Proteinbiochemische Und Elektrophysiologische Charakterisierung Des Bile Acid- Sensitive Ion Channels BASIC"

„Proteinbiochemische und elektrophysiologische Charakterisierung des bile acid- sensitive ion channels BASIC"

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der RWTH Aachen University zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

vorgelegt von

M. Sc. RWTH

Daniel Löhrer

aus

Aachen

Berichter: Priv.-Doz. Dr. Dominik Wiemuth, Ph.D Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Marc Spehr

Tag der mündlichen Prüfung 03.07.2017

Die Dissertation ist auf der Internetseite der Universitätsbibliothek online verfügbar 1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Dominik Wiemuth Universitätsklinikum der RWTH Aachen Institut für Physiologie Pauwelsstraße 30 52074 Aachen Tel.: +49 241 80-88802 E-mail: [email protected]

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Marc Spehr RWTH Aachen

2. Sammelbau Biologie

Institut für Biologie II

Abteilung Chemosensorik

Worringer Weg 3

D-52074 Aachen

Tel.: +49 241 80-20802

E-mail: [email protected] Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung...... 7 Summary...... 8 1 Einleitung...... 9 1.1 Die DEGenerin / Epithelial Na+ Channel (DEG/ENaC) Ionenkanal Superfamilie...... 9 1.1.1 Caenorhabditis elegans Degenerine (DEG)...... 11 1.1.2 Hydra Na+ Channels (HyNaCs)...... 13 1.1.3 Der Epitheliale Na+ Kanal (ENaCs)...... 15 1.1.4 Acid-sensing ion channels (ASICs)...... 18 1.1.4.1 Interaktionspartner von ASIC...... 19 1.1.5 Bile Acid-sensitive Ion Channels (BASICs) / Brain liver intestine Na+ Channels (BLINaCs)...... 21 1.2 Cholangiocyten...... 24 1.2.1 Physiologie von Cholangiocyten ...... 26 1.2.2 Cholangiopathien...... 32 1.3 Gallensäuren...... 34 Zielsetzung...... 37 2. Material und Methoden...... 39 2.1 Materialien...... 39 2.1.1 Chemikalien...... 39 2.1.2. Materialien für molekularbiologische Methoden...... 39 2.1.3 Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden...... 40 2.1.4 Primer...... 41 2.1.5 Materialien für zellbiologische Methoden...... 42 2.1.6 Antibiotika...... 42 2.1.7 Materialien für proteinbiochemische Methoden...... 43 2.1.8 Antikörper...... 43 2.1.9 Lösungen für das Tandem Affinity Purification Assay (TAP-Assay)...... 44 2.1.10 Lösungen für Ussing-Kammer Experimente/Calcium Imaging...... 45 2.1.11 Materialien und Lösungen für Immunhistochemie...... 46 2.1.12 Geräte und Software des Calcium-Imagin Settup:...... 46 2.2 Methoden...... 47 2.2.1 Molekularbiologische Methoden...... 47 2.2.1.1 Agarose Gelelektrophorese ...... 47 2.2.1.2 Aufreinigung der DNA-Fragmente...... 47 2.2.1.3 DNA Restriktionsverdau...... 47 2.2.1.4 Polymerase Kettenreaktion...... 48 2.2.1.5 Transformation von kompetenten E. Coli...... 49 2.2.1.6 Isolation der Plasmid-DNA (DNA-Miniprep)...... 49 2.2.1.7 Isolation der Plasmid-DNA (DNA-Maxiprep)...... 49 2.2.1.8 Isolation genomischer DNA ...... 49 2.2.2 Zellbiologische Methoden...... 50 2.2.2.1 Transiente Transfektion durch Calcium-Phosphat-Präzipitation...... 50 2.2.2.2 Transfektion von NRCs...... 50 2.2.3 Proteinbiochemische Methoden...... 51 2.2.3.1 Proteinpräparation von Zellen...... 51 2.2.3.2 Quantifizierung der Protein-Konzentration mit dem BCA-Assay...... 51 2.2.3.3 Gelelektrophorese: SDS-PAGE nach Laemmli...... 52 2.2.3.4 Semidry-Proteintransfer...... 53 2.2.3.5 Immundetektion...... 53 2.2.3.6 Immunhistochemische Färbung...... 54 2.2.3.7 Tandem Affinity Purification Assay (TAP-Assay)...... 55 2.2.4 Elektrophysiologische Methoden...... 56 2.2.4.1 Ussing-Kammer...... 56 2.2.5 Calcium-Imaging...... 58 2.2.6 CRISPR/Cas-9 Knockout...... 59 3 Ergebnisse...... 61 3.1 Identifizierung möglicher Interaktionspartner des BASIC...... 61 3.1.1 Tandem affinity purification (TAP) Methode...... 61 3.1.2 Massenspektrometrie Versuch...... 63 3.1.3 Co-Immunpräzipitation...... 67 3.1.4 Interaktionsstudie des BASIC-N-Terminus-GFP und der Plasmamembran...... 69 3.2 Charakterisierung von rBASIC in normal rat cholangiocytes (NRCs)...... 71 3.2.1 Expression des BASIC in Cholangiocyten...... 71 3.2.2 Elektrophysiologische Untersuchung von BASIC in NRCs mittels Ussing- Kammer...... 74 3.2.3 Elektrophysiologische Untersuchung transepithelialer Ströme in BASIC-KO- NRCs...... 79 3.2.4 Elektrophysiologische Untersuchung des Einflusses von Somatostatin auf BASIC...... 82 3.3 Purinerges Signaling und der Einfluss von Gallensäuren...... 84 3.3.1 Einfluss von Gallensäuren auf ATP-abhängigen transepithelialen Strom ...... 84 3.3.2 Einfluss von Gallensäuren auf die ATP-abhängige intrazelluläre Ca2+-Konzentration...... 87 4 Diskussion...... 93 4.1 Identifizierung möglicher Interaktionspartner des BASIC...... 93 4.1.1 Interaktionsstudie des BASIC-N-Terminus und der Plasmamembran...... 97 4.2 Charakterisierung von rBASIC in normal rat cholangiocytes (NRCs)...... 98 4.3 Purinerges Signaling und der Einfluss von Gallensäuren...... 103 4.4 Zusammenfassung & Ausblick...... 107 Literaturverzeichnis...... 109 Anhang Abbildungen...... 131 Abbildungsverzeichnis...... 132 Tabellenverzeichnis...... 134 Abkürzungsverzeichnis...... 135

Zusammenfassung

Der bile acid-sensitive ion channel (BASIC) ist ein Mitglied der DEG/ENaC Ionenkanal Superfamilie. Er wird primär im Cerebellum, den Epithelzellen der Gallengänge in der Leber und im Darm exprimiert. BASIC aus Ratte und Mensch (r- und hBASIC) sind nativ geschlossen, der BASIC aus Maus (mBASIC) hingegen ist konstitutiv offen (Wiemuth und Gründer 2011). Sowohl rBASIC als auch hBASIC können durch Gallensäuren aktiviert werden (Wiemuth et al. 2012). Das Diarylamidin Diminazen hat eine inhibierende Wirkung auf alle BASICs (Wiemuth und Gründer 2011). Es sind viele Proteine beschrieben die einen regulierenden oder modulierenden Effekt sowohl auf die Expression, als auch auf die Aktivität verschiedener Mitglieder der DEG/ENaC Familie haben (Rotin, 2000; Zha, 2013). Es liegt daher nahe, dass auch BASIC auf Grund der strukturellen Verwandtschaft zu den anderen Mitgliedern der DEG/ENaC Familie durch verschiedene Proteine moduliert werden könnte. In dieser Arbeit konnten 21 mögliche Interaktionspartner von BASIC identifiziert werden. Die intrazellulären N- und C-Termini der DEG/ENaC Mitglieder sind oftmals an der Interaktion mit modulierenden Proteinen beteiligt. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass BASIC über den N-Terminus mit Tubulin interagiert. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass die amphiphile, α-helikale Struktur des N-Terminus (AS 15- 25) eine Bindung von BASIC mit der Membran ermöglicht. Die physiologische Funktion von BASIC ist bis dato noch nicht beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass BASIC in normal rat cholangiocytes (NRCs), einer immortalisierten Zelllinie der Epithelzellen der Gallengänge, exprimiert wird. Der nativ exprimierte BASIC wurde elektrophysiologisch charakterisiert. Dabei stellte sich heraus, dass BASIC an einem durch Gallensäuren-induzierten, transepithelialen Strom beteiligt ist. Etwa 50% des induzierten Stroms sind BASIC-abhängig und Diminazen-sensitiv. Die Beteiligung von BASIC an diesem Strom konnte durch die Generierung einer BASIC-KO- NRC Zelllinie nachgewiesen werden. Neben der Funktion von BASIC in den Cholangiocyten gibt es eine Vielzahl von Signalwegen in diesen Zellen, die maßgeblich an der physiologischen Funktion der Cholangiocyten beteiligt sind. Die durch ATP-induzierte

- Sekretion von HCO3 und Wasser aus den Zellen spielt dabei eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Gallensäuren einen inhibierenden Effekt auf Calcium- aktivierte Cl- Kanäle (CaCCs) haben. Die Ergebnisse tragen zum besseren Verständnis von BASIC und den ihn exprimierenden Cholangiocyten bei und ermöglichen neue Ansätze zur weiteren Charakterisierung der physiologischen Funktion.

7 Summary

The bile acid-sensitive ion channel (BASIC) is a member of DEG/ENaC superfamily of ion channels. It is primarily expressed in the cerebellum, the epithelial cells lining the bile ducts of the liver, and in the intestine. BASIC from rat and human (r- and hBASIC) are naturally in a closed state, while BASIC from mouse (mBASIC) shows high constitutive activity (Wiemuth and Gründer 2011). Both, rBASIC and hBASIC can be activated by bile acids (Wiemuth et al. 2012). The diarylamidine Diminazene has an inhibiting effect on all BASICs (Wiemuth und Gründer 2011). There are many proteins described that have a regulating or modulating effect on the expression and activity of some members of DEG/ENaC family (Rotin, 2000; Zha, 2013). Due to the structural similarity of BASIC and the other DEG/ENaC channels, it was logical to assume that BASIC is also modulated by different proteins. 21 possible interacting candidates could be identified in this study. The intracellular N- and C-terminal domain of the DEG/ENaC channels often are the targets for interacting proteins. In this study, it could be shown that Tubulin interacts with BASIC on the N-terminal domain. Furthermore, it could be shown that the amphiphilic, α- helical structure of the N-terminal domain (AA 15-25) enables the binding of BASIC to the plasma membrane. The physiological function BASIC is still unknown. In this study, I could show that BASIC is expressed in normal rat cholangiocytes (NRCs), an immortalized cell line derived from the epithelial cells of the bile ducts. The electrophysiological characterization of BASIC revealed that BASIC is involved in a bile acid induced transepithelial current. About 50% of this current is BASIC dependent and Diminazene sensitive. The involvement of BASIC in this current could be verified by generating a BASIC-KO-NRC cell line. Besides BASIC, there is a plethora of signaling pathways involved in the physiological function of the

- cholangiocytes. The ATP induced secretion of HCO3 and water from the cells plays a major role in cholangiocytes. In this study, it could be shown that bile acids have an inhibiting effect on calcium-activated Cl- channels (CaCCs). All results from this study benefit the understanding of BASIC and the cholangiocytes and show new opportunities to characterize the physiological function of BASIC.

8 1 Einleitung

1.1 Die DEGenerin / Epithelial Na+ Channel (DEG/ENaC) Ionenkanal Superfamilie

Die DEG/ENaC Ionenkanal Superfamilie ist nach den ersten beiden beschriebenen Vertretern dieser Familie benannt worden, den Degenerinen (DEG) aus Caenorhabditis elegans und dem Epithelialen Na+ Kanal (ENaC) der Vertebraten (1992/1993). Im Laufe der folgenden Jahre konnte gezeigt werden, dass Vertreter der DEG/ENaC Familie in vielen unterschiedlichen Spezies vorkommen, darunter Nematoden, Fliegen, Schnecken und Vertebraten, den Menschen eingeschlossen. Genau so vielfältig wie die Spezies die DEG/ENaC-Kanäle exprimieren, sind auch die Funktionen und die Expressionsmuster in der Kanalfamilie. Dazu gehören die Mechanosensitivität, Nozizeption, Propriozeption, Gametogenese und die Na+-Homöostase. Entsprechend ihrer Funktionen sind die Kanäle in Epithelien, Muskeln und Neuronen exprimiert. Trotz einer hohen Sequenzhomologie der einzelnen Subfamilien der DEG/ENaC-Kanäle unterscheiden sie sich deutlich in ihrem gating. Zum einen gibt es konstitutiv offene Kanäle wie die ENaCs (Garty et al. 1997) und Kanäle die auf mechanische Stimuli reagieren wie die C. Elegans Degenerine (Gu et al. 1996). Zum anderen gibt es Kanäle die direkt durch Peptide aktiviert werden, wie die hydra Na+ channels (HyNaC) (Golubovic et al. 2007) oder solche, die durch Protonen aktiviert werden, wie die acid-sensing ion channels (ASICs) (Waldmann et al. 1998). Die Kanalsuperfamilie vereint trotz ihrer funktionellen Diversität eine Reihe von Eigenschaften. Dazu gehört, dass DEG/ENaC Kanäle nicht spannungsgesteuert, selektiv für Kationen und sensitiv für das Diuretikum Amilorid sind (Bianchi und Driscoll, 2002; Garty und Palmer, 1997). Sie besitzen eine gemeinsame Struktur, bestehen aus zwei Transmembrandomänen (M1 und M1), einem Cystein-reichen extrazellulären Loop (CRD I-III) und einem intrazellulär liegenden N- und C-Terminus (Bianchi, 2007; Bianchi und Driscoll, 2002; Canessa et al. 1994; Corey und Garcia-Anoveros, 1996; Renard et al. 1994; Tavernarakis und Driscoll, 2000, 2001a). Die Proteinkomplexe verfügen über hoch konservierte Sequenzbereiche zu denen ein HG-Motiv (His-Gly) am N-Terminus (Gründer et al. 1999), ein di-Arginin-Motiv vor der TMD1, ein hoch konserviertes Tryptophan in der TMD1, das Selektivitätsfilter-Motiv 'GAS' in der TMD2, eine FpxxTxC Sequenz direkt hinter der M1 Domäne (post M1) und Reste der M2 Domäne gehören (Kellenberger et al. 1999; Snyder et al. 1999) (Abb. 1.1).

9 Die einzelnen Kanäle der DEG/ENaC Superfamilie bestehen aus drei dieser hoch konservierten, etwa 530-740 Aminosäuren großen, Untereinheiten und bilden Hetero- oder Homomultimere (Benson et al. 2002, Canessa et al. 1994B; Eskandari et al. 1999; Jasti et al. 2007; Kellenberger und Schild, 2002; Zha et al. 2009b). Basierend auf der Kristallstruktur von ASIC1a ist allgemein anerkannt, dass sich die DEG/ENaC Untereinheiten zu trimeren Strukturen zusammenschließen (Firsov et al. 1998, Coscoy et al. 1998, Kosaris et al. 1998). In diesem Model sind drei Untereinheiten um eine zentrale Ionenpore angeordnet, die Untereinheiten ähneln einem aufgerichteten Unterarm mit geschlossener Hand. Der extrazelluläre Teil repräsentiert die Hand und entsprechend wurden auch die verschiedenen Strukturen Handfläche (palm), Knöchel (knuckle), Finger (finger), β-ball und Daumen (thumb) benannt (Jasti et al. 2007) (Abb. 1.1). Die Zusammensetzung der einzelnen Untereinheiten hat Einfluss auf die Pharmakologie und die biophysikalischen Eigenschaften der Kanäle. Dies weist darauf hin, dass die Zusammenstellung der Untereinheiten ein wichtiger Mechanismus für die Regulation der DEG/ENaC Kanäle ist (Askwith et al. 2004; Benson et al. 2002; Chu et al. 2004; Xie et al. 2003; Zha et al. 2009A; Zhang et al. 2008).

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung einer DEG/ENaC Untereinheit. (Eigene Abbildung, A modifiziert nach Kellenberger und Schild, 2002, B modifiziert nach Kellenberger und Schild 2015)

10 1.1.1 Caenorhabditis elegans Degenerine (DEG)

In den Fadenwürmern der Spezies Caenorhabditis elegans konnten durch genetische und molekulare Untersuchungen 15 Gene identifiziert werden, die für mechanosensitive Degenerin-Kanäle kodieren. Die Mutation des deg-1 Gens führt zu einer Degeneration der sensorischen Neurone in C. elegans. Die Kanalfamilie wurde nach dem dadurch entstehenden Phänotyp Degenerine benannt. Sie sind maßgeblich für die Transduktion mechanischer Kräfte verantwortlich. Die Wahrnehmung mechanischer Stimuli wie Strecken, Beugen und Druck machen die Degenerine zu den primären Mediatoren des

Tastsinns (Gu et al. 1996, Tavernarakis et al. 1/1997; Chalfie et al. 1989) sowie der Propriozeption in C. elegans (Tavernarakis et al. 2/1997). Die mec Gene und die durch sie kodierten Proteine bilden einen touch-transducing

Komplex (Gu et al. 1996; Tavernarakis et al. 1/1997). Diese Gene sind zum Teil den Degenerinen zugehörig. Es gibt jedoch auch MEC Proteine die keine Degerine sind. MEC-4, welches in PVM Neuronen (Neurone lateral posterior) exprimiert wird (Driscoll et al. 1991; Lai et al. 1996) und MEC-10 aus den PVD Neuronen (Neurone in Schwanz und lumbal) (Huang et al. 1994) sind die zwei maßgeblichen Untereinheiten für den Komplex. MEC-4 kann einen homotrimeren oder zusammen mit MEC-10 einen touch-transducing Kanal bilden (Huang et al. 1994, Chalfie et al. 1979; Lai et al. 1996; Hong et al. 1994, Chen et al. 2015). Zusammen mit Stomatin-like Protein MEC-2 / UNC-24 und dem paraoxonase-like Protein MEC-6 erfährt der touch-transducing Kanal aus MEC-4 und MEC-10 eine synergistische Erhöhung der Kanalaktivität (Huang et al., 1995; Chelur et al., 2002; Zhang et al., 2004; O'Hagan et al. 2005). MEC-2 und MEC-6 sind jedoch nicht eng mit dem Kanal verbunden und beeinflussen auch nicht dessen Stöchiometrie (Chen et al. 2015). Die extrazelluläre Domäne des touch-transducing Kanals ist über MEC-5, einem Kollagen, und/oder MEC-9, einem großen Protein mit ausgeprägten Interaktionsdomänen wie EGF- Wiederholungen (epidermal growth factor) und Kunitz-Proteaseinhibitor-Domänen (Du et al. 1996), mit der extrazellulären Matrix verbunden. Die intrazellulären Domänen hingegen sollen über spezielle 15-Protofilament-Mikrotubuli verbunden sein. Diese Mikrotubuli bestehen aus MEC-12 α-Tubulin, MEC-7 β-Tubulin (Savage et al. 1989; Fukushige et al. 1999) und dem MEC-2 Linkerprotein (Huang et al. 1995). Die Interaktion der Degenerine mit dem Zytoskelett stellt einen interessanten Mechanismus dar, wie mechanische Kräfte Ionenkanäle beeinflussen und aktivieren

11 können. Daher ist es von Interesse zu untersuchen, ob solche Interaktionen auch in anderen Mitgliedern der DEG/ENaC Ionenkanal Superfamilie vorhanden sind. Eine Untersuchung zur Identifikation möglicher Interaktionspartner für den bile acid-sensitive ion channel (BASIC) wird in dieser Arbeit durchgeführt. Es wird vermutet, dass für die Propriozeption die Gene unc-8 und del-1 von Bedeutung sind. UNC-8 und DEL-1 gehören zu der Familie der DEG/ENaC Proteine. UNC-8 wird in sensorischen, Inter- und Motorneuronen (VA/VB) exprimiert (Tavernarakis et al. 1/1997) und soll zusammen mit DEL-1 einen mechano-transducing Komplex bilden (Tavernarakis et al. 2/1997). Möglicherweise interagiert auch das Stomatin-Homolog UNC-1 mit diesem Komplex, da eine Expression in annähernd den gleichen Neuronen wie UNC-8 nachgewiesen werden konnte (Mano und Driscoll, 1999).

12 1.1.2 Hydra Na+ Channels (HyNaCs)

Eine weitere DEG/ENaC-Subfamilie konnte aus dem Süßwasserpolyp Hydra magnipapillata kloniert werden. Bis dato wurden 12 Untereinheiten der hydra Na+ channels (HyNaC) beschrieben. Diese werden HyNaC1-12 genannt (Golubovic et al. 2007; Dürrnagel et al. 2010; Assmann et al. 2014). Die endogenen Neuropeptide HydraRFa I und II wurden als Liganden identifiziert, die die HyNaCs direkt aktivieren können (Golubovic et al. 2007). HyNaC3 und 4 teilen eine Homologie von ~60%. HyNaC2 ist gegenüber HyNaC3 und 4 nur zu ~28% homolog in seiner Aminosäuresequenz. Die Homologie der sieben neuen Untereinheiten liegt zwischen 29-65% und HynaC3 teilt mit HyNaC11 ~85% Homologie (Assmann et al. 2014). Bei hynac 1 handelt es sich vermutlich um ein Pseudogen, da ein für die Translation wichtiges Methionin und das N-Terminale HG-Motiv der DEG/ENaC Familie fehlen (Gründer et al. 1997; Gründer et al. 1999; Golubovic et al. 2007). In in-situ Experimenten konnte ein distinktes Expressionsmuster der verschiedenen HyNaCs gezeigt werden. Transkripte von hynac2-5 konnten an der Basis der Tentakel im adulten Polypen und in ephiteliomuskulären Zellen, Transkripte von hynac2 und 3 in der Knospungsregion wachsender Polypen, hynac4 und 6 an der aboralen Seite und hynac5 und 11 an der oralen Seite der Tentakelbasis nachgewiesen werden (Golubovic et al. 2007; Dürrnagel et al. 2010) (Abb. 1.2). Am Pedunkel konnten Transkripte von hynac7 und 10, am Hypostom hynac10 und Transkripte von hynac8 und 9 über die komplette Körpermitte nachgewiesen werden (Assmann et al. 2014) (siehe Abb. 1.2). Der erste funktionelle Kanal der gefunden wurde, der vermutlich auch physiologisch vorkommt, setzt sich aus den Untereinheiten HyNaC2/3 zusammen (Golubovic et al. 2007). Später wurde festgestellt, dass der Kanal mit der Zusammensetzung der Untereinheiten HyNaC2/3/5 eine deutlich höhere Affinität für Amilorid, eine höhere Selektivität für Na+ und eine 100-mal höhere Affinität zu den HydraRF-Amiden I und II hat als ein Kanal der nur aus den Untereinheiten HyNaC2/3 besteht. Der funktionelle HyNaC2/3/5 Kanal ist permeabel für Ca2+ und kann durch extrazelluläres Ca2+, ähnlich wie auch BASIC, geblockt werden (Dürrnagel et al. 2012). Nach der Entdeckung von HyNaC6-12 konnten zusammen mit HyNaC2-5 insgesamt dreizehn weitere heteromere Kanäle nachgewiesen werden, die alle sensitiv für HydraRF- Amide sind (Assmann et al. 2014). Die HyNaCs lassen sich über ihre phylogenetische Verwandtschaft in Untergruppen definieren (Assmann et al. 2014). Voraussetzung für

13 einen funktionellen Kanal sind das Vorhandensein von HyNaC2, einer Untereinheit aus der Untergruppe 1 (HyNaC5-7) und einer Untereinheit aus der Untergruppe 2 (HyNaC3,4,8- 11). Alle Kanäle die Sensitivität für HydraRFa I zeigen sind auch sensitiv für HydraRFa II und können durch Reduktion des extrazellulären Ca2+ geöffnet werden. Des Weiteren zeigen sie eine Ca2+-Permeabilität und sind durch Diminazen blockbar. Eine Ausnahme bildet HyNaC2/9/5. Dieser Kanal ist nicht sensitiv für HydraRF-Amid I aber sensitiv für die Ca2+-Reduktion, aktiviert demnach bei Wegnahme von Ca2+ (Assmann et al. 2014). Basierend auf den in-situ Daten wird vermutet, dass HyNaC2/3/5 auf der oralen Seite und HyNaC2/11/5 auf der aboralen Seite der Tentakelbasis exprimiert werden. HyNaC2/9/7 und HyNaC2/10/7 werden dementsprechend in der Pedunkel Region exprimiert (Assmann et al. 2014).

Abbildung 1.2: Expressionsmuster von HyNaC in Hydra magnipapillata. (modifiziert nach Gründer und Assmann, 2015) HyNaC2-5 exprimiert an der Basis der Tentakel; HyNaC2 und 3 exprimieren in der Knospungsregion; HyNaC4 exprimiert an der aboralen Seite der Tentakel; Pfeil bei HyNaC4 u. 5 zeigt die aborale Seite der Tentakel.

14 1.1.3 Der Epitheliale Na+ Kanal (ENaCs)

In allen Organismen ist das Gleichgewicht der extrazellulären und intrazellulären Na+-Konzentration (Na+-Homöostase) fundamental wichtig für das Überleben. Ein zu hohes Na+-Niveau kann in höheren Organismen, wie dem Menschen, zu einem erhöhten Blutdruck führen. Dieser wirkt sich negativ auf das Herz-Kreislaufsystem aus und kann im schlimmsten Fall zu einem Versagen des selbigen und des renalen Systems führen. Ein zu niedriges Na+-Niveau kann hingegen zu Dehydrierung und metabolen Azidosen führen. Der epitheliale Na+ Kanal ENaC spielt bei der Aufrechterhaltung der Na+-Homöostase eine entscheidende Rolle. Der Kanal ist im distalen Nephron, dem Colon, der Lunge und in den Speicheldrüsen für die Na+-Absorption verantwortlich. Des Weiteren konnte ENaC mRNA in der Haut, den Blutgefäßen, dem Auge und dem Herzen nachgewiesen werden (Mauro et al. 2002; Drummond et al. 2004; Krueger et al. 2012). Die wichtige Funktion der ENaCs wird deutlich durch seine tragende Rolle bei Na+ Gleichgewichtsstörungen wie dem Liddle Syndrom (Hansson et al. 1995, Lifton et al. 1995, Schild et al. 1995). Beim Liddle Syndrom handelt es sich um eine erbliche Form der Hypertonie, die sich durch eine zu hohe Na+-Resorption, ein zu hohes Aldosteron-Level und eine verminderte renale Funktion auszeichnet und tritt oft in der Verbindung mit einer Hyperkaliämie und metabolischer Azidose auf (Schild, 1996) Der funktionelle ENaC-Kanal setzt sich in den meisten Fällen zu einem Heterotrimer aus der α β γENaC Untereinheit (Canessa et al. 1993/1994), und in selteneren Fällen aus der δ bzw. γENaC Untereinheit zusammen (Waldmann et al. 1995, Gründer et al. 2001). In dieser Zusammensetzung zeichnet er sich durch eine hohe Selektivität für Na+ und Li+, eine hohe Offenwahrscheinlichkeit und lange Kanalöffnungszeiten, aber einer kleinen Leitfähigkeit von ~5 pS aus (Garty et al. 1997). Das Na+/K+-Selektivitätsverhältnis liegt bei >500 und spricht für eine Selektivität für kleine Kationen (Benos, 1982; Palmer, 1982). Die Selektivität basiert auf der Größe der Kationen und der Interaktion mit der Kanalpore. Kleine Ionen, wie Na+ und Li+ können durch den Kanal permeieren, große Kationen wie K+,

+ NH4 oder divalente Kationen jedoch nicht. Drei konservierte Aminosäuren (G/SxS) in der Transmembrandomäne M2 aller Untereinheiten (α, β und γ) stehen im Verdacht für diese Selektivität verantwortlich zu sein (Kellenberger et al. 1999/2001; Snyder et al. 1998). Trotz der konstitutiven Aktivität ist ENaC exakt reguliert. Die Aktivität und die Expression passen sich der durch den Urin ausgeschiedenen und der durch Nahrung aufgenommenen Na+-Menge an, um die Salz-Homöostase beizubehalten. Die

15 Oberflächenexpression wird auf Proteinebene hormonell durch Aldosteron und Vasopressin moduliert. Auf transkriptioneller Ebene wird die Expression auch durch Aldosteron und durch Insulin reguliert (Linguelia et al. 1994; Champigny et al. 1994) (Abb. 1.3). Einen weiteren wichtigen Regulationsmechanismus für ENaC stellen mit dem Kanal direkt oder indirekt interagierende Proteine dar. Das SNARE Protein Syntaxin1A verstärkt die Oberflächenexpression von ENaC und verringert gleichzeitig die Aktivität (Qi et al. 1999) (Abb. 1.3). Syntaxin1A ist am Proteintransport von ENaC durch Vesikel an die Zelloberfläche involviert. Der genaue Mechanismus ist bis dato ungeklärt. Es lässt sich vermuten, dass Syntaxin1A Einfluss auf das trafficking und das Kanal-Recycling von ENaC hat, da γENaC und Syntaxin1A präzipitieren (Qi et al. 1999). Die ENaC α- und β- Untereinheiten können ubiquitiniert werden. Durch die dadurch ausgelöste schnelle Degradierung der Proteine kommt es zu einer Verringerung der Oberflächenexpression funktioneller ENaC-Kanäle (Staub et al. 1996/1997). Ubiquitin-Ligasen, welche über die Prolin-reichen Bereiche der β-ENaC Untereinheit mit dem funktionellen ENaC-Kanal interagieren, sind Nedd4-1 und Nedd4-2 (Neuronal precursor cells Expressed Developmentally Downregulated) (Kumar et al. 1992; Abriel et al. 1999; Goulet et al. 1998; Farr et al. 2000). Diese binden an ein am C-terminalen Bereich befindliches PY-Motiv der ENaC Untereinheit und katalysieren die Ubiquitinierung (Farr et Abbildung 1.3: Positive und negative Regulation des ENaCs durch intra- und extrazelluläre akzesorische al. 2000; Asher et al. 2001; Lott et al. Proteine. (Eigene Abbildung, modifiziert nach Rotin 2000) 2002). Bei einer Mutation des PY-Motivs, kann ENaC nicht mehr ubiquitiniert werden. Es wird vermutet, dass die nach der Endocytose ENaC enthaltenden Vesikel durch das fehlende Degradierungssignal zur Plasmamembran recycelt werden und es dadurch zu einer unkontrollierten Erhöhung der Oberflächenexpression kommt und somit zu einer gesteigerten Na+-Resorption (Shimkets et al. 1997). Die gesteigerte Resorption ist der Auslöser des Liddle Syndroms (Hansson et

16 al. 1995; Tamura et al. 1996). Die Modulation von ENaC durch Aldosteron kann in drei Phasen eingeteilt werden. Die latente Phase in den ersten 45 Minuten, eine frühe Phase 45 Minuten bis 3 Stunden nach Modulation und eine späte Phase, die mehrere Tage anhalten kann und in der ein Anstieg der α-ENaC mRNA festgestellt werden kann (Verrey, 1999). Ein weiteres Protein, das auch durch Aldosteron induzierbar ist und Einfluss auf die ENaC-Expression hat, ist die serum and glucocorticoid-regulated kinase (SGK). Die Aldosteron-induzierte SGK-Expression wird während der latenten Phase erhöht und somit der Einfluss auf ENaC (Alvarez et al. 1999; Chen et al. 1999; Naray-Feyes-Toth und Fejes-Toth 2000). Es ist unwahrscheinlich, dass SGK ENaC direkt phosphoryliert (Alvarez de la Rosa et al. 1999). Wahrscheinlicher ist, dass die mit ENaC interagierenden Proteine, wie Nedd4-2, phosphoryliert werden und dadurch deren Aktivität auf ENaC reguliert wird (Debonneville et al. 2001; Snyder et al. 2002). Weitere regulatorische Mechanismen zur Aktivierung von ENaCs sind PKA, cAMP, PKC, Ca2+ und G-Proteine (Garty et al. 1997). Das G-Protein K-Ras 2A aus der Ras Familie kann durch Aldosteron induziert werden, verringert die Oberflächenexpression von ENaC und erhöht dessen Aktivität (Mastroberardino et al. 1998). GTP bindende Proteine wie K-Ras 2A können durch guanine nucleotide-exchange factors (GEFs) beeinflusst werden (Quilliam et al. 2002). Das cylic nucleotide Ras GEF (CNrasGEF) wurde als Substrat von Nedd4 identifiziert (Pham und Rotin 2001). Wie ENaC enthält CNrasGEF ein PY-Motiv das die Interaktion mit Nedd4 möglich macht. Es wird vermutet, dass CNrasGEF die Verbindung zwischen ENaC und dem ras pathway darstellt. Extrazelluläre Serinprotease, wie Trypsin und die Ser Protease CAP-1-3 (channel-activating protease 1- 3), können die Aktivität von ENaC schon in kleinen Dosen steigern (Vallet et al. 1997; Chraibi et al. 1998) (Abb. 1.3). Dies geschieht durch eine Erhöhung der Offenwahrscheinlichkeit (Garty et al. 1983; Chraibi et al. 1998; Vuagniaux et al. 2002; Andreasen et al. 2002). Trypsin kann des Weiteren über proteolytische Spaltung fast komplett inaktive Kanäle zu konstitutiv aktiven Kanälen transformieren (Caldwell et al. 2004). Der Cl--Transporter CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) verringert, wie die extrazellulären Proteine Nedd4 und Syntaxin1A, die Aktivität von ENaC (Abb. 1.3). Weitere Agonisten, die die Aktivität von ENaCs steigern, sind Gallensäuren. Vier von sechs Gallensäuren aus der Ratten-Galle konnten in geringer Konzentration eine Erhöhung der Aktivität hervorrufen (Wiemuth et al. 2013). Wie schon bei den Degenerinen zeigt sich beim ENaC der Einfluss von interagierenden Proteinen auf die Kanäle der DEG/ENaC Ionenkanal Superfamilie.

17 1.1.4 Acid-sensing ion channels (ASICs)

Die acid-sensing ion channels (ASICs) wurden auf Grund ihrer großen Homologie zu den DEG/ENaC Kanälen entdeckt und kloniert. Es wird beim Menschen zwischen vier verschiedenen ASIC Genen unterschieden (ASIC1-4), wovon ASIC1 und ASIC2 je zwei splice Varianten haben (ASIC1a/b und ASIC2a/b). Der bile acid-sensitve channel (BASIC) wurde bei seiner Entdeckung als BLINaC bezeichnet. Er wird in manchen Datenbanken unter dem Namen ASIC5 geführt, stellt jedoch eine eigene Subfamilie der DEG/ENaC Kanäle dar. Die Expression der ASICs erstreckt sich über das zentrale und periphere Nervensystem, so wird zum Beispiel im Gehirn ASIC1a, ASIC2a und ASIC2b exprimiert. Die höchsten Expressionslevel dieser drei Isoformen sind im Hippocampus, Cerebellum, Neo- und Allocortex, Bulbus olfactorius, Habenulae und im basolateralen Amygdala- Nucleus zu finden (Biagini et al. 2001; Waldmann, Lazdunski et al. 2000). ASIC4 wird ebenfalls in vielen Arealen des Gehirns exprimiert, mit einer besonders starken Expression in der Hypophyse (Gründer et al. 2000, Akopina et al. 2000). Im peripheren Nervensystem konzentriert sich die Expression im Besonderen auf die small-diameter sensory neurons. ASIC3 kommt fast ausschließlich in sensorischen Neuronen vor (Babinski et al. 1999/2000, Chen et al. 1998, Waldmann et al. 1997). ASICs werden durch eine schnelle Erhöhung der extrazellulären Ionenkonzentration aktiviert. Dadurch entsteht ein H+-gesteuerter, depolarisierender Strom, der ausreicht um Aktionspotentiale auszulösen (Varming 1999, Ferreira et al. 1999). Dabei zeigen homomere Kanäle aus ASIC1a und ASIC3 die höchste Sensitivität für Protonen, aktivieren schon bei einem pH unter ~6,9 und sind maximal aktiviert bei einem pH von ~6.0 (Babini et al. 2002; Sutherland et al. 2001; Waldmann et al. 1997a/b). Physiologisch spielen ASICs vermutlich eine Rolle bei der durch Azidose ausgelösten Schmerzwahrnehmung, bei Angstreaktionen, Lernen, der Neurodegeneration bei ischämischen Schlaganfällen und neurodegenerativen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (Reeh und Steen 1996; Waldmann et al. 1997/1998; Noël et al. 2010; Sluka et al. 2009; Chu und Xiong, 2012; Gründer und Chen, 2010). In Säugetieren können die Untereinheiten ASIC1a, ASIC1b, ASIC2a und ASIC3 funktionelle homotrimere Kanäle bilden (Bassilana et al. 1997; Bässler et al. 2001; Chen et al. 1998; Waldmann et al. 1997a/b; Bartoi et al. 2014; Carnally et al. 2008; Gonzales et al. 2009; Jasti et al. 2007). Die gleichen vier Untereinheiten und zusätzlich ASIC2b bilden jedoch auch heterotrimere Kanäle (Hesselager et al. 2004). In den Neuronen des

18 zentralen Nervensystems kommen ASIC1a Homomere oder Heteromere aus ASIC1a/2a und ASIC1a/2b mit flexibler Stöchiometrie vor (Askwith et al. 2004; Baron et al. 2002; Vukicevic und Kellenberger 2004; Wu et al. 2004; Sherwood et al. 2011; Bartoi et al. 2014). ASICs sind permeabel für Na+ und Li+ und das Na+/K+-Selektivitätsverhältnis liegt bei ≤10. Im Gegensatz zu den ENaCs zeigen manche ASICs, wie ASIC1a, eine geringe Permeabilität für Ca2+ (Bässler et al. 2001). Extrazelluläre, divalente Kationen wie Ca2+ und Mg2+ haben einen ausschlaggebenden Einfluss auf das gating von ASIC1a und ASIC3 (Babini et al. 2002; Immke und McCleskey 2001, 2003). Bei einer niedrigen extrazellulären Ca2+-Konzentration erhöht sich die Affinität, bei einer hohen Ca2+-Konzentration verringert sich entsprechend die Affinität (Babini et al. 2002; Immke und McCleskey 2001). ASICs können durch verschiedene Moleküle moduliert werden. Amilorid und nicht steroidale anti-inflammatorische Wirkstoffe wie Diarylamidine haben einen inhibierenden Effekt auf die ASIC Aktivität (Voilley et al. 2001). Die Inhibierung der ASICs kann mit einem direkten analgetischen Effekt in Verbindung gebracht werden (Ferreira et al. 1999).

1.1.4.1 Interaktionspartner von ASIC

Es gibt eine Vielzahl von beschriebenen, modulierenden Proteinen, die Einfluss auf die elektrophysiologischen Eigenschaften oder die Oberflächenexpression haben. So kann Stomatin und das Stomatin-like protein 3 (SLP3) mit ASIC1a, 2a und 3 interagieren. Durch die Interaktion wird die Desensitisierung von ASIC2a beschleunigt und die Aktivität von ASIC3 stark verringert. SLP3 kann des Weiteren den Strom von ASIC2a reduzieren ohne die Oberflächenexpression zu verändern (Price et al. 2004; Wetzel et al. 2007; Lapatsina et al. 2012). PICK1 (Protein-interacting with C-kinase) erhöht die Oberflächenexpression von ASIC1a und interagiert als scaffolding Protein mit der PDZ-Domäne von ASIC1a und ASIC2 (Duggan et al. 2002; Hruska-Hageman et al. 2002). Die Interaktion zwischen PICK1 und ASIC1a wird durch Proteinkinase A (PKA) und C (PKC) reguliert (Baron et al. 2002; Leonard et al. 2003; Hu et al. 2010). Die Kinasen können ASIC1a an der KRXS- Sequenz des C-Terminus phosphorylieren, wodurch PICK1 nicht mehr an ASIC1a binden kann. Viele weitere modulierende Proteine interagieren mit ASICs über die PDZ Domäne. Dazu gehören CIPP (channel-interacting PDZ domain protein), NHERF1 und 2 (Na+/H+ exchange regulatory factor) und PSD-95 (Postsynaptic density protein 95). ASIC3 interagiert mit CIPP und erhöht die Anzahl der funktionellen Kanäle an der Oberfläche und

19 damit die Stromdichte (Anzai et al. 2002). NHERF1 und 2 interagieren wie CIPP mit ASIC3 (Deval et al. 2006). NHERF1 erhöht die Oberflächenexpression, die maximale Amplitude und den sustained-Strom von ASIC3. Dieser Effekt kann durch eine Phosphorylierung durch PKC von Serin 523 potenziert werden (Deval et al. 2006). PSD-95 interagiert mit ASIC2a und ASIC3 (Zha et al. 2009; Hruska-Hageman et al. 2004). Die Interaktion von PSD-95 mit ASIC3 konnte in lipid rafts nachgewiesen werden. Dort reduziert es die Oberflächenexpression von ASIC3 und dessen Stromamplitude (Hruska-Hageman et al. 2004; Eshcol et al. 2008). In Schnitten aus dem Hippocampus konnte gezeigt werden, dass PSD-95 Einfluss auf die Expression von ASIC2a in den Synapsen hat und damit auch auf das ASIC1a Level und Azidose bedingte Ca2+-Antworten in dendritischen spines (Zha et al. 2009). ASIC3 interagiert des Weiteren mit Lin-7b, was die Oberflächenexpression und die Stromamplitude vergrößert (Hruska-Hageman et al. 2004). Ein weiteres Protein welches das trafficking moduliert ist Annexin II light chain/p11. Es bildet zusammen mit Annexin II einen Komplex und erhöht die Oberflächenexpression von ASIC1a und damit die Stromdichte ohne die anderen Eigenschaften des Kanals zu verändern (Svenningsson und Greengard 2007; Donier et al. 2005). Es ist beschrieben, dass verschiedene Chaperone Einfluss auf die Oberflächenexpression von ASIC haben können. So interagieren Hsp90 und Grp4 mit ASIC1a, Hsp70 mit ASIC2a und Grp78 und Calnexin sowohl mit ASIC1a, als auch mit ASIC2a (Vila-Carriles et al. 2007). ASIC1a und α-Actinin interagieren über das C-terminale LDDVK Motiv miteinander. Die pH-Sensitivität und die allgemeine Stromdichte steigt. Des Weiteren sind die Kanäle kürzer desensitisiert (Schnizler et al. 2009). AKAP150 ist ein Protein welches für die Verankerung von PKA in Synapsen verantwortlich ist. Es kolokalisiert mit ASIC1a und ASIC2a und erhöht deren Leitfähigkeit. Der Einfluss von AKAP150 auf ASICs wird vermutlich durch PKA vermittelt (Chai et al. 2007) Wie auch bei den Degenerinen und den ENaCs zeigt sich bei den ASICs die vielfältige Art und Weise wie die Kanäle durch interagierende Proteine beeinflusst werden können. Eine Identifikation interagierender Proteine für die anderen Mitglieder der DEG/ENaC Ionenkanalfamilie ist somit von großem Interesse.

20 1.1.5 Bile Acid-sensitive Ion Channels (BASICs) / Brain liver intestine Na + Channels (BLINaCs)

Es sind neun Gene im humanen Genom bekannt, welche für die DEG/ENaC Kanäle kodieren (Kellenberger und Schild 2002). ACCN1-4 kodieren für die acht bekannten ASIC splice Varianten und SCNNA-D für die α-, β-, γ- und δ-Untereinheit von ENaC. Das neunte Gen, ACCN5 codiert für BASIC. Wegen seiner nahen Verwandtschaft zu den ASICs wird BASIC auch als ASIC5 geführt (Abb.1.4).

Abbildung 1.4: Schematische Darstellung der Verwandtschaft zwischen BASIC, ASIC und ENaC. Die Länge der einzelnen Zweige im Stammbaum entspricht ungefähr der evolutionären Entfernung der Kanalfamilien. (Abbilung modifiziert nach Wiemuth, Assman, Günder 2014) Die Funktion ist jedoch bis dato unbekannt. Die phylogenetische Verwandtschaft dieser drei DEG/ENaC Unterfamilien ist im Menschen als auch in den Nagetieren eng. BASIC ist zu 30% homolog zu den ASICs und ~20% homolog zu den ENaC Untereinheiten (Sakai et al. 1999). Trotz der Verwandtschaft zu den ASICs konnte keine Aktivierung durch Protonen nachgewiesen werden und daher wurde der Kanal ursprünglich nach seinem Expressionsmuster benannt (Sakai et al. 1999). Die Expression der mRNA konnte sowohl in neuronalem als auch nicht neuronalem Gewebe nachgewiesen werden. So wird BASIC vermehrt im Gehirn, der Leber und dem Darm exprimiert, in geringeren Maße jedoch auch in Niere, Lunge, Herz und Thymus (Sakai et al. 1999). Daher wurde der Kanal als brain liver intestine Na+ channels (BLINaCs) bezeichnet. Der mBASIC (Maus) wird darüber hinaus auch in den Testes exprimiert (Sakai et al. 1999). Des Weiteren konnte vor kurzem eine distinkte Expression in den unipolaren brush Zellen des Vestibulocerebellum der Maus gezeigt werden (Boiko et al. 2014). Das human Homolog des BASIC wird nur im Dünndarm exprimiert und wurde daher auch intestine Na+ channel (hINaC) genannt. BASIC wird in Maus und Ratte in den Cholangiocyten der Gallengänge in der Leber

21 exprimiert (Wiemuth et al. 2012). Aufgrund seiner Sensitivität und Aktivierbarkeit durch Gallensäuren wurde BLINaC in bile acid-sensitive ion channel (BASIC) umbenannt (Wiemuth et al. 2012). Erste elektrophysiologische Messungen wurden an einer Mutante des rBASIC mit gain-of- function Mutation in der deg-Postion (A443) in der extrazellulären Domäne kurz vor der zweiten Transmembrandomäne durchgeführt (Sakai et al. 1999). Diese Messungen zeigten die Fähigkeit von BASIC einen funktionellen homomeren Ionenkanal zu bilden. Auch wenn m- und rBASIC zu 97% homolog sind, unterscheiden sie sich jedoch in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften. Es konnte gezeigt werden, dass r- und hBASIC in Ruhe geschlossen sind, mBASIC jedoch konstitutiv offen ist (Wiemuth und Gründer 2011). Sowohl rBASIC als auch hBASIC werden durch physiologische Konzentrationen extrazellulärer divalenter Kationen blockiert. Eine Wegnahme divalenter Kationen resultiert in einer erhöhten Aktivität und der Steigerung der Selektivität für Na+ und K+ (Wiemuth und Gründer 2010; Lefèvre et al. 2013; Wiemuth et al. 2013). Die Affinitäten von rBASIC für Ca2+ und Mg2+ liegen bei 13 und 79 µM und für hBASIC bei je 18 und 51 µM (Wiemuth und Gründer 2010; Lefèvre et al. 2013; Wiemuth et al. 2013). mBASIC weist eine beinahe 250-fach geringere Affinität für Ca2+ auf, was auch den konstitutiv offenen Zustand erklärt. rBASIC und hBASIC sind unselektiv für Na+ und K+ Kationen, mBASIC ist selektiv für Na+ (Wiemuth und Gründer 2010). Das Diuretikum Amilorid ist ein Inhibitor, der auf alle DEG/ENaC Kanäle wirkt (Kellenberger und Schild, 2002). Die Wirkung auf die verschiedenen BASICs unterscheidet sich jedoch stark. Während r- und hBASIC im geschlossenen Zustand selbst durch millimolare Konzentrationen Amilorid kaum inhibiert werden können, reichen schon geringe mikromolare Konzentrationen um mBASIC zu inhibieren (Sakai et al. 1999; Schaefer et al. 2000; Wiemuth und Gründer 2010). Die Unterschiede in der Physiologie und Pharmakologie von mBASIC zu rBASIC lassen sich auf eine einzelne Aminosäure zurückführen. In der Ratte befindet sich an Position 387 der extrazellulären Domäne ein Alanin, wohingegen in der Maus ein Serin an gleicher Position ist (Wiemuth und Gründer 2010). Wird diese Aminosäure im rBASIC ausgetauscht, wird aus einem fast komplett inaktiven unselektiven Kanal ein konstitutiv offener, Na+-selektiver Kanal (Wiemuth und Gründer 2010). Die Diarylamidine Diminazen und Nafamostat inhibieren im Gegensatz zu Amilorid sowohl m- als auch rBASIC und hBASIC in gleicher Weise (Wiemuth und Gründer 2011). Die Inhibitoren wirken vermutlich als Porenblocker, da sie zum einen spannungsabhängig sind und zum anderen kompetitiv um die Bindungsstelle mit Amilorid

22 konkurrieren (Wiemuth und Gründer 2011). Da ENaC nicht durch Diminazen geblockt werden kann, stellt es ein Werkzeug dar, um zwischen ENaC und BASIC unterscheiden zu können. Ein weiterer kürzlich entdeckter Inhibitor ist 4-Aminopyridin (4-AP), welcher auch

+ ein Inhibitor für Kv (voltage-dependent K channel) ist (Boiko et al. 2013). Einige der wenigen Aktivatoren für rBASIC sind Fenamate wie Flufenaminsäure (FFA). Diese aktivieren rBASIC nicht nur, sondern erhöhen auch dessen Na+-Selektivität. BASIC wird in den Gallengängen der Leber exprimiert, daher wurde Galle als möglicher Aktivator getestet. Es konnte gezeigt werden, dass Gallensäuren als möglicher Ligand für BASIC fungieren (Wiemuth et al. 2012). Der rBASIC wird robust durch Hyodeoxycholsäure

(HDCA) (EC50 2,1 mM), Chenodeoxycholsäure (CDCA) und Ursodeoxycholsäure (UDCA)

(EC50 2,5 mM) aktiviert (Wiemuth et al. 2012). Interessanterweise haben HDCA und CDCA einen potenzierenden Effekt auf die BASIC-Antwort, wenn sie gleichzeitig wirken. HDCA ist eine hydrophile Gallensäure und CDCA eine hydrophobe Gallensäure. Eine geringere Aktivierung erfolgt durch β-Muricholsäure (β-MCA) oder Cholsäure (CA), welche aber durch Koapplikation mit anderen Gallensäuren wie HDCA potenziert werden kann (Wiemuth et al. 2012). Der humane BASIC kann durch HDCA nur gering aktiviert werden, jedoch zeigen CDCA und Deoxycholsäure (DCA) einen großen Effekt auf hBASIC (Lefèvre et al. 2013; Wiemuth et al. 2012). Da HDCA nicht in humaner Galle vorkommt und CDCA und DCA einen großen Anteil der Galle ausmachen, liegt die Vermutung nahe, dass sich BASIC an die Gallenzusammensetzung der verschiedenen Spezies adaptiert hat (Lefèvre et al. 2013; Wiemuth et al. 2013). BASIC könnte direkt durch Gallensäuren in Sinne einer Ligandenbindung aktiviert werden. Der genaue Mechanismus ist jedoch bis jetzt unbekannt. Eine weitere Möglichkeit der Aktivierung könnte indirekt sein: Gallensäuren als amphiphile Moleküle könnten in oder an die Plasmamembran adsorbieren und somit Struktur, Elastizität und Zusammensetzung der Membran verändern. Diese Veränderung könnte zur Aktivierung von BASIC führen (Wiemuth et al. 2013; Schmidt et al. 2014). Es konnte gezeigt werden, dass Substanzen wie Trinitrophenol (TNP) und Chlorpromazin (CPZ), die eine Veränderungen der Plasmamembran hervorrufen, Einfluss auf die Aktivierung von rBASIC durch UDCA haben (Schmidt et al. 2014). So verringern 0,5 mM CPZ die Antwort von rBASIC auf 2 mM UDCA um die Hälfte und TNP steigert die Antwort von rBASIC auf 2 mM UDCA in Dosis-abhängiger Weise (Schmidt et al. 2014). Des Weiteren konnten Detergenzien, ohne direkte strukturelle Verwandtschaft zu Gallensäuren, rBASIC aktivieren. So konnten SDS, L-Lauroylsarcosin und Triton-X 100 in

23 größeren mikromolaren Konzentrationen in rBASIC-injizierten Oozyten einen Strom erzeugen, welcher in ASIC oder HyNaC injizierten Oozyten ausblieb (Schmidt et al. 2014). Interessanterweise konnte ein ähnlicher Effekt auch für den konstitutiv offenen mBASIC nachgewiesen werden. So vergrößerten sich dessen Ströme je nach Substanz um das 1,2- bis 1,5-Fache des normalen Stroms (Schmidt et al. 2014). Es konnte bisher keine Bindestelle für Gallensalze an BASIC entdeckt werden, jedoch konnte gezeigt werden, dass sowohl der extrazelluläre Loop als auch die Transmembrandomänen für die Aktivierung von BASIC durch Gallensalze wichtig sind (Schmidt et al. 2014). Aus den elektrophysiologischen Untersuchungen von BASIC ergibt sich, dass sowohl die Wegnahme von divalenten Kationen als auch die Aktivierung mit Gallensäuren den geschlossenen Zustand von BASIC destabilisieren (Lefèvre et al. 2013).

1.2 Cholangiocyten

Die Leber ist eines der zentralen Organe im Stoffwechsel des Körpers. Neben der Produktion von Proteinen und der Verwertung von Nahrungsbestandteilen ist die Gallenproduktion eine wichtige Aufgabe der Leber. Die Galle wird über die Gallengänge zum Darm transportiert. Die Gallengänge beschreiben ein dreidimensionales Netzwerk aus tubulären Gängen verschiedener Größen und Eigenschaften. Dabei lassen sich diese in intra- und extrahepatische Gallengänge unterteilen. Die Nomenklatur der einzelnen Abschnitte der Gallengänge bezieht sich im Menschen auf die Größe und die Nähe zur Leber (Lemaigre, 2009; Raynaud et al. 2009; Si-Tayeb et al. 2010; Strazzabosco und Fabris, 2008). Den Beginn der Gallenwege bilden die Canaliculi biliferi oder Gallenkapillare. Diese werden sowohl durch Hepatocyten, als auch durch Cholangiocyten ausgekleidet und durch Zonulae occludens abgedichtet. Die Gallenkapillaren vereinigen sich dann zum Ductus biliferus, dem Gallengang. Der Gallengang bildet zusammen mit Arteria hepatica und der Vena portae das Glisson-Trias (Trias hepatica). Bei Nagetieren wird lediglich zwischen kleinen (<15 µM Durchmesser) und großen Gallengängen (>15 µM) unterschieden. Diese werden in den kleinen Gallengängen durch 4-5 Cholangiocyten und in großen Gallengängen durch 8-15 Cholangiocyten ausgekleidet (Alpini et al. 1996; Alipini et al. 1997; Benedetti et al. 1996; Glaser et al. 2009; Kanno et al. 2000; Ludwig, 1987). Die Vorläuferzellen der Cholangiocyten des intrahepatischen Gallengangs sind Hepatoblasten, die auch die Vorläuferzellen für Hepatocyten darstellen (Vestentoft et al. 2011). Die Vorläuferzellen der Cholangiocyten des extrahepatischen

24 Gallengangs entwickeln sich aus dem Endoderm, wie auch die Pankreas-Zellen und das Duodenum (Lemaigre, 2009; Raynaud et al. 2009). Cholangiocyten können sich in ihrer Größe und Morphologie unterscheiden. Sie können einen Durchmesser von 6-15 µM haben und sowohl als flache, kubische, oder „säulenartige“ Zellen vorkommen (Alpini et al. 1996; Alipini et al. 1997; Benedetti et al. 1996; Ishii et al. 1989; Kanno et al. 2000; Sasaki et al. 1967; Schaffner und Popper, 1961). Je größer der Gallengang-Durchmesser wird, desto größer werden auch die Cholangiocyten die ihn auskleiden (Baiocchi et al. 1999). Cholangiocyten sind polarisierte Zellen mit einer apikalen (luminalen) und einer basolateralen Membran. Sie sind lateral untereinander durch tight junctions (zonulae occludens) nahe der apikalen Membran verbunden (Ishii et al. 1989; Vroman und LaRusso, 1996). Diese Verbindungen gewährleisten die Entstehung und das Beibehalten des polarisierten Epithels. Des Weiteren sind angrenzende Zellen über gap junctions miteinander verbunden und erlauben eine direkte zytoplasmatische Kommunikation (Bode et al. 2002). Auf der apikalen Oberfläche befinden sich Mikrovilli welche die Oberfläche um ein vielfaches vergrößern und ein primäres Cilium (Alpini et al. 1989; Banales et al. 2008; Huang et al. 2006; Ishii et al. 1989; Ludwig et al. 1998; Masyuk AI et al. 2008/1; Masyuk AI et al. 2008/2; Masyuk AI et al. 2006; Masyuk TV et al. 2003; Vroman und LaRusso 1996). In der immortalisierten Zelllinie aus Ratten-Cholangiocyten, die als normal rat cholangiocytes (NRCs) bezeichnet wird, bildet sich das Cilium drei Tage post Konfluenz, wächst dann bis zum zehnten Tag und erreicht dann seine volle Funktionalität (Huang et al. 2006). Einen fundamental wichtigen Einfluss auf die strukturelle und funktionelle Integrität hat das Aktin-Zytoskelett. Durch dieses wird die Zellpolarität, das Vesikel trafficking und die Membranprotein-Verteilung reguliert (Doctor et al. 2002; Doctor und Fouassier 2002). Cholangiocyten haben ein prominenten Golgi-Apparat nahe der apikalen Plasmamembran, ein unauffälliges und spärliches Endoplasmatisches Reticulum, kleine perinucleäre Mitochondrien und einen basal lokalisierten Zellkern (Benedetti et al. 1996; Ishii et al. 1989; Marzioni et al. 2002).

25 1.2.1 Physiologie von Cholangiocyten

Die Gallensekretion ist physiologisch eine Reaktion der Leber auf eine Mahlzeit. Im duodenalen Lumen führen ein saurer pH und verschiedene Peptide postprandial zur Stimulation von S-Zellen im Duodenum und Jejenum, welche ihrerseits Secretin in den Kreislauf der Portalvene abgeben. Secretin reguliert ein Reihe physiologischer Funktionen,

- dazu gehört auch die Sekretion von HCO3 -reicher Galle (Boyer, 2003; Kanno et al. 2001; Strazzabosco und Fabris, 2008). Die Sekretion wird ausgelöst durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration und dadurch kommt es zu einem Cl--Efflux. Der elektrochemische Gradient des Cl- wird

- dazu genutzt, durch einen Antiporter HCO3 zu sekretieren. Durch den osmotischen

- Gradienten, der durch das extrazelluläre HCO3 entsteht, strömt Wasser aus dem Epithel in das Lumen der Gallengänge und der Gallenfluss erhöht sich (Abb. 1.5). Secretin-Rezeptoren kommen ausschließlich an der basolateralen Membran der

Cholangiocyten vor (Alpini et al. 1994; Farouk et al. 1993; Farouk et al. 1992). Die Gαs Untereinheit des an den Secretin-Rezeptoren gekoppelten G-Proteins kann nach Aktivierung durch Secretin die Adenylat-cyclasen (AC) 8 und 9 aktivieren (Strazzabosco et al. 2009). Diese kann cyclisches Adenosin 3',5'-monophosphat (cAMP) synthetisieren. Die cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA) Phosphorylierung des cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) resultiert in einem Efflux intrazellulärer Cl--Ionen in das Lumen der Gallengänge (Boyer, 2003; Tabibian et al. 2013) (Abb. 1.5). Unter basalen Bedingungen ist der Cl- Transport über die apikale Membran der Cholangiocyten gering, kann jedoch durch cAMP um ein 20- bis 40-faches erhöht werden (Fitz et al. 1993; McGill et al. 1994). Cholangiocyten besitzen mehrere Proteine und

- Mechanismen um die HCO3 -Homöostase zu wahren (Spirli et al. 1998). Eines dieser

+ - - Proteine ist der Na -unabhängige Cl /HCO3 Antiporter (SLC4A2/AE2). Steigt die

- - Extrazelluläre Cl -Konzentration durch Aktivierung von CFTR, so wird infolgedessen HCO3 durch den an der apikalen Membran liegenden SLC4A2 entgegen und abhängig vom Cl--Gradienten sekretiert (Alper, 2006; Banales et al. 2006/1; Banales et al. 2006/2; Lecchi et al. 2010; Martinez-Anso et al. 1994; Spirli et al. 1998; Strazzabosco et al. 1997). Durch

- das extrazelluläre HCO3 entsteht ein osmotischer Gradient, der dazu führt, dass Wasser über Aquaporine (AQPs) in das Lumen der Gallengänge fließt (Masyuk AI und LaRusso, 2006; Masyuk et al. 2002) (Abb. 1.5). Mit dem einströmenden Wasser wird auch der

- Gallenfluss erhöht. Zusätzlich wird durch das extrazelluläre Hydrogencarbonat der HCO3 -

26 umbrella ausgebildet, der ein schützendes alkalisches Milieu an der luminalen Seite der apikalen Membran bildet (Hohenester et al. 2011). Dadurch kann unter anderem verhindert werden, dass protonierte, Glycin-konjugierte Gallensäuren unkontrolliert durch die Membran diffundieren können (Amelsberg et al. 1196; Beuers et al. 2010). Die Secretin-induzierte Sekretion wird durch die Protein-Phosphatasen 1 und 2A inaktiviert, welche die regulatorische Domäne des CFTR dephosphorylieren und den CFTR deaktivieren können (Alvaro et al. 1997).

- Um die intrazelluläre HCO3 -Konzentration aufrecht zu erhalten und dem apikalen Efflux

+ - - entgegen zu wirken, verfügen Cholangiocyten über Na -abhängige Cl /HCO3 Antiporter (NCHE) an der basolateralen Membran (Tabibian et al. 2013). Einen weiteren

- + Mechanismus bilden die Carboanhydrase II, welche HCO3 und H aus CO2 und H2O synthetisiert, und der Na+/H+ Antiporter (NHE1/SLC9A1) um die intrazelluläre

- HCO3 -Konzentration beizubehalten (Kivela et al. 2005; Spirli et al. 1998; Ueno et al. 1998). Die Sekretion von Galle kann jedoch auch über andere Mechanismen induziert werden. Einer davon beginnt mit der Stimulation von basolateralen M3 muscarinischen Rezeptoren durch Acetylcholin (Abb. 1.5). Dabei aktiviert die an dem M3 Rezeptor gekoppelte Gα q

Untereinheit die Phospholipase C (PLC) welche daraufhin PIP2 in IP3 und DAG verstoffwechselt. Die lokale Erhöhung von IP3 wiederum führt zur Aktivierung der am endoplasmatischen Reticulum befindlichen IP3-Rezeptoren (IP3R I/II). Dadurch kommt es zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und zur Aktivierung von Ca2+-

- - - aktivierten Cl -Kanälen. Der Cl -Efflux und der über AE2 damit verbundene HCO3 -Efflux führen, wie bei dem durch Secretin ausgelösten Mechanismus, zum osmotisch getriebenen Efflux von H2O in das Lumen der Gallengänge (Tabibian et al. 2013; Minagawa et al. 2007) (Abb 1.4). Die molekulare Identität der Ca2+-aktivierten Cl--Kanälen ist weitestgehend unbekannt (Dutta et al. 2008; Fitz, 2004; Woo et al. 2008; Woo et al. 2010). Es konnte jedoch transmembrane member 16A (TMEM16A)/ Anoctamine 1 (ANO1) identifiziert werden, der durch intrazelluläres Ca2+ einen Cl--Strom aktiviert (Dutta et al. 2012). Wie die beiden Hauptmechanismen der Sekretion zeigen, sind für die Reaktion auf intra- und extrazelluläre Stimuli maßgeblich das cAMP und Ca2+ signaling verantwortlich. ATP spielt in beiden Signalwegen eine wichtige Rolle als auto- und parakrines Signalmolekül. In den Cholangiocyten von Nagetieren konnten sechs der acht Säuger P2Y

Rezeptoren nachgewiesen werden (P2Y1,P2Y2,P2Y4,P2Y6,P2Y12,P2Y13 und ein Homolog

27 zum humanen P2Y11 ausschließlich in Ratten Cholangiocyten) (Dranoff et al. 2001; Masyuk AI et al. 2008/1; Salter et al. 2000; Schlenker et al. 1997; Yu et al. 2009). Die identifizierten Rezeptoren können in zwei Untergruppen unterteilt werden. P2Y1, P2Y2,

2+ P2Y4, P2Y6, P2Y11 sind Gαq gekoppelt, aktivieren somit die PLC und sorgen für eine Ca

Freisetzung aus IP3-sensitiven intrazellulären Speichern (Abbracchio et al. 2006;

Burnstock, 2007). P2Y11 ist des weiteren Gαs gekoppelt, aktiviert die AC und führt dadurch zu einem cAMP anstieg (Abbracchio et al. 2006; von Kügelgen, 2006). Die andere

Untergruppe bilden P2Y12, P2Y13 welche Gαi gekoppelt sind und zu einer Inhibierung der AC und somit zu einer verringerten cAMP-Konzentration führen (Abbracchio et al. 2006; Burnstock et al. 2010; Leipziger, 2003; Schwiebert und Zsembery, 2003; von Kügelgen,

2006). Cholangiocyten exprimieren die drei bekannten Isoformen des IP3R (Typ I, II, III) wobei IP3R Typ III die vorrangige Isoform ist (Hirata et al. 2002; Shibao et al. 2003).

+ 2+ Auf der Seite der purinergen Na -Kanäle mit Ca -Permeabilität konnten P2X2, P2X3, P2X4,

P2X7 in normal rat cholangiocytes (NRCs) nachgewiesen werden, wobei P2X4 die vorrangige Isoform ist (Doctor et al. 2005; Dranoff et al. 2001). Weitere Ca2+-Kanäle in Cholangiocyten sind polycystin-2 (PC-2), der mit polycystin-1 (PC- 1) und anderen Proteinen im primären Cilium einen mechanosensitiven Komplex bildet (Huang et al. 2006; Nauli et al. 2003), und transient receptor potential cation channel subfamiliy V member 4 (TRPV4), der im Cilium als Osmorezeptor dient (Gradilone et al. 2007; Gradilone et al. 2010; Masyuk et al. 2008/1). In Studien der letzten Zeit wurde die primäre Rolle von CFTR als Hauptmechanismus für die cAMP regulierte Cl--Sekretion in Frage gestellt. Es wird angenommen das CFTR eher einen regulierenden Einfluss auf die durch Ca2+ aktivierten Cl--Kanäle hat (Fiorotto et al. 2007; Minagawa et al. 2007). In diesem Model reguliert CFTR die ATP Ausschüttung in das Lumen der Gallengänge durch einen noch nicht vollständig geklärten Mechanismus. Die Exocytose von ATP-enthaltenden Vesikeln oder andere Mechanismen der ATP Freisetzung werden hierbei in Betracht gezogen (Fitz et al. 2007). Die Vesikel Exocytose kann durch die Scherkräfte des Gallenfluss ausgelöst werden (Woo et al. 2008). In Folge dessen werden apikale P2 Rezeptoren aktiviert die wiederum zu einer Ca2+ Erhöhung und einem Ca2+ aktivierten Cl--Efflux führen. Ein weiterer Kanal der Einfluss auf den Cl--Efflux hat ist der Ca2+ activated small conductance K+ Kanal (SK2) (Dutta et al. 2009; Masyuk et al. 2006). Dieser wird durch einen geringen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert und hyperpolarisiert die Membran. Dadurch steigt der elektrische Gradient und ermöglicht einen

28 kontinuierlichen Cl--Strom (Dutta et al. 2009; Feranchak et al. 2004). Neben der Gallensekretion verfügen Cholangiocyten über eine Reihe an Mechanismen zur Absorption von Ionen, Gallensäuren und anderen Molekülen, um so die Galle zu modifizieren. Der Na+/H+ Antiporter (NHE3/SLC9A3) konnte mit der Flüssigkeitsabsorption aus dem Lumen der Gallengänge und der Inhibition der Sekretion in Verbindung gebracht werden (Mennone et al. 2001). Es wird angenommen, dass NHE3/SLC9A3 über Protein-Protein Interaktionen die CFTR Aktivität regulieren kann (Mennone et al. 2001). Ein kleiner Anteil der unkonjugierten Gallensäuren, welche von den Hepatocyten sekretiert werden, werden in den Gallengängen protoniert und könnte passiv durch die apikale Plasmamembran der Cholangiocyten diffundieren (Hofman, 2009; Masyuk et al. 2006). Konjugierte Gallensäuren hingegen müssen aktiv über die Membran transportiert werden. An der apikalen Membran befindet sich der Na+-abhängige Gallensäure Transporter (ASBT/SLC10A2), welcher in einem Verhältnis von 2:1 Gallensäuren und Na+ in das Zellinnere transportiert. Dieser ist nur schwach exprimiert und spielt daher eher eine geringe Rolle im Transport von Gallensäuren (Dawson et al. 2006; Dawson et al. 2009). Um eine zytotoxische Akkumulation von Gallensäuren in den Cholangiocyten zu vermeiden, gibt es an der basolateralen Membran eine durch alternatives splicen trunkierte Form des ASBT/SLC10A2 (t-ASBT), die einen Efflux von Gallensäuren begünstigt (Lazaridis et al. 2000). Der Transport von Glukose aus der Galle zurück in den Blutkreislauf wird über den Na+-abhängigen Glukose Kotransporter (SGLT1) auf der apikalen Seite und den solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 (GLUT1) an der basolateralen Membran vermittelt (Brown, 2000; Wright et al. 2007). Die Absorption von Glukose aus der Galle stellt zum einen eine Möglichkeit dar, die chemische Zusammensetzung zu beeinflussen, zum anderen entsteht ein osmotischer Gradient um Wasser aus der Galle in die Zellen zu resorbieren (Guzelian und Boyer, 1974; Lira et al. 1992; Masyuk AI et al. 2002). Die Modifikation der Galle durch Sekretion und Absorption ist durch die Aktivierung oder Inhibierung des intrazellulären cAMP- und Ca2+-Signalwegs durch extrazelluläre Faktoren reguliert. Das zuvor erwähnte Secretin gehört zu den regulatorischen Faktoren welche die basale Sekretion regulieren. Bombesin, auch bekannt als gastrin-releasing peptide, ist ein weiteres Neurotransmitter-Peptid, dass die Sekretion der Galle direkt beeinflusst, dabei aber cAMP-, cGMP-, Ca2+-unabhängig ist (Cho et al. 1997; Cho et al. 1998; Cho und Boyer, 1999). Die Bombesin-abhängige Sekretion wird durch eine Erhöhung der

29 SLC4A4/AE2 Aktivität und durch Aktivierung apikaler Cl--Kanäle stimuliert, durch den Na+-

- + HCO3 Kotransporter (SLC4A4/Nbc1) (Uriarte et al. 2010) und K Kanäle an der basolateralen Membran verringert (Cho und Boyer, 1999; Glad et al. 1994). Corticosteroide wie Dexamethason und Budesonid erhöhen die Sekretion über die Regulation des apikalen SLC4A4/AE2 und des basolateralen NHE1 (Alvaro et al. 2002). Es gibt eine weitere Klasse an Faktoren, welche die Sekretion nicht selbst induzieren aber die Secretin-stimulierte Sekretion potenzieren können. Acetylcholin hat einen solchen potenzierenden Einfluss auf die Sekretion. Es wird angenommen, dass die durch Acetylcholin ausgelöste Ca2+ Erhöhung Ca2+-sensitive AC Isoformen aktiviert und diese die cAMP-Konzentration weiter erhöhen (Alvaro et al. 1997). Es konnten des Weiteren adrenerge Agonisten als potenzierende Faktoren identifiziert werden. Cholangiocyten exprimieren α1-, α2-, β1-, β2-, α2A-, α2B-, α2c-Adrenorezeptoren (Barbaro et al. 2004; Kanno et al. 2002; LeSage et al. 2004). Die Aktivierung der Adrenorezeptoren durch Phenylephrine führten zu einer Potenzierung der cAMP-Konzentration nach Secretin Stimulation aber hat keinen alleinigen Effekt (LeSage et al. 2004). Neben den Faktoren, die die Sekretion induzieren oder potenzieren gibt es auch solche die die Secretin-stimulierte Sekretion inhibieren. Somatostatin kann sowohl den basalen Gallenfluss als auch die Secretin-stimulierte Sekretion inhibieren (Gong et al. 2003; Ricci und Fevery, 1989; Tietz et al. 1995). Es wirkt dabei basolateral über den Somatostatin Rezeptor 1-4 (sst1-4) und inhibiert das cAMP signaling, die Expression der Secretin

- Rezeptoren, die HCO3 -Sekretion und die Exocytose von Vesikeln an der apikalen Membran (Alpini et al. 1998; Gong et al. 2003; Masyuk et al. 2007; Tietz et al. 1995). Das Peptid Gastrin wirkt über den Cholecystokinin-B/Gastrin Rezeptor und führt zu einer Membrantranslokation und Aktivierung Ca2+-abhängiger PKC α und somit zur Inhibition der Secretin-stimulierten cAMP Synthese (Glaser et al. 1997; Glaser et al. 2000). Dopaminerge Agonisten wie Quinelorane erhöhen über den D2 dopaminergen Rezeptor

2+ die intrazelluläre IP3- und Ca -Konzentration. Das führt auch zur Inhibierung der Secretin- induzierten Sekretion. Durch die Aktivierung der PKC γ und der Inhibierung der PKA Aktivität sinkt die cAMP-Konzentration (Glaser et al. 2003) (Abb. 1.5). Die chemische Zusammensetzung, Osmolarität und Fließgeschwindigkeit der Galle haben ebenfalls einen regulatorischen Effekt auf die Absorption und Sekretion der Cholangiocyten. ATP ist ein wichtiges auto- und parakrines Signalmolekül, das sich sowohl in der Galle befindet und die Cholangiocyten-Sekretion induzieren kann, als auch in Folge der Secretin-stimulierten Sekretion ausgeschüttet werden kann, um diese weiter zu

30 potenzieren. Das Wirken von mechanischen Kräften auf die apikale Membran und das primäre Cilium führen zu mehreren Effekten in Cholangiocyten: so steigt durch den PC-1 und PC-2 Mechanokomplex die intrazelluläre Ca2+-Konzentration und der cAMP Signalweg wird inhibiert (Masyuk et al. 2006). Des Weiteren konnte ein Anstieg des intrazellulären

- - pH-Wertes festgestellt werden welcher mit dem Cl - und HCO3 -Transport zusammenhängt. TRPV4 reagiert bereits auf geringe Veränderungen der Osmolarität der Galle (Gradilone et al. 2007). So aktiviert TRPV4 bei extrazellulärer Hypotonizität und inhibiert bei extrazellulärer Hypertonizität. Die Aktivierung führt zu einem Ca2+ Einstrom in die Cholangiocyten (Everaerts et al. 2010). Cholangiocyten stellen einen komplexes und empfindliches System dar um den Gallenfluss zu regulieren. Das intrazelluläre signaling durch Ca2+ und cAMP kann durch verschiedenste Faktoren reguliert werden und entscheidet über die zelluläre Funktion. Wird diese Regulation gestört kann es zu biliär-assoziierten Erkrankungen kommen.

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der Sekretionsmechanismen in normal rat cholangiocytes (NRCs). Die Sekretion in Cholangiocyten kann durch mehre Mechanismen aktiviert werden: apikal können 2+ durch ATP purinerge Proteine (P2X/P2Y) aktiviert werden, wodurch es zu einem Anstieg der [Ca ]int kommt. Dieser Anstieg kann auch basolateral durch Acetylcholine (ACh) über muscarinische Rezeptoren (M3) oder durch Adrenalin über adrenerge Rezeptoren (α/β) hervorgerufen werden. Durch Ca2+ werden Calcium- aktivierte Chlorid Kanäle (CaCCs) aktiviert wodurch es zu einem Cl--Efflux kommt. Ein entsprechender Cl-- Efflux kann auch basolateral durch Secretin aktiviert werden und dann über CFTR erfolgen. Durch den - - Antiporter AE2 wird Cl gegen HCO3 transportiert. Entlang des dadurch entstehenden Gradienten wird Wasser über Aquaporine (AQP1) aus der Zelle sekretiert. (Eigene Abbildung)

31 1.2.2 Cholangiopathien

Als Cholangiopathien bezeichnet man biliäre chronische, progressiv verlaufende Erkrankungen. Mangels einer effektiven Therapie führen diese meist zu Lebererkrankungen im Endstadium, und erfordern dann zwangsläufig eine Lebertransplantation (Yoon et al. 1986). Die sechs häufigsten Cholangiopathien lassen sich in verschiedene Unterklassen einteilen. Die Cystische Fibrose oder die Polyzystische Lebererkrankung sind genetisch bedingte Erkrankungen. Als idiopathische Erkrankungen gelten die Gallengangatresie, die primär biliäre Zirrhose und die primär sklerosierende Cholangitis. Eine weitere Unterklasse bildet das maligne Cholangiokarzinom. Im weiteren werden die Cholangiopathien behandelt, die im direkten Zusammenhang mit Kanälen oder Transportern in Cholangiocyten stehen. Cholangiocyten sind ein komplexes System, das streng reguliert ist und auf viele unterschiedliche Faktoren reagieren muss. Kommen diese Mechanismen aus dem Gleichgewicht, so können sich daraus Erkrankungen entwickeln (Cardinale et al. 2011; Carpino et al. 2012). Die primäre biliäre Zirrhose wird durch nicht suppressive Inflammationen und die Zerstörung der interlobulären Gallengänge charakterisiert (Boonstra et al. 2012). Auch wenn die primäre biliäre Zirrhose als Autoimmunerkrankung eingestuft wird, ist eine Therapie mit konventionellen Immunsuppressiva nicht möglich (Karlsen et al. 2014). Es ist bekannt,

+ - - dass bei Patienten mit dieser Erkrankung der Na -unabhängige Cl /HCO3 Antiporter (SLC4A2/AE2) eine reduzierte Expression hat. Dies führt zu einer geringeren Bicarbonat-

- Sekretion und der Schutz des HCO3 umbrella gegen die Toxizität der Gallensäuren ist nicht gegeben (Banales et al. 2012). Diese Fehlregulation scheint maßgeblich zur Pathogenese der Erkrankung beizutragen (Hohenester et al. 2012). Die Cystische Fibrose ist eine systemische Erkrankung welche durch eine Mutation des CFTR-Kanals ausgelöst wird. Dabei sind zahlreiche Organe wie die Lunge, die Fortpflanzungsorgane, der Pankreas, der Dünndarm und auch die Leber betroffen. In der Leber sind die Cholangiocyten der einzige Zelltyp, der den CFTR Kanal exprimiert (Boyer et al. 2003). Durch eine Mutation im CFTR Kanal kann es zu einer Änderung des Cl -- und Na+-Transports und zur unkontrollierten Sekretion von Wasser in verschiedene Gewebe kommen. Die genaue Pathogenese von Lebererkrankungen in CF Patienten bleibt bisher ungeklärt. Zu erwähnen ist, dass nur etwa 30% aller CF Patienten eine klinisch signifikante Lebererkrankung entwickeln (Moyer und Balisteri, 2009). Der direkte Zusammenhang zwischen Mutationen des CFTR und der Ausbildung von Lebererkrankungen ist nicht

32 vollends bewiesen (Kobelska-Dubiel, Klincewicz, Cichy, 2014). Die Polyzystische Lebererkrankung ist eine autosomal dominante vererbliche Erkrankung die alleine oder zusammen mit einer polyzystischen Nierenerkrankung auftreten kann. Bei der Erkrankung liegt eine Mutation des PRKCSH oder des Sec63 Gens vor. Beide werden in Cholangiocyten exprimiert und führen zu verändertem Polycystin-1 und 2 (Masyuk et al. 2009). Der Mechanismus der hepatischen Zystogenese beinhaltet benigne Cholangiocyten-Hyperproliferation, abnormalen Flüssigkeitstransport und eine Disregulation des Zellzyklus. Auf molekularer Ebene konnte eine intrazelluläre Erhöhung der cAMP-Konzentration in Cholangiocyten als Schlüsselmechanismus für die Zystenbildung und die Progression identifiziert werden (Banales et al. 2009). Da der direkte Zusammenhang von Secretin und Somatostatin auf die cAMP-Konzentration bekannt ist, wurde Somatostatin als mögliches Therapeutikum in Betracht gezogen (Masyuk et al. 2007). In in vitro und in vivo Studien konnten Somatostatin-Analoga das cAMP-Level in zystischen Cholangiocyten verringern und somit die Zystenexpansion reduzieren (Masyuk et al. 2007). Die Gängige Therapie für die meisten Cholangiopathien ist eine perorale Aufnahme von Ursodeoxycholsäure (10-20 mg/kg pro Tag) obwohl wenige Langzeitstudien verfügbar sind (Lindor et al. 2009 ;EASL Clinical Practice Guidlines 2009). Da für viele Cholangiopathien die Gallensäure UDCA das Mittel der Wahl zur Therapie ist, ist es von besonderem Interesse BASIC in diesem Zusammenhang zu untersuchen. Möglicherweise spielt dieser Gallensäure-aktivierte Kanal eine Rolle bei solchen Erkrankungen

33 1.3 Gallensäuren

Gallensäuren sind amphiphile Moleküle mit einem Steroidkern. Sie werden durch Hydroxilierungsreaktionen und oxidative Verkürzungen in Hepatocyten der Leber aus Cholesterin gebildet (Hofmann 2008/2009). Gallensäuren galten lange als Moleküle, die nur für die Lipidverdauung und die Cholesterinsolubilisierung im Lumen des Dünndarms verantwortlich sind. Im Laufe der letzten Jahre hat sich gezeigt, dass Gallensäuren weitreichende Effekte auf den gesamten Organismus haben. Sie tragen zur Homöostase von Lipiden, Glukose und anderen metabolischen Substraten bei, beeinflussen die Funktion des Immunsystems und regulieren die Zusammensetzung des Microbioms im Darm (Li und Chiang, 2014; Qi et al. 2015; Sipka und Bruckner 2014; Ridlon et al. 2014). Cholsäure (CA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) sind die primären Gallensäuren der Menschlichen Galle die aus Cholesterin hydroxiliert werden und können mit Taurin oder Glycin zu Amiden konjugiert werden (Abb. 1.6) (Fisher und Yousef 1973; Setchell et al. 1997).

Abbildung 1.6: Strukturformeln von Cholesterin und der durch Hydroxylierungen gebildeten Gallensäuren Cholsäure und Chenodeoxycholsäure.

Bei der Lipidverdauung werden die Gallensäuren über die bile salt export pump (BSEP, ABCB11) in den Dünndarm abgegeben wo sie die Lipolyse und die Absorption von Fettsäuren unterstützt. Im Ileum und im proximalen Colon werden über ASBT (ISBT/IBAT/NTCP2) 95% der Gallensäuren wieder absorbiert und über der Portalvene zurück zur Leber zurück geleitet (Modica et al. 2010). Durch die Konjugation der Gallensäuren wird ihre Hydrophilie gesteigert und somit ihre Löslichkeit in der Galle (Sakakura et al. 1993). Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von ENaC und BASIC durch Gallensäuren unabhängig von der Konjugation der Gallensäure ist, sondern von ihrem Cholesteringrundgerüst abhängt (Abb. 1.6) (Wiemuth et al. 2012; Wiemuth et

34 al. 2013). Die Galle setzt sich je nach Spezies aus verschiedenen Gallensäuren zusammen. So besteht die Galle des Schweins zum größten Teil aus Hyodeoxycholsäure (HDCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) (Haslewood, 1971; Qiao et al. 2011). Ratten-Galle hingegen besteht Hauptsächlich aus Cholsäure (CA, 50%), β-Muricholsäure (β-MCA, 23%) und zu geringeren Teilen aus Hyodeoxycholsäure (HDCA), Chenodeoxycholsäure (CDCA), Deoxycholsäure (DCA) (je 2-7%) und Ursodeoxycholsäure (UDCA, 2%) (Sakakura et al. 1993). Die Funktionen der Gallensäuren auf den Organismus werden in der Regel durch die Bindung von Gallensäuren an sowohl zytoplasmatische als auch nukleäre Rezeptoren in verschiedenen Geweben und Organen vermittelt (Zhou und Hylemon, 2014). Zu den nukleären Rezeptoren, an welche Gallensäuren binden können, gehören der Farnesoid X Rezeptor (FXR), der Vitamin D Rezeptor (VDR), der konstitutive androstane Rezeptor (CAR) und der Pregnan X Rezeptor (PXR). Des Weiteren gibt es den transmembrane G protein coupled receptor (TGR5), muscarinische Rezeptoren und den Sphingosine 1- Phosphat Rezeptor 2 (S1PR2), welche alle cytoplasmatische Rezeptoren sind (Vitek und Haluzik, 2016). Der TGR5 ist ein Mitglied der rhodopsin-like Unterfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. TGR5 wird in den Makrophagen der Leber (Kupffer Zellen), dem Dünndarm, der Lunge, dem Peritoneum und in CD14-positiven Monozyten exprimiert (Keitel et al. 2015; Masyuk et al. 2013). Das höchste Level der Expression wird jedoch in den Epithelzellen des Dünndarms und der Gallengänge detektiert. In den Cholangiocyten wird TGR5 in der apikalen Plasmamembran, dem primären Zilium und der inneren und äußeren nukleären Membran exprimiert (Masyuk et al. 2013). Der an der apikalen Membran befindliche TGR5 ist über den cAMP-Signalweg an der Ausbildung des

- HCO3 -umbrella beteiligt (Keitel et al. 2015). Des weiteren hat TGR5 unterschiedliche Einflüsse auf die Proliferation, abhängig davon, ob die Cholangiocyten das primäre Zilium bereits ausgebildet haben. In Cholangiocyten bindet TGR5 vorrangig Gαs-Protein, wenn kein Zilium vorhanden ist und Gαi Protein, wenn das primäre Zilium ausgebildet ist (Masyuk et al. 2013). In Folge dessen wird in Cholangiocyten ohne Zilium die cAMP- Konzentration durch Aktivierung mit Gallensäuren erhöht, der extracellular regulated protein kinase (ERK) Signalweg gehemmt und somit die Proliferation angeregt. Haben die Cholangiocyten ein primäres Zilium, so verhält es sich umgekehrt und die Proliferation wird verringert (Masyuk et al. 2013).

35 Der nukleäre FXR wird in der Leber und im Dünndarm exprimiert (Deuschle et al. 2015). Hydrophobe Gallensäuren sind Liganden des FXR und aktivieren einen negativen Feedback Loop der Gallensäure Produktion (Jung et al. 2014). FXR aktiviert den fibroblast growth factor 19 (FGF19) welcher dann den fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) aktiviert. Dadurch kommt es zur herunter-Regulierung der Sterol-27-Hydroxylase (CYP27), die ein entscheidendes Enzym in der Gallensäure Synthese ist (Jung et al. 2014). ASBT wird durch FXR herunter reguliert was zu einer geringeren Absorption von Gallensäuren führt (Cheng et al. 2013). Der organic solute transporter α/β (OSTα/β), welcher für den basolateralen Efflux von Gallensäuren verantwortlich ist, hat bei verringerter FXR Expression eine reduzierte Aktivität, was zu einer Akkumulation von Gallensäuren in den Cholangiocyten führt (Cheng et al. 2013). Neben dem Einfluss des FXR auf den Cholesterol/Gallensäure-Metabolismus wirkt FXR regulierend auf den Triacylglycerol und Glukose-Metabolismus (Fuchs et al. 2013; Schittenhelm et al. 2015). Der Sphingosine 1-Phosphat Rezeptor 2 (S1PR2) ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor. der durch Sphingosine-1-Phosphat (S1P) aktiviert wird und je nach Gewebe die Proliferation aktiviert oder inhibiert. In Cholangiocyten wird die Proliferation durch S1PR2, über den ERK1/2 und Proteinkinase B (AKT) Signalweg, vergrößert (Maroni et al. 2014). Neben S1P kann S1PR2 auch durch TCA (tauro-Cholsäure) aktiviert werden (Liu et al. 2014). Ursodeoxycholsäure ist eine hydrophile Gallensäure, die als Therapeutikum bei primärer biliärer Zirrhose (PBC) eingesetzt wird (Uriz et al. 2011; Wiemuth et al. 2013). In Patienten mit PBC ist die Secretin-induzierte Sekretion und die Ausbildung des Bicarbonat umbrella

- stark eingeschränkt. Konjugiertes UDCA kann die Secretin-induzierte Sekretion von HCO3

+ - - über den Na -unabhängigen Cl /HCO3 Antiporter (SLC4A2/AE2) unterstützen und steigern (Uriz et al. 2011). Es konnte gezeigt werden, dass die Antwort auf konjugiertes UDCA über mehrere Mediatoren erfolgt. So ist die Antwort abhängig von AE2, PKCα, PI3K, MEK, PKA, intrazellulärem Ca2+ und den Mikrotubuli (Uriz et al. 2011). Ist beispielsweise die Mikrotubuli-Polymerisation durch Agenzien wie Colchicin inhibiert so zeigt UDCA keine Wirkung mehr auf die Sekretion (Uriz et al. 2011). BASIC könnte eine Rolle in der Wirkung von UDCA auf die Bicarbonat-Sekretion haben (Wiemuth et al. 2013).

36 Zielsetzung

Es ist bekannt, dass der bile acid-sensitive ion channel (BASIC) ein Gallensäuren aktivierter, Na+-permeabler Ionenkanal ist, der wahrscheinlich über eine Änderung der Membraneigenschaften aktiviert wird. Gallensäuren wie UDCA, die BASIC aktivieren können, spielen eine große Rolle in der Therapie von Cholangiopathien. Die Expression von BASIC konnte in Cholangiocyten, den Epithelzellen der Gallengänge, nachgewiesen werden. Es stellt sich die Frage der physiologischen Funktion von BASIC und ob dieser möglicherweise eine Rolle bei Cholangiopathien spielen könnte. Daher war ein Ziel dieser Arbeit den bile acid-sensitive ion channel (BASIC) in seinem nativen Gewebe weitergehend zu charakterisieren. Hierzu wurde untersucht, ob BASIC im nativen System der immortalisierten Zelllinie normal rat cholangiocytes (NRCs) exprimiert wird. Ein Nachweis über Expression und die Charakterisierung der elektrophysiologischen Eigenschaften von BASIC könnten Aufschluss über die physiologische Funktion in einem nativen System geben. In der Literatur ist beschrieben, dass die Oberflächenexpression und die elektrophysiologischen Eigenschaften von ASIC und ENaC durch direkt oder indirekt interagierende Proteine verändert werden kann. Für BASIC sind bis dato keine Interaktionen mit anderen Proteinen bekannt. Ein Teilziel dieser Arbeit ist es daher mögliche Interaktionspartner von BASIC zu identifizieren und solche Interaktionen zu charakterisieren. Interaktionen mit anderen Proteinen könnten sowohl Auskunft über die Regulierung der BASIC Funktion, als auch über mögliche Einflüsse von BASIC auf andere Signalwege geben. Die Cholangiocyten sind ein komplexes System, das vielen Regulationsmechanismen unterliegt. Daher kann das Zusammenspiel von elektrophysiologischer Charakterisierung und Identifikation von Interaktionspartnern von BASIC ein Fortschritt im Verstehen dieses Zellsystems der Cholangiocyten bringen. Im Rahmen der Untersuchungen der NRCs konnte außerdem ein unbekannter Einfluss von Gallensäuren auf die Sekretion beobachtet werden. Auch dieser Mechanismus wurde in dieser Arbeit weiter untersucht.

37 38 2. Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Chemikalien

Falls nicht anders angegeben, wurden die Feinchemikalien für die Gelelektrophorese von Bio-Rad (München, DE), Carl Roth (Karlsruhe, DE), Zellkulturmedien von PAN-Biotech (Aidenbach, DE), Zellkulturzusätze von Gibco/Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) und weitere Chemikalien sowie Verbrauchsmaterialien von Carl Roth (Karlsruhe, DE) bzw. Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) und Merck (Darmstadt, DE) bezogen. Für das Ansetzen von Lösungen wurde steriles doppelt destilliertes Wasser (Millipore-Qualität) verwendet.

2.1.2. Materialien für molekularbiologische Methoden

Ready to use Materialien:

1 kB GeneRuler DNA-ladder Fermentas, St. Leon-Rot, DE RedSafe DNA-staining dye Chembio, Medford, NY, USA dNTPs Carl Roth, Karlsruhe, DE

Enzyme:

Restrictions endonucleasen New Englande Biolabs, Ipswich, MA, USA KAPA HiFi DNA-Polymerase Peqlab, Erlangen, DE Gateway BP-Clonase II Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Gateway LR-Clonase II Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

39 Top10 kompetente E.Coli:

Für alle Transformationsversuche wurden in dieser Arbeit Top10 kompetente E. coli Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) verwendet. Die Transformationseffizienz liegt bei 10 9 Kolonien/µg.

Kits:

High Pure PCR Product Purification Kit Roche, Mannheim, DE High Pure Plasmid Isolation Kit Roche, Mannheim, DE

2.1.3 Lösungen und Puffer für molekularbiologische Methoden

Agarosegel: 30 ml oder 90 ml TAE-Puffer 0,3 g oder 0,9 g Agarose hinzufügen (für 1%)

LB-Medium: 10 g Trypton 5 g Hefe Extrakt 10 g NaCl

add ddH2O auf 1 l, pH 7,5 durch autoklavieren sterilisiert

Agar-Platten: 15 g/l Agarose 1 ml Ampicilin (100 mg/ml) add LB-Medium auf 1 l durch autoklavieren sterilisiert, Ampicilin nach abkühlen hinzufügen

50x TAE-Puffer: 242 g Tris-Base 57,1 ml Eisessigsäure 100 ml 0,5 M EDTA

add ddH2O auf 1 l

40 2.1.4 Primer

Alle Primer wurden bei MWG-Biotech AG, Ebersberg, DE bestellt. Die Konzentration wurde für alles Versuche auf 10 pmol/µl eingestellt. Die verwendeten Primer sind in der unteren Tabelle aufgeführt:

Tabelle 1: Liste der verwendeten Primer Name Sequenz Verwendung 5' Exon 2 A 5'-TACATCCCCCTTTATTGCC-3' Kotroll-PCR für BASIC-KO in Exon 2 auf genomischer DNA von NRCs; vorwärts 3' Exon 2 A 5'-CCTGTTCAAGTTACAGAATGTCA-3' Kotroll-PCR für BASIC-KO in Exon 2 auf genomischer DNA von NRCs; rückwärts 5' Exon 2 B 5'-TATTTTTTACATTATCAAATATA-3' Kotroll-PCR für BASIC-KO in Exon 2 auf genomischer DNA von NRCs; vorwärts 3' Exon 2 B 5'-GATGCCAGCGCTTTAAATACTTCA-3' Kotroll-PCR für BASIC-KO in Exon 2 auf genomischer DNA von NRCs; rückwärts PP1 f 5'-GAGAAATCAAAAGGGCCCGC-3' Amplifizierung von BASIC Fragmenten aus revers-transkribierte cDNA, vorwärts, 323 bp, Anfang PP1 r 5'-CAGAATGTCACAGCCGGGAA-3' Amplifizierung von BASIC Fragmenten aus revers-transkribierte cDNA, rückwärts, 323 bp, Anfang PP2 f 5'-GAGTGTGTCTGGAAGAGGCTT-3' Amplifizierung von BASIC Fragmenten aus revers-transkribierte cDNA, vorwärts, 303 bp, Mitte PP2 r 5'-TGCTTGGCTTTGCACTCCTT-3' Amplifizierung von BASIC Fragmenten aus revers-transkribierte cDNA, rückwärts, 303 bp, Mitte PP3 f 5'-GCGAAGAAACAGAATACCCTGC-3' Amplifizierung von BASIC Fragmenten aus revers-transkribierte cDNA, vorwärts, 354 bp, Ende PP3 r 5'-CTGTCTGAGGTGGAGAAGTCC-3' Amplifizierung von BASIC Fragmenten aus revers-transkribierte cDNA, rückwärts, 354 bp, Ende PP4 f 5'-CCCGCCGAGAAAGGACTCTT-3' Amplifizierung von BASIC Fragmenten aus revers-transkribierte cDNA, vorwärts,525 bp, Anfang bis Mitte

41 PP4 r 5'- Amplifizierung von BASIC GTGCACCAAAGTGTCATGAT Fragmenten aus revers- TGA-3' transkribierte cDNA, rückwärts, 525 bp, Anfang bis Mitte PP5 f 5'- Amplifizierung von BASIC TGGCGAGAATGTCCAAAGCA Fragmenten aus revers- -3' transkribierte cDNA, vorwärts, 506 bp, Mitte bis Ende PP5 r 5'- Amplifizierung von BASIC CTGTTTCTTCGCATGGCACG- Fragmenten aus revers- 3' transkribierte cDNA, rückwärts, 506 bp, Mitte bis Ende

2.1.5 Materialien für zellbiologische Methoden

Ready to use Materialien:

X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent Roche, Mannheim, DE Lipofectamin 2000 Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

2.1.6 Antibiotika

Tabelle 2: Liste der in Zellkulturmedien hinzugefügten Antibiotika Name Konzentration Hersteller Invitrogen/Thermo Fisher Zeocin 100 µg/ml Scientific, Waltham, MA, USA Blasticidin S HCL 15 µg/ml InvivoGen, Toulouse, FR Hygromycin B from Streptomyces 100 µg/ml Applichem PanReac, Darmstadt, DE hygroscopicus GIBCO/Thermo Fisher Scientific, Neomycin 1 mg/ml Waltham, MA, USA

42 2.1.7 Materialien für proteinbiochemische Methoden

Ready to use Materialien:

IgG Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, SE Calmodulin Sepahrose 4B GE Healthcare Bio-Science AB, Uppsala, SE Precision Plus Protein Standards Kaleidoscope Bio-Rad, München, DE Clarity Western ECL Bio-Rad, München, DE Super-Signal ELISA Femto Maximum Thermo Fisher Scientific, Waltham, sensitivity Substrate MA, USA

Enzyme:

AcTEV Protease Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

2.1.8 Antikörper

Tabelle 3: Liste der verwendeten Antikörper für Immundetektion und Immunhistochemie

Primärantikörper Epitop Typ Hersteller α-rBASIC letzten 14 AS des rabbit IgG Charles-River, Wilmington, rBASIC MA, USA α-GFP AS 132-144 mouse IgG Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA α-Flag Flag Sequenz mouse IgG Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, DYKDDDDK USA α-Tubulin AS L40-44 mouse IgG Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA α-βActin 11 AS des C-Terminus mouse IgG Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA Sekundärantikörper Anti- Donor donkey-anti-rabbit-HRP rabbit IgG donkey DIANOVA GmbH, Hamburg, DE anti-Mouse-HRP mouse IgG goat Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA anti-rabbit-Alexa Fluor 488 rabbit IgG goat Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA

43 2.1.9 Lösungen für das Tandem Affinity Purification Assay (TAP-Assay)

Lyse-Puffer: Tris pH 7,5 50 mM NaCl 150 mM EDTA 1 mM Glycerol 10 % (v/v) NP-40 oder T-X-100 1 % (v/v) frisch zugeben: DTT 1 mM LAP 1:1000 PMSF 0,5 mM TEV Puffer: Tris pH 7,5 50 mM NaCl 150 mM EDTA 0,5 mM DTT (frisch zugeben) 1 mM

Calmodulin-Bindungs-Puffer: Tris pH 7,5 10 mM NaCl 150 mM NP-40 oder T-X-100 0,2 % (v/v) Magnesium Acetat 1 mM

CaCl2 2 mM frisch zugeben: Imidazol 1 mM β-ME 10 mM

Calmodulin-Wasch-Puffer: NH4HCO3 pH 8,0 50 mM NaCl 75 mM Magnesium Acetat 1 mM

CaCl2 2 mM Imidazol (frisch zugeben) 1 mM

Elutions-Puffer: NH4HCO3 pH 8,0 50 mM EGTA 25 mM

44 2.1.10 Lösungen für Ussing-Kammer Experimente/Calcium Imaging

NRC-Ringer Lösungen:

NRC-Ringer-Lsg: NaCl 140 mM KCl 4 mM

KH2PO4 1 mM

MgCl2 2 mM

CaCl2 1 mM Glucose 10 mM HEPES 10 mM

pH 7,4 mit NaOH

Low Cl- NRC-Ringer-Lsg: NaCl 2,5 mM Natriumgluconat 137,5 mM Kaliumgluconat 4 mM

KH2PO4 1 mM

MgCl2 2 mM

CaCl2 1 mM Glucose 10 mM HEPES 10 mM

pH 7,4 mit NaOH

Low Na+ NRC-Ringer-Lsg: NaCl 2,5 mM NMDG 137,5 mM KCl 4 mM

KH2PO4 1 mM

MgCl2 2 mM

CaCl2 2 mM Glucose 10 mM HEPES 10 mM

pH 7,4 mit NaOH

45 Low Ca2+ NRC-Ringer-Lsg: NaCl 140 mM KCl 4 mM

KH2PO4 1 mM

MgCl2 2 mM Glucose 10 mM HEPES 10 mM

pH 7,4 mit NaOH

2.1.11 Materialien und Lösungen für Immunhistochemie

DAPI Applichem PanReac, Darmstadt, DE

4% Paraformaldehyd 4 g PFA/ 100 ml PBS pH 7,4 mit NaOH

Permeabilisier-Lsg. 3% BSA 0,05% T-X-100 in PBS

2.1.12 Geräte und Software des Calcium-Imagin Settup: digitale CCD-Kamera: Sensicam qe PCO AG, Kelheim, DE Fura-Filter 510 nm: AHF 400DCLP D510/40 AHF, Tübingen, DE Inverses Mikroskop: Olympus IX 71 Olympus, Tokyo, JP Monochromator: Polychrome V Till Photonics, Gräfelfing, DE Objektiv: Olympus Uapo/340 20x Olympus, Tokyo, JP Perfusionspumpe: Reglo Analog Ismatec, Glattbrugg, CH Mikromanipulator: LN SM I Luigs & Neumann Feinmechanik & Elektrotechnik GmbH, Ratingen, DE

Software: TillVision 4.0.1.3 Till Photonics, Gräfelfing, DE

46 2.2 Methoden

2.2.1 Molekularbiologische Methoden

2.2.1.1 Agarose Gelelektrophorese

Die Agarose Gelelektrophorese wurde genutzt um DNA Fragmente anhand ihrer Größe aufzutrennen und zu analysieren. Des weiteren wurden Präparative Gele angefertigt um DNA-Fragmente zu isolieren. Es wurde für die Gele 1% Agarose in 1x TAE-Puffer verwendet. Die Mischung wurde in einer Mikrowelle aufgekocht und 1,5 µl RedSafe DNA- staining dye pro 30 ml Gel hinzugefügt. Taschen entsprechender Größen wurden durch Kunststoff Kämme eingefügt. Nach dem Abkühlen wurden die Gele in Laufkammern (Bio- Rad) gelegt und die Laufkammern mit 1x TAE-Puffer als Laufpuffer aufgefüllt. Vor dem Auftragen wurden die Proben mit 6x Gel-Ladepuffer vermischt. Als Standard für das Molekulargewicht wurde ein 1 kB GeneRuler Marker verwendet. Nach dem Verbinden der Laufkammern mit der Stromzufuhr (Power PaC 300, Bio-Rad) wurden 80-120 V für 20-45 Minuten angelegt. Die DNA-Fragmente wurden unter einer UV-Lampe (Gel Doc XR, Bio- Rad) sichtbar gemacht und mit der Quantity-One 4.6.1 (Bio-Rad) Software analysiert.

2.2.1.2 Aufreinigung der DNA-Fragmente

Für das Aufreinigen von DNA-Fragmenten aus eine Agarosegel wurde das High Pure PCR Purifcation Kit (Roche) verwendet. Die Banden von Interesse wurden mit einem Skalpell unter UV-Licht ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die restliche Aufreinigung wurde nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt (Roche).

2.2.1.3 DNA Restriktionsverdau

Alle Restriktionsverdaus wurden mit Restriktionsendonucleasen (New England Biolabs) nach der Empfehlung der Herstellers mit entsprechenden Puffern durchgeführt. 10 U der Enzyme wurden für den Verdau von etwa 1 µg DNA verwendet. Die Restriktionsverdaus wurden bei empfohlenen Temperaturen für 1 bis 2 Stunden im Schüttel-Inkubator (Thermo Mixer, Eppendorf) durchgeführt. Die DNA wurde nach dem Verdau über eine Agarose- Gelelektrophorese analysiert.

47 2.2.1.4 Polymerase Kettenreaktion

Die Polymerase Kettenreaktion (PCR, Polymerase chain reaction) dient zur Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente. Die DNA wird im ersten Schritt denaturiert um DNA Einzelstränge zu erzeugen. Danach können Sequenzspezifische Primer in 5' und 3' Richtung während der Hybridisierungsphase binden. In der Elongationsphase kann eine DNA-Polymerase beginnend an den gebundenen Primern neue komplementäre DNA durch Anlagerung von dNTPs synthetisieren. Alle PCRs wurden, wenn nicht anders angegeben, nach dem folgenden Protokoll (Tabelle 4) durchgeführt, wobei die Annealing- Temperaturen für entsprechende Primerpaare angeglichen wurden.

5x KAPA HiFi Polymerase Puffer 10 µl dNTPs 1 µl forward Primer 1,5 µl reverse Primer 1,5 µl DNA Template 1 µl Polymerase 0,5 µl add H2O 34,5 µl

Reaktionsvolumen 50 µl

PCR-Protokoll

Tabelle 4: PCR Protokoll

Schritt Temperatur Zeit Zyklen

Initiale Denaturierung 95°C 180s 1

Denaturierung 98°C 20s

Annealing Tm ± 10°C 30s

Elongation 72°C 30s/kb 16-20

Finale Elongation 72°C 180s 1

Zur Kontrolle der PCR wurde eine Agarosegel angefertigt und die DNA aus diesem aufgereinigt und gegebenenfalls sequenziert.

48 2.2.1.5 Transformation von kompetenten E. Coli

Um DNA-Plasmide zu vervielfältigen wurden kompetente TOP 10 E. Coli Bakterien (Invitrogen) verwendet. Die Bakterien wurden in 50 µl Aliquots bei -80°C gelagert. Um sie zu transformieren, wurden die Bakterien langsam auf Eis aufgetaut und ~50ng Plasmid DNA hinzugefügt. Danach folgte eine Inkubation von 30 Minuten bei 4°C. Nach einem Hitzeschock (42°C für 45 Sekunden) wurden 250 µl LB-Medium hinzugefügt und es folgte eine weitere Inkubationszeit von 60 Minuten bei 37°C. 50-100 µl der Bakteriensuspension wurden anschließend auf Agarplatten mit entsprechenden Antibiotika aufgetragen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Klone wurden für weiter folgende Versuch gepickt.

2.2.1.6 Isolation der Plasmid-DNA (DNA-Miniprep)

Zur Isolation der Plasmid-DNA wurden 5ml LB-Medium mit 5 µl (100mg/ml) der entsprechenden Antibiotika versetzt und mit einer einzelnen Kolonie mit dem gewünschten Plasmid transformierter Bakterien angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht auf einem Schüttel-Inkubator bei 37°C und 220 rpm inkubiert. Die Kultur wurde anschließend abzentrifugiert und das Pellet mit dem High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) präpariert und die Plasmid DNA aufgereinigt.

2.2.1.7 Isolation der Plasmid-DNA (DNA-Maxiprep)

Zur Isolation größerer Mengen Plasmid-DNA wurden morgens 2,5ml LB-Medium mit 2,5 µl (100mg/ml) der entsprechenden Antibiotika versetzt und mit einer einzelnen Kolonie mit dem gewünschten Plasmid transformierter Bakterien angeimpft. Aus den 2,5 ml Vorkultur wurden 300 µl in einen neuen Erlenmeyerkolben mit 150ml LB-Medium + Antibiotika (100 mg/ml) überführt und bei 37°C und 220 rpm über Nacht inkubiert. Die Kultur wurde anschließend abzentrifugiert und das Pellet mit dem Nucleo Bond Xtra Maxi Plus Kit (Macherey-Nagel, Düren, DE) präpariert und die Plasmid DNA aufgereinigt.

2.2.1.8 Isolation genomischer DNA Um die genomische DNA von transient oder stabil transfizierten Zellen zu isolieren wurde das my-Budget DNA Mini Kit (Bio-Budget, Krefeld, DE) nach Angaben des Herstellers verwendet.

49 2.2.2 Zellbiologische Methoden

2.2.2.1 Transiente Transfektion durch Calcium-Phosphat-Präzipitation

Die transiente Transfektion ist das temporäre Einbringen von Plasmiden in eukaryotische Zellen. Es gibt verschiedene Methoden um dies zu erreichen. In dieser Arbeit wurde die

2+ Ca PO4-Methode verwendet. Für die Calcium-Phosphat-Präzipitation wurde 30 Minuten bis eine Stunde vor der Transfektion frisches Medium auf die Zellen gegeben oder die

Zellen gesplittet. Danach wurde ~3 µg Plasmid-DNA langsam zu 300 µl 250 mM CaCl 2 pipettiert. Die DNA CaCl2 Mischung wurde anschließend tropfenweise zu 300 µl 2x HEBS hinzugefügt und gründlich gemischt. Nach 20-30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Lösung zu den Zellen gegeben und durch sanftes schütteln in der Petrischale oder den Wells verteilt. 24 Stunden nach der Transfektion konnten die Zellen für weitere Experimente verwendet werden.

HEBS 2x: NaCl 274 mM Dextrose 12 mM

Na2HPO4 1,4 mM KCl 10 mM

ad ddH2O, pH 7,05, steril filtrieren

CaCl2: CaCl2 250 mM

ad ddH2O, steril filtrieren

2.2.2.2 Transfektion von NRCs

Die NRC Zelllinie wurde X-treme Gene 9 DNA Transfection Reagent (Roche, Mannheim, DE) nach Anleitung des Herstellers verwendet.

50 2.2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.2.3.1 Proteinpräparation von Zellen

Wenn nicht anders angegeben wurde auf die zu lysierenden Zellen entsprechend der Wachstumsgröße (10 cm Petrischale 1 ml Lyse-Puffer, 6 cm Schale 600 µl Lyse-Puffer) Lyse-Puffer mit 1% Triton-X gegeben und für eine Stunde bei 4°C schüttelnd inkubiert. Danach wurden die Zellen mit sterilen Spateln von den Zellkulturschalen abgelöst und in 1,5 ml Eppendorf Gefäße überführt. Danach wurden die Proben bei 10.000 rpm 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert um die Triton lösliche (Überstand) von der Triton unlöslichen Fraktion (Pellet) zu trennen. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorf Gefäß überführt und das Pellet in 200 µl Lyse-Puffer aufgenommen und ggf. sonifiziert. Die Proben konnten nun bei 4°C weiter verwendet werden oder bei -20 - -80°C gelagert werden.

Lyse-Puffer: Tris pH 7,5 50 mM NaCl 150 mM EDTA 1 mM Glycerol 10% (v/v) T-X-100 1% (v/v) frisch zugeben DTT 1 mM LAP 1:1000 PMSF 0,5 mM

2.2.3.2 Quantifizierung der Protein-Konzentration mit dem BCA-Assay

Die BCA Lösung (Micro BCA, Thermo Scientific) wurde nach Angaben des Herstellers zusammen pipettiert und nach dem Schema in Abb. 2.1 vorgelegt. Danach wurde Protein aus den zu bestimmenden Proben hinzugefügt, die Lösung für 10-15 Minuten inkubiert und danach die Absorption bei 563 nm gemessen und über die Bestimmung einer Standardkurve aus der Eichreihe die Proteinkonzentration der Proben berechnet.

51 Abbildung 2.1: Schema der Verdünnungsreihe und der Probenvorbereitung für das BCA-Assay.

2.2.3.3 Gelelektrophorese: SDS-PAGE nach Laemmli

Die Auftrennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen erfolgte mit einem SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-System (SDS-PAGE) nach Laemmli (1970). Dazu wurden Polyacrylamid Gele (Trenngele 10-12% PAA (Roth), Sammelgel 5% PAA) verwendet. Die Protein-Proben wurden vor dem Auftragen mit Probenpuffer versetzt und 5 min bei 95°C denaturiert. Die Gele wurden nach der Anleitung in Tabelle 5 zusammenpipettiert und in das Mini-PROTEAN Tetra Cell System eingespannt. Die Kammern wurden mit 1x SDS-Running Puffer befüllt und die Gele mit den Proben beladen. Die Gele liefen bei konstant 30 mA pro Gel für ~80-100 Minuten.

SDS-Running Puffer 25 mM Tris 250 mM Glycin 0,1 % SDS, pH 8,8

10x SDS-Running Puffer: Glycin 288g Tris Base 58g SDS 100g

ad 2L H2O

52 Tabelle 5: Pipettierschema für Polyacrylamid Gele

ddH2O Acrylamid/Bis Gel Puffer 10% SDS APS TEMED -Acrylamid 5% 11,4 ml 3,4 ml 5ml (pH 6,8) 200 µl 200 µl 40 µl Sammelgel 10% Trenngel 8,2 ml 6,6 ml 5ml (pH 8,8) 200 µl 200 µl 40 µl

2.2.3.4 Semidry-Proteintransfer

Der Proteintransfer auf PVDF im Semidry-Verfahren erfolgte zwischen mit Transferpuffer getränkten Filterpapieren 45-90 min lang bei konstant 150 mA pro Gel. Der Transfer erfolgte im Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad). Die PVDF-Membran wurde in Methanol aktiviert und das Gel wird für 10 Minuten in Transferpuffer äquilibriert. Dem 1x Transferpuffer wurde frisch 10% (v/v) Methanol hinzugefügt.

Transferpuffer: 25 mM Tris 10 % (v/v) Methanol 192 mM Glycin

10x Transferpuffer: Glycin 144g Tris Base 30,39g

ad 1L H2O

2.2.3.5 Immundetektion

Die proteinhaltigen PVDF-Membranen wurden zunächst 1 Stunde über Nacht mit Blockierlösung (s.u.) blockiert. Nach Inkubation mit primärem Antikörper (verdünnt in Blockierlösung oder PBS; bei RT für 1 h oder 4°C über Nacht) wurden diese mehrfach mit PBS mit 0,05% Tween 20 gewaschen und anschließend mit Sekundärantikörper inkubiert (HRP-Konjugate verdünnt in PBS; 1 h bei RT). Nach weiterem Waschen wurden die gebundenen konjugierten Enzyme durch Chemilumineszenz (ECL) detektiert. Verwendet wurde das Clarity Western ECL (Bio-Rad) und Super Signal ELISA Femto Maximum

53 Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) nach Angaben des Herstellers. Die Membran wurde mit frisch angesetzter Arbeitslösung benetzt, 5 min inkubiert. Das Signal wurde dann im Chemi-Smart (Vilber Lourmat, Marne-la-Valleé, FR) detektiert und mit der Chemi- Capt Software (Vilber Lourmat) analysiert.

Blockierlösung: 4 % (w/v) Magermilchpulver, gelöst in PBS

10x PBS: 14,4g Na2HPO4 x H2O

2g NaH2PO4 2g KCl 80g NaCl auf 1 Liter

2.2.3.6 Immunhistochemische Färbung

Die NRCs wurden die Zellen auf kollagenbeschichteten Deckgläschen in 6 Well- Zellkulturschalen kultiviert. Die Deckgläschen wurden ein mal mit PBS gewaschen und danach mit 4% Paraformaldehyd für 10 min bei RT fixiert. Danach wurden die Zellen drei mal mit PBS für 5 min gewaschen. Die Zellen wurden mit Permeabilisier-Lsg. (3% BSA) für 10 min bei RT permeabilisiert. Die Deckgläschen wurden aus der Zellkulturschale in eine Feuchtekammer überführt. Danach wurden die Zellen mit primär Antikörper (1:5000) 1 h bei RT inkubiert. Die Zellen wurden erneut drei mal mit PBS für 5 min gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 3% BSA für 10 min erneut blockiert. Die Zellen wurden 30-60 min mit dem Sekundärantikörpern inkubiert und danach erneut drei mal für 5 min mit PBS gewaschen. Des Weiteren wurden die Zellen mit DAPI nach Angaben des Herstellers gefärbt. Nach erneutem waschen mit PBS wurden die Deckgläschen mit 15-30 µöl Mowiol auf Objektträger gelegt und über Nacht getrocknet.

54 2.2.3.7 Tandem Affinity Purification Assay (TAP-Assay)

Die Tandem Affinity Purification (TAP) basiert auf einer zweischrittigen Aufreinigung eines mit einem N- oder C-Terminalen TAP-Tag versehenen Proteins. Der TAP-Tag besteht aus einem Protein A welches über eine spezifische Restriktionsschnittstelle für die TEV- Protease mit einem Calmodulin bindenden Protein verbunden ist. Dieses Calmodulin bindende Protein wiederum ist mit dem gewünschten Protein verbunden. Die das Proteine exprimierenden Zellen wurden mit Lyse-Puffer für 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Im ersten Schritt wurde, nach dem Abzentrifugieren der Zellen (10.000xg 4°C 25'), das Lysat der Protein exprimierenden Zellen auf 50 µl (pro 10 cm Petrischale) IgG-Beads (mit Immunglobulin G fusionierte Sepharose Beads) gegeben und für 90 Minuten bei 4°C unter Rotieren inkubiert. Die IgG- Beads wurden vor der Präzipitation mit 0,5 ml Lyse Puffer pro 50 µl Beads äquilibriert. Das am TAP-Tag befindliche Protein A sollte mit dem an die Beads fusionierten IgG präzipitieren. Die Beads wurden bei 200xg für 2 Minuten abzentrifugiert. Nach zwei Waschschritten mit 500 µl TEV-Puffer bei dem nicht assoziierte Proteine entfernt werden, wurden die Beads in 250 µl TEV-Puffer Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der resuspendiert und 4U TEV Protease Schritte im TAP-Versuch. (eigene Abbildung, modifiziert nach Seraphin et al. 2012) pro 10 µl Beads hinzugefügt. Die Inkubation wurde im Laufe der Versuch von 2 Stunden bei 4°C auf über Nacht bei 4°C verlängert. Die Protease sollte den TAP-TAG nun an der dafür vorgesehenen TEV- Restriktionsschnittstelle schneiden und so das Protein von Interesse von den IgG-Beads lösen. Die Beads wurden erneut bei 200xg für 2 Minuten abzentrifugiert. Der Überstand, der das Protein mit dem geschnittenen TAP-Tag enthalten sollte, wurde auf mit CaM-

55 Bindungs-Puffer äquilibrierte CaM-Beads (mit Calmodulin fusionierte Sepharose Beads) gegeben. Unter Zugabe von 16 µl CaCl2 (1 M) sollte das Calmodulin bindende Protein des TAP-Tag an die CaM-Beads binden. Die CaM-Beads wurden für 2 Stunden bei 4°C inkubiert. In zwei weiteren Waschschritten mit 1ml CaM-Wash-Puffer wurden alle noch vorhandenen unspezifisch gebundenen Proteine entfernt. Zum Schluss wurden die Beads in 400 µl Elutions-Puffer resuspendiert und für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Das Protein von Interesse sollte durch Zugabe von Ca2+ Chelatoren wie EGTA von den Beads eluiert werden. In der Elution sollte nun nur noch das gewünschte Protein und alle mit ihm interagierenden bzw. bindende Proteine vorhanden sein.

Proben werden genommen von: Lysat 25 µl der lysierten und abzentrifugierten Zellen IgG Überstand 1 ml Überstand der IgG-Beads nach der Präzipitation IgG-Beads IgG-Beads nach dem Restriktionsverdau in 100 µl 1x Probenpuffer TEV Überstand 25 µl des Überstands nach dem Restriktionverdau CaM Überstand 1 ml Überstand der CaM-Beads nach der Präzipitation CaM-Beads CaM-Beads nach der Elution in 100 µl 1x Probenpuffer Eluat 400 µl Eluat

2.2.4 Elektrophysiologische Methoden

2.2.4.1 Ussing-Kammer

Die oben beschriebenen normal rat cholangiocytes (NRCs) wurden in elektrophysiologisch mit der Ussing-Kammer Methode untersucht. Ursprünglich wurde diese Methode von Ussing und Zerahn entwickelt um Transportprozesse über isolierte Membranen (Froschhaut) nachzuweisen (Ussing und Zehran, 1951). Neben diesen präparierten Geweben können des Weiteren auch artifizielle Gewebe wie gewachsene Monolayer einer Zelllinie auf speziellen für Zellkultur präparierten Filtern untersucht werden. Ungefähr vier bis sechs Tage nachdem die NRCs auf Snapwell Polyester Membran Inserts (Corning Costar, Sigma Aldrich, St. Louis, Mo, USA) ausgesäht wurden, bildet sich ein konfluenter Monolayer von Zellen. Entscheidend für die Messungen in der Ussing-Kammer ist der transepitheliale Widerstand TEER (transepithelial electric resistance), der mittels

56 eines Epithelial Voltohmmeter (EVOM, World Precision Instruments (WPI), Sarasota, Fl, USA) gemessen werden kann. Es wurden ausschließlich Filter mit einem TEER von mindestens 300 Ω verwendet.

Das Ussing-Kammer System (Scientific Instruments, Aachen, DE) umfasst sechs für Zellkultur-Inserts modifizierte Ussing-Kammern, die in einem, durch zirkulierendes thermoreguliertes Wasser, beheizten Heizblock stehen und einem 6 Kanal Voltage/Current Clamp (VCC) Inteface. Das VCC Interface ist mit einem externen Mikrorechner verbunden der einen Analog/Digital Wandler und Stromquellen für die Elektroden enthält und mit einem PC verbunden wird. Strom- und Spannungselektroden werden an das VCC Interface angeschlossen und in der Ussing-Kammer platziert. Heizblock, VCC Interface und Ussing-Kammern sind, um eine gleichbleibende Temperatur zu gewährleisten, in einem Inkubator untergebracht (Memmert, Schwabach, DE). Über das PC-Programm Clamp können alle Parameter der Messungen gesteuert werden. Die für die Versuche verwendeten Ag/AgCl-Pellet-Elektroden werden in 3 M KCl Lösung und 3% Agar eingebettet. Vor den Messungen muss der Eigenwiderstand der Agarbrücke und eines leeren Filter ermittelt werden, damit diese aus den eigentlichen Messungen subtrahiert werden können. Die Messungen wurden im Open Circuit Modus durchgeführt, in welchem in einem 60 Sekunden-Intervall ein Stromimpuls von 1 µA appliziert wird und danach die

Gewebepotentialdifferenz dP0 und die Membranleitfähigkeit Gt / der transepitheliale

Widerstand Rt ermittelt wird. Durch Anwendung des Ohm'schen Gesetzes kann bei der Auswertung der Strom (I) errechnet werden.

U U =R× I I= R

Die Filter wurden nach Erreichen des entsprechenden TEER in die für Zellkultur-Inserts modifizierten Ussing-Kammern eingespannt. Die Inserts bzw. der Zellmonolayer trennen die einzelnen Kompartimente der Ussing-Kammer und können je nach Ausrichtung der Zellen in ein apikales und ein basolaterales Kompartiment unterteilt werden. Die Kammer wird nach dem Zusammenbau mit je nach Zelltyp spezifischer Ringer-Lösung befüllt. In jedem Kompartiment werden je eine Spannungs- und Stromelektrode platziert. Nachdem die Messung gestartet worden ist, wird 20-30 Minuten bis zum Beginn des eigentlichen

57 Versuchsprotokolls gewartet um einen stabilen Widerstand der Zellen zu gewährleisten. Danach können je nach Fragestellung verschiedene Substanzen apikal oder basolateral appliziert werden.

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung einer Ussing-Kammer.

2.2.5 Calcium-Imaging

Um die intrazelluläre Calciumkonzentration der normal rat cholangiocytes (NRCs) zu messen wurde der Calciumbindende Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 verwendet. Um die Zellen mit dem Farbstoff zu beladen, wurde eine Acetoxymethylester-Modifizierte Variante (Fura-2-AM) benutzt, da die lipophile Esterverbindung membranpermeabel ist. Intrazellulär spalten Esterase die Acetoxymethylgruppe vom Farbstoff und dieser kann nicht mehr aus der Zelle. Fura-2 kann durch Licht der Wellenlängen 340-380 nm angeregt werden und emittierten dann Licht der Wellenlänge 510 nm. Bindet Calcium an Fura-2 so nimmt die Fluoreszenz nach Anregung mit 340 nm Wellenlänge (f340) zu und nach

Anregung mit 380 nm Wellenlänge (f380) ab. Um Variablen, wie z.Bsp. Konzentration von Fura-2 in der Zelle, Zellgröße/-dicke, zu umgehen, wurde der Quotient der gemessenen

Fluoreszenzen f340 und f380 gebildet. Die bestehende Hintergrundfluoreszenz beider Anregungswellenlängen wurde ebenfalls erfasst und von der relativen Fluoreszenz abgezogen. Die relative Fluoreszenz ergab sich aus folgender Formel:

58 f 340 Zelle− f 340 Hintergrund f 340/ f 380= f 380 Zelle− f 380 Hintergrund

Um die NRCs zu beladen wurden 4 µl Fura-2-AM mit 1,25 µl Pluronic-Acid (250 mg Pluronic F-127/1 ml DMSO) gemischt und 1 ml HBSS hinzugefügt. Die zu beladenen Deckgläschen wurden zwei Mal mit 1 ml HBSS gewaschen und dann für 15 Minuten mit 200 µl der Fura-Pluronic Mischung bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Deckgläschen erneut 2 mal mit 1 ml HBSS gewaschen und für weitere 10 Minuten mit 1 ml HBSS bei 37°C inkubiert. Die Deckgläschen wurden nun unter dem Mikroskop fixiert und ein geeigneter Bereich für die Messungen gewählt. Nach Aufnahmen im Durchlicht, bei 340 nm Wellenlänge Anregung und 380 nm Wellenlänge Anregung wurden ~20 Zellen verschiedener Größe und Platzierung gewählt. Die Zellen wurden mit in Abschnitt. 2.1.10 beschriebener NRC- Ringer-Lösung umspült. Nach Beginn der Messung wurden die Zellen alle 3 Sekunden mit Licht der Wellenlänge 340 und 380 nm angeregt und das emittierte Licht aufgezeichnet. Je nach Fragestellung wurden die Zellen mit verschiedenen Lösungen umspült und die Perfusion so eingestellt, dass ein gleichbleibender Flüssigkeitspegel in der Messkammer vorhanden war. Nach der Messung wurden Bereiche ohne Zellen in den Aufnahmen markiert um die Hintergrundfluoreszenz zu erfassen. In der Till Vision-Software konnte die Fluoreszenzsignale der zuvor markierten Zellen, abzüglich der Hintergrundfluoreszenz, errechnet und grafisch ausgegeben werden.

2.2.6 CRISPR/Cas-9 Knockout

Die CRISPR/CAS-9 Methode ist ein neuartiges Werkzeug gezielt DNA zu editieren. Durch Transformation oder Transfektion von Vektoren welche den crRNA Komplex, die tracrRNA und Cas9 enthalten können in die DNA von verschiedenen Organismen gezielte DNA Sequenzen eingefügt oder deletiert werden. Die CRISPR/CAS-9 Methode basiert auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien. CRISPR steht für clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Cas 9 (CRISPR-associated) ist eine Endonuklease welche bestimmte RNA-Sequenzen genannt crRNA repeats (Sequenz: GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG) binden kann und DNA schneiden kann. Diese crRNA repeats bilden Sekundärstrukturen welche von Cas9 erkannt wird. Dies führt zu einer Konformationsänderung von Cas9 und die Ziel

59 DNA kann von der RNA gebunden werden. Die Ziel DNA muss ein PAM-Motiv (protospacer adjacent motif) enthalten um Cas9 aktivieren zu können. Die crRNA besteht aus den crRNA repeats und einer Ziel DNA bindende Sequenz (crRNA spacer) die komplementär zur Ziel DNA ist. Um die DNA an einer bestimmten Stelle zu schneiden muss noch eine DNA-Sequenz homologe RNA (tracrRNA, trans-acting CRISPR RNA) vorhanden sein. Wird anstatt der natürlich vorkommenden crRNA spacer Sequenz eine Ziel DNA spezifische RNA Sequenz zur crRNA und tracrRNA hinzugefügt schneidet Cas9 die DNA nahe der geänderten Zielsequenz. Die crRNA und die tracrRNA können in einem selbsthybridisierenden RNA Strang untergebracht werden. Cas9 kann Doppelstrangbrüche in der DNA erzeugen welche die Häufigkeit einer homologen Rekombination erhöht. Des Weiteren kann durch den Doppelstrangbruch eine gerichtete Deletion erzeugt werden.

Abbildung 2.4: Schematische Darstellung des CRISPR Cas9 Geneditierungs Tools.

60 3 Ergebnisse

3.1 Identifizierung möglicher Interaktionspartner des BASIC

3.1.1 Tandem affinity purification (TAP) Methode

Ein Hauptprojekt dieser Arbeit war die Identifikation möglicher Interaktionspartner des Bile acid-sensitive ion channel (BASIC). Für die direkten Verwandten des BASIC, die acid sensing ion channels (ASICs) und epithelial sodium channels (ENaCs), ist bekannt, dass diese durch eine Vielzahl an Proteinen in ihrer Expression und Aktivität moduliert werden können. Um mögliche Proteine zu identifizieren, die mit BASIC interagieren, wurde die tandem affinity purification (TAP) Methode in unserer Arbeitsgruppe etabliert. Diese Methode erlaubt es Proteine, die mit einem TAP-Tag fusioniert sind, über zwei hintereinander gereihte Präzipitationsschritte aufzureinigen. Im Idealfall sollten dadurch auch alle Proteine, welche mit dem getaggten Protein interagieren, co-aufgereinigt werden. Der TAP-Tag besteht aus einem Protein A- und einem Calmodulin-bindenden Protein, die über eine TEV-Protease Schnittstellensequenz miteinander verbunden sind (siehe S. 55). Im Laufe des TAP-Versuchs wird das getaggte Protein über zwei verschiedene Beads aufgereinigt. Der Protein A Anteil des TAP-Tags präzipitiert an die Immunglobuline der IgG-Beads. Danach kann das Protein durch Restriktion mit der TEV- Protease wieder eluiert werden. Das nun freiliegende Calmodulin-bindende Protein des Tags kann unter Zugabe von Ca2+ an das Calmodulin der CaM-Beads binden. Die Proteine können von den CaM-Beads durch Zugabe von Ca2+-Chelatoren, wie EDTA, eluiert werden. Während der Etablierung der Methode hat sich gezeigt, dass BASIC in stabil transfizierten und induzierbaren HEK293/FRT/TO Zellen eine deutlich stärkere Expression hat, wenn der TAP-Tag N-terminal fusioniert ist. Die Expression des C-terminal fusionierten Konstrukts könnte zwar mittels Western Blot nachgewiesen werden, jedoch reichte die Proteinmenge nicht für die Aufreinigung aus. Es machte für die Expression keinen Unterschied, ob es sich um m- oder rBASIC handelt. Im Folgenden wurden alle Versuche mit N-terminal fusioniertem BASIC (BASIC N-TAP) durchgeführt. Während der Etablierung des TAP-Versuchs in unserer Arbeitsgruppe konnte keine erfolgreiche Elution des Zielproteins von den CaM-Beads erreicht werden (Masterarbeit D. Löhrer, 2013). Daher wurde auf diesen Schritt verzichtet.

61 In einem repräsentativen TAP Versuch mit N-terminal fusioniertem rBASIC kann in der Spur „Lysat“ (Lysat induzierter HEK293/FRT/TO Zellen) eine Bande bei ca. ~90 kDa gesehen werden (Abb. 3.1.1). Eine weitere Bande bei ~90 kDa kann in der Spur „IgG Ü“ gesehen werden (Überstand der IgG-Beads nach Inkubation für die Präzipitation). In der Spur „IgG-Beads“ (IgG-Beads nach Restriktionsverdau) ist eine Bande bei ~90 kDa zu sehen (Abb. 3.1.1). In den Spuren „TEV Ü“ (Überstand nach Restriktionsverdau durch die TEV Protease) und „CaM-Beads“ (Calmodulin Beads nach Präzipitation) sind jeweils weitere Banden bei ca. ~75 kDa zu sehen (Abb. 3.1.1). Zusätzlich ist in der „IgG-Beads“- Spur eine starke Bande bei ~50 kDa zu sehen (Abb. 3.1.1). Die Bande in der „Lysat“-Spur zeigt, dass die induzierte Expression von BASIC in den stabil transfizierten HEK293/FRT/TO Zellen erfolgreich ist. Die Bande in der „IgG-Beads“-Spur zeigt die erfolgreiche Präzipitation von BASIC-N-TAP an die IgG-Beads. Die Bande in der „IgG Ü“- Spur zeigt jedoch, dass ein Teil des exprimierten BASICs nicht präzipitiert wurde. Die Bande in der „TEV Ü“-Spur deutet auf eine erfolgreiche Restriktion des TAP-Tags durch die TEV-Protease hin. Die Bande in der CaM-Beads Spur zeigt die Präzipitation von BASIC an die CaM-Beads. Bei der zusätzlichen unteren Bande in der „IgG-Beads“ Spur handelt es sich um die schwere Kette des an die Beads fusionierten IgGs, welche durch die Denaturierung während der SDS-Gelelektrophorese gelöst wird.

Abbildung 3.1.1: Repräsentativer TAP Versuch mit rBASIC-N-TAP aus stabil transfizierten Zellen. Lysat: 0,3% Lysat der mit 1 µg/ml Tetracyclin-induzierten HEK293/FRT/TO Zellen; IgG Ü: 0,3% Überstand der IgG-Beads nach der Präzipitation; IgG-Beads: 3% IgG-Beads nach Restriktionsverdau; TEV Ü: 3% Probe des Überstandes des Restriktionsverdaus; CaM Ü: 3% Überstand der CaM-Beads nach der Präzipitation CaM-Beads: 3% CaM-Beads nach Präzipitation; Spur Lysat, IgG Ü, IgG-Beads: Banden auf der Höhe von ~90 kDa; Spur IgG-Beads: zusätzliche Bande bei ~50 kDa; Spur TEV Ü und CaM-Beads: Banden auf einer Höhe von ~75 kDa; Precision Plus Protein™ Kaleidoscope Marker; Antikörper: primärer Antikörper α-rBLINaC 1:5000; sekundärer Antikörper donkey-anti-rabbit-HRP 1:5000.

62 3.1.2 Massenspektrometrie Versuch

Um mögliche Interaktionspartner nach der Präzipitation zu analysieren wurde durch Dr. Christian Preisinger (IZKF UK-Aachen) eine massenspektrometrische Analyse der an die CaM-Beads gebundenen Proteine durchgeführt. Hierzu wurden TAP-Versuche mit mBASIC N-TAP, rBASIC N-TAP und einer Negativkontrolle, einem TAP-Tag ohne BASIC, durchgeführt. Die CaM-Beads wurden für einen On-Bead Verdau an die IZKF Core Facility übergeben. In der massenspektrometrischen Analyse konnten über 400 Proteine detektiert werden, die mit BASIC präzipitiert wurden. Um zufällig präzipitierte Proteine von möglichen Interaktionspartnern von BASIC zu unterscheiden, wurden alle detektierten Peptide nach verschiedenen Kriterien untersucht. Zu den ausschlaggebenden Messwerten gehören der MS/MS Count und die Intensität. Der MS/MS Count gibt Auskunft über die Anzahl der gemessenen MS-Spektren für ein entsprechendes Peptid. Die Intensität hingegen ist der extracted ion current (XIC), ein Masse-Ladung Verhältnis, das Auskunft über die Stärke des detektierten Signals gibt. Für beide Werte gilt, dass wenn der Wert in der Kontrolle gering oder gleich null ist, aber deutlich größer für r- und mBASIC ist, ist die Wahrscheinlichkeit für eine spezifische Präzipitation hoch. In die engere Auswahl wurden solche Proteine genommen, die mindestens einen doppelt so hohen MS/MS Count bei r- oder mBASIC im Vergleich zur Kontrolle hatten. Des Weiteren musste die log ratio mindesten 1,5 betragen. Die log ratio ist die logarithmische Ableitung des Verhältnisses der Intensität der Peptide von r- oder mBASIC zur Kontrolle. Eine log ratio von 1 würde bedeuten, dass die Intensität des detektierten Peptids mindestens doppelt so hoch bei m-/rBASIC ist wie bei der Kontrolle. Eine log ratio von 2 bedeutet schon eine 4 mal stärkere Intensität der Peptide bei BASIC zur Kontrolle. So ausgewertet hat sich die Liste möglicher Interaktionspartner auf 21 Proteine reduziert. Die anderen Kandidaten sind höchstwahrscheinlich unspezifische Präzipitationspartner. Die 21 Kandidaten sind in drei Gruppen unterteilt worden. In Tab. 6 sind in grün die Proteine gekennzeichnet, die einen MS/MS Count <10 in der Kontrolle und gleichzeitig einen Wert >20 für m- und rBASIC haben, die also als wahrscheinliche Interaktionspartner infrage kommen. Der MS/MS Count ratte/maus BASIC ist in der Regel mindestens 10-mal größer als in der Kontrolle. In blau sind die Proteine gekennzeichnet, die einen MS/MS Count >11 gegenüber der Kontrolle haben, aber einen mindestens doppelt so hohen Wert für m- und rBASIC haben. In gelb sind die Proteine gekennzeichnet, welche einen MS/MS Count <10 in der Kontrolle

63 zeigen und der Wert für m- und rBASIC <20 aber mindesten 5 mal größer als in der Kontrolle ist. Hier ist es am wenigsten klar, ob es sich um spezifische Interaktionspartner handelt. Die log ratio gibt darüber hinaus einen Hinweis auf die Spezifität der Präzipitation, da für sich für jede Steigerung der log ratio um 1 das Verhältnis der Intensitäten verdoppelt. Auffällig bei den 21 Kandidaten ist die hohe Anzahl an Membran- oder Zytoskelett- assoziierten Proteinen. Es sind vier verschiedene Isoformen von Tubulin aufgeführt, eine Isoform von Aktin, und sechs Isoformen des mit Aktin assoziierten Myosins. Des Weiteren ist das Aktin-bindende Protein Drebrin aufgeführt, das die Polymerisation von Aktin unterstützt. Calnexin und Calmegin sind zwei ER-assoziierte Chaperone. Calnexin ist membrangebunden und die Aktivität Ca2+-abhängig. Die Expression von Calmegin ist bisher nur in den Testes beschrieben (Tanaka et al. 1997). Clathrin ist ein Protein, das die Vesikelbildung an der Plasmamembran unterstützt. Zwei mitochondriale Proteine sind die ADP/ATP Translokase 1/2/3 und der mitochondriale Phosphat-Transporter (Phosphate carrier protein, mitochondrial). Die ADP/ATP Translokase transportiert ADP in die Mitochondrien und ATP aus den Mitochondrien in das Cytoplasma. Der Phosphat- Transporter hingegen transportiert Phosphate in die Mitochondrien und ist Teil der Atmungskette. Das Protein Emerin ist mit der Membran des Zellkerns assoziiert. Es ist für die Stabilität des Zellkerns zuständig und befindet sich zwischen Lamina und Kernhülle (Lattanzi et al. 2003; Sakaki et al. 2001). Insulin receptor subrate 4 ist ein cytoplasmatisches Protein, das viele mögliche Tyrosin und Serine/Threonin Phosphorylierungsstellen hat. Das Protein wird bei Interaktion mit dem Insulin Rezeptor durch dessen Tyrosin-Kinasen phosphoryliert und kann dann mit cytoplasmatischen SH2 Domänen enthaltenden signaling Molekülen interagieren (White, 2002; Hoxhaj et al. 2013). ATPase family AAA domain-containing proteins sind weitere mit den Mitochondrien assoziierte Proteine. Sie spielen eine Rolle in der Organisation und dem Metabolismus der Mitochondrien und stehen im Verdacht auch ein wichtiger Teil des Proteinsynthese- Komplex zu sein (Snider und Houry, 2008). Das Pleckstrin homology domaine-containing family S member 1 Protein beinhaltet die PH-Domäne, welche beim intrazellulären signaling und dem Zytoskelett eine Rolle spielt. So kann die Pleckstrin-Homologie-

Domäne sowohl Phosphatidylinositol Lipide wie PIP2 und PIP3 binden, als auch mit Proteinen wie den βγ-Untereinheiten von G-Proteinen, oder der Proteinkinase C interagieren (Wang et al. 1994/1995; Yao et al. 1994). Dies soll unter anderem der Rekrutierung verschiedener Proteine an Membranen dienen, damit diese signaling

64 Komplexe bilden können. Interessanterweise beinhaltet das Protein Insulin receptor substrat 1 auch eine PH Domäne. Da die Zytoskelett- oder Membran-assoziierten Proteine in der Auswertung der massenspektrometrischen Analyse überwiegen und BASIC selbst ein Membranprotein ist, wurden das Hauptaugenmerk in den folgenden Versuchen auf diese Proteine gelegt.

65 MS/MS MS/MS MS/MS Intensität Intensität Intensität log ratio log ratio Protein Namen Count Count Count Kontrolle Maus Ratte m/c r/c Kontrolle Maus Ratte Myosin-10 0 137 220 1,00E+00 2,94E+08 3,11E+08 28,13 28,21 Tubulin beta-4A/B chain 0 130 200 1,00E+00 2,26E+08 2,24E+08 27,75 27,74 Calnexin 0 42 82 1,00E+00 8,20E+07 1,26E+08 26,29 26,90 Clathrin heavy chain 1 0 62 53 1,00E+00 9,30E+07 4,16E+07 26,47 25,31 Calmegin 0 40 40 1,00E+00 5,44E+07 5,16E+07 25,70 25,62 Drebrin 0 25 15 1,00E+00 3,00E+07 2,41E+07 24,84 24,52 ADP/ATP translocase 1/2/3 1 165 83 6,55E+06 2,36E+08 1,61E+08 5,17 4,62 Unconventional myosin-VI 1 35 15 4,21E+05 8,03E+07 2,00E+07 7,57 5,57 Actin, cytoplasmic 1/N-terminally processed 4 79 115 4,94E+07 2,11E+08 2,26E+08 2,10 2,19 Myosin regulatory light chain 12A/B 6 57 47 1,72E+07 7,37E+07 4,50E+07 2,10 1,39 Phosphate carrier protein, mitochondrial 7 103 102 1,11E+07 1,60E+08 1,06E+08 3,85 3,26 Myosin light chain 1/3, skel. muscle isoform 1 22 12 7,91E+06 7,68E+07 7,89E+07 3,28 3,32 Tubulin beta chain 119 1348 981 1,59E+08 2,61E+09 1,81E+09 4,04 3,51 Myosin light chain kinase 2, skel./card. muscle 81 2103 2646 1,27E+08 9,02E+09 1,42E+10 6,15 6,80 Tubulin alpha chain isoforms 42 966 720 5,60E+07 2,23E+09 1,96E+09 5,32 5,13 Myosin light polypeptide 6 107 266 232 1,53E+08 4,49E+08 5,22E+08 1,56 1,77 Tubulin beta-2A/B chain 0 8 2 1,00E+00 1,19E+08 3,04E+07 26,83 24,86 Emerin 1 15 6 6,59E+05 1,60E+07 6,38E+06 4,60 3,27 Insulin receptor substrate 4 1 12 5 2,52E+05 7,53E+06 1,21E+07 4,90 5,59 ATPase family AAA domain-containing proteins 1 7 14 3,14E+05 3,30E+06 6,11E+06 3,39 4,28 Pleckstrin homol. domain-cont. fam. S member 1 5 19 15 9,29E+06 5,26E+07 5,46E+07 2,50 2,56 Tabelle. 6: Auswertung der massenspektrometrischen Analyse möglicher Interaktionspartner von r- und mBASIC-N-TAP. Expression von mBASIC-N-TAP und rBASIC-N-TAP wurde in stabil transfizierten HEK293/FRT/TO Zellen induziert; Zellen wurden lysiert und m- und rBASIC (bile acid-sensitive ion channel) per tandem affinity purification (TAP) aufgereinigt. Die an die Calmodulin-Beads präzipitierten Proteine wurden per On-Bead-Verdau für die massenspektrometrische Analyse vorbereitet; Kontrolle: TAP-Tag ohne weiteres Protein; MS/MS count: Anzahl der gemessen MS-Spektren für entsprechendes Peptid; Intensität: zusammengenommene eXtracted Ion Current (XIC) aller isotopischen Cluster die mit der identifizierten Aminosäure Sequenz assoziiert sind; Log ratio: logarithmische Ableitung des Verhältnisses der Intensitäten des ratten/maus BASIC zur Kontrolle. In grün: Proteine welche in der Kontrolle nicht/sehr wenig vorkommen aber stark an r- und mBASIC sind; in blau: Proteine die in der Kontrolle vorhanden sind aber deutlich höher an r- und mBASIC sind; in gelb: Proteine die in der Kontrolle nicht/sehr wenig vorkommen aber auch wenig an r- und mBASIC sind.

66 3.1.3 Co-Immunpräzipitation

Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse der BASIC-TAP-Versuche haben eine Reihe verschiedener, möglicher Interaktionspartner von BASIC geliefert. Um eine Aussage über die Qualität der Präzipitation zu treffen, mussten die Interaktionen zwischen BASIC und den identifizierten Proteinen mittels anderer Techniken weiter untersucht werden. Im folgenden wurden Co-Immunpräzipitationsversuche durchgeführt um eine Interaktion zu verifizieren. In diesen Versuchen konnten keine TAP-Tag fusionierten Konstrukte eingesetzt werden, da der TAP-Tag Protein A beinhaltet, welches IgG- Antikörper binden kann. Dies kann zu falsch positiven Ergebnissen führen. Es wurden im folgenden Versuch GFP-fusionierte BASIC-Konstrukte verwendet. Für die Co- Immunpräzipitation wurde rBASIC-GFP in HEK293 Zellen transfiziert. Die Zellen wurden nach 24 h lysiert. Das Zelllysat wurde mit anti-BASIC-Antikörper oder dem zu untersuchenden Protein spezifischen primären Antikörpern inkubiert. Danach wurden Protein A/G-Beads hinzugefügt, welche den Protein-Antikörper-Komplex binden. Die Protein A/G-Beads wurden abzentrifugiert, gewaschen, und später mit Probenpuffer für die SDS-Gelelektrophorese denaturiert. Es wurde sowohl die Co-Immunpräzipitation eines BASIC-GFP-Konstrukts, als auch der GFP-fusionierten 30 Aminosäuren des N-Terminus von BASIC mit Tubulin durchgeführt (Abb. 3.1.2). Der N-Terminus wurde als zusätzliches Konstrukt gewählt, da bekannt ist, dass viele Proteine über die intrazellulären N- und C-Termini der DEG/ENaC Kanäle interagieren. Da Tubulin eines der häufigsten Ergebnisse der Massenspektrometrie war, wurde es ausgewählt, um erste Interaktionsstudien mit BASIC durchzuführen. Im Co- Immunpräzipitationsversuch von BASIC-GFP mit Tubulin konnte in den Untersuchten HEK293 Zellen jeweils eine deutliche Expression von transfiziertem BASIC-GFP (Abb. 3.1.2 A, oben) und nativem Tubulin (Abb. 3.1.2 A, Mitte) detektiert werden. Des weiteren konnte Tubulin detektiert werden, welches im Versuch über BASIC-GFP mit einem α- rBLINaC Antikörper präzipitiert worden ist (Abb. 3.1.2 A, unten). In den Co-Immunpräzipitationsversuchen mit GFP-fusionierten N-Terminus von BASIC mit Tubulin konnte sowohl die Expression von BASIC-N-Terminus-GFP (Abb. 3.1.2 B, oben) nachgewiesen werden, als auch die Expression von nativem Tubulin (Abb. 3.1.2 B, Mitte). In diesen Versuchen konnte über Tubulin und α-Tubulin Antikörper präzipitierter BASIC N- Terminus-GFP detektiert werden (Abb. .3.1.2 B, unten) Die Ergebnisse deuten auf eine Interaktion von BASIC und Tubulin hin. Für BASIC ist eine Membransensitivität

67 beschrieben (Schmidt et al. 2014). So aktivieren Detergenzien rBASIC direkt und andere membranverändernde Substanzen steigern die Aktivierung von BASIC durch UDCA. Damit BASIC durch die Veränderung der Membran beeinflusst werden kann, muss BASIC in der Plasmamembran verankert sein. Die Interaktion mit dem Zytoskelett könnte BASIC möglicherweise genügend stabilisieren, um ihn durch membranverändernde Substanzen zu aktivieren. Dies könnte ein Hinweis für die indirekte Aktivierung von BASIC durch eine Veränderung der Membran sein.

Abbildung 3.1.2: Co-Immunpräzipitation von BASIC-GFP u. BASIC-N-Terminus GFP gegen Tubulin. A: Oben, Expression von BASIC-GFP in transient transfizierten HEK293 Zellen; Bande auf Höhe von ~95 kDa; primärer Antikörper α-rBLINaC 1:5000; sekundärer Antikörper donkey-anti-rabbit-HRP 1:5000. Mitte, endogene Expression von Tubulin in HEK293 Zellen; Bande auf Höhe von ~50 kDa; primärer Antikörper α- Tubulin 1:5000; sekundärer Antikörper anti-mouse-HRP 1:5000. Unten, Immunpräzipitation von Tubulin über BASIC und 1 µl α-rBLINaC Antikörper; Bande auf Höhe von ~50 kDa; primärer Antikörper α-Tubulin 1:5000; sekundärer Antikörper anti-mouse-HRP 1:5000. B: Oben, Expression von BASIC-N-Terminus GFP in transient transfizierten HEK293 Zellen; Bande auf Höhe von ~32 kDa; primärer Antikörper α-GFP 1:5000; sekundärer Antikörper anti-mouse-HRP 1:5000. Mitte, nativ Expression von Tubulin in HEK293 Zellen; Bande auf Höhe von ~50 kDa; primärer Antikörper α-Tubulin 1:5000; sekundärer Antikörper anti-mouse-HRP 1:5000. Unten, Immunpräzipitation von BASIC-N-Terminus GFP über Tubulin und 1 µl α-Tubulin Antikörper; Bande auf Höhe von ~32 kDa; primärer Antikörper α-GFP 1:5000; sekundärer Antikörper anti-mouse-HRP 1:5000.

68 3.1.4 Interaktionsstudie des BASIC-N-Terminus-GFP und der Plasmamembran

Die mögliche Interaktion des BASIC-N-Terminus mit Tubulin in Abb 3.1.2 B zeigt, dass der N-Terminus eine mögliche Region für Proteininteraktionen ist. Es ist bekannt, dass die zytosolischen Domänen der DEG/ENaC-Kanalfamilie sowohl eine Rolle in der Regulation der Kanäle als auch in der Modulation ihrer biophysikalischen Eigenschaften spielen (Kellenberger und Schild, 2015). Ein Beispiel hierfür ist der C-Terminus des ENaC, der ein konserviertes PY-Motiv enthält und eine Bindungsstelle für Nedd4 bietet (Staub et al. 1996). ASICs haben ein PDZ-Motiv in der C-terminalen Domäne, das als Interaktionsstelle für viele regulatorische Proteine gilt (Kellenberger und Schild, 2015). Um die möglichen Eigenschaften der zytosolischen Domänen von BASIC zu identifizieren wurden einzelne Bereiche der N- und C-Terminalen Bereiche des BASIC deletiert. Bei der Deletion des zytosolischen N-Terminus konnte beobachtet werden, dass die Aktivität von rBASIC gesteigert wird. Sequenzanalysen dieser Region haben eine putative amphiphile α-Helix gezeigt (Schmidt und Löhrer et al. 2016). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die polaren Reste der Helix Richtung der hydrophilen Kopfregion ausgerichtet sind und die unpolaren Reste der Helix Richtung der hydrophoben Kohlenwasserstoffschwänze der Phospholipide der Membran ausgerichtet sind (Schmidt und Löhrer et al. 2016). So könnte der N-Terminus mit der Membran verbunden sein. Daher wurden neben der Verifikation der Interaktionen auch eine Analyse der möglichen Membranbindung durchgeführt. Hierzu wurden HEK293 Zellen transient mit drei verschiedenen BASIC-N-Terminus GFP Konstrukten transfiziert. Das erste Konstrukt umfasste die ersten 30 Aminosäure des BASIC-N-Terminus (N-Term). Das zweite Konstrukt bestand aus den ersten 30 Aminosäuren des BASIC-N-Terminus mit einer Deletion der Aminosäuren 15-25 (N-Term Δ15-25). Das dritte Konstrukt beinhaltete die ersten 30 Aminosäuren des BASIC-N- Terminus, wobei ein Arginin an Position 21 gegen ein Prolin ersetzt worden ist (N-Term R21P). Durch den großen Rest des Prolins entsteht ein Knick in der helikalen Struktur. Alle Konstrukte waren mit GFP terminal fusioniert. Die Zellen wurden nach 24 h lysiert und anschließend in eine Triton-X-lösliche, zytosolische Fraktion und eine Triton-X-unlösliche Membranfraktion getrennt. Die Fraktionen wurden per SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und die N-Terminus-Konstrukte im Western Blot mit anti GFP-Antikörper nachgewiesen. Es zeigte sich, dass der aus 30 Aminosäuren bestehende N-Terminus von BASIC (N- Term) beinahe ausschließlich in der Membranfraktion zu finden war (Abb. 3.1.3, Mitte). Die trunkierten oder mutierten Konstrukte des N-Terminus ( N-Term Δ15-25, N-Term R21P)

69 sowie GFP ohne BASIC-N-Terminus ließen sich hingegen ausschließlich in der zytosolischen Fraktion des Lysats nachweisen (Abb. 3.1.3, oben). Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass der N-Terminus tatsächlich für eine Bindung an die Plasmamembran verantwortlich ist. Es konnte des Weiteren gezeigt werden, dass es im speziellen die Aminosäuren 15-25 des N-Terminus sind, welche die Membranbindung begünstigen und der Helix ihren, für die Bindung wichtigen, amphiphilen Charakter geben.

Abbildung 3.1.3: Interaktionsstudie des BASIC-N-Terminus mit der Plasmamembran. Repräsentativer Westernblot der zytosolischen und Membranfraktion transient transfizierter HEK293 Zellen. BASIC-N- Terminus GFP (N-Term) ist ausschließlich in der unlöslichen Membranfraktion vorhanden (Mitte, Membranfraktion). BASIC-N-Terminus Δ15-25 GFP (N-Term Δ15-25), BASIC-N-Terminus R21P (N-Term R21P) und GFP alleine (GFP) sind in der zytosolischen Fraktion nachweisbar (Oben, zytosolische Fraktion). Ladekontrolle: Tubulin (Unten, Tubulin Kontrolle) primärer Antikörper α-GFP 1:5000; sekundärer Antikörper anti-mouse-HRP 1:5000; Unten, primärer Antikörper α-Tubulin 1:5000; sekundärer Antikörper anti-mouse- HRP 1:5000 (modifiziert aus Schmidt und Löhrer et al. 2016)

70 3.2 Charakterisierung von rBASIC in normal rat cholangiocytes (NRCs)

3.2.1 Expression des BASIC in Cholangiocyten

Cholangiocyten sind die Epithelzellen der Gallengänge, die die Leber mit dem Darm verbinden. Aus Ratten-Cholangiocyten wurde eine immortalisierte Zelllinie erstellt, welche als normal rat cholangiocytes (NRCs) bezeichnet wird (Vroman und LaRusso, 1996). Immunhistologische Untersuchungen deuten darauf hin, dass BASIC in Cholangiocyten exprimiert wird (Wiemuth et al. 2012; unpublizierte Daten D. Wiemuth). Zur Verifikation wurden verschiedene Techniken verwendet.

Um die Expression von BASIC auf RNA- Ebene nachzuweisen wurde die gesamte RNA von einer 10cm Platte konfluenter NRCs isoliert und in cDNA transkribiert. Die cDNA wurde daraufhin mit zwei verschiedenen Primer Paaren Abbildung 3.2.1: Nachweis der Expression von rBASIC auf RNA-Ebene. Expression der rBASIC mRNA amplifiziert. Durch die Amplifikation des in kultivierten NRCs nachgewiesen durch RT-PCR Versuche; NRCs auf kollagenbeschichteten Template mit Primer Paar 1 konnte ein Zellkulturschalen kultiviert. Aus einer konfluenten Zellschicht NRCs wurde die gesamt RNA isoliert und in Konstrukt von ~500 bp erzeugt werden cDNA transkribiert; Zwei Primer Paare wurden zur (Abb. 3.2.1, links, +), was der durch das Amplifizierung zwei verschiedener rBASIC Fragmente genutzt; Primer Paar 1, erwartete PCR-Fragment Länge Primer Paar 1 erwarteten Größe des 506 bp; Primer Paar 2, erwartete PCR-Fragment Länge 354 bp; Negativ Kontrolle, RT-PCR ohne template DNA; Fragments entspricht. In der M=Marker (100bp) Negativkontrolle (Amplifikation ohne Template) konnte kein Fragment erzeugt werden (Abb. 3.2.1, links, -). Durch Amplifikation des Template mit Primer Paar 2 wurde ein Fragment von ~350 bp erzeugt (Abb. 3.2.1, rechts, +), was der erwarteten Größe des Fragments entspricht. In der Negativkontrolle (ohne Template) konnte kein Fragment nachgewiesen werden (Abb. 3.2.1, rechts, -). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass BASIC mRNA in NRCs vorkommt.

Für den Nachweis von BASIC auf Proteinebene wurde eine 10 cm Platte konfluenter NRCs lysiert und in eine Triton-X-100 unlösliche Membranfraktion und eine Trition-X-100 lösliche zytosolische Fraktion getrennt. Die Fraktionen wurden in einer SDS- Gelelektrophorese aufgetrennt und auf einem Western Blot dargestellt. Es konnte gezeigt

71 werden, dass BASIC in der unlöslichen Membranfraktion vorhanden und in der zytosolischen Fraktion abwesend ist (Abb. 3.2.2, Membran, Zytosol). Als Vergleich wurden rBASIC exprimierenden Xenopus laevis Oozyten verwendet (Abb. 3.2.2, rBASIC). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass auch endogener BASIC eine Verbindung mit der Membran hat. Um BASIC auch immunhistochemisch nachzuweisen wurden die Zellen auf kollagenbeschichteten Deckgläsern kultiviert. Danach wurden die NRCs mit 4% PFA fixiert, mit 0,05% Triton-X-100 permeabilisiert und mit 3% BSA fixiert. BASIC wurde mit anti-rBASIC Antikörper Abbildung 3.2.2: Nachweis der Expression von rBASIC auf Protein Ebene. Expression des rBASIC in markiert und mit sekundärem AlexaFluor NRCs nachgewiesen durch Western Blot Versuche; rBASIC ist in der Trition-X-100 unlöslichen 488 Antikörper gefärbt. Die NRCs sind in Membranfraktion aber nicht in der Trition-X-100 löslichen der Aufsicht (Abb. 3.2.3, Mitte, Projektion zytosolischen Fraktion; Kontrolle, Membran Fraktion von BASIC exprimierenden Xenopus laevis Oozyten; des Z-Stapels) und in optischen erwartetes Molekulargewicht von rBASIC 70 kDa; primärer Antikörper polyklonaler anti-rBASIC Antikörper Schnitten durch den Z-Stapel von der 1:5000; sekundärer Antikörper donkey-anti-rabbit-HRP 1:1000; M=Marker (100bp) Seite zu sehen (Abb. 3.2.2, oben und rechts). In grün ist die Expression von BASIC in den NRCs zu sehen. Die Expression von BASIC ist nicht genau zu lokalisieren. So könnte BASIC sowohl in der Membran des ER exprimieren, als auch in der Plasmamembran vorhanden sein. Der Antikörper färbt möglicherweise auch unreifen BASIC im ER oder abgebauten BASIC in den Lysosomen an. In blau sind die mit DAPI gefärbten Nuklei der NRCs zu sehen. Die immunhistochemischen Ergebnisse lassen vermuten, dass BASIC eine deutliche Expression in normal rat cholangiocytes hat, aber eine genaue subzelluläre Lokalisation war bisher nicht möglich. In zukünftigen Experimenten könnte durch Ko-Expression mit Organell-Markern eine genauere Lokalisation erreicht werden.

72 Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Expression von BASIC in Cholangiocyten mit mehreren Techniken nachgewiesen werden konnte.

Abbildung 3.2.3: Nachweis der Expression von rBASIC auf zellulärer Ebene. Expression von rBASIC in NRCs nachgewiesen durch Immunhistochemie. Aufsicht und optische Schnitte durch den Z-Stapel von der Seite; NRCs wurden auf kollagenbeschichteten Deckgläschen kultiviert, mit 4% PFA fixiert, permeabilisiert mit 0,05% Trition-X-100, blockiert mit 3% BSA und gefärbt mit polyklonalem rabbit anti-rBASIC Antikörper und anti- rabbit AlexaFluor 488 Antikörper (grün), Nuklei wurden mit DAPI gefärbt (blau)

73 3.2.2 Elektrophysiologische Untersuchung von BASIC in NRCs mittels Ussing- Kammer

Nachdem die Expression des rBASIC in normal rat cholangiocytes (NRCs) nachgewiesen wurde, sollte im nächsten Schritt die Funktion von BASIC in NRCs charakterisiert werden. Es wurden transepitheliale Ströme der NRCs mit der Ussing-Kammer-Methode gemessen, um einen möglichen Beitrag von BASIC zu untersuchen. Die NRCs wurden auf Snap-Well- Filtern kultiviert und 4-6 Tage nach Ausbildung eines Epithels für die Messungen verwendet. Um die Funktionalität und Vitalität der NRCs einzuschätzen, wurden zu Beginn jeder Messung 100 µM ATP appliziert. ATP ist ein wichtiges auto- und parakrines Signalmolekül für das Ca2+-signaling (Abb. 3.2.4). Über purinerge Kanäle und Rezeptoren wird eine intrazelluläre Erhöhung der Ca2+-Konzentration vermittelt, welche zu einem Cl--Efflux führt (Abb. 3.2.4). Der Cl--Efflux kann in der Ussing-Kammer gemessen werden. Für die Versuche wurden Zellen mit robuster Antwort auf ATP Applikation verwendet.

Abbildung 3.2.4: Schematische Darstellung der purinergen Signalwege in Cholangiocyten und dem möglichen Einfluss von Gallensäuren und Diminazen auf BASIC. ATP kann die purinergen Proteine 2+ (P2Y/P2X) aktivieren, wodurch es zu einer Steigerung der [Ca ]int kommt. Dadurch werden Calcium aktivierte Chlorid Kanäle (CaCC) aktiviert und Chlorid wird sezerniert. BASIC kann durch Gallensäuren (GS) aktiviert werden, jedoch ist die Funktion in Cholangiocyten unbekannt. Diminazen (DIMI) ist ein bekannter Inhibitor für BASIC. ATP, GS und DIMI werden Apikal appliziert.

74 rBASIC kann durch Gallensäuren aktiviert werden (Abb. 3.2.4). Daher wurde im ersten Schritt extrahierte Schweinegalle in einer 1:100 Verdünnung eingesetzt, um eine mögliche Antwort durch BASIC zu beobachten. Die Applikation von 100 µM ATP erzeugte einen Anstieg des transepithelialen Stroms von 6,69 ± 0,41 µA (Abb. 3.2.5, A). Die darauffolgende Applikation von verdünnter Galle (GS) führte zu einem Anstieg des Stroms von 3,24 ± 0,36 µA (Abb. 3.2.5, A). Da der Gallensäuren-aktivierte Strom möglicherweise ein BASIC-abhängiger Strom ist, wurden weitere Untersuchungen mit pharmakologischen Mitteln wie Diminazen durchgeführt. Bei Diminazen handelt es sich um einen spezifischen Inhibitor von BASIC (Abb. 3.2.4). Die Applikation von 100 µM Diminazen zu Beginn der Messung führte zu keiner Veränderung des Stroms. Applikation von ATP löst einen transepithelialen Strom von 7,51 ± 0,46 µA aus (Abb. 3.2.5, B). Die darauffolgende Applikation von verdünnter Schweinegalle führte zu einer Erhöhung des Stroms um 2,08 ± 0,21 µA (Abb. 3.2.5, B). Etwa 50% des durch Gallensäuren aktivierten Stroms wurde demnach durch Diminazen inhibiert. rBASIC wird als selektiver Kationenkanal beschrieben. Um zu testen, ob der beobachtete Strom durch Na+ getragen wird, wurde im nächsten Schritt das extrazelluläre Na+ durch NMDG+ ersetzt. NMDG+ ist ein Kation, das größer als Na+ ist und daher i. d. R. nicht durch Ionenkanäle permeieren kann. Die Applikation von ATP führte zu einem transienten Anstieg des Stroms auf 9,83 ± 0,38 µA (Abb. 3.2.5, C). Der Gallensäuren-aktivierte Strom betrug 0,43 ± 0,08 µA (Abb. 3.2.5, C). Die statistische Auswertung (Abb. .3.2.5, D) ergab, dass der ATP-induzierte Strom bei 7,2 ± 0,43 µA liegt. Der durch verdünnte Schweinegalle hervorgerufene Strom liegt bei 4,11 ± 0,71 µA. Der durch Gallensäuren aktivierte Strom nach Applikation von Diminazen liegt bei 1,72 ± 0,43 µA. Diminazen reduziert demnach den Galle-aktivierten Strom um 58%. Die Entfernung von extrazellulärem Na+ verringert den durch verdünnte Schweinegalle aktivierten Strom auf 0,13 ± 0,05 µA. Zusammengefasst konnte so gezeigt werden, dass durch Gallensäuren ein Diminazen- sensitiver und Na+-abhängiger Strom induziert werden kann. Dies deutet darauf hin, dass ein Teil des beobachteten Stroms durch BASIC vermittelt wurde.

75 Abbildung 3.2.5: Gallensäuren aktivieren einen Diminazen-sensitiven transepithelialen short-circuit Strom in NRCs. Apikale Applikation von ATP (100 µM) und Gallensäuren (1:100 verdünnte Schweinegalle) führen zu einem kurzen (≈10 min) Anstieg des Isc; NRCs wurden auf Snap-Well-Filtern (Porengröße 0,4 µM) kultiviert und 4-6 Tage nach erreichen eines transepithelialen Widerstand von ~350 Ω für die Messungen verwendet; die Filter wurden in ein Ussing-Kammer Set Up eingespannt; das transepitheliale Potential und der Widerstand wurden jede Minute gemessen; A: Diese repräsentative Spur zeigt die Erhöhung des Isc nach Applikation von ATP um 6,69 ± 0,41 µA; die Applikation von verdünnter Schweinegalle führt zu einer

Erhöhung des Isc um 3,24 ± 0,36 µA; B: Repräsentative Spur nach Applikation von 100 µM Diminazen zu Beginn der Messung; Applikation von ATP führt zu einer Erhöhung des Isc um 7,51 ± 0,46 µA; die Applikation von verdünnter Schweinegalle führt zu einer Erhöhung des Isc um 2,08 ± 0,21 µA; C: Repräsentative Spur + nach Wegnahme von extrazellulären Na ; Applikation von ATP erhöht den Isc um 9,83 ± 0,38 µA; die Applikation von verdünnter Schweinegalle führt zu einer Erhöhung des Isc um 0,43 ± 0,1 µA; D: Zusammenfassung der Isc aller Messungen aus A-C. Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt, ** p<0.01, ungepaarter zweiseitiger t-test, n=6-72

76 Galle besteht aus verschiedenen Gallensäuren in verschiedenen Konzentrationen. Es konnte in verschiedenen Studien gezeigt werden, dass BASIC durch die einzelnen Gallensäuren aktiviert werden kann. Nachdem gezeigt werden konnte, dass verdünnte Schweinegalle einen Diminazen-sensitiven Strom in NRCs hervorruft, sollte im nächsten Schritt ein Vergleich zu einzelnen Gallensäuren gezogen werden. Die Kombinationen und Konzentrationen der Gallensäuren für die folgenden Versuche wurden wie folgt ausgewählt. Die Kombination von 1 mM HDCA in Kombination mit 0,5 mM CDCA wurde gewählt da, wie auf S. 21 beschrieben, HDCA in Verbindung mit CDCA den stärksten aktivierenden Effekt auf rBASIC haben (Wiemuth et al. 2012; Wiemuth et al. 2013). UDCA gilt als Therapeutikum für verschiedene Cholangiopathien. Daher wurde 1 mM UDCA in Kombination mit 0,5 mM CDCA verwendet, um mögliche synergetische Effekte der Gallensäuren, wie bei HDCA und CDCA, mit in Betracht zu ziehen. Des Weiteren wurde 4 mM UDCA in Kombination mit 0,5 mM CDCA verwendet.

Alle Gallensäuren-Kombinationen und Konzentrationen konnten einen transepithelialen Strom in NRCs erzeugen. 1 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA riefen einen Strom von 3,75 ± 0,55 µA hervor. 1 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA erzeugten einen Strom von 2,37 ± 0,30 µA. 4 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA erzeugten einen leicht größeren Strom von 2,58 ± 0,35 µA (Abb. 3.2.6, A). Es ließ sich ein Einfluss von Diminazen auf die von den einzelnen Gallensäuren hervorgerufenen Ströme beobachten. Der durch verdünnte Galle hervorgerufene Strom unter Einfluss von Diminazen verringerte sich um ~60% von 4,11 ± 0,71 µA auf 1,72 ± 0,43 µA. Der HDCA-induzierte transepitheliale Strom verringerte sich signifikant um ~50% von 3,75 ± 0,55 µA auf 2,01 ± 0,5 µA. Diminazen verringerte den 1 mM UDCA-induzierten Strom signifikant um ~30% von 2,37 ± 0,3 µA auf 1,69 ± 0,26 µA. Bei 4 mM UDCA und 0,5 mM CDCA kam es zu einer signifikanten Verringerung um ~40% von 2,58 ± 0,35 µA auf 1,51 ± 0,23 µA (Abb. 3.2.6, B). Wie in den Messungen zu sehen war, induziert 1 mM HDCA mit 0,5 mM CDCA einen größeren Strom als 4 mM UDCA mit 0,5 mM CDCA. Der

EC50 Wert von UDCA auf BASIC ist größer als der von HDCA. Daher reichen niedrigere Konzentrationen HDCA aus um BASIC zu aktivieren. Die hier dargestellten Untersuchungen legten die Vermutung nahe, dass der endogene BASIC sensitiver auf HDCA, als auf UDCA reagiert. Es wird vermutet, dass die Sensitivität des BASIC auf die verschiedenen Gallensäuren je nach Spezies an die Zusammensetzung der Galle gekoppelt ist (Lefèvre et al. 2013; Wiemuth et al. 2013).

77 Abbildung 3.2.6: Vergleich der Aktivierung des transephitthelialen short-circuit Strom durch einzelne Gallensäuren in NRCs und die Inhibierung durch Diminazen. Apikale Applikation von Galle (1:100 verdünnte Schweinegalle) und Gallensäuren (1 mM HDCA/0,5 mM CDCA; 1 u. 4 mM UDCA/0,5 mM CDCA) führen zu einem kurzen (≈10 min) Anstieg des Isc; NRCs wurden auf Snap-Well-Filtern (Porengröße 0,4 µM) kultiviert und 4-7 Tage post Konfluenz nach erreichen eines transepithelialen Widerstand von ~350 Ω für die Messungen verwendet; die Filter wurden in ein Ussing-Kammer-Set Up eingespannt; das transepitheliale Potential und der Widerstand wurden jede Minute gemessen; der Strom wurde entsprechend des

Ohm'schen Gesetzt errechnet; A: Zusammenfassung der Isc aller Messungen zur Aktivierung der Strom durch Gallensäuren: 1:100 GS 4,11 ± 0,71 µA; 1 mM HDCA/0,5 mM CDCA 3,75 ± 0,55 µA; 1 mM UDCA/0,5 mM CDCA 2,37 ± 0,3 µA; 4 mM UDCA/0,5 mM CDCA 2,58 ± 0,35 µA; B: Zusammenfassung der

Isc aller Messungen zur Sensitivität der Gallensäuren aktivierten Ströme auf Diminazen: 1:100 GS Verringerung von 4,11 ± 0,71 µA auf 1,72 ± 0,43 µA; 1 mM HDCA/0,5 mM CDCA Verringerung von 3,75 ± 0,55 µA auf 2,01 ± 0,5 µA; 1 mM UDCA/0,5 mM CDCA Verringerung von 2,37 ± 0,3 µA auf 1,69 ± 0,26 µA; 4 mM UDCA/0,5 mM CDCA Verringerung von 2,58 ± 0,35 µA auf 1,51 ± 0,23 µA; Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, *=p<0.05, ungepaarter zweiseitiger t-test, n=9-35

78 3.2.3 Elektrophysiologische Untersuchung transepithelialer Ströme in BASIC-KO- NRCs

Diminazen hat einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf die durch Gallensäuren- induzierten Ströme. Es werden jedoch nur ~30-58% des durch Gallensäuren aktivierten Stroms inhibiert. Daher lässt sich annehmen, dass ~50% des Stroms, der durch Diminazen inhibiert wird, durch rBASIC getragen wird. Um die pharmakologischen Daten zur Rolle von BASIC in Cholangiocyten zu verifizieren, wurde ein weiterer Ansatz gewählt. Eine BASIC Knock-Out NRC Zelllinie wurde generiert.

Abbildung 3.2.7: Schematische Darstellung der Deletion von BASIC Exon 2 durch das Crispr/Cas9 System.

Als Grundlage für die Knock-Out Zelllinie wurden die den BASIC endogen exprimierenden NRCs gewählt. In diesen sollte ein 500 bp großes Fragment aus dem hinteren Teil des BASIC Exon 2 durch das Crispr/Cas9 System deletiert werden (Abb. 3.2.7; Abb. 5.1, Anhang). Die NRCs wurden mit Plasmiden transfiziert, die sowohl für Cas9, die crRNA, als auch für die spezifische tracrRNA codieren. Ein zusätzliches GFP auf den Plasmiden machte es möglich transfizierte Zellen zu identifizieren. NRCs sind schwer zu transfizieren und die Transfektionseffizienz lag bei ~1%. Die GFP-positiven Zellen wurden in einem FACS sortiert. Von 2 Millionen sortierten Zellen wurden ~20.000 aufgefangen und danach wieder dünn ausgesäht. Nachdem die einzelnen Klone Inseln gebildet hatten, wurden sie erneut gepickt und auf neue Zellkulturschalen überführt. Von 500 überprüften Klonen konnte eine monoklonale Zelllinie generiert werden, die den gewünschten Knock-Out enthielt. Der Knock-Out wurde durch PCR-basierte Typisierung der genomischen DNA der Zelllinie bestätigt. Entsprechende Primer wurden so gewählt, dass in WT Zellen ein ~800 bp Fragment amplifiziert würde. Bei einer erfolgreichen Deletion des ~500 bp großen Teils

79 von Exon 2 sollte nur noch ein Fragment von ~300 bp amplifiziert werden können (Abb. 3.2.8). Bei positivem Ergebnis der PCR Versuche wurden entsprechende 300 bp Fragmente ausgeschnitten, aufgereinigt und sequenziert um den Knock-Out zu bestätigen.

Abbildung 3.2.8: Schematische Darstellung der Typisierungsstrategie per PCR der genomischen DNA.

In Abb. 3.2.9. konnte der Knock-Out eines Klons nachgewiesen werden. So ist in der Spur KO eine Bande auf Höhe von ~300 bp zu sehen und im Vergleich dazu in den WT Spuren jeweils eine Bande auf Höhe von ~800 bp. Auch in der Sequenzierung konnte in diesem Klon die Deletion des Exon 2 verifiziert werden (Abb. 5.2, Anhang). Abbildung 3.2.9: PCR zur Kontrolle der NRC-KO Zelllinie. Es war keine offensichtliche, durch den Knock-Out Kontrolle des Exon 2 von rBASIC in kultivierten NRCs durch PCR ausgelöste, Veränderung des Phänotyps erkennbar. Versuche; NRC auf kollagen- Die BASIC-KO-NRCs wurden wie alle NRCs zuvor mit der beschichteten Zellkulturschalen kultiviert. Aus einer 6cm Schale Ussing-Kammer Methode untersucht. Es zeigte sich, dass konfluenter NRCs wurde die gesamt genomische DNA isoliert. der Kock-Out des BASIC Exon 2 erfolgreich war. Ein Primer-Paar gegen das Exon 2 wurde verwendet um die Schweinegalle (1:100) erzeugt in WT-NRCs einen Strom Deletion durch die Crispr/Cas9 Methode zu beweisen. KO: von 1,48 ± 0,33 µA. In BASIC-KO-NRCs verringerte sich Crispr/Cas9 transfizierte Zellen, der durch Schweinegalle aktivierte Strom signifikant auf Bande auf Höhe von ~300 bp; WT: Wildtyp NRCs; Bande auf 0,44 ± 0,15 µA (Abb. 3.2.10). Auch für alle anderen Höhe von ~800 bp; M=Marker (100bp) Gallensäuren zeigte sich der gleiche Effekt (Abb. 3.2.10). So reduziert sich der durch 1 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA-induzierte Strom in BASIC-KO- NRCs auf 1,69 ± 0,27 µA. Interessanterweise hat Diminazen auf den durch HDCA/CDCA hervorgerufenen Strom in BASIC-KO-NRCs keinen weiteren inhibitorischen Effekt. Der durch 1 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA-induzierte Strom in Anwesenheit von Diminazen hat

80 eine Amplitude von 1,15 ± 0,22 µA. Der durch 1 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA aktivierte Strom in BASIC-KO-NRCs ist nur geringfügig niedriger als in WT-NRCs und liegt bei 1,86 ± 0,26 µA. In BASIC-KO-NRCs reduziert sich der durch 4 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA aktivierte Strom von 2,58 ± 0,35 µA in WT-NRCs auf 1,19 ± 0,19 µA. Die Verringerung des Stroms in den BASIC-KO-NRCs ist für die 1:100 verdünnte Schweinegalle, 1 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA und 4 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA statistisch signifikant und liegt ähnlich wie bei Diminazen bei 29-70% des WT-NRC Stroms. Es ist sehr wahrscheinlich, dass ~30-50% des durch Gallensäuren-induzierten, Diminazen-sensitiven transepithelialen Stroms in NRCs BASIC-abhängig ist.

Abbildung 3.2.10: Aktivierung eines reduzierten transepithelialen short-circuit Stroms in BASIC-KO- NRCs durch verschiedene Gallensäuren. Apikale Applikation von Galle (1:100 verdünnte Schweinegalle) und Gallensäuren (1 mM HDCA/0,5 mM CDCA; 1 u. 4 mM UDCA/0,5 mM CDCA) führen zu einem kurzen

(≈10 min) Anstieg des Isc der in BASIC-KO-NRCs um ~30-70% reduziert ist; WT-NRCs und BASIC-KO- NRCs wurden auf Snap-Well-Filtern (Porengröße 0,4 µM) kultiviert und 4-6 Tage post Konfluenz nach erreichen eines transepithelialen Widerstand von ~350 Ω für die Messungen verwendet; die Filter wurden in ein Ussing Kammer Set Up eingespannt; das transepitheliale Potential und der Widerstand wurden jede Minute gemessen; der transepitheliale Strom wurde entsprechend des Ohm'schen Gesetzt errechnet; A:

Zusammenfassung der Isc aller Messungen zur Aktivierung der Strom durch Gallensäuren in WT-NRCs und BASIC-KO-NRCs: 1:100 GS 1,48 ± 0,33 µA in WT-NRCs, 0,44 ± 0,15 µA in BASIC-KO-NRCs; 1 mM HDCA/0,5 mM CDCA 3,75 ± 0,55 µA in WT-NRCs, 1,69 ± 0,27 µA in BASIC-KO-NRCs, Applikation von 100 µM Diminazen zu BASIC-KO-NRCs 1,15 ± 0,22 µA; 1 mM UDCA/0,5 mM CDCA 2,37 ± 0,3 µA in WT- NRCs, 1,86 ± 0,26 µA in BASIC-KO-NRCs; 4 mM UDCA/0,5 mM CDCA 2,58 ± 0,35 µA in WT-NRCs, 1,19 ± 0,19 µA in BASIC-KO-NRCs; Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, ** p<0.01, ungepaarter zweiseitiger t-test, n=8-35

81 3.2.4 Elektrophysiologische Untersuchung des Einflusses von Somatostatin auf BASIC

In den vorangehenden Versuchen mit den NRCs wurde gezeigt, dass durch Gallensäuren ein transepithelialer Strom induziert werden kann, der zu ~50% BASIC-abhängig ist. Die physiologische Funktion von BASIC wurde dadurch nicht geklärt. Es ist bekannt, dass einer der wichtigsten physiologischen Prozesse in den Cholangiocyten die durch Secretin hervorgerufene Sekretion von Flüssigkeit in das Lumen der Gallengänge und die damit verbundene Steigerung des Gallenflusses ist (Abb. 3.2.11). Somatostatin ist der Hauptantagonist dieses Prozesses (Abb. 3.2.11). Es könnte sein, dass BASIC eine Rolle bei der Sekretion oder Absorption in Cholangiocyten spielt. Wenn BASIC an der Sekretion beteiligt ist, sollte Somatostatin inhibierend wirken. Sollte BASIC an der Absorption beteiligt sein, so würde Somatostatin keinen Einfluss auf BASIC haben, oder seinen Strom oder seine Aktivität erhöhen (Abb. 3.2.11). Im folgenden Versuch wurde der Einfluss von Somatostatin auf den durch Gallensäuren- induzierten Strom untersucht. Dazu wurden die Zellen in 100nM Somatostatin enthaltendem Medium 12h vor der Messung inkubiert. Die Präinkubation mit Somatostatin führte zu keiner offensichtlichen Veränderung der Zellen oder des gemessenen Ruhestroms (Abb. 3.2.12, A). Die Applikation von ATP erzeugt einen transepithelialen Strom von 12,48 µA (Abb. 3.2.12, A). Nach der Applikation von Gallensäure (1:100) war keine messbare Erhöhung des Stroms zu erkennen (Abb. 3.2.12, A u. B). Auch die Applikation von 1 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA konnte nach der Inkubation mit Somatostatin keinen messbaren Strom mehr aktivieren (Abb. 3.2.12, B). Interessanterweise wirkte sich die Inhibition des Gallensäure aktivierten Stroms durch Somatostatin nicht, wie Diminazen, nur auf den durch BASIC getragenen Strom aus, sondern inhibierte auch den BASIC- unabhängigen Reststrom. Daher wird Somatostatin entweder einen direkten inhibierenden Effekt auf BASIC und die anderen an dem Strom beteiligten Proteine haben, oder die Inhibition der Sekretion und Herabregulierung der cAMP Synthese durch Somatostatin haben einen indirekten Einfluss auf den Strom.

82 Abbildung 3.2.11: Schematische Darstellung der Signalwege in Cholangiocyten und der mögliche Einfluss von Somatostatin auf BASIC. Secretin aktiviert über die Secretin Rezeptoren (SR) die Adenylatcyclase (AC). Durch die erhöhte cAMP Konzentration wird die PKA und somit der CFTR aktiviert. - - Entgegen des entstehenden Cl Gradienten wird HCO3 aus der Zelle transportiert (AE2). Dem Bicarbonat Gradienten folgend wird Wasser über Aquaporine (AQP) sezerniert. Somatostatin inhibiert über den - Somatostatin Rezeptor (sst) das cAMP signaling die Expression von Secretin Rezeptoren und die HCO 3 Sekretion.

Abbildung 3.2.12: Präinkubation von Somatostatin verringert den durch Gallensäuren aktivierten transepithelialen short-circuit Strom in NRCs. Apikale Applikation von ATP (100 µM), Galle (1:100 verdünnte Schweinegalle) und Gallensäuren (1 mM HDCA/0,5 mM CDCA) führen zu längeren (>10 min) Anstieg des Isc; Somatostatin inhibiert den durch Galle und Gallensäuren aktivierten Strom zu 100%; NRCs wurden auf Snap-Well-Filtern (Porengröße 0,4 µM) kultiviert und 4-6 Tage post Konfluenz nach erreichen eines transepithelialen Widerstand von ~350 Ω für die Messungen verwendet; Ein Teil der Filter wurde 12h vor den Messungen mit 100nM Somatostatin inkubiert; die Filter wurden in ein Ussing Kammer Set Up eingespannt; das transepitheliale Potential und der Widerstand wurden jede Minute gemessen; der Strom

wurde entsprechend des Ohm'schen Gesetzt errechnet; A: Repräsentative Spur zeigt die Erhöhung des Isc nach Applikation von ATP um 12,48 µA; die Applikation von verdünnter Schweinegalle führt zu keiner

Erhöhung des Isc unter Einfluss von Somatostatin; B: Zusammenfassung der Isc aller Messungen mit und ohne Somatostatin; Applikation von Gallensäuren erzeugen einen Isc von 4,11 ± 0,71 µA; Applikation von 1 mM HDCA/0,5 mM CDCA erzeugen einen Isc von 3,75 ± 0,55 µA; keine Erhöhung des Isc durch GS und HDCA/CDCA unter Einfluss von Somatostatin. Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt, *** p<0.001, ungepaarter zweiseitiger t-test, n=18-20

83 3.3 Purinerges Signaling und der Einfluss von Gallensäuren

3.3.1 Einfluss von Gallensäuren auf ATP-abhängigen transepithelialen Strom

Purinerges signaling ist wichtig für die Funktion der Cholangiocyten. Der Effekt von Gallensäuren auf ebendieses ist aber nicht untersucht. Im Rahmen meiner Untersuchungen zum Einfluss von Gallensäuren auf BASIC, habe ich daher die Versuche erweitert und analysiert, inwieweit Gallensäuren purinerge Rezeptoren beeinflussen. In den vorangegangenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass der durch ATP-induzierte Strom robust aktiviert werden kann. Dieser wird vermutlich durch den aktivierenden Effekt von ATP auf P2X/Y Proteine erzeugt. Um nun den Einfluss von Gallensäuren auf die in diesem Mechanismus beteiligten Proteine zu untersuchen, wurde ein neues Applikationsprotokoll erstellt, in dem Gallensäuren vor ATP auf die Cholangiocyten appliziert werden.

Abbildung 3.3.1: Schematische Darstellung der purinergen Signalwege in Cholangiocyten und der mögliche Einfluss von Gallensäuren auf diese. ATP kann über purinerge Proteine (P2X/ P2Y) einen 2+ - Anstieg der [Ca ]int hervorrufen. Dadurch werden Calcium aktivierte Chlorid Kanäle (CaCC) aktviert und Cl wird sezerniert. Entgegen des entstandenen Cl- Gradienten wird Bicarbonat über einen Antiporter (AE2) aus der Zelle transportiert. Entlang dieses Gradients wird Wasser über Aquaporine (AQP1) aus der Zelle sekretiert .

Um einen Vergleich zu haben, wurde zuerst eine Kontrollmessung nach dem Standardprotokoll der vorherigen Versuche durchgeführt. Die Applikation von ATP am Anfang der Messung löste einen Strom von 7,17 ± 0,42 µA aus. Die Applikation von

84 Gallensäuren induzierte einen Strom von 3,24 ± 0,35 µA (Abb. 3.3.2, A). Als nächstes wurde das neu erstellte Protokoll durchgeführt, um den Einfluss von Gallensäuren auf den ATP-induzierten Strom zu untersuchen. Zu Beginn der Messung wurde Schweinegalle (1:100) appliziert, die einen Strom von 3,83 ± 0,32 µA induzierte (Abb. 3.3.2, B). Nach Beendigung der Antwort, wurde 100 µM ATP appliziert. Die Gallensäuren wurden nicht ausgewaschen und reduzierten den durch ATP aktivierten Strom signifikant auf 0,29 ± 0,16 µA (Abb. 3.3.2, B, D post GS). Daher wurde der Einfluss von einzelnen Gallensäuren auf den ATP-aktivierten Strom untersucht. Nach 1 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA verringerte sich der durch ATP aktivierte Strom auf 0,96 ± 0,14 µA. Post 1 mM HDCA betrug der ATP- induzierte Strom 0,12 ± 0,08 µA. Die ATP Antwort post 1 mM UDCA lag bei 1,34 ± 0,54 µA. CDCA in einer Konzentration von 1 mM verringerte den ATP aktivierten Strom auf 1,76 ± 0,18 µA (Abb. 3.3.2, D). Die ersten Proteine, in der durch ATP aktivierten Signalkaskade, die zu dem in der Ussing-Kammer messbaren Strom führen, sind die purinergen P2X und P2Y Kanäle/Rezeptoren. Um die genaue Rolle der P2X und P2Y Kanäle/Rezeptoren bei dem durch ATP aktivierten Strom zu untersuchen, wurde 100 µM Suramin verwendet. Suramin ist ein P2X/Y Inhibitor der alle Mitglieder der P2X/Y inhibiert. Die Applikation von Suramin induzierte keinen messbaren Strom. Suramin verringerte den durch ATP- induzierten Strom auf 1,98 ± 0,56 µA (Abb. 3.3.2, C, D ATP post Suramin). Darauf folgend wurden Gallensäuren appliziert die einen Strom von 3,99 µA ± 0,41 induzierten (Abb.3.3.2 C). Die Ergebnisse zeigen, dass P2X/Y Proteine in die ATP-induzierte Antwort involviert sind. Des Weiteren ist zu erkennen, dass sowohl alle Gallensäuren, als auch die verdünnte Schweinegalle, einen signifikanten inhibierenden Effekt auf den durch die Applikation von 100 µM ATP ausgelösten Strom haben. 100 µM Suramin haben einen ähnlichen inhibierenden Effekt auf den ATP-induzierten Strom wie die Gallensäuren. Die Messungen lassen die Vermutung zu, dass Gallensäuren einen inhibierenden Effekt auf P2X/Y Proteine haben könnten.

85 Abbildung 3.3.2: Gallensäuren verringern den durch ATP-induzierten transepithelialen short-circuit Strom in NRCs. Apikale Applikation von ATP (100 µM) und Gallensäuren (1-1,5 mM und 1:100 verdünnte

Schweinegalle) führen zu einem kurzen (≈10 min) Anstieg des Isc; NRCs wurden auf Snap-Well-Filtern (Porengröße 0,4 µM) kultiviert und 4-6 Tage nach Konfluenz nach Erreichen eines transepithelialen Widerstand von ~350 Ω für die Messungen verwendet; die Filter wurden in ein Ussing Kammer Set Up eingespannt; das transepitheliale Potential und der Widerstand wurden jede Minute gemessen; der Strom wurde entsprechend des Ohm'schen Gesetzt errechnet; A: Repräsentative Spur zeigt die Erhöhung des Isc nach Applikation von ATP um 6,69 ± 0,42 µA; die Applikation von verdünnter Schweinegalle führt zu einer

Erhöhung des Isc um 3,24 ± 0,35 µA; B: Repräsentative Spur des u-Protokolls die erst eine Applikation von GS vorsieht und danach eine Applikation von ATP; Applikation von GS führt zu einer Erhöhung des I sc um 3,83 ± 0,32 µA; die Applikation von ATP führt zu einer Erhöhung des Isc um 0,7 ± 0,23 µA; C: Repräsentative Spur der Messungen nach Applikation von 100 µA Suramin; Applikation von ATP erhöht den Isc um 1,08 ± 0,38 µA; die Applikation von verdünnter Schweinegalle führt zu einer Erhöhung des Isc um 3,99 ± 0,41 µA; D: Zusammenfassung der Isc aller Messungen aus A-C. Vergleich der ATP Antworten prä und post Gallensäuren-Applikation von 100 µM ATP: 7,17 ± 0,42 µA; Applikation von ATP post 100 µM Suramin: 1,98 ± 0,56 µA; Applikation von ATP post 1 mM UDCA/0,5 mM CDCA: 0,96 ± 0,14 µA; Applikation von ATP post 1:100 verdünnter Schweinegalle: 0,29 ± 0,16 µA; Applikation von ATP post 1 mM HDCA: 0,12 ± 0,08 µA; Applikation von ATP post 1 mM UDCA: 1,34 ± 0,54 µA; Applikation von ATP post 1 mM CDCA: 1,76 ± 0,18 µA. Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, *** p<0.001, ungepaarter zweiseitiger t-test, n=3-73

86 3.3.2 Einfluss von Gallensäuren auf die ATP-abhängige intrazelluläre Ca2+-Konzentration

Extrazelluläres ATP aktiviert sowohl P2X Kanäle, als auch P2Y Rezeptoren, was zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration führt. Daraufhin werden Ca2+-aktivierte Cl-- Kanäle geöffnet und es kommt zu einem Cl--Efflux. Dies entspricht dem Strom, der auf die ATP-Applikation folgt und in der Ussing-Kammer gemessen werden kann. Hierfür spricht auch die Inhibition durch Suramin, einem P2X/P2Y Antagonisten. Im vorhergehenden Versuch konnte gezeigt werden, dass auch Gallensäuren einen inhibierenden Effekt auf den durch ATP-induzierten Strom haben. Um weiter zu untersuchen, ob Gallensäuren inhibierend auf P2X/P2Y wirken und somit den Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration verhindern, wurden Calcium-Imaging Versuche mit NRCs durchgeführt. Als erstes wurde ein Protokoll durchgeführt, dass dem Protokoll aus dem vorherigen Versuch (B, Abb. 3.3.2) entspricht, um einen möglichen inhibitorischen Effekt der Gallensäuren auf den intrazellulären Ca2+ Anstieg zu untersuchen. Die Applikation von

2+ 2+ 1,5 mM UDCA ruft einen Anstieg der intrazellulären Ca -Konzentration ([Ca ]int) von 355,97 ± 53,06 RFU hervor. Die darauf folgenden Applikation von 100 µM ATP ruft einen

2+ erneuten Anstieg der [Ca ]int von 882,49 ± 85,71 RFU (relative Fluoreszenzeinheiten)

2+ hervor (Abb. 3.3.3, A). Da 1 mM UDCA einen Einfluss auf die [Ca ]int hat, wurden weitere Messungen mit höheren Konzentrationen von UDCA durchgeführt. 4 mM UDCA erzeugen

2+ einen Anstieg der [Ca ]int von 680,64 ± 61,87 RFU (Abb. 3.3.3, B). Zur Kontrolle wurde ATP ohne Einfluss von Gallensäuren appliziert. Die Applikation von 100 µM ATP führte zu

2+ einem Anstieg der [Ca ]int von 882,49 ± 85,71 RFU (Abb. 3.3.3, C). Zusätzliche Messungen zeigten, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit des extrazellulären Calcium

2+ 2+ ([Ca ]ext) keinen Einfluss auf den Anstieg des [Ca ]int durch ATP oder Gallensäuren haben (Abb. 3.3.3, D). Es konnte gezeigt werden, dass Gallensäuren keinen inhibitorischen

2+ Effekt auf den durch ATP hervorgerufenen [Ca ]int Anstieg haben. Des Weiteren wurde

2+ gezeigt, dass Gallensäuren dosisabhängig einen Anstieg der [Ca ]int hervorrufen können. Mit anderen Methoden konnte eine Inhibition von Gallensäuren auf verschiedene P2 Proteine nachgewiesen werden, auch wenn dies hier nicht gezeigt werden konnte. Ein Einfluss von Gallensäuren auf purinerge Rezeptoren und Kanäle sollte nicht ausgeschlossen werden.

87 Abbildung 3.3.3: Gallensäuren lösen einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aus. Apikale Applikation von ATP (100 µM) und Gallensäuren (1,5-4 mM) führen zu einem kurzen (≈10 min) 2+ 2+ Anstieg der intrazellulären Ca -Konzentration ([Ca ]int); [Fluoreszenz Einheiten] (RFU) ; NRCs wurden auf Collagen beschichteten Deckgläschen für 2-4 Tage kultiviert; vor Verwendung wurden die Zellen mit Fura- 2AM beladen; die Deckgläschen wurden in ein Fura-2AM imaging Set Up eingespannt; die relative Fluoreszenz des Quotienten aus 340/380 nm wurde alle 3 Sekunden aufgenommen; A: repräsentative Fluoreszenz Spuren des Kontrollprotokolls zeigen, dass die Applikation von 1,5 mM UDCA eine Erhöhung 2+ der [Ca ]int um 355,97 ± 53,06 RFU hervorruft und die Applikation von 100 µM ATP in Anwesenheit von 1,5 mM UDCA eine Erhöhung von 882,49 ± 85,71 RFU. B: repräsentative Fluoreszenz Spuren zeigen, dass 2+ die Applikation von 4 mM UDCA eine Erhöhung der [Ca ]int um 680,64 ± 61,87 RFU hervorruft; C: repräsentative Fluoreszenz Spuren zeigen, dass die Applikation von 100 µM ATP eine Erhöhung der 2+ 2+ [Ca ]int um 882,49 ± 85,71 RFU RFU hervorruft; D: Zusammenfassung der Anstiege der [Ca ]int durch ATP 2+ und Gallensäuren in An- und Abwesenheit von extrazellulärem Calcium ([Ca ]ext); Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, n=50-120.

88 Da in den Calcium-Imaging-Versuchen kein inhibitorischer Effekt von Gallensäuren auf P2X-Kanäle oder P2Y-Rezeptoren gezeigt werden konnte, wurde der nächste mögliche Kandidat in der durch ATP ausgelösten Signalkaskade der NRCs untersucht. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in NRCs führt zur Aktivierung Ca2+-aktivierter Cl-- Kanäle (CaCC) und zu einem Efflux von Cl- (Abb 3.3.4). Es gibt neben den CaCCs weitere Cl--Kanäle wie cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), der durch die cAMP-Konzentration reguliert wird. Um die CaCCs zu untersuchen mussten diese unabhängig von den CFTR-Kanälen aktiviert werden. Durch m-3M3FBS kann ein Anstieg

2+ der [Ca ]int herbeigeführt werden, ohne in der Plasmamembran liegende Kanäle oder Rezeptoren zu aktivieren. Das Molekül m-3M3FBS ist ein direkter Aktivator der

Phospholipase-C (PLC). Die PLC Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu

Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) hydrolysieren. IP3 führt über die IP3- Rezeptoren in der Membran des endoplasmatischen Retikulums zur Freisetzung von Ca2+

2+ in das Cytoplasma (Abb. 3.3.4). Der Anstieg der [Ca ]int führt dann zur Aktivierung der CaCCs und zu einem Cl- Efflux (Abb. 3.3.4).

Abbildung 3.3.4: Schematische Darstellung der purinergen Signalwege in Cholangiocyten unter Einfluss von m-3M3FBS und Gallensäuren. m-3M3FBS ist eine direkter Aktivator der Phospholipase C (PLC). Durch m-3M3FBS kommt es, wie durch die Aktivierung von P2Y durch ATP, zu einem Anstieg der

[Ca2+]int. Daher sollten durch m-3M3FBS CaCCs aktiviert werden können. Gallensäuren haben möglicherweise einen inhibierenden Einfluss auf CaCCs.

89 Abbildung 3.3.5: Gallensäuren verringern den CaCC getragenen Cl- Strom in NRCs. Apikale Applikation von ATP (100 µM) und m-3M3FBS (20 µM) führen zu einem kurzen (≈10 min) Anstieg des Isc; NRCs wurden auf Snap-Well-Filtern (Porengröße 0,4 µM) kultiviert und 4-6 Tage post Konfluenz nach erreichen eines transepithelialen Widerstand von ~350 Ω für die Messungen verwendet; die Filter wurden in ein Ussing Kammer Set Up eingespannt; das transepitheliale Potential und der Widerstand wurden jede Minute gemessen; der Strom wurde entsprechend des Ohm'schen Gesetzt errechnet; A: Repräsentative Spur zeigt die Erhöhung des Isc nach Applikation von m-3M3FBS um 1,12 µA; die Applikation von ATP führt zu einer Erhöhung des Isc um 2,55 µA; B: Repräsentative Spur des umgekehrten Kontrollprotokolls die erst eine Applikation von GS vorsieht und danach eine Applikation von m-3M3FBS; Applikation von GS führt zu einer

Erhöhung des Isc um 1 µA; die Applikation von m-3M3FBS führt zu einer Erhöhung des I sc um 0,62 µA; C: Repräsentative Spur der Messungen nach Applikation von 100 µM Tannic-acid; Applikation von m-3M3FBS erhöht den Isc um 0,68 µA; D: Zusammenfassung der Isc aller Messungen aus A-C. Applikation von 100 µM ATP: 4,43 ± 0,12 µA; Applikation von 20 µM m-3M3FBS : 1,25 ± 0,17 µA; Applikation von m-3M3FBS post 1:100 verdünnter Schweinegalle: 0,48 ± 0,12 µA; Applikation von m-3M3FBS post 100 µM Tannic-acid: 0,4 ± 0,12 µA; Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, ** p<0.01, ungepaarter zweiseitiger t-test, n=7-12.

Die Applikation von 20 µM m-3M3FBS löste einen Strom Anstieg von 1,12 ± 0,11 µA aus (Abb. 3.3.5, A). Die Konzentration von m-3M3FBS für diese Versuche wurde anhand von Vergleichswerten aus der Literatur gewählt (Fang et al. 2009; Tsai et al. 2010; Chi et al. 2012). Die darauf folgende Applikation von 100 µM ATP sollte als Kontrolle über den Einfluss von m-3M3FBS auf den ATP-induzierten Strom dienen. ATP rief einen Strom von 2,55 ± 0,3 µA hervor (Abb. 3.3.5, A). Um den Einfluss von Gallensäuren auf den durch m- 3M3FBS-induzierten Strom zu untersuchen, wurde erst Galle und dann m-3M3FBS appliziert. Die Applikation von 1:100 verdünnter Schweinegalle aktivierte einen Strom von 1 ± 0,23 µA (Abb. 3.3.5, B). Die Applikation von m-3M3FBS in Anwesenheit der 1:100 verdünnter Schweinegalle reduzierte den durch m-3M3FBS-induzierten Strom auf 0,62 ± 0,14 µA (Abb. 3.3.5, B). Um die spezifische Aktivierung des CaCC durch m-3M3FBS

90 nachzuweisen wurde Tannic-acid eingesetzt. Tannic-acid ist ein unspezifischer Inhibitor für CaCCs. Die Applikation von 100 µM Tannic-acid führt zu keinem messbaren Strom. Die Applikation von m-3M3FBS in Anwesenheit von Tannic-acid reduziert den Strom auf 0,68 ± 0,11 µA (Abb. 3.3.5, C). Die Wiederholung der Versuche hat ergeben, dass ATP einen Strom von 4,43 ± 0,83 µA aktivierte. Die Applikation von 20 µM m-3M3FBS führte zu einem Strom von 1,25 ± 0,17 µA. Der durch m-3M3FBS ausgelöste Strom wurde in Anwesenheit von 1:100 verdünnter Schweinegalle um 62% auf 0,48 ± 0,12 µA reduziert. Die Applikation von m-3M3FBS in Anwesenheit von Tannic-acid reduzierte den Strom um 68% auf 0,4 ± 0,12 µA (Abb. 3.3.5, D) Die Tatsache, dass Tannic-acid den durch m- 3M3FBS-induzierten Strom inhibiert, spricht für eine Aktivierung der CaCCs. Gallensäuren haben einen ähnlichen inhibierenden Effekt wie Tannic-acid. Folglich scheint es plausibel, dass Gallensäuren den CaCC getragenen Strom inhibieren/reduzieren. Der durch m- 3M3FBS induzierte Strom ist jedoch geringer, als der durch 100 µM ATP ausgelöste Strom. Es lässt sich daher sagen, dass die Reduzierung des ATP-induzierten Stroms durch Gallensäuren (B/D Abb. 3.3.2) teilweise durch die Inhibierung der CaCCs durch Gallensäuren erfolgt. Ob Gallensäuren noch an anderen Stellen einen inhibierenden Effekt haben bleibt ungeklärt.

91 92 4 Diskussion

4.1 Identifizierung möglicher Interaktionspartner des BASIC

Es sind eine Vielzahl an Proteinen beschrieben, die einen regulierenden oder modulierenden Effekt sowohl auf die Expression, als auch auf die Aktivität verschiedener Mitglieder der DEG/ENaC Familie haben (Rotin, 2000; Zha, 2013). Es war daher ein wichtiger Teil dieser Arbeit mögliche interagierende Proteine für den bile acid-sensitive ion channel (BASIC) zu identifizieren um das Verständnis seiner physiologischen Funktion zu verbessern. Um dieses Ziel zu verfolgen, wurde eine stabile Zelllinie erzeugt, die nach Induzierung einen BASIC exprimiert, der N-terminal mit einem TAP-Tag fusioniert ist. Der TAP-Tag ermöglicht eine zweistufige Aufreinigung des BASIC mit möglichen interagierenden Proteinen. Diese Aufreinigung konnte erfolgreich abgeschlossen werden. In Abb. 3.1.1 ist zu sehen, dass BASIC nach der Restriktion durch die TEV-Protease an die Calmodulin- Beads bindet. In einer massenspektrometrischen Analyse, der durch einen on-Bead Verdau von den Calmodulin-Beads gelösten Proteine, konnten viele mögliche Interaktionspartner identifiziert werden. Nach einer ausgiebigen Auswertung der massenspektrometrischen Daten, konnte die Liste möglicher interagierender Proteine auf 21 Kandidaten eingegrenzt werden. Den Großteil der interagierenden Proteine machen Zytoskelett- oder membranassoziierte Proteine aus. Es wurden vier Tubulin-Isoformen, sechs Myosin-Isoformen und eine Aktin- Isoform gefunden. Ein weiteres und Zytoskelett-assoziiertes Protein, das detektiert wurde, ist Drebrin. Dieses Protein kann Aktin binden und dessen Polymerisation unterstützen (Mikati et al. 2013). Die identifizierten Proteine könnten BASIC an das Zytoskelett fixieren und ihm so intrazellulär Stabilität gegen die Membran vermitteln und auf diese Weise auch an seiner Membransensitivität beteiligt sein. Es wurde bereits gezeigt, dass membranverändernde Substanzen wie Trinitrophenol und Chlorpromazin einen Einfluss auf die Aktivierung von BASIC durch UDCA haben (Schmidt et al. 2014). Diese Substanzen verringern die Sensitivität von BASIC für UDCA. Andere Detergenzien aktivieren hingegen sowohl r- als auch m-BASIC (Schmidt et al. 2014). Eine Membransensitivität von BASIC könnte erst möglich sein, wenn BASIC intrazellulär fixiert wäre. Eine Kraftübertragung von der Membran auf den Kanal wäre erst so möglich, andernfalls wäre BASIC frei in der Membran beweglich und nicht durch mechanische

93 Veränderungen betroffen. Durch die detektierten Zytoskelett-Proteine könnte zum einen der Einfluss der Membranveränderung mechanisch auf BASIC übertragen werden, oder zum anderen könnte die Interaktion mit dem Zytoskelett auch den geschlossenen Zustand des rBASIC oder den Offen-Zustand des mBASIC stabilisieren. Bei Calnexin und Calmegin handelt ist sich um zwei Chaperone des endoplasmatischen Retikulums die Ca2+-abhängig sind. Es ist beschrieben, dass Calnexin einen Einfluss auf die Oberflächenexpression des mit dem BASIC verwandten ASIC1a und ASIC2a hat (Villa- Carriles et al. 2007). Möglicherweise hat Calnexin auch einen ähnlichen Einfluss auf BASIC. Interessanterweise sind beide Chaperone Calcium-abhängig. Die Veränderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration durch Efflux von Ca2+ aus dem ER ist ein entscheidender Mechanismus in Cholangiocyten, in denen BASIC nativ exprimiert wird (Hirata et al. 2002; Shibao et al. 2003). Die Expression oder Aktivität von BASIC könnte möglicherweise durch das intrazelluläre Ca2+-signaling beeinflusst werden. Interessanterweise ist Calmegin bisher nur in den Testis beschrieben und spielt dort eine Rolle in der Spermatogenese (Tanaka et al. 1997). Über mBASIC ist bekannt, dass dieser auch in den Testis exprimiert wird (Sakai et al. 1999). Für rBASIC ist eine solche Expression bis dato nicht beschrieben. Es wäre aber möglich, dass rBASIC ebenfalls in Testis exprimiert wird und dort mit Calmegin interagieren könnte und so gegebenenfalls eine Rolle in der Spermatogenese haben könnte. Zwei weitere Proteine, die in der Analyse detektiert werden konnten, sind die mitochondriale ADP/ATP-Translokase und der mitochondriale Phosphat Transporter. Beide Proteine stehen in Verbindung mit der ATP-Synthese und der Atmungskette in Mitochondrien. Es ist bekannt, dass die Mitochondrien Ca2+-abhängig die Apoptose von Cholangiocyten einleiten. Steigt die Ca2+-Konzentration in Mitochondrien, wird die Membran permeabel und Cytochrom C wird in das Zytosol abgegeben. Dies löst zum einen die Apoptose der Zellen aus, aktiviert aber auch gleichzeitig die nahegelegenen Inositol-1,4,5-trisphosphate Rezeptoren (InsP3R), was wiederum zu einer weiteren Erhöhung der Ca2+-Konzentration führt und einen positiven Feedback Loop startet (Ichas et al. 1997; Boehning et al. 2004; Mendes et al. 2005). Darüber hinaus ist bekannt, dass die Applikation von UDCA in humanen Cholangiocyten die Freisetzung von Cytochrom C in das Zytoplasma inhibiert (Que et al. 1999). Möglicherweise bildet BASIC das Bindeglied zwischen den Gallensäuren und der inhibierten Apoptose in den Cholangiocyten. In Cholangiocyten ist ein Mechanismus beschrieben, bei dem ATP aus dem Zytosol durch ATP-permable Kanäle oder durch Exocytose in das Lumen der Gallengänge gelangt und

94 dort wiederum die purinergen Kanäle und Rezeptoren aktivieren kann (Fitz et al. 2007; Woo et al. 2008). Auch dort könnte BASIC eine regulierende Rolle einnehmen, wenn die Interaktion zwischen ihm und den mitochondrialen Proteinen bestätigt werden könnte. Ein weiterer Hinweis darauf könnte die mögliche Interaktion mit den Clathrinen sein. Weitere mit Mitochondrien assoziierte Proteine, die detektiert werden konnten, sind die ATPase family AAA domain-containing Proteine. Diese Proteine haben Einfluss auf die Organisation und den Metabolismus der Mitochondrien (Snider und Houry, 2008). Wie sich diese Proteine in das beschriebene Bild einfügen ist unklar. Weitere Proteine, die detektiert werden konnten sind Emerin, Insuline receptor subtrate 4 und Pleckstrin homology domain-containing family S member 1. Diese drei Proteine lassen sich in keines der oben beschriebenen Szenarien einordnen, wie die Stabilisierung von BASIC in der Membran, der Involvierung in die Apoptose-Mechanismen oder dem Ca2-signaling in NRCs. So ist Emerin ein Protein das an der Stabilität der Kernhülle des Zellkerns beteiligt ist (Lattanzi et al. 2003; Sakaki et al. 2001). Ein Einfluss von BASIC auf den Zellkern wurde bis dato nicht beschrieben. Das Insulin receptor substrate 4 (IRS4) ist eine cytoplasmatisches Protein mit vielen Tyrosin und Serine/Threonin Phosphorylierungsstellen (White, 2002). Für ENaC wurden Proteine beschrieben die durch Ser/Thr Kinasen phosphoryliert werden können. Wird Nedd4-2 phosphoryliert, so kann es nicht mehr an ENaC binden und kann dessen Funktion nicht mehr herunterregulieren (Debonneville et al. 2001; Snyder et al. 2002). Des Weiteren gibt es die Serum and glucocorticoid-regulated kinase (SGK), eine Aldosteron-induzierte Ser/Thr Kinase, welche ein noch unbekanntes Protein phosphorylieren soll, um so die Expression und Aktivität von ENaC zu regulieren (Alvarez et al. 1999; Chen et al. 1999; Naray-Fejes-Toth et al. 2004). IRS4 könnte ein Bindeglied zwischen einer Ser/Thr Kinase und BASIC sein und einen regulierenden Einfluss auf dessen Expression und Aktivität haben. Des Weiteren konnte in

Krebszelllinien gezeigt werden, dass die Expression von IRS4 mit der IP3-Konzentration korreliert (Hoxhaj et al. 2013). Ist IRS4 phosphoryliert kann es mit SH2 Domänen enthaltenden Signalmolekülen wie PLCγ interagieren (Rotin et al. 1992). PLC und IP3 spielen in den Cholangiocyten eine maßgebliche Rolle in der Sekretion. Das Pleckstrin homology domain-containing family S member 1 beinhaltet eine PH-Domäne, die es ermöglicht sowohl PIP2 und PIP3 zu binden, als auch mit den βγ-Untereinheiten von G- Proteinen und der Proteinkinase C zu interagieren (Wang et al. 1994/1995; Yao et al. 1994). Ein genauer Zusammenhang mit BASIC lässt sich nicht herstellen, jedoch haben alle Proteine welche an Pleckstrin homology domain-containing family S member 1 binden

95 oder mit ihm interagieren einen großen Einfluss auf das signaling in Cholangiocyten. Sowohl auf Grund des häufigen Vorkommens in der massenspektrometrischen Analyse als auch wegen der guten Verfügbarkeit eines Antikörpers wurde Tubulin für erste Interaktionsstudien ausgewählt. In Co-Immunpräzipitationsversuchen sollte eine mögliche Bindung und damit auch eine Interaktion von BASIC mit Tubulin gezeigt werden. Die für die TAP-Versuche generierten Konstrukte konnten für die Co-IP Versuche nicht verwendet werden, da ein Bestandteil des an den BASIC fusionierten TAP-Tags ein Protein A ist, das an die eingesetzten IgG-Antikörper binden, präzipitieren und falsch positive Ergebnisse liefern würde. Um dieses Problem zu umgehen, wurden HEK293 Zellen transient mit einem N-terminal GFP-fusionierten BASIC transfiziert und nach 24 h für die Co-IP Versuche lysiert. Das Tubulin wird als Haushaltsgen endogen in HEK293 Zellen exprimiert, was eine zusätzliche Transfektion unnötig machte. Es konnte gezeigt werden, dass Tubulin über BASIC aus dem Lysat der Zellen präzipitiert werden konnte. Obwohl Tubulin ~50 kDa groß ist und somit auf gleicher Höhe wie die schwere Kette der eingesetzten Antikörper liegt, kann ein falsch positives Ergebnis ausgeschlossen werden. Es wurden zwei Antikörper verschiedener Spezies, mit verschiedenen Sekundärantikörpern eingesetzt. Diese Antikörper zeigen keine Kreuzreaktion mit den Antikörpern der anderen Spezies. Die Präzipitation von BASIC über Tubulin konnte nicht eindeutig gezeigt werden. Die Expression von BASIC war in diesen Versuchen von Beginn an gering. Es kann daher sein, dass wenn an ein BASIC Protein mehrere Tubulin Proteine binden die Präzipitation von Tubulin über BASIC in ausreichender Menge erfolgt. Andersherum erfolgt die Präzipitation von BASIC über Tubulin in geringerer Menge, als dass sie im Western-Blot nachgewiesen werden konnte. In einem weiteren Präzipitationsversuch wurde anstatt des volle-Länge BASIC Proteins nur die ersten 30 AS des N-Terminus von BASIC eingesetzt. Dieses Konstrukt ist mit GFP fusioniert und wurde ebenfalls transient in HEK293 Zellen transfiziert. In diesen Versuchen konnte die Präzipitation des BASIC N-Terminus über Tubulin nachgewiesen werden. Für die Darstellung der Ergebnisse wurden die selben Antikörper genutzt wie im Versuch zuvor, um falsch positive Ergebnisse auszuschließen. In diesem Versuch konnte jedoch die Präzipitation von Tubulin über den BASIC nicht eindeutig gezeigt werden. Da in beiden Versuchen die Präzipitation von BASIC und Tubulin gezeigt werden konnte, scheint eine Interaktion dieser beiden Proteine wahrscheinlich. Entsprechende funktionelle Studien, wie durch elektrophysiologische Untersuchungen, sollten eine Interaktion bestätigen oder ausschließen können, sowie die mögliche physiologische Rolle des

96 BASIC weiter definieren können. Es wurden weitere Co-Immunpräzipitationsversuche durchgeführt. In diesen sollte die Präzipitation von BASIC und Actin gezeigt werden. Die Ergebnisse gaben Hinweise auf eine mögliche Interaktion dieser beiden Proteine. Die entsprechenden Banden im Western-Blot waren jedoch nicht eindeutig genug um die Präzipitation zweifelsfrei zu bestätigen. Ein Problem des Nachweises war die geringe Effizienz des Actin-Antikörpers. Es konnte in vielen Versuchen kaum die endogene Expression von Actin nachgewiesen werden. Weitere Versuche mit Actin und einem anderen Actin-Antikörper sollten den Verdacht bestätigen oder widerlegen können. Es sollten weitere Interaktionsstudien mit den anderen Proteinen, die in der massenspektrometrischen Analyse detektiert werden konnten, durchgeführt werden, um weitere mögliche Interaktionen zu identifizieren. Die Interaktion könnte sowohl über Bindungsstudien, wie Co-Immunpräzipitation- oder Yeast-Two-Hybrid-Versuche festgestellt werden, als auch durch physiologische Interaktionsstudien wie Knock-Downs mit siRNA oder Knock-Outs durch das Crispr/Cas9 System, gefolgt von funktionellen Untersuchungen. In elektrophysiologischen Untersuchungen zur Interaktion von Tubulin und Actin mit BASIC wurden die Zytoskelett-Inhibitoren Cytochalasin B für Actin und Colchicin für Tubulin eingesetzt. Beide Inhibitoren verhindern die Polymerisation des Zytoskeletts, was nach kurzer Zeit zu einer deutlichen Destabilisierung der Zelle führt. Es deutete sich an, dass die durch Gallensäuren aktivierte und vermutlich von BASIC getragene Antwort durch die Zytoskelett-Inhibitoren zum Teil oder vollständig inhibiert wurden. Da die Ergebnisse nicht vollständig reproduzierbar waren, konnte bisher keine eindeutige Aussage getroffen werden. Weitere Versuche sind daher angebracht. In der Literatur ist jedoch beschrieben, dass Colchicin die durch UDCA verstärkte Secretin-induzierte Sekretion in Cholangiocyten inhibieren kann (Uriz et al. 2011). Eine Rolle von BASIC kann daher in diesem Zusammenhang in Betracht gezogen werden.

4.1.1 Interaktionsstudie des BASIC-N-Terminus und der Plasmamembran

Da die Ergebnisse der Präzipitationsversuche eine Interaktion von BASIC mit einem Protein des Zytoskeletts zeigen konnten und die Struktur des N-Terminus von BASIC eine amphiphile, α-helikale Struktur besitzt, die eine Bindung an die Membran ermöglichen könnte, wurde die Interaktion des BASIC N-Terminus weitergehend untersucht. Für diesen

97 Zweck wurden verschiedene Konstrukte des BASIC N-Terminus transient in HEK293 Zellen transfiziert. Die Zellen wurden nach 24 h lysiert und in zytosolische Fraktion und Membranfraktion getrennt. Es konnte gezeigt werden, dass die ersten 30 AS des BASIC N-Terminus in der Membranfraktion vorhanden sind und in der zytosolischen Fraktion nicht nachweisbar sind. Daher lässt sich davon ausgehen, dass der BASIC N-Terminus mit der Plasmamembran interagiert und in ihr verankert ist. Sind die Aminosäuren 15-25 des N- Terminus deletiert oder einzelne Aminosäuren gegen ungeladene Proline ausgetauscht, so verliert der N-Terminus seine Eigenschaft an die Membran zu binden. Es kann also davon ausgegangen werden, dass die Aminosäuren 15-25 den amphiphilen Charakter der Helix ausmachen. Die polaren Reste der Helix sind in Richtung der hydrophilen Kopfregion ausgerichtet und die unpolaren Reste der Helix sind in Richtung der hydrophoben Kohlenwasserstoffschwänze der Phospholipide der Membran ausgerichtet (Schmidt und Löhrer et al. 2016). Dadurch ermöglicht die α-Helix die Verankerung von BASIC an die Membran.

4.2 Charakterisierung von rBASIC in normal rat cholangiocytes (NRCs)

In einem weiteren Projekt dieser Arbeit sollte der endogen exprimierte BASIC in normal rat cholangiocytes (NRCs) elektrophysiologisch charakterisiert werden. Die Expression von BASIC in Cholangiocyten konnte bereits gezeigt werden (Wiemuth et al. 2012). Darüber hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit die Expression von BASIC in der immortalisierten Cholangiocyten Zelllinie sowohl auf mRNA- und Proteinebene als auch in immunhistochemischen Färbungen nachgewiesen werden (Abb. 3.2.1; Abb. 3.2.2.; Abb. 3.2.3). Für den Nachweis auf Proteinebene wurden NRCs lysiert und in zytosolische Fraktion und Membranfraktion getrennt, per SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und im Western-Blot durch Antikörper sichtbar gemacht. BASIC konnte hauptsächlich in der Membranfraktion lysierter NRCs nachgewiesen werden. Diese Tatsache deckt sich mit den Ergebnissen der Bindungsstudien des BASIC N-Terminus mit der Membran. Die immunhistochemischen Färbungen zeigen ein retikuläres Muster, wie man es häufig bei Membranproteinen sieht. Das schließt alle membranösen Strukturen der Zelle ein (Lysosome, ER, Plasmamembran etc.). Es ist bekannt, dass BASIC durch Gallensäuren aktiviert werden kann (Wiemuth et al. 2012). Daher war es von Interesse die Wirkung von Gallensäuren auf NRCs mittels der Ussing-Kammer Methode zu untersuchen. Es zeigte sich, dass durch die Applikation von

98 1:100 verdünnter Schweinegalle Ströme erzeugt werden konnten (Abb. 3.2.5). Diese

+ + Ströme sind abhängig von extrazellulärem Na und werden bei Wegnahme der [Na ]ext inhibiert. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die durch Galle aktivierten Ströme durch 100 µM Diminazen um ~60% verringert werden (Abb. 3.2.5). Diminazen ist ein spezifischer Inhibitor für BASIC und es ist beschrieben, dass rBASIC unselektiv für Na + und K+ ist (Wiemuth, Gründer 2010/2011). Die Abhängigkeit der Gallen aktivierten Ströme

+ von Diminazen und [Na ]ext gibt einen ersten Hinweis darauf, dass BASIC partiell verantwortlich ist. Galle besteht aus verschiedenen Gallensäuren, die je nach Spezies in unterschiedlichen Zusammensetzungen und Konzentrationen vorkommen. Von manchen Gallensäuren ist bekannt, dass sie BASIC aktivieren können. Es konnte gezeigt werden, dass verdünnte Schweinegalle einen Diminazen-sensitiven Strom in Cholangiocyten erzeugt. Nun sollte untersucht werden, ob auch die Gallensäure aktivierten Ströme durch Diminazen inhibiert werden. Zum einen wurde die Kombination von 1 mM Hyodeoxycholsäure (HDCA) mit 0,5 mM Chenodeoxycholsäure (CDCA) gewählt da beschrieben ist, dass HDCA mit CDCA eine potenzierende Wirkung auf die BASIC Aktivität hat (Wiemuth et al. 2012). Zum anderen wurde 1 und 4 mM Ursodeoxycholsäure (UDCA) mit jeweils 0,5 mM CDCA gewählt, da UDCA BASIC mit einem EC50 Wert von 2,5 mM aktiviert und UDCA ein gängiges Therapeutikum zur Behandlung verschiedener Cholangiopathien ist (Wiemuth et al. 2012; Lindor et al. 2009; EASL Clinical Practise Guidlines 2009). Alle verwendeten Gallensäurenkombinationen induzierten einen Strom in Cholangiocyten, ähnlich dem durch verdünnte Schweinegalle. Die Kombination aus 1 mM HDCA und 0,5 mM CDCA induzierte die höchste Stromamplitude, die nur geringfügig kleiner ist als die durch Galle-induzierte Stromamplitude. Die Kombinationen aus 1 mM UDCA mit 0,5 mM CDCA und 4 mM UDCA mit 0,5 mM CDCA induzieren etwas kleinere Ströme als HDCA mit CDCA (Abb. 3.2.6). Die Größe der Ströme korreliert mit den in der Literatur beschriebenen EC50 Werten. So aktiviert HDCA mit CDCA einen größeren Strom als

UDCA mit CDCA da auch dessen EC50 Wert geringer ist und die potenzierende Wirkung der Gallensäurenkombination beschrieben ist (Wiemuth et al. 2012). Alle durch Gallensäuren induzierten Ströme konnten durch 100 µM Diminazen partiell inhibiert werden. Wie schon für die verdünnte Schweinegalle gezeigt (Abb. 3.2.5) wird der durch 1 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA aktivierte Strom um ~50% verringert. Bei 1 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA verringert sich der Strom um ~30% und bei 4 mM UDCA/ 0,5 mM um ~40% (Abb. 3.2.6). Es ist also anzunehmen, dass die 30-50% des durch die verschiedenen

99 Gallensäuren aktivierten Stroms durch BASIC getragen werden. Der Unterschied in der Inhibierbarkeit der Ströme könnte daraus resultieren, dass BASIC nicht durch jede Kombination und Konzentration an Gallensäuren in gleicher Stärke aktiviert wird. So wird BASIC durch HDCA mit CDCA stärker aktiviert als durch UDCA mit CDCA und entsprechend kann BASIC durch Diminazen stärker inhibiert werden. Von dem Gallensäure-aktivierten Strom verbleibt nach Inhibition durch Diminazen ein Reststrom, der unabhängig von der verwendeten Gallensäure, immer gleich groß ist. Daher ist davon auszugehen, dass dieser Strom weder Diminazen sensitiv ist, noch durch BASIC hervorgerufen wird. Es ist bekannt, dass in Cholangiocyten Rezeptoren wie der TGR5 und der FXR exprimiert werden, für die Gallensäuren die Liganden darstellen (Masyuk et al. 2013; Deuschle et al. 2015). Diese Rezeptoren reagieren schon auf geringe Konzentrationen von Gallensäuren und könnten zum Teil den nach Inhibition durch Diminazen verbleibenden Strom indirekt erklären. TGR5 und FXR könnten durch Signalkaskaden andere Ionenkanäle aktivieren. Die Sensitivität für Diminazen sprach für eine Involvierung von BASIC in dem durch Gallensäuren aktivierten Strom in Cholangiocyten. Um diese These zu verifizieren wurde per Crispr/Cas9 System ein Teil des Exon 2 von BASIC in NRCs deletiert. Die Deletion des Exon 2 wurde per PCR der genomischen DNA nachgewiesen und durch Sequenzierung bestätigt (Abb. 3.2.9, Abb. 5.2). Der Phänotyp der NRCs wurde nicht offensichtlich verändert. Mit weiteren Ussing-Kammer Versuchen wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften der BASIC-KO-NRCs untersucht. Es zeigte sich, dass in der BASIC-KO-NRC Zelllinie alle durch Gallensäuren aktivierten Ströme ähnlich der Inhibition durch Diminazen verringert wurden (Abb. 3.2.10). So verringerte sich der Strom nach Aktivierung durch verdünnte Schweinegalle (1:100) um ~70%. Bei 1 mM HDCA/ 0,5 mM CDCA verringerte sich der Strom um ~55%. Bei 1 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA verringerte sich der Strom ~30%. Bei 4 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA verringerte sich der Strom um ~40%. Eine zusätzliche Applikation von 100 µM Diminazen zu den BASIC- KO-NRCs kann den durch Gallensäuren aktivierten Strom nicht weiter verringern (Abb. 3.2.10). In diesem Versuch zeigte sich ein ähnliches Bild, wie für die Verringerung des Stroms durch Diminazen. Es lässt sich sagen, dass die stärkste Verringerung des durch Gallensäuren-induzierten Stroms bei den Gallensäuren auftritt, die auch den stärksten Strom hervorrufen. So wird vermutlich durch 1 mM UDCA/ 0,5 mM CDCA kaum BASIC aktiviert und daher fällt die Verringerung durch den BASIC-KO im Vergleich zu den anderen Gallensäuren gering aus. Die Verringerung durch den BASIC-KO spricht deutlich

100 dafür, dass BASIC einen Teil des durch Gallensäuren aktivierten Stroms trägt. Der verbleibende Strom bewegt sich in der gleichen Größenordnung wie durch die Inhibition von Diminazen. Da durch den BASIC-KO der verbleibende Strom nicht maßgeblich verändert wird, kann man davon ausgehen, dass dieser Strom von anderen durch Gallensäuren aktivierten Rezeptoren hervorgerufen wird. Es konnte gezeigt werden, dass BASIC zu ~50% an den durch Gallensäuren aktivierten Strömen beteiligt ist. Das gibt jedoch noch keine Auskunft über seine physiologische Funktion. Einer der wichtigsten Prozesse in den Cholangiocyten, ist die während der Verdauung durch Secretin-induzierte Sekretion, die den Gallenfluss steigert. Ein Antagonist in diesem Prozess ist das Peptidhormon Somatostatin. Werden die NRCs für die Ussing-Kammer Versuche in 100 nM Somatostatin präinkubiert, kann durch die Applikation von Gallensäuren kein Strom mehr erzeugt werden. Somatostatin inhibiert das

- cAMP signaling, die Sekretion von HCO3 , die Exocytose von Vesikeln an der apikalen Plasmamembran und reguliert die Expression von basolateralen Secretin Rezeptoren herunter (Abb. 3.2.11) (Alpini et al. 1998; Gong et al. 2003; Masyuk et al. 2007; Tietz et al. 1995). Die Inhibition eines dieser Signalwege durch Somatostatin in den Cholangiocyten muss an der Verringerung des durch Gallensäuren aktivierten Stroms beteiligt sein. Da anders als bei Diminazen oder dem BASIC-KO kein BASIC-unabhängiger Reststrom bleibt, müssen auch die anderen Rezeptoren durch Somatostatin beeinflusst werden. TGR5 ist über den cAMP Signalweg an der Sekretion von Bicarbonat an die extrazelluläre

- Seite der Plasmamembran beteiligt und so an der Bildung des HCO 3 -umbrella (Keitel et al. 2015). Wird der cAMP Signalweg durch Somatostatin inhibiert, kann auch die Signalweiterleitung des TGR5 nicht mehr erfolgen. Die Beteiligung des TGR5 an dem nach Applikation von Diminazen und durch den BASIC-KO verbleibenden Strom scheint wahrscheinlich. In welcher Weise BASIC durch Somatostatin beeinflusst wird, bleibt unklar. Möglicherweise wird die Expression von BASIC im Zuge der Somatostatin Präinkubation herunterreguliert, was durch eine quantitative PCR nachgewiesen werden könnte. Andererseits könnte der BASIC Strom auch nachfolgende Signalkaskaden aktivieren, die durch Somatostatin inhibiert werden. Bei Betrachtung der Ergebnisse in Verbindung mit der Literatur lassen sich zwei verschiedene Theorien über die mögliche physiologische Funktion von BASIC bilden. Diese beiden Hypothesen sind in Abb. 4.1 grafisch dargestellt. Nachdem die Sekretion von Wasser in das Lumen der Gallengänge den Gallenfluss anregt, wird BASIC durch die erhöhte Gallensäuren-Konzentration aktiviert. In der ersten Theorie wird durch das

101 einströmende Natrium ein osmotischer Gradient erzeugt, der groß genug ist, um eine Resorption von Wasser über AQP1 aus dem Lumen zu aktivieren. Dadurch kommt es zu einer Verringerung des Gallenflusses. BASIC ist dosisabhängig durch Gallensäuren aktivierbar. Wenn der Gallenfluss zunimmt und eine höhere Konzentration an Gallensäuren erreicht wird (Boyer, 2013), könnte BASIC einen Negativ-Feedback Mechanismus aktivieren. Um dieser Theorie nachzugehen, könnte in Patch-Clamp Versuchen die Kapazität der Zellen vor und nach Applikation von Gallensäuren gemessen werden. Nimmt die Zelle nach Aktivierung von BASIC Wasser auf, so müsste auch die Kapazität der Zelle größer werden. In der zweiten Theorie wird das durch BASIC nach intrazellulär einströmende Natrium

+ - über den SLC4A4/NBC1 Na /HCO3 -Cotransporter zusammen mit Bicarbonat nach extrazellulär transportiert. Dadurch kommt es zum einen zum Aufbau des Bicarbonat- umbrellas und zum anderen, wie bei der normalen Sekretion, zu einem Efflux von Wasser entlang des osmotischen Gradienten und somit zu einer Erhöhung des Gallenfluss. Der SLC4A4/NBC1 ist jedoch bis dato in Cholangiocyten der Ratte nur basolateral beschrieben (Uriarte et al. 2010). Es wäre von Interesse in weitergehenden Versuchen den SLC4A4/NBC1 in NRCs zu inhibieren. Eine Möglichkeit dafür wäre 4,4'- diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS), ein bekannter Inhibitor für NBC1. In beiden Fällen ist die Aktivierbarkeit von BASIC durch Gallensäuren und die Leitfähigkeit für Na+ wichtig um nachstehende Kaskaden zu aktivieren. Es wäre von großem Interesse einen BASIC-KO in einem in vivo System zu beobachten.

Abbildung 4.1: Mögliche physiologische Funktion von BASIC in Cholangiocyten.

102 4.3 Purinerges Signaling und der Einfluss von Gallensäuren

Nachdem gezeigt werden konnte, dass Gallensäuren einen robusten Strom in Cholangiocyten induzieren können und dieser zum Teil BASIC-abhängig ist, stellte sich die Frage nach weiteren Proteinen die durch Gallensäuren aktiviert oder inhibiert werden. Das purinerge signaling ist ein wichtiger Mechanismus in den NRCs. Der Einfluss von Gallensäure auf diesen Signalweg wurde jedoch noch nicht untersucht. Da die Applikation von ATP in allen Versuchen einen gleichbleibenden Strom aktivieren konnte, wurde der Einfluss von Gallensäuren auf die in der ATP aktivierten Signalkaskade geprüft. Dafür wurde ein neues Protokoll genutzt, dass eine Applikation von Gallensäuren am Anfang der Messung gefolgt von einer ATP Applikation vorsah. Der durch ATP aktivierte Strom verringerte sich unter Einfluss von 1:100 verdünnter Schweinegalle um 96%. Nachdem die Verringerung des Strom reproduziert werden konnte, wurden auch weitere Gallensäuren wie UDCA, HDCA, CDCA und die Kombination von UDCA und CDCA getestet. Es zeigte sich, dass alle Gallensäuren den durch ATP-induzierten Strom zwischen ~75-98% verringern. Eine naheliegende Überlegung war, dass die Gallensäuren möglicherweise einen inhibierenden Effekt auf die purinergen Rezeptoren und Kanäle haben könnten, da diese in NRCs apikal exprimiert und durch ATP aktiviert werden (Dranoff et al. 2001; Masyuk et al. 2008/1; Salter et al. 2000; Schlenker et al. 1997; Yu et al. 2009; Doctor et al. 2005). Um zu kontrollieren, ob entweder P2X oder P2Y an dem ATP-induzierten Strom involviert sind, wurde eine Applikation von 100 µM ATP in Anwesenheit von 100 µM Suramin durchgeführt. Suramin ist ein potenter Inhibitor sowohl der P2X Kanäle als auch der P2Y Rezeptoren und verringerte die ATP-induzierte Antwort um 72%. Die Verringerung durch Suramin fiel im Vergleich zu den Gallensäuren geringer aus. Das ist darauf zurück zu führen, dass 100 µM Suramin nicht alle purinergen Kanäle und Rezeptoren zu 100% inhibiert. Es bleiben bei dieser Konzentration genügend aktive Kanäle übrig, um einen Strom zu erzeugen. Die Gallensäuren scheinen dagegen eine stärkere Wirkung zu haben. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Gallensäuren keinen inhibierenden Effekt auf die purinergen Kanäle und Rezeptoren hatten. Dieses Ergebnis wurde durch Calcium Imaging Versuche erlangt. Es konnte ein deutlicher Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration durch die Applikation 100 µM ATP gemessen werden, der unabhängig von extrazellulärem Calcium ist. Wenn man wie in den Ussing-Kammer Versuchen zuvor erst Gallensäuren appliziert und darauf ATP folgt, bleibt der durch ATP ausgelöste Anstieg des intrazellulären Calcium gleich groß. Darüber hinaus führt die

103 Applikation von Gallensäuren alleine zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration. Der durch die Gallensäuren induzierte Anstieg ist zum einen Dosis- abhängig, zum anderen unabhängig von extrazellulärem Calcium. Es ist bis dato kein Kanal oder Rezeptor beschrieben, der durch Gallensäuren aktiviert wird und Einfluss auf das Calcium signaling hat. Es wurde beschrieben, dass BASIC durch membranverändernde Substanzen aktiviert werden kann (Schmidt et al. 2014). Des Weiteren wurde die These aufgestellt, dass Gallensäuren mit ihrem amphiphilen Charakter eine Membranveränderung hervorrufen und damit BASIC aktivieren. Wenn dem so ist, wäre es auch möglich, dass Gallensäuren andere Kanäle über einen ähnlichen Mechanismus aktivieren könnten. Es ist nicht auszuschließen, dass Gallensäuren einen inhibierenden Effekt auf die purinergen Kanäle und Rezeptoren haben. Dadurch das gezeigt werden konnte, dass Gallensäuren unabhängig von ATP eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration hervorrufen können, könnte die Inhibierung der P2X/Y Proteine überdeckt werden. Mit anderen Methoden konnte eine Inhibition von Gallensäuren auf verschiedene P2 Proteine nachgewiesen werden. Es blieb die Frage wo der inhibierende Effekt der Gallensäuren auf den in den Ussing-Kammer Experimenten durch ATP ausgelösten Strom wirkt. Die nächsten Kandidaten in der Signalkaskade die einen messbaren transepithelialen Strom erzeugen könnten, wären die Calcium aktivierten Chlorid Kanäle (CaCCs) (Dutta et al. 2008; Dutta Iet al. 2012; Fitz, 2004; Woo et al. 2008; Woo et al. 2010). Diese werden durch den Anstieg der intrazellulär Calciumkonzentration aktiviert und Chlorid kann aus der Zelle strömen. Um zu überprüfen, ob Gallensäuren einen inhibierende Effekt auf die CaCCs haben, mussten diese gesondert und unabhängig von ATP in Ussing-Kammer Versuchen aktiviert werden. Dies wurde erreicht indem m- 3M3FBS appliziert wurde. Dieses Molekül ist ein direkter Aktivator der Phospholipase-C

(PLC) und diese wiederum hydrolysiert PIP2 zu IP3 und DAG. IP3 bindet an die IP3- Rezeptoren in der Membran des endoplasmatischen Retikulums und dies führt zu einem Efflux von Calcium aus dem intrazellulären Speicher in das Zytosol. Diese Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration sollte die CaCCs aktivieren. Die Applikation von 20 µM m-3M3FBS führte zu einem transepithelialen Strom. Um zu überprüfen ob es sich bei dem erzeugten Strom tatsächlich um die CaCCs handelt wurde m-3M3FBS in Präsenz von 100 µM Tannic acid appliziert. Bei Tannic acid handelt es sich um einen unspezifischen Inhibitor der CaCCs. Es konnte gezeigt werden, dass Tannic acid den durch m-3M3FBS ausgelösten Strom um 68% verringert. Es scheint daher wahrscheinlich, dass die 68% des durch m-3M3FBS aktivierten Strom durch CaCCs und einem Cl--Efflux

104 erzeugt werden. Um nun zu überprüfen ob Gallensäuren einen inhibierenden Effekt auf die CaCCs haben, wurde m-3M3FBS in Anwesenheit von 1:100 verdünnter Schweinegalle appliziert. Ähnlich wie Tannic acid konnte auch die Schweinegalle den durch m-3M3FBS- induzierten Strom um 62% reduzieren. Der durch m-3M3FBS aktivierte Strom wird durch Tannic acid und Gallensäuren in ähnlicher Stärke verringert. Das spricht dafür, dass Gallensäuren einen starken inhibierenden Effekt auf die CaCCs haben (Abb. 3.3.5). Diese Ergebnisse erklären zum Teil wie Gallensäuren den ATP-induzierten Strom in NRCs inhibieren können. Jedoch ist der durch ATP aktivierte Strom deutlich größer als der durch m-3M3FBS aktivierte Strom. Es ist daher nicht ausgeschlossen, dass es noch andere Kanäle oder Proteine in der durch ATP ausgelösten Signalkaskade gibt, die durch Gallensäuren inhibiert werden können. Eine Identifikation dieser Proteine wäre von großem Interesse. Kandidaten dafür wären weiterhin die purinergen Proteine, der CFTR (Abb.1.4), da dieser auch an der Cl--Sekretion beteiligt ist, und der AE2. Diese Proteine stehen in direktem oder indirektem Zusammenhang mit der durch ATP aktivierten Signalkaskade. Es lässt sich zusammenfassen, dass Gallensäuren einen inhibierenden Effekt auf die Cl-- Sekretion haben. Die Cl--Sekretion ist entscheidend für die Sekretion von Wasser in das Lumen der Gallengänge und somit für den Gallenfluss. Es wäre interessant herauszufinden, ob Gallensäuren auch einen inhibierenden Effekt auf die durch Secretin ausgelöste Sekretion haben. Wenn dem so wäre könnte die These aufgestellt werden, dass die Gallensäuren bei größer werdendem Gallenfluss einen negativen Feedback Loop auslösen, um den Gallenfluss entsprechend wieder zu verringern. Der mögliche Feedback-Mechanismus ist in Abb. 4.2 grafisch dargestellt. Durch einen erhöhten Gallenfluss kommt es zum Anstieg der Gallensäuren-Konzentration im Lumen (Boyer, 2013). Die Gallensäuren wirken inhibierend auf die CaCCs und der Cl --Efflux wird kleiner.

- Infolgedessen verringert sich auch der HCO3 Efflux über den AE2. Durch den fehlenden osmotischen Gradienten wird die Sekretion von Wasser in das Lumen der Gallengänge und der Gallenfluss verringert.

105 Abbildung 4.2: Möglicher Einfluss von Gallensäuren auf die Cl--Sekretion in NRCs.

106 4.4 Zusammenfassung & Ausblick

Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich in drei Themengebiete zusammenfassen. Zuerst wurde festgestellt, dass BASIC über den N-Terminus mit der Membran verankert ist. Es konnte festgestellt werden, dass die Aminosäuren 15-25 essentiell für die Bindung des N-Terminus an die Membran sind. Der N-Terminus liegt an dieser Stelle als amphiphile Helix vor. Wird dieser amphiphile Charakter durch eine Mutation verändert, so kann er nicht mehr an die Membran binden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Tubulin über den N-Terminus mit BASIC interagiert. Tubulin konnte sowohl in der massenspektrometrischen Analyse möglicher Interaktionspartner detektiert werden, als auch die Präzipitation in direkten Co-Immunpräzipitationsversuchen nachgewiesen werden. Es wurden 20 weitere mögliche Interaktionspartner identifiziert, jedoch die tatsächliche Interaktion noch nicht verifiziert. Um die physiologische Identität von BASIC weiter zu charakterisieren sollten weitere Bindungsstudien mit den möglichen Interaktionspartner aus der massenspektrometrischen Analyse durchgeführt werden. Diese möglichen Interaktionen könnten wiederum in elektrophysiologischen Experimenten untersucht werden. Als nächstes konnte nachgewiesen werden, dass rBASIC in NRCs endogen exprimiert wird. Die elektrophysiologische Untersuchung des BASIC hat ergeben, dass BASIC durch Gallensäuren robust aktiviert werden kann. Der induzierte Strom ist sowohl Na +-abhängig als auch Diminazen-sensitiv. Es wird durch Diminazen 50% des induzierten Stroms inhibiert. In einer erstellten BASIC Knockt-Out Zelllinie konnte nachgewiesen werden, dass der durch Diminazen inhibierbare Strom BASIC-abhängig ist. Es verbleibt sowohl beim Knock-Out, als auch bei der Inhibition durch Diminazen stets ein Reststrom welcher möglicherweise genauer untersucht werden sollte. Die NRC Zelllinie in der Ussing- Kammer stellt eine Möglichkeit dar den endogenen BASIC weitergehend zu untersuchen. Eine Untersuchung der zwei aufgestellten Hypothesen zur physiologischen Funktion von BASIC könnten Aufschluss über dessen Rolle in Cholangiocyten geben. Schlussendlich wurde der Einfluss von Gallensäuren auf die durch ATP-induzierte Signalkaskade in NRCs untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass Gallensäuren die CaCC-abhängige Cl--Sekretion in NRCs inhibieren können. Der Einfluss von Gallensäuren auf weitere Proteine dieser Signalkaskade, die Sekretion in NRCs und der mögliche damit verbundene negative Feedback Mechanismus sollte weitergehend untersucht werden.

107 108 Literaturverzeichnis

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130 Anhang Abbildungen

Abbildung 5.1: BASIC DNA Sequenz. In blau markiert ist Exon 2 des BASIC; in rot markiert ist der durch das Crispr/Cas9 System deletierte Bereich

131 Abbildung 5.2: Ergebnis der Sequenzierung der ~300 bp Bande der BASIC-KO-NRC Zelllinie. In blau markiert ist der Sequenzbereich der vor der Deletion von Exon 2 liegt; in rot markiert ist der Sequenzbereich der hinter der Deletion in Exon 2 liegt

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung einer DEG/ENaC Untereinheit...... 10

Abbildung 1.2: Expressionsmuster von HyNaC in Hydra magnipapillata...... 14

Abbildung 1.3: Positive und negative Regulation des ENaCs durch intra- und extrazelluläre akzesorische Proteine...... 16

Abbildung 1.4: Schematische Darstellung der Verwandtschaft zwischen BASIC, ASIC und ENaC...... 21

Abbildung 1.5: Schematische Darstellung der Sekretionsmechanismen in normal rat cholangiocytes (NRCs)...... 31

Abbildung 1.6: Strukturformeln von Cholesterin und der durch Hydroxylierungen gebildeten Gallensäuren Cholsäure und Chenodeoxycholsäure...... 34

Abbildung 2.1: Schema der Verdünnungsreihe und der Probenvorbereitung für das BCA-Assay...... 52

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Schritte im TAP-Versuch...... 55

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung einer Ussing-Kammer...... 58

Abbildung 2.4: Schematische Darstellung des CRISPR Cas9 Geneditierungs Tools...... 60

Abbildung 3.1.1: Repräsentativer TAP Versuch mit rBASIC-N-TAP aus stabil transfizierten Zellen...... 62

Abbildung 3.1.2: Co-Immunpräzipitation von BASIC-GFP u. BASIC-N-Terminus GFP gegen Tubulin...... 68

Abbildung 3.1.3: Interaktionsstudie des BASIC-N-Terminus mit der Plasmamembran...... 70

Abbidlung 3.2.1: Nachweis der Expression von rBASIC auf RNA-Ebene...... 71

132 Abbidlung 3.2.2: Nachweis der Expression von rBASIC auf Protein Ebene...... 72

Abbidlung 3.2.3: Nachweis der Expression von rBASIC auf zellulärer Ebene...... 73

Abbildung 3.2.4: Schematische Darstellung der purinergen Signalwege in Cholangiocyten und dem möglichen Einfluss von Gallensäuren und Diminazen auf BASIC...... 74

Abbildung 3.2.5: Gallensäuren aktivieren einen Diminazen-sensitiven transepithelialen short-circuit Strom in NRCs...... 76

Abbildung 3.2.6: Vergleich der Aktivierung des transephitthelialen short-circuit Strom durch einzelne Gallensäuren in NRCs und die Inhibierung durch Diminazen...... 78

Abbildung 3.2.7: Schematische Darstellung der Deletion von BASIC Exon 2 durch das Crispr/Cas9 System...... 79

Abbildung 3.2.8: Schematische Darstellung der Typisierungsstrategie per PCR der genomischen DNA...... 80

Abbildung 3.2.9: PCR zur Kontrolle der NRC-KO Zelllinie...... 80

Abbildung 3.2.10: Aktivierung eines reduzierten transepithelialen short-circuit Stroms in BASIC-KO-NRCs durch verschiedene Gallensäuren...... 81

Abbildung 3.2.11: Schematische Darstellung der Signalwege in Cholangiocyten und der mögliche Einfluss von Somatostatin auf BASIC...... 83

Abbildung 3.2.12: Präinkubation von Somatostatin verringert den durch Gallensäuren aktivierten transepithelialen short-circuit Strom in NRCs...... 83

Abbildung 3.3.1: Schematische Darstellung der purinergen Signalwege in Cholangiocyten und der mögliche Einfluss von Gallensäuren auf diese...... 84

Abbildung 3.3.2: Gallensäuren verringern den durch ATP-induzierten transepithelialen short-circuit Strom in NRCs...... 86

Abbildung 3.3.3: Gallensäuren lösen einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aus...... 88

Abbildung 3.3.4: Schematische Darstellung der purinergen Signalwege in Cholangiocyten unter Einfluss von m-3M3FBS und Gallensäuren...... 89

Abbildung 3.3.5: Gallensäuren verringern den CaCC getragenen Cl--Strom in NRCs...... 90

Abbildung 4.1: Mögliche physiologische Funktion von BASIC in Cholangiocyten...... 102

Abbildung 4.2: Möglicher Einfluss von Gallensäuren auf die Cl--Sekretion in NRCs...... 106

133 Abbildung 5.1: BASIC DNA Sequenz...... 131

Abbildung 5.2: Ergebnis der Sequenzierung der ~300 bp Bande der BASIC-KO-NRC Zelllinie...... 132

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Liste der verwendeten Primer...... 41

Tabelle 2: Liste der in Zellkulturmedien hinzugefügte Antibiotika...... 42

Tabelle 3: Liste der verwendeten Antikörper für Immundetektion und Immunhistochemie...... 43

Tabelle 4: PCR Protokoll...... 48

Tabelle 5: Pipettierschema für Polyacrylamid Gele...... 53

Tabellle 6: Auswertung der massenspektrometrischen Analyse möglicher Interaktionspartner von r- und mBASIC-N-TAP...... 66

134 Abkürzungsverzeichnis

A Abb...... Abbildung AC...... Adenylatcyclase ADP...... Adenosindiphosphat AE2...... anion exchanger 2 Ag/AgCl...... Silber/Silberchlorid ANO1...... Anoctamin 1 4-AP...... 4-Aminopyridin AQP...... Aquaporine AS...... Aminosäure ASBT...... Na+-abhängiger Gallensäure Transporter ASIC...... acid sensing ion channel ATP...... Adenosintriphosphat B BASIC...... bile acide-sensitive ion channel BSA...... bovines Serumalbumin β-MCA...... Betamuricholsäure β-ME...... Betamercaptoethanol C C. elegans...... Chaenorabditis elegans CA...... Cholsäure Ca2+...... Calcium-Ion

2+ 2+ [Ca ]int...... intrazelluläre Ca -Konzentration CaCCs...... Ca2+ activated Cl- channels

CaCl2...... Calciumchlorid CaM...... Calmodulin cAMP...... zyklische Adenosinmonophosphat CAP 1-3...... channel activating protease 1-3 CAR...... konstitutiver Androstane Rezeptor CDCA...... Chenodeoxycholsäure CFTR...... cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cGMP...... zyklisches Guanosinmonophosphat

135 CIPP...... channel interacting PDZ domain protein CnrasGEF...... cyclic nucletide RAS-GEF CO-IP...... Co-Immunpräzipitation CPZ...... Chlorpromazin CRD I-III...... Cysteinreicher extrazellulärer Loop I-III CYP27...... Sterol-27-Hydroxylase D ddH2O...... doppelt destilliertes Wasser (Millipore Qualität) DAG...... 1,2-Diacyl-sn-glycerine DCA...... Deoxycholsäure DEG...... degenerine DNA...... Desoxyribonukleinsäure dNTPs...... Desoxyribonukleosidtriphosphate DTT...... Dithiothreitol Δ...... delta für Deletion E E. coli...... Escherichia coli ECL...... enhanced chemiluminescence EDTA...... Ethylendiamintetraessigsäure EGF...... epidermal growth factor EGTA...... Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure ELISA...... enzyme linked immunosorbent assay ENaC...... epithelial sodium channel EVOM...... epitheliales Voltohmmeter F FFA...... Flufenaminsäure FGF...... fibroblast growth factor FGFR...... fibroblast growth factor receptor FXR...... Farsenoid X Rezeptor f340/f380...... Fluoreszenz bei Anregung mit Licht von 340/380 nm Wellenlänge G g...... Gramm GEFs...... guanine nucleotide-exchange factors

136 GFP...... green fluorescent protein GLUT1...... facilitated glucose transporter member 1 H

+ H ...... Wasserstoff-Ion (Proton) H. magnipapilata...... Hydra magnipapilata hBASIC...... BASIC aus Mensch HBSS...... hank's balanced bath solution

- HCO3 ...... Bicarbonat HDCA...... Hyodexycholsäure HEPES...... 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure HG-Motiv...... Histidin-Glycin-Motiv HRP...... horseradish peroxidase Hsp...... heatshock protein HydraRFa I/II...... HydraRF-Amid I/II HyNaC...... hydra sodium channel I I...... Stromstärke i.d.R...... in der Regel IgG...... Immunglobulin G

IP3...... Inositol-1,4,5-trisphosphat

IP3R...... Inositol-1,4,5-trisphosphat Rezeptor IRS4...... insuline receptor substrate 4

Isc...... short circuit current J K K+...... Kalium-Ion kB...... Kilobasen Kcl...... Kaliumchlorid kDa...... Kilodalton

KH2PO4...... Kaliumdihydrogenphosphat

+ Kv...... voltage dependent K -channel L LAP...... Leucinaminopeptidase LB-Medium...... lysogeny broth Medium

137 Li+...... Lithium-Ion M mBASIC...... BASIC aus Maus MEC...... mechanosensitive mutations mg...... Milligramm µg...... Mikrogramm

MgCl2...... Magnesiumchlorid ml...... Milliliter mM...... Millimolar µM...... Mikromolar mRNA...... messenger Ribonukleinsäure N Na+...... Natrium-Ion

+ + [Na ]ext...... extrazelluläre Na -Konzentration

Na2HPO4...... Natriumdihydrogenphosphat Nedd4-1/2...... neuronal precursor cells expressed developmentally downregulated 4-1/2 NHE3...... Na+/H+ Antiporter NHERF...... Na+/H+ exchange regulatory factor

NH4HCO3...... Ammoniumhydrogencarbonat nm...... Nanometer NMDG...... N-Methyl-D-glucamin NP-40...... Nonoxinol 40 NRCs...... normal rat cholangiocytes O OST...... organic solute transporter Ω...... Ohm P PAM-Motiv...... protospacer adjacent motif PBC...... primäre biliäre Zirrhose PBS...... phosphate buffer solution PC-1/2...... Polycystin 1/2 PCR...... Polymerasekettenreaktion PFA...... Paraformaldehyd

138 + pH...... negativer log10 der H -Konzentration PICK1...... protein interacting with C-kinase

PIP2...... Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PKA...... Proteinkinase A PKC...... Proteinkinase C pmol...... Picomol PMSF...... Phenylmethylsulfonylfluorid rpm...... rounds per minute pS...... pico Siemens PSD-95...... postsynaptic density protein 95 PVDF...... Polyvinylidenfluorid PXR...... Pregnan X Rezeptor PY-Motiv...... prolinreiches Motiv Q R R...... elektrischer Widerstand rBASIC...... BASIC aus Ratte RFU...... relative Fluoreszenzeinheiten RT...... Raumtemperatur S S1PR2...... Sphingosin 1-Phophat Rezeptor 2 SDS...... Natriumdodecylsulfat SDS-PAGE...... SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese SEM...... standard error of mean (Standardfehler) SGK...... serum and glucocorticoid-regulated kinase SGLT...... solute carrier family SLP...... stomatine like protein SNARE...... soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor T Tab...... Tabelle TAP...... tandem affinity purification TCA...... tauro-Cholsäure TEER...... transepithelial electric resistance TGR5...... transmembrane G protein coupled receptor

139 TMD...... Transmembrandomäne TMEM16...... transmembrane member 16 TNP...... Trinitrophenol TRPV4...... transient receptor potential cation channel subfamily V member T-X-100...... Triton-X-100 U U...... Unit U...... elektrische Spannung UDCA...... Ursodeoxycholsäure UNC...... uncoordinated locomotion mutant V V...... Volt VCC...... voltage/current clamp VDR...... Vitamin D Rezeptor W X Y Z

140 An dieser Stelle möchte ich mich bei all denen bedanken die mir diese Arbeit ermöglicht haben. Zuallererst möchte ich Priv.-Doz. Dr. Dominik Wiemuth dafür danken, dass er mich all die Jahre im Labor mit Rat und Tat unterstützt hat, immer Zeit für meine Fragen und Ideen und immer ein offenes Ohr für mich hatte. Seine ausgezeichnete Betreuung während meiner Arbeit hat mit sehr geholfen. Univ.- Prof. Dr. Stefan Gründer möchte ich dafür danken, dass er mir die Möglichkeit gegeben hat in einem so tollen Labor und in einer so guten Arbeitsgruppe zu arbeiten. Des weiteren danke ich ihm für die fachliche Unterstützung im Verlauf meiner Arbeit. Ich bedanke mich herzlich bei Univ.- Prof. Dr. Marc Spehr für die Übernahme des Zweitgutachtens. An dieser Stelle möchte ich mich auch bei allen (auch ehemaligen) Mitarbeitern der Physiologie bedanken. Ich habe mich dort immer sehr wohl gefühlt und werde oft an die Zeit im Institut zurück denken. Im besonderen geht mein Dank an Monika Wirtz, Adrienne Oslender-Bujotzek und Pia Lenzig die mich oft unterstützt haben und mit denen ich immer gerne gearbeitet habe.

Meinen Eltern Uta und Theo Löhrer möchte ich für ihre Unterstützung in allen Lebenslagen danken. Ohne sie wäre ich nicht der Mensch der ich heute bin und wäre wahrscheinlich auch nicht an dem Punkt im Leben, an dem ich gerade bin. Meinem Bruder Marco Löhrer danke ich für seine hilfreichen Tipps während meiner Laborarbeit, als auch für die moralische Unterstützung bei der Anfertigung dieser Arbeit. Des weiteren danke ich auch meine Schwiegereltern, Emma und Wolfgang Bornes für ihre große Unterstützung und ihrem Rückhalt. Großer Dank gilt auch meiner Oma Irene Schmitz für ihre aufmunternden Worte und Unterstützung.

Zuletzt möchte ich mich bei meinen lieben Zuhause bedanken. Meiner Frau Meike Löhrer danke ich für ihre bedingungslose Unterstützung, ihrer Geduld für meine ständig wechselnden Einfälle und ihrer Motivation um diese Arbeit abzuschließen. Meinem Sohn Max möchte ich dafür danken, dass er mich mit seiner unbändigen Lebensfreude immer aufmuntern konnte und mir die Wichtigkeit meines Vorankommens zeigte. Meinem Sohn Ben verdanke ich wohl die meiste Motivation diese Arbeit abzuschließen. Ich danke auch Monty und Mausi für die ausdauernde Gesellschaft in so vielen Stunden die ich am Schreibtisch saß und arbeiten musste.

141 CV Daniel Löhrer, *29.10.1987 Couvenstr. 9, 52062 Aachen 0241/92042568 [email protected] Wissenschaftlicher Werdegang seit 05/2013 Uniklinik RWTH Aachen: Promotion am Institut für Physiologie, Arbeitsgruppe Prof. Dr. Stefan Gründer Betreuer: PD Dr. Dominik Wiemuth 01.04.13 Master of Science in Biologie Vertiefungsrichtung: Biologische Informationsverarbeitung Thema der Masterarbeit: „Identifizierung intrazellulär assoziierter Proteine des Ionenkanals BASIC (bile acid-sensitive ion channel)“ Betreuer: PD Dr. Dominik Wiemuth 10/2010 – 03/2013 RWTH Aachen University Studium der Biologie, Abschluss M.Sc 01.09.10 Bachelor of Science in Biologie Thema der Bachelorarbeit: „Biochemische Charakterisierung der Interaktionen zwischen Filaminen und dem Multiadapterprotein Myopodin“ Betreuer: Dr. Anja Linnemann 10/2007 – 09/2010 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Studium der Biologie, Abschluss B.Sc 2007 Allgemeine Hochschulreife St. Leonhard Gymnasium Aachen

Veröffentlichungen

Schmidt A*, Löhrer D*, Alsop RJ, Lenzig P, Oslender-Bujotzek A, Wirtz M, Rheinstädter MC, Gründer S, Wiemuth D. A Cytosolic Amphiphilic α-Helix Controls the Activity of the Bile Acid-sensitive Ion Channel (BASIC). J Biol Chem. 2016; 291(47):24551-24565. PubMed PMID: 27679529

* geteilte Erstautorenschaft

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