Masarykova Univerzita V Brně Lékařská Fakulta

Masarykova univerzita v Brně Lékařská fakulta

TERMOREZISTENTNÍ PLÍSNĚ V PROSTŘEDÍ

Bakalářská práce v oboru Výživa člověka

Vedoucí bakalářské práce: Autor: doc. MUDr. Jan Šimůnek, Csc. Kateřina Pražáková obor Výživa člověka

Brno, květen 2008 2

Jméno a příjmení autora: Kateřina Pražáková

Název bakalářské práce: Termorezistentní plísně v prostředí

Pracoviště: Ústav preventivního lékařství, Lékařská fakulta, Masarykova univerzita, Brno

Vedoucí bakalářské práce: doc. MUDr. Jan Šimůnek, CSc.

Rok obhajoby bakalářské práce: 2008

Souhrn: Tato bakalářská práce se zabývá problematikou mikroskopických hub, jejich vlastnostmi, významem a výskytem v životním prostředí. Podrobněji jsou popsány termorezistentní plísně, které mají schopnost přežívat záhřev na 80 °C po určitou dobu. Jejich primárním zdrojem je půda, ze které se mohou dostávat do okolního prostředí a do potravin,a tímto způsobem ohrožovat zdravotní stav člověka.

Klíčová slova: mikromycety, termorezistentní, mykotoxiny, lesní půda, orná půda

Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením doc. MUDr. Jana Šimůnka, CSc. a uvedla v seznamu literatury všechny literární a odborné zdroje.

V Brně dne……………… ……………………

Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucímu bakalářské práce doc. MUDr. Janu Šimůnkovi, CSc. za vedení bakalářské práce, cenné rady a připomínky. 4

Obsah

1 Úvod...... 7 2 Půda...... 8 2.1 Definice půdy ...... 8 2.2 Složení půdy...... 8 2.2.1 Pevná fáze půdy ...... 9 2.2.2 Kapalná fáze půdy...... 10 2.2.3 Plynná fáze půdy ...... 11 2.3 Složení lesní půdy ...... 12 2.4 Složení orné půdy...... 12 2.5 Taxonomický klasifikační systém půd ČR – půdní typy ...... 13 2.6 Funkce půdy ...... 17 2.7 Půda jako zdroj mikroorganismů ...... 18 3 Mikroskopické houby – mikromycety...... 21 3.1 Taxonomie mikromycet ...... 21 3.2 Morfologie mikromycet ...... 22 3.3 Rozmnožování mikromycet ...... 22 3.4 Významné rody mikromycet...... 23 3.4.1 Rod Aspergillus...... 23 3.4.2 Rod Penicillium...... 24 3.4.3 Rod Fusarium ...... 25 3.4.4 Rod Mucorales ...... 25 3.4.5 Rod Rhizopus ...... 26 3.5 Metabolické produkty plísní...... 26 3.5.1 Charakteristika toxinogenních vláknitých mikromycet ...... 27 3.5.2 Mykotoxiny ...... 27 3.5.3 Rozdělení mykotoxinů ...... 28 3.5.4 Přehled nejvýznamnějších mykotoxinů ...... 31 3.5.4.1 Aflatoxiny...... 31 3.5.4.2 Citrinin ...... 32 5

3.5.4.3 Fumonisiny...... 32 3.5.4.4 Ochratoxiny...... 32 3.5.4.5 Patulin...... 33 3.5.4.6 Sterigmatocystin...... 34 3.5.4.7 Tremorgenní mykotoxiny...... 34 3.5.4.8 Trichotheceny...... 34 3.5.4.9 Zearalenony...... 35 3.5.5 Mykotoxiny a legislativa...... 35 3.5.6 Onemocnění vyvolaná mykotoxiny ...... 36 3.5.6.1 Jistá a vyvolaná pouze mykotoxiny ...... 36 3.5.6.2 Jistá, ale s možnou další etiologií...... 37 3.6 Fyzikálně chemické podmínky pro růst ...... 38 3.7 Termorezistence mikromycet...... 40 3.7.1 Přehled termorezistentních mikromycet...... 41 3.7.1.1 Byssochlamys sp...... 41 3.7.1.2 Eupenicillium sp...... 43 3.7.1.3 Neosartorya sp...... 43 3.7.1.4 Talaromyces sp...... 44 3.7.2 Mykotoxiny termorezistentních mikromycet...... 45 3.8 Výskyt mikromycet...... 45 3.8.1 Systém prevence výskytu vláknitých mikromycet a mykotoxinů v potravinách...... 47 3.9 Význam mikromycet...... 48 4 Cíl práce ...... 49 5 Metodika ...... 50 5.1 Místa odběru půdních vzorků...... 50 5.2 Odběr půdních vzorků...... 50 5.3 Stanovení vlhkosti zeminy ...... 51 5.4 Zpracování půdních vzorků...... 51 5.5 Určování mikromycet...... 52 6 Materiál...... 54 6.1 Kultivační půdy...... 54 6.1.1 Půdy používané k identifikaci mikromycet...... 54 6.1.2 Půdy používané k uchovávání kultur ...... 55 6

6.1.3 Diagnostické půdy k průkazu plísní...... 56 6.2 Pomůcky...... 56 7 Výsledky ...... 57 7.1 Vlhkost půdy ...... 57 7.2 Zpracování vzorků zeminy...... 59 8 Diskuse...... 70 9 Závěr...... 72 10 Seznam použité literatury...... 73 11 Příloha ...... 77

1 Úvod

Ústav preventivního lékařství lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně se již delší dobu zabývá studiem výskytu a vlastností mikroskopických hub v různých prostředích. Hlavní pozornost je věnována zejména termorezistentním mikromycetám a mikroskopickým houbám produkujícím mykotoxiny. Málo probádanou oblastí byl výskyt mikromycet v lesní půdě. Cílem této práce je navázat na předchozí výzkumy a zmapovat přítomnost termorezistentních mikroskopických hub, schopných přežívat po určitou dobu teplotu 80 °C, v půdě odebrané z jednotlivých lokalit v různých ročních obdobích a dále zhodnotit výskyt termorezistetntních plísní v závislosti na intenzitě obdělávání a antropogenních zásazích v jednotlivých typech půd.

2 Půda

2.1 Definice půdy

Půda je vrchní porézní vrstva pevné zemské kůry. Je to přírodní útvar vyvinutý z povrchových zvětralin zemské kůry a z organických zbytků. Jedná se o složitý a komplexní ekosystém, který je výsledkem působení abiotických a biotických faktorů. Půda vzniká z půdotvorného substrátu v půdotvorném procesu činností půdotvorných činitelů působících v prostoru a čase. Mezi půdotvorné činitele patří matečná hornina, organismy žijící na půdě a v půdě, klima, reliéf terénu a vliv člověka. Obecně se proces vzniku půdy nazývá zvětrávání a podle převažujícího působícího faktoru se rozlišuje zvětrávání fyzikální, chemické a biologické (10, 16, 19, 33).

2.2 Složení půdy

Půda je složitý dynamický systém, který má vlastní autotransformační a transportní schopnost. Skládá se z různě velkých minerálních částic, organických látek, živých organismů a jejich odumřelých zbytků, vody a vzduchu. Z hlediska koloidního tak představuje heterogenní třífázový polydisperzní systém s fází pevnou, kapalnou a plynnou. Pevná fáze se skládá z minerální a organické složky. Kapalnou fázi tvoří půdní roztok a plynnou fázi představuje půdní vzduch (16, 18).

Vzduch 20% Minerální podíl Minerální podíl Organický podíl 48% Voda Voda Vzduch 30% Organický podíl 2%

Obr.1. Průměrné objemové složení půdy 9

2.2.1 Pevná fáze půdy

Pevná fáze je tvořena půdotvorným substrátem, přeměněným půdotvorným procesem v zemitou hmotu. Ta se skládá z minerálního podílu, který představuje 95 – 98 % z pevné fáze půdy, a organického podílu (2 – 5 %) (18, 42).

Pevná fáze

neústrojný podíl ústrojný podíl

neživá část živá část humus edafon

fytoedafon zooedafon

Obr.2. Složení pevné fáze půdy

Minerální (neústrojná) část je výsledkem zvětrávání matečné horniny a skládá se z jílových minerálů (až 75 %), oxidů a hydroxidů (10 – 15 %) a primárních minerálů (7 – 10 %) (33, 42). Organická (ústrojná) část se skládá z neživé a živé složky. Neživá složka – humus – je soubor organických látek pocházejících z odumřelých zbytků rostlin, živočichů a mikrobů. Živou složku tvoří edafon, neboli společenstvo všech organismů žijících v půdě. Dělí se obvykle na fytoedafon (rostlinná komponenta) a na zooedafon (mikroskopičtí i makroskopičtí živočichové) (16, 18, 42).

mikroflóra – bakterie, aktinomycety, řasy

fytoedafon

makroflóra – živé orgány vyšších rostlin (kořeny, hlízy, oddenky)

Edafon

mikrozooedafon – živočichové menší než 100 µm (prvoci – nálevníci, kořenonožci, bičíkovci)

zooedafon mezozooedafon – živočichové o velikosti 100 µm - 1 cm (drobní členovci – roztoči, chvostoskoci, hlístice)

makrozooedafon – žížaly, roupice, dešťovky, – myši, hraboši, hryzci

Obr.3. Složení edafonu (42)

2.2.2 Kapalná fáze půdy

Kapalná fáze je tvořena půdní vodou, která není nikdy chemicky čistá, neboť jsou v ní rozpuštěny různé chemické sloučeniny minerální a organické. Tento půdní roztok se účastní reakcí půdotvorného procesu, zajišťuje transport látek do živých buněk kořenového systému rostlin i vertikální transport látek půdním profilem (2, 18, 42).

vázaná

Půdní voda kapilární pórová gravitační

Obr.4. Složení kapalné fáze půdy

Voda vázaná je ta část vody, kterou půda zadržuje i proti působení gravitace, voda, která obaluje povrch půdních částic a není přístupná pro rostliny ani pro mikroorganismy. Voda gravitační (srážková) zasakuje vlivem gravitace různou rychlostí do půdy. V půdních pórech se všemi směry pohybuje voda kapilární, kterou jsou rostliny i mikroorganismy schopny využít (2). Mezi obsahem vody v půdě a množstvím mikroorganismů existuje rovnovážný stav. Se změnami půdní vlhkosti dochází nejen ke změnám v počtu bakterií a ostatních mikroorganismů, ale i k ovlivnění aktivity půdní mikroflóry. Pokud je v půdě malý obsah vody, jsou dostatečně zvlhčovány jen malé plochy celkového povrchu půdních částic, a proto je v půdě i malý počet bakterií (16).

2.2.3 Plynná fáze půdy

Plynná fáze – půdní atmosféra – je vzduch, který spolu s vodou tvoří stálou součást půdy, která vyplňuje všechny volné póry. Na rozdíl od vzduchu atmosférického má jiné kvantitativní složení – vyšší obsah vodní páry a oxidu uhličitého (2, 18, 42). Oxid uhličitý je nejvýraznější zastoupenou složkou půdního vzduchu, je to jediný zdroj uhlíku pro stavbu biomasy. Koncentrace CO2 v půdě je 0,3 %, tj. 10 – krát víc než ve vzduchu. Stoupne- li jeho obsah na 10 – 15 %, stává se škodlivým (2, 14, 18). Obsah kyslíku je v půdním vzduchu o něco menší než v atmosférickém (10 – 20 %). Důvodem je velká spotřeba kyslíku půdními mikroorganismy a dýcháním kořenů, zatímco difúze vzduchu do půdy je často pomalá. Při nedostatku kyslíku probíhají v půdě redukční pochody zejména železitých sloučenin a hnilobné pochody (14, 18).

Aerace neboli provzdušňování půdy obohacuje půdní vzduch o CO2 a tím zlepšuje jeho obsah v atmosférickém vzduchu, kde je ho nedostatek pro fotosyntézu rostlin, na druhé straně atmosférický vzduch bohatší na kyslík při nadměrném provzdušňování povrchové vrstvy ji silně prohřívá a vysouší, což ovlivňuje tepelný režim půdy a intenzitu biologických procesů, půdotvorných procesů až růst a vývoj rostlin. Aerace je jeden z nejdůležitějších faktorů, ovlivňujících výskyt a rozmnožování mikroorganismů v půdě (15, 16).

2.3 Složení lesní půdy

Lesní půda zaujímá přibližně 33,4 % plochy České republiky. Tvorba půd pod lesními porosty probíhá odlišně a svým uspořádáním půdního profilu se značně liší od orných půd (18, 26, 33). Svrchní vrstva obsahuje čistě organickou hmotu – mrtvý lesní kryt, označovaný také jako lesní hrabanka. Ta se tvoří hlavně z nadzemních orgánů rostlin – ze suchého opadávajícího listí, jehličí, větviček a z rostlinného podrostu. Lesní hrabanka tlí a humifikuje, naspodu ji hmyz a larvy mechanicky zpracovávají na rozdrobenou listovou drť. Působením mikroorganismů se z drti vytváří jemná měl, což je ještě silněji humifikovaná bezstrukturní prášková vrstva hrabankového materiálu. Hlouběji vzniká mísením měli s minerální zeminou lesní prsť, která postupně přechází v nehumózní minerální spodinu, a půdní podklad – matečný substrát (18, 26). Hlavní masa humusu je tedy uložena na povrchu půdy. Jedná se o tmavý beztvarý humus, jehož vlastnosti se mění podle druhu porostu, ze kterého vznikl. Humus získaný rozkladem a humifikací jehličí má kyselou reakci, z porostů listnatých se tvoří humus se zásaditější reakcí. To je také důvodem toho, že mikromycety upřednostňující kyselejší reakci prostředí, se nacházejí zejména v lesní půdě, zatímco na dobrých orných půdách převládají půdní bakterie vyžadující neutrální nebo slabě alkalické prostředí. Množství jednotlivých rodů mikromycet v lesní půdě nesouvisí s druhovým zastoupením stromů, je významně ovlivněno složením spodního bylinného patra (5, 18, 26). Lesní porosty mají vliv na půdní vlhkost a teplotu. V důsledku lepšího zachycování sněhu a pozvolnějšího tání mají povrchové vrstvy lesních půd ve srovnání s ornou půdou větší vlhkost a nižší teplotu (18).

2.4 Složení orné půdy

V České republice tvoří zemědělská půda asi 54,2 % z celkové rozlohy, z toho 71,9 % představuje orná půda a 28,1 % trvalé travní porosty. Orná půda se společně s půdou luční a zahradní řadí mezi půdy kulturní (42, 43). V povrchové vrstvě orné půdy se nachází ornice, kterou lze odlišit od ostatních vrstev půdního profilu – podorničí a spodiny. Ornice má temnější barvu, vyšší obsah organických látek (obsah humusu se pohybuje okolo 2 –3 % i více) a vykazuje vyšší biologickou činnost. Hloubka ornice závisí zejména na hloubce kultivace. Podle hloubky ornice se orné půdy 13 rozdělují na půdy mělké (s hloubkou ornice do 15 cm), půdy střední (s hloubkou ornice do 20 cm) a půdy hluboké (s hloubkou ornice nad 25 cm). Pod ornicí se nachází vrstva orné půdy označovaná jako podbrázdí. Podorničí je zhutnělá vrstva spodiny s velmi malou biologickou činností. Spodina se liší od svrchních vrstev půdy vlastnostmi i vzhledem. Je světlejší, protože ve většině případů již neobsahuje humus, nebo bývá různě zabarvená sloučeninami železa. Hloubka spodiny je závislá na mateční hornině a průběhu půdotvorného procesu. Pod spodinou se nachází podklad půdy zvaný matečný substrát. Ten může být buď pevný skalnatý nebo sypký, složený ze zvětralin, písků, spraše a podobně (18, 43).

2.5 Taxonomický klasifikační systém půd ČR – půdní typy

LITOZEM – LI Jde o půdy velmi slabě vyvinuté, mělké, skeletovité a propustné. Vyskytují se na malých plochách pahorkatin a hornatin, v zemědělství se mohou využívat pouze jako součásti pastvin (19, 24).

RANKER – RN Tyto půdy bývají nadměrně provzdušněné a silně ohrožené erozí. Jsou rozšířené po celém území pahorkatin a hornatin a až na výjimky jsou kryté lesními porosty (19, 24).

RENDZINA – RZ Rendziny jsou charakteristické svým minerálním složením – nadbytkem vápníku a hořčíku a nedostatkem dalších živin (hlavně draslík a fosfor). Jejich úrodnost je celkově nízká, na území ČR se vyskytují pouze v omezené míře (19, 24).

PARARENDZINA – PR Jedná se o půdy hlubší, které lépe drží vodu. V závislosti na nadmořské výšce a zrnitostním složení se řadí spíše k úrodnějším půdám (19, 24).

REGOZEM – RG Regozem je typ půdy, který se vyvinul ze sypkých sedimentů, hlavně z písků v rovinatých částech reliéfu. Mohou se vyskytovat i na jiných substrátech, zejména v polohách, kde vývoj půdy narušuje vodní eroze (19, 24). 14

FLUVIZEM – FL Fluvizemě se vytváří z povodňových sedimentů v nivách řek a potoků. Pro blízkost vodních zdrojů jsou vhodné pro zavlažování (19, 24).

KOLUVIZEM – KO Tyto půdy vznikají akumulací erozních sedimentů ve spodních částech svahů, prohlubních a terénních průlezech. U nás nebyly koluvizemě dosud mapovány (19, 24).

SMONICE – SM Smonice představují nejtěžší půdy vznikající na těžkých substrátech. Vyskytují se jen v nejsušších rovinatých oblastech, na našem území pouze v severozápadních Čechách a na jižní Moravě (19, 24).

ČERNOZEM – CE Půdy vytvořené v rovinném a mírně zvlněném terénu v nadmořských výškách přibližně do 320 m, v nejteplejších a nejsušších místech území ČR. Z agronomického hlediska jsou černozemě velmi příznivé půdy, které mají dostatečné množství živin a jsou dobře biologicky oživené (19, 24).

ČERNICE – CC Černice jsou minerálně velmi bohaté půdy, které se zpravidla tvoří v širokých říčních nivách s lužním půdotvorným procesem. Tvorba půdy je již méně narušována záplavami (19, 24).

ŠEDOZEM – SE Tyto půdy jsou velmi úrodné, jejich půdotvorným substrátem je spraš. Představují přechodné půdy v oblastech lesů lesostepní zóny v nadmořských výškách kolem 200 – 300 m (19, 24).

HNĚDOZEM – HN Vytváří se přibližně v nadmořských výškách od 200 m, půdotvorný substrát tvoří převážně spraše, sprašové hlíny a svahoviny. Hnědozemě jsou půdy s vysokou agronomickou hodnotou, řadí se k nejlepším obilnářským půdám (19, 24). 15

LUVIZEM – LU Luvizemě vznikají hlavně na sprašových materiálech (spraš, sprašová hlína, jemné váté písky). Původní společenstvo na těchto půdách tvořil listnatý les (dub, buk, habr, lípa). Tvoří se v rovinách a mírně zvlněném reliéfu, nejvýše do nadmořské výšky 600 m, jinak by podléhaly erozi (19, 24).

KAMBIZEM – KA Jedná se o nejrozšířenější půdní typ na území ČR. Typickým procesem je hnědnutí – zvětrávání a přeměna půdního materiálu, při kterém dochází k uvolňování železa z primárních minerálů a k tvorbě sekundárních jílových minerálů. Intenzita zvětrávání je závislá na mineralogickém složení substrátu a hydrotermických podmínkách půdního prostředí. Tvoří se hlavně ve svažitých podmínkách pahorkatin, vrchovin a hornatin, v menší míře v rovinatém reliéfu (19, 24).

PELOZEM – PE Pelozemě jsou dobře zásobeny živinami a vyznačují se vysokou bobtnavostí při přesycení vodou a smršťováním a tvorbou trhlin při periodickém vyschnutí půdy. Jejich výskyt v ČR nebyl zaznamenán (19, 24).

ANDOZEM – AD Jedná se o extrémně kyprou, úrodnou půdu s abnormálně vysokou sorpční a vodní kapacitou. V České republice nebyl dosud tento typ půdy identifikován (19, 24).

KRYPTOPODZOL – KP Kryptopodzoly jsou kypré, hlinitopísčité, skeletovité, příznivě vlhké půdy, vyskytující se pod smíšenými porosty s převahou buku, smrku a jedle. Nacházejí se v nižších horských polohách v nadmořských výškách od 750 do 1200 m (19, 24).

PODZOL – PZ Půdy s velmi nízkou sorpční kapacitou a zásobou živin, které většinou vznikají na minerálně slabých a kyselých substrátech (žuly, ruly, svory, pískovce apod.) v nejvyšších horských polohách ve velmi vlhkém a chladném klimatu (19, 24).

PSEUDOGLEJ – PG Pseudogleje jsou půdy s mramorovaným pseudoglejovým horizontem, vyvinutým následkem přítomnosti vrstvy se sníženou drenážní schopností. Jsou rozšířené na rovinách, plošinách, mírně skloněných úpatích svahů a v plochých úžlabinách (19, 24).

STAGNOGLEJ – SG Jedná se o pseudogleje s velmi dlouhou periodou povrchového převlhčení. Vytváří se v lokálních podmínkách dlouhodobějšího povrchového oglejení než pseudoglej (19, 24).

GLEJ – GL Kvůli nepříznivým fyzikálním vlastnostem mají gleje nízkou agronomickou hodnotu, jsou převážně vázané na nivy vodních toků a prameniště. Tyto půdy se nachází na celém území ČR (19, 24).

SOLONČAK – SK Tento půdní typ se tvoří akumulací solí v půdě. Zasolování je způsobováno opakovaným kapilárním zdvihem nebo zaplavováním povrchu půdy vodou s vysokým obsahem solí. Odpařováním vody se soli hromadí v půdě, zejména na povrchu. Tento typ půdy se může výjimečně vyskytovat na jižní Moravě (19, 24).

SLANEC – SC Půdy vznikající degradací solončaku. Soli jsou z horních vrstev půdy prosakující vodou vymývány, usazují se a hromadí v hlubších vrstvách. V České republice se jejich výskyt dosud nepotvrdil (19, 24).

ORGANOZEM – OR Organozemě se vytvořily procesem nahromadění málo rozložené organické hmoty ve zvodnělém prostředí. V České republice jsou rozšířené nejvíce v horských polohách na Šumavě, Krkonoších a Krušných horách a v nižších polohách na Třeboňsku (19, 24).

KULTIZEM – KU Půdy vznikající kultivační činností člověka – při mimořádném zapravování zúrodňovacích materiálů do ornice, hloubkovým kypřením, rigolováním apod. (19, 24).

ANTROPOZEM – AN Půda vytvořená uměle činností člověka – nakupením substrátů získaných při těžební stavební činnosti (19, 24).

2.6 Funkce půdy

V důsledku složitých vazeb, jichž se půda v ekosystémech účastní, není možné jednoznačně určit jednu nejdůležitější funkci půdy. Půda má nezastupitelnou úlohu v plnění těchto funkcí: Půda je základní článek potravního řetězce a současně je substrátem pro růst rostlin. Půda je životně důležitou zásobárnou vody pro suchozemské rostliny i pro mikroorganismy a je filtračním čisticím prostředím, přes které voda prochází. Mikroorganismy žijící v půdě jsou obrovským a nedoceněným rezervoárem genetické informace a umožňují průběh důležitých procesů v ekosystémech. Cyklus vody, uhlíku, dusíku, fosforu a síry probíhá v půdě prostřednictvím interakcí mikrobiální složky s fyzikálními a chemickými vlastnostmi. Organická hmota přítomná v půdě je hlavní suchozemskou zásobárnou uhlíku, dusíku, fosforu a síry a bilance a přístupnost těchto prvků je neustále ovlivňována mikrobiální mineralizací a imobilizací. Půda hraje zcela zásadní a nezastupitelnou roli ve stabilitě ekosystémů a v ovlivňování bilancí látek a energií. Působí jako environmentální pufrační medium, které mimo jiné zadržuje, degraduje, ale za určitých podmínek i uvolňuje potenciálně rizikové látky. Z půdy pochází mnoho základních složek stavebních materiálů a surovin, současně půda poskytuje prostor pro umisťování staveb, pro rekreační činnost a další lidské aktivity. Půda je prostředím, ve kterém probíhá archeologický a paleontologický výzkum (23).

zásobárna vody růst rostlin filtrační funkce produkce potravin

stavební materiály stavební činnost PŮDA suroviny rekreace koloběh látek pufrační funkce

archeologická genetická banka naleziště mikroorganismů

Obr.5. Schématické znázornění funkcí půdy (23)

trvale udržitelná produkce kvalita životního zdraví člověka a zemědělských plodin a prostředí živočichů bioty

- rostlinná produkce - kvalita podzemní vody - nutriční hodnota krmiv - odolnost k erozi - kvalita povrchové vody a potravin - kvalita ovzduší - zdravotní nezávadnost krmiv a potravin

Obr.6. Rámcové oblasti pro hodnocení funkcí půdy (23)

2.7 Půda jako zdroj mikroorganismů

Půda je hlavním rezervoárem mikroorganismů na zeměkouli a zároveň tedy hlavní zásobárnou mikrobní DNA. Půda představuje vhodné prostředí pro mnoho druhů mikroorganismů, jejichž mikrokolonie jsou vázány na půdní zrnité či jílovité částice.Výskyt mikroorganismů je závislý na vlastnostech půdy, zejména na půdním typu, fyzikálním stavu půdy, obsahu vody, ročním období, hnojení, obdělávání, druhu pěstované plodiny aj.(16, 33). 19

Ve svrchní vrstvě půdy, do které proniká sluneční světlo, můžeme pozorovat sinice, rozsivky a zelené mikroskopické řasy, v dobře provzdušněných meziprostorech různé druhy plísní, v kanálcích po kořenech rostlin a meziprostorech vyplněných vodou přítomné prvoky. V půdním roztoku s obsahem půdních agregátů se nachází hlavně bakterie. Na čerstvých zbytcích rostlin působí zejména plísně, na těžko rozložitelných ligninových látkách pomalu rostoucí plísně. Dusíkaté organické látky zpracovávají nejdříve aktinomycety, později plísně. S narůstající hloubkou postupně plísně a aktinomycety ubývají a začínají převažovat různé anaerobní bakterie (18). Podstatně větší množství mikroorganismů se nachází v rhizosféře ve srovnání s okolní půdou a to z hlediska jak kvantitativního, tak kvalitativního. Rhizosféra – biologicky nejaktivnější část půdy – je tenká vrstva půdy těsně přiléhající ke kořenům. Na akumulaci mikroflóry mají největší vliv sekrety kořenů, které obsahují cukry, aminokyseliny a vitaminy, dále zbytky kořenových vlásků a odumírající povrchová pletiva kořenů jako zdroje organických látek. Mikroorganismy v rhizosféře mají mimo jiné význam pro výživu rostlin, protože mohou přeměňovat přítomné látky na formy využitelné rostlinami (16). Početně dominantní mikroorganismy v půdě představují bakterie, které mají odpovědnost za mnoho biochemických přeměn v půdním prostředí. Běžný je výskyt bakterií rodů Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Eubacterium, Flavobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhizobium, Streptomyces (16, 33).

Tab.1. Počet a hmotnost půdních mikroorganismů (podle: Růžek, L. aj. 2003)

Půdní bakterie 109 . g-1 2,5 t.ha-1 Půdní aktinomycety 108 . g-1 2,0 t.ha-1 Půdní mikromycety 105 . g-1 5,0 t.ha-1 Celkem 1022 . g-1 9,5 t.ha-1

Půdní mikromycety se vyskytují především v půdách dobře obdělávaných a provzdušňovaných. Převažovat mohou v kyselých půdách s pH 5,5, které již většina bakterií nesnese (16).

Tab.2. Nejfrekventovanější rody mikromycet v půdě (podle: Růžek, L. aj. 2003)

Rod Třída Podíl Penicillium Deuteromycetes < 100 % Rhizopus Zygomycetes < 77 % Aspergillus Deuteromycetes < 77 % Mucor Zygomycetes < 70 % Trichoderma Deuteromycetes < 70 % Cladosporium Deuteromycetes < 70 % Verticillium Deuteromycetes < 62 % Acremonium Deuteromycetes < 62 % Absidia Zygomycetes < 62 % Chaetomium Ascomycetes < 62 %

Mikroorganismy se z půdy mohou rozšiřovat také do vody a ovzduší, na rostliny, odkud jsou roznášeny hmyzem, případně mohou kontaminovat potraviny, ponejvíc ovoce a zeleninu (2).

3 Mikroskopické houby – mikromycety

Mikroskopické houby, zkráceně mikromycety, zahrnují plísně a mnohé houby, jejichž hyfy, fruktifikační orgány a spory je možné pozorovat pouze pomocí mikroskopu. Jako plísně jsou označovány mikroskopické vláknité eukaryotní mikroorganismy, náležející mezi houby (Fungi) (16, 36). Běžně se jako plísně označují veškeré houbovité organismy, které vytvářejí vlákna mycelia, prorůstají substrát a pokrývají ho vláknitým povlakem. Botaničtí taxonomové používají uvedený termín „plísně“ pouze pro konkrétní skupinu jednobuněčných hub s nepřehrádkovaným myceliem, tzv. „pravých plísní“, řazených do třídy Zygomycetes). Plísně, které jsou známé kažením potravin a z fermentačních procesů se řadí do podkmenu Ascomycotina a Deuteromycotina, jsou botaniky označovány jako vláknité houby (36, 37). Technologové používají název plísně pro zástupce všech tří skupin, protože jejich fyziologické vlastnosti a nárůst na napadeném materiálu jsou velmi podobné (36).

3.1 Taxonomie mikromycet

Podle přítomnosti a typu pohlavního rozmnožování se důležité plísně řadí do těchto taxonomických jednotek: 1. Třída Zygomycetes – je charakterizována jednobuněčným (nepřehrádkovaným) myceliem a pohlavním rozmnožováním s tvorbou tzv. zygospor. Nepohlavní rozmnožování probíhá pomocí endospor. 2. Podkmen Ascomycotina – je charakterizovaný přehrádkovaným myceliem a pohlavním rozmnožováním za tvorby askospor tvořených v asku. Nepohlavní rozmnožování se děje exosporami. 3. Podkmen Deuteromycotina (Fungi imperfect – houby nedokonalé) – vyznačují se přehrádkovaným myceliem a pouze nepohlavním rozmnožováním pomocí exospor (36).

3.2 Morfologie mikromycet

Základem těla mikromycet je vegetativní vláknitý útvar – stélka (thallus). Stélka je tvořena vlákny (hyfy), která jsou buď jednobuněčná, tj. bez přepážek, nebo vícebuněčná čili septovaná. Hyfy plísní o průměru 5 – 10 μm se většinou větví přibližně v pravém úhlu a jejich spleť se nazývá mycelium. Rozlišujeme dva typy mycelií: substrátové, které prorůstá substrátem a vyživuje celý organismus, a vzdušné mycelium vyrůstající nad substrátem. Mycelium může být nedělené (neseptované, nepřehrádkované) nebo pravidelně dělené (septované, přehrádkované) (28, 36, 39). Tvrdý polokulovitý útvar vytvářený hustou spletí hyf se nazývá sklerocium. Je většinou tmavé barvy, má průměr až několik milimetrů a je odolný vůči nepříznivým podmínkám. Vyskytuje se hlavně u těch druhů, u nichž není známá tvorba pohlavních ani nepohlavních spor. Kožovitá spleť hyf se označuje jako stroma a nalézá se často u plísní parazitujících na ovoci a jiném rostlinném materiálu (36).

3.3 Rozmnožování mikromycet

Mikroskopické houby se mohou rozmnožovat jednak vegetativně, tedy rozpadem vlákna, kdy z každého fragmentu hyfy může vyrůst nový jedinec, a jednak sporami. Spory se tvoří buď vegetativním způsobem (tzv. nepohlavní neboli vegetativní spory), nebo po spájení (pohlavní spory)(36, 39). Nepohlavní spory vznikají buď na vegetativních hyfách nebo na zvláštních fruktifikačních orgánech během imperfektního (nedokonalého) stádia vývoje hub. Fruktifikační orgány jsou rodově specifické a slouží jako důležitý identifikační znak. Spory umístěné vně orgánů se nazývají exospory nebo konidie a vznikají odškrcováním, pučením nebo rozpadem mycelia. Exospory různých rodů se od sebe značně odlišují, mohou být kulovitého, elipsoidního, válcovitého, vřetenovitého, srpkovitého a spirálově stočeného tvaru, mohou být jednobuněčné (někdy označované jako mikrokonidie) nebo vícebuněčné (označované jako makrokonidie). Mohou být umístěny jednotlivě, v řetízcích nebo kulovitých útvarech (36, 39). Některé rody plísní kolem jednotlivých buněk mycelia mohou vytvořit velmi silný obal, přičemž se obsah buňky zahustí. Tímto způsobem se vytváří chlamydospora, která je odolná proti nepříznivým podmínkám. Chlamydospory mohou být koncové nebo interkalární a mohou se nacházet i v myceliu bez přehrádek nebo ve vícebuněčných konidiích (36). 23

Spory, které se nacházejí uvnitř orgánů, se nazývají endospory. U některých rodů vznikají ve specializovaném vakovitém útvaru zvaném sporangium a označují se jako sporangiospory. Sporangium je kulovitého, hruškovitého nebo válcovitého tvaru a je umístěno na jednoduchém nebo větveném sporangioforu (36, 39). Pohlavní spory vznikají po spájení dvou buněk. Mezi plísněmi jsou známy homothalické rody, které nejsou pohlavně rozlišeny, takže dochází ke spájení buněk vyrůstajících ze stejné hyfy. Většina plísní je heterothalická, takže každý druh obsahuje kmeny pohlavního typu + a kmeny opačného typu – mezi nimiž dochází ke konjugaci a následně vznikají pohlavní spory (36, 39).

3.4 Významné rody mikromycet

3.4.1 Rod Aspergillus

Rod Aspergillus zahrnuje převážně velmi rychle rostoucí mikromycety, které tvoří plně vybarvené kolonie po třech až pěti dnech inkubace. Zástupci tohoto rodu mají septované mycelium, které může být bezbarvé, žluté, modré i černé. Vegetativní rozmnožování probíhá pomocí konidií, které vznikají v řetízcích z fialid na rozšířeném konci konidioforu. U některých druhů je známá také tvorba neuspořádaných asků obsahujících 8 askospor. Asky se nachází v kulovitém kleistotheciu, které má sírově žlutou barvu a je zřetelné pouhým okem jako drobné kuličky o průměru menším než 1 mm (36, 39, 41). Plísně rodu Aspergillus mají velmi bohatý enzymový aparát a jsou častými původci kažení potravin a krmiv. Díky silné lipolytické aktivitě způsobují znehodnocování olejnin, tuků, jedlých olejů a potravin bohatých na tuky. Některé druhy jsou schopné snášet i velmi nízkou vodní aktivitu, proto mohou napadat sušené potraviny nebo potraviny s vysokým podílem cukrů a soli jako je např. sušené maso, džemy, sušené ovoce a zelenina, obiloviny a pečivo. Zástupci rodu Aspergillus se vyskytují rovněž na čerstvém ovoci, citrusech a zelenině. Díky své bohaté enzymatické výbavě jsou často využívány pro průmyslovou výrobu amyláz, lipáz a pektináz, které se pak používají v potravinářské průmyslu nebo při výrobě pracích prášků. Určité druhy se využívají pro průmyslovou kvasnou výrobu organických kyselin, jiné druhy se účastní výroby sojové omáčky. Některé plísně rodu Aspergillus produkují antibiotika, která jsou ovšem velmi toxická a tak nenašla uplatnění pro lékařské použití (36, 39). 24

Rod Aspergillus zahrnuje celkově asi 150 druhů, z nichž jen několik bylo prokázáno jako původci lidských onemocnění. Aspergily mohou způsobovat systémové mykózy (endokarditidy, plicní aspergilóza) i povrchové infekce (onychomykózy, otomykózy aj.), konidie přítomné v dýchacích cestách mohou mechanickým drážděním zhoršovat zdravotní stav alergiků a astmatiků. Nejčastějším původcem mykóz je Aspergillus fumigatus, méně Aspergillus flavus a Aspergillus niger. A. flavus dále se uvádí jako producent nebezpečných aflatoxinů B1, B2, G1, G2 a M s hepatotoxickými účinky (3, 40, 41).

Tab. 3. Systematické zařazení rodu Aspergillus (podle: Ostrý, V. aj. 2003)

Říše Oddělení Řád Čeleď Anamorfní rod Fungi (houby) Ascomycota Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus

3.4.2 Rod Penicillium

Rod Penicillium zahrnuje asi 220 druhů, částečně se jedná o imperfektní stádia rodů Eupenicillium a Talaromyces, které vytváří pohlavní askospory a jsou řazeny do třídy Ascomycetes. Plísně tohoto rodu se vyskytují ve formě septovaného nepigmentovaného mycelia, konidiofory jsou na koncích větvené v podobě metuly, na kterou přisedají fialidy, z nichž se odškrcují dlouhé řetízky konidií zelenošedé až modré barvy (39). Penicilia se vyskytují v půdě, ve vodě, na povrchu živých i odumřelých organismů, jejich spory se nachází v ovzduší a ulpívají na nejrůznějších substrátech, na nichž dovedou při minimálních požadavcích na živiny vyklíčit. Vyskytují se prakticky na všech potravinách, zejména pak na pečivu, ovoci a citrusových plodech (7, 39). Některé druhy, například Penicillium camemberti, Penicillium candidum nebo Penicillium roqueforti se používají jako startovací kultury při výrobě sýrů. Podobně jako aspergily i zástupci rodu Penicillium dovedou produkovat mykotoxiny, a to i některé kmeny užívané v potravinářství (41). Až donedávna byl celý rod považován za nepatogenní pro člověka. To již neplatí po prokázání schopnosti jihoasijského druhu Penicillium marneffei vyvolat infekci u člověka. Tento druh může v oblastech jižní Asie vyvolávat disseminované infekce u nemocných AIDS, které postihují hlavně plíce, játra a kůži. Kromě zmíněného druhu existuje několik dalších druhů (Penicillium expansum, Penicillium islandicum) podezřelých z účasti na vzniku 25 lidských infekcí – onychomykóz a dermatomykóz. Druh Penicillium veridicatum produkuje ochratoxin A a způsobuje tak ochratoxikózy nejen u zvířat, ale i u lidí. Konidie penicilií, které se dostanou do dýchacích cest astmatiků nebo alergiků, mohou zhoršovat jejich stav mechanickým drážděním (40, 41).

3.4.3 Rod Fusarium

Plísně rodu Fusarium se vyznačují bohatým septovaným šedým, žlutým, hnědým, růžovým, červeným nebo fialovým myceliem, na kterém se tvoří dva typy konidií: mikrokonidie a makrokonidie. Mikrokonidie jsou jednobuněčné, elipsoidního nebo oválného tvaru a mají podstatně menší velikost než makrokonidie. Makrokonidie mají charakteristický rohlíčkovitý nebo srpovitý tvar, jsou tvořeny vždy několika buňkami. U velkého množství druhů se mikrokonidie a makrokonidie vyskytují současně, některé druhy mikrokonidie nevytváří vůbec, jiné mohou produkovat jenom mikrokonidie bez makrokonidií. Některé druhy vytváří kromě toho ještě chlamydospory – zduřelé buňky se silnou stěnou uprostřed nebo na konci hyf, případně i v makrokonidiích (16, 36, 39). Mikroskopické houby rodu Fusarium jsou široce rozšířeny v půdě, ale také ve vodě a ovzduší. Jsou to parazité rostlin a způsobují velké škody na rostoucích obilovinách a při skladování rostlinných produktů, jako je kukuřice, ovoce, brambory, citrusy atd. Některé druhy mají schopnost produkovat mykotoxiny v obilí, což může ovlivnit zdraví lidí i zvířat, jestliže se tyto mykotoxiny dostanou do jejich potravního řetězce (16, 22, 39). Mezi nejznámější toxiny produkované plísněmi tohoto rodu patří skupina trichothecenových mykotoxinů, jako jsou T2 toxin, deoxynivalenol, zearalenon a moniliformin. Fumonisiny produkované plísní Fusarium moniliforme jsou uváděné jako možné karcinogeny pro člověka. Některé druhy mohou produkovat toxická antibiotika (4, 36, 40). Dříve byli zástupci rodu Fusarium považováni za nepatogenní pro člověka, v současné době jsou však popsány případy mykotických onemocnění určitých osob se sníženou imunitou nebo s oslabeným organismem (16).

3.4.4 Rod Mucorales

Rod Mucorales zahrnuje přes 100 druhů schopných vytvářet neseptované mycelium, ze kterého vyrůstají sporangiofory nesoucí sporangia. Sporangia jsou kulovitého tvaru, 26 z počátku světlá, později hnědá až černá, viditelná pouhým okem a obsahující nepohlavní spory. Pohlavní spory se vytváří přímo na hyfách mycelia. Mikromycety tohoto rodu se vyskytují na různých potravinách, zejména na zelenině a ovoci, ale způsobují kažení také mraženého masa, masných výrobků, fermentovaných potravin, pečiva a pekařských kvasnic. Některých druhů se využívá pro průmyslovou výrobu proteolytických enzymů a amyláz (36, 39). Určité druhy rodu Mucorales produkují mykotoxiny, jiné jsou navíc ještě patogenní – mohou vyvolávat rhinocerebrální mykózy, otomykózy zevního zvukovodu a infekci rozsáhlých popálenin (36, 41).

3.4.5 Rod Rhizopus

Jde o velmi rozšířený rod mukurovitých plísní, které poměrně rychle rostou na různých kultivačních půdách. Tvoří výrazně rozvětvené mycelium šedé barvy. Sporangiofory se vyskytují ve svazcích po 2, 3 i více a téměř nikdy se nevětví. Vyrůstají ve výhoncích, stolonech, které vytváří na pevném podkladu kořínkovitě rozvětvené, tmavohnědě zbarvené rhizoidy. Sporangia jsou kulovitého tvaru, konec sporangioforu pod sporangiem je rozšířený v tzv. apofýzu a přechází spojitě v čočkovitou kolumelu. Po prasknutí sporangia se kolumela s apofýzou typicky kloboukovitě obrací, což je pro tento rod charakteristické (16, 36). Rod Rhizopus je v přírodě velmi rozšířený, způsobuje kažení ovoce i dalších potravin, v mlékárenském průmyslu může znehodnocovat sýry. Bývá původcem vzdušné kontaminace laboratorních půd. Některé druhy jsou schopné tvořit mykotoxiny, některé jsou patogenní. Zástupci tohoto rodu mají fermentačními schopnostmi, mohou vyvolat také alkoholové kvašení. Známé je použití pro průmyslovou produkci kyseliny fumarové a při mikrobiálních transformacích steroidních sloučenin při výrobě některých léků. (16, 36).

3.5 Metabolické produkty plísní

Mikromycety produkují do substrátu širokou škálu nejrůznějších metabolitů. Některé z nich jsou pro člověka vysoce užitečné (enzymy, antibiotika, organické kyseliny) a produkční kmeny se využívají k průmyslové výrobě těchto látek. Kromě užitečných látek produkují mikroskopické houby také metabolity o různém stupni toxicity (mykotoxiny) (38). 27

Nejdůležitější skupiny metabolických produktů: 1. Antibiotika: penicilin, fumigatin, griseofulvin 2. Organické kyseliny: citronová, glukonová, gallová, šťavelová, itakonová, fumarová 3. Enzymy: proteolytické, lipolytické, amylolytické, pektolytické, celulolytické aj. 4. Mykotoxiny: aflatoxiny, ochratoxiny, zearalenon, rubratoxin, luteoskyrin, islandotoxin, sterigmatocystin, patulin aj.(38)

3.5.1 Charakteristika toxinogenních vláknitých mikromycet

Toxinogenní vláknité mikromycety jsou mikroorganismy, které mají schopnost produkovat mykotoxiny. Řadí se k významným faktorům, které mohou v negativním smyslu ovlivňovat zdraví člověka. Plesnivé potraviny obsahující toxinogenní mikromycety a mykotoxiny představují významné nebezpečí pro zdraví populace v ČR, zvláště z hlediska tzv. pozdních toxických účinků jako je např. karcinogenita a vývojová toxicita. Potraviny představují vhodný substrát pro kontaminaci, růst a rozmnožování toxinogenních mikroskopických hub a následně pro produkci mykotoxinů. Z celkového množství asi 114 druhů mikromycet, které mají význam v potravinách, je 65 druhů toxinogenních. Takto kontaminované potraviny představují významné nebezpečí tzv. „skrytých mykotoxinů“ (29).

3.5.2 Mykotoxiny

Mykotoxiny jsou sekundární metabolity plísní, které mohou vznikat během růstu plísní na potravinách a krmivech. Počet mykotoxinů není přesně známý, protože jsou neustále objevovány nové látky patřící do této skupiny. Na druhé straně dochází i ke snižování počtu mykotoxinů, protože látky objevené nezávisle různými výzkumnými týmy jsou později ztotožněny. Lze odhadnout, že celkem existuje asi 500 látek řadících se mezi mykotoxiny (37, 39). Z velkého množství mikroskopických hub je známo asi 150 druhů, které mají schopnost produkovat jeden nebo více mykotoxinů. Mezi nejvýznamnější mikromycety produkující mykotoxiny se řadí rody Aspergillus, Fusarium a Penicillium. Mykotoxiny se 28 všeobecně tvoří v myceliu, ale můžou se hromadit např. ve specializovaných strukturách jako jsou konidie, sklerocia, nebo se po vyloučení kumulují v okolním prostředí. Významným faktorem ovlivňujícím tvorbu mykotoxinů jsou klimatické podmínky, zejména teplota a vysoká relativní vlhkost (12, 37, 40). Příčinami přítomnosti mykotoxinů v potravinách mohou být: kažení potravin plísněmi, které produkují mykotoxiny; zpracovávání surovin obsahujících mykotoxiny; zkrmování krmiv s obsahem mykotoxinů, které se mohou následně dostat až do masa a mléka; výroba potravin pomocí plísní produkujících mykotoxiny (39). Mezi nejčastější suroviny a potraviny kontaminované mykotoxiny náleží rostlinná krmiva, rostlinné suroviny a potraviny, jako jsou např. ořechy, cereálie, ovoce, zelenina (včetně kandovaného ovoce, zavařenin a šťáv) a živočišné výrobky. Hlavními mykotoxiny nalézanými v potravinách jsou aflatoxin B1, citrinin, fumonisin, ochratoxin a vomitoxin (39, 40). Mykotoxiny vykazují fyziologický až toxický účinek na vyšší organismy. Jsou schopné vyvolávat různé toxické reakce, tzv. mykotoxikózy a můžou být příčinou různých onemocnění od alergických reakcí přes imunosupresivní účinky až po vznik karcinomů (40).

3.5.3 Rozdělení mykotoxinů

Mykotoxiny se mohou rozdělovat podle velkého množství kritérií. Žádné z doposud používaných kritérií nemůže být považováno za univerzálně použitelné. Nejjednodušší je rozdělení mykotoxinů podle chemické struktury – výhodou je poměrně snadné a jednoznačné zařazení jakékoliv látky o známé chemické struktuře. Pro toxikologickou praxi má význam dělení mykotoxinů podle toxicity, lze využít i třídění podle způsobu biosyntézy, jehož výhodou je velmi dobré postižení vztahu k produkujícímu organismu a do určité míry respektuje i vztahy určené chemickou strukturou (37).

Tab. 4. Dělení mykotoxinů podle chemické struktury (podle: Šimůnek, J. 2004)

Skupina Příklady mykotoxinů Furanofurany aflatoxiny, sterigmatocystin, versicolorin Substituované pyreny a hydroxypyreny kyselina koji, sekalonové kyseliny luteoskyrin, rubratoxin, Substituované chinony xanthomegnin, viridicatumtoxin patulin, kyselina penicillová, Nenasycené laktony kyselina mykofenolová, alternariol, citreoviridin, ochratoxiny, rubratoxin B, 4,5,8 - trimetylpsoralen Griseofulviny griseofulvin T-2 toxin, diacetoxyscirpenol, Epoxytrichotheceny deoxynivalenol, nivalenol, fusarenony, verrucariny, roridiny, satratoxiny Polycyklické substituované indolové kyselina cyklopiazonová, deriváty paspaliny, penitremy gliotoxin, sporidesminy, roquefortin, Cyklické dipeptidy fumitremorgen, verruculogeny, brevianamidy zearalenon, curvularin, citrinin, Mykotoxiny jiné struktury PR-toxin, canthecellin, moniliformin, kyselina betanitropropionová

Tab. 5. Dělení mykotoxinů podle toxicity – kvantitativní (podle: Šimůnek, J. 2004)

Stupeň toxicity Mykotoxin aflatoxin, patulin, luteoskyrin, spirodesminy, ochratoxin A, Silně toxické cyklochlorotin (islandotoxin), zearalenon (F-2 toxin), T-2 toxin, DAS (diacetoxyscirpenol), citreoviridin, rubratoxiny, penitrem A citrinin, kyselina penicillová, Středně toxické sterigmatocystin, kyselina cyklopiazonová griseofulvin, kyselina koji, trihothecin, Slabě toxické kyselina mykofenolová, chaetomin

Tab. 6. Dělení mykotoxinů podle toxicity – kvalitativní (podle: Šimůnek, J. 2004)

aflatoxiny, sporidesminy, luteoskyrin, Hepatotoxiny sterigmatocystin Nefrotoxiny ochratoxin A, citrinin Toxiny zažívacího traktu T-2 toxin, další trichotheceny Neurotoxiny, myotoxiny tremorgeny (např. penitrem A), citreoviridin verrucariny, psoraleny, sporidesminy, Dermotoxiny trichotheceny Toxiny dýchacího traktu patulin Genitotoxiny zearalenony Imunotoxiny aflatoxiny, ochratoxin A, trichotheceny

Tab. 7. Dělení mykotoxinů podle způsobu biosyntézy (podle: Šimůnek, J. 2004)

Biosyntéza moniliforminu moniliformin (z kyseliny octové) patulin, ochratoxin, emodin, Biosyntéza z polyketidů kyselina sekalonová, aflatoxiny Biosyntéza z isoprenoidů trichotheceny, roquefortiny kyselina cyklopiazonová, Biosyntéza z aminokyselin cyklické dipeptidy

Tab. 8. Dělení mykotoxinů podle účinku na buňku (podle: Šimůnek, J. 2004)

citreoviridin, luteoskyrin, xanthomegnin, Inhibitory tvorby energie kyselina sekalonová D, moniliformin Inhibitory proteosyntézy trichotheceny, ochratoxin A griseofulvin, cytochalasiny, Modifikátory cytoskeletu cyclochlorotin Estrogenní mykotoxiny zearalenon penitremy (A, B, C), Tremorgeny fumitremorgeny (A a B), verruculogeny Karcinogenní mykotoxiny aflatoxin B1

3.5.4 Přehled nejvýznamnějších mykotoxinů

3.5.4.1 Aflatoxiny

Aflatoxiny představují jednu z nejvýznamnějších skupin mykotoxinů produkovaných plísněmi Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Jedná se o historicky prvně objevené mykotoxiny. Počátek jejich intenzivního výzkumu se datuje od roku 1960, kdy v Anglii došlo k hromadnému úhynu více než 100 000 krůťat. Nemoc byla označována jako Turkey X disease. Následně se zjistilo, že příčinou úhynu bylo zkrmování plesnivělého krmiva, kterým byla moučka z burských oříšků – nepukavých kožovitých lusků podzemnice olejné, dovezených z Brazílie a kontaminovaným nebezpečnými aflatoxiny. Podle chemické struktury mohou být charakterizovány jako polycyklické, nenasycené, vysoce substituované kumariny. Známých je šest hlavních typů aflatoxinů – B1, B2, G1, G2,

M1 a M2 (16, 20, 39). Aflatoxiny jsou netoxické, ale v organismu jsou přeměňovány na vysoce toxické formy skrze oxidační metabolismus cytochromem P 450. Mají karcinogenní účinky, hlavně v játrech, kde mohou způsobovat také cirhózy a fibrózy. Aflatoxin B1 je nejsilnější hetatokarcinogen, i když jeho účinky jsou odlišné v závislosti na druhu, věku, pohlaví a nutričním stavu. Jeho hepatokarcinogenita souvisí s biotransformací na vysoce reaktivní elektrofilní epoxidy, které jsou schopné tvořit addukty s DNA, RNA a proteiny. Aflatoxiny vyvolávají onemocnění, které se nazývají aflatoxikózy. Akutní aflatoxikóza může končit smrtí, následkem chronické aflatoxikózy bývá rakovina, snížená odolnost imunitního systému a další patologické stavy, mohou způsobovat poškození plodu nebo až potraty. (20, 39). Aflatoxiny se nachází zejména v obilovinách a výrobcích z nich, v ořeších (podzemnice olejná, vlašské ořechy, brazilské ořechy para, pistáciové ořechy), v koření a v sušeném ovoci (fíky, hrozinky, datle, sušené meruňky a švestky). Do produktů živočišného původu se aflatoxiny dostávají sekundárně, při zkrmování kontaminovaného krmiva. Aflatoxiny přijaté do organismu s kontaminovaným krmivem se pak nacházejí především v játrech a ledvinách, pronikají i do mléka a následně do sýrů. Při průchodu mléčnou žlázou se původní aflatoxiny B1, B2, G1 a G2 transformují na metabolity M1 a M2, které jsou ještě výrazně toxičtější než výchozí látky (17).

3.5.4.2 Citrinin

Tento mykotoxin je produkován hlavně plísněmi Penicillium citrinum a Penicillium viridicatum, ale také některými dalšími. Často bývá nalezen v rýži, pšenici a ovsu, v plesnivém chlebu a špatně skladované šunce. Jeho producenti bývají často nalezeny v kávě, kde však dochází k inhibici jejich růstu kofeinem a toxiny se proto nevytváří. Po ozáření UV světlem tento mykotoxin žlutě fosforeskuje. Původně byl citrinin charakterizován jako antibakteriální antibiotikum, má však i účinky antiprotozoární a antimykotické. Na organismus savců citrinin působí jako velmi silný nefrotoxin, poškozuje metabolismus jater a má karcinogenní a mutagenní účinky (39, 41).

3.5.4.3 Fumonisiny

Fumonisiny jsou mykotoxiny produkované plísněmi rodu Fusarium, konkrétně Fusarium moniliforme a Fusarium proliferatum. Nejčastěji se vyskytují na kukuřici a ostatních zrninách (např. rýže a proso). Kontaminace kukuřice a kukuřičných produktů (kukuřičné lupínky, siláž) je běžná v řadě zemí. Zatímco produkty z kukuřice určené pro lidskou výživu zpravidla obsahují méně než 1 mg/kg fumonisinu B1, krmiva pro zvířata bývají často silně kontaminována. Fumonisiny mají hepatotoxické a neurotoxické účinky, mohou způsobovat rakovinu jícnu. Mezi popsané mykotoxikózy způsobené fumonisinem patří leukoencefalomalácie u koní a plicní edémy u prasat (39).

3.5.4.4 Ochratoxiny

Celkem je známo asi sedm různých ochratoxinů, z nichž nejznámější a nejtoxičtější ochratoxin A byl objeven již v roce 1965. Podle způsobu biosyntézy se ochratoxin A řadí mezi pentaketidy, obecně se může charakterizovat jako derivát 7 izokumarinu vázaný na aminoskupinu L- β- fenylalaninu. Producenty ochratoxinu A jsou především dva rody plísní, Aspergillus a Penicillium, za nejdůležitějšího producenta je považován Aspergillus ochraceus. Kmeny Aspergillus ochraceus produkují ochratoxin A v teplotním rozmezí 15 – 37 °C, plísně rodu Penicillium v rozmezí teplot 4 – 30 °C (16, 27, 39). K hlavním toxickým účinkům patří nefrotoxicita, imunotoxicita, genotoxicita, karcinogenita, teratogenita a neurotoxicita. V organismu ochratoxin A vstupuje do 33 enterohepatálního cyklu, který je částečně odpovědný za dlouhý biologický poločas tohoto mykotoxinu – u člověka je pravděpodobně 35 dní. Ochratoxin A se chová jako kumulativní jed s rychlou absorpcí a pomalým vylučováním. Distribuován je krevní cestou, k retenci dochází zejména v ledvinách, játrech, varlatech a střevě. K významným toxickým účinkům ochratoxinu A patří nefrotoxicita – cílovými orgány jsou ledviny a vylučovací systém. Rozsah renálního poškození závisí na dávce, délce expozice a akumulaci toxinu ve tkáni ledvin. Bylo prokázáno, že ochratoxin A by mohl mít velkou úlohu v etiologii neuropatie prasat. Ochratoxin A je spojován také s nádory ledvin a nádorovým onemocněním varlat. IARC FAO/WHO klasifikuje ochratoxin A jako možný karcinogen pro člověka (27). Ochratoxin A se vyskytuje v potravinách rostlinného i živočišného původu. Za hlavní zdroje se považují obiloviny, vepřové maso, krev a vnitřnosti, dále se tento mykotoxin nachází v kávě, kakau, pivu, luštěninách, koření, sušeném ovoci, hroznové šťávě a ve vínech. Stejně jako ostatní mykotoxiny je vysoce termostabilní, nelze jej zničit pouhým varem (27, 39). Na základě současných poznatků se může pokládat zdravotní riziko akutních toxických účinků ochratoxinu A pro populaci v České republice za minimální, v našich podmínkách se může spíše uplatnit chronická toxicita (tzv. pozdní toxické účinky), ke které dochází po příjmu nízkých a opakovaných dávek ochratoxinu A v potravinách (27).

3.5.4.5 Patulin

Patulin je cyklický gama – lakton, produkovaný celou řadou plísní, zejména Penicillium expansum a Penicillium cyclopium, ale i dalšími druhy rodu Aspergillus a Penicillium a také druhy Byssochlamys nivea a Byssochlamys fulva. Některé z těchto plísní jej mohou produkovat i při teplotách nižších než 2 °C. Patulin byl původně popsaný jako antibiotikum účinné na grampozitivní a gramnegativní bakterie i na Mycobacterium tuberculosis. Patulin má bakteriostatické, baktericidní a antifungální účinky, je vysoce toxický pro rostlinné a živočišné buňky. Vykazuje karcinogenní, mutagenní a teratogenní aktivitu, vyvolává gastrointestinální poruchy, otoky a krvácení různých orgánů. Ve studiích in vivo a in vitro byl zaznamenán imunosupresivní efekt. Patulin indukuje zlomy jedno- i dvou- vláknové DNA ve zvířecích a lidských buněčných kulturách, inhibuje syntézu RNA – specificky blokuje aktivitu RNA – polymerázy v iniciačním stádiu transkripce a zasahuje do proteosyntézy (4, 13, 34, 39). 34

Patulin je nejtypičtějším kontaminantem ovoce, nachází v různých druzích (zejména jablka, hrozny, pomeranče, banány) a výrobcích z nich (ovocné džusy, šťávy, mošty). Vyskytuje se plesnivém pečivu, v párcích a dalších potravinách (13, 17, 39).

3.5.4.6 Sterigmatocystin

Sterigmatocystin je mykotoxin produkovaný houbami rodu Aspergillus (zejména druhy plísní Aspergillus nidulans a Aspergillus versicolor) a dále zástupci rodu Chaetonium a

Monocillium. Tento mykotoxin je prekurzorem aflatoxinu B1, poškozuje játra a ledviny. Na druhé straně se prokázaly jeho protirakovinné a antibiotické účinky. V experimentech se potvrdila jeho karcinogenita pro myši a krysy (16, 41).

3.5.4.7 Tremorgenní mykotoxiny

Tremorgenní mykotoxiny představují speciální skupinu přírodních látek schopných působit na centrální nervový systém. Jsou produkovány některými druhy rodů Aspergillus, Penicillium a Claviceps. Do této skupiny se řadí penitremy, verruculogeny, fumitremorgeny a TR – 2 toxin. U obratlovců vyvolávají neurotoxický syndrom, který se projevuje třesem, slabostí končetin a ataxií. V Belgii, v oblasti Flander, se smrtící neurotoxikóza vyskytla současně mezi zvířaty patřícími do různých stád hovězího dobytka. Mezi prvotní příznaky patřila slabost zadních končetin, ataxie, laterální vychýlení zadní části těla a zřetelný svalový třes. Postupně se objevovala paréza, tetraplegie a chůze s omezenou hybností končetin. Některá zvířata ležela v pozici sedícího psa, neschopná natáhnout končetiny. V pozdějším stádiu se nacházela v permanentní poloze v leže (4, 34).

3.5.4.8 Trichotheceny

Nejvýznamnějšími producenty trichotecenů jsou plísně rodu Fusarium. Tyto mykotoxiny byly izolovány především z kukuřice, pšenice, sóji, semen olejnin a pivě vyrobeném z napadeného ječmene, příležitostně se trichoteceny vyskytují i ve špatně skladované rýži. Nejznámějšími zástupci jsou T2 toxin a deoxynivalenol (vomitoxin). Akutní toxicita deoxynivalenolu se projevuje zažívacími obtížemi a zvracením, mohou být pozorovány také kožní léze, krvácení, imunosupresivní, teratogenní a nefrotoxické účinky. Nižší dávky deoxynivalenolu způsobují anorexii, vyšší dávky navozují dosud neobjasněným 35 mechanismem zvracení. Protože deoxynivalenol mění neurochemii mozku, anorexie a zvracení by mohly být výsledkem jeho neurotoxicity. T2 toxin vyvolává onemocnění zvané alimentární toxická leukémie, která se z počátku projevuje zvracením, průjmy, záněty sliznic a bolestmi hlavy, v dalším stádiu dochází ke snížení počtu krevních destiček a bílých krvinek. V důsledku oslabení organismů dochází ve třetí fázi k infekci mikroorganismy, které jsou za normálních podmínek pro člověka neškodné. Trichoteceny mohou být částečně transformovány a snad i detoxikovány střevní mikroflórou (20, 39).

3.5.4.9 Zearalenony

Zearalenony jsou mykotoxiny produkované zástupci rodu Fusarium (jedná o druhy Fusarium graminearum a Fusarium tricinctum). Tyto plísně se množí na obilí, hlavně na ječmeni, ovsu a pšenici, zejména během vlhkého a deštivého počasí. Zearalenony biochemicky náleží mezi estrogeny, u myší a prasnic vyvolávají ovulaci. Kromě estrogenní aktivity mají i anabolické účinky. Toho bylo využíváno na podporu růstu hovězího dobytka a ovcí, zejména v USA. Zearalenon má i slabé antibakteriální a mutagenní účinky (39, 41).

3.5.5 Mykotoxiny a legislativa

Mykotoxiny se řadí k významným faktorům, které můžou negativně ovlivňovat zdraví člověka a zdraví užitkových hospodářských zvířat. Představa, že se tento problém týká jen rozvojových zemí Asie a Afriky, kde klimatické podmínky – teplo a vlhkost jsou pro růst plísní a produkci mykotoxinů zvlášť příznivé, se ukázala mylná. Světová organizace FAO odhaduje, že až 25 % z celoroční produkce potravin ve světě je kontaminováno mykotoxiny. Současné výzkumy ukázaly, že riziko mykotoxinů existuje na celém světě i v chladnějších klimatických podmínkách a týká se také průmyslově vyspělých zemí. Sledování výskytu mykotoxinů v potravinách a krmivech v rámci státního dozoru má bezesporu svoje místo v zabezpečení potravinové bezpečnosti obyvatelstva (12). Až donedávna se nařízení týkající se mykotoxinů v rámci Evropské unie zaměřovaly na maximální hodnoty aflatoxinů, ochratoxinu A a patulinu. V posledních letech se příslušné úřady zabývají toxikologickým hodnocením fusariových toxinů (deoxynivalenol, zearalenon, fumonisiny, T2 toxin a HT2 toxin) a dalších mykotoxinů. Odpovědí na požadavky vyplývající z těchto vědeckých hodnocení je v současné době diskuze zabývající se regulací maximálních hodnot mykotoxinů v rámci Evropské unie. 36

Současné a budoucí maximální limity mykotoxinů musí být viděny ve světle následujících nejdůležitějších aspektů: - ochrana spotřebitelů - ekonomický dopad regulace na potravinářský a krmivářský průmysl - mezinárodní obchod V současné době jsou v Evropské unii stanoveny nařízení pro aflatoxiny, ochratoxin A, patulin, deoxynivalenol, zearalenon a fumonisiny. Pro T2 toxin a HT2 toxin jsou projednávány přípustné hodnoty, dalšími kandidáty jsou námelové alkaloidy a mykotoxiny mikroskopických hub rodu Alternaria (9).

3.5.6 Onemocnění vyvolaná mykotoxiny

3.5.6.1 Jistá a vyvolávaná pouze mykotoxiny

Alimentární toxická aleukie (ATA) Onemocnění je způsobené T2 toxinem a příbuznými trichotheceny, které produkují především houby z rodu Fusarium. Vyskytuje se u lidí i zvířat po konzumaci kontaminovaného obilí (12). Onemocnění probíhá ve třech fázích: - V první fázi dochází k prudkému nástupu příznaků na bráně vstupu, zpravidla se jedná o trávicí ústrojí (záněty sliznice, zvracení, průjmy – i krvavé). T2 toxin však do organismu může pronikat i přes neporušenou pokožku. - Ve druhé fázi se dostavuje zdánlivá úleva, která je doprovázená poklesem počtu krevních destiček a bílých krvinek (úbytek erytrocytů u těžších případů nastává později). - Ve třetí fázi jsou nemocní postiženi jak bakteriálními infekcemi, a to banální a pro normálního člověka neškodnou flórou, tak i krvácením. Často bývají postiženy krční mandle, proto byla choroba známa jako „septická angína“. Při onemocnění je důležitý zejména dostatečný přísun plnohodnotných bílkovin, který do určité míry kompenzuje pokles proteosyntézy vyvolaný trichotheceny (20, 37).

Akutní kardiální beri – beri Při tomto onemocnění dochází ke křečím a postupné paralýze, na srdci je výrazná porucha rytmu, tzv. Wenckebachovy periody. Onemocnění může skončit smrtí, jejíž příčinou 37 je zástava srdce v diastole. Toxinem vyvolávajícím toto onemocnění je citreoviridin, který je produkovaný především plísní Penicillium citreoviride do rýže. Citreoviridin má jasně žlutou barvu, která je na rýži patrná („žlutá rýže“). Vztah mezi žlutým zabarvením rýže a chorobou byl odborně popsaný začátkem tohoto století. Obyvatelé v oblastech s výskytem „žluté rýže“ ji vystavují v tenké vrstvě slunečním paprskům, čímž dochází k účinné detoxikaci, neboť citreoviridin je silně fotolabilní (12).

Ergotismus Tato mykotoxikóza se projevuje po konzumaci obilí a rýže zkontaminované černými nebo tmavofialovými sklerocii – námelem houby rodu Claviceps, která tvoří námelové alkaloidy ergotamin a ergocristin a způsobuje otoky končetin a gangrény. Mezi nejčastější příznaky patří nauzea, zvracení, závratě a ospalost, křeče, slepota a paralýza. U psychotropní formy ergotismu se vyskytují zejména tělní a sluchové halucinace (12).

3.5.6.2 Jistá, ale s možnou další etiologií

U těchto chorob jsou mykotoxiny jedním z většího množství možných etiologických činitelů (37).

Toxická hepatitida Jako téměř každý hepatotoxin mohou aflatoxiny při chronické expozici vyvolávat poškození jater, které má charakter zánětu. Stejně tak mohou působit i jiné hepatotoxické mykotoxiny, jako např. cyklochlorotin či luteoskyrin. Výskyt toxické hepatitidy je u lidí převážně v rozvojových zemích a v chudých vrstvách, častější je výskyt hepatitidy hospodářských zvířat (37).

Primární hepatom Karcinogenita aflatoxinů se projevuje především indukcí nádoru, vycházejícího z hepatocytů, což jsou funkční buňky jaterního parenchymu. Primární hepatom má také vztah k nosičství viru infekční hepatitidy B. Prodělání virové hepatitidy typu B zvyšuje riziko karcinomu jater přibližně dvacetinásobně. Tento virus je v současné době považován za jeden z prokázaných lidských onkovirů, ovšem k onkogenezi je nutná přítomnost karcinogenní látky, kterou je velice často právě aflatoxin (37).

Reyův syndrom Reyův syndrom je polyetiologický chorobný stav, který může být vyvolaný i některými léky (např. Acylpyrin), jedy, virovou infekcí a snad existuje i dědičná dispozice. Bylo prokázáno, že u mnoha kojenců do 1 roku života (a zvláště do 6 měsíců) krmených umělou výživou je etiologickým faktorem aflatoxin. Onemocnění je charakterizováno rychlým přechodem do těžkého bezvědomí po horečnatém onemocnění s nespecifickými příznaky, které připomínají virózu. V komatu se projeví současné těžké postižení jater a mozku, které je zároveň příčinou smrti (37).

Hyperestrogenismus Pokud se zearalenon s estrogenní aktivitou vyskytuje v potravě (zejména v obilninách a výrobcích z nich), může vyvolat hyperestrogenní syndrom. Je znám především u dobytka, u něhož jsou popsány záněty rodidel, zmetání a poruchy plodnosti u samců (37).

3.6 Fyzikálně chemické podmínky pro růst

Mikroskopické houby jsou do značné míry tolerantní k různým, často i extrémním podmínkám vnějšího prostředí (38).

Teplota Mikromycety jsou schopné růst a množit se v širokém rozmezí teplot od -8 °C do 90 °C. Teplotní optimum představuje rozmezí teplot, při kterém je růst mnohonásobně rychlejší. Pro jednotlivé druhy mikromycet jsou teplotní optima odlišná. U mikroskopických hub se nejedná jen o teplotní optimum a teplotní rozmezí růstu, ale také o teploty, při kterých mohou plísně tvořit mykotoxiny (13, 38). Tak jako u všech mikroorganismů rozlišujeme podle optimální růstové teploty i u mikroskopických hub druhy: - psychrofilní – jejich růst probíhá nejlépe při nízkých teplotách, optimální teplotu mají nižší než 20 °C - mezofilní – rostou v teplotním rozmezí od 5 °C do 45 °C, teplotní optimum se pohybuje kolem 30 °C - termofilní – rostou nejlépe při vyšších teplotách, optimální teplota je 50 až 60 °C (13, 36, 38) 39

Tab. 9. Rozdělení mikromycet podle vztahu k teplotě (podle Tichá, J. 1988)

teplota Plísně minimální optimální maximální Psychrofilní - 8 - 0 °C 10 - 20 °C 25 - 30 °C Mezofilní 5 - 10 °C 20 - 40 °C 40 - 45 °C Termofilní 25 - 40 °C 50 - 60 °C 70 - 80 °C

pH pH je velmi důležitým činitelem, který ovlivňuje jak rozmnožování mikroorganismů, tak i jejich biochemickou aktivitu. Na rozdíl od většiny mikroorganismů, které mohou růst a množit se pouze v určitém rozmezí pH, jsou mikromycety k hodnotám koncentrace vodíkových iontů v substrátu značně tolerantní. Přestože se optimum pH pro většinu mikroskopických hub nachází v rozmezí 5 až 7, rostou tyto mikroorganismy ještě při pH 1,5, ale také při pH 11. Při pH 2 – 3 jsou některé mikromycety schopné produkovat mykotoxiny. V silně kyselém prostředí při pH 0,5 – 2 se množí jen plísně produkující značná množství organických kyselin (13, 16, 38).

Vlhkost Mikromycety jsou schopné využívat vzdušnou vlhkost, proto se vyskytují hlavně ve vlhkém prostředí. Ke klíčení spor je obvykle potřeba vyšší relativní vlhkost než k růstu mycelia. Při optimální teplotě postačuje ke klíčení a růstu plísní nižší relativní vlhkost, při nižší teplotě je třeba vyšší relativní vlhkost (38).

Mikromycety mají ve většině případů schopnost množit se při nižší vodní aktivitě aw (poměr tlaku páry vody nad substrátem ku tlaku páry nad čistou vodou), než mají kvasinky a bakterie, většina roste v rozmezí aw 0,85 až 1,0. Vodní aktivita omezuje také tvorbu mykotoxinů (13, 38).

Vztah ke kyslíku Plísně se řadí mezi aerobní mikroorganismy, které ke svému růstu a množení vyžadují přítomnost molekulárního kyslíku, a proto se vyskytují zejména na povrchu substrátu (38, 39).

Živiny Mikromycety patří k nenáročným a velmi přizpůsobivým mikroorganismům. Využívají různé druhy sacharidů, bílkovin a tuků. Rostou a pomnožují se na nejrůznějších substrátech – surovinách, potravinách a materiálech. Mohou růst nejen na potravinářských surovinách, ale i na lepence, papíru, dřevě, textiliích a výrobcích z plastů, případně i na takových substrátech jako je nafta (38).

3.7 Termorezistence mikromycet

Mikromycety, které mají schopnost odolávat účinkům vyšších teplot, představují ekonomicky i zdravotně významnou skupinu mikroorganizmů. Většina mikroskopických vláknitých hub je velmi citlivá na působení tepla, jejich vegetativní buňky jsou inaktivovány již při záhřevu na 60 °C po dobu 5 – 10 minut. Některé druhy mikromycet vytvářejí hrubostěnné útvary (např. sklerocia), které mohou přežít i záhřev na 85 °C po dobu 5 minut. Všeobecně lze říci, že termorezistence určitých druhů mikroskopických hub se váže k tvorbě pohlavních spor – askospor. Jednotná definice termorezistence mikromycet, stejně jako i vědecky exaktní hranice mezi termorezistentními a termosenzitivními mikromycetami, nebyla dosud stanovena. Odolnost termorezistentních askospor vůči účinkům tepla je variabilní, je závislá na druhu a kmeni mikromycet, na věku kultury, je ovlivňována kultivačním a záhřevným médiem (jeho pH, obsahem sacharidů, lipidů, organických kyselin apod.), růstovými podmínkami atd. Buněčné mechanismy termorezistence nejsou dosud dostatečně objasněny. Všeobecně se může říci, že termorezistence askospor roste s obsahem sacharidů v záhřevném i kultivačním médiu, s věkem kultury, nejvýhodnější je optimální růstová teplota a pH pro daný druh mikromycety, třebaže termorezistence různých kmenů téhož druhu se liší i při stejných kultivačních a záhřevných podmínkách. Askospory některých termorezistentních hub vyžadují pro svoji germinaci tzv. tepelný šok. Tepelnou aktivaci ovlivňuje i koncentrace některých iontů v záhřevném médiu (Na+, Mn2+, Mg2+ a Ca2+) (31). Význam termorezistentních hub je uvažován především z hlediska přípravy tepelně konzervovaných potravin (kompoty apod.), které navíc nelze zahřívat po libovolně dlouhou dobu na libovolně vysokou teplotu. V konzervárenském průmyslu může docházet k nárůstu mycelia ve sklenicích s kompoty a dalšími výrobky, což způsobuje senzorické znehodnocení výrobků. Zároveň mohou být konzumenti ohroženi produkovanými toxiny, které nejsou 41 dosud plně prozkoumány. Další riziko představují termorezistentní houby v možném přímém napadení člověka (37). Termorezistentní houby jsou široce rozšířeny v půdě a následně jsou spojovány s kažením produktů obsahujících ovoce (např. jogurty a zmrzlina), které je snadno kontaminované půdou – jahody, hrozny a další. Vedle ovoce je známo, že askospory rodu Byssochlamys, což je velmi běžně se vyskytující termorezistentní plíseň, se nacházejí v mléce a mléčných výrobcích (1).

3.7.1 Přehled termorezistentních mikromycet

Druhy Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Nesoartorya fischeri, Talaromyces flavus, Talaromyces macrosporus a Eupenicillium brefeldianum jsou nejznámějšími představiteli termorezistentních mikromycet; jejich askospory jsou schopné přežít tepelnou konzervaci běžnou při výrobě např. ovocných šťáv a kompotů. Méně často se vyskytují druhy Byssochlamys verrucosa, Talaromyces striatus, Eupenicillium lapidosum, Aspergillus quadricinctus, Dichotomomyces cejpii (synonymum Talaromyces cejpii), Eupenicillium baarnense, Talaromyces avellaneus, Talaromyces bacillisporus a Talaromyces emersonii (11, 31).

3.7.1.1 Byssochlamys sp.

Druhy rodu Byssochlamys jsou charakteristické absencí kleistotecií, resp. gymnotecií – útvarů, které během vývoje a dozrávání askospor obalují asky. Asky tohoto druhu se vytváří ve shlucích obalených hyalinními hyfami, jsou kulovitého nebo polokulovitého tvaru a obsahují 8 askospor s hladkou stěnou. Askospory jsou schopné přežít záhřev na teplotu 80 – 90 °po dobu 10- ti minut (25, 35).

Druh Byssochlamys fulva (anamorfní stádium Paecilomyces fulvus) Na Malt agaru za 7 až 14 dní kultivace při 30 °C vytváří kolonie s průměrem kolem 90 mm. Na povrchu kolonií jsou makroskopicky viditelné shluky bílých asků, pokryté vločkovitým porostem konidiálního stádia, které zabarvuje kolonie do žlutohnědé barvy. Reverzní strana kolonií má žlutou až hnědou barvu. Kolonie mají sladkou aromatickou vůni, nevytváří se na nich exsudáty. Substrátové mycelium bývá silnější než vzdušné. Asky se 42 objevují po 7 až 10-ti dnech kultivace při 30 °C, při kultivační teplotě nižší než 24 °C se asky netvoří. Askospory mají elipsoidní tvar a jsou nažloutlé barvy. Konidie anamorfního stádia vznikají na septovaných konidioforech, jsou hladké, hyalinní, válcovitého až ovoidního tvaru. Tvoří se odškrcováním z 2 – 3 hladkých fialid umístěných na krátkých metulách, někdy jsou přítomné i jednotlivé fialidy. Konidie jsou převážně v delších řetízcích. Druh Byssochlamys fulva netvoří chlamydospory (35). Druh Byssochlamys fulva má teplotní optimum pro růst při 30 – 35 °C, teplotní minimum okolo 10 °C a teplotní maximum při 45 °C. Má schopnost syntetizovat byssochlamovou kyselinu, která se tvoří pouze za aerobních růstových podmínek a pro morčata má slabě hepatotoxické účinky (16, 25).

Druh Byssochlamys nivea (anamorfní stádium Paecilomyces niveus) Druh Byssochlamys nivea roste v rozmezí teplot 10 – 40 °C, teplotní optimum leží mezi 30 a 35 °C (25). Na sladinkovém agaru po 7 – 10 denní kultivaci při 30 °C vytváří kolonie s průměrem 70 – 90 mm. Na povrchu jsou viditelné bílé vločky asků, překryté hyfami krémové barvy. Starší kolonie vysychají a mají granulovitou strukturu. Reverzní strana kolonií je hnědá až žlutokrémová, mají příjemnou vůni a neprodukují exsudáty. Vegetativní hyfy jsou hyalinní a tenčí než hyfy substrátové (35). Na myceliu se tvoří shluky asků, které nejsou obklopené stěnou typickou pro plodnice jiných zástupců této skupiny hub. Asky mají průhlednou stěnu, která se ve zralosti rozplývá. Obsahují 8 askospor elipsovitého tvaru, hyalinních, hladkých, 4-5,5 x 2,5-3,5 µm velkých. Nepohlavní stádium je charakteristické bohatou tvorbou chlamydospor a někdy také tvorbou štětcovitých konidioforů. Chlamydospory vyrůstají někdy jednotlivě, častěji však v krátkých řetízcích. Jsou jednobuněčné, hruškovitého tvaru a hladké, mají nahnědlou barvu.Jsou mírně termorezistentní. Konidiofory nesou 2 – 3 hladké konidiogenní buňky (fialidy) válcovitého tvaru s protáhlým krčkem, na jejich konci vyrůstají v řetízku konidie, které jsou3-6 µm dlouhé, hladké,kulatého až elipsoidního tvaru, hyalinní až nažloutlé barvy (35, 44).

Oba druhy způsobují kažení konzervovaných potravin v důsledku jejich schopnosti vytvářet termorezistentní spóry, růst při nízkém parciálním tlaku kyslíku a při nízkém pH. Díky velmi malým požadavkům na kyslík mohou růst i pod hladinou tekutin (16, 25).

3.7.1.2 Eupenicillium sp.

Druhy rodu Eupenicillium jsou teleomorfními stádii v životním cyklu některých druhů rodu Penicillium. Rod Eupenicillium vždy produkuje kleistotecia s hladkou stěnou, které mají kulovitý až ovoidní tvar a jsou světlé barvy. Zralá kleistotecia mají velmi tvrdou stěnu, obsahují velmi mnoho osmisporových asků, mají schopnost přežívat několik týdnů až měsíců (35).

Druh Eupenicillium brefeldianum (anamorfní stádium Penicillium dodgei) Na Czapek – Doxově agaru s kvasničným extraktem se tvoří po 7 dnech kultivace při 25 °C radiálně zvrásněné kolonie s nízkým okrajem a průměrem 30 – 40 mm. Mycelium má na okrajích bílou barvu, u čerstvých izolátů je jasně žluté až šedooranžové, s bohatou vrstvou kleistotecií na povrchu. Konidie mají zelené až olivové zbarvení. Někdy se vytváří čiré exsudáty, rozpustná extracelulární barviva se netvoří. Reverzní strana kolonií je zbarvená v různých odstínech žluté. Kleistotecia dozrávají do 2 týdnů, jsou relativně měkká, jejich barva je hnědočervená nebo hnědá. Asky jsou kulaté, askospory mají elipsoidní tvar, s echinulátní nebo jemně podélně zbrázděnou stěnou. Konidiofory anamorfního stádia se tvoří na hyfách vzdušného mycelia, jsou dlouhé, hladkostěnné, nerozšířené, monoverticilátní, někdy s metulami nebo subterminálními fialidami. Ve verticiliu se nachází 2 – 5 fialid s dlouhou kolulou. Konidie jsou kulovitého až elipsoidního tvaru, seskupené v krátkých řetízcích. Kolonie nerostou při kultivaci při 5 °C po dobu 7 dní, při 37 °C po 7 dnech kultivace mají kolonie průměr do 40 mm, bílé mycelium, zřídka se tvoří konidie a kleistotecia. Na sladinkovém agaru rostou kolonie Eupenicillium brefeldianum podobně (35).

3.7.1.3 Neosartorya sp.

Rod Neosartorya zahrnuje 8 druhů a 3 variety. Anamorfní stádia se řadí k rodu Aspergillus. Pět druhů rodu Neosartorya patří do skupiny Aspergillus fumigatus a série Aspergillus fisheri, další dva druhy jsou zařazené do skupiny Aspergillus ornatus. 44

Druh Neosartorya fischeri (anamorfní stádium Aspergillus fischeri) má tři variety – Neosartorya fischeri var. fischeri, Neosartorya fischeri var. glabra a Neosartorya fischeri var. spinosa, které se odlišují hlavně ornamentací askospor. Na Czapek – Doxově agaru s kvasničným autolyzátem po 7 denní kultivaci při 37 °C vytváří kolonie o průměru minimálně 50 – 60 mm. Kolonie mají bílou až bledě žlutou barvu, po 14 dnech jsou pokryté vrstvou zralých kleistotecií. Při 25 °C se tvoří větší množství kleistotecií a konidiální struktury mají zelenomodrou barvu. Při teplotě kolem 37 °C je méně bohatá tvorba kleistotecií a konidiální hlavičky mají olivově šedou barvu. Nejpříznivěji působící teplota pro tvorbu konidiálních struktur je 37 – 40 °C. Substrátové mycelium je bezbarvé, popřípadě až masové barvy. Na sladinkovém agaru rostou kolonie rychle při teplotě 25 i 37 °C. Při 25 °C se opět vydatně tvoří bílá až nažloutlá kleistotecia, aspergilových struktur je méně. Kultivační teplota 37 °C je opět vhodnější pro růst anamorfního stádia mikromycety. Na sladinkovém agaru roste substrátové mycelium bezbarvé až bledě růžové barvy. Kleistotecia se tvoří od středu kolonie v soustředných kružnicových vrstvách. Jsou kulovitého tvaru s dvou až třívrstevným obalem. Po 9 – 12 dnech se z dozrálých kleistotecií uvolňují osmisporové asky. Askospory jsou bezbarvé, elipsoidního až oválného tvaru, obvykle s 2 – 4 ekvatoriálními hřebínky na jinak hladkém povrchu. Konidiální hlavičky aspergilového stádia mají sloupcovitý tvar, asexuální spory se vytváří v řetízcích. Konidiofory jsou různě dlouhé, jsou tenké a bezbarvé. Lahvovité vezikuly mají šedozelenou barvu, do jedné poloviny až tří čtvrtin povrchu jsou porostlé jednou řadou světle až tmavě zelených fialid. Konidie bývají polokulaté, kulaté až elipsoidní, s hladkým až mírně ornamentovaným povrchem (35). Neosartorya fischeri byla popsána jako podmíněný patogen, schopný vyvolat u pacientů s defektem imunity těžké až smrtelné infekce(37).

3.7.1.4 Talaromyces sp.

Druhy rodu Talaromyces jsou charakteristické tvorbou gymnotecií žlutobílé barvy. Anamorfní stádia 16- ti druhů tohoto rodu se řadí k rodu Penicillium, anamorfní stádia dalších druhů náleží k rodům Geosmithia, Merimbla a Paecilomyces. Druh Talaromyces flavus (anamorfní stádium Penicillium dangeardii, synonymum Penicillium vermiculatum) má dvě variety Talaromyces flavus var. flavus a Talaromyces flavus var. macrosporus, které se mezi sebou liší velikostí askospor. 45

Na Czapek – Doxově agaru s kvasničným autolyzátem po 7 dnech kultivace při 25 °C tvoří ploché kolonie s hladkým okrajem a průměrem do 30 mm. Okrajové mycelium má bílou, nažloutlou, pastelově žlutou až slámově žlutou barvu, zřídka bývá červenohnědé. Většina izolátů vytváří gymnotecia a konidiální vrstvu zelenošedé až olivové barvy. Reverzní strana kolonií je žlutá, méně často bývá oranžová, červená nebo hnědá. Na sladinkovém agaru rostou kolonie za stejných kultivačních podmínek rychleji (průměr 30 – 50 mm). Gymnotecia jsou tvořena hustým myceliem, jsou většinou žlutá, někdy jsou růžová až purpurová. Asky se uvolňují ve formě řetízků. Askospory mají žlutou, někdy červenou barvu, jsou elipsoidního tvaru. Konidiofory se vytváří na vzdušném myceliu, jsou hladkostěnné, většinou ukončené biverticilátní (zřídka i monoverticilátní) penicillou. Metuly jsou stlačené, se 4 – 6 jehlicovitými fialidami. Fialidy nesou krátké řetízky hladkostěnných konidií elipsoidního až rožkovitého tvaru (35). Některé druhy rodu Talaromyces jsou schopné produkovat mykotoxiny: Talaromyces stipitatus – duclauxin, talaromycin, botryodiploidin, emodin; Talaromyces wortmannii – rugulosin; Talaromyces flavus – wortmannin, mitorubrin; Talaromyces ohiensis – vermikulin (8).

3.7.2 Mykotoxiny termorezistentních mikromycet

Různé druhy termorezistentních mikroskopických hub jsou schopné produkovat některé z následujících mykotoxinů: brefeldin A (cyanein) a C, Byssotoxin A (asymetrin, variotin), kyselinu byssochlaminovou, eupenifeldin, fischerin, patulin, tremorgenní mykotoxiny (fumitremorgen A a C, penitrem A, verrukulogen), vermikulin, vermicidin a vermistatin (11).

3.8 Výskyt mikromycet

Mikroskopické houby jsou ubikvitárně rozšířené po celém světě, jejich stáří se odhaduje na 300 miliónů let. Díky svému enzymatickému vybavení jsou velmi adaptabilní pro kontaminaci téměř jakéhokoliv substrátu. Jejich velká morfologická rozmanitost a schopnost přizpůsobit se nejrůznějším ekologickým podmínkám umožňuje osídlování řady rozdílných biotopů. Mikroskopické houby se nachází v půdě, ve vzduchu, ve vodě, na 46 rostlinách, surovinách a výrobcích . Půda je jejich hlavním rezervoárem, mají zde účast na rozkladu organických látek a tvorbě humusu (28, 36, 38). Z půdy se mikromycety dostávají do vzduchu. Barviva konidií i endospor tvoří ochranu pro tyto buňky před nepříznivými účinky ultrafialové složky slunečního světla, a proto se vyskytují jako velmi častá vzdušná kontaminace (36). Většina mikromycet se řadí mezi saprofyty, tzn., že jejich zdroj živin představují organické substráty, odumřelá těla rostlin, různé suroviny apod. Některé druhy parazitují na rostlinách a živočiších, určité druhy jsou patogenní pro člověka, zvířata nebo rostliny. Vybrané druhy mikroskopických hub se využívají v potravinářských technologiích při výrobě potravin a nápojů (16, 38, 39).

HOUBY cca 100 000 druhů

Mikroskopické houby 6000 rodů s 64 000 druhy

Mikroskopické houby (Fungi imperfecti) 2600 rodů (+ 1500 synonym) s 15 000 druhy

Mikromycety, kvasinky a Zoopatogenní (antropopatogenní) kvasinkové mikroorganismy mikroskopické houby (150 druhů) v potravinách 62 rodů s 126 druhy (přes 290 produkovaných mykotoxinů)

Obr.7. Kvantitativní výskyt mikroskopických hub v životním prostředí a potravinách (podle: Ostrý, V. 1998)

3.8.1 Systém prevence výskytu vláknitých mikromycet a mykotoxinů v potravinách

Systém prevence výskytu mikromycet a mykotoxinů v potravinách je nejefektivnější a je založen na: Vytváření vhodných podmínek, které vedou k minimalizaci růstu mikromycet a produkci mykotoxinů. Jedná se o ochranu zemědělské produkce a potravin před vysokou vlhkostí a teplotou v souladu s ekonomickými a technickými možnostmi, od producentů zemědělských plodin až ke spotřebitelům (konkrétně pak preventivní opatření spočívají ve snaze zabránit kontaminaci substrátu sporami mikromycet a dále také ve snaze zabránit vyklíčení těchto spor s využitím mikrobiálních překážek). Zajištění zemědělské produkce po sklizni takovým způsobem, aby nedocházelo k sekundární kontaminaci mykotoxiny působením toxinogenních „skladištních“ mikromycet, a to jak ve skladech, distribuční síti, tak i v domácnostech. Provádění důsledné kontroly a dozorové činnosti nad dováženými komoditami, zejména z rizikových oblastí světa (tropy, subtropy), z hlediska výskytu mykotoxinů a toxinogenních vláknitých mikromycet. Podpora veřejného zdraví prostřednictvím výchovy ke správné výživě. Rizikovou skupinou z hlediska expozice mykotoxinům a vzniku pozdních toxických účinků mohou být konzumenti jednostranně zaměřené diety (např. vegetariáni, nemocní celiakií při konzumaci bezlepkových extrudovaných potravin na bázi kukuřice atd.) (21).

Systém prevence výskytu mikromycet a mykotoxinů v potravinách v rámci potravinového řetězce je prováděn následujícím způsobem: Na poli: Používat vhodná agrotechnická opatření (vhodné střídání kulturních plodin, aplikace fungicidů, přizpůsobení zavlažování klimatickým podmínkám, aplikace minerálních hnojiv do půdy). Při sklizni: Dohlížet na vhodnou zralost zrna, provádět vizuální prohlídky za účelem odstranění kontaminovaného zrna a neprovádět sklizeň obilí ve vlhkém období. 48

Při skladování: Suroviny skladovat na chladných a suchých místech, pravidelně suroviny kontrolovat, včetně kontroly teploty a vlhkosti. Při zpracování: Zavést systém HACCP a provádět důsledné kontroly zaměřené především na mykotoxiny a toxinogenní vláknité mikromycety. V krmivu: Zabezpečit zdravotně nezávadné krmivo – a tím zajistit zdravotně nezávadné potraviny živočišného původu (21).

Při nákupu, uchovávání a konzumaci potravin je třeba dodržovat následující doporučení: Nakupovat potraviny plánovitě v množství podle požadavků a potřeby. Nekupovat potraviny se senzorickými změnami (např. plesnivé, nahnilé) ani potraviny, u kterých je podezření z uvedených změn. Nakupovat pouze jakostní potraviny Nedotýkat se rukama nebalených potravin při jejich nákupu (např. pečivo a chleba). Uchovávat potraviny v domácnosti podle doporučení výrobce a podle obecných hygienických zásad. Nekonzumovat plesnivé potraviny, neokrajovat a nevykrajovat je a nevyužívat je ke krmení hospodářských nebo domácích zvířat. Nekonzumovat zplesnivělé kompoty, zavařeniny a mošty. Dodržovat základní hygienická pravidla při manipulování s potravinami v domácnosti. Pravidelně provádět úklid domácnosti (21).

3.9 Význam mikromycet

Význam mikroskopických hub je dán jejich fyziologickými vlastnostmi. Přísně aerobní povaha plísní spolu se širokým enzymovým vybavením umožňuje napadat nejrůznější organický materiál včetně kůže, tkanin, papíru, syntetických barviv, některých plastů apod. Díky své schopnosti využívat vzdušnou vlhkost mohou napadat tyto materiály, jsou- li uložené ve vlhkém prostředí. Nenáročnost na živiny způsobuje, že napadají také vlhké zdi, optiku přístrojů uložených ve vlhku apod. Plísně se dokážou rozmnožovat za poměrně nízké vodní aktivity prostředí, a proto přednostně napadají povrch džemů, marmelád, chleba i 49 různého pečiva, případně i navlhlé suroviny, jako je mouka, skladované obilí, mák, sója a arašídy. Jsou schopné napadat i neporušená rostlinná pletiva (např. zeleniny, měkkého ovoce, skladovaného obilí nebo cukrovky), čímž se otevírá cesta i bakteriálnímu rozkladu. Napadený materiál se tak stává nevhodným pro přípravu potravin. Schopnost rozmnožovat se za velmi nízkého pH umožňuje mikroskopickým houbám uplatnit se i tam, kde většina bakterií není schopna metabolismu (např. na kyselém ovoci, ovocných šťávách, džemech a marmeládách). Mimořádně vysoký negativní význam má tvorba mykotoxinů. Některé plísně jsou pro člověka vysoce patogenní a způsobují infekci u všech exponovaných osob, jiné jsou příležitostné patogeny a způsobují onemocnění jen u osob se sníženou imunitou, inhalací spor mohou vznikat alergická onemocnění dýchacích cest. Některé druhy mikromycet jsou fytopatogenní (30, 36). Pozitivní význam mají plísně jako producenti antibiotik a organických kyselin, enzymů, mastných kyselin, polysacharidů, aminokyselin, vitaminů, pigmentů apod. Uvedené produkty nacházejí široké uplatnění v potravinářském průmyslu. Existuje řada zástupců tzv. kulturní mykoflóry, která se vedle bakterií a kvasinek podílí na cílených technologických postupech při výrobě fermentovaných potravin. Mikromycety se uplatňují i v moderních technologiích při výrobě léků. Vysoce významná je činnost plísní při aerobních postupech čištění odpadních vod. Některé plísně jsou patogenní pro určité druhy hmyzu a využívají se pro výrobu mikrobiálních insekticidů (28, 36).

4 Cíl práce

Cílem této práce je: 1. zmapovat výskyt termorezistentních mikromycet v půdách s různou mírou intenzity obdělávání 2. zhodnotit výskyt termorezistentních mikromycet v půdě v závislosti na půdní vlhkosti

5 Metodika

Postupovalo se v souladu s metodou, která byla použita v předchozích pracích.

5.1 Místa odběru půdních vzorků

Ke sledování výskytu termorezistentních mikroskopických hub v půdě byly vybrány dvě odběrová místa v lesní lokalitě, nacházející se ve zvlněné krajině jihovýchodního okraje Českomoravské vysočiny v nadmořské výšce okolo 340 metrů. Jedná se o les s převahou borového porostu. Dále byly vybrány čtyři odběrová místa na pozemku Střediska pro pěstování léčivých rostlin LF MU.

Odběrová místa v lesní lokalitě 1. Severní svah lesa 2. Jižní svah lesa

Odběrová místa na pozemku Střediska pro pěstování léčivých rostlin LF MU 3. Záhon medvědice lékařské 4. Záhon Papaveraceae 5. Záhon yzopu lékařského 6. Neobhospodařovaný okraj

5.2 Odběr půdních vzorků

Odběr půdních vzorků z daných odběrových míst se uskutečnil v červnu, říjnu, prosinci a březnu. Samotný odběr vzorků lesní půdy byl prováděn z hloubky 10 – 15 cm (po odhrnutí svrchní vrstvy půdy), pomocí kovové lžičky. Odebraná půda (v množství asi 250 g zeminy) se ukládala do igelitových sáčků a do zpracování uchovávala v lednici při teplotě 2- 8 °C. Vzorky zeminy z jednotlivých záhonů na pozemku Střediska pro pěstování léčivých rostlin LF MU byly získány tak, že se z každého záhonu odebralo laboratorní lžičkou z pěti odběrových míst – ze středu a z rohů záhonu – vždy stejné množství zeminy. Tímto způsobem 52 získané směsné vzorky půdy (o hmotnosti asi 250 g) se uložily do igelitových sáčků a byly ihned zpracovávány v laboratoři.

5.3 Stanovení vlhkosti zeminy

U všech odebraných vzorků byla spočítána vlhkost půdy v procentech.

Z každého odebraného vzorku se navážilo 10 g (hmotnost m1 = hmotnost půdy před vysušením). Navážka se uložila do sušárny a nechala při teplotě 80 °C na 90 minut sušit. Půl hodiny před dosušením se teplota v sušárně zvýšila na 100 °C. Potom se půda opět zvážila a zjištěná hmotnost navážky po vysušení (hmotnost m2) zaznamenala. Z takto získaných hodnot se podle níže uvedeného vzorce vypočítala hmotnost vody (hmotnost m) přítomnou v 10 g půdy. Tato hodnota byla vyjádřena v procentech.

Výpočet hmotnosti m: m = m1 – m2 m…..hmotnost vody

m1…..hmotnost půdy před vysušením

m2…..hmotnost půdy po vysušení

Vlhkost zeminy je definována jako podíl hmotnosti vody (m) a hmotnosti vysušeného půdního vzorku (m2) vyjádřený v procentech.

Vypočítané hodnoty byly využity pro sestrojení grafů.

5.4 Zpracování půdních vzorků

Zpracováváno bylo celkem šest vzorků půdy.

Postup: 10 g půdy a 90 ml fyziologického roztoku se smísí v Erlenmeyerově baňce, protřepe se a nechá usadit. Poté se z této baňky napipetuje po 5 ml do zkumavek a ty se temperují 1 hodinu při teplotě 80 °C na vodní lázni. Po tepelném opracování a vychladnutí se napipetuje 2- krát po 1 ml suspenze do sterilních Petriho misek a zalije agarem s bengálskou červení (8 g Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar na 0,250 l destilované vody). Půda na miskách se nechá ztuhnout. 53

10 g půdy a 90 ml připraveného agaru s bengálskou červení se smísí v Erlenmeyerově baňce a řádně protřepe. Potom se baňky umístí do vodní lázně a temperují 1 hodinu při teplotě 80 °C. Po tepelném opracování a vychladnutí se vylije obsah každé baňky do 3 Petriho misek a nechá ztuhnout. Misky označené číslem vzorku a datem se uloží do termostatu a kultivují 30 dní při teplotě 28- 30 °C. Zachycené kolonie se vyočkovávájí na kultivační média, kterými jsou sladinka (40 g ječmenného sladu + 20 g agarových nudlí na 1 l destilované vody) a Czapek – Doxův agar (55 g Czapek – Doxova agaru + 10 g agarových nudlí na 1 l destilované vody). Izolované kmeny se vyočkují na šikmý brokolico – jablečný agar (brokolico – jablečný extrakt 150g + 20 g agarových nudlí na 1 l destilované vody) a kultivujeme v termostatu při 28- 30 °C. Při práci se dodržují hygienické zásady pro práci v mikrobiologické laboratoři.

5.5 Určování mikromycet

Identifikace mikromycet se provádí jen v čisté kultuře.

Makroskopická identifikace

Znaky se zjišťují přímo na Petriho miskách s vhodnou kultivační půdou, protože různé půdy do značné míry mění charakteristické makroskopické i mikroskopické znaky mikroskopických hub. Nejčastěji se používá Czapek – Doxův agar.

Makroskopicky pozorované a popisované znaky: - velikost kolonií - rychlost růstu - povrch kolonií (např. hladký, zvrásněný, sametový, vláknitý, vločkovitý apod.) - barva mycelia (je ovlivněna použitou půdou, osvětlením a stářím kultury) - barva a vzhled reverzní strany kolonií - barva difundující do okolní půdy - přítomnost a barva kapek transpirované tekutiny na vzdušném myceliu - přítomnost zvláštních útvarů viditelných pouhým okem

Mikroskopická identifikace

Pozorují se mikroskopické preparáty zhotovené z čistých kultur.

Zhotovení mikroskopického preparátu Sterilní kličkou nebo preparační jehlou se odebere z povrchu půdy část mycelia ve směru od kraje ke středu (max. velikost 5 mm) a přenese do kapky barviva – laktofenolu (10 g fenolu rozpuštěného v 10 ml destilované vody, 10 g kyseliny mléčné a 20 g glycerolu) na podložním sklíčku. Za použití druhé jehly se oddělí jednotlivá vlákna od sebe. Preparát se překryje krycím sklíčkem a na mírném plameni zahřeje k varu. Lehkým přimáčknutím krycího sklíčka se odstraní vzduch a filtračním papírem odsaje přebytečné barvivo. Preparát se opatrně očistí a zarámečkuje pipetkou – přelitím rozehřáté glycerinželatiny přes okraje krycího sklíčka. Nechá se ztuhnout. Takto připravený preparát má trvanlivost delší než měsíc.

Mikroskopicky pozorované a popisované znaky: - charakter mycelia (tloušťka vláken, přítomnost sept, větvení, struktura, barva) - charakter konidioforu (tvar, tloušťka, délka, tloušťka stěn, způsob větvení) - fruktifikační orgány (tvar, velikost, tloušťka obalů, počet, tvar, povrch askospor) - charakter dalších orgánů (sklerocia atd.)

Na základě pozorování výše zmíněných znaků se podle klíčů určují jednotlivé rody a případně i druhy mikromycet.

6 Materiál

6.1 Kultivační půdy

6.1.1 Půdy používané k identifikaci mikromycet

Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (Hi Media Laboratories) Složení (obsah látek v 1 litru připravené půdy): Sójový pepton 5,0 g Dextróza 10,0 g Fosforečnan draselný 1,0 g Síran hořečnatý 0,5 g Bengálská červeň 0,05 g Agar 15,0 g Příprava: 32 g přípravku se vsype do 1000 ml destilované vody a sterilizuje se v při 121 °C po dobu 15 minut. Poté se nechá ochladit na 45 °C a přidají se 4 ml chloramfenikolu (FD 033) na 1000 ml půdy. Po promíchání se plní do sterilních misek. Použití: DRBC Agar je určený ke kultivaci plísní a kvasinek.

Czapek – Doxův agar (Imuna) Czapek – Doxův agar je vysušený granulát složený z těchto komponent: Obsah látek v 1 litru připravené půdy: Sacharóza 30,0 g Dusičnan sodný 3,0 g Fosforečnan draselný 1,0 g Chlorid draselný 0,5 g Síran železnatý 0,01 g Síran hořečnatý 0,5 g Agar práškový 20,0 g Příprava: 55 g Czapek – Doxova agaru se suspenduje v 1000 ml destilované vody, pro zvýšení tuhosti se přidává 10 g agarové řasy na 1000 ml vody. Po nabobtnání a následné sterilizaci se agar rozlije přibližně po 30ml do Petriho misek. Použití: Czapek – Doxův agar se využívá ke kultivaci kvasinek a plísní.

Sladinový agar Připravuje se v poměru 40 g ječmenného sladu a 20 g agarových nudlí na 1000 ml destilované vody. Používá se ke kultivaci plísní a kvasinek.

Sabouradův agar (podle Fassatiové, 1986) Složení: Glukóza 40 g Mykologický pepton 10 g Agar 15 g Destilovaná voda 1000 ml

Malt agar (Hi Media Laboratoires) Složení: Malt extrakt 30 g Agar 15 g Příprava: 45 g Malt agaru se přidá k 1000 ml destilované vody a povaří do úplného rozpuštění. Poté se sterilizuje 15 minut v autoklávu při 121 °C. Použití: Malt agar se využívá k izolaci a detekci plísní a kvasinek z potravin a jiného materiálu.Může se použít i k uchovávání kultur.

6.1.2 Půdy používané k uchovávání kultur

Sabouraudův konzervační agar (podle Fassatiové, 1986) Složení: Mykologický pepton 10 g Agarová řasa 20 g Voda 1000 ml Použití: Ve formě šikmého agaru se používá k uchovávání kultur.

Brokolico – jablečný agar Složení: Brokolico – jablečný extrakt 150 g Agarová řasa 20 g Voda 1000 ml Použití: Využívá se k uchovávání kultur ve zkumavkách ve formě šikmého agaru. (Při přípravě se vychází z metodiky podle Fassatiové, 1986) 57

6.1.3 Diagnostické půdy k průkazu plísní

Malt extract agar – MEA (podle Pitta, 1997) Složení: Malt extrakt – práškový 20 g Pepton 1 g Glukóza 20 g Agar 20 g Destilovaná voda 1000 ml

Czapek yeast extract agar – CYA (podle Pitta, 1997)

Složení: K2HPO4 1 g Czapek koncentrát 10 ml Roztok stopového kovu 1 ml Kvasničný extrakt – práškový 5 g Sacharóza 30 g Agar 15 g Destilovaná voda 1000 ml

25% glycerol – nitrát agar – G25N (podle Pitta, 1997)

Složení: K2HPO4 0,75 g Czapek koncentrát 7,5 ml Kvasničný extrakt 3,7 g Glycerol 250 g Agar 12 g Destilovaná voda 750 ml

6.2 Pomůcky

Erlenmeyerovy baňky, Petriho misky, mikrobiologické zkumavky, zkumavky, odměrné válce, kádinky, bakteriologické kličky, pipety, mikropipety, podložní sklíčka, krycí sklíčka, kovové zátky, alobal, lékovky, filtrační papír, nůžky, pinzety, laboratorní lžičky, lupa, mikrobiologická destička, předvážky, zápalky, stojan na zkumavky, plynový kahan, vodní lázeň, autokláv, sušárna, termostaty, světelný mikroskop, lampa, mraznička, digestoř 58

7 Výsledky

7.1 Vlhkost půdy

U vzorků půdy získaných z vybraných odběrových míst byly zjištěny následující hodnoty udávající půdní vlhkost v procentech v jednotlivých obdobích.

Tab. 10. Vlhkost půdy v % vzorků získaných z odběrových míst v měsících červen, říjen, prosinec, březen

Vlhkost půdy v % Číslo vzorku červen říjen prosinec březen Průměrná vlhkost 1 28,57 19,05 15,00 18,20 20,21 2 8,70 9,10 11,43 16,67 11,48 3 28,57 18,75 * 18,45 21,92 4 20,00 10,00 * 16,67 15,56 5 25,00 9,10 * 18,80 17,63 6 9,52 12,50 * 18,80 13,61 Průměrná vlhkost 20,06 13,08 13,22 17,93

* v důsledku nízkých venkovních teplot nebylo možné odebrat vzorky zeminy

Vzorek č.1 – severní svah lesa Vzorek č.2 – jižní svah lesa Vzorek č.3 – záhon medvědice lékařské Vzorek č.4 – záhon Papaveraceae Vzorek č.5 – záhon yzopu lékařského Vzorek č.6 – neobhospodařovaný okraj

Graf 1. Vlhkost půdy v % vzorků získaných z odběrových míst v měsících červen, říjen, prosinec, březen

20 vzorek 1 vzorek 2 15 vzorek 3 dy v %

ů vzorek 4 10 vzorek 5 vzorek 6 Vlhkost p 5

0 červen říjen prosinec březen vzorek 1 – severní svah lesa, vzorek 2 – jižní svah lesa, vzorek 3 – záhon medvědice lékařské, vzorek 4 – záhon Papaveraceae, vzorek 5 – záhon yzopu lékařského, vzorek 6 – neobhospodařovaný okraj

Graf 2. Průměrná vlhkost půdy jednotlivých vzorků v %

25,00

20,00 vzorek 1 vzorek 2 15,00 vzorek 3 vzorek 4 10,00 vzorek 5 rná vlhkost v % ě vzorek 6

m 5,00 ů Pr 0,00

vzorek 1 – severní svah lesa, vzorek 2 – jižní svah lesa, vzorek 3 – záhon medvědice lékařské, vzorek 4 – záhon Papaveraceae, vzorek 5 – záhon yzopu lékařského, vzorek 6 – neobhospodařovaný okraj 60

Graf 3. Průměrná vlhkost půdy v jednotlivých měsících v %

20 červen 15 říjen prosinec 10 březen rná vlhkost v % ě m ů 5 Pr

7.2 Zpracování vzorků zeminy

Vzorky zeminy odebrané v měsíci červnu Zpracováním a následnou kultivací půdních vzorků bylo získáno celkem 1468 KTJ. Vzorky zeminy odebrané v měsíci říjnu Zpracováním a následnou kultivací půdních vzorků bylo získáno celkem 1357 KTJ. Vzorky zeminy odebrané v měsíci prosinci Zpracováním a následnou kultivací půdních vzorků bylo získáno celkem 118 KTJ. Vzorky zeminy odebrané v měsíci březnu Zpracováním a následnou kultivací půdních vzorků bylo získáno celkem 1865 KTJ.

Nejčastěji se vyskytující kolonie byly hodnoceny podle makroskopických a mikroskopických znaků a následně přiřazeny do rodů Byssochlamys, Humicola a Aspergillus. Přesnější identifikace nebyla cílem této práce.

Tab. 11. Srovnání počtu získaných KTJ . 10-1 g půdy v jednotlivých odběrových místech v měsících červen, říjen, prosinec a březen

Číslo vzorku červen říjen prosinec březen Celkem 1 280 6 118 18 422 2 13 7 ● 6 26 3 50 443 * 471 964 4 1000 626 * 691 2317 5 116 185 * 550 851 6 9 90 * 129 228 Celkem 1468 1357 118 1865 4808

● nárůst nepočitatelného množství KTJ

* v důsledku nízkých venkovních teplot nebylo možné odebrat vzorky zeminy

Graf 4. Srovnání počtu izolovaných KTJ . 10-1 g půdy v jednotlivých odběrových místech v měsících červen, říjen, prosinec a březen

1000 900 800

700 Vzorek 1 600 Vzorek 2 Počet KTJ 500 Vzorek 3 400 Vzorek 4 Vzorek 5 300 Vzorek 6 200 100 0 červen říjen prosinec březen

Graf 5. Celkový počet izolovaných KTJ . 10-1 g půdy v měsících červen, říjen, prosinec a březen

2000 1800 1600 1400 1200 Počet KTJ 1000 800 600 400 200 0 červen říjen prosinec březen

Graf 6. Celkový počet izolovaných KTJ . 10-1 g půdy v jednotlivých odběrových místech

2500

2000 Vzorek 1 Vzorek 2 1500 Vzorek 3 Počet KTJ Vzorek 4 1000 Vzorek 5 Vzorek 6 500

Graf 7. Srovnání počtu izolovaných KTJ . 10-1 g půdy na severním svahu lesa v měsících červen, říjen, prosinec a březen

300

250

200

Počet KTJ 150

100

0 červen říjen prosinec březen

Graf 8. Srovnání počtu izolovaných KTJ . 10-1 g půdy na jižním svahu lesa v měsících červen, říjen, prosinec a březen

Počet KTJ 15

0 červen říjen prosinec březen

V měsíci prosinci při kultivaci vzorku zeminy z jižního svahu lesa narostlo nepočitatelné množství KTJ. 64

Graf 9. Srovnání počtu izolovaných KTJ . 10-1 g půdy na záhonu medvědice lékařské v měsících červen, říjen, prosinec a březen

500 450 400 350 300 Počet KTJ 250 200 150 100 50 0 červen říjen prosinec březen

V měsíci prosinci nebylo možné v důsledku nízkých venkovních teplot odebrat vzorek zeminy ze záhonu medvědice lékařské.

Graf 10. Srovnání počtu izolovaných KTJ . 10-1 g půdy na záhonu Papaveraceae v měsících červen, říjen, prosinec a březen

1000 900 800 700 600 Počet KTJ 500 400 300 200 100 0 červen říjen prosinec březen

V měsíci prosinci nebylo možné v důsledku nízkých venkovních teplot odebrat vzorek zeminy ze záhonu Papaveraceae. 65

Graf 11. Srovnání počtu izolovaných KTJ . 10-1 g půdy na záhonu yzopu lékařského v měsících červen, říjen, prosinec a březen

600

500

400

Počet KTJ 300

200

100

0 červen říjen prosinec březen

V měsíci prosinci nebylo možné v důsledku nízkých venkovních teplot odebrat vzorek zeminy ze záhonu yzopu lékařského.

Graf 12. Srovnání počtu izolovaných KTJ . 10-1 g půdy na neobhospodařovaném okraji v měsících červen, říjen, prosinec a březen

140

120

100

80 Počet KTJ 60

0 červen říjen prosinec březen

V měsíci prosinci nebylo možné v důsledku nízkých venkovních teplot odebrat vzorek zeminy v místě neobhospodařovaného okraje. 66

Tab. 12: Počet KTJ . 10-1 g půdy v jednotlivých odběrových místech o dané vlhkosti půdy vyjádřené v % v měsíci červnu

Číslo vzorku Vlhkost půdy v % v červnu Počet KTJ 1 28,57 280 2 8,70 13 3 28,57 50 4 20,00 1000 5 25,00 116 6 9,52 9

Graf 13. Závislost počtu KTJ . 10-1 g půdy na půdní vlhkosti v % v měsíci červnu

1000 900 800 700 600 Počet KTJ 500 400 300 200 100 0 28,57 8,70 28,57 20,00 25,00 9,52 Vlhkost půdy v %

Tab. 13: Počet KTJ . 10-1 g půdy v jednotlivých odběrových místech o dané vlhkosti půdy vyjádřené v % v měsíci říjnu

Číslo vzorku Vlhkost půdy v % v říjnu Počet KTJ 1 19,05 6 2 9,10 7 3 18,75 443 4 10,00 626 5 9,10 185 6 12,5 90

Graf 14. Závislost počtu KTJ . 10-1 g půdy na půdní vlhkosti v % v měsíci říjnu

700

600

500

400 Počet KTJ 300

200

100

0 19,05 9,10 18,75 10,00 9,10 12,5 Vlhkost půdy v %

Tab. 14: Počet KTJ . 10-1 g půdy v jednotlivých odběrových místech o dané vlhkosti půdy vyjádřené v % v měsíci prosinci

Číslo vzorku Vlhkost půdy v % v prosinci Počet KTJ 1 15,00 118 2 11,43 ●

● nárůst nepočitatelného množství KTJ

Vzorek č.1 – severní svah lesa Vzorek č.2 – jižní svah lesa

V důsledku nízkých venkovních teplot nebylo možné odebrat půdní vzorky č. 3, 4, 5 a 6.

Graf 15. Závislost počtu KTJ . 10-1 g půdy na půdní vlhkosti v % v měsíci prosinci

250

200

150 Počet KTJ 100

0 15,00 11,43 Vlhkost půdy v %

V měsíci prosinci při kultivaci vzorku zeminy z jižního svahu lesa narostlo nepočitatelné množství KTJ.

Tab. 15: Počet KTJ . 10-1 g půdy v jednotlivých odběrových místech o dané vlhkosti půdy vyjádřené v % v měsíci březnu

Číslo vzorku Vlhkost půdy v % v březnu Počet KTJ 1 18,20 18 2 16,67 6 3 18,45 471 4 16,67 691 5 18,80 550 6 18,80 129

Graf 16. Závislost počtu KTJ . 10-1 g půdy na půdní vlhkosti v % v měsíci březnu

700

600

500

400 Počet KTJ 300

200

100

0 18,20 16,67 18,45 16,67 18,80 18,80 Vlhkost půdy v %

7 Diskuse

Termorezistentní mikromycety představují významnou skupinu mikroskopických hub vyznačující se schopností přežívat po určitou dobu záhřev na 80 °C. Mohou se tedy stát příčinou kažení konzervovaných a nedostatečně tepelně opracovaných potravin. Takto kontaminovaná potravina může následně ohrozit zdravotní stav konzumenta. Půda je primárním zdrojem termorezistentních mikroskopických hub, z něhož se rozšiřují do okolního prostředí. Ke kontaminaci potravin dochází buď přímým kontaktem s půdou (např. jahody) nebo nedodržováním dostatečných hygienických opatření v potravinářských provozech (např. ovocné a mléčné výrobky). Ke sledování výskytu termorezistentních mikromycet v půdě bylo vybráno šest různých odběrových míst, které se lišily mírou intenzity obdělávání. Odběrová místa na severním a jižním svahu lesa představovaly lokality s půdou s minimálními antropogenními zásahy. Vybrané čtyři záhony ve Středisku pro pěstování léčivých rostlin LF MU se lišily svým porostem a stupněm obdělávání. Množství půdních mikroorganismů je závislé na půdní hloubce, proto byly vzorky zeminy odebírány pokaždé ze stejné hloubky 10 – 15 cm. Ze všech vzorků zeminy (každý o hmotnosti 10 g) odebraných ze zvolených míst bylo izolováno celkem 4808 KTJ termorezistentních mikromycet, které přežily záhřev na teplotu 80 °C po dobu 60 minut. Počet izolovaných KTJ termorezistentních mikromycet z půdy severního a jižního svahu lesa byl výrazně nižší než počet izolovaných KTJ termorezistentních mikromycet ze vzorků zeminy z 3 obdělávaných záhonů (záhon medvědice lékařské, záhon Papaveraceae, záhon yzopu lékařského). Ze čtyř odběrových míst Střediska pro pěstování léčivých rostlin LF MU byl získán nejnižší počet KTJ termorezistentních mikromycet z půdy neobhospodařovaného okraje. Nejvyšší počet KTJ termorezistentních mikromycet byl získán ze vzorků zeminy záhonu Papaveraceae. Získané výsledky se do značné míry shodují s výsledky Baldermannové (2), které uvádí ve své práci z roku 1999: nejvyšší počet KTJ termorezistentních mikromycet byl izolován ze vzorků půdy ze záhonu Papaveraceae, nejnižší počet KTJ termorezistentních mikromycet byl získán z půdy neobdělávaného okraje pod záhonem.

Výše zmíněné výsledky naznačují vztah mezi výskytem termorezistentních mikromycet a intenzitou obdělávání půdy. Počty KTJ termorezistentních mikromycet izolované v jednotlivých měsících se výrazně nelišily, nejvyšší počet KTJ byl získán v měsíci březnu. Současně je třeba zdůraznit, že v měsíci prosinci nebylo možné v důsledku nízkých venkovních teplot odebrat vzorky zeminy ze čtyř záhonů ve Středisku pro pěstování léčivých rostlin LF MU v Brně. Tím dochází k určitému zkreslení poměru mezi celkovými počty KTJ termorezistentních mikromycet získanými z odběrových míst na severním a jižním svahu lesa a celkovými počty KTJ izolovaných ze vzorků půdy z jednotlivých záhonů. Obecně platí, že půdní vlhkost ovlivňuje přítomnost mikroorganismů v půdě – nízká půdní vlhkost má negativní vliv na výskyt půdních mikroorganismů. Tento vztah naznačují pouze výsledky získané ze vzorku půdy neobhospodařovaného okraje – s narůstající vlhkostí půdy se zvyšovaly i počty izolovaných KTJ termorezistentních mikromycet. Nejvyšší průměrná půdní vlhkost byla zjištěna ve vzorku půdy ze záhonu medvědice lékařské, nejnižší průměrná půdní vlhkost byla zjištěna z půdy z jižního svahu lesa. Měsícem s nejvyšší průměrnou vlhkostí půdy byl červen, nejnižší průměrná vlhkost byla zaznamenána v měsíci říjnu.

8 Závěr

Termorezistentní mikromycety jsou schopné přizpůsobit se i značně nepříznivým podmínkám prostředí. Jejich zárodky mohou přežívat vysoké teploty a zároveň také vyšší koncentrace běžně používaných konzervačních látek a způsobovat tak kažení různých potravin a výrobků. Současně mohou produkovat toxické, často karcinogenní, sekundární metabolity. Tím dochází nejen k významným ekonomickým ztrátám, ale může být ohrožen i zdravotní stav konzumentů. Původním zdrojem termorezistentních mikromycet je půda, z níž se zárodky termoretistentních mikromycet mohou dostávat do okolí. Kultivací všech vzorků půdy ze zvolených šesti odběrových míst bylo získáno celkem 4808 KTJ termorezistentních mikromycet, které dokázaly přežít záhřev na 80 °C po dobu 60 minut. Nejnižší počty KTJ byly izolovány z půdy s minimálními antropogenními zásahy, nejvyšší počty KTJ byly získány z půdy záhonu se značnou intenzitou obdělávání. Důležitou roli v ochraně před termorezistentními mikroskopickými houbami a produkovanými toxiny má prevence jejich výskytu v potravinách potravinových surovinách. Jedná se především o dodržování hygienických zásad při zpracování ovoce a zeleniny, používání vhodných technologií pro zpracování a uchovávání potravin a zejména vyloučení kontaminovaných potravin z jídelníčku člověka, ale i ostatních živočichů, v jejichž těle by se mohly toxiny kumulovat a dostávat se tak opětovně do potravního řetězce člověka.

10 Seznam použité literatury

1. AYDIN, A. – ULUSOY, B. H. – ERGUN, O. A survey on heat-resistant moulds in heat treated milk, milk products and fruit juices. Archiv fur lebensmittelhygiene, 2005, vol. 56, no. 3, s. 58-60. 2. BALDERMANNOVÁ, A. Termorezistentní mikroskopické houby, jejich význam a ochrana proti nim, Diplomová práce, Brno: Pedagogická fakulta MU, 1999, 85 s. 3. BEDNÁŘ, M. – SOUČEK, A. – VÁVRA, J. Lékařská speciální mikrobiologie a parazitologie. Praha: Triton, 1994, 226 s. ISBN 80-901521-4-7. 4. BETINA, V. Mykotoxíny, chémia – biológia – ekológia. 1.vyd. Bratislava: Alfa, 1990, 288 s. 5. DE BELLIS, T. Plant community influences on soil microfungal assemblages in boreal mixed-wood forests. Mycologia, 2007, vol. 99, no. 3, s. 356-367. 6. FASSATIOVÁ, O. Moulds and filamentous fungi in technical microbiology. Amsterdam: Elsevier, 1986, 233 s. ISBN 0-444-99559-5. 7. FASSATIOVÁ, O. Plísně a vláknité houby v technické mikrobiologii (Příručka k určování). 1.vyd. Praha: SNTL, 1979, 240 s. 8. FRISVAD, J. C. et al. Chemotaxonomy of the genus Talaromyces. Antonie van Leewenhoek, 1990, vol. 57, no. 3, s. 179-189. 9. GAREIS, M. Mycotoxins nad risk assessment in EU. In SÝKOROVÁ, S. – CHVÍLOVÁ, M. Mykotoxíny 2007. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2007, s. 3. ISBN 978- 80-97011-06-5. 10. GRUNDA, B. Lesnická pedologie a mikrobiologie lesních půd. Příručka pro cvičení. 1.vyd. Brno: Vysoká škola zemědělská, 1992, 72 s. 11. HOŘÁKOVÁ, M. Přítomnost a toxicita termorezistentních plísní v léčivých bylinách experimentální botanické zahrady LF MU Brno, Bakalářská práce, Brno: Lékařská fakulta MU, 1999, 47 s. 12. HREŠKO, M. – HRNČIARIKOVÁ, E. Prítomnosť mykotoxínov v potravinách rastlinného a živočišného pôvodu (Január – september 2007). In SÝKOROVÁ, S. – CHVÍLOVÁ, M. Mykotoxíny 2007. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2007, s. 63-69. ISBN 978-80-97011-06-5. 74

13. HRUBÝ, S. – TUREK, B. Mikrobiologická problematika ve výživě. 1.vyd. Brno: Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1996, 145 s. ISBN 80-7013-232-9. 14. JELÍNEK, J. – ZICHÁČEK, V. Biologie pro gymnázia. Olomouc: Nakladatelství Olomouc, 1998, 551 s. ISBN 80-7182-070-9. 15. KINCL, M. – KUBICOVÁ, S. – ZELINKA, J. Základy rostlinné výroby pro učitele. Ostrava: Pedagogická fakulta, 1987, 236 s. 16. KLABAN, V. Ilustrovaný mikrobiologický slovník. 1.vyd. Praha: Galén, 2005, 654 s. ISBN 80-7262-341-9. 17. KOMPRDA, T. Obecná hygiena potravin. 1.vyd. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2004, 145 s. ISBN 80-7157-757-X. 18. LANÍK, J. – HALADA, J. Kniha o půdě 1. Půda a rostlina. 1.vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství, 1960, 255 s. 19. LEJDAROVÁ, D. Výskyt termorezistentních mikromycet v půdě a jejich toxické působení, Diplomová práce, Brno: Lékařská fakulta MU, 2002, 132 s. + příloha. 20. MALÍŘ, F. aj. Mycotoxins and possible bioterrorism. In SÝKOROVÁ, S. – CHVÍLOVÁ, M. Mykotoxíny 2007. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2007, s. 28-38. ISBN 978-80-97011-06-5. 21. MALÍŘ, F. – OSTRÝ, V. aj. Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. 1.vyd. Brno: Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů, 2003, 349 s. ISBN 80-7013-395-3. 22. MILLIGAN, C. The occurence of Fusarium mycotoxins in food processing and methods of analysis. In SÝKOROVÁ, S. – CHVÍLOVÁ, M. Mykotoxíny 2007. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2007, s. 23-25. ISBN 978-80-97011-06-5. 23. MINISTERSTVO ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ ČR. Definice, složení a význam půdy. Env.cz [cit. 30. dubna 2008] Dostupné na World Wide Web: http://www.env.cz/AIS/web-pub.nsf/$pid/MZPKHFDQGJEB/$FILE/Definice.pdf 24. MINISTERSTVO ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ ČR. Taxonomický klasifikační systém půd ČR. Env.cz [cit. 30. dubna 2008] Dostupné na World Wide Web: http://www.env.cz/AIS/web- pub.nsf/$pid/MZPKHFDQHDYJ/$FILE/taxonomicky_klasifikacni_system_pud_v_cr.doc 25. MOUCHACCA, J. Heat tolerant fungi and applied research: Addition to the previously treated group of strictly thermotolerant species. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007, vol. 23, no. 12, s. 1755-1770. 26. NOVÁK, V. Jak se tvoří a mění půda. 1.vyd. Praha: Orbis, 1953, 26 s. 75

27. OSTRÝ, V. aj. Ochratoxin A, ochratoxinogenní plísně a potraviny – nové poznatky. In SÝKOROVÁ, S. – CHVÍLOVÁ, M. Mykotoxíny 2007. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2007, s. 11-22. ISBN 978-80-97011-06-5. 28. OSTRÝ, V. Vláknité mikroskopické houby (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. 1.vyd. Praha: Státní zdravotní ústav, 1998, 20 s. ISBN 80-7071-102-7. 29. OSTRÝ, V. – ŠKARKOVÁ, J. Metodické doporučení k mikrobiologickému zkoušení potravin a pokrmů. Kultivační metoda průkazu aflatoxinogenních mikromycetů (plísní) Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus v potravinách a pokrmech. Praha: Státní zdravotní ústav, 2003, 28 s. 30. PEUTHERER, J. F. – SLACK, R. C. B. – GREENWOOD, D. Lékařská mikrobiologie (Přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita, laboratorní diagnostika a epidemiologie). 1.vyd. Praha: Grada, 1999, 686 s. ISBN 80-7169-365-0. 31. PIECKOVÁ, E. Termorezistentní mikromycety a požívatiny. Chpr.szu.cz. 2008-02-08.

[cit. 26. dubna 2008] Dostupné na World Wide Web:

http://www.chpr.szu.cz/zprávy/P199/Priloha99.htm

32. PITT, J. I. – HOCKING, A. D. Fungi and food spoilage. Cambridge: University Press, 1997, 593 s. ISBN 0-41255-460-7. 33. RŮŽEK, L. – VOŘÍŠEK, K. Vybrané kapitoly z pedologie a mikrobiologie. 1.vyd. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, Agronomická fakulta, Katedra mikrobiologie a biotechnologie, 2003, 151 s. ISBN 80-213-1064-2. 34. SABATER-VILAR, M. et al. Patulin produced by an Aspergillus clavatus isolated from feed containing malting residues associated with a lethal neurotoxicosis in cattle. Mycopathologia, 2004, vol. 158, no. 4, s. 419-426. 35. SKALNÍKOVÁ, H. Toxicita termorezistentních mikromycet izolovaných z čajů, Bakalářská práce, Brno: Lékařská fakulta MU, 1998, 69 s. + příloha. 36. ŠILHÁNKOVÁ, L. Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Praha: Academia, 2002, 363 s. ISBN 80-200-1024-6. 37. ŠIMŮNEK, J. Plísně a mykotoxiny. Brno, říjen 2004. [cit. 26. dubna 2008] Dostupné na World Wide Web: http://www.med.muni.cz/dokumenty/pdf/plisne_a_mykotoxiny.pdf 38. TICHÁ, J. Mikroorganismy a jiní škůdci v mlýnskopekárenském průmyslu a ochrana proti nim. 1.vyd. Praha: Státní nakladatelství technické literatury, 1988, 151 s. 39. TOMÁNKOVÁ, E. – RADA, V. – KILLER, J. Potravinářská mikrobiologie. 1.vyd. Praha: Česká zemědělská univerzita v Praze, 2006, 168 s. ISBN 80-213-1583-0. 76

40. TRUSKOVÁ, I. Zdravotné aspekty mykotoxínov. In SÝKOROVÁ, S. – CHVÍLOVÁ, M. Mykotoxíny 2007. Praha: Výzkumný ústav rostlinné výroby, 2007, s. 26-27. ISBN 978-80-97011-06-5. 41. VOTAVA, M. aj. Lékařská mikrobiologie speciální. Brno: Neptun, 2003, 495 s. ISBN 80- 902896-6-5. 42. VRBA, V. – HULEŠ, L. Humus – půda – rostlina (2) Humus a půda. Biom.cz[online]. 2006-11-14. [cit. 26. dubna 2008] Dostupné na World Wide Web: http://biom.cz/index.shtml?x=1933368. ISSN 1801-2655. 43. http://www.apic-kraj.cz/e-learning/chapter.asp?id=3&courseid=3 44. http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/bys.htm

Příloha I:

Použité symboly a zkratky

AIDS Acquired immune deficiency syndrome – Syndrom Získané Imunodeficience DNA Deoxyribonucleic acid – Deoxyribonukleová kyselina HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point – Analýza nebezpečí a kritické kontrolní body IARC International Agency for Research on Cancor – Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations – Organizace Spojených národů pro výživu a zemědělství RNA Ribonucleic acid – Ribonukleová kyselina USA United States of America – Spojené státy americké WHO World Health Organization – Světová zdravotnická organizace

Poznámka: V seznamu nejsou uvedeny symboly a zkratky všeobecně známé nebo používané jen ojediněle s vysvětlením v textu.