide konnten dann weiterverwendet werden.

II. 4. 4 DNA-Übertragung in Bakterien

II. 4. 4. 3 Transformation von Escherichia coli

II. 4. 4. 3. 1. Transformation CaCl2-kompetenter Escherichia coli

Die Herstellung CaCl2-kompetenter E. coli erfolgte nach einem modifizierten Protokoll von Cohen et al. (1972) und Dagert et al. (1979)151,152. Der genaue Mechanismus ist bis heute nicht verstanden. Allerdings ist es wahrscheinlich, dass die Ca2+-Ionen eine Bindung zwischen Zellhülle und dem negativ geladenen Phosphat-Rückgrat der DNA begünstigen. Die Inkubation auf Eis reduziert die thermale Bewegung der Moleküle, sodass die Bindung zwischen DNA und Zellhülle weiter unterstützt wird. Beim Hitzeschock und DNA kann aufgenommen werden. verändert sich die Membranoberfläche und stülpt sich nach innen. Die Zelle ist für eine kurze Zeit „undicht Für die Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli wurden 100 mL LB-Medium mit einer E. coli üN-Kultur auf eine OD600 nm=0,02 beimpft und bei 37 °C und 180 rpm bis zum Erreichen einer OD600 nm=0,5-0,6, kultiviert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurde die E. coli Kultur auf zwei sterile 50 mL Zentrifugenröhrchen verteilt und zentrifugiert (10 min, 5000 rpm, 4 °C). Die Zellpellets wurden zweimal mit jeweils 10 mL eiskalter, steriler CaCl2-Lösung (50 mM) gewaschen (10 min, 5000 rpm, 4 °C). Im Anschluss wurden die Zellpellets mit 20 mL eiskalter, steriler CaCl2-Lösung (50 mM) gewaschen (10 min, 5000 rpm, 4 °C), danach erneut in 20 mL eiskalter, steriler CaCl2-Lösung (50 mM) resuspendiert, 30 min auf Eis inkubiert und anschließend erneut pelletiert (10 min, 5000 rpm, 4 °C). Auf die Zugabe von 8 mL eiskaltem, sterilem Glycerin (10 %) erfolgten weitere 15 min auf Eis. Je 200 µL der Zellsuspension wurden dann in vorgekühlte 1,5 mL Reaktionsgefäße aliquotiert und bei 80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert. – Die Transformation von CaCl2-kompetenten E. coli erfolgt nach dem Prinzip der Hitzeschock- Transformation. Ein Aliquot der CaCl2-kompetenten E. coli wurde auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden 10-20 µL eines Ligationsansatzes (siehe Kapitel B. II. 4. 3) oder 5-10 µL eines Plasmids zugegeben. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis folgte der Hitzeschock bei 42 °C für 90 sec. Der Transformationsansatz wurde dann für weitere 3 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss an die Zugabe von 63 Material und Methoden

1 mL LB-Medium wurde der Transformationsansatz zur Expression der Antibiotika-Resistenzgene 90 min ohne Selektionsdruck bei 37 °C inkubiert. Nach der Transformation von Ligationsansätzen wurden die Zellen zentrifugiert (1 min, 13000 rpm), der Überstand wurde verworfen, das Pellet im Rücklauf resuspendiert und auf einer LB-Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert. Bei der Blau-Weiß-Selektion wurde die LB-Agarplatte zusätzlich mit IPTG (1 mM) und X-Gal (100 µg/mL) überschichtet. Die Inkubation üN erfolgte bei 37 °C im Brutschrank. Bei der Transformation von Plasmiden wurden 50-100 mL LB-Medium mit Antibiotikum beimpft und üN bei 37 °C und 180 rpm kultiviert.

II. 4. 4. 3. 2. Transformation von Escherichia coli durch Elektroporation

Für die Transformation von größeren DNA-Molekülen, wie z.B. BACs, ist die Elektroporation häufig effizienter als die Hitzeschock-Transformation. Für die Elektroporation müssen die E. coli Zellen vollkommen salzfrei sein. Für die Herstellung elektrokompetenter E. coli wurden 100 mL LB-Medium (mit entsprechendem Antibiotikum) mit einer gut gewachsenen üN-Kultur beimpft und bei 37 °C und 180 rpm bis zum Erreichen einer OD600 nm von 0,4 kultiviert. Die Kultur wurde 15 min auf Eis gekühlt und anschließend zentrifugiert (20 min, 5000 rpm, 4 °C). Das Pellet wurde zweimal mit 50 mL eiskaltem, sterilen H2Obidest. gewaschen und zentrifugiert (20 min, 5000 rpm, 4 °C). Im Anschluss wurde das Pellet in 50 mL eiskaltem, sterilen Glycerin (8,7 %) resuspendiert und erneut zentrifugiert (20 min, 5000 rpm, 4 °C). Nachdem das Pellet in 2,5 mL eiskaltem, sterilem Glycerin (8,7 %) resuspendiert wurde, wurden je 50 µL in vorgekühlte 1,5 mL Reaktionsgefäße aliquotiert und bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Elektrokompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut und 2 µL eines Ligationsansatzes (salzfrei) oder 5 µL eines Plasmides wurden zugegeben. Der gesamte Transformationsansatz wurde in eine vorgekühlte Küvette gegeben und bei 1800 mV für 5 ms elektroporiert. Anschließend wurden sofort 950 µL LB-Medium hinzupipettiert und der Transformationsansazu wurde 60-90 min ohne Selektionsdruck bei 37 °C inkubiert.

II. 4. 4. 4 Intergenerische Konjugation von Escherichia coli und Aktinomyceten

Bei der intergenerischen Konjugation kann Fremd-DNA eines Donorstammes in einen Rezipientenstamm eingebracht werden. Der intergenerische Transfer von Plasmiden von E. coli in Streptomyces wurde durch Modifikationen des Mobilisierungssystems Gram-negativer Bakterien entwickelt 153. Für solch eine Zell-Zell DNA-Übertragung werden Vektoren verwendet, die den origin of transfer (oriT) des IncP Plasmids RP4 (auch RP1/RK2) besitzen 125,154,155. Der Plasmidtransfer wird in trans, durch Mobilitätsfaktoren der RP4 derivatisierten Hilfsplasmide pUB307 oder pUZ8002, unterstützt. Bei der intergenerischen Konjugation wird pUZ8002 (oriT-) nicht übertragen 156, pUB307 hingegen besitzt einen funktionellen oriT und kann sich somit selbst in den Rezipientenstamm transferieren 120. Als Donorstamm wurde der Dam-, Dcm- und Hsd- E. coli ET12567 121 verwendet, um der Restriktionsmaschinerie des Rezipienten zu entgehen.

Bei der intergenerischen Konjugation können sowohl replikative als auch nicht replikative Plasmide, die über homologe Rekombination oder Attachmentsites in das Chromosom integrieren können, verwendet werden. Das Plasmid pKC1132 integriert über homologe Bereiche in das Aktinomyceten-Genom, während pTESa über eine auf dem Plasmid codierte Integrase an der Attachmentsite in das Genom integriert. Das Plasmid pUWL-T verbleibt hingegen extrachromosomal.

Die optimalen Bedingungen können je nach Rezipienten variieren, wobei die Verwendung von Mycel in einer höheren Zahl an Rekombinanten resultiert157. Das folgende Protokoll zur intergenerischen Konjugation wurde nach Kieser et al. (2006) modifiziert158.

Vorbereitung des E. coli ET12567 Donor-Stamm

Zunächst wurden CaCl2-kompetente E. coli ET12567 mit pUZ8002 oder pUB307 (KanR) mit dem zu übertragenen Plasmid transformiert und der Transformationsansatz wurde in 100 mL LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika üN bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Die Kultur wurde auf zwei 50 mL Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und pelletiert (10 min, 5000 rpm). Durch Waschen der Zellpellets mit jeweils 50 mL LB-Medium (10 min, 5000 rpm) wurden die entsprechenden Antibiotika ausgewaschen. Für

64 Material und Methoden die intergenerische Konjugation mit Aktinomycetensporen wurde das Zellpellet in 1 mL LB-Medium resuspendiert.

Vorbereitung des Rezipienten-Stammes

Von einer gut gewachsenen Aktinomyceten-Kultur wurden 0,5-1 mL abgenommen und zentrifugiert (5 min, 7000 rpm). Das Pellet wurde mit 1 mL frischem TSB-Medium gewaschen (5 min, 7000 rpm) und anschließend wieder in 1 mL TSB-Medium resuspendiert. Alternativ können 100-300 µL hitzeaktivierte Sporen verwendet werden.

Durchführung der intergenerischen Konjugation

Das vorbereitete E. coli Zellpellet wurde in 1 mL der Aktinomyceten-Suspension resuspendiert und auf MS-Platten mit CaCl2 ausplattiert. Bei der intergenerischen Konjugation mit Aktinomycetensporen wurden 300-500 µL der E. coli Suspension mit 100-300 µL Sporen gemischt und ebenfalls auf MS-Platten mit CaCl2 ausplattiert. Zusätzlich wurde zur Kontrolle zweimal nur der Aktinomyceten-Stamm ausplattiert. Nachdem die Platten offen unter einer Sterilbank getrocknet wurden, wurden sie bei 28 °C inkubiert.

Nach einer 8-12 stündigen Inkubation wurden die MS-Platten mit einer Antibiotika-Lösung überschichtet. Dabei wurde 1 mL TSB-Medium oder steriles H2Obidest. mit Fosphomycin (100 µg/mL) und dem Antibiotikum zur Selektion des übertragenen Plasmids gemischt und zur Überschichtung verwendet. Fosfomycin soll dabei das Wachstum von E. coli ET12567 unterdrücken. Alternativ zu Fosphomycin kann auch Nalidixinsäure (25 µg/mL) verwendet werden. Die Negativkontrolle wurde mit dem Selektionsantibiotikum des zu übertragenden Plasmids überschichtet, während die Positivkontrolle mit Fosfomycin überschichtet wurde. Die Konjugations-Platten wurden dann 3-7 Tage bei 28 °C inkubiert, bis Exkonjuganten sichtbar wurden. Diese wurden ein- bis zweimal auf MS-Platten mit Antibiotika überpickt um etwaige E. coli Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wurden die Exkonjuganten weiter analysiert.

II. 4. 4. 5 Transformations-assoziierte Rekombination in Hefe

Aktinomyceten besitzen die genetische Kapazität eine Vielzahl an Sekundärmetaboliten zu produzieren. Unter Laborbedingungen werden allerdings nur wenige BGC exprimiert 124. Mit Hilfe der transfomations- assoziierten Rekombination (TAR) in Saccharomyces cerevisiae VL6-48N können große chromosomale Bereiche, wie z.B. stille BGCs, aus komplexen Genomen selektiv isoliert werden 122,159. Dabei wird die homologe Rekombination in Hefe genutzt, die während der Spheroblasten-Transformation zwischen der partial verdauten genomischen DNA und dem linearisierten TAR-Vektor stattfindet (siehe Abb. 15). Das TAR-Plasmid enthält homologe Fragmente, die den Zielbereich flankieren. Mit Hilfe des Auxotrophiemarkers TRP1 werden Hefekolonien selektiert, bei denen die Rekombination erfolgreich stattgefunden hat. Das TAR-Plasmid kann dann isoliert werden und heterolog in Aktinomyceten produziert werden (Abb. 15).

Für die TAR in Hefe wurde ein modifiziertes Protokoll nach Yamanaka et al. (2014) verwendet124, das von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Andriy Luzhetskyy (Pharmazeutische Biotechnologie, Universität des Saarlandes; persönliche Kommunikation) optimiert wurde. Der Hefestamm S. cerevisiae VL6-48N wurde von Dr. Vladimir Larionov (Center of Cancer Research, Maryland, USA) und das TAR-Plasmid pCAP01 wurde von Prof. Dr. Bradley Moore (Center for Marine Biotechnology and Biomedicine, Scripps Institution of Oceanography, UC San Diego, USA) zur Verfügung gestellt.

Einen Tag vor der TAR-Klonierung werden 100 mL YPAD-Medium mit einer Einzelkolonie Saccharomyces cerevisiae VL6-48N beimpft und über Nacht bei 30 °C und 180 rpm inkubiert. Am nächsten Morgen wird die optische Dichte der Kultur bei 600 nm bestimmt. Bei Erreichen einer OD600 nm = 4,3-4,6 wird die Kultur auf zwei 50 mL Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und zentrifugiert (5 min, 3500 rpm, 4 °C). Das Pellet wird zunächst mit 30 mL sterilem H2Odest. (5 min, 3500 rpm, 4 °C) und anschließend in 10 mL frisch vorbereiteten 1 M Sorbitol, 25 mM EDTA (pH 8) und 50 mM DTT gewaschen (5 min, 3000 rpm, 4 °C). Nachdem das Pellet in 20 mL 1 M Sorbitol resuspendiert und zentrifugiert (5 min, 3000 rpm, 4 °C) wurde, wurde das Pellet für die Herstellung von Spheroblasten in 20 mL SPE-Puffer (1 M Sorbitol, 0,01 M Na3PO4, 0,01 M EDTA, pH 7,5)

65 Material und Methoden resuspndiert. Nach der Zugabe von 7 µL Lyticase (2000 U/mL) zu jedem der beiden 50 mL Zentrifugenröhrchen wurden sie bei 30 °C inkubiert. Eines der Zentrifugenröhrchen wurde für die Transformation verwendet, das andere Zentrifugenröhrchen um die OD600nm zu messen. Als Nullabgleich diente 1 mL 1M Sorbitol. Direkt nach der Zugabe der Lyticase, wurden 100 µL der Zellsuspension entnommen und mit 900 µL 1 M Sorbitol vermischt. Durch Messen der OD600nm wurde die Stabilität der Spheroblasten kontrolliert. Dabei sollte der gemessene Wert über die gesamte Zeit konstant bleiben. Weitere 100 µL der Zellsuspension wurden mit 2 % SDS gemischt und die OD600nm wurde bestimmt (X). Dieser Wert sollte mit der vorangegangenen Messung fast identisch sein. Das Fortschreiten der Spheroblastierung wurde durch den Vergleich der OD600nm in 2 % SDS nach 20 min (Y) kontrolliert. SDS lysierte nur die Spheroblasten, aber nicht die intakten Zellen. Bei sind 60-70 % der Zellen zu Spheroblasten geworden und können dann für die Transfor mation verwendet werden. Dafür × ≈ − % werden die fertigen Spheroblasten 10 min bei 1200 rpm und 4 °C zentrifugiert, 50 mL 1M Sorbitol werden zum Pellet gegeben und durch vorsichtiges invertieren gemischt. Nach der Zentrifugation (10 min, 1200 rpm, 4 °C) wird dieser Schritt wiederholt. Für die Transformation wird das Pellet in 2 mL STC-Lösung resuspendiert und je 200 µL werden für einen Transformationsansatz in ein 1,5 mL steriles Reaktionsgefäß aliquotiert. Die geschnittene gDNA ( und das linearisierte TAR-Plasmid (1-2 µg) wurden zu den Spheroblasten gegeben, vorsichtig gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden 800 µL PEG 8000 Lösung zugegeben≥ µ푔) und der Transformationsansatz wird weitere 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden pelletiert (5 min, 2000-2500 rpm, 4 °C) und langsam und vorsichtig in 800 µL SOS-Lösung resuspendiert. Die Spheroblasten werden dann 40 min bei 30 °C ohne Schütteln inkubiert, mit 7 mL geschmolzenem TOP-Agar-Leu gemischt und vorsichtig auf eine SORB-Leu Agarplatte (+1 M Sorbitol) gegossen. Die Transformationsplatten werden 4-6 Tage bei 30 °C inkubiert.

Abb. 15: Transformations-assoziierte Rekombination in Saccharomyces cerevisiae VL6-48N. Partial verdaute gDNA mit dem entsprechenden Biosynthese-Gencluster (1. a)) und linearisiertem pCAP01 mit homologen Bereichen - -Ende des BGCs (1. b)) werden in S. cerevisiae VL6-48N Spheroblasten eingebracht. Es kommt zur in vivo Rekombination zwischen den homologen Bereichen (2.) und pCAP01 mit entsprechendem BGC kann isoliert werden (zum3.) und und zur heterologen Expression in Aktinomyceten (4.) verwendet werden.

66 Material und Methoden

II. 4. 5 Geninaktivierung in Aktinomyceten

Durch die gezielte Inaktivierung von Genen kann deren Funktion genauer untersucht werden. Dabei kann ein Gen durch die Integration eines Selektionsmarkers unterbrochen werden (single crossover). Die Herstellung einer double crossover Mutante ist sehr zeitaufwendig. Durch das CRISPR-Cas9-System kann die Deletion von Genen beschleunigt werden. Die resultierenden Mutanten werden anschließend durch PCR verifiziert und können dann weiter analysiert werden.

II. 4. 5. 1 Geninaktivierung mittels single cross over

Die homologe Rekombination ist in der Natur ein Mechanismus für die DNA-Reparatur und wird bei der Herstellung von single crossover Mutanten genutzt. Für die Inaktivierung eines Gens durch einen single crossover wurde ein Bereich eines Gens durch PCR amplifiziert, über einen Zwischenvektor vervielfältigt und schließlich mit dem Zielvektor pKC1132 (ApraR) ligiert. Über die intergenerische Konjugation von E. coli ET12567 mit pUB307 oder pUZ2008 wurde dieses Plasmid in den entsprechenden Aktinomyceten- Stamm eingebracht. Bei resistenten Mutanten fand die homologe Rekombination zwischen den homologen Bereichen von Plasmid und Genom statt. Das Plasmid integrierte dabei vollständig in das Genom und unterbricht damit das gewünschte Gen, indem zwei nicht-funktionelle Kopien des Zielgens im Genom - -Ende stark verkürzt. Um sicherzustellen, dass keine der beiden, verkürzten Bereiche zu einem aktiven Protein führen, sollte das Zielgen mindestens eine Größe von verbleiben.1 kb aufweisen. Diese sind Der jeweils amplifizierte am und DNA-Bereich am sollte nicht kleiner als 500 bp sein, da die Rekombinationsfrequenz proportional zur Länge des DNA-Fragments ist.

Abb. 16: Geninaktivierung durch Insertion mittels single Crossover. Ein interner Bereich (> 500 bp) des Zielgens wird in einen geeigneten Vektor kloniert. Durch Rekombination der homologen Bereiche des Vektors und des Zielgens, wird das Zielgen durch Integration des Vektors unterbrochen und ist somit nicht mehr funktionsfähig. (ABR=Antibiotika- Resistenzgen zur Selektion auf das single crossover Ereignis)

Single crossover Mutanten können ihren Genotyp durch Exzision des Plasmids durch ein single crossover Ereignis schnell wieder zum Wildtyp umkehren. Sie sind nicht stabil, obwohl die Rate bei nicht-selektivem Wachstum bei 1 % liegt und eignen sich nur für die schnelle Charakterisierung 160.

67 Material und Methoden

II. 4. 5. 2 Deletion von Genen mit dem CRISPR-Cas9 System

Durch Evolution oder lateralen Gentransfer haben Bakterien verschiedene Mechanismen, wie das CRISPR- Cas System, entwickelt um sich vor Bakteriophagen zu schützen161. Das CRISPR-Cas System wird mittlerweile in der Molekularbiologie für die gezielte Deletion von Genen genutzt. Bei double crossover Mutanten wird, im Gegensatz zum single crossover, das gesamte Zielgen deletiert. Allerdings ist die Herstellung von double crossover Mutanten sehr zeitaufwendig. Durch die Nutzung des CRISPR-Cas9 Systems können Rekombinationsereignisse beschleunigt werden. Dafür wurden zunächst 120 bp lange single guided RNAs (sgRNA) in pCRISPR-Cas9 kloniert. Diese sgRNAs enthielten 20-24 bp lange DNA- Bereiche, homolog zu einem internen Bereich des zu deletierenden Gens. Wird die sgRNA in der Zelle transkribiert, bindet sie an den homologen DNA-Bereich und führt somit die Cas9-Endonuklease zu ihrem Zielort. Die Cas9-Endonuklease erkennt dabei die tertiäre Struktur der sgRNA, sowie das anschließende Protospacer adjacent motif (PAM) GCC und führt einen Doppelstrangbruch herbei. Die Zelle versucht diesen Doppelstrangbruch durch Non-homologous End-Joining (NHEJ) zu reparieren. Dabei können wenige Basenpaare bis hin zu mehreren Kilobasen deletiert werden. Für die gezielte Deletion eines Gens, werden ca. 1 kb große DNA- -Cas9 kloniert. Die Zelle kann nun den, durch die Cas9-Endonuklease entstandenen Doppelstrangbruch mittels Homology Directed RepairBereiche (HDR) die sich reparieren und (siehe des Abb.Zielgens 17). befinden Die Methode amplifiziert wurde und in To inng pCRISPR et al. (2015) beschrieben und für Streptomyceten optimiert123. Das pCRISPR-Cas9 Plasmid wurde von Prof. Dr. Tilmann Weber (DTU Biosustain, Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark) zur Verfügung gestellt.

Abb. 17: Gezielte Deletion durch Cas9 induzierten Doppelstrangbruch und homology-directed repair. Das Plasmid pCRISPR-Cas9 (1. homologe Bereiche des Zielgens für den HDR des Cas9 induzierten Doppelstrangbruchs (2.). Nach der DNA-Reparatur ist das Zielgen deletiert (3.). codiert für die Cas Endonuklease, eine vom Zielgen abgeleitete sgRNA und und

In dieser Arbeit sollte foxGI des Foxicin-BGCs mit Hilfe des CRISPR-Cas9 Systems deletiert werden. Dazu wurde pCRISPR-Cas9-foxGI, wie in Kapitel B. II. 4. 7. 7 beschrieben, kloniert und in CaCl2-kompetente E. coli ET12567 x pUZ2008 und ET12567 x pUB307 transformiert (siehe Kapitel B. II. 4. 4. 3). Die transformierten Zellen wurden für die intergenerische Konjugation mit S. diastatochromogenes pokOIV kultiviert (siehe Kapitel B. II. 4. 4. 4). Zur Induktion des Thiostrepton-induzierbaren Promotors der Cas9 Endonuklease wurden die erhaltenen Exkonjuganten, nach zweimaliger Selektion, in TSB-MediumΔ mit 0,5 oder 1 µg/mL Thiostrepton kultiviert. Da Thiostrepton im wässrigen nicht gut löslich ist, wurden auch MS-Agarplatten mit 1 µg/mL Thiostrepton zur Kultivierung verwendet. Die gewachsenen Kulturen oder Kolonien wurden durch Aktinomyceten-Kolonie-PCR (siehe Kapitel B. II. 4. 1. 2) oder nach Isolierung der chromosomalen DNA (siehe Kapitel B. II. 2. 1) mit dem Primerpaar crispr_GI_fw und crispr_GI_rv (Primeranlagerung: 55 °C, 45 sec) überprüft und anschließend zur Foxicin-Produktion in HA-Medium kultiviert und analysiert (siehe Kapitel B. II. 6. 1).

68 Material und Methoden

II. 4. 6 Heterologe Genexpression in Aktinomyceten

II. 4. 6. 1 Komplementierung

Die gezielte Inaktivierung von Genen hilft, deren Funktion genauer zu untersuchen. Dabei sollte sichergestellt werden, dass die Inaktivierung keine Auswirkungen auf die umliegenden Gene hat. Solche polaren Effekten können vor allem bei Insertionsmutanten auftreten und wenn Gene in einem Operon vorliegen. Bei der Komplementierung wird eine funktionale Kopie des inaktivierten Gens in die Mutante eingebracht. Die so komplementierte Mutante sollte dann wieder dieselben Fähigkeiten zeigen, wie der WT.

Nach der Inaktivierung von foxGI durch einen single crossover, wurden die Komplementierungsplasmide pUWL-T-G3P und pUWL-H-G3P erstellt (siehe Kapitel B. II. 4. 7. 6). Diese sollten durch intergenerische Konjugation von E. coli nach S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint übertragen werde. Die resultierenden Exkonjuganten sollten hinsichtlich ihrer Foxicin Produktion untersucht werden. Δ Nach der Deletion von foxGI mit dem CRISPR-Cas9 System oder der Redirect® Technologie sollte pTESa-foxGI zur Komplementierung verwendet werden. Die resultierenden Exkonjuganten sollten anschließend hinsichtlich ihrer Foxicin Produktion analysiert werden.

II. 4. 6. 2 Expression

Die Funktion von Genen kann nicht nur über deren Inaktivierung analysiert werden, sondern auch durch deren Überexpression im WT. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Regulatoren des Foxicin-BGCs in pTESa kloniert und durch den Promoter des Erythromycin-Resistenzgen ermE aus Saccharopolyspora erythreae transkribiert 162.

69 Material und Methoden

II. 4. 7 Klonierungen dieser Arbeit

Im Folgenden sind die PCR-Bedingungen, sowie die einzelnen Klonierungsschritte für die Herstellung der Plasmide die in dieser Arbeit erstellt und verwendet wurden, beschrieben. Falls nicht anders beschrieben, wurde die PCR mit Hilfe der Phusion-Polymerase durchgeführt.

II. 4. 7. 1 Die Klonierung von pET28a-N-fkbH und pET-STN-fkbH zur Überproduktion der FkbH-ähnlichen Domäne

Die 1045 bp FkbH-ähnliche Domäne wurde durch die Primer FkbH_fw und FkbH_rev erfolgreich amplifiziert (Primeranlagerung: 66 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 35 sec) und über die SmaI Schnittstelle in den Zwischenvektor pUC19 kloniert. Das Gen für die FkbH-ähnliche Domäne wurde über die Schnittstellen NdeI und Xho -Extension der Primer angefügt wurden, präparativ ausgeschnitten und mit pET28a ligiert, der ebenfalls mit NdeI und XhoI geschnitten vorlag. Die Klonierung wurde durch SequenzierungI, überprüftdie durch und das Plasmid pET28a-N-fkbH (siehe Abb. 18, links) wurde für die heterologe Produktion der FkbH-ähnlichen Domäne mit N-terminalem His6-Tag in E. coli verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 4).

Abb. 18: Die Plasmidkarten von pET28a-N-fkbH (links) und pET-STN-fkbH (rechts) zur Überproduktion der FkbH-ähnlichen Domäne. T7: Promotor für die T7-Polymerase; f1 ori: Replikationsursprung; lacI: lac-Repressor als Teil des T7-Expressionssystems; lac Operator; KanR: Kanamycin-Resistenzgen; N-fkbH: das zu exprimierende Gen für die FkbH-ähnliche Domäne mit N-terminalem His6-Tag (gelb); Strep-fkbH: das zu exprimierende Gen für die FkbH- ähnliche Domäne mit N-terminalem StrepII-Tag (orange); XhoI, HindIII und NdeI Schnittstellen

Die FkbH-ähnliche Domäne wurde mit dem Primerpaar fkbH_fw und fkbH_strep_rev amplifiziert (Primeranlagerung: 66 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 35 sec) und über die SmaI Schnittstelle in den Zwischenvektor pBSK(-) kloniert. Über die Schnittstellen HindIII und Xho Primer eingefügt wurden, wurde das fkbH-ähnliche Fragment präparativ ausgeschnitten und mit pET-STN, der ebenfalls mit HindIII und XhoI geschnitten wurde, ligiert. Das resultierendeI, die über Plasmid Extensionen pET-STN-fkbH der (siehe Abb. 18, rechts) wurde durch Sequenzierung überprüft und im Anschluss zur heterologen Proteinproduktion der FkbH-ähnlichen Domäne mit N-terminalem StrepII-Tag verwendet.

70 Material und Methoden

II. 4. 7. 2 Die Klonierung von pET28a-N-PCP und pET28a-N-PCPmini zur Überproduktion der PCP-Domäne von foxBIII

Der DNA-Bereich von foxBII, der für die Domäne des PCPs (1171 bp) codiert, wurde mit dem Primerpaar foxCP_fw_XhoI+Stop und foxCP_rv_NdeI, am Startcodon von foxBIII beginnend, mit der Phusion-Polymerase amplifiziert (Primeranlagerung: 55 °C und 45 sec; Extension: 72 °C und 40 sec). Das PCR-Produkt wurde zur Vervielfältigung über die SmaI Schnittstelle in den Zwischenvektor pUC19 kloniert und anschließend präparativ über XhoI und NdeI ausgeschnitten und mit pET28a ligiert. Vor der Verwendung von pET28a-N-PCP (siehe Abb. 19, links) für die rekombinante Produktion des N-PCPs in E. coli, wurde die Klonierung durch sequenzieren überprüft

Abb. 19: Die Plasmidkarten von pET28a-N-PCP (links) und pET28a-N-PCPmini (rechts) zur Überproduktion der PCP-Domäne von foxBII. T7: Promotor für die T7-Polymerase; f1 ori: Replikationsursprung; lacI: lac-Repressor als Teil des T7-Expressionssystems; lac Operator; KanR: Kanamycin-Resistenzgen; N-PCP: das zu exprimierende Gen für die PCP-Domäne mit N-terminalem His6-Tag (hellgrün); N-PCPmini: das zu exprimierende Gen für die minimale PCP-Domäne mit N-terminalem His6-Tag (grün); XhoI und NdeI Schnittstellen

Der DNA-Bereich von foxBIII, der für die PCP-Domäne codiert, umfasst ungefähr 222 bp und wurde mit dem Primerpaar PCPmini_fw und PCPmini_rv (Primeranlagerung: 66 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 20 sec) amplifiziert und über die EcoRV Schnittstelle in den Zwischenvektor pBSK(-) kloniert. Über die Schnittstellen NdeI und XhoI wurde die PCP-Domäne mit pET28a ligiert. Das resultierende Plasmid pET28a-N-PCPmini (siehe Abb. 19, rechts) wurde sequenziert und anschließend für die heterologe Produktion der minimalen PCP-Domäne verwendet.

71 Material und Methoden

II. 4. 7. 3 Die Klonierung von pET28a-N-foxGI und pET28a-C-foxGI zur heterologen Produktion von FoxGI in Escherichia coli

Die Plasmide pET28a-N-foxGI und pET28a-C-foxGI wurden für die heterologe Proteinproduktion von FoxGI in E. coli erstellt. Dazu wurde foxGI zur Produktion mit N-terminalem His6-Tag mit dem Primerpaar N-GDH_NdeI_14 und N-GDH_XhoI+S_15 amplifiziert (siehe Tab. 5). Zur Primeranlagerung wurden 61 °C und 45 sec gewählt und zur Extension durch die Pfu-Polymerase wurden 72 °C und 2:30 min gewählt (siehe Kapitel B. II. 4. 1). Das 1457 bp lange PCR-Produkt wurde über die blunt end Schnittstelle SmaI mit pUC19 ligiert und pUC19-N-foxGI wurde in E. coli XL1-Blue vervielfältigt (siehe Kapitel B. II. 4. 3. 1). Ausgeschnitten wurde foxGI mit Hilfe der Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen XhoI und NdeI die -Extension der Primer angehängt wurden. Das Expressionsplasmid pET28a wurde ebenfalls mit XhoI und NdeI verdaut und mit foxGI ligiert. Die Klonierung wurde durch Sequenzierung überprüft und durchpET28a-N- foxGI (siehe Abb. 20) wurde dann zur Produktion des rekombinaten FoxGI verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 3).

Abb. 20: Plasmidkarten von pET28a-N-foxGI (links) und pET28a-C-foxGI (rechts) zur rekombinanten Proteinproduktion von FoxGI mit N- oder C-terminalem His6-Tag in E. coli. T7: Promotor für die T7-Polymerase; f1 ori: Replikationsursprung; lacI: lac-Repressor als Teil des T7-Expressionssystems; lac Operator; KanR: Kanamycin- Resistenzgen; N-foxGI: das zu exprimierende Gen für foxGI mit N-terminalem His6-Tag (grün, links); C-foxGI: foxGI mit C-terminalem His6-Tag (grün, rechts); XhoI, PciI, NcoI und NdeI Schnittstellen

Für die Produktion von FoxGI mit C-terminalem His6-Tag wurde foxGI mit dem Primerpaar C-GDH_PciI_16 und GDHCX amplifiziert (siehe Tab. 5). Mit 45 sec und 67 °C zur Primeranlagerung und 1 min und 72 °C zur Extension durch die Phusion-Polymerase wurde das 1463 bp lange foxGI amplifiziert (siehe Kapitel B. II. 4. 1). Das PCR-Produkt wurde über eine Zwischenklonierung in pUC19 über die SmaI Schnittstelle vervielfältigt und wurde über die XhoI und Pci -Anhänge der Primer eingefügt wurden, ausgeschnitten. Das DNA-Fragment wurde mit pET28a ligiert, der durch XhoI und NcoI geöffnet wurde. PciI ist ein Isoschizomer von NcoI. BeideI Schnittstellen, Restriktionsendonukleasen die über produzieren dieselben, kompatible Überhänge die miteinander ligiert werden können, haben aber unterschiedliche Erkennungssequenzen. Da NcoI eine Erkennungssequenz in foxGI besitzt, konnte dieses Restriktionsenzym nicht zur Herstellung komptibler, sticky ends verwendet werden, weswegen PciI ausgewählt wurde. Durch Sequenzierung wurde die Klonierung auf ihre Richtigkeit überprüft und pET28a-C-foxGI (siehe Abb. 20) wurde dann zur Produktion von FoxGI in E. coli verwendet werden (siehe Kapitel B. II. 5. 3).

72 Material und Methoden

II. 4. 7. 4 Die Klonierung von pET28a-N-foxGII und pET28a-C-foxGII zur heterologen Produktion von FoxGII in Escherichia coli

Für die rekombinante Proteinproduktion von FoxGII wurden die Plasmide pET28a-N-foxGII und pET28a-C-foxGII erstellt. Für die Produktion von FoxGII mit N-terminalem His6-Tag wurden die 946 bp von foxGII durch das Primerpaar N-TPI_NdeI_18 und N-TPI_XhoI+S_19 (Primeranlagerung: 63 °C und 45 sec; Extension: 72 °C und 2:30 min) und die Pfu-Polymerase amplifiziert (siehe Kapitel B. II. 4. 1). Das PCR- Produkt wurde über die blunt end Schnittstelle SmaI in pUC19 kloniert (siehe Kapitel B. II. 4. 3. 1). Nach der Vervielfältigung wurde foxGII über XhoI und NdeI, die über die Primer an foxGII angehängt wurden, ausgeschnitten und über kompatible Enden mit pET28a ligiert. Bevor pET28a-N-foxGII (siehe Abb. 21) zur Proteinproduktion verwendet werden konnte, wurde die Klonierung durch Sequenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft.

Abb. 21: Plasmidkarten von pET28a-N-foxGII (links) und pET28a-C-foxGII (rechts) zur rekombinanten Proteinproduktion von FoxGII mit N- oder C-terminalem His6-Tag in E. coli. T7: Promotor für die T7-Polymerase; f1 ori: Replikationsursprung; lacI: lac-Repressor als Teil des T7-Expressionssystems; lac Operator; KanR: Kanamycin- Resistenzgen; N-foxGII: das zu exprimierende Gen für foxGII mit N-terminalem His6-Tag (blau, links); C-foxGII: foxGII mit C-terminalem His6-Tag (blau, rechts); XhoI, NcoI und NdeI Schnittstellen

Die Amplifikation von foxGII für die Produktion mit C-terminalem His6-Tag wurde mit dem Primerpaar TPIfw_NcoIC_7 und TPIrev_XhoIC_8 (Primeranlagerung: 65 °C und 45 sec; Extension: 72 °C und 2:30 min) und der Pfu-Polymerase durchgeführt (siehe Kapitel B. II. 4. 1). Das 940 bp lange PCR-Produkt wurde mit dem SmaI geschnittenen pUC19 ligiert und in E. coli vervielfacht (siehe Kapitel B. II. 4. 3. 1). Über kompatible Enden, die durch den Verdau mit XhoI und NcoI entstanden sind, wurde foxGII in den Expressionsvektor pET28a eingebracht und anschließend sequenziert. pET28a-N-foxGII (siehe Abb. 21) wurde zur Produktion von FoxGII mit C-terminalem His6-Tag verwendet.

II. 4. 7. 5 Die Klonierung von pET28a-N-foxGIII und pET28a-C-foxGIII zur heterologen Produktion von FoxGIII in Escherichia coli

FoxGIII wurde zur heterologen Proteinproduktion in pET28a kloniert. Dabei wurden zwei unterschiedliche Expressionsplasmide erstellt um FoxGIII mit N- oder C-terminalem His6-Tag zu produzieren. Für die Klonierung von pET28a-N-foxGIII wurde das 870 bp lange foxGIII mit dem Primerpaar FDAfw_NdeIN_9 und FDArev_XhoIN_10 (Primeranlagerung: 67 °C und 40 sec; Extension: 72 °C und 60 sec) und der Phusion- Polymerase amplifiziert (siehe Kapitel B. II. 4. 1). Das PCR-Produkt wurde über SmaI in pUC19 kloniert und in E. coli vervielfacht (siehe Kapitel B. II. 4. 3. 1). Anschließend wurde foxGIII präparativ mit den Restriktionsschnittstellen XhoI und Nde -Anhänge der Primer eingebracht wurden, ausgeschnitten und mit pET28a ligiert, der ebenfall mit XhoI und NdeI verdaut wurde. Die Klonierung wurde durch Sequenzierung überprüft und pET28a-N-I, die überfoxGII (siehe Abb. 22) wurde dann für die Proteinproduktion verwendet. 73 Material und Methoden

FoxGIII mit C-terminalem His6-Tag konnte durch die Expression von pET28a-C-foxGIII in E. coli produziert werden. Für die Herstellung des Plasmids wurde foxGIII (896 bp) zunächst mit den Primern FDAfw_NcoIC_11 und FDACX und der Pfu-Polymerase amplifiziert (Primeranlagerung: 68 °C und 45 sec; Extension: 72 °C und 2:15 min) und über SmaI in pUC19 kloniert. Über die Schnittstellen XhoI und NcoI wurde foxGIII ausgeschnitten und über kompatible Enden mit pET28a ligiert. Vor der Verwendung von pET28a-C-foxGIII (siehe Abb. 22) wurde die Klonierung durch Sequenzierung kontrolliert.

Abb. 22: Plasmidkarten von pET28a-N-foxGIII (links) und pET28a-C-foxGIII (rechts) zur rekombinanten Proteinproduktion von FoxGIII mit N- oder C-terminalem His6-Tag in E. coli. T7: Promotor für die T7-Polymerase; f1 ori: Replikationsursprung; lacI: lac-Repressor als Teil des T7-Expressionssystems; lac Operator; KanR: Kanamycin- Resistenzgen; N-foxGIII: das zu exprimierende Gen für foxGIII mit N-terminalem His6-Tag (orange, links); C-foxGIII: foxGIII mit C-terminalem His6-Tag (orange, rechts); XhoI, PciI, NcoI und NdeI Schnittstellen

II. 4. 7. 6 Die Klonierung des single crossover Plasmids pKC1132-foxGIint und der Komplementierungsplasmide pUWL-T-foxGI und pUWL-H-foxGI

Das Gen foxGI des Foxicin-BGCs wurde durch einen single crossover inaktiviert. Zur Herstellung des single crossover Plasmids pKC1132-foxGIint wurde ein 1139 bp langer, interner Bereich von foxGI durch das Primerpaar fwGDH_ko und rvGDH_ko und die Pfu-Polymerase amplifiziert (Primerannealing: 45 sec und 56 °C; Extension: 2:15 min und 72 °C). Das PCR-Produkt wurde über die blunt end Schnittstelle SmaI in pBSK- zwischenkloniert und anschließend durch die Restriktionsendonukleasen HindIII und EcoRI präparativ ausgeschnitten. Das so vorbereitete DNA-Fragment wurde mit dem Plasmid pKC1132 ligiert, das

Abb. 23: Plasmidkarten von pKC1132-foxGIint (links) und pUWL-T-foxGI (rechts). pKC1132-foxGIint mit aac als ApraR, lacZa, oriT, Replikationsursprung und 1139 bp homologer Bereich von foxGI. pUWL-T-foxGI mit ermE Promotor, foxGI, lacZa, bla als AmpR, tsr als ThioR, oriT und Replikationsursprung.

74 Material und Methoden

ebenfalls mit HindIII und EcoRI verdaut wurde. Das Plasmid pKC1132-foxGIint (Abb. 23) wurde durch Sequenzierung überprüft und anschließend für die Inaktivierung von foxGI in S. diastatochromogenes pokOIV verwendet.

ΔNach der erfolgreichen Inaktivierung von foxGI wurde die single crossover Mutante durch das Plasmid pUWL-T-foxGI komplementiert. Dazu wurde foxGI durch das Primerpaar G3P_fw und G3P_rv und der Phusion-Polymerase amplifiziert (Primerannealing: 45 sec und 56 °C; Extension: 45 sec und 72 °C). Das PCR-Produkt wurde, nach einer Zwischenklonierung über die SmaI Schnittstelle in pUC19, über EcoRI und BamHI in pUWL-oriT kloniert. Durch Sequenzierung wurde pUWL-T-foxGI (Abb. 23) auf seine Richtigkeit überprüft und anschließend zur Komplementierung verwendet.

II. 4. 7. 7 Die Klonierung von pCRISPR-Cas9-foxGI zur Deletion von foxGI

Für die Herstellung von pCRISPR-Cas9-foxGI wurden zunächst die 128 bp kleine sgRNA mit den Primern sgRNA2-F und sgRNA-R 123 amplifiziert (Primeranlagerung: 69 °C, 30 sec; Extension: 72 °C, 15 sec). Als PCR-Template diente pCRISPR-Cas9. Über die SmaI Schnittstelle in der multiple cloning site von pUC19 wurde die sgRNA vermehrt und über die NcoI und SnaBI Schnittstellen mit pCRISPR-Cas9 ligiert. Die Klonierung der sgRNA wurde durch Sequenzierung überprüft. Da der Cas9-induzierte Doppelstrangbruch mittels homology-directed repair Bereiche von foxGI mit den Primerpaaren foxGI foxGI °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 20 sec) und foxGI foxGIrepariert werden soll, wurden nichtcodierende °C, 45 sec; Extension: und 72 °C, 25 sec) __F/-DNA-Bereich__R wurde amplifiziert über die Primeranlagerung: SmaI Schnittstelle in der Zwischenvektor pBSK(- __F/ __R Primeranlagerung:-Bereich von foxGI in zwei Orientierungen vorliegen. Beim amplifiziert.präparativen Der Verdau mit bp EcolangeRI und SacI wurde die Version von pBSK-foxGI- , -Ende die Eco eingebracht. Dabei kann der -Bereich von foxGI wurde über SmaI in pUC19 eingebracht und es wurde mit pUC19-foxGI- EcoRI und verwendet Sac an dessen gewünschtenRI Sequenz DNA-Bereichs vorliegt. Der liegen. bp Das lange Plasmid pUC19-foxGI- EcoRI und SacI geschnitten und anschließend mit dem weitergearbeitet, EcoRI und Sac I ingeschnittenen dem die foxGI- -BereichI Schnittstellen ligiert. Das Plasmid des wurde präparativ mit

Abb. 24: Plasmidkarte von pCRISPR-Cas9-foxGI. cas9: Cas9 Endonuklease unter Kontrolle eines Thiostrepton- induzierbaren Promotors, tsr: ThioR, rep: Replikationsursprung, aac: ApraR, sgRNA-Sequenz. pCRISPR-Cas9 enthält bereits die sgRNA und wurde mit Stu -Bereiche aus pUC19 wurden mit foxGI foxGI rung: 59 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 35 sec) amplifiziert und das PCR-Produkt (1164 bp) konnte dann Iüber präparativ blunt end geschnitten. Schnittstelle Die Stu/I mit pCRISPR- Cas9 ligiert zu werden. Das__F/ fertig klonierte__R PrimeranlagepCRISPR-Cas9-foxGI (siehe Abb. 24) wurde im Anschluss über die intergenerische Konjugation in Streptomyces diastatochromogenes pokOIV eingebracht und die Transkription der Cas9-Endonuklease mit Thiostrepton induziert (siehe Kapitel B. II. 4. 5. 2) Δ

75 Material und Methoden

II. 4. 7. 8 Klonierung der Regulatoren des Foxicin Biosynthese-Genclusters

Im fox Cluster befinden sich zehn ORFs die für putative Regulatoren codieren. Um die Rolle der Regulatoren für die Biosynthese von Foxicin zu analysieren, wurden sie in pTESa kloniert und in S. diastatochromogenes pokOIV überexprimiert.

Abb. 25: Plasmidkarten der fox Regulatoren in pTESa. aac3‘IV für ApraR; oriT: Transferursprung; pint: Promotor -Phagen; attP als Erkennungssequenz für die Integrase; ColE1ori als Replikationsursprung in E. coli; ermEp1 Promotor; loxP: Erkennungssequenz für die Cre-Rekombinase; tfd derTerminator Integrase; des φC fd Phagen; Integrase Schnittstellen aus dem φCBamHI, EcoRI, KpnI und XbaI

Der Regulator durch foxRI (757 bp) wurde durch das Primerpaar foxRI_fw und foxRI_rv (Primeranlagerung: 55 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 35 sec) amplifiziert und in den Zwischenvektor pUC19 kloniert. Anschließend wurde foxRI über BamHI und EcoRI ausgeschnitten und in den Zielvektor pTESa kloniert. Die Regulatoren foxRII (1281 bp) und foxRIII (747 bp) gehören zu einem putativen Zwei-Komponenten-System und wurden durch die Primerpaare foxRII_fw und foxRII_rv (Primeranlagerung: 56 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 40 sec), bzw. durch foxRIII_fw und foxRIII_rv (Primeranlagerung: 53 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 25 sec), amplifiziert. Nach der PCR wurde foxRII in den Zwischenvektor pUC19 und anschließend, über die Restriktionsschnittstellen KpnI und XbaI, in pTESa kloniert. Das PCR-Produkt foxRIII sollte über BamHI und EcoRI in pTESa kloniert werden. Durch die Primerpaare foxRIV_fw und foxRIV_rv (Primeranlagerung: 56 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 20 sec) wurde der putative MarR Regulator foxRIV (544 bp) amplifiziert und durch die Primer foxRVI_fw und foxRVI_rv (Primeranlagerung: 55 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 30 sec) wurde der putative AraC Regulator foxRVI (819 bp) amplifiziert. Auch foxRIV und foxRIV wurden über den

76 Material und Methoden

Zwischenvektor pUC19 vervielfacht. Anschließend wurde foxRIV über die Schnittstellen KpnI und XbaI in pTESa kloniert, während foxRIV mit Hilfe der BamHI und EcoRI Schnittstellen in pTESa kloniert wurde. Die putative 50S rRNA Methyltransferase foxRVII (1164 bp) wurde durch das Primerpaar foxRVII_fw und foxRVII_rv amplifiziert (Primeranlagerung: 57 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 45 sec). Nachdem foxRVII mit dem Zwischenvektor pUC19 vervielfältigt wurde, wurden der putative Regulator über BamHI und EcoRI in pTESa eingebracht. Die putative Dioxygenase foxRVIII (755 bp) wurde durch das Primerpaar foxRVIII_fw und foxRVIII_rv amplifiziert (Primeranlagerung: 53 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 30 sec). Der putative Regulator foxRVIII wurde ebenfalls in pUC19 zwischen kloniert und anschließend über BamHI und EcoRI in pTESa kloniert. Mit dem Primerpaar foxRIX_fw und foxRIX_rv wurde der putative ROK Regulator foxRIX (1284 bp) amplifiziert (Primeranlagerung: 61 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 45 sec). Über XbaI und EcoRI wurde foxRIX in pTESa kloniert. Der putative TetR/AraC Regulator foxRX (816 bp) wurde durch das Primerpaar foxRX_fw und foxRX_rv amplifiziert (Primeranlagerung: 59 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 30 sec) und, nach der Klonierung in den Zwischenvektor pUC19, über die Schnittstellen XbaI und EcoRI in pTESa eingebracht.

II. 4. 7. 9 Klonierung des TAR-Vektors pCAP01-Sco7

Für die Herstellung von pCAP01-Sco7 wurde der ORF ctg1_932 (up, upstream) mit dem Primerpaar aap20_04_Fw und aap20_04_Re (Primeranlagerung: 57 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 1:15 min) amplifiziert. Das 1306 bp große PCR-Produkt wurde über die blunt end Schnittstelle SmaI in pBSK(-) kloniert. Der orf1_964 (down, downstream) wurde durch das Primerpaar Down_XhoI_24 und Down_AgeI_25 (Primeranlagerung: 65 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 1 min) amplifiziert. Das PCR-Produkt (1124 bp) wurde über die blunt end Schnittstelle SmaI in pUC19 kloniert, anschließend mit XhoI und HindIII präparativ ausgeschnitten und mit pBSK-up, ebenfalls mit XhoI und HindIII geschnitten, ligiert. Die 2493 bp große Verbindung aus up- und downstream Fragement wurde mit XhoI und SpeI ausgeschnitten und mit pCAP01, der ebenfalls mit XhoI und SpeI geschnitten wurde, ligiert. Der fertige pCAP01-Sco7 wurde durch Sequenzierung verifiziert und für die Transformations-assoziierte Rekombination in S. cerevisiae verwendet.

Abb. 26: Plasmidkarte von pCAP01-Sco7. Up entspricht dem upstream Fragment und down entspricht dem downstream Fragment, TRP1 als Auxotrophiemarker für Tryptophan; CEN6_ARS4 als Replikationsurpsrung in S. cerevisiae; aph(3)II für KanR mit Promotor; mit attP; RP4 oriT als origin of transfer; pBR322 ori.

φC

77 Material und Methoden

II. 4. 7. 10 Klonierung der Kernregion des BGC 7 aus S. collinus Tü365

Die ORFs ctg1_941 bis ctg1_946 bilden die Kernregion des BGC 7 aus S. collinus Tü365 und sollten durch PCR amplifiziert werden. Der erste Kernbereich core 1 (4,99 kb) wurde durch das Primerpaar Core1fw_EcoRV und Core1rev (Primeranlagerung: 61 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 5:10 min) amplifiziert. Der Bereich core 2 wurde durch das Primerpaar Core2fw und Core2rev amplifiziert (Primeranlagerung: 55 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 8 min) und der Bereich core 3 wurde durch das Primerpaar Core3fw und Core3rev amplifiziert (Primeranlagerung: 58 °C, 45 sec; Extension: 72 °C, 6 min). Die optimalen PCR- Abb. 27: Die vier Bereiche (core 1-4) der Kernregion des Bedingungen für das Primerpaar Core4fw2 und BGC 7 aus S. collinus Tü365 mit den Schnittstellen ClaI, Core4rev2 zur Amplifizierung des BsrGI und XhoI. Kernbereichs core 4 konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht ermittelt werden. Die Kernbereiche 1 bis 3 wurden jeweils über die SmaI Schnittstelle in pUC19 kloniert. Anschließend sollten pUC19-core1 und der Kernbereich core 2 über HindIII und ClaI ligiert werden. Das Plasmid pUC10-core3 sollte mit dem Kernbereich core 4 über XbaI und XhoI ligiert werden. Über die Schnittstellen BsrGI und XbaI sollte pUC19-core1-core2 mit core3-core4 ligiert werden. Das Plasmid pUC19-core1-core2-core3-core4 sollte dann präparativ mit XbaI und EcoRV verdaut werden und mit dem ebenfalls geschnittenen pTESa ligiert werden. Das fertige Plasmid pTESa-Sco-core kann dann für die heterologe Expression in S. sp. verwendet werden.

Abb. 28: Plasmidkarte von pTESa-Sco-core. aac3‘IV für ApraR; oriT: Transferursprung; pint: Promotor der -Phagen; attP als Erkennungssequenz für die Integrase; ermE Promotor; loxP: Erkennungssequenz für die Cre-Rekombinase; tfd Terminator des fd Phagen; Schnittstellen EcoRV, ClaI, BsrGI und XhoI Integrase; φC Integrase aus dem φC

78 Material und Methoden

II. 5. Produktion, Aufreinigung und Analytik von Proteinen

Die Produktion von rekombinanten Proteinen in einem geeigneten Wirtssystem, wie z.B. E. coli, dient der experimentellen Analyse von Enzymfunktionen und -eigenschaften. Dazu werden die entsprechenden Gene amplifiziert, in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und in E. coli eingebracht. Die verwendeten pET-Vektoren sind Teil des T7-Expressionssystems, somit kann die Proteinproduktion durch die Zugabe von IPTG induziert werden. Expressionsvektoren wie die pET-Vektoren, enthalten in der Regel eine Tag- Sequenz, die bei der Proteinbiosynthese am N- oder C-Terminus des rekombinanten Proteins fusioniert wird. Tags, wie der His6-Tag oder der Strep-Tag, die in dieser Arbeit verwendet wurden, vereinfachen die Aufreinigung. Nach der Aufreinigung können die rekombinanten Proteine für in vitro Assays verwendet werden.

In dieser Arbeit wurden die Proteine FoxGI, FoxGII, FoxGIII, sowie die FkbH-ähnliche Domäne des fox-Clusters und die PCP-Domäne von foxBIII heterolog in E. coli produziert und in in vitro Assays auf ihre Funktion untersucht.

II. 5. 1 Heterologe Produktion von Proteinen in Escherichia coli

Die Produktion rekombinanter Proteine in E. coli wurde im analytischen (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1), sowie im präparativen Maßstab (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 2) durchgeführt.

II. 5. 1. 1 Testexpression

Vor der Produktion von unbekannten Proteinen im präparativen Maßstab, wurden die optimalen Bedingungen für die Proteinproduktion durch Testexpressionen ermittelt. Dabei wurden unterschiedliche E. coli Stämme (siehe Tab. 2), Nährmedien (LB, 2xYT, TB, Autoinduktionsmedium, siehe Tab. 8) und Temperaturen (20 °C, 28 °C, 37 °C) getestet, die bei der späteren Produktion im präparativen Maßstab verwendet wurden.

Die verschiedenen E. coli Stämme wurden mit dem entsprechenden Expressionsplasmid transformiert und in 20 mL LB-Medium unter Selektionsdruck über Nacht bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Am folgenden Tag wurde die OD600 nm der Vorkultur bestimmt und die 100 mL Hauptkultur wurde auf eine OD600 nm von 0,02 beimpft (siehe Kapitel B. II. 1. 1). Das Wachstum der Kulturen wurde photometrisch verfolgt und beim Erreichen einer OD600 nm von 0,5 bis 0,6 wurde die Proteinproduktion mit IPTG induziert (Endkonzentration im Medium: 100 mM IPTG). Anschließend wurden die Kulturen bei unterschiedlichen Temperaturen weiter kultiviert, wobei in regelmäßigen Abständen je 1 mL der Kultur entnommen wurde. Die Kultivierungstemperatur entschied dabei über den zeitlichen Abstand der Probennahme. Bei 37 °C beträgt die Verdopplungzeit von E. coli ungefähr 20 min, bei 28 °C oder 20 °C dauert die Verdopplung deutlich länger. Die Kulturen bei 37 °C wurden in der Regel 3-8 h kultiviert, wobei die Proben hier im Abstand von 1 h genommen wurden. Die Kulturen bei 28 °C wurden hingegen 10-16 h, die Kulturen bei 20 °C bis zu 20 h kultiviert. Die Probennahme fand in größeren, zeitlichen Intervallen statt. Die entnommenen Proben wurden für die Analyse mittels SDS-PAGE verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 1), wodurch die optimalen Bedingungen für die Proteinproduktion bestimmt werden konnten. Diese Bedingungen wurden dann für die Produktion im präparativen Maßstab (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 2) verwendet.

II. 5. 1. 2 Präparativer Maßstab

Für die heterologe Produktion von Proteinen im präparativen Maßstab wurden die optimalen Produktionsbedingungen zunächst im Rahmen von Testexpressionen ermittelt (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1). Sind diese Bedingungen bekannt, wurde das Expressionsplasmid in den entsprechenden E. coli Stamm transformiert und in 100 mL LB-Medium unter Selektionsdruck üN bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Am

79 Material und Methoden

folgenden Tag wurde die OD600 nm der Vorkultur bestimmt. Eine 0,5-3 L Hauptkultur mit AB wurde mit der Vorkultur auf eine OD600 nm von 0,02 beimpft. Bei Erreichen der OD600 nm= 0,5-0,6 wurde die Proteinproduktion durch die Zugabe von IPTG (Enkonzentration 100 mM) induziert und die Kulturen wurden dann unter den spezifischen Bedingungen kultiviert. Anschließend wurden die Kulturen zentrifugiert und das Pellet wurde für die weitere Aufreinigung verwendet oder bei -20 °C gelagert (siehe Kapitel B. II. 5. 2).

II. 5. 2 Aufreinigung von rekombinanten Proteinen

Die pET-Vektoren, die in dieser Arbeit verwendet wurden, codieren für Tag-Sequenzen (His6-Tag oder StrepII-Tag), die N- oder C-terminal mit dem rekombinanten Protein fusioniert werden können und die spätere Aufreinigung vereinfachen. Nachfolgend wird die Aufreinigung von heterolog produzierten Proteinen beschrieben (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2 bis Kapitel B. II. 5. 2. 3).

II. 5. 2. 1 Zellaufschluss

Wird bei der Produktion von rekombinanten Proteinen E. coli als Wirtssystem verwendet, verbleiben die Proteine intrazellulär. Falls nötig können Protein durch das Anbringen von spezifischen Signalsequenzen ins Periplasma sekretiert werden. Aus diesem Grund werden die E. coli Zellen vor der weiteren Aufreinigung aufgeschlossen. Die Wahl der Methode kann dabei vom Kulturvolumen abhängen, z.B. bei der Lyse mittels Lysozym oder der French Pressure Cell.

II. 5. 2. 1. 1. Zellaufschluss mit Lysozym

Für die Aufreinigung von Proteinen aus kleinen Kulturvolumina (bis 500 mL) wurde das Pellet langsam auf Eis aufgetaut und dann in 8 mL Lysepuffer (siehe Tab. 17) resuspendiert. Durch die Zugabe von 15-30 µL Lysozym (100 mg/mL) wu -1,4-glykosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure und N-Acetylglucosamin der bakteriellen Zellwand hydrolysiert. Optional wurde hier DNase I zugegeben. Die Zellen wurden dann ca. 30 rdenmin aufdie Eis oder 15 min bei RT bei mehrmaligem invertieren inkubiert, bis die Lyse der Zellen zu erkennen ist. Das Zelllysat wurde dann bei 15 min bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert um die festen Bestandteile wie z.B. Zelltrümmer von den löslichen Komponenten zu trennen und wurde dann für die Aufreinigung mit Ni2+-Agarose weiterverwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 1 und Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2).

II. 5. 2. 1. 2. Zellaufschluss mit der French Pressure Cell

Der Zellaufschluss bei größeren Kulturvolumina (> 1 L) erfolgte durch die Verwendung einer vorgekühlten French® pressure cell press. Dazu wurde das Zellpellet langsam auf Eis aufgetaut, in 15-50 mL des proteinspezifischen Puffer A oder Puffer 1 (siehe Tab. 17) resuspendiert und anschließend mit einer Spatelspitze Lysozym vermischt. Zusätzlich wurden 10-30 µL DNase I zugegeben, da freiwerdende gDNA möglicherweise die Mikrokanäle der French® pressure cell press verstopfen kann. Beim Zellaufschluss mit der French® pressure cell press wird die Zellsuspension in einem Druckbehälter komprimiert. Durch pulsweises Öffnen eines Nadelventils entstehen Scherkräfte, die zu Rissen in der bakteriellen Zellwand führen. Die Zellsuspension wurde ungefähr dreimal wie beschrieben behandelt, bis der Zellaufschluss deutlich zu sehen war. Durch Zentrifugation (30-60 min, 10000 rpm, 4 °C; bei Bedarf Überstand abnehmen und nochmals zentrifugieren) wurden die festen von den löslichen Bestandteilen abgetrennt und die entsprechende Fraktion wurde dann zur Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie unmittelbar weiterverwendet.

80 Material und Methoden

II. 5. 2. 1. 3. Zellaufschluss durch Ultraschall

Der Zellaufschluss durch Ultraschall kann sowohl bei kleineren als auch bei größeren Zellmengen verwendet werden. Das Zellpellet wurde in 25-30 mL Puffer A resuspendiert und in ein Becherglas gefüllt. Die Ultraschallsonde sollte möglichst mittig und bis knapp über dem Becherglasboden eingetaucht werden. Werden die Zellen dem Ultraschall ausgesetzt entstehen Kavitationskräfte, bei denen die Zellen aneinanderstoßen und scheren. Dabei entsteht zusätzlich Wärme, weshalb permanent auf Eis gearbeitet werden sollte. Für kleinere Zellmengen (ca. 5 g) wurde der Ultrasonic Processor XL mit Ultrasonic Converter, 20 kHz von Misonix verwendet. Die Zellen wurden insgesamt 5 min, mit 10 sec Ultraschallpuls und 10 sec Pause aufgeschlossen. Bei größeren Zellmengen (ca. 10 g) wurde der Vibra Cell Processor mit CV26 Konverter von Sonics & Materials Inc. verwendet. Die Zellsuspension wurde insgesamt 4 min, mit 2 sec Ultraschallpuls und 2 sec Pause aufgeschlossen. Durch Zentrifugation (30 min, 18000 rpm, 4 °C) wurden die festen von den löslichen Bestandteilen getrennt und die entsprechende Fraktion wurde dann zur Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie unmittelbar weiterverwendet.

II. 5. 2. 2 Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie

Die codierenden Gene für die Herstellung rekombinanter Proteine werden in der Regel mit einer so genannten Tag-Sequenz fusioniert. Diese Tag-Sequenz kann sich später am C- oder N-Terminus des Proteins befinden und erleichtert die Aufreinigung des produzierten Proteins. Häufig werden sogenannte Affinitäts-Tags wie z.B. der Hexa-Histidin-Tag (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 1 und Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 1) oder der Strep-Tag (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 3) verwendet.

Der His6-Tag bindet an eine Matrix mit immobilisierten Ni2+ Ionen und wird somit zurückgehalten. Imidazol konkurriert mit Histidin um die Ni2+ Bindestellen und somit können durch steigende Imidazolkonzentrationen nicht, oder unspezifisch bindende Proteine ausgewaschen werden. Durch hohe Imidazolkonzentrationen (250-500 mM) wird das His6-getaggte Protein dann von der Säule verdrängt.

Der Strep-Tag II hingegen ist eine Sequenz bestehend aus acht Aminosäuren (WSHPQFEK), die spezifisch und reversibel an Streptavidin bindet. Durch die Verwendung des Strep-Tags II kann das rekombinante Protein unter milden Pufferbedingungen kompetitiv mit D-Biotin oder D-Desthiobiotin eluiert werden163.

Die Aufreinigung rekombinanter Proteine kann im kleinen, analystischen Maßstab durchgeführt werden oder im präparativen Maßstab mit Hilfe einer FPLC-Anlage. Die Aufreinigung von rekombinanten Proteinen kann sowohl mit löslichen, als auch mit unlöslichen Proteinen durchgeführt werden (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 2). Trotzdem sollten die Kultivierungsbedingungen so gewählt werden, dass das gewünschte Protein löslich vorliegt.

II. 5. 2. 2. 1. Analytischer Maßstab mit Ni2+ Agarose

Die Aufreinigung His6-getaggter, rekombinanter Proteine aus kleinen Kulturvolumina (bis 500 mL) wurde mit Ni2+-Agarosebeads durchgeführt. Nach dem Zellaufschluss (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1) wurde das Lysat auf mehrere 2 mL Reaktionsgefäße verteilt und zentrifugiert (15 min, 14000 rpm, 4 °C). In der Zwischenzeit wurden 1,5-2 mL Ni2+-Agarose 2-3-mal mit Lysepuffer oder H20dest. gewaschen. Der Überstand wurde in ein kleines Becherglas überführt und zusammen mit der gewaschenen Ni2+-Agarose unter Rühren für 60 min auf Eis inkubiert. Das Gemisch wurde dann in eine leere Plastiksäule mit Fritte gegeben und der Durchfluss wurde in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Um Proteine zu entfernen, die unspezifisch oder über ionische Wechselwirkungen an die Ni2+-Agarose gebunden haben, wurde die Säule zweimal mit jeweils 4 mL kaltem Waschpuffer (Tab. 17) gewaschen. Beide Fraktionen wurden ebenfalls in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen aufgefangen. Das His6-getaggte Protein wurde durch die Zugabe von viermal je 0,5 mL kaltem Elutionspuffer (Tab. 17) eluiert und die Fraktionen wurden in vier 1,5 mL Reaktionsgefäßen aufgefangen. Nach der Benutzung der Ni2+-Agarose wurde für 30 min mit 0,5 M NaOH gewaschen und zur Lagerung in 1-2 mL 30 % EtOH gelöst. Alternativ kann die Ni2+-Agarose mit 2 mL EDTA (0,5 M, pH 8) gestrippt und anschließend mit 10 mL H20bidest. gewaschen werden. Um die Ni2+-Agarose neu zu beladen

81 Material und Methoden

wurden 2,5 mL NiCl2 (100 mM) verwendet und die Säule wurde dann erneut mit 10 mL H20bidest. gewaschen. Die Ni2+-Agarose kann dann in 30 % EtOH gelöst werden und bis zur nächsten Verwendung bei 4 °C gelagert werden.

Die Eluate wurden dann für die Analyse mittels SDS-PAGE vorbereitet und verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 1).

II. 5. 2. 2. 2. Präparativer Maßstab mittels ÄKTA-FPLC

Bei größeren Kulturvolumina oder um die Pufferbedingungen genauer kontrollieren zu können, wurden His6-getaggte Proteine mit Hilfe der ÄKTA-FPLC aufgereinigt. Als mobile Phase wurden die Puffer aus Tab. 17 verwendet, die ausgehend von zwei Vorratsgefäßen dem System über Schläuche zugeführt werden können. Durch zwei Pumpen kann einerseits das Mischungsverhältnis der Puffer exakt eingestellt werden, andererseits wird verwendet. Der angelegte Fluss und der daraus resultierende Druck richten sich nach den der Fluss kontrolliert und reguliert. Als stationäre Phase wurde die HisTrap™ FF mL Superloop statt. Bei kleineren Probenvolumina bis 2 mL wurde der 2 mL Sampleloop verwendet. Das SammelnHerstellerangaben von Proben zur wurde HisTrap™ vollautomatisch FF mL. Das über Auftragen den Probensammler der Probe fi Fracndet 900in der durchgeführt. Regel mit dem Das gesamte mL System ist dauerhaft auf 4 °C gekühlt und ist bei Nichtbenutzung in 20 % EtOH gelagert.

II. 5. 2. 2. 2. 1. Aufreinigung von Proteinen mittels HisTrap™ FF 5 mL

Konditionierung der HisTrap FF 5 mL Säule:

wurde in 20 % EtOH gelagert und muss vor der Verwendung gewaschen und äquilibriert werden. Dazu wurde zunächst mit 6 SV H2Obidest. und anschließend mit 6 SV Puffer A gespült (siehe Tab. 34). DieDurch HisTrap™ das enthaltene FF Natriumchlorid soll die unspezifische Bindung von Proteinen über ionische Wechselwirkungen verhindert werden. Die geringe Imidazolkonzentration wirkt der unspezifischen Bindung von Proteinen entgegen und bereitet die Säule für die nachfolgende Aufreinigung vor.

Tab. 34: Konditionierung der HisTrap™ FF mL

Reinigungsschritt Säulenvolumen (SV) Fluss [mL/min]

6 SV H2Obidest. 1 6 SV Puffer A Äquilibrieren der HisTrap™ FF

Aufreinigung von rekombinanten Proteinen mit fusioniertem His6-Tag

Der Zellaufschluss erfolgte wie im Kapitel B. .II. 5. 2. 1 beschrieben. Nach der Zenrifugation des Zelllysats wurde der Überstand abgenommen, in den 150 mL Superloop gefüllt und mit dem ÄKTA-FPLC-System verbunden. Die Probe wurde dann auf die HisTrap t dem automatischen Probensammler aufgefangen. Im Durchfluss befinden sich alle Proteine, die nicht an die stationäre Phase gebunden haben. Nach dem vollständigen™ FF Auftrag geladenen und der Probe, der Durchfluss wurde so wurdelange mit mi Puffer A gespült, bis die gemessene Absorption (280 nm) wieder die Basislinie erreicht hatte. Um anschließend Proteine zu entfernen, die unspezifisch gebunden haben, wurde Puffer A bestimmte Mengen Puffer B beigemischt um einen ansteigenden Imidazolgradienten zu erzielen. Dieser Gradient wurde entweder liniear oder stufenweise eingestellt. Zur Elution wurde die Imidazolkonzentration weiter erhöht. Während der Elution wurden mit dem Probensammler einzelne Fraktionen gesammelt und für die weitere Proteinanalystik oder eine Gelfiltration verwendet. Nach der Aufreinigung wurde die Säule mit 6 SV H2Obidest. und 6 SV 20 % EtOH zur Lagerung gewaschen.

Regeneration der HisTrap™ FF mL Säule nd neu beladen werden um weiterhin eine optimale Aufreinigung zu garantieren. Für die standardmäßige Nachdem die HisTrap™ FF mL Säule mehrfach verwendet wurde, sollte die Säule gewaschen u 82 Material und Methoden

Regeneration der stationären Phase wurden die Ni2+-Ionen mit 5-10 SV des Stripping Puffers gelöst und mit 5-10 SV Puffer A und nachfolgend 5-10 SV H2Obidest. ausgewaschen. Die nun weiße Säule wurde dann mit 2,5 mL NiSO4 (0,1 M) neu beladen und anschließend mit 5 SV H2Obidest. und 5 SV Puffer A gewaschen um den pH-Wert wieder e dann bis zur Verwendung in 20 % EtOH gelagert (siehe Tab. 35). herzustellen. Die regenerierte HisTrap™ FF wurd Sollte der Säulendruck während der Benutzung stark erhöht sein, könnte der Grund dafür eine verstopfte oder stark verunreinigte Säulenmatrix sein. Um die Säule von ausgefallenen Proteinen, Lipoproteinen und über ionische oder hydophobe Wechselwirkungen gebundene Proteine zu reinigen, wurde das folgende Protokoll verwendet. Diese Reinigung wurde an der ÄKA-FPLC durchgeführt. Zur Entfernung von Proteinen, die über ionische Wechselwirkungen geb -10 SV NaCl (1,5 M) und anschließend mit 10 SV H2Obidest. gespült. Ausgefallene Proteine, Lipoproteine oder Proteine, die über hydrophobische Wechselwirkungen an dieunden Säule sind, gebunden wurde sind, die HisTrap™ wurden dur FF chmit Spülen mit 1 M NaOH über 1-2 h entfernt werden. Anschließend wurde mit 10 SV Puffer A und 5-10 SV H2Obidest. gewaschen. Weitere Verunreinigungen mit Lipoproteinen, Lipiden und hydrophobisch gebundene Proteinen, wurden durch 5-10 SV Isopropanol (30 %) und 10 SV H2Obidest. entfernt. Zusätzlich wurde über 1-2 h mit einer Mischung aus 0,1 M Essigsäure und 0,1-0,5 % nichtionischem Detergenz gespült und anschließend mit 5 SV EtOH (70 %) und 10 SV H2Obidest. . D % EtOH gelagert (siehe Tab. 35).

Tab. 35: Lösungen und Säulenvoluminaie HisTrap™ zur FFReinigung wurde dann und zum in Beladen der HisTrap™ FF

Reinigung Reinigungsschritt Säulenvolumen (SV)

Regeneration 5-10 SV Stripping Puffer 5-10 SV Puffer A der HisTrap™ FF Strippen der HisTrap™ FF: 5-10 SV H2Obidest.

2,5 mL NiSO4 (0,1 M)

Beladen der HisTrap™ FF: : 5 SV H2Obidest. 5 SV Puffer A Waschen der HisTrap™ FF Lagern in 20 % EtOH

Reinigung der Ionisch gebundene Proteine 5-10 SV NaCl (1,5 M) der FPLC 10 SV H2Obidest. HisTrap™ FF mit Hilfe Ausgefallene Proteine, 1-2 h 1M NaOH hydrophobisch gebundene Proteine 10 SV Puffer A und Lipoproteine 5-10 SV H2Obidest.

Hydrophobisch gebundene Proteine, 5-10 SV 30 % Isopropanol Lipoproteine und Lipide 10 SV H2Obidest. 1-2 h mit 0,1-0,5 % nichtionisches Detergenz in 0,1 M Essigsäure 5 SV 70 % EtOH 10 SV H2Obidest.

Lagern in 20 % EtOH

II. 5. 2. 2. 2. 2. Aufreinigung von Proteinen aus Einschlusskörperchen

In E. coli sind Transkription und Translation eng miteinander gekoppelt. Alle 35 Sekunden verlässt eine Aminosäurenkette das Ribosom164. Rekombinante Proteine schaffen es häufig nicht schnell genug ihre native Konformation zu erreichen. Die Benutzung von starken Promotoren, sowie die reduzierenden Bedingungen im Cytoplasma von E. coli führen zur Bildung von sogenannten Einschlusskörperchen (inclusion bodies). Einschlusskörperchen sind resistent gegenüber Proteolyse und enthalten große Mengen des rekombinanten und werden häufig bei der Produktion von toxischen, unstabilen Proteinen oder einfach zu renaturieren Proteinen verwendet.

83 Material und Methoden

Hancock veröffentlichte 2001 ein Protokoll zur Aufreinigung rekombinanter Proteine, die in Einschlusskörperchen vorliegen mit Hilfe einer Ni2+-Affinitätschromatographie132. Diese Methode schließt die Auflösung von Einschlusskörperchen mit Hilfe von Urea ein, sowie die De- und Renaturierung des rekombinanten Proteins während der Affinitätschromatographie. Die Proteinproduktion wurde wie im Kapitel B. II. 5. 1. 2 beschrieben durchgeführt und die Zellen wurden wie gewöhnlich aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1). Das Zelllysat wurde zentrifugiert (30-60 min, 10000 rpm, 4 °C) und nach der Probennahme für die SDS-PAGE wurde der Überstand verworfen. Das Pellet wurde zweimal mit 25 mL Puffer 1 mit 0,5 % Triton X-100 (siehe Tab. 17) gewaschen (15 min, 5000 rpm, 4 °C) und anschließend in 15 mL Puffer 3, der 8 M Urea enthält, resuspendiert (siehe Tab. 17). Urea ist chaotrop und löst durch diese Eigenschaft die Einschlusskörperchen. Die Suspension wurde nun 30-60 min auf Eis inkubiert bis eine deutliche Veränderung zu beobachten war. Anschließend wurde die Probe zentrifugiert (30 min, 15000 rpm, 4 °C) und der Überstand für die Aufreinigung durch Ni2+- Affinitätschromatographie in den 150 mL Superloop Säule wurde mit 5 SV H2Obidest. gewaschen und mit 5 SV des Puffers 3 äquilibriert (Fluss: 0,5-1 mL/min). überführt. Zur Vorbereitung der Säulenchromatografie wurde die HisTrap™ FF mL

Abb. 29: Schema der Aufreinigung von rekombinanten Proteinen aus Einschlusskörperchen unter Nutzung einer Ni2+-Affinitätschromatographie.

In Abb. 29 ist eine schematische Darstellung der Aufreinigung zu sehen. Die Probe wurde mit einem Fluss einzelnen Schritte, sowie das eluierte Protein gesammelt. Nachdem die Absorption wieder abgesunken und stabilvon , war, mL/min wurde auf mit die 12 HisTrap™ SV Puffer FF 3 gespült.mL geladen. Im darauffolgenden Mit dem Probensammler Schritt wurde Frac das wurdengebundene Proben Protein der langsam renaturiert, indem ein 16 SV langer, linearer Gradient von 100 % Puffer 3 bis 100 % Puffer 1 angelegt wurde (Fluss: 0,5 mL/min). Anschließend wurde mit weiteren 4 SV Puffer 1 gespült. Nun erfolgte ein Wechsel des Puffersystems, wobei die proteinspezifischen Puffer A und B zur Reinigung mit Hilfe eines

5 mL Säule wurde nach dem linearen Gradienten von 0-100 % Puffer B für weitere 6 SV mit 100 % Puffer B linearengespült. Imidazolgradienten SV verwendet wurden. Zur vollständigen Reinigung der HisTrap™ FF

Tab. 36: Aufreinigung von His-getaggten Proteinen aus Einschlusskörperchen

Reinigungsschritt Säulenvolumen (SV) Fluss [mL/min]

Äquilibration 5 SV H2Obidest. 0,5-1 5 SV Puffers 3 Probenauftragder HisTrap™ FF 0,5

Aufreinigung des His-getaggten 12 SV Puffer 3 0,5 Proteins 16 SV linearer Gradient von 100 % Puffer 3 bis 100 % Puffer 1 4 SV Puffer 1

10 SV linearer Gradient von 100 % Puffer A bis 100 % 0,5-1 Puffer B 6 SV 100 % Puffer B

84 Material und Methoden

Reinigungsschritt Säulenvolumen (SV) Fluss [mL/min]

Waschen und Lagerung der 6 SV H2Obidest. 0,2 6 SV 20 % EtOH

HisTrap™ FF

Die gesammelten Proben wurden mit Hilfe einer SDS-PAGE analysiert und das gereinigte Protein konnte dann aufkonzentriert (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 4) und weiterverwendet werden (siehe Kapitel B. II. 5. 6).

II. 5. 2. 2. 2. 3. Aufreinigung mittels StrepTrap™ 5 mL

Der Strep II Tag besteht aus einer kurzen Sequenz von acht Aminosäuren (W-S-H-P-Q-F-E-K) mit einem geringen Molekulargewicht und hoher Affinität zu Streptavidin. Diese Eigenschaften ermöglichen die Aufreinigung von Proteinen, mit N- oder C-terminalem Strep II Tag, in nur einem Schritt und unter milden Bedingungen165. Die verwendete StrepTrap HP (5 mL) Säule enthält das immobilisierte Streptavidin Derivat StrepTactin, welches eine gesteigerte Affinität zum Strep II Tag aufweist. Vor der Proteinaufreinigung wurde die StrepTrap HP™ Säule mit 6 SV H2Obidest. gespült und anschließend mit 6 SV Bindungspuffer äquilibriert (Fluss: 1 mL/min; siehe Tab. 37). ™ Der Zellaufschluss wurde wie im Kapitel B. II. 5. 2. 1 beschrieben durchgeführt. Der Überstand wurde in einen 150 mL Superloop geladen und der Probenauftrag fand mit einem Fluss von 0,5 mL/min statt. Die beladene StrepTrap HP Säule wurde dann mit mindestens 6 SV Bindungspuffer gewaschen bis die Absorption wieder die Basislinie erreicht hat. Alle unerwünschten Proteine befinden sich im Durchfluss, das mit dem Strep II™ Tag fusionierte Protein wird noch auf der Säule zurückgehalten. Der Elutionspuffer enthält 2,5 mM D-Desthiobiotin, wodurch das getaggte Protein kompetitiv von den StrepTactin Bindestellen verdrängt wurde. Das Protein wurde durch den automatischen Probensammler Frac 900 aufgefangen und wurde vor der weiteren Verwendung auf einem SDS-Gel analysiert.

Nach der Elution mit 6 SV des Elutionspuffers muss die StrepTrap HP Säule regeneriert werden. Dabei müssen die StrepTactin Bindestellen von D-Desthiobiotin befreit werden. Dazu wurde die StrepTrap HP Säule mit 15 SV Bindepuffer, der 1 mM des gelben Farbstoffes ™ 2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoesäure (HABA) enthält, gespült. HABA verdrängt dabei D-Desthiobiotin von der StrepTactin Bindestelle. Bei diesem™ Vorgang ist eine Veränderung der Farbe von Gelb zu Rot zu beobachten. Anschließend wurde HABA durch 30 SV Bindungspuffer ausgewaschen und nachdem die Säule mit 6 SV 20 % EtOH gespült wurde, wurde sie bis zur nächsten Verwendung gelagert.

Tab. 37: Schritte und Säulenvolumina für die Aufreinigung von Proteinen mittels StrepTrap™ HP.

Schritt der Aufreinigung Säulenvolumen (SV)

Konditionierung der StrepTrap HP 5 mL 6 SV H2Obidest. 6 SV Bindungspuffer ™ Aufreinigung des StrepII getaggten Proteins mind. 6 SV Bindungspuffer nach dem Probenauftrag 6 SV Elutionspuffer

Regeneration und Lagerung der StrepTrap HP 5 mL 15 SV Bindungspuffer mit 1 mM HABA 30 SV Bindungspuffer ™ 6 SV 20 % EtOH

85 Material und Methoden

II. 5. 2. 3 Gelfiltration

Die Gelfiltration, Größenauschlusschromatographie (size exclusion chromatography (SEC)) oder auch Gelpermeationschromatographie ist eine flüssigchromatographisches Verfahren zur Auftrennung von Proteinen nach ihrer Größe. Die Gelfiltrationssäulen bestehen aus einer porösen Gelmatrix mit bestimmter Porengröße. Kleinere Moleküle diffundieren stärker in diese Gelmatrix als größere Moleküle und verbleiben somit auch länger auf der Säule. Proteine werden nach absteigender Molekülmasse eluiert.

Die Gelfiltration wurde an der ÄKTA-FPLC durchgeführt. Dabei wurde entweder die 24 mL Superdex 200 10/300 GL verwendet oder die 120 mL HiLoad® 16/60 Superdex® 200 prep grade. Das System wurde zunächst mit 1 SV H2Obidest. gewaschen und mit 1 SV Gelfiltrationpuffer (siehe Tab. 38) äquilibriert. Die Proteinlösung wurde mit den Vivaspin Konzentratoren auf 0.5-2 mL eingeengt (Kapitel B. II. 5. 2. 4) und anschließend zentrifugiert (10 min, 14000 rpm, 4 °C). Der Überstand wurde dann in den 2 mL Sampleloop geladen und auf die Gelfiltrationssäule aufgetragen. Mit 1 SV des Gelfiltrationspuffers wurde eluiert. Mit Hilfe des automatischen Probensammlers wurden kontinuierlich Proben mit Fraktionsgrößen von 1-2 mL genommen, die dann später weiterverwendet und analysiert wurden (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 1). Die Säule wurde im Anschluss mit 1 SV H2Obidest. gewaschen und in 20 % EtOH gelagert (siehe Tab. 38).

Tab. 38: Aufreinigung von Proteinen mittels Größenausschlusschromatographie

Schritt der Aufreinigung Säulenvolumen (SV) Fluss (mL/min)

Konditionierung der Gelfiltrationssäule 1 SV H2Obidest. 0,2-0,5 1 SV Gelfiltrationspuffer 0,2-0,5

Probenauftrag 0,5

Elution 1 SV Gelfiltrationspuffer 0,5

Spülen und Lagerung der Gelfiltrationssäule 1 SV H2Obidest. 0,2-0,5 1 SV 20 % EtOH 0,2-0,5

II. 5. 2. 4 Umpufferung und Aufkonzentrierung durch Zentrifugieren

Das Volumen einer Proteinlösung wurde nach der Affinitätschromatographie oder der Gelfiltration durch Ultrafiltration eingeengt. Dazu wurde die Proteinlösung in Vivaspin 20 Konzentratoren mit einem Ausschlussvolumen (MWCO) von 10 kDa gefüllt und bei 4 °C zentrifugiert. Die Dauer der Zentrifugation hängt von dem Volumen der Proteinlösung und der Proteinkonzentration ab.

Zur Änderung der Pufferbedingungen wurde der Vivaspin Konzentrator nach dem Einengen mit dem neuen Puffer befüllt und erneut abzentrifugiert. Dieser Schritt wurde 2-3-mal wiederholt. Anschließend kann das Protein weiterverwendet werden.

II. 5. 3 Produktion und Aufreinigung von FoxGI, FoxGII und FoxGIII

Die Gene foxGI, foxGII und foxGIII des Foxicin BGC wurden, wie in Kapitel B. II. 4. 7. 3, Kapitel B. II. 4. 7. 4 und Kapitel B. II. 4. 7. 5 beschrieben, in den Expressionsvektor pET28a kloniert. Zunächst wurden, zur Bestimmung der optimalen Produktionsbedingungen, Testexpressionen durchgeführt (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1).

Produktion und Aufreinigung von C-FoxGI

Kompetente E. coli BL21 (DE3) Star wurden mit dem Expressionsplasmid pET28a-C-foxGI transformiert und über Nacht bei 37 °C und 180 rpm in 20 mL LB mit Kan50 kultiviert. Am folgenden Tag wurden 500 mL

86 Material und Methoden

LBKan50-Medium auf eine OD600 nm = 0,02 mit der Vorkultur beimpft und bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Beim Erreichen einer OD600 nm = 0,6 wurde die Proteinproduktion durch die Zugabe von IPTG (finale Konzentration: 100 mM) induziert und die Kultur wurde dann für 18-20 h bei 20 °C und 180 rpm kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (15 min, 5000 rpm) und das Pellet in 8 mL Lysepuffer (siehe Tab. 17) resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte wie im Kapitel B. II. 5. 2. 1 dargestellt und die weitere Aufreinigung von C-FoxGI erfolgte mit Ni2+-Agarose nach dem Protokoll aus Kapitel B. II. 5. 2. 2. 1. Alle Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 1). Das gereinigte C-FoxGI wurde durch Zentrifugation aufkonzentriert, umgepuffert (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 4) und anschließend im NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assay verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 3).

Produktion und Aufreinigung von C-FoxGII

Mit dem Expressionsplasmid pET28a-C-foxGII wurden chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 und über Nacht in 100 mL LBKan50, Cam30, Amp100, 0,2 % Glc-Medium bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Am folgenden Tag wurden 2 L LBKan50, Cam30, Amp100, 0,2 % Glc-Medium auf eine OD600 nm = 0,02 mit der Vorkultur beimpft und bei 37 °C und 180 rpm bis zu einer OD600 nm = 0,6 kultiviert. Die Proteinproduktion wurde durch die Zugabe von IPTG (finale Konzentration: 1mM) induziert und die Kultur wurde weitere 3 h bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation geerntet (15 min, 5000 rpm) und das Pellet in 25 mL Puffer A (250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM Imidazol, 1 mM MgCl2; pH 7,8; siehe Tab. 17) resuspendiert. Nach Zugabe einer Spatelspitze Lysozym und 20 µL DNase wurden die Zellen mit Hilfe der French Pressure Cell aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 2) und anschließend zentrifugiert (30 min, 10000 rpm, 4 °C), um die löslichen von den unlöslichen Bestandteilen zu trennen. Die Aufreinigung von C-FoxGII aus dem löslichen Überstand erfolgte mit der ÄKTA-FPLC (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 1). Der Anteil an Puffer B (250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 500 mM Imidazol; pH 7,8; siehe Tab. 17) wurde schrittweise erhöht, beginnend mit 10 %, 15 %, 50 % und 100 %. Alle Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 1). C-FoxGII wurde bei 50 % Puffer B von der Säule gespült, gesammelt und durch Zentrifugation aufkonzentriert und umgepuffert (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 4). C-FoxGII wurde dann im NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assay verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 3).

Produktion und Aufreinigung von N-FoxGIIII

Mit dem Expressionsplasmid pET28a-N-foxGIII wurden chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 und über Nacht in 100 mL LBKan50, Cam30, Amp100, 0,2 % Glc-Medium bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Am folgenden Tag wurden 2 L LBKan50, Cam30, Amp100, 0,2 % Glc-Medium auf eine OD600 nm = 0,02 mit der Vorkultur beimpft und bei 37 °C und 180 rpm bis zu einer OD600 nm = 0,6 kultiviert. Die Proteinproduktion wurde durch die Zugabe von IPTG (finale Konzentration: 1 mM) induziert und die Kultur wurde 18-20 h bei 20 °C und 180 rpm kultiviert. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation geerntet (15 min, 5000 rpm) und das Pellet wurde in 20 mL Puffer 1 (500 mM NaCl, 20 mM Na2HPO4, 5 mM Imidazol; pH 7,4; siehe Tab. 17) resuspendiert. Nach Zugabe einer Spatelspitze Lysozym und 20 µL DNase wurden die Zellen mit Hilfe der French Pressure Cell aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 2) um die löslichen von den unlöslichen Bestandteilen zu trennen. Zunächst erfolgte die Aufreinigung des löslichen Überstandes mit der ÄKTA-FPLC (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 1) und einer linearen Erhöhung des Anteils an Puffer 2 (500 mM NaCl, 20 mM Na2HPO4, 500 mM Imidazol; pH 7,4; siehe Tab. 17). Die SDS-PAGE Analyse ergab, dass N-FoxGIII nicht im löslichen Überstand vorliegt, stattdessen wurde es in der unlöslichen Fraktion in Einschlusskörperchen gefunden. Die Aufreinigung von N-FoxGIII aus Eischlusskörperchen wurde im Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 2 beschrieben. Das reine N-FoxGIII wurde bei 78-88 % Anteil Puffer 3 von der Säule gespült, gesammelt und, nach erneuter SDS-PAGE Analyse, durch Zentrifugation aufkonzentriert und umgepuffert (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 4). N-FoxGIII wurde dann im NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assay verwendet (siehe B. II. 5. 6. 3).

87 Material und Methoden

II. 5. 4 Produktion und Aufreinigung der FkbH-ähnlichen Domäne, Tmn16 und Tmn7a

Die FkbH-ähnliche Domäne des fox-Clusters sollte in einem in vitro Beladungsassay (siehe Kapitel B.II. 5. 6. 4) hinsichtlich ihrer Enzymfunktion analysiert werden. Dazu wurde die foxFLD heterolog in E. coli produziert und anschließend aufgereinigt. Zur Kontrolle wurde das in vitro Beladungsassay ebenfalls mit Tmn16 und Tmn7a des Tetronomycin BCGs durchgeführt. Tmn16 und Tmn7a wurden im Department of Biochemistry der University of Cambridge produziert und aufgereinigt.

Produktion und Aufreinigung der foxFLD

Die FkbH-ähnliche Domäne des Foxicin-Biosynthese-Genclusters wurde wie im Kapitel B. II. 4. 7. 1 beschrieben in die Expressionsvekor pET28a beziehungsweise pET-STN kloniert. Die Plasmide wurden dann für Testexpressionen in verschiedenen E. coli Stämmen und unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1). Die beste Produktion der fox-FLD fand mit pET28a-N-fkbH, in E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 statt. Chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 wurden mit dem Expressionsplasmid pET28a-N-fkbH transformiert und über Nacht bei 37 °C und 180 rpm in 20 mL LB-Medium mit Kan50, Cam30 und Amp100 kultiviert. Am folgenden Tag wurden 1-3 L TBKan50, Cam30, Amp100, 0,2 % Glc-Medium (siehe Tab. 8) auf eine OD600 nm = 0,02 mit der Vorkultur beimpft und bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Bei Erreichen einer OD600 nm = 0,4 wurden die Kulturen bei 20 °C und 180 rpm bis zum Erreichen einer OD600 nm = 0,5-0,6 weiterkultiviert. Die Proteinproduktion wurde durch die Zugabe von IPTG (finale Konzentration: 1 mM) induziert und die Kulturen wurden dann für weitere 18-20 h bei 20 °C und 180 rpm inkubiert. Die Zellen wurden durch zentrifugieren (5000 rpm, 10-15 min) geerntet und in Abhängigkeit der Zellmenge in 20-30 mL Puffer A (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10 mM MgCl2, pH 7,8). Die Zellen wurden unter der Benutzung von Ultraschall aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 3) und anschließend bei 4 °C und 14000 rpm für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde zusammen mit der Ni2+-Agarose für 1 h unter Rühren auf Eis inkubiert und anschließend in eine Säule gegeben (siehe B. II. 5. 2. 2. 1). Der Durchfluss wurde für die spätere Analyse durch eine SDS-PAGE aufgefangen. Danach wurde die Säule zweimal mit 10 mL Puffer A gewaschen (Waschen 1 & Waschen 2, siehe Tab. 39) und anschließend zweimal mit 10 mL Puffer A mit 40 mM Imidazol (Waschen 3 & Waschen 4, siehe Tab. 39). Die Elution begann mit 5 mL Puffer A mit 80 mM Imidazol, gefolgt von je 3 mL Puffer A mit 150 mM, 200 mM, 250 mM und 500 mM (Elution 1-5, siehe Tab. 39). Alle Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert.

Tab. 39: Aufreinigung der foxFLD, Tmn16 und Tmn7a mittels Ni2+-Agarose

Aufreinigungsschritt Menge Imidazolkonzentration in Puffer A

Waschen 1 10 mL 10 mM Waschen 2 10 mL 10 mM Waschen 3 10 mL 40 mM Waschen 4 10 mL 40 mM Elution 1 5 mL 80 mM Elution 2 2,5 mL 150 mM Elution 3 2,5 mL 200 mM Elution 4 2,5 mL 250 mM Elution 5 2,5 mL 500 mM

Produktion und Aufreinigung von Tmn16 und Tmn7a

Am Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK wurde E. coli BL21 (DE3) mit den Expressionsplasmiden pYH94 und pYH185 transformiert und üN in 10 mL 2xYT unter Selektionsdruck bei 37 °C und 220 rpm kultiviert. Am nächsten Tag wurde 1 L 2xYT-Medium mit jeweils 10 mL der Vorkulturen beimpft. Die anschließende Kultivierung zur Überproduktion von Tmn16 und Tmn7a fand analog zu der Kultivierung für die Überproduktion der foxFLD statt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren (5000 rpm,

88 Material und Methoden

10-15 min) geerntet und in Abhängigkeit der Zellmenge in 20-30 mL Puffer A (20 mM Tris, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol; pH 8,02; siehe Tab. 17) resuspendiert. Der Zellaufschluss wurde unter der Benutzung von Ultraschall, wie in Kapitel B. II. 5. 2. 1. 3 beschrieben, durchgeführt und das Zelllysat wurde dann bei 4 °C und 18000 rpm für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde durch einen 0,45 µm Filter filtriert und zur Ni2+-Agarose in eine Säule gegeben. Der Durchfluss wurde für die spätere Analyse durch eine SDS-PAGE aufgefangen. Danach wurde die Säule zweimal mit 10 mL Puffer A gewaschen (Waschen 1 & Waschen 2, siehe Tab. 39) und anschließend zweimal mit 10 mL Puffer A mit 40 mM Imidazol (Waschen 3 & Waschen 4, siehe Tab. 39). Die Elution begann mit 5 mL Puffer A mit 80 mM Imidazol, gefolgt von je 2,5 mL Puffer A mit 150 mM, 200 mM, 250 mM und 500 mM Imidazol (Elution 1-5, siehe Tab. 39). Alle Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert.

Waschen und Beladen der Ni2+-Agarose

Nach der Aufreinigung von foxFLD, Tmn16 und Tmn7a wurde die Säule gestrippt und neu beladen. Dazu wurden die Ni2+-Ionen mit 2 mL 0,5M EDTA (pH 8, siehe Tab. 17) entfernt und die Säule mit 10 mL H2Obidest. gespült. Anschließend wurde die Säule mit 2,5 mL NiCl2 (100 mM, sieheTab. 17) neu beladen und danach wiederum mit 10 mL H2Obidest. gespült. Die Säule kann dann bis zur nächsten Verwendung bei 4 °C in H2Obidest. gelagert werden.

II. 5. 5 Produktion und Aufreinigung der PCP-Domäne aus FoxBIII

Das PCP des fox-Clusters soll für weitere Untersuchungen der Enzymfunktion rekombinant produziert und aufgereinigt werden. Das PCP wurde, wie in Kapitel B. II. 4. 7. 2 beschrieben, in den Expressionsvekor pET28a kloniert. Dabei entstand

pET28a-N-PCP, der die 1171 bp lange Sequenz des PCPs enthält und pET28a-N-PCPmini, der die 222 bp langen minimale Sequenz für das PCP enthält. Das Plasmid pET28a-N-PCP wurde dann für Testexpressionen in verschiedenen E. coli Stämmen und unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1). Die beste Produktion des N-PCPs fand mit pET28a-N-PCP, in E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 statt. Chemisch kompetente E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 wurden mit dem Expressionsplasmid pET28a-N-PCP transformiert und über Nacht bei 37 °C und 180 rpm in 20 mL LB-Medium mit Kan50, Cam30 und Amp100 kultiviert. Am folgenden Tag wurde 1 L LBKan50, Cam30, Amp100, 0,1 % Glc-Medium (siehe Tab. 8) auf eine OD600 nm = 0,02 mit der Vorkultur beimpft und bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Bei Erreichen einer OD600 nm = 0,6 wurde die Proteinproduktion durch die Zugabe von IPTG (finale Konzentration: 1 mM) induziert und die Kulturen wurden dann für weitere 3 h bei 28 °C und 180 rpm inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 rpm, 10-15 min) geerntet und in Abhängigkeit der Zellmenge in 20 mL Puffer A (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10 mM MgCl2, pH 7,8). Die Zellen wurden durch die Benutzung von Ultraschall aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 3) und anschließend bei 4 °C und 14000 rpm für 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde zusammen mit der Ni2+-Agarose für 1 h unter Rühren auf Eis inkubiert und anschließend auf eine Säule gegeben (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 1). Der Durchfluss wurde für die spätere Analyse durch eine SDS-PAGE aufgefangen. Danach wurde die Säule zweimal mit 10 mL Puffer A gewaschen (Waschen 1 & Waschen 2, siehe Tab. 39) und anschließend zweimal mit 10 mL Puffer A mit 40 mM Imidazol (Waschen 3 & Waschen 4, siehe Tab. 39). Die Elution begann mit 5 mL Puffer A mit 80 mM Imidazol, gefolgt von je 3 mL Puffer A mit 150 mM, 200 mM, 250 mM und 500 mM (Elution 1-5, siehe Tab. 39). Alle Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert. Da sich das N-PCP in der unlöslichen Fraktion befand, wurde das Pellet zweimal mit je 1 mL Puffer A mit 0,5 % Triton X-100 gewaschen (13000 rpm, 5 min 4 °C) und das Pellet wurde anschließend in 10 mL Puffer A mit 8 M Urea resuspendiert. Nach der Inkubation für 30 -60 min auf Eis, wurde zentrifugiert (13000 rpm, 30 min, 4 °C). Der Überstand wurde mit Ni2+-Agarose für 1 h auf Eis inkubiert (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 2. 1). Der Durchfluss wurde aufgefangen. Die Säule wurde dreimal mit jeweils 4 mL Puffer A gewaschen und anschließend mit zweimal je 4 mL Puffer A mit 80 mM Imidazol. Eluiert wurde mit jeweils 1 mL Puffer A mit 150 mM, 250 mM und 500 mM Imidazol. Alle Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE analysiert.

89 Material und Methoden

II. 5. 6 Proteinanalytik

Nach der Produktion und Aufreinigung rekombinanter Proteine (siehe Kapitel B. II. 5. 1 und Kapitel B. II. 5. 2) wurden die Proben für die Proteinanalytik verwendet. Mit Hilfe einer SDS-PAGE wurde die Proteinproduktion und die Reinheit nach der Aufreinigung überprüft und visualisiert (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 1). Nach der Konzentrationsbestimmung (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 2) wurden die Proteine für in vitro Assays verwendet um deren Funktion zu bestimmen (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 3 und Kapitel B. II. 5. 6. 4). Nachfolgend sind die genannten Methoden und deren Durchführung beschrieben.

II. 5. 6. 1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate) -Polyacrylamid-Gelelektrophorese) ist eine analytische Methode zur Trennung von Proteinen ihrer Größe nach im elektrischen Feld. Das vertikal angeordnete SDS-Gel besteht aus einem Sammel- und einem Trenngel mit diskontinuierlichem pH-Wert. Der pH-Wert des Sammelgels (pH 6,8) liegt nahe am isoelektrischen Punkt von Glycin. Glycin hat zu Beginn eine geringe elektrophoretische Mobilität im Gegensatz zu den Chloridionen mit hoher Mobilität. Dadurch entsteht ein Spannungsgradient induziert: Im Bereich der Chloridionen ist die Feldstärke niedrig und im Bereich von Glycin ist die Feldstärke hoch. In diesem Feldstärkegradienten bilden die Proteine einen Stapel in der Reihenfolge ihrer Mobilität, was zur Vortrennung und Aufkonzentrierung der einzelnen Proteinklassen führt. Die Erhöhung des pH-Wertes im engmaschigeren Trenngel (pH 8,8) verschiebt das Gleichgewicht in Richtung Glycin. Während die anderen Proteine hier einen höheren Reibungswiderstand erfahren, bleibt Glycin davon unbeeinflusst und überholt die Proteine. Daraufhin löst sich der Stapel auf und die Proteine werden nach ihrem Masse zu Ladungsverhältnis aufgetrennt. Da die Eigenladung der Proteine durch SDS maskiert wurde, beeinflusst nur die Größe ihre Wandergeschwindigkeit. Jedes Protein besitzt eine spezifische Aminosäurenabfolge, die in unterschiedlichen Tertiär- oder Quartätstrukturen resultieren, sowie eine spezifische Eigenladung. Bei der Vorbereitung der Proben für die SDS-PAGE müssen die Proteine demnach denaturiert, sowie deren Eigenladung überdeckt werden.

Gießen der SDS-Gele

Die gereinigten Glasplatten, in der Regel wurde ein Abstand von 0,75 mm verwendet, wurden in die Apparatur zum Gießen der Gele eingesetzt. Zunächst wurde der Ansatz für das Trenngel erstellt (siehe Tab. 19). Dabei wurden APS und TEMED zuletzt zugegeben, da sie für die Polymerisierung von Acrylamid verantwortlich sind. Der Ansatz wurde in die Vorrichtung pipettiert und mit Isopropanol überschichtet. Nach der Aushärtung der Trenngels wurde das Isopropanol abgenommen und das Sammelgel (siehe Tab. 19) auf das Trenngel pipettiert. In das noch flüssige Sammelgel wurde zur Bildung der Probentaschen der Kamm gesteckt und nach der Polymerisierung wurde das Gel entweder direkt verwendet oder in feuchten

Tüchern (H2Odest.) bei 4 °C gelagert.

Durchführung der SDS-PAGE

Das SDS-Gel wurde in der Gelhalterung fixiert, in die Laufkammer gestellt und die Laufkammer wurde mit Laufpuffer gefüllt.

Zur Vorbereitung der Proben wurde eine entsprechende Menge Lämmli-Puffer (siehe Tab. 18) zur Probe gegeben, danach für 5 min bei 95 °C erhitzt. Das enthaltene SDS lagert sich an ein Protein an und maskiert so dessen Eigenladung. Dabei binden 1,4 g SDS pro 1 g Protein. Zusätzlich unterstützt es die Denaturierung bei 95 °C. Glycerin erhöht die Viskosität der Proben und erleichtert so das Absinken in die Geltasche. -Mercaptoethanol oder DTT können als Reduktionsmittel eingesetzt werden und reduzieren die Disulfidbrücken. Nach dem Erhitzen wurden die Proben kurz zentrifugiert (15 sec, 14000 rpm, RT) und je 18 -20 µL wurden auf das SDS-Gel aufgetragen. Zusätzlich wurde ein Größenstandard aufgetragen (Menge je nach Herstellerangaben, siehe Tab. 15).

Die SDS-PAGE wurde bei 120-150 V betrieben, bis das Bromphenolblau aus dem Lämmli-Puffer den unteren Rand der Glasplatten verlässt oder, bei einem vorgefärbten Größenstandard, bis die Proben im Gel weit

90 Material und Methoden genug gewandert sind. Im Anschluss daran wurden die Trenngele mit Coomassie Brilliant Blue übergossen, in der Mikrowelle kurz aufgekocht und für ca. 45 min gefärbt und anschließend entfärbt, bis die einzelnen Proteinbanden deutlich zu sehen waren. Die Gele wurden nun mit einem Scanner oder durch Fotografieren digitalisiert und gespeichert.

II. 5. 6. 1. 1. SDS-PAGE mit dem NuPAGE® System

Das NuPAGE® System schließt die Verwendung von Bis-Tris Gelen ein. Diese enthalten wie die Tris-Glycin Gele Chloridionen, die als Leitionen fungieren. Das im Laufpuffer enthaltene 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) dient als Folgeion. Bis-Tris ist positiv geladen und liegt in hoher Konzentration vor. Die Kombination des pH-Wertes des Laufpuffers (pH 7,3-7,7) und des Geles (pH 6,4) führen zu einem pH-Wert von 7 während der Elektrophorese.

-Tris Gele wurden ihrer Verpackung entnommen und mit H2Odest. gewaschen. Nachdem der Kamm und der Klebestreifen entfernt wurden, wurden die Gele in die Die vorgefertigten Invitrogen™-Cell Elektrophoresekammer NuPAGE™ Bis gestellt. Die Kammer wurde mit 1x NuPAGE® MES SDS Running Buffer gefüllt. Die Proben wurden nach Herstellerangaben mit dem NuPAGE LDS Sample Buffer versehenXCell SureLock™ und für Mini die SDS-PAGE vorbereitet. Ein Größenstandard (2,5 µL Precision Plus Protein Standard, siehe Tab. 20) und je 15 µL der Proben wurden auf das Gel aufgetragen und die Elektrophorese wurde bei 200 V für 35 min durchgeführt. Das Bis-Tris Gel wurde dann mit InstantBlue Protein Stain für 10-15 min gefärbt bis die einzelnen Proteinbanden deutlich zu sehen waren. Die Gele wurden dann durch Fotografieren digitalisiert und gespeichert.

II. 5. 6. 2 Konzentrationsbestimmung

Die Stoffmengenkonzentration von Proteinen in Lösung wurde mit Hilfe der Absorption bei 280 nm berechnet. Das ExPASy tool ProtParam (http://web.expasy.org/protparam) analysiert Aminosäuresequenzen von Proteinen und liefert dann Daten über die genaue Zusammensetzung, das Molekulargewicht und den Extinktionskoeffizienten. Die Absorption bei 280 nm wurde mit dem Nanodrop 2000 gemessen. Mit 280nm), der Schichtdicke der Küvette (d) und der molaren Masse (Mr) kann die Konzentration (c) der Proteinlösung mit der folgenden Formel (sieheHilfe desFormel Extinktionskoeffizienten 1) berechnet werden: ε, der Absorption bei nm A

A280 nm: Absorption bei 280 nm Mr: molare Masse des gemessenen Proteins (in ) 푔 ) 푔 퐿 퐴280 × 푟[ ] d: Schichtdicke der Küvette (in cm) 푔 표 ε: Extinktionskoeffizient in ×푐 [ ] = c: Konzentration der Proteinlösung (in ) 푔 휀 [ ] × [] 표 × 퐿 Formel 1: Berechnung der Proteinkonzentration

Die Konzentration wurde zusammen mit der Proteinmasse (in kDa) anschließend in die nachfolgende Formel (siehe Formel 2) eingesetzt, um die Stoffmengenkonzentration des Proteins in der Lösung zu berechnen.

c: Konzentration der Proteinlösung (in ) M: Molekülmasse (in kDa) µ푔 µ푔 퐿 [ ] [µ] = Formel 2: Berechnung der [퐷푎] Stoffmengenkonzentration

91 Material und Methoden

II. 5. 6. 3 NAD+/NADH+H+ gekoppeltes Glykolyse Assay

Mit diesem NAD+/NADH+H+ gekoppelten Assay sollen die Funktionen von FoxGI, FoxGII und FoxGIII analysiert werden. Die Hexose Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) wird von der Fructose-1,6-bisphosphat- Aldolase (FBA) zu Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) gespalten. Nur GAP kann von der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAP-DH) zu 1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG) oxidiert werden, während NAD+ zu NADH+H+ reduziert wird. Die Triosephosphat-Isomerase (TIM) stellt das Gleichgewicht zwischen GAP und DHAP her (siehe Abb. 30). Durch die Reduktion des Cofaktors NAD+ kann die Reaktion photometrisch bei 340 nm verfolgt werden. Bei 260 nm absorbiert der identische Adeninbereich von NAD+ und NADH+H+. Der reduzierte Nikotinring von NADH+H+ absorbiert hingegen bei 340 nm, während der oxidierte Nikotinring bei 260 nm absorbiert und somit die gesamte Absorbtion bei 260 nm lediglich erhöht.

Das Assay für die Aktivitätsbestimmung von FoxGI, FoxGII und FoxGIII wurde nach 134 modifiziert. Die FDA, TIM und GAP-DH wurden von Sigma-Aldrich bezogen und zur Kontrolle verwendet. Dazu wurden, wie in Tab. 40 zu sehen ist, 500 µL K-SH-Puffer mit 100 µL FBP (80 mM Stocklösung), 100 µL NAD+ (Stammlösung: 25 mM in Abb. 30: Teilreaktion der Glykolyse katalysiert durch FBA, TIM und GAP-DH 1 mM NaOH), 40 µL GAP-DH bzw. FoxGI, FoxGII und FoxGIII. FBP wird von der FBA oder FoxGIII zu DHAP und + (Stammlösung: 1 mg in 250 GAP gespalten. GAP wird unter Verbrauch von NAD von der GAP-DH oder von FoxGI zu 1,3-BPG umgewandelt. Die TIM oder FoxGII katalysiert das Gleichgewicht zwischen µL 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5) GAP und DHAP. und 40 µL FDA (Stammlösung: 10 µL in 240 µL 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5) in einer Küvette vermischt. Nach der Zugabe von 170 µL H2Obidest. wurde der Nullabgleich bei 340 nm gemessen. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 50 µL Na3PO4 (150 mM Stammlösung) gestartet und bei 340 nm, in 10 sec Intervallen über 900 sec verfolgt. In dieser Reaktion wurde NAD+ zu NADH+H+ reduziert, was in einem Anstieg der Absorption resultierte. Nachdem sich das Gleichgewicht der Reaktion eingestellt hat, wurden 20 µL der TIM (20 µL in 230 µL 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5) zugegeben und gemischt. Die Reaktion wurde erneut bei 340 nm, in 10 sec Intervallen über 900 sec verfolgt. Die TIM verschiebt hierbei das Gleichgewicht wieder in die Richtung von DHAP, wobei NADH+H+ wieder zu NAD+ oxidiert wurde und ein Abfall der Absorption zu beobachten war. Mit den Negativkontrollen (siehe Tab. 40) wurde ebenfalls wie beschrieben verfahren.

Tab. 40: Pipettierschema der Kontrollen

Positivkontrolle Negativkontrolle Negativkontrolle Negativkontrolle I II III

K-SH Puffer 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL FBP (80 mM) 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL NAD+ (25 mM) 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL GAP-DH 40 µL - 40 µL - FBA 40 µL 40 µL - - ZnSO4 (14 mM) - - - 50 µL Na3PO4 (150 mM) 50 µL 50 µL 50 µL 50 µL H2Obidest. ad 1 mL ad 1 mL ad 1 mL ad 1 mL

340 nm, 10 sec Intervall, 900 sec insgesamt

TIM 20 µL - - -

340 nm, 10 sec Intervall, 900 sec insgesamt

92 Material und Methoden

Für die Bestimmung der Aktivität von FoxGI wurde die GAP-DH durch FoxGI ersetzt, bei der Aktivitätsbestimmung von FoxGII wurde das aufgereinigte FoxGII anstelle der TIM verwendet und bei der Bestimmung der FoxGIII Aktivität wurde die FBA durch FoxGIII ersetzt. Die genauen Mengenangaben sind in Tab. 41 aufgeführt. Bei der Reaktion von FoxGIII wurden zusätzlich 50 µL ZnSO4 zugegeben. Die Messung des Nullabgleichs und der Reaktion wurde bereits beschrieben.

Tab. 41: Pipettierschema für die Überprüfung der Enzymfunktionen von FoxGI, FoxGII und FoxGIII

FoxGI FoxGII FoxGIII

K-SH Puffer 500 µL 500 µL 500 µL FBP (80 mM) 100 µL 100 µL 100 µL NAD+ (25 mM) 100 µL 100 µL 100 µL GAP-DH - 40 µL 40 µL FoxGI 150 µL - - FDA 40 µL - FoxGIII - 100 µL ZnSO4 (14 mM) - - 50 µL Na3PO4 (150 mM) 50 µL 50 µL 50 µL H2Obidest. ad 1 mL ad 1 mL ad 1 mL

340 nm, 10 sec Intervall, 900 sec insgesamt

TIM 20 µL - - FoxGII - 100 µL -

340 nm, 10 sec Intervall, 900 sec insgesamt

93 Material und Methoden

II. 5. 6. 4 In vitro -Phosphopantetheinylierung von apo-Tmn7a und in vitro Beladung von foxFLD und von Tmn16

Das Experiment wurde unter der Betreuung von Dr. Hui Hong in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter F. Leadlay im Department for Biochemistry, University of Cambridge, Cambridge, UK durchgeführt.

Abb. 31: Schematische Darstellung der in vitro -Phosphopantetheinylierung (A), der in vitro Beladung von holo-Tmn7a zu Glyceryl-S-Tmn7a durch Tmn16 (B.) und der in vitro Beladung der foxFLD (C.).

Um die gereinigten Proteine foxFLD, Tmn16 und Tmn7a detektieren zu können, wurden sie zunächt mit 5-10 mM DTT oder TCEP versetzt und mit H2Obidest. auf 100 pm verdünnt (siehe Tab. 42). Anschließend wurden die Proben 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde in ein HPLC-MS Gefäß gegeben. In der Tab. 45 ist der HPLC-MS Gradient aufgeführt, der für alle Messungen verwendet wurde.

Tab. 42: Bestandteile für die Detektion von Proteinen mittels HPLC-MS

Bestandteile

> 100 pM Protein (foxFLD, Tmn16 oder Tmn7a) 5-10 mM DTT oder TCEP ad 50 µL H2Obidest.

Die Beladung von foxFLD und Tmn16 mit 1,3-BP wurde durch ein in vitro Assay und anschließender HPLC-MS Analyse untersucht. Dazu wurden 5-10 µM des jeweiligen gereinigten Proteins zu 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 und 1 mM TCEP oder DTT gegeben. Die zugegebene Phosphokinase (0,5 U) hydrolysiert ATP zu ADP und phosphoryliert D-Phosphoglycerat zu 1,3-BPG, das dann als Substrat für foxFLD und Tmn16 dient (schematische Darstellung siehe Abb. 31, B und C). Die Bestandteile des in vitro Assays sind in Tab. 43 dargestellt. Der Ansatz wurde 1 h bei 30 °C inkubiert. Um ausgefallene Proteine zu

94 Material und Methoden entfernen wurde der Ansatz vor der HPLC-MS Analyse noch zentrifugiert (2 min, 14000 rpm). Zur Untersuchung der Beladung von Tmn7a durch foxFLD oder Tmn16, wurden nach 1 h bei 30 °C, 5-10 µL holo-Tmn7a (siehe Tab. 44) zugegeben und der Ansatz wurde eine weitere Stunde bei 30 °C inkubiert, bevor er zentrifugiert (2 min, 14000 rpm) und mittels HPLC-MS analysiert wurde.

Tab. 43: Bestandteile des in vitro Assays für die Beladung von Fox-FkbH und Tmn16 mit 1,3-BPG

Bestandteile

5-10 µM foxFLD oder Tmn16 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM MgCl2 1 mM TCEP/DTT 1 mM ATP 50 mM D-Phosphoglycerat 0,5 U Phosphokinase ad 50 µL H2Obidest.

für die Beladung von Tmn7a durch Tmn16 wurden nach 1 h, 30 °C 5-10 µL holo-Tmn7a zugegeben und eine weitere Stunde bei 30 °C inkubiert.

In einem weiteren in vitro Assay wurde holo-Tmn7a, durch Anhängen eines PPT-Arms durch eine 4'-Phosphopantetheinyl Transferase (Sfp), generiert (siehe Tab. 44 und Abb. 31, A). Dazu wurden 100 µM apo-Tmn7a zu 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 10 mM MgCl2 gegeben. Durch die Sfp wurde apo-Tmn7a mit Coenzym A zu holo-Tmn7a aktiviert. Die Generierung von holo-Tmn7a wurde durch HPLC-MS Analyse kontrolliert und das aktivierte Enzym kann anschließend zur Beladung durch foxFLD oder Tmn16 verwendet werden (siehe Abb. 31, B).

Tab. 44: Bestandteile der in vitro -Phosphopantetheinylierung von apo-Tmn7a

Bestandteile

100 µM apo-Tmn7a 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 10 mM MgCl2 1,2 mM Coenzym A 2,6 µM 4'-Phosphopantetheinyl Transferase (Sfp) ad 50 µL H2Obidest.

Zur Analyse der zuvor beschriebenen in vitro Assays wurde die HPLC-Anlage (1100 oder 1200 Serie) von Agilent Technologies verwendet, die an ein LCQ Massenspektrometer mit Elektronenspray Ionisierung oder an ein LTQ Massenspektrometer mit Elektronenspray Ionisierung gekoppelt war (beide ThermoFinnigan, siehe Tab. 24). Zur Auftrennung der Analyten wurde die Jupiter® C4 Säule von Phenomenex verwendet (siehe Tab. 25). Die Tab. 45 beschreibt den verwendeten HPLC-MS Gradienten von 45-95 % ACN mit 0,1 % TFA und 55-5 % H2Obidest. mit 0,1 % TFA.

Tab. 45: Gradient für die HPLC-MS Analyse von foxFLD, Tmn16 und Tmn7a

Zeit H2Obidest. + 0,1 % TFA ACN + 0,1 % TFA ( Fluss (min) ( %) %) (mL/min)

0 55 45 2 5 55 45 2 10 50 50 2 40 25 75 2 45 5 95 2 46 55 45 2 47 55 45 2

95 Material und Methoden

II. 6. Produktion, Aufreinigung und Analytik von bakteriellen Naturstoffen

II. 6. 1 Produktion von bakteriellen Naturstoffen

Zunächst wurden S. diastatochromogenes Tü6028, S. diastatochromogenes pokOIV und die abgeleiteten Mutanten in TSB-Medium (gegebenenfalls mit Antibiotika zur Selektion) kultiviert. Anschließend wurden 200 mL HA-Medium (gegebenenfalls mit Antibiotika zur Selektion) mit Δ 4 mL einer gut gewachsenen Vorkultur beimpft. Die Kulturen wurden dann ca. sieben Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert.

Zur Aufreinigung der produzierten Foxicine und für Fütterungsexperimente wurden 3-8 L HA-Medium auf 500 mL Erlenmeyerkolben aufgeteilt (je 200 mL). Diese wurden dann mit je 5 mL einer gut gewachsenen Vorkultur beimpft und bis zur Extraktion (siehe Kapitel B. II. 6. 2) sieben Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert.

II. 6. 1. 1 Fütterung von 13C-markierten Vorstufen

Zur weiteren Aufklärung der Foxicin Biosynthese wurden Fütterungsexperimente mit [13C6]-Glucose und [1-13C]-Acetat durchgeführt. Die Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV erfolgte unter den Standardbedingungen die in Kapitel B. II. 6. 1 beschrieben wurden. Δ S. diastatochromogenes pokOIV wurde in 4 L HA-Medium für sieben Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert. Ab Tag 4 der Kultivierung wurden insgesamt 9 Portionen [13C6]-Glucose bis zu einer Endkonzentration von 5,5 mMol/L im pulse feedingΔ Verfahren zugegeben 166. Die Portionen wurde an den Tagen 4-6, je dreimal am Tag im Abstand von 6 h gefüttert, anschließend folgte eine 12-stündige Pause. Das Schema der Fütterung ist in Tab. 46 dargestellt. An Tag sieben wurde Foxicin mit Ethyacetat extrahiert und anschließend durch Festphasenextraktion, präparative HPLC und Sephadex LH-20 aufgereinigt und anschließend von Herrn Dr. Thomas Paululat, Universität Siegen mittels NMR analysiert.

Tab. 46: Fütterungsschema für die Fütterung mit [13C6]-Glucose

Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7

Beimpfen von 96 h 120 h 44 h Extraktion mit 4 L HA- - - - 102 h 126 h 150 h Ethylacetat Medium 108 h 132 h 156 h

Zur Fütterung von [1-13C]-Acetat wurden 3 L HA-Medium mit S. diastatochromogenes pokOIV beimpft und sieben Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert. Das markierte Acetat wurde im pulse feeding Verfahren zugegeben, mit insgesamt 11 Portionen bis zu einer Endkonzentration von Δ 6,1 mMol/L167. Das Fütterungsschema ist in Tab. 47 dargestellt. An Tag 3 der Kultivierung wurde die Fütterung begonnen. Dabei wurde an Tag 3 zweimal im Abstand von 6 h gefüttert. An den Tagen 4-6 wurde dreimal pro Tag, im Abstand von 6 h und anschließender 12-stündiger Pause, gefüttert. An Tag sieben wurde Foxicin mit Ethylacetat extrahiert und nachfolgend durch Festphasenextraktion und Dünnschichtchromatographie aufgereinigt. Das resultierende, markierte Foxicin wurde zur NMR-Analyse zu Herrn Dr. Thomas Paululat, Universität Siegen geschickt.

Tab. 47: Fütterungsschema für die Fütterung von [1-13C]-Acetat

Tag 0 Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Tag 7

Beimpfen von - 96 h 120 h 44 h Extraktion mit 3 L HA- - - 78 h 102 h 126 h 150 h Ethylacetat Medium 84 h 108 h 132 h 156 h

96 Material und Methoden

II. 6. 2 Extraktion von bakteriellen Naturstoffen

Die Aktinomycetenstämme wurden, wie in Kapitel B.II. 6. 1 beschrieben, kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die gesamte Kultur zentrifugiert (15-20 min, 5000 rpm). Die produzierten Sekundärmetabolite können sowohl im Medium als auch intrazellulär vorliegen.

Zur Extraktion der Sekundärmetabolite aus dem Medium, wurde der Überstand vollständig abgenommen und mit HCl auf einen pH=4 eingestellt. Dadurch liegen die Sekundärstoffe in protonierter Form vor und können aus der organischen Phase extrahiert werden. Der Überstand wurde in einen Scheidetrichter überführt, mit dem gleiche Volumen Ethylacetat versetzt und für 30-60 min bei 180 rpm geschüttelt. Nach dem Schütteln wurden zwei Phasen sichtbar, eine untere, wässrige Phase und eine obere, organische Phase. Die organische Phase enthält die extrahierten Naturstoffe und wurde abgenommen, in einen Rundkolben filtriert und mit einem Rotationsverdampfer bei 40 °C, unter reduziertem Druck, einrotiert.

Das pelletierte Mycel wurde in 5 mL Aceton resuspendiert und ungefähr eine Stunde lang bei 180 rpm geschüttelt. Nach der Zentrifugation des Gemisches (10 min, 5000 rpm) wurde der Überstand abgenommen, einrotiert und anschließend in 10 mL H2Obidest. gelöst und auf pH=4 eingestellt. Mit 10 mL Ethylacetat wurde, wie bereits beschrieben, extrahiert und die organische Phase wurde in einen Rundkolben filtriert und wiederum einrotiert.

Zur HPLC-MS Analyse wurden die Extrakte in einem entsprechenden Volumen MeOH gelöst und durch einen 0,45 µm Filter partikelfrei filtriert. Je 30-100 µL wurden dann für die HPLC-MS Analyse abgenommen und gegebenenfalls weiter verdünnt (siehe Kapitel B. II. 6. 4. 1). Die gelösten Extrakte wurden dann unter Benutzung der Speedvac wieder einrotiert und bei -20 °C gelagert.

II. 6. 3 Aufreinigung von bakteriellen Naturstoffen

Die bakteriellen Naturstoffe liegen vor weiteren Aufreinigungsschritten als Gemisch vor. Diese können durch verschiedene Verfahren, wie die Festphasenextraktion (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 1), die Dünnschichtchromatographie (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 2) oder die präparative HPLC voneinander getrennt und gereinigt werden.

II. 6. 3. 1 Festphasenextraktion

Die Festphasenextraktion oder solid phase extraction (SPE) basiert auf der Interaktion von gelösten Substanzen mit einer Matrix, der stationären Phase. Die Substanzen werden auf der Säule zurückgehalten und können in Abhängigkeit ihrer Polarität mit einem geeigneten Eluent eluiert und gesammelt werden. Als stationäre Phase wurde die Oasis® HLB 35cc (6g) LB Extraction Cartrige verwendet. Ein spezifisches Verhältnis aus den zwei Monomeren N-Vinylpyrrolidon und Divinylbenzen sorgt für ein hydrohil-lipophiles Gleichgewicht des reversed-phase Sorbens.

Die Säule wurde zunächst mit einem absteigenden MeOH-Gradienten äquilibriert. Dabei wurde zwischen der Aufreinigung unbekannter Substanzen und der Aufreinigung der Foxicine unterschieden. Die Elution der aufzureinigenden Substanzen fand dann mit ansteigenden MeOH Konzentrationen statt.

Festphasenextraktion zur Fraktionierung von Foxicin A und B

Für die Festphasenextraktion von Foxicin A und B wurde die Säule mit je 100 mL von 100 %, 60 % und 40 % MeOH (V/V) konditioniert und über Nacht in 40 % MeOH (V/V) gelagert. Am folgenden Tag wurde die Säule nochmals mit 100 mL von 40 % MeOH (V/V) gespült. Der Rohextrakt (siehe Kapitel B.II. 6. 2) wurde in 5 mL 40 % MeOH (V/V) gelöst. Dazu wurde der Extrakt zunächst in 100 % MeOH vollständig gelöst und anschließend mit H2Obidest. aufgefüllt. Das gelöste Extrakt wurde dann zentrifugiert (10 min, 5000 rpm) und der Überstand wurde mit einer Pasteurpipette langsam auf die Säule aufgetragen. Es wurden 100 mL von 40 % MeOH (V/V) auf die Säule aufgetragen und der Durchfluss in einem 250 mL Rundkolben

97 Material und Methoden aufgefangen. Dieser Schritt wurde mit ansteigenden MeOH Konzentrationen wiederholt. Die Probe wurde in je 5 mL von 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 % MeOH (V/V) gelöst, zentrifugiert und auf die Säule aufgetragen. Dementsprechend wurden je 100 mL derselben MeOH Konzentration verwendet um die Probe aufzutrennen und der Durchfluss wurde wiederum in 250 mL Rundkolben aufgefangen (siehe Tab. 48). Bevor die Fraktionen mit einem Rotationsverdampfer bei 40 °C einrotiert wurden, wurden jeweils 100 µL für die HPLC-MS Analyse (siehe Kapitel B. II. 6. 4. 1) abgenommen. Die Fraktionen, die Foxicin A und B enthielten wurden für weitere Aufreinigungsschritte verwendet (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 2 und Kapitel B. II. 6. 3. 3).

Tab. 48: Schritte der Festphasenextraktion für die Fraktionierung von Foxicin A und B

Schritt MeOH Elutionsvolumen (in % (V/V)) (in mL)

Konditionierung der 100 100 Säule 60 100 40 100

Fraktionierung des 40 100 Rohextraktes 50 100 60 100 65 100 70 100 80 100 90 100 100 100

Waschen der Säule Dichlormethan 15 mL MeOH (100 % (V/V)) 35 mL Essigsäure 0,5 mL

Ethylacetat 200 mL

100 % MeOH (V/V) 100 mL

Die Festphasenextraktionssäule wurde nach Gebrauch gewaschen. Dafür wurden 15 mL Dichlormethan mit 35 mL MeOH (100 %) und 0,5 mL Essigsäure gemischt und auf die Säule aufgetragen. Anschließend wurde mit 200 mL Ethylacetat, gefolgt von 100 mL MeOH (100 %) gewaschen.

II. 6. 3. 2 Dünnschichtchromatographie

Die Dünnschichtchromatographie (DC) ist eine physikalisch-chemische Trennmethode um die Zusammensetzung von Substanzgemischen gegen eine Referenz zu prüfen. Zur Analyse von Naturstoffgemischen wurden die DC-Fertigfolien ALUGRAM®, beschichtet mit 0,2 mm Kieselgel 60 und Fluoreszenzindikator UV254, verwendet (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren). Die gewünschte Probe wurde in einem geringen MeOH-Volumen gelöst und insgesamt 5 µL wurden in einer Distanz von 1 cm zum unteren Rand aufgetragen. Der Auftrag erfolgte in 1 µL-Schritten, wobei zwischen jedem Schritt gewartet wurde, bis das Lösemittel verdampft war. Die DC-Platte wurde dann in eine gesättigte DC-Kammer gestellt. Für die Trennung der Foxicine bestand die mobile Phase aus Dichlormethan: MeOH: EtAc (8:1:1) mit 0,0005 % Essigsäure. Bei einer Lauffront von ca. 14 cm wurde die DC-Platte herausgenommen und getrocknet. Die farbigen Foxicine lassen sich visuell erkennen, andere Substanzen können unter einer UV- Lame oder durch Fluoreszenzlöschung detektiert werden.

Bei der präparativen DC wurden Glasplatten beschichtet mit 0,25 mm Kieselgel (60 Å) und Fluoreszenzindikator UV254, verwendet (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe). Die präparative DC diente der weiteren Aufreinigung von Naturstoffgemischen und unterscheidet sich in der Durchführung lediglich im Probenaufrag von der analytischen DC. Die Proben wurden in einem geringen MeOH-Volumen gelöst und 100 µL-350 µL wurden mit ca. 1 cm Abstand zu den Rändern über die gesamte Länge der DC-Platte

98 Material und Methoden aufgetragen. Nachdem die DC-Platte aus der Laufkammer genommen und getrocknet wurde, wurden die gewünschten Banden mit einem Spatel herausgekratzt. Durch dreimalige Extraktion mit jeweils 10 mL MeOH (30 min schüttelnd extrahieren) wurde die Substanz vom Kieselgel getrennt. Die filtrierte Probe wurde anschließend durch HPLC-MS (siehe Kapitel B. II. 6. 4. 1) analysiert und weiterverwendet (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 3).

II. 6. 3. 3 Präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Nach der Extraktion von Naturstoffen mit Ethylacetat (siehe Kapitel B. II. 6. 2), der Fraktionierung durch Festphasenchromatographie (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 1), der Dünnschichtchromatographie (optional, siehe Kapitel B. II. 6. 3. 2) wurde die präparative Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC, engl.: high performance liquid chromatography) als weiterer Schritt zur Aufreinigung angeschlossen. Dazu wurde die Probe in einem geringen MeOH-Volumen gelöst und durch einen Spritzenfilter filtriert. Zur Aufreinigung wurde die präparative HPLC-Anlage von Waters Corporation (siehe Tab. 24) mit der XBridge® C18 Säule (Vorsäule: 4,6 mm x 20 mm; Hauptsäule: 4,6 mm x 100 mm; Partikelgröße: 3,5 µm) verwendet. Die Tab. 49 zeigt den verwendeten Gradienten mit den Laufmitteln Acetonitril (ACN) mit 0,5 % Essigsäure und H2O mit 0,5 % Essigsäure. Der gewünschte Peak wurde manuell aufgefangen und anschließend mit einem Rotationsverdampfer getrocknet. Durch mehrmaliges Waschen mit Ethylacetat und darauffolgendes Einrotieren wurde die restliche Essigsäure entfernt.

Tab. 49: präparative HPLC Methode zur Aufreinigung der Foxicine

Zeit ACN H2O Fluß Name [min] + 0,5 % Essigsäure + 0,5 % Essigsäure [mL/min] [ %] [ %]

Foxi_präp_DD 0-3 50 50 0,5 3-10 50 - 70 50 - 30 0,5 10-12 95 5 0,5 12-15 50 50 0,5

II. 6. 3. 4 Größenausschlusschromatographie mittels Sephadex™ LH-20

Die Sephadex LH-20 Matrix besteht aus verzweigten, hydroxypropyliertem Dextran und wurde für die Größenausschlusschromatographie von bakteriellen Naturstoffen verwendet. Dieses Verfahren kann dabei als erster Aufreinigungsschritt™ oder, wie in dieser Arbeit, zum abschließenden Polishing, verwendet werden.

Vor der Duchführung wurden 6-7 g Sephadex LH-20 in 40 mL MeOH gelöst, bis eine dichte Suspension entstanden ist. Diese wurde dann in eine saubere 40 cm lange Glassäule mit Hahn gefüllt. Nachdem sich das Säulenmaterial gesetzt hat, wurde das MeOH ™über den Hahn so weit entfernt bis die oberste Sephadex LH-20 Schicht nicht mehr mit MeOH bedeckt war. ™ Die Probe wurde in 500 µL-1 mL MeOH gelöst und auf die Säule gegeben und bei geöffnetem Hahn langsam einsinken lassen. Anschließend wurde MeOH in 1 mL-Schritten auf die Säule gegeben und der Durchfluss in 1 mL Fraktionen aufgefangen. Für die Aufreinigung von Foxicin A wurden 22 mL MeOH benötigt. Alle Fraktionen wurden im Anschluss mittels HPLC-MS analysiert und ins Trockene einrotiert. Die Fraktionen, die Foxicin A enthielten, wurden vereinigt und zur Strukturaufklärung zu Herrn Dr. Thomas Paululat an die Universität Siegen geschickt.

99 Material und Methoden

II. 6. 4 Analyse von bakteriellen Naturstoffen

II. 6. 4. 1 Analyse von Naturstoffen durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie

Extrakte und gereinigte Naturstoffe wie Foxicin wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography, HPLC) mit Elektronenspray Ionisierung (ESI) und Messenspektrometer (MS) analysiert. Die HPLC-ESI-MS Anlage der 1100 Series von Agilent Technologies ist ausgestatet mit einem Probengeber, einem Säulenofen (Säulentemperatur: 28 °C), einem Degaser, einer quarternären Pumpe, einem Diodenarray Detektor und einem Quadrupol Massendetektor (MSD; siehe Tab. 24). Naturstoffe können dabei nicht nur über ihr UV/Vis Spektrum identifiziert werden, sondern auch über ihr Massenspektrum. Zur Auftrennung wurden die XBridge® C18 Säule (4,6 mm x 100 mm) mit Vorsäule (4,6 mm x 20 mm) verwendet (siehe Tab. 25). Polyketomycin oder die Foxicine wurden mit der pokESI2R Methode analysiert (siehe Tab. 49).

Tab. 50: Methoden zur Analyse von Naturstoffen durch HPLC-MS

Zeit ACN H2O Fluß Detektion Name [min] + 0,5 % Essigsäure + 0,5 % Essigsäure [mL/min] [ %] [ %]

pokESI2R 0-1 20 80 0,5 200 nm, 310 nm, 1-8 20-60 80-40 0,5 430 nm, 254 nm, 8-24 60-95 40-5 0,5 280 nm 24-29 95 5 0,5 MSD(-) 29-30 95-20 5-80 0,5 30-35 20 80 0,5

Tab. 51: Parameter der ESI-Quelle

ESI Parameter Einstellung

Dry Gas Flow 12 L/min Dry gas temperature 350 °C Nebulizer pressure 50 psi Kapillarspannung (Vcap pos., Vcap neg.) 3000 V

Die Analyse der Daten erfolgte mit dem Programm LC/MSD ChemStation Rev. B. 04. 03 von Agilent Technologies.

II. 6. 4. 2 Kenspinresonanz-Spektroskopie

Die Kernspinresonanz-Spektroskopie (nuclear magnetic resonance, NMR) wurde zur Strukturauflösung von Foxicin aus der Fütterung mit [13C6]-Glucose und 13C-1 Acetat, durchgeführt. Die Proben wurden von Herrn Dr. Thomas Paululat (Universität Siegen) mit einer Bruker AV 400 oder einer Varian NMR-S600 MHz analysiert und deren Spektren aufgenommen

100 Material und Methoden

II. 7. Aktivitätsbestimmungen bakterieller Naturstoffe

Bakterielle Naturstoffe zeichnen sich durch eine Vielzahl an Eigenschaften aus. Bei unbekannten bakteriellen Naturstoffen werden diese Eigenschaften durch Aktivitätsbestimmungen untersucht. Im Folgenden werden Methoden beschrieben, anhand derer die Aktivität von Foxicin A untersucht wurde.

II. 7. 1 Detektion von Siderophoren mit Chromazurol S (CAS)

Schwyn und Neilands (1987) entwickelten das Chromazurol S (CAS) Assay zur Detektion von Siderophoren, das im Laufe der Zeit weiter modifiziert und an unterschiedliche Anwendungsbereiche angepasst wurde168. Chromazurol S bindet Fe3+ und was in einer dunkelblauen Färbung des Reagenzes resultiert. Durch die Zugabe von Molekülen mit hoher Affinität zu Eisen, werden die Fe3+ Ionen auf die Siderophore übertragen. Daraufhin ist ein Farbumschlag zu beobachten, der von den funktionellen Gruppen des Siderophors abhängig ist. Bei Hydroxamat-Gruppen ist ein Umschlag von blau zu orange beobachten, bei Catecholgruppen findet die Veränderung von blau zu lila statt169. Mit dem CAS-Reagenz können Siderophore in Lösung detektiert und bestimmt werden168. Nach der Zugabe von Agarose oder Agar-Agar kann das CAS-Reagenz auch als Topagar (O-CAS Assay)169 oder als Agarplatte (CASAD-Assay)170,171 verwendet werden. In Tab. 52 ist die Zusammensetzung des CAS-Reagenz aufgeführt. Für die Durchführung des O-CAS Assays wurden 0,9 % Agarose zugegeben und für die Durchführung des CASAD Assays wurden 1,6 % Agar- Agar zugegeben. Anschließend kann das Reagenz autoklaviert werden.

Tab. 52: Zusammensetzung des CAS-Reagenz

Bestandteile

CAS-Reagenz: 60,5 mg Chromazurol S 72,9 mg HDTMA 30,24 g PIPES 10 mL FeCl3 x 6 H2O (1 mM in 10 mM HCl)

ad 1 L H2Obidest.

O-CAS Assay: 0,9 % Agarose (w/v)

CASAD Assay: 1,6 % Agar-Agar (w/v)

Detektion von Siderophoren in Lösung

Streptomyces coelicolor, S. albus, S. diastatochromogenes Tü6028 und S. diastatochromogenes pokOIV wurden, wie in Kapitel B. II. 6. 1 beschrieben, zur Produktion bakterieller Naturstoffe kultiviert. Zu 1 mL CAS-Reagenz wurden 300 µL oder 1 mL des Kulturüberstandes oder in MeOH gelöstes, gereinigtesΔ Foxicin gegeben. Die Proben wurden durch Invertieren gemischt und bei Anwesenheit eines Siderophores konnte ein entsprechender Farbumschlag detektiert werden.

O-CAS Assay

Beim O-CAS Assay wurden die zu untersuchenden Aktinomyceten auf MS-Platten ausgestrichen und kultiviert (siehe Kapitel B. II. 1. 2). Das gut gewachsene Mycel wurde dann mit 15 mL CAS-Topagar überschichtet. In Anwesenheit eines Siderophors konnte, über der entsprechenden Aktinomycetenkolonie, ein Farbumschlag beobachtet werden.

101 Material und Methoden

CASAD Assay

Beim CAS Agardiffusionsassay wurden 1,6 % Agar-Agar zum CAS-Reagenz gegeben und nach kurzem Aufkochen wurden ca. 17-25 mL in eine Petrischale gegossen. Nach dem Festwerden des Agars, wurde ein 5 mm großes Loch ausgestochen in das, der in MeOH gelöste, gereinigte Siderophor pipettiert wurde. Zur Kontrolle wurden 10 mM EDTA verwendet. Die Platten wurden 1h bei RT inkubiert bis ein Hof mit Farbumschlag zu sehen war.

II. 7. 2 Einfluss verschiedener Faktoren auf die Foxicin Produktion

Die Produktion von Foxicin wurde unter dem Einfluss verschiedener Faktoren untersucht und quantitativ verglichen. Dabei wurde S. diastatochromogenes pokOIV in unterschiedlichen Nährmedien unter der Zugabe verschiedener Ionen oder EDTA kultiviert. Zusätzlich wurde ein Minimalmedium ohne Eisen verwendet. Δ

II. 7. 2. 1 Foxicin Produktion bei der Kultivierung von Streptomyces diastatochromogenes ΔpokOIV in Anwesenheit verschiedener Ionen

S. diastatochromogenes pokOIV wurde in einem Vorexperiment in HA-Medium kultiviert. Den Kulturen wurden je 1 mM CaCl2, MgSO4, ZnSO4, MnCl2, CuSO4, FeSO4 oder FeCl3 zugegeben. Nach der Extraktion mit Ethylacetat wurden dieΔ Extrakte mittels HPLC-MS analysiert. In einem zweiten Experiment wurden ausgewählte Ionen (ZnSO4, MnCl2, CuSO4, FeSO4 oder FeCl3) in unterschiedlichen Konzentrationen von 1 mM, 0,1 mM und 0,01 mM zu S. diastatochromogenes pokOIV Kulturen gegeben. Nach der Extraktion mit Ethylacetat wurden die Extrakte mittels HPLC-MS analysiert und die Zellpellets zur Bestimmung des Trockengewichtes 2-3 Tage bei 60 °C getrocknet. Die FoxicinΔ Produktion wurde anschließend quantitativ verglichen.

II. 7. 2. 2 Foxicin Produktion bei der Kultivierung von Streptomyces diastatochromogenes ΔpokOIV in NMMP Medium

NMMP ist ein Minimalmedium dessen Zusammensetzung in Tab. 8 beschrieben wurde. S. diastatochromogenes pokOIV wurde in NMMP mit und ohne Eisen für 6 Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert (siehe B. II. 6. 1). An Tag 7 der Kultivierung wurde die Kultur abzentrifugiert, der Überstand wurde mit Ethyacetat extrahiert,Δ einrotiert (siehe Kapitel B. II. 6. 2) und anschließend zur Analyse mittels HPLC-MS verwendet (siehe Kapitel B. II. 6. 4. 1). Das Pellet wurde 2-3 Tage bei 60 °C getrocknet und das Trockengewicht zum quantitativen Vergleich der Naturstoffproduktion verwendet.

II. 7. 2. 3 Foxicin Produktion bei der Kultivierung von Streptomyces diastatochromogenes ΔpokOIV in HA Medium mit EDTA

Der Eisengehalt von HA-Medium wurde von Frau Sigrid Hirth-Walther am Institut für Geowissenschaften, (Abteilung für Mineralogie und Geochemie, Albertstr. 23b) mit einem AAS Vario 6 (Analytik Jena) durch Flammen-Atomabsorption bestimmt. Die Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV zur Foxicin Produktion wurde, wie in Kapitel B. II. 6. 1 beschrieben, durchgeführt. Zusätzlich wurde einer Kultur, analog zum Eisengehalt, EDTA zugegeben. An Tag sieben wurden die produzierten NaturstofΔ fe mit Ethylacetat extrahiert und mittels HPLC-MS analysiert.

102 Material und Methoden

II. 7. 2. 4 Foxicin Produktion bei der Kultivierung von Streptomyces diastatochromogenes ΔpokOIV in HA Medium mit Glycerin

Die Rolle des putativen Regulators FoxRV wurde durch die Zugabe von Glycerin zur S. diastatochromogenes pokOIV Kultur untersucht. S. diastatochromogenes pokOIV wurde, wie im Kapitel B. II. 6. 1 beschrieben, kultiviert. Eine Kultur wurde, wie gewohnt, in HA-Medium kultiviert. Eine weitere Kultur wurde in mit 1 %, Δ0,1 % oder 0,01 % Glycerin supplementiert. An TagΔ sieben wurden die produzierten Naturstoffe mit Ethylacetat extrahiert (siehe Kapitel B. II. 6. 2) und durch HPLC-MS analysiert (siehe Kapitel B. II. 6. 4. 1).

II. 7. 3 UV/Vis Spektroskopie von Foxicin

Das aufgereinigte Foxicin A oder B wurde in einer Konzentration von 10 mM in MeOH gelöst. Anschließend wurden ZnSO4, MnCl2, CuSO4, FeSO4 oder FeCl3 Lösungen in ansteigengen Konzentrationen (0,05 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM) zugegeben. Nach einer kurzen Inkubationszeit (30 sec-1 min) wurde das UV/Vis Spektrum von 200-600 nm aufgenommen und anschließend hinsichtlich einer Komplexierung ausgewertet.

II. 7. 4 Agar Diffusionstest

Die antibiotische Wirkung von Naturstoffen wurde durch einen Agar-Diffusionstest untersucht. Dazu wurde das entsprechende Extrakt in einem geringen MeOH-Volumen gelöst und auf sterile Filterrondelle gegeben. Zur Kontrolle wurde reines MeOH verwendet. Nachdem das MeOH verdampft war, wurden die Filterrondelle auf Agarplatten mit den Testkeimen (siehe Tab. 4) gelegt. Die Testplatten wurden inkubiert und anschließend wurden die wachstumsfreien Zonen um die Filterrondelle ausgemessen und ausgewertet.

II. 8. Bioinformatik

II. 8. 1 StreptomeDB

Die erste Version der StreptomeDB wurde von Dr. Xavier Lucas, AG Prof. Dr. Stefan Günther, entwickelt 172. Bis zu diesem Zeitpunkt existierten zwar viele Publikationen über Streptomyceten und deren Sekundärmetabolite, allerdings gab es keine verständliche und allgemein verfügbare Datenbank. Die StreptomeDB war mit ihrer Veröffentlichung die größte Datenbank und beinhaltete mehr als 2400 Naturstoffe von mehr als 1900 Streptomycetenstämmen. Die steigende Anzahl an Naturstoffen erforderte die Erweiterung der StreptomeDB. Dazu wurden Artikel automatisch aus der Pubmed Datenbank extrahiert und anschließend ausgewertet. Hierfür wurde die Software Compund Research System Curator (CoRSCurator) verwendet 173,174. Mit dem CoRSCurator wurden mehr als 100 Artikel gelesen und Entitäten wie der Name eines Naturstoffes und des Streptomyceten, wurden extrahiert. Nachdem diese beiden complete werden. Weitere Informationen, wie z.B. die biologische Aktivität, das biologische Target oder die EntitätenBiosynthese gefunden wurden, und falls extrahiertvorhanden, wurden, ebenfalls konnte extrahiert. der entsprechendeDie Namen der extrahierten Artikel als „ Naturstoffe markiert wurden in einer Tabelle gesammelt und eine Suche in der PubChem Datenbank durchgeführt. Die PubChem ID wurde in die Tabelle eingefügt, wenn die Substanz gefunden wurde. Konnte mehr als eine CID (PubChem Compound Identification) beschriftet und die korrekte Struktur wurde später manuell gesucht. gefunden werden, wurde die entsprechende Substanz mit „weitere CIDs Die Substanzen, die nicht anhand des Namens bei PubChem gefunden werden konnten, wurden die Substanzen anhand ihrer Struktur gesucht. Dazu wurden 202 Strukturen mit MarvinSketch (ChemAxon Ltd.) gezeichnet, in SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry Specification) konvertiert und erneut bei

103 Material und Methoden

PubChem gesucht. Die so gefundenen CIDs wurden in die Tabelle eingefügt, nicht gefundene, neue Strukturen wurden dann in die StreptomeDB eingebunden.

II. 8. 2 RAST

Der RAST-Server (Rapid Annotation using Subsystem Technology - Server) ist ein vollautomatischer Service zur Annotation bakterieller und archaealer Genome und wurde für die Analyse des Genoms von S. diastatochromogenes Tü6028 genutzt 145.

II. 8. 3 antiSMASH

Mit antiSMASH (antibiotics & Secondary Metabolite Analysis SHell) können Biosynthese Gencluster von bakteriellen Sekundärstoffen im Genom schnell identifiziert, annotiert und analysiert werden.

104 Ergebnisse

Ergebnisse

I. Untersuchungen zu Foxicin aus Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Streptomyces diastatochromogenes pokOIV produziert die para-Quinone Foxicin A-D3.

Foxicin A wurde als (S)-2-Hydroxy-3-(Acetylamino)-5-Tü Δ (3 , 5 S, 7 -trimethyl-hepta-3 E, 6 - 4 dienoyl-amino)-1,4-Benzoquinon charakterisiert . Das Foxicin BGC wurde von Dr. Anja Greule identifiziert und die postulierten Funktionen der 41 ORFs wurden in Greule et al. (2017) publiziert. Eine aktualisierte und erweiterte Version der postulierten Funktionen ist in Tab. 53 dargestellt. Die Gene foxGI-III, foxRV, die FkbH-ähnliche Domäne von foxBII und die PCP-Domäne von foxBIII wurden durch in silico Analysen untersucht und näher charakterisiert. Dabei wurde die postulierte Foxicin-Biosynthese durch weitere Experimente untersucht. Die Regulation der Foxicin Biosynthese wurde durch in silico Analysen und Überproduktion der Regulatoren in S. diastatochromogenes pokOIV näher betrachtet. Zudem wurde die biologische Rolle von Foxicin

4 als Siderophor experimentellΔ überprüft und verschiedene Faktoren, die einen Einfluss auf die Foxicin Produktion haben, wurden ermittelt.

Tab. 53: Postulierte Funktionen der ORFs des fox-Clusters aus S. diastatochromogenes Tü6028

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

foxTI ABC-Transporter 629811 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799658.1 Substratbindeprotein (441) 631136 (0.0 - 414/422(98 %) - 865 bits(2236)) foxTII Zucker ABC-Transporter 628877 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799657.1 Permease (304) 629791 (0.0 - 300/304(99 %) - 593 bits(1529)) foxTIII carbohydrate ABC-Transporter 627951 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799656.1 Permease (309) 628880 (0.0 - 307/309(99 %) - 617 bits(1590)) foxHI hypothetisches Protein (66) 627071 - Streptomyces ambofaciens WP_079030599.1 627271 (2,00E-10 - 28/42(67 %) - 59.3 bits(142)) foxHII hypothetisches Protein (60) 626682 - Streptomyces sp. M41(2017) WP_081222930.1 626864 (1,00E-23 - 48/59(81 %) - 92.4 bits(228)) foxC ATP/GTP-Bindeprotein (346) 625508 - Streptomyces sp. NRRL S-646 WP_030931006.1 626548 (0.0 - 312/346(90 %) - 619 bits(1597)) foxD Dipeptidase (451) 623992 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799652.1 625347 (0.0 - 445/451(99 %) - 897 bits(2318)) foxOI Hyaluronat Lyase (409) 622579 - Streptomyces olivochromogenes WP_067372955.1 623808 (0.0 - 379/404(94 %) - 733 bits(1892)) foxHIII Oxidoreduktase (149) 621751 - Streptomyces aureus WP_037616058.1 622200 (8,00E-96 - 137/148(93 %) - 281 bits(719)) foxRI TetR/AcrR Regulator (237) 620788 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799649.1 621501 (3,00E-158 - 228/236(97 %) - 446 bits(1148)) foxRII Sensor Histidin Kinase (417) 619413 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_037762539.1 620666 (0.0 - 400/416(96 %) - 721 bits(1862)) foxRIII DNA-binding response Regulator 618751 - Streptomyces yerevanensis WP_033318626.1 (221) 619416 (2,00E-143 - 211/221(95 %) - 407 bits(1047)) foxHIV hypothetisches Protein (129) 618401 - Streptomyces olivochromogenes WP_067372966.1 618790 (8,00E-30 - 58/90(64 %) - 111 bits(278))

105 Ergebnisse

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

foxTIV MFS Transporter (493) 616845 - Streptomyces avermitilis WP_010982901.1 618326 (0.0 - 454/493(92 %) - 849 bits(2193)) foxRIV MarR Regulator (137) 616346 - Streptomyces sp. Ag82_O1-15 WP_095856198.1 616759 (6,00E-80 - 121/135(90 %) - 240 bits(612)) foxHV hypothetisches Protein (246) 615526 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799644.1 616266 (3,00E-156 - 227/246(92 %) - 442 bits(1136)) foxTV MFS Transporter (399) 614205 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_037762535.1 615404 (0.0 - 371/377(98 %) - 704 bits(1817)) foxA N-Acetyltransferase (371) 612424 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799642.1 613539 (0.0 - 362/371(98 %) - 731 bits(1886)) foxGI Glycerinaldehyde-3-phosphat 610475 - Streptomyces subrutilus WP_069919052.1 Dehydrogenase (481) 611920 (0.0 - 452/481(94 %) - 933 bits(2411)) foxBI Nicht-ribosomale 608119 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_051370386.1 Peptidsynthetase (CAL) (574) 609843 (0.0 - 552/574(96 %) - 1119 bits(2894)) foxBII Polyketidsynthase (ACP - KS - AT 593458 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_078628893.1 - DH - KR - ACP - KS - AT - DH - 607881 (0.0 - 4456/4847(92 %) - 8322 bits(21594)) KR - ACP - C - FkbH) (4870) foxBIII Polyketidesynthase (PCP - TE) 590544 - Streptomyces avermitilis WP_010982989.1 (945) 593381 (0.0 - 634/829(76 %) - 1194 bits(3089)) foxEI Esterase (378) 589411 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799639.1 590547 (0.0 - 364/378(96 %) - 732 bits(1890)) foxEII Carboxylesterase (259) 588567 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799638.1 589346 (1,00E-180 - 247/258(96 %) - 504 bits(1299)) foxTVI MFS Transporter (131) 588031 - Streptomyces sp. 13-12-16 WP_085571931.1 588426 (6,00E-48 - 87/113(77 %) - 170 bits(430)) foxTVII MFS Transporter (253) 587297 - Streptomyces hygroscopicus WP_014670669.1 588058 (5,00E-129 - 204/250(82 %) - 384 bits(986)) foxRV DeoR/GlpR Regulator (259) 586479 - Streptomyces sp. Ag82_O1-15 WP_095856224.1 587258 (7,00E-159 - 235/259(91 %) - 450 bits(1157)) foxGII Zuckerisomerase (306) 585465 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799636.1 586385 (0.0 - 286/296(97 %) - 570 bits(1469)) foxGIII Ketosebisphosphate Aldolase 584581 - Streptomyces viridochromogenes WP_004003319.1 (283) 585432 (3,00E-165 - 244/283(86 %) - 468 bits(1204)) foxHVI hypothetisches Protein (99) 584279 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799634.1 584578 (6,00E-64 - 95/99(96 %) - 196 bits(499)) foxOII Phytanoyl-CoA Dioxygenase 583449 - Actinobacteria bacterium OK006 WP_054228744.1 (277) 584282 (1,00E-175 - 240/277(87 %) - 493 bits(1270)) foxRVI AraC Regulator (257) 582604 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799632.1 583377 (2,00E-176 - 252/257(98 %) - 494 bits(1271)) foxRVII 50S rRNA-Methyltransferase 581472 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799631.1 (380) 582614 (0.0 - 366/375(98 %) - 742 bits(1916)) foxRVIII Dioxygenase (240) 580696 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799630.1 581418 (1,00E-161 - 227/236(96 %) - 455 bits(1170)) foxRIX ROK Regulator (413) 579441 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799629.1 580682 (0.0 - 409/413(99 %) - 781 bits(2017)) foxEIII Phosphotriesterase (307) 578457 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799628.1 579380 (0.0 - 294/307(96 %) - 572 bits(1475)) foxHVII hypothetisches Protein (194) 577870 - Streptomyces olivochromogenes WP_067373093.1 578454 (2,00E-115 - 158/194(81 %) - 334 bits(857)) foxRX TetR/AcrR Regulator (239) 577094 - Streptomyces olivochromogenes WP_067373096.1 577813 (8,00E-118 - 174/189(92 %) - 342 bits(878)) foxTIX ABC-Transporter ATP- 576006 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799624.1 Bindeprotein (252) 576764 (4,00E-174 - 246/252(98 %) - 488 bits(1255)) foxTX ABC-Transporter 573448 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028799623.1 Substratbindeprotein (853) 576009 (0.0 - 823/853(96 %) - 1587 bits(4110)) Stand: 09.10.2017 106 Ergebnisse

I. 1. FoxGI, FoxGII und FoxGIII synthetisieren 1,3-BPG als Vorstufe für die Foxicin Biosynthese

In silico Analysen der Aminosäuresequenzen von foxGI, foxGII und foxGIII ergaben große Sequenzähnlichkeiten zu Enzymen, die an der Glykolyse beteiligt sind. Dabei ist foxGI ähnlich zur Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, foxGII zeigt Ähnlichkeit zu einer Zuckerisomerase und foxGIII ähnelt einer Ketosebisphosphat-Aldolase (für weitere Informationen siehe Tab. 53). Die postulierten Funktionen von FoxGI-III und die Synthese des Vorläufermoleküls 1,3-BPG, (siehe Kapitel A. III) wurden experimentell in einem in vitro Assay nachgewiesen.

I. 1. 1 Produktion und Aufreinigung von FoxGI, FoxGII und FoxGIII

Zur Untersuchung der Enzymfunktionen von FoxGI, FoxGII und FoxGIII wurden die Proteine rekombinant in E. coli produziert, aufgereinigt und schließlich in dem NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assay verwendet.

Dazu wurde foxGI, wie in Kapitel B. II. 5. 3 beschrieben, in den Expressionsvektor pET28a kloniert. Zur Ermittlung der optimalen Produktionsbedingungen wurde FoxGI mit C-terminalem und mit

N-terminalem His6-Tag in verschiedenen E. coli Expressionsstämme und unter verschiedenen Bedingungen produziert (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1). Die höchste Ausbeute an rekombinantem

FoxGI mit C-terminalen His6-Tag wurde in E. coli BL21 (DE3) Star erreicht, die, nach der Induktion mit 100 mM IPTG, 18 h bei 20 °C und 180 rpm kultiviert wurden. Nach der Ernte der Zellen wurde C-FoxGI, wie in den Kapiteln B. II. 5. 2. 2. 1 und B. II. 5. 3 beschrieben, aufgereinigt. Je 20 µL des Durchflusses (DF), der Waschfraktionen WF 1 und WF 2 und der Elutionsfraktionen E 1 bis E 4 wurden für die Analyse mittels SDS-PAGE abgenommen (für weitere Informationen siehe Kapitel B. II. 5. 6. 1). In Abb. 32 ist das Ergebnis der SDS-PAGE dargestellt. C-FoxGI (48,379 kDa) wurde in den Elutionsfraktionen E 1 bis E 4 mit 250 mM Imidazol eluiert. Die Fraktionen E 3 und E 4

Abb. 32: SDS-PAGE nach der Aufreinigung von FoxGI mit wurden vereint, mit einem Vivaspin 20 2+ C-terminalem His6-Tag (48,379 kDa) mit Ni -Agarose. Konzentrator aufkonzentriert und für das in PL| Proteinleiter (Protein Marker VI (10-245) prestained BC, AppliChem); 18 h n. I.| nach 18 h der Kultivierung bei 20 °C; vitro Assay in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) DF| Durchfluß; WF 1| Waschfraktion 1; WF 2| Waschfraktion 2; E 1 - E 4| Elutionsfraktionen 1 - 4; P| Pellet umgepuffert. der unlöslichen Komponenten.

107 Ergebnisse

Außerdem wurde foxGII in pET28a kloniert (siehe Kapitel B. II. 4. 7. 4) und die besten Produktionsbedingungen wurden mit Hilfe von Testexpressionen festgestellt (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1). Die beste Proteinproduktion von C-FoxGII wurde mit E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 erzielt, die, nach der Induktion mit 100 mM IPTG für 3 h bei 37 °C und 180 rpm kultiviert wurden. Die Aufreinigung wurde mit dem ÄKTA-FPLC System durchgeführt und die Anteile des Elutionspuffers wurde in den Schritten 10 %, 15 %, 50 % und 100 % erhöht (siehe Kapitel B. II. 5. 3 und Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 1 für die Aufreinigung, Tab. 17 für die verwendeten Puffer). C-FoxGII wurde bei einem Anteil von 50 % (siehe

Abb. 33, B: C-FoxGII Peak mit Asteriskdes markiert).Elutionspuffers Auf dem von SDS-Gel der HisTrap™ ist C-FoxGII FF inmL den eluiert Fraktionen drei bis sechs, mit der erwarteten Größe von 34,045 kDa, zu sehen (siehe Abb. 33, A: SDS-PAGE Proben 3-6). Die Fraktionen fünf und sechs wurden vereint, mit einem Vivaspin 20 Konzentrator aufkonzentriert und für das NAD+/NADH+H+ gekoppelte Glykolyse Assay in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) umgepuffert.

Abb. 33: SDS-PAGE Analyse der C-FoxGII Aufreinigung (A) und ÄKTA-FPLC Chromatogramm der C-FoxGII Aufreinigung (B). A: PL| Proteinleiter (Protein Marker VI (10-245) prestained BC, AppliChem); v. I.| vor der Induktion mit IPTG; 3 h n. I.| 3 h nach der Induktion mit IPTG; 1-7| gesammelte Fraktionen während der Aufreinigung, davon enthalten 5 und 6 das gereinigte C-FoxGII (34,045 kDa); B: schwarz| Absorption des Säulendurchlaufs (mAU); rot| Anteil des Elutionspuffers (%); Peak, der mit einem Asterisk markiert ist, enthält C-FoxGII und ist in den gesammtelten Fraktionen 5 und 6 zu sehen.

Das PCR Produkt foxGIII wurde, zur Produktion von FoxGIII mit C- und N-terminalem His6-Tag, ebenfalls in den Expressionsvektor pET28a kloniert (siehe Kapitel B. II. 4. 7. 5). Die optimalen Produktionsbedingungen wurden auch hier durch Testexpressionen festgestellt (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1). Unabhängig der Produktionsbedingungen aggregierte das rekombinante FoxGIII in sogenannten Einschlusskörperchen (inclusion bodies). Die Aufreinigung von FoxGIII aus den Einschlusskörperchen wurde in Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 2 beschrieben. Zunächst wurde der Überstand nach dem Zellaufschluss und der Zentrifugation mittels ÄKTA-FPLC aufgereinigt. Bei der SDS-PAGE Analyse zeigte sich N-FoxGIII in keiner der gesammelten und analysierten Fraktionen, sondern im Pellet mit den unlöslichen Komponenten (siehe Abb. 34, A.). In Kapitel B. II. 5. 2. 2. 2. 2 wurde das weitere Vorgehen mit dem Pellet beschrieben. Die Aufreinigung mit der ÄKTA-FPLC und die nachfolgende SDS-PAGE Analyse ist in der Abb. 34 dargestellt. Nach der

108 Ergebnisse

Renaturierung wurde N-FoxGIII während eines linearen Gradienten mit 78-88 % des Elutionspuffer eluiert (siehe Abb. 34, B. Elutionsfraktion 7). N-FoxGIII wurde mit einem Vivaspin 20 Konzentrator aufkonzentriert und für das NAD+/NADH+H+ gekoppelte Assay in 0,1 M Tris-HCl mit ZnSO4 (pH 7,5) umgepuffert.

Abb. 34: Aufreinigung von N-FoxGIII aus Einschlusskörperchen mittels ÄKTA-FPLC. A| SDS-PAGE Analyse der ÄKTA-FPLC Reinigung der löslichen Fraktion. N-FoxGIII (31,255 kDa) befindet sich in der unlöslichen Fraktion (P); B| SDS-PAGE Analyse der ÄKTA-FPLC Reinigung der unlöslichen Fraktion. N-FoxGIII befindet sich in Elutionsfraktion 7; C|Chromatogramm der ÄKTA-FPLC Aufreinigung der löslichen Fraktion; D| Chromatogramm der ÄKTA-FPLC Aufreinigung der unlöslichen Fraktion, mit einem Asterisk ist die Elutionsfraktion 7 markiert (78-88 % Elutionspuffer), die N-FoxGIII enthält; PL| Proteinleiter (Protein Marker VI (10-245) prestained BC, AppliChem); schwarz| Absorption des Säulendurchlaufs (mAU); rot| Anteil des Elutionspuffers (%).

I. 1. 2 Charakterisierung von FoxGI, FoxGII und FoxGIII mit dem NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assay

Das NAD+/NADH+H+ gekoppelte Glykolyse Assay sollte die enzymatischen Funktionen von FoxGI, FoxGII und FoxGIII klären. Als Referenz wurden die Fructose-1,3-bisphosphat-Aldolase (FBA), die Triosephosphat-Isomerase (TIM) und die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAP-DH) von Sigma-Aldrich Chemie GmBH (München) verwendet, die schrittweise durch C-FoxGI, C-FoxGII und N-FoxGIIII ersetzt wurden (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 3). Im ersten Teil der Reaktion synthetisieren die FBA und die GAP-DH das Produkt 1,3-BPG, wobei NAD+ zu NADH+H+ reduziert wurde. Nachdem sich das Gleichgewicht der Reaktion eingestellt hatte, wurde die TIM zugegeben,

109 Ergebnisse die das Gleichgewicht in Richtung DHAP verschiebt, wobei NADH+H+ wieder oxidiert wurde. Das genaue Vorgehen wurde im Kapitel B. II. 5. 6. 3 detailliert beschrieben. Die Abb. 35 zeigt das Ergebnis des NAD+/NADH+H+ gekoppelten Glykolyse Assays. Abbildungsteil A zeigt die Referenzreaktion mit den Enzymen FBA und GAP-DH (schwarz), sowie die negative Kontrollreaktion ohne die GAP-DH (grau). Die FBA und die GAP-DH wandeln, unter Verbrauch von NAD+, Fructosebisphosphat zu 1,3-BPG um. Dies resultiert in einem Anstieg der Absorption bei 340 nm durch die Reduktion von NAD+. Wie erwartet war bei der Negativkontrolle keine Veränderung zu beobachten. Die FBA wurde anschließend durch N-FoxGIII ersetzt (siehe Abb. 35, B; schwarz). Der Absorptionsanstieg war abermals auf die Reduktion von NAD+ zurückzuführen,

Abb. 35: NAD+/NADH+H+ gekoppeltes Glykolyse Assay mit den Enzymen GAP-DH, TIM, FBA und C-FoxGI, C- FoxGII und N-FoxGIII. A| Kontrollreaktion mit FBA und GAP-DH (schwarz), sowie die Negativkontrolle ohne GAP- DH (grau); B| GAP-DH wurde durch FoxGI ersetzt (schwarz), sowie Negativkontrolle ohne FoxGI (grau); C| FBA wurde durch FoxGIII ersetzt (schwarz), sowie Negativkontrolle ohne FoxGIII (grau); D| Kontrollreaktion mit FBA und GAP-DH, nach 900 sec wurde TIM zugegenen (schwarz); E| Reaktion mit FBA und GAP-DH (schwarz), nach 900 sec wurde die TIM durch FoxGII ersetzt (blau)

110 Ergebnisse was darauf hindeutet, dass N-FoxGIII die Funktion der FBA übernehmen kann. Die Abb. 35, C zeigt die Absorption der Reaktion, in der die GAP-DH durch C-FoxGI ersetzt wurde (schwarz). Auch hier ist ein Anstieg der Absorption aufgrund der Reduktion von NAD+ zu beobachten. Somit übernahm C-FoxGI die enzymatische Funktion der GAP-DH. Die Abb. 35, D zeigt den Verlauf der Reaktion erneut, wobei hier die TIM nach 900 sec zur Referenzreaktion gegeben wurde. Die Absorption nimmt nach der Zugabe umgehend ab, da NADH+H+ bei der Entstehung von DHAP wieder oxidiert wird. Die TIM wurde anschließend durch C-FoxGII ersetzt, welches ebenfalls nach 900 sec zur Reaktion zugegeben wurde (siehe Abb. 35, E, blau). Die Abnahme der Absorption lässt darauf schließen, dass C-FoxGII dieselbe enzymatische Funktion aufweist wie die TIM. Die Negativkontrollen (grau) zeigen wie erwartet nahezu keine Veränderung.

Die rekombinanten Proteine C-FoxGI, C-FoxGII und N-FoxGIII zeigen nicht nur Sequenzähnlichkeiten zu den Enzymen der Glykolyse, sie katalysieren auch die gleichen enzymatischen Reaktionen zur Produktion von 1,3-BPG.

111 Ergebnisse

I. 2. Die Unterbrechung von foxGI führt zu einer Verminderung der Foxicin Produktion

Um die Rolle von FoxGI während der Foxicin-Produktion in S. diastatochromogenes pokOIV zu analysieren, wurde foxGI durch einen single crossover unterbrochen. Die daraus resultiertenΔ Mutanten S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint A und B wurden zunächst durch PCR verifiziert und mit S. diastatochromogenesΔ pokOIV verglichen. In der Abb. 36, A. sind die Integration von pKC1132-foxGIint und die BindestellenΔ der Primer schematisch dargestellt, während die Abb. 36, B. die Ergebnisse der Kontroll-PCR zeigt.

Abb. 36: Schematische Darstellung der Integration (A.) und PCR-Kontrolle der Integration (B.) von pKC1132- foxGIint in foxGI aus S. diastatochromogenes ΔpokOIV Δ. A. Bindestellen der Primer G3P-for, G3P_rev, lac-for und lac-rev zur Kontrolle der Integration durch Pfeile dargestellt. G3P_for/G3P_rev zur Amplifikation von Fragment 1; G3P_for/lac-for zur Amplifikation von Fragment 2; G3P_rev/lac-rev zur Amplifikation von Fragment 3. foxGIint: homologer Bereich von foxGI zur Integration von pKC1132-foxGIint; foxGI: unterbrochenes foxGI durch pKC1132-foxGIint; ApraR: Apramycin-Resistenzkassette; lacZ -Galactosidasegen aus pKC1132; B. A| S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint Mutante A; B| S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGI : 92 bp; A, B: 6 kb); 2| Amplifikation von Fragment 2 Δ Δ int Mutante B; | Amplifikation von Fragment Δ: Δ: kein PCR Produkt; A, B: bp; | Amplifikation von Fragment Δ: kein PCR Produkt; A, B: bp. Die erfolgreiche Integration wurde durch die Amplifikationen verschiedener Bereiche um foxGI überprüft und mit S. diastatochromogenes pokOIV verglichen. Das erste Fragment wurde mit dem Primerpaar G3P_for und G3P_rev amplifiziert,Δ wobei in S. diastatochromogenes pokOIV 1592 bp amplifiziert wurden. In S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIintΔ A und B wurden hingegen, bei einer erfolgreichen Integration, ungefährΔ 6000 bp von pKC1132-foxGIint amplifiziert. Die PCR-Produkte entsprachen den erwarteten Größen (siehe Abb. 36, B. 1). Für die Amplifikation des zweiten Fragments wurde das Primerpaar G3P_for und lac-for verwendet, wobei in S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint A und B 1291 bp erwartet

Δ 112 Ergebnisse wurden. Fragment drei wurde mit dem Primerpaar G3P_rev und lac-rev amplifiziert. Bei S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint A und B wurden 1463 bp erwartet. Bei fehlender Integration vonΔ pKC1132-foxGIint sollten die Primerpaare für Fragment zwei und drei kein Produkt erzeugen, wie es in S. diastatochromogenes pokOIV der Fall war (siehe Abb. 36, B.

2 und 3). Die erwarteten PCR-Produkte konnten durch eineΔ Agarose-Gelelektrophorese bestätigt werden und somit auch die erfolgreiche Unterbrechung von foxGI. Die Mutanten wurden anschließend hinsichtlich ihrer Foxicin Produktion untersucht und mit S. diastatochromogenes pokOIV verglichen. Bei der Analyse der Foxicin Produktion von S. diastatochromogenes pokOIV warΔ bei einer Retentionszeit von 16 min der Foxicin A Peak bei 310 nm zu sehen (siehe ΔAbb. 37, S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint A kein Foxicin

A.detektiert Δ, während werden bei konnte (siehe Abb. 37, A. A).Δ S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132- foxGIint B zeigte hingegen noch eine leichte Foxicin A Produktion (siehe ΔAbb. 37, A. B). Die Flächen unter den Foxicin A Peaks bei 310 nm wurden zudem quantitativ und in Triplikaten verglichen (siehe Abb. 37, B.). Dazu wurden die Extrakte in 100 % MeOH gelöst, wobei sich das exakte Volumen MeOH aus dem Trockengewicht errechnete. Zum Vergleich der Foxicin Produktion wurde der Foxicin A Peak bei 310 nm integriert.

Abb. 37: Vergleich der Foxicin A Produktion zwischen S. diastatochromogenes ΔpokOIV Δ und den Mutanten S. diastatochromogenes ΔpokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint A und B; A. Vergleich der HPLC-Analyse der Rohextrakte; B. Vergleich der AuC der Foxicin A Peaks bei 310 nm; n=3

113 Ergebnisse

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass foxGI, aufgrund der Integration von pKC1132-foxGIint nicht mehr als funktionales Protein exprimiert wurde und somit nicht mehr an der Biosynthese von Foxicin teilhaben konnte.

I. 3. Die Deletion von foxGI mit dem CRISPR-Cas9 System führt zu einer Foxicin Nullmutante

Die Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase FoxGI sollte mit Hilfe des CRISPR-Cas9 Systems deletiert werden. Das Plasmid pCRISPR-Cas9 wurde von PD Dr. Tilmann Weber (DTU Biosustain, Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainibility, Technical University of Denmark) zur Verfügung gestellt123. Die Klonierung von pCRISPR-Cas9-foxGI wurde in Kapitel B. II. 4. 7. 7 beschrieben und die Durchführung der Deletion ist in Kapitel B. II. 4. 5. 2 zu finden. Die einzelnen Schritte der Klonierung wurden durch PCR oder Restriktion überprüft. Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophoresen sind in der Abb. 38 gezeigt. Die sgRNAs 2-4 wurden amplifiziert (Abb. 38, A. 1-4; 128 bp bzw. 125 bp) und im Rahmen der Diplomarbeit von Maxie Schmitt über NcoI und SnaBI mit pCRISPR-Cas9 ligiert (Abb. 38, A. 5; 327 foxGI wurden für den homology-directed repair (HDR) über StuIbp. in pCRISPR-Cas9-sgRNA2Die und Bereiche von kloniert (Abb. 38, A. 6; 2956 bp und 9549 bp).

Abb. 38: Agarosegelelektrophorese der Klonierungsschritte von pCRISPR-Cas9-foxGI (A.), PCR-Kontrolle der CRISPR-Mutante (B. 1) im Vergleich zu S. distatochromogenes ΔpokOIV B. Δ und schematische Darstellung der foxGI Deletion durch die Cas9 Endonuklease (C.) A| 1-4: PCR der sgRNA 2 (128 bp), sgRNA 3 (128 bp), sgRNA (125 bp); 5: PCR von pCRISPR-Cas9-sgRNA2 mit sgRNA_check und sgRNA_rv (327 bp); 6: pCRISPR-Cas9-foxGI mit NotI geschnitten (2956 bp und 9549 bp); B| PCR mit dem Primerpaar G3P_for/G3P_rev; Δ: 1529 bp bp; 1: 82 bp; L1| 100 bp Ladder (NEB); L2| 50 bp Ladder (NEB); L3| 1 kb Ladder (NEB); C| grün: Cas9 Endonuklease; gelb: sgRNA; blau: foxGI mit -rev.

und flankierenden Bereichen; Pfeile: Bindestellen der Primer GP_for/GP Das Plasmid pCRISPR-Cas9-foxGI wurde durch intergenerische Konjugation in S. diastatochromogenes pokOIV übertragen. Die Transkription der Endonuklease Cas9 wurde in den resultierten ExkonjugantenΔ durch Thiostrepton induziert und die Mutanten wurden anschließend durch PCR auf die Deletion von foxGI überprüft. Dazu wurde das Primerpaar G3P_for und G3P_rev verwendet. Die erwartete Bande in S. diastatochromogenes pokOIV war 1592 bp groß, die Bande in S. diastatochromogenes pokOIV foxGI sollte 82 Δ bp entsprechen. Die Ergebnisse der PCR sind in der Abb. 38 zu sehen.Δ Das Ergebnis, Δ der PCR von S. diastatochromogenes

114 Ergebnisse

pokOIV entsprach den Erwartungen (Abb. 38, B. S. diastatochromogenes pokOIV foxGI wurdeΔ die erwartete Bande aufgrund ihrer geringenΔ, Größe bei nicht visualisiert (Abb.Δ 38, B. 1)., Δ Die CRISPR-Mutanten wurden anschließend zur Analyse der Foxicin Produktion, wie gewohnt in HA-Medium, kultiviert und mit Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte wurden durch HPLC-MS analysiert und mit der Foxicin-Produktion von S. diastatochromogenes pokOIV verglichen. In

S. diastatochromogenes pokOIV foxGI konnten zwei neue Peaks, mit einerΔ Retentionszeit von 18 min und 18,6 min, detektiertΔ , Δ werden (siehe Abb. 39, A. graue und rote Markierung). Als zugehörige Massen wurden für beide Peaks 330,3 M-H+ und 331,3 M-H+ detektiert (siehe Abb. 39, C.). Foxicin besitzt eine Retentionszeit von 16 min und eine Masse von 345 M-H+. Im Extrakt von S. diastatochromogenes pokOIV wurde Foxicin anhand seiner Retentionszeit, der Masse und des UV/Vis Spektrums identifiziertΔ (siehe Abb. 39, A.). In der Abb. 39, B. sind die UV/Vis Spektren der Peaks bei 18 min und 18,6 min, sowie das UV/Vis Spektrum von Foxicin A dargestellt (Abb. 39, C.).

Abb. 39: Analyse der Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV, ΔfoxGI im Vergleich zu S. diastatochromogenes ΔpokOIV. A| HPLC-Analyse der Extrakte von S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI und S. diastatochromogenes pokOIV; blau: Foxicin (Retentionszeit: 16 min); grau: unbekannter Peak (Retentionszeit: 18 min) rot: unbekannter Peak (Retentionszeit: 18,6 min); B| UV/Vis Spektren der unbekanntenΔ Δ Peaks aus S. diastatochromogenes ΔpokOIV, foxGI 1 (rot) und 2 (schwarz) verglichen mit dem UV/Vis Spektrum von Foxicin (blau); C| detektierte Massen der unbekannten Peaks aus S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI Δ Δ Δ Δ

115 Ergebnisse

Die Deletion von foxGI durch das CRISPR-Cas9 System führte zu Foxicin Nullmutanten. In den Mutanten wurden zudem zwei, bislang unbekannte Peaks detektiert. Dieses Ergebnis wurde in elf von insgesamt zwölf untersuchten Mutanten nachgewiesen.

I. 4. Untersuchungen zur FkbH-ähnlichen Domäne foxFLD von FoxBII

Die FkbH-ähnliche Domäne foxFLD von FoxBII wurde durch in silico Analysen untersucht und anschließend in E. coli heterolog produziert. Die rekombinante foxFLD wurde in einem in vitro Beladungsassay verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 4), wobei die Beladung mit einer Glyceryl-Einheit durch HPLC-MS analysiert wurde. Des Weiteren wurden Tmn16, ebenfalls ein FkbH-ähnliches Protein und Tmn7a, ein ACP des Tetronomycin BCGs, produziert, aufgereinigt und in dem gleichen in vitro Assay verwendet. Die Analyse dieser Probe mittels HPLC-MS diente später als Positivkontrolle. Das Beladungsassay, sowie die nachfolgenden Analysen wurden im Department for Biochemistry, University of Cambridge, mit der Unterstützung von Dr. Hui Hong durchgeführt.

I. 4. 2. 1 In silico Analysen der FkbH-ähnlichen Domäne foxFLD

Am C-Terminus von FoxBII befindet sich eine Domäne mit Ähnlichkeit zur FkbH-Domäne des FK520 (auch Ascomycin) BGCs aus Streptomyces hygroscopicus (Accession: AAF86387.1)76,175. Aus diesem Grund wurde die Domäne des fox-Clusters im Folgenden foxFLD (FkbH-like domain) genannt. Neben FkbH sind weitere FkbH-ähnliche Proteine bekannt, die Glycerin-ähnliche Vorläufermoleküle erkennen und in die naszierende Polyketidkette inkorporieren können. Die Aminosäuresequenzen von ZmaN der Zwittermicin A Biosynthese aus Bacillus cereus (Accession: ACM79809.1)75, OzmB der Oxazolomycin Biosynthese aus S. sp KBFP-2025 und S. albus JA3453 (Accession: ABA39082.2)78, GdmH der Geldanamycin Biosynthese aus S. hygroscopicus (Accession: ABI93783.1)79, BryA der Bryostatin Biosynthese aus Candidatus Endobugula sertula (Accession: AAT48869.1)176, ChlD1 der Chlorothricin Biosynthese aus S. antibioticus (Accession: AAZ77703.1)82 und Tmn16 der Tetronomycin Biosynthese aus Streptomyces sp. NRRL 11266 (Accession: BAE93736.1)5 wurden mit den Sequenzen von FkbH und der foxFLD verglichen (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). In der Abb. 41 ist das Sequenzalignment zu sehen. Die konservierten Bereiche sind farblich hervorgehoben (siehe Abb. 41, grün und blau). Abb. 40: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von ChlD1, Tmn16, FoxBII_FLD, BryA (partiell), ZmaN, Die Aminosäuresequenzen von BryA, Tmn16 FkbH, GdmH und OzmB. Erstellt durch Neighbour Joining.

116 Ergebnisse und ChlD1 wurden, der besseren Darstellung wegen, am N-Terminus gekürzt. Alle Proteine zeigten ein konserviertes DXDX(T/V) Motiv, charakteristisch für die Haloacid Dehalogenase (HAD) Superfamilie, mit konservierter Asparaginsäure (D) für die Dephosphorylierung des 1,3-BPG Vorläufers (siehe Abb. 41, grüne Markierung). Zudem besitzen alle acht Proteine ein konserviertes Cystein über welches die aktivierte Carboxylgruppe der Phosphoglycerat-Einheit kovalent gebunden wird (siehe Abb. 41, blaue Markierung). Anhand der Aminosäuresequenzen wurde ein phylogenetischer Baum erstellt (http://www.phylogeny.fr/143,144; siehe Abb. 40). Dabei ist deutlich zu erkennen, dass die foxFLD große Ähnlichkeit zu Tmn16 (33,53 % Identität), ChlD1

Abb. 41: Sequenzalignment von Proteinen oder Domänen mit HAD-Motiv aus verschiedenen BCGs. Foxicin (FoxBII_FLD), FK520 bzw. Ascomycin (FkbH), Zwittermicin A (ZmaN), Oxazolomycin (OzmB), Geldanamycin (GdmH), Bryostatin (partielle Sequenz von BryA*), Chlorithricin (ChlD1*) und Tetronomycin (Tmn16*). Konserviertes DXDX(T/V) HAD-Motiv grün markiert, konserviertes Cystein blau markiert; Proteinsequenzen mit Asterisk (*) markiert wurden zur übersichtlichen Darstellung am N-Terminus gekürzt.

117 Ergebnisse

(32,07 % Identität) und BryA (31,13 % Identität) hat. OzmB (29,78 % Identität), GdmH (28,53 % Identität), ZmaN (26,27 % Identität) und FkbH (26,33 % Identität) zweigen schon früher ab und sind daher verwandtschaftlich weiter entfernt. Aufgrund der hohen Sequenzidentität und der konservierten Sequenzbereiche, wurde angenommen, dass die foxFLD 1,3-BPG als Substrat erkennt, dephosphoryliert und über das Cystein kovalent bindet.

Im Kapitel C. I. 4. 2. 2 wird die Produktion und Aufreinigung der foxFLD, von Tmn16 und Tmn7a beschrieben. Die Ergebnisse der in vitro -Phosphopantetheinylierung von Tmn7a und die

Beladung von Tmn16 und foxFLD sind in den Kapiteln C. I. 4. 2. 3, C. I. 4. 2. 4 und C. I. 4. 2. 5 aufgeführt.

I. 4. 2. 2 Produktion und Aufreinigung von foxFLD, Tmn16 und Tmn7a

Die enzymatische Funktion der foxFLD wurde in einem in vitro Beladungsassay untersucht. Tmn16 und Tmn7a dienten dabei als Positivkontrolle. Die Produktion und die Aufreinigung der FLD des fox-Clusters wurden im Kapitel B. II. 5. 4 beschrieben. Das Vorgehen mit Tmn16 und Tmn7a wurde in Sun et al. (2008) beschrieben und im Rahmen dieser Arbeit leicht modifiziert (siehe Kapitel B. II. 5. 4).

Abb. 42: SDS-PAGE der Aufreinigung von Tmn16 (A.) und Tmn7a (B.) mit N-terminalem His6- Tag. PL| Proteinleiter (Precision Plus Protein Standard); SN| löslicher Überstand nach dem Zellaufschluss; P| unlösliche Bestandteile nach dem Zellaufschluss; DF| Durchfluss; W 1-2| Waschfraktion mit 10 mM Imidazol; W 3-4| Waschfraktion mit 40 mM Imidazol; E 1-5| Elution mit 80 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM Imidazol

Tmn16 mit N-terminalem His6-Tag, wurde in E. coli BL21 (DE3) produziert. Zur Produktion von Tmn16 wurde E. coli BL21 (DE3) x pYH94 nach der Zugabe des Induktors IPTG über Nacht bei 18 °C und 180 rpm kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 3), aufgeschlossen und anschließend wurde Tmn16 mit Ni2+-Agarose aus dem löslichen Überstand aufgereinigt (siehe Kapitel B. II. 5. 4). Die Elutionsfraktionen E 2-5, die das 70,987 kDa

118 Ergebnisse große Tmn16 (siehe Abb. 42, A.) enthielten, wurden mit einem 30 000 MWCO Konzentrator eingeengt und in ST-Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,5) umgepuffert. Es konnten 5,4 mg/mL bzw. 76,1 µM Tmn16 aufgereinigt werden. Nach der Zugabe von 10 % Glycerin wurde Tmn16 bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.

Das 10,093 kDa große ACP Tmn7a des Tetronomycin BCG wurde ebenfalls in E. coli BL21 (DE3) produziert. E. coli BL21 (DE3) x pYH185 wurde, nach der Zugabe von IPTG, zur Proteinproduktion über Nacht bei 18 °C und 180 rpm kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und anschließend aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 3). Tmn7a wurde mit Ni2+-Agarose aus dem löslichen Überstand aufgereinigt (siehe Kapitel B. II. 5. 4). Die Fraktionen W 2-3 und E 1-2 (siehe Abb. 42, B.) wurden vereinigt, mit einem 5 000 MWCO Konzentrator aufkonzentriert und in ST-Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,5) umgepuffert. Es wurden 2,9 mg/mL bzw. 28,73 µM Tmn7a aufgereinigt. Die Proteinlösung wurde mit 10 % Glycerin versetzt und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.

Abb. 43: Aufreinigung der FkbH-ähnlichen Domäne mit N-terminalem His6-Tag aus E. coli Codon Plus RP x pL1SL2. A. SDS-PAGE Analyse der Ni2+-Aufreinigung der FkbH-ähnlichen Domäne; PL| Proteinleiter (Protein Marker VI (10 - 245); E 1-5| Elutionsfraktionen B| Gelfiltration von E 3-5; PL| Proteinleiter (Protein Marker VI (10 - 245); G 1-4| gesammelte Fraktionen der Gelfiltration

Die foxFLD wurde, wie im Kapitel B. II. 4. 7. 1 beschrieben, in den Expressionsvektor pET28a kloniert. Mit Hilfe von Testexpressionen wurden die besten Bedingungen für die Produktion der

119 Ergebnisse foxFLD mit N-teminalem Hexahistidin-Tag ermittelt (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1). E. coli Codon Plus RP x pL1SL2 x pET28a-N-fkbH wurde in 2 L TB-Medium bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Nach Induktion der Proteinproduktion mit IPTG, wurde die Kultur bei 18 °C und 180 rpm über Nacht weiter kultiviert. Das genaue Vorgehen wurde im Kapitel B. II. 5. 4 beschrieben. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschall aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 3).

2+ Die foxFLD mit N-terminalem His6-Tag wurde mit Ni -Agarose aufgereinigt (siehe Kapitel B. II. 5. 4) und konnte mit 150-500 mM Imidazol eluiert werden. Die Elutionsfraktionen E 3-5 wurden vereint, aufkonzentriert und anschließend durch eine Größenausschlusschromatographie weiter aufgereinigt (siehe Abb. 43, A.). Die Fraktionen G 2-4 der Größenausschlusschromatographie wurden vereint, aufkonzentriert und in ST-Puffer (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7,5) umgepuffert. Es wurden 1,056 mg/mL bzw. 26,55 µM der FkbH-ähnlichen Domäne aufgereinigt, die dann direkt im in vitro Beladungsassay verwendet wurden (siehe Kapitel C. I. 4. 2. 5).

120 Ergebnisse

I. 4. 2. 3 In vitro -Phosphopantetheinylierung von apo-Tmn7a

Am N-Terminus von Tmn7a befindet sich ein konserviertes Serin, das posttranslational modifiziert wurde -Phosphopantetheinyl - Rests von

Coenzym A wurde .das Durch inaktive das apo Anhängen-Enzym zur eines aktiven holo-Form umgewandelt.PPT Für die in vitro -Phosphopantetheinylierung von apo-Tmn7a wurde die -Transferase Sfp aus Bacillus

subtilis verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 4). Die in vitro PPT-Phosphopantetheinylierung wurde durch HPLC-MS Analyse überprüft. In der Abb. 44 ist das Ergebnis der HPLC-MS Analysen dargestellt, wobei die Chromatogramme (Mikroabsorptionseinheiten über die Zeit) oben und in der Mitte die relative Abundanz über die Zeit gezeigt wurden. Die untere Darstellung zeigt die relative Abundanz über das Masse-/Ladungsverhältnis. Die Dekonvolution des Masse-/Ladungsverhältnisses wurde mit dem Computerprogramm MagTran 1.03b2 (siehe Tab. 26) durchgeführt. Die absolute Molekülmasse von apo-Tmn7a beträgt 10 093 Da (siehe Abb. 44, A), die Molekülmasse des holo-Enzyms beträgt 10 434 Da (siehe Abb. 44, B). Der Unterschied von 341 Da entspricht dem -Rest. Durch die HPLC-MS Analyse wurde gezeigt, dass eine

100 %-ige Umwandlung vonPPT apo-Tmn7a zu holo-Tmn7a stattfand. Das aktivierte holo-Tmn7a wurde dann im in vitro Beladungsassay mit Tmn16 eingesetzt (siehe Kapitel C. I. 4. 2. 4)

Abb. 44: HPLC-MS Analyse der in vitro -Phosphopantetheinylierung von apo-Tmn7a zu holo-Tmn7a. A. Messung von apo-Tmn7a; oben| Chromatogramm, Mikroabsorptionseinheiten über die Zeit; Mitte| relative Abundanz über die Zeit; unten| relative Abundanz über dem Masse/Ladungsverhältnis; berechnete Molekülmasse aus den Mehrfachladungen: 10 093 Da. B. Messung von holo-Tmn7a nach der in vitro -Pantetheinylierung; oben| Chromatogramm, Mikroabsorptionseinheiten über die Zeit; Mitte| relative Abundanz über die Zeit; unten| relative Abundanz über dem Masse/Ladungsverhältnis; berechnete Molekülmasse aus den Mehrfachladungen: 10 434 Da

121 Ergebnisse

I. 4. 2. 4 In vitro Beladung von holo-Tmn7a durch Tmn16

Im in vitro Beladungsassay wurde D-3-Phosphoglycerat von einer D-3-Phosphoglycerat Phosphokinase, unter der Hydrolyse von ATP, zu 1,3-BPG phosphoryliert (siehe Kapitel B. II. 5. 6. 4). Das FkbH-ähnliche Protein Tmn16 dephosphoryliert 1,3-BPG und bindet dieses gleichzeitig über die aktivierte Carboxygruppe kovalent an das konservierte Cystein. Das resultierende Glyceryl-Tmn16 überträgt die Glyceryl-Einheit auf das aktivierte holo-Tmn7a. In der Abb. 45 sind die Ergebnisse der HPLC-MS Messung des Beladungsassays zu sehen. Abb. 45, B. zeigt das Massenspektrum des großen Peaks aus Abb. 45, A. Das Spektrum entspricht dem Glyceryl-S- Tmn7a. Die Dekonvolution des Massenspektrums ergab eine Molekülmasse von 10 521 Da. Das ergibt einen Unterschied von 87 Da im Vergleich zu den 10 434 Da des holo-Tmn7a. Bei einer erfolgreichen Beladung von holo-Tmn7a durch Glyceryl-Tmn16 wurde ein Massenunterschied von 88 Da erwartet. Die Ergebnisse zeigen eine erfolgreiche Beladung von holo-Tmn7a durch Tmn16.

Abb. 45: Ergebnis der HPLC-MS Analyse der Beladung von holo-Tmn7a zu Glyceryl-S-Tmn7a durch Tmn16a. A| Chromatogramm des in vitro Beladungsassays; Peak zwischen 3,5-5 min entspricht Glyceryl-S-Tmn7a (Mikroabsorptionseinheiten über die Zeit); B| Massenspektrum des Glyceryl-S-Tmn7a Peaks von A|; 10 521 Da nach der Dekonvolution ermittelt entspricht der Masse von Glyceryl-S-Tmn7a.

122 Ergebnisse

I. 4. 2. 5 In vitro Beladungsassay mit der FkbH-ähnlichen Domäne des fox-Clusters

Die rekombinante foxFLD wurde, wie zuvor Tmn16, für das in vitro Beladungsassay verwendet, das im Kapitel B. II. 5. 6. 4 beschrieben wurde. Dafür wurde foxFLD zunächst mittels HPLC-MS analysiert um die Detektion zu optimieren. Die Abb. 46 zeigt das Ergebnis der foxFLD Detektion. Die erwartete Masse betrug 39 763 Da und es wurden nach der Dekonvolution des Massenspektrums die Massen 39 662,7 Da, 39 691,9 Da, 39 720,2 Da, 39 754,8 Da, 39 776,9 Da und 39 806 Da detektiert (siehe Abb. 46). Somit wurde foxFLD durch die HPLC-MS erfolgreich detektiert und anschließend in dem in vitro Beladungsassay verwendet.

Abb. 46: Ergebnis der HPLC-MS Analyse der FkbH-ähnlichen Domäne des fox-Clusters. links: relative Abundanz über die Zeit; rechts: relative Abundanz über dem Masse/Ladungsverhältnis, das Massenspektrum ergab nach der Dekonvolution die folgenden Massen 39 662,7 Da, 39 691,9 Da, 39 720,2 Da, 39 754,8 Da, 39 776,9 Da und 39 806,0 Da.

Die Beladung von foxFLD mit der Glyceryl-Einheit (+ 88 Da) konnte nicht gezeigt werden (Daten nicht gezeigt). Kleine Proteine sind durch HPLC-MS einfacher zu detektieren als größere. Aus diesem Grund wurde in einem weiteren Experiment getestet, ob die 39 763 Da große foxFLD das 10 433 Da große holo-Tmn7a des Tetronomycin BGCs mit der Glyceryl-Einheit beladen kann. Dazu wurde das Assay mit foxFLD zusätzlich mit holo-Tmn7a inkubiert und anschließend durch HPLC-MS analysiert. In der Abb. 47 wurden die Ergebnisse der HPLC-MS Analyse dargestellt. Bei dem Peak, der bei 3,5-5 min im Chromatogramm zu sehen war (siehe Abb. 47, A.), wurden nach der Dekonvolution des Massenspektrums zwei Massen detektiert (siehe Abb. 47, B. und C.). Die detektierten 10 433 Da entsprachen der Masse des holo-Tmn7a, die detektierten 10 531 Da wiesen auf eine Beladung von Tmn7a durch foxFLD hin, liegen allerdings 10 Da über der erwarteten Masse von 10 521 Da für Glyceryl-S-Tmn7a.

123 Ergebnisse

Abb. 47: Ergebnis der HPLC-MS Analyse der Beladung von holo-Tmn7a zu Glyceryl-S-Tmn7a durch foxFLD. A| Chromatogramm des in vitro Beladungsassays; Peak zwischen 3,5-5 min entspricht holo-Tmn7a und Glyceryl-S-Tmn7a (Mikroabsorptionseinheiten über die Zeit) und relative Abundanz über die Zeit; B| Massenspektrum des holo-Tmn7a Peaks von A|; 10 433 Da nach der Dekonvolution ermittelt entspricht der Masse von holo-Tmn7a; C| Massenspektrum dem Glyceryl-S-Tmn7a Peak aus A|; 10 531 Da nach der Dekonvolution ermittelt, entspricht der Masse des holo-Tmn7a + 98 Da.

I. 5. Untersuchungen der PCP-Domäne des fox-Clusters

In Greule et al. (2017) wurde postuliert, dass foxFLD die Glyceryl-Einheit auf die PCP-Domäne von FoxBIII überträgt. Die PCP-Domäne wurde zunächst in silico analysiert und anschließend heterolog in E. coli produziert und aufgereinigt. Das rekombinante PCP könnte dann für weitere in vitro Untersuchungen der Foxicin Biosynthese verwendet werden.

I. 5. 1 In silico Untersuchungen der PCP-Domäne des fox-Clusters

FoxBII enthält zwei Domänen, eine PCP-Domäne und eine TE-Domäne (siehe Kapitel F. II, Abb. 92). Die foxFLD belädt die PCP-Domäne mit einer Glyceryl-Einheit. Die Aminosäuresequenz des PCPs weist das konservierte GGXS-Motiv auf, an dem das apo-PCP durch eine -Phosphopantetheinylierung zum holo-PCP aktiviert werden kann (siehe Kapitel F. II, Abb. 92).

Um weitere Informationen zur postulierten Enzymfunktion der PCP-Domäne des fox-Clusters gewinnen zu können, wurde die Aminosäuresequenz mit bekannten ACPs verglichen, die durch

124 Ergebnisse

FkbH-ähnliche Proteine mit Glyceryl-Einheiten beladen werden. Die Aminosäuresequenz der PCP-Domäne wurde mit Asm14 der Ansamitocin Biosynthese aus Actinosynnema pretiosum subsp. auranticum (Accession: AAM54092), mit ChlD2 der Chlorothricin Biosynthese aus S. antibioticus Abb. 48: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von Tmn7a, ChlD2, FoxBIII_CP, ctg1_944, GdmJ, (Accession: AAZ77704.1), mit ctg1_944 des BGCs 7 ZmaD, FkbJ und Asm14. Erstellt durch Neighbour Joining aus S. collinus Tü365, mit FkbJ der FK520 bzw. Ascomycin Biosynthese aus S. hygroscopicus (Accession: AAF86389.1), mit GdmJ der Geldanamycin Biosynthese aus S. hygroscopicus (Accession: ABI93785.1), mit Tmn7a der Tetronomycin Biosynthese aus S. sp. NRRL11266 (Accession: BAF73715) und ZmaD der Zwittermicin A Biosynthese aus B. cereus (Accession: AAD40107.1) mit Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/, siehe Tab. 27) verglichen (siehe Abb. 49). Alle -Phosphopantetheinylierung stattfindet,

Domänenworüber die zeigen Glyceryl-Einheit ein konserviertes kovalent Serin gebunden an dem wird die (siehe Abb. 49, grüne Markierung). Anhand der Aminosäuresequenzen wurde ein phylogenetischer Baum erstellt (http://www.phylogeny.fr/143,144, siehe Abb. 48). Das PCP von FoxBIII zeigt die größte Ähnlichkeit zu ctg1_944 (76 % Identität) und ist des Weiteren ähnlich zu Asm14 (36,96 % Identität), FkbJ (32,61 % Identität), GdmJ (32,61 % Identität), Tmn7a (31,82 % Identität) und ChlD2 (31,82 % Identität). Die geringste Homologie zeigt sich im Vergleich mit ZmaD (19,57 % Identität).

Abb. 49: Sequenzalignment von ACP- bzw. PCP-Domänen mit Spezifität zu Glyceryl-Einheiten aus den BCG von. Foxicin (FoxBIII_CP), (Asm14), Chlorothricin (ChlD2), dem unbekannten Naturstoff aus S. collinus Tü365 (ctg1_944), FK520 bzw. Ascomycin (FkbJ), Geldanamycin (GdmJ), Tetronomycin (Tmn7a) und Zwittermicin A (ZmaD), grün markiert: konserviertes Serin.

Aufgrund der hohen Sequenzidentitäten wurde angenommen, dass das PCP von FoxBIII ebenfalls an der Inkorporation der Glyceryl-Einheit beteiligt ist.

125 Ergebnisse

I. 5. 2 Produktion und Aufreinigung des PCPs von FoxBIII

Die genaue Enzymfunktion von FoxBIII_CP kann in in vitro Assays, wie z.B. den in Kapitel C. I. 4. 2. 4 und Kapitel C. I. 4. 2. 5 beschriebenen, untersucht werden. Zunächst wurden die Expressionsvektoren pET28a-N-PCP und pET28a-N-PCPmini, wie in Kapitel B. II. 4. 7. 2 beschrieben, kloniert. Die folgenden Experimente zur N-PCP Produktion und Aufreinigung wurden im Rahmen der Bachelorarbeit von Janina Hauser durchgeführt. Das Plasmid pET28a-N-PCP wurde für Testexpressionen in E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 verwendet (siehe Kapitel B. II. 5. 1. 1), um die optimalen Bedingungen für die Proteinproduktion herauszufinden. Anschließend wurde E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RP x pL1SL2 x pET28a-N-PCP in 1 L LBAmp, Kan, Cm, 0,1 % Glc-Medium zur Produktion des N-PCPs kultiviert. Nach Erreichen der

OD600 nm von 0,6 wurde die Proteinproduktion mit IPTG induziert und die Kultur wurde weitere 3 h bei 28 °C und 180 rpm kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und mit Ultraschall aufgeschlossen (siehe Kapitel B. II. 5. 2. 1. 3). Die Aufreinigung der löslichen und unlöslichen Fraktionen wurde in Kapitel B. II. 5. 5 beschrieben. Die Analyse der einzelnen Fraktionen durch SDS-PAGE ist in der Abb. 50 dargestellt. Das 39,013 kDa große N-PCP wurde aus der unlöslichen Fraktion mit 80-150 mM Imidazol eluiert (siehe Abb. 50, C.). Die Elutionsfraktionen E 2-3 wurden vereinigt, mit einem 10 000 MWCO Konzentrator eingeengt und in ST-Puffer umgepuffert. Nach der Zugabe von 10 % Glycerin kann das aufgereinigte N-PCP bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert werden.

Abb. 50: SDS-PAGE Analyse der N-PCP (39,013 kDa) Aufreinigung. A| Aufreinigung der löslichen Fraktion; DF: Durchfluss; W 1-2: Waschfraktion mit 10 mM Imidazol; W 3-4: Waschfraktion mit 40 mM Imidazol; E 1: Elution mit 80 mM Imidazol; B| Analyse der unlöslichen Bestandteile nach der Zentrifugation (P); C| Aufreinigung des N-PCPs aus Einschlusskörperchen; DF: Durchfluss; W 1-3: Waschfraktionen mit 10 mM Imidazol; E 1-2: Elution mit 80 mM Imidazol; E 3: Elution mit 150 mM Imidazol.

126 Ergebnisse

I. 6. Die Fütterung von 13C-markierten Vorstufen identifiziert den Ursprung der C-Atome im Foxicin Gerüst

Durch die Fütterung von 13C-markierten Vorstufen können tiefere Einblicke in die Biosynthese eines bestimmten Naturstoffes gewonnen werden. Im Falle von Foxicin A sollte, durch die

13 Fütterung von [ C6]-Glucose, der Ursprung des para-Quinonrings geklärt werden. Des Weiteren sollte zur Kontrolle [1-13C]-Acetat gefüttert werden. Durch verschiedene Vorexperimente wurden die optimalen Bedingungen für die Fütterungsexperimente ermittelt.

Abb. 51: Quantitativer Vergleich der Foxicin A (links) und Foxicin B (rechts) Produktion in den Produktionsmedien HA, SG, DNPM, NL4 und NL111.

Zunächst wurde S. diastatochromogenes pokOIV in verschiedenen Produktionsmedien kultiviert und die Produktion von Foxicin A und B Δverglichen (siehe Abb. 51). Dazu wurden die Extrakte in 100 % MeOH gelöst, wobei sich das exakte Volumen MeOH, zum quantitativen Vergleich der Produktion, aus dem Trockengewicht errechnete. Zum Vergleich der Foxicin-Produktion wurde der Foxicin A Peak bei 310 nm integriert. Die größte Foxicin A und B Produktion wurde in DNPM- Medium erreicht. In HA-Medium wurde ebenfalls eine hohe Foxicin A Produktion erreicht. Interessanterweise ist die Produktion von Foxicin B in SG-Medium höher als die von Foxicin A.

13 DNPM-Medium enthält 4 % Dextrin, das mit der [ C6]-Glucose konkurrieren würde. Für die Fütterungsexperimente wurde aus diesem Grund HA-Medium mit 0,4 % Glucose ausgewählt.

Anschließend wurde eine Fermentationskurve erstellt, um den Zeitraum der Foxicin A Produktion einzugrenzen (siehe Abb. 52). S. diastatochromogenes Tü6028 produzierte nach drei Tagen der Kultivierung die größte Menge an Foxicin A (siehe Abb. 52, orange), während Polyketomycin nach sieben Tagen der Kultivierung das Maximum erreichte (siehe Abb. 52, schwarz). S. distatochromogenes pokOIV erreichte nach sieben Tagen die größte Foxicin A Produktion

13 (siehe Abb. 52, rot). AnhandΔ dieser Ergebnisse sollte die Fütterung von [ C6]-Glucose an Tag vier der Kultivierung beginnen und bis zum sechsten Tag andauern (siehe Kapitel B. II. 6. 1. 1). Die Fütterung von [1-13C]-Acetat sollte an Tag drei der Kultivierung beginnen und ebenfalls bis Tag sechs andauern (siehe Kapitel B. II. 6. 1. 1). Die Ergebnisse der Fütterung von [13C6]-Glucose sind

127 Ergebnisse im Kapitel C. I. 6. 1 beschrieben und die Ergebnisse der Fütterung von [1-13C]-Acetat sind im Kapitel C.I. 6. 2 dargestellt.

2 0 0 0 Tü6028 - Polyketomycin 4 0 0 0 0 C u A Tü6028 - Foxicin A

nm n 4 5 2  p o k O IV - Foxicin A 1 5 0 0 3 0 0 0 0

Pol omycin c y m to e k ly o P

Foxicin1 A 0 0 0 2 0 0 0 0

3 2 0 n m 5 0 0 1 0 0 0 0 A u C

0 0 2 4 6 8 T a g Abb. 52: Vergleich der Naturstoffproduktion von Polyketomycin und Foxicin in S. diastatochromogenes Tü6028 WT und S. diastatochromogenes ΔpokOIV über acht Tage. AUC254 nm von Polyketomycin (schwarz), AuC320 nm pokOIV (rot); AUC320 nm von Foxicin A aus WT (orange) von Foxicin A aus Δ

128 Ergebnisse

I. 6. 1 Die Fütterung von [13C6]-Glucose

Das Fütterungsschema wurde im Kapitel B. II. 6. 1. 1 beschrieben. Vor der eigentlichen Fütterung

13 mit [ C6]-Glucose wurden die Bedingungen in einem Vorexperiment mit unmarkierter Glucose getestet und mit der Foxicin Produktion in HA-Medium ohne Glucose-Zugabe verglichen (Daten nicht gezeigt). In beiden Kulturen wurden ähnliche Mengen an Foxicin produziert, sodass die Bedingungen für die eigentliche Fütterung übernommen wurden. Am siebten Tag der Kultivierung wurde Foxicin mit Ethylacetat aus dem Kulturüberstand extrahiert (siehe Kapitel B. II. 6. 2) und durch Festphasenextraktion (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 1), präparative HPLC (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 3) und Sephadex LH-20 (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 4) aufgereinigt. Die Ergebnisse der Aufreinigungsschritte sind in ™der Abb. 53 dargestellt. Exemplarisch wurde nur eine Fraktion der Aufreinigung duch Sephadex LH-20 gezeigt, wobei mehrere Fraktionen für die NMR Analyse

13 vereinigt wurden. Insgesamt wurden™ 2,46 mg Foxicin A aus der [ C6]-Glucose Fütterung aufgereinigt, die dann zur NMR-Analyse zu Dr. Thomas Paululat, Department für Chemie und

Abb. 53: HPLC Analysen der Aufreinigung von Foxicin der [13C6]-Glucose Fütterung. A| Rohextrakt nach der Extraktion mit Ethylacetat; B| 65 % MeOH Fraktion der Festphasenextraktion mit Foxicin A; C| 70 % MeOH Fraktion der Festphasenextraktion mit Foxicin A, B und C; D| Foxicin A nach der präparativen HPLC Aufreinigung; E| Foxicin A nach der Sephadex LH-20; F| UV/Vis Spektrum von Foxicin A nach der Sephadex LH-20. Retentionszeit von Foxicin A: 16 min (graue Markierung).

129 Ergebnisse

Biologie, an der Universität Siegen geschickt wurden. Die NMR-Daten wurden im Anhang, unter Kapitel F. II, aufgeführt.

Abb. 54: Relative Häufigkeit des Masse-/Ladungsverhältnisses von Foxicin A (links) und Foxicin A aus der [13C6]-Glucose Fütterung (rechts).

Die relative Häufigkeit des Masse-/Ladungsverhältnisses von unmarkiertem und markiertem Foxicin A ist in der Abb. 54 zu sehen. Bei unmarkiertem Foxicin (Abb. 54, links) können 345,3 m/z und 346,3 m/z gefunden werden. Beim markierten Foxicin A (Abb. 54, rechts) wurde zusätzlich 347,2 m/z gefunden, was auf den Einbau von zwei 13C-Atomen hindeutet. In der Abb. 55 sind die markierten C-Atome innerhalb der Foxicin A Struktur zu sehen. Die C-Atome, die mit einem Asterisk (*) gekennzeichnet wurden, waren 13C-markiert. Die C-Atome, die mit einem Asterisk in Klammern gekennzeichnet wurden, waren möglicherweise 13C markiert. C- und C- intakte Kopplungspaare. Ein möglicher Einbau könnte an Position C-2 stattgefunden haben. D sindabei zeigt C-2 eine mögliche Kopplung mit C-3, allerdings ohne ein klar sichtbares Signal. Auch das Signal von C-11 zeigt einen möglichen Einbau, der allerdings nicht eindeutig ist.

Abb. 55: Struktur von Foxicin A und die markierten Positionen (rot). *| markierte C-Atome; (*) | möglicherweise markierte C-Atome

130 Ergebnisse

I. 6. 2 Die Fütterung von [1-13C]-Acetat

Die Fütterung mit [1-13C]-Acetat wurde im Kapitel B. II. 6. 1. 1 beschrieben. Am siebten Tag der Kultivierung wurde Foxicin durch Ethylacetat extrahiert (siehe Kapitel B. II. 6. 2), anschließend durch Festphasenextraktion fraktioniert (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 1) und schließlich durch präparative Dünnschichtchromatographie weiter aufgereinigt (siehe Kapitel B. II. 6. 3. 2). Als Laufmittel bei der Dünnschichtchromatographie wurde ein Gemisch aus Dichlormethan, MeOH und Ethylacetat im Verhältnis 8:1:1 mit 0.05 % HAc verwendet. Zusätzlich zu den 65 % und 70 % MeOH-Fraktionen der Festphasenextraktion aus der [1-13C]-Acetat Fütterung wurden Foxicin Abb. 56: analytische DC A und B als Referenz aufgetragen (siehe Abb. 56). Für Foxicin A wurde von Foxicin A und B der [1-13C]-Acetat Fütterung. ein Rf-Wert von 0,28 ermittelt, für Foxicin B ein Rf-Wert von 0,68. Für Foxicin A und B zur Kontrolle; 65 % und 70 % die präparative Aufreinigung wurden Foxicin A und B mit einem Spatel MeOH Fraktion der SPE der Fütterung (v. l. n. r.); Pfeile von der DC-Platte herausgekratzt und mit Hilfe von Ethylacetat markieren die Laufstrecke von Foxicin A (u.) und B (o.). extrahiert (siehe Kapitel B. II. 6. 2). Insgesamt wurde ungefähr 1 mg Foxicin A aufgereinigt, das dann zur NMR-Analyse zu Dr. Thomas Paululat, Department für Chemie und Biologie der Universität Siegen, geschickt wurde. Die Menge an Foxicin B war nicht ausreichend für eine NMR Analyse. Die NMR-Analyse von Foxicin A aus der [1-13C]-Acetat Fütterung lieferte keine Ergebnisse, die Acetat als Vorläufer für das Grundgerüst von Foxicin A eindeutig bestätigen konnten (Daten siehe Abb. 96 im Anhang).

Abb. 57: HPLC Analysen der Aufreinigung von Foxicin A der [1-13C]-Acetat Fütterung. A| Rohextrakt nach der Extraktion mit Ethylacetat; B| 65 % MeOH Fraktion der Festphasenextraktion; C| 70 % MeOH Fraktion der Festphasenextraktion; D| Foxicin A nach der präparativen DC; Retentionszeit von Foxicin A: 16 min (graue Markierung).

131 Ergebnisse

II. Untersuchungen zur Regulation der Foxicin Biosynthese in Streptomyces diastatochromogenes ΔpokOIV

Die in silico Analysen der ORFs des fox Clusters, die im Kapitel C. I gezeigt wurden, ergaben zehn putative Regulatorgene. Dabei codiert foxRI für einen putativen Regulator der TetR/AcrR Familie und foxRII für eine putative Sensor-Histidin-Kinase. Das putative Regulatorgen foxRIII codiert für einen DNA-binding response Regulator der LuxR Familie und foxRIV für einen putativern MarR Regulator. Der putative DeoR/GlpR Regulator foxRV wurde im Kapitel C. II. 2 genauer betrachtet. Der putative Regulator der AraC Familie wird durch foxRVI codiert, während foxRVII für eine putative rRNA-Metyhltransferase codiert. Das Regulatorgen foxRVIII codiert für eine putative Dioxygenase, foxRIX für einen putativen Regulator der ROK Familie und foxRX für einen putativen Regulator der TetR/AcrR Familie. In den Kapiteln C. II. 1 und C. II. 2 wurden die Regulatoren genauer untersucht und deren Rolle während der Foxicin-Biosynthese analysiert.

FoxRI und FoxRX gehören zur häufigsten Familie trankskriptioneller Regulatoren, der TetR/AcrR Familie und wurden mit bereits beschriebenen Regulatoren dieser Familie verglichen. Der Vergleich der Aminosäuresequenz wurde in einem

Abb. 58: Phylogenetischer Baum zum Vergleich phylogenetischen Baum veranschaulicht (siehe Abb. von LanK, ArpA, Aur1R, Sco1712, FoxRI, 58). FoxRI besitzt 25,39 % Sequenzidentität mit VarR FoxR10, ActR, SimR und VarR der TetR/AcrR Familie. Erstellt durch Neighbour Joining. (Accession: BAB32408), einem Regulator der Virginiamycin S Biosynthese aus S. virginiae. Zu LanK aus S. cyanogenus S136 (14,88 % Identität; Accession: AAD13556), ArpA aus S. griseus (14.97 % Identität; Accession: Q9ZN78), Aur1R aus Kitasatospora aureofaciens CCM 3239 (16,94 % Identität; Accession: ADM72853), Sco1712 (20,42 % Identität; Accession: NP_733542) und ActR (21,39 % Identität; Accession: 3B6C_B) aus S. coelicolor, SimR aus S. antibioticus (18,65 % Identität; Accession: 3ZQL_A) und FoxRX aus Streptomyces diastatochromogenes pokOIV

(19,34 % Identität) zeigt FoxRI nur geringe Sequenzähnlichkeiten. Die größte SequenzähnlichkeitΔ hat FoxRX zu LanK (25 % Identität), zu Aur1R (22,4 % Identität), zu Sco1712 (21,47 % Identität) und zu ArpA (20,22 % Identität). Die Sequenzidentitäten zu ActR, SimR und VarR liegen mit 14 % deutlich unter den vorangegangen Werten.

FoxRIII gehört zur Familie der LuxR Transkriptionsregulatoren die in der Regel als Aktivatoren der Transkription agieren. Abb. 59: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von RamA, FoxRIII, FomR, ClmR2, AveR, GdmRI Sequenzvergleiche mit bereits bekannten Vertretern und SlnM der LuxR Familie. Erstellt durch ergaben Sequenzidentitäten von 31,82 % zu ClmR2 Neighbour Joining.

132 Ergebnisse aus S. sp. CS40 (Accession: CCC55908), 25,77 % zu AveR aus S. avermitilis (Accession: BAA84600), 20,1 % zu RamA aus Corynebacterium glutamicum (Accession: Q8NML3), 19,25 % zu GdmRI aus S. hygroscopicus (Accession: ABI93791), 18,9 % zu SlnM aus S. lydicus (Accession: AHB62093) und 17,58 % zu FomR aus S. fradiae (Accession: ACG70813). Die Abb. 59 stellt die phylogenetische Untersuchung der Aminosäuresequenzen dar.

Vertreter der MarR Familie, wie FoxRIV, können sowohl Aktivatoren als auch Repressoren der Transkription sein. Sequenzvergleiche auf der Basis der Aminosäurenabfolge zeigten, dass FoxRIV 30,08 % Identität mit AbsC aus S. coelicolor Abb. 60: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von AbsC, FoxRIV, PenR, PntR, PcaV und Sco4513 (Accession: 3ZMD_D), 28,32 % mit PntR aus der MarR Familie. Erstellt durch Neighbour joining. S. arenae TU 469 (Accession: ADO85569), 26,55 % mit PenR aus S. exfoliatus UC5319 (Accession: ADO85585), 26,17 % mit Sco5413 (Accession: 4B8X_A) und 25,47 % mit PcaV aus S. coelicolor aufweist (Accession: 4G9Y_A). Diese Sequenzidentitäten waren die Grundlage für die Erstellung des phylogenetischen Baums, der in der Abb. 60 zu sehen ist.

Die Aminosäurenabfolge des Regulators FoxRVI wurde mit weiteren Regulatoren der AraC/XylS Familie verglichen. FoxRVI besitzt 27,32 % und 27,12 % Identität zu GapR aus K. aureofaciens Abb. 61: Phylogenetischer Baum zum Vergleich von GapR, AdpA, NanR4, FoxRVI und RapG der (Accession: AAA91363) und zu NanR4 aus AraC/XylS Familie. Erstellt durch Neighbour joining. S. nanchangensis (Accession: AAP42877). RapG aus S. hygroscopicus177 teilt 25 % Sequenzidentität mit FoxRVI und FoxRVI teilt 22,93 % mit AdpA aus S. griseus (Accession: BAA86265). In der Abb. 61 ist ein phylogenetischer Baum zu sehen, der auf der Basis der Aminosäuresequenzen erstellt wurde.

FoxRV und weitere Mitglieder der DeoR/GlpR Familie transkriptioneller Regulatoren werden im Kapitel C.II. 2 näher betrachtet.

II. 1. Die Überproduktion der fox-Regulatoren in S. diastatochromogenes ΔpokOIV führt zu einer Veränderung der Foxicin-Produktion

Die Rolle der fox-Regulatoren bei der Produktion von Foxicin wurde durch Überexpression der einzelnen Regulatorgene in Streptomyces diastatochromogenes pokOIV untersucht. Dazu wurden die fox-Regulatoren foxRI, foxRII, foxRIV, foxRVI, foxRVII, foxRVIIIΔ , foxRIX und foxRX durch PCR amplifiziert und anschließend in pTESa kloniert (siehe Kapitel B. II. 4. 7. 8). Die Klonierung von

133 Ergebnisse foxRI und foxRVI wurde im Rahmen der Diplomarbeit von Fabienne Gutacker durchgeführt. Die fertiggestellten Plasmide pTESa-foxRI, pTESa-foxRII, pTESa-foxRIV, pTESa-foxRVI, pTESa-foxRVII, pTESa-foxRVIII, pTESa-foxRIX und pTESa-foxRX wurden durch intergenerische Konjugation in Streptomyces diastatochromogenes pokOIV eingebracht und die Integration der Plasmide wurde durch PCR mit dem Primerpaar pTESa_check_fwΔ und pTESa_check_rv überprüft. In der Abb. 62

Abb. 62: Kontrollen der Regulatormutanten durch PCR mit dem Primerpaar pTESa_check_fw/pTESa_check_rv. A| Kontrolle von ΔpokOIV:: pokOIV als Negativkontrolle; 2: pTESa als Positivkontrolle; 3- pokOIV::pTESa; B| Kontrolle pokOIV::pTESa-foxRI (933 bp); 1: pTESa-foxRI als Positivkontrolle; 2: ΔpokOIV pokOIV::pTESapTESa- bpfoxRI erwartet;; C| : Δ pokOIV::pTESa-foxRII pokOIV als: Δ Negativkontrolle; 2: pTESa-vonfoxR ΔII als Positivkontrolle; 3- pokOIV::pTESa-foxRII; D| Kontrolle von alspokOIV:: Negativkontrolle;pTESa-foxR IV: Δ KontrollepokOIV als von Negativkontrolle; Δ 2: pTESa-foxR bpIV erwartet; als Positivkontrolle; : Δ 3- pokOIV::pTESa-foxRIV; E| pokOIV::pTESa-:foxR ΔVI (995 bp pokOIV als ΔNegativkontrolle; 2: pTESa- bpfoxR erwartet;VI : Δ pokOIV::pTESa-foxRVI; F| Kontrolle von pokOIV::: Δ pTESa-foxRVII Kontrolle vonpokOIV Δ als Negativkontrolle; 2: pTESa-foxRVIIerwartet; als Positivkontrolle; : Δ 3-5: pokOIV::pTESa-foxRVII; G| als Positivkontrolle;pokOIV::pTESa-foxRVIII : Δ (931 bp erwartet); 1: pTESa-foxRVIII als Δ pokOIV bp erwartet; als Negativkontrolle; : Δ 3- pokOIV::pTESa-foxRVIII; H| Kontrolle von ΔpokOIV::pTESa-foxRIX Kontrolle von Δ pokOIV als Negativkontrolle 2: pTESa-foxRIX als Positivkontrolle; Positivkontrolle;pokOIV als Negativkontrolle; : Δ 3- pokOIV::pTESa-foxRIX, :I| Δ pokOIV::pTESa-foxRX (1020 bp erwartet);Δ 1: pTESa-foxRX bp erwartet; : ΔpokOIV als Negativkontrolle; 2: pokOIV als Negativkontrolle; 3 - 5: :ΔpokOIV:: Δ pTESa-foxRX; L1: 1 kb Ladder: (NEB); Δ L2: 50 bp Ladder (NEB)Kontrolle von Δ als Positivkontrolle : Δ Δ 134 Ergebnisse wurden die Ergebnisse der PCR dargestellt, wobei die gDNA von S. diastatochromogenes pokOIV als Negativkontrolle verwendet wurde und das entsprechende pTESa KonstruktΔ als Positivkontrolle. In der Abb. 62, A. ist die Kontrolle von S. diastatochromogenes pokOIV::pTESa

(202 bp erwartet) dargestellt, in B. wurde pokOIV::pTESa-foxRI (PCR-Fragment:Δ 933 bp), in C. pokOIV::pTESa-foxRII (PCR-Fragment: Δ 1492 bp), in D. pokOIV::pTESa-foxRIV (PCR-Fragment:Δ pokOIV::pTESa-foxRVI (PCR-Fragment:Δ 995 bp), in F. pokOIV::pTESa-foxRVII bp, (PCR- in E. Δ pokOIV::pTESa-foxRVIII (PCR- Fragment:Δ Fragment:pokOIV::pTESa- foxR bp,IX in (PCR-Fragment: G. Δ 1489 bp) und in I. pokOIV::pTESa- bp,foxRX in(PCR-Fragment: H. Δ 1020 bp) analysiert. Alle Regulatormutanten zeigten die erwartetenΔ Fragmentgrößen.

Die Mutanten wurden, zur Produktion von Foxicin, in 200 mL HAApra 50-Medium für sechs Tage bei 28 °C und 180 rpm kultiviert (siehe Kapitel B. II. 6. 1). Die Kulturen wurden zentrifugiert und die Zellpellets wurde bei 65 °C für drei Tage getrocknet. Der Überstand wurde auf pH 4 eingestellt und Foxicin wurde durch Ausschütteln mit Ethylacetat, wie im Kapitel B. II. 6. 2 beschrieben, aus dem Überstand extrahiert und anschließend ins Trockene einrotiert. Die Extrakte wurden in 100 % MeOH gelöst, wobei sich das exakte Volumen MeOH, zum quantitativen Vergleich der Produktion, aus dem Trockengewicht errechnete. Zum Vergleich der Foxicin Produktion wurde der Foxicin A Peak bei 310 nm integriert (siehe Abb. 63). In den Mutanten S. diastatochromogenes pokOIV::foxRII, pokOIV::foxRVII, pokOIV::foxRVIII pokOIV::foxRIX pokOIV::foxRX konnte

Δkein Foxicin detektiertΔ werden. S. diastatochromogenesΔ , Δ pokOIV::foxRIund produzierte Δ doppelt soviel Foxicin A pokOIV::pTESaΔ und fünfmal soviel Foxicin A als pokOIV::foxRIVals der KonstrollstammpokOIV::foxRVI Δ produzierte 25-mal weniger Foxicin A als ΔpokOIV::foxRI. Die. Der entsprechenden Stamm Δ Chromatogramme der HPLC-Analyse sind im Anhang gezeigt Δ(siehe Abb. 93 in Kapitel F. III).

Abb. 63: Vergleich der Foxicin-Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV::pTESa und den Regulator- Überproduktionsmutanten.

135 Ergebnisse

Die Überproduktion der Regulatoren des fox-Clusters kann die Foxicin Produktion auf positive und negative Art beeinflussen.

II. 2. Analysen des putativen DeoR/GlpR Regulators FoxRV

Das glp Regulon aus E. coli ist zuständig für die Dissimilation von sn-Glycerin-3-Phosphat und dessen Vorläufer Glycerin und Glycerinphosphodiester. Das glp Operon wird durch den glp Repressor GlpR kontrolliert. GlpR bindet an eine Tandemsequenz des Operators (WATKYTCGWW; W kann A oder T sein, K kann G oder T sein und Y ist C oder T178), die zudem mit dem Promotor überlappend ist179. In Anwesenheit des Induktors Glycerin oder Glycerin-3-Phosphat ist die Bindung des Regulators an die DNA vermindert180. In silico Analysen des putativen Regulators FoxRV ergaben eine große Ähnlichkeit zu GlpR. Sequenzvergleiche von

Abb. 64: Alignment von verschiedenen GlpR Regulatoren. FoxRV des fox-Clusters; DeoR aus Streptomyces coelicolor A3 (2); EcGlpR aus Escherichia coli O25b:H4; HiGlpR aus Haemophilus influenzae; IolR aus Bacillus subtilis; YihW aus Escherichia coli O25b:H4. Blau: HTH Motiv; Unterstrichen: HTH-Motiv aus E. coli K12

136 Ergebnisse

FoxRV mit DeoR aus Streptomyces coelicolor A3 (2) (Accession: NP_624611), GlpR aus Escherichia coli O25b:H4 (Accession: ANK03908), GlpR aus Haemophilus influenzae (Accession: NP_439170), IolR aus Bacillus subtilis (Accession: KIX80820), YihW aus E. coli O25b:H4 (Accession: ANK06028) zeigten Sequenzidentitäten von 22,31 % bis 31,87 %. Das helix-turn-helix (HTH) DNA-Bindemotiv aus E. coli K12, charakteristisch für Glp Regulatoren, wurde in allen Regulatoren identifiziert (Abb. 64, blaue Markierung). In der Abb. 65: Konservierte Aminosäuren des HTH-Motivs der GlpR Abb. 65 wurden die Regulatoren aus S. diastatochromogenes Tü6028, S. coelicolor A3 (2), H. influenzae, E. coli O25b:H4, B. subtilis und E. coli K12. Darstellung mit konservierten Aminosäuren des weblogo.berkeley.edu/ HTH-Motivs dargestellt, wobei vor allem die fünf Aminosäuren Serin, Threonin, Arginin und Aspartat streng konserviert vorliegen. Zeng et al. zeigten, dass Glycerin-3-Phosphat von GlpR gebunden werden kann, wodurch die Bindung von GlpR an die DNA verringert wird179. Nicht nur Glycerin-3-Phosphat wirkt als Induktor, sondern auch Glycerin. Die Sequenzvergleiche lassen darauf schließen, dass FoxRV ebenfalls eine Glp Repressorfunktion besitzt. Der Einfluss von Glycerin auf die Foxicin Produktion wurde durch die Zugabe von 1 %, 0,1 % und 0,01 % Glycerin zum Produktionsmedium, analysiert. Das Ergebnis ist in der Abb. 66 zu sehen. S. diastatochromogenes

pokOIV produzierte Foxicin A wie gewohnt in HA-Medium (AuC310 nm = 15 398,5; siehe Abb. 66,

ΔA.). In Anwesenheit von 0,01 % Glycerin produzierte S. diastatochromogenes pokOIV weniger Foxicin A als ohne zusätzliches Glycerin (AUC310 nm = 10 147,3; siehe Abb. 66, B.).Δ Entgegen den

Abb. 66: Analyse der Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV unter Zugabe von Glycerin. A| Foxicin Produktion in HA-Medium ohne die Zugabe von Glycerin; B| mit 0,01 % Glycerin; C| mit 0,1 % Glycerin; D| mit 1 % Glycerin. Graue Markierung: Foxicin A Peak, Retentionszeit: 16 min; gemessen bei 310 nm.

137 Ergebnisse

Erwartungen produzierte S. diastatochromogenes pokOIV in HA-Medium mit 0,1 % und 1 %

Glycerin kein Foxicin A mehr (siehe Abb. 66, C. und D.).Δ Die Rolle von Glycerin als Induktor des Glp Repressor konnte in diesem Experiment nicht bestätigt werden.

III. Die biologische Rolle von Foxicin

Um die biologische Rolle von Foxicin zu bestimmen und genauer zu untersuchen, wurden verschiedene Experimente durchgeführt. Die Ergebnisse werden in den folgenden Kapiteln C. III. 1, C. III. 2, C. III. 3 und C. III. 4 gezeigt.

III. 1. Metalle beinflussen die Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV

S. diastatochromogenes pokOIV wurde in HA-Medium zur Produktion von Foxicin kultiviert

2+ 2+ 3+ (siehe Kapitel B. II. 6. 1). ZusätzlichΔ wurde das Kulturmedium mit den Metallionen Ca , Cu , Fe , Fe2+, Mg2+, Mn2+, und Zn2+, in einer Konzentration von 1 mM supplementiert (siehe Kapitel B. II. 7. 2. 1). Die Extrakte wurden in 100 % MeOH gelöst, wobei sich das exakte Volumen MeOH, zum quantitativen Vergleich der Produktion, aus dem Trockengewicht errechnete. Zum Vergleich der Foxicin Produktion wurde der Foxicin A Peak bei 310 nm integriert. Ca2+ und Mg2+ hatten keinen Einfluss auf die Foxicin Produktion, während in Anwesenheit der anderen Metalle kein Foxicin mehr produziert wurde (Daten nicht gezeigt). S. diastatochromogenes pokOIV wurde dann in

2+ 3+ 2+ 2+ 2+ Anwesenheit von Cu , Fe , Fe , Mn , und Zn , in Konzentrationen vonΔ 0,01 mM, 0,1 mM und 1 mM, erneut kultiviert. Bei der Bestimmung des Trockengewichts fiel auf, dass die Kulturen mit 1 mM Cu2+ und 1 mM Zn2+ kaum Wachstum zeigten. Die Kulturen mit 0,01 mM Cu2+, 1 mM Fe2+

Abb. 67: Supplementierte Metalle beeinflussen die Foxicin Produktion von S. diastatochromogenes ΔpokOIV. A| Trockengewicht [mg] der Kulturen mit 1 mM, 0,1 mM oder 0,01 mM Cu2+, Fe3+, Fe2+, Mn2+, und Zn2+; B| Area under Curve (AUC) bei 310 nm von Foxicin A der Kulturen mit 1 mM, 0,1 mM oder 0,01 mM Cu2+, Fe3+, Fe2+, Mn2+, und Zn2+.

138 Ergebnisse

und 0,1 mM Fe2+ wuchsen ebenfalls schwächer als die anderen Kulturen, die alle ein ungefähr gleiches Wachstum aufwiesen (siehe Abb. 67, A.). In der Abb. 67, B. ist die Bestimmung der Fläche unter der Kurve (AuC) bei 310 nm des Foxicin A Peaks der Kulturen dargestellt. Mit ansteigender Metallkonzentration im Medium sank die Foxicin Produktion ab, bei nahezu gleichbleibender Zellmasse. Daraus kann gefolgert werden, dass nicht nur Fe3+ einen Einfluss auf die Foxicin Produktion hat, sondern auch weitere Metallionen können die Produktion beeinflussen.

III. 2. Foxicin bindet Eisen und weitere Metallionen

2+ 3+ 2+ 2+ 2+ Im Kapitel C. III. 1 konnte gezeigt werden, dass die Metalle Cu , Fe , Fe , Mn , und Zn die Produktion von Foxicin beeinflussen. Ergänzend wurde durch UV/Vis Spektroskopie überprüft, ob Foxicin A und B die entsprechenden Metallionen binden können. Dazu wurden Foxicin A und B produziert und aufgereinigt (siehe Kapitel B. II. 6. 1, Kapitel B. II. 6. 2, Kapitel B. II. 6. 3. 1, Kapitel

Abb. 68: UV/Vis Spektroskopie von Foxicin A mit den Metallen Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ und Zn2+. A| 0,01 mM -10 mM Fe3+; B| 0,01 mM -10 mM Fe2+; C| 0,01 mM -10 mM Cu2+; D| 0,01 mM -10 mM Mn2+; E| 0,01 mM -10 mM Zn2+; pink: Foxicin A, gelb: Cu2+, Fe3+, Fe2+, Mn2+, bzw. Zn2+ Kontrolle

139 Ergebnisse

B. II. 6. 3. 3 und Kapitel B. II. 6. 3. 4). Es konnten 18,05 mg Foxicin A und 6 mg Foxicin B aus einer 4 L Kultur isoliert werden. Foxicin A und B wurden, bis zu einer finalen Konzentration von 10 mM, in MeOH gelöst. Die Zugabe der Metallionen erfolgte schrittweise in Konzentrationen von 0,01 mM bis 20 mM, dazwischen wurde das UV/Vis Spektrum von 200-600 nm gemessen. Die genaue Vorgehensweise wurde im Kapitel B. II. 7. 3 beschrieben. Die Abb. 68 stellt die Ergebnisse der UV/Vis Spektroskopie mit Foxicin A und den verschiedenen Metallen dar. Mit zunehmender Fe3+ und Fe2+ Konzentration verschiebt sich der Peak bei 320 nm in Richtung 350 nm (siehe Abb. 68, A. und B.). Bei steigender Cu2+ Konzentration ist eine stärkere Verschiebung des Peaks bei 320 nm in Richtung 370 nm sichtbar (siehe Abb. 68, C.). Mit ansteigender Mn2+ und Zn2+ Konzentration ist nur eine leichte Veränderung des Maximums bei 320 nm sichtbar (siehe Abb. 68, D. und E.). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Foxicin A in der Lage ist Fe3+, Fe2+ und Cu2+ zu binden. Die UV/Vis Spektren von Foxicin B mit den Metallen sind in Abb. 69 gezeigt. Das Maximum von Foxicin B bei 320 nm verschiebt sich mit ansteigenden Fe3+ und Cu2+ Konzentrationen in Richtung 350 nm (Abb. 69, A. und C.). Die Spektren mit Foxicin B und Fe2+, Mn2+ und Zn2+ zeigen eine leichte Verschiebung in Richtung der höheren Wellenlänge (Abb. 69, B., D. und E.).

Abb. 69: UV/Vis Spektroskopie von Foxicin B mit den Metallionen Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ und Zn2+. A| 0,01 mM - 1 mM Fe3+; B| 0,01 mM -1 mM Fe2+; C| 0,01 mM -1 mM Cu2+; D| 0,01 mM -1 mM Mn2+; E| 0,01 mM -1 mM Zn2+; pink: Foxicin A, gelb: Cu2+, Fe3+, Fe2+, Mn2+ bzw. Zn2+ Kontrolle

140 Ergebnisse

III. 3. Chromazurol S identifiziert Foxicin A und B als Siderophore

Durch Chromazurol S (CAS) können Naturstoffe als Siderophore identifiziert werden. Wenn Fe3+ gebunden wurde färbt sich das CAS-Reagenz blau. In Anwesenheit eines Siderophors wird Fe3+ von CAS auf den Siderophore übertragen, was als Farbumschlag zu sehen ist. Der Farbumschlag ist abhängig von der funktionellen Gruppe des Siderophores. Während bei Hydroxamat-Gruppen eine orange Färbung detektiert werden kann, sieht man bei Catechol-Gruppen eine violette Färbung. Das genaue Vorgehen wurde im Kapitel B. II. 7. 1 beschrieben.

Abb. 70: CASAD-Assay mit Foxicin (links), 10 mM EDTA (Positivkontrolle, Mitte) und MeOH (Negativkontrolle, rechts).

Das CASAD-Assay basiert auf der Diffusion eines Siderophores in den CAS-Agar. Durch die Übertragung von Fe3+ ist die Diffusion als farbiger Hof zu sehen. Auf dem mittleren Bild der Abb. 70 ist die Positivkontrolle mit EDTA (10 mM) deutlich zu sehen. Die Negativkontrolle mit MeOH zeigt wie zu erwarten keinen farbigen Hof (siehe Abb. 70, rechts). Die Abb. 70, links zeigt das Ergebnis der Diffusion von Foxicin. Die Färbung ist nicht eindeutig, da sowohl eine orange als auch eine violette Färbung zu erkennen ist. Um dies genauer zu untersuchen, wurde das flüssige CAS- Reagenz mit gereinigtem Foxicin A beziehungsweise Foxicin B vermischt. In der Abb. 71 ist links das blaue CAS-Reagenz zu sehen. Nach der Zugabe von gereinigtem Foxicin A wurde eine violette Färbung des Reagenzes sichtbar (siehe Abb. 71, Mitte) und nach der Zugabe von gereinigtem Foxicin B war eine orange Färbung zu sehen. Die Ergebnisse des CASAD- und des CAS-Assays deuten darauf hin, dass Foxicin A und B als Siderophore agieren können indem sie Fe3+ binden. Aufgrund der Färbung des CAS-Reagenz könnte Foxicin A Fe3+ über eine Catechol-Gruppe binden, Foxicin B hingegen über eine Hydroxamat-Gruppe. Die Resultate des CAS-Assays wurden in Greule et al. (2017) veröffentlicht4.

Abb. 71: CAS-Assay mit gereinigtem Foxicin A (mitte) und gereinigtem Foxicin B (rechts). Das blaue CAS- Reagenz (links) dient der Kontrolle.

141 Ergebnisse

III. 4. Die Kultivierung von S. diastatochromogenes ΔpokOIV unter Eisen-limitierten Bedingungen

Im Kapitel C. III. 1 wurde gezeigt, dass Foxicin bei Eisenüberschuss nicht produziert wurde. In Kapitel C. III. 3 wurden Foxicin A und B durch Chromazurol S als Siderophore identifiziert. Die Biosynthese von Siderophoren ist eng an das Eisenlevel in der Umgebung gekoppelt, wobei Siderophore bei Eisenüberschuss nicht produziert werden, unter Eisen-limitierten Bedingungen hingegen schon. In der Abteilung für Mineralogie und Geochemie der Universität Freiburg wurde in HA-Medium ein Eisen-Gehalt von 0,46 mg/L bestimmt (siehe Kapitel B. II. 7. 2. 4). Das entspricht einer Konzentration von 8,236 µM Eisen. In Abhängigkeit der Eisenkonzentration wurde EDTA zugegeben und S. diastatochromogenes pokOIV wurde wie gewohnt zur Foxicin Produktion kultiviert (siehe Kapitel B. II. 6. 1). Die RohextrakteΔ wurden mittels HPLC-MS analysiert und die Ergebnisse sind in der Abb. 72 dargestellt. Entgegen den Erwartungen, konnte die größte Foxicin Produktion in HA-Medium (siehe Abb. 72, C.) detektiert werden und nicht unter Eisen-limitierten

Bedingungen (siehe Abb. 72, B.). Die Kultur, die mit 1 mM FeCl3 kultiviert wurde, produzierte wie erwartet kein Foxicin (Abb. 72, A.).

Abb. 72: Analyse der Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV unter Zugabe von FeCl3 und EDTA. A| HA-Medium mit 1 mM FeCl3; B| HA-Medium mit 8,236 µM EDTA; C| HA-Medium; graue Markierung: Foxicin A Peak gemessen bei 310 nm, Retentionszeit: 16 min

Ergänzend wurde die Foxicin Produktion, unter Eisen-limitierten Bedingungen, in dem Minimalmedium NMMP untersucht. Dabei wurde S. diastatochromogenes pokOIV in

NMMP-Medium und in NMMP-Medium ohne FeSO4 zur Foxicin Produktion (siehe KapitelΔ B. II. 6. 1), kultiviert. Die HPLC-MS Analyse der Extrakte ergab, dass S. diastatochromogenes pokOIV weder in NMMP noch in NMMP ohne FeSO4 Foxicin produzierte (siehe Abb. 74). DagegenΔ konnte in dem Rohextrakt aus NMMP ohne FeSO4 ein neuer Peak bei einer Retentionszeit von 14,41 min

142 Ergebnisse detektiert werden (Abb. 74, B.). Das UV/Vis Spektrum des neuen Peaks zeigt keine Ähnlichkeit zum UV/Vis Spektrum von Foxicin und auch die gefundenen Massen (911,5 M-H+, 912,5 M-H+ und 226,1 M-H+) passen nicht zu den Foxicin Derivaten. In späteren Versuchen wurde S. diastatochromogenes pokOIV in MS-Medium kultiviert. Bei der AnalyseΔ des Rohextrakts durch Abb. 73: Vergleich der UV/Vis Spektren. Peaks bei HPLC-MS konnte zwar kein Foxicin detektiert 14,41 min aus der Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV in NMMP-Medium werden, dafür aber ein Peak mit dem gleichen ohne FeSO4 und MS-Medium. UV/Vis Spektrum und der gleichen Retentionszeit Δ wie der Peak im NMMP ohne FeSO4 Rohextrakt (siehe Abb. 74, C.). In der Abb. 73 wurden die UV/Vis Spektren des Peaks bei 14,41 min aus den beiden Rohextrakten miteinander verglichen. Beide zeigen Maxima bei 250 nm, 330 nm, 400 nm, 540 nm und 570 nm. Die hohe Absorption bei 400 nm erklärt sich durch die rote Farbe des Extraktes, die wahrscheinlich auf diese Substanz zurückzuführen ist. Die Ähnlichkeit der Spektren lässt auf dieselbe Substanz schließen.

Abb. 74: Analyse der Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV, kultiviert in NMMP-Medium, NMMP-Medium ohne FeSO4 und MS-Medium. A| NMMP-Medium; B| NMMP-Medium ohne FeSO4; C| MS-Medium; Retentionszeit des neuen Peaks 14, 41 min (markiert mit einem Asterisk (*)); alle gemessen bei 310 nm; n=3.

Aufgrund der ausbleibenden Foxicin Produktion in NMMP Medium und des Auftretens eines neuen Peaks, wurden S. diastatochromogenes pokOIV Mutante hinsichtlich ihrer Morphologie verglichen. Dazu wurden dieTü beiden WT Stämme und die auf Δ den Festmedien TSB (siehe

Abb. 75, A.), MS (siehe Abb. 75, B.), NMMP (siehe Abb. 75, C.) und NMMP ohne FeSO4 (siehe Abb. 75, D.) ausgestrichen, kultiviert und verglichen. Der WT zeigt keine größeren morphologischen

143 Ergebnisse

Unterschiede, auch in der Melanin- pokOIV Mutante zeigt auf MS-Medium die charakteristischeProduktion Gelbfärbung, gibt es kaum beiUnterschiede. der Kultivierung Die Δ auf TSB-Agar,

NMMP-Agar und NMMP-Agar ohne FeSO4 wurden keinerlei Pigmente gebildet. Die morphologischen Vergleiche lassen keine Schlüsse über die Foxicin Produktion unter Eisen- limitierten Bedingungen zu. Zudem gibt es keine weiteren Hinweise auf die Bildung der neuen, roten Substanz in NMMP-Medium ohne FeSO4.

Abb. 75: Vergleich der Morphologie von S. diastatochromogenes Tü WT und ΔpokOIV Δ. WT und wurden auf TSB-Agar (A.), auf MS-Agar (B.), auf NMMP-Agar (C.) und auf NMMP-Agar ohne FeSO4 (D.) ausgestrichen. Δ

144 Ergebnisse

IV. In silico Untersuchungen ähnlicher BGC aus Streptomyces sp.

In Greule et al. (2017) wurden BCG aus 21 Streptomyces Stämmen beschrieben, die große Ähnlichkeit zum fox-Cluster aufwiesen4. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die BCG aus S. collinus Tü365, S. bingchenggensis BCW-1 und S. avermitilis MA-4680 genauer betrachtet und miteinander verglichen. Durch antiSMASH wurden die BGC in der gDNA-Sequenz von S. collinus Tü365, S. bingchenggensis BCW-1 und S. avermitilis MA-4680 gefunden und die ORFs wurden weiter untersucht. Die Ergebnisse der in silico Analysen der 31 ORFs des BGC 7 aus S. collinus Tü365 wurden in der Tab. 54 aufgelistet. Die Tab. 55 zeigt die Ergebnisse der in silico Analysen der 39 ORFs des BGC 9 aus S. avermitilis MA-4680 und die Tab. 56 zeigt die Ergebnisse für die 36 ORFs des BGC 44 aus S. bingchenggensis BCW-1 (siehe Anhang, Kapitel F. IV). Alle drei BCGs besitzen die gleiche Domänenstruktur innerhalb der hybriden PKS I/NRPS wie foxBI, foxBII und foxBIII, bestehend aus einer A-Domäne (CAL), dem ACP des Startmoduls, nachfolgend zwei Module mit jeweils einer KS, einer AT, einer DH, einer KR und einem ACP, anschließend das letzte Modul mit einer C-Domäne, einer FkbH-ähnlichen Domäne, einem PCP und einer TE. Nachfolgend finden sich in allen BGCs eine putative Esterase und eine putative Carboxylesterase. FoxGI, FoxGII und FoxGIII sind ein wichtiger Teil der Foxicin-Biosynthese, da sie an der Synthese von 1,3-BPG beteiligt sind. Der ORF ctg1_948 des BGC 7 aus S. collinus Tü365 codiert für eine putative Inositol-2-Dehydrogenase, der ORF ctg1_1638 aus S. avermitilis MA-4680 codiert für eine putative Zuckerphosphat-Isomerase und der ORF ctg1_9147 aus S. bingchenggensis BCW-1 codiert für eine Tartratdehydrogenase. Das BGC 44 aus S. bingchenggensis BCW-1 enthält mehrere Gene die für putative Endoglucanasen codieren. Das deutet darauf hin, dass Zucker oder Zucker-ähnliche Moleküle auch Vorstufen der bislang unbekannten Sekundärmetabolite aus S. collinus Tü365, S. bingchenggensis BCW-1 und S. avermitilis MA-4680 sind.

Die ORFs ctg1_963 und ctg1_960 aus dem BGC 7 aus S. collinus Tü365 codieren für weitere, putative A-Domänen einer NRPS, mit Spezifitäten für Prolin und Dihydroxybutyrat/Salicylsäure. Des Weiteren codiert ctg1_959 für eine Enoyl-CoA Hydratase (ECH) und man findet zwei putative Acetyltransferasen im BGC (ctg1_936 und ctg1_937). Die weiteren ORF-Analysen sind in der Tab. 54 aufgeführt. Die antiSMASH-Analyse liefert, basierend auf der Kolinearität von PKS und NRPS, eine grobe Strukturvorhersage. Die Vorhersage des Grundgerüstes des unbekannten Naturstoffes aus S. collinus Tü365 ist in der Abb. 76 gezeigt. Bei der Erstellung der Vorhersage wurden keine

Abb. 76: Strukturvorhersage des Grundgerüstes des tailoring-Schritte berücksichtigt. Das BGC ist in unbekannten Sekundärmetabolites aus S. collinus der Abb. 77 abgebildet und die einzelnen ORFs Tü365 durch antiSMASH.

145 Ergebnisse wurden gruppiert und den Gruppen entsprechend einsortiert. Rot eingefärbt wurden die ORFs, die für eine PKS I codieren. Die Gene, die für putative NRPS codieren wurden grün markiert und die Gene die am Zuckermetabolismus beteiligt sind, wurden in hellblau dargestellt. Gene für die Modifikation wurden in grau dargestellt, Gene für die Regulation in schwarz, Gene für den Transport in dunkelblau und Gene mit unbekannter Funktion in weiß. Des Weiteren wurde die Domänenarchitektur gezeigt (Abb. 77, B und C), die bereits beschrieben wurde.

Abb. 77: Darstellung des BGC 7 aus S. collinus Tü365. A| gesamtes 56 559 bp langes BGC; B| ctg1_963 codiert für eine putative A-Domäne mit Prolin Spezifität, ctg1_960 codiert für eine putative A-Domäne mit Spezifität für Dihydroxybutyrat bzw. Salicylsäure und ctg1_959 codiert für eine putative Enoyl-CoA Hydratase Domäne (ECH); C| ctg1_946 codiert für eine putative A-Domäne; ctg1_945 codiert für drei Module einer PKS vom Typ 1 mit ACP, KS, AT, DH, KR, ACP, KS, AT, DH, KR, ACP, C, FkbH, ctg1_944 codiert für ein PCP und TE-Domäne. rot| PKS I; grün| NRPS; blau| Zucker; grau| Modifikation; gelb| andere; schwarz| Regulation; blau| Transport; weiß| unbekannt.

IV. 1. Die selektive Isolierung des BGCs 7 aus S. collinus Tü365 durch die Transformations-assoziierte Rekombination in S. cerevisiae VL6-48N

Das stille BGC 7 aus S. collinus Tü365 sollte durch die Transformations-assoziierte Rekombination in S. cerevisiae VL6-48N selektiv isoliert werden und dann in dem TAR-Vektor pCAP01 vorliegen. Eine genaue Beschreibung der Methode befindet sich im Kapitel B. II. 4. 4. 5. Die Erstellung des TAR-Plasmids pCAP01-Sco7 wurde im Kapitel B. II. 4. 7. 9 beschrieben und in der Abb. 78 ist der Kontrollverdau mit SpeI und XhoI zu sehen. Das resultierende Plasmid pCAP01-Sco7 wurde mit AgeI und EcoRI linearisiert und für die Transformations-assoziierte Rekombination verwendet. Die gDNA von S. collinus Tü365 wurde isoliert, mit EcoRV und NheI verdaut und mit Hilfe einer Alkoholfällung gereinigt (siehe Kapitel B. II. 2. 4.). Die beiden DNA-Fragmente wurden dann, wie im Abb. 78: Kontrollverdau Kapitel B. II. 4. 4. 5 beschrieben, für die Transformations-assoziierte von pCAP01-Sco7 mit SpeI, XhoI (erwartet: 2493 Rekombination in S. cerevisiae VL6-48N verwendet. Die gewachsenen bp und 9013 bp, 1.), L: Leiter.

146 Ergebnisse

Hefekolonien wurden in Hefe(-Leu)-Medium kultiviert, die YACs wurden anschließend, wie im Kapitel B. II. 2. 3 beschrieben, isoliert, in E. coli XL1- Blue transformiert und nach der Kultivierung erneut isoliert (siehe Kapitel B. II. 2. 2. 5). Die TAR-Plasmide wurden durch PCR und Restriktionsspaltungen auf die Anwesenheit des BGCs 7 aus S. collinus Tü365 untersucht. Zunächst wurde mit dem Primerpaar Abb. 79: Ergebnis der Kontroll-PCR mit dem Primerpaar aap20_04_Fw und aap20_04_Rv, aap20_04_fw und aap20_04_rv die Anwesenheit des erwartete Größe: 1309 bp; 1-7: S. cerevisiae VL6- 48N mit pCAP01-Sco8; K 1: pCAP01; L: Leiter. pCAP01-Sco7 überprüft. Das Ergebnis der PCR ist in der Abb. 79 zu sehen. Die isolierten YACs 1 bis 7 zeigen eine 1206 bp große Bande, die auf die Anwesenheit des TAR-Plasmides hindeutet. Der Vektor pCAP01 diente als Negativkontrolle und zeigt keine Bande bei 1306 bp (siehe Abb. 79, K1). Durch weitere PCRs sollte das BGC 7 nachgewiesen werden. Die durchgeführten PCRs zeigten kein eindeutiges Ergebnis, sowie eine negative Positivkontrolle (Daten nicht gezeigt). Des Weiteren wurden die YACs mit BamHI geschnitten, wobei das resultierende Bandenmuster weder dem des pCAP01 entsprach, noch dem TAR-Plasmid bei erfolgreicher Rekombination (Daten nicht gezeigt). Dies deutete auf eine Rekombination mit unspezifischen Elementen der Hefe hin.

IV. 2. Kombinatorische Biosynthese mit der Kernregion von BGC 7 aus S. collinus Tü365

Der Kernbereich des BGC 7 aus S. collinus Tü265, bestehend aus ctg1_941, ctg1_942, ctg1_943, ctg1_944, ctg1_945 und ctg1_946 sollte durch vier PCR amplifiziert werden und anschließend für die heterologe Expression in S. sp. in pTESa kloniert werden. Die Ergebnisse der PCRs der Kernbereiche core 1 bis 3 wurde in der Abb. 80 dargestellt. Die Bereiche core 1 bis core 3 wurden erfolgreich amplifiziert (siehe Abb. 80) und die Bereiche core 1 und core 2 wurden erfolgreich in den Zwischenvektor pUC19 kloniert. Weitere Klonierungschritte sind noch ausstehend.

Abb. 80: Ergebnis der PCR der Kernbereiche core 1, core 2 und core 3. A| PCR von core 1 (4,99 kb); B| PCR von core 2 (7,5 kb); C| PCR von core 3 (5,6 kb)

147 Ergebnisse

V. StreptomeDB

Im Rahmen eines umfassenden Updates der StreptomeDB (http://www.pharmaceutical- bioinformatics.de/streptomedb2/) wurden 157 Publikationen und insgesamt 395 Naturstoffe analysiert. Das Minimum an Information bestand aus Streptomyceten Stämmen und deren produzierten Naturstoffen, die mit Hilfe des CoRSCurator kategorisiert wurden. Die biologische Aktivität, der Zielorganismus, der Biosynthesweg und weitere Daten wurden, sofern vorhanden, ebenfalls integriert. Die Informationen über die identifizierten Naturstoffe wurden in einer Excel- Tabelle gesammelt und später in die StreptomeDB integriert. Ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit war das Auffinden und Identifizieren der Naturstoffe in PubChem. Von 157 Publikationen enthielten 79 relevante Informationen über insgesamt 196 Naturstoffe, von denen wiederum 119 anhand ihres Names bei PubChem identifiziert wurden. Die Strukturen von 63 der verbleibenden 77 Naturstoffe waren in den Publikationen verfügbar. Sie wurden mit Marvin Sketch gezeichnet, in das SMILES Format konvertiert und anhand ihrer Struktur erneut bei PubChem gesucht. Nach der Struktursuche wurden für 14 Naturstoffe PubChem Einträge gefunden, während 49 Naturstoffe bis dahin nicht auf PubChem verfügbar waren.

Abb. 81: Schematische Darstellung der Integration von Information in die StreptomeDB. A. 79/157 Publikationen enthielten relevante Informationen mit 196 Substanzen, 77 Substanzen waren ohne PubChem Eintrag, bei 63/77 Substanzen befand sich die Struktur in der Publikation, 14/63 Substanzen wurden bei PubChem anhand ihrer Struktur identifiziert. B. Von 198 Substanzen wurden 177 bei PubChem gesucht, 73/177 Substanzen wurden anhand ihrer Struktur bei PubChem identifiziert.

In der zweiten Runde wurden weitere 198 Substanzen analysiert, die wiederum anhand ihrer Struktur bei PubChem gesucht wurden. Darunter waren 73 Naturstoffe die bei PubChem gefunden

148 Ergebnisse wurden und 104 Naturstoffe die bislang keinen PubChem Eintrag hatten. Die Strukturen der 104 Naturstoffe wurden in die StreptomeDB integriert. Eine umfassende Beschreibung der Resultate wurde in Klementz et al. (2016) veröffentlicht147.

149 Diskussion

Diskussion

I. Das para-Quinon Foxicin aus S. diastatochromogenes Tü6028

S. diastatochromogenes Tü6028 produziert das tetrazyklische Quinonglykosid Polyketomycin zwischen dem Tag vier und dem Tag sieben der Kultivierung. Zuvor werden geringe Mengen der para-Quinonderivate Foxicin A bis D gebildet. Nach der Deletion der FAD-abhängigen Oxygenase pokOIV des Polyketomycin BGCs durch Dr. Iris Peintner, konnte in der resultierten Mutante S. diastatochromogenes pokOIV kein Polyketomycin mehr detektiert werden. Dahingegen wurden aber größere MengenΔ der Foxicine detektiert, wodurch die experimentelle Untersuchung der Foxicin-Biosynthese realisierbar wurde3,4.

Foxicin A wurde von Dr. Anja Greule als (S)-2-Hydroxy-3-(Acetylamino)-5-(3´´, 5´´S, 7´´-trimethyl- hepta-3´´E, 6´´-dienoyl-amino)-1,4-Benzoquinon identifiziert (siehe Abb. 12). Das Zentrum der Struktur bildet der 1,4-Benzoquinonring mit einer Hydroxylgruppe an Position C-2. An der Position C-3 befindet sich ein Aminoacetat und eine weitere Aminogruppe befindet sich am C-5. Über diese Aminogruppe ist eine Seitenkette mit zwei dreifach substituierten Doppelbindungen verknüpft. Im Rahmen der Dissertation von Dr. Anja Greule wurde das fox-Cluster identifiziert und nach in silico Analysen der 41 ORFs wurde ein möglicher Foxicin-Biosyntheseweg postuliert. Die vorliegende Arbeit diente der experimentellen Untersuchung der postulierten Biosynthese. Dabei wurde besonders die Synthese des 1,4-Benzoquinonrings betrachtet, der durch die Verknüpfung einer Glyceryl-Einheit und einer Aminosäure gebildet werden soll.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese des 1,4-Benzoquinons untersucht. Die Markierung von Biosynthese-Vorstufen durch stabile Isotope wie 13C ermöglichen Einsichten in die grundlegenden Syntheseschritte von Sekundärmetaboliten. Bei erfolgreichem Einbau der Isotope steigt die Intensität der gemessenen 13C-NMR-Signale deutlich über das natürliche Level an. Durch die Fütterung von [13C5,15N]-L-Valine konnte Philipp Schwarzer im Rahmen seiner Doktorarbeit Isobutyryl-CoA als Valin-abgeleiteten Ursprung der ungewöhnlichen Seitenkette von Rishirilid B identifizieren (Schwarzer et al., Manuskript eingereicht). Durch Fütterungsexperimente konnte Glycerin als Vorstufe von Starter- und Verlängerungseinheiten in Sekundärstoffen nachgewiesen werden. Die Bor-haltigen Makrolide Boromycin, produziert von S. sp., Aplasmomycin, produziert von S. griseus SS-20 und Tartrolon B, produziert von Sorangium cellulosum unterscheiden sich strukturell nur geringfügig und verwenden verzweigte Startereinheiten aus drei Kohlenstoffen, die aus Glycerin-Vorstufen synthetisiert werden. Die Fütterung von [U-13C]-Glycerin ergab eine Anreicherung an den Positionen C-15 bis C-17 für Boromycin und Aplasmomycin und eine Anreicherung an den Positionen C-19 bis C-21 für 150 Diskussion

181 185 Tartrolon B (siehe Abb. 82) . Die Plecomakrolide Concanamycin A und Bafilomycin A1 und – B1, gefunden in S. sp., sind potente Inhibitoren der V-Typ-ATPase und verwenden Verlängerungseinheiten aus zwei Kohlenstoffatomen -Methoxygruppe aus Glycerin-

Vorstufen. Die Positionen C-1 und C-2, sowie C-13 und mit C-14 waren nach der Fütterung von 13 186 [U- C3]-Glycerin markiert (siehe Abb. 82) .

Abb. 82: Fütterungsexperimente identifizierten [U-13C]-Glycerin als Vorläufer der Startereinheit bei Boromycin, Aplasmomycin und Tartrolon B und als Vorläufer der Extendereinheiten bei Bafilomycin A1 und B1 und Concanamycin.

Strukturen wie das 1,4-Benzoquinon aus Foxicin kann in weiteren Naturstoffen gefunden werden. Diese unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Biosynthese. Die Aminoglykoside Neomycin, Paromomycin, Ribostamycin, Butirosin, Kanamycin, Tobramycin und Gentamycin sind strukturell durch ein Aminozyklitol charakterisiert, dessen Ursprung 2-Deoxystreptamin (2-DOS) darstellt. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit von 2-DOS zum para-Quinon aus Foxicin, könnte D-Glucose-6-Phosphat das Vorläufermolekül der Ringstruktur sein. 2-DOS bildet die zentrale Einheit der meisten klinisch relevanten Aminoglykoside und wird aus D-Glucose-6-Phosphat synthetisiert. Durch eine 2-Deoxy-scyllo-Inosose (2-DOI) Synthase wird Glucose-6-Phosphat zu 2-DOI, das nachfolgend, durch Transaminierung des Ketons, zu 2-Deoxy-scyllo-Inosamin (2-DOIA) wird. Oxidierung und Transaminierung der Position C-3 führt zu 2-DOS (siehe Abb. 83)187. Homologe zur 2-DOI Synthase wurden in allen BGC gefunden, die für die Produktion von

Abb. 83: Biosynthese von 2-DOS aus D-Glucose-6-Phosphat. D-Glucose-6-Phosphat wird durch eine 2-DOI Synthase (1) zu 2-DOI. Eine 2-DOI-Keto-DOIA-Aminotransferase (2) synthetisiert 2-DOIA und nachfolgend wird Keto-2-DOIA durch eine 2-DOIA Dehydrogenase (3) generiert. (1) ist schließlich an der Herstellung von 2-DOS erneut beteiligt.

151 Diskussion

2-DOS-haltige Aminoglykosiden verantwortlich sind187. In S. diastatochromogenes hingegen konnten keine Gene für die Produktion von 2-DOS gefunden werden.

Das 3-Amino-1,4-Benzoquinon, auch mC7N-Einheit, der Ansamycine Geldanamycin, Herbimycin, Macbecin I und Rifamycin S wird durch den Einbau der ungewöhnlichen Startereinheit 3-Amino-5-Hydroxybenzoat (AHBA) synthetisiert (siehe Abb. 84)188. In Amycolatopsis mediterranei sind die sieben Gene rifG-N verantwortlich für die Synthese von AHBA, ausgehend von UDP-3-Keto-D-Glucose188. Das fox-Cluster codiert nicht für Gene, die eine Nutzung von AHBA als Startereinheit möglich machen.

Abb. 84: Strukturen der Ansamycine Geldanamycin, Herbimycin A, Macbecin I und Rifamycin S, sowie der Vorläufer AHBA der mC7N-Einheit.

Die Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV in Anwesenheit von Glycerin minderte die

13 Produktion von Foxicin, weshalb [U- C6]-GlucoseΔ verwendet wurde, um den Ursprung der Kohlenstoffmoleküle des 1,4-Benzoquinonrings von Foxicin zu identifizieren. Die Position C-2 zeigte eine mögliche Anreicherung und die Position C-3 fungierte als möglicher Kopplungspartner. Allerdings war die Anreicherung nicht ausreichend für eine eindeutige Identifizierung. Die Ergebnisse der Fütterung schließen 2-DOS als Vorläufer des 1,4-Benzoquinons aus. 2-DOS wird aus D-Glucose-6-Phosphat synthetisiert, wobei die Fütterung von [U-13C6]-Glucose zu einer Anreicherung in allen sechs C-Atomen führen sollte (siehe Abb. 83). Das konnte nicht bestätigt werden. Hingegen wurden die Positionen C-2´ und C-3´ der Acetat- Einheit als intakte Kopplungspaare identifiziert, sowie C-7´´ und C-8´´ der Methylmalonyl-CoA Verlängerungseinheit. Die unspezifische Markierung von Acetat wurde bei Fütterungsexperimenten mit [U-13C]-Glycerin von Schummer et al. (1996) beschrieben, da Glycerin durch den Primärstoffwechsel zu Pyruvat und dann zu Acetat metabolisiert werden kann181. Auch die unspezifische Markierung von Methylmalonyl-CoA rührt von der Metabolisierung von Glucose her und wurde von Schuhmann et al. (2004) ebenfalls beobachtet186. Methylmalonyl-CoA wird durch mehrere Synthesewege produziert: Durch die Carboxylierung von Propionyl-CoA, durch Umlagerung und Epimerisierung von Succinyl-CoA, durch die Umwandlung von Acetoacetyl-CoA oder durch den Metabolismus von Valin189. Pyruvat wird dabei zu L-Valin metabolisiert, das den Vorläufer für die Synthese von Methylmalonyl-CoA darstellt189 192. Weitere – 152 Diskussion

Hinweise auf den Usprung der Positionen C-2 und C-3 von Foxicin könnten Fütterungsexperimente mit markiertem 1,3-BPG oder markiertem Glycerin in einer Konzentration unter 0,1 % liefern.

Wenzel et al. (2006) identifizierten 1,3-BPG als Vorläufer für Glycerin-abgeleitete Verlängerungseinheiten aufgrund fortlaufender 13C-Markierungen, das Resultat der Fütterung

13 81 von [1,2- C2]-Glycerin . Ein Cluster-assoziiertes Set an vier bzw. fünf Genen erkennt 1,3-BPG und prozessiert den Vorläufer für die Inkorporation in die naszierende Polyketidkette. Die entsprechenden Proteine FkbGHIJK der FK520 Biosynthese, Asm13-17 der Ansamitocin Biosynthese, OzmBDEFG der Oxazolomycin Biosynthese, GdmGHIJK der Geldanamycin Biosynthese und ZmaDEGN der Zwittermicin A Biosynthese wurden im Kapitel A. II. 4 vorgestellt. FoxBII enthält die bifunktionale FkbH-ähnliche Domäne foxFLD, die als Glyceryl-Transferase mit Phosphataseaktivität agiert und ähnlich ist zu FkbH, Asm16, OzmB, GdmH, ZmaN, Tmn16 und ChlD1 (siehe Kapitel C. I. 4. 2. 1). Außerdem ist die PCP-Domäne von FoxBIII ähnlich zu FkbJ, Asm14, OzmE, GdmJ, ZmaD, Tmn7a und ChlD2 (siehe Kapitel C. I. 5. 1). Die weiteren zwei bzw. drei Proteine, die an der Biosynthese von HM-S-ACP oder MM-S-ACP für FK520, Ansamitocin, Oxazolomycin, Geldanamycin und Zwittermicin A beteiligt sind, konnten nicht gefunden werden. Bei der Betrachtung der Struktur des 1,4-Benzoquinonrings, erscheint die Inkorporation von Glycerin wahrscheinlicher als die von Hydroxy- oder Methoxymalonat, was durch die Abwesenheit der 3-Hydroxyacyl-CoA Dehydratase, der Acyl-CoA Dehydratase und der O-Methyltransferase unterstützt wird. Die foxFLD weist die größte Ähnlichkeit zu Tmn16 der Tetronomycin Biosynthese und zu Chld1 der Chlorothricin Biosynthese auf. Die Glyceryl-Einheit ist während der Biosynthese von Tetronomycin und Chlorothricin an der Bildung des fünfgliedrigen Tetronsäurerings beteiligt. Obwohl auch die Glyceryl-Einheit bei der Foxicin Biosynthese an der Bildung eines intramolekularen Ringsystems beteiligt sein soll, konnten keine weiteren Ähnlichkeiten zwischen Tmn7a, Tmn7 und Tmn17, bzw. ChlD2, ChlD3 und ChlD4 und den ORFs des fox-Clusters gefunden werden. Die Beteiligung von Glyceryl-Vorläufern an Ringschlüssen ist nicht nur für Tetronomycin und Chlorothricin beschrieben. Die Bildung der Tetronsäure während der Biosynthese von Acaterin aus Pseudomonas sp. A92193, Agglomerin A-D aus Enterobacter agglomerans PB-6042194, Versipelostatin aus S. versipellis 4083- SVS6195, Boromycin aus S. sp185 und Abb. 85: Biosynthese von RK-682. RkD katalysiert die Aplasmomycin aus S. griseus SS-20182 184 Bildung der C-C und C-O Bindungen zwischen 3-Oxo-Stearoyl-S-RkC und Glyceryl-S-RkF um das findet durch die Kondensation einer– 3-Hexadecanoyl-5-hydroxymethyl Tetronat RK-682 zu bilden

153 Diskussion

Glyceryl-Einheit und einer weiteren Einheit der PKS statt. Sun et al. (2010) rekonstruierten die Biosynthese des Phosphatase- und HIV-1 Proteinase-Inhibitors RK-682 aus Saccharopolyspora erythraea in vitro196. RkD, eine 3-Oxoacyl-(acyl carrier protein)-Synthase III, katalysiert die Bildung einer C-C-Bindung zwischen dem Glyceryl-S-ACP und 3-Oxo-Stearoyl-S-ACP. Daraufhin bildet sich die C-O-Bildung aus, wodurch der Tetronatring entsteht (siehe Abb. 85)196. Im fox- Cluster konnte kein RkD-ähnliches Protein gefunden werden. Trotzdem sind Ringbildungen zwischen einer Glyceryl-Einheit und einem anderen Molekül möglich.

Eine weitere, ähnliche und interessante Ringstruktur kann bei den 2,5-Diketopiperazinen gefunden werden (siehe Abb. 86). Die Zyklodipeptide entstehen durch die Kondensation von zwei -Aminosäuren und können mit unterschiedlichen Seitenketten substituiert werden197 199. Die 2,5-Diketopiperazine weisen eine Abb. 86: 2,5-Diketopiperazin. Vielzahl an bioaktiven Eigenschaften– auf, darunter auch die Bildung von Chelatkomplexen200.

Die Verbindung einer Aminosäure und einer Glyceryl-Einheit soll zur Bildung des 1,4-Benzoquinonrings führen. Dr. Anja Greule postulierte in ihrer Dissertation einen Enzym-katalysierten Ringschluss mit Beteiligung der Esterasen FoxEI und FoxEII. Diese Hypothese wird von Dimah Wassouf im Rahmen ihrer Dissertation untersucht. Auch die TE-Domäne von FoxBIII könnte die Ringbildung katalysieren. Die TE-Domäne des Pikromycin BGC katalysiert dessen Makrozyklisierung und somit die Entstehung des Makrolactonrings201 203. Tripathi et al. (2016) tauschten die TE-Domänen eines linearen Polyketids mit der TE– des cyclischen Polyketids Pikromycin aus. Das vormals lineare Molekül konnte nun zyklisiert vorgefunden werden und vice versa203. Ergänzend zu den Untersuchungen von Dimah Wassouf könnte die TE des fox-Clusters näher betrachtet werden. Der Austausch von Aminosäuren kann eine unfunktionale TE erzeugen und die folgende Analyse der Sekundärstoffproduktion würde die Charakterisierung der TE ermöglichen. In Anlehnung an Tripathi et al. (2016) könnte die TE durch eine TE eines linearen Polyketides ausgetauscht und die Sekundärstoffproduktion analysiert werden. Diese Versuche würden die Aufklärung der Zyklisierung von Foxicin unterstützen.

Das Substrat 1,3-BPG für die Biosynthese der HM- und MM-Verlängerungseinheiten wird, soweit bekannt, aus dem Primärmetabolismus abgeleitet und durch Cluster-assoziierte Proteine prozessiert. Das fox-Cluster hingegen codiert für die drei ORFs foxGI, foxGII und foxGIII mit großer Ähnlichkeit zur Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, zur Triosephosphat-Isomerase und zu Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase der Glykolyse. Durch das NAD+/NADH+H+ gekoppeltes in vitro Assay wurden die postulierten Enzymfunktionen verifiziert. Das fox-Cluster ist also für die Biosynthese des Vorläufers 1,3-BPG verantwortlich, der somit nicht aus dem 154 Diskussion

Primärmetabolismus abgeleitet wird. Aufgrund der Unterbrechung der Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase produzierte S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint A kein Foxicin mehr und in S. diastatochromogenes ΔpokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint B war die Foxicin Produktion stark verringert. S. diastatochromogenesΔ Tü6028 enthält zusätzlich zu FoxGI eine zweite Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (Position: 1817683 bp -1818693 bp), in räumlicher Nähe zu weiteren Proteinen, die an der Glykolyse beteiligt sind (Analysen des Genoms durch http://rast.nmpdr.org/; siehe Tab. 27). Die geringe Foxicin Produktion in S. diastatochromogenes pokOIV, foxGI::pKC1132-foxGIint B könnte sich durch die Verwendung von 1,3-BPG aus dem PrimärmetabolismusΔ erklären. Bei einem single crossover werden Gene durch Insertion unterbrochen, was in einigen Fällen foxGI mit

HilfeEinfluss des auf CRISPR-Cas9 die Transkription Systems der markerlos und liegenden deletiert Gene werden. haben kann. Das CRISPR-CasDeshalb sollte System ist verantwortlich für die bakterielle Abwehr von Bakterophagen-DNA. Der CRISPR-Locus (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) und die Cas (CRISPR-assoziierte) Proteine erkennen gezielt artfremde DNA und schneiden sie161,204. Tong et al. (2015) ermöglichten die Nutzung des CRISPR-Cas Systems zur gezielten Deletion von Genen in Actinobakterien (siehe Kapitel B. II. 4. 5. 2)123. Das pCRISPR-Cas9 Plasmid wurde mit einer sgRNA ligiert, die die Cas9-Endonuklease zur Ziel-DNA begleitet, um dort einen Doppelstrangbruch herbeizuführen. Die Größe des Doppelstrangbruches ist nicht zu kontrollieren und die resultierenden Enden werden durch NHEJ ligiert. Zur DNA-Repa

Bereiche von foxGI in das Plasmid eingebracht.ratur Die durch Übertragung HDR wurden von pCRISPR-Cas9- und flankierendefoxGI durch

Abb. 87: Analyse der Sekundärstoffproduktion in S. diastatochromogenes ΔpokOIV, ΔfoxGI. Chromatogramm (oben), UV/Vis Spektren der Peaks 3 und 4 (Mitte); Massenspektren der Peaks 3 und 4.

155 Diskussion intergenerische Konjugation gestaltet sich aufgrund der Größe von 12 445 bp schwierig und langwierig. Die Transkription der Cas9-Endonuklease wurde in den resultierenden Exkonjuganden durch Thiostrepton induziert und die Deletion von foxGI wurde durch PCR verifiziert, wobei unspezifische Targets nur durch Genomsequenzierung identifiziert werden können. Bei der Analyse der Sekundärstoffproduktion von S. diastatochromogenes pokOIV,

foxGI wurde kein Foxicin detektiert, hingegen aber zwei bislang unbekannte Peaks mitΔ einer ΔRetentionszeit von 18 min und 18,6 min (siehe Abb. 87, oben) und einer Masse von 330,3 und 331,3 [M-H+] (siehe Abb. 87, unten). Die UV/Vis Spektren zeigten keine Ähnlichkeit zu Foxicin (siehe Abb. 87, Mitte).

Das UV/Vis Spektrum des ersten Peaks ähnelt dem UV/Vis Spektrum des Polyens 4-Z-Annimycin aus S. calvus aat::[bldA, aac(3)IV] (siehe Abb. 88, C). Auch die detektierte Masse von 330,3 [M-H+] entspricht der Masse von 4-Z-Annimycin205. Die Retentionszeit, sowie die weiteren Massen stimmen nicht mit 4-Z-Annimycin überein. In silico Analysen der gDNA Sequenz von S. diastatochromogenes Tü6028 ergab kein BGC mit Ähnlichkeit zu den Genen des 4-Z-Annimycin BGCs. Möglicherweise handelt es sich bei den neuen Peaks aus S. diastatochromogenes pokOIV,

foxGI um ein Annimycin-ähnliches Polyen. Die Massen unterscheiden sich allerdings nurΔ um 14 + Δbeziehungsweise 15 [M-H ] von Foxicin A, weshalb es sich auch um ein shunt Produkt als Resultat der foxGI-Deletion handeln kann. NMR-Analysen der unbekannten Peaks und die foxGI könnten den Ursprung klären.

Komplementierung von Δ

Die FkbH-ähnliche Domäne des fox-Clusters foxFLD erkennt 1,3-BPG bindet es bei gleichzeitiger Dephosphorylierung kovalent an das konservierte Cystein. Die Sequenzvergleiche mit bekannten, FkbH-ähnlichen Proteinen zeigten die gleichen konservierten Bereiche, die für die bifunktionale Glyceryl-Transferase und Phosphataseaktivität wesentlich sind. Das konservierte Motiv DXDX(T/V) ist charakteristisch für die HAD Superfamilie und zuständig für die

156 Diskussion

Dephosphorylierung von 1,3-BPG. Das konservierte Cystein des SCR-Motivs bindet die Glyceryl-Einheit, bevor sie auf die PCP-Domäne von FoxBIII geladen wird5,78. Die Beladung der rekombinanten foxFLD konnte durch das in vitro Beladungsassay nicht gezeigt werden. Die detektierte Masse des Beladungsassays mit der foxFLD und Tmn7a lag 10 Da über der erwarteten Masse von 10 531 Da. Das in vitro Beladungsassay sollte mit der rekombinanten foxFLD und dem PCP von FoxBIII wiederholt werden. Bei der heterologe Produktion des PCPs in E. coli aggregierte das Protein in Einschlusskörperchen. Um dieses Problem zu umgehen wurde die minimale Sequenz der PCP-Domäne amplifiziert und von Janina Hauser im Rahmen ihrer Bachelorarbeit kloniert. Die heterologe Produktion des PCPmini ist noch ausstehend. Eine kleinere Version des Proteins könnte sich nicht nur positiv auf dessen Löslichkeit während der Produktion auswirken, sondern auch die Detektion der Beladung durch foxFLD vereinfachen.

Die in silico Analysen der A-Domäne, codiert durch foxBI, ergaben keine Spezifität für eine bestimmte Aminosäure. Dr. Anja Greule produzierte FoxBI heterolog in E. coli und verwendete ein NADH/NAD+-gekoppeltes Assay zur Bestimmung des Substrates206. Das Assay basiert auf der Aktivierung einer Aminosäure durch eine A-Domäne, wobei ein Aminosäure-Adenylat und Pyrophosphat entsteht. Eine Pyrophosphat-abhängige Phosphofructokinase phosphoryliert Fructose-6-phosphat zu Fructose-1,6-bisphosphat, das dann durch die Fructose-1,6-bisphosphat Aldolase, die Triosephosphat Isomerase und die Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase zu 1,3-BPG umgewandelt wird. Dabei wird NAD+ zu NADH+H+ reduziert, was photometrisch bei 340 nm detektiert werden kann. Dr. Anja Greule untersuchte die Aktivierung der proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren Alanin, Arginin, 2,4-Diaminobutyrat, Ornithin und Serin durch FoxBI, was allerdings kein eindeutiges Ergebnis lieferte. Aufgrund der ungewöhnlichen Struktur ist der Einbau einer nicht-proteinogenen Aminosäure wahrscheinlich. Süssmuth et al. (2017) beschrieben Beispiele für nicht-proteinogene Aminosäuren, die für die Synthese von NRPs verwendet werden68. Friulimicin und Pacidamycin enthalten 2,3-Diaminobutyrat, das durch eine ATP-Grasp-Ligase aus Asparagin oder Threonin synthetisiert wird68,207,208. Aus einem Asparaginsäure-Semialdehyld wird 2,4-Diaminobutyrat synthetisiert, was in Polymyxinen zu finden ist209. Auch die Synthese aus zwei Glycinen durch die Dipeptidase FoxD wäre als Ursprung der Aminosäure-Einheit denkbar.

Aktuelle Analysen des fox-Clusters durch antiSMASH identifizierten FoxBI als Coenzym A Ligase (CAL)-Domäne (siehe Abb. 89). CoA Ligasen binden ihr Substrat an CoA und der Thioester kann dann von Abb. 89: Analyse des fox-Clusters mit antiSMASH. ctg1_23 der PKS in die Polyketidkette eingegliedert entspricht FoxBI; ctg1_22 entspricht FoxBII; ctg1_21 entspricht FoxBIII. werden. Die Aminosäuresequenz von FoxBI

157 Diskussion wurde mit den Sequenzen verschiedener A-Domänen und CoA Ligasen verglichen. FoxBI ist am ähnlichsten zu RkA der RK-682 Biosynthese (45,16 % Identität) und zur putativen Acyl-CoA- Synthase LipA aus Actinoplanes friuliensis (42,23 % Identität; Accession: CAD32910). RkA ist eine Palmitoyl-CoA Synthetase, die Palmitinsäure aktiviert und das ACP RkB mit dem resultierende Palmitoyl-CoA belädt (Accession: GQ332353)196. Geringere Sequenzähnlichkeiten zeigt FoxBI zu den A-Domänen des WS9326A BGC aus Modul 6 (Asparagin-Spezifität; 25,75 % Identität) und Modul 7 (Serin-Spezifität; 23,36 % Identität)210. Zur 6-Methylsalicyl-AMP-Ligase PokM3 des Polyketomycin BGCs besitzt FoxBI 24,49 % Sequenzidentität und zur Acyl-CoA-Ligase PokL 29,46 % Sequenzidentität. Die Sequenzvergleiche lassen darauf schliessen, dass es sich bei FoxBI um eine CoA Ligase handelt. STRVN_7500 und STRVN_2700 sind CoA Ligasen, die 4-Guanidinbutyrat, synthetisiert aus zwei Molekülen L-Arginin, mit CoA verküpfen. Das ermöglicht die Verwendung der ungewöhnlichen Startereinheit 4-Guanidinobutyryl-CoA für die Biosynthese von Azolomycin F3a und den Clethramycinen. Die Sequenzen von STRVN_7500 und STRVN_2700 sind bislang nicht publiziert, was weitere Sequenzvergleiche ausschließt72. Möglicherweise verbindet FoxBI eine Aminosäure mit CoA und sorgt so für deren Eingliederung in Foxicin über die PKS.

Das fox-Cluster enthält zehn Gene, die für putative Regulatoren codieren. Die Regulatoren foxRI, foxRII und foxRIV-foxRX wurden in S. diastatochromogenes pokOIV überexprimiert, um deren

Einfluss auf die Foxicin Δ pokOIV::foxRI und pokOIV::foxRIV produziertenBiosynthese mehr Foxicin zu als untersuchen. der Kontrollstamm Die Stämme pokOIV Δ::pTESa. Die Familie derΔ TetR/AcrR Regulatoren besitzen in der Regel eine N-teminale ΔDNA-Bindedomäne, die den Operator bindet und so die Transkription verhindert. Bindet der entsprechende Ligand am C-Terminus des Regulators, dissoziiert er von der DNA und die Transkription findet statt110. Aufgrund des variablen C-Terminus besitzen verschiedene TetR/AcrR Regulatoren unterschiedliche Stimuli110. Auch foxRX gehört zur Familie der TetR/AcrR Regulatoren. Der pokOIV::foxRX produzierte allerdings kein Foxicin. Wahrscheinlich binden

Stammunterschiedliche Δ Stimuli an die C-terminalen Bindestellen von foxRI und foxRX, wobei die pokOIV::foxRI anwesend waren. Der putative Regulator FoxRIV gehört zur

Ligandenvielfältigen von GruppeFoxRI in Δ der MarR-Regulatoren. Sie beeinflussen zahlreiche Prozesse wie Metabolismus, Stressantworten, Virulenz, Abbau und Export von Antibiotika105. Die Foxicin pokOIV::foxRIV pokOIV. FoxRIV scheint die Foxicin

Produktion positiv in Δ zu beeinflussen.ist Der dreifach putative höher Regulator als in ΔFoxRVI gehört zur AraC/XylS-Familie, die in der Regel als Aktivatoren agieren. Somit ist es ungewöhnlich, dass die Foxicin-Produktion pokOIV::foxRVI im Vergleich zu pokOIV verringert ist. Der putative Regulator FoxRIII gehört inzur Δ LuxR-Familie, die ebenfalls Δ überwiegend als Aktivatoren fungieren. Die genetische Mani pokOIV gestaltete sich als langwierig. Das Plasmid zur Überproduktion von

pulation von Δ 158 Diskussion

FoxRIII konnte durch intergenerische pokOIV eingebracht werden. Die zahlreichen regulatorischen Proteine desKonjugation fox-Clusters nicht deuten in Δ auf eine strenge Regulation der Foxicin Biosynthese hin.

Eisen ist ein essentielles Element für alle Lebewesen. Das Redoxpaar Fe2+-Fe3+ katalysiert viele wichtige, zelluläre Redox-Reaktionen und ist am Transport von Sauerstoff, an der ATP-Synthese und am Elektronentransport beteiligt. Zudem ist Eisen als Cofaktor wichtig für die Funktionalität von Proteinen, wie z.B. bei Hämproteinen oder in Eisen-Schwefel-Clustern (Fe-S Cluster). Letztere werden über Aminosäuren wie Cystein oder Histidin gebunden und sind damit an der Regulation des Stoffwechsels, am Elektronenstransport und an weiteren wichtigen enzymkatalysierten Reaktionen beteiligt. In wässrigen Lösungen und unter neutralem pH ist Fe2+ löslich und kann deshalb von ubiquitären Metalltransportern aufgenommen werden. Fe2+ oxidiert spontan zu Fe3+, das unter denselben Bedingungen unlösliche, stabile Eisenoxidhydrate bildet, weswegen nur 109-10-18 M freies Fe3+ existiert211. Viele Mikroorganismen sekretieren unter Eisen-limitierten Bedingungen Siderophore: Naturstoffe von niedrigem Molekulargewicht und mit hoher Affinität zu Eisen. Robert Hider und Xiaole Kong beschrieben Siderophore als Moleküle mit höherer Affinität zu Fe3+ als zu Fe2+, sowie die Selektivität von Siderophoren für dreifach positiv geladene Metalle84. Abgesehen von Al3+ gibt es nur wenige, dreifach positiv geladene Metalle mit biologischer Relevanz. Ohne diese Selektivität würden Siderophore ebenfalls zweifach positiv geladenen Metalle binden84. Aufgrund ihrer hohen Affinität zu Fe3+ können negativ geladene Sauerstoffatome in Siderophoren gefunden werden, die häufig oktaedrisch um ein Fe3+ angeordnet sind84. Auch Stickstoff- oder Schwefelatome können daran beteiligt sein. Die funktionellen Gruppen der Siderophore wurden im Kapitel A. IV beschrieben. Die drei -Hydroxycarboxylate. Die hohe

3+ LadungsdichteHauptgruppen bilden der beiden die Catecholate, ortho-Phenolate die Hydroxamate der Catecholat-Siderophore und die begünstigen die Fe - 84 Bindung (pKa-Wert: 9,2 und 13,0) . Hydroxamate können in zwei mesomeren Formen vorkommen, mit hoher Ladungsdichte um das Sauerstoffatom der Carbonylgruppe. Die Elektronendichte um das Sauerstoffatom kann durch entsprechende Seitenketten erhöht werden84. Trotz der hohen Affinität zu Fe3+ binden Siderophore aufgrund ihrer hohen Ladungsdichte 2+, Al3+, Cr3+, Pu3+, Pu4+ und Ga3+ 85,212.

2+ 3+ 2+ 2+ Ein ähnliches Ladungs-weitere, zu sogenannte Radiusverhältnis „harte haben,Metalle neben wie Zn weiteren auch Mn , Fe , Mg und Ca . Das CAS-Assay identifiziert Siderophore und gibt zusätzlich Aufschluss über die funktionellen Gruppen. Ist Fe3+ an Chromazurol S gebunden, erscheint das Reagenz blau. In der Anwesenheit eines Siderophores findet eine Übertragung von Fe3+ statt, was in einem Farbumschlag resultiert168 170,213,214. Der Farbumschlag ist abhängig von den funktionellen Gruppen des Siderophores.– Bei Catecholaten erscheint eine violette Färbung und bei Hydroxamaten erscheint eine orangene Färbung85. Foxicin A erzeugt eine violette Färbung, während Foxicin B eine

159 Diskussion organene Färbung erzeugt (siehe Kapitel C. III. 3.). Somit werden die Fe3+-bindenden Eigenschaften von Foxicin A durch eine Catecholat-Gruppe und von Foxicin B durch eine Hydroxamat-Gruppe vermittelt. Die Struktur von Foxicin B ist bislang noch nicht eindeutig gelöst. Trotz gleicher Masse wie Foxicin A, besitzt Foxicin B unterschiedliche Retentionszeiten, was auf einen Unterschied in der Struktur schließen lässt. Das CAS-Assay gibt hierbei einen Hinweis auf die Struktur von Foxicin B. Weitere Analysen, durch NMR-, VDC- und IR-Analysen können bei der Strukturaufklärung helfen.

In Anwesenheit der Metalle Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ und Zn2+ war die Foxicin-Produktion von S. diastatochromogenes pokOIV eingeschränkt (siehe Kapitel C. III. 1). Die Biosynthese von

211,215 Siderophoren beginnt beiΔ intrazelluläre Eisenkonzentration von 1 µM und weniger . Liegt die intrazelluläre Menge an Eisen darüber, synthetisieren Mikroorganismen keine Eisen- chelierenden Moleküle. Somit war die absinkende Foxicin-Produktion bei ansteigender Konzentration der Metalle zu erwarten. Unter Laborbedingungen werden Streptomyceten zur Produktion von Siderophoren in Eisen-defizienten Medien, wie NMMP kultiviert216. Dabei wird eine hohe Siderophor-Ausbeute erreicht. Im Gegensatz dazu fand während der Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV unter Eisen-limitierten Bedingungen keine Foxicin-Produktion statt (siehe Kapitel C. III.Δ 4). Im Kapitel C. III. 2 wurden die UV/Vis Spektren von Foxicin A und B in Anwesenheit der Metalle Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+ und Zn2+ gezeigt. Das UV/Vis Spektrum von Foxicin A verschob sich, mit ansteigenden Konzentrationen der Metalle Fe3+, Fe2+ und Cu2+ in Richtung höherer Wellenlängen, was auf eine Komplexbildung hindeutet. Des Weiteren fand eine leichte Veränderung des UV/Vis Spektrums von Foxicin A mit Zn2+ statt, was ebenfalls auf eine leichte Bindung zurückzuführen ist. Anhand der UV/Vis Spektroskopie mit Foxicin B wurde eine Bindung mit Fe3+, Cu2+ und Zn2+ gezeigt. Weder Foxicin A und B binden Mn2+.

Die Sauerstoff-Donatoren der funktionellen Gruppen sind essentiell für die Interaktion mit Metallionen und die Bildung von Siderophor-Fe3+ Komplexen. Foxicin weist keine Selektivität für dreifach positiv geladene Metalle auf, sondern bindet auch zweifach positiv geladene Metalle. Zwar wird die Biosynthese bei einem Überschuss an Metallen beeinträchtigt, allerdings ergab die Verwendung von Eisen-defizientem Medium (NMMP oder HA mit EDTA) keine Steigerung der Foxicin Produktion. Nicht nur Siderophore weisen Metall-bindendende Eigenschaften auf, sondern auch weitere Moleküle, wie z.B. Ionophore oder Quinone. Ionophore haben ein niedriges Molekulargewicht (0,5-2 kDa) und finden sich häufig unter den Makroliden und den Polyethern. Ionophore erhöhen die Membranpermeabilität für Ionen durch Delokalisierung der Ionenladung, um sie von den hydrophoben Regionen der Lipiddoppelschicht abzuschirmen. Aus diesem Grund finden sich hydrophile und hydrophobe Bereiche innerhalb der Moleküle. Man findet zwei Arten von Ionophoren: Mobile Carrier und Kanalbildner. Die mobilen Carrier, wie Valinomycin, 160 Diskussion

diffundieren durch die Membran und vermitteln somit den Transport von Ionen217. Der Kanalbildner Gramicidin bildet einen Kanal in der Membran aus und vermittelt so den Transport von Protonen und Kationen218. Aufgrund der kurzen lipophilen Seitenkette von Foxicin ist eine Interaktion mit der Cytoplasmamembran eher unwahrscheinlich. Zudem wird Foxicin aus dem Kulturüberstand extrahiert, was ebenfalls gegen eine Interaktion mit der Membran spricht und für einen aktiven Transport aus der Zelle.

Quinone sind chromatophore Substanzen die aufgrund ihrer Redox-Eigenschaften eine Vielzahl von Funktionen in biologischen Systemen übernehmen. Man unterscheidet zwischen Benzoquinonen (ortho-Benzoquinon, para-Benzoquinon), Naphtoquinonen (ortho-Naphtoquinon, para-Naphtoquinon) und Anthraquinonen (siehe Abb. 90). Quinone können ein oder zwei Elektronen akzeptieren, wobei die Reduktion der Quinone durch enzymatischen oder nicht-enzymatischen Elektronentransfer geschieht (siehe Abb. 91)219. Aufgrund ihrer Redox-Eigenschaften sind sie in der Zelle vor allem am Elektronentransfer beteiligt. Biologisch wichtige Quinone wie Ubiquinon, Plastoquinon oder Vitamin K besitzen eine lipophile Seitenkette, die mit den lipophilen Bereichen der Cytoplasmamembran interagieren kann219. Die Radikalanionen von ortho-Semiquinonen formen Abb. 91: Die Redox-Stadien von Komplexe mit Metallionen wie Fe3+, Cu2+, Zn2+ 220,221. An p-Benzoquinon. das Radikalanion gebunden beschleunigen Metallionen, die als Lewissäure agieren, den Elektronentransfer222. Yuasa et al. (2006) beschrieben para-Quinone zwar als biologisch relevanter als ortho-Quinone, dagegen interagieren sie aber kaum mit Metallionen. Durch Elektronenspinresonanz (ESR) konnten Yuasa et al. eine Komplexierung von Sc3+ durch ein para-Benzoquinon Radikalanion zeigen222. Dr. Iris Peintner identifizierte, im Rahmen ihrer Doktorarbeit, die intramolekulare Ringstruktur von Foxicin als ortho-Quinon. Nicht nur die NMR-Spektroskopie favorisierte ein 1,2-Benzoquinon, sondern auch -Orbitale der diebenachbarten intensive, rote Sauerstoffatome Eigenfarbe von kommt Foxicin es zuA. zweiDurch n die Wechselwirkung der n diesem Grund sind die Absorptionsmaxima von 1,2-Benzoquinonen→ * Elektronenübergangszuständen. in den langwelligeren Bereich Aus

161 Diskussion verschoben, im Gegensatz zu den Absorptionsmaxima von 1,4-Benzoquinonen3,223. Die aktuellsten Strukturanalysen von Dr. Anja Greule zogen hingegen eine 1,4-Benzoquinonstruktur vor4,83. Aufgrund der vorliegenden Metall-bindenden Eigenschaften von Foxicin A und B erscheint die ortho-quinoide Struktur wahrscheinlicher als die para-quinoide Struktur.

Biosynthese und Sekretion von Siderophoren sind streng reguliert. Die Regulation erfolgt auf Transkriptionsebene durch die Regulatoren Fur und DtxR. In Gram-negativen Mikroorganismen mit geringem GC-Gehalt übernimmt Fur die Rolle des globalen Eisenregulators, in Gram-positiven Mikroorganismen mit hohem GC-Gehalt (z.B. Streptomyceten, Mycobakterien, Corynebakterien) übernimmt DtxR eine vergleichbare Aufgabe211. Eine Sequenz mit Ähnlichkeit zu DtxR Regulatoren befindet sich in S. diastatochromogenes an Position 3 758 514-3 757 822 bp.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die postulierten Enzymfunktionen von FoxGI-GIII experimentell nachgewiesen. Ergänzend wurde eine Hypothese über die Inkorporation von 1,3-BPG in Foxicin aufgestellt. Die Beladung von foxFLD mit 1,3-BPG konnte nicht gezeigt werden. Die Unterbrechung von foxGI führte zu einer Verminderung der Foxicin-Produktion, während die Deletion von foxGI durch das CRISPR-Cas9 System zur Produktion einer unbekannten Substanz führte. Die Strukturaufklärung dieser Substanz könnte weitere Informationen über die Foxicin-Biosynthese liefern.

Dr. Julia Wunsch-Palasis fütterte im Zuge ihrer Promotion unterschiedliche 13C-Acetateinheiten um deren Orientierung in Rishirilid B zu identifizieren. Die Wiederholung der Fütterung von 13C-Acetat sollte gleichermaßen wiederholt werden, um den Ursprung und die Orientierung der Acetateinheiten in Foxicin zu identifizieren167. Dadurch können die Markierungen durch die

Fütterung von [13C6]-Glucose eindeutig zugeordnet werden.

Für weitere Untersuchungen der Foxicin-Biosynthese sollte in der Cosmid-Bibliothek von S. diastatochromogenes Tü6028 nach einem Cosmid mit vollständigem fox-Cluster gesucht werden1. Da sich die genetische Manipulation von S. diastatochromogenes pokOIV langwierig gestaltete, würde die heterologe Expression des fox-Clusters weitere ExperimenteΔ vereinfachen.

Die DH1- und DH2-Domänen von foxBII unterscheiden sich in ihren konservierten

Sequenzmotiven. Das veränderte Motiv der DH1 (HxxxGxxxxS) soll für die nicht-konjugierte Doppelbindung der Foxicin-Seitenkette verantwortlich sein83. Durch einen Aminosäureaustausch von Serin zu Prolin würde das Motiv der DH1 zu dem Motiv der DH2 (HxxxGxxxxP), was in der Synthese von zwei Doppelbindungen in Konjugation resultieren sollte (Methode gefunden in Kieser et al., 2000). Dies würde weitere Informationen über die Biosynthese von Foxicin liefern. Die Zusammenarbeit einer DH-Domäne und einer C-Methyltransferase ist laut einer Studie von Berkhan et al. (2016) verantwortlich für den Olefin-Shift während der Ambruticin Biosynthese224.

162 Diskussion

Das könnte ein weiterer Hinweis auf die Verschiebung der Doppelbindung in der Foxicin Seitenkette sein.

Während der Kultivierung von S. diastatochromogenes pokOIV unter Eisen-limitierten

Bedingungen wurde kein Foxicin produziert, was ungewöhnlichΔ für Siderophore ist. Stattdessen wurde ein Peak einer unbekannten Substanz detektiert. Die Metall-bindenden Eigenschaften von Foxicin sprechen für eine ortho-quinoide Struktur. Den Ergebnissen dieser Arbeit folgend, entspricht Foxicin und dessen Produktion nicht den klassischen Definitionen von Siderophoren. Wahrscheinlich vermittelt die quinoide Struktur die antibiotischen Eigenschaften, sowie die Bindung von Elektronen und Metallen. Dr. Isabelle Schalk (Université de Straßbourg, Frankreich) ist Expertin auf dem Gebiet der Siderophore und eine Kollaboration könnte die biologische Rolle von Foxicin weiter aufklären.

163 Diskussion

II. Untersuchungen der weiteren BGCs und S. collinus Tü365

In 21 Streptomyces Stämmen konnten BGC gefunden werden, die eine große Ähnlichkeit zum fox-Cluster aus S. diastatochromogenes Tü6028 haben4. Die in silico Betrachtungen der BGC aus S. collinus Tü365, S. bingchenggensis BCW-1 und S. avermitilis MA-4680 ergab dieselbe Domänenarchitektur des PKS I/NRPS Hybrids wie im fox-Cluster. Die Foxicin-ähnlichen Naturstoffe tragen somit alle die gleiche lipophile Seitenkette die, aufgrund der Anwesenheit einer A-Domäne, mit einer Aminosäure verbunden sein sollte. Zusätzlich wurden in den ähnlichen BGCs Gene gefunden, die für die Verwendung von Zuckern oder Zucker-ähnlichen Vorstufen in den unbekannten Sekundärmetaboliten sprechen. Trotz der weiten Verbreitung des fox-Clusters wurde bislang keine Foxicin-ähnliche Substanz beschrieben. Der S. diastatochromogenes WT produziert Foxicin in einer frühen Phase des Wachstums und nur in einer geringen Menge, weshalb Foxicin bis zur Deletion der FAD-abhängigen Oxygenase PokOIV unbekannt war. Zum einen könnten die Sekundärstoffe der fox-ähnlichen Cluster zwar produziert, aber bislang nicht detektiert werden. Zum anderen könnte es sich auch um sogenannte stille BGCs handeln. Mit Aufkommen der Genomsequenzierungen zeigte sich das große Potential der Streptomyceten, deren Genom im Durchschnitt für 30-40 BGCs codiert21. Unter Laborbedingungen wird allerdings nur ein Bruchteil davon exprimiert und die Mehrheit der BGCs verbleibt still. Daraus entwickelten sich verschiedene Methoden, um stille BGCs aufzuwecken. Die Expression des Balhimycin BGC-spezifischen Regulators bbr aus Amycolatopsis balhimycina in A. japonicum MG417-CF17 aktivierte die Expression des Ristomycin A BGCs225. FoxRI scheint die Expression des fox-Clusters zu aktivieren bzw. zu verstärken und könnte in S. collinus Tü365 einen positiven Einfluss auf die Produktion des unbekannten Sekundärmetaboliten haben. S. collinus Tü365 produzierte unter Laborbedingungen lange Zeit nur das Elfamycin Kirromycin. Dr. Dumitrita Iftime konnte durch die Optimierung der Kultivierung und durch heterologe Expression ganzer BGCs, neue, bislang unbekannte Naturstoffe aus S. collinus Tü365 identifizieren53,54. Durch die Transformations-assoziierte Rekombination (TAR) können ganze BGC mit Hilfe eines geeigneten Vektors aus der gDNA extrahiert und durch die heterologe Expression können neue Naturstoffe identifiziert werden122,124,226. Die TAR-Methode sollte die Extraktion des 56,559 kb großen BGC 7 aus S. collinus Tü365 ermöglichen. Durch TAR wurden schon sehr große BGCs isoliert, wie zum Beispiel das 67 kb große Taromycin BGC. Trotzdem war die Isolierung des BGC 7 aus S. collinus Tü365 nicht erfolgreich (siehe Kapitel C. IV. 1). Die Entwicklung der TAR-Klonierung sollte die heterologe Expression stiller BGCs vereinfachen. Trotzdem bleibt die Anzahl an Publikationen mit erfolgreicher Isolation von BGCs überschaubar. Die Amplifizierung der BGC 7 Kernbereiche core 1, 2 und 3 war erfolgreich, die Amplifizierung des Kernbereichs core 4 hingegen war bisher nicht möglich.

164 Diskussion

Die heterologe Expression von fox-ähnlichen Naturstoffen könnte zu neuen Erkenntnissen über deren Biosynthese und deren biologische Aktivität führen. Dabei könnte das BGC 7 aus S. collinus Tü365 aus einer Cosmidbank extrahiert werden (Prof. Dr. Wolfgang Wohlleben, Eberhard-Karls-Universität, Tübingen; persönliche Kommunikation). Die Erstellung von Cosmidbanken aus den weiteren Streptomyces-Stämmen würde auch hier die heterologe Expression ermöglichen.

Die weite Verbreitung der fox-ähnlichen Cluster über verschiedene Streptomyceten Stämme ist ein Hinweis auf die biologische Relevanz von Foxicin und Foxicin-ähnlichen Naturstoffen.

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–

178 Anhang

Anhang

I. Abkürzungsverzeichnis

Physikalische Größen und Einheiten

Delta mA Milliampere °C Grad Celsius min Minuten A∆ Absorption mol Einheit der Stoffmenge AU Absorptionseinheiten (-units) OD optische Dichte bp Basenpaare Rf Retentionsfaktor d Tage (days) rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) Da Dalton RT Raumtemperatur g Gramm sec Sekunde h Stunden (hours) t Zeit (time) L Liter U Units, Maß für Enzymaktivität M molare Masse (g/mol) molar (mol/L) V Volt m/V Verhältnis Masse/Volumen (g/L) V/V Verhältnis Volumen zu Volumen m/z Masse/Ladungs-Verhältnis Wellenlänge

λ Vorsilben

k kilo 103 c zenti 10-2 m milli 10-3 µ micro 10-6 n nano 10-9

Nukleotide und weitere

A Adenin ATP Adenosintriphosphat dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate C Cytosin AMP Adensosinmonophosphat NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat G Guanin DNA Desoxyribonukleinsäure NADH Nicotinamidadenindinukleotid T Thymin RNA Ribonukleinsäure

Aminosäuren

A Ala Alanin L Leu Leucin R Arg Arginin K Lys Lysin N Asn Asparagin M Met Methionin D Asp Asparaginsäure F Phe Phenylalanin C Cys Cystein P Pro Prolin Q Gln Glutamin S Ser Serin E Glu Glutaminsäure T Thr Threonin G Gly Glycin W Trp Tryptophan H His Histidin Y Tyr Tyrosin I Ile Isoleucin V Val Valin

Sonstige

Delta, in einer Mutante inaktiviertes Gen 1,3-BPG 1,3-Bisphosphoglycerat A∆ Adenylierungsdomäne aac(3)IV Apramycinresistenzgen ACN Acetonitril ACP Acylcarrier Protein 179 Anhang

ADP Adenosindiphosphat antiSMASH Antibiotics & Secondary metabolite Analysis Shell APCI Chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (atmospheric pressure chemical ionization) aphII Kanamycinresistenzgen APS Ammoniumpersulfat AS Aminosäure AT Acyltransferase AUC Fläche unter der Kurve (Area under the curve) BAC Bacterial Artificial Chromosome BGC Biosynthese-Gencluster bidest. Bidestilliert bla -Lactamresistenzgen BLAST Basic local alignment search tool bp Basenpaare C Kondensationsdomäne CoA Coenzym A CoA Coenzym A COSY correlation spectroscopy: homonukleare Korrelationsspektroskopie für 1H/1H CP Carrier Protein Cy Heterocyclisierungsdomäne d Schichtdicke DAD Dioden-Array-Detektor DCM Dichlormethan DF Durchfluss DH Dehydratase DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dNTP Desoxynukleotidtriphosphat E Epimerisierungsdomäne Molarer Absorptionskoeffizient E. coli Escherichia coli EDTAƐ Ethylendiamintetraessigsäure ESI Elektronenspray-Ionisation et al. et aliae, und andere EtOH Ethanol F Formylierungsdomäne FAS Fettsäuresynthase (fatty acid synthase) FDA Fructose-1,6-bisphosphat Aldolase FLD FkbH-like domain (FkbH-ähnliche Domäne) FPLC Fast Protein Liquid Chromatography GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphate Dehydrogenase GC-Gehalt Gehalt an Guanin und Cytosin gDNA genomische DNA HM-S-ACP Hydroxymalonyl-S-ACP HPLC High pressure liquid chromatography int Integrasegen IPTG Isopropyl- -D-thiogalactopyranosid KAc Kaliumacetat KR Ketoreduktase KS Ketosynthase LB Lysogeny Broth LC Liquid Chromatography M Methylierungsdomäne MeOH Methanol MM-S-ACP Methoxymalonyl-S-ACP MS Massenspektrometrie NCBI National Center for Biotechnology Information Ni2+-NTA Nickel-Nitrilotriessigsäure NMR Kernspinnresonanzspektroskopie (nuclear magnetic resonance) NRP Nonribosomales Peptid NRPS Nonribosomale Peptidsynthetase oriC origin of replication oriT origin of transfer Ox Oxidationsdomäne PCP Peptidylcarrier Protein PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

180 Anhang

PKS Polyketidsynthase PKS I Polyketidsynthase Typ I PKS II Polyketidsynthase Typ II R Reduktionsdomäne RT Raumtemperatur SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis sp. Species SPE Festphasenextraktion (solid phase extraction) SV Säulenvolumen TAR Transformations-assoziierte Rekombination TCEP Tris(2-carboxyethyl)phosphin TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin TIM Triosephosphate Isomerase Tris 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol tRNA transfer-RNA tsr Thiostreptonresistenzgen ÜN über Nacht UV Ultraviolettes Licht VIS Sichtbares Licht X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl- -D-galactopyranosid YAC Yeast Artificial Chromosome

181 Anhang

II. PCP Sequenz

Abb. 92: Aminosäuresequenz von FoxBIII. grün: Sequenzbereiche des PCP mit konserviertem GGXS-Motiv; blau: Sequenzbereich der TE-Domäne.

III. Vergleich der Regulator-Überexpressionsmutanten

Abb. 93: HPLC Analyse der Foxicin A Produktion in den Mutanten S. diastatochromogenes ΔpokOIV::pTESa, ΔpokOIV::foxRI, ΔpokOIV::foxRII, ΔpokOIV::foxRIV, ΔpokOIV::foxRVI, ΔpokOIV::foxRVII, ΔpokOIV::foxRVIII, ΔpokOIV::foxRIX und ΔpokOIV::foxRX. Graue Markierung: Foxicin A bei einer Retentionszeit von 16 min.

182 Anhang

IV. In silico Analysen der BCGs mit Ähnlichkeit zum fox-Cluster

Tab. 54: In silico Analysen der ORFs des BGC 7 aus S. collinus Tü365

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

ctg1_963 Phenylacetat-CoA Ligase (AMP- 1169439 - Streptomyces sp. NRRL WC-3725 WP_031025704.1 binding (Pro)) (431) 1170734 (0.0 - 395/431(92 %) - 799 bits(2063)) ctg1_962 -Hydrolase (306) 1168343 - Streptomyces sp. NRRL B-3648 WP_053707418.1 1169263 (7e-156- 226/281(80 %)- 445 bits(1144)) ctg1_961 hypothetisches/ Protein (610) 1166539 - Streptomyces sp. HGB0020 WP_016433337.1 1168371 (0.0 - 498/612(81 %)- 949 bits(2453)) ctg1_960 Acyl-CoA Synthetase (AMP- 1164765 - Streptomyces sp. Ag109_G2-15 WP_097256479.1 bindin (dhb|sal)) (539) 1166384 (0.0 - 486/534(91 %)- 995 bits(2573)) ctg1_959 Enoyl-CoA Hydratase (ECH) 1163776 - Streptomyces olindensis WP_031118609.1 (266) 1164576 (8e-177- 248/266(93 %)- 496 bits(1276)) ctg1_958 DNA-Bindeprotein (313) 1162814 - Streptomyces puniciscabiei WP_069782709.1 1163755 (0.0 - 286/313(91 %) - 583 bits(1502)) ctg1_957 Lipid-Transferprotein (349) 1161768 - Streptomyces sp. MUSC 14 WP_071376211.1 1162817 (0.0 - 317/347(91 %)- 639 bits(1647)) ctg1_956 Acetyl-CoA Acetyltransferase 1160605 - Streptomyces griseochromogenes WP_067309623.1 (388) 1161771 (0.0 - 378/388(97 %)- 765 bits(1976)) ctg1_955 hypotetisches Protein (80) 1160269 - Streptomyces sp. MUSC 14 WP_071376213.1 1160511 (8e-48- 76/80(95 %)- 154 bits(390)) ctg1_954 hypothetisches Protein (165) 1159548 - Streptomyces lavenduligriseus WP_030783931.1 1160045 (6e-112 - 162/165(98 %)- 323 bits(828)) ctg1_953 N-Acetylmuramoyl-L-Alanine 1157563 - Streptomyces sp. NRRL B-3648 Amidase (656) 1159533 (0.0 - 550/658(84 %)- 1095 bits(2833)) WP_053707303.1 ctg1_952 Aminoglycosid 1156147 - Streptomyces griseochromogenes WP_067309600.1 Phosphotransferase Protein 1157292 (0.0 - 358/381(94 %)- 702 (381) bits(1813)) ctg1_951 hypothetisches Protein (497) 1154360 - Streptomyces griseochromogenes WP_067309598.1 1155853 (0.0 - 468/497(94 %) - 924 bits(2389)) ctg1_950 Phosphatase (476) 1152902 - Streptomyces sp. Ag109_G2-15 WP_097256489.1 1154332 (0.0 - 404/478(85 %)- 791 bits(2043)) ctg1_949 SsgA Familie 1152143 - Streptomyces cellostaticus WP_066998522.1 Sporulation/Zellteilungsregulat 1152556 (3e-76- 115/137(84 %)- 231 bits(588)) or (137) ctg1_948 Inositol 2-Dehydrogenase (337) 1151059 - Streptomyces puniciscabiei WP_079161662.1 1152072 (0.0 - 300/336(89 %) - 596 bits(1537)) ctg1_947 hypothetisches Protein (395) 1149756 - Streptomyces sp. NRRL S-1022 1150943 (0.0 - 304/364(84 %) - 605 bits(1559)) WP_030339589.1 ctg1_946 Peptidsynthetase (CAL) (577) 1147759 - Streptomyces griseochromogenes WP_079147017.1 1149492 (0.0 - 501/572(88 %) - 1013 bits(2618)) ctg1_945 Polyketisynthase (ACP - KS - AT 1133779 - Streptomyces sp. Ag109_G2-15 WP_097256494.1 - DH - KR - ACP - KS - AT - DH - 1147581 (0.0 - 3871/4636(83 %) - 7099 KR - ACP - C - FkbH) (4600) bits(18418)) ctg1_944 Polyketidsynthase (PCP - TE) 1131133 - Streptomyces puniciscabiei WP_069782606.1 (870) 1133745 (0.0 - 666/872(76 %) - 1212 bits(3135)) ctg1_943 Esterase (379) 1129997 - Streptomyces sp. Ag109_G2-15 WP_097256495.1 1131136 (0.0 - 350/379(92 %) - 704 bits(1817)) ctg1_942 Carboxylesterase (259) 1129155 - Streptomyces griseochromogenes WP_067309574.1 1129934 (9e-171 - 236/258(91 %) - 480 bits(1235)) ctg1_941 Asparaginsynthase 1127037 - Streptomyces sp. Ag109_G2-15 WP_097256497.1 (Glutaminhydrolyse) (613) 1128878 (0.0 - 565/613(92 %) - 1146 bits(2965)) ctg1_940 hypotetisches Protein (175) 1126517 - Streptomyces yokosukanensis WP_067121874.1 1127044 (2e-69 - 125/176(71 %) - 216 bits(551)) ctg1_939 / -Hydrolase (548) 1124741 - Streptomyces sp. Ag109_G2-15 WP_097256499.1 1126387 (0.0 - 419/547(77 %) - 854 bits(2207)) ctg1_938 Chaplin (237) 1123744 - Streptomyces cellostaticus WP_066998489.1 1124457 (1e-76 - 156/229(68 %) - 238 bits(608)) ctg1_937 N-Acetyltransferase (284) 1122595 - Streptomyces cellostaticus WP_066998486.1 1123449 (2e-179 - 253/284(89 %) - 504 bits(1298))

183 Anhang

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

ctg1_936 N-Acetyltransferase (261) 1121519 - Streptomyces cellostaticus WP_066998478.1 1122304 (1,00E-138 - 214/261(82 %) - 399 bits(1024)) ctg1_935 Hydrolase (484) 1119878 - Streptomyces sp. 2231.1 WP_093695400.1 1121332 (0.0 - 773/911(85 %) - 1541 bits(3991)) ctg1_934 Exo- -D-Glucosaminidase (911) 1117104 - Streptomyces griseochromogenes WP_067309547.1 1119839 (0.0 - 307/309(99 %) - 617 bits(1590)) ctg1_933 ROK Regulator (400) 1115753 - Streptomyces yokosukanensis WP_067121854.1 1116955 (0.0 - 351/390(90 %) - 663 bits(1710)) ctg1_932 APC Permease (485) 1114176 - Streptomyces bungoensis WP_079060074.1 1115633 (0.0 - 439/484(91 %) - 883 bits(2282)) Stand: 07.11.2017

184 Anhang

Tab. 55: In silico Analysen der ORFs des BGCs aus S. avermitilis MA-4680

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

ctg1_1623 FUSC-family Protein (498) 1875451 - Streptomyces sp. CB03234 WP_073755721.1 1876947 (0.0 - 363/494(73 %) - 677 bits(1748)) ctg1_1624 hypothetisches Protein (68) 1877242 - Streptomyces mirabilis WP_075030296.1 1877448 (3e-31 - 55/67(82 %) - 112 bits(280)) ctg1_1625 ANTAR domain-containing 1877473 - Streptomyces sp. OK228 WP_097283199.1 Protein (116) 1877823 (9e-32 - 56/80(70 %) - 116 bits(290)) ctg1_1626 Lrp/AsnC Regulator (158) 1878051 - Streptomyces ipomoeae WP_009301667.1 1878527 (4e-101 - 152/158(96 %) - 295 bits(756)) ctg1_1627 HAD-family Phosphatase (239) 1878524 - Streptomyces sp. Tue6028 WP_095932662.1 1879243 (3e-129 - 195/228(86 %) - 373 bits(957)) ctg1_1628 XshC-Cox1-family Protein 1879347 - Streptomyces sclerotialus WP_030575241.1 (386) 1880507 (0.0 - 315/375(84 %) - 617 bits(1590)) ctg1_1629 Xanthin-Dehydrogenase-family 1880500 - Streptomyces sp. Ncost-T10-10d WP_093899985.1 Protein Molybdopterin-binding 1881981 (0.0 - 430/491(88 %) - 844 bits(2180)) subunit (493) ctg1_1630 Xanthine-Dehydrogenase- 1882639 - Streptomyces sp. OK228 WP_097283658.1 family Protein subunit M (330) 1883631 (0.0 - 298/330(90 %) - 560 bits(1443)) ctg1_1631 (2Fe-2S)-binding Protein (190) 1883628 - Streptomyces mirabilis WP_052067449.1 1884200 (1e-118 - 166/181(92 %) - 342 bits(878)) ctg1_1632 TetR/AcrR Regulator (192) 1884474 - Streptomyces lydicus WP_046924687.1 1885052 (4e-113 - 162/192(84 %) - 328 bits(842)) ctg1_1633 NAD(P)-dependent 1885125 - Streptomyces phaeochromogenes WP_055611633.1 Oxidoreductase (296) 1886015 (1e-167 - 239/295(81 %) - 475 bits(1223)) ctg1_1634 hypothetisches Protein (539) 1886233 - Streptomyces sclerotialus WP_030581159.1 1887852 (0.0 - 417/533(78 %) - 784 bits(2025)) ctg1_1635 Acyltransferase (419) 1888040 - Streptomyces glauciniger WP_089228755.1 1889299 (0.0 - 293/402(73 %) - 578 bits(1489)) ctg1_1636 GAP-family Protein (175) 1889510 - Streptomyces sp. AS58 WP_053755896.1 1890037 (2e-76 - 121/174(70 %) - 236 bits(603)) ctg1_1637 Carboxymuconolacton 1890201 - Streptomyces sp. Ncost-T10-10d WP_093898613.1 Decarboxylase-family Protein 1890674 (3e-85 - 135/156(87 %) - 256 bits(654)) (157) ctg1_1638 RpiB/LacA/LacB-family 1890784 - Streptomyces scabiei WP_086749586.1 Zuckerphosphat-Isomerase 1891254 (1e-88 - 133/153(87 %) - 263 bits(673)) (156) ctg1_1639 Carboxylesterase (266) 1891269 - Streptomyces neyagawaensis WP_055543089.1 1892069 (7e-156 - 216/258(84 %) - 442 bits(1138)) ctg1_1640 Esterase (378) 1892133 - Actinobacteria bacterium OK006 WP_054228759.1 1893269 (0.0 - 352/378(93 %) - 714 bits(1842)) ctg1_1641 Polyketidsynthase (PCP - TE) 1893266 - Streptomyces mirabilis WP_075025589.1 (842) 1895794 (0.0 - 689/851(81 %) - 1294 bits(3348)) ctg1_1642 Polyketidsynthase (ACP - KS - 1895828 - Streptomyces sp. NRRL S-646 WP_078912844.1 AT - DH - KR - ACP - KS - AT - 1910317 (0.0 - 3670/4878(75 %) - 6701 DH - KR - ACP - C - FkbH) bits(17385)) (4829) ctg1_1643 Peptidsynthetase (CAL) (574) 1910558 - Streptomyces sp. OK228 WP_097283581.1 1912282 (0.0 - 501/574(87 %) - 1015 bits(2624)) ctg1_1644 Klasse I SAM-dependent 1912604 - Streptomyces aureus WP_037616824.1 Methyltransferase (oMT) (226) 1913284 (1e-132 - 185/224(83 %) - 381 bits(978)) ctg1_1645 Serine/Threonine Phosphatase 1913338 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_051370506.1 (660) 1915320 (0.0 - 507/684(74 %) - 955 bits(2469)) ctg1_1646 MFS Transporter (440) 1915333 - Streptomyces alboviridis WP_032754837.1 1916655 (0.0 - 339/428(79 %) - 628 bits(1619)) ctg1_1647 AraC Regulator (331) 1916727 - Streptomyces pactum WP_055421384.1 1917722 (0.0 - 256/319(80 %) - 529 bits(1362)) ctg1_1648 hypothetisches Protein (121) 1917913 - Streptomyces sp. CdTB01 WP_058923184.1 1918278 (2e-61 - 101/121(83 %) - 192 bits(488)) 185 Anhang

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

ctg1_1649 unbekannt (278) 1918238 - unbekannt unbekannt 1919074 ctg1_1650 hypothetisches Protein (140) 1919349 - Streptomyces pharetrae WP_086169248.1 1919771 (3e-89 - 127/140(91 %) - 264 bits(674)) ctg1_1651 ABC-Transporter Permease 1920099 - Streptomyces phaeochromogenes WP_055615269.1 (292) 1920977 (1e-179 - 266/308(86 %) - 506 bits(1302)) ctg1_1652 ABC-Transporter ATP-binding 1920950 - Streptomyces phaeochromogenes WP_055615270.1 Protein (260) 1921732 (2e-164 - 238/260(92 %) - 463 bits(1192)) ctg1_1653 aliphatic sulfonates ABC- 1921845 - Streptomyces olivochromogenes WP_067372635.1 Transporter 1922873 (0.0 - 293/323(91 %) - 587 bits(1513)) Substratbindeprotein (342) ctg1_1654 alkanesulfonate 1922873 - Streptomyces phaeochromogenes WP_055615272.1 Monooxygenase (384) 1924027 (0.0 - 351/384(91 %) - 699 bits(1805)) ctg1_1655 NAD(P)/FAD-abhängige 1924069 - Streptomyces sp. Tue6028 WP_095932675.1 Oxidoreductase (362) 1925157 (0.0 - 318/352(90 %) - 635 bits(1639)) ctg1_1656 Aminodeoxychorismate Lyase 1925174 - Streptomyces mirabilis WP_037743041.1 (281) 1926019 (2e-157 - 229/281(81 %) - 448 bits(1153)) ctg1_1657 ABC-Transporter ATP-binding 1926063 - Streptomyces sp. 142MFCol3.1 WP_028800283.1 Protein (599) 1927862 (0.0 - 558/598(93 %) - 1116 bits(2887)) ctg1_1658 MarR Regulator (151) 1927957 - Streptomyces mirabilis WP_075025439.1 1928412 (4e-91 - 141/151(93 %) - 270 bits(690)) ctg1_1659 C4-Dicarboxylat-Transporter 1928740 - Streptomyces olivochromogenes WP_067373431.1 (85) 1928997 (1e-22 - 54/86(63 %) - 99.8 bits(247)) ctg1_1660 Peptid-N4-Asparagin Amidase 1929019 - Streptomyces phaeochromogenes WP_055615278.1 A (541) 1930644 (0.0 - 438/548(80 %) - 886 bits(2289)) ctg1_1661 Lipoprotein (274) 1930839 - Streptomyces griseoaurantiacus EGG43280.1 1931663 M045 (6e-142 - 208/267(78 %) - 408 bits(1049)) ctg1_1662 ABC-Transporter Permease 1931874 - Streptomyces sp. HG99 PIB06724.1 (620) 1933736 (0.0 - 537/612(88 %)- 1016 bits(2627)) Stand: 09.11.2017

186 Anhang

Tab. 56: In silico Analysen der ORFs des BGCs aus S. bingchenggensis BCW-1

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

ctg1_9140 ABC-Transporter 10895292 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089509914.1 Substratbindeprotein (371) 10896407 (9e-157 - 268/310(86 %)- 471 bits(1213)) ctg1_9141 Hydroxylase (305) 10896821 - Streptomyces sp. TP-A0356 WP_055490807.1 10897738 (2e-169- 235/305(77 %)- 480 bits(1236)) ctg1_9142 Anti-Sigmafactor (238) 10897895 - Streptomyces sp. Ncost-T10-10d (4e- WP_093897847.1 10898611 103- 175/239(73 %)- 307 bits(786)) ctg1_9143 RNA-Polymerase (192) 10898608 - Streptomyces atratus WP_072489594.1 10899186 (5e-113- 163/190(86 %)- 328 bits(841)) ctg1_9144 DUF1996 domain-containing 10899277 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_031118609.1 protein (323) 10900248 (0.0- 299/321(93 %)- 582 bits(1500)) ctg1_9145 C4-Dicarboxylat Transporter 10900532 - Streptomyces himastatinicus WP_009715634.1 DctA (487) 10901995 (0.0 - 402/475(85 %)- 750 bits(1937)) ctg1_9146 LysR Regulator (301) 10902067 - Streptomyces sp. NBRC 110468 WP_062642659.1 10902972 (0.0 - 263/301(87 %)- 513 bits(1322)) ctg1_9147 Tartratdehydrogenase (363) 10903132 - Streptomyces sclerotialus WP_030580608.1 10904223 (0.0 - 338/363(93 %)- 694 bits(1791)) ctg1_9148 Endoglucanase (599) 10904310 - Streptomyces sparsogenes WP_065967620.1 10906535 (0.0 - 458/575(80 %)- 826 bits(2133)) ctg1_9149 Endoglucanase (599) 10906741 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089509899.1 10908540 (0.0 - 553/595(93 %)- 1095 bits(2833)) ctg1_9150 TetR/AcrR Regulator (190) 10908587 - Streptomyces sp. B9173 10909159 (1e-99 - 150/190(79 %)- 294 bits(753)) WP_081548411.1 ctg1_9151 short-chain Dehydrogenase 10909317 - Streptomyces sp. S10(2016) WP_062930785.1 (KR) (233) 10910018 (1e-136 - 196/231(85 %)- 391 bits(1005)) ctg1_9152 hypothetisches Protein (368) 10910077 - Streptomyces natalensis WP_030072827.1 10911183 (0.0 - 281/368(76 %) - 524 bits(1349)) ctg1_9153 Carboxylesterase (260) 10911232 - Streptomyces sparsogenes WP_065967619.1 10912014 (2e-157 - 217/257(84 %) - 446 bits(1148)) ctg1_9154 Esterase (383) 10912070 - Streptomyces sp. cf386 WP_093910376.1 10913221 (0.0- 309/379(82 %)- 623 bits(1606)) ctg1_9155 Polyketidsynthase (PCP - TE) 10913218 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089509894.1 (768) 10915524 (0.0 - 729/785(93 %) - 1382 bits(3578)) ctg1_9156 Polyketidsynthase (ACP - KS - 10915566 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089509893.1 AT - DH - KR - ACP - KS - AT - 10929572 (0.0 - 4344/4699(92 %) - 8023 DH - KR - ACP - C - FkbH) bits(20818)) (4668) ctg1_9157 Peptidsynthetase (CAL) (584) 10929576 - Streptomyces sp. NBS 14/10 (0.0 - WP_089509953.1 10931330 552/586(94 %)- 1070 bits(2766)) ctg1_9158 hypothetisches Protein (91) 10931350 - Streptomyces sp. WP_014181762.1 10931625 (9e-46 - 72/73(99 %) - 149 bits(377)) ctg1_9159 TAT-pathway Signalsequenz 10931635 - Streptomyces sp. OK228 WP_097283324.1 Domänenprotein (482) 10933083 (0.0 - 334/445(75 %) - 670 bits(1728)) ctg1_9160 Endoglucanase (798) 10933262 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089510847.1 10935658 (0.0 - 776/798(97 %)- 1580 bits(4091)) ctg1_9161 GPP34-family Phosphoprotein 10936001 - Streptomyces sparsogenes WP_065967617.1 (200) 10936603 (8e-92 - 155/201(77 %) - 275 bits(704)) ctg1_9162 hypothetisches Protein (63) 10936646 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089510754.1 10936837 (2e-37 - 62/62(100 %)- 127 bits(319) ctg1_9163 hypothetisches Protein (158) 10936984 - Streptomyces avermitilis WP_037645932.1 10937460 (8e-87- 124/153(81 %)- 260 bits(665)) ctg1_9164 Tautomerase-family Protein 10937525 - Nocardiopsis gilva WP_017618945.1 (139) 10937944 (8e-79 - 113/139(81 %) - 238 bits(606)) ctg1_9165 Ig-family Protein (1114) 10938036 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089510759.1 10941380 (0.0 - 1056/1113(95 %)- 2072 bits(5368)) ctg1_9166 Endopolygalacturonase (507) 10941377 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089510760.1 10942900 (0.0 - 490/507(97 %) - 1016 bits(2626)) ctg1_9167 Fumarylacetoacetat Hydrolase 10943145 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089510761.1 (311) 10944080 (0.0 - 299/311(96 %) - 590 bits(1521))

187 Anhang

Name Funktion (AS) Position größte Ähnlichkeit Sequenz ID (E-Wert - Identities - BLAST score)

ctg1_9168 LacI Regulator (378) 10944031 - Streptomyces sp. PRh5 WP_037956177.1 10945167 (0.0 - 314/355(88 %) - 594 bits(1531)) ctg1_9169 Hydroxypyruvat Isomerase 10945397 - Streptomyces hygroscopicus WP_078638660.1 (260) 10946179 (1e-171 - 237/259(92 %)- 482 bits(1240)) ctg1_9170 Dehydrogenase (341) 10946224 - Streptomyces sp. Root369 WP_057613971.1 10947249 (0.0 - 290/340(85 %)- 568 bits(1463)) ctg1_9171 NAD(P)-abhängige 10947274 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089510763.1 Oxidoreductase (KR) (265) 10948071 (0.0 - 260/265(98 %)- 522 bits(1344) ctg1_9172 hypothetisches Protein (60) 10948433 - Streptomyces sp. RTd22 WP_063734257.1 10948615 (2e-13 - 34/41(83 %)- 68.2 bits(165)) ctg1_9173 hypothetisches Protein (190) 10948612 - Streptomyces violaceusniger WP_043236793.1 10949184 (7e-107 - 153/190(81 %) - 312 bits(800)) ctg1_9174 Typ IV Sekretionprotein Rhs 10949181 - Streptomyces sp. CNT360 WP_078514430.1 (141) 10949606 (6e-31 - 60/81(74 %) - 126 bits(316)) ctg1_9175 hypothetisches Protein (246) 10949614 - Streptomyces sp. CNT360 WP_051352065.1 10950354 (3e-104 - 147/244(60 %) - 310 bits (795)) ctg1_9176 LLM-Klasse Flavin-abhängige 10950354 - Streptomyces sp. NBS 14/10 WP_089510765.1 Oxidoreductase (362) 10951442 (0.0 - 328/336(98 %) - 644 bits(1660)) Stand: 09.11.2017

188 Anhang

V. Spektren der NMR-Analysen

13 Im Folgenden sind die Daten der NMR-Analysen aus den Fütterungsversuchen mit [ C6]-Glucose und 13C-1 Acetat, durchgeführt von Dr. Thomas Paululat (Department für Chemie und Biologie, Universität Siegen), dargestellt. Für weitere Informationen siehe Kapitel C. I. 6. 1 und Kapitel C. I. 6. 2.

Tab. 57: NMR-Daten von Foxicin A (600/150/60MHz, CDCl3 (Spuren von DCl (der Gasphase)), 25 °C)

Position Referenzsubstanz: δC from feeding experiment: δC; J (Hz) markierte Position

1 178.6 178.7 Nein 2 116.0 116.0 (mögliches coupling, d (80)) Nicht eindeutig 3 145.5 Signal nicht klar sichtbar Nicht eindeutig 3-OH - - - 4 182.3 182.3 Nein 5 111.8 111.8 Nein 6 137.2 137.3 Nein ʹ-NH - - - ʹ 171.6 171.6 (54) Ja ʹ 23.6 23.6 (54) Ja ʹʹ-NH - - - ʹʹ 167.5 167.5 Nein ʹʹ 128.2 128.2 Nein ʹʹ 12.5 12.5 Nein ʹʹ 144.2 144.2 Nein ʹʹ 32.7 32.7 Nein ʹʹ 20.8 20.8 Nein ? ʹʹ 126.7 126.8 Nein ʹʹ 132.3 132.4 (42) Ja ʹʹ 18.1 18.1 (42) Ja ʹʹ 25.7 25.7 (??? 44 ???) Nicht eindeutig

189 Anhang

Abb. 94: 13C NMR Spektrum von Foxicin A nach der Fütterung von [13C6]-Glucose (blau) und von unmarkiertem Foxicin A als Referenz (schwarz)

Abb. 95: 1H NMR Spektrum von Foxicin A nach der Fütterung von [13C6]-Glucose (blau) und von unmarkiertem Foxicin A als Referenz (schwarz)

190 Anhang

Abb. 96: Ergebnis der NMR-Analyse von Foxicin A aus der [1-13C]-Acetat Fütterung. Schwarz| Referenzspektrum von Foxicin A; rot| Spektrum von Foxicin A aus der [1-13C]-Acetat Fütterung. Messdauer 60 h.

191 Danksagung

Danksagung

„In every job that must be done there is an element of fun… “ Mary Poppins

Ich möchte mich herzlich bei allen bedanken, die mich bei meiner Promotion unterstützt haben und damit direkt oder indirekt zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Ich bedanke mich bei Prof. Dr. Andreas Bechthold für die Möglichkeit meine Promotion an seinem Lehrstuhl durchzuführen, für die Bereitstellung des interessanten Themas, für die Unterstützung und die Ratschläge und für das Interesse an meiner Forschung.

Bei Prof. Dr. Thorsten Friedrich möchte ich mich für die Übernahme des Koreferats bedanken, im Rahmen des sowieRTG1976. für das Ich Interessedanke Pro undf. Dr. die Stefan Anregungen Günther während für seine der Bereitschaft „Committee anMeetings meinem Rigorosum als Drittprüfer teilzunehmen.

I would like to thank Prof. Dr. Peter Leadlay from the Department of Biochemistry, University of Cambridge for the opportunity to stay in his lab and for the inspiring conversations. A special thank goes to Dr. Hui Hong who supervised and supported me and my experiments. Last but not least, all members of the Leadlay group, who made my stay unforgettable and who made it even harder to leave. My heartfelt thanks!

Ein großer Dank gilt Dr. Thomas Paululat der Universität Siegen für die große Hilfe vor, während und nach den Fütterungsexperimenten.

Bedanken möchte ich mich bei der gesamten AG Bechthold mit allen ehemaligen und aktuellen Kolleginnen und Kollegen die mich während meiner Zeit in Freiburg begleitet haben. Zudem bedanke ich mich bei allen Mitgliedern des Graduiertenkolleg RTG1976. Ein weiterer, großer Dank geht an die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), die meine Promotion finanzierten und mir die Teilnahme an großen Konferenzen ermöglichte.

Ich bedanke mich bei Dr. Gabriele Weitnauer, Elisabeth Welle, Sandra Gross und Marcus Essing, die mir bei allen Problemchen und Fragen tatkräftig zur Seite standen und vielen Dank für all die netten Gespräche. Zudem bedanke ich mich bei allen Mädels aus dem Sekretariat, die ich während meiner Promotion kennenlernen durfte und die mir bei allen organisatorischen Problemen halfen.

Danksagung

Ein großer Dank gilt auch meinen Studenten Maxie Schmitt, Fabienne Gutacker und Janina Hauser die meine Projekte tatkräftig unterstützten.

Bei meinen ehemaligen Kolleginnen und Kollegen Dr. Suzan Samra, Dr. Irene Santillana, Dr. Yvonne Schmidt-Bohli, Nils Gummerlich und Dr. Anja Greule möchte ich mich für die unterhaltsamen Mittagspausen und die netten Gespräche bedanken.

Mirjam Bernhard, Isabelle Fix, Fabienne Gutacker, Philipp Schwarzer, Dima Wassouf, vielen Dank für die vielen, tollen Gespräche, für Eispausen und G&T-Freitage.

Ich bedanke mich bei meinen fleißigen Korrekturleserinnen und -lesern Fabienne Gutacker, Philipp Schwarzer, Gerlinde Deubel und Simon Stemmler.

Insbesondere bedanke ich mich bei Philipp vong Schwarzer, König des Sauerlandes,

Mitbegründer des Hauses Hufflepuff und Bukhan„ Mountain-Bezwinger. Ich danke Dir für alle fachlichen und alle anderen Gespräche. Danke für die beste Denkzelle (im 4. OG der Stefan-Meier- Str. 19 (VF)) aller Zeiten.

Ich bedanke mich bei meinen Eltern, Helmuth und Gerlinde, die mich immer unterstützt haben und mir so vieles ermöglichten.

Emanuel, ich danke Dir für Deine Unterstützung, für Motivation, für Aufmunterung, für Kritik und vor allem dafür, dass Du immer an mich glaubst.

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“Mischief managed.”

MaraudersJ. Potter, S. Black,map R. Lupin, P. Pettigrew