Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A. C.

“REGENERACIÓN IN VITRO DE ECHEVERIA CALYCOSA MORAN (CRASSULACEAE), VÍA ORGANOGÉNESIS”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRA EN CIENCIAS DE LA FLORICULTURA

PRESENTA

Q.F.B. MARÍA DE JESÚS SALGADO GUTIÉRREZ

GUADALAJARA, JALISCO, MÉXICO. DICIEMBRE DE 2015.

REFERENCIAS

El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de cultivo de tejidos Vegetales en la Unidad de Biotecnología Vegetal del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ), bajo la dirección de la Dra. Noemí Obledo Vázquez.

Formó parte del proyecto “Desarrollo de protocolos de propagación de dos especies vegetales endémicas de Michoacán: Echeveria purhepecha y Echeveria calycosa”.

Se realizó en colaboración con el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Michoacán del Instituto Politécnico Nacional y con el Colegio de Michoacán.

Financiado por el Fondo Mixto CONACYT – Gobierno del Estado de Michoacán.

La autora de la presente tesis contó con el apoyo de la beca CONACYT, como parte del “Programa Nacional de Posgrados de Calidad”

Con agradecimiento al fondo mixto CONACYT- gobierno del Estado de Jalisco, proyecto 2008 – 04 – 99210 “Fortalecimiento de la maestría de ciencias de la floricultura”, programa del posgrado de nueva creación del CIATEJ.

a

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ, A.C.), por haberme dado la oportunidad de, una vez más formarme tanto académica como profesionalmente, así como por proporcionarme los conocimientos durante el periodo de la maestría así como brindarme el apoyo y las facilidades para realizar el presente trabajo de investigación y obtener el grado de Maestra en Ciencias de la Floricultura.

A la Dra. Noemí Obledo Vázquez que fungió como directora de esta tesis; por el apoyo brindado, por transmitir sus conocimientos y experiencia para la realización de este trabajo.

Al comité tutorial: Dr. Rodrigo Barba G. y el Mtro. Ignacio Ruíz, por su colaboración y apoyo en la realización de este trabajo.

A los Doctores y Maestros de la unidad de biotecnología vegetal que colaboraron en mi formación profesional y que me apoyaron para lograr esta meta.

A todos los compañeros del posgrado y del laboratorio, con quien tuve el gusto de compartir este periodo, cada uno de ellos contribuyó para que yo pudiera seguir sin desistir, con su aceptación, sus consejos y su experiencia profesional.

GRACIAS

b

DEDICATORIAS

A mi esposo: Felipe

A mis hijos: Andrea, Felipe y Alan

Sin su apoyo no hubiera sido posible terminar este grado, no hay palabras para expresar mi agradecimiento y mi amor incondicional para Uds. “mi familia”.

A LA MEMORIA DE

Mis padres

Sr. Jesús Salgado Salgado

Sra. Otilia Gutiérrez García

a quien debo lo que soy

A Dios por el milagro de la vida

c Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

TABLA DE CONTENIDO

Página

REFERENCIAS ______a AGRADECIMIENTOS ______b DEDICATORIAS ______c ABREVIATURAS ______i INDICE DE TABLAS ______ii INDICE DE FIGURAS ______v RESUMEN ______1 SUMMARY ______2 1 ANTECEDENTES ______2 1.1 FAMILIA CRASSULACEAE ______4 1.2 EL GÉNERO ECHEVERIA ______5 1.2.1 Echeveria calycosa ______6 1.3 PROPAGACIÓN DEL GÉNERO ECHEVERIA ______8 1.3.1 Reproducción sexual ______8 1.3.2 Reproducción asexual______8 1.4 REGENERACIÓN POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS in vitro ______8 1.4.1 Medio de cultivo in vitro ______10 1.4.2 Auxinas ______10 1.4.3 Citocininas ______11 1.4.4 Etapas del cultivo in vitro ______11 1.4.5 Trabajos publicados del cultivo in vitro en diferentes especies de Echeveria ______13 2 JUSTIFICACIÓN ______15 3 HIPOTESIS ______16 4 OBJETIVOS ______17 4.1 General ______17 4.2 Específicos ______17 5 METODOLOGÍA ______18 5.1 Material Vegetal ______18 5.2 Propagación por semilla (sexual) ______18

I Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

5.3 Propagación por esqueje de hoja (asexual) ______19 5.4 Propagación in vitro ______19 5.4.1 Establecimiento ______19 5.4.1.1 Explantes ______19 5.4.1.2 Desinfección de los explantes ______21 5.4.1.3 Establecimiento de los explantes ______22 5.4.2 Propagación ______22 5.4.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui. ______22 5.4.2.2 Propagación, experimentos bifactoriales con 4 niveles. ______23 5.4.2.2.1 Primer experimento de propagación______23 5.4.2.2.2. Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E.calycosa obtenidas in vitro. ______26 5.4.2.2.3 Primer experimento de propagación utilizando E. purhepecha ______26 5.4.2.3.1 Segundo experimento de propagación ______27 5.4.2.3.2 Segundo experimento de propagación utilizando E. purhepecha ______29 5.5 Enraizamiento ______30 5.6 Aclimatación (periodo ex vitro) ______32 5.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro ______34 6 RESULTADOS y DISCUSIÓN ______36 6.1 Propagación por semilla (sexual) ______36 6.2 Propagación por esqueje de hoja (asexual) ______39 6.3 Propagación in vitro ______40 6.3.1 Establecimiento ______40 6.3.1.1 Explantes ______42 6.3.1.2 Desinfección de los explantes. ______44 6.3.2 Propagación ______45 6.3.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui ______45 6.3.2.2 Propagación con diferentes tratamientos de RCV experimentos bifactoriales con 4 niveles ______47 6.3.2.2.1 Primer experimento bifactorial de propagación ______47 6.3.2.2.2 Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E. calycosa propagadas in vitro ______57 6.3.2.3.1 Primer experimento de propagación con E. purhepecha ______61 6.3.2.4. Segundo experimento de propagación ______65 6.3.2.4.1 Segundo experimento bifactorial de propagación con Echeveria purhepecha 72 6.4. Inducción de brotes a partir de callo ______78

II Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

6.5 Enraizamiento ______82 6.5.1 Enraizamiento de hojas ______89 6.6 Aclimatación (periodo ex vitro) ______91 6.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro ______94 7. CONCLUSIONES ______96 8. BIBLIOGRAFÍA ______98 9. ANEXO 1. Tablas y figuras del análisis estadístico ______104 10. APENDICE ______116

III Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

ABREVIATURAS ANA Ácido naftalen acético ANOVA Análisis de varianza AZ sacarosa BAP bencil amino purina °C grados centígrados C.A. carbón activado CIATEJ Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco cm centímetros col. colaboradores conc. concentración fig. figura g/l gramos por litro HCl ácido clorhídrico HSA hemisulfato de Adenina IBA ácido indol butírico KIN cinetina lb libras LSD Least Significant Difference, (prueba de Fisher) mg miligramos min minutos ml mililitro MS Murashige and Skoog (medio de cultivo) µ micras N Normalidad: equivalentes gramo del soluto por litro de solución NaOH Hidróxido de sodio pH potencial hidrógeno; (medida de acidez o alcalinidad de una disolución). ® Marca Registrada RCV reguladores de crecimiento vegetal SA sulfato de Adenina

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Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

INDICE DE TABLAS

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Tabla 1. Procedimientos para establecer los explantes de E. calycosa in vitro ------20 Tabla 2. Tratamiento de desinfección de los explantes de E. calycosa ------21 Tabla 3. Concentraciones de RCV utilizadas en el primer experimento de propagación ------24 Tabla 4. Tratamientos que componen el primer experimento de propagación ------25 Tabla 5. Concentraciones de RCV utilizadas en el segundo experimento de propagación ------27 Tabla 6. Tratamientos que componen el segundo experimento de propagación ------28 Tabla 7. Tratamientos para enraizar las rosetas de E. calycosa obtenidas en la propagación in vitro ------31 Tabla 8. Procedimiento para aclimatar rosetas de E. calycosa obtenidas mediante enraizamiento in vitro ------33 Tabla 9. Tratamientos para la aclimatación – enraizado ex vitro ------35 Tabla 10. Resultados de los tratamientos para establecer los explantes de E. calycosa in vitro ---- 40 Tabla 11. Resultados de la propagación de E. calycosa con la combinación de RCV utilizada en E. laui ------45 Tabla 12. Número de explantes de E. calycosa establecidos al inicio y los que sobrevivieron después de 120 días en el primer experimento de propagación ------47 Tabla 13. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta de regeneración a los 30 días de establecidos in vitro ------.49 Tabla 14. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta de regeneración a los 60 días de establecidos in vitro ------50 Tabla 15. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta de regeneración a los 90 días de establecidos in vitro ------51 Tabla 16. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta de regeneración a los 120 días de establecidos in vitro ------52 Tabla 17. Resumen del comportamiento de los explantes de E. calycosa durante el primer experimento de propagación ------53 Tabla 18. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que se establecieron y los que sobrevivieron después de 90 días ------58

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Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

Tabla 19. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que presentaron respuesta a los 120 días ------59 Tabla 20. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron después de 120 días------62 Tabla 21. Número de explantes de E. purhepecha que presentaron respuesta a 120 días. ------63 Tabla 22. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 120 días, en el primer estudio de propagación ------64 Tabla 23. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que sobrevivieron después de 90 días en el segundo experimento de propagación ------66 Tabla 24. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que presentaron respuesta a los 30 días ------67 Tabla 25. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que presentaron respuesta a los 60 días. ------69 Tabla 26. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que presentaron respuesta a los 90 días ------71 Tabla 27. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron después de 90 días en el segundo experimento de propagación ------.73 Tabla 28. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que presentaron respuesta a los 90 días ------74 Tabla 29. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 90 días, en el segundo estudio de propagación ------75 Tabla 30. Área en cm2 de los callos producido por los tratamientos 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15 y 16 en el primer estudio de propagación ------78 Tabla 31. Respuesta obtenida al establecer los callos obtenidos del primer estudio de propagación de E. calycosa, en los tratamientos donde se produjeron brotes ------80 Tabla 32. Resultados obtenidos en los diferentes tratamientos de enraizamiento ------83 Tabla 33. Presencia de tallos fusionados en plántulas de E. calycosa, enraizadas en diferentes concentración de sacarosa ------88 Tabla 34. Número de hojas enraizadas y con roseta ------89 Tabla 35. Resultados de la aclimatación de las plántulas obtenidas del periodo de enraizamiento in vitro ------91

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Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

Tabla 36. Resultados de la aclimatación y enraizamiento simultáneos de plántulas de E. calycosa. ------94 Tabla 37. Resumen del análisis estadístico de la influencia del tratamiento para establecer explantes de E. calycosa en la respuesta obtenida por los explantes ------104 Tabla 38. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de los tratamientos de desinfección en la calidad de explantes de E. calycosa. ------105 Tabla 39. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la especie de Echeveria en la respuesta de los explantes de las dos especies de Echeveria en el segundo estudio de propagación ------106 Tabla 40. Resumen Análisis de varianza de la influencia de los 16 tratamientos de RCV en la respuesta del explante de E. calycosa en el primer estudio de propagación ------107 Tabla 41. Resumen del análisis estadístico de la influencia de la especie de Echeveria con respecto a la respuesta obtenida por los explantes de las dos especies de Echeveria comparadas en el primer estudio de propagación ------108 Tabla 42. Resumen Análisis de varianza de la influencia de los tratamientos de enraizado en la respuesta de las rosetas de E. calycosa ------109 Tabla 43. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa sobre el tamaño de la roseta de E. calycosa ------110 Tabla 44. Resumen del Análisis de varianza de la influencia del carbón activado sobre el tamaño de la roseta de E. calycosa ------111 Tabla 45.- Resumen del Análisis de varianza de la influencia del carbón activado sobre sobre el para largo de raíz ------112 Tabla 46. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa sobre el largo de la raíz ------113 Tabla 47. Resumen del Análisis de varianza de la influencia del carbón activado sobre el largo de raíz ------114 Tabla 48. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa en la respuesta de formación de tallos fusionados en las rosetas de E. calycosa en la etapa de enraizamiento ------115

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Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

INDICE DE FIGURAS Página Figura 1.Distribución del género Echeveria en la república Mexicana ------6 Figura 2. Planta de E. calycosa floreciendo ------7 Figura 3. Inflorescencia de E. calycosa ------7 Figura 4. Plantas de E. calycosa en su hábitat natural y en invernadero ------18 Figura 5. Rosetas obtenidas por cultivo in vitro a partir de un explante de E. Calycosa propagado en medio MS 50% suplementado con ANA: KIN, 4: 6 mg/l ------26 Figura 6. Semillas de E. calycosa ------36 Figura 7. Semillas de E. Calycosa germinadas ------37 Figura 8. Plántulas obtenidas por germinación de semilla ------38 Figura 9. Plantas de E. calycosa obtenidas de semillas ------38 Figura 10. Explantes de hoja de E. calycosa establecidos en tepojal – peat moss ------39 Figura 11. Presencia de contaminación de explantes de E. calycosa ------41 Figura 12. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa ------41 Figura 13. Procedencia de los explantes que se utilizaron en el tratamiento no. 4 del establecimiento in vitro de E. calycosa. ------42 Figura 14. Sobrevivencia de los explantes de E. calycosa al proceso de desinfección ------43 Figura 15. Calidad de los explantes de E. calycosa de acuerdo al tejido que le dio origen ------43 Figura 16. Explante de hoja de E. calycosa dañado por el tratamiento de desinfección ------44 Figura 17. Explantes de E. calycosa muestran organogénesis directa ------46 Figura 18. Rosetas de E. calycosa hiperhidratadas ------46 Figura 19. Porcentaje de sobrevivencia de explantes de E. calycosa establecidos en 4 diferentes estudios------48 Figura 20. Variación de la calidad de los explantes de E. calycosa, durante el tiempo de estudio inicial, 30 60, 90 y 120 días ------53 Figura 21. Calidad en % de los explantes de hoja e inflorescencia de E. calycosa, a los 120 días ------54 Figura 22. Respuesta que presentaron los explantes de E. calycosa a los 120 días dependiendo del tipo de explante ------54

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Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

Figura 23. Respuesta representativa de los explantes de E. calycosa a los tratamientos del primer estudio de propagación ------56 Figura 24. Respuesta de los explantes de rosetas obtenidas in vitro de E. calycosa a los tratamientos del primer estudio de propagación los 180 días ------60 Figura 25. Número de explantes de E. purhepecha que presentaron respuesta dependiendo del tipo de explante a los 120 días ------64 Figura 26. Número de explantes de E. calycosa que presentaron un calidad de entre 1 y 5 durante los primeros 30 días de propagación ------68 Figura 27. Porcentaje de sobrevivencia de explantes de E. calycosa a los 30 días de iniciada la etapa de propagación ------68 Figura 28. Número de explantes de E. calycosa que presentaron una calidad entre 1 y 5 a los 60 días de iniciada la propagación ------70 Figura 29. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa a los 60 días de iniciada la propagación ------70 Figura 30. Número de explantes de E. calycosa durante el periodo de la propagación ------71 Figura 31. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa, en el periodo de propagación a los 90 días ------72 Figura 32. Organogénesis indirecta, en explantes de E. calycosa con 180 días ------76 Figura 33. Organogénesis directa en explantes de E. calycosa con 90 días ------77 Figura 34. Organogénesis directa en diferentes épocas del año ------77 Figura 35. Callos producidos en el primer estudio de propagación ------79 Figura 36. Formación de brotes a partir del callo del explante 25.7.1 ------81 Figura 37. Formación de brotes a partir de callo del explante 212.1 ------81 Figura 38. Rosetas enraizadas en el medio de cultivo adicionado con ANA (0.1 mg/l) ------82 Figura 39. Rosetas enraizadas a partir de medios de cultivo sin RCV ------84 Figura 40. Rosetas enraizadas en medio de cultivo sin RCV: ------85 Figura 41. Rosetas enraizadas en medio de cultivo adicionado con KIN (0.1 mg/l). ------85 Figura 42. Rosetas con exposición a la KIN, in vitro ------86 Figura 43. Rosetas enraizadas en medios de cultivo adicionados con KIN ------87 Figura 44. Relación entre la alteración de tallos fusionados en las plántulas de E. calycosa con respecto al aumento de la concentración de sacarosa en el medio de enraizamiento ------88

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Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

Figura 45. Hojas que formaron raíz y roseta en los medios de enraizamiento in vitro sin adición de RCV ------90 Figura 46. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de aclimatación. ------92 Figura 47. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de aclimatación por grupo de estudio de enraizamiento del que proceden ------92 Figura 48. Parte de las plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de aclimatación, en invernadero ------93 Figura 49. Plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de enraizado - acondicionado simultaneo ex vitro ------96 Figura 50. Análisis de medias de la influencia de grupo de tratamiento sobre la respuesta del explante en el establecimiento. ------104 Figura 51. Análisis de medias de la influencia del tipo de explante en la calidad obtenida en el establecimiento de los explantes ------105 Figura 52. Análisis de medias de la influencia de la especie de Echeveria en la respuesta en el segundo experimento de propagación ------106 Figura 53. Análisis de medias de la influencia de los tratamientos de RCV del primer estudio de propagación sobre la respuesta obtenida en los explantes de E. calycosa ------107 Figura 54. Análisis de medias de la influencia de la especie de Echeveria en la respuesta en el primer experimento de propagación ------108 Figura 55. Análisis de las medias de la influencia de los 14 tratamientos para enraizamiento de rosetas de E. calycosa en la respuesta de altura de la roseta ------109 Figura 56. Análisis de medias de la influencia de la concentración de sacarosa utilizada en el enraizamiento sobre la altura de la planta ------110 Figura 57. Análisis de medias de la influencia del carbón activado en la altura de la planta ------111 Figura 58. Análisis de medias de la influencia del carbón activado en el largo de la raíz ------112 Figura 59. Análisis de medias de la influencia de la concentración de sacarosa utilizada en el enraizamiento en el largo de la raíz------113 Figura 60. Análisis de medias de la influencia del carbón activado en lo largo de la raíz ------114 Figura 61. Análisis de medias de la influencia de la concentración de sacarosa utilizada en el medio de enraizamiento en la formación de tallos fusionados en rosetas de E. calycosa ------115

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RESUMEN Echeveria calycosa Moran, planta suculenta, pertenece a la familia Crassulaceae y al género Echeveria con forma de roseta, atractiva, destinada a planta ornamental. Endémica del Estado de Michoacán, expuesta a diferentes situaciones que ponen en riesgo su prevalescencia dentro de su hábitat natural. Para contribuir a su propagación y a su conservación, se probaron diferentes técnicas de propagación ex vitro e in vitro. Ex vitro se trabajó: propagación por esqueje de hoja de roseta, se establecieron en contendores de plástico con tepojal: peat moss (1:1) como sustrato, bajo condiciones controladas; no se obtuvo éxito en esta propagación; propagación por semilla, se desinfectaron y sembraron semillas de E. calycosa en contenedores de plástico con tepojal: peat moss (1:1) como sustrato, se mantuvieron bajo condiciones de temperatura, humedad y luz controlada, obteniendo un índice de germinación de 15%. In vitro se establecieron hojas de roseta y fragmentos de inflorescencia, en medio de cultivo Murashige – Skoog (MS) a temperatura, humedad y luz controlada. El establecimiento se logró con tratamiento de desinfección y utilizando la etapa 0 con el fungicida amistar ®, obteniendo una sobrevivencia de 62%. En la propagación, los esquejes establecidos se estimularon con diferentes proporciones de reguladores de crecimiento vegetal: ácido naftalen acético (ANA) y cinetina (KIN) adicionados al medio de cultivo, donde el tratamiento que contenía 4:2 (mg/l) de ANA: KIN fue el que produjo mejor respuesta, hasta 50 brotes por explante a los 180 días. En la etapa de enraizamiento, se utilizó medio de cultivo MS (100 y 50%); con y sin carbón activado (2 g/l); con y sin ANA o KIN (0.1 mg/l); y sacarosa (30.0, 15,7.5 y 0.0 g/l); obteniendo plántulas de mayor tamaño en el medio de cultivo MS – sacarosa 30 g/l – KIN 0.1 mg/l y raíz de mayor tamaño en medio MS - Sacarosa 30 g/l - Carbón activado (2g/l). Aclimatación ex vitro.- Las plántulas obtenidas se sembraron en maceta con tepojal: peat moss 1:1, como sustrato la sobrevivencia fue 75.7%. Enraizamiento y aclimatación simultanea ex vitro.- se utilizó ácido Indol butírico (IBA) (0.2 y 0.1 mg/ml) en plantas sin raíz y plantas con raíz (con y sin hemisulfato de adenina); las plantas con raíz adicionadas con HSA tuvieron el mejor resultado, con una sobrevivencia de 100%. Se logró la propagación in vitro de Echeveria calycosa utilizando métodos biotecnológicos, contribuyendo a su preservación y posiblemente a la de otras especies que pertenecen al género Echeveria.

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SUMMARY Echeveria calycosa Moran. Succulent plant, belong to the genus Echeveria of the Crassulaceae family, with rosette shape, attractive, intended as an ornamental plant. Endemic to Michoacán state, it is exposed to different situations that are threatening its existence in the wild. To contribute to its propagation and conservation, different multiplication techniques were tested, ex vitro and in vitro. In ex vitro: 1) propagation by rosette leaf cuttings, they were established in pots containing soil tepojal:peat moss (1: 1) with controlled temperature, humidity and photoperiod; this propagation wasn’t successful. 2) Propagation by seed; seeds of E. calycosa were disinfected and planted in soil tepojal:peat moss (1:1), kept in controlled conditions of temperature, humidity and light obtaining a germination rate of 15%. In vitro: rosette leaves and cincinni fragments were settled on MS medium, with controlled temperature, humidity and light. The establishment was achieved with disinfection treatment using stage 0 with the fungicide Amistar ®, obtaining 62% survival. For propagation, cuttings were stimulated with different growth regulators ratios: naphthaleneacetic acid (NAA) and kinetin (KIN) added to the culture medium to produce a regenerative response, the best response was obtained with the treatment containing: ANA: KIN (4: 2, mg/l), obtaining up to 50 shoots per explant after 180 days. For rooting, MS (1, ½) medium was used; with and without activated carbon (2 g/l); with and without ANA or KIN (0.1 mg/l); and sucrose (30, 15, 7.5 and 0.0 g/l); obtaining the biggest plants in MS medium - sucrose 30 g/l - KIN 0.1 mg/l and the higher root production was achieved in MS - Sucrose 30 g/l - Activated charcoal (2 g/l). "Ex vitro" Acclimatization- the obtained plantlets were planted in pots with soil, tepojal: peat moss, 1: 1; the survival was 75.7%. Simultaneous ex vitro rooting and acclimatization.- Indole butyric acid (IBA) (0.2 and 0.1 mg/ml) was used in plants with and without roots (both with and without presence of HSA); plants with root-spiked with HSA, had the best result, with 100%survival. The in vitro propagation of Echeveria calycosa was achieved using biotechnological methods, contributing to its preservation and possibly to other species belonging to the genus Echeveria.

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1 ANTECEDENTES En nuestro país existen numerosas especies florales cuya importancia ambiental, científica, médica, económica o cultural es esencial para el buen funcionamiento de los ecosistemas, contribuyendo al bienestar y a la salud humana. Al proteger y conservar la biodiversidad se cuida las fuentes de alimentación y el medio ambiente. Al hablar de biodiversidad es necesario incluir desde la cultura e identidad de los pueblos, hasta la investigación científica, pasando por la educación e incluso la religión, pudiendo llegar a trascender en el ámbito moral. Al perder una especie, con ella se pierde toda la información, los bienes y servicios que proporciona, así como los usos potenciales que podría prestar. Lamentablemente a pesar de que es reconocido el gran valor y la importancia de la biodiversidad, la pérdida de ésta es una realidad debido principalmente a actividades del ser humano, como son agricultura, ganadería, urbanismo y sector industrial entre otros, seguido de la pérdida causada por catástrofes naturales como son inundaciones, erosiones, deslaves, etc. reconociendo que algunos de estos desastres son también causados por intervención del ser humano, siendo esta pérdida tan rápida que en la mayoría de los casos no se llega a conocer su importancia. La flora de México es una de las más diversas del planeta. Se han hecho estimaciones sobre su riqueza florística, la cual oscila entre las 22 000 y las 31 000 especies, de las cuales alrededor de 9 300 presentan algún endemismo. La evaluación más reciente, realizada por Villaseñor (2004), indica que la flora de México tiene más de 23 424 especies de plantas vasculares (helechos y plantas afines, gimnospermas y plantas con flores) y 2 663 géneros, de los cuales 218 se consideran endémicos al país. También se estima que entre el 40% y 50% de la flora vascular es endémica del territorio mexicano (Rzedowski, 1991; Toledo, 1993; Villaseñor, 2003, 2004; Sosa y De Nova, 2012). Echeveria calycosa es una especie endémica del Estado de Michoacán, el cual presenta una gran diversidad florística la que se explica principalmente por su complejidad geológica y climática. El clima que predomina en la región de la barranca del río Cupatitzio es semicálido sub-húmedo con abundantes lluvias en verano, 630.6 mm en la zona, la temperatura media anual fluctúa entre 18 y 20 °C (Hernández, 2009). La vegetación del Área de Río Cupatitzio no ha sido descrita en detalle, aunque se considera que incluye elementos florísticos de bosque de pino-encino, mesófilo de montaña y de galería, perturbados por la introducción de plantas exóticas. En el Parque Nacional Barranca del Cupatitzio se ha registrado un total de 563 especies de plantas; 495 de éstas son nativas, de las que 50 son helechos, 10 son coníferas y 435 plantas con flor, además de 68 especies introducidas. De la especie Echeveria calycosa perteneciente a la familia Crassulaceae, endémica del estado de Michoacán, se han reportado poblaciones en el cañón del rio Cupatitzio en la localidad de Tinaja Verde perteneciente al municipio de Uruapan. Es una especie apreciada como planta de ornato, por

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lo cual es comercializada utilizando para ello ejemplares obtenidos directamente de su hábitat natural. Esta actividad, aunada a su lento crecimiento, las pocas poblaciones que se tienen localizadas, las dificultades que presenta para su propagación y el cambio de uso de suelo circundante a su hábitat, amenazan su prevalencia. Por esta razón se decidió realizar un trabajo de investigación con la finalidad de incrementar su índice de propagación utilizando técnicas biotecnológicas como es el cultivo de tejidos vegetales in vitro. 1.1 FAMILIA CRASSULACEAE Crassulaceae, del latín (“crassus”= hoja gruesa) es una familia de angiospermas morfológicamente diversa y compleja que está integrada por cerca de 1 500 especies repartidas en 35 géneros (Berger, 1930). Es uno de los grupos más importantes conformado por plantas que poseen hojas, tallos o raíces suculentas, cultivadas ampliamente como ornamentales por su gran atractivo natural. Se distribuyen casi en todo el mundo, pero la mayoría se encuentran en cinco centros de diversidad: en primer lugar se encuentra México con aproximadamente 330 especie de las cuales cerca del 89,2 % son endémicas del país y el 37,3 %, endémicas de algún Estado; le sigue Asia oriental con aproximadamente 300 especies, Sudáfrica con cerca de 225 especies; la cuenca del Mediterráneo con aproximadamente 100 especies y en quinto lugar se encuentra Macronesia con aproximadamente 63 especies. En general, las especies crecen mejor en zonas áridas y semiáridas y ambientes rocosos montañosos con climas templados (Reyes y col., 2011; Oviedo, 2003).

Las crasuláceas son plantas tipo CAM, que a diferencia de las plantas C3 y C4, asimilan CO2 atmosférico en ácidos de cuatro carbonos, principalmente de noche y subsecuentemente, lo fijan durante el siguiente día vía ciclo de Calvin. Los estomas de las plantas CAM permanecen abiertos durante la noche y cerrados durante la mayor parte del día, resultando de esta manera en una pérdida mínima de agua y fotorrespiración reducida (Herppich y Peckmann, 2000). Las plantas CAM exhiben tasas en la eficiencia del uso del agua de cinco a diez veces más altas que las plantas C4, resultando en una considerable ventaja competitiva en ambientes en que el agua es el factor limitante, como por ejemplo desiertos o ambientes epífitos (Cushman, 2001). Son plantas desde herbáceas hasta arbustivas, solitarias o cespitosas con hojas dispuestas en forma de roseta (Oviedo, 2003), o a lo largo de un tallo, dando lugar a una roseta floja. El color de las hojas muestra diferentes tonalidades de verde, en ocasiones se observa la presencia de máculas rojas. Con frecuencia perennes, aunque también hay anuales o bienales. Las inflorescencias pueden ser centrales, terminales, axiales o laterales. Las flores son actinomorfas, los sépalos, pétalos y carpelos tienen igual número, en ocasiones tienen el mismo número de estambres. Los frutos con 4 a 5 folículos membranosos, dehiscentes por valvas con numerosas semillas pequeñas. Muchas están en peligro de extinción y en la gran mayoría de los casos su estatus está pobremente documentado.

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La descripción más amplia de Crassulaceae es de Berger en 1930, que reconoce 35 géneros en seis subfamilias que han sido colocadas en dos linajes, el linaje Crassula que incluye tres subfamilias (Crassuloideae, Cotyledonoideae y Kalanchoideae) encontrándose predominantemente en el sur de África y el linaje Sedum que incluye también tres subfamilias (Echeverioideae, Sedoideae, y Sempervivoideae) encontrándose predominantemente en el hemisferio norte (‘t Hart y Eggli, 1995). Dentro de estos dos linajes, Berger delimitó subfamilias basadas principalmente en la morfología floral, la posición de las hojas y de las inflorescencias. En tiempos recientes han surgido otras propuestas de clasificación para casi todos los grupos de organismos. Dos factores han disparado este fenómeno: 1) el concepto de monofilia como base para reconocer y nombrar grupos. Todos los miembros incluidos en alguna de las categorías taxonómicas deben tener un origen común. 2) los estudios sobre las secuencias del ADN que han sido utilizadas para generar hipótesis sobre la historia evolutiva, estos estudios conocidos como filogenias moleculares, han modificado profundamente la idea de la evolución y consecuentemente, la clasificación de muchos grupos de plantas, incluida las de la familia Crassulaceae. A pesar del uso de numerosas fuentes de datos, las relaciones sistemáticas dentro Crassulaceae no son aún claras y requieren de estudios más profundos. 1.2 EL GÉNERO ECHEVERIA Es un grupo exclusivo de América. La Mayoría de las especies crecen mejor en las zonas templadas del Hemisferio Norte. Está conformado por 127 especies conocidas y registradas de las cuales el 83% se restringen exclusivamente al territorio Mexicano (Reyes y Carrillo, 2011). México es el centro de mayor diversidad y endemismo de este grupo de plantas. El nombre fue propuesto en el año 1831 por el botánico Agustín Pyramus de Candolle, en honor al ilustrador botánico mexicano Atanasio Echeverría y Godoy, quien asistió en el siglo XVIII a José Mariano Mociño y Martin de Sessé y Lacasta, durante la Real Expedición Botánica a la Nueva España, cuyo objetivo era compilar un inventario de la flora y fauna de este territorio (Reyes y col., 2011). El género Echeveria se distribuye en casi todos los estados de la República Mexicana como puede observarse en la Figura 1. Las especies de este género muestran preferencia por sitios con afloramientos rocosos tales como riscos, laderas escarpadas, paredes más o menos verticales de cañadas y cañones. Las plantas que pertenecen al género Echeveria tienen la capacidad de almacenar agua en sus hojas en forma de jugos mucilaginosos, principalmente durante los periodos de humedad de ahí que sean llamadas plantas suculentas.

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Figura 1. Distribución del género Echeveria en la república Mexicana (Reyes y col., 2011).

1.2.1 Echeveria calycosa Fue descrita en 1967 por Reid Moran, quien especifica que fue descubierta por el profesor Charles H. Uhl y su equipo de la Universidad de Cornell, al sur de Uruapan, Michoacán, en la primavera de 1965, dándole el nombre de calycosa debido a su prominente cáliz (Moran, 1967) Es una planta glabra, florece de julio a agosto, presenta un espesor de 0.5 a 1.5 cm, la roseta no plana de 0.5 a 1.5 dm de diámetro, de 15 a 25 hojas muy juntas de color verde claro, en forma de espátula, redondeada en el ápice. De 2.5 hasta 9 cm de largo, de 1.5 a 3.5 cm la parte más ancha, de 4 a 10 mm de ancho en la base. Los tallos florales (figura 2) de color verde a rosa en la parte superior, de 0.5 a 2 dm de altura, de 1.5 a 5 mm de espesor en la base, los tallos florales viejos suelen persistir unidos firmemente por varias temporadas. Los cincinos o inflorescencias se presentan principalmente solitarios, de vez en cuando 2 y raramente 3, tienen de 5 a 38 flores con apertura a intervalos de 3 días aproximadamente apuntando primero hacia abajo con 45°, llegando a horizontal; Pedicelos de color rosa; cáliz de color rosa en la base, de color verde claro arriba, corola amarilla por encima, rosa por debajo y apareciendo a continuación anaranjado, pentagonal con lados aplanados de 7.5 a 10 mm de largo. Gineceo de color rosado de 5 a 6 mm de altura y grosor de 3 a 3.5 mm, en la figura 3 se muestra un cincino. Los pistilos erectos, los estilos amarillos con puntas verdes. Cromosomas: n=31 (Moran, 1967).

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Figura 2. Planta de Echeveria calycosa floreciendo. Fotografía tomada por MC I. García.

Localmente se le conoce como “conchita”.

Figura 3. Inflorescencia, cincino o vara floral de Echeveria calycosa Fotografía tomada por MC I. García

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1.3 PROPAGACIÓN DEL GÉNERO ECHEVERIA La técnica de propagación de especies suculentas es relativamente reciente remontándose a los años 80’s (Villalobos y col., 1993). Las plantas suculentas se multiplican por dos vías distintas, la reproducción sexual mediante semillas y la propagación vegetativa, por esquejes, vástagos y hojas. 1.3.1 Reproducción sexual La reproducción sexual es prioritaria en el género Echeveria, ya que representa muchas ventajas principalmente el mantenimiento de la diversidad genética, factor muy importante para un programa de restauración ecológica. Se requiere de la polinización entre dos o más plantas al inicio de la época reproductiva con la finalidad de obtener semillas y posteriormente frutos. En la familia de las crasuláceas las semillas se forman dentro de cápsulas después de un mes de la floración aproximadamente. En la mayoría de las especies las semillas miden alrededor de 1 mm, son de color de paja a verde y cambian a color rojo púrpura cuando están maduras (Reyes, 2013). 1.3.2 Reproducción asexual La reproducción asexual puede ser por los siguientes métodos (Uhlig, 2008). Vástagos.- brotes que emergen alrededor de la planta madre, los cuales con el tiempo emiten raíces y forman un nuevo individuo idéntico a la planta madre. Esquejes.- porciones de la planta que se desprenden o se toman de ella, como: hojas, tallos o raíces a partir de los cuales se formará un nuevo ejemplar. 1.4 REGENERACIÓN POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS in vitro El cultivo de tejidos in vitro se puede definir como el cultivo de células, tejidos y órganos bajo condiciones físicas y químicas bien definidas manteniendo la asepsia. Con la ayuda de esta tecnología se exploran las condiciones que promueven la división celular y la reprogramación genética en condiciones in vitro, por efecto de los reguladores de crecimiento vegetal (RCV) (Loyola y col., 2006); se aplica en la producción masiva de plantas comestibles, medicinales y ornamentales las cuales presentan un interés económico o biológico, resultando también una excelente alternativa tecnológica para conseguir una propagación clonal rápida en plantas cuyos cultivos presentan bajos rendimientos y para el rescate de especies vegetales en peligro de extinción. El éxito en la propagación in vitro de una especie vegetal dependerá de la posibilidad de expresar su potencialidad celular total, es decir, que algunas de sus células recuperen su condición meristemática, concepto conocido como totipotencia celular, el cual sugiere que las células vegetales tienen la información necesaria como unidad fundamental, para regenerar un organismo completo. La regulación de la morfogénesis fue descrita por Miller y Skoog quienes establecieron que se regula por la concentración de auxinas y citocininas en el medio de cultivo. Se ha observado

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que cada especie vegetal puede responder de manera diferente a las condiciones y a los reguladores del crecimiento usados en el cultivo in vitro, por lo que es necesario trabajar con cada una de ellas para encontrar las condiciones de regeneración más adecuadas, (Retes y col., 2007). Las plantas están compuestas de diferentes órganos, estos están constituidos de tejidos, los cuales a su vez se componen de células los cuales tienen la capacidad de responder a diferentes estímulos en igual o diferente forma (Jacobs, 1977; Kerstetter, 1997), característica que es aprovechada por el cultivo in vitro. Esta técnica se inicia con material vegetal obtenido in vivo de diferentes partes de la planta denominados “explantes”; El explante es el tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a un medio de cultivo artificial estéril apropiado. El medio de cultivo más utilizado es el desarrollado por Murashige y Skoog, mejor conocido como MS el cual muestra particularmente concentraciones muy altas de N03 y NH4 (Thorpe, 2007). Se requieren condiciones de asepsia para la disección microscópica de la planta para transferir su punto de crecimiento o tejido meristemático al recipiente estéril que contiene el medio de crecimiento seleccionado. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán, dependen de los objetivos del cultivo de tejidos y de los inductores que se utilicen. En algunos casos las células formarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, induciendo posteriormente la formación de órganos. Este proceso es llamado organogénesis indirecta. En otros casos estarán presentes estructuras reconocibles como tallos, órganos, raíces, bulbos u otros órganos. Este proceso es conocido como organogénesis directa. Ambos procesos dependerán de la relación de fitohormonas, la división celular, la desdiferenciación para adquirir la capacidad organogénica, de iniciación de órganos y desarrollo (Duclercq y col., 2011). La inducción de callo representa un proceso de desdiferenciación y división celular intensiva, que dependerá principalmente del explante, genotipo, medio de cultivo, tipo de regulador de crecimiento así como de su concentración y combinación (Larson et al. 2006, Feeney et al. 2007, Rashmi y Trivedi 2014). La organogénesis indirecta a menudo induce la variación somaclonal y permite exponer características diferentes que no están expresadas normalmente en la naturaleza o bien eliminar alguna indeseable (Sala y Labra 2003). Por otra parte, los callos pueden ser utilizados para hacer suspensiones celulares para la producción de embriones somáticos. Normalmente, esta vía requiere de una elevada concentración de auxinas en la etapa de inducción de callo. Aun cuando técnicamente cualquier tejido es capaz de responder al tratamiento al que se exponga, la selección del explante dependerá de - El tipo de cultivo que se realice - El propósito del cultivo propuesto - La especie de planta utilizada.

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La elección correcta del tipo de explante puede tener un efecto importante en el éxito del cultivo de tejido. Los tipos de explantes más comúnmente utilizados son: embriones, órganos reproductores o segmentos de tejido vegetativo como hojas, tallo o raíz. (Ammirato, 1985). El cultivo in vitro permite obtener altas tasas de multiplicación partiendo de poco material vegetal lo que es importante cuando se trata de poblaciones extremadamente reducidas, si se cuenta con un número reducido de semillas o si el desarrollo de la planta es lento. (Iriondo, 2001). Debido a que los explantes deben ser cultivados en medio nutritivo que también favorece el crecimiento de microorganismos, en la medida de lo posible, los explantes deben estar libres de contaminantes microbianos. 1.4.1 Medio de cultivo in vitro Los medios de cultivo artificiales, involucran nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo de una planta. Se componen de macronutientes, micronutrientes y vitaminas. El medio de cultivo, provee de compuestos orgánicos e inorgánicos, particularmente contiene concentraciones muy altas de N03 y NH4 (Thorpe, 2007), se adiciona con sacarosa como fuente de carbono; para su solidificación se utiliza agar o phytagel. Normalmente está contenido en recipientes de vidrio donde es esterilizado. El medio de cultivo también puede estar adicionado con reguladores de crecimiento vegetal (RCV) que son incorporados en concentraciones muy bajas, regulando el desarrollo, crecimiento y nutrición de las plantas. Durante el cultivo in vitro, las plántulas crecen en condiciones controladas dentro de recipientes de cultivo relativamente herméticos, con el fin de evitar la contaminación microbiana dentro del recipiente. Los medios de cultivo se complementan con fuentes de carbono (azúcares) como fuentes de energía. Esta adición reduce considerablemente el potencial hídrico del medio y aumenta el riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. A las plántulas normalmente se les suministra reguladores de crecimiento. Estas condiciones dan como resultado la formación de plántulas de morfología, anatomía y fisiología diferente a la que se presenta en la naturaleza, (Kozai y Smith 1995). Existen varias clases de reguladores de crecimiento vegetal reconocidas, los grupos principales son: Auxinas, citocininas, giberelinas y etileno, aunque se han descubierto otras como los brasinoesterioides y el ácido jasmónico que ya se encuentran bien caracterizados. A continuación se describen los RCV utilizados en este trabajo. 1.4.2 Auxinas La palabra auxina tiene su origen del griego y significa alargamiento o crecimiento (George y col., 2008). Este grupo de hormonas vegetales fue el primero en descubrirse, regulan muchos aspectos del desarrollo y crecimiento de las plantas; ya que son capaces de iniciar la división celular, en los

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tejidos están involucradas en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad y en plantas enteras tienen un marcado efecto en el mantenimiento de la dominancia apical y mediación de tropismos (Friml, 2003). En las plantas se encuentran como ácido indolacético (AIA), otras formas naturales son el ácido 4-cloro-idolacético (4-Cl-IAA), ácido fenilacético (PAA), ácido indol butírico (IBA) y ácido indol propiónico (IPA), (Ludwing-Muller, 2000). Se encuentran en todos los tejidos de la planta, una mayor concentración ocurre en las regiones en crecimiento activo, como meristemos apicales, hojas jóvenes y frutos en desarrollo. Sus análogos sintéticos como el ácido naftalenacético (ANA y el ácido 2,4 – diclorofenoxiacetico (2,4-D), son metabólicamente más estables por lo que son ampliamente utilizados. En el cultivo de tejidos se emplean auxinas para promover en combinación con la citocininas la formación de callo y la inducción de raíces adventicias. Promueven la división y el alargamiento celular. De manera general, una concentración de auxina similar a la concentración de citocinina promueve la formación de callo. En concentraciones bajas de auxinas con respecto a las citocininas se promueve la formación de brotes, y el uso único de auxinas promueve la formación de raíces. La elección de la concentración de auxinas en el cultivo de tejidos, dependerá de: el tipo de crecimiento y desarrollo requerido; los niveles endógenos dentro del explante; la sensibilidad del tejido de la planta a las auxinas; la interacción si existe, entre auxinas aplicadas y las sustancias endógenas naturales. 1.4.3 Citocininas Se sintetizan principalmente en la raíz, aunque también en el meristemo apical y en semillas inmaduras. Al igual que las auxinas las más utilizadas son las de origen sintético como la benciladenina (BA) y la furfurilaminopurina (Cinetina). Se ha sintetizado otro tipo de moléculas con estructura totalmente diferente, sin la base adenina, pero de acción biológica idéntica a la citocininas como el tidiazurón (TDZ). Todos ellos más potentes que las hormonas naturales endógenas (zeatina, o isopentiladenina). Las citocininas regulan el crecimiento de brotes y raíces. Controlan la tasa de diferenciación celular durante el desarrollo del meristemo radicular, suprimiendo el transporte y señalización de las auxinas. En el cultivo in vitro se utilizan para promover la formación de brotes y de embriones, en combinación con auxinas, estimulan la división celular y controlan de la morfogénesis (George y col., 2008). Se ha encontrado que la adición de 0,5 mg/l cinetina y auxinas al medio de enraizamiento la citocinina tiene un efecto bacteriostático (Boxus y Terzi, 1988). 1.4.4 Etapas del cultivo in vitro El cultivo in vitro se divide en 4 etapas generales (Castillo, 2008), pero Debergh y Maene (1981), sugirieron una etapa adicional conocida como etapa 0. Las etapas se describen de la siguiente manera:

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Etapa 0.- Es el paso inicial de la micropropagación en el que las plantas destinadas para ser utilizadas como fuente de material vegetal en una propagación in vitro, se cultivan bajo condiciones controladas en invernadero, para incidir sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos (Olmos y col. 2010). Esta etapa de pre-acondicionamiento de la planta donadora incluye establecer medidas para la reducción de contaminantes tanto superficiales como endógenos. Etapa 1.- Establecimiento. Consiste en mantener explantes en condiciones de cultivo in vitro, libres de microorganismos y de oxidación, desarrollándose en un medio de cultivo sintético. La razón por la que los explantes deben encontrarse libres de microorganismos, aun cuando en la naturaleza, éstos no sean patógenos e incluso puedan ser benéficos, es debido a que en el cultivo in vitro la planta cambia su metabolismo de autótrofo a mixotótrofo, es decir su actividad fotosintética se disminuye de manera significativa y la mayor parte de fuente de carbono lo constituye la sacarosa que es el componente mayoritario del medio de cultivo. Esta fuente de carbono es también una fuente de carbono para los microrganismos, los cuales independientemente de su nicho ecológico, tienen una tasa de propagación mucho mayor que las células vegetales y en consecuencia, pueden causar daño a los explantes. Por esta razón, los explantes deben pasar por un proceso de desinfección antes de sembrarse en el medio de cultivo previamente esterilizado. La selección y concentración de los desinfectantes y el tiempo de exposición a ellos, se determina, en gran medida, por las características del explante; en la práctica, se establecen experimentalmente por ensayo y error (Roca y Mroginski, 1991). Etapa 2.- Propagación o multiplicación. En esta etapa, el explante establecido, encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo, poniéndose en contacto con reguladores de crecimiento que inducen su multiplicación. El número de plantas que se obtienen depende de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo, el cual puede alcanzar incrementos exponenciales cuando se han optimizado todos los factores que afectan el crecimiento. En los sistemas de regeneración vía organogénesis es necesario establecer la fuente de tejido vegetal, un protocolo de desinfección y evaluar diferentes tejidos como explante, probar diferentes interacciones de concentraciones de RCV para establecer la inducción de callo, brotes y /o raíz (Rico, 2013). Etapa 3.- Enraizamiento. En esta etapa, las partes aéreas de las plantas obtenidas se transfieren a medio de cultivo inductor de raíces logrando de esta manera la obtención de plantas completas. Un sistema radicular funcional y adecuado en las plantas garantiza no solo su supervivencia, sino un desarrollo apropiado durante y después de la etapa de aclimatación en invernadero, en vivero y posteriormente en el campo (Goncalves J. y col. 1998) Etapa 4.- Aclimatación. Durante ésta etapa las plántulas procedentes de cultivo in vitro, se adaptan a condiciones ex vitro, se busca establecer un cambio gradual que le permita a la planta

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sobrevivir, recuperar su metabolismo autótrofo, abandonando el metabolismo mixótrofo de la etapa de cultivo in vitro. Al transferir a condiciones ex vitro las plántulas tienen que cambiar las condiciones antes mencionadas. En el invernadero, y especialmente en el campo, la irradiación es mucho mayor y la humedad del aire mucho menor que en los recipientes. El potencial hídrico del sustrato es mayor que el potencial hídrico del medio de cultivo con sacarosa, las plántulas pueden marchitarse rápidamente debido a que la pérdida de agua de sus hojas no está restringida. Además, el suministro de agua puede ser limitante debido a la baja conductividad hídrica de raíces (Fila y col., 1998). Muchas plántulas mueren, durante este período. Por lo tanto, después del trasplante a ex vitro de plántulas por lo general necesitan algunas semanas de aclimatación con reducción gradual de la humedad del aire (Preece y Sutter 1991, Kadlecek, 1997, Bolar y col., 1998). Se han desarrollado unidades de aclimatación con la temperatura, la humedad, la radiación, la concentración de CO2 y la velocidad del flujo del aire controlado por un ordenador (Hayashi, y col., 1988).

1.4.5 Trabajos publicados del cultivo in vitro en diferentes especies de Echeveria En el caso de Echeveria calycosa al igual que en la mayoría de las especies de su género, no se ha reportado un sistema de regeneración in vitro a pesar que se trata de una planta con gran potencial ornamental y económico. Dentro del género Echeveria se han publicado contados estudios sobre propagación in vitro, entre los cuales se encuentran los siguientes:

- “In vitro Propagation of Echeveria elegans, a Species of the Flora Endangered Mexican” El objetivo de este estudio fue realizar la propagación in vitro de esta especie a partir de brotes axilares como una alternativa de multiplicación y preservación, utilizando una combinación de 6 Bencil Aminopurina (6-BAP) con Ácido Naftalen Acético (α-NAA) en diferentes concentraciones (Solís y col., 2013).Obteniendo un máximo de 4.21 brotes promedio por explante en las concentraciones: 6.66 µM of 6-BAP + 1.35 µM of α-NAA a los 40 días de su establecimiento.

- “Establecimiento de métodos de propagación vegetativa in vivo e in vitro de Echeveria laui (CRASSULACEAE)” El objetivo general fue propagar mediante reproducción sexual y vegetativa in vivo e in vitro individuos de Echeveria laui. Para los experimentos realizados en este trabajo se utilizaron hojas tomadas directamente de la planta madre. (Verastegui,

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2009). Se obtuvo formación de brotes con 6 mg/l de Cinetina y 4 mg/l de Ácido naftalen acético, sin mencionar la tasa de propagación.

- “Obtención in vitro de plantas de Echeveria pumila cv. 'Glauca' libres de bacterias y fitoplasmas asociados a la fasciación del tallo”. El objetivo de este trabajo fue propagar mediante cultivo in vitro esta planta para obtener material vegetal y desarrollar una metodología para eliminar patógenos (Bulbarela, 2014). Utilizando la combinación de BA 0.2 mg/l y ANA 0.02 mg/l se obtuvieron 3.6 brotes por explante y con Thidiazuron (0.6 mg/l) 2.5 brotes por explante libres de bacterias y fitoplasmas.

- “Comparación de la tasa de propagación in vitro y ex vitro de la especie endémica de Michoacán, Echeveria purhepecha”. El objetivo fue propagar in vitro y ex vitro la especie y comparar los resultados obtenidos de las tasas de propagación. Por observaciones hechas en campo, E. purhepecha se ha considerado como una especie en posible situación de vulnerabilidad ocasionada, principalmente, por el cambio de uso de suelo en su hábitat natural. La tasa de propagación bajo condiciones de cultivo in vitro de E. purhepecha con 4 mg/l de 6 Bencil aminopurina (BAP) y 0.2 mg/l de ácido indol acético (AIA) a partir de hoja y tallo fue 1.6 puntos mayor respecto a la de propagación obtenida ex vitro, (Ayala y Obledo, 2015).

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2 JUSTIFICACIÓN Echeveria calycosa es una especie vegetal que al igual que la mayoría de los individuos que pertenecen al género Echeveria tiene gran valor como planta ornamental, muchas especies de este género aunque no aparecen en el listado de la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT- 2010, (Protección ambiental-Especies nativas de México de flora y fauna silvestres- Categorías de riesgo y especificaciones para su inclusión, exclusión o cambio- Lista de especies en riesgo), se ha considerado como una especie en posible situación de vulnerabilidad.

Al encontrarse en una zona muy delimitada posee un alto grado de endemismo lo que la hace más vulnerable que aquellas que se encuentran ampliamente distribuidas.

En la actualidad enfrenta varias amenazas como son el cambio de uso de suelo en la región donde es endémica, la conversión de áreas de vegetación natural a zonas frutícolas diversas; se han localizado pocas poblaciones que están formadas por un número pequeño de individuos las cuales tienen un lento crecimiento; la extracción ilegal de poblaciones silvestres en su hábitat natural con fines de comercialización, frecuentemente esta actividad recolectora supera la tasa natural de reproducción; existe poca o nula información sobre su propagación.

Debido a la problemática que presenta E. calycosa es importante realizar estudios de regeneración, principalmente de propagación in vitro debido a que por medio de este método se han reportado estudios de propagación masiva de otras especies vegetales en las cuales probando diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal y variando las proporciones de los mismos se ha logrado encontrar la combinación más adecuada para el propósito, contribuyendo así a su conservación, multiplicación y posiblemente asegurar su persistencia.

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3 HIPOTESIS

La tasa de propagación que presenta Echeveria calycosa bajo condiciones de invernadero se puede incrementar, mediante el desarrollo de un sistema de regeneración in vitro evaluando diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento vegetal Acido Naftalen Acético (ANA) y Cinetina (KIN).

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4 OBJETIVOS

4.1 General Establecer un sistema de regeneración in vitro para la especie Echeveria calycosa que incremente su tasa de propagación como alternativa para su preservación.

4.2 Específicos Implementar una metodología para la propagación por esqueje de hoja de Echeveria calycosa.

Conocer el índice de germinación de las semillas de Echeveria calycosa.

Implementar una metodología para el establecimiento in vitro de explantes de Echeveria calycosa.

Seleccionar el tejido vegetal que presente la mejor respuesta de regeneración in vitro de E. calycosa.

Evaluar diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento vegetal: Ácido Naftalen Acético (ANA) y Cinetina (KIN) para establecer cuáles son las concentraciones que incrementan la tasa de propagación de Echeveria calycosa.

Evaluar diferentes medios de cultivo para enraizamiento in vitro.

Determinar las condiciones de aclimatación de las plantas de E. calycosa, propagadas in vitro, sin pasar por la etapa de enraizamiento in vitro, utilizando ácido indol butírico como inductor de formación de raíz en condiciones ex vitro.

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5 METODOLOGÍA

5.1 Material Vegetal

Se utilizaron plantas de Echeveria calycosa colectadas en su hábitat natural: la cañada del rio Cupatitzio en el municipio de la Tinaja Verde al sur de Uruapan en el Estado de Michoacán, por el M. C. Ignacio García; mismas que fueron mantenidas en el invernadero del CIATEJ (Figura 4).

Figura 4. A) Plantas de E. calycosa en su hábitat natural, B) Planta de E. calycosa mantenida en condiciones de invernadero y tratada con fungicida Amistar® 5.2 Propagación por semilla (sexual) Las semillas fueron obtenidas de la inflorescencia de plantas en floración mantenidas en condiciones controladas dentro del invernadero del CIATEJ. Los frutos se dejaron madurar y secar para la posterior recolección de las semillas, con la ayuda del microscopio estereoscopio se separaron semillas que presentaron características indicativas de viabilidad: color rojo y turgentes, las semillas se observaron por medio de microscopio óptico binocular a través del objetivo 10X, se observó con detalle la estructura, su tamaño (menor de 1 mm), para tener un mejor criterio de selección. Se contaron 100 semillas, las cuales se desinfectaron sumergiéndolas en cloro al 10 % (a partir de cloro comercial) durante 1 minuto. Después de este tratamiento se sembraron en botes de plástico con tapa del mismo material con sustrato conformado por tepojal – peat moss 1:1, pasado a través de malla 10 – 12 y esterilizado en autoclave durante 15 min a 15 lb de presión. Los botes con semillas se mantuvieron en cámaras de incubación en condiciones controladas: temperatura de 23°C, iluminación que les proporcionó un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2·s-1). Se mantuvieron en estas condiciones durante 150 días. Variables a medir, número de semillas que germinaron, considerando como semilla germinada aquella que da origen a una nueva planta de la misma especie. Con los datos generados se obtuvo el porcentaje de germinación de semillas de E. calycosa = (Número de semillas germinadas / número total de semillas puestas a germinar) x 100.

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5.3 Propagación por esqueje de hoja (asexual) Se utilizaron hojas de la parte media de la roseta de la planta adulta de E. calycosa, se procuró hojas jóvenes de tamaño medio. Con cuidado se separaron las hojas de la base del tallo, la herida se trató con Captan® (fungicida) polvo con el fin de promover la cicatrización del tejido y evitar su contaminación, se dejaron en lugar fresco y seco durante dos semanas, transcurrido este lapso de tiempo se procedió a propagarlas, adicionando en la base de cada hoja gel enraizador (Clonex®) y estableciendo una hoja por maceta (dimensiones 6 X 6 X 6 cm) conteniendo sustrato [tepojal (pasado a través de malla 10 – 12) – peat moss en una proporción 1:1] (Verastegui, 2009), esterilizado en horno de microondas, durante 25 min. Se mantuvieron en cámaras de incubación controladas a una temperatura de 25°C, proporcionándoles iluminación con un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2·s-1), el sustrato se mantuvo siempre húmedo por medio de riego con agua de garrafón. Se mantuvieron en estas condiciones durante 45 días, pasado este tiempo se registraron los resultados. Se establecieron 3 hojas, no se aplicaron tratamientos, ni se realizaron repeticiones debido al poco material vegetal con el que se contó. Las variables a medir fueron, número de explantes enraizados, número de rosetas formadas por explante, sobrevivencia y calidad del explante. En esta etapa no se realizó análisis estadístico.

5.4 Propagación in vitro La metodología para la propagación in vitro de E. calycosa, se llevó a cabo en cuatro etapas: Establecimiento de explantes en condiciones de cultivo in vitro, Regeneración de los explantes que sobrevivieron a la etapa de establecimiento, utilizando reguladores de crecimiento vegetal, inducción de enraizamiento y aclimatación de plantas de E. calycosa a condiciones ex vitro. 5.4.1 Establecimiento Se diseñaron cuatro diferentes procedimientos para inducir la mayor sobrevivencia de los explantes de E. calycosa en la etapa de establecimiento in vitro; en la tabla 1 se muestra a detalle los cuatro procedimientos. 5.4.1.1 Explantes Los explantes se obtuvieron de las plantas mencionadas en el párrafo de material vegetal, se utilizaron cuatro diferentes tipos de explantes para seleccionar el tejido vegetal que produjera la mejor respuesta en los estudios de propagación para esta especie, la medida del explante fue de aproximadamente 1 cm de largo, el ancho dependió del tejido vegetal del cual se tratara, en hoja se procuró que fuera también de 1 cm, todos ellos se trataron con el mismo método de desinfección el cual se detalla en el apartado correspondiente, el tipo de explante, el número de ellos y su distribución en los tratamientos se encuentra detallado en la tabla 1. De acuerdo a los resultados obtenidos, los tratamientos se fueron adecuando de manera progresiva hasta alcanzar el objetivo de su establecimiento en condiciones in vitro, los tres primeros tratamientos se realizaron con plantas

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tomadas directamente de su hábitat natural y el cuarto de plantas mantenidas en cuarentena durante 2 meses a las cuales se les aplicó el producto Amistar® siguiendo las indicaciones del fabricante (etapa 0 o de acondicionamiento).

Tabla 1.- Procedimientos para establecer explantes de E. calycosa in vitro, su origen y cantidad utilizados en cada caso.

# Procedimiento Explante Tipo Cantidad 1 Se utilizaron explantes de plantas obtenidas directamente de su hábitat Hoja 160 natural, se procedió a su desinfección y establecimiento en medio de cultivo Murashige - Skoog (MS). 2 Se utilizaron explantes de plantas obtenidas directamente de su hábitat Hoja 20 natural, antes de realizar la desinfección se sometieron a un choque térmico. Los explantes se lavaron, se colocaron en un envase con agua a 60°C durante 2 min, pasándolas inmediatamente después a otro envase conteniendo agua a 0°C. se procedió a su desinfección y establecimiento en medio MS. 3 Se utilizaron explantes de plantas obtenidas directamente de su hábitat Hoja 40 natural, antes de realizar la desinfección se sometieron a un choque térmico, esto con el fin de eliminar microorganismos endógenos. Los explantes se lavaron, se colocaron en un envase con agua a 60°C durante 2 min, pasándolas inmediatamente después a otro envase conteniendo agua a 0°C. se procedió a su desinfección y establecimiento en medio MS al cual se le adiciono 0.48 ml de PPM*/l de medio de cultivo MS. 4 Las plantas de E. calycosa obtenidas de su hábitat natural se les aplicó Hoja 84 en forma de spray una solución de Amistar®** fungicida de amplio espectro con doble poder translaminar y sistémico a una conc. de 20 mg/100ml aplicación foliar a las hojas de la roseta, las plantas de E. Tallo 125 calycosa recibieron este tratamiento de acondicionamiento cada 10 días floral durante dos meses. Las plantas se mantuvieron en condiciones controladas de humedad y temperatura durante este periodo. Una vez Tallo 20 que la planta contó cuando menos con 4 aplicaciones, se tomaron los

explantes, se procedió a su desinfección y establecimiento en medio de cultivo MS. Raíz 15 *PPM, Plant Preservative Mixture, (5-Cloro-2-Metil-3[2H]-Isotiazolone 0,1350 % + 2-Metil-3[2H]-Isotiazolone 0,0412 % + ingredientes inertes 99,8238 %) es un conservador de amplio espectro, que puede tener acción biocida o biostática, recomendado para controlar la contaminación microbiana en el cultivo de tejidos vegetal. **Amistar ® contiene 500 g /kg de azoxistrobi : Metil (E)-2-2-6-(2-cianofenoxi) pirimidin-4-iloxi-fenil-3-metoxiacrilato.

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5.4.1.2 Desinfección de los explantes Los pasos para la desinfección de los explantes seguidos en este trabajo se describen en la tabla 2. En cada etapa se colocó el tejido vegetal dentro de un recipiente de tamaño adecuado a los explantes conteniendo el tratamiento correspondiente y se mantuvo bajo agitación durante el tiempo requerido.

Tabla 2. Tratamiento de desinfección de los explantes de E. calycosa.

Tratamiento Tiempo (min) 1.- Solución antioxidante* 3 2.- Solución jabonosa** 5 3.- Agua destilada 2 4.- Alcohol etílico al 80% 1.5 5.- Agua destilada 2 6.- Cloro 6%*** 30 7.- Agua destilada estéril 2 min en cada enjuague**** 8.- Solución antioxidante estéril * 2 * Ácido cítrico 200 mg/l – ácido ascórbico 150 mg/l ** Detergente Axón® al 3% *** Hipoclorito de sodio 25 % (a partir de cloro comercial) + 2 gotas de tween 20 + 2 gotas de microdyn® ****Se realizaron tres enjuagues

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5.4.1.3 Establecimiento de los explantes Los explantes desinfectados se establecieron en cajas Petri con 25 ml de medio de cultivo Murashige y Skoog, (MS) (1962) adicionado con 30 g de sacarosa y 4.5 g/l de phytagel, el pH se ajustó a 5.7 antes de la adición de phytagel con HCl 1 N o NaOH 1 N según era necesario. Se esterilizó en autoclave a 121°C, 15 lb de presión por 20 min. (Gauchan, 2012), este procedimiento se realizó en campana de flujo laminar en condiciones de asepsia. Las cajas Petri se colocaron en cámaras de incubación en condiciones controladas de temperatura (20°C) e iluminación con un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2·s-1), Se mantuvieron en estas condiciones por un periodo mínimo de ocho días para su adaptación al medio y comprobación de ausencia de microorganismos. Las variables de respuesta fueron el número de explantes libres de contaminación y la calidad del explante. La calidad del explante se determinó utilizando una escala ordinal de 0 a 100 donde el explante con calidad inicial es un valor de 100 hasta 0 donde representa explante completamente blanco o contaminado. Los resultados se analizaron utilizando ANOVA y la prueba de rangos múltiples de diferencia mínima significativa con apoyo del programa estadístico Statgraphics centurión XV.I, comparando plantas con tratamiento y sin tratamiento antimicrobiano, la contaminación y calidad del explante con respecto al tipo de explante.

5.4.2 Propagación

5.4.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui. El objetivo de esta etapa fue evaluar la respuesta del explante previamente establecido a la adición de RCV utilizados en estudios preliminares realizados en el laboratorio y en trabajos publicados en otras especies de Echeveria, que han dado buenos resultados, para comprobar si en la especie E. calycosa produce una respuesta positiva en su regeneración utilizando los mismos RCV y cumple el objetivo general de este trabajo que es propagar esta especie. Los reguladores de crecimiento vegetal probados fueron cinetina (KIN) y ácido naftalenacético (ANA) en concentraciones de 6 mg/l y 4 mg/l respectivamente, concentraciones que han producido brotes en otra especie de Echeveria (Verastegui, 2009), no se reporta tasa de propagación. Se utilizaron los explantes que sobrevivieron a la etapa de establecimiento, obtenidos de hojas de roseta y de las inflorescencias, los cuales se traspasaron a frascos de vidrio con tapa de plástico que contenían 25 ml de medio de cultivo MS al 50% suplementado con 6 mg/l de cinetina (KIN) y 4 mg/l de ácido naftalenacético (ANA) + sacarosa 15 g/l + phytagel 4.5 g/l, el pH = 5.7 se ajustó antes de la adición de phytagel con HCl 1 N o NaOH 1 N según fue necesario. Se esterilizó en autoclave a 121°C, 15 lb de presión por 20 min. (Gauchan, 2012).

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Los frascos se colocaron en cámaras de incubación con condiciones controladas de temperatura (20°C) y de iluminación con un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2·s-1), Se mantuvieron en estas condiciones hasta un periodo de 120 días. Se realizaron observaciones semanales, registrando los cambios observados. Las variables de respuesta fueron: sobrevivencia, presencia de callo, de raíz y/o de rosetas, tiempo de respuesta, la cantidad de brotes nuevos y calidad presentada por el explante, en este caso por tratarse de una variable cualitativa la calidad se midió de acuerdo al color del explante con la siguiente escala: 1= explante verde fuerte, 2= explante verde claro, 3= explante blanco o casi blanco, 4= explante café, 5= explante negro (totalmente oxidado). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

5.4.2.2 Propagación, experimentos bifactoriales con 4 niveles. Se realizaron 2 experimentos completos, cada uno formado por 16 tratamientos de diferentes concentraciones de los dos RCV que se seleccionaron a partir de estudios que presentaron organogénesis en otras especies de Echeveria; al conjunto de 16 tratamientos se le identifico como un estudio factorial.

5.4.2.2.1 Primer experimento de propagación El objetivo fue probar combinaciones de las concentraciones de los mismos reguladores de crecimiento vegetal que probaron estimular al explante dando una respuesta mayor sobre la tasa de regeneración que tiene E. calycosa en invernadero. Se diseñó un experimento bifactorial con cuatro niveles. Donde los factores fueron los RCV: KIN y ANA; y los niveles las concentraciones de estos RCV se muestran en la tabla 3. Las concentraciones se eligieron tratando de que entre ellas se encontrara el tratamiento que ya dio respuesta de organogénesis directa y abarcar concentraciones más altas y más bajas para observar el comportamiento del explante al exponerlo a ellas.

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Tabla 3. Concentraciones de RCV utilizadas en el primer experimento de propagación.

CITOCININA AUXINA

Nivel KIN (mg/ ml) ANA (mg/ml)

1 0.0 0.0

2 2.0 4.0

3 6.0 8.0

4 18.0 16.0

Los tratamientos a probar en este estudio son el resultado de las combinaciones de los cuatro niveles de los RCV mostrados en la tabla 3. Los 16 tratamientos resultantes se muestran en la tabla 4.

El tipo de explante y su manejo se encuentra descrito al inicio de la propagación in vitro Las variables de respuesta fueron sobrevivencia del explante, presencia de callo compacto, callo friable, presencia de raíz y/o brotes, la cantidad y calidad presentada; tiempo de respuesta, en cada una de las diferentes concentraciones del diseño bifactorial. La calidad de los brotes y callo se determinará con ayuda de una escala ordinal del 1 al 3, donde: 1 verde; 2 verde claro – beige; 3 beige – blanco. La calidad del explante se midió utilizando una escala ordinal de 1 a 5 donde: la calidad 1 corresponde a verde intenso (aspecto fresco); la calidad 2 (verde seco – claro), la calidad 3 (verde muy claro a blanco), la calidad 4 (café claro transparente), la calidad 5 (negro; oxidación completa). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

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Tabla 4. Tratamientos que componen el primer experimento de propagación.

Tratamiento RCV (mg/l)

ANA KIN

1 0.0 0.0

2 4.0 0.0

3 8.0 0.0

4 16.0 0.0

5 0.0 2.0

6 4.0 2.0

7 8.0 2.0

8 16.0 2.0

9 0.0 6.0

10 4.0 6.0

11 8.0 6.0

12 16.0 6.0

13 0.0 18.0

14 4.0 18.0

15 8.0 18.0

16 16.0 18.0

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5.4.2.2.2. Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E. calycosa obtenidas in vitro. En este primer experimento de propagación se incluyó otro tipo de explante que fue rosetas de E. calycosa obtenidas mediante propagación in vitro en medio de cultivo MS al 50 % suplementado con RCV ANA: KIN, 4: 6 mg/l respectivamente. En la figura 5 se observa el tamaño y la cantidad de rosetas obtenidas mediante su propagación por cultivo in vitro, las cuales se expusieron a los 16 tratamientos. Solo se realizó un estudio factorial de acuerdo al material vegetal con el que se contaba. Al encontrarse en condiciones de asepsia, no hubo necesidad de pasar por la etapa de establecimiento, los explantes se distribuyeron en los 16 tratamientos en condiciones de asepsia en el factorial identificado con el número 4.

Figura 5. Rosetas obtenidas por cultivo in vitro a partir de un explante de E. Calycosa propagado en medio MS al 50% suplementado con ANA: KIN, 4: 6 mg/l.

5.4.2.2.3 Primer experimento de propagación utilizando E. purhepecha Con el fin de tener una referencia más sobre el comportamiento de explantes de plantas del género Echeveria, se utilizó la especie E. purhepecha planta de la cual ya se han obtenido resultados positivos en propagación con otros RCV. Los explantes se obtuvieron de plantas donantes que se tienen en el invernadero del CIATEJ, los cuales fueron expuestos a las mismas concentraciones de reguladores utilizados en esta propagación. Las variables a medir fueron las mismas ya mencionadas para las pruebas realizadas en Echeveria calycosa,

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5.4.2.3.1 Segundo experimento de propagación El objetivo de realizar este segundo estudio de propagación fue buscar si existe un tratamiento que incremente la tasa de regeneración que tiene E. calycosa en el invernadero, utilizando concentraciones más bajas de los RCV. Se ha comprobado que mediante modificaciones en la composición química del medio de cultivo, especialmente del balance citocininas/auxinas, así como de otras condiciones físicas y químicas del cultivo, es posible inducir la diferenciación del tejido; sin embargo, pueden ocurrir algunas variaciones en la respuesta, dependiendo de la variedad y de las condiciones del cultivo (Roca, 1983). Se diseñó un experimento bifactorial con cuatro niveles. Donde los factores los factores fueron los RCV: KIN y ANA; y los niveles las concentraciones de estos RCV se muestran en la tabla 5.

Tabla 5. Concentraciones de RCV utilizadas en el segundo experimento de propagación.

CITOCININA AUXINA

Nivel KIN (mg/ ml) ANA (mg/ml)

1 0.0 0.0

2 0.6 3.0

3 4.0 6.0

4 8.0 12.0

Loa tratamientos a probar en este estudio son el resultado de las combinaciones de los cuatro niveles de RCV mostrados en la tabla 3. Los 16 tratamientos resultantes se muestran en la tabla 6.

El tipo de explante y su manejo es el que se describió al inicio de la propagación in vitro. Las variables de respuesta fueron sobrevivencia del explante, presencia de callo compacto, callo friable, presencia de raíz y/o brotes, la cantidad y calidad presentada; tiempo de respuesta, en cada una de las diferentes concentraciones del diseño bifactorial. La calidad de los brotes y callo se determinó con ayuda de una escala ordinal del 1 al 3, donde: 1 verde; 2 verde claro – beige; 3 beige – blanco. La calidad del explante se midió utilizando una escala ordinal de 1 a 5 donde: la calidad 1 corresponde a verde intenso (aspecto fresco); la calidad 2 (verde seco – claro), la calidad 3 (verde muy claro a blanco), la calidad 4 (café claro transparente), la calidad 5 (negro; oxidación completa).

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El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

Tabla 6. Tratamientos que componen el segundo experimento de propagación.

Tratamiento RCV (mg/l)

ANA KIN

1 0.0 0.0

2 3.0 0.0

3 6.0 0.0

4 12.0 0.0

5 0.0 0.6

6 3.0 0.6

7 6.0 0.6

8 12.0 0.6

9 0.0 4.0

10 3.0 4.0 11 6.0 4.0

12 12.0 4.0

13 0.0 8.0

14 3.0 8.0

15 6.0 8.0

16 12.0 8.0

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5.4.2.3.2 Segundo experimento de propagación utilizando E. purhepecha Con el fin de corroborar los datos obtenidos en los explantes de E. calycosa en este segundo estudio se tomó como referencia nuevamente la especie E. purhepecha. Los explantes fueron expuestos a las mismas concentraciones de reguladores utilizados en esta propagación. Las variables a medir fueron las mismas ya mencionadas para las pruebas realizadas en E. calycosa mostradas en el segundo experimento de propagación,

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5.5 Enraizamiento Esta etapa de propagación se diseñó para encontrar la mejor respuesta entre la composición de los medios de cultivo que se ha reportado que inducen la formación de raíz en plántulas obtenidas en propagación in vitro. Las auxinas cumplen un papel importante en el enraizamiento adventicio, siendo su aplicación común en la mayoría de los sistemas de propagación. Los ácidos naftalenacético (ANA) e indol butírico (IBA) son las fitohormonas más empleadas y la forma en que se apliquen incide en el éxito del proceso morfogénico (Luna y col. 2004). Las altas concentraciones de citocininas (0,5 a 10 mg/l) inhiben o retardan la formación de raíces (Schraudolf y Reinert, 1959; Harris y Hart, 1964; Ben-Jaacov y col., 1991). A pesar de estas observaciones, hay informes de que las citoquininas a veces pueden inducir o promover el crecimiento de la raíz (Fries, 1960), o la formación de raíces adventicias, en ausencia de auxinas (Nemeth, 1979). Concentraciones bajas (0,5 mg/l) de cinetina sin presencia de auxinas son eficaces para enraizar brotes (Konwar y Coutts, 1990). Algunas especies requieren la adición de citocininas para la inducción y desarrollo de la raíz. Se ha reportado que el uso del carbón activado en medio sin reguladores ha inducido rizogénesis y plántulas más grandes (Debnath & McRae, 2001), así como se ha reportado que el incremento de la sacarosa en el medio de cultivo aumenta tanto el peso de la materia fresca como el de la materia seca (Kubota y col., 2002; Shim y col., 2003). En base a esta información se diseñaron 14 tratamientos para observar el efecto en la inducción de raíz en los brotes obtenidos en la propagación in vitro, los tratamientos se describen en la tabla No. 7. La exposición de los brotes a Cinetina se realizó en cuatro diferentes periodos de tiempo y terminado este periodo se procedió a pasarlos a medio MS – 30 g/ de sacarosa – 2 g/l de carbón activado, para que completaran el periodo de tiempo de 40 + 2 días que tienen los demás tratamientos.

Se utilizaron frascos de vidrio con tapa de plástico que contenía 25 ml de medio de cultivo correspondiente a cada uno de los tratamientos descritos en la tabla 7. A cada medio se le ajusto el pH a 5.7 antes de la adición del agar, con HCl 1 N o NaOH 1 N según fue necesario. Se esterilizaron en autoclave a 121°C, 15 lb de presión por 15 min. Este procedimiento se realizó en campana de flujo laminar en condiciones asépticas. Se establecieron los brotes obtenidos de la segunda propagación in vitro, uno por frasco. Cada tratamiento tuvo cuarenta repeticiones, excepto el de la KIN que fueron 8 repeticiones por periodo de exposición dando un total de 32 repeticiones) esto debido a la cantidad de material vegetal con el que se contó, los frascos se mantuvieron en incubación a una temperatura de 23 °C con un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2·s-1) por un periodo de 40 + 2 días, al término de este periodo se procedió a medir las variables.

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Tabla 7. Tratamientos para enraizar las rosetas de E. calycosa obtenidas en la propagación in vitro.

# MS % Sacarosa g/l Carbón activado ANA 0.1 mg/l KIN 0.1 mg/l

1 100 30 + - -

2 100 30 - - -

3 50 15 + - -

4 50 15 - - -

5 50 7.5 + - -

6 50 7.5 - - -

7 50 0.0 + - -

8 50 0.0 - - -

9 50 15 + + -

10 50 15 - + -

11 100 30 + - +1

12 100 30 + - + 2

13 100 30 + - + 3

14 100 30 + - + 4 (1) una semana de exposición a la KIN; (2) dos semanas de exposición a la KIN; (3) tres semana de exposición a la KIN; (4) cuatro semanas de exposición a la KIN; En todos los tratamientos el agente gelificante fue agar 8 g / l.

Las variables a medir fueron: presencia o ausencia de raíz, largo de la raíz, tipo de raíz [en caso de presentar: R= ramificada, S= separadas, A= adventicias (sin un lugar específico en la plántula)], tamaño de la plántula (largo y ancho en mm). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I.

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5.6 Aclimatación (periodo ex vitro) Una vez transcurridos 40 + 2 días después de iniciado el periodo de enraizamiento se procedió a retirar las plántulas obtenidas del medio de cultivo in vitro. Las plántulas obtenidas se pasaron a macetas con un diámetro de 5 cm conteniendo sustrato peat moss – tepojal (1:1) con un tamaño de partícula de malla 10 - 12 esterilizado en autoclave a 121°C y 15 libras de presión por 25 min, se aplicó el enraizador comercial clonex® (ácido Indol butírico 3g/l), con el objetivo de mejorar el desarrollo y funcionalidad de la raíz. Se diseñó un experimento unifactorial con dos niveles con la finalidad de evaluar el efecto del producto “Liquido rojo” patentado por el CIATEJ (número de patente 265,785) utilizado para preservar e incrementar la supervivencia de plantas en el invernadero, disminuyendo el estrés considerablemente fuerte que se genera cuando las plántulas se sacan del ambiente in vitro y se llevan a condiciones ex vitro en el invernadero (Paz, 2015). Los niveles fueron presencia y ausencia del producto. En los tratamientos con presencia de líquido rojo, éste se adicionó de manera foliar, el protocolo que se siguió para la etapa de aclimatación de E. calycosa se describe en la tabla 8. Las macetas conteniendo las plántulas se mantuvieron a una temperatura de 23°C con una humedad relativa del 100% los primeros quince días, una iluminación con un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2·s-1). La variable a medir fue: sobrevivencia. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

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Tabla 8. Procedimiento para aclimatar rosetas de E. calycosa obtenidas por enraizamiento in vitro.

Etapa Descripción del procedimiento 1 Eliminación del medio de cultivo adherido a las raíces, mecánicamente con mucho cuidado o lavándolo en el chorro del agua. 2 Adición de gel enraizador 3 Transferencia a macetas que contienen el sustrato descrito en la propagación ex vitro (Verastegui, 2009): 4 Riego con solución de Captan® – Bactrol® (1 g/l de c/u) para evitar la contaminación del sustrato. 5 Proporcionar una humedad relativa alta (100%) cubriendo la maceta con una bolsa de plástico transparente y ajustarla al tamaño de la misma. 6 Riego diario durante la primera semana continuando cada tercer día hasta transcurrido el primer mes de aclimatación. 7 Transcurridos 15 días, apertura de la bolsa por una esquina superior, asegurándonos que exista transferencia de aire del exterior al interior. 8 Transcurridos 20 días, apertura de la bolsa por la segunda esquina superior 9 Transcurridos 25, apertura completa de la bolsa por la parte superior 10 Transcurrido un mes eliminación de la bolsa y transferencia de la maceta a condiciones de invernadero

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5.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro En ocasiones en el enraizamiento in vitro la zona de transición entre la raíz y el tallo es anormal, con unas conexiones vasculares débiles y malformadas, lo que produce problemas en la absorción y circulación de agua desde las raíces al tallo (Grout y Aston, 1977). Esta disfunción se corrige, al menos parcialmente, tras una adecuada aclimatación. En otras ocasiones las raíces que crecen en agar son defectuosas, carecen de pelos radicales y suelen necrosarse al trasplantar las plántulas, dejando de crecer la planta (Deberg y Maene, 1981). Se ha observado raíces formadas in vitro, gruesas, con pelos radicales engrosados y anormales, siendo sus sistemas vasculares anómalos, en comparación con raíces formadas en un sustrato arenoso. En las raíces que no mueren durante el proceso de trasplante se producen nuevas raíces laterales y adventicias normales durante el proceso de aclimatación y estas crecen activamente. Por ello la proporción raíz: tallo siempre es más grande en plantas enraizadas ex vitro que in vitro. Muchas veces el enraizamiento in vitro, puede resultar problemático, difícil y caro. No es posible generalizar, ya que la elección del método de enraizamiento va a depender totalmente de la especie y de sus características: porcentajes de enraizamiento y supervivencia final, que varían enormemente de unas especies a otras. Cuando el enraizamiento y aclimatación se pueden realizar simultáneamente, sin que haya demasiada pérdida de plantas, tanto los costes como la eficiencia de la producción se ven muy favorecidas. Debido a que el enraizamiento ex vitro junto con la aclimatación de plantas aumenta el estrés debido a la evapotranspiración acelerada de las plantas en las primeras etapas del trasplante pudiendo reducir mucho la supervivencia, se decidió utilizar el hemisulfato de adenina, para fortificar a la planta en esta difícil etapa ya que se ha reportado (Gatica y col., 2010) que el sulfato de adenina (SA) juega un importante rol en la inducción de estructuras organogénicas in vitro. La adenina es una fuente alternativa de nitrógeno reducido que puede ser aprovechada en el crecimiento y desarrollo. Por ejemplo, en Brassica campestris se encontró que las plantas cultivadas en medios de cultivo con SA presentaron mayor masa fresca y la coloración de las hojas fue de un verde oscuro (Paek y col., 1987). El experimento se realizó en 3 grupos de plantas que formaron 6 tratamientos diferentes que se muestran en la tabla 9 y se describen a continuación: Primer grupo de plantas, se les extirpó la raíz, se les colocó en una solución de ácido indol butírico (0.2 mg/ml) durante 2 horas, se procedió a sembrarlas siguiendo el protocolo de aclimatación descrito en la tabla no. 8, la mitad de las plantas se trató con 5 ml de solución de hemisulfato de adenina (160 mg/l). Segundo grupo de plantas, se les extirpo la raíz, se les coloco en una solución de ácido indol butírico (0.1 mg/ml) durante 2 horas, se procedió a sembrarlas siguiendo el protocolo de aclimatación descrito en la tabla no. 8, la mitad de las plantas se trató con 5 ml de solución de hemisulfato de adenina (160 mg/l).

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Grupo testigo: plantas con raíz, se procedió a sembrarlas siguiendo el mismo protocolo de aclimatación descrito en la tabla no. 8, la mitad de las plantas se trató con 5 ml de solución de hemisulfato de adenina (160 mg/l). Las macetas con las plántulas recién sembradas y cubiertas con bolsa de plástico, se mantuvieron a una temperatura de 23°C, una humedad relativa del 100%, una iluminación con un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2·s-1). Las variables iniciales a medir fueron: sobrevivencia, apariencia, diámetro; después de 26 días de sembradas se midió él diámetro y la sobrevivencia. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

Tabla 9.- Tratamientos para la aclimatación – enraizado ex vitro.

No. de Tratamiento con Presencia de raíz HSA No de muestras tratamiento IBA

1 0.2 mg/ml - 160 mg/l 9 2 0.2 mg/ml - - 9 3 0.1 mg/ml - 160 mg/l 9 4 0.1 mg/ml - - 9 5 - + 160 mg/l 9 6 - + - 9

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6 RESULTADOS y DISCUSIÓN 6.1 Propagación por semilla (sexual) Se logró la propagación de E. calycosa por método de semilla, Al observar las semillas a través del microscopio óptico se pudo distinguir perfectamente las características particulares de las semillas del género Echeveria que de acuerdo a (Verastegui 2009), son viables Estas presentaron un aspecto robusto y un color rojizo a diferencia de las no viables que se presentan incoloras, con aspecto casi blanco – transparente.(figura 6).

Figura 6. Semillas de E. calycosa vistas a través de microscopio óptico. La semilla A de color

rojizo, turgente; la semilla B aspecto seco y sin vida.

Las plantas obtenidas a partir de semilla empezaron a emerger a partir de los 20 días de haber sido sembradas (Figura 7 y 8), se obtuvieron 15 plantas. A los 5 meses se pasaron a macetas individuales (figura 9).

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100

Número de semillasde Número 12 14 15 15 15 15 6 0 0 2 3 0 0 10 20 24 28 32 36 40 44 48 52 días

Figura 7. Semillas de E. Calycosa germinadas con respecto al tiempo.

Resultados obtenidos:

No. de semillas sembradas = 100 semillas No. de semillas germinadas= 15 semillas % índice de germinación = 15 semillas germinadas X 100 = 15% 100 semillas sembradas

Este es el primer reporte de la germinación de semillas de E. calycosa Su porcentaje de germinación es bajo si se compara con el obtenido en el grupo de trabajo para E. purhepecha que fue del 92%. En la familia Crassulaceae; en algunos estudios se han reportados resultados muy variados en el porciento de germinación que va desde 0% hasta 92% (Carque y col., 1996) y están en función del tiempo de almacenamiento de las semillas, de la exposición a luz y de la temperatura (Jiménez, A., Flores, J., 2010).

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Figura 8. Plántulas obtenidas por germinación de semilla a los 25 días después de sembradas.

Figura 9.- Plántas de E. calycosa obtenidas de semilla (15) después de 150 días de sembradas en macetas de 6x6 cm.

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6.2 Propagación por esqueje de hoja (asexual) No se logró la propagación de Echeveria calycosa por el método de esqueje de hoja, los esquejes no respondieron a las condiciones en que se les mantuvo, muriendo la totalidad de los esquejes dentro del periodo de un mes posterior a su establecimiento. Por la limitada cantidad de material vegetal, no fue posible hacer mayor número de repeticiones en condiciones variadas hasta encontrar las condiciones adecuadas para su propagación por esqueje de hoja. En la figura 10 se muestran esquejes de hoja de Echeveria calycosa en maceta al inicio de su propagación por este método.

Figura 10. Explantes de hoja de E. calycosa establecidos en sustrato tepojal – peet moss (1:1) A) aspecto inicial, B) aspecto después de 15 días de su establecimiento.

A pesar de la creencia de que las plantas que pertenecen al género Echeveria se propagan fácilmente por esqueje de hoja, en el caso de E. calycosa, no fue posible lograr su propagación por este método, en la literatura se reporta que a nivel mundial se ha realizado poca investigación de la familia Crassulaseae, con respecto a la reproducción in vivo. Pocas especies se han reproducido utilizando diferentes sustratos y mezclas artificiales junto a reguladores de crecimiento, se han evaluado diferentes intensidades de luz y cantidad de nutrimientos, para obtener la regeneración de individuos a partir de esquejes de hoja (Verastegui, 2009), esto implica una gran cantidad de experimentos a realizar, en nuestro caso no fue posible realizar un número mayor de pruebas debido al poco material vegetal con el que contamos para diseñar nuestros experimentos, pero la realización de una investigación más exhaustiva en este campo pudiera proporcionar muy buenos resultados en la propagación por esqueje de E. calycosa y de esta forma poder aprovechar las ventajas que nos ofrece la propagación in vivo por esqueje de hoja.

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6.3 Propagación in vitro 6.3.1 Establecimiento Se realizaron cuatro diferentes tratamientos para el establecimiento. En los primeros tres se perdió cerca el 100% de los explantes como puede observarse en la tabla 10. Tabla 10.- Resultados de los tratamientos para establecer los explantes de E. calycosa in vitro.

Explantes Cantidad Contaminación muerte % de Tipo sobrevivencia

Tratamiento - + 1 Hoja 160 3 157 1.9

2 Hoja 20 ---- 20 0

Hoja 40 40 0 3

Hoja 84 62 22 73.8 cincino 125 89 36 71.2 Tallo 20 0 20 0 4 Raíz 15 0 15 0

Total 244 151 93 62

Como se describió en el apartado 5.4.1.3 de metodología del establecimiento de explantes, los tratamientos 1, 2 y 3 corresponden a explantes procedentes de plantas obtenidas directamente de su hábitat natural sin recibir un tratamiento previo para disminuir la cantidad de microorganismos de tipo endógeno, en los tratamientos 1 y 2 la perdida de material vegetal fue ocasionada por contaminación y en el tratamiento 3 por muerte del tejido. La contaminación bacteriana se observa en la figura no. 11.

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Figura 11.- Presencia de contaminación microbiana en explantes de E. calycosa, en los grupos 1 y 2 en la etapa de establecimiento. El tratamiento 4, que incluyó el programa de acondicionamiento de las plantas con el producto Amistar®, mostró la mayor sobrevivencia de los explantes como se muestra en la tabla 10 y en la Figura 12. Estos resultados demostraron la importancia de la etapa 0 en la propagación in vitro (Razdan, 2003) de E. calycosa.

70 62 60 50 40 30 20

% de sobreviviencia de % 10 1.9 0 0 0 1 2 3 4

Tratamientos

Figura 12. Porcentaje de sobrevivencia de explantes provenientes de plantas de Echeveria calycosa, en cada uno de los tratamientos probados en el establecimiento.

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El análisis estadístico (anexo 1 fig. 50 y tabla 37) mostró que existe una influencia significativa del tratamiento sobre la sobrevivencia de los explantes; el tratamiento 4 fue diferente a los tratamientos 1, 2 y 3, ofreciendo un mejor resultado en la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa. La contaminación por microorganismos, hongos y bacterias, es una de las limitaciones principales en el cultivo in vitro sobre todo cuando son obtenidos de plantas adultas procedentes directamente en el campo (Ramírez y col., 1999). Por esta razón es importante tener un método de desinfección endógeno y exógeno adecuado, E. calycosa siendo una planta suculenta de consistencia turgente presentó una gran pérdida de explantes por presencia de contaminación microbiana, también demostró que la consistencia en su tejido vegetal es susceptible a los métodos de desinfección y un tratamiento fuerte puede conducir a la muerte del tejido, por lo que se evaluó el método de desinfección, el tratamiento de los explantes y análisis de la planta hasta encontrar el método apropiado para reducir tanto la contaminación endógena como exógena y lograr el establecimiento de los explantes. La aplicación de la etapa cero del cultivo in vitro, fue determinante para el establecimiento de los explantes. 6.3.1.1 Explantes El tipo de explante mostró una relación directa con la respuesta a su establecimiento in vitro. Los explantes que presentaron la mayor sobrevivencia fueron los provenientes de la hoja de roseta seguidos de los provenientes de la vara flora de plantas de E. calycosa (Fig. 14) con un 73.8 % y un 71.2%, respectivamente, los explantes de raíz y tallo, no sobrevivieron, debido a que el tratamiento de acondicionamiento aplicado a la planta donadora no fue suficiente o él adecuado para disminuir la cuenta microbiana y evitar la presencia de microorganismos durante el establecimiento. En la figura 13 se muestra el número de explantes establecidos según el tipo de tejido de donde se extrajeron. Los resultados obtenidos concuerdan con lo observado en otros estudios previos con respecto a los explantes que se encuentran en contacto directo con el sustrato induciendo una alta contaminación en los explantes, especialmente cuando estos son extraídos de plantas provenientes del campo (Villalobos y Pérez, 1979).

15 20 84 hoja inflorescencia tallo raíz 125

Figura 13. Procedencia de los explantes que se utilizaron en el tratamiento no. 4 del establecimiento in vitro de E. calycosa.

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73.80% 71.20% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 0.0% 10% 0.0% 0% hoja inflorescencia tallo raíz

Figura 14. Sobrevivencia de los explantes de E. calycosa al proceso de desinfección Con respecto a la calidad de los explantes de E. calycosa, utilizados en el establecimiento in vitro se encontró que el de la vara florar, fue el tipo de explante que conservó mejor su aspecto inicial, dando los mejores resultados en la escala de la calidad establecida en la metodología, seguidos de las hojas, como puede verse en la Figura 15.

10 U. A U. 8

6

4

2

0 hoja inflorescencia tallo raiz

Figura 15. Calidad de los explantes de Echeveria calycosa de acuerdo al tejido que le dio origen.

El análisis estadístico (anexo 1 figura 51 y tabla 38) mostró que existe una influencia significativa del tipo de explante sobre la calidad del mismo en la etapa del establecimiento. Los explantes de hoja e inflorescencia ofrecen un resultado semejante que es mejor al obtenido por los explantes de tallo y raíz en la etapa del establecimiento.

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La selección del explante es un parámetro a considerar en los experimentos de regeneración. En este trabajo se observó que diferentes tejidos presentan variación en el potencial de respuesta, por lo que la elección del tejido se volvió crítico al igual que la evaluación de los reguladores de crecimiento vegetal y las condiciones del cultivo, esto concuerda con lo reportado por otros autores como Piqueras y col., (2010). De los cuatro tipos de explante utilizados dos sobrevivieron a la etapa de establecimiento: 1) hojas de roseta y 2) segmentos de inflorescencia.

6.3.1.2 Desinfección de los explantes. En el método utilizado para la desinfección de los explantes se observó que su calidad después de la desinfección fue directamente proporcional al tamaño del mismo, un explante pequeño mostró mayor daño en su superficie que uno desinfectado en las mismas condiciones pero de mayor tamaño, factor que también conduce a la pérdida del material vegetal (figura 16). Debido a estas observaciones se optó por seguir el método de desinfección propuesto por Verastegui , (2009), solo para la desinfección de explantes con tamaño medio a grande y realizar modificaciones para la desinfección de explantes pequeños. Se redujo el tiempo de exposición al cloro por medio de observación al momento de realizar el procedimiento de desinfección, para evitar el posible daño del explante y con ello finalmente su pérdida; cuando el explante comenzó a presentar daño evidente se retiró de la solución de hipoclorito. En el caso de la desinfección de hojas de rosetas muy pequeñas, se procedió a realizar el proceso de desinfección como una unidad, es decir sin separar las hojas de la roseta siempre inspeccionándola visualmente para evitar daño o muerte del tejido.

Figura 16. Explante de hoja de E. calycosa dañado por el tratamiento de desinfección.

La pérdida del explante se presentó por diferentes razones siendo la principal la contaminación microbiana, la segunda por obscurecimiento del tejido (oxidación) y la última por muerte del explante sin una razón aparente como lo muestra la tabla 10. La contaminación puede provenir del

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tejido vegetal en forma exógena, ser introducida durante la manipulación del tejido o por no conseguir las condiciones de asepsia requeridas para cumplir este objetivo. El obscurecimiento que conduce a la pérdida del explante es el resultado de la oxidación de compuestos fenólicos liberados en los extremos del corte de los tejidos, por acción de polifenol oxidasa, peroxidasa o el oxígeno presente en el aire. Los productos de oxidación, pertenecientes al grupo de las quinonas, son altamente reactivos e inhiben la actividad enzimática pudiendo conducir a la muerte de los explantes (Bhat y Chandel, 1991). El establecimiento in vitro de E. calycosa se vio influenciado por los tres factores evaluados: tratamiento para el establecimiento, tipo de explante y método de desinfección, siendo determinante el tratamiento de la planta donante para lograr esta etapa del cultivo in vitro.

6.3.2 Propagación 6.3.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui Se utilizó el medio de cultivo descrito en la metodología, se establecieron 20 explantes uno por frasco. En el periodo de los primeros 30 días no mostraron respuesta, a los 60 días inició la formación de raíz, a los 90 días se observó la formación de rosetas. Se obtuvieron 12 rosetas que corresponden a 60% de organogénesis directa con 1.2 brotes/explante a los 90 días de iniciada la propagación. tabla 11. La supervivencia del explante en fue de 50%, la pérdida de explantes no se debió a contaminación sino a la muerte del tejido vegetal.

Tabla 11. Resultados de la propagación de E. Calycosa con la combinación de RCV utilizada en

E.laui

Tiempo de Explantes Rosetas/ respuesta Raíz Rosetas con No explantes explante % organogénesis respuesta

30 días ------

60 días presencia --- 10 20 1.2 60%

90 días presencia 12 10

En la figura 17 se muestran explantes que presentan organogénesis directa con presencia de roseta y raíces.

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Las rosetas obtenidas se pasaron a medio de cultivo MS al 50% donde continuaron su desarrollo. La mayoría de ellas presentó hiperhidricidad, a pesar de las técnicas que se aplicaron para evitar que avanzara este comportamiento (figura 18), lo que condujo a su pérdida, otras se contaminaron antes de los 150 días.

Figura 17. Explantes de E. calycosa mostrando organogénesis directa en el medio de propagación.

Figura 18. Rosetas de E. calycosa hiperhidratadas. a) roseta con inicios de síntomas de hiperhidricidad; b) a la misma roseta con los síntomas más avanzados.

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6.3.2.2 Propagación con diferentes tratamientos de RCV experimentos bifactoriales con 4 niveles 6.3.2.2.1 Primer experimento bifactorial de propagación Para documentar este primer experimento de propagación se realizaron 4 repeticiones del estudio bifactorial. En la tabla 12 se enlista el número de explantes establecidos y su sobrevivencia a los 120 días para cada repetición.

Tabla 12. Número de explantes de E. calycosa establecidos al inicio y los que sobrevivieron después de 120 días en el primer experimento de propagación.

No. de 1 2 3 4 factorial 120 120 120 120 Tratamiento inicial inicial inicial inicial días días días días 1 1 0 ------4 0 2 1 2 2 0 2 1 3 2 3 0 3 1 1 1 0 3 1 2 1 4 1 0 3 1 3 2 2 0 5 2 0 2 0 3 0 2 2 6 1 1 ------3 3 2 2 7 1 0 1 0 4 3 2 2 8 1 0 ------3 3 2 0 9 1 0 1 0 3 0 2 0 10 1 0 ------3 3 3 3 11 2 0 1 0 3 2 2 0 12 1 1 1 0 3 3 2 2 13 2 0 1 0 3 0 2 0 14 2 0 ------2 0 2 0 15 2 0 ------2 0 2 1 16 2 0 1 0 3 3 2 0 Total 23 3 12 2 48 25 36 14

Con los resultados de la tabla 12, se calculó la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa, dividiendo el número de explantes vivos entre el número total de explantes establecidos. Se obtuvo

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un 44.5% de sobrevivencia de E. calycosa. La pérdida de los explantes se debió principalmente a la muerte del explante. En la figura 19 se representa la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa en este segundo estudio de propagación.

37% 67 % sobrevivencia mortandad

Figura 19. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa, establecidos en 4 diferentes estudios. La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 16 tratamientos, después de 30 días de iniciado el estudio se muestra en la tabla 13.

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Tabla 13. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta a los 30 días de establecidos in vitro.

No Con Tipo de Explantes Muertos/ Tratamiento Calidad explantes respuesta respuesta* vivos contaminados

1 7 1 1 1 5 2

2 10 0 0 1 8 2

3 7 0 0 1 7 0

4 9 1 2 1 7 2

5 9 0 0 2 6 3

6 6 0 0 1 6 0

7 8 0 0 1 6 2

8 6 0 0 1 5 1

9 7 0 0 2 3 4

10 7 0 0 1 6 1

11 8 0 0 1 6 2

12 7 0 0 1 6 1

13 8 0 0 1 5 3

14 6 0 0 1 1 5

15 6 0 0 1 4 2

16 8 0 0 2 5 3

Total 119 2 86 33

* en respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En el periodo de 30 días se tuvo una sobrevivencia de 72.3 %.

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 60 días de iniciado el estudio se muestra en la tabla 14.

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Tabla 14. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta a los 60 días de establecidos in vitro.

No Con Tipo de Explantes Muertos/ Tratamiento Calidad explantes respuesta respuesta* vivos contaminados

1 5 1 1 1 5 0

2 8 2 1 1 7 1

3 7 2 1 1 6 1

4 7 2 1 y 2 1 4 3

5 6 2 1 2 5 1

6 6 3 1, 2 y 4 1 6 0

7 6 3 1, 2 1 6 0

8 5 2 2 1 3 2

9 3 0 0 4 0 3

10 6 0 0 1 6 0

11 6 0 0 1 4 2

12 6 1 1 y 2 1 6 0

13 5 0 0 2 5 0

14 1 1 4 1 1 0

15 4 0 0 1 4 0

16 5 0 0 2 4 1

Total 86 19 72 14

* en respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de brotes

En este periodo se obtuvo una sobrevivencia de 60.5%. La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 90 días de iniciado el estudio se muestra en la tabla 15.

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Tabla 15. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta a los 90 días de establecidos in vitro.

No Con Tipo de calidad Explantes Muertos/ Tratamiento explantes respuesta respuesta* vivos contaminados

1 5 1 1 1 4 1

2 7 4 1 y 2 1 4 3

3 6 2 1 1 3 3

4 4 2 1 1 3 1

5 5 1 1 2 3 2

6 6 4 1, 2 y 4 1 6 0

7 6 5 1, 2 1 5 1

8 3 1 2 1 3 0

9 0 0 0 -- 0 --

10 6 5 2 1 6 0

11 4 1 1 y 2 2 3 1

12 6 1 1 y 2 1 6 0

13 5 0 0 4 0 5

14 1 1 4 1 1 0

15 4 1 2 3 1 3

16 4 1 2 3 3 1

Total 72 30 51 21

* en la columna respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En el periodo de 90 días se tuvo una sobrevivencia de 42.8 %.

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 120 días de iniciado el estudio se muestra en la tabla 16.

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Tabla 16. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta a los 120 días de establecidos in vitro. No Con Tipo de calidad Explantes Muertos/ Tratamiento explantes respuesta respuesta* vivos contaminados

1 4 1 1 1 1 3

2 4 2 1 y 2 2 3 1

3 3 2 1 y 3 1 3 0

4 3 2 1 y 3 1 3 0

5 3 1 1 1 2 1

6 6 6 1, 2 y 4 1 6 0

7 5 5 1, 2 1 5 0

8 3 1 2 1 3 0

9 0 0 -- -- 0 --

10 6 6 2 1 6 0

11 3 2 2 2 2 1

12 6 1 1 y 2 1 6 0

13 0 0 0 - 0 -

14 1 0 -- -- 0 1

15 1 1 2 1 1 0

16 3 1 2 2 3 0

Total 51 31 44 7

* en la columna respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En el periodo de 120 días se tuvo una sobrevivencia de 37.0%.

El análisis estadístico (anexo 1 figura 53 y tabla 40) nos indica que existe una diferencia significativa para p< 0.05 entre las respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa a los 16 tratamientos expuestos a los 120 días en el primer estudio de propagación. En la tabla 17 se resumen los resultados obtenidos de la respuesta obtenida por los explantes de E. calycosa en los diferentes periodos de tiempo establecidos.

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Tabla 17. Resumen del comportamiento de los explantes de E. calycosa durante el primer experimento de propagación.

No. de No. de Periodo explantes Tipo de explantes Sobrevivencia No. de brotes con respuesta* días presentes respuesta 0 119 --- 100 0 30 86 2 72.3 1 60 72 19 60.5 1 - 2 90 51 30 42.9 1 – 2 - 4 4 (1 / explante) 120 42 31 37.0 1 – 2 – 3 - 4 4 (1 / explante) * en la columna respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En la figura 20 se ve el comportamiento de la calidad de los explantes de E. calycosa al paso del tiempo que duró este estudio de propagación.

100 94 90

80 72

70 Calidad 60 53 1 verde 49 50 2 verde claro 40 36 3 blanco

No. de de No. explantes 30 4 cafe 18 18 20 14 12 5 negro 7 10 5 5 5 3 2 2 1 1 2 0 2 0 0 0 30 60 90 120 días

Figura 20. Variación de la calidad de los explantes de E. calycosa, durante el tiempo de . estudio inicial, 30 60, 90 y 120 días de su establecimiento.

La figura 21 representa la variación de la calidad en porcentaje de los explantes de E. calycosa dependiendo del tipo de explante que se utilizó (hoja o inflorescencia) después de 120 días de

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inducidos, se encontró que los explantes de tipo inflorescencia presentan ligeramente una mejor calidad que los explantes de tipo hoja, aunque la calidad no es un parámetro indicativo de que se va a tener una mejor respuesta como podemos ver en la figura 22.

Figura 21. Calidad en % de los explantes de hoja e inflorescencia de E. calycosa, a los 120 días de iniciada la propagación

Figura 22.- Respuesta que presentaron los explantes de E. calycosa a los 120 días dependiendo del tipo de explante.

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De 119 explantes que se establecieron en este estudio de propagación para E. calycosa, 44 explantes se obtuvieron de partes de la inflorescencia y 75 de la hoja de roseta, en la figura 22 se representa gráficamente la respuesta que se obtuvo de los explantes que seguían vivos después de 120 días de iniciado este estudio.

Analizando los resultados mostrados en la figura 22 aparentemente el explante de hoja presenta mayor número de respuestas que la inflorescencia, pero haciendo el análisis estadístico se observa que no existe una diferencia significativa en la respuesta entre los dos tipos de explantes ya que se obtiene un valor de p= 0.22.

En la figura 23 se encuentran fotografías realizadas a través del microscopio estereoscopio de las respuestas obtenidas por los explantes que sobrevivieron en este segundo estudio de propagación para E. calycosa. Se encontró una relación entre la respuesta obtenida de acuerdo a la fila y a la columna en la cual se encuentran los explantes; la respuesta de los explantes al tratamiento depende de la combinación de reguladores de crecimiento vegetal utilizado.

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Figura 23.- Respuesta representativa de los explantes de E. calycosa a los tratamientos (identificados por los números 1 al 16) de los reguladores ANA y KIN en el primer estudio de propagación; Los tratamiento 5, 9 y 13 donde solo se adiciono KIN al medio de cultivo, no hubo respuesta, los explantes tienden a secarse y morir; En los tratamientos 6, 10 donde la cantidad de ANA es baja y

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la de KIN es semejante se observa la presencia de brotes a partir de callo; En el tratamiento 14 donde la cantidad adicionada de ANA menor con respecto a la de KIN se observó la presencia de roseta sin etapa de formación de callo. Los tratamientos 7, 8, 11, 12 15 y 16 se observó formación de callo. En estos tratamientos donde las concentraciones de ANA y KIN son menos altas el callo es más friable y con respecto a las concentraciones más altas de los dos reguladores tiene a compactarse. Al aumentar la concentración de KIN en presencia de ANA la respuesta fue más efectiva para la formación de brotes, hasta llegar a un punto que fue demasiada elevada que detiene el crecimiento de las células, como se observa en las filas 3 y 4 donde solo se forma callo, las concentraciones altas de ANA reprimen la formación de brotes y forman callo. Los tratamientos 2, 3 y 4 donde solo se adicionó ANA al medio de cultivo tendieron a formar callo compacto. De cada uno de los tratamientos al menos se realizaron 5 repeticiones.

6.3.2.2.2 Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E. calycosa propagadas in vitro

Sobrevivencia.- la perdida de explantes en este estudio no se debió a la contaminación sino a la muerte del tejido que pudo ser ocasionado por el tamaño pequeño de los explantes ya que existe también un tamaño mínimo debajo del cual no se obtiene la respuesta deseada. (Hernán, 2007) o debido a las concentraciones de los RCV utilizados. La sobrevivencia fue de 56%, se calculó de la misma manera que en los casos anteriores. El número de explantes obtenido de las rosetas sobrevivientes se dividió entre el número total de explantes establecidos. En la tabla 18 se indica el número de explantes establecidos por combinación de RCV al inicio del estudio y al término de 120 días.

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Tabla 18. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que se establecieron y los que sobrevivieron después de 90 días.

No. explantes

tratamiento inicial 120 días

1 1 0

2 3 2

3 2 2

4 3 2

5 2 2

6 2 2

7 1 0

8 1 0

9 3 0

10 2 0

11 1 0

12 2 2

13 1 0

14 3 0

15 2 0

16 1 0

Total 30 12

En la tabla 19 podemos observar la respuesta de los explantes de roseta a los diferentes tratamientos establecidos para este estudio bifactorial.

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Tabla 19. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que presentaron respuesta a los 120 días de establecidos y la respuesta presentada. Donde se observan respuesta de callo friable=1, callo compacto=2, raíz= 3 y formación de roseta= 4.

No Con Callo Callo no No de Raíz Tratamiento explantes respuesta friable friable rosetas

1 1 0 0 0 0 0

2 3 3 2 0 3 1

3 2 2 0 0 2 2

4 3 3 0 0 3 0

5 2 2 2 0 0 2

6 2 2 2 0 1 4

7 1 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0 0

10 0 0 0 0 0 0

11 0 0 0 0 0 0

12 3 2 0 0 0 2

13 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0

16 0 0 0 0 0 0

Total 17 22 21 13 0 11

La respuesta obtenida fue diferente a la obtenida por explantes de origen in vivo, en este caso el callo que se formó fue de tipo compacto y en algunos casos como en el tratamiento no. 4 las rosetas iniciales terminaron formando callo.

Esto se explica ampliamente si hacemos referencia a la siguiente cita: “Diferentes tejidos presentan variación en el potencial de respuesta, por lo que la elección del tejido se vuelve crítico al igual que

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la evaluación de los reguladores de crecimiento vegetal y las condiciones del cultivo” (Piqueras y col., 2010).

En la figura 24 se observan los resultados obtenidos en el factorial número 6, donde se muestra formación de rosetas, callo y raíz .

Figura 24. Respuesta de los explantes de rosetas obtenidas in vitro de E. calycosa a los 16 tratamientos del primer experimento de propagación a los 180 días, donde se observan respuesta de callo friable=1, callo compacto=2, raíz= 3 y formación de roseta= 4. a) tratamiento no. 2: 4 mg/l de ANA – 0 mg/l de KIN (resp= 2, 3 y 4) b) tratamiento no. 12: 16 mg/l de ANA – 6 mg/l de KIN (resp= 1 ,3 y 4) c) tratamiento no. 3: 8 mg/l de ANA – 0 mg/l de KIN (resp= 2 ,3 y 4) d) tratamiento no. 6: 4 mg/l de ANA – 6 mg/l de KIN (resp= 3 y 4) e) tratamiento no. 4: 16 mg/l de ANA – 0 mg/l de KIN (resp= 2 y 3) f) tratamiento no. 5: 0 mg/l de ANA – 2 mg/l de KIN (resp= 3 y 4)

Durante el periodo de propagación in vitro, la pérdida de explantes fue debida a la contaminación de los explantes, esto se puede atribuir a malos manejos en la manipulación, a no tener las condiciones requeridas de asepsia en el lugar de trabajo o en la campana de flujo laminar, o a la contaminación endógena en el explante que no se había manifestado en la etapa anterior del establecimiento. La contaminación por microorganismos es la causa más importante de pérdidas en el cultivo de células y tejidos vegetales, considerando que las plantas, están asociadas a microorganismos endógenos y exógenos que encuentran condiciones favorables de desarrollo en dichos medios nutritivos (Perla, 2007).

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Otra causa de pérdida de explantes fue debido a la muerte del explante, que se puedo atribuir al daño sufrido desde la etapa de desinfección o a su oxidación. También la composición de algunos tratamientos de reguladores no permite la sobrevivencia del explante. La calidad del explante se midió como indicativo de sobrevivencia, observándose que una buena calidad del explante no es sinónimo de respuesta, ya que los explantes deteriorados o aparentemente muertos presentaron respuesta a la presencia de RCV en el medio de propagación, el explante de inflorescencia mantuvo una mejor calidad, pero el explante de hoja presentó un mayor porcentaje de respuesta como muestra la figura 22.

6.3.2.3.1 Primer experimento de propagación con E. purhepecha

En este el primer estudio de propagación en el que se utilizó la especie E. purhepecha, se realizaron 2 estudios de 16 tratamientos de RCV (descritos en la tabla no. 4) debido a la cantidad de material vegetal con el que se contaba, que ya había pasado la etapa de establecimiento, en la tabla 20 se describe el número de explantes que se estableció en cada combinación de acuerdo a la cantidad de tejido vegetal que se disponía después de pasar por la etapa de establecimiento, cabe señalar que el primer estudio se realizó con partes de la inflorescencia y el segundo con hojas. También en este caso se obtuvo la sobrevivencia en base a los tablas 20 y 21, dividiendo el número de explantes vivos (27) después de 120 días que fue el periodo que se extendió este estudio entre el no. total de explantes establecidos al inicio de este estudio (77), nos dio un resultado de 35.1 % de sobrevivencia en los dos factoriales establecidos.

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Tabla 20. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron

después de 120 días.

No. 1 2 factorial Tratamiento inicial 120 días inicial 120 días

1 1 0 2 1

2 4 4 3 2

3 4 0 3 2

4 4 0 3 0

5 4 0 3 0

6 4 4 2 2

7 3 2 3 1

8 1 0 3 2

9 1 0 3 0

10 1 0 3 0

11 2 0 2 0

12 2 1 2 2

13 1 0 2 0

14 1 0 4 1

15 1 0 3 1

16 1 0 2 2

Total 34 11 43 16

Los explantes de E. purhepecha se monitorearon semanalmente y se reportó la respuesta y la calidad a los 30, 60, 90 y 120 días de iniciado el diseño factorial.

Por no ser el motivo de este estudio solo se reporta la calidad y respuesta de los explantes de Echeveria purhepecha al después de 120 días de iniciado el estudio y se encuentran recopilados en la tabla 21.

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Tabla 21. Número de explantes de Echeveria purhepecha que presentaron respuesta a los 120 días de establecidos y la respuesta que presentaron.

No. Con Tipo de calidad Explantes Muertos/ Tratamiento explantes respuesta respuesta* vivos contaminados 1 1 1 1 1 1 -

2 6 6 1 1 6 -

3 2 2 1 1 2 -

4 --- 0 0 - - -

5 --- 0 0 - - -

6 6 6 1 y 4 1 7 0

7 2 2 2 y 4 1 2 -

8 2 2 3 y 4 2 2 -

9 1 0 0 5 - 1

10 --- 0 0 - - -

11 --- 0 0 - - -

12 3 3 1, 2 y 4 2 3 0

13 1 0 0 5 - 1

14 2 0 0 1 1 1

15 1 1 2 y 4 1 1 0

16 2 2 2 y 4 1 2 -

Total 30 25 27 3 * tipo de respuesta: 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En la figura 25 se observa la respuesta que presentaron los explantes de Echeveria purhepecha a los 120 días después de su inducción; de acuerdo al origen del explante, hoja o inflorescencia.

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inf hoja

17

11 9

5 4 3 2 0

raíz callo friable callo compacto rosetas a los 120 días

Figura 25. Número de explantes de E. purépecha que presentaron respuesta a los 16 tratamintos del primer estudio de propagación, según el tipo de explante a los 120 días de iniciado el estudio.

En la tabla 22 se comparan los resultados tanto para E. calycosa y E. purhepecha obtenidos al finalizar este estudio bifactorial de propagación. Tabla 22. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 120 días en el primer estudio de propagación. Total de Con Tipo de Explantes % de % de Especie explantes respuesta respuesta* vivos respuesta Sobrevivencia calycosa 119 31 1, 2, 3 y 4 44 26.1 37.0 purhepecha 77 26 1, 2, 3 y 4 27 33.7 35.1

* tipos de respuesta: 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

El análisis estadístico (anexo 1, figura 54 y tabla 41) nos indica que existe una influencia significativa para p < 0.05 de la especie de Echeveria sobre la respuesta obtenida por los explantes al tratamiento a los 120 días en el primer estudio de propagación. La Especie E. calycosa es significativamente diferente a la especie E. purhepecha con respecto a la respuesta que presenta a los tratamientos de RCV en este primer estudio de propagación.

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6.3.2.4. Segundo experimento de propagación En la tabla 23 se resume el número de explantes establecidos en cada uno de los 16 tratamientos (factorial), se realizaron dos repeticiones identificadas como factorial no. 3 y no. 5, se reporta el número de explantes sobrevivientes al final del estudio, establecido a los 90 días. En base a los resultados de la tabla 22, se calculó la sobrevivencia, dividiendo el número de explantes vivos al final del estudio (90 días) entre el no. total de explantes presentes al inicio del estudio en los dos factoriales realizados. Se obtuvo un 2.9 % de sobrevivencia. Las causas de la pérdida de explantes fueron: en mayor parte se debió a muerte del explante y como segunda causa contaminación microbiológica del explante. En el factorial no. 3 se utilizaron explantes de hojas de la roseta y en el factorial no. 5 se utilizaron tallos, hojas e inflorescencias de la vara floral, que fueron los dos tipos de explante que sobrevivieron a la etapa del establecimiento. Los explantes de E. calycosa se monitorearon semanalmente, pero solo se reportó la respuesta obtenida y la calidad que presentaron los explantes a los 30, 60 y 90 días.

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Tabla 23. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que sobrevivieron después de 90 días en el segundo estudio de propagación.

No. factorial 3 5 Número de explantes vivos

Tratamiento inicial 90 días inicial 90 días

1 1 0 3 0

2 1 0 3 0

3 1 0 3 0

4 1 0 3 0

5 1 0 4 0

6 1 0 3 0

7 1 0 3 0

8 1 0 1 0

9 1 0 4 0

10 1 1 3 0

11 1 0 3 0

12 2 0 4 0 13 1 1 3 0

14 2 0 3 0

15 2 0 4 0

16 1 0 3 0

Total 19 2 50 0

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 30 días se presenta en la tabla 24.

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Tabla 24. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que presentaron respuesta al tratamiento a los 30 días.

No Tratamiento respuesta vivos calidad muertos contaminados explantes

1 4 0 0 4 1 3

2 4 0 3 2 1 0

3 4 0 0 5 4 0

4 4 0 0 4 4 0

5 5 0 0 3 5 0 6 4 0 0 4 4 0 7 4 0 1 2 3 0

8 2 0 0 4 2 0

9 5 0 5 2 0 0

10 4 0 1 1 2 1

11 4 0 4 2 0 0

12 6 0 4 2 0 2

13 4 0 3 1 0 1 14 5 0 4 1 1 0

15 6 0 2 1 0 4

16 4 0 0 5 0 4

Total 79 0 27 27 15

* en la columna respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En la figura 26 se muestra la calidad de los explantes de Echeveria calycosa a 30 días de iniciado el periodo de regeneración.

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25 23

20 17

15 14

10

10 No. de de No. explantes 5 5

0 1 2 3 4 5

Calidad

Figura 26. Número de explantes de E. calycosa que presentaron una calidad entre 1 y 5 durante los primeros 30 días de propagación.

La sobrevivencia de los explantes de E. calycosa a los 30 días fue de 39.13 %. En el segundo estudio de propagación se observa una alta mortandad de explantes desde el primer periodo de 30 días, figura 27.

39.13 Explante vivo 60.87 Explante muerto

Figura 27. Porcentaje de sobreviviencia de explantes de Echeveria calycosa a los 30 días después de iniciada la etapa de propagación

Los resultados a los 60 días de iniciado el segundo estudio de propagación se muestran en la tabla 25.

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Tabla 25. Número de explantes de Echeveria calycosa establecidos y los que presentaron respuesta a los 60 días de establecidos.

No Con Tratamiento vivos calidad explantes respuesta muertos contaminados

2 3 0 0 5 3 0

7 1 0 1 2 - 0

9 5 0 1 2 4 0

10 1 0 1 3 1 0

11 4 0 0 4 4 0

12 4 0 0 5 0 4

13 3 0 2 2 1 0

14 4 0 0 1 0 3

15 2 0 0 4 2 0

Total 27 0 5 15 7 * en la columna respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En la figura 28 se muestra el número de explantes de E. calycosa que se mantuvieron en el rango de calidad entre 1 y 5 a los 60 días, se observa que sigue la tendencia de perdida de la calidad y muerte de los explantes de E. calycosa. En la figura 29 se muestra la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa después transcurridos 60 días de iniciado el experimento que fue de 7.25%. Los resultados obtenidos por los explantes de E. calycosa sobrevivientes a los 90 días de cultivo se describen en la tabla 26.

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Figura 28. Número de explantes de E. calycosa que presentaron una calidad entre 1 y 5 en el periodo de 60 días de iniciada la propagación.

7.25

sobrevivencia mortandad 92.75

Figura 29. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa después de transcurrido un periodo de 60 días de iniciada la propagación.

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Tabla 26. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que presentaron respuesta a los 90 días.

No Con vivos calidad Tratamiento muertos explantes respuesta contaminados

7 1 0 0 5 1 0

9 1 0 0 5 1 0

10 1 0 1 1 0 0

13 2 0 1 1 1 0

Total 5 0 2 3 0

La figura 30 muestra el no. de explantes que sobrevivieron durante este estudio de propagación y la figura 31 muestra el % de sobrevivencia de los mismos.

Figura 30. Número de explantes de E. calycosa durante el periodo de propagación. 1) total de explantes establecidos, 2) explantes que sobrevivieron, 3) explantes muertos en el periodo de 90 días.

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2.9

sobrevivencia mortandad

97.1

Figura 31. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de Echeveria calycosa, en el periodo de propagación a los 90 días.

Transcurridos 90 días se dejó de monitorear estos estudios factoriales debido a que la pérdida de explantes se acercó al 100% y no se presentó respuesta en los explantes sobrevivientes.

6.3.2.4.1 Segundo experimento bifactorial de propagación con Echeveria purhepecha Los explantes utilizados para la propagación in vitro de E. purhepecha, fueron los que sobrevivieron a la etapa de su establecimiento. Se realizaron 4 repeticiones de los 16 tratamientos (factoriales) que se monitorearon durante 90 días. En la tabla 27 se muestra el número de explantes de E. purhepecha establecidos en cada tratamiento (los tratamientos se encuentran descritos en la tabla no. 6). En base a los resultados de los tablas 27 y 28, se calculó la sobrevivencia, dividiendo el número de explantes vivos entre el no. total de explantes establecidos. Se obtuvo un 41.4 % de sobrevivencia en los cuatro factoriales establecidos; es importante hacer notar que en los estudios factoriales 1 y 2 se utilizaron hojas como explantes y en los estudios 3 y 4 se utilizaron fragmentos de cincinos, esto para ser comparativo con los estudios realizados con la especie E. calycosa. Los explantes de E. purhepecha se monitorearon semanalmente y se reportó la respuesta y la calidad a los 30, 60, y 90 días de iniciado el diseño factorial. Por no ser el motivo de nuestro estudio los resultados de Echeveria purhepecha, solo se reporta la calidad final y respuesta a los 90 días y se compara con los resultados de Echeveria calycosa. Los resultados obteniendo a los 90 días de iniciados los estudios de los explantes de E. purhepecha se encuentran recopilados en la tabla 28.

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Tabla 27. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron después de 90 días.

No. 1 2 6 7 factorial Tratamiento inicial 90 días inicial 90 días inicial 90 días inicial 90 días

1 1 1 1 1 4 0 2 0

2 1 1 1 1 3 0 2 2

3 2 0 1 0 3 0 2 0

4 1 0 1 0 3 0 2 1

5 1 0 2 0 4 2 2 2

6 2 2 1 1 2 2 2 2

7 1 1 1 1 3 0 3 1

8 1 1 2 1 2 0 ------

9 1 0 1 0 2 0 2 0

10 1 1 1 1 2 0 2 2

11 1 1 1 1 2 0 2 2

12 1 1 2 2 3 0 2 0

13 1 1 1 1 3 0 1 1

14 1 1 1 1 3 0 2 2

15 1 1 1 1 2 0 2 0

16 1 1 1 1 3 0 2 1

Total 18 13 19 13 44 8 30 15

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Tabla 28. Número de explantes de E. purhepecha y los que presentaron respuesta a los 90 días de establecidos.

No Con Tipo de calidad Explantes Tratamiento Muertos/ explantes respuesta respuesta* vivos contaminados 1 8 0 0 1 2 6

2 7 2 1 y 4 1 4 3

3 8 0 0 4 0 8

4 7 1 2 4 1 6

5 9 4 1 y 4 4 4 5

6 7 1 2 2 7 0

7 8 1 1 y 4 1 3 5

8 5 0 0 4 2 3

9 6 0 0 2 0 6

10 6 2 1 y 2 1 4 2

11 6 2 2 2 4 2

12 8 2 2 2 3 5

13 6 2 2 1 3 3

14 7 2 2 1 4 3

15 6 2 2 1 2 4

16 7 2 2 5 3 4

Total 111 21 46 65 * tipos de respuesta: 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

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En la tabla no. 29 se comparan los resultados de la respuesta de E. calycosa y E. purhepecha transcurrido un periodo de 90 días de iniciado este estudio de propagación.

Tabla 29. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 90 días de iniciado el segundo estudio de propagación.

Total de Con Tipo de Especie Explantes % de % de explantes respuesta respuesta* vivos respuesta Sobrevivencia

Calycosa 79 0 0 2 0 2.9

Purhepecha 111 21 1, 2 y 4 46 18.9 41.4 * tipos de respuesta: 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

El análisis estadístico (anexo 1 figura 52 y tabla 39) mostró influencia de la especie vegetal utilizada sobre la respuesta de sobrevivencia y regeneración obtenida. Estos resultados evidencian que especies del mismo género responden de manera diferente al mismo tratamiento recibido en la etapa de propagación. El tipo de explante a usarse en los procesos de propagación depende de la especie y de los objetivos que se persigan En los estudios de propagación realizados se encontró que la concentración de RCV que generó una mejor respuesta en los explantes de E. calycosa fue la que conformó al tratamiento no. 6 del segundo estudio de propagación (medio de cultivo: MS ½,, suplementado con los RCV: ANA 4.0 mg/l de – 2.0 mg/l de KIN + sacarosa 15 g/l + phytagel 4.5 g/l, con un pH = 5.7 ajustado antes de la adición de phytagel con HCl 1 N o NaOH 1 N según fue necesario. Los estudios bifactoriales se realizaron en diferentes épocas del año, se observó un comportamiento de los explantes diferente, dependiendo de la época del año y a su contenido hormonal endógeno, los explantes inoculados en otoño e invierno sobrevivieron menos y casi todos formaron callo que en algunos tratamientos produjo organogénesis indirecta. Los inoculados en primavera se adaptaron mejor al medio de cultivo y presentaron una respuesta más rápida a la exposición de RCV y no pasaron por la formación de callo, (organogénesis directa) esté fue el caso de la primera propagación que se realizó en una sola concentración 6 mg/l de KIN y 4 mg/l de ANA ver figura 33; los explantes que se inocularon en invierno en este miso tratamiento, a los 120 días comenzaron a dar respuesta de formación de roseta mediante organogénesis indirecta.

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En la figura 34 incisos a y b) se observa la formación de rosetas en dos explante de hoja a través del microscopio estereoscopio, ambos explantes se inocularon en primavera en el tratamiento no. 6 del segundo estudio bifactorial en donde el medio de cultivo MS ½ esta adicionado con RCV 2 mg/l de KIN y 4 mg/l de ANA. Se observa claramente el inicio de la organogénesis directa y el mayor número de brotes formándose. En la figura 34 incisos c y d) se observa dos explantes inoculados en el mismo tratamiento 6, en época de invierno, tardaron más tiempo en dar respuesta e inicialmente se observó la formación de callo, a partir del cual se formaron los brotes. En la figura 32 se observa un explante en el mismo tratamiento de 2 mg/l de KIN y 4 mg/l de ANA que formó hasta 50 rosetas por explante por organogénesis indirecta después de 180 días de inoculado, fue establecido en diciembre. Los explantes extraídos de plantas donadoras en diferentes épocas del año pueden no dar resultados reproducibles en cultivo de tejidos. Esto puede ser debido a la variación en el nivel de contaminantes externos o debido a cambios estacionales en los niveles de reguladores del crecimiento endógenos (George y col., 2008).

Figura 32. Organogénesis indirecta, en explante de E. calycosa en medio de cultivo MS 50 % adicionado de 2:4 mg/l (KIN : ANA). Experimento iniciado en diciembre, explante con 180 días.

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Figura 33. Organogénesis directa en explantes de E. calycosa en medio de cultivo MS 50% adicionado de 6:4mg/l de KIN : ANA. Experimento iniciado en mayo, explante con 90 días.

Figura 34. A y B.- organogénesis directa en explantes de E. calycosa experimento iniciado en abril explantes con 80 días; C.- organogénesis indirecta en explantes de E. calycosa experimento iniciado en enero explante con 150 días; D.- organogénesis indirecta, en explantes de E. calycosa

experimento iniciado en diciembre, explante con 120 días. Todos los explantes estuvieron expuestos al tratamiento 6: medio de cultivo MS al 50% adicionado con 2 mg/l de KIN y 4 mg/l de ANA.

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6.4. Inducción de brotes a partir de callo Los tratamientos del primer experimento de propagación que produjeron callo fueron: no. 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12,15 y 16. En todos estos tratamientos no se observaron cambios en los callos producidos solo el aumento del tamaño después de los 120 días de inoculados, por lo que se procedió a medir el tamaño del área de los callos formados (ver tabla no. 30).

Tabla 30. Área en cm2 de los callos producido por los tratamientos 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15 y 16 en el primer estudio de propagación. Tratamiento No. Medida del área del callo en Total factorial cm2 por explante cm2

2 3 0.80 0.24 --- 1.04

3 25.1 1.32 2.16 0.56 4.04

4 25.1 1.68 1.56 --- 3.24

7 25.1 3.04 1.32 1.32 5.68

8 25.1 0.99 1.20 1.30 3.49

11 25.1 0.64 0.70 0.30 1.64

12 1 1.44 1.68 1.17 4.29

12 25.1 1.50 2.40 3.60 7.50

15 25.2 1.21 0.50 --- 1.71

16 25.2 3.00 2.25 2.70 7.95

16 25.1 1.44 1.17 2.04 4.65

Los callos que se obtuvieron de estos tratamientos se muestran en la figura no. 35, se puede observar que los callos de la primer columna (tratamientos 2, 3 y 4) tienden a formar callo compacto, frecuentemente con presencia de raíz que con el tiempo tiende a degenerar en callo compacto; los de la segunda y tercera columna son callos de tipo friable, los tratamientos 7, 11 y 15 presentan un color más pálido y se obtuvieron en menor cantidad que los de los tratamientos 8, 12 y 16.

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Los callos obtenidos y separados de los explantes que los produjeron, fueron segmentados e inoculados en frascos de vidrio conteniendo medió de cultivo estéril de los tratamientos que produjeron brotes (tratamientos no. 6, 10 y 14) utilizando medio de cultivo 1/2 MS sin reguladores como testigo, para comprobar si la presencia de callo puede degenerar en la obtención de brotes al colocarlos en las concentraciones apropiadas de RCV que si produjeron brotes. Los callos que se establecieron en los nuevos tratamientos se monitorearon cada 8 días durante un mes observando que algunos produjeron respuesta y otros no; ver tabla 31. En las figuras 36 y 37 podemos observar la respuesta de los callos que pertenecen a los tratamientos 7 y 12 mostrando presencia de brotes.

Figura 35. Callos producidos en el primer estudio de propagación. En la primera columna observamos callos tipo compacto, de color obscuro; en la segunda columna callo friable, un poco más flojo y un color más pálido que los de la tercera columna donde la producción de callo fue mayor, de un verde más obscuro y una textura más compacta. Se produce callo compacto en concentraciones altas de auxinas (Cruz, 2013).

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Tabla 31. Respuesta obtenida al establecer los callos obtenidos del primer estudio de propagación de E. Calycosa, en los tratamientos donde se produjeron brotes.

Tratamiento Tratamiento de donde Tipo de proviene el callo Testigo MS No. 6 No. 10 No. 14 callo sin RCV

2 compacto 0 0 0 0

3 compacto 0 1 (1 mes) 0 0

4 compacto 1 (1 mes) 1 (1 mes) 0 0

7 friable 0 0 0 2 (4 días)

8 friable 0 0 0 0

11 friable 0 2 (1 mes) 0 0

12 friable 0 2 (1 mes) (2) 1 mes 0

15 friable 0 0 0 0

16 friable 0 0 0 2 (1 mes) Dónde: 0= sin respuesta, 1= formación de raíz, 2= formación de roseta.

La respuesta obtenida en el cultivo in vitro dependerá de la ubicación del tejido vegetal utilizado en la planta, del tipo de tejido que se trate, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas entre otros, etc. . Es indudable que la falta de respuesta o la contaminación del explante sean indeseables, pero respuestas como proliferación de callos son de gran valor para iniciación de suspensiones celulares y la proliferación de vástagos que pueden ser ideales si se pretende micropropagar plantas (Mroginski y Roca, 1991). El balance exógeno de auxinas y citocininas en el medio, es esencial para la organogénesis, jugando un rol importante en la determinación morfológica del callo. Donde la obtención de órganos está regulada por la relación de auxinas y citocininas (Zhao y col., 2008).

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Figura 36. Formación de brotes a partir del callo del explante 25.7.1 después de 18 días (A) y 23 días (B) inoculado en el tratamiento no. 14 (4 mg/l de ANA, 18 mg/l de KIN).

Figura 37. Formación de brotes a partir de callo del explante 212.1 después de 23 días de inoculado en los tratamientos no. 6 (4 mg/l de ANA, 2 mg/l de KIN) y no. 10 (4 mg/l de ANA, 6 mg/l de KIN), en ambos tratamientos presenta formación de brotes.

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6.5 Enraizamiento Los tratamientos y las respuestas obtenidas en cada uno de los diferentes parámetros que se establecieron para el control del enraizado se describen en la tabla 32, cada dato representa el valor promedio de las mediciones realizadas en cada grupo. La adición de ANA indujo la producción de callo, plantas en forma de racimo con varias rosetas pequeñas, con raíz de tipo adventicio o sin raíz, figura 38. El carbón activado, en todos los casos produjo una raíz y roseta más grande, su presencia influyo en el tamaño de la raíz, pero no fue significativo en el no. de raíces presentes. La concentración más alta de sacarosa 30g/l en medio de cultivo MS, proporcionó raíz más grande y abundante, así como plantas más grandes, pero más frágiles. La ausencia de sacarosa reportó plantas pequeñas con poca raíz o sin ella. En los medios de cultivo donde se adicionó KIN, en general se obtuvieron plantas más grandes que las obtenidas en los demás tratamientos de enraizamiento, no presentaron la fragilidad que las que no se adicionaron con KIN, se formaron menos raíces y más delgadas en las plántulas obtenidas, se presentó con mayor frecuencia y más acentuado la alteración que consiste de tallos fusionados En el Anexo 1, en los tablas 42 al 47 y en las figuras 55 al 60 se encuentran el análisis estadístico para la altura de planta y largo de raíz; en donde se indica que existe una influencia significativa para p< 0.05, del número de grupo, el contenido de sacarosa y de la presencia de carbón activado en la altura de la planta y largo de la raíz obtenidos en los tratamientos de enraizamiento. Se muestra cuáles son los tratamientos que son significativamente diferentes en la etapa de enraizamiento. En la figura 39 podemos apreciar las rosetas representativas que se desarrollaron junto con sus raíces, en los 8 tratamientos de enraizado realizados en medio de cultivo que no estaban adicionados con RCV.

Figura 38.- Rosetas enraizadas en el medio de cultivo adicionado con ANA (0.1 mg/l), con presencia de callo en la base de las pequeñas rosetas y raíces de tipo adventicio.

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Tabla 32.- Resultados obtenidos en los diferentes tratamientos de enraizamiento.

Raíz Roseta ANA 0.1 KIN 0.1 # MS % AZ C.A. No. tipo mg/l mg/L Largo Alto Ancho cm cm cm 1 100 30 + - - 3.14 17.12 1 2.18 2.52 2 100 30 - - - 2.51 16.06 1 1.46 1.81 3 50 15 + - - 2.08 7.80 1 2.03 2.04 4 50 15 - - - 1.87 11.07 1 1.50 1.72 5 50 7.5 + - - 1.58 6.95 1 1.95 1.96 6 50 7.5 - - - 1.51 8.75 1 1.44 1.59 7 50 0.0 + - - 0.91 3.63 1 1.32 1.44 8 50 0.0 - - - 1.32 6.77 2 1.21 1.41 9 50 15 + + - 0.71 1.76 3 0.79 1.07 10 50 15 - + - 0.24 0.59 3 0.76 0.93 11 100 30 + - +1 1.98 12.43 1 2.30 2.26 12 100 30 + - +2 1.94 13.83 1 2.45 2.81 13 100 30 + - +3 2.90 11.64 1 2.59 2.78 14 100 30 + - +4 2.04 10.67 1 3.13 3.08 Donde C.A. = carbón activado; ANA= ácido naftalenacetico; tipo de raíz obtenida: 1= fibrosa, 2= escasa o nula, 3= adventicia; MS= medio de cultivo Murashige-Skoog, AZ= sacarosa.

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Figura 39.- Rosetas enraizadas en medios de cultivo que no contenían RCV, después de 40 días de iniciado este periodo, los medios de cultivo fueron: 1= MS ½ + 7.5 g/l de az.; 2= MS ½ + 7.5 g/l de az + C.A; 3= MS ½ + 15 g/l de az + C.A; 4= MS ½ + 15 g/l de az; 5= MS + 15 g/l de az. ; 6= MS 100+ 15 g/l de az + C.A; 7= MS ½ ; 8= MS ½ + C.A; Donde MS= Medio de cultivo Murashige and Skoog, az= sacarosa, C.A.= carbón activado. nota: Es importante tomar en cuenta la escala para apreciar el tamaño real. La figura 40 es una muestra representativa de los diferentes tipos de rosetas que se presentaron en los 8 tratamientos de enraizado realizados en medio de cultivo que no estaban adicionados con RCV

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Figur a 40. Rosetas obtenidas durante el enraizamiento: A y C= rosetas solas , B y D= rosetas en racimo; E, B= rosetas hiperhidratadas, F,G,H = rosetas con tallos fusionados. En la figura 41 se muestra las rosetas que se obtuvieron en los medios de cultivo que se adicionaron con KIN en el tratamiento de enraizamiento, se observan rosetas de un tamaño grande que aumenta con el tiempo de exposición a la KIN, la raíz, no alcanzó el tamaño de la obtenida en el medio de cultivo equivalente sin reguladores de crecimiento, conforme aumenta el tiempo de exposición a KIN la raíz es más escasa y delgada. No se observaron raíces con vellosidades o con ramificaciones. En la figura 42 podemos apreciar diferentes desarrollos de las plántulas expuestas al tratamiento de KIN todavía en los frascos de cultivo in vitro,

Figura 41. Rosetas obtenidas del enraizamiento con medio de cultivo adicionado con KIN (0.1 mg/l). A: 1 semana; B: 2 semanas; C: 3 semanas; D: 4 semanas de exposición a KIN.

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Figura 42.- Rosetas con exposición a la KIN, A y F) con forma de roseta alargada, B) con tallos

fusionados en la punta, C y D) con roseta floja y alargadas; E) con la forma típica de una roseta.

En la figura 43 se presentan algunas rosetas procedentes de medios de cultivo para enraizamiento que estuvieron expuestas a KIN, en las cuales se presenta la alteración de tallos fusionados en diferente grado o con una forma alargada, perdiendo la forma típica de una roseta de E. calycosa. en su mayoría estas rosetas no sobrevivieron.

Se realizó un análisis estadístico para la presencia de la alteración de tallos fusionados ver anexo 1 figura 61 tabla 48 el cual muestra que existe una influencia significativa para p < 0.05 de la concentración de sacarosa para la presencia de la alteración de tallos fusionados. Entre más alta es la concentración de sacarosa en el medio de cultivo in vitro para el enraizamiento, mayor es el porciento de la presencia de esta alteración, la presencia de sacarosa en 30 g/l en el medio de enraizamiento aumenta significativamente la presencia de tallos fusionados en las rosetas. En la tabla 33, se muestra los resultados obtenidos de la frecuencia con la que se presentó esta alteración con respecto al grupo de enraizamiento, al realizar el análisis estadístico de la presencia de

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reguladores o de carbón activado el análisis estadístico arrojo que ninguno de estos parámetros es significativo en su influencia para la presencia de esta alteración.

Figura 43. Rosetas enraizadas en medios de cultivo adicionados con KIN, las cuales presentaron algún tipo de alteración en su desarrollo. A, B, C D y E presentan la alteración de tallos fusionados en diferente grado en B, C y F se observan rosetas alargadas. El enraizamiento se logró con todos los tratamientos, La inducción de raíz se realiza generalmente por la aplicación de auxinas en el medio de cultivo, ya que promueve la formación de raíz, en ocasiones el utilizar medio libre de RCV representa una buena alternativa y puede producir mejores resultados. En nuestro caso pudimos observar que la presencia de auxinas en el medio no produjo la mejor respuesta a la rizogénesis, que el medio de cultivo sin RCV produjo una formación de raíz de mayor longitud a la obtenida en presencia de ANA, también se observó la perdida de la arquitectura de la raíz, e indujo la formación de callo. En el caso de la exposición de KIN, no produjo mayor formación de raíz que en los medios de cultivo sin RCV, las raíces obtenidas fueron más finas y no presentaron la formación de vellosidades, con respecto a la plántula obtenida pudimos observar que fue de un tamaño mayor al obtenido en los otros medos de cultivo lo cual es de esperarse ya que la presencia de citocininas

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Tabla 33. Presencia de tallos fusionados en plántulas de E. calycosa, enraizadas en diferentes concentración de sacarosa. Conc. de No de plántulas con Total de plántulas % de presencia de sacarosa mg/l presencia de tallos unidos obtenidas por grupo tallos fusionados 0 0 39 0 0 0 44 0 0 1 40 2.5 0 1 40 2.5 7.5 1 39 2.6 7.5 6 41 14 30 5 40 12.5 30 6 40 15 30 7 40 17 30 8 40 20 30 9 40 22.5 En la Figura 44 se muestra como aumenta la el fenómeno de tallos unidos en las plántulas de E. calycosa obtenidas en los medios de enraizamiento con respecto a la concentración de sacarosa.

25 22.5 % 20 20 17.5 14.6 15 15 12.5

10

5 2.5 2.5 2.6 0 0 0 0 0 0 0 7.5 7.5 15 15 30 30 30 ANA, ANA CA CA CA CA KIN CA CA Concentración de sacarosa

Figura 44. Relación entre la alteración de tallos fusionados en las plántulas de E. calycosa con respecto al aumento de la concentración de sacarosa en el medio de enraizamiento.

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La respuesta del explante se ha atribuido a la composición del medio: sales nutrientes, agentes gelificantes y especialmente RCV, sin embargo también se pueden deber a la interacción entre el genotipo y el medio ambiente, dando como resultado una expresión fenotípica diferente. Las plantas herbáceas propagadas in vitro con frecuencia se ven afectadas por la presencia redundante de varios factores que conducen a trastornos metabólicos y morfológicos (Ziv, 1991, 1999), en varios estudios se muestra que las principales alteraciones en cultivo in vitro conducen a grandes espacios intercelulares que tienden a aparecer dando una apariencia de tejido semidesintegrado, llevando en gran medida a un tallo de diámetro más grande de lo normal, el número de estomas es reducido en su superficie adaxial, lo que explica en parte la perdida de estas plantas con este tipo de alteraciones.

6.5.1 Enraizamiento de hojas Al realizar el procedimiento de establecimiento de rosetas en los medios de cultivo para enraizamiento donde no se adicionó RCV, se separaron pequeñas hojas de la roseta y se dejaron sobre el mismo medio de cultivo para observar si era posible su enraizamiento de acuerdo a su composición. Se obtuvo enraizamiento de hojas y también formación de rosetas a partir de estas hojas enraizadas en la mayoría de estos medios. Se puede decir que el tratamiento no. 3 fue el más propicio para enraizar hojas y el tratamiento no. 1 fue el más propicio para que las hojas enraizadas formaran rosetas. Los resultados obteniendo se muestran en la tabla 34. Tabla 34.- Número de hojas enraizadas y enraizadas con presencia de roseta en los tratamientos utilizados para enraizar sin adición de RCV.

Hoja AZ # MS % C.A. g/l Solo con raíz roseta 1 100 30 + 6 4 2 100 30 - 7 2 3 50 15 + 10 1 4 50 15 - 8 2 5 50 7.5 + 5 2 6 50 7.5 - 5 2 7 50 0.0 + 5 0 8 50 0.0 - 3 1

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Este no fue un experimento controlado ya que no se puso el mismo número de hojas de roseta en cada uno de los tratamientos probados. En la figura 45 se observa las hojas enraizadas y con presencia de roseta.

Figura 45. Hojas que formaron raíz y roseta en los medios de enraizamiento in vitro

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6.6 Aclimatación (periodo ex vitro) Se establecieron un total de 371 plantas en macetas con sustrato tepojal – peat moss (1:1) siguiendo el protocolo mencionado en la tabla 9 de las cuales sobrevivieron 281 dando un total de 75.74 % de sobrevivencia (figura 46), después de transcurrido un mes. Estas plántulas se obtuvieron de los 8 tratamientos de enraizamiento realizado sin utilizar RCV, en la tabla 35 se reportan los resultados por número de tratamiento. Tabla 35. Resultados de la aclimatación de las plántulas obtenidas del periodo de enraizamiento in vitro. No. rosetas No. plantas sobrevivencia Tratamiento de enraizado establecidas después de 1mes No. medio AZ C.A. inicio vivas muertas % 8 MS - 50 --- con 47 27 20 57.4 6 MS - 100 30 g/l con 52 33 19 63.5 4 MS - 50 15 g/l sin 42 32 10 76.2 1 MS - 50 7.5 g/l sin 44 34 10 77.3 7 MS - 50 --- sin 44 34 10 77.3 3 MS - 50 15 g/l con 51 41 10 80.4 2 MS - 50 7.5 g/l con 43 35 8 81.4 5 MS - 100 30 g/l sin 48 45 3 93.8 TOTAL 371 281 90

Los resultados obtenidos por grupos de enraizamiento se encuentran dentro de un rango que va de 57.4 a 93.8 % de sobrevivencia como podemos ver en la figura 47, no se encontró ninguna relación con respecto al tratamiento de enraizado, el grupo de tratamiento con menos sobrevivencia que fue el no. 8 que presento plantas muy pequeñas y con muy poca presencia de raíz, pero el grupo siguiente en cuanto a menor sobrevivencia fue el grupo 6 donde se obtuvieron las rosetas más grandes y con mayor tamaño de raíz; el grupo que presento mayor sobrevivencia fue el no. 5 que presento plantas grandes con raíz larga y abundante.

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24.26

vivas muertas

75.74

Figura 46. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de iniciada la aclimatación.

100 93.8 90 80.4 81.4 76.2 77.3 77.3 80 70 63.5 57.4 60 50 40 30 20

% de plantas vivas al al mes vivasplantas % de 10 0 8 6 4 1 7 3 2 5 grupos

Figura 47. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de aclimatación por grupo de estudio de enraizamiento del que proceden. La acción del líquido rojo adicionado a la mitad de las plantas de cada grupo se relacionó con su sobrevivencia y se realizó un análisis estadístico de los datos obtenidos observándose que no existió una diferencia significativa entre las plantas que recibieron el tratamiento y las que no lo recibieron. La adición del reactivo hemisulfato de adenina en este grupo de plantas se realizó después de 25 días de iniciado el periodo de aclimatación, no se observó una diferencia significativa entre las plantas que recibieron el tratamiento y las que no. Al mes de establecidas las plántulas, se midió la sobrevivencia, no encontrando alguna relación entre el grupo de enraizado de donde proceden. Las de menor sobrevivencia fueron las del grupo 8 donde se obtuvieron rosetas más pequeñas y con menos tamaño de raíz, seguidas de las del grupo 6 que fueron las de mayor tamaño de planta y raíz.

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Transcurrido un mes de que las plantas se pasaron a condiciones de invernadero se observó que la gran mayoría de las sobrevivientes presentaban la forma de típica de una roseta, no se presentaron formas alargadas o tallos fusionados que no lograron sobrevivir ver fig. 48. Se observó que las rosetas muy pequeñas que sobrevivieron fueron aquellas obtenidas de hojas enraizadas, que mostraron gran posibilidad de sobrevivencia.

Figura 48. Parte de las plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de aclimatación, en invernadero. La etapa de aclimatación es el paso que constituye la transferencia de las plántulas obtenidas del enraizamiento in vitro a el medio externo ex vitro, se puede considerar la etapa final del cultivo in vitro, si esta no es realizada con extremo cuidado puede resultar en la perdida significante del material propagado. Al iniciar este periodo, las plantas obtenidas pierden rápidamente agua, en algunas especies los estomas no son capaces de cerrarse completamente bajo condiciones de humedad relativa baja, esto se compensó tapando la maceta con una bolsa de plástico para obtener una humedad relativa cercana o igual al 100%, para evitar su perdida. El adicionar sacarosa al medio produjo plantas más grandes y el alto contenido de carbohidratos los cuales resultan en energía que la planta acumula durante la etapa de crecimiento in vitro, esto las ayuda a sobrevivir en la etapa de aclimatización. Se observó la presencia de raíz con vellosidad en los medios que no tenían carbón activado, produciendo una raíz más funcional, que condujo a una mayor sobrevivencia en el periodo de aclimatación.

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6.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro En la tabla 36 se muestran los 6 tratamientos que se aplicaron para realizar el experimento de enraizado y aclimatación juntos en condiciones ex vitro. Tabla 36.- Resultados de la aclimatación y enraizamiento simultáneos de plántulas de E. calycosa.

No. de No de Plántulas Aumento IBA raíz HSA tratamiento muestras sobrevivientes tamaño

1 0.2 mg/ml - 160 mg/l 8 6 0.27

2 0.2 mg/ml - - 8 3 0.17

3 0.1 mg/ml - 160 mg/l 8 8 0.24

4 0.1 mg/ml - - 9 5 0.05

5 - + 160 mg/l 8 8 0.47

6 - + - 10 8 0.37 En todos los tratamientos que se adiciono hemisulfato de adenina (HSA), arrojaron mejor resultado en sobrevivencia y crecimiento de la planta que en sus homólogos sin este reactivo, la permanencia de la raíz en la planta hizo que se obtuvieran mayor crecimiento que en plantas que no tenían raíz, además presentaron un aspecto más saludable. Ver figura 49.

Es posible realizar el paso de enraizamiento junto con el de aclimatación, obteniéndose plantas un poco más pequeñas que las obtenidas provenientes de un periodo de enraizado in vitro, corriendo el riesgo que la sobrevivencia de las plantas sea menor. Las plantas necesitan producir su propio requerimiento de carbón y de nitrógeno reducido, el HSA es un reactivo que nos proporciona nitrógeno reducido, el cual se emplea en el cultivo de tejidos in vitro, no existen reportes de la adición de este compuesto en la aclimatación ex vitro, pero en este trabajo pudimos comprobar que si se adiciona en el momento en que se inicia el periodo de aclimatación, puede ayudar a la plántula a su adaptación a condiciones ex vitro.

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Figura 49. Plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de enraizamiento y acondicionado en condiciones ex vitro. 1) Tratamiento: 0.2 mg/ml de IBA + HSA – sin raíz; 2) tratamiento: 0.2 mg/ml de IBA – sin raíz; 3) tratamiento: 0.1 mg/ml de IBA + HSA; 4) tratamiento: 0.1 mg/ml de IBA – sin raíz; 5) tratamiento HSA – con raíz; 6) grupo de plantas con raíz y sin tratamiento. Donde IBA= ácido indol butírico; HSA= hemisulfato de adenina.

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7. CONCLUSIONES

Se logró la propagación de Echeveria calycosa por semilla. Con la metodología probada para la propagación de esqueje de hoja en este trabajo, no se logró la propagación por esqueje de hoja, en condiciones de invernadero. La tasa de propagación que presenta E. calycosa bajo condiciones de invernadero se puede incrementar, mediante el desarrollo de un sistema de regeneración in vitro evaluando diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento vegetal ácido naftalen acético (ANA) y cinetina (KIN). El sistema de regeneración in vitro de E. calycosa desarrollado en este trabajo, utilizando los reguladores de crecimiento vegetal ANA y KIN indujo un incremento de 2,500% de la tasa de propagación obtenida en invernadero. El periodo de cuarentena al que se sometió la planta donadora, fue decisivo para la sobrevivencia de explantes de E. calycosa en la regeneración in vitro Los tres factores evaluados: tratamiento para el establecimiento, tipo de explante y método de desinfección, tuvieron influencia sobre el establecimiento in vitro de explantes de E. calycosa. La hoja de roseta procedente de cultivo in vitro, fue el tipo de explante con mejor respuesta de regeneración in vitro de E. calycosa La presencia de carbón activado en el medio de cultivo para enraizamiento, contribuyo a obtener plántulas de E. calycosa más grandes y con raíces más largas. El aumento en la concentración de sacarosa en el medio de enraizamiento produjo plántulas más grandes con raíces más largas y de mayor numero Los reguladores de crecimiento vegetal que se evaluaron en el presente trabajo en la etapa de enraizamiento in vitro no contribuyeron con una mejor formación de raíces de E. calycosa. La adición de Ácido naftalen acético al medio para enraizamiento in vitro produce plantas más chicas, formación de callo y raíz, adventicia, La adición de cinetina al medio de enraizamiento in vitro, incrementó el tamaño de las plantas, y disminuyó la formación de raíces. Se presentó la alteración de tallos fusionados en las rosetas enraizadas in vitro; esta alteración aumentó conforme se aumentó la concentración de sacarosa en el medio de cultivo para enraizamiento. Las concentraciones exógenas elevadas y similares de ANA y KIN indujeron callo friable y productivo en E. calycosa

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Las concentraciones exógenas medias y similares de ANA y KIN indujeron la formación de rosetas de E. calycosa Concentraciones elevadas de KIN en ausencia de ANA indujeron la muerte del tejido de E. calycosa. Concentraciones elevadas de ANA en ausencia de KIN indujeron la formación de callo compacto improductivo Se logró el enraizamiento ex vitro de E. calycosa de forma simultánea al periodo de aclimatación utilizando el ácido indol butírico.

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9. ANEXO 1. Tablas y figuras del análisis estadístico

Tabla 37. Resumen del análisis estadístico de la influencia del tratamiento para establecer explantes de E. calycosa en la respuesta obtenida por los explantes. Se observa que los valores obtenidos son significativos donde p< 0,05,

Tabla ANOVA para respuesta por grupo Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 105.494 3 35.1648 267.38 0.0000 Intra grupos 60.497 460 0.131515 Total (Corr.) 165.991 463

Medias y 95.0% de Fisher LSD

3.1

2.8

2.5

2.2 resp

1.9

1.6

1.3 1 2 3 4 grupo

Figura 50. Análisis de medias, muestra la influencia del tipo de tratamiento sobre la respuesta del explante en el establecimiento. El tratamiento 3 y 4 fueron significativamente diferentes entre sí y entre los grupos 1 y 2 con respecto a la respuesta del explante en el establecimiento de E. calycosa,

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Tabla 38 Resumen del análisis estadístico con respecto a la calidad del explante entre los cuatro tratamientos de desinfección realizados para el establecimiento de explantes de E. calycosa. Se observa que los valores obtenidos son significativos donde p< 0,05,

Tabla ANOVA para calidad por tipo de explante Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 276478 3 92159.2 62.25 0.0000 Intra grupos 681066 460 1480.58 Total (Corr.) 957544 463

Medias y 95.0% de Fisher LSD

86

66

46

calidad 26

6

-14 1 2 3 4 tipo exp

Figura 51. El análisis de medias muestra que existe influencia del tipo de explante en la calidad obtenida. Se observa que los grupos no son homogéneos. El explante 2 (inflorescencia) presento la mejor respuesta, seguido de hoja (1), raíz y tallo (3 y 4 respectivamente) su calidad fue 0. (donde calidad 0 corresponde a explante muerto, 100 corresponde a aspecto como en el inicio).

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Tabla 39 Resumen del análisis estadístico con respecto a la respuesta del explante de las dos especies de Echeveria comparadas en el segundo estudio de propagación. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para respuesta por las plantas E. calycosa y E. purhepecha Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 21.2868 1 21.2868 9.41 0.0026 Intra grupos 278.121 123 2.26115 Total (Corr.) 299.408 124

Medias y 95.0% de Fisher LSD

3

2.7

2.4

2.1 respuesta

1.8

1.5 1 2 planta

Figura 52. El análisis de medias muestra que la respuesta obtenida entre las dos especies de Echeveria en el segundo experimento de propagación es diferente entre las dos plantas (donde 1 corresponde a E. calycosa y 2 E. purhepecha).

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Tabla 40 Resumen del análisis estadístico con respecto a la respuesta del explante de E. calycosa a los 16 tratamientos en el segundo estudio de propagación. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para resp 120 por trat Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 171.665 15 11.4443 2.81 0.0011 Intra grupos 418.89 103 4.06689 Total (Corr.) 590.555 118

Medias y 95.0% de Fisher LSD

6.8

4.8

2.8 resp 120 resp

0.8

-1.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 trat

Figura 53. El análisis de medias muestra que los 16 tratamientos de RCV del primer estudio de propagación influyen significativamente en la respuesta obtenida en los explantes de E. calycosa. Los tratamientos 6 y 10 influyeron de manera diferente en los explantes.

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Tabla 41. Resumen del análisis estadístico de la influencia de la especie de Echeveria con respecto a la respuesta obtenida por los explantes de las dos especies de Echeveria comparadas en el primer estudio de propagación. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para resp 120 por planta Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 34.9354 1 34.9354 6.87 0.0096 Intra grupos 849.775 167 5.08847 Total (Corr.) 884.71 168

Medias y 95.0% de Fisher LSD

3.3

2.9

2.5

resp 120 resp 2.1

1.7

1.3 1 2 planta

Figura 54. El análisis de medias muestra que se trata de dos especies de Echeveria que son significativamente diferentes para la respuesta a los tratamientos del primer experimento de propagación (donde 2 corresponde a E. purhepecha y 1 E. calycosa).

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Tabla 42. Resumen del análisis estadístico para la respuesta a los tratamientos del enraizamiento de plántulas de Echeveria. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05.

Tabla ANOVA para alto por grupo Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 150.898 13 11.6076 41.29 0.0000 Intra grupos 137.469 489 0.281123 Total (Corr.) 288.367 502

Figura 55. El análisis de las medias muestra que se trata de grupos heterogéneos con respecto a la respuesta de altura de la planta, obtenida de los 14 tratamientos para el enraizamiento de rosetas de E. calycosa. El grupo 14 mostró ser significativamente diferente a los demás grupos influyendo más en el enraizamiento.

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Tabla 43. Resumen del Análisis estadístico para Alto de la planta por la concentración se sacarosa.- se observa que existe significancia entre las concentraciones de sacarosa utilizadas.

Tabla ANOVA para alto por conc sac Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 58.0515 3 19.3505 41.92 0.0000 Intra grupos 230.316 499 0.461555 Total (Corr.) 288.367 502

Medias y 95.0% de Fisher LSD

2.3

2.1

1.9

1.7 alto

1.5

1.3

1.1 0 25 50 100 conc sac

Figura 56. El análisis de medias muestra que se trata de grupos heterogéneos con respecto a la concentración de sacarosa utilizada. La concentración de sacarosa 30 g /l (100%) mostro ser significativamente diferente a las otras tres concentraciones y fue la que influyo mayormente en la altura de la planta seguida de la concentración de 25%.

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Tabla 44. Resumen del análisis estadístico para Alto de la planta como lo influye el carbón activado en los tratamientos del enraizamiento de plántulas de Echeveria. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para alto por carbón act Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 39.6098 1 39.6098 79.77 0.0000 Intra grupos 248.758 501 0.496522 Total (Corr.) 288.367 502

Medias y 95.0% de Fisher LSD

2

1.8

1.6 alto

1.4

1.2 1 2 carbón act

Figura 57. El análisis de medias para la influencia del carbón activado en la altura de la planta muestra que se trata de grupos heterogéneos, donde 1 presencia de carbón 2 ausencia de carbón activado; podemos observar que la presencia de cartón activado influyo significativamente en la altura de la planta obteniendo un mejor resultado al adicionarlo al medio. .

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Tabla 45. Resumen del análisis estadístico para la influencia de carbón activado sobre el largo de la raíz en los tratamientos del enraizamiento de plántulas de Echeveria. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para l raíz por grupo Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 347.873 13 26.7594 32.12 0.0000 Intra grupos 409.038 491 0.833071 Total (Corr.) 756.91 504

Figura 58. El análisis de medias para la influencia del carbón activado en lo largo de la raíz muestra que se trata de grupos heterogéneos. que los grupos 8 y 13 que ambos contienen 100 % de sacarosa con presencia de carbón activado influyeron mayormente en lo largo de la raíz, siendo significativamente diferentes a los otros grupos, el grupo dos que contenía ANA sin carbón activado fue el que menos influyo en lo largo de la raíz.

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Tabla 46. Resumen del Análisis estadístico para la influencia de la concentración de sacarosa en lo largo de raíz muestra que existe significancia para una p< 0.05

Tabla ANOVA para l raíz por conc sac Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 209.375 3 69.7916 63.86 0.0000 Intra grupos 547.536 501 1.09289 Total (Corr.) 756.91 504

Medias y 95.0% de Fisher LSD

2.9

2.5

2.1 l raiz 1.7

1.3

0.9 0 25 50 100 conc sac

Figura 59. El análisis de medias para la influencia de la concentración de sacarosa en lo largo de la raíz muestra que se trata de grupos heterogéneos. Que el grupo que contiene 100 % de sacarosa influye mayormente en lo largo de la raíz, siendo significativamente diferente a los otros grupos, el grupo que contienen sacarosa.

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Tabla 47. El resumen del Análisis estadístico para la respuesta de largo de raíz influenciada por el carbón activado muestra que los resultados son significativos para una p< 0.05.

Tabla ANOVA para l raíz por carbón act Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 13.7905 1 13.7905 9.33 0.0024 Intra grupos 743.12 503 1.47738 Total (Corr.) 756.91 504

Medias y 95.0% de Fisher LSD

2.1

1.9

1.7 l raiz

1.5

1.3 1 2 carbón act

Figura 60. El análisis de medias para la influencia del carbón activado en lo largo de la raíz muestra que se trata de grupos heterogéneos. Los grupos con carbón activado influyeron mayormente en lo largo de la raíz, siendo significativamente diferente al grupo sin carbón activado que fue el que menos influyo en lo largo de la raíz.

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Tabla 48. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa en la respuesta de formación de tallos fusionados en las rosetas de E. calycosa en la etapa de .enraizamiento, se muestra que los resultados son significativos para una p< 0.05.

Tabla ANOVA para respuest por sacarosa Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 1.39447 3 0.464825 3.78 0.0108 Intra grupos 43.8027 356 0.123041 Total (Corr.) 45.1972 359

Medias y 95.0% de Fisher LSD

2.1

2

1.9 respuest

1.8

1.7 0 7.5 15 30 sacarosa

Figura 61.- En el análisis de medias muestra que existe una influencia significativa de la concentración de sacarosa en la formación de tallos fusionados en rosetas de E.calycosa, enraizadas. El aumento en la concentración de sacarosa influyó en la presencia de los tallos fusionados en E. calycosa. Dónde: respuesta 1.- tallo fusionado, 2.- tallo normal.

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Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis

10. APENDICE Composición del medio MS Compuesto mg/l

NH4NO3 1650.00

KNO3 1900.00

CaCl2 333.00

MgSO4 181.00

KH2PO4 170.00 Kl 0.830

H2BO3 6.200

MnSO4·H2O 16.900

ZnSO4·7H2O 8.600

Na2MoO4·2H2O 0.250

CuSO4·5H2O 0.025

CoCl2·6H2O 0.025 FeEDTA 6.200

FeSO4·7H2O 27.80

Na2EDTA 4.123 Myo-inositol 100 Piridoxina 0.5 Tiamina 0.1 Sacarosa 30 g/l PHYTAGEL 4.5 g/l / AGAR 8.0 g/l

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