UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO . DIVISIÓN DE CIENCIAS FORESTALES

ANATOMÍA Y FISIOLOGÍA DE

LA SEMILLA DE TEJORUCO “Genipa americana L.” DE

GUERRERO .

TESIS PROFESIONAL

PRESENTA ERICA VICENTE RIVERA

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO FORESTAL

TUTOR Ing. JOSÉ RICO CERDA

CHAPINGO, EDO. MÉXICO, DICIEMBRE 2019

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AGRADECIMIENTOS

Mi profundo agradecimiento a la Universidad Autónoma Chapingo, a la División de Ciencias Forestales por permitirme formarme en ella, haberme brindado tantas oportunidades y por el conocimiento adquirido en estos años.

Quiero expresar un sincero agradecimiento a mi Director de Tesis, por sus consejos, motivación, por la dirección y el apoyo brindado para culminar este trabajo, a el Dr. Dante A. Rodríguez, a la M. C. Marìa Sol Robledo, al Dr. Josè A.Gil Vera, por brindarme sus conocimientos, orientación y atención a mis consultas sobre metodología en la investigación, y por el material facilitado. Agradezco a la Biòl. Lucina Díaz, por brindarme su amistad, conocimientos y de gran apoyo en momentos difíciles.

Así mismo agradezco la asesoría técnica en la realización de esta tesis, al Lab. Gerardo Mendoza, al Biòl. Leopoldo Rosas, al Ing. Mario Iván Venegas y la aportación de los colegas Natalia Hernandez y Gabriel Pintor.

Pero, sobre todo, gracias a mis padres Manuel y Altagracia, a mis hermanos Manuel y Rocio, por el apoyo vital, la confianza, los ánimos y la energía que me ofrecen de seguir conquistando nuevas metas. Así mismo, agradezco profundamente a mis tíos, Ricardo y Artemia, por todo su apoyo y ejemplos de lucha, constancia y perseverancia. Agradezco profundamente a mi esposo y a mi hijo, por la paciencia, comprensión y solidaridad para culminar este proyecto.

A mis amigos, porque cada uno de ellos han dejado una huella importante y me han prestado un apoyo moral.

Finalmente, a todos los que formaron parte de manera directa e indirecta en esta investigación, muchas gracias, sin su apoyo no habría sido posible la culminación y por eso, este trabajo es también el suyo.

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DEDICATORIA

A Dios, por darme fortaleza, salud e inspiración.

A mis padres, por apoyarme y darme la mejor herencia que me pueden dar, el estudio y los valores; pero, en especial a mi madre por su incansable ayuda en todo momento, por los consejos de perseverancia y sobre todo por confiar y creer en mí.

A mis hermanos, Manuel y Rocio, porque gracias a ellos la vida es más divertida.

A mi pequeño Max, por acompañarme desde el inicio hasta el final, por convertirse en mi mayor inspiración y a mi querido Wilbert por alegrar cada uno de mis días.

En general, este trabajo, se lo dedico con mucho cariño aquellas personas que me ayudaron a cumplir esta meta.

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ÍNDICE GENERAL PAG. 1. INTRODUCCIÓN ...... 16 2. OBJETIVOS ...... 18 3. HIPÓTESIS ...... 18 4. REVISIÓN DE LITERATURA ...... 18 4.1 Ubicación de la semilla en el Reino Plantae ...... 18 4.1.1 La semilla...... 20 4.1.2 Las partes de la semilla ...... 21 4.2 Importancia de la conservación y análisis de semillas...... 22 4.3 Distribución de la familia Rubiaceae ...... 23 4.3.1 Tejoruco (Genipa americana L.) ...... 23 4.3.2 Taxonomía ...... 24 4.3.3 Distribución ...... 24 4.3.4 Vegetación asociada ...... 26 4.3.5 Características botánicas...... 27 4.3.6 Usos e importancia ...... 31 4.4 Colorantes naturales ...... 32 4.5 Descripción de Genipina ...... 35 5. MATERIAL Y MÉTODO ...... 37 5.1 Recolección de frutos ...... 37 5.2 Etapa I ...... 39 5.2.1 Pureza ...... 39 5.2.2 Peso ...... 39 5.2.3 Contenido de humedad ...... 39 5.2.4 Pruebas de viabilidad ...... 40 5.2.5 Prueba de germinación ...... 41 5.3 Etapa II ...... 42 5.4 Etapa III ...... 42 5.4.1 Cortes con micrótomo manual...... 42 5.4.2 Prueba de Tinción...... 43

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5.4.3 Preparación y fijación de las semillas en parafina ...... 44 5.4.4 Lavado y Deshidratación ...... 44 5.4.5 Procesador Automático de Tejidos ...... 44 5.4.6 Inclusión en Parafina ...... 45 5.4.7 Microtomía ...... 46 5.4.8 Adhesión a portaobjetos ...... 47 5.4.9 Tinción de corte ...... 49 5.4.10 Montaje permanente ...... 50 5.4.11 Identificación y observación en microscopio ...... 50 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 52 6.1 Datos de la recolección de frutos ...... 52 6.2 Análisis de semillas de Genipa americana L...... 57 6.2.1 Pureza ...... 57 6.2.2 Peso ...... 59 6.2.3 Contenido de humedad ...... 60 6.2.4 Pruebas de viabilidad ...... 62 6.2.5 Prueba de germinación ...... 64 6.3 Estructura del fruto de Genipa americana L...... 68 6.4 Estructura externa de la semilla de Genipa americana L...... 68 6.5 Pruebas de tinción ...... 71 6.5.1 Sudan III ...... 71 6.5.2 Azul de Toluidina ...... 73 6.5.3 Safranina O ...... 74 6.5.4 Lugol ...... 75 6.5.5 Azul de Bromotimol ...... 76 6.6 Preparación y adhesión de cortes a portaobjetos ...... 76 6.7 Tinción de cortes en parafina ...... 79 6.7.1 Pruebas de tiempo de tinción...... 79 6.7.2 Tinción de cortes ...... 79 6.8 Anatomía de la semilla ...... 81 6.9 Localización de la genipina mediante fluorescencia ...... 88

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7. CONCLUSIONES ...... 91 8. RECOMENDACIONES Y/O SUGERENCIAS ...... 92 9. LITERATURA CITADA ...... 93 10. FUENTES CONSULTADAS ...... 100 11. ANEXOS ...... 101 11.1 Figuras ...... 101

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ÍNDICE DE FIGURAS PÁG.

Figura 1. Estados de la República Mexicana, donde se distribuye G. americana L...... 25 Figura 2. Áreas de distribución de Genipa americana L., en América...... 25 Figura 3. Fuste de Genipa americana L...... 27 Figura 4. Hojas de Genipa americana L...... 28 Figura 5. Flor de Genipa americana L...... 29 Figura 6. Fruto de Genipa americana L...... 30 Figura 7. Semillas húmedas de Genipa americana L ...... 31 Figura 8. Equipo montado sobre una mesa de apoyo. A) micrótomo manual sujetado por un brazo de sujeción. B) Platina de deslizamiento...... 43 Figura 9. Representación de los pasos consecutivos que se requieren para obtener: A) Extracción de las semillas del fruto. B) Lavado y deshidratación. C) Procesador automático de tejidos. D) Inclusión en parafina. E) Cubo de parafina solida con la semilla en el centro. F) soportes de madera con los cubos de parafina. G) Cortes histológicos. H) Adhesión en portaobjetos...... 48 Figura 10. Árbol de G. americana L., en el pueblo de Santa Cruz del Rincón. A) Árbol joven de Tejoruco. B) Follaje poco abundante. C) Hoja inmadura de la especie ...... 53 Figura 11. Árbol de G. americana L., en el pueblo de Ocotito. A) Fuste de la especie de color gris claro y manchas blancas en las ramas. B) Presencia de follaje abundante. C) Los frutos se encuentran en los extremos de las ramas. D) Hojas, flor y fruto. E) Flor de tejoruco...... 55 Figura 12. Prueba de viabilidad utilizando el método de flotación. A) Lote 1. B) Lote 2 ... 63 Figura 13: A) Tinción de las semillas de G. americana L. con la prueba de viabilidad con sales de tetrazolio. B) del lado izquierdo se observa la actividad bioquímica presente en la semilla, indicando latencia, mientras que en el lado derecho no se muestra ninguna reacción...... 64 Figura 14. Representación gráfica del porcentaje de germinación de G. americana L., de cada repetición de cada Lote...... 65 Figura 15. Diferencia en la capacidad germinativa entre Lote 1 y 2 de G. americana L. ... 67

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Figura 16. Corte trasversal y longitudinal del fruto de G. americana L. Exocarpo (ex). Semilla (s). Mesocarpio y endocarpio (me)...... 68 Figura 17. Vista superficial de la semilla hidratada de G. americana L...... 69 Figura 18. Vista superficial de la semilla de G. americana L., sin tricomas. A) apreciando forma. B-C) color y textura de esta...... 69 Figura 19. Vista superficial de la semilla de G. americana L, en etapa de germinación; AB) abertura de la testa o micrópilo (Mc). C) Corte tangencial de la diáspora de la misma especie, mostrando la próxima emergencia de la radícula (rd)...... 70 Figura 20. Vista superficial de la semilla de G. americana L, en etapa de germinación; con la cicatriz o hilo (H) en la testa, que señala el desprendimiento del funículo con la placenta...... 71 Figura 21. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Sudan III durante 30 segundos para el lado izquierdo y 10 segundos para el derecho. Tricomas (tc). Células del endospermo (ce). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x...... 72 Figura 22. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Azul de Toluidina durante 30 segundos para el lado izquierdo y 10 segundos para el derecho. Testa (t). Tricomas (tc). Células del endospermo (ce). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x...... 73 Figura 23. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Safranina O durante 1 minuto para el lado izquierdo y 30 segundos para el derecho. Celulas de la testa (ct). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x...... 74 Figura 24. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Lugol durante 1 minuto para el lado izquierdo y 30 segundos para el derecho. Amiloplastos (ap). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x...... 75 Figura 25. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., A) Sección teñida con el colorante Azul de Bromotimol durante 1 minuto. B) Corte testigo. Objetivo 5x...... 76 Figura 26. Proceso en serie de la tinción de los cortes de semilla de G. americana L. A) Baño en xilol. B) Alcohol al 100%. C) Alcohol al 96%. D) Alcohol al 50%. E) Safranina O. F) Agua destilada. G) Alcohol al 70%. H) Alcohol al 50%. I) Alcohol al 30%. J) Agua

10 destilada K) Azul de Toluidina. L) Agua destilada. M) Alcohol al 96%. N) Alcohol al 100%. O) Xileno...... 80 Figura 27. Corte transversal de G. americana L. Principales componentes que constituyen la semilla: testa (t), endospermo (ed) y embrión (e). Objetivo 5x...... 82 Figura 28. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. La testa consta: tricomas (tc), capa de esclereidas (ce), macroesclereidas (me) braquiesclereidas (be) y tegmen (tg). Objetivo 40x...... 83 Figura 29. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L.(endospermo). Pared celular (pc), vacuola (v), núcleo (n), cromoplasto (cm). A) Objetivo 40x. B) Objetivo 100x...... 84 Figura 30. Corte longitudinal de la semilla de G. americana L. Principales partes, cotiledones (c), yema apical (ya), tallo embrionario (te), radícula (rd). Se encuentra rodeado por endospermo (ed) y una capa protectora testa (t). Objetivo 5x...... 85 Figura 31. Corte longitudinal de la semilla de G. americana L. Principales partes del embrión, cotiledones (c), procambium (p), yema apical (ya), protodermis (ep), sistema vascular primario (svp). Objetivo 20x...... 86 Figura 32. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L., (embrión). Profase (pr), metafase (mt), anafase (an) y telofase (tf). Objetivo 40x...... 87 Figura 33. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. Fluorescencia en los cortes utilizando Naranja G., Los filtros utilizados en A-B es azul, C-D rojo y E-F verde. A- C-E-F) Objetivo 4x. B-D) Objetivo 10x ...... 89 Figura 34. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. Fluorescencia en los cortes utilizando Rodamina 6G., campo claro para A-B, Los filtros utilizados en C-D azul y E-F verde. A-B-C-D-E) Objetivo 4x. E) Objetivo 10x...... 90 Figura 35. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. Fluorescencia en los cortes utilizando Rodamina 6G., el filtro utilizado es verde. A) Objetivo 20x. B) Objetivo 40x...... 91 Figura 36. Frutos de inmaduros en agua de Genipa americana L., colectados en Santa Cruz del Rincón, municipio de Malinaltepec, Guerrero...... 101 Figura 38. Lavado de las semillas de G. americana L...... 101

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Figura 37. Etapas de la maduración del fruto de G. americana L., colectados en Ocotito, Chilpancingo de Bravo...... 101 Figura 39. Semillas de Genipa americana L., pertenecientes al Lote 2. colectados en Ocotito, Chilpancingo de Bravo...... 102 Figura 40. Lote 1 de las semillas en una cámara de ambiente controlado...... 102 Figura 41. Cortes en fresco de la semilla de G. americana L., con micrótomo manual. ... 102 Figura 42. Prueba de tinción de la semilla en fresco con Azul de Toluidina...... 102 Figura 43. Semillas de G. americana L. metidas en capsulas de aluminio para posteriormente colocarlas dentro del Procesador Automático de Tejidos LEICA TP 1020...... 102 Figura 44. Inclusión en parafina de las semillas de G. americana L...... 102 Figura 45. A) Bloques de parafina. B) Cortes en micrótomo rotatorio. C) Materiales para la adhesión de cortes a portaobjetos...... 102

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ÍNDICE DE CUADROS PÁG.

Cuadro 1. Clasificación de plastidios...... 34 Cuadro 2. Información sobre Genipina...... 35 Cuadro 3: Orden del grado de alcohol y parafina en el Procesador de Tejidos...... 45 Cuadro 4: Protocolo de procesamiento de muestras de G. americana L., para la desparafinación, hidratación y tinción de los cortes...... 50 Cuadro 5: Información de los árboles en los que fueron colectados los frutos del primer lote de semillas G. americana L...... 52 Cuadro 6: Información del árbol en el que fueron colectados los frutos del segundo lote de semillas de G. americana L...... 53 Cuadro 7. Datos de los frutos del Lote 1...... 57 Cuadro 8. Datos de los frutos del Lote 2...... 58 Cuadro 9. Prueba de pureza de las semillas con respecto al fruto de G. americana L...... 59 Cuadro 10: Obtención de la cantidad de semillas que existen por kilogramo...... 59 Cuadro 11. Contenido de humedad en ambos lotes...... 61 Cuadro 12. Contenido de humedad y procesos que acontecen a la semilla...... 62 Cuadro 13. Porcentajes de viabilidad correspondientes a cada prueba...... 63 Cuadro 14. Porcentaje de germinación por repetición en cada Lote...... 65 Cuadro 15. Número de ensayos para la obtención de cortes completos hasta el procedimiento de adhesión a portaobjetos...... 77 Cuadro 16. Tiempos experimentados para obtener un balance de tinción entre los dos colorantes elegidos...... 79

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RESUMEN Se realizó un estudio para describir la anatomía, estructura y evaluar la viabilidad y germinación de tejoruco, Genipa americana L., así como identificar en qué parte de la semilla se localiza el pigmento genipina, se usaron dos lotes de semillas, uno de Santa Cruz del Rincón, Malinaltepec y otro de Ocotito, Chilpancingo de los Bravo, ambos del estado de Guerrero, colectados el 26 de marzo y 8 de septiembre de 2018 respectivamente.

Se realizaron análisis físicos como peso, pureza, contenido de humedad y pruebas de germinación. Esta última se realizó en una cámara de ambiente controlado con 12 horas de luz a 25°C y 12 horas de oscuridad con 20°C, el criterio utilizado fue el tamaño de la radícula. Los resultados obtenidos demuestran que la longevidad de la semilla fue variable, ya que se obtuvo una de germinación del 31.75% de Santa Cruz del Rincón y el 80.5% en aquellas provenientes de Ocotito.

El fruto es una baya globosa con olor característico, la semilla presenta una cubierta protectora, delgada, color amarillo ocre y textura ligeramente rugosa. Se usaron colorantes para contrastar las estructuras y se elaboraron preparaciones permanentes y temporales por medio de técnicas histológicas. Para la tinción de las preparaciones estuvieron sumergidas en componentes para su desparafinación, hidratación y tinción en diferentes tiempos, el montaje permanente se realizó utilizando resina sintética y resguardado en un horno de convección a 45°C.

Se hicieron observaciones de las preparaciones en microscopio de campo claro y también en un microscopio de fluorescencia, en ambos se identificó la testa, los tejidos nutricios como el endospermo y los cotiledones; se reconoció el embrión constituido por el eje primario o tallo embrionario, el epicótilo con la yema apical, el hipocótilo en contacto con la radícula. Con el objetivo de mayor aumento se observó la protodermis, el procambium, fases mitóticas y el sistema vascular primario.

Las preparaciones para microscopía de fluorescencia fueron temporales y se utilizaron diferentes colorantes como Naranja G y Rodamina 6G. Fueron observadas mediante el filtro verde del microscopio de fluorescencia compuesto, se identificó que el pigmento genipina se encuentra en el endospermo, en las zonas cercanas a la cubierta seminal.

Palabras clave: Genipa americana L., tejoruco, germinación, fluorescencia, anatomía.

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SUMMARY

A study was carried out to describe the anatomy, structure and to evaluate the viability and germination of Tejoruco, Genipa americana L., as well as to identify in which part of the seed in which part of the seed the genipine pigment is located, two batches of seeds, one from Santa Cruz del Rincón, Malinaltepec and another from Ocotito, Chilpancingo de los Bravo, both from the state of Guerrero, collected on March 26 and September 8, 2018 respectively.

Physical analyzes such as weight, purity, moisture content and germination tests were performed. The latter was performed in a controlled environment chamber with 12 hours of light at 25 ° C and 12 hours of darkness at 20 ° C, the criterion used was the size of the radicle. The results obtained show that the longevity of the seed was variable, since a germination of 31.75% of Santa Cruz del Rincón and 80.5% was obtained in those from Ocotito.

The fruit is a globose berry with a characteristic smell, the seed has a protective cover, thin, yellow ocher and slightly rough texture. Dyes were used to contrast the structures and permanent and temporary preparations were made by means of histological techniques. For staining the preparations were immersed in components for dewaxing, hydration and staining at different times, permanent assembly was performed using synthetic resin and protected in a convection oven at 45 ° C.

Observations of the preparations were made in a light field microscope and also in a fluorescence microscope, in both the testa, nutritional tissues such as the endosperm and cotyledons were identified; the embryo constituted by the primary axis or embryonic stem, the epicotyl with the apical yolk, the hypocotyl in contact with the radicle was recognized. With the objective of greater increase, the protodermis, the procambium, mitotic phases and the primary vascular system were observed.

The preparations for fluorescence microscopy were temporary and different dyes such as Orange G and Rhodamine were used. That were observed by the green filter of the compound fluorescence microscope, it was also identified that the genipine pigment is in the endosperm, in the areas near the seminal cover.

Keywords: Genipa americana L., tejoruco, germination, genipin, fluorescence, anatomy.

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1. INTRODUCCIÓN

México forma parte de los diez países mega diversos y con mayor superficie de bosques primarios en el mundo, nuestro país ocupa el cuarto sitio en riqueza de especies (SEMARNAT, 2011) y Guerrero es el cuarto estado con mayor diversidad biológica en México (Ochoa y Flores, 2006); la riqueza y abundancia de especies forestales es importante, debido a la cantidad de agua que captan, su producción, alimentos, resguardo de la fauna y elementos de sustancias de uso medicinal o para la industria, permiten encontrar oportunidades que podrían mejorar las condiciones de la gente en el lugar; pero no todas la especies forestales son conocidas por la comunidad, muchas de ellas no se aprovechan de manera adecuada mientras que en otros países tienen importancia en diversas áreas de la industria.

En los diferentes ámbitos de nuestras vidas, las fuentes bioactivas naturales están ganando interés, sobre todo por los beneficios en la salud, las preocupaciones biológicas y seguridad (Chemat et al, 2015). Los productos naturales obtenidos por plantas, insectos o minerales son sostenibles y con mínimo impacto ambiental si son aprovechados de manera sustentable. Una especie forestal con potencial y fuente importante del compuesto genipina es el fruto de Genipa americana L., debido a su origen natural y al uso ancestral de los frutos, la genipina ha sido estudiada desde diversas perspectivas, incluyendo la formulación de pigmentos de diversos colores (amarillos, azules, rojos, etc.) para la industria alimentaria y de cosméticos decorativos, como entrecruzante atóxico para la formulación de hidrogeles basados en biopolímeros con grupos de amina para la preparación de bioadhesivos usados en el tratamientos de heridas y como soporte basado en proteínas para la regeneración de nervios, como reactivo forense para el levantamientos de huellas dactilares latentes en productos de papel, etc. De la misma manera muy recientemente se ha comenzado a vislumbrar también su potencial aplicación en el tratamiento de enfermedades hepáticas, entre ellas la diabetes tipo II (Lárez et al., 2014). La genipina se comercializa en cantidades limitadas, al día de hoy 25 mg de este compuesto tienen un costo de 111, 50 USD, mientras que 125 mg alcanzan los 448, 00 USD (Merk, 2017). Debido a su alto costo es necesario encontrar una técnica que incremente la escala de obtención de este pigmento aprovechando cada parte del fruto.

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Esta especie es un árbol nativo de América latina, teniendo una distribución desde ambas costas de México hasta las Antillas, representa una actividad económica prometedora principalmente por la producción de genipina en los frutos, además de presentar diferentes cualidades favorables para su procesamiento diverso en la industria, es apto para plantaciones como frutal o con fines maderables, lo que representa un fuerte potencial para el desarrollo de su cultivo y con ello el aprovechamiento múltiple de la especie; a nivel comercial, se desconoce su comportamiento, pero se ha ensayado en plantaciones puras en Costa Rica y Panamá, como la especie ocurre en un rango de climas, al plantarla es muy importante escoger una fuente de semillas apropiadas (OFI/CATIE, 2003). Las semillas no solo son un órgano importante que permite la dispersión y con ello la perpetuación de las plantas sino que también son una importante fuente de alimentos. La aparición de la semilla en el ciclo vital de las plantas superiores constituyo un proceso de adaptación único, ya que con ella se asegura que la planta madre sobreviva en la generación siguiente, aun en condiciones ambientales adversas (Matilla, 2008). El estudio de la semilla de Genipa americana L., permite reconocer la importancia ecológica y económica que tiene la especie en el ámbito forestal, debido a su gran potencial y sus múltiples aprovechamientos que esta puede tener, especialmente con la extracción de la genipina.

Este trabajo pretende contribuir generando información sobre Genipa americana L., en México, especialmente sobre la semilla, debido a la escasa información sobre este órgano y la localización del pigmento genipina en ella. Por ello, esta investigación tuvo el objetivo de determinar la viabilidad y germinación de la semilla., además, describir la estructura por medio de la observación de preparaciones temporales y localizar en la semilla el pigmento genipina para establecer el lugar donde se encuentra.

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2. OBJETIVOS

 Determinar la viabilidad y germinación de la semilla de Genipa americana L.  Describir la estructura de Genipa americana L., por medio de la observación de preparaciones temporales.  Localizar en la semilla el pigmento Genipina para establecer el lugar donde se encuentra.

3. HIPÓTESIS

Existe la posibilidad de que los resultados de la prueba de viabilidad y germinación de la semilla de Genipa americana L., sea alta inicialmente, al momento de madurez del fruto y esta decrezca gradualmente. Es posible que el pigmento conocido como Genipina se localice en los cotiledones o en el endospermo de la semilla.

4. REVISIÓN DE LITERATURA

4.1 Ubicación de la semilla en el Reino Plantae

Las angiospermas, (del griego aggeion = vaso, ánfora, y sperma = semilla) son plantas con “semillas encerradas”, en referencia a que sus óvulos (y posteriormente sus semillas) están en el interior de los carpelos, que forman el ovario, hasta convertirse en fruto. Las primeras angiospermas se originaron en los trópicos y luego fueron radiando hacia las zonas templadas; en el hemisferio boreal fueron sustituyendo a los helechos y gimnospermas (Lobato et al., 2012).

Se estima que hay más de 250 mil especies de plantas vasculares. Sus ancestros son probablemente las algas verdes, porque ambas, tienen características similares. Las plantas vasculares y algas verdes tienen clorofila a y b, almacenan almidón en los cloroplastos, tienen células con flagelos móviles (excepto en Pinofita, Gnetofita y Magnoliofita), tienen fragmoplasto y forman una placa celular durante la división celular. Las algas más próximas evolutivamente parecen ser las de la familia Charophyceae. Sin embargo, las plantas vasculares han creado por sí solas un cuerpo muy complejo, resultado de una larga evolución, que presenta órganos muy especializados y adaptados a la vida terrestre.

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Estos órganos son la raíz, que además de fijar la planta al suelo, toma de éste el agua y las sales minerales disueltas, el tallo, que sirve de soporte a las hojas, flores y frutos, y conduce el agua y las sales minerales desde la raíz a las hojas y las sustancias elaboradas en las hojas a las zonas de crecimiento y a las raíces. Las hojas son órganos especializados en captar energía solar, producir sustancias orgánicas por medio de la fotosíntesis y liberar vapor de agua mediante la transpiración, además de estar diseñadas para ofrecer poca resistencia al viento (Megias et al., 2018). Y las flores que son un conjunto de hojas modificadas: sépalos, pétalos, estambres y carpelos, los dos primeros como órganos estériles, cuya función es la protección y la atracción de los polinizadores; los segundos homólogos o microsporófilas (estambres) y megasporófilas (carpelos) respectivamente. Las angiospermas tienen los óvulos y, en consecuencia, las semillas están protegidas por los carpelos. Los estambres constituidos por filamento y antera la cual contiene dos tecas y cada una dos sacos polínicos.

En las angiospermas se presenta una doble fecundación, una alternancia de generaciones, ambas pluricelulares: un esporofito (2n) y un gametofito (n), la dominancia de una respecto a la otra, ha cambiado en la evolución de lo que se conoce como embriofitas (plantas con el desarrollo de un embrión). En las angiospermas el esporofito es dominante y los gametofitos están muy reducidos, dependen de su nutrición del esporofito, aunque hay que considerar que el gametofito femenino tiene un papel muy importante en cuanto a la protección y desarrollo del cigoto, que dará al embrión.

En las angiospermas el ciclo de vida es heterospórico, debido a que el esporofito presenta dos tipos de esporangios; los microsporangios y los megasporangios. Los microsporangios o sacos polínicos localizados en las anteras, constituyen los estambres, o el androceo y los megasporangios se localizan en el interior de los carpelos, constituyen el gineceo.

En los microsporangios o sacos polínicos, se realiza la microsporogenesis, a partir de células 2n, llamadas células madre de las microsporas que pasan por meiosis, dando lugar a 4 microsporas haploides envueltas por una pared de calosa, la cual se disuelve y deja libres a las microsporas. Posteriormente se presenta la microgametogenesis, que consiste en la formación de los gametos masculinos; a partir de cada microspora y por medio de una mitosis origina 2 células: Una célula vegetativa que se transforma en el tubo polínico o

19 gametofito masculino y una célula generatriz, que presenta otra mitosis para formar los 2 gametos masculinos.

La megasporogenesis, consiste en la formación de las megasporas en el interior del megasporangio, en las angiospermas se presentan en general, dos tegumentos que rodean al megasporangio u ovulo y al principio se localiza en su interior una célula 2n, el megasporocito que por meiosis origina 4 megasporas haploides, tres degeneran y una es funcional la cual pasa a la siguiente fase.

La megagametogenesis consiste en que la megaspora funcional se divide por 3 divisiones mitóticas para formar el megagametofito o saco embrionario (en angiospermas), el cual está formado por 7 células y 8 núcleos, 3 antipodas en la zona de la chalaza, 2 sinergidas y la ovocelula en la zona micropilar, y en el centro del saco embrionario se localiza la célula central con 2 núcleos polares por migrar de los polos.

Cuando los gametofitos se han formado (tubo polínico y saco embrionario) con sus respectivos gametos (núcleos espermáticos y ovocélula) los granos de polen son liberados y transportados por medios bióticos o abióticos hasta el estigma de una flor (polinización), ya en el estigma se desencadena una serie de procesos que permiten el desarrollo del tubo polínico, a partir de la célula del tubo, el cual transporta los gametos masculinos o núcleos espermáticos, hasta el micrópilo del ovulo para que se lleve a cabo la fecundación (Díaz, 2019. Com. pers.).

4.1.1 La semilla

Una semilla consiste en un embrión y un tejido nutritivo, ambos rodeados por la pared del megaesporangio, denominado nucela y está cubierta por una envoltura protectora llamada testa. El precursor ontogenético de la semilla es el óvulo y la diferencia fundamental entre este y la semilla es la presencia de un embrión. Sin embargo, debido a que en los fósiles difícilmente se puede comprobar el momento de la fecundación y la presencia del embrión; los paleontólogos utilizan indistintamente el termino semilla y óvulo, y la semilla la definen simplemente como un óvulo fecundado (Valencia et al., 2014).

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4.1.2 Las partes de la semilla

La semilla se forma a partir del rudimento seminal, localizado en el ovario de las flores, tras producirse la fecundación por los granos de polen. Megías et al., (2018), mencionan que se pueden distinguir diferentes partes en una semilla:

Embrión: Está compuesto por un eje embrionario (tigellum) en cuyos extremos se encuentran una radícula y una plúmula, más uno o dos cotiledones. Tiene su origen en la fusión de un núcleo generativo del grano de polen con la ovocélula que se encuentra en el saco embrionario. La célula diploide resultante de la fecundación comienza con una primera mitosis que dará dos células. La célula más interna será la responsable de formar el embrión, la más externa, por diversas divisiones mitóticas siempre transversales, forma una estructura denominada suspensor que tiene como misión unir el embrión a los otros tejidos del rudimento seminal. En el caso de las semillas dicotiledóneas la célula que forma inicialmente el embrión se divide en dos por medio de un tabique longitudinal, separando los futuros cotiledones.

Endospermo secundario: Es un tejido nutritivo que se encuentra a un lado o rodeando completamente al embrión. En el caso de las angiospermas procede de la fusión de un núcleo generativo con los dos núcleos centrales del saco embrionario formando un tejido triploide. El endospermo es un tejido de reserva que proporciona nutrientes al embrión y a las primeras fases del desarrollo de la planta. Las células nutricias almacenan granos de almidón o proteínas que pueden formar gránulos amorfos llamados glútenes o complejos proteicos cristalizados llamados granos de aleurona. En algunas especies de angiospermas hay un tejido de reserva adicional formado por células de la nucela, que es una parte del rudimento seminal, y que forma el denominado perispermo, aunque en la mayoría de las semillas la nucela no está presente.

Cubiertas protectoras: están envolturas de la semilla son de origen materno y a partir de los tejidos que rodean al óvulo. La formación de la cubierta está inhibida antes de la fecundación y la fecundación elimina esta inhibición permitiendo el desarrollo de la cubierta. La cubierta se origina principalmente a partir de los tegumentos interno y externo del rudimento seminal, los cuales se convertirán en el tegmen y la testa de la semilla, respectivamente. Normalmente tegmen y testa están unidos y es difícil separarlos, excepto

21 en algunas plantas como las judías. Conjuntamente se denominan epispermo o cubierta seminal. El tegmen es normalmente delgado y flexible, mientras que la testa es dura. En la superficie de la testa se sitúa una capa de células a modo de epidermis que desarrollan una cutícula que supone una barrera física para el agua y agentes externos, pero es semipermeable a los gases. A veces, en la cubierta, se pueden encontrar moléculas denominadas genéricamente defensinas, que son repelentes o tóxicos frente a patógenos o herbívoros. En algunas especies hay un elemento adicional de protección consistente en sustancias tóxicas.

4.2 Importancia de la conservación y análisis de semillas

Se admite que aproximadamente el 97% de las plantas que pueblan la superficie terrestre son espermatofitas. La estructura de la semilla y su fisiología están adaptadas para actuar como unidad de dispersión, además de permitir la propagación y perpetuación de las plantas (Matilla, 2008).

Las semillas son un pilar irremplazable de la producción de alimentos. Desde hace milenios los pueblos han guardado e intercambiado semillas. Así se han creado cientos de cultivos que por este intercambio se han ido a adaptando a otros climas y topografías. Gracias a ello hemos tenido una dieta variada y las comunidades han tenido una autonomía alimentaria (Rossi S/A).

La finalidad de un análisis de semillas es determinar la calidad de un lote o muestra ensayada. Los factores que afectan dicha calidad, en general, comprenden: pureza, semillas de otras especies, pureza especifica varietal, porcentaje de germinación y capacidad germinativa, presencia o ausencia de organismos patógenos, contenido de humedad, peso específico, numero de semillas por kilogramo, bueno hasta el lugar de la cosecha interviene en el análisis (Hartmann y Kester, 1989; Justice, 1986).

Los análisis de semillas tienen los siguientes objetivos principales: proporcionar información necesaria para cubrir las normas legales; determinar la calidad de las semillas, según los métodos de recolección y beneficio, así como el control de las plagas y enfermedades; por último, definir la cantidad y densidad de siembra (Patiño et al., 1983; Justice, 1986; Hartmann y Kester, 1989).

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Debido a que las semillas son un artículo de comercio, se deben someter a normas estandarizadas que regulen las pruebas a realizar en ellas, por ello existen organizaciones que se dedican regular dichas normas, como son la Asociación Oficial Internacional para el Análisis de Semillas (AISA) (Justice, 1986; Hartmann y Kester, 1989).

4.3 Distribución de la familia Rubiaceae

La familia Rubiaceae considerando su diversidad, es la cuarta más grande entre las fanerógamas, contando con unos 650 géneros y 13 000 especies (Delprete, 2004). La mayoría de ellas vive en la región tropical y juega un papel importante en la vegetación de las zonas calientes. Estas cifras explican en parte, por qué los conocimientos actuales insuficientes para tener elaboraciones detalladas sobre esta familia en la mayoría de los países tropicales y subtropicales. La diversidad de la familia todavía no está explorada ni para la ciencia, ni para el beneficio de la sociedad humana. Esta situación puede ser ilustrada por el hecho de que solamente en el área del Caribe en los últimos veinte años más de 15 géneros y más de 100 especies han sido descritos cómo nuevos para la ciencia (Borhidi, 2012).

La última clasificación basada en caracteres morfológicos fue desarrollada por Robbrecht (1988 con suplementos en 1993a, b). Según su concepto la familia Rubiaceae se divide en 4 subfamilias: Antirheoideae, Cinchonoideae, Ixorioideae y Rubioideae. Según la reseña de los resultados moleculares obtenidos (Bremer 2009) los estudios confirmaron la existencia de solamente 3 subfamilias Cinchonoideae, Ixorioideae y Rubioideae y más de 43 tribus, pero la circunscripción y delimitación de muchas tribus no están establecidas.

Dentro de la subfamilia Rubioideae se encuentra el género de Genipa con unas cinco especies neotropicales, distribuido desde Florida hasta Bolivia y en las Antillas.

4.3.1 Tejoruco (Genipa americana L.)

El Tejoruco es un árbol que pertenece a la familia Rubiaceae, cuya clasificación taxonómica se indica en el siguiente numeral.

Genipa americana L., se conoce por los nombres comunes de jagua, caruto (en español), genipa (en inglés), bois de fer (en francés) y genipapo (en portugués) (Rivas, 2014). Es tolerante a las inundaciones y adecuada para su uso en programas de restauración de

23 bosques de galería (Bezerra et al., 2015). Los resultados de algunas investigaciones indican que los principales compuestos bioquímicos que contiene la Genipa americana L., son: manitol, genipina, taninos, ácido tartárico, ácido geniposídico, hidantoína, cafeína y calcio; contiene también iridoides de genipina que reaccionan con proteínas produciendo un color azul y dos compuestos antibióticos con estructura de monoterpenos ciclopentanoicos (UNCTAD, 2005).

4.3.2 Taxonomía

Taxonomía de Genipa americana L.

División Magnoliophita Clase Equisetopsida Subclase Magnoliidae Superorden Asteranae Orden Gentianales Familia Rubiaceae Género Genipa L. Especie americana Fuente: www.tropicos.org

4.3.3 Distribución

El árbol de jagua se originó probablemente en la Cuenca Amazónica y fue esparcido a través de los Trópicos Americanos por los seres humanos en tiempos pre-históricos (FAO, 1989). Los límites originales de su distribución se desconocen hoy en día, los árboles de jagua crecen naturalmente a lo largo de ambas costas en México un poco al norte del Istmo de Tehuantepec y del istmo a través de la América Central (Echenique et al., 1975) (Figura 1) y a través del norte de la América del Sur hasta Paraguay y el norte de Argentina (López et al., 1987). Esta especie también se puede encontrar en las Antillas Mayores (a excepción de Jamaica) y en muchas de las islas de las Antillas Menores (Bisse, 1988 y López et al., 1987) (Figura 2).

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Figura 1. Estados de la República Mexicana, donde se distribuye G. americana L. FUENTE: Francis J, 1993

Figura 2. Áreas de distribución de Genipa americana L., en América. FUENTE: 2018 Google, INEGI, Naturalista.

Es una especie heliófita del trópico húmedo y subhúmedo, típica de los bosques semideciduos. Es común en elevaciones bajas de climas cálidos y húmedos y en llanuras

25 costeras. Crece en elevaciones que van desde el nivel del mar hasta los 1200 m, en sitios con precipitaciones de 800 a 4500 mm promedio anuales y una temperatura media anual de 18 a 30 ºC. Prospera en todo tipo de suelos, desde aluviales inundables, como tierra firme con buen drenaje; soporta bien hidromorfismo de agua en movimiento, pero no estancada. Su mejor desarrollo se da en suelos arcillosos o de textura media con buen contenido de nutrimentos. Prefiere suelos moderadamente profundos, con fertilidad media a alta, bien drenados, con texturas de franca a arcillosa y no tolera heladas. Puede tolerar hasta seis meses de sequía (OFI/CATIE, 2003).

4.3.4 Vegetación asociada

A través de su extensa área de distribución, en México crece asociado con muchas especies, por ejemplo: Scheelea liebmanii, Sabal mexicana, Brosimum alicastrum, Poulsenia sp., Guatteria anomala, Podocarpus sp., Platanus sp., Stirax sp., Acrocomia mexicana, Coccoloba barbadensis, Ceiba pentandra, Spondias mombin, Bursera simaruba, Apeiba sp., con los siguientes tipos de vegetación: Bosque de encino, Bosque de galería, Bosque espinoso, Bosque mesófilo de montaña, Bosque tropical caducifolio, Bosque tropical perennifolio, Bosque tropical subcaducifolio y Bosque tropical subperennifolio (Sistema Nacional de Información Forestal, S/A).

En otros países, por ejemplo, en un sitio a la margen de un río en el valle de Atrato en Colombia, se puede encontrar a los árboles de jagua creciendo con Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg, Cecropia sp., Cedrela sp., Cespedesia macrophylla Seem., Guilielma gasipaes (H.B.K.) Bailey, Gustavia superba Berg, Inga sp., Luehea seemannii Planch. & Triana, Parkia sp., Pithecellobium sp., Vismia sp. y Vochysia sp. (IGAC, 1977). En los bosques de Puerto Rico, el jagua se ve usualmente restringido a los terrenos previamente utilizados para la agricultura de subsistencia. Entre las especies frecuentemente asociadas con el jagua se encuentran Mangifera indica L., A. altilis, Andira inermis (W. Wright) DC., Tabebuia heterophylla (DC.) Britton y Guarea guidonia (L.) Sleumer (Francis, 1993).

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4.3.5 Características botánicas

Tallo Es un árbol de 25-30 metros de altura y 60-80 centímetros de diámetro a la altura de pecho en condiciones naturales. El fuste es recto y ligeramente cilíndrico, corteza externa lisa de color pardo claro., corteza interna blanco cremosa de textura arenosa; la ramificación es verticilada (OFI/CATIE, 2003), con ramas numerosas y fuertes con las hojas concentradas en los extremos (Martínez, 2016) (Figura 3).

La madera de jagua, la cual tiene muchos usos es de color pardo amarillento claro, de textura pareja y moderadamente pesada (Rivas, 2014), La albura es crema y el duramen café amarillento claro, con tintes rosados o purpúreos. Tiene poco brillo. Olor y sabor no distintivos. La madera es dura, pesada (0.66-0.87), flexible y resistente. Textura fina y grano recto a irregular (OFI/CATIE, 2003).

Figura 3. Fuste de Genipa americana L. FUENTE: Fotografía propia (2018)

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Hojas Hojas simples, opuestas, de 10-35 cm de largo (OFI/CATIE, 2003) de color verde oscuro en el haz y más claro en el envés, espatulada, margen entero-sinuoso, ápice acuminado y base atenuada. Estomas anisocíticos en epidermis inferior, tricomas glandulares pluricelulares cortos en lámina y pecíolo, gran cantidad de drusas en mesófilo y pecíolo (González et al., 2011) (Figura 4).

Figura 4. Hojas de Genipa americana L. FUENTE: Fotografía propia (2018)

Flores

Las flores bisexuales pequeñas nacidas en inflorescencias terminales (Joker et al., 2003). Son grandes, con cinco pétalos de color blanco o amarillo y ligeramente perfumadas (OFI/CATIE, 2003). En la mayoría de los árboles, las abejas polinizan las flores (UNCTAD, 2005) (Figura 5).

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Figura 5. Flor de Genipa americana L. FUENTE: Fotografía propia (2018)

Fruto

Los árboles comienzan a dar frutos cuando tienen alrededor de 6 años y un árbol de 15 a 20 años puede producir 400-600 frutas por cosecha (UNCTAD, 2005).

El fruto es una baya color pardo amarillento a café, abayado, carnoso, elipsoidal a subgloboso, 3.5 a 9 cm de diámetro, pericarpo blando, azul al oxidarse, pulpa mucilaginosa (Borhidi, 2012) (Figura 6). Cuando son verdes, las frutas proporcionan un jugo de color azulado, a menudo utilizado como tinte (Lorenzi 1992, Sebbenn 1997) y la carne blanca se vuelve de color amarillo a morado azulado y finalmente a negro azabache al exponerse al aire (Kumar, et al., 2016), además, el fruto de Huito, cuando está verde es astringente. Contiene una buena cantidad de azúcar y acidez pronunciada, que varían con el tipo y dependiendo del clima y el suelo (Xavier et al., 1976). Constituido por una corteza blanda, parda o pardacenta-amarillenta, membranosa, fina y arrugada que representa el 9.56% del total del fruto; 73.81% es pulpa con olor característico, muy fuerte, sabor dulce acidulado, envolviendo numerosas semillas achatadas (Andrade et al., 2000).

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El fruto de Tejoruco se caracteriza por un aroma afrutado, Borges y Rezende (2000) detectaron los principales ácidos, como el octanoico (34, 1%) 2-metilbutírico (9, 1%), hexanoico (18,2%) y 2-metil-éster 2-(E)-butenoato de metilo (4, 1%), octanoato (3,2%) y 2-propilfurano (2,5%) y ácidos butírico, ácido 2-metilbutírico y 6 hexanoico responsable de las notas amargas y el sabor a fruta característico se atribuyó a la presencia del éster de 2 - y 3-metilbutirato de etilo.

La fruta de esta especie no es perecedera y pueden conservarse en refrigeración entre 10- 15°C hasta 15 días, tiempo límite para su inmediato procesamiento, temperaturas inferiores a 10°C, ocasionan ennegrecimiento del fruto, por quemado del epicarpo (Attokaran, 2011).

Las frutas se dispersan por el agua o por los animales que se alimentan de la pulpa suave (Joker et al., 2003), se han reportado semillas en las heces de monos (especies no especificadas) y coyotes (Canis latrans) en Costa Rica (Janzen et al., 1983). Probablemente un gran número de mamíferos salvajes y domésticos, aves y murciélagos ayudan en la dispersión de las semillas (Francis, 1993).

Figura 6. Fruto de Genipa americana L. FUENTE: Fotografía propia (2018)

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Semilla

Las semillas aplanadas, elipsoidales, 5 a 10 mm de largo (Borhidi, 2012), de color pardo oscuro (OFI/CATIE, 2003) (Figura 7). La propagación convencional ocurre a través de semillas, pero está restringido debido a la falta de uniformidad de la germinación y pérdida rápida de la viabilidad de la semilla, ya que se clasifican como intermedio (Magistrali et al., 2013). Salomão, (2004) y Salomão et al., (2006), mencionan que las semillas de G. americana L., pueden ser parcialmente desecadas, sin embargo, pierden gradualmente su viabilidad durante su almacenamiento a corto plazo en bajas temperaturas. Las bajas temperaturas no son las adecuadas para los niveles máximos de su germinación, además provocan un ambiente propicio para la proliferación de hongos xerotolerantes (Ramirez et al., 2010).

Figura 7. Semillas húmedas de Genipa americana L. FUENTE: Fotografía propia (2018)

4.3.6 Usos e importancia

Tiene importancia económica (Andrade et al., 2003), este fruto, raramente es consumido de forma natural, ha sido utilizado de forma artesanal como materia prima para la producción de compostas, cristalizados, helados, refrescos, licor y vino (Andrade et al., 2000). Estos usos siguen siendo una práctica común en grandes áreas, o en las zonas más remotas de

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Latinoamérica, por ejemplo, las flores se utilizan para producir aceites aromáticos y como infusión medicinal, la corteza, resina y frutos también se les atribuye propiedades medicinales, como tinte natural para teñir la ropa y la cerámica. Sin embargo, la especie se cultiva principalmente por su fruto (UNCTAD, 2005), la madera se puede emplear para la elaboración de vigas, cajas de empacar, muebles, baúles, hormas de zapato, zarandas, culatas de escopeta, tacos de billar, aros de tambores, mangos de instrumentos agrícolas y arados, contrachapados, palillos de dientes, cucharillas para helados, depresores linguales y artículos deportivos (Quesada et al., 2010).

En Paraguay las hojas se emplean como antidiabético (Pin, 2009; Basualdo, et al., 2003, 2004) como antilipídico (Basualdo, et al., 2003, 2004); la decocción de hojas y corteza se emplea para disminuir niveles de colesterol y como adelgazante; la corteza en decocción se usa como hipotensor (Pin, 2009). En otros países el fruto se emplea como antisifilítico, astringente, refrescante; la raíz como purgante (Toursarkissian, 1980). En Brasil la raíz también se considera purgante; la cáscara del fruto es usada en baños para tratar las úlceras, como diurético; el jugo del fruto maduro está indicado contra la enteritis y la hidropesía; las semillas peladas en emulsión tienen efecto vomitivo rápido y enérgico (Balbalch, S/A).

Genipa americana L., es una fuente natural de hierro, riboflavina y sustancias antibacterianas. Los frutos son comestibles cuando están verdes y la pulpa de los maduros. Las frutas se utilizan para preparar jarabe, como fuente de bebidas y licores. Como fruta comestible se clasifica bajo. Las poblaciones indígenas también usan la pulpa como repelente de insectos y etno medicina (UNCTAD, 2005).

4.4 Colorantes naturales

Los colorantes naturales son sustancias químicas que se obtienen de las diferentes partes de la planta, principalmente provienen de plantas y de algunos insectos, que tienen la capacidad de teñir o colorear un material. Algunos usos tradicionales de los colorantes son por medio del untado directo sobre fibras, exprimidos, aprovechamiento de colorantes naturales rojos de cochinilla mediante la aplicación de mordentes y calor, extracto de cocción, como por ejemplo la flor de dalia, separación del colorante mediante sustancias

32 acidas, o cenizas como la flor de cártamo, reducción y oxidación como el arbusto añil flora también conocido como azul indigo (Yoshiko 1996).

Es importante tener clara y presente la función de los colorantes y pigmentos en la naturaleza. La gran diversidad de pigmentos cumple funciones específicas dentro de ella incluyendo a los animales superiores (como el ser humano), ya que algunos pueden actuar como inhibidores para la germinación de semillas u hormonas para el crecimiento, o como sustancias tóxicas para defensa o para guiar a los insectos a las flores para realizar la polinización o como factor de atracción entre géneros para la reproducción, etc. (Draelos, 2010).

Los pigmentos que dan color a las plantas se encuentran en orgánulos con capacidad de rediferenciarse. Los proplastos, son plastidios jóvenes e inmaduros, a partir de los cuales se pueden diferenciar todos los plastidios (Pérez, S/A). Los plastidios, de las plantas superiores existen en una gran variedad de formas y tienen un ámbito amplio de estructura y función. Están involucrados en el metabolismo de la energía en actividades de almacenamiento y en la reproducción de las plantas. En mayor o menor grado son capaces de asimilar nitrógeno inorgánico, sintetizar aminoácidos, ácidos grasos, almidón, metabolismos secundarios y pigmentos según la especie el tejido, la célula y el grado de desarrollo (Eames et al., 1997). Todos los plastidios están rodeados por una membrana doble. La membrana externa está compuesta por porinas que permiten el tráfico de moléculas hidrofílicas con una masa molecular no mayor de 10kDa (Eames et al., 1997; Heins et al., 1998). La membrana interna origina el sistema de membranas especializadas que se encuentran dentro del cloroplasto. El desarrollo relativo del sistema de membranas y los contenidos del estroma definen los diferentes tipos de plastidios (Bogoard 1981; Getz 1991; Martin et al., 1998; Pharthasarathy et al., 1985).

Para efectos de estudio se establecen dos tipos de plastidio: cromoplastos o plastidios pigmentados o leucoplastos plastidios carentes de pigmentos (Cuadro 1).

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Cuadro 1. Clasificación de plastidios.

Carente de clorofila y contiene gránulos de almidón. Se encuentra en los meristemos, o tejidos Amiloplasto embrionarios y en los cotiledones, endospermo, tubérculos y células de la caliptra asociadas con la cofia. Leucoplastos Almacenan proteínas en forma de Proteinoplastos cristales o filamentos.

Contienen aceites esenciales o Oleoplastos combinaciones de proteínas y PLASTIDIOS lípidos.

Organelos citoplasmáticos más conspicuos de las células de las plantas verdes. En ellos se transforma la energía lumínica en Cloroplasto energía química acumulada en un Cromoplastos enlace fosfoanhidrido del ATP y en los enlaces químicos de los carbohidratos.

Carotenos y xantofilas, de color Otros plastos rojo naranja y amarillos. Fuente: Flores, 1999.

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4.5 Descripción de Genipina

El Genipósido es un iridoide glicosilado que mediante hidrólisis con -glucosidasa se descompone en Genipina y D-glucosa. La estructura de la Genipina fue descubierta en 1960 por Djerassi y colaboradores a partir de la fruta madura de Genipa americana L., esta sustancia es responsable de la coloración azul violeta que se observa al reaccionar espontáneamente con aminoácidos, en general con aminas primarias (Miranda et al., 2015) (Cuadro 2). Existen muchos reportes acerca de los efectos medicinales de la genipina, como antiinflamatorio, anticanceroso, anti bactericida, antitrombótico, inhibidor neurotóxico, con efectos antidepresivos y con propiedades útiles en la cura de gastritis y diabetes (Yang et al., 2011). Djerassi y colaboradores (1960) y Guilherme (2007) reportan que a partir del fruto de la Genipa americana L., es posible la obtención directa de genipina, con rendimientos de (0,9-1,0) % y 0,52%, respectivamente.

Cuadro 2. Información sobre Genipina.

GENIPINA Cuadro 02. Información sobre Genipina.

(1R,2R,6S)-2-Hidroxi-9-(hidroximetil)-3-oxabiciclo [4.3.0]nona- Nombre IUPAC 4,8-dieno-5-carboxilato de metilo Éster metílico de ácido 1, 4a-alfa,5, 7a-alfa-tetrahidro-1-hidroxi- Otros nombres 7-(hidroximetil)- ciclopenta(c) pirano-4-carboxilíco

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Identificadores

Numero CAS 6902-77-8

PubChem 442424 InChI=1/C11H14O5/c1-15-10(13)8-5-16-11(14)9-6(4-12)2-3- InChI 7(8)9/h2,5,7,9,11-12,14H,3-4H2,1H3/t7-,9-,11-/m1/s1

Propiedades

Fórmula molecular C11H14O5

Masa molar 226.226 g/mol

Apariencia Cristales incoloros

Punto de fusión 120-121 °C

Solubilidad en agua Soluble

Solubilidades Soluble en metanol, etanol y éter dietílico. Baja toxicidad, (En ratón) LD50 i.p.153mg/kg y LD50 p.o. Toxicidad 237mg/kg. Longitud de onda La genipina absorbe en el ultravioleta a una longitud de onda de de absorción 240 nm. Fuente: UENG, T. et al., 1997.

Figura 3. Equipo montado sobre una mesa de apoyo. A) micrótomo manual sujetado por un brazo de sujeción. B) Platina de deslizamiento.Fuente: UENG, T. et al., 1997.

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5. MATERIAL Y MÉTODO

El presente trabajo de investigación se desarrolló en tres etapas. La Etapa 1 consistió en realizar un análisis físico de las semillas de la especie de estudio en el Laboratorio de Semillas Forestales de la División de Ciencias Forestales de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh), con el objetivo de obtener información básica e importante. La Etapa 2 radicó en estudio morfológico de la semilla y se desarrolló en el Laboratorio de Histología y Citología General del Área de Biología, Departamento de Preparatoria Agrícola, llevándose a cabo en el mismo lugar la Etapa 3, donde se realizaron cortes histológicos y pruebas de fluorescencia a las semillas de Genipa americana L., con la finalidad de buscar el pigmento.

5.1 Recolección de frutos

El primer lote de semillas de G. americana L., fue proporcionado por el maestro José Rico Cerda (División de Ciencias Forestales de la Universidad Autónoma Chapingo). Los frutos fueron recolectados en tres árboles, el día 26 de marzo del 2018, en Santa Cruz del Rincón, municipio de Malinaltepec, Guerrero, por Natalia Hernández Pérez. Posterior a su recolección, algunos de los frutos inmaduros les fueron extraídas las semillas y colocadas en un frasco con agua, mantenidos los frutos en refrigeración a 6° C, para evitar la deshidratación y la maduración de las mismas, mientras que a otros grupos también fueron extraídas las semillas y se mantuvieron bajo las mismas condiciones que los frutos (pero sin agua) durante tres semanas fueron conservadas de esa forma, posteriormente fueron expuestas a temperatura ambiente hasta el día 12 de mayo del 2018.

El municipio de Malinaltepec, Guerrero, se encuentra ubicado en entre los paralelos 16° 55’ y 17° 21’ de latitud norte, los meridianos 98° 34’ y 98° 49’ de longitud oeste; altitud entre 400 y 2 600 m. Se encuentra en la provincia de la Sierra Madre del Sur, cuenta con dos subprovincias: Cordillera Costera del Sur (84.53%) y Costas del Sur (15.47%). El rango de temperatura del municipio es de 14 – 26°C, con un rango de precipitación de 1100 – 2500 milímetros. El municipio pertenece a la región hidrológica Costa Chica – Rio verde (91.9%) y al Balsas (8.1%), tiene siete corrientes de agua perennes y 20 intermitentes (INEGI, 2009). Santa Cruz del Rincón, se encuentra entre latitud 16,996°, longitud -

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98,735°, con una elevación de 754 msnm. La topografía en un radio de 3 kilómetros tiene variaciones enormes de altitud, con un cambio máximo de 650 metros y una altitud promedio sobre el nivel del mar de 697 metros. La temporada de lluvia es opresiva y nublada, la temporada seca es parcialmente nublada y es muy caliente durante todo el año. Durante el transcurso del año, la temperatura generalmente varía de 14 °C a 32 °C y rara vez baja a menos de 12 °C o sube a más de 34 °C (Cedar Lake Ventures, S/A). Cuenta con un clima cálido subhúmedo con lluvias en verano, de mayor humedad; la geología del pueblo es ígnea intrusiva, con suelo dominante regosol, el uso del suelo está destinado a la agricultura en su mayoría y la otra parte cubierta por bosque (INEGI, 2009).

El segundo lote de semillas de la especie fue recolectado en la comunidad de Ocotito, situado en el municipio de Chilpancingo de Bravo, Guerrero. Chilpancingo de Bravo, Guerrero, ubicado entre los paralelos 17° 10’ y 17° 37’ de latitud norte; los meridianos 99° 23’ y 100° 04’ de longitud oeste; altitud entre 200 y 2600 msnm. Se encuentra en la provincia de la Sierra Madre del Sur, contando con dos subprovincias: Cordillera Costera del Sur (89.86%) y Costas del Sur (10.14%). Tiene un rango de temperatura de 14 – 28°C y 800 – 2500 milímetros de precipitación. Se encuentra en tres regiones hidrológicas: Costa Chica - Río Verde (99.3%) y Balsas (0.7%), cuenta con 23 corrientes de aguas perenes y 12 intermitentes. La superficie del municipio está destinada a la agricultura y zona urbana, cuenta con vegetación de bosque en mayor medida, pastizal y selva (INEGI, 2009).

El pueblo de Ocotito se encuentra en las coordenadas geográficas: 17,246° y -99,515° y a una elevación de 732 msnm. La topografía del pueblo tiene variaciones enormes en un radio de tres kilómetros, con un cambio máximo de altitud de 611 metros y una altitud promedio sobre el nivel del mar de 774 metros. El área en un radio de tres kilómetros de Ocotito está cubierta de tierra de cultivo (60%) y árboles (37%). La temporada de lluvia es opresiva y nublada, la temporada seca es parcialmente nublada y es muy caliente durante todo el año. Durante el transcurso del año, la temperatura generalmente varía de 14 °C a 32 °C y rara vez baja a menos de 12 °C o sube a más de 34 °C (Cedar Lake Ventures, S/A). El clima con el que cuenta es Cálido subhúmedo con lluvias en verano, de mayor humedad. Presenta geología de rocas ígneas intrusivas y sedimentarias; los suelos dominantes del

38 lugar son luvisol, phaeozem y leptosol. La mayor cantidad de la superficie está destinada a la agricultura y una pequeña porción es bosque (INEGI, 2009). Los frutos fueron cosechados el día 8 de septiembre de 2018. Se recolectaron de un solo árbol, con un total de 84 frutos y expuestos a temperatura ambiente por una semana para evitar su pudrición.

5.2 Etapa I

El análisis de las semillas de ambos lotes se realizó en el de Laboratorio de Semillas Forestales. Las pruebas se realizaron con base en Bonner (1994).

5.2.1 Pureza

Este parámetro fue utilizado con respecto al fruto, es decir, el porcentaje que las semillas ocupan en el fruto. El proceso se realizó de la siguiente manera, cada fruto fue utilizado y posteriormente con la ayuda de unas pinzas se extrajeron las semillas de 8 frutos para el primer lote y 20 frutos maduros del segundo, se lavaron hasta quedar completamente limpias y secaron a temperatura ambiente por 24 horas. Posteriormente se contabilizaron las semillas y pesaron.

5.2.2 Peso

Se contaron las semillas existentes de 8 frutos del lote 1 y 20 del lote 2, se lavaron correctamente y se secaron a temperatura ambiente por 24 horas, posteriormente se pesó la semilla obtenida por fruto y la cantidad total por lote. Estableciendo una inferencia de cálculo se obtuvo el peso aproximado de 1000 semillas, así mismo la cantidad de semillas promedio que existen en un kilogramo.

5.2.3 Contenido de humedad

Se determinó con base en peso seco (CHo) y en peso húmedo (CHf); para ello se obtuvo una muestra de 100 semillas al azar (del total de semillas extraídas de los frutos disponibles de cada lote), se pesaron para obtener el peso fresco (Pf) en una caja Petri de vidrio etiquetada (la muestra de semillas fue lavada y se dejó escurrir para obtener el peso fresco), se introdujo a una estufa de secado a 75°C, hasta obtener un peso constante, tomando nota cada 24 horas. El peso anhidro (Po) de las semillas fue rápido para que estas no absorbieran

39 la humedad del ambiente, utilizando una báscula digital Scout Prot (Okaus). Para obtener los valores antes mencionados, se utilizarón los siguientes modelos:

(푃퐹 − 푃푂) 퐶퐻표 = 100 푃푂

(푃퐹 − 푃푂) 퐶퐻푓 = 100 푃퐹

5.2.4 Pruebas de viabilidad

El procedimiento consistió en emplear dos métodos: prueba de flotación y sales de tetrazolio.

Flotación

Se colocó una muestra de 100 semillas en un contenedor con agua (1 litro) por unos minutos, agitando el contenedor al inicio y dejando reposar, trascurrido este tiempo las semillas vanas flotaron y las viables se sumergieron en el contenedor. Se calculó el porcentaje de viabilidad con la siguiente formula:

(푛ú푚푒푟표 푡표푡푎푙 푑푒 푠푒푚푖푙푙푎푠 − 푛ú푚푒푟표 푑푒 푠푒푚푖푙푙푎푠 푓푙표푡푎푛푡푒푠) % 푑푒 푣푖푎푣푖푙푖푑푎푑 푝표푟 푓푙표푡푎푐푖ó푛: 100 푛ú푚푒푟표 푡표푡푎푙 푑푒 푠푒푚푖푙푙푎푠 (푁)

Tinción con tetrazolio

En esta evaluación se empleó una solución al 1% de cloruro de 2, 3, 5-trifeniltetrazolio que es un reactivo químico utilizado para diferenciar tejidos metabólicamente activos de aquellos metabólicamente inactivos de las semillas, mediante la tinción de color rojo en los tejidos vivos de esta.

Para realizar la prueba se tomó una muestra de 100 semillas, se remojaron en agua por unos minutos para facilitar la ejecución de los cortes, a fin de que el tetrazolio penetre a todas las partes de la semilla, el corte se efectuó de manera transversal a modo de que el embrión quedara expuesto, la mitad de cada semilla se colocó en un vaso de precipitado cubriéndola con la solución, se envolvió con papel aluminio y se etiquetó. La caja se mantuvo a temperatura ambiente por 24 h.

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Transcurrido el tiempo se contabilizaron las semillas teñidas con la ayuda de unas pinzas sencillas y un microscopio estereoscópico.

Se determinó el porcentaje de viabilidad aplicando la siguiente fórmula:

푛ú푚푒푟표 푑푒 푠푒푚푖푙푙푎푠 푣푖푎푏푙푒푠 % 푑푒 푣푖푎푏푖푙푖푑푎푑 = 100 푛ú푚푒푟표 푡표푡푎푙 푑푒 푠푒푚푖푙푙푎푠 (푁)

5.2.5 Prueba de germinación

Se realizó para determinar la capacidad potencial que tiene la semilla de poder germinar en condiciones favorables. El criterio utilizado para considerar una semilla germinada fue que el tamaño de la radícula fuera al menos del mismo tamaño que esta.

Para hacer esta prueba se esterilizaron cuatro cajas de plástico para el primer lote y uno solo para el segundo, el medio de germinación utilizado fue papel filtro remojado previamente en una solución de 80 ml agua destilada y 2% de clorotalonil 720 (fungicida), para inhibir la respiración de las células de algún hongo.

Se tomó una muestra de 400 semillas al azar con submuestras de 100, se remojaron por 10 minutos en cloro al 10% en un vaso de precipitación para matar hongos y bacterias. Posteriormente se colocaron 100 semillas al azar en cada caja en hileras de 10*10 para su germinación para el primer caso, para el Lote 2 se colocaron 400 semillas en grupos de 100 (10*10) en una sola caja. Se situaron en una cámara de ambiente controlado Barnstead Lab- Line, con 12 horas luz y el resto de noche, a una temperatura de 25° C de día y 20° C de noche.

La variable medida se monitoreo cada día, anotando las observaciones correspondientes. El porcentaje de germinación se calculó de la siguiente manera:

푛ú푚푒푟표 푑푒 푠푒푚푖푙푙푎푠 푔푒푟푚푖푛푎푑푎푠 % 푑푒 푔푒푟푚푖푛푎푐푖ó푛 = 100 푛ú푚푒푟표 푡표푡푎푙 푑푒 푠푒푚푖푙푙푎푠 (푁)

Para el análisis estadístico de esta variable se utilizó la germinación transformada con la función arco seno, se aplicó la prueba de comparación de medias, pero con el método gráfico se apreció que no hay normalidad en los datos, por ello se aplicó la prueba de Wilcoxon. Para realizar lo anterior se utilizó el Software SAS (v 9.0).

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5.3 Etapa II

Se identificó la estructura del fruto, realizando un corte trasversal utilizando un cuchillo común. La identificación y observación de la morfología externa de la semilla de Genipa americana L., se realizó en el Laboratorio de Histología del Departamento de Preparatoria Agrícola de la Universidad, utilizando un microscopio óptico compuesto. Para ello se utilizaron tres semillas recién extraídas del fruto y tres más en proceso de germinación; las imágenes fueron trasmitidas en directo a una computadora de escritorio mediante un programa que permitió capturar y editar las imágenes tomadas por el mismo.

Las tres primeras se sumergieron en agua para hidratarse y obtener una mejor observación de la estructura externa con la utilización de unas pinzas sencillas, las semillas en proceso de germinación fueron observadas inmediatamente posterior a su extracción de la caja germinadora para evitar su deshidratación.

5.4 Etapa III

La siguiente metodología se desarrolló en el Laboratorio de Histología, donde se identificó la estructura de la semilla con la utilización del microscopio de fluorescencia compuesto (AXIO ZEISS, SCOPE A1), además de localizar en qué tejido se encuentra el pigmento Genipina.

Para lo anterior se realizó lo siguiente:

5.4.1 Cortes con micrótomo manual.

Se utilizaron dos semillas para realizar cortes transversales con ayuda de un brazo de sujeción, un micrótomo manual (Figura 8A) y una platina de deslizamiento (se le colocó una navajita de afeitar) (Figura 8B); se ensambló el equipo sobre una mesa como superficie de apoyo, colocando el micrótomo en la pinza de mesa.

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B

A Figura 8. Equipo montado sobre una mesa de apoyo. A) micrótomo manual sujetado por un brazo de sujeción. B) Platina de deslizamiento. FUENTE: Fotografías propias (2018)

En dos cajas Petri se colocó un poco de agua y con ayuda de un pincel se mojó la platina de cristal y de deslizamiento, para tener menor fricción. Por otra parte, se preparó el material que sostuvo la semilla (debido a su tamaño, requirió de un sujetador). El material de sostén se ubicó al interior del cilindro del micrótomo manual y con la ayuda del tornillo micrométrico de la base, se niveló el material con la platina de vidrio.

Los cortes se obtuvieron al desplazar la cuchilla en forma recta sobre la semilla (que se localizaban en la platina de vidrio). Adquiridos los cortes, se colocaron en una caja Petri con agua para mantener su hidratación.

5.4.2 Prueba de Tinción.

Para la prueba, los colorantes utilizados fueron Sudan III, Azul de Toluidina, Safranina O, Lugol y Azul Bromotimol, los tiempos de tinción para los dos primeros colorantes fue de un minuto, 30, 10 y 5 segundos, el tercer y cuarto pigmento fueron de un minuto y 30 segundos, finalmente el último fue de uno y cinco minutos.

El procedimiento de tinción fue el siguiente: en un vidrio de reloj se colocaron cinco gotas del colorante a utilizar y en otra agua destilada para enjuagar, con la ayuda de un pincel se

43 extrajo un corte hidratado de la caja Petri, se sumergió en el colorante al mismo tiempo que el cronómetro comenzó a contar el tiempo asignado, al finalizar se enjuagaron en agua destilada hasta ya no desprender más colorante. Se observaron en un microscopio óptico compuesto con objetivos de 5x, 10x y 40x. Cabe mencionar que algunos de los siguientes procesos tuvieron varios ensayos antes de realizar la tinción para el montaje permanente.

5.4.3 Preparación y fijación de las semillas en parafina

Los materiales biológicos llevan a cabo el proceso de degradación, para evitarla es necesario someterlas a un proceso y estabilizar sus estructuras, para ello se utilizan sustancias químicas también conocidas como fijadores.

Se extrajeron 15 semillas de un fruto maduro (Figura 9A), se lavaron correctamente, posteriormente se sometieron a un fijador (proporcionado por el laboratorista) por 24 horas a temperatura ambiente y con luz natural.

5.4.4 Lavado y Deshidratación

Transcurrido el tiempo, las semillas se lavaron de la siguiente manera: cinco enjuagues por dos minutos con agua de llave y cinco enjuagues más por un minuto con agua destilada.

Posteriormente, se realizó una solución para la primera deshidratación: en una probeta se midieron 30 mililitros de alcohol absoluto y se completaron 100 ml con agua destilada, la solución se vertió en un nuevo frasco junto con las semillas, se etiquetó con el nombre de la especie y el responsable. Se dejó en reposo a temperatura ambiente por 48 horas (Figura 9B).

5.4.5 Procesador Automático de Tejidos

Para el siguiente método se utilizó un Procesador Automático de Tejidos LEICA TP 1020, el cual sirve para la fijación, deshidratación, purificación y finalmente la infiltración mediante parafina liquida, el procesador contiene 12 estaciones, los primeros 10 vasos contienen diferentes grados de alcohol y los últimos dos vasos parafina liquida (Cuadro 3).

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Cuadro 3: Orden del grado de alcohol y parafina en el Procesador de Tejidos. ESTACIÓN CONTENIDO DE ALCOHOL 1 50% 2 70% 3 96% 4 100% 5 100% 6 100% 7 Xilol 8 Xilol 9 Xilol 10 Xilol 11 30% alcohol y 70% parafina 12 100 % Parafina FUENTE: Elaboración propia (2018)

Las semillas fueron retiradas de la solución y colocadas en cápsulas de aluminio, estas fueron envueltas en tela de tul amarradas con hilo cáñamo blanco (para evitar que salieran del recipiente). Las cápsulas fueron colocadas en el interior de un casete, se colocó en un vaso que luego fue sumergido en el primer contenedor con alcohol al 50%. Las semillas se mantuvieron en cada estación por 8 horas, un total de 4 días en el procesador (Figura 9C).

5.4.6 Inclusión en Parafina

Con el fin de observar las muestras en el microscopio óptico compuesto, estas se incluyeron primero en parafina. Para ello se empleó parafina solida marca MERCK y para poder utilizarla se colocó en un horno de convección a 65° C por 24 horas.

En tres charolas de aluminio se vertió la parafina liquida y enseguida se retiraron las cápsulas de la estación doce, se extrajeron las semillas y se colocaron cinco en cada charola de aluminio, se dejó reposar el tiempo necesario hasta que la parafina se solidificó completamente (Figura 9D). Posteriormente las muestras fueron sacadas de las charolas, emparejando la superficie irregular del bloque con la ayuda de un cuchillo, luego seccionado de acuerdo con el número de semillas, obteniendo un cubo (Figura 9E); una vez

45 que los cortes se encontraron en bloques, se eliminó el exceso de parafina que rodeaba la pieza incluida y de acuerdo con el área a cubrir sobre la cara superior del soporte de madera, después, con la ayuda de una navaja de disección y una lámpara de alcohol fueron adheridos fijamente entre el bloque y el soporte con el derretimiento de la misma parafina, dejando enfriar a temperatura ambiente (Figura 9F).

5.4.7 Microtomía

El siguiente procedimiento fue la obtención de los cortes histológicos. Para ello, se utilizó una caja de papel donde los cortes fueron colocados, unas pinzas sencillas, un pincel y un micrótomo rotatorio LEICA RM 212 RT.

En esta etapa, la semilla y la parafina integran un solo bloque, que posee la dureza y la consistencia suficiente para la obtener secciones delgadas y transparentes, para ello: se colocó el soporte de madera sobre el brazo del micrótomo, orientando la cuchilla reciclable del equipo y la pieza de tal forma que la navaja se encontrara paralelo a la superficie del bloque de parafina. Primero se realizaron pruebas del grosor del corte iniciando con 12, 14, 16, 18 y 20 micras, en posición longitudinal, transversal y tangencial. Se seleccionaron cortes de las diferentes micras y se adhirieron a un portaobjetos (en el punto 5.4.8 se explica detalladamente el proceso), se observaron en un microscopio óptico compuesto con el fin de identificar a que micra se obtiene un mejor corte. Identificado el grosor de las secciones, se procedió a realizar los cortes de cada semilla de acuerdo con las secciones objetivo (trasversal, longitudinal y tangencial). Se sujetó firmemente el bloque con la abrazadera del micrótomo y la muestra orientada correctamente, alineando el filo de la navaja con la superficie de corte. En el dial del micrótomo se marcó el número de micrómetros de grosor de los cortes, se accionó la manivela que desplaza la abrazadera y cuidadosamente se desgastó la superficie del bloque de parafina hasta que se alcanzó la semilla, teniendo la certeza de abarcar toda el área que se deseaba seccionar, continuamente se obtuvieron los cortes y con la ayuda de una pinza y un pincel fino se recogieron y colocaron cuidadosamente en una caja de papel. Este procedimiento se repitió con cada bloque de parafina con las tres diferentes direcciones de cortes (Figura 9G).

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5.4.8 Adhesión a portaobjetos

Los cortes obtenidos, se adhirieron a un portaobjetos utilizando una plancha termostática (C. S. & E. SLIDE WARMER) y las siguientes dos sustancias: adhesivo de Haupt y formol al 10%. Se realizaron dos procedimientos diferentes, para ello, el primer paso fue identificar el mejor corte.

El primer procedimiento consistió en colocar sobre el portaobjetos de una a dos gotas de adhesivo, formol y consecutivamente sobreponer la sección elegida, seguidamente se colocó el portaobjetos tan solo unos segundos sobre la plancha caliente (56°C) y se retiró hasta observar que la parafina adquiría un tono brilloso, se escurrió el exceso producido de las sustancias, dejando enfriar por unos minutos la muestra, finalmente se observaron en microscopio para identificar errores en el proceso.

El segundo radicó en colocar sobre el portaobjetos una a dos gotas de adhesivo, formol y consecutivamente colocarlo tan solo unos segundos sobre la plancha para que las sustancias se entibiaran, se retiró y seguidamente se colocó el corte seleccionado, pasado unos segundos se escurrió el exceso de las sustancias, se dejó enfriar por unos minutos y se observaron en microscopio para identificar errores en el proceso.

Una vez adheridos los cortes de los tejidos a los portaobjetos, estos se encontraban listos para ser teñidos, pero antes fueron colocados en una canastilla de metal e introducidos a una estufa de convección a 45°C, por 24 horas para tener un secado de las sustancias utilizadas y obtener una buena adhesión (Figura 9H).

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El proceso puede resumirse en el conjunto de imágenes de la Figura 9.

B C A

D E F

H

G

Figura 9. Representación de los pasos consecutivos que se requieren para obtener: A) Extracción de las semillas del fruto. B) Lavado y deshidratación. C) Procesador automático de tejidos. D) Inclusión en parafina. E) Cubo de parafina solida con la semilla en el centro. F) soportes de madera con los cubos de parafina. G) Cortes histológicos. H) Adhesión en portaobjetos. FUENTE: Fotografías propias (2018)

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5.4.9 Tinción de corte

El procedimiento de tinción consistió en lo siguiente:

Primero, preparación del colorante Azul de Toluidina en la proporción 0.1g por cada 100 ml. Para ello, se balanceó una báscula tradicional y en una tara se pesó un gramo del colorante, seguidamente se midió un litro de agua destilada y se vertieron en un matraz de vidrio junto con Azul de T., para poder obtener una mezcla uniforme se introdujo una cápsula electromagnética dentro del matraz y colocado sobre un agitador durante 30 min. La solución se filtró para evitar sustancias que pudiesen perjudicar el proceso de tinción.

Se utilizaron 20 cestillas especiales de vidrio, cada una con un reactivo en diferentes grados de concentración y dos de ellos para el colorante Safranina O y Azul de Toluidina (Cuadro 4). Los portaobjetos fueron colocados sobre una rejilla dispuesta en una bandeja, el protocolo de tinción empleado fue primero Safranina O y luego Azul de Toluidina.

El proceso de tinción de dividió en las siguientes fases:

1. La primera fase consistió en el desparafinado de los cortes, para ello fueron bañados en xileno el cual disuelve la parafina, luego sumergidos en diferentes grados de alcohol. 2. Desparafinado el corte, se procedió con el protocolo de tinción, el cual consistió en una secuencia de baños con los colorantes, limpiadores y reactivos, propios de la técnica.

Los cortes fueron sumergidos en diferentes tiempos en los reactivos y colorantes, como se muestra a continuación en el Cuadro 4:

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Cuadro 4: Protocolo de procesamiento de muestras de G. americana L., para la desparafinación, hidratación y tinción de los cortes.

COMPONENTE TIEMPO DE COMPONENTE TIEMPO DE PERMANENCIA PERMANENCIA (MINUTOS) (MINUTOS) Xilol 4 Alcohol 30% 3 Xilol 4 Agua destilada 1 Xilol 4 Azul de Toluidina 25 Alcohol 100% 4 Agua destilada 1 Alcohol 96% 4 Alcohol 96% 4 Alcohol 50% 4 Alcohol 96% 4 Safranina O 35 Alcohol 100% 4 Agua destilada 1 Alcohol 100% 4 Alcohol 70% 1´30¨ Xileno 2 Alcohol 50% 2 Xileno 2 FUENTE: Elaboración propia (2019).

5.4.10 Montaje permanente

La última fase consiste en el montaje permanente de las muestras para su observación al microscopio. Para montar y proteger los cortes, primero se extrajeron de la última canastilla de vidrio una por una, se limpiaron cuidadosamente sin dañar el corte, posteriormente se colocó encima de ellos resina sintética (medio de montaje) y un cubreobjetos, que forman un conjunto estable y duradero. La preparación montada se dejó secar unas horas en un horno de convección a 45 °C, para su posterior observación.

5.4.11 Identificación y observación en microscopio

La primera dinámica de observación de muestras en el microscopio de fluorescencia compuesto (AXIO ZEISS SCOPE A1), fue transmitida a una computadora de escritorio con el uso del programa ZEN 2012 (instalada previamente) y fue la siguiente:

La preparación fue colocada sobre la platina y observada con el objetivo de menos aumento (4x), se navegó sobre todo el corte localizando las áreas de interés y elementos singulares.

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Se fueron utilizando progresivamente los objetivos mayores (10x, 20x, 40x y 100x, en este último se empleó un aceite especial), se tomaron fotos con el uso del programa instalado, las imágenes obtenidas por el programa se editaron de acuerdo con el objetivo perseguido (claridad, enfoque y tamaño).

Se realizaron también dos pruebas de fluorescencia la primera consistió en cortar un trozo muy pequeño del pericarpio de la fruta y se maceró ligeramente, se colocó sobre un portaobjetos agregándole dos gotas de agua, posteriormente se sobrepuso un cubreobjetos para poder ser observado en el microscopio. La preparación fue colocada sobre la platina y enfocada con el objetivo 4x utilizando progresivamente los objetivos de mayores aumentos, además de identificar el filtro en el que se presenta fluorescencia. La segunda prueba consistió en utilizar cortes en fresco (el proceso de obtención de cortes se describe en el punto: 5.4.1 Cortes con micrótomo manual), tiñendo con el colorante Naranja G. al 10% y Rodamina 6G, en diferentes tiempos. El primer ensayo consistió en colocar 5 gotas de Naranja G. en el reloj de vidrio y sumergir el corte por un minuto e inmediatamente se pasó al agua destilada para el enjuague, se colocó sobre un portaobjetos sobreponiendo una lámina muy fina de vidrio, enseguida la muestra fue observada en el microscopio con los tres de filtros diferentes (verde, azul y rojo) y observada con los diferentes objetivos, al mismo tiempo que se tomaron fotos de la fluorescencia emitida en cada filtro. El segundo experimento consistió en el mismo procedimiento que Naranja G., solo que en este caso se utilizó Rodamina 6G.

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6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Datos de la recolección de frutos

Los frutos trabajados, en el primer lote, fueron recolectados en tres árboles diferentes en el municipio de Malinaltepec, Guerrero, de acuerdo con la información del apartado 5.1 se presentan los siguientes datos:

Cuadro 5: Información de los árboles en los que fueron colectados los frutos del primer lote de semillas G. americana L.

ÁRBOL ALTURA (m) TAMAÑO DE COPA NÚMERO DE FRUTOS RECOLECTADOS 1 2 Chica 2 2 15 Grande 92 3 7 Mediana 168 FUENTE: Comunicación personal (2018).

Los árboles presentaban fustes cilíndricos, corteza color café oscuro y liso, la ramificación era de forma helicoidal y ramas flexibles. Las hojas maduras eran en el haz lisas y lustrosas de color verde oscuro, mientras que el envés verde claro opaco, dispuestas al final de las ramas, en esa época los árboles no presentaban flores (Fotografías de Natalia Hernández) (Figura 10). El lugar de la colecta fue cerca de un de un río a una distancia aproximada de 100 metros, el uso del suelo del lugar es el pastoreo (Hernández, 2018 com. pers.). La especie en este lugar se le observan flores en el mes de julio aproximadamente y con mayor fructificación en el mes de diciembre a abril.

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A B C Figura 10. Árbol de G. americana L., en el pueblo de Santa Cruz del Rincón. A) Árbol joven de Tejoruco. B) Follaje poco abundante. C) Hoja inmadura de la especie FUENTE: Hernández, (2018).

La segunda muestra de frutos fue colectada de un solo árbol, en Ocotito, Chilpancingo de Bravo, el cual presenta la siguiente información:

Cuadro 6: Información del árbol en el que fueron colectados los frutos del segundo lote de semillas de G. americana L.

ÁRBOL ALTURA (m) TAMAÑO DE COPA NÚMERO DE FRUTOS RECOLECTADOS 1 16 Grande 84 FUENTE: Elaboración propia (2018).

Del total de frutos colectados en el segundo lote, 71 se encontraron en estado de madurez y 13 inmaduros. El árbol presentaba un fuste ligeramente cilíndrico, corteza lisa y color café claro, las ramas mostraban manchas redondas de color blancas, ramificación verticilada, hojas simples y opuestas, de forma oblonga-ovalada, has liso-lustroso y color verde oscuro, mientras que el envés verde claro, dispuestas al final de la rama, el árbol presentaba follaje denso. Las pocas flores que se presenciaron eran de color amarillo con cinco pétalos. Los frutos se

53 encontraban en los extremos de las ramas (Figuras 11). Se observó que en todo el árbol se presentaban hormigas negras, así como manchas foliares. El lugar donde se realizó la colecta fue en el centro del pueblo de Ocotito y se encontraba en el patio de una casa. El mes de mayor floración en este sitio es julio y los primeros frutos comienzan a observarse a partir de agosto, cabe destacar que la floración se mantiene en menor cantidad durante el resto del año (Pintor, 2019 com. pers.). Las especies asociadas más observables en el lugar son: Mangifera indica, Swietenia macrophylla, Licania arborea, Burcera simarua, Cecropia obtusifolia, Ceiba aesculifolia, Byrsornima crassifolia, Cochlospermum vitifolium, Curatella americana, Leucaena spp., Ficus trigonata y Acacia cornígera (Pintor, 2019 com. pers.). Datos recolectados por Wilson et al., (2018) en un paraje próximo al municipio de San Luis Acatlán, estado de Guerrero, describe que la especie se encuentra en un hábitat de selva baja caducifolia, a un altura de 280 msnm; el árbol del que se realizó la recolecta de frutos presentaba la siguientes características: altura de cinco metros, corteza café, haces vasculares jóvenes blancos y maduros de color amarillo; flores color blanco-amarillento, frutos verdes, los cuales con utilizados para consumo; la cual coincide con la descripción de los árboles de las comunidades donde fueron realizados las recolectas.

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A B C

D E Figura 11. Árbol de G. americana L., en el pueblo de Ocotito. A) Fuste de la especie de color gris claro y manchas blancas en las ramas. B) Presencia de follaje abundante. C) Los frutos se encuentran en los extremos de las ramas. D) Hojas, flor y fruto. E) Flor de tejoruco. FUENTE: Fotografías propias (2018).

Arias et al., (2006) y Orozco et al., (2006) mencionan que G. americana L., fructifica durante todo el año y un mismo individuo puede poseer frutos en todos los estados de crecimiento por la periodicidad en la floración y la larga durabilidad de los frutos; los cuales tardan hasta un año en madurar (Orozco et al., 2002). Se reporta que los árboles de jagua en el estado de Pará, en Brasil, florecen de julio a diciembre y producen frutas de octubre a junio (Müller et al., 1989). En Haití esta especie produce fruto de septiembre a enero, alcanzando un máximo en octubre y noviembre (Francis, 1993); mientras que, en Santa Cruz del Rincón, Malinaltepec y Ocotito, Chilpancingo de Bravo, ambos del estado

55 de Guerrero, la floración comienza en el mes de julio y la fructificación de diciembre a abril para el primer sitio y en agosto para el segundo, teniendo una diferencia significativa con respecto a la producción de frutos. Ambos sitios a nivel municipal presentan el mismo clima, temperatura, una precipitación similar y un rango de altitud de 400-2600 para Malinaltepec y 200-2600 msnm para Chilpancingo de Bravo, así como a nivel comunidad, la diferencia no varía mucho, cuentan con las mismas condiciones climáticas, de temperatura y precipitación. Por lo que, los periodos de floración son similares en ambas comunidades, pero el periodo de fructificación diferentes.

La fruta de la especie es consumida por los animales silvestres y el ganado doméstico (Janzen et al., 1983; Little et al., 1964). A la vez, las flores son una fuente de néctar para las abejas de miel (Lioger, 1978), para el primer sitio los árboles que se encontraban en un terreno de pastoreo, las frutas posiblemente pueden ser consumidas por el ganado y demás fauna, además de ser utilizado como árbol de sombra para estos animales de pasto, otros usos posibles a esta especie es de postes de cercas vivos y para leña; en el pueblo de Ocotito, se observó que el uso dado a esta especie es ornamental, además se de ser una fuente de alimento para diversos mamíferos como los murciélagos, ardillas y diversas aves e insectos, que a su vez ayudan con la dispersión de las semillas.

Francis (1993) menciona que la especie es en su mayoría un componente menor en bosques primarios, creciendo por lo usual como árboles solitarios. En Brasil y Venezuela la densidad de los árboles del estrato superior puede variar de uno a dos por hectárea hasta uno en varias hectáreas (Martorell, 1975; Veillón, 1963). En contraste, la especie es común en tierras previamente usadas para la agricultura, en particular en la cercanía de viviendas ya sea en uso o en desuso. Casi todos los árboles de jagua en Puerto Rico se encuentran en fincas de subsistencia en uso o abandonadas (Francis, 1993), lo anterior se puede comparar con lo observado en los sitios de colecta, donde en Santa Cruz del Rincón, Malinaltepec, los árboles se encontraban en un terreno asignado al pastoreo, mientras que, en Ocotito, Chilpancingo de Bravo, el árbol se encontraba en el patio de una casa, además presentaba una plaga de hormigas negras y manchas foliares color amarillas. Varios insectos coleópteros, homópteros y lepidópteros se reportan usando la especie como huésped, aunque ninguno parece causar un daño serio (FAO, 1986; Martorell, 1975).

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6.2 Análisis de semillas de Genipa americana L.

Del proceso de análisis, siguiendo las etapas descritas en el punto 5.2, las semillas del Lote 1 y Lote 2 de G. americana L., arrojan lo siguiente:

6.2.1 Pureza

Con 8 repeticiones para el Lote 1 y 20 para el Lote 2, el peso total de los frutos fue de 400.544 y 809.331 gramos respectivamente y el promedio por fruto de 50.068 gramos para el primero y 40.467 para el segundo, así mismo, el peso y el número de semillas promedio por fruto fue de 13.435 gramos con 148 y 8.838 con 117, correspondientemente. El peso total de las semillas para el Lote 1 fue 107.476 gramos (8 frutos) y 176.767 para el segundo (20 frutos), teniendo un porcentaje de pureza del 26.8% y 21.8% respectivamente, tal como se muestran en los Cuadros 7, 8 y 9.

Cuadro 7. Datos de los frutos del Lote 1.

FRUTO PESO DEL PESO DE LAS NÚMERO DE FRUTO SEMILLAS SEMILLAS POR FRUTO 1 51.364 13.558 147 2 54.962 13.367 172 3 56.821 15.806 172 4 52.756 14.922 157 5 44.283 12.46 128 6 50.124 12.976 154 7 46.341 12.512 140 8 43.893 11.875 113

TOTAL 400.544 107.476 1183 PROMEDIO 50.068 13.435 148 DESVIACIÓN 4.840 1.326 20.560 ESTANDAR FUENTE: Elaboración propia (2019).

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Cuadro 8. Datos de los frutos del Lote 2.

FRUTO PESO DEL PESO DE LAS NÚMERO DE FRUTO (gr) SEMILLAS (gr) SEMILLAS POR FRUTO 1 36.736 9.047 119 2 41.733 9.351 123 3 44.36 9.745 127 4 43.24 9.275 122 5 46.58 7.92 106 6 39.57 8.867 117 7 45.252 11.535 113 8 37.398 9.286 108 9 39.945 7.218 82 10 36.315 6.706 99 11 40.492 8.376 110 12 44.104 10.245 121 13 42.02 9.362 121 14 3.494 8.19 120 15 42.516 10.061 130 16 45.151 9.621 117 17 52.3 10.851 144 18 44.585 6.706 133 19 42.988 6.969 117 20 40.552 7.436 119

TOTAL 809.331 176.767 2348 PROMEDIO 40.467 8.838 117 DESVIACIÓN 9.455 1.374 12.931 ESTANDAR FUENTE: Elaboración propia (2019).

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Cuadro 9. Prueba de pureza de las semillas con respecto al fruto de G. americana L.

CANTIDAD DE PESO TOTAL DE PESO TOTAL DE % DE FRUTOS FRUTOS (gr) SEMILLAS (gr) PUREZA

LOTE 1 8 400.544 107.476 26.8 LOTE 2 20 809.331 176.767 21.8 FUENTE: Elaboración propia (2019).

Los resultados encontrados muestran que los frutos recolectados del Lote 1, en promedio cuentan con mayor peso, el cual puede explicarse posiblemente por el periodo de tiempo que se mantuvieron hidratadas en refrigeración, en comparación al Lote 2 que se mantuvo en condiciones ambientales después de su colecta, con respecto a la cantidad de semillas, se debe al tamaño que estas tenían, puesto que eran ligeramente más grandes en comparación a las del Lote 1 y debido posiblemente a la época de colecta. Francis (1993) menciona que en Brasil las frutas de jagua han rendido un promedio de 266 semillas por fruta, el doble de cantidad en comparación con las obtenidas en los sitios del estado de Guerrero. 6.2.2 Peso

Con los datos descritos en los Cuadros 7 y 8, estableciendo una relación donde 107.476 gramos equivalen a 1 183 semillas, por lo que un kilogramo tendrá aproximadamente 11 007 semillas para el Lote 1, mientras que para el Lote 2, un kilogramo tendrá cerca de 13 283 semillas (Cuadro 10).

Cuadro 10: Obtención de la cantidad de semillas que existen por kilogramo.

CANTIDAD PESO SEMILLAS CANTIDAD DE DE FRUTOS TOTAL DE TOTALES SEMILLAS/KILOGRAMO SEMILLAS (gr) LOTE 1 8 107.476 1 183 11 007 LOTE 2 20 176.767 2 348 13 283 FUENTE: Elaboración propia (2019).

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La relación existente entre el peso promedio del fruto, la cantidad y el peso de semillas en el Lote 1 es que un fruto pesa aproximadamente 50.168 gramos llegando a contener 148 semillas con un peso promedio de 13.435 gramos (DE=1.326), mientras que en el Lote 2, encontramos que un fruto puede pesar cerca de 40.467 gramos con 117 semillas en su interior con un peso promedio de 8.838 (DE=1.374). Estableciendo una inferencia de cálculo se obtiene que la cantidad de 1000 semillas pesan aproximadamente 90.85 gramos para el primer lote y 75.28 gr para el segundo, lo anterior es debido a que las semillas de los frutos del primer lote eran ligeramente más pequeñas que las del Lote 2. Por otra parte, el número de semillas por kilogramo varía en función de la especie, incluso entre dentro de esta (de árbol a árbol), conocer tal dato es importante, porque permite calcular cantidades de semillas necesarias a utilizar, para alguna actividad. El Sistema Nacional de Información Forestal (S/A), establece que el número de semillas por kilogramo para esta especie es de 4 500 a 8 000 (11 000) semillas mientras que González (1991) menciona que existen 9 200 semillas por kilogramo, su estudio lo realizó en el país de Costa Rica, en la estación Biológica La Selva; Müller (1989) menciona que las semillas de los frutos de Brasil pesaron un promedio de 0.078 g por semilla y hubo 12,800 semillas por kilogramo. Una muestra de semillas en Puerto Rico promedió 14,770 semillas por kilogramo (Marrero, 1949). En otra muestra procedente de Puerto Rico, las semillas promediaron 0.050 g por semilla o 20,000 semillas por kilogramo (Francis, 1993).

6.2.3 Contenido de humedad

Este parámetro importante tiene relación con la longevidad de la semilla, su determinación nos permite saber las condiciones de almacenamiento. Del método utilizado para la determinación del contenido de humedad se obtuvo que los porcentajes con base al peso húmedo para el Lote 1 fue de 8.35% y 10.566% para el segundo (Cuadro 11), también se puede observar que los porcentajes determinados son mayores utilizando el método del peso seco teniendo 0.761% y 1.248% de diferencia respectivamente.

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Cuadro 11. Contenido de humedad en ambos lotes.

PESO PESO CONTENIDO DE CONTENIDO DE FRESCO ANHIDRO HUMEDAD EN HUMEDAD EN PESO (Pf) (Po) PESO SECO (CHo) FRESCO (CHf) LOTE 1 2.491 2.283 9.111% 8.35% LOTE 2 2.953 2.641 11.814% 10.566% FUENTE: Elaboración propia (2019).

La proporción porcentual del contenido de humedad del peso de 100 semillas húmedas con respecto al peso total de estas es de 2.317% para el primer lote y 1.670% para el Lote 2, teniendo una diferencia menor al uno por ciento (0.647%). Por otra parte, los resultados desiguales obtenidos entre ambos lotes pueden deberse al grado de maduración del fruto durante su colecta y al tiempo trascurrido desde su cosecha hasta las pruebas realizadas. Salomão et al., (2006), reporta que la humedad inicial de las semillas de G. americana L., está directamente relacionada al grado de maduración de los frutos. La relación entre contenido de humedad y varios procesos que tienen lugar dentro de la semilla, los reporta Willan (1991) según se muestra en el Cuadro 12, el Lote 1 se encuentra dentro del rango de contenido de humedad donde existe una importante reducción en el ataque de insectos, mientras que el Lote 2 se encuentra en la misma, pero ante un posible desarrollo de hongos. El Sistema Nacional de Información Forestal (S/A), recomienda que las óptimas condiciones de almacenamiento se encuentran entre el 6 a 10% de contenido de humedad a 4°C y puede almacenarse por un año a 17°C con 50% de CHo. Por otro lado, González (1991) menciona que el contenido de humedad en las semillas de G. americana L. es del 29% y Ramírez et al., (2010) indica que es de aproximadamente 43%, ambos resultados de los autores superan el porcentaje obtenido en los dos lotes de semillas.

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Cuadro 12. Contenido de humedad y procesos que acontecen a la semilla.

CONTENIDO DE HUMEDAD (%) PROCESO OCURRIDO Entre 45 y 60 Empieza la germinación Entre 16 y 20 La semilla puede calentarse, a causa de una tasa rápida de respiración Entre 12 y 14 Posible desarrollo de hongos Entre 8 y 9 Importante reducción en el ataque de insectos Entre 4 y 8 Almacenamiento, en condiciones herméticas, sin peligro de ataques FUENTE: Willian R. L. (1991)

Salomão et al., (2006) recomienda que el secado de semillas de la especie, a un contenido de humedad crítico entre 9-6% resulta en decremento en el porcentaje de germinación, al igual que en contenido de humedad entre 38-42%. Mientras que cuando se almacena a temperatura ambiente a 11% de contenido de humedad la germinación se mantiene por más tiempo. 6.2.4 Pruebas de viabilidad

La estimación del porcentaje de viabilidad de las semillas de Genipa americana L., se realizó mediante dos pruebas:

Flotación Los resultados en esta prueba muestran un alto porcentaje de viabilidad en ambos lotes, 99% para el Lote 1 y 100% para el segundo, como se muestra el Cuadro 13 (Figura 12). Cabe mencionar que datos obtenidos cuentan con un margen de error mayor en comparación a la prueba de tinción de tetrazolio y a la prueba de germinación. Debido a la falta de información de este experimento sobre esta especie, los datos no pueden compararse con alguna otra investigación.

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A B Figura 12. Prueba de viabilidad utilizando el método de flotación. A) Lote 1. B) Lote 2 FUENTE: Fotografías propias (2018).

Tinción de Tetrazolio Esta prueba, mayormente utilizada para estimar la viabilidad muestran un porcentaje de 85 para el Lote 1 y 88% de viabilidad en el Lote 2 (Cuadro 13), indicando que una muestra de 100 semillas se puede encontrar ese porcentaje aproximado de semillas latentes. En el estudio realizado por Ramírez et al., (2010), reportan que el porcentaje de viabilidad promedio obtenido por el método de Tinción con Tetrazolio para las semillas de G. americana L. fue de 75%, ligeramente por debajo de los resultados obtenidos en ambos lotes.

Cuadro 13. Porcentajes de viabilidad correspondientes a cada prueba.

PRUEBA DE PRUEBA DE TINCIÓN DE FLOTACIÓN TETRAZOLIO LOTE 1 99 % 85% LOTE 2 100% 88% FUENTE: Elaboración propia (2019).

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Medina (1977) menciona que el embrión se tiñera de color rojo carmín, al hidratarse y entrar en actividad las enzimas hidrolíticas y oxidorreductasas (deshidrogenadas), de manera que en el citoplasma de la célula el 2, 3,5 trifenil tetrazolium es reducido a formazán, indicando así que el embrión de la semilla se encuentra vivo (Figura 13).

A B

Figura 13: A) Tinción de las semillas de G. americana L. con la prueba de viabilidad con sales de tetrazolio. B) del lado izquierdo se observa la actividad bioquímica presente en la semilla, indicando latencia, mientras que en el lado derecho no se muestra ninguna reacción. FUENTE: Fotografías propias (2018).

Bradbeer (1988) postula que, si más del 90% de las semillas sometidas a la prueba de tetrazolium se observaban en intensa tinción, podríamos asegurar, en el caso de cultivos un excelente establecimiento en el campo, por lo que los resultados de esta prueba pueden concluir un comportamiento y un porcentaje de germinación de la especie diferente en un establecimiento en campo.

6.2.5 Prueba de germinación

La prueba tuvo una duración de 42 días para el Lote 1 y 57 días para el segundo a partir de la fecha de siembra. En los resultados de esta prueba, se observó una diferencia muy notoria en el porcentaje de germinación entre ambos Lotes (48.75%), siendo el primero con menor porcentaje (31.75%) y el segundo con 80.5%, a pesar de que fueron sometidos bajo

64 las mismas condiciones. Esto lo podemos apreciar en el Cuadro 14 y en la Figura 14, donde se muestra el porcentaje de germinación en cada repetición de cada lote.

Cuadro 14. Porcentaje de germinación por repetición en cada Lote.

LOTE REPETICIÓN % GERMINACIÓN 1 1 43 2 36 3 30 4 18 % PROMEDIO 31.75 DESVIACIÓN 10.595 ESTANDAR

2 1 88 2 85 3 79 4 70 % PROMEDIO 80.5 DESVIACIÓN 7.937 ESTANDAR FUENTE: Elaboración propia (2019).

100 90 80 70 Rep. 1 60 Rep. 2 50 Rep. 3 40 Rep. 4

30 % DEGERMINACIÓN % 20 10 0 1 2 LOTE Figura 14. Representación gráfica del porcentaje de germinación de G. americana L., de cada repetición de cada Lote. FUENTE: Elaboración propia (2019).

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Se observaron dentro de las cajas germinadoras semillas teñidas de color azul marino que no fueron germinadas, posiblemente debido a que las semillas eran inmaduras. Es probable que el bajo porcentaje de germinación del primer lote se deba a que las condiciones dadas no hayan sido favorables para esta especie, también puede deberse al tiempo trascurrido desde su cosecha hasta las pruebas realizadas. Silva et al., (2006), mencionan que la temperatura óptima para germinación de las semillas de G. americana L., extraídas de frutos inmaduros y de frutos maduros se encuentra en la franja de 22°C a 31°C, las temperaturas dadas en este caso para ambos lotes de semillas fue 20°C de noche y 25°C de día, por lo que existe la posibilidad de que la temperatura de noche haya influido en el porcentaje de germinación. Ramírez et al., (2010) concluyó en su trabajo de investigación que los porcentajes más altos de germinación para las semillas almacenadas se presentaron con tortolita a temperatura ambiente, condición dada muy diferente con respecto a las establecidas para este trabajo.

OFI-CATIE (2003) menciona que la germinación de la especie es rápida, iniciando 8-15 días posterior a la siembra y finaliza 25 a 30 días después, por otro lado, según las apreciaciones de González (1991) la germinación comienza a los 26 y culmina a los 72 días, presenta germinación epigea y un porcentaje del 34%, sin embargo, Ramírez et al., (2010) indica en sus resultados de investigación que la germinación inicial es de 78.33% durante un periodo de 33 días. Los resultados obtenidos en ambos lotes son diferentes a los emanados por OFI – CATIE y González con respecto al comienzo y término de la germinación, sin embargo, el porcentaje de plántulas obtenidas solo es aproximado con los resultados adquiridos con el autor González para al primer lote y Ramírez et al., para el Lote 2, esto puede deberse probablemente a que los estudios realizados fueron en zonas diferentes (país, zona, variación climática, altitud y edáfica); Nascimento et al., (1998), mencionan que entre los problemas con esta especie, se ha reportado la rápida pérdida de viabilidad de sus semillas, lo que ha obligado a la siembra después de la remoción de sus frutos, a fin de obtener los mejores resultados de germinación.

Capacidad germinativa

Puede describirse también como el porcentaje de germinación final de ambos lotes, es decir, la relación existente entre el total de plántulas obtenidas entre las semillas sembradas;

66 es también un indicador de calidad, no obstante, deben considerarse otros parámetros para obtener una mayor seguridad en los resultados.

En la Figura 15, se ilustra la velocidad germinativa de G. americana L. identificados como Lote 1 y 2. En cada caso la capacidad germinativa fue de 31.75% y 80.5% respectivamente. De acuerdo con los resultados el Lote 2 tuvo mayor vigor y capacidad, porque manifestó un proceso con mayor regularidad, a pesar de iniciar la germinación a los 16 días de la siembra, mientras que el Lote 1 lo realizó a los 14, aun cuando los dos lotes tuvieron aparentemente las mismas condiciones para la germinación, lo anterior puede deberse posiblemente a eventos ocurridos después de la cosecha, época y estado de maduración con que se colectó y localidad.

100 90 80 70 60 50 40 30

20 GERMINACIÓN (%) GERMINACIÓN 10 0 0 10 20 30 40 50 60 TIEMPO (DÍAS)

LOTE 1 LOTE 2

Figura 15. Diferencia en la capacidad germinativa entre Lote 1 y 2 de G.

americana L.

FUENTE: Elaboración propia (2019).

Análisis estadístico La prueba de Wilcoxon, indica que hay diferencias estadísticamente significativas (P = 0.0179) entre los dos Lotes estudiados. La germinación media del Lote 1 fue 39.4% (DE = 19.41), mientras que la del Lote 2 alcanzó 84.0% (DE = 4.58).

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6.3 Estructura del fruto de Genipa americana L.

El fruto es una baya globosa a elipsoidal, con exocarpo liso, delgado y color café-grisáceo, con pulpa carnosa color amarillo pálido, el fruto presenta numerosas semillas encerradas en membranas ordenadas en fila. (Figura 16).

ex

ex s s

me A me B Figura 16. Corte trasversal y longitudinal del fruto de G.Mc americana L. Exocarpo (ex). Semilla (s). Mesocarpio y endocarpio (me). FUENTE: Fotografías propias, 2018.

CATIE (2000), menciona que los frutos son sub-globosa u ovoide, de 9 a 15 centimetros de largo y de 6.5 a 8.5 de diametro; corteza coriacea, olor agrio y pulpa color castaño amarillo, por otro lado Davidse et al., (2012), indica que los frutos son subglobosas a elipsoidales, pardas o negruzcas, el pericarpo coriáceo a leñoso, liso o a veces suberoso, la pulpa carnosa y frecuentemente de color oscuro; semillas numerosas, elipsoidales a subcirculares, comprimidas, lisas; la descripcion de los autores coinciden con las observaciones encontradas en los frutos estudiados.

6.4 Estructura externa de la semilla de Genipa americana L.

De acuerdo con las fotos obtenidas mediante el programa, se pudo apreciar de manera más detallada la estructura externa de la semilla de la especie, el cual presenta una capa envolvente de tricomas color blanco apreciable cuando estas se encuentran hidratadas (Figura 17).

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Figura 17. Vista superficial de la semilla hidratada de G. americana L.

Megías et al., (2018), hace referencia a que histológicamente hay una gran variedad en la organización de la cubierta de las semillas según las diferentes especies de plantas y estas envueltas protectoras pueden proceder de las células de la nucela o incluso del saco embrionario, este caso nuestra cubierta protectora son los tricomas.

La mayoría de las semillas presenta una forma oblonga, delgadas, con color amarillo ocre y textura ligeramente rugosa con patrones de líneas que parten del centro hacia el exterior, como se puede apreciar en la Figura 18.

B

A C Figura 18. Vista superficial de la semilla de G. americana L., sin tricomas. A) apreciando forma. B-C) color y textura de esta.

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CATIE (2003) describe que las semillas son duras, llanas y color café oscuro, de 10–12 milímetros de largo y se encuentran cubiertas por la fibra del mesocarpio, esto último posiblemente refiriéndose a los tricomas observados en la Figura 17.

El micrópilo es una pequeña apertura a manera de canal por donde puede entrar el agua para favorecer la germinación, siendo la manera en que la semilla se comunica con el exterior, esta apertura se aprecia más cuando se encuentra en etapa de germinación, tal como se muestra en la Figura 19.

Mc Mc

A B

rd

C Figura 19. Vista superficial de la semilla de G. americana L, en etapa de germinación; AB) abertura de la testa o micrópilo (Mc). C) Corte tangencial de la diáspora de la misma especie, mostrando la próxima emergencia de la radícula (rd).

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El hilo de la semilla es una cicatriz que queda después del desprendimiento del funículo (puede describirse como un cordón conectado al óvulo), en esta especie el hilo se presenta a un costado y un poco larga, presenta una textura lisa en comparación al resto de la testa (Figura 20).

H H

Figura 20. Vista superficial de la semilla de G. americana L, en etapa de germinación; con la cicatriz o hilo (H) en la testa, que señala el desprendimiento del funículo con la placenta.

6.5 Pruebas de tinción

Los colorantes seleccionados de acuerdo con los objetivos para la tinción de los cortes fueron Safranina O y Azul de Toluidina, con tiempos de mejor respuesta de 1 minuto y 10 segundos respectivamente (Figuras 21 y 22).

6.5.1 Sudan III

Con este colorante se puede apreciar la tinción en color rojo los triglicéridos, lípidos y lipoproteínas. Las imágenes del lado izquierdo fueron sumergidas en el tinte por 30 segundos mientras que la derecha solo fueron 10, observando que entre menor el tiempo de baño menor la tinción del corte. Se observan tricomas en la testa, las células del endospermo tienen forma poliédrica y pentagonal además de presentar vacuolas grandes, los eleoplastos se encuentran en la periferia de la las células (Figura 21).

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A

tc

B

ce

C Figura 21. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Sudan III durante 30 segundos para el lado izquierdo y 10 segundos para el derecho. Tricomas (tc). Células del endospermo (ce). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x.

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6.5.2 Azul de Toluidina

Es uno de los colorantes seleccionados para la tinción de las muestras permanentes, se pudo apreciar de manera clara en la muestra teñida por 10 segundos, la epidermis monoestratificada con dos tipos de células, una con las paredes gruesas (secundaria) y la otra más delgada, rodeada por una capa de tricomas simples alargados, la pared celular primaria y secundaria del endospermo, así mismo los núcleos de estas, las células presentan forma poliédrica o pentagonal con paredes gruesas por celulosa (Figura 22).

tc

A

B

t

ce

C Figura 22. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Azul de Toluidina durante 30 segundos para el lado izquierdo y 10 segundos para el derecho. Testa (t). Tricomas (tc). Células del endospermo (ce). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x.

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6.5.3 Safranina O

Así como Azul de Toluidina este tinte se utilizó para teñir los cortes de forma indeleble, en la Figura 23, se puede apreciar que los tiempos de baño no fueron significativamente diferentes. Las células de la testa presentan una pared secundaria (lignina), la cual es teñida por este colorante.

A

B

ct

C Figura 23. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Safranina O durante 1 minuto para el lado izquierdo y 30 segundos para el derecho. Celulas de la testa (ct). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x.

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6.5.4 Lugol

Este colorante para células tiñe los núcleos y polisacáridos como los almidones (color azul intenso o violeta), glucógenos y ciertas dextrinas. En la figura 24C, se observan amiloplastos color violeta, la leve tinción en el corte indica escasa presencia de almidón en el endospermo de la semilla, se aprecia nuevamente vacuolas.

B

ap

A C Figura 24. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., teñida con el colorante Lugol durante 1 minuto para el lado izquierdo y 30 segundos para el derecho. Amiloplastos (ap). A) Corte observado a 5x. B) Objetivo a 10x. C) Objetivo a 40x.

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6.5.5 Azul de Bromotimol

No se observó ninguna tinción sobre el corte a pesar de los tiempos dados, teniendo una semejanza en coloración con el corte testigo (Figura 25).

A B

Figura 25. Corte trasversal de la semilla de G. americana L., A) Sección teñida con el colorante Azul de Bromotimol durante 1 minuto. B) Corte testigo. Objetivo 5x.

6.6 Preparación y adhesión de cortes a portaobjetos

En cada ensayo realizado para la obtención de cortes completos, sin desprendimiento de tejidos o desgarre del mismo fue diferente en alguna parte del proceso, en el primer caso no se ejecutó ningún pretratamiento a las semillas, obteniendo cortes en el micrótomo de mala calidad (el factor causante de tal complicación aún no se ha determinado con certeza); en el segundo y tercer caso, las semillas fueron lijadas de manera paralela al corte objetivo (tangencial, transversal y longitudinal), en este caso las secciones obtenidas siguieron presentando desprendimiento del embrión y desgarre en el endospermo durante la adhesión al portaobjetos (en este caso la aplicación de calor era el factor que manipular para una buena adhesión.), los dos últimos ensayos se utilizaron semillas previamente sumergidas en parafina liquida (dentro del horno de convección a 65°C), estas semillas presentaron mejor facilidad de corte, puesto que el desprendimiento de los tejidos se redujo con la ayuda del procedimiento de enfriamiento de los bloques de parafina con agua fría antes de realizar los cortes, cabe destacar que no existió diferencia significativa entre los tiempos de permanencia en parafina liquida. Las secciones adheridas en portaobjetos fueron resguardadas en un horno de secado a 45°C, hasta el proceso de tinción (Cuadro 15).

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Cuadro 15. Número de ensayos para la obtención de cortes completos hasta el procedimiento de adhesión a portaobjetos.

ENSAYO PRE- FIJACIÓN Y TIEMPO EN INCLUSÍON MICROTOMIA ADHESIÓN A TRATAMIENTO DESHIDRTACIÓN EL P. A. T PORTAOBJETOS

1 Ninguno Se utilizaron 15 8 horas por Tiempo necesario El embrión es Se utilizó el primer semillas. estación, 4 para la solidificación desprendido al procedimiento. El días en total. del bloque a momento de tiempo de calor no 24 h en fijación y temperatura realizar la acción. era adecuado, se 48 horas en ambiente. Cortes en mal observaron deshidratación. estado. desprendimientos en los tejidos.

2 Lijar un lado de Se utilizaron 12 6 horas por Tiempo necesario El movimiento de Se utilizó el primer la semilla semillas. estación, 3 para la solidificación la manivela fue procedimiento. días en total. del bloque a lento para obtener Algunos de los cortes 24 horas en temperatura los cortes con se presentaron fijación y 48 h en ambiente. mayor cuidado. completos, pero el deshidratación. Algunos bloques de tiempo en la plancha parafina fueron aun no era la enfriados con agua adecuada ocasionado fría. desprendimiento del embrión.

3 Lijar un lado de Se utilizaron 12 6 horas por 3 semillas se Se realizó de la Para desenrollar los la semilla semillas. estación, 3 utilizaron para misma forma que cortes, fueron días en total. realizar los bloques en el experimento metidos en agua 24 h en fijación y de parafina, 3. Los cortes tibia, y colocados 48 horas en solidificándose a salieron enrollados. enseguida sobre el deshidratación. temperatura ambiente portaobjetos. y a completando de 5 También se utilizó el a 10 minutos de segundo

77

refrigeración. procedimiento.

El resto fue metido al horno de convección (65°C).

4 Las semillas Ninguna Ninguna Solidificación del Los cortes se Se utilizó el segundo restantes en el bloque a temperatura presentaron un procedimiento. ensayo 2 fueron ambiente, a poco más uniforme, Algunos de los cortes metidas al completando el aunque algunos aun se observaron de horno de proceso con presentaron manera un poco más convección refrigeración de 5 a desprendimiento completa. (65°C) con 10 min. del embrión. parafina durante Se utilizó el método 12 días. de enfriamiento.

5 El restante de Ninguna Ninguna Solidificación del Los cortes se La adhesión al semillas del bloque a temperatura presentaron de portaobjetos se ensayo 3, se ambiente, a manera más realizó utilizando el mantuvieron en completando el uniforme, aunque segundo método. Tan el horno de proceso con se tuvo que recurrir solo unos cortes convección con refrigeración de 5 a al método de fueron buenos. parafina por 4 10 min. enfriamiento con días. agua.

FUENTE: Elaboración propia (2019).

78

6.7 Tinción de cortes en parafina

6.7.1 Pruebas de tiempo de tinción

Se llevaron a cabo 5 pruebas de tinción, del cual se obtuvo que los mejores tiempos para teñir los cortes es de 35 minutos en Safranina O y 25´ en Azul de Toluidina (Cuadro 16).

Cuadro 16. Tiempos experimentados para obtener un balance de tinción entre los dos colorantes elegidos.

SAFRANINA O AZUL DE OBSERVACIONES TOLUIDINA 30 min 5 min El segundo colorante tiñó escasamente el corte. 30 min 10 min Azul de T. sigue escaso en la tinción de los cortes. 30 min 15 min El tiempo otorgado empieza a dar efecto ligeramente para el caso de Azul de T. 40 min 20 min Los cortes quedaron muy teñidos por Safranina y Azul de T. le falto un poco más de participación. 35 min 25 min La tinción quedo balanceada permitiendo una buena observación de los tejidos. FUENTE: Elaboración propia (2019).

Montalvo (2010), menciona que Azul de Toluidina es un colorante que tiene la propiedad de además de ceder su propio color a una estructura celular o tisular también tiñe de color distinta a otras estructuras. Por ejemplo, azul de Toluidina colorean de azul los núcleos y a otras estructuras basófilas, lo anterior puede comprobarse en los cortes obtenidos, debido a que se observaron estructuras teñidas de color púrpura o violeta.

6.7.2 Tinción de cortes

Se realizó una tinción múltiple, para ello se procedió a una serie de pasos descritos en el apartado 5.4.9. La parafina fue eliminada de los cortes mediante xilol, haciéndolo pasar por baños de alcohol en graduación decreciente, una vez teñidos los cortes, se deshidratan para quitarles el agua, para ello los cortes pasaron por alcohol en gradación creciente hasta el alcohol absoluto, después se aclararon con dos baños de xileno, tal como se muestra en el conjunto de imágenes de la Figura 26 (Fotografías propias).

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A B C

D E F G

H I J

K L M

N O Figura 26. Proceso en serie de la tinción de los cortes de semilla de G. americana L. A) Baño en xilol. B) Alcohol al 100%. C) Alcohol al 96%. D) Alcohol al 50%. E) Safranina O. F)

Agua destilada. G) Alcohol al 70%. H) Alcohol al 50%. I) Alcohol al 30%. J) Agua destilada K) Azul de Toluidina. L) Agua destilada. M) Alcohol al 96%. N) Alcohol al 100%. O)

Xileno.

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Posterior a lo anterior, a las preparaciones obtenidas se les realizó un montaje con el fin de dar las condiciones adecuadas y conservarlas por el mayor tiempo posible (años), además de poderlos utilizar infinidad de veces sin que estos se deterioren.

Los cortes histológicos mostraron que el protocolo utilizado para el procesamiento de desparafinación, hidratación y tinción otorgados en cada cestilla de vidrio, así como el montaje permanente, dieron como resultado una buena tinción donde se pudo observar la testa, endospermo y embrión de manera muy diferenciada, las células y sus paredes bien definidas y los núcleos, sin embargo, posteriormente se observó que los colorantes (Safranina O y Azul de Toluidina) no fueron utilizados de forma adecuada, debido a que en ciertas zonas existió competencia en la tinción de los tejidos.

6.8 Anatomía de la semilla

Para poder realizar la identificación de los tejidos de la semilla y la localización del pigmento genipina, las preparaciones fueron colocadas sobre el microscopio de fluorescencia compuesto y con la utilización del software ZEN 2012, se realizaron capturas de imágenes sobre el corte, las cuales se presentan a continuación.

La semilla es el ovulo fecundado y se pueden distinguir diferentes partes en una semilla, en el corte histológico de la semilla de Genipa americana L., se pueden apreciar los tejidos principales que la constituyen, la testa, endospermo y el embrión (Figura 27). Se observa que la testa se encuentra desprendida debido posiblemente a factores externos como el corte en el micrótomo o en la aplicación de calor para la adhesión al portaobjetos y a internos como tener una testa con varias capas haciéndola ligeramente dura, dificultando la absorción de líquidos para su ablandamiento. El endospermo es ancho teniendo por consecuencia un embrión delgado, Megías et al., (2018) mencionan que las semillas que contienen endospermo en estadios maduros se denominan semillas endospérmicas o albuminosas, mientras que hay algunas que lo consumen en los primeros estadios de la maduración y se denominan semillas no endospérmicas o exalbuminosas, en este caso la semilla de nuestra especie estudiada puede clasificarse como endospérmica.

81

t

ed

e

Figura 27. Corte transversal de G. americana L. Principales componentes que constituyen la semilla: testa (t), endospermo (ed) y embrión (e). Objetivo 5x.

La cubierta protectora de la semilla consta de tres regiones, la primera es una región epidérmica con tricomas que protegen a la semilla; la segunda está constituida por una zona esclerenquimatica uniestratificada con pared anticlinal engrosada, aumentando dimensiones hacia la parte exterior de la cubierta seminal, mide aproximadamente 205.606 µm, esta región se conforma de dos estratos celulares de esclereidas: macroesclereidas que presentan un lumen amplio en la parte superior y lumen angosto en el interior y braquiesclereidas de forma isodriametricas con cinco o seis lados; la última región encontrada fue el tegmen con cinco a siete estratos de células, teniendo un ancho de 43.734 µm aproximadamente (Figura 28). Cabe mencionar que la figura que se muestra pertenece a la zona de la radícula.

82

tg

be ce

me

tc

Figura 28. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. La testa consta: tricomas (tc), capa de esclereidas (ce), macroesclereidas (me) braquiesclereidas (be) y tegmen (tg). Objetivo 40x.

Megías et al., (2018), indica que normalmente tegmen y testa están unidos y es difícil separarlos. Conjuntamente se denominan epispermo o cubierta seminal. El tegmen es normalmente delgado y flexible, mientras que la testa es dura.

El endospermo es un tejido de reserva que en este caso rodea completamente al embrión para proporcionarle nutrientes hasta que sea capaz de producir su propio alimento mediante el proceso de la fotosíntesis y que a su vez se encuentra envuelto por el tegmen. En el tejido del endospermo podemos identificar claramente las células que lo constituyen, las paredes celulares se encuentran teñidas de un tono azul más intenso, las vacuolas quedaron sin teñir y los núcleos se aprecian como manchitas cercanas a los cromoplastos las cuales de observan en forma de panal (Figura 29B.)

83

n

n cm pc

cm

v

A

pc

cm v

B

Figura 29. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L.(endospermo). Pared celular (pc), vacuola (v), núcleo (n), cromoplasto (cm). A) Objetivo 40x. B) Objetivo 100x.

84

El embrión se encuentra compuesto por un tallo embrionario, en donde en el hipocótilo se encuentra en contacto con la radícula y el epicótilo con la yema apical, debido a que es una semilla dicotiledónea se puede apreciar dos cotiledones que posteriormente se convertirán en plúmulas, lo anterior puede apreciarse en la Figura 30.

Figura 30. Corte longitudinal de la semilla de G. americana L. Principales partes, cotiledones (c), yema apical (ya), tallo embrionario (te), radícula (rd). Se encuentra rodeado por endospermo (ed) y una capa protectora testa (t). Objetivo 5x.

85

Los cotiledones pueden almacenar sustancias de reserva para la germinación y entonces suelen tener un aspecto carnoso. Están unidos al eje embrionario en un punto llamado nodo y se abren hacia afuera como un libro. La porción del eje que queda apical al punto de inserción de los cotiledones, hacia la plúmula, se denomina epicótilo, mientras, la que queda por debajo se denomina hipocótilo (Megías et al., 2018)

En la Figura 31 se puede apreciar el embrión de la semilla de la especie trabajada en corte longitudinal, donde se observa con mayor detalle los cotiledones, el procambium, la yema apical, la protodermis y el sistema vascular primario que dará origen después de la germinación al floema y xilema de la planta.

c c

ya p

pt

svp

Figura 31. Corte longitudinal de la semilla de G. americana L. Principales partes del embrión, cotiledones (c), procambium (p), yema apical (ya), protodermis (ep), sistema vascular primario (svp). Objetivo 20x. 86

En la radícula del embrión se puede observar el proceso mitótico, en el estadio de profase se visualiza de forma redonda y condensados, en la metafase aparece un huso mitótico donde los cromosomas se orientan de forma perpendicular, en el anafase comienza la separación de los cromosomas, donde cada juego cromosómico migra hacia un polo de la célula, finalmente, el estadio telofase ocurre cuando los cromosomas llegan a los polos de la célula, dando origen a dos nuevas células (Figura 32).

pr tf

mt

an

Figura 32. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L., (embrión). Profase (pr), metafase (mt), anafase (an) y telofase (tf). Objetivo 40x.

87

6.9 Localización de la genipina mediante fluorescencia

En las imágenes obtenidas por el microscopio de fluorescencia compuesto y el programa ZEN 2012, se observa la emisión de fluorescencia por activación del pigmento genipina con los colorantes utilizados (Safranina y Azul de Toluidina), vistos a través de tres diferentes filtros, en el primer filtro (verde) las imágenes son observadas en color azul, en el segundo filtro (azul) se miran en verde y el tercer filtro (rojo) el color reflejado es naranja.

Con el filtro verde, se encontró que el endospermo emite fluorescencia en las zonas cercanas a la cubierta seminal (Figura 33 E-F), mientras que en las imágenes A-B-C-D, se aprecia muy poca exposición de fluorescencia en el tejido. La utilización del colorante Rodamina 6G, permitió observar y comparar las muestras capturadas en campo, claro, con los filtros 1 y 2, debido a que el colorante y el filtro 3 tienen la misma longitud de onda no se observó ninguna imagen. El filtro azul no dio respuesta de fluorescencia (tiene que ver con la longitud de onda de la genipina y el color que emite) en comparación con el filtro verde, donde se puede apreciar que la emisión de igual manera que con el colorante Naranja G., se encuentra en el endospermo y con mayor intensidad en las zonas cercanas a la testa, también se aprecia que existe fluorescencia en la cubierta seminal (Figura 34).

En la Figura 35, se aprecia con mayor detalle algunas de las células del endospermo emitiendo fluorescencia, lo cual se puede interpretar como presencia de la genipina en este tejido.

De acuerdo con las imágenes obtenidas en la realización de pruebas de fluorescencia con Naranja G. y Rodamina 6G utilizando cortes en fresco y observadas con el filtro verde, podemos decir que la sustancia genipina se encuentra contenida en las vacuolas de las células del endospermo, cercanas a las paredes primarias, con los filtros azul y rojo se observa la lignina que constituye las paredes gruesas de las esclereidas de la testa en la Figura 33 mientras que en la Figura 34 solo se aprecia claramente en E y F.

88

A B

C D

E F

Figura 33. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. Fluorescencia en los cortes utilizando Naranja G., Los filtros utilizados en A-B es azul, C-D rojo y E-F verde. A-C-E-F) Objetivo 4x. B-D) Objetivo 10x.

89

A B

C D

E F

Figura 34. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. Fluorescencia en los cortes utilizando Rodamina 6G., campo claro para A-B, Los filtros utilizados en C-D azul y E-F verde. A-B-C-D-E) Objetivo 4x. F) Objetivo 10x.

90

A B Figura 35. Corte longitudinal de la semilla de Genipa americana L. Fluorescencia en los cortes utilizando Rodamina 6G., el filtro utilizado es verde. A) Objetivo 20x. B) Objetivo 40x.

La localización de la sustancia genipina en la semilla mediante el método de fluorescencia, permitió admirar su emisión en el endospermo. La utilización de este método se practica en menor medida en tejidos vegetales, debido a que la mayor aplicación se encuentra en investigaciones de inmunofluorescencia. Hasta el momento, los resultados encontrados son una nueva aportación al conocimiento de esta especie, pues no se ha encontrado alguna investigación similar.

7. CONCLUSIONES

Del trabajo de investigación de tesis se puede concluir lo siguiente: Los frutos de Genipa americana L., varían en tamaño y cantidad de semillas de acuerdo al área geográfica y con la localidad de origen.

Es importante la realización de ensayos para establecer la calidad de la semilla. A través del análisis físico entre ambos lotes se determinó que la longevidad de la semilla es baja., debido a que entre más tiempo transcurrió desde su cosecha hasta las pruebas en laboratorio la viabilidad fue menor en el Lote 1 en comparación al segundo Lote.

Los porcentajes de germinación obtenidos fueron significativamente diferentes, corroborando que la viabilidad es directamente proporcional a la longevidad, pudiendo

91 clasificar a la semilla de esta especie como microbiota, tomando en cuenta que otros autores mencionan que su viabilidad es corta y se pierde gradualmente, lo que se confirma en la presente investigación.

Mediante las técnicas histológicas empleadas se pudieron distinguir como estructuras morfológicas principales: la cubierta seminal constituida por tres regiones: la primera por tricomas, la segunda conformada por células de esclereidas y la tercera región por el tegmen. La siguiente estructura es el endospermo y finalmente el embrión constituido principalmente por los cotiledones y un eje embrionario (en la parte superior se encuentra la yema apical y en sentido contrario la radícula).

Este es el primer trabajo que contribuye a la anatomía y descripción histológica de esta especie.

Finalmente, la localización del pigmento genipina, se encontró en el endospermo de la semilla, en las zonas cercanas a la cubierta seminal.

8. RECOMENDACIONES Y/O SUGERENCIAS

La investigación realizada permite sugerir los siguientes puntos para trabajos futuros, según los datos obtenidos sobre la especie, aún existen aspectos que son necesarios investigar.

 Realizar más pruebas de análisis físico de las semillas de la especie, pero en diversas áreas geográficas en México, para tener información más amplia acerca de Genipa americana L.  Llevar a cabo un estudio ontogénico para verificar si los tricomas presentes en la semilla pertenecen a la testa o al endocarpio.  Realizar pruebas de pretratamientos a las semillas para obtener cortes de excelente calidad.  Efectuar un estudio ontogénico desde la etapa de floración hasta la maduración del fruto para conocer el origen de las estructuras del fruto y a su vez de la semilla.  Desarrollar una investigación genética de la especie.  Realizar un estudio y evaluación del comportamiento de las plántulas después de la germinación.

92

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99

10. FUENTES CONSULTADAS

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TRÓPICOS. Genipa americana L. www.tropicos.org.

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11. ANEXOS

11.1 Figuras

Figura 36. Frutos de inmaduros en agua de Genipa americana L., colectados en Santa Cruz del Rincón, municipio de Malinaltepec, Guerrero. FUENTE: Fotografía propia

Figura 37. Etapas de la maduración del fruto de G. americana L., colectados en Ocotito, Chilpancingo de Bravo. FUENTE: Fotografía propia

Figura 38. Lavado de las semillas de G. americana L. FUENTE: Fotografía propia

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Figura 39. Semillas de Genipa americana L., pertenecientes al Lote 2. colectados en Ocotito, Chilpancingo de Bravo.

FUENTE: Fotografía propia

Figura 40. Lote 1 de las semillas en una cámara de ambiente controlado. FUENTE: Fotografía propia

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Figura 41. Cortes en fresco de la semilla de G. americana L., con micrótomo manual. FUENTE: Fotografía propia

Figura 42. Prueba de tinción de la semilla en fresco con Azul de Toluidina. FUENTE: Fotografía propia

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Figura 43. Semillas de G. americana L. metidas en capsulas de aluminio para posteriormente colocarlas dentro del Procesador Automático de Tejidos LEICA TP 1020. FUENTE: Fotografía propia

Figura 44. Inclusión en parafina de las semillas de G. americana L. FUENTE: Fotografía propia

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A B

C Figura 45. A) Bloques de parafina. B) Cortes en micrótomo rotatorio. C) Materiales para la adhesión de cortes a portaobjetos. FUENTE: Fotografía propia

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