Roberto do Val Vilela
Roedores e biomas neotropicais: estudos evolutivos e comparativos
Neotropical rodents and biomes: evolutionary and comparative studies
São Paulo 2010 2
Roberto do Val Vilela
Roedores e biomas neotropicais: estudos evolutivos e comparativos
Neotropical rodents and biomes: evolutionary and comparative studies
Tese apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção de Título de Doutor em Ciências, na Área de Biologia (Genética).
Orientador(a): Yatiyo Yonenaga- Yassuda
São Paulo 2010 3
Vilela, Roberto do Val Roedores e biomas neotropicais: estudos evolutivos e comparativos 113p.
Tese (Doutorado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.
1. Evolução 2. Rodentia I. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Genética e Biologia Evolutiva.
Comissão Julgadora:
______Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
______Prof(a). Dr(a). Prof(a). Dr(a).
Prof(a). Dr(a). Orientador(a) 4
Ao Lucas 5
A satisfactory answer to the riddle 'Why are there so many species in the tropics?' remains elusive. Mark B. Bush, J. Biogeogr., 1994
Pensar nas biodiversidades que existiam e, sobretudo, naquelas que sobreviveram, é uma obrigação permanente daqueles que refletem sobre o futuro do planeta Terra, a diferentes níveis de profundidade de tempos. Aziz Nacib Ab'Saber, Estudos Avançados, 1990
Understanding the evolutionary processes that generate and sustain diversity in tropical faunas has challenged biologists for over a century and should underpin conservation strategies. C. Moritz, J. L. Patton, C. J. Schneider e T. B. Smith, Ann. Rev. Ecol. Syst., 2000
Até hoje a sistemática evolutiva pouco tem dado, em troca, às ciências da Terra; ainda vai receber muito antes que possa começar a pagar sua dívida. Paulo Emílio Vanzolini, Estudos Avançados, 1992
- Que século, meu Deus! diziam os ratos. E começavam a roer o edifício. Carlos Drummond de Andrade, Edifício Esplendor 6
Agradecimentos
Agradeço a todos que contribuíram e torceram pelo sucesso desta empreitada.
Agradeço ao Guincho pelo socorro na hora crítica.
Especialmente agradeço à Maíra pela paciência e suporte em todas as horas, a ela devo essa tese.
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Índice
Introdução 08 Objetivos 35 Materiais e Métodos Materiais 36 Métodos 41 Resultados 46 Discussão 79 Conclusões 94 Resumo 95 Abstract 96 Referências Bibliográficas 97 8
Introdução
Teorias de Especiação em Florestas Tropicais
Os mecanismos evolutivos responsáveis por gerar a alta biodiversidade das florestas tropicais vêm sendo debatidos há décadas (ERWIN, 1991; MAYR, 1963;
STEBBINS, 1974). Geralmente, os modelos de especiação de faunas tropicais têm enfatizado o contexto geográfico e focado em divergência alopátrica. A única exceção é o modelo de Endler de divergência parapátrica em resposta à seleção diversificadora ao longo de gradientes ecológicos (ENDLER, 1982a).
Dentre os modelos de diversificação alopátrica em florestas tropicais, destacamos os três principais: a Hipótese dos Refúgios (HAFFER, 1969; MAYR e
O'HARA, 1986; VANZOLINI e WILLIAMS, 1970), a Hipótese dos Rios como
Barreiras (WALLACE, 1852) e a Hipótese do Isolamento em Montanhas (MOREAU,
1966). Todos os três modelos invocam mecanismos vicariantes (i.e. separação de um grupo de organismos por uma barreira geográfica resultando em diferenciação do grupo original em formas ou espécies diferentes) – seja a contração de florestas tropicais em refúgios isolados durante o Máximo Glacial do Pleistoceno (Refúgios e
Montanhas) ou a divisão de um habitat contínuo pela formação de grandes rios de maneira que as populações de ambos os lados fiquem isoladas. Em cada cenário, as populações geograficamente isoladas divergem por deriva genética e/ou seleção natural, porque estão isoladas dos efeitos homogeneizantes do fluxo gênico.
A Hipótese dos Refúgios, que tem sido o modelo mais influente de especiação alopátrica (HAFFER, 1969; VANZOLINI e WILLIAMS, 1970; WHITMORE e
PRANCE, 1987), salienta o papel de grandes refúgios florestais isolados em gerar 9 novos táxons e alta diversidade de espécies (HAFFER, 1969; MAYR e O'HARA,
1986). A Hipótese dos Refúgios baseia-se na premissa de que mudanças climáticas causaram a retração das florestas tropicais, deixando refúgios separados por florestas xéricas ou cerrados (PRANCE, 1982). Desde a sua proposição, a Hipótese dos
Refúgios tem sido controversa (CRACRAFT, 1994; ENDLER, 1982a, b; HAFFER,
1969; MAYR e O'HARA, 1986), isso reflete uma longa história de equiparar centros de biodiversidade com centros de origem das espécies (DARWIN, 1876; WILLIS,
1922). Críticas a este modelo incluem: (1) incerteza sobre se a Floresta Amazônica contraiu ou apenas mudou sua composição florística (COLINVAUX e DE
OLIVEIRA, 2001; COLINVAUX et al., 2000; COLINVAUX et al., 1996); (2) vieses provocados por diferenças no esforço amostral (áreas bem estudadas tendem a ter mais espécies descritas e, portanto, ser identificadas como refúgios e/ou centros de endemismo, (NELSON et al., 1990); (3) um raciocínio circular na localização de zonas de contato definidas por relações entre grupos-irmãos (ENDLER, 1982b;
MAYR e O'HARA, 1986); (4) a falta de discussão de modelos alternativos que ofereçam explicações igualmente boas para os padrões biogeográficos (ENDLER,
1982A, B); (5) dificuldade em identificar, a priori, refúgios delimitados espacial e temporalmente.
Embora os primeiros debates tenham incidido sobre as conseqüências de eventos climáticos do Pleistoceno, principalmente os do último ciclo glacial ou dos dois últimos (p. ex.: DIAMOND e HAMILTON, 1980; HAFFER, 1969), a Hipótese dos Refúgios foi recentemente estendida para eventos do Terciário, pressupondo que oscilações no clima ao longo deste período também foram de amplitude e duração suficientes para promover a fragmentação de florestas tropicais e especiação
(HAFFER, 1992). De maneira geral, a importância dos períodos glaciais para 10 especiação é uma área de debate bastante controvertida (ARBOGAST et al., 1998;
AVISE e WALKER, 1998; KLICKA e ZINK, 1997; MORITZ et al., 2001;
SCHNEIDER et al., 1998; ZINK, 1997). Importantes, mas raramente discutidas, são as condições ecológicas dentro dos refúgios propostos e os processos de divergência associados (p. ex.: VANZOLINI E WILLIAMS, 1981). Se as condições ecológicas entre os refúgios diferem substancialmente, pode-se esperar que as populações divirjam em resposta à seleção natural divergente, enquanto que, se as condições ecológicas são semelhantes, as populações podem divergir apenas por deriva.
O segundo modelo alopátrico, a Hipótese de Isolamento em Montanhas, postula que o isolamento em remanescentes de floresta em montanhas durante períodos climáticos secos levou à divergência e especiação (com as novas espécies posteriormente expandindo sua distribuição para áreas mais baixas). Introduzida primeiramente por Moreau (1966), baseado na distribuição de aves estreitamente relacionadas em montanhas isoladas na África Ocidental, a Hipótese de Isolamento em Montanhas propõe a divergência de populações como um simples resultado do isolamento nas montanhas e não especifica se a divergência resulta principalmente de deriva ou seleção divergente.
O terceiro modelo alopátrico, a Hipótese de barreiras fluviais, postula que o isolamento geográfico produzido por sistemas fluviais provoca divergência e especiação (WALLACE, 1852). A observação comum de que os limites de espécies ou subespécies estreitamente relacionadas, muitas vezes coincidem com os principais rios da Amazônia, tem sido tomada como evidência da Hipótese dos Rios como
Barreiras. Como exemplo, vários primatas (HERSHKOVITZ, 1977), algumas aves passeriformes (CRACRAFT e PRUM, 1988; HAFFER, 1969, 1974) e muitos lagartos da Amazônia (AVILA-PIRES, 1995) têm suas distribuições delimitadas por rios. 11
Entretanto, a congruência entre os padrões de diversidade fenotípica e distribuição dos rios é inconsistente (CAPPARELLA, 1991). Um problema compartilhado com a
Hipótese dos Refúgios é que os dados de distribuição sozinhos são consistentes com hipóteses de especiações múltiplas. Dificuldades com a Hipótese dos Rios como
Barreiras surgem do fato de que grandes rios, por inibir dispersão, podem ser pontos de encontro convenientes para espécies que divergiram em outros lugares (PATTON et al., 1994) e, portanto, pouco ou nada têm a ver com o processo de especiação em si. Além disso, a força da barreira para o fluxo gênico deve diminuir em direção à cabeceira de um rio (AYRES e CLUTTON-BROCK, 1992; PERES et al., 1996) e padrões de drenagem são dinâmicos, mudando ao longo do tempo evolutivo. Como na situação de barreiras as condições ecológicas são esperadamente similares, espera- se que a seleção desempenhe um papel menor na diferenciação e que as populações divirjam preferencialmente por deriva.
Modelos não-alopátricos de divergência incluem divergência entre populações contíguas (divergência parapátrica) (MAYR, 1963). O principal modelo parapátrico é a Hipótese dos Gradientes Ecológicos. Este modelo postula que seleção divergente ao longo de fortes gradientes ambientais é suficiente para causar diferenciação e especiação, apesar da presença de fluxo gênico (ENDLER, 1977; ORR e SMITH,
1998; RICE e HOSTERT, 1993; SMITH et al., 1997). A Hipótese dos Gradientes
Ecológicos implica que os ambientes de transição (ecótonos ou gradientes altitudinais) sejam áreas em que seleção divergente e especiação ocorrem. Por conseguinte, a Hipótese dos Gradientes Ecológicos prevê que as transições de habitat, ao invés de rios ou fronteiras entre refúgios, são as áreas de contato entre táxons irmãos. Uma ênfase recente na heterogeneidade da estrutura vegetacional atual
(TUOMISTO et al., 1995) e, possivelmente, histórica (COLINVAUX et al., 1996) da 12
Amazônia sugere que os ambientes de transição são um componente comum na paisagem da floresta tropical e podem proporcionar oportunidades para a Hipótese dos Gradientes Ecológicos operar dentro de florestas tropicais. A observação de que as zonas híbridas estão geralmente localizadas em ecótonos (ENDLER, 1982a, b), e a de que gradientes ecológicos abruptos ao longo das encostas inferiores das cadeias montanhosas são muitas vezes as áreas de maior diversidade de espécies
(DUELLMAN, 1978; FJELDSA, 1994) é consistente com a Hipótese dos Gradientes
Ecológicos, mas dados de distribuição apenas estão sujeitos a múltiplas interpretações (p. ex.: ENDLER, 1982b; MAYR e OHARA, 1986).
As hipóteses descritas anteriormente geram uma série de padrões previstos em ambos os níveis, interespecíficos (filogenéticos) e intraespecífico (filogeográficos).
Em geral, os modelos alopátricos prevêem que espécies irmãs sejam encontradas em cada lado das barreiras atuais ou históricas à dispersão enquanto o modelo de gradientes ecológicos prediz que espécies irmãs, devam ocupar habitats adjacentes, porém diferentes (por exemplo, a substituição altitudinal por espécies irmãs). Se admitirmos que os processos geradores de espécies e os processos que resultam na divergência de populações são os mesmos, então análises dessas divergências podem ser particularmente esclarecedoras. Comparações simultâneas das populações que ocupam diferentes habitats em regiões geograficamente isoladas fornecem fortes evidências dos processos que influenciam na divergência. Amostragens de populações ao longo de habitats, dentro e entre regiões geograficamente isoladas fornecem uma prova direta da importância relativa do isolamento geográfico e dos gradientes ecológicos na divergência. Se, para um determinado nível de divergência genética, o isolamento reprodutivo ou a divergência morfológica é maior entre os habitats do que dentro de habitats, um papel maior para a divergência em resposta a 13 gradientes ecológicos é sugerido. Se a divergência reprodutiva ou morfológica entre populações isoladas em habitats semelhantes é tão grande quanto entre populações isoladas que ocupam habitats diferentes, um papel menor para a divergência adaptativa ao longo de gradientes ecológicos é sugerido (p. ex. COSTA, 2003; LARA et al., 2005).
As faunas e floras mais ricas do planeta estão nas florestas tropicais (MYERS,
2003; MYERS et al., 2000). Considera-se que nos trópicos novas espécies são geradas mais rapidamente (WRIGHT et al., 2006) e as espécies encontram abrigo por mais tempo que em regiões temperadas (WIENS et al., 2006), sendo dessa maneira vistas tanto como “berço” quanto como “museu” de espécies (MCKENNA e
FARRELL, 2006). Uma interação histórica complexa de linhagens, climas, geografia e adaptação molda os padrões atuais de biodiversidade, e filogenias oferecem o principal registro de seus efeitos (BROOKS e MCLENNAN, 1991). Padrões filogenéticos de linhagens que têm capacidade de dispersão limitada e são diversificadas entre regiões de endemismo podem ser particularmente instrutivas na reconstrução de histórias regionais (NELSON e PLATNICK, 1981).
A compreensão sobre radiações complexas de organismos tropicais é aprimorada continuamente pela descoberta de novas espécies, aprofundamento do conhecimento das relações entre grupos e expansão das pesquisas genéticas. Uma melhor diagnose dos gêneros (EMMONS, 2005) e melhor compreensão filogenética da família Echimyidae (GALEWSKI et al., 2005), convidam a reconstruções filogenéticas e biogeográficas destes roedores.
Fósseis, moléculas e escalas de tempo evolutivo 14
A utilização de seqüências de DNA para estimar tempos de divergência em
árvores filogenéticas (datação molecular) vem ganhando crescente interesse no campo da biologia evolutiva na última década. A abundância de publicações sobre o assunto, os numerosos métodos alternativos propostos e as discussões freqüentemente acaloradas sobre diversos aspectos da disciplina demonstram o interesse que ela gera
(BRITTON, 2005; BRITTON et al., 2007; BRITTON et al., 2002; CONROY e VAN
TUINEN, 2003; DRUMMOND et al., 2006; DRUMMOND e RAMBAUT, 2007;
FOREST, 2009; HASEGAWA et al., 2003; HEDGES et al., 2006; HO et al., 2005;
JOBB, 2008; LINDER et al., 2005; ROWE et al., 2010; RUTSCHMANN, 2006;
RUTSCHMANN et al., 2007; SANDERSON, 1994, 1997, 1998, 2002, 2003;
SANDERSON et al., 2004; THORNE et al., 1998). A hipótese do relógio molecular foi proposta primeiramente por Zuckerkandl e Pauling (1965), eles propuseram que as diferenças nas seqüências de DNA (ou de proteína) entre duas espécies são proporcionais ao tempo decorrido desde a divergência do seu ancestral comum mais recente.
A subseqüente inclusão de uma estrutura temporal em muitos estudos evolutivos tem influenciado a forma como os resultados são interpretados e alteraram significativamente o modo pelo qual as conclusões são tiradas desses resultados. As associações entre a evolução de determinados caracteres morfológicos ou inovações ecológicas chave e eventos geológicos, climáticos ou bióticos tornam-se mais claras em função de uma escala de tempo evolutiva. O desenvolvimento de ferramentas moleculares de datação tornou-se particularmente útil para a disciplina de biogeografia histórica, adicionando um indicador temporal para a direção dos eventos demonstrados na topologia de árvores filogenéticas. Inferências sobre padrões de distribuição observados tornaram-se significativamente mais plausíveis num quadro 15 temporal, mesmo que apenas descritivo. Além disso, novos métodos de reconstrução biogeográfica foram desenvolvidos, como o Lagrange, que usa uma abordagem de verossimilhança para inferir a evolução de distribuições geográficas e incorpora tempos de divergência, bem como limita as ligações entre locais e tempos específicos
(REE e SMITH, 2008).
A lógica por trás da hipótese do relógio molecular, que as taxas de evolução são constantes, mostrou-se incorreta em muitos casos analisados (AYALA, 1999;
LEWIN, 1990; SCHWARTZ e MARESCA, 2006), o relógio não bate regularmente.
A heterogeneidade das taxas de substituição entre diferentes linhagens de uma árvore filogenética explica essa irregularidade (BRITTEN, 1986) e é resultado de fatores espécie-específicos, tais como: tempo de geração, taxa metabólica, tamanho efetivo da população e taxas de mutação (RUTSCHMANN, 2006). A extensão da influência de alguns desses fatores, no entanto, continua controversa (p. ex.: WHITTLE e
JOHNSTON, 2003).
Rutschmann (2006) classificou os métodos mais comumente utilizados para estimar tempos de divergência em três categorias, dependendo de como lidar com a heterogeneidade das taxas, a saber: adotar uma taxa de substituição global (relógio molecular padrão); corrigir para heterogeneidade da taxa (por exemplo, excluindo ramos ou incorporando várias categorias de taxas antes do procedimento de datação); ou incorporar a heterogeneidade taxa (ou seja, integrar a heterogeneidade das taxas ao processo de datação utilizando modelos de alteração de taxas – relógio molecular relaxado). Quatro dos métodos mais comumente usados na literatura caem na terceira categoria: suavização não-paramétrica das taxas (NPRS – Non-Parametric Rate
Smoothing) (SANDERSON, 1997), verossimilhança penalizada (PL – Penalized
Likelihood) (SANDERSON, 2002), o método bayesiano implementado no pacote 16
Multidivtime (THORNE et al., 1998) e análise evolutiva bayesiana por amostragem de árvores (BEAST – Bayesian Evolutionary Analysis by Sampling Trees)
(DRUMMOND e RAMBAUT, 2007). Os primeiros três destes métodos pressupõem que as variações das taxas entre as linhagens ancestrais e descendentes são autocorrelacionados, ou seja, que as taxas de substituição das linhagens descendentes são, de certa forma, herdadas das linhagens ancestrais. Esses métodos diferem na maneira com que a autocorrelação entre as taxas é tratada. O método implementado no programa BEAST não assume autocorrelação de taxas, em vez disso ele amostra as taxas a partir de uma distribuição. O BEAST proporciona flexibilidade adicional por poder opcionalmente incorporar incerteza filogenética, bem como a possibilidade de atribuir distribuições a priori ao processo de calibração. Mais detalhes sobre esses métodos e vários outros podem ser encontrados na revisão de Rutschmann (2006).
Dois grandes temas têm alimentado a controvérsia associada com relógios molecular: como lidar com a heterogeneidade das taxas e a calibração. No seu início, os estudos de datações moleculares concentraram-se nos desvios de heterogeneidade das taxas entre as linhagens. Entretanto, a calibração, processo pelo qual o tempo relativo é transformado em idade absoluta (por exemplo, milhões de anos), utilizando informação independente da árvore filogenética e seus dados subjacentes, foi um pouco banalizada. Esta situação mudou nos últimos anos e muitos estudos já abordaram as inúmeras dificuldades associadas à calibração. Forest (2009), por exemplo, discutiu a calibração do relógio molecular (em especial com base em dados paleontológicos), os problemas potenciais e fontes de erro associadas a ela, e os vários métodos propostos para integrar estas incertezas nas estimativas de tempos de divergência molecular.
Fontes de informação para calibração 17
As informações utilizadas para calibrar uma árvore filogenética são obtidas a partir de três fontes principais: eventos geológicos, estimativas a partir de estudos independentes de datação molecular e registro fóssil, sendo este último a fonte de informações mais comumente utilizada para calibrar árvores filogenéticas.
Informações a partir de dados paleoclimáticos também têm sido também utilizadas para calibrar as árvores (p. ex.: BALDWIN e SANDERSON, 1998).
Designação de pontos de calibração
Idealmente, pontos de calibração baseados em registro fóssil deveriam ser aplicados amplamente em toda a filogenia para reduzir a ampliação de erro associada com a extrapolação das taxas de evolução para nós cada vez mais distantes dos pontos de calibração (LINDER et al., 2005; NEI et al., 2001).
Fatores que influenciam estimativas de tempos de divergência
Certamente, métodos bayesianos são conhecidos por serem sensíveis à designação de probabilidades a priori (BELL e DONOGHUE, 2005; HO et al., 2005;
RENNER, 2005; SMITH et al., 2006; WELCH e BROMHAM, 2005; WELCH et al.,
2005). Em particular, mostrou-se que a pressuposição a priori de uma distribuição log-normal de taxas, tem levado a uma tendência a subestimação de nós, particularmente para aqueles mais antigos que os pontos de calibração (HO et al.,
2005). Alternativamente, mostrou-se que o método conhecido como non-parametric- rate-smoothing (NPRS), tende a sobreparametrizar os dados, levando a rápidas flutuações nas taxas onde há internós curtos, e assim a superestimar idades próximas
à raiz (BELL e DONOGHUE, 2005; RUTSCHMANN, 2006).
Armadilhas na amostragem taxonômica 18
É sabido que a detecção de taxas variáveis de evolução é sensível à amostragem taxonômica (BROMHAM et al., 2000; SANDERSON, 1998) e, mais importante, um estudo empírico recente sugere que uma amostragem taxonômica fraca leva a estimativas incorretas de tempos de divergência mesmo quando métodos de relógio-relaxado são empregados (LINDER et al., 2005). Parece haver uma relação logarítmica entre a proporção de subamostragem e o grau de subestimação de tempo, particularmente para a metodologia de NPRS (LINDER et al., 2005). Nesse aspecto, amostragens que possuíam menos de 10% das espécies vivas resultaram em estimativas que tinham metade das idades daquelas obtidas sob uma amostragem taxonômica completa.
Amostragens taxonômicas esparsas podem, no entanto, explicar estimativas de idade mais recentes relatadas em estudos moleculares anteriores, particularmente em casos em que o método NPRS de relógio-relaxado foi adotado. No entanto essa está longe de ser uma explicação universal, dado que estimativas de idade igualmente recentes foram relatadas usando métodos bayesianos.
Efeitos combinados de subamostragem e distância de calibração
Tanto evidências simuladas quanto empíricas têm indicado que estimativas de tempos de divergência antigos usando pontos de calibração recentes estão sujeitas a erros cada vez maiores conforme aumentam as distâncias dos pontos de calibração
(LINDER et al., 2005; NEI et al., 2001). Linder et al. (2005) relataram uma relação linear positiva entre o grau de subestimação de idade e distância do ponto de calibração, tanto para NPRS quanto para o método bayesiano. Em outras palavras, quanto maior a distância do nó de calibração, mais sensíveis aos efeitos de subamostragem as estimativas de tempo se tornam (levando à subestimação das 19 verdadeiras idades). Essa é uma relação importante, e encaixa-se na observação de estimativas de idade mais recentes sendo obtidas quando amostragens taxonômicas esparsas acompanhavam o uso de pontos de calibração distantes em estudos moleculares anteriores que empregavam métodos bayesianos (p. ex.: ADKINS et al.,
2003; HASEGAWA et al., 2003; SPRINGER et al., 2003).
Contexto taxonômico
A família neotropical de roedores Echimyidae é uma das 17 famílias pertencentes à infraordem Hystricognathi (WOODS e KILPATRICK, 2005). Exceto pela pan-americana Erethizontidae e pela paleotropical Histricidae, as famílias de hystricognatos restantes são endemismos continentais. Três pequenas famílias
(Bathyergidae, Petromuridae e Thyronomyidae) são africanas, enquanto uma dúzia de outras são restritas aos neotrópicos. Exceto por alguns táxons fósseis, não há controvérsia na associação com a infra-ordem (MCKENNA e BELL, 1997). No entanto, as origens e a biogeografia dos seus membros separados têm sido longamente debatidas, porque os grupos do Hemisfério Sul são muito recentes para terem divergido com a separação de Gondwana. Os primeiros roedores que apareceram na América do Sul durante seu isolamento terciário, representados por táxons classificados como Echimyidae, Erethizontidae e Cunniculidae, são encontrados na formação Santa Rosa da Amazônia peruana, datada no final do
Eoceno (FRAILEY e CAMPBELL JR., 2004).
Equimiídeos adicionais são conhecidos da formação de Salla do Deseadense
(Oligoceno tardio) da Bolívia, produtos óbvios de uma radiação do Paleogêneo
(PATTERSON e WOOD, 1982). 20
A família Echimyidae possui hoje cerca de 23 gêneros e aproximadamente 90 espécies vivas (EMMONS, 2005; IAK-XIMENES et al., 2005; WOODS e
KILPATRICK, 2005). Woods e Kilpatrick (2005) dividiram a família Echimyidae em quatro subfamílias: Dactylomyinae (gêneros Dactylomys, Kannabateomys e
Olallamys); Echimyinae (gêneros Callistomys, Diplomys, Echimys, Isothrix,
Makalata e Phyllomys); Eumysopinae (gêneros Carterodon, Clyomys,
Euryzygomatomys, Hoplomys, Lonchothrix, Mesomys, Proechimys, Thrichomys e
Trinomys) e a extinta Heteropsomyinae (gêneros Boromys, Brotomys e
Heteropsomys). Porém essa divisão não é um consenso (p. ex.: GALEWSKI et al.,
2005; LARA et al., 1996; LEITE e PATTON, 2002), além disso, trabalhos recentes descreveram novos gêneros como: Pattonomys, Santamartamys e Toromys
(EMMONS, 2005; IAK-XIMENES et al., 2005) ou sugeriram a inclusão de
Capromys e Myocastor na família Echimyidae (GALEWSKI et al., 2005; LEITE e
PATTON, 2002).
Radiações sul-americanas de Echimyidae ocorreram muito antes da chegada, no final do Mioceno-início do Plioceno, de miomorfos (ratos e camundongos) e sciuromorfos (esquilos) como “arautos” do Grande Intercâmbio Biótico Americano que se seguiu à formação do istmo do Panamá (MCKENNA et al., 1997; WOODS,
1982). A ausência de concorrentes pode explicar o impressionante conjunto de nichos ecológicos explorados por gêneros de equimiídeos (GALEWSKI et al., 2005;
MARES e OJEDA, 1982): além de gêneros terrestres (Hoplomys, Proechimys,
Trinomys e Thrichomys), semi-fossoriais (Clyomys, Carterodon e Euryzygomatomys), escansoriais (Capromys) e semi-aquáticos (Myocastor), muitas formas são principalmente arbóreas, movendo-se como esquilos em troncos e ramos seja alimentando-se de folhas e frutos (Callistomys, Diplomys, Echimys, Isothrix, 21
Makalata, Mesomys, Lonchothrix, Pattonomys, Phyllomys, Santamartamys e
Toromys) ou restritas ao bambu (Dactylomys, Kannabateomys e Olallamys). A maioria dos gêneros arbóreos mal é amostrada por métodos tradicionais de coleta, portanto muitos táxons permanecem insuficientemente conhecidos. A amostragem incompleta tem obscurecido o conhecimento da diversidade dos equimiídeos, delimitado artificialmente suas distribuições geográficas e restringido a amostragem taxonômica nas análises filogenéticas, mas a situação está melhorando. Na última década, quatro novos gêneros arbóreos (Callistomys, Pattonomys, Santamartamys e
Toromys) foram descritos para refletir a nova compreensão das relações de grupo
(EMMONS, 2005; EMMONS et al., 2002; IAK-XIMENES et al., 2005).
As primeiras análises filogenéticas de equimiídeos, usando seqüências do gene mitocondrial do citocromo-b (cyt-b), ressaltaram uma clara diferenciação de gêneros e sugeriram sua divergência quase simultânea. Lara et al. (1996), apropriadamente chamaram a estrutura de árvore resultante de "filogenia-em-estrela," composta por ramificações terminais longas e distintas (principalmente gêneros e grupos de espécies) e internós curtos e mal apoiados para relacionamentos de nível superior. Eles forneceram evidência de que ratos-de-espinho da Mata Atlântica, anteriormente classificados em Proechimys, mereciam distinção genérica de
Trinomys e mostraram relações estreitas entre Proechimys (stricto sensu) e
Hoplomys. Uma análise posterior, empregando mais táxons e três genes mitocondriais (cyt-b, 12S e 16S) ofereceu maior resolução e revelou que Myocastor e
Capromys pertenciam a Echimyidae (LEITE e PATTON, 2002). Os ratos escaladores, Lonchothrix e Mesomys foram removidos de Eumysopinae, que, em seguida, formou um clado-irmão das formas arbóreas. No entanto, nem Isothrix nem 22
Lonchothrix + Mesomys agruparam com os gêneros arbóreos restantes agrupados em
Dactylomyinae ou Echimyinae, reafirmando a filogenia-em-estrela.
Recentemente, Galewski et al. (2005) adicionaram o éxon 28 do gene nuclear do fator de von Willebrand (vWF) aos dados anteriores, gerando mais resolução para alguns membros terrestres. Eles descobriram três clados de equimiídeos: (Myocastor,
Thrichomys (Proechimys, Hoplomys)); um segundo de ((Euryzygomatomys, Clyomys)
Trinomys); e um terceiro dos gêneros arbóreos. No entanto, a posição de Capromys e as inter-relações dos gêneros arbóreos continuaram não-resolvidas. Usando um relógio molecular relaxado, eles estimaram que gêneros mais modernos datam do
Mioceno médio (14,4 Ma); radiações das espécies dos gêneros arbóreos foram datadas no Plioceno (2,3 a 2,7 Ma).
A morfologia permite diagnóstico confiável para a maioria dos gêneros de equimiídeos, mas assim como o conjunto de dados moleculares oferece pouco apoio para a maioria dos agrupamentos de supragenéricos. Empregando 50 caracteres cranianos e dentários para 54 táxons (23 deles extintos), Carvalho e Salles (2004) mostraram que as formas semifossoriais Carterodon, Clyomys e Euryzygomatomys formam um clado com os fósseis Pampamys e Theridomysops na base de
Echimyidae; eles também associaram Trinomys a Proechimys e Hoplomys
(reformando assim Eumysopinae) e aliaram como clados-irmãos todos os gêneros arbóreos mais Myocastor em um clado mal resolvido. Analisando os gêneros arbóreos usando 47 caracteres externos, cranianos e dentários, (EMMONS, 2005) recuperaram Echimys, Isothrix, Makalata, Pattonomys e Phyllomys como gêneros monofilético, razoavelmente bem apoiados, mas encontraram apoio fraco ou duvidoso para agrupamentos genéricos, tribais e subfamiliais. 23
Hipóteses de vicariância são sugeridas para explicar a divergência de alguns gêneros de equimiídeos (LEITE e PATTON, 2002). Esses mesmos dados, no entanto, apontam para uma diferenciação de aproximadamente 3,5 milhões de anos atrás para dois pares de gêneros, tendo cada par um gênero Amazônico e um da Floresta
Atlântica: os ratos arborícolas Echimys (Amazônico) e Phyllomys (Floresta Atlântica) e os ratos do bambu Dactylomys (Amazônico) e Kannabateomys (Floresta Atlântica).
Nessa data teria havido uma abrupta queda na temperatura e talvez um clima muito mais seco. Assim, a floresta úmida e contínua que se apresentava há cinco milhões de anos na América do Sul e abrigaria os ancestrais comuns dos pares de gêneros teria sofrido uma retração, passando a restringir-se à Costa Atlântica e à bacia Amazônica.
Uma vez que os ratos das árvores e os ratos do bambu são típicos das áreas de florestas, eles constituiriam as formas vicariantes, agora restritas à Amazônia e à
Floresta Atlântica (LEITE e PATTON, 2002). Galewski et al. (2005), no entanto, estimaram as divergências entre Echimys e Phyllomys, e entre Dactylomys e
Kannabateomys como 10,3 e 9,5 milhões de anos, respectivamente, coincidindo com a época da queda do nível do mar mais significativa do final do Terciário, levando-os a postular que este evento de regressão marinha poderia estar ligado a mudanças climáticas na América do Sul, implicando a redução de florestas úmidas. Segundo esses autores, as variações paleoclimáticas e paleoambientais durante o Mioceno desempenharam um papel crucial na diversificação ecomorfológica dos equimiídeos.
Proechimys
O gênero Proechimys de ratos-de-espinho representa um dos mais diversos grupos de roedores neotropicais com 63 formas nomeadas (WOODS e
KILPATRICK, 2005). Revisado em parte por Reig et al. (1980), Gardner e Emmons
(1984) e Patton (1987), o gênero pode incluir Hoplomys (LARA et al., 1996; 24
PATTON e REIG, 1989). O gênero, devido a sua alta diversidade e vasta distribuição geográfica, distribuindo-se das florestas de Honduras ao Paraguai, Amazônia e matas de galeria do Cerrado do Brasil central, é taxonomicamente um dos menos compreendidos entre todos os mamíferos neotropicais. O diagnóstico das espécies e, conseqüentemente, a definição de unidades naturais em Proechimys têm sido prejudicados pelo extraordinário nível de variabilidade intra e interpopulacional, havendo sobreposição de caracteres morfológicos entre as espécies. Mesmo os cariótipos, que têm sido úteis em diferenciar táxons de Proechimys em simpatria
(PATTON e GARDNER, 1972), são muitas vezes altamente variáveis geograficamente (GARDNER e EMMONS, 1984; REIG et al., 1980; REIG e
USECHE, 1976).
Apesar da alta variabilidade intra e interpopulacional de caracteres, algum progresso vem sendo feito na definição de espécies e seus prováveis limites geográficos (GARDNER e EMMONS, 1984; PATTON, 1987). Usando vários caracteres qualitativos craniodentais e baculares, Patton (1987) definiu nove grupos de espécies de Proechimys: decumanus, canicollis e simonsi como grupos monotípico e semispinosus, longicaudatus, goeldii, guyannensis, cuvieri e trinitatus como grupos politípicos. Patton et al. (2000), utilizando uma abordagem baseada em técnicas citogenéticas, moleculares, biogeográficas e morfológicas detectaram oito espécies de Proechimys apenas ao longo do rio Juruá em território brasileiro.
Dados cariológicos são muito úteis para a identificação dos táxons de
Proechimys. As espécies desse gênero apresentam variação considerável no número diplóide, de 2n = 14 (BARROS, 1978) a 2n = 62 cromossomos (AGUILERA e
CORTI, 1994; REIG e USECHE, 1976). Tal variação levou alguns autores a levantar a hipótese de que divergências cariotípicas seriam profundamente relevantes para a 25 especiação de Proechimys (AGUILERA e CORTI, 1994; PATTON e GARDNER,
1972). Reig e Useche (1976) identificaram cinco cariótipos diferentes em exemplares morfologicamente indistinguíveis do gênero Proechimys coletados no Peru: P. brevicauda (2n = 24), P. longicaudatus (2n = 28), P. semispinosus (2n = 30), P. handeei (2n = 32) e P. guyannensis (2n = 40). Fato similar foi detectado em exemplares coletados no Brasil. Barros (1978) descreveu três novas espécies de
Proechimys em um complexo de animais morfologicamente idênticos, provenientes do Pará: Proechimys sp.1 com 2n = 30; Proechimys sp.2 com 2n = 26, 27 e 26/27 e
Proechimys sp.3 com 2n = 14, 15 e 16. No entanto, as diferenças cariotípicas não estão restritas apenas aos números diplóides; Machado et al. (2005) descreveram quatro cariomorfos com 2n = 30, três com 2n = 28, um com 2n=15 e um com 2n =
44, encontrados em 42 espécimes coletados em 12 localidades de Floresta
Amazônica, Cerrado e áreas transicionais, resultando em um total de nove citótipos de Proechimys. Esses diferentes citótipos foram alocados em cinco espécies distintas representando os grupos goeldii, guyannensis e longicaudatus.
Alguns autores realizaram estudos combinando citogenética e sistemática molecular. Da Silva (1998) encontrou quatro espécies novas através de caracterização morfológica e genética (cariótipos e citocromo b): P. echinothrix (2n = 32, NF = 60);
P. kulinae (2n = 34, NF = 52); P. gardneri (2n = 40, NF = 56); P. handeei (2n = 40,
NF = 56). Weksler et al. (2001) analisaram dados cariológicos, morfométricos, morfológicos e moleculares entre populações e examinaram o atual arranjo taxonômico de P. roberti e P. oris. Seus resultados, juntamente com uma análise filogenética de seqüências do citocromo b levaram os autores a concluir que P. roberti, conhecido anteriormente por sua distribuição isolada, é uma espécie do grupo 26 guyannesis e que P. oris, que representa as espécies que ocorrem no leste da
Amazônia, é provavelmente um sinônimo júnior de P. roberti.
Vilela (2005) examinou parte dos grupos de espécies de Proechimys com base em uma análise conjunta do gene mitocondrial do citocromo b, de cariótipos e de distribuição geográfica, encontrando suporte para o monofiletismo do gênero
Proechimys. P. cuvieri, geralmente considerado em um grupo à parte, o grupo cuvieri, apresentou estreito relacionamento com espécies do grupo longicaudatus.
Este grupo, segundo esse estudo é um grupo natural apenas se acrescido de P. cuvieri, juntamente com P. longicaudatus, P. brevicauda e uma espécie nova morfologicamente assemelhada a P. longicaudatus, mas geneticamente distinta. O grupo goeldii não foi refutado, nem corroborado e incluiu: P. goeldii, P. quadruplicatus, P. steerei e uma espécie nova morfologicamente assemelhada a P. goeldii, porém geneticamente distinta. O grupo guyannensis incluiu P. arabupu, P. guyannensis e uma espécie ainda sem nome, P. sp. A, mas não incluiu P. roberti que formou um grupo separado das outras espécies. P. gardneri também não agrupou com espécies do grupo guyannensis e, quando agrupado, formou um grupo à parte com P. kulinae. O grupo simonsi confirmou-se como um grupo monotípico. P. echinothrix também formou um grupo monotípico. As relações filogenéticas supra- específicas em Proechimys encontradas através do citocromo b foram particularmente pouco resolvidas, sugerindo uma diversificação explosiva de muitas espécies do gênero.
O gênero vem despertando interesse desde que estudos recentes demonstraram que Proechimys poderia ter mecanismos naturais endógenos que fazem com que este animal seja resistente a epileptogênese como observado quando estes animais são submetidos a diferentes protocolos de epilepsia experimental (ARIDA et al., 2005). A 27 resistência aos tratamentos epileptogênico foi inicialmente caracterizada por Racine
(1972), com base nessas observações passou-se a investigar vários mecanismos neurais potencialmente importantes que poderiam estar por trás da resistência de
Proechimys à epilepsia (ANDRIOLI et al., 2009; ARIDA et al., 2005; CARVALHO et al., 2003; FABENE et al., 2001; ROCHA et al., 2006).
Thrichomys
Os punarés ou rabudos, como são conhecidos popularmente os roedores do gênero Thrichomys habitam ambientes xéricos e rochosos nos biomas da Caatinga e
Cerrado brasileiros e do Chaco paraguaio e boliviano (ALHO et al., 1986;
ANDERSON, 1997; CABRERA, 1961; MARES et al., 1985; MOOJEN, 1952;
STREILEIN, 1982). Essa ampla distribuição está intimamente associada com o cinturão diagonal de formações abertas que se estende ao longo de um eixo nordeste- sudoeste separando a Floresta Amazônica e a Mata Atlântica (ALHO, 1982; ALHO et al., 1986; MARES et al., 1986; MARES e OJEDA, 1982; MARES et al., 1985).
O gênero Thrichomys, anteriormente denominado Cercomys (Cuvier, 1829)
(nome este cujo holótipo é um composto constituído por elementos dos quais nenhum representa Thrichomys), foi, durante muito tempo, considerado monotípico e
Thrichomys apereoides sua única espécie (CABRERA, 1961; EISENBERG e
REDFORD, 1999; HONACKI et al., 1982; NOWAK, 1991; PETTER, 1973;
WOODS, 1993).
Com base nas áreas de ocorrência e padrões de coloração reconhecia-se cinco subespécies de Thrichomys apereoides: T. a. apereoides (Lund, 1839), no oeste de
Minas Gerais a Goiás; T. a. inermis (Pictet, 1843), em Jacobina na Bahia; T. a. pachyurus (Wagner, 1845), em Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, e Norte de São
Paulo; T. a. fosteri Thomas, 1903, no Paraguai e na Bolívia; e T. a. laurentius 28
Thomas, 1904, do Ceará a Pernambuco (ANDERSON, 1997; CABRERA, 1961;
MOOJEN, 1952).
Apesar de sua ampla distribuição, a maioria dos estudos sobre variação morfológica e citogenética em Thrichomys tem abordado principalmente amostras de populações do Nordeste brasileiro. Dos estudos de variação morfológica, podemos citar aqueles com análise de variação craniométrica em populações da região
Nordeste (BANDOUK e REIS, 1995; BANDOUK et al., 1996; DUARTE et al.,
1998), e de morfometria geométrica de mandíbula (DUARTE et al., 2000) e de crânio (REIS et al., 2002a, b) em populações da região Nordeste e estados de Minas
Gerais e Goiás. Os estudos de morfometria geométrica de crânio detectaram duas unidades geográficas morfometricamente diferenciadas: a primeira incluía populações dos estados de Ceará, Paraíba, Pernambuco e Alagoas enquanto a segunda era representada por amostras dos estados de Bahia, Minas Gerais e Goiás.
O gênero Thrichomys tem despertado interesse nos últimos anos pela variedade de cariótipos que têm sido descritos em diferentes localidades. Souza e
Yonenaga-Yassuda (1982) fizeram a primeira descrição de cariótipos de Thrichomys em uma amostra de 22 exemplares de cinco localidades no estado de Pernambuco que apresentaram 2n = 30, NF = 54. A não ser por um único exemplar de Exú, todos os machos apresentaram o cromossomo Y submetacêntrico. Além disso, um espécime de São Caetano apresentou heteromorfismo no par 1 e uma fêmea de
Floresta do Navio possuía o par X heteromórfico.
Svartman (1989) descreveu uma variação do cariótipo com 2n = 30, em que o
NF foi igual a 56, proveniente de um exemplar macho coletado no Distrito Federal.
Esse mesmo cariótipo foi encontrado no estado do Tocantins por Lima (2000). 29
Leal-Mesquita (1991) e Leal-Mesquita et al. (1993) encontraram dois cariótipos bastante distintos em localidades próximas na região do médio Rio São
Francisco na Bahia: 2n = 30, NF = 54, na margem oeste (esquerda); e 2n = 26, NF =
48, na margem leste (direita); sugerindo que os cariótipos encontrados representavam espécies distintas. Já Bonvicino et al. (2002) descreveram novos cariótipos e associaram estes e os cariótipos já descritos aos nomes disponíveis, de acordo com suas localidades-tipo e ocorrência dos diferentes cariomorfos: Thrichomys apereoides apereoides para 2n = 28, NF = 50; T. a. laurentius para 2n = 30, NF = 54; T. inermis para 2n = 26, NF = 48 e T. pachyurus para 2n = 34, NF = 64. Dois cariótipos (2n =
28, NF = 52 e 2n = 30, NF = 56) não puderam ser atribuídos a nenhum nome existente. Os autores propuseram modelos alopátricos e/ou parapátricos para diversificação cariotípica em Thrichomys sem, no entanto, fazer uma revisão taxonômica.
Basile (2003) propôs uma revisão taxonômica para o grupo, baseada em uma análise conjunta de dados morfológicos, morfométricos, variação geográfica e cariotípica. A autora reconhece quatro espécies distintas do gênero Thrichomys: T. apereoides, com distribuição pelo Norte do estado de Minas Gerais até o Sudoeste do estado de Goiás; T. inermis que ocorre na porção leste do estado de Bahia, delimitada a norte e a oeste pelo Rio São Francisco; T. laurentius que apresenta uma distribuição restrita à região leste dos estados de Alagoas e Pernambuco, associada às Florestas
Estacional Decidual e Ombrófila; e T. fosteri distribuído nos estados de Mato Grosso,
Mato Grosso do Sul e no Paraguai. Embora se tenha conseguido distinguir esses táxons, há uma grande área de ocorrência do gênero onde todos os prováveis táxons são novas espécies, não possuindo nomes disponíveis. Essa área corresponde ao interior dos estados de Alagoas, Bahia, Ceará, Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais, 30
Paraíba, Pernambuco, Piauí e Tocantins. Os espécimes dessas amostras são muito semelhantes entre si, sendo indistinguíveis, e apresentam quatro cariomorfotipos diferentes (2n = 30, NF = 54; 2n = 30, NF = 56; 2n = 28, NF = 52; 2n = 26, NF = 48).
Um estudo da variação cariotípica e morfométrica de Thrichomys, comparando exemplares de Lagoa Santa (localidade-tipo de T. apereoides), em
Minas Gerais, com 2n = 28, NF = 50 e do norte do Pantanal, em Mato Grosso, com
2n = 34, NF = 64, confirmou tratarem-se de espécies distintas e atribuiu o nome T. pachyurus para a amostra de Mato Grosso, por estar próxima a Cuiabá, a localidade- tipo da espécie (PESSÔA et al., 2004).
Braggio e Bonvicino (2004), com base em cerca de 1100 pares de bases do citocromo b, reconstruíram filogenias (por agrupamento de vizinhos, máxima parcimônia e máxima verossimilhança) e sugeriram o seguinte arranjo: T. pachyurus
(2n = 34), T. inermis (2n = 26), T. sp. n. (2n = 30, NF = 56) e T. apereoides (2n = 28,
NF = 50 ou 52; 2n = 30, NF = 54). Os autores explicaram este último como uma diferenciação cariotípica recente e/ou extinção casual de linhagens de uma população ancestral, na qual o polimorfismo do DNA mitocondrial estava presente.
Há, porém, alguns equívocos nas citações feitas por Bonvicino et al. (2002) e repetidos por Braggio e Bonvicino (2004) quanto à localização de alguns cariótipos.
O exemplar de 2n = 30, NF = 56 do Tocantins foi descrito por Lima (2000) como sendo proveniente da Fazenda Maracujá, no município Pequizeiro, e não na Fazenda
Osara, no município de São Sebastião, conforme foi apresentado nos estudos mencionados.
Além disso, Bonvicino et al. (2002) e Braggio e Bonvicino (2004) supuseram que a localidade de Queimada, na Bahia, apontada por Leal-Mesquita (1991) como uma das localidades de origem de exemplares com 2n = 30 e NF = 54, tratava-se do 31 município de Queimadas, no Nordeste Baiano, na região de Euclides da Cunha, enquanto as coordenadas fornecidas por Leal-Mesquita et al. (1993) localizam
Queimadas na região dos Mares de Dunas na margem oeste do Médio Rio São
Francisco, Bahia. Isso levou Bonvicino et al. (2002) e Braggio e Bonvicino (2004) a deduzirem, erroneamente, que em toda a porção leste da Bahia é encontrado o cariótipo de 2n = 30, NF = 54, e que o cariótipo de 2n = 26, NF = 48 limita-se apenas
à porção central do mesmo estado.
Em uma análise combinada de dados moleculares, citogenéticos e biogeográficos, Vilela (2005) sugeriu que o gênero Thrichomys é composto por pelo menos cinco espécies: T. inermis (2n = 26, NF = 48) no centro e leste da Bahia; T. pachyurus (2n = 30, NF = 56) em Goiás, norte de Mato Grosso e oeste do Tocantins;
T. fosteri (2n = 34, NF = 64) em Mato Grosso do Sul, sul de Mato Grosso e no
Paraguai; T. sp. n. (2n = 26, NF = 48) no sudeste do Tocantins; e T. apereoides que, ao contrário de estudos anteriores, naquele trabalho teve pouco suporte como grupo monofilético e apareceu dividido em, ao menos, três clados: (1) populações do norte e centro de Minas Gerais (2n = 28, NF = 50 ou 52); (2) populações do Ceará, Paraíba,
Piauí, Sergipe e oeste de Alagoas e Pernambuco (2n = 30, NF = 54); e (3) populações do sul da Bahia (2n = 28, NF = 52; ou 2n = 30, NF = 54 ou 56). Apesar de geralmente apresentarem suporte apenas moderado e valores de distâncias genéticas entre eles variando de pouco a considerável, esses três clados apresentaram composições de cariótipos distintas e aparentemente representam casos de especiação recente com pouco fluxo gênico. Uma espécie adicional, T. laurentius, foi reconhecida em estudo anterior (BASILE, 2003) baseando-se em dados morfológicos e morfométricos, com distribuição pelo leste de Alagoas e Pernambuco, cujo cariótipo (2n = 30, NF = 54) é semelhante ao encontrado nas populações do clado „2‟ de T. apereoides. 32
Trinomys
Os ratos-de-espinho terrestres do gênero Trinomys, têm uma ampla distribuição, com onze espécies e oito subespécies reconhecidas (WOODS E
KILPATRICK, 2005), em seis estados brasileiros (LARA et al., 2002). Essas espécies são encontradas principalmente em áreas de Mata Atlântica do leste do Brasil, em altitudes que variam do nível do mar a 1,3 mil metros (BONVICINO et al., 1997;
EISENBERG e REDFORD, 1999; GEISE et al., 2004; LARA e PATTON, 2000;
LARA et al., 2002; MOOJEN, 1948; PESSÔA et al., 1996). Aspectos de sua distribuição, limites de espécies e taxonomia ainda são pouco resolvidos, com vários táxons conhecidos apenas por suas localidades-tipo e adjacências: Trinomys gratiosus bonafidei (MOOJEN, 1948), Trinomys yonenagae (DA ROCHA, 1995), Trinomys moojeni (PESSÔA et al., 1992), Trinomys eliasi (PESSÔA e REIS, 1993) e Trinomys mirapitanga (LARA et al., 2002).
Thomas (1921) dividiu o gênero Proechimys em dois subgêneros (Proechimys sensu stricto e Trinomys). Porém, Lara et al. (1996), com base em seqüências do gene mitocondrial do citocromo b, mostraram que Trinomys não está filogeneticamente relacionados com Proechimys e deve, portanto, ser considerado um gênero separado.
Esses autores também mostraram que o gênero é composto por três clados distintos cujas divergências de seqüências são iguais ou maiores que as encontradas entre outros gêneros de equimiídeos. A filogenia de seqüências completas do citocromo b de Lara et al. (1996) não resolveu as relações de grupos-irmãos entre a maioria dos gêneros da família Echimyidae, incluindo os dois gêneros Trinomys e Proechimys, nem entre os clados de Trinomys. No entanto, Lara et al. (1996) mantiveram uma visão conservadora e trataram Trinomys como uma unidade monofilética. Este grupo possui caracteres morfológicos e citogenéticos únicos que podem ser sinapomórficos, 33 mas porque a polaridade é difícil determinar, para equimídeos em geral, o monofiletismo de Trinomys só pôde ser adotado como uma hipótese de trabalho.
Cada uma das espécies descritas de Trinomys tem uma distribuição restrita, e muitos táxons formais (espécies ou subespécies reconhecidas atualmente) são conhecidos apenas em suas localidades-tipo. Uma extensa variação dentro e entre populações torna a identificação taxonômica e classificação das populações locais uma tarefa desafiadora, contribuindo para uma sistemática confusa. Embora alguns estudos tenham sido publicados sobre a sistemática, ecologia e história natural de
Proechimys, pouco há sobre Trinomys. O trabalho mais abrangente sobre a sistemática deste táxon foi produzido por Moojen (1948). Apenas recentemente estudos taxonômicos mais detalhados foram iniciados, com os trabalhos de Pessôa
(1992), Pessôa e Reis (1991, 1992a, b, 1993, 1994) e Pessôa e Reis (1996). Estudos citogenéticos também têm sido úteis na caracterização e diagnóstico de espécies de
Trinomys (CORRÊA et al., 2005; LEAL-MESQUITA et al., 1992; PESSÔA et al.,
2005; YONENAGA-YASSUDA et al., 1985). Esses estudos, com base em cariótipos, morfologia e morfometria, foram úteis na criação de caracteres diagnósticos para as unidades taxonômicas reconhecidas, embora não tenham tentado colocar a nova informação em um contexto filogenético. No entanto, as informações apresentadas na revisão taxonômica de Pessôa (1992), forneceram a base para uma análise filogenética, que testasse os arranjos taxonômicos (e sua filogenia implícita).
Essa base serviu para que Lara e Patton (2000) analisassem as relações filogenéticas e filogeográficas entre e dentro das espécies de Trinomys usando dados de seqüência do citocromo b. Os níveis de divergência das seqüências entre as espécies de Trinomys foram tão elevados quanto os encontrados entre os táxons de equimiídeos reconhecidos como gêneros diferentes, resultados similares aos 34 encontrados por Lara, et al. (1996). Trinomys engloba três clados distintos monofiléticos que mostraram uma concordância notável com a distribuição da vegetação. Os haplótipos do clado 1 estão distribuídos ao longo da costa do sudeste brasileiro, seguindo a floresta tropical úmida. Os membros do clado 2 são encontrados nas florestas semidecíduas. T. albispinus representa o clado 3 e é encontrado em uma vegetação mais xérica. Estimativas de tempos de divergência separando os três clados forneceram um intervalo de 1,6 a 7,4 milhões de anos, anterior às flutuações climáticas do Pleistoceno. Portanto, a hipótese de refúgios do
Pleistoceno tardio na Mata Atlântica não pode explicar a divergência dos clados de
Trinomys, mas provavelmente as oscilações climáticas do Pleistoceno moldaram a distribuição atual das espécies. Lara e Patton (2000) sugeriram então uma ampla revisão taxonômica, refletindo as relações filogenéticas das entidades monofiléticas dentro do gênero Trinomys, o grau de diferenciação molecular e a diagnosticabilidade morfológica.
No presente estudo procurou-se datar os principais eventos de cladogênese envolvendo unidades taxonômicas dos gêneros de equimiídeos Proechimys,
Thrichomys e Trinomys, relacionando-os com mudanças climático-vegetacionais que tenham ocorrido na região neotropical, mais especificamente nas regiões da Floresta
Amazônica, da Mata Atlântica e das formações abertas que as separam. 35
Objetivos
Este projeto teve como principal objetivo investigar como as mudanças climático-vegetacionais ocorridas durante o Cenozóico podem ter influenciado a fauna sul-americana, mais especificamente de pequenos mamíferos terrestres. Foram utilizadas ferramentas de filogenia e datação moleculares, para testar e propor hipóteses que resultaram em contribuições para a compreensão da história evolutiva da região neotropical e caracterização de espécies de roedores da família Echimyidae, aumentando o conhecimento da distribuição e taxonomia desses táxons. Para tanto pretendeu-se datar os principais eventos de cladogênese envolvendo unidades taxonômicas dos gêneros de equimiídeos terrestres Proechimys, Thrichomys e
Trinomys, da Amazônia, do Cerrado e da Mata Atlântica, respectivamente, relacionando-os com mudanças climático-vegetacionais que teriam ocorrido na região neotropical, principalmente a partir do Oligoceno. 36
Materiais e Métodos
Materiais
Para estimar as datas dos eventos de cladogênese envolvendo unidades taxonômicas de cada gênero construímos matrizes com seqüências de até 801 pares de bases do gene mitocondrial do citocromo b, sendo 42 seqüências de Proechimys
(Tabela 1), 31 de Thrichomys (Tabela 2) e 21 de Trinomys (Tabela 3).
Tabela 1. Exemplares do gênero Proechimys utilizados em nossas análises, suas respectivas localidades, coordenadas, espécies, números de acesso no GenBank
(quando disponíveis), tamanhos dos fragmentos em pares de bases e referências.
Exemplar1 Localidade2 Lat. Lon. Referido como GenBank / Procedência
ALG14040 San Carlos de Rio Negro, VEN 1,9 -67,1 P. amphichoricus U35413
INPA3445 Sobral, AC -8,4 -72,8 P. brevicauda MVZ-UC, Berkeley
MVZ157878 La Poza, PER -5,9 -78,7 P. brevicauda MVZ-UC, Berkeley
V-939 Nouragues, GUF 4,1 -52,7 P. cayennensis AJ2513978
PCA2477 Pic Matecho, GUF 3,8 -53,0 P. cayennensis AY206606
INPA3461 Igarapé Porongaba, AC -8,7 -72,8 P. cuvieri MVZ-UC, Berkeley
INPA3476 Seringal Condor, AM -6,8 -70,9 P. cuvieri MVZ-UC, Berkeley
MVZ160091 Bolivar, VEN 6,5 -61,7 P. cuvieri MVZ-UC, Berkeley
PCU2336 Baramita, GUF 7,4 -60,5 P. cuvieri AY206626
PCU2475 Pic Matecho, GUF 3,8 -53,0 P. cuvieri AY206627
INPA3482 Lago Vai-Quem-Quer, AM -3,3 -66,0 P. echinothrix MVZ-UC, Berkeley
MVZ187209 Altamira, AM -6,6 -68,9 P. gardneri MVZ-UC, Berkeley
USNM549572 Altamira, PA -3,7 -52,4 P. goeldii MVZ-UC, Berkeley
CIT1950 UHE Guaporé, MT -15,3 -59,2 P. gr. goeldii este estudo
CIT588 Gaúcha do Norte, MT -13,2 -53,3 P. gr. goeldii este estudo
CIT648 Juruena, MT -10,3 -58,5 P. gr. goeldii este estudo
ALG14242 Río Mawarinuma, VEN 0,8 -66,2 P. guyannensis MVZ-UC, Berkeley
MNRJ42831 São João da Baliza, RR 1,0 -59,9 P. guyannensis MVZ-UC, Berkeley 37
MUSM13340 Nuevo San Juan, PER -5,3 -73,2 P. kulinae MVZ-UC, Berkeley
MVZ187193 Barro Vermelho, AM -6,5 -68,8 P. kulinae MVZ-UC, Berkeley
CIT1124 PN Emas, GO -18,3 -52,9 P. longicaudatus este estudo
CIT1949 UHE Guaporé, MT -15,3 -59,2 P. longicaudatus este estudo
CIT375 Aripuanã, MT -10,2 -59,5 P. longicaudatus este estudo
CIT441 Apiacás, MT -9,6 -57,4 P. longicaudatus este estudo
CIT622 Juruena, MT -10,3 -58,5 P. longicaudatus este estudo
TTS119 El Refugio, BOL -14,8 -61,0 P. longicaudatus MVZ-UC, Berkeley
CIT1359 Uruçuí-Uma, PI -8,9 -45,0 P. oris este estudo
CIT1402 Paranã, TO -12,5 -47,9 P. oris este estudo
CIT1488 Peixe, TO -12,0 -48,5 P. oris este estudo
CJ5 FLONA Carajás, PA -6,4 -50,0 P. oris MVZ-UC, Berkeley
LPC714 Rio Santa Teresa, TO -11,8 -48,6 P. oris MVZ-UC, Berkeley
MVZ157871 La Poza, PER -5,9 -78,7 P. quadruplicatus MVZ-UC, Berkeley
CIT458 Cláudia, MT -11,6 -55,1 P. roberti este estudo
CIT589 Gaúcha do Norte, MT -13,2 -53,3 P. roberti este estudo
MVZ197580 RESEC Cristalino, MT -9,6 -55,9 P. roberti MVZ-UC, Berkeley
CIT714 Vila Rica, MT -9,9 -51,2 P. roberti EU544666
MVZ190710 Penedo, AM -6,8 -70,8 P. simonsi MVZ-UC, Berkeley
JLP11051 Madre de Dios, PER -12,7 -71,3 P. simonsi U35414
IM3575 UHE Samuel, RO -8,9 -63,3 P. sp. MVZ-UC, Berkeley
JLP16737 Macaco, AM -2,1 -62,1 P. steerei MVZ-UC, Berkeley
MVZ160036 Reserva Cusco Amazónico, PER -12,6 -69,1 P. steerei MVZ-UC, Berkeley
1 Exemplares estão depositados nas coleções do: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus
(INPA), Museu Nacional, Rio de Janeiro (MNRJ), Museum of Vertebrate Zoology, University of
California, Berkeley (MVZ), United States National Museum, Washington (USNM). Outros prefixos correspondem aos números de campo de espécimes coletados por: A. L. Gardner (ALG); F. Catzeflis
(V); J. L. Patton (JLP), Laboratório de Citogenética de Vertebrados, IB-USP (CIT).
2 AC = Acre; AM = Amazonas; GO = Goiás; MT = Mato Grosso; PA = Pará; PI = Piauí; RO =
Rondônia; RR = Roraima; TO = Tocantins. BOL = Bolívia; GUF = Guiana Francesa; PER = Peru; VEN
= Venezuela.
38
Tabela 2. Exemplares do gênero Thrichomys utilizados em nossas análises com o gene do citocromo b, suas respectivas localidades, coordenadas, espécies, números de acesso no GenBank, tamanhos dos fragmentos em pares de bases e referências.
Exemplar1 Localidade2 Lat. Lon. Referido como GenBank / Procedência
LBCE 1257 João Costa, PI -8,5 -42,4 T. apereoides AY083332
LBCE 862 Coronel José Dias, PI -8,8 -42,5 T. apereoides AY083334
LV-XI 02 Delmiro Gouveia, AL -9,4 -38 T. apereoides AY083338
CRB 1848 Jaborandi, BA -14,6 -45,8 T. apereoides AY083339
FC 107 Juramento, MG -16,9 -43,6 T. apereoides AY083341
CRB 1595 Jaborandi, BA -14,6 -45,8 T. apereoides AY083342
LBCE 1505 Caetité, BA -14,1 -42,5 T. apereoides AY083344
CIT 1225 Milagres, BA -12,9 -39,9 T. apereoides este estudo
CIT 1531 PN Serra das Confusões, PI -9,1 -43,5 T. apereoides este estudo
CIT 1546 EE Uruçuí-Una, PI -8,9 -45,2 T. apereoides este estudo
CIT 2056 Januária, MG -15,5 -44,4 T. apereoides este estudo
LGA 461 PN Gr. Sertão Veredas, MG -15,4 -46,1 T. apereoides este estudo
MA 01 S. Francisco do Brejão, MA -5,1 -47,4 T. apereoides este estudo
MA 13 Porto Franco, MA -6,4 -47,4 T. apereoides este estudo
MAS 179 Araruna, PB -6,5 -35,7 T. apereoides este estudo
LBCE 1920 Corumbá, MS -19,3 -57 T. fosteri AY083329
MS 11i Ribas do Rio Pardo, MS -20,5 -53,8 T. fosteri MVZ-UC, Berkeley
LBCE 1302 Sento Sé, BA -9,7 -41,9 T. inermis AY083343
BIO 872 Santo Inácio, BA -11,1 -42,7 T. inermis U34854
XI 012i Delmiro Gouveia, AL -9,4 -38 T. inermis U34855
CIT 1224 Morro do Chapéu, BA -11,6 -41,2 T. inermis este estudo
YL 46 Canudos, BA -10 -39 T. inermis MVZ-UC, Berkeley
CRB 1815 Teresina de Goiás, GO -13,8 -47,3 T. pachyurus AY083330
CRB 899 Cavalcante, GO -14,1 -47,8 T. pachyurus AY083331
CIT 1221 PN Araguaia, TO -10,5 -50,2 T. pachyurus este estudo
CIT 1544 Chapada dos Guimarães, MT -15,9 -55,4 T. pachyurus este estudo
MA 35 Figueirópolis, TO -12,1 -49,1 T. pachyurus este estudo
CIT 1409 Paranã, TO -12,6 -47,9 T. sp. n. este estudo
LGA 891 PE Jalapão, TO -10,4 -46,3 T. sp. n. este estudo
LGA 895 PE Jalapão, TO -10,4 -46,3 T. sp. n. este estudo
MTR 3926 Paranã, TO -12,6 -47,9 T. sp. n. este estudo 39
1 Prefixos correspondem aos números de campo de espécimes coletados por: C. R. Bonvicino (CRB);
Laboratório de Biologia e Controle da Esquistosomose, FIOCRUZ (LBCE); Laboratório de
Citogenética de Vertebrados, IB-USP (APM, BIO, CIT); Laboratório de Genética Animal, UFES
(LGA); Laboratório de Veretebrados, UFRJ (LV); M. A. N. de Souza (MAS); M. Lapenta e A. Bueno
(MA); M. T. Rodrigues (MTR); R. Cerqueira (MS, XI); Y. Leite (YL).
2 AL = Alagoas; BA = Bahia; GO = Goiás; MA = Maranhão; MG = Minas Gerais; MS = Mato Grosso do Sul; MT = Mato Grosso; PB = Paraíba; PI = Piauí; TO = Tocantins.
Tabela 3. Exemplares do gênero Trinomys utilizados em nossas análises com o gene do citocromo b, suas respectivas localidades, coordenadas, espécies, números de acesso no GenBank, tamanhos dos fragmentos em pares de bases e referências.
Exemplar1 Localidade2 Lat. Lon. Referido como GenBank
AL 3054 Cristinápolis, SE -11,5 -37,8 T. albispinus EU313251
AP 36 Bocaiúva, MG -17,4 -43,9 T. albispinus MVZ-UC, Berkeley
LG 3 Nova Friburgo, RJ -22,3 -42,5 T. dimidiatus U35167
MNR J31413 Sta. Maria Magdalena, RJ -22,0 -42,0 T. dimidiatus U35168
MAM 10 Angra dos Reis, RJ -23,0 -44,5 T. dimidiatus U35169
JDM 3 Petrópolis, RJ -22,5 -43,2 T. dimidiatus U35170
ML 141 Restinga de Maricá, RJ -22,9 -42,8 T. eliasi U35166
MNRJ 31370 Serra do Paquequé, RJ -22,2 -42,7 T. gratiosus bonafidei AF194281
MNRJ 31426 Santa Tereza, ES -19,8 -40,4 T. gratiosus gratiosus AF194277
PH 10337 PN Caparaó, ES -20,5 -41,8 T. gratiosus gratiosus AF194278
PH 10340 PN Caparaó, ES -20,5 -41,8 T. gratiosus gratiosus AF194279
YL 3 Sta. Rita do Jacutinga, MG -22,1 -44,1 T. gratiosus gratiosus AF194280
CIT 1616 EB Boracéia, SP -22.2 -48.8 T. iheringi EU544664
NSV 15 Ubatuba, SP -23,4 -45,1 T. iheringi MVZ-UC, Berkeley
MVZ 193411 Ilha de São Sebastião, SP -23,8 -45,3 T. iheringi U35171
MNRJ 31459 Porto Seguro, BA -16,4 -39,1 T. mirapitanga U35173
YL 34 Grota da Aracruz Florestal, ES -19,8 -40,2 T. paratus U35165
MNRJ 31441 Conceição do Mato Dentro, MG -19,0 -43,4 T. setosus denigratus AF422923
MNRJ 31448 Rio Casca, MG -20,2 -42,7 T. setosus elegans AF422924
AL 3072 Cristinápolis, SE -11,5 -37,8 T. setosus setosus U34856 40
PEU 880027 Ibiraba, BA -10,8 -42,8 T. yonenagae U35172
1 Exemplares estão depositados nas coleções do: Museu Nacional, Rio de Janeiro (MNRJ); Museum of
Vertebrate Zoology, University of California, Berkeley (MVZ). Outros prefixos correspondem aos números de campo de espécimes coletados por: A. Langguth (AL); L. Geise (LG); Laboratório de
Citogenética de Vertebrados, IB-USP (CIT); M. Lara (ML); P. Hershkovitz (PH); P. L. B. da Rocha
(PEU); R. Cerqueira (JDM, MAM); Y. Leite (YL).
2 BA = Bahia; ES = Espírito Santo; MG = Minas Gerais; RJ = Rio de Janeiro; SE = Sergipe; SP = São
Paulo.
Visando evitar os efeitos combinados de amostragens taxonômicas esparsas e distância dos pontos de calibração, procuramos utilizar o maior número possível de táxons e pontos de calibração, com boa proximidade entre os pontos de calibração e os nós a serem estimados. Assim nossas estimativas de tempos de divergência seriam menos suscetíveis ao aumento no grau de imprecisão causado por subamostragem somada ao uso de pontos de calibração distantes.
Com este objetivo, incluímos em nossas análises com cada matriz, seqüências obtidas no GenBank de 32 exemplares pertencentes a nove famílias de
Hystricomorpha: Ctenodactylidae (Ctenodactylus vali, AJ389532 e Massoutiera mzabi, AJ389533), Bathyergidae (Bathyergus suillus, AY425913; Cryptomys hottentotus nimrodi, AY425885 e Heliophobius argenteocinereus, AY425940),
Hystricidae (Atherurus macrourus, FJ931121 e Hystrix africaeaustralis, X70674),
Erethizontidae (Chaetomys subspinosus, EU544660; Coendou bicolor, U34851;
Coendou prehensilis, AF411581; Erethizon dorsatum, FJ357428; Sphiggurus villosus,
EU544661 e EU544662), Dasyproctidae (Dasyprocta leporina, AF437791 e
Myoprocta acouchy, AF437781), Caviidae (Cavia aperea, EU544669; Dolichotis 41 patagonun centricola, GU136724; Hydrochoeris hydrochaeris, GU136721 e Kerodon rupestris, GU136722), Octodontidae (Octodontomys gliroides, AF370706;
Spalacopus cyanus, AF007061 e Tympanoctomys barrerae, AF007060), Ctenomyidae
(Ctenomys frater, AF007045 e Ctenomys latro, AF370705) e Echimyidae, representada pelas subfamílias: Capromyinae (Capromys pilorides, AF422915),
Dactylomyinae (Dactylomys boliviensis, L23339 e Kannabateomys amblyonyx,
EU544665), Echimyinae (Echimys macrurus, EU302703), Myocastorinae (Myocastor coypus, EU544663) e Eumysopinae (Clyomys laticeps, AF422918; Euryzygomatomys spinosus, EU544667). Como grupo externo utilizamos uma seqüência de Mus musculus (AB042809), também do GenBank.
Métodos
Isolamento do DNA, Amplificação e Seqüenciamento do Gene do
Citocromo b
As amostras de DNA foram isoladas de fragmentos de fígado, músculo ou orelha, preservados em etanol absoluto ou congelados, seguindo os procedimentos descritos em Fetzner (1999) ou kits de extração. Dois fragmentos de DNA do citocromo b foram amplificados em reações em cadeia da polimerase (PCR) de 25 μl usando os pares de oligonucleotídeos MVZ 05–MVZ 16 e MVZ 127–MVZ 108 e o seguinte regime de temperaturas: desnaturação inicial 94°C/5 min; 40 ciclos de
94°C/30 s, 48°C/45 s, 72°C/1min; e extensão final a 72°C/10 min.
Após uma verificação em gel de agarose, os produtos de PCR, após serem purificados, passaram pela reação de seqüenciamento empregando o kit Big Dye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Byosystems) por 25 ciclos de 42
95C/30 s, 50C/15 s, 60C/4 min com os mesmos oligonucleotídeos citados acima.
Após lavagens com isopropanol a 75% e depois com etanol a 70%, os produtos da reação de seqüenciamento foram precipitados e então ressuspendidos em tampão
TSR (Applied Biosystems) e então corridos em sequenciadores automáticos ABI
PRISM Genetic Analyzer (modelos 3100 ou 3700). Os fragmentos foram reunidos e as seqüências montadas foram alinhadas manualmente no editor CodonCode Aligner v3.5.7 (CodonCode Corporation, 2009) e automaticamente no aplicativo ClustalW
(THOMPSON et al., 1994) implementado no programa BioEdit v7.0.9.0 (HALL,
1999) com penalidades 30 para abertura de deleções e 10 para extensão tanto nos alinhamentos par-a-par quanto nos múltiplos. As seqüências de aminoácidos resultantes das seqüências de nucleotídeos foram obtidas usando o programa
Mesquite v2.72 (MADDISON e MADDISON, 2009), estimativas das freqüências de bases e substituições e do uso dos códons foram obtidos no programa MEGA 4
(TAMURA et al., 2007) e a ocorrência de saturação foi verificada através do programa DAMBE v5.2.18 (XIA e XIE, 2001).
Análises Filogenéticas
Análises filogenéticas foram executadas utilizando o programa Treefinder versão de outubro de 2008 (JOBB, 2008) para análise de máxima verossimilhança e utilizando o programa BEAST v1.5.4 (DRUMMOND e RAMBAUT, 2007) para análise bayesiana. Os modelos para máxima verossimilhança foram determinados com base no Critério de Informação de Akaike com correção (AICc) utilizando o programa Treefinder versão de outubro de 2008 (JOBB, 2008); enquanto os modelos para análise bayesiana foram definidos por AIC com a ajuda do programa
MrModeltest 2.3 (NYLANDER, 2004). Tendo em conta os diferentes processos 43 evolutivos que ocorrem em cada uma das três posições do códon, foram estimados e incorporados modelos específicos para cada posição do códon, com freqüências de bases, substituições, e parâmetros desvinculados entre si.
Os suportes dos ramos na máxima verossimilhança foram dados pelo método de Strimmer e Rambaut (2002) de pesos de verossimilhança esperada em rearranjos locais (Local Rearrangements Expected-Likelihood Weights – LR-ELW) e por bootstrap (FELSENSTEIN, 1985) com mil pseudo-réplicas; ambos utilizando o programa Treefinder versão de outubro de 2008 (JOBB, 2008).
Na análise bayesiana, as cadeias markovianas foram amostradas a cada mil em dez milhões de gerações com quatro cadeias simultâneas. As probabilidades posteriores bayesianas foram calculadas combinando-se árvores amostradas por modelos de relógio estrito e relaxado após a remoção das primeiras gerações (burnin) das amostragens feitas a partir de cada modelo.
Datações Moleculares
Para verificar se um relógio molecular global poderia ser aplicado aos nossos dados, implementamos através do software PAUP* v4.0b10 (SWOFFORD, 2003) um teste de razão de verossimilhança entre os escores de verossimilhança de uma análise produzida pressupondo taxas de substituição homogêneas entre os ramos (relógio forçado) e de uma análise sem este pressuposto (relógio relaxado). O modelo de substituição utilizado foi o mesmo em ambas as análises, TVM+I+G, determinado por AICc no programa jModeltest v0.1.1 (POSADA, 2008). As estimativas de tempos de divergência foram calculadas usando métodos baseados em análises bayesianas
(DRUMMOND et al., 2002) e métodos não-bayesianos. Na análise bayesiana, as datas foram estimadas tanto por meio de relógio estrito quanto por relógio relaxado, 44 este último usando taxas não-correlacionadas com distribuição log-normal, conforme descrito por Drummond et al. (2006). Ambos os modelos foram implementados utilizando o programa BEAST v1.5.4 (DRUMMOND e RAMBAUT, 2007). Como métodos não-bayesianos foram utilizados: o método de deformação mínima da taxa global (global rate minimum deformation – GRMD); e uma variante do método de suavização não-paramétrica das taxas (nonparametric rate smoothing – NPRS)
(SANDERSON, 1997) que compara as taxas em escala logarítmica (NPRS-LOG).
Ambos os métodos foram implementados no programa Treefinder, versão de Junho de 2008 (JOBB, 2008). Os limites de confiança para as datações por métodos não- bayesianos foram obtidos por reamostragem por bootstrap com cem pseudo-réplicas.
Os métodos utilizados para estimar os tempos de divergência permitiram a incorporação de múltiplos pontos de calibração com base no registro paleontológico.
Assim, fósseis foram selecionados para abarcar a abrangência e profundidade filogenética dos roedores histricognatos. Objetivando minimizar erros imprevistos associados com heterogeneidade de taxas de substituição entre linhagens, escolhemos pontos de calibração de maneira a incorporar a gama potencial de classes de taxas evolutivas através da inclusão de representantes fósseis que englobam vários atributos de história natural (DOBSON e OLI, 2007; RAMBAUT e BROMHAM, 1998;
ROWE e HONEYCUTT, 2002; WILSON e REEDER, 2005). Com efeito, empregamos apenas pontos de calibração que se adequaram ao critério de cair dentro do grupo de interesse (ou seja, Hystricognathi), abrangendo a gama de nós dos mais recentes aos mais basais.
O primeiro ponto de calibração utilizado foi a radiação de Caviomorpha no
Eoceno Superior-Oligoceno Inferior, aproximadamente 34 milhões de anos atrás, na 45 idade Mustersense de Mamíferos Terrestres Sul-americanos (South American Land
Mammal Age - SALMA) conforme geocronologia de Kay et al. (1999), baseado na fauna da formação Santa Rosa na Amazônia peruana (FRAILEY e CAMPBELL JR.,
2004). Como um segundo ponto de calibração utilizou-se a separação entre Caviidae e Dasyproctidae no Oligoceno inferior, a cerca de 31,5 Ma, com base na presença de um possível dasiproctídeo na fauna de Tinguiririca, no Chile (FLYNN et al., 2003).
Como um terceiro ponto de calibração utilizou-se a separação entre as linhagens de
Echimyidae de Octodontidae e Ctenomyidae no Oligoceno Superior, a cerca de 27 milhões de anos (idade Deseadense, SALMA) (VUCETICH et al., 1999). Como quarto ponto de calibração, posicionou-se o ancestral comum mais recente de
Echimyidae no Mioceno inferior, a cerca de 20 milhões de anos (idade
Colhuehuapiense, SALMA) (CARVALHO e SALLES, 2004). Finalmente, como quinto ponto de calibração, consideramos o ancestral comum mais recente de
Hydrochoerus, Kerodon e Dolichotis como tendo 16 Ma (CROFT, 2007). 46
Resultados
Proechimys
Composição de bases e variação das seqüências
A matriz resultante apresentou 76 táxons e 801 caracteres, sendo destes: 363 constantes, 52 variáveis não-informativos para parcimônia e 386 informativos. O sinal filogenético foi significativo conforme indicado pelo teste G1 (média =
6807,092623; desvio-padrão = 77,648995; g1 = -0,376504; g2 = 0,221365). A razão de substituições entre as posições do códon foi de 4:1:16, contrastando com a razão observada por Lara et al. (1996), 2:1:15 para o mesmo gene.
As freqüências de G variaram muito entre as posições: 22,4% na primeira,
12,9% na segunda e 2,9% na terceira. A base mais freqüente na terceira posição do códon foi A (39,6%), seguida de C (31,9%) e T (25,7%), enquanto na segunda posição a base mais freqüente foi T (38,9%), e na primeira, A (29,5%). Essas freqüências refletem uma forte tendência para o uso preferencial de códons terminando com A, depois com C, T e G e diferem das freqüências médias obtidas, onde T (30,7%) é a mais usada, seguida por A (30,1%), C (26,5%) e G (12,7%). A composição de bases do gene do citocromo b em nossa matriz foi muito similar aos padrões encontrados para este gene em mamíferos em geral (IRWIN et al., 1991; MA et al., 1993) e equimiídeos em particular (LARA et al., 1996).
As transições do tipo T↔C na terceira posição foram as substituições mais comuns, totalizando 56; as próximas substituições mais comuns foram transversões do tipo C↔A e do tipo T↔A na terceira posição e transições do tipo T↔C na primeira posição e A↔G na terceira posição, perfazendo 21, 20, 12 e 9 substituições, 47 respectivamente. No total das três posições, as transições do tipo A↔G ocorreram com uma freqüência bem menor que T↔C (16 contra 73 substituições), possivelmente devido às baixas freqüências de G tipicamente encontradas no DNA mitocondrial. As transversões também apresentaram a mesma tendência, com C↔A e
T↔A representando respectivamente 25 e 24 substituições, contra C↔G e T↔G representando três substituições cada.
Os dados das curvas de saturação foram consistentes com aqueles esperados para seqüências codificadoras e já descritos para o citocromo b de Echimyidae por
Lara et al. (1996) e de Rodentia por Montgelard et al. (2002). Observou-se uma forte saturação para as transições nas terceiras posições, mas as transições nas primeiras e segundas posições e transversões em todas as posições estavam fracamente saturadas
(Figura 1). A saturação observada nas terceiras posições deveu-se às transições do tipo T↔C, muito mais freqüentes que as do tipo A↔G.
Figura 1: Relações entre as transições (s) e transversões (v) e as distâncias par-a-par de Jukes e Cantor (1969) para cada posição do códon em nossos dados. As linhas de tendência foram construídas por regressão linear e apresentam seus respectivos R- quadrados. 48
Análises filogenéticas
Em nossas análises de máxima verossimilhança, o modelo mais adequado aos nossos dados foi o HKY+G para as três posições do códon. O modelo HKY
(HASEGAWA et al., 1985) assume freqüências distintas para cada base e duas taxas de substituições distintas, uma para as transversões e outra para as transições; a ele adicionou-se o pressuposto de que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama. Cada posição teve seus parâmetros de freqüências de bases, taxas de substituição e alfa otimizados independentemente. Nas análises bayesianas o modelo mais adequado foi o GTR+I+G para as três posições do códon. O modelo GTR (General Time
Reversible), ou Modelo Geral Reversível, (TAVARÉ, 1986), assume freqüências distintas para cada base e taxas distintas para cada tipo de substituição; a ele adicionou-se o pressuposto de que há uma proporção de sítios invariáveis e que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama. Os valores de suporte para os principais nós de Proechimys estão resumidos na Tabela 4. O filograma da árvore de máxima verossimilhança (lnL = -15545,24) e a árvore-consenso de bootstrap são apresentados na Figura 2.
Tabela 4: Suportes dos principais nós obtidos nas reconstruções filogenéticas feitas com base no gene mitocondrial do citocromo b.
Suportes
Clados LR-ELW BP BPP
(Proechimys, Myocastor) 89 57 94 49
Proechimys 93 93 100
(P. kulinae, P. gardneri) 89 86 100
P. kulinae 64 69 79
((P. ech., P. rob.), (gr. goe., gr.guy., P. sim., gr. lon., P. cuv.)) 55 * 41
(P. echinothrix., P. roberti) 65 * 81
P. roberti ((sudoeste, (leste, norte)) 98 100 100
P. roberti (sudoeste) 100 100 100
P. roberti (leste, norte) 80 89 100
P. roberti (leste) 95 98 100
P. roberti (norte) 92 100 100
(gr. goe., gr.guy., P. sim., gr. lon., P. cuv.) 63 * 44 grupo goeldii (P. goe., P. sp., P. ste., P. qua.,P. amp.) 73 * 93
P.sp. gr. goeldii 100 100 100
(P. goe., P. ste., P. qua.,P. amp.) 49 * *
(P. goe., P. sp.) * * 35
(P. steerei, (P. quadruplicatus,P. amphichoricus)) 71 62 84
P.steerei 91 93 100
(P. quadruplicatus, P. amphichoricus) 100 100 100
P. simonsi 100 100 100 grupo guyannensis (P. cherriei, P. arabupu, P. guyannensis) 100 97 100
(P. arabupu, P. guyannensis) 75 93 97
P. guyannensis 98 100 100
(gr. longicaudatus, P. cuvieri) 87 81 100 grupo longicaudatus (P. bre., P. lon., P. sp.) 48 * 53
P. brevicauda 100 100 100
(P. longicaudatus, P. sp.) 79 56 97
P. longicaudatus 100 100 100
P. sp. gr. longicaudatus 99 99 100
P. cuvieri (norte, sul) 87 78 100
P. cuvieri (norte) 100 100 100
P. cuvieri (sul) 100 100 100
Os suportes dos ramos na máxima verossimilhança foram calculados pelo método de pesos de verossimilhança esperada em rearranjos locais (LR-ELW) e por bootstrap (BP) com mil pseudo- réplicas. As porcentagens de BP foram obtidas de árvores de consenso pela regra da maioria (50%). A partir das análises bayesianas foram estimadas as probabilidades posteriores bayesianas (BPP). *: indica que o nó não foi recuperado na respectiva análise. 50
51
Figura 2: Filograma de máxima verossimilhança (esquerda) e árvore-consenso de bootstrap com mil pseudoréplicas (direita). Valores de suporte estão representados nos ramos.
Taxas de evolução e datação molecular
O teste da razão de verossimilhança, comparando os escores de verossimilhança de reconstruções sem restrições e com o relógio estrito, não foi significativo ao nível de alfa 0,01 (lnL = -16027,61696 com relógio forçado contra lnL = -15980,90571 com relógio relaxado; razão de verossimilhança = 93,423828 com 74 graus de liberdade; P = 0,063158), sugerindo que não há variação significativa nas taxas de substituição entre os ramos, ou seja, a hipótese de um relógio molecular global foi aceita para esses dados.
A distribuição posterior do desvio padrão do relógio relaxado usando taxas não-correlacionadas com distribuição log-normal aproximou-se de zero na análise bayesiana, indicando que o modelo de relógio estrito é adequado a esses dados.
As estimativas de tempos de divergência, calculadas usando métodos não- bayesianos adotando um relógio global (GRMD) ou suavização de taxas (NPRS-
LOG), são apresentadas na Tabela 5 e em dois cronogramas na Figura 3. As datações estimadas por métodos bayesianos são apresentadas na Tabela 6 e em dois cronogramas na Figura 4.
Tabela 5. Estimativas das médias dos tempos de divergência, e seus respectivos limites de confiança de 95%, dados pelas análises não-bayesianas das seqüências de citocromo b. 52
GRMD NPRS-LOG Época
Clados Média 95% LC Média 95% LC geológica
(Proechimys, Myocastor) 13,5 8,2-18,0 13,6 7,8-17,7 Mio. Méd. (L/ S)
Proechimys 8,5 6,3-11,1 8,5 6,2-12,1 Mio. Sup. (T)
(P. kulinae, P. gardneri) 5,4 3,5-8,5 5,7 3,1-9,2 Mio./ Pli.
P. kulinae 4,4 2,6-7,7 4,7 2,3-8,1 Pli. Inf.
((P. ech., P. rob.), (gr. goe., gr.guy., P. 7,9 5,6-10,4 7,8 5,5-10,8 Mio. Sup. (T/ M) sim., gr. lon., P. cuv.))
(P. echinothrix., P. roberti) 6,8 4,4-9,5 6,7 4,5-9,7 Mio./ Pli.
P. roberti ((sudoeste, (leste, norte)) 2,7 1,7-3,9 3,1 1,3-5,1 Pli./ Ple.
P. roberti (sudoeste) 0,121 0,034-0,293 0,085 0,010-0,302 Ple. Sup.
P. roberti (leste, norte) 1,4 0,7-2,4 1,7 0,5-3,2 Ple. Inf. (G/ C)
P. roberti (leste) 0,100 0,016-0,251 0,142 0,002-0,472 Ple. Sup.
P. roberti (norte) 0,129 0,011-0,323 0,210 0,010-0,791 Ple. Sup.
(gr. goe., (gr.guy., P. sim., gr. lon., P. 7,3 5,4-9,7 7,2 5,1-9,9 Mio. Sup. (T/ M) cuv.))
(gr.guy., (P. sim., gr. lon., P. cuv.)) 7,1 5,3-9,4 7,0 4,8-9,7 Mio. Sup. (T/ M)
(P. sim., (gr. lon., P. cuv.)) 6,7 4,7-9,0 6,6 4,2-9,4 Mio. Sup. (M) grupo goeldii (P. sp., (P. goe., P. ste., 6,3 4,3-8,3 6,1 3,9-8,8 Mio. Sup. (M)
P. qua.,P. amp.))
P.sp. gr. goeldii 0,234 0,056-0,462 0,305 0,079-0,672 Ple. Méd./ Sup.
(P. goe., (P. ste., P. qua.,P. amp.)) 5,8 4,0-8,0 5,6 3,8-8,1 Mio. Sup. (M)
(P. ste., (P. qua.,P. amp.)) 4,4 3,1-5,8 4,3 2,6-6,4 Pli. Inf.
P.steerei 2,7 1,6-4,1 2,8 1,4-4,5 Pli./ Ple.
(P. quadruplicatus, P. amphichoricus) 1,0 0,3-1,6 0,8 0,2-1,4 Ple. Inf./ Méd.
(P. sim., (gr. lon., P. cuv.)) 6,7 4,7-9,0 6,6 4,2-9,4 Mio. Sup. (M)
P. simonsi 0,361 0,052-0,842 0,237 0,031-0,548 Ple. Méd./ Sup. grupo guyannensis (P. che. (P. ara., P. 2,1 1,4-2,9 2,3 1,3-3,7 Pli./ Ple. guy.)
(P. arabupu, P. guyannensis) 1,4 0,9-2,1 1,5 0,7-2,5 Ple. Inf. (G/ C)
P. guyannensis 0,149 0,028-0,393 0,179 0,037-0,570 Ple. Méd./ Sup.
(gr. longicaudatus, P. cuvieri) 5,2 3,5-7,3 5,0 3,4-7,9 Mio./ Pli. grupo longicaudatus (P. bre., P. lon., P. 4,8 3,4-6,5 4,5 2,9-7,0 Pli. Inf. sp.)
P. brevicauda 1,3 0,8-1,8 1,1 0,5-2,0 Ple. Inf. (C)
(P. longicaudatus, P. sp.) 3,8 2,5-5,2 3,5 2,2-5,3 Pli. Inf./ Sup. 53
P. longicaudatus 0,4 0,1-0,7 0,4 0,1-0,8 Ple. Méd./ Sup.
P. sp. gr. longicaudatus 1,5 0,9-2,0 1,2 0,7-2,0 Ple. Inf. (G/ C)
P. cuvieri (norte, sul) 3,8 2,5-5,4 3,5 2,0-5,7 Pli. Inf./ Sup.
P. cuvieri (norte) 1,0 0,3-1,6 0,9 0,3-1,7 Ple. Inf./ Méd.
P. cuvieri (sul) 0,324 0,049-0,642 0,316 0,034-0,816 Ple. Méd. / Sup.
As estimativas de tempo são dadas em milhões de anos. GRMD: método de deformação mínima da taxa global. NPRS-LOG: método de suavização não-paramétrica das taxas, comparadas em escala logarítmica. LC: limites de confiança. As épocas geológicas correspondem à Escala de Tempo
Geológico de 2009 da Sociedade Geológica Americana. Mio.: Mioceno; Pli.: Plioceno; Ple.:
Pleistoceno; Inf.: Inferior; Méd.: Médio; Sup.: Superior. Subdivisões: (L) Langhiense e (S)
Serravalliense (Mioceno Médio); (T) Tortoniense e (M) Messiniense (Mioceno Superior); (G)
Gelasiense e (C) Calabriense (Pleistoceno Inferior). 54
Figura 3: Cronogramas com datações obtidas por métodos não-bayesianos: GRMD
(esquerda) e NPRS-LOG (direita). Números à esquerda correspondem às médias das idades (em milhões de anos) estimadas para os ramos e números entre colchetes correspondem aos limites de confiança de 95%. 55
Tabela 6. Estimativas das médias dos tempos de divergência, e seus respectivos intervalos de 95% de HPD, dados pelas análises bayesianas das seqüências de citocromo b.
CLOC UCLN Época
Clados Média 95% HPD Média 95% HPD geológica
(Proechimys, Myocastor) 17,4 14,4-20,4 16,5 13,2-19,6 Mio. Inf. (B)
Proechimys 10,6 8,8-12,5 10,8 8,9-12,7 Mio. Méd./ Sup.
(P. kulinae, P. gardneri) 6,0 4,5-7,6 6,3 4,5-8,3 Mio. Sup. (M)
P. kulinae 5,0 3,7-6,5 5,1 3,4-6,9 Mio./ Pli.
((P. ech., P. rob.), (P. sim., gr.guy., gr. 9,8 - 10,1 8,4-11,8 Mio. Sup. (T) goe., gr. lon., P. cuv.))
(P. echinothrix., P. roberti) 8,0 6,1-10,0 8,2 6,2-10,6 Mio. Sup. (T/ M)
P. roberti ((sudoeste, (leste, norte)) 3,9 2,8-5,0 3,9 2,6-5,4 Pli. Inf./ Sup.
P. roberti (sudoeste) 0,3 0,1-0,5 0,292 0,1-0,5 Ple. Méd./ Sup.
P. roberti (leste, norte) 1,8 1,1-2,4 1,8- 1,0-2,7 Ple. Inf. (G/ C)
P. roberti (leste) 0,3 0,1-0,5 0,264 0,1-0,5 Ple. Méd./ Sup.
P. roberti (norte) 0,3 0,1-0,5 0,267 0,1-0,5 Ple. Méd./ Sup.
(P. sim., (gr.guy., gr. goe., gr. lon., P. 9,3 - * * Mio. Sup. (T) cuv.))
((gr.guy., gr. goe.), (gr. lon., P. cuv.)) 9,0 - * * Mio. Sup. (T)
(gr. guyannensis, gr. goeldii) 8,5 - * * Mio. Sup. (T)
((P. sim., gr.guy., gr. goe.), (gr. lon., P. * * 9,5 8,0-11,2 Mio. Sup. (T) cuv.))
((P. sim., gr.guy.), gr. goe.) * * 9,1 - Mio. Sup. (T)
(P. simonsi, gr. guyannensis) * * 8,2 - Mio. Sup. (T)
P. simonsi 0,6 0,3-1,0 0,7 0,3-1,0 Ple. Inf./ Méd. grupo guyannensis (P. che. (P. ara., 2,7 1,9-3,5 2,8 1,8-3,9 Pli./ Ple.
P. guy.)
(P. arabupu, P. guyannensis) 1,9 1,2-2,5 1,9 1,1-2,7 Ple. Inf. (G/ C)
P. guyannensis 0,4 0,1-0,6 0,4 0,1-0,7 Ple. Méd. grupo goeldii ((P. goe., P. sp.), (P. 7,2 5,8-8,7 * * Mio. Sup. (T/ M) ste., P. qua.,P. amp.))
(P. goe., P. sp.) 6,2 - * * Mio. Sup. (M) grupo goeldii ((P. sp., (P. goe., P. ste., * * 7,5 5,8-9,2 Mio. Sup. (T/ M)
P. qua.,P. amp.)) 56
(P. goe., (P. ste., P. qua.,P. amp.)) * * 6,9 - Mio. Sup. (M)
P.sp. gr. goeldii 0,5 0,2-0,7 0,5 0,2-0,8 Ple. Méd.
(P. ste., (P. qua.,P. amp.)) 5,6 4,3-6,9 5,6 4,0-7,1 Mio./ Pli.
P.steerei 2,9 2,0-4,0 3,1 1,9-4,4 Pli. Sup.
(P. quadruplicatus, P. amphichoricus) 1,4 0,9-2,0 1,4 0,8-2,1 Ple. Inf. (C)
(gr. longicaudatus, P. cuvieri) 7,1 5,7-8,4 7,1 5,7-8,7 Mio. Sup. (T/ M) grupo longicaudatus (P. bre., P. lon., 6,5 5,3-7,8 6,5 5,0-7,9
P. sp.) Mio. Sup. (M)
P. brevicauda 1,7 1,1-2,4 1,7 0,9-2,6 Ple. Inf. (G/ C)
(P. longicaudatus, P. sp.) 5,4 4,1-6,6 5,4 4,0-6,8 Mio./ Pli.
P. longicaudatus 0,7 0,4-1,1 0,7 0,4-1,1 Ple. Inf./ Méd.
P. sp. gr. longicaudatus 2,0 1,5-2,6 2,1 1,4-2,8 Ple. Inf. (G)
P. cuvieri (norte, sul) 4,9 3,7-6,2 4,9 3,5-6,5 Mio./ Pli.
P. cuvieri (norte) 1,4 0,8-1,9 1,4 0,8-2,1 Ple. Inf. (C)
P. cuvieri (sul) 0,5 0,2-0,9 0,5 0,2-0,9 Ple. Méd.
As estimativas de tempo são dadas em milhões de anos. CLOC: taxas conforme um relógio molecular.
UCLN: taxas não-correlacionadas, independentemente extraídas de uma distribuição log-normal. HPD: densidades posteriores mais altas (highest posterior densities). As épocas geológicas correspondem à
Escala de Tempo Geológico de 2009 da Sociedade Geológica Americana. * indica que o nó não foi recuperado na respectiva análise. Mio.: Mioceno; Pli.: Plioceno; Ple.: Pleistoceno; Inf.: Inferior; Méd.:
Médio; Sup.: Superior. Subdivisões: (B) Burdigaliense (Mioceno Inferior); (T) Tortoniense e (M)
Messiniense (Mioceno Superior); (G) Gelasiense e (C) Calabriense (Pleistoceno Inferior).
57
Figura 4: Cronogramas com datações obtidas por análises bayesianas utilizando relógio estrito (esquerda) e relógio relaxado com taxas não-correlacionadas extraídas de uma distribuição log-normal (direita). Os tempos de divergência correspondem às 58 médias posteriores em milhões de anos e estão apresentados nos ramos. As barras azuis correspondem aos intervalos de 95% das densidades posteriores mais altas.
Thrichomys
Composição de bases e variação das seqüências
A matriz resultante apresentou 65 táxons e 801 caracteres, sendo destes: 371 constantes, 48 variáveis não-informativos para parcimônia e 382 informativos. O sinal filogenético foi significativo conforme indicado pelo teste G1 (média =
5690,212662; desvio-padrão = 108,268102; g1 = -0,271899; g2 = 0,081718). A razão de substituições entre as posições do códon foi de 4:1:15, contrastando com a razão observada por Lara et al. (1996), 2:1:15 para o mesmo gene.
As freqüências de G variaram muito entre as posições: 22,1% na primeira,
13,0% na segunda e 3,4% na terceira. As bases mais freqüentes na terceira posição do códon foram A (38,6%) e C (35,9%), seguidas de T (22,1%), enquanto na segunda posição a base mais freqüente foi T (38,5%), e na primeira, A (29,0%). Essas freqüências contrastam com as freqüências médias dessas bases (A = 29,7%; C =
28,3%; T = 29,2% e G = 12,8%) e refletem uma forte tendência para o uso preferencial de códons terminando com A, depois com C, T e, em menor número, G.
A composição de bases do gene do citocromo b de Thrichomys não diferiu dos padrões encontrados para este gene em mamíferos em geral (IRWIN et al., 1991; MA et al., 1993) e equimiídeos em particular (LARA et al., 1996).
As transições do tipo T↔C na terceira posição foram as substituições mais comuns, totalizando 49; as próximas substituições mais comuns foram transversões do tipo C↔A e do tipo T↔A na terceira posição e transições do tipo T↔C na 59 primeira posição e A↔G na terceira posição, perfazendo 24, 18, 13 e 10 substituições, respectivamente. No total das três posições, as transições do tipo A↔G ocorreram com uma freqüência bem menor que T↔C (18 contra 67 substituições), possivelmente devido às baixas freqüências de G tipicamente encontradas no DNA mitocondrial. As transversões também apresentaram a mesma tendência, com C↔A e
T↔A representando respectivamente 29 e 22 substituições, contra C↔G e T↔G representando 3 substituições cada.
Os dados das curvas de saturação foram consistentes com aqueles esperados para seqüências codificadoras e já descritos para o citocromo b de Echimyidae por
Lara et al. (1996) e de Rodentia por Montgelard et al. (2002). Observou-se uma forte saturação para as transições nas terceiras posições, mas as transições nas primeiras e segundas posições e transversões em todas as posições estavam fracamente saturadas
(Figura 5). A saturação observada nas terceiras posições deveu-se às transições do tipo T↔C, muito mais freqüentes que as do tipo A↔G.
Figura 5: Relações entre as transições (s) e transversões (v) e as distâncias par-a-par de Jukes e Cantor (1969) para cada posição do códon em nossos dados. As linhas de tendência foram construídas por regressão linear e apresentam seus respectivos R- quadrados. 60
Análises filogenéticas
Em nossas análises de máxima verossimilhança, os modelos mais adequados aos nossos dados foram o J2+G para a primeira posição e o HKY+G para a segunda e terceira posições do códon. O modelo J2 assume freqüências distintas para cada base e quatro taxas de substituições distintas, uma para cada transição, uma para as transversões T↔A e C↔A outra para as transversões T↔G e C↔G; a ele adicionou- se o pressuposto de que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama. O modelo HKY
(HASEGAWA et al., 1985) assume freqüências distintas para cada base e duas taxas de substituições distintas, uma para as transversões e outra para as transições; a ele adicionou-se o pressuposto de que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama. Cada posição teve seus parâmetros de freqüências de bases, taxas de substituição e alfa otimizados independentemente. Nas análises bayesianas o modelo mais adequado foi o GTR+I+G para as três posições do códon. O modelo GTR (General Time
Reversible), ou Modelo Geral Reversível, (TAVARÉ, 1986), assume freqüências distintas para cada base e uma taxas distintas para cada tipo de substituição; a ele adicionou-se o pressuposto de que há uma proporção de sítios invariáveis e que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama. Os valores de suporte para os principais nós de Thrichomys estão resumidos na Tabela 7. O filograma da árvore de máxima verossimilhança (lnL = -12702,49) e a árvore-consenso de bootstrap são apresentados na Figura 6. 61
Tabela 7: Suportes dos principais nós obtidos nas reconstruções filogenétiicas feitas com base no gene mitocondrial do citocromo b.
Suportes
Clados LR-ELW BP BPP
(Thrichomys, Trinomys) 44 * 52
Thrichomys 100 100 100
(T. inermis, T. sp. n.) 40 * 44
T. sp. n. 100 100 100
T. inermis 92 63 100
T. inermis (norte) 100 100 100
T. inermis (sul) 99 98 100
(T.fosteri, T.pachyurus, T. apereoides) 75 73 100
T.fosteri 100 100 100
(T.pachyurus, T. apereoides) 80 58 95
T.pachyurus (MT, GO, TO) 100 100 100
T.pachyurus (GO, TO) 33 * 44
T.pachyurus (GO) 99 100 100
T.pachyurus (TO) 67 53 94
T. apereoides (BA, MG, NE) 93 77 100
T. apereoides (BA, MG) * * 62
T. apereoides (MG, NE) 41 * *
T. apereoides BA (SO/BA, SE/BA) 94 82 100
T. apereoides (SO/BA) 100 100 100
T. apereoides (SE/BA) 96 99 100
T. apereoides MG (S/MG, N/MG) 90 81 100
T. apereoides (N/MG) 91 97 100
T. apereoides NE ((AL, PB), (PI, MA)) 97 91 100
T. apereoides (AL, PB) 79 89 100
T. apereoides (AL) 88 100 100
T. apereoides (PI, MA) 100 100 100
Os suportes dos ramos na máxima verossimilhança foram calculados pelo método de pesos de verossimilhança esperada em rearranjos locais (LR-ELW) e por bootstrap (BP) com mil pseudo- réplicas. As porcentagens de BP foram obtidas de árvores de consenso pela regra da maioria (50%). A 62 partir das análises bayesianas foram estimadas as probabilidades posteriores bayesianas (BPP). *: indica que o nó não foi recuperado na respectiva análise.
63
Figura 6: Filograma de máxima verossimilhança (esquerda) e árvore-consenso de bootstrap com mil pseudoréplicas (direita). Valores de suporte estão representados nos ramos.
Taxas de evolução e datação molecular
O teste da razão de verossimilhança, comparando os escores de verossimilhança de reconstruções sem restrições e com o relógio estrito, foi significativo ao nível de alfa 0,01 (lnL = -13171,83527 com relógio forçado contra lnL = -13125,35987 com relógio relaxado; razão de verossimilhança = 92,949219 com 63 graus de liberdade; P = 0,008394), sugerindo que há uma variação importante nas taxas de evolução molecular entre os ramos, rejeitando portanto a hipótese de um relógio molecular global para esses dados.
A distribuição posterior do desvio padrão do relógio relaxado usando taxas não-correlacionadas com distribuição log-normal aproximou-se de zero na análise bayesiana, indicando que o modelo de relógio estrito é adequado a esses dados.
As estimativas de tempos de divergência, calculadas usando métodos não- bayesianos adotando um relógio global (GRMD) ou suavização de taxas (NPRS-
LOG), são apresentadas na Tabela 8 e em dois cronogramas na Figura 7. As datações estimadas por métodos bayesianos são apresentadas na Tabela 9 e em dois cronogramas na Figura 8.
Tabela 8. Estimativas das médias dos tempos de divergência, e seus respectivos limites de confiança de 95%, dados pelas análises não-bayesianas das seqüências de citocromo b. 64
GRMD NPRS-LOG Época
Clados Média 95% LC Média 95% LC geológica
(Thrichomys, Trinomys) 15,6 10,5-19,3 15,4 11,2-19,1 Mio. Méd. (L)
Thrichomys 3,6 2,5-5,2 3,8 2,3-7,4 Pli. Inf./ Sup.
(T. inermis, T. sp. n.) 3,4 2,4-4,7 3,6 2,1-6,6 Pli. Inf./ Sup.
T. sp. n. 0,124 0,035-0,372 0,194 0,004-0,744 Ple. Méd./ Sup.
T. inermis 2,1 1,4-3,0 2,2 1,2-5,2 Ple. Inf. (G)
T. inermis (norte) 0,260 0,038-0,550 0,207 0,034-0,528 Ple. Méd./ Sup.
T. inermis (sul) 0,260 0,046-0,654 0,337 0,041-1,190 Ple. Méd.
(T.fosteri, T.pachyurus, T. apereoides) 2,9 1,9-4,1 3,1 1,7-5,7 Pli. Sup.
T.fosteri 0,4 0,1-0,7 0,5 0,1-1,0 Ple. Méd.
(T.pachyurus, T. apereoides) 2,1 1,4-3,1 2,2 1,2-3,7 Ple. Inf. (G)
T.pachyurus (MT, GO, TO) 0,7 0,4-1,1 0,7 0,3-1,2 Ple. Inf./ Méd.
T.pachyurus (GO, TO) 0,7 0,4-1,1 0,7 0,3-1,2 Ple. Inf./ Méd.
T.pachyurus (GO) 0,218 0,037-0,410 0,195 0,03-0,476 Ple. Méd./ Sup.
T.pachyurus (TO) 0,6 0,4-1,0 0,6 0,3-1,1 Ple. Inf./ Méd.
T. apereoides (BA, (MG, NE)) 1,2 0,9-1,7 1,3 0,6-2,3 Ple. Inf. (C)
T. apereoides (MG, NE) 1,2 9,8-1,6 1,3 0,6-2,2 Ple. Inf. (C)
T. apereoides BA (SO/BA, SE/BA) 0,9 0,4-1,4 0,9 0,5-1,6 Ple. Inf./ Méd.
T. apereoides (SO/BA) 0,006 0,005-0,007 0,007 0,003-0,016 Hol.
T. apereoides (SE/BA) 0,177 0,032-0,448 0,236 0,040,645 Ple. Méd./ Sup.
T. apereoides MG (S/MG, N/MG) 0,6 0,1-1,2 0,7 0,2-1,4 Ple. Inf./ Méd.
T. apereoides (N/MG) 0,034 0,005-0,060 0,085 0,010-0,290 Ple. Sup.
T. apereoides NE ((AL, PB), (PI, MA)) 0,6 0,4-1,0 0,7 0,2-1,4 Ple. Inf./ Méd.
T. apereoides (AL, PB) 0,4 0,1-0,6 0,4 0,1-1,1 Ple. Méd.
T. apereoides (AL) 0,052 0,023-0,102 0,091 0,022-0,280 Ple. Sup.
T. apereoides (PI, MA) 0,070 0,035-0,166 0,128 0,0120,350 Ple. Sup.
As estimativas de tempo são dadas em milhões de anos. GRMD: método de deformação mínima da taxa global. NPRS-LOG: método de suavização não-paramétrica das taxas, comparadas em escala logarítmica. LC: limites de confiança. As épocas geológicas correspondem à Escala de Tempo
Geológico de 2009 da Sociedade Geológica Americana. Mio.: Mioceno; Pli.: Plioceno; Ple.:
Pleistoceno; Hol.: Holoceno; Inf.: Inferior; Méd.: Médio; Sup.: Superior. Subdivisões: (L) Langhiense
(Mioceno Médio); (G) Gelasiense e (C) Calabriense (Pleistoceno Inferior).
65
Figura 7: Cronogramas com datações obtidas por métodos não-bayesianos: GRMD
(esquerda) e NPRS-LOG (direita). Números à esquerda correspondem às médias das idades (em milhões de anos) estimadas para os ramos e números entre colchetes correspondem aos limites de confiança de 95%.
66
Tabela 9. Estimativas das médias dos tempos de divergência, e seus respectivos intervalos de 95% de HPD, dados pelas análises bayesianas das seqüências de citocromo b.
CLOC UCLN Época
Clados Média 95% HPD Média 95% HPD geológica
(Thrichomys, Trinomys) 19,0 15,9-21,9 17,4 14,2-20,9 Mio. Inf. (B)
Thrichomys 4,9 3,9-6,0 5,1 3,8-6,5 Mio./ Pli.
(T. inermis, T. sp. n.) 4,5 - 4,5 - Pli. Inf.
T. sp. n. 0,6 0,3-0,9 0,6 0,3-1,0 Ple. Inf./ Méd.
T. inermis 2,8 2,0-3,7 2,9 1,8-4,1 Pli./ Ple.
T. inermis (norte) 0,4 0,1-0,7 0,4 0,1-0,7 Ple. Méd.
T. inermis (sul) 0,4 0,2-0,7 0,4 0,1-0,8 Ple. Méd.
(T.fosteri, T.pachyurus, T. apereoides) 3,7 2,9-4,6 3,7 2,7-4,9 Pli. Inf./ Sup.
T.fosteri 0,6 0,3-1,0 0,6 0,2-1,1 Ple. Inf./ Méd.
(T.pachyurus, T. apereoides) 2,9 2,2-3,7 2,9 2,1-3,9 Pli. Sup.
T.pachyurus (MT, GO, TO) 1,0 0,7-1,3 1,0 0,6-1,4 Ple. Inf. (C)
T.pachyurus (GO, TO) 0,9 - 0,9 - Ple. Inf. (C)
T.pachyurus (GO) 0,4 0,2-0,6 0,4 0,1-0,7 Ple. Méd.
T.pachyurus (TO) 0,7 0,4-1,0 0,7 0,4-1,1 Ple. Inf./ Méd.
T. apereoides ((BA, MG), NE) 1,8 1,3-2,3 1,8 1,2-2,4 Ple. Inf. (G/ C)
T. apereoides (BA, MG) 1,5 1,1-2,0 1,5 1,0-2,1 Ple. Inf. (G/ C)
T. apereoides BA (SO/BA, SE/BA) 1,1 0,7-1,5 1,1 0,6-1,6 Ple. Inf. (C)
T. apereoides (SO/BA) 0,044 1E-5-0,131 0,044 2E-5-0,133 Ple./ Hol.
T. apereoides (SE/BA) 0,4 0,2-0,6 0,4 0,1-0,7 Ple. Méd.
T. apereoides MG (S/MG, N/MG) 0,8 0,4-1,2 0,8 0,4-1,2 Ple. Inf./ Méd.
T. apereoides (N/MG) 0,206 0,033-0,404 0,208 0,032-0,429 Ple. Méd./ Sup.
T. apereoides NE ((AL, PB), (PI, MA)) 1,1 0,7-1,5 1,1 0,7-1,5 Ple. Inf. (C)
T. apereoides (AL, PB) 0,7 0,4-1,0 0,7 0,4-1,0 Ple. Inf./ Méd.
T. apereoides (AL) 0,3 0,1-0,5 0,3 0,1-0,6 Ple. Méd.
T. apereoides (PI, MA) 0,3 0,1-0,5 0,3 0,1-0,5 Ple. Méd.
As estimativas de tempo são dadas em milhões de anos. CLOC: taxas conforme um relógio molecular.
UCLN: taxas não-correlacionadas, independentemente extraídas de uma distribuição lognormal. HPD: densidades posteriores mais altas (highest posterior densities). As épocas geológicas correspondem à
Escala de Tempo Geológico de 2009 da Sociedade Geológica Americana. Mio.: Mioceno; Pli.: 67
Plioceno; Ple.: Pleistoceno; Inf.: Inferior; Méd.: Médio; Sup.: Superior. Subdivisões: (B) Burdigaliense
(Mioceno Inferior); (G) Gelasiense e (C) Calabriense (Pleistoceno Inferior).
68
Figura 8: Cronogramas com datações obtidas por análises bayesianas utilizando relógio estrito (esquerda) e relógio relaxado com taxas não-correlacionadas extraídas de uma distribuição log-normal (direita). Os tempos de divergência correspondem às médias posteriores em milhões de anos e estão apresentados nos ramos. As barras azuis correspondem aos intervalos de 95% das densidades posteriores mais altas.
Trinomys
Composição de bases e variação das seqüências
A matriz resultante apresentou 55 táxons e 801 caracteres, sendo destes: 371 constantes, 44 variáveis não-informativos para parcimônia e 386 informativos. O sinal filogenético foi significativo conforme indicado pelo teste G1 (média =
5408,010230; desvio-padrão = 64,900376; g1 = -0,500921; g2 = 0,416013). A razão de substituições entre as posições do códon foi de 4:1:13, contrastando com a razão observada por Lara et al. (1996), 2:1:15 para este gene.
As freqüências de G variaram muito entre as posições: 20,2% na primeira,
13,1% na segunda e 3,6% na terceira. As bases mais freqüentes na terceira posição do códon foram A (39,1%) e C (34,3%), seguidas de T (23,0%), enquanto na segunda posição a base mais freqüente foi T (39,0%), e na primeira, A (29,5%). Essas freqüências contrastam com as freqüências médias dessas bases (A = 30,0%; C =
27,4%; T = 29,7% e G = 12,9%) e refletem uma forte tendência para o uso preferencial de códons terminando com A, depois com C, T e, em menor número, G.
A composição de bases do gene do citocromo b em nossa matriz não diferiu dos padrões encontrados para este gene em mamíferos em geral (IRWIN et al., 1991; MA et al., 1993) e equimiídeos em particular (LARA et al., 1996). 69
As transições do tipo T↔C na terceira posição foram as substituições mais comuns, totalizando 53; as próximas substituições mais comuns foram transversões do tipo C↔A e do tipo T↔A na terceira posição e transições do tipo T↔C na primeira posição e A↔G na terceira posição, perfazendo 25, 21, 13 e 11 substituições, respectivamente. No total das três posições, as transições do tipo A↔G ocorreram com uma freqüência bem menor que T↔C (18 contra 73 substituições), possivelmente devido às baixas freqüências de G tipicamente encontradas no DNA mitocondrial. As transversões também apresentaram a mesma tendência, com C↔A e
T↔A representando respectivamente 30 e 26 substituições, contra C↔G e T↔G representando 4 e 3 substituições, respectivamente.
Os dados das curvas de saturação foram consistentes com aqueles esperados para seqüências codificadoras e já descritos para o citocromo b de Echimyidae por
Lara et al. (1996) e de Rodentia por Montgelard et al. (2002). Observou-se uma forte saturação para as transições nas terceiras posições, mas as transições nas primeiras e segundas posições e transversões em todas as posições estavam fracamente saturadas
(Figura 9). A saturação observada nas terceiras posições deveu-se às transições do tipo T↔C, muito mais freqüentes que as do tipo A↔G.
Figura 9: Relações entre as transições (s) e transversões (v) e as distâncias par-a-par de Jukes e Cantor (1969) para cada posição do códon em nossos dados. As linhas de 70 tendência foram construídas por regressão linear e apresentam seus respectivos R- quadrados.
Análises filogenéticas
Em nossas análises de máxima verossimilhança, os modelos mais adequados aos nossos dados foram o J2+G para a primeira posição e o J1+G para a segunda e terceira posições do códon. O modelo J2 assume freqüências distintas para cada base e quatro taxas de substituições distintas, uma para cada transição, uma para as transversões T↔A e C↔A outra para as transversões T↔G e C↔G; a ele adicionou- se o pressuposto de que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama. O modelo J1 assume freqüências distintas para cada base e quatro taxas de substituições distintas, uma para cada transição, uma para as transversões T↔A e T↔G outra para as transversões C↔A e C↔G; a ele adicionou-se o pressuposto de que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama. Cada posição teve seus parâmetros de freqüências de bases, taxas de substituição e alfa otimizados independentemente. Nas análises bayesianas o modelo mais adequado foi o GTR+I+G para as três posições do códon. O modelo GTR (General Time Reversible), ou Modelo Geral Reversível,
(TAVARÉ, 1986), assume freqüências distintas para cada base e uma taxas distintas para cada tipo de substituição; a ele adicionou-se o pressuposto de que há uma proporção de sítios invariáveis e que há heterogeneidade nas taxas de substituição entre os sítios, sendo que os valores dessas taxas apresentam uma distribuição gama.
Os valores de suporte para os principais nós de Trinomys estão resumidos na Tabela 71
10. O filograma da árvore de máxima verossimilhança (lnL = -13622,01) e a árvore- consenso de bootstrap são apresentados na Figura 10.
Tabela 10: Suportes dos principais nós obtidos nas reconstruções filogenéticas feitas com base no gene mitocondrial do citocromo b.
Suportes
Clados LR-ELW BP BPP
(Trinomys, Thrichomys) 47 * 46
Trinomys 93 53 100
(T. alb., (T. gra., (T. mir., (T. ihe., T. dim.)))) 44 * 43
Clado 1: (T. gra., (T. mir., (T. ihe., T. dim.))) 91 93 100
T. gratiosus 96 97 100
(T. mirapitnaga, (T. iheringi, T. dimidiatus)) 89 93 84
(T. iheringi, T. dimidiatus) 84 84 99
T. iheringi 100 100 100
T. dimidiatus 100 100 100
Clado 2: ((T. yon., T. set.), (T. eli., T. par.)) 93 67 100
(T. yonenagae, T. setosus) 40 * 78
T. s. ((setosus, (denigratus, elegans)) 100 96 100
T. s. (denigratus, elegans) 94 96 100
(T. eliasi, T. paratus) 100 100 100
Clado 3: T. albispinus 100 100 100
Os suportes dos ramos na máxima verossimilhança foram calculados pelo método de pesos de verossimilhança esperada em rearranjos locais (LR-ELW) e por bootstrap (BP) com mil pseudo- réplicas. As porcentagens de BP foram obtidas de árvores de consenso pela regra da maioria (50%). A partir das análises bayesianas foram estimadas as probabilidades posteriores bayesianas (BPP). *: indica que o nó não foi recuperado na respectiva análise.
72
Figura 10: Filograma de máxima verossimilhança (esquerda) e árvore-consenso de bootstrap com mil pseudoréplicas (direita). Valores de suporte estão representados nos ramos.
73
Taxas de evolução e datação molecular
O teste da razão de verossimilhança, comparando os escores de verossimilhança de reconstruções sem restrições e com o relógio estrito, foi significativo ao nível de alfa 0,01 (lnL = -14127,70610 com relógio forçado contra lnL = -14071,15414 com relógio relaxado; razão de verossimilhança = 113,103516 com 53 graus de liberdade; P = 0,000003), sugerindo que há uma variação importante nas taxas de evolução molecular entre os ramos, rejeitando portanto a hipótese de um relógio molecular global para esses dados.
A distribuição posterior do desvio padrão do relógio relaxado usando taxas não-correlacionadas com distribuição log-normal não aproximou-se de zero na análise bayesiana, indicando que o modelo de relógio estrito não é adequado a esses dados.
As estimativas de tempos de divergência, calculadas usando métodos não- bayesianos adotando um relógio global (GRMD) ou suavização de taxas (NPRS-
LOG), são apresentadas na Tabela 11 e em dois cronogramas na Figura 11. As datações estimadas por métodos bayesianos são apresentadas na Tabela 12 e em dois cronogramas na Figura 12.
Tabela 11. Estimativas das médias dos tempos de divergência, e seus respectivos limites de confiança de 95%, dados pelas análises não-bayesianas das seqüências de citocromo b.
GRMD NPRS-LOG Época
Clados Média 95% LC Média 95% LC geológica
(Trinomys, Thrichomys) 15,5 12,2-19,1 15,5 11,6-19,0 Mio. Méd. (L)
Trinomys 12,5 9,6-15,0 12,3 7,4-16,0 Mio. Méd. (S) 74
(T. alb., (T. gra., (T. mir., (T. ihe., T. dim.)))) 11,6 8,5-14,5 11,3 6,1-14,8 Mio. Méd./ Sup.
Clado 1: (T. gra., (T. mir., (T. ihe., T. dim.))) 8,7 6,2-11,3 7,5 3,7-11,5 Mio. Sup. (T/ M)
T. gratiosus 1,3 0,6-2,5 1,2 0,1-3,0 Ple. Inf. (C)
(T. mirapitnaga, (T. iheringi, T. dimidiatus)) 6,8 4,8-8,8 5,2 2,0-8,4 Mio. Sup. (M)
(T. iheringi, T. dimidiatus) 5,2 3,7-6,9 3,8 1,4-6,4 Pli. Inf. (C)
T. iheringi 0,310 0,097-0,662 0,158 0,017-0,376 Ple. Méd.
T. dimidiatus 1,5 0,8-2,1 0,7 0,3-1,5 Ple. Inf. (C)
Clado 2: ((T. yon., T. set.), (T. eli., T. par.)) 8,8 4,7-12,8 9,1 4,7-13,7 Mio. Sup. (T)
(T. yonenagae, T. setosus) 7,8 4,7-11,1 8,0 4,7-11,4 Mio. Sup. (T/ M)
T. s. ((setosus, (denigratus, elegans)) 3,3 2,0-4,5 3,1 1,5-5,5 Pli. Sup.
T. s. (denigratus, elegans) 1,5 1,0-2,1 1,3 0,6-2,5 Ple. Inf. (C)
(T. eliasi, T. paratus) 2,2 0,6-3,3 1,9 0,4-3,3 Ple. Inf. (G/ C)
Clado 3: T. albispinus 1,5 0,1-3,1 1,2 0,1-2,9 Ple. Inf. (C)
As estimativas de tempo são dadas em milhões de anos. GRMD: método de deformação mínima da taxa global. NPRS-LOG: método de suavização não-paramétrica das taxas, comparadas em escala logarítmica. LC: limites de confiança. As épocas geológicas correspondem à Escala de Tempo
Geológico de 2009 da Sociedade Geológica Americana. Mio.: Mioceno; Pli.: Plioceno; Ple.:
Pleistoceno; Inf.: Inferior; Méd.: Médio; Sup.: Superior. Subdivisões: (L) Langhiense e (S)
Serravalliense (Mioceno Médio); (T) Tortoniense e (M) Messiniense (Mioceno Superior); (G)
Gelasiense e (C) Calabriense (Pleistoceno Inferior).
75
Figura 11: Cronogramas com datações obtidas por métodos não-bayesianos: GRMD
(esquerda) e NPRS-LOG (direita). Números à esquerda correspondem às médias das idades (em milhões de anos) estimadas para os ramos e números entre colchetes correspondem aos limites de confiança de 95%.
Tabela 12. Estimativas das médias dos tempos de divergência, e seus respectivos intervalos de 95% de HPD, dados pelas análises bayesianas das seqüências de citocromo b.
CLOC UCLN Época
Clados Média 95% HPD Média 95% HPD geológica 76
(Trinomys, Thrichomys) 17,6 - 17,2 - Mio. Inf. (B)
Trinomys 14,3 12,0-16,6 14,4 11,5-17,4 Mio. Méd. (L)
(T. alb., (T. gra., (T. mir., (T. ihe., T. dim.)))) 13,2 - 13,2 - Mio. Méd. (S)
Clado 1: (T. gra., (T. mir., (T. ihe., T. dim.))) 9,2 7,4-11,2 9,9 7,2-12,7 Mio. Sup. (T)
T. gratiosus 1,9 1,3-2,6 2,2 1,2-3,2 Ple. Inf. (G)
(T. mirapitnaga, (T. iheringi, T. dimidiatus)) 7,9 6,3-9,6 8,1 5,7-10,7 Mio. Sup. (T/ M)
(T. iheringi, T. dimidiatus) 6,6 5,0-8,3 6,2 4,2-8,4 Mio. Sup. (M)
T. iheringi 0,4 0,2-0,6 0,4 0,2-0,7 Ple. Méd.
T. dimidiatus 1,8 1,2-2,4 1,9 1,1-2,7 Ple. Inf. (G/ C)
Clado 2: ((T. yon., T. set.), (T. eli., T. par.)) 10,1 7,9-12,3 10,1 7,4-13,1 Mio. Méd./ Sup.
(T. yonenagae, T. setosus) 7,9 6,1-10,1 8,6 5,8-11,5 Mio. Sup. (T/ M)
T. s. ((setosus, (denigratus, elegans)) 3,4 2,4-4,5 3,8 2,3-5,5 Pli. Sup.
T. s. (denigratus, elegans) 1,6 1,0-2,3 1,7 0,8-2,7 Ple. Inf. (G/ C)
(T. eliasi, T. paratus) 2,5 1,7-3,3 2,5 1,3-4,0 Pli./ Ple.
Clado 3: T. albispinus 2,5 1,6-3,5 2,6 1,4-4,1 Pli./ Ple.
As estimativas de tempo são dadas em milhões de anos. CLOC: taxas conforme um relógio molecular.
UCLN: taxas não-correlacionadas, independentemente extraídas de uma distribuição lognormal. HPD: densidades posteriores mais altas (highest posterior densities). As épocas geológicas correspondem à
Escala de Tempo Geológico de 2009 da Sociedade Geológica Americana. Mio.: Mioceno; Pli.:
Plioceno; Ple.: Pleistoceno; Inf.: Inferior; Méd.: Médio; Sup.: Superior. Subdivisões: (B) Burdigaliense
(Mioceno Inferior); (L) Langhiense e (S) Serravalliense (Mioceno Médio); (T) Tortoniense e (M)
Messiniense (Mioceno Superior); (G) Gelasiense e (C) Calabriense (Pleistoceno Inferior). 77
78
Figura 12: Cronogramas com datações obtidas por análises bayesianas utilizando relógio estrito (esquerda) e relógio relaxado com taxas não-correlacionadas extraídas de uma distribuição log-normal (direita). Os tempos de divergência correspondem às médias posteriores em milhões de anos e estão apresentados nos ramos. As barras azuis correspondem aos intervalos de 95% das densidades posteriores mais altas. 79
Discussão
Em geral, as datações feitas com máxima verossimilhança apresentaram maior variância que as datações feitas com análise bayesiana, já as estimativas de tempo feitas com análise bayesiana foram em geral mais antigas que aquelas feitas com máxima verossimilhança, porém houve pouca discrepância. Comparando os métodos sob um mesmo tipo de análise, os métodos utilizando relógio relaxado apresentaram maior variância em comparação com métodos utilizando relógio global, este resultado é consistente com as premissas adotadas por cada metodologia. As datações foram em geral similares, geralmente incidindo sobre as mesmas épocas geológicas.
A natureza estocástica dos dados derivados de nosso conjunto de dados usando o método de NPRS pode ser atribuída a inadequações conhecidas desse método em termos de sobreparametrização dos dados (BELL e DONOGHUE, 2005), ou mesmo ao número reduzido de réplicas, 100, usadas no cálculo dos limites de confiança das datações de máxima verossimilhança. Superestimativas e subestimativas com NPRS têm se mostrado particularmente severas quando apenas um único nó superficial, recente, é usado como ponto de calibração. Nesses casos, estimativas de idade da raiz são igualmente passíveis de mover-se para infinito ou de reter valores mais realísticos (SANDERSON et al., 2004). A esse propósito, é encorajador ver uma congruência em geral entre nossas estimativas bayesianas e de
NPRS, particularmente nos nós da raiz.
Com relação a problemas de subamostragem, é improvável que nossas inferências tenham sido amplamente subestimadas (p. ex. na faixa de metade da 80 idade verdadeira), já que incorporamos boa parte das linhagens vivas de histricognatos. Adicionalmente, métodos bayesianos têm se mostrado menos suscetíveis aos efeitos de subamostragem, e obtivemos idades similares ao NPRS usando este método.
Nossas estimativas de tempos de divergência foram também, provavelmente, menos suscetíveis a efeitos combinados de sub-amostragem e distância de calibração, dados nossa ampla amostragem e o uso de múltiplos pontos de calibração com boa proximidade dos nós que estavam sendo estimados.
Outro aspecto relevante é que, quando se estima tempos de especiação com base em genealogias, é preciso ter em conta que, como haplótipos divergem de uma população ancestral comum antes da especiação, as espécies são mais jovens que as idades estimadas para a coalescência de seus haplótipos. Em certos casos, haplótipos de DNA mitocondrial podem diferir por várias centenas de milhares de anos
(EDWARDS, 1997).
De maneira geral houve pouca sobreposição nos eventos de cladogênese quando confrontamos os três gêneros (Figura 13). Como se poderia esperar
Thrichomys exibiu o padrão de diversificação mais diverso, apresentando momentos de maior diversificação durante o Plioceno e da idade Calabriense do Pleistoceno
Inferior ao Pleistoceno Médio.
Proechimys apresentou um padrão quase inverso ao padrão de Thrichomys, apesar de ter tido o padrão mais constante de diversificação entre os três gêneros, destacaram-se o intervalo entre a idade Tortoniense do Mioceno Superior e a transição do Mio-Plioceno, a transição Gelasi-Calabriense do Pleistoceno inferior e a transição do Pleistoceno Médio ao Inferior. 81
O padrão de especiação de Trinomys mostrou-se intermediário aos dos outros gêneros, mas com maior sobreposição com Proechimys, nele os períodos mais significativos foram a idade Tortoniense do Mioceno Superior e a idade Calabriense do Pleistoceno Inferior.
Figura 13: Distrbuição das freqüências de novas linhagens segundo as épocas e idades Geológicas.
Com relação às SALMAS destacamos a importância da idade
Montehermosense para diversificação de Proechimys, da idade Uquiense, para
Trinomye e da idade Lujaniense para Thrichomys (Figura 14).
82
Figura 14: Distrbuição das freqüências de novas linhagens segundo as idades de
Mamíferos Terrestres Sul-americanos (SALMA).
Esses padrões de diversificação, excluindo possíveis vieses amostrais, sugerem que as oscilações climáticas do passado afetaram de maneira diversa cada bioma, produzindo padrões distintos de especiação em suas respectivas biotas.
A seguir detalhamos a cronologia dos eventos de cladogênese para cada gênero.
Proechimys
Como a variância das datações feitas com máxima verossimilhança foi maior e as datações bayesianas geralmente estavam incluídas dentro do intervalo dos limites de confiança das datações de máxima verossimilhança, optou-se por discutir os dados com base nas datações feitas por análise bayesiana, usando o modelo de relógio 83 estrito, uma vez que, a distribuição posterior do desvio padrão do relógio relaxado aproximou-se de zero.
Mioceno Inferior
Os dados indicam que Proechimys divergiu dos outros equimiídeos no
Mioceno Inferior, na transição entre as idades Colhuehuapiense a Santacruciense de
Mamíferos Terrestres Sul-americanos (SALMA).
Mioceno Médio a Superior
O Ancestral comum mais recente das espécies de Proechimys da amostra foi datado no Mioceno Médio. Nesta época, na idade Mayoense (SALMA), o clado formado por P. kulinae e P. gardneri divergiu das outras espécies de Proechimys.
Cabe lembrar que no final do Mioceno Médio, há cerca de 11,8 milhões de anos atrás (no Serravaliense), houve um pico regressivo e pouco depois, no início do
Mioceno Superior, há cerca de 10,6 milhões de anos atrás (no Tortoniense), houve um pico transgressivo (HARDENBOL et al., 1998; LUNDBERG et al., 1998; OGG et al., 2008). Esses dois eventos ocorreram na idade Mayoense (SALMA) e podem ter influenciado sobre os eventos subseqüentes de cladogênese.
Mioceno Superior
No Mioceno Superior encontramos grande parte dos eventos de cladogênese profunda entre as espécies de Proechimys. Uma extensiva transgressão marinha no final do Mioceno pode ter levado a formação de paleolagos, ou mesmo um mar interior, no que é hoje a bacia amazônica (LUNDBERG et al., 1998; RÄSÄNEN et al., 1995). Esses sistemas de lagos podem ter provocado a fragmentação das florestas tropicais, isolando linhagens de Proechimys, que teriam divergido em alopatria. 84
Nessa época, no Tortoniense, houve divergências sucessivas, ou quase simultâneas, entre clados agrupando diferentes grupos de espécies propostos por
Patton (1987). Um reflexo desta rápida diversificação é a pouca resolução encontrada nas relações entre esses clados, com topologias conflitantes e índices de suporte baixos. Um clado formado por P. echinothrix e P. roberti divergiu de outro formado pelos grupos simonsi, guyannensis, goeldii, cuvieri e longicaudatus, indicando que as características morfológicas que levaram Patton (1987) e Weksler et al. (2001) a incluir P. roberti no grupo guyannensis possam ser, de fato, plesiomórficas. Em seguida, os grupos simonsi, guyannensis e goeldii separaram-se entre si e de cuvieri e longicaudatus, no entanto, não está clara a ordem em que essa seqüência de eventos de cladogênese ocorreu. As topologias, nesse ponto, são conflitantes, possivelmente porque os tempos entre os eventos foram curtos demais, impedindo uma segregação completa das linhagens. Esses eventos teriam ocorrido na Idade Chasicoense
(SALMA) até o início da idade Huayqueriense (SALMA) e sugerem que nessa época teria havido uma diversificação quase simultânea dos grupos de espécies de
Proechimys.
Na transição entre as idades Tortoniense e Messiniense, já na idade
Huayqueriense (SALMA), houve a divergência entre as espécies do grupo goeldii e a separação entre os grupos cuvieri e longicaudatus, sugerindo que esses dois últimos estão intimamente relacionados, podendo pertencer ao mesmo grupo de espécies. As relações dentro do grupo goeldii são pouco resolvidas, provavelmente refletindo uma rápida diversificação dentro desse grupo.
No Messiniense, já na idade Montehermosense (SALMA), P. brevicauda divergiu de P. longicaudatus e P. gr. longicaudatus sp. n., os três táxons formaram o grupo longicaudatus apesar de este ser pouco apoiado. O haplótipo identificado como 85
P. goeldii divergiu dos haplótipos de P. gr. goeldii sp. n., numa relação também pouco apoiada. O haplótipo de P. gardneri divergiu dos haplótipos de P. kulinae.
Pouco depois, já no final do Mioceno houve um pico regressivo, cerca de 5,8 milhões de anos atrás (HARDENBOL et al., 1998; OGG et al., 2008). Esta regressão marinha poderia estar associada com mudanças climáticas na América do Sul, implicando em uma expansão das formações abertas e, conseqüente fragmentação das florestas úmidas, com as novas linhagens, surgidas entre o final do Mioceno e início do Plioceno, constituindo formas vicariantes.
Mio-Plioceno
Ainda na idade Montehermosense (SALMA), na transição do Mioceno para o
Plioceno, P. steerei divergiu de P. quadruplicatus e P. amphichoricus; P. longicaudatus divergiu de P. gr longicaudatus sp. n.. O haplótipo de P. kulinae do estado do Amazonas divergiu do haplótipo de P. kulinae de Nuevo San Juan, no Peru, sugerindo, pelo tempo de divergência entre as duas linhagens, que possam ser espécies distintas. Os haplótipos de P. cuvieri da porção norte de sua distribuição
(Venezuela e Guiana Francesa) divergiram dos haplótipos de P. cuvieri da porção sul de sua distribuição (Acre e Amazonas), sugerindo, pelo tempo de divergência entre as duas linhagens, que possam pertencer a espécies distintas.
Plioceno
Durante o Plioceno, os haplótipos de P. roberti da porção sudoeste de sua distribuição (Mato Grosso, a oeste do rio Xingu), divergiram dos haplótipos de P. roberti das porções norte (Mato Grosso e Pará, a leste do rio Xingu) e leste (Piauí e
Tocantins) de sua distribuição. Este evento deu-se na transição entre as idades
Montehermosense e Chapadmalense (SALMA). Nessa mesma época, o haplótipo de 86
P. steerei do estado do Amazonas divergiu do haplótipo de P. steerei da Reserva
Cusco Amazônico, no Peru. Este evento deu-se na transição entre as idades
Chapadmalense e Uquiense (SALMA). Em ambos os casos o tempo de divergência entre as linhagens envolvidas sugere que possam tratar-se de espécies distintas.
Plio-Pleistoceno
Na transição do Plio-Pleistoceno, P. guyannensis do rio Mawarinuma, na
Venezuela, divergiu de P. guyannensis de São João da Baliza, no estado de Roraima, no Brasil e P. guyannensis da Guiana Francesa (P. cayennensis é sinônimo júnior de
P. guyannensis), na idade Uquiense (SALMA). O tempo de divergência sugere que aquela primeira linhagem possa tratar-se de uma espécie distinta, que tentativamente chamaremos de P. cherriei por ser um nome disponível para o grupo guyannensis na
Venezuela. Patton (1987) incluiu cherriei, roberti, vacillator, oris, warreni, boimensis, arescens, riparum, e arabupu em guyannensis, mas sugeriu que os táxons do sul da Amazônia são provavelmente uma espécie diferente dos do norte.
Pleistoceno
Ainda na idade Uquiense (SALMA), vários eventos de cladogênese ocorreram na transição entre as idades Gelasiense e Calabriense, no Pleistoceno Inferior.
Haplótipos de P. gr longicaudatus sp. n. divergiram em duas linhagens. O haplótipo de P. guyannensis de São João da Baliza, Roraima divergiu do haplótipo de P. guyannensis da Guiana Francesa, este exemplar de Roraima foi identificado como P. arabupu por Bonvicino et al. (2005), baseado em dados morfológicos, cariológicos e moleculares. Apesar do tempo de divergência recente entre este haplótipo e os haplótipos da Guiana Francesa, o suporte reduzido para a associação entre P. guyannensis e P. arabupu sugere tratarem-se de linhagens independentes, 87 corroborando as análises de Bonvicino et al. (2005). Os haplótipos de P. roberti da porção norte de sua distribuição divergiram dos haplótipos de P. roberti da porção leste de sua distribuição. As linhagens de P. brevicauda de Sobral, no estado do Acre e de La Poza, no Peru, divergiram.
Já na idade Calabriense do Pleistoceno Inferior, o haplótipo de P. quadruplicatus divergiu do haplótipo de P. amphichoricus. O tempo de divergência entre as linhagens sugere que este último seja sinônimo júnior de P. quadruplicatus, conforme já foi proposto por outros estudos (PATTON, J. L. et al., 2000; VILELA,
2005). Os haplótipos de P. cuvieri da porção norte de sua distribuição tiveram sua divergência mais antiga. Ambos os eventos ocorreram na idade Enseadense
(SALMA).
Na transição do Pleistoceno Inferior a Médio, o haplótipo de P. longicaudatus de El Refugio, na Bolívia, divergiu dos haplótipos de P. longicaudatus de Goiás e
Mato Grosso; e o haplótipo de P. simonsi de Madre de Dios, no Peru, divergiu do haplótipo de P. simonsi de Penedo, no estado do Amazonas. No Pleistoceno Médio, as linhagens de P. cuvieri dos estados do Acre e Amazonas divergiram, as linhagens de P. gr. goeldii sp. n. divergiram e as duas linhagens de P. guyannensis da Guiana
Francesa divergiram. Na transição do Pleistoceno Médio a Superior, os haplótipos de
P. roberti de cada porção de sua distribuição divergiram entre si. Todos esses eventos deram-se na Idade Lujaniense (SALMA).
Thrichomys
Como a variância das datações feitas com máxima verossimilhança foi maior e as datações bayesianas geralmente estavam incluídas dentro do intervalo dos limites 88 de confiança das datações de máxima verossimilhança, optou-se por discutir os dados com base nas datações feitas por análise bayesiana, usando o modelo de relógio estrito, já que a distribuição posterior do desvio padrão do relógio relaxado aproximou-se de zero.
Mioceno Inferior
Os dados indicam que Thrichomys divergiu dos outros equimiídeos no
Mioceno Inferior, na idade Colhuehuapiense de Mamíferos Terrestres Sul- americanos (SALMA). Apesar de ter divergido dos outros gêneros de equimiídeos nessa época, apenas no Plioceno inferior, cerca de 10 milhões de anos depois, encontramos a primeira radiação de Thrichomys, sugerindo que o gênero pode ter passado por um (ou mais) severo gargalo, que pode ter eliminado quase todas as linhagens, deixando uma única remanescente. Esta extinção de linhagens pode estar relacionada com o Grande Intercâmbio Biótico do Plioceno, quando diversos táxons, em sua maioria típicos de formações abertas, invadiram a América do Sul, vindos da
América do Norte, através da recém formada América Central, acarretando o desaparecimento de inúmeros táxons sul-americanos (MARSHALL, 1988; WEBB,
1978).
Plioceno
No Plioceno Inferior, na idade Montehermosense (SALMA), as primeiras linhagens de Thrichomys divergiram. Um clado formado por T. inermis e T. sp. n. divergiu de outro, formado por T. apereoides, T. fosteri e T. pachyurus. Pouco depois, também na idade Montehermosense (SALMA), divergiram T. inermis e T. sp., sugerindo uma rápida diversificação dessas linhagens. 89
Na transição do Plioceno Inferior ao Superior, na idade Chapadmalense
(SALMA), T. fosteri divergiu de T. apereoides e T. pachyurus.
No Plioceno Superior, na transição das idades Chapadmalense e Uquiense
(SALMA), T. apereoides e T. pachyurus divergiram; e na idade Uquiense (SALMA), linhagens do norte e do sul da distribuição de T. inermis divergiram. No final do
Plioceno, cerca de 2,9 milhões de anos atrás, ocorreu um pico transgressivo
(HARDENBOL et al., 1998; OGG et al., 2008). Esta transgressão marinha poderia estar associada com mudanças climáticas na América do Sul, implicando numa expansão das florestas úmidas e, conseqüente fragmentação das formações secas, isolando aquelas linhagens.
Pleistoceno
Também na idade Uquiense (SALMA), mas já no Pleistoceno Inferior, linhagens de T. apereoides do Nordeste divergiram das linhagens dos estados da
Bahia e Minas Gerais.
Ainda no Pleistoceno Inferior, na transição das idades Enseadense e
Lujaniense (SALMA), ocorreu uma sucessão de eventos de cladogênese: linhagens dos estados de Alagoas e Paraíba de T. apereoides do Nordeste divergiram de linhagens dos estados do Piauí e Maranhão; linhagens do sudoeste da Bahia de T. apereoides divergiram de linhagens do sudeste da Bahia; linhagens de T. pachyurus do estado de Mato Grosso divergiram de linhagens dos estados de Goiás e Tocantins; e linhagens de T. pachyurus de Goiás e Tocantins divergiram entre si.
Na transição do Pleistoceno Inferior a Médio, as linhagens do norte e do sul da distribuição de T. apereoides de Minas Gerais divergiram; as linhagens de T. apereoides de Alagoas e da Paraíba divergiram; os haplótipos de T. pachyurus de 90
Tocantins divergiram; os haplótipos de T. fosteri divergiram; e os haplótipos de T. sp. n. divergiram. No Pleistoceno Médio, os haplótipos da parte sul da distribuição de T. inermis divergiram; os haplótipos da parte norte da distribuição de T. inermis divergiram; os haplótipos de T. pachyurus de Goiás divergiram; os haplótipos de T. apereoides do sudeste da Bahia divergiram; os haplótipos de T. apereoides de
Alagoas divergiram; os haplótipos de T. apereoides do Piauí e do Maranhão divergiram. Na transição do Pleistoceno Médio a Superior, os haplótipos de T. apereoides do norte de Minas Gerais divergiram. Todos esses eventos deram-se na
Idade Lujaniense (SALMA).
Pleisto-Holoceno
Na transição pleisto-holocenênica, ainda na idade Lujaniense (SALMA), os haplótipos de T. apereoides do sudoeste da Bahia divergiram.
Trinomys
Como a variância das datações feitas com máxima verossimilhança foi maior e as datações bayesianas geralmente estavam incluídas dentro do intervalo dos limites de confiança das datações de máxima verossimilhança, optou-se por discutir os dados com base nas datações feitas por análise bayesiana, usando o modelo de relógio relaxado, já que a distribuição posterior do desvio padrão do relógio relaxado não se aproximou de zero.
Mioceno Inferior
Os dados indicam que Trinomys divergiu dos outros equimiídeos no Mioceno
Inferior, na transição entre as idades Colhuehuapiense a Santacruciense de
Mamíferos Terrestres Sul-americanos (SALMA). 91
Mioceno Médio
O ancestral comum mais recente das espécies de Trinomys da amostra encontra-se no Mioceno Médio. Nesta época, na idade Colloncurense (SALMA), um clado formado por T. eliasi, T. paratus, T. setosus e T. yonenagae divergiu das outras espécies de Trinomys. Este clado foi chamado de clado 2 por Lara e Patton (2000).
Pouco depois, já na idade Laventense (SALMA), T. albispinus divergiu de um clado formado por T. dimidiatus, T. gratiosus, T. iheringi e T. mirapitanga, dando origem aos clados 3 e 1, respectivamente, como definidos por Lara e Patton (2000). No início do Mioceno Médio, há cerca de 15,8 milhões de anos atrás (no Langhiense), houve um pico transgressivo, na idade Friasiense (SALMA), que pode ter influenciado os eventos de cladogênese que o sucederam. No final do Mioceno Médio, há cerca de
11,8 milhões de anos atrás (no Serravaliense), houve um pico regressivo; e pouco depois, no início do Mioceno Superior, há cerca de 10,6 milhões de anos atrás (no
Tortoniense), houve um pico transgressivo (HARDENBOL et al., 1998; LUNDBERG et al., 1998; OGG et al., 2008) essa seqüência de eventos ocorreu na idade Mayoense
(SALMA) e pode ter influenciado os eventos de cladogênese que se seguiram.
Nossa estimativa para a divergência dos clados de Trinomys, entre 13,2 e 14,3 milhões de anos, é muito mais antiga que a estimativa de Lara e Patton (2000), de 1,6 a 7,4 milhões de anos.
Mioceno Superior
No Mioceno Superior, na transição entre as idades Mayoense e Chasicoense
(SALMA), o clado formado por T. eliasi, T. paratus divergiu de outro clado formado por T. setosus e T. yonenagae, este último pouco apoiado; e T. gratiosus divergiu de um clado formado por. T. dimidiatus, T. iheringi e T. mirapitanga; na idade 92
Huayqueriense (SALMA), T. yonenagae divergiu de T. setosus e T. mirapitanga divergiu de um clado formado por T. dimidiatus, T. iheringi; e na idade
Montehermosense (SALMA), T. dimidiatus divergiu de T. iheringi.
Plioceno
Na transição do Plioceno Inferior ao Superior, na idade Chapadmalense
(SALMA), T. setosus setosus divergiu de um clado formado por T. s. denigratus e T. s. elegans. O tempo de divergência entre as linhagens sugere que sejam espécies distintas.
Plio-Pleistoceno
Na transição do Plio-Pleistoceno, na idade Uquiense (SALMA), os haplótipos de T. albispinus divergiram, sugerindo que pertençam a espécies distintas, sendo o exemplar de Cristinápolis, no estado de Sergipe, pertencente à subespécie sertonius, sugerimos sua elevação à categoria de espécie, ficando assim Trinomys sertonius
(Thomas, 1921). Nessa mesma época os haplótipos de T. eliasi e T. paratus divergiram.
No final do Plioceno, cerca de 2,9 milhões de anos atrás, ocorreu um pico transgressivo (HARDENBOL et al., 1998; OGG et al., 2008). Esta transgressão marinha poderia estar associada com mudanças climáticas na América do Sul, implicando em um aumento nas florestas úmidas e, conseqüente fragmentação de formações mais secas. Note-se que as linhagens de Trinomys originadas por volta dessa época pertencem ao clado 3, de formações xerofíticas, e ao clado 2 de florestas semidecíduas.
Pleistoceno 93
Ainda na idade Uquiense (SALMA), mas já no Pleistoceno Inferior, ocorreu a primeira divergência entre os haplótipos amostrados de T. gratiosus; duas linhagens de T. dimidiatus do estado do Rio de Janeiro divergiram, uma do norte e outra do sul da distribuição da amostra; e os haplótipos de T. s. denigratus e T. s. elegans divergiram, o tempo de divergência entre essas duas linhagens mitocondriais apoiando seu status subespecífico, baseado na definição de subespécie de Avise e
Ball (1990) e O‟Brien e Mayr (1991).
Na transição do Pleistoceno Inferior para o Médio, no início da idade
Lujaniense (SALMA), T. gratiosus bonafidei divergiu de um clado formado por duas das linhagens de T. g. gratiosus amostradas, apoiando o status subespecífico atribuído a T. gratiosus bonafidei; e os haplótipos de T. dimidiatus do norte da distribuição da amostra divergiram.
Ainda na idade Lujaniense (SALMA), mas já no Pleistoceno Médio, ocorreu a primeira divergência entre os haplótipos amostrados de T. iheringi; e os haplótipos de
T. dimidiatus do sul da distribuição da amostra divergiram.
94
Conclusões
1. De maneira geral houve pouca sobreposição nos eventos de cladogênese,
comparativamente entre os três gêneros, sugerindo que as variações climáticas
do passado afetaram de maneira diversa cada bioma e suas respectivas biotas.
2. Proechimys e Trinomys apresentam diversas linhagens antigas, que
divergiram desde o Mioceno Médio.
3. Thrichomys sofreu uma severa extinção de linhagens entre o final do Mioceno
e o início do Plioceno, possivelmente associada com o Grande Intercâmbio
Biótico Americano.
4. A hipótese de refúgios do Pleistoceno não pode explicar a diversidade de
espécies dos gêneros analisados, mas possivelmente as oscilações climáticas
do Pleistoceno desempenharam um papel decisivo sobre a distribuição atual
das espécies.
5. Apenas um modelo de diversificação não pode explicar nossos dados, que
sugerem a ocorrência tanto de vicariância quanto de dispersão, demonstrando
a necessidade de modelos mais complexos para abordar a diversidade na
região Neotropical.
6. Este estudo mostra a importância de analisar filogenias sobre uma estrutura
temporal, produzindo inferências dentro de uma perspectiva histórica e não
apenas sistemática. 95
Resumo
Uma análise comparativa dos tempos de divergência dos eventos de cladogênese dentro dos gêneros Proechimys, Thrychomys e Trinomys de equimiídeos, baseada em seqüências do gene mitocondrial citocromo b, revelou distintos padrões de diversificação para esses três gêneros. Em geral houve pouca sobreposição entre os eventos de diversificação dos três gêneros comparados. Tanto Proechimys quanto Trinomys comportam diversas linhagens antigas, que vêm se diferenciando desde o Mioceno Médio. Thrichomys apresentou indício de uma perda de linhagens entre o final do Mioceno e o início do Plioceno, que pode estar associada ao Grande Intercâmbio Biótico Americano. Esses dados sugerem que as oscilações climáticas podem ter afetado de maneira diversa, com distintas respostas, os diferentes biomas ocupados por esses três gêneros. Nossos dados sugerem que apenas um modelo de diversificação não pode explicar a diversidade neotropical, enfatizando a necessidade de abordagens com modelos mais complexos. Este estudo demonstra a importância de associar uma estrutura temporal às análises filogenéticas. Associar tempo a eventos de cladogênese permite inferir modelos de especiação e extinção, comparar taxas de evolução entre táxons e correlacionar esses eventos com processos geológicos, paleoclimáticos e biogeográficos. 96
Abstract
Comparative analysis of divergence times for cladogenic events within the echimyid genera Proechimys, Thrychomys, and Trinomys, based on sequences of the mitochondrial cytochrome-b gene, revealed distinct patterns of diversification for these three genera. In general there was little overlap between the events of diversification of the three genera, when compared. Both Proechimys and Trinomys consist of several lineages which have become differentiated since the Middle
Miocene. Thrichomys seems to have undergone a severe bottleneck, with the survival of a single lineage, which may be associated with the Great American Biotic
Interchange. These data suggest that fluctuations in past climate may have affected differently, the different biomes occupied by these three genera. Our data suggest that a single speciation mode fails to explain Neotropical biodiversity, emphasizing the need for approaches using complex models. This study demonstrates the importance of associating a temporal framework to phylogenetic analyses. Relating cladogenesis and time allows testing of hypotheses about the mode of speciation and extinction, comparison of rates of evolution across taxa, and correlation of such events with important geological, paleoclimatic, and biogeographic processes. 97
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