Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A. C. “REGENERACIÓN IN VITRO DE ECHEVERIA CALYCOSA MORAN (CRASSULACEAE), VÍA ORGANOGÉNESIS” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRA EN CIENCIAS DE LA FLORICULTURA PRESENTA Q.F.B. MARÍA DE JESÚS SALGADO GUTIÉRREZ GUADALAJARA, JALISCO, MÉXICO. DICIEMBRE DE 2015. REFERENCIAS El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de cultivo de tejidos Vegetales en la Unidad de Biotecnología Vegetal del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A.C. (CIATEJ), bajo la dirección de la Dra. Noemí Obledo Vázquez. Formó parte del proyecto “Desarrollo de protocolos de propagación de dos especies vegetales endémicas de Michoacán: Echeveria purhepecha y Echeveria calycosa”. Se realizó en colaboración con el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad Michoacán del Instituto Politécnico Nacional y con el Colegio de Michoacán. Financiado por el Fondo Mixto CONACYT – Gobierno del Estado de Michoacán. La autora de la presente tesis contó con el apoyo de la beca CONACYT, como parte del “Programa Nacional de Posgrados de Calidad” Con agradecimiento al fondo mixto CONACYT- gobierno del Estado de Jalisco, proyecto 2008 – 04 – 99210 “Fortalecimiento de la maestría de ciencias de la floricultura”, programa del posgrado de nueva creación del CIATEJ. a AGRADECIMIENTOS Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ, A.C.), por haberme dado la oportunidad de, una vez más formarme tanto académica como profesionalmente, así como por proporcionarme los conocimientos durante el periodo de la maestría así como brindarme el apoyo y las facilidades para realizar el presente trabajo de investigación y obtener el grado de Maestra en Ciencias de la Floricultura. A la Dra. Noemí Obledo Vázquez que fungió como directora de esta tesis; por el apoyo brindado, por transmitir sus conocimientos y experiencia para la realización de este trabajo. Al comité tutorial: Dr. Rodrigo Barba G. y el Mtro. Ignacio Ruíz, por su colaboración y apoyo en la realización de este trabajo. A los Doctores y Maestros de la unidad de biotecnología vegetal que colaboraron en mi formación profesional y que me apoyaron para lograr esta meta. A todos los compañeros del posgrado y del laboratorio, con quien tuve el gusto de compartir este periodo, cada uno de ellos contribuyó para que yo pudiera seguir sin desistir, con su aceptación, sus consejos y su experiencia profesional. GRACIAS b DEDICATORIAS A mi esposo: Felipe A mis hijos: Andrea, Felipe y Alan Sin su apoyo no hubiera sido posible terminar este grado, no hay palabras para expresar mi agradecimiento y mi amor incondicional para Uds. “mi familia”. A LA MEMORIA DE Mis padres Sr. Jesús Salgado Salgado Sra. Otilia Gutiérrez García a quien debo lo que soy A Dios por el milagro de la vida c Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis TABLA DE CONTENIDO Página REFERENCIAS ______________________________________________________________ a AGRADECIMIENTOS ________________________________________________________ b DEDICATORIAS _____________________________________________________________ c ABREVIATURAS _____________________________________________________________ i INDICE DE TABLAS __________________________________________________________ ii INDICE DE FIGURAS _________________________________________________________ v RESUMEN ___________________________________________________________________ 1 SUMMARY __________________________________________________________________ 2 1 ANTECEDENTES ___________________________________________________________ 2 1.1 FAMILIA CRASSULACEAE ______________________________________________ 4 1.2 EL GÉNERO ECHEVERIA _________________________________________________ 5 1.2.1 Echeveria calycosa ____________________________________________________ 6 1.3 PROPAGACIÓN DEL GÉNERO ECHEVERIA ________________________________ 8 1.3.1 Reproducción sexual __________________________________________________ 8 1.3.2 Reproducción asexual__________________________________________________ 8 1.4 REGENERACIÓN POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS in vitro ______________ 8 1.4.1 Medio de cultivo in vitro _______________________________________________ 10 1.4.2 Auxinas ____________________________________________________________ 10 1.4.3 Citocininas _________________________________________________________ 11 1.4.4 Etapas del cultivo in vitro ______________________________________________ 11 1.4.5 Trabajos publicados del cultivo in vitro en diferentes especies de Echeveria _______ 13 2 JUSTIFICACIÓN _________________________________________________________ 15 3 HIPOTESIS ______________________________________________________________ 16 4 OBJETIVOS _____________________________________________________________ 17 4.1 General ________________________________________________________________ 17 4.2 Específicos ____________________________________________________________ 17 5 METODOLOGÍA _________________________________________________________ 18 5.1 Material Vegetal ________________________________________________________ 18 5.2 Propagación por semilla (sexual) ___________________________________________ 18 I Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis 5.3 Propagación por esqueje de hoja (asexual) ____________________________________ 19 5.4 Propagación in vitro _____________________________________________________ 19 5.4.1 Establecimiento _______________________________________________________ 19 5.4.1.1 Explantes ______________________________________________________ 19 5.4.1.2 Desinfección de los explantes ______________________________________ 21 5.4.1.3 Establecimiento de los explantes ____________________________________ 22 5.4.2 Propagación ___________________________________________________________ 22 5.4.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui. ______________ 22 5.4.2.2 Propagación, experimentos bifactoriales con 4 niveles. _____________________ 23 5.4.2.2.1 Primer experimento de propagación_________________________________ 23 5.4.2.2.2. Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E.calycosa obtenidas in vitro. _______________________________________________________________ 26 5.4.2.2.3 Primer experimento de propagación utilizando E. purhepecha ____________ 26 5.4.2.3.1 Segundo experimento de propagación _______________________________ 27 5.4.2.3.2 Segundo experimento de propagación utilizando E. purhepecha ___________ 29 5.5 Enraizamiento __________________________________________________________ 30 5.6 Aclimatación (periodo ex vitro) _____________________________________________ 32 5.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro ______________________________ 34 6 RESULTADOS y DISCUSIÓN _______________________________________________ 36 6.1 Propagación por semilla (sexual) ___________________________________________ 36 6.2 Propagación por esqueje de hoja (asexual) ____________________________________ 39 6.3 Propagación in vitro _____________________________________________________ 40 6.3.1 Establecimiento ______________________________________________________ 40 6.3.1.1 Explantes _______________________________________________________ 42 6.3.1.2 Desinfección de los explantes. _______________________________________ 44 6.3.2 Propagación _________________________________________________________ 45 6.3.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui _____________ 45 6.3.2.2 Propagación con diferentes tratamientos de RCV experimentos bifactoriales con 4 niveles ________________________________________________________________ 47 6.3.2.2.1 Primer experimento bifactorial de propagación ________________________ 47 6.3.2.2.2 Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E. calycosa propagadas in vitro ______________________________________________________ 57 6.3.2.3.1 Primer experimento de propagación con E. purhepecha __________________ 61 6.3.2.4. Segundo experimento de propagación ________________________________ 65 6.3.2.4.1 Segundo experimento bifactorial de propagación con Echeveria purhepecha 72 6.4. Inducción de brotes a partir de callo ______________________________________ 78 II Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis 6.5 Enraizamiento __________________________________________________________ 82 6.5.1 Enraizamiento de hojas _______________________________________________ 89 6.6 Aclimatación (periodo ex vitro) ____________________________________________ 91 6.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro ______________________________ 94 7. CONCLUSIONES _________________________________________________________ 96 8. BIBLIOGRAFÍA __________________________________________________________ 98 9. ANEXO 1. Tablas y figuras del análisis estadístico _____________________________ 104 10. APENDICE _____________________________________________________________ 116 III Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran (CRASSULACEAE), vía organogénesis ABREVIATURAS ANA Ácido naftalen acético ANOVA Análisis de varianza AZ sacarosa BAP bencil amino purina °C grados centígrados C.A. carbón activado CIATEJ Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco cm centímetros col. colaboradores conc. concentración fig. figura g/l gramos por litro HCl ácido clorhídrico HSA hemisulfato de Adenina IBA ácido indol butírico