INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA EVOLUTIVA – PPG-GCBEv

VANESSA SUSAN PINHEIRO FIGLIUOLO

MANAUS, AMAZONAS 2020 2

VANESSA SUSAN PINHEIRO FIGLIUOLO

ORIENTADORA: MARIA CLAUDIA GROSS – UNILA ​ CO-ORIENTADORA: ELIANA FELDBERG – INPA ​

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como requisito para obtenção do título em Doutora em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

MANAUS, AMAZONAS 2020 3

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Dedico esta tese à minha mãe Edlamar Silva, meu esposo Vittorio Figliuolo Neto e meu filho Vincenzo Figliuolo pelo incentivo e apoio incondicional. 6

Eu sou parte de uma equipe. Então quando venço, não sou eu apenas quem vence. De certa forma, termino o trabalho de um grupo enorme de pessoas. Ayrton Sena 7

Apoio: ● Coordenação de Pós-Graduação – COPOG/INPA; ● Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva – PPG-GCBEv/INPA; ● Comitê de Ética em Pesquisa – CEP/INPA; ● Coordenação de Biodiversidade – COBIO/INPA; ● Setor de Transportes/INPA; ● Divisão de Suporte às Estações e Reservas – DSER/INPA; ● Base de Apoio Flutuante Catalão/INPA; ● Coleção Zoológica/INPA; ● COBIO/INPA: Dr Jansen Zuanon; ● Laboratório de Genética Animal – LGA/INPA; ● Laboratório de Citogenômica Animal – LACA/UFAM; ● O presente trabalho foi realizado com apoio do Governo do Estado do Amazonas, Secretaria de Estado de Desenvolvimento Econômico, Ciência, Tecnologia e Inovação (SEDECTI), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) – POSGRAD 2016 Resolução N. 002/2016, PAPAC/FAPEAM Edital 005/2019 e Apoio Financeiro Edital Universal Amazonas - Dinâmica de elementos transponíveis do tipo Rex em ​ peixes amazônicos frente a mudanças ambientais Edital 002/2018; ● O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001; Processo 23038.009447/2013-45, número do auxílio 3295/2013, Programa Pró-Amazônia: Biodiversidade e Sustentabilidade Edital Nº 047/2012; ● INCT – Centro de Estudos das Adaptações da Biota Aquática ADAPTA-AMAZÔNIA/Fase II, Chamada Pública MCTI/CNPq/FAPS Nº 16/2014.

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Agradecimentos

Eu consigo fechar meus olhos e lembrar da Vanessa sonhadora na época do vestibular ou pensando em todas as áreas interessantes da biologia que queria seguir (Olha que eu queria seguir praticamente todas, conforme cursava as disciplinas) e num piscar de olhos estou aqui escrevendo os agradecimentos de minha tese. De fato, a gente não lembra de dias, meses ou anos, mas de momentos que são o que realmente compõem a vida. Momentos que sejam tempestades ou felicidades são sempre momentos de crescimento, por mais que a gente mesmo não perceba isso na hora.

Um dia a minha amiga Erika Milena me disse: “A história da tua tese é uma história de amor. Daria para escrever um livro”. Realmente é uma história de amor... próprio. Nunca imaginei passar por nada parecido. Imagine alguém que morava na casa dos pais e que terminou o mestrado de forma tecnicamente tranquila e, simplesmente, resolve entrar no doutorado, e entra! De repente casa, a orientadora muda de cidade, tem um filho, muda de laboratório, passa em um concurso público, assume o concurso, a avó falece e apesar de todos esses acontecimentos ainda tinha que terminar a tese durante uma pandemia! A rapadura foi doce, mas nenhum pouco mole! Foi uma montanha russa em todos os sentidos, mas olhando para trás não poderia ter acontecido melhor. A orientadora (que sempre foi uma das minhas maiores inspirações) apenas fisicamente distante, fez-me ter mais autonomia ainda e, como consequência fez-me efetivamente conhecer uma das pessoas mais maravilhosas que pude conhecer, minha co-orientadora. Amo igualmente e singularmente as duas!

O processo de doutoramento trouxe um crescimento profissional incrível, mas um gigantesco amadurecimento pessoal. A vida muda caminhos graças a Deus, mas não é capaz de nos fazer esquecer. Foram quatro anos e muitos momentos vividos, com isso carrego muitas pessoas no coração, gente que vi ontem e que há muito tempo não vejo. Gente que passou pela minha vida e plantou flores lindas no meu jardim. Flores que rego com muita saudade. Gente que me marcou e sempre terá espaço em meu lar e no meu coração. Gente que chegou nas asas de anjos e durou o tempo certo para me ensinar, ajudar e melhorar... e de todo meu coração sempre serei grata. Incluo cada uma dessas pessoas nas minhas orações e sei que torcem por mim, mesmo aqui pertinho ou do outro lado do mundo. A vida é isso: pessoas vão e vêm, não tem jeito. E a gente vai selecionando quem fica ou não no lado esquerdo do peito. 9

Jamais poderia deixar de primeiramente agradecer a Deus por esse momento vivido. Que alegria eu sinto pela bondade de Deus! Depois, agradecer minha família: à minha mãezinha linda, Edlamar, pelo incentivo e apoio incondicional durante o doutorado e toda minha vida; ao meu marido, Vittorio, pelo encorajamento de entrar no doutorado e por todos os muitos momentos de compreensão. Você merece um subtítulo de doutor por esse doutorado, por tabela. Você me inspira a me superar, mudar e a sempre aprender algo novo! Juntamente a ele agradeço ao meu filho, Vincenzo, por entender, mesmo que pequeno, os diversos sábados ausentes e dias de coleta. Amo vocês!

Agradeço imensamente ao meu time de gigantes, Maria Claudia Gross e Eliana Feldberg, por todos os momentos de parceria, coletas, trabalho de laboratório, escrita, discussões científicas, conselhos e por segurarem o leme quando eu joguei a toalha. Sobre segurar o leme não posso deixar de agradecer ao Leo e ao Patrik. Obrigada, meninos!

Minha gratidão segue pelos caminhos que passei ao longo desses anos em forma dos melhores desejos a todos que me fizeram bem:

LACA/UFAM: Carlos, Dani Matoso (Dani, foi maravilhoso fazer os estágios de docência com você! Eu aprendi muito. Foi quando realmente me vi professora!), Erika, Francy, Leo, Maria Claudia Gross, Marcos, Masseo, Natália, Sassá.

LGA/INPA: Alex, Alber, Deborah, Eliana Feldberg, Erika, Francy, Janice, José, Juliana, Leo, Marajó, Patrik, Ramon, Simone.

GCBEv: Gislene Zilse e Jacqueline Baptista

Banca de qualificação: Carlos Faresin, Diego Pinangé, Izeni Farias, José Gomes, Sidineia Amadio.

Banca de defesa: Diego Pinangé, Josiane Taldi, Luís Reginaldo, Maelin Silva, Marcelo Cioffi, Patricia Maltempi, Rafaela Ota e Roberto Artoni.

Dr. Daniel Ribeiro Chaves, Dra. Luciana Mendes, Dra. Luise Gonçalves, Gisele Moura e Lidialuz e família.

Fecho um ciclo, mas não fecho o círculo de amizade!

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Resumo

Cynodontidae é uma família de peixes carnívoros da ordem Characiformes formada por oito espécies, agrupadas nos gêneros Cynodon, Raphiodon e Hydrolycus e, juntamente ​ ​ ​ com Hemiodontidae, Serrasalmidae, Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidae, Curimatidae e Anostomidae formam a superfamília Curimatoidea. Embora o conhecimento sobre a posição filogenética desta família tenha avançado, pouco ainda se sabe a respeito da evolução cromossômica. Assim, este estudo traz evidências da evolução cariotípica da família Cynodontidae a partir da caracterização citogenômica de três espécies da Amazônia e do estudo de suas relações. Para tanto, são apresentados dados citogenéticos convencionais e mapeamento de DNAs repetitivos (DNAr 5S e 18S, Rex 1, 3 e 6 e sequências microssatélites) em uma espécie de cada gênero de ​ ​ ​ ​ Cynodontidae (Cynodon gibbus, Raphiodon vulpinus e Hydrolycus armatus) com o ​ ​ ​ ​ ​ objetivo de elucidar os mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica. As três espécies aqui estudadas possuem número diploide igual a 54 e variação na macroestrutura cariotípica (NF = 104, 106, 108), indicando a ocorrência de rearranjos não Robertsonianos. Além disso, apresentamos o primeiro relato de cromossomos sexuais diferenciados dentro de Cynodontidae, em C. gibbus, que apresentou ​ ​ cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW com origem independente dentro de Curimatoidea e mostramos que DNAs repetitivos desempenharam um papel fundamental na diferenciação desses cromossomos sexuais.

Palavras-chave: Curimatoidea, Cromossomos sexuais, DNAr, Rex, FISH, ​ ​ ​ ​ Microssatélite.

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Abstract Cynodontidae is a family of carnivorous fishes of the order Characiformes formed by eight species, grouped in the genera Cynodon, Raphiodon and Hydrolycus, together ​ ​ ​ with Hemiodontidae, Serrasalmidae, Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidae, Curimatidae, and Anostomidae form the superfamily Curimatoidea. Although knowledge about the phylogenetic position of this family has advanced, little is known about chromosomal evolution. Thus, this study brings evidence of the karyotype evolution of the Cynodontidae family from the cytogenomic characterization of three species in the Amazon and the study of their relationships. For that, conventional cytogenetic data and repetitive DNA mapping (5S and 18S rDNA, Rex 1, 3 and 6 and ​ ​ ​ ​ microsatellite sequences) are presented in a species of each genus of Cynodontidae (Cynodon gibbus, Raphiodon vulpinus and Hydrolycus armatus) with the objective to ​ ​ ​ ​ ​ elucidate the evolutionary mechanisms involved in karyotype differentiation. The three species studied here have a diploid number equal to 54 and variation in the karyotype macrostructure (FN = 104, 106, 108), indicating the occurrence of non-Robertsonian rearrangements. In addition, we present the first report of differentiated sex chromosomes within Cynodontidae, in C. gibbus, which presented sex chromosomes of ​ ​ the ZZ/ZW type with independent origin in Curimatoidea and showed that repetitive DNAs played a fundamental role in the differentiation of these sex chromosomes.

Keywords: Curimatoidea, rDNA, Rex, repetitive DNA, sex chromosomes, FISH, ​ ​ Microsatellite.

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO 1 Família Cynodontinae 1 Filogenia de Cynodontidae 3 Citogenética de Cynodontidae 7 DNAs repetitivos 8 Cromossomos sexuais 11 OBJETIVOS 13 Objetivo Geral 13 Objetivos Específicos 13 MATERIAL E MÉTODOS 14 Material 14 Obtenção de cromossomos mitóticos 14 Preparações de lâminas com cromossomos mitóticos 15 Detecção da Heterocromatina Constitutiva - Banda C 15 Detecção de regiões organizadoras do nucléolo (RON) - Ag-RON 15 Extração de DNA 16 Isolamento de sequências repetitivas por Polymerase Chain Reaction (PCR) 16 ​ ​ Marcação das sondas 17 Hibridização in situ fluorescente – FISH 18 ​ ​ Análises cromossômicas 19 RESULTADO E DISCUSSÃO 20 Capítulo 1. Primeira descrição de cromossomos sexuais em uma espécie da família Cynodontidae: Cynodon gibbus (Spix & Agassiz 1829) 21 Resumo 23 Introdução 24 Material e Métodos 26 Resultados 27 Discussão 30 Capítulo 2. Insights sobre a evolução cariotípica de Cynodontidae (Ostariophysy: ​ ​ Characiformes) 33 Resumo 34 Introdução 35 Material e Métodos 36 Resultados 38 13

Discussão 46 Capítulo 3. Diversidade oculta da porção terminal dos cromossomos de espécies de Cynodontidae (Ostariophysi: Characiformes) 51 Resumo 52 Introdução 52 Material e Métodos 54 Resultados 55 Discussão 60 CONCLUSÃO 65 REFERÊNCIAS 66

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Lista de figuras

INTRODUÇÃO

Figura 1. Imagem ilustrativa de representantes dos três gêneros de Cynodontidae (Cynodon, Raphiodon e Hydrolycus). Fonte: ​ ​ ​ ​ ​ www.aquariofilia.net/forum/gallery/image/35029-cynodontinae Acesso: 23/04/2020...... 2

Figura 2. Mapa hidrológico da América do Sul com a distribuição de Cynodontidae. ​ Círculos pretos indicam onde espécies de Cynodontidae já foram amostradas. Azul corresponde a distribuição de R. vulpinus. Vermelho corresponde a distribuição das ​ ​ espécies de Hydrolycus e Cynodon. Fonte: Toledo-Piza 2000, com ​ ​ ​ modificações...... 3

Figura 3. Cladograma de Cynodontidae baseado em dados osteológicos. Fonte: adaptada de Toledo-Piza (2000)...... 5

Figura 4. Árvore filogenética mostrando a relação de Erythrinidae, Cynodontidae, Hemiodontidae, Serrasalmidae, Anostomidae, Chilodontidae, Prochilodontidae e Curimatidae. Uma série de três números (por exemplo, 1/100/90) em cada um dos nós principais representa a probabilidade posterior para divisão obtida na análise bayesiana, porcentagem de suporte bootstrap obtida por máxima verossimilhança e porcentagem ​ de suporte bootstrap obtida por máxima parcimônia. Traços indicam valores de bootstrap inferiores a 50%. Círculos indicam o número do clado segundo o autor. Em destaque: Cynodontidae. Fonte: Oliveira et al. (2011)...... 6

Figura 5. Árvore filogenética de Curimatoidea proposta por Betancur-R et al. (2018). ​ ​ Fonte: Betancur-R et al. ​ ​ (2018)...... 7

RESULTADO E DISCUSSÃO

Capítulo 1 15

Figura 1. Cariótipos de macho de Cynodon gibbus: a coloração por Giemsa. b ​ ​ ​ ​ Bandeamento C. Cromossomos sexuais de fêmeas são mostrados nas caixas. Barra de escala: 10 µm...... 28

Figura 2. Mapeamento cromossômico de DNA repetitivos em Cynodon gibbus: a – c ​ ​ ​ ​ Elementos transponíveis. d – i Sequências microssatélites. j Sequência telomérica. Nas ​ ​ caixas: Cromossomos sexuais femininos (a – h, j) e o par 18 (i) com (GATA)8. Barra de ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ escala: 10 µm...... 29

Capítulo 2

Figura 1. Cariótipo de Rhaphiodon vulpinus: a em coloração convencional com ​ ​ ​ Giemsa; b Distribuição de heterocromatina constitutiva; c Sequências teloméricas. ​ ​ Barra indica 10µm...... 40

Figura 2. Cariótipo de Hydrolycus armatus: a em coloração convencional com Giemsa; ​ ​ ​ b distribuição de heterocromatina constitutiva; c Sequências teloméricas. Barra indica ​ 10µm...... 42

Figura 3. Nas caixas estão evidenciados os pares portadores de Região Organizadora de ​ Nucléolo (a, d, g); DNAr 18S (sinal em verde) (b, e, h); DNAr 5S (sinal em vermelho) ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ (c, f, i) para as espécies R. vulpinus, H. armatus e C. gibbus...... ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ 43

Figura 4. Ideograma mostrando a compilação de dados citogenéticos disponíveis para ​ as espécies C. gibbus, H. armatus e R. vulpinus. * Pastori et al. 2009 ** Martinez et al. ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ 2004 * Dados de RON e Heterocromatina constitutiva informados sem precisão de localização cromossômica. Árvore filogenética proposta por Oliveira et al. 2011, Silva ​ ​ 2011, Betancur-R et al. ​ 2018...... 45

Capítulo 3

Figura 1. a Hibridização de sequências repetitivas de DNA Rex 6 (sinais em vermelho) ​ ​ ​ em cromossomos metafásicos de Rhaphiodon vulpinus. Cromossomos metafásicos de R. ​ ​ ​ vulpinus com ausência de hibridização de: b Rex 1e c Rex 3. Barra indica ​ ​ ​ ​ ​ ​ 10µm...... 56 16

Figura 2. Sequências de microssatélites (sinais em vermelho) hibridizadas em ​ cromossomos mitóticos de Rhaphiodon vulpinus: a (CA)15; b (AG)15; c (GATA)8; d ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ (GACA) Cromossomos metafásicos de C. gibbus com ausência de hibridização de: e ​8. ​

(CAT)10 e f (CAC)10. Barra indica 10µm...... 57 ​ ​ ​ ​ ​ ​ Figura 3. Hibridização de sequências repetitivas de DNA (sinais em vermelho) em ​ cromossomos metafásicos de Hydrolycus armatus: a Rex1; b Rex3; c Rex6. Barra indica ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ 10µm...... 58

Figura 4. Sequências de microssatélites (sinais em vermelho) hibridizadas em ​ cromossomos mitóticos de Hydrolycus armatus: a (CA)15; b (AG)15; c (GATA)8; ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​

Cromossomos metafásicos de H. armatus com ausência de hibridização de: d (CAT)10; ​ ​ ​ e (CAC)10; f (GACA)8. Barra indica ​ ​ ​ ​ ​ 10µm...... 60

Figura 5. Idiograma com as diferenças citogenéticas encontradas em R. vulpinus, H. ​ ​ ​ ​ armatus e C. gibbus a partir de marcadores utilizados no presente trabalho, em ​ Pinheiro-Figliuolo et al. (2020) para C. gibbus e heterocromatina constitutiva e ITS de ​ ​ ​ Pinheiro-Figliuolo et al. (in prep.). Dados de microssatélites e Rex mostram apenas os ​ ​ ​ ​ ​ cromossomos onde estas sequências estão compartimentalizadas. Traço ( _ ) em C. ​ gibbus indica a localização do cromossomo sexual, que está representado na caixa...... 61

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Lista de tabelas RESULTADO E DISCUSSÃO

Capítulo 2

Tabela 1. Espécies, número de indivíduos por sexo, pontos de coleta e número dos ​ vouchers das espécies analisadas no presente trabalho...... 37

Tabela 2 Dados Citogenéticos de Cynodontidae. 2n= Número diploide; FC = Fórmula cariotípica; HC = Heterocromatina constitutiva; RON = Região Organizadora de Nucléolo; 5S = DNAr 5S; 18S = DNAr 18S; m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; st = subtelocêntrico; a = acrocêntrico; p= braço curto; q = braço longo; t = terminal; i = intersticial; c = centromérica; - = dados não disponibilizados; NE = dados não evidenciados. Referências: 1 = Martinez et al. 2004; 2 = Pastori et al. 2009; 3 = ​ ​ ​ Pinheiro-Figliuolo et al. 2020; 4 = Presente ​ ​ trabalho...... 44

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Lista de abreviações e siglas

μL Microlitro °C Graus Celsius 2n Número diploide a Acrocêntrico AgNO Nitrato de Prata ​3 Ag-RON Região organizadora de nucleolo argenteofílica Ba(OH) Hidróxido de bário ​2 Banda C Técnica de detecção da heterocromatina constitutiva c Centromérico CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal DAPI 4',6-diamidino-2-phenilindole DNA Ácido desoxirribonucléico (deoxyribonucleic acid) ​ ​ DNAr Ácido desoxirribonucléico ribossômico (ribosomal ​ deoxyribonucleic acid) ​ dNTP Desoxirribonucleotídeos dATP Desoxiadenosina trifosfatada dUTP Desoxiuracila trifosfatada EDTA Ácido etilenodiaminotetracético ETs Elementos transponíveis FC Fórmula Cariotípica FISH Hibridização Fluorescente in situ ​ FITC Fluoresceina isotiocianato (fluorescein isothiocyanate) ​ ​ g Gramas h Hora (s) HCl Ácido Clorídrico i Intersticial ICMBio Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade IGS Espaçador intergênico (intergenic spacer) ​ ​ INPA Instituto Nacional de Pesquisas da Amazonia 19

ITS Sítios teloméricos intersticiais (interstitial telomeric ​ sites) ​ Kb Quilobases KCl Cloreto de potássio LDS Locus de determinação do sexo m Metacêntrico M Molar MgCl Cloreto de magnésio ​2 mL Mililitros mm Milimetros mM Micromolar N Normal não-LTR Sem Longas terminações repetidas diretas (Long ​ Terminal Repeat) ​ NF Número fundamental NTS Espaçador não-transcrito (non-transcribed spacer) ​ ​ p Braço curto pb Pares de base pg Picograma PBS Tampão fosfato dextrano PCR Reação em cadeia da polimerase pH Potencial Hidrogeniônico primers Oligos iniciadores Rex Retroelemento isolado primariamente de Xiphophorus ​ RNA Ácido Ribonucléico RNAm Ácido Ribonucléico mensageiro RNAr Ácido Ribonucléico ribossomal RON Região organizadora de nucléolo rpm Rotações por minuto RT Transcriptase reversa S Subunidade SDS Dodecil sulfato de sódio SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade 20 sm Submetacêntrico SSC Solução salina de citrato padrão SSR Sequências de repetição simples/Microssatélites (Single Sequence Repeat) ​ ​ st Subtelocêntrico t Terminal U Unidades

INTRODUÇÃO Família Cynodontinae

A família Cynodontidae Eigenmann 1910 é um grupo de peixes predadores pouco diverso entre os Characiformes, possuindo oito espécies (Fricke et al. 2020). ​ Seus representantes apresentam nadadeira peitoral bem desenvolvida e boca oblíqua, com dentes caninos altamente desenvolvidos que servem para segurar as presas e se alimentam prevalentemente de peixes (Arent 1997; Toledo-Piza 2000). Os peixes dessa família atingem até 70 cm de comprimento total (Toledo-Piza 2000, 2013, 2018). Fósseis deste grupo, com datação do Mioceno (ca. 5,3-23 m.a.), foram encontrados em La Venta, atual vale do rio Magdalena, na Formação da Anta, localizada na Quebrada de La Yesera na Argentina e próximo à cidade de Paraná, na província de Entre Rios na Argentina (Cione e Casciotta 1995, 1997; Lundberg 1997). Três gêneros compõem os Cynodontidae (Figura 1): Cynodon Spix 1829 com ​ ​ as espécies Cynodon gibbus (Spix & Agassiz 1829), Cynodon meionactus Géry et al. ​ ​ ​ ​ 1999 e Cynodon septenaruis Toledo-Piza 2000, que é basal do clado formado por ​ Rhaphiodon Agassiz 1829, um gênero monotípico composto apenas por Rhaphiodon ​ ​ vulpinus Spix & Agassiz 1829 e pelo grupo-irmão Hydrolycus Müller & Troschel 1844, ​ composto pelas espécies Hydrolycus armatus (Jardine 1841), Hydrolycus scomberoides ​ ​ ​ (Cuvier 1819), Hydrolycus tatauaia Toledo-Piza Menezes & Santos 1999 e Hydrolycus ​ ​ ​ wallacei Toledo-Piza Menezes & Santos 1999 (Toledo-Piza et al. 1999; Buckup et al. ​ ​ ​ ​ 2007). Morfologicamente os três gêneros são de fácil distinção: Cynodon apresenta ​ peixes de médio porte com comprimento total de até 30 cm com coloração cinza-prateada, escamas ciclóides de aspecto liso, corpo curto e alto, nadadeira adiposa transparente, nadadeira dorsal localizada na altura do início da nadadeira anal, eventualmente com pequenas variações, e uma mancha escura arredondada atrás da margem superior da abertura branquial e outra na base da nadadeira caudal. Já Hydrolycus possui peixes de grande porte com comprimento total de até 50 cm com coloração escura em tons pretos, escamas ctenóides de aspecto áspero, nadadeira adiposa preta na extremidade, nadadeira dorsal à frente do início da nadadeira anal, e uma mancha escura alongada atrás da margem superior da abertura branquial. Rhaphiodon possui grande porte atingindo até 70 cm de comprimento total com ​

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coloração cinza-prateada, corpo alongado, nadadeira dorsal atrás do início da nadadeira anal (Santos et al. 1984, 2009; Toledo-Piza 2000). ​ ​

Figura 1. Imagem ilustrativa de representantes dos três gêneros de Cynodontidae (Cynodon, Raphiodon e Hydrolycus). Fonte: ​ ​ ​ ​ ​ www.aquariofilia.net/forum/gallery/image/35029-cynodontinae Acesso: 23/04/2020.

Os peixes da família Cynodontidae apresentam grande quantidade de espinhos, por isso são de baixo valor comercial como alimento para população humana. Entretanto, algumas espécies de Hydrolycus e Rhaphiodon são utilizadas na pesca de ​ ​ subsistência e os peixes do gênero Hydrolycus e Rhaphiodon são ainda utilizados para ​ ​ ​ pesca esportiva (Santos et al. 1984, 2009; Taphorn 1992). Estes peixes vivem no ​ ​ metalímnion e epilíminion de lagos, rios e florestas alagadas por serem visualmente orientados e podem ocorrer preferencialmente em águas com maior transparência, como pretas e claras (Arendt 1997; Melo et al. 2009). A maioria dos Cynodontidae está ​ ​ distribuída na bacia Amazônica (C. gibbus, C. septenaruis, R. vulpinus, H. armatus, H. ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ scomberoides, H. tatauaia e H. wallacei), bacia do rio Orinoco (C. gibbus, C. ​ ​ ​ ​ ​ septenaruis, R. vulpinus, H. armatus, H. tatauaia e H. wallacei) e nas bacias atlânticas ​ ​ ​ ​ ​ ​

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das Guianas (C. gibbus, C. meionactis, C. septenaruis, R. vulpinus, H. armatus e H. ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ tatauaia). Sendo que Rhaphiodon vulpinus ocorre ainda no Sul da América do Sul, ​ ​ especificamente nas bacias dos rios Paraná-Paraguai e Uruguai (Lucena e Menezes 1998; Toledo-Piza 2000; Frickle et al. 2020) (Figura 2). ​ ​

Figura 2. Mapa hidrológico da América do Sul com a distribuição de Cynodontidae. ​ Círculos pretos indicam onde espécies de Cynodontidae já foram amostradas. Azul corresponde à distribuição de Rhaphiodon vulpinus. Vermelho corresponde à ​ ​ distribuição das espécies de Hydrolycus e Cynodon. Fonte: Toledo-Piza (2000), com ​ ​ ​ modificações.

Filogenia de Cynodontidae

Durante muito tempo, Cynodontidae foi composta por duas subfamílias: Roestinae e Cynodontinae (Lucena e Menezes 1998), entretanto o monofiletismo das

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subfamílias era incerto (Menezes 1974; Lucena 1993; Mattox 2010; Toledo-Piza 2000; Oliveira et al. 2011; Silva 2011). Estudos iniciais, com base apenas em dados ​ ​ morfológicos, trataram Roestes Günther 1864 e Gilbertolus Eigenmann 1907 (gêneros ​ ​ de Roestinae) como sinônimos e os incluíram em Characidae (Menezes 1974). Howes (1976) ao estudar a musculatura intracraniana objetivando investigar as relações desse grupo, propôs pela primeira vez uma relação mais próxima de Roestes com os gêneros ​ Cynodon, Hydrolycus e Rhaphiodon na tribo Cynodontinii juntou as duas subfamílias ​ ​ ​ na tribo Cynodontinii (Characidae). Já, Lucena (1993) hipotetizou o grupo monofilético Roestinae como grupo-irmão de Characidae, enquanto Lucena e Menezes (1998) averiguaram caracteres morfológicos que sugeriam o monofiletismo não só de Roestinae, mas também da família Cynodontidae, introduzindo Roestinae dentro de Cynodontidae. Moreira (2007) sugeriu Cynodontidae como grupo-irmão do clado composto por Acestrorhynchus, Hepsetidae e Ctenolucidae. Mattox e Toledo-Piza ​ ​ (2012) consideraram Roestinae como uma subfamília de Characidae. Portanto, conforme a metodologia filogenética foi avançando, e os autores foram inserindo mais caracteres morfológicos e mais táxons terminais as relações foram sendo recuperadas de formas diferentes. Entretanto, em sua maioria aproximando Roestinae à Characidae. Nas propostas mais recentes, que foram posteriormente corroboradas por dados moleculares, Roestinae é mais proximamente relacionada à Acestrorhynchidae do que com Cynodontidae (Howes 1976; Lucena 1993; Oliveira et al. 2011; Mattox e ​ Toledo-Piza 2012). Ao contrário de Roestinae, o monofiletismo de Cynodontinae nunca foi questionado devido à elevada similaridade morfológica que as espécies apresentam (Toledo-Piza 2020). Apesar de ainda não ter uma proposta filogenética, Eigenmann (1910) apresentou os gêneros pertencentes à subfamília (Cynodon, Hydrolycus e ​ ​ ​ Raphiodon) e trabalhos morfológicos seguintes apresentaram diferentes caracteres ​ diagnósticos e as primeiras sinapomorfias para subfamília (Howes 1976; Buckup e Petry 1994; Lucena e Menezes 1998). O trabalho de Toledo-Piza (2000) foi o mais abrangente, utilizando dados osteológicos que corrobororaram a monofilia de Cynodontinae e dos três gêneros que a compõe, e recuperou Hydrolycus como ​ grupo-irmão do clado composto por Raphiodon e Cynodon (Figura 3). Já, filogenias ​ ​ moleculares recuperaram Cynodon como grupo-irmão do clado formado por Hydrolycus ​ ​ e Raphiodon (Oliveira et al. 2011; Silva 2011) (Figura 4). Adicionalmente, essas ​ ​ ​ filogenias moleculares não recuperaram o monofiletismo das subfamílias Cynodontinae

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e Roestinae. Assim, Oliveira et al. (2011) incluiram Roestinae em Acestrorhynchidae e ​ ​ Cynodontinae foi elevada à família (Cynodontidae), composta pelos gêneros: Cynodon, ​ ​ Hydrolycus e Raphiodon. Essa classificação foi seguida por diversos autores ​ ​ subsequentes como Toledo-Piza (2018); Betancourt-R et al. (2018) e Mirande (2019).

Figura 3. Cladograma de Cynodontidae baseado em dados osteológicos. Fonte: adaptada de Toledo-Piza (2000).

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Figura 4. Árvore filogenética mostrando a relação de Erythrinidae, Cynodontidae, Hemiodontidae, Serrasalmidae, Anostomidae, Chilodontidae, Prochilodontidae e Curimatidae. Uma série de três números (por exemplo, 1/100/90) em cada um dos nós principais representa a probabilidade posterior para divisão obtida na análise bayesiana, porcentagem de suporte bootstrap obtida por máxima verossimilhança e porcentagem ​ de suporte bootstrap obtida por máxima parcimônia. Traços indicam valores de ​ bootstrap inferiores a 50%. Círculos indicam o número do clado segundo o autor. Em destaque: Cynodontidae. Fonte: Oliveira et al. (2011). ​ ​

Outra discussão pertinente é a posição filogenética de Cynodontidae dentro de Characiformes, onde filogenias moleculares, que incluíram ao menos um representante de Cynodontidae em suas análises, recuperaram árvores filogenéticas com Cynodontidae como grupo-irmão de Parodontidae ou Cynodontidae como grupo-irmão do clado formado por Serrasalmidae, Anostomidae, Hemiodontidae e Parodontidae (Orti e Meyer 1997; Calcagnoto et al. 2005, respectivamente). Já, as análises com um ​ número maior de espécies encontraram Cynodontidae como grupo derivado, assim

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como Serrasalmidae, num clado formado também por Hemiodontidae, Prochilodontidae e Parodontidae ou Cynodontidae basal e grupo-irmão do clado formado por Hemiodontidae, Serrasalmidae, Anostomidae, Chilodontidae, Prochilodontidae e Curimatidae (Silva 2011; Oliveira et al. 2011, respectivamente). Betancur-R et al. ​ ​ ​ ​ (2018) usando elementos ultraconservados do DNA recuperaram o clado formado pelas mesmas famílias encontradas por Oliveira et al. (2011), mas com ausência de parafilia entre Curimatidae, Chilodontidae e Prochilodontidae e, portanto, mais resolutivo, chamando-o de superfamília Curimatoidea. Em Curimatoidea, Cynodontidae é o clado basal e grupo irmão de Hemiodontidae, Serrasalmidae, Anostomidae, Chilodontidae, Parodontidae, Prochilodontidae e Curimatidae (Betancourt-R et al. 2018) (Figura 5). ​ ​

Figura 5. Árvore filogenética de Curimatoidea proposta por Betancur-R et al. (2018). ​ ​ Fonte: Betancur-R et al. (2018). ​ ​

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Citogenética de Cynodontidae

Estudos citogenéticos na família Cynodontidae são incipientes, provavelmente por sua distribuição geográfica ampla e maior concentração na região amazônica, onde existem poucos grupos de pesquisa em citogenética bem como no Brasil, comparado à riqueza de espécies da ictiofauna a ser conhecida e pela fragilidade das espécies de Cynodontidae após serem capturadas, o que dificulta as preparações cromossômicas. Assim, dados cromossômicos restringem-se à espécie R. vulpinus, que apresenta 2n=54 ​ ​ cromossomos (Martinez et al. 2004, Pastori et al. 2009). Porém, existem diferenças ​ ​ ​ ​ intraespecíficas quanto às fórmulas cariotípicas, com distintos números de cromossomos do tipo metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a): R. vulpinus do rio Paraná (Porto Rico, Paraná, Brasil) apresentou ​ 32m+12sm+8st+2a (Martinez et al. 2004) e do rio Paraná (Posadas, Misiones, ​ ​ Argentina) apresentou 34m-sm+20st-a (Pastori et al. 2009). Além disso, a RON é do ​ ​ ​ tipo simples e a heterocromatina constitutiva está nas porções centroméricas, terminais e em poucos pares nas porções intersticiais e no braço curto de três pares cromossômicos (Martinez et al. 2004; Pastori et al. 2009). ​ ​ ​ ​ Embora apenas R. vulpinus tenha sido estudada citogeneticamente e regiões ​ com maior riqueza de espécies, como a bacia amazônica, não tenham sido investigadas neste contexto, Cynodontidae é sugerida como um grupo com macroestrutura cariotípica altamente conservada (Oliveira et al. 1988). O número diploide igual a 54 ​ ​ cromossomos, que parece ser conservado neste grupo, também é presente em outras famílias de Characiformes como Anostomidae, Chilodontidae, Curimatidae, Parodontidae e Prochilodontidae (Oliveira et al. 1988). Para estas famílias o processo de ​ ​ diversificação das espécies pode estar envolvido com a organização diferencial da fração repetitiva de DNA dos genomas (Terencio et al. 2012b; Barros et al. 2016; ​ ​ ​ Pinheiro et al. 2016; Traldi et al. 2016), especialmente porque sequências repetitivas de ​ ​ ​ ​ DNA apresentam um alto grau de polimorfismo, devido à variação no número das unidades de repetição, ocasionada por mutações (Tautz 1989), influenciando na estrutura, função e evolução dos cromossomos (Dey e Rath 2005; Tang 2011). Esta variabilidade torna os DNAs repetitivos excelentes marcadores para mapeamento e caracterização do genoma (Patak e Ali 2012). Entretanto, ainda não existem dados de mapeamento físico cromossômico de DNAs repetitivos, disponíveis para Cynodontidae.

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DNAs repetitivos

Os DNAs repetitivos compõem uma grande parte do genoma eucarioto e são conceituados como sequências de DNA, que podem ser idênticas ou semelhantes. Embora inicialmente tenha sido considerada DNA lixo, atualmente, esta classe de DNA apresenta diversas funções reconhecidas, dentre elas função estrutural e organizacional, de regulação gênica, replicação, reparo de DNA, diferenciação e regulação cromossômica e rearranjos cromossômicos. As sequências de DNAs repetitivos são subdivididas em duas classes: DNAs repetitivos dispersos no genoma e DNAs repetitivos in tandem (Sumner 2003). ​ ​ Os DNAs repetitivos dispersos são conhecidos também como elementos transponíveis (ETs), que são sequências repetitivas de DNA com capacidade de movimentação e multiplicação no genoma uma vez que estejam ativos, perfazendo uma parte grande do genoma dos vertebrados. Este processo de transposição é catalisado por enzimas CIS ou TRANS presentes no mesmo genoma, e que apresentam capacidade de cortar e religar cadeias de DNA através da quebra da ligação fosfodiéster (Volff et al. ​ ​ 2003; Burt e Trivers 2006; Varani et al. 2015; Carducci et al. 2018). Ainda, esta ​ ​ ​ movimentação pode acontecer de maneira autônoma ou não autônoma de acordo com a presença de genes, que codificam todas as proteínas necessárias para transposição do ET ou ausência, respectivamente (Wicker et al. 2007). ​ ​ Os elementos transponíveis são classificados em classe I e classe II. A classe I é também conhecida como retrotransposons na qual fazem parte Rex 1, 3 e 6, SINE, ​ ​ ​ ​ ​ LINE e Penolope-like, por exemplo. Nesta classe, a síntese ocorre a partir de ácido ribonucleico mensageiro (RNAm), que ao chegar no citoplasma é traduzido em um conjunto de enzimas relacionadas à transposição, como a transcriptase reversa (RT), responsável pela síntese de uma nova cópia em DNA do retroelemento, utilizando a própria molécula de RNAm recém-transcrita como molde (Varani et al. 2015). Já, na ​ classe II, conhecida como transposons da qual fazem parte Tc1-Mariner e Helitron por exemplo, a transposição acontece sem uma molécula molde de RNAm. Assim, a transposição acontece a partir da síntese de enzimas para excisão de um sítio doador para sua inserção em um sítio receptor (Varani et al. 2015). ​ ​ Os ETs têm se mostrado importantes na estrutura e evolução de genomas de peixes, onde o tamanho do genoma tem sido sugerido como paralelo ao conteúdo de ETs dentro dele (Shao et al. 2019). Dentre os ETs mais estudados citogeneticamente ​ ​

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estão os retroelementos Rex 1, 3 e 6 que são sequências não-LTR, isoladas ​ ​ ​ ​ ​ primeiramente de Xiphophorus maculatus (Volff et al. 2003). Eles têm sido ​ ​ ​ ​ relacionados principalmente à função estrutural, rearranjos cromossômicos, processos de especiação, criação de novos genes e determinação de sexo (Chalopin et al. 2015; ​ ​ Auvinet et al. 2018; Carducci et al. 2018). Portanto, o estudo de ETs seja a partir de ​ ​ ​ ​ mapeamento destes DNAs repetitivos em cromossomos ou de outras metodologias é essencial para investigação e compreensão da dinâmica evolutiva dos genomas. Os DNAs repetitivos in tandem compreendem DNAs satélites e os DNAs ​ ribossomais (DNAr) (Phillips e Reed 1996; Kidwell 2002; Suntronpong et al. 2017). ​ DNAs satélites comumente são encontrados em regiões heterocromáticas dos cromossomos, principalmente na porção centromérica ou terminal (Martins et al. 2004). ​ ​ Esta classe de DNA engloba, dentre outras subclasses, a de microssatélites. Estes são conceituados como sequências (motivos) de nucleotídeos de 2 a 6 pares de bases (bp) que se repetem em conjunto para formar trechos de DNA maiores, geralmente de comprimento entre 20 e 100 pares de bases (pb) (Beckmann e Weber 1992). Devido à sua alta taxa de mutação e distribuição genômica, microssatélites podem impactar significativamente a evolução do genoma por inúmeros mecanismos, incluindo efeitos potenciais na recombinação, regulação de expressão gênica, conversão genética e organização cromossômica (Pardue et al. 1987; Charlesworth et al. 1994; Moxon et al. ​ ​ ​ ​ 1994; Richard e Pâques 2000; Li et al. 2002; Martin et al. 2005; Balaresque et al. ​ ​ ​ ​ 2014). Dentre os microssatélites citogeneticamente estudados destacam-se sequências teloméricas. Essas sequências são hexanucleotídeos do tipo (TTAGGG) em ​n vertebrados e vêm sendo amplamente mapeadas nos cromossomos de peixes a fim de averiguar possíveis rearranjos cromossômicos (e.g. Rosa et al. 2012; Pinheiro et al. ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ 2016). Os DNAr são organizados em duas famílias multigênicas, 45S e 5S, que codificam RNA ribossomais (RNAr). A família 45S codifica os RNAr 18S, 28S e 5,8S e um espaçador intergênico não transcrito (IGS). Já, o DNAr 5S codifica o RNAr 5S e são unidades transcricionais conservadas e intercaladas por espaçadores não transcritos (NTS) (Martins et al. 2004). O mapeamento destas sequências é altamente informativo, ​ pois embora sejam sequências gênicas conservadas mesmo entre espécies distintas, os espaçadores variam em tamanho e em composição, permitindo entender a dinâmica da organização genômica desses genes, levando muitas vezes à caracterização de espécies e populações de peixes e, consequentemente permitindo o estudo de relações evolutivas

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interespecíficas (Martins et al. 2004; Barros et al. 2016; Ferreira et al. 2016; Favarato et ​ ​ ​ ​ ​ ​ al. 2019). ​ Diante das relações evolutivas das inúmeras classes e subclasses de DNAs repetitivos, tais sequências têm despertado interesse para o conhecimento de sua composição nos cromossomos, uma vez que é possível averiguar além de sua composição, sua relação na estrutura e função, evolução, rearranjos cromossômicos, origem e evolução de cromossomos supranumerários e cromossomos sexuais (Sumner 2003).

Cromossomos sexuais

A determinação de sexo em peixes é considerada flexível já que pode depender de fatores ambientais, comportamentais e genéticos. No caso de fatores genéticos, genes sexo-determinantes podem estar tanto em cromossomos autossômicos como em cromossomos sexuais heteromórficos (Devlin e Nagahama 2002). O processo de formação de cromossomos sexuais se inicia a partir de um par autossômico, em que um de seus homólogos recebe um locus de determinação do sexo ​ (LDS) que inibindo a recombinação da região, originando protossexuais (Charlesworth 1991). Associados à ação dos genes antagonistas que podem estar associados com o locus de determinação do sexo, rearranjos cromossômicos podem ocorrer, facilitando a supressão de recombinação (Bachtrog 2006). Consequentemente, a região afetada fica sujeita a ações de amplificação de DNAs repetitivos e acúmulo de heterocromatina constitutiva, de forma que este homólogo pode passar a ter alteração de composição, além da alteração de tamanho (Charlesworth et al. 2005; Bachtrog 2006). Embora esta ​ ​ alteração de tamanho não seja regra, é possível encontrar cromossomos sexuais em graus variáveis de diferenciação, desde homomórficos até extremamente heteromórficos e, por fim, sistemas de cromossomos sexuais derivados (Smith 1978; Bull 1983; Cioffi et al. 2017). Assim, os cromossomos sexuais podem ser do tipo simples, sendo XX/XY quando o heteromofismo está no macho e ZZ/ZW quando o heteromorfismo está na fêmea (Smith 1978; Bull 1983). Ainda, os cromossomos sexuais podem ser do tipo múltiplo, geralmente quando seus protossexuais passaram por rearranjos cromossômicos do tipo fissão ou fusão cêntrica (Ohno 1967; Charlesworth et al. 2005). ​ ​ O grupo com maior variedade de tipos de cromossomos sexuais é o de peixes, apresentando nove sistemas descritos atualmente: XX/XY, XX/X0, ZZ/ZW, ZZ/Z0,

X1X1X2X2/X1X2Y, XX/XY1Y2, Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2, X1X1X2X2/X1Y1X2Y2 e ZZ/ZW1W2 ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​

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(Ueno et al. 2001; de Oliveira et al. 2008; Arai 2011; Soares et al. 2014; Ferreira et al. ​ ​ ​ 2016; Yano et al. 2016; Araya-Jaime et al. 2017; Freitas et al. 2017; de Oliveira et al. ​ ​ ​ ​ ​ 2018). Em Cynodontidae até o presente momento nenhum cromossomo sexual diferenciado foi descrito. Em cromossomos heteromórficos é comum encontrar padrões de W ou Y heterocromático e rico em DNAs repetitivos (Volff et al. 2007; Vicari et al. 2008; Yano ​ ​ ​ ​ et al. 2014). Isso destaca a importância do estudo de mapeamento de sequências de DNAs repetitivos em cromossomos sexuais para compreender a composição dos cromossomos sexuais bem como sua origem e evolução. Portanto, o estudo da composição de sequências de DNAs repetitivos em espécies da famíliade Cynodontidae contribui para melhor compreensão do processo de diferenciação cromossômica da família a partir da relação de dados cromossômicos com as filogenias moleculares mais inclusivas de Cynodontidae (Oliveira et al. 2011; Silva ​ ​ 2011; Betancour-R et al. 2018). ​ ​

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OBJETIVOS Objetivo Geral

Compreender os mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica de Cynodontidae.

Objetivos Específicos Investigar a variação ou conservação da macroestrutura cariotípica de espécies de Cynodontidae provenientes da Amazônia brasileira.

Verificar a existência de tendência evolutiva à conservação do número diploide em Cynodontidae a partir de uma espécie representativa de cada gênero.

Compreender a organização genômica de DNAs repetitivos e seu papel na evolução genômica de espécies representativas de Cynodontidae.

Averiguar possíveis rearranjos cromossômicos em espécies representativas de cada gênero de Cynodontidae.

Compreender a evolução cromossômica de Cynodontidae, a partir do estudo de relações entre dados citogenéticos obtidos a partir de espécies representativas de cada gênero e filogenias moleculares propostas.

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MATERIAL E MÉTODOS Material

Foram estudados citogeneticamente 41 exemplares de Cynodontidae, coletados na Amazônia, com ênfase na Amazônia Central. Destes, 13 são Cynodon gibbus sendo ​ 2 machos e 5 fêmeas do lago Catalão (AM) (2°33’28,4”S, 60°46’29,7”W) e 2 machos e 4 fêmeas do Arquipélago de Anavilhanas (AM) (2°37’28,5”S, 60°58’16,8”W); 10 Hydrolycus armatus do rio Araguaia (PA) (5°22’34”S, 48°43’08”W) sendo 6 machos e 4 fêmeas e 18 Raphiodon vulpinus do lago Catalão (AM) (2°33’28,4”S, 60°46’29,7”W) ​ sendo 10 machos e 8 fêmeas. Os indivíduos foram coletados com redes de pesca (malhas 70, 80 e 90) com pesos nas extremidades inferiores e auxílio de tarrafas e rapichés. Com o suporte de um bote, as redes foram esticadas em canais e revisadas a cada 30 minutos e os peixes foram colocados em recipientes/tanques com água do próprio ambiente até serem transportados vivos para o Laboratório montado no flutuante ou do INPA. As coletas foram realizadas com a autorização concedida pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade – ICMBio, através do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade – SISBIO (Licença permanente no. 28095-1 e 5659-1) e pela Comissão de ética no uso de animais (CEUA) do Instituto Nacional de pesquisas da Amazônia (INPA) (no 045/2017, SEI ​ 01280.000804/2018-29). Os peixes foram eutanasiados com auxílio de Eugenol que causa bloqueio neuromuscular no peixe, seguindo as recomendações das Diretrizes da Prática da Eutanásia do Concea (Concea 2013). Após eutanasiados, para a obtenção de preparações cromossômicas foi extraído o rim, que é o órgão hematopoiético, e para extração do DNA as amostras de tecido muscular e fígado de todos os indivíduos, sendo estes exemplares numerados, registrados, fixados em formol 10% durante 24h e acondicionados posteriormente em recipientes contendo álcool 70% para o depósito na coleção ictiológica do INPA. Número de depósito:INPA-ICT 59499 (Cynodon gibbus), ​ ​ INPA-ICT 59500 (Rhaphyodon vulpinus), INPA-ICT 59501(Hydrolycus armatus). ​ ​ ​ ​ Obtenção de cromossomos mitóticos

Os cromossomos mitóticos foram obtidos de acordo com protocolo descrito por Bertollo et al. (2015). Após eutanasiados, o rim (anterior e posterior) de cada animal ​ ​ foi retirado. O material foi então lavado com Cloreto de Potássio (KCl) a 0,075M e

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hipotonizado com 10 mL da mesma solução, após sua dissociação com uma pinça de dissecção e seringa sem agulha, que auxilia na separação das células, sendo incubado a 37 °C por 30 minutos. Após este tempo, o material foi ressuspendido cautelosamente com auxílio de seringa sem agulha e transferido para tubos de centrífuga. Adicionou-se 10 gotas de fixador Carnoy (3 metanol:1 ácido acético) e centrifugou-se por 10 minutos a 900 rpm e retirou-se o sobrenadante. O material foi novamente ressuspendido com auxílio de pipeta Pasteur e o volume foi completado para 10 mL com fixador e centrifugado por 10 minutos a 900 rpm com repetição para fixação do material. Após a última centrifugação e eliminação do sobrenadante foram adicionados 1,5 mL de fixador e o material ressuspendido. As preparações foram armazenadas em tubos tipo eppendorf de 1,5mL e condicionados em freezers a 20 °C. ​ Preparações de lâminas com cromossomos mitóticos

As preparações cromossômicas foram analisadas em microscópio óptico com lâminas previamente preparadas (lavadas, secas ao ar e imersas em água destilada a 55 °C). As lâminas a 55 °C e com uma película de água foram submetidas a gotejamento das preparações, posteriormente coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06M e pH 6,8 por 15 minutos e lavadas com água destilada.

Detecção da Heterocromatina Constitutiva - Banda C

Para o bandeamento C as lâminas, anteriormente coradas e analisadas, foram descoradas por meio de lavagem com fixador Carnoy ou álcool 70%. O bandeamento foi realizado seguindo o protocolo de Sumner (1972), sendo as lâminas tratadas com Ácido Clorídrico (HCl) 0,2N a 46 °C por 2 minutos, lavadas com água destilada e secas ao ar. As lâminas foram imersas em solução de Hidróxido de Bário [Ba(OH)2] 5% por 1 ​ ​ minuto para quebra de sítios apurínicos e despurinização da molécula de DNA e lavadas com HCl a 42 °C para inibição da ação do Ba(OH)2. Em seguida foram colocadas em ​ ​ uma solução salina de 2xSSC por 15 minutos, para extração do DNA e estabilização da molécula, e lavadas com água destilada. Após o bandeamento as lâminas foram coradas com Giemsa 5% em tampão fosfato 0,06 M e pH 6,8 por 15 minutos e lavadas com água destilada.

Detecção de regiões organizadoras do nucléolo (RON) - Ag-RON

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As lâminas, previamente analisadas em coloração convencional ou utilizadas para detecção da heterocromatina constitutiva, foram primeiramente descoradas por meio de lavagem com fixador Carnoy para posterior detecção das regiões organizadoras de nucléolos ativas, segundo Howel e Black (1980). Para tanto, foram adicionadas 3 gotas de solução coloidal de gelatina (1g de gelatina comercial sem sabor + 50 mL de água destilada + 0,5 mL de ácido fórmico) em cada lâmina. Para cada gota de gelatina foram adicionadas 2 gotas de Nitrato de Prata (AgNO3) a 50% e coberta com lamínula. ​ ​ As lâminas foram colocadas em câmara úmida, em banho-maria a 60 °C por 3-8 minutos até que atingissem uma coloração castanha dourada. Após atingir a coloração ideal as lâminas foram lavadas em água destilada corrente até que a lamínula fosse retirada.

Extração de DNA

As extrações foram realizadas segundo o protocolo de isolamento de DNA total de Sambrook e Russel (2001), que consiste na lise celular alcalina de aproximadamente 0,02 mg de tecido muscular com o auxílio de 1% de SDS e digestão com 20 μL de Proteinase K (20 mg.mL-1) a 55 °C overnight (aproximadamente 10 ​ horas). O produto da digestão foi então purificado, separado dos “debris” celulares, por sucessivas lavagens utilizando-se fenol/clorofórmio (1:1) e clorofórmio. Depois de isolado, o DNA total foi precipitado com etanol absoluto, lavado com 1 mL de etanol 70% e eluído em tampão TE 1X (Tris-HCl 10 mM pH 8,5 e EDTA 0,1 mM). O DNA extraído foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com Gel Red (Biotium) para a verificação quanto ao grau de integridade deste DNA.

Isolamento de sequências repetitivas por Polymerase Chain Reaction (PCR) ​ ​ As amplificações dos genes de RNAr 18S, 5S e dos retroelementos Rex 1, 3 e 6 ​ ​ ​ ​ ​ foram realizadas por reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os oligonucleotídeos iniciadores (primers) 18Sf (5’ -CGCTTTGGTGACTCTTGAT-3’) e ​ ​ 18Sr (5’ -CCGAGGACCTCACTAAACCA -3’) (Gross et al. 2010); 5Sa (5’ ​ ​ -TACGCCCGATCTCGTCCGATC -3’) e 5Sb (5’-CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC -3’) (Martins e Galetti Jr. 1999); RTX1-F1 (5’-TTCTCC AGTGCCTTCAACACC-3’) e RTX1 -R1 (5’-TCCCTCAGCAGAAAGAGTCTGCTC-3’) (Friesen et al. 1999) e ​ ​ RTX3 -F3 (5’ -CGGTGAYAAAGGGCAGCCCTG-3’) e RTX3-R3 (5’-TGGCAGACNGGGGTGGTGGT-3’) (Volff et al. 2000); Rex 6-Medf1 (5` ​ ​ ​

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-TAAAGCATACATGGAGCGCCAC- 3’ e Rex 6- Medr1 (5’- ​ GGTCCTCTACCAGAGGCCTGGG- 3’) (Volff et al. 1999). As reações de PCR foram ​ ​ realizadas em um volume final de 25 μL, contendo DNA genômico de cada espécie

(200ng), tampão 10x com 1,5 mM de MgCl2, Taq DNA polimerase (5 U/μL), dNTPs (1 ​ ​ mM), par de primers (5 mM), e água Milli-Q. O perfil de reação para o DNAr 18S foi 1 ​ min 95 °C; 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 56 °C e 1 min 30s a 72 °C; seguidos por 5 min a 72 °C. As condições para amplificação do DNAr 5S foram 1 min 95 °C; seguido por 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 59 °C, e 1 min 30 s a 72 °C; e uma extensão final de 5 min a 72 °C e para Rex 1, Rex 3 e Rex 6: 2 min a 94 °C; 35 ciclos de ​ ​ ​ ​ ​ ​ 1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C e 1 min 30 s a 72°C; e uma extensão final de 5 min a 72 °C. A PCR da sequência telomérica (TTAGGG)n foi realizada em um volume final de

25 μL contendo tampão 10x com 1,5 mM de MgC2, dNTPs (1 mM), 0,2μL primer ​ ​ ​

(TTAGGG)5, 0,2μL primer (CCCTAA)5 (Ijdo et al. 1991) e 2U de Taq DNA ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ polimerase. A primeira parte da amplificação foi realizada com baixa estringência (4 min a 94 °C; seguida por 12 ciclos de 1 min a 94 °C, 45 s a 52 °C e 1 min 30 s a 72 °C), seguidos por 35 ciclos de alta estringência (1 min a 94 °C, 1 min 30 s a 60 °C e 1 min 30 s a 72 °C). Os fragmentos foram submetidos a uma eletroforese em gel de agarose 1% corado com Gel Red (Biotium) para a verificação quanto ao grau de integridade deste DNA. Os produtos de PCR foram utilizados como sondas para hibridização dos cromossomos metafásicos, após marcação. Foram utilizadas também as sequências microssatélites (GA)15, (CA)15, (CAC)10, (CAT)10, (GACA)8 e (GATA)8 que foram ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ marcadas diretamente com Cy3 durante a síntese (Kubat et al. 2008). ​ ​ Marcação das sondas

As sondas isoladas (PCR) foram marcadas pelo método de nick translation, ​ ​ utilizando biotina 14-dATP (Bionick labeling system - Invitrogen) e/ou digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix - Roche). Para tanto, em um tubo de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparada uma solução contendo 1 μL de Mix dNTP 10x; 1 μL de sonda de DNA (200 ng/μL); 1 μL de Mix de enzima 10x; 6 μL de água milli-Q, totalizando 9 μL, para cada lâmina que foi hibridizada. Esta solução foi homogeneizada, centrifugada brevemente e incubada a 16 ºC por 90 minutos no termociclador. Em seguida, para interromper a reação, foi adicionado 1 μL de stop buffer (EDTA 0,5 M) e ​ após isso foi mantida em freezer -20 ºC para posterior utilização. Os motivos

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microssatélite utilizados (GA)15, (CA)15, (CAC)10, (CAT)10, (GACA)8 e (GATA)8 foram ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ marcados diretamente com Cy3 durante a síntese (Kubat et al. 2008). ​ ​

Hibridização in situ fluorescente – FISH ​ ​ Foi utilizada a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH) descrita por ​ Pinkel et al. (1986). Sequências teloméricas, DNA ribossomais, elementos transponíveis ​ obtidos por PCR, foram utilizados como sondas. Além disso, as sondas de microssatélites foram obtidas comercialmente e já vieram marcadas com digoxigenina. As lâminas foram lavadas em tampão PBS 1x por 5 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada e tratadas com 90 μL de RNase 10 μg/mL (5 μL de RNase 10 mg/mL e 975 μL de 2xSSC) por 1 hora em câmara úmida a 37 ºC. Em seguida, foram lavadas três vezes em 2xSSC durante 5 minutos cada e lavadas em PBS 1x durante 5 minutos. Após isso, as lâminas foram fixadas em formaldeído 1% em PBS 1x/50 mM MgCl durante 10 minutos à temperatura ambiente e lavadas em PBS 1x por 5 minutos. ​2 Posteriormente, foram desidratadas em série alcoólica gelada (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos cada e então desnaturadas em formamida 70% em 2xSSC a 70 ºC por 5 minutos e novamente desidratadas em uma série de etanol gelado (70%, 85% e 100%) por 5 minutos cada. Para solução de hibridização, em um tubo de 1,5 μL, foram adicionados 4 μL de sonda, 20 μL de formamida, 8 μL de sulfato de dextrano 50% e 4 μL de 20xSSC. A sonda foi desnaturada a 99 °C por 10 minutos e passada imediatamente ao gelo. Durante a hibridização foram colocados 40 μL de solução de hibridização sobre uma lamínula e a lâmina foi invertida sobre a lamínula. As lâminas foram mantidas com o material voltado para baixo em câmara úmida (H20 destilada) a 37 °C por cerca de 14 horas. ​ ​ Posteriormente, as lamínulas foram removidas das lâminas e então foram lavadas duas vezes em formamida 15% a 42 °C durante 10 minutos cada. Em seguida, foi lavada novamente em solução Tween 0,5% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Para detecção, as lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos. Após isso foram lavadas duas vezes com solução Tween 5% por 5 minutos à temperatura ambiente. Foram então colocadas sobre cada lâmina 50 μL de anti

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digoxigenina-rodamina ou 30 μL de avidina-FITC 0,07% em tampão C (0,1 M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15 M de NaCl). Em seguida foram cobertas com lamínula e deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água destilada. Posteriormente as lamínulas foram removidas e as lâminas foram lavadas três vezes em solução Tween 5% por 2 minutos à temperatura ambiente cada. As lâminas foram desidratadas em série alcoólica 70, 85 e 100% durante 5 min cada. Ao final, após cada lâmina secar, foi adicionada em cada solução de DAPI diluído em antifade VectaShield Vector (20 μL de antifade e 1 μL de DAPI).

Análises cromossômicas

Pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo foram analisadas para confirmar o número cromossômico, a estrutura do cariótipo e os padrões de distribuição de sequências de DNAs repetitivos nos cromossomos. As imagens foram obtidas utilizando um microscópio Olympus BX51 (Olympus Corporation, Ishikawa, Japão) equipado com CoolSNAP. As melhores metáfases foram fotografadas e montado o cariótipo no programa Adobe ImageReady CS. Os cromossomos metafásicos foram recortados, emparelhados, medidos e colocados em ordem decrescente de tamanho. A relação de braços dos cromossomos para classificação foi determinada de acordo com Levan et al. ​ ​ (1964). O número fundamental (NF) foi determinado considerando cromossomos metacêntricos (m), submetacêntricos (sm) e subtelocêntricos (st) como portadores de dois braços e os acrocêntricos (a) como portadores de apenas um braço.

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RESULTADO E DISCUSSÃO Os resultados e discussão obtidos neste estudo são apresentados em 3 capítulos, na forma de artigos científicos: ● Capítulo 1. Primeira descrição de cromossomos sexuais em uma espécie da família Cynodontidae: Cynodon gibbus (Spix & Agassiz 1829) ● Capítulo 2: Insights sobre a evolução cariotípica de Cynodontidae ​ ​ ​ (Ostariophysy: Characiformes) ● Capítulo 3: Diversidade oculta da porção terminal dos cromossomos de ​ espécies de Cynodontidae (Ostariophysi: Characiformes)

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Chamarelli

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Resumo

A família de peixes Cynodontidae pertence à superfamília Curimatoidea, juntamente com Hemiodontidae, Serrasalmidae, Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidae, Curimatidae e Anostomidae. A maioria das espécies desta superfamília que foram analisadas até o momento têm um número diploide igual a 54 cromossomos. Dentre estas famílias, apenas Prochilodontidae, Parodontidae e Anostomidae possuem cromossomos sexuais diferenciados (heteromorfismo na fêmea) com diferentes níveis de degeneração. Aqui apresentamos o primeiro relato de cromossomos sexuais diferenciados em Cynodontidae, em Cynodon gibbus, que também apresentou ​ ​ cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW, e mostramos que DNAs repetitivos desempenharam um papel fundamental na diferenciação desses cromossomos sexuais.

Palavras-chave: Amazônia, Curimatoidea, Microssatélites, Rex. ​ ​

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Introdução

Cynodon gibbus (Agassiz 1829) é um Characiformes encontrado nas bacias Amazônica e do rio Orinoco, e no Rio Rupununi, nas Guianas (Toledo-Piza 2000; Buckup 2007). O gênero Cynodon é um táxon basal de Cynodontidae, que inclui dois ​ outros gêneros: Hydrolycus e Raphiodon (Oliveira et al. 2011; Silva 2011). Os ​ ​ ​ ​ cinodontídeos são peixes grandes (comprimento total acima de 70 cm), com boca oblíqua, dentes caninos bem desenvolvidos e nadadeiras peitorais relativamente grandes (Toledo-Piza 2000; Nelson et al. 2016). Cynodontidae é um grupo basal da superfamília ​ Curimatoidea, sendo grupo irmão do clado formado pelas demais famílias, ou seja, Hemiodontidae, Serrasalmidae, Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidae, Curimatidae e Anostomidae. Dentro desse clado, Hemiodontidae e Serrasalmidae constituem o grupo irmão do clado formado por Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidae, Curimatidae e Anostomidae (Betancur-R et al. 2018). ​ ​ Embora Cynodontidae contenha oito espécies válidas (Fricke et al. 2020), a ​ única espécie para a qual dados citogenéticos estão disponíveis é Raphiodon vulpinus, ​ ​ sendo esta da bacia Paraná-Paraguai. Esta espécie possui 2n = 54, com dois cariótipos descritos até agora. Um composto por 32 metacêntricos (m), 12 submetacêntricos (sm), 8 subtelocêntricos (st) e 2 acrocêntricos (a) (Martinez et al. 2004) e o outro com 34 ​ ​ meta-submetacêntricos e 20 subtelo- acrocêntricos (Pastori et al. 2009). Os cariótipos ​ desta espécie têm um único par de regiões organizadoras de nucléolos (RONs) e suas regiões heterocromáticas geralmente estão localizadas nas regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos, embora alguns braços cromossômicos tenham pequenas regiões heterocromáticas terminais (Martinez et al. 2004; Pastori et al. 2009). ​ ​ ​ ​ Número diploide igual a 54 cromossomos é comum dentro de Curimatoidea, sendo registrado em quase todas as espécies cariotipadas até agora, com algumas exceções em Serrasalmidae e Curimatidae (Muramoto et al. 1968; Porto et al. 1993; ​ ​ ​ Moreira Peres et al. 2006; Nakayama et al. 2012; Terencio et al. 2012a; Ribeiro et al. ​ ​ ​ ​ ​ 2014; Traldi et al. 2016; Favarato et al. 2019). Em Serrasalmidae, o número diploide ​ ​ varia de 54 no clado basal, os pacus, a 62 no clado derivado, o das piranhas (Muramoto et al. 1968; Moreira Peres et al. 2006; Nakayama et al. 2012; Ribeiro et al. 2014; ​ ​ ​ Favarato et al. 2019). Em Curimatidae, o número diploide varia de 48 a 102, embora 2n ​ = 54 seja prevalente e considerado ancestral (Feldberg et al. 1992, 1993; Venere et al. ​ ​ 2008).

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Grupos com número diploide e/ou macroestrutura cromossômica conservados, como encontrado em Cynodontidae, oferecem uma excelente oportunidade para estudar os padrões de evolução cromossômica por meio da análise da variação na microestrutura cromossômica, mapeando frações repetitivas do genoma (Silva 2011; Terencio et al. 2012a; Traldi et al. 2016, 2019). DNAs repetitivos provaram ser ​ ​ ​ extremamente úteis na investigação de processos de evolução do cariótipo de peixes, incluindo a origem e diferenciação dos cromossomos sexuais (Yano et al. 2014, 2017; ​ Sember et al. 2015; Soto et al. 2018). ​ ​ ​ ​ Os peixes são os vertebrados com a maior diversidade conhecida de sistemas de cromossomos sexuais. Nove sistemas foram descritos até agora - XX/XY, XX/X0,

ZZ/ZW, ZZ/Z0, X1X1X2X2/X1X2Y, XX/XY1Y2, Z1Z1Z2Z2/Z1Z2W1W2, ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​

X1X1X2X2/X1Y1X2Y2 e ZZ/ZW1W2 (Ueno et al. 2001; de Oliveira et al. 2008; Arai ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ 2011; Valentim et al. 2013; Soares et al. 2014; Ferreira et al. 2016; Yano et al. 2016; ​ ​ ​ ​ Araya-Jaime et al. 2017; Freitas et al. 2017; de Oliveira et al. 2018). Apesar dessa ​ ​ ​ ​ enorme diversidade, apenas 5% das espécies de peixes para as quais existem dados citogenéticos disponíveis, são conhecidos por terem cromossomos sexuais diferenciados, e metade dessas espécies são encontradas na região Neotropical (Arai 2011; Cioffi et al. 2012). ​ ​ Um pequeno número de espécies de Curimatoidea têm cromossomos sexuais heteromórficos, incluindo sistemas simples e múltiplos, embora a última categoria tenha sido encontrada em apenas duas espécies, Apareiodon affinis (Parodontidae), que possui ​ ​ um sistema ZZ/ZW1W2 (Moreira-Filho et al. 1980) e Megaleporinus elongatus ​ ​ ​ ​ ​

(Anostomidae), com uma Sistema Z1Z1Z2Z2/Z1W1Z2W2 (Parise-Maltempi et al. 2013; ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ Ramirez et al. 2016). Um padrão heterogamético feminino (ZZ/ZW) é encontrado em ​ 16 espécies de Curimatoidea. Dentre estas espécies incluem seis Parodontidae (Apareiodon sp., A. hasemani, A. ibitiensis, A. wladii, Parodon moreirai e P. hilari) ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ (Moreira-Filho et al. 1993; Centofante et al. 2002; de Rosa et al. 2006; Vicari et al. ​ ​ ​ ​ 2006; Bellafronte et al. 2011; 2012; Schemberger et al. 2014) e oito Anostomidae ​ ​ (Megaleporinus elongatus com ZW e seus múltiplos, M. obtusidens, M. reinhardti, M. ​ ​ ​ ​ ​ ​ macrocephalus, M. trifasciatus, M. conirostris, M. multimaculatus e M. striatus) ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ (Galetti et al. 1981; 1984; 1995; Galetti e Foresti 1987; Venere et al. 2004; ​ ​ Parise-Maltempi et al. 2013; Ramirez et al. 2016; Barros et al. 2018). Cromossomos ​ ​ ​ ​ sexuais ZZ/ZW também foram encontrados em Semaprochilodus taeniurus ​ (Prochilodontidae) (Feldberg et al. 1987). ​ ​ 25

O presente estudo fornece a primeira descrição de cromossomos sexuais heteromórficos (ZZ/ZW) em uma espécie de Cynodontidae, Cynodon gibbus, e mostra ​ ​ que DNAs repetitivos desempenharam um papel fundamental na diferenciação desses cromossomos.

Material e Métodos

Preparações cromossômicas e bandamento C

Foram analisados 4 machos e 9 fêmeas de C. gibbus. As preparações ​ ​ cromossômicas foram obtidas de acordo com Bertollo et al. (2015) e a heterocromatina ​ constitutiva detectada a partir do protocolo de Sumner (1972).

Preparação das sondas de hibridação derivadas de sequências repetitivas

As sondas dos retrotransposons Rex 1, Rex 3 e Rex 6 e as sondas teloméricas ​ ​ ​ ​ (TTAGGG) foram isoladas e amplificadas seguindo os protocolos de Volff et al. ​n ​ ​ (2000), Volff et al. (1999), Shimoda et al. (1999) e Ijdo et al. (1991), respectivamente. ​ ​ ​ ​ Essas sondas foram marcadas com digoxigenina-11-dUTP usando Mix de Hibridização Dig-Nick (Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com as recomendações do fabricante. Os motivos microssatélite (GA)15, (CA)15, (CAC)10, (CAT)10, (GACA)8 e ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ (GATA) foram marcados diretamente com Cy3 durante a síntese (Kubat et al. 2008), ​8 ​ para verificar a composição dos cromossomos Z e W e identificar quais componentes podem estar envolvidos na diferenciação desses cromossomos.

Análise FISH

A hibridização fluorescente in situ (FISH) foi baseada no protocolo de Pinkel ​ et al. (1986). As lâminas foram desnaturadas em formamida a 70%/2xSSC a 70 °C, pH ​ 7, e desidratadas em uma série crescente de etanol (70, 85 e 100%) por 5 min em cada concentração. Subsequentemente, 20 μL da solução de hibridação (100 ng de cada sonda, 50% formamida, 2xSSC e 10% de sulfato de dextrano) foi colocada em cada lâmina, a qual foi levada para uma câmara úmida contendo água destilada a 37 °C por 24 h para hibridização. Os cromossomos foram contracorados com DAPI (1,2 μg/mL) e a lâmina montada com antifade (Vector, Burlingame, CA, EUA). Após a FISH, as lâminas foram submetidas à técnica de Banda C (Sumner 1972) para identificar os cromossomos W nas metáfases.

Análise microscópica

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Pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo foram analisadas para confirmar o número cromossômico, a estrutura do cariótipo e os padrões FISH de C. gibbus. As ​ ​ imagens foram obtidas, utilizando um microscópio Olympus BX51 (Olympus Corporation, Ishikawa, Japão) equipado com CoolSNAP. Os cromossomos foram classificados como metacêntrico (m), submetacêntrico (sm), subtelocêntrico (st) ou acrocêntrico (a), seguindo Levan et al. (1964). ​ ​ Resultados

Características do cariótipo e distribuição de heterocromatina constitutiva

Todos os indivíduos de C. gibbus analisados apresentaram 2n=54 e um número ​ fundamental NF = 108. O cariótipo apresenta 33m + 17sm + 4st nas fêmeas e 34m + 16sm + 4st nos machos (Figura 1a). Nas fêmeas, o par cromossômico 17 é heteromórfico e um dos homólogos é o menor cromossomo metacêntrico do complemento, facilitando sua identificação. O outro elemento desse par é um cromossomo submetacêntrico grande. Além disso, o cromossomo metacêntrico não contém heterocromatina e o homólogo submetacêntrico apresenta um grande bloco heterocromático na região pericentromérica. Por outro lado, no sexo masculino, o par 17 é homomórfico, sendo ambos homólogos metacêntricos e completamente sem blocos de heterocromatina. Estes resultados indicam um sistema de cromossomos sexuais ZZ/ZW em C. gibbus. Nos autossomos, blocos de heterocromatina constitutiva foram ​ ​ encontrados nas regiões centroméricas de 5 pares metacêntricos e nas porções terminais de 7 pares de cromossomos metacêntricos. Blocos de heterocromatina constitutiva também estão presentes nas regiões proximais dos braços longos (q) de todos os ​ ​ cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos (Figura 1b).

Mapeamento dos elementos Rex e microssatélites

Os retroelementos Rex 1, 3 e 6 encontram-se dispersos ao longo dos ​ ​ cromossomos de machos e fêmeas de C. gibbus (Figura 2a-c). Adicionalmente, os Rex 3 ​ ​ e 6 foram evidenciados em maior concentração na porção terminal dos cromossomos. ​ Com relação aos cromossomos sexuais, Rex 3 não está presente, enquanto sítios de Rex ​ ​ ​ 1 são evidenciados na porção terminal do braço longo do Z e ausente no W, o Rex 6 está ​ ​ na porção terminal do braço longo do Z, enquanto no W está na região pericentromérica, sintênico com a região de heterocromatina constitutiva.

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Dentre os microssatélites analisados, (GA) e (CA) são os com maior ​15 ​15 distribuição ao longo dos cromossomos de C. gibbus, com maior concentração nas ​ ​ porções terminais de todos os cromossomos do complemento. A repetição (GA) ​15 também foi localizada nas porções terminais dos cromossomos Z e W, com pequenos sinais também na região pericentromérica do cromossomo W. O microssatélite (CA) ​15 está disperso por todo o cromossomo Z, mas particularmente nas regiões terminais, enquanto no cromossomo W foram detectados sinais nas porções terminais e, mais uma vez, na porção pericentromérica do cromossomo, correspondendo a blocos de heterocromatina constitutiva (Figura 2 d, e). As repetições (CAC) e (CAT) estão ​10 ​10 presentes em menor intensidade, em regiões terminais de alguns cromossomos. A repetição (CAC) está ausente no Z, mas no W foi encontrada na porção terminal do ​10 braço curto e na região pericentromérica, colocalizada com a heterocromatina constitutiva. A repetição (CAT) está na porção terminal do braço curto do Z e na ​10 porção terminal do braço longo do W (Figura 2 f, g). O microssatélite (GACA) foi ​8 detectado na porção terminal de quase todos os cromossomos, incluindo W e Z e na região centromérica do par 18 (Figura 2 h), que também contém (GATA) na porção ​8 proximal do braço longo, em machos e fêmeas, sobrepondo-se à porção heterocromática do cromossomo (Figura 2i). Sequências teloméricas estão restritas às regiões terminais de todos os cromossomos (Figura 2j).

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Figura 1. Cariótipos de macho de Cynodon gibbus: a coloração por Giemsa. b ​ ​ ​ ​ Bandeamento C. Cromossomos sexuais de fêmeas são mostrados nas caixas. Barra de escala: 10 µm.

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Figura. 2. Mapeamento cromossômico de DNAs repetitivos em Cynodon gibbus: a – c ​ ​ ​ ​ Elementos transponíveis. d – i Sequências microssatélites. j Sequência telomérica. Nas ​ ​

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caixas: Cromossomos sexuais femininos (a – h, j) e o par 18 (i) com (GATA)8. Barra de ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ escala: 10 µm.

Discussão

A presença de cromossomos sexuais, onde a fêmea possui heteromorfismo como encontrado em Cynodon gibbus, é comum dentro de Curimatoidea, uma vez que ​ ​ espécies de Prochilodontidae, Parodontidae e Anostomidae apresentam sistemas de cromossomos sexuais ZW simples e múltiplos, embora nas demais famílias, pertencentes a esta superfamília, ainda não tenha sido detectada nenhuma espécie com cromossomos sexuais diferenciados (Porto et al. 1993; Martins et al. 2000; Pinheiro et ​ ​ ​ ​ al. 2016). Nas espécies de Curimatoidea que possuem um sistema cromossômico sexual diferenciado, o cromossomo W é geralmente o maior metacêntrico ou submetacêntrico no cariótipo, como em Semaprochilodus taeniurus, Apareiodon hasemani e ​ ​ ​ ​ Megaleporinus trifaciatus (Terencio et al. 2012b; Schemberger et al. 2014; Barros et al. ​ ​ ​ ​ ​ 2018). Nestas espécies, a diferenciação do cromossomo W está associada ao acúmulo de grandes quantidades de heterocromatina constitutiva, contendo diferentes classes de DNAs repetitivos (Galetti e Foresti, 1986; Terencio et al. 2012b; Schemberger et al. ​ ​ ​ 2014; Barros et al. 2018). Em S. taeniurus e M. trifaciatus, o cromossomo W possui o ​ ​ ​ ​ braço longo heterocromático (Terencio et al. 2012b; Barros et al. 2018), enquanto em A. ​ ​ ​ ​ hasemani o braço curto é heterocromático (Schemberger et al. 2014). O acúmulo de ​ ​ uma grande quantidade de heterocromatina e DNAs repetitivos no cromossomo W é evidência de um processo relativamente antigo de diferenciação do cromossomo sexual nessas espécies (Galetti e Foresti 1986; Terencio et al. 2012b; Schemberger et al. 2014; ​ ​ ​ Barros et al. 2018). Como em C. gibbus apenas um segmento pericentromérico do ​ ​ ​ cromossomo W é heterocromático, provavelmente o processo de diferenciação nesta espécie é recente e, por tanto, pode ter origem relacionada a mutações de novo. ​ ​ A heterocromatinização do W e o acúmulo de DNAs repetitivos, em particular do tipo Rex, parece ser uma característica comum na diferenciação de cromossomo ​ ​ sexual em Curimatoidea, uma vez que já foi observado em Prochilodontidae, Anostomidae e Parodontidae (Valente et al. 2011; Terencio et al. 2012b; Schemberger ​ ​ ​ ​ et al. 2014, 2019; Barros et al. 2018; Dechaud et al. 2019; Utsunomia et al. 2019). ​ ​ ​ ​ ​ ​ Contudo, os elementos Rex 1 e Rex 3 não parecem estar envolvidos na diferenciação dos ​ ​ cromossomos sexuais de C. gibbus, porque nesta espécie apenas o elemento Rex 6 e os ​ ​ ​ motivos microssatélites (CA) e (CAC) estão acumulados na pequena porção ​15 ​10

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heterocromática do W. É importante salientar que o acúmulo de sequências repetitivas de DNA podem não necessariamente fornecer informações específicas sobre a idade dos cromossomos sexuais, dado que este processo pode ocorrer durante os estágios iniciais ou posteriores de sua diferenciação (Mariotti et al. 2009; Cioffi et al. 2012; Bachtrog ​ ​ ​ 2013; Palacios-Gimenez et al. 2017). ​ ​ Em C. gibbus, a localização dos elementos transponíveis Rex e dos ​ ​ ​ microssatélites, com maior acúmulo nas regiões terminais dos cromossomos, pode indicar uma possível associação por microsatellite seeding. Durante esse processo, os ​ ​ microssatélites atuam como flanqueadores nas sequências de elementos transponíveis, facilitando a proliferação dos microssatélites quando estes estão ativos (Arcot et al. ​ 1995; Castoe et al. 2011). Além disso, a variação no tamanho das sequências ​ ​ encontradas nas porções terminais pode ser explicada por recombinação ectópica que, embora leve à variabilidade de microssatélites, culminam em sua expansão ou contração (Schug et al. 1998; Payseur e Nachman 2000; Adams et al. 2016). ​ ​ ​ ​ Os retroelementos Rex foram encontrados em regiões cromossômicas com ​ baixas taxas de recombinação, como em cromossomos sexuais, em diferentes espécies de peixes (Valente et al. 2011; Terencio et al. 2012b; Barros et al. 2018). Tais regiões ​ ​ ​ ​ ​ podem ficar sujeitas a quebras cromossômicas, gerando possivelmente rearranjos cromossômicos, os quais podem ser identificados a partir do mapeamento de sequências teloméricas, que são repetições de (TTAGGG) nos vertebrados, comumente ​n encontradas nas extremidades dos cromossomos, com função de proteção contra danos (Ye et al. 2014). Todavia, também podem ser encontradas em porções intersticiais (ITs) ​ ​ indicando muitas vezes rearranjos cromossômicos, que podem estar envolvidos na formação de cromossomos sexuais, como já encontrado em Harttia punctata (Blanco et ​ ​ al. 2014). ​ Cromossomos sexuais originários de rearranjos cromossômicos foram detectados em espécies de Parodontidae. Esses rearranjos incluem inversões cromossômicas, que transferem DNAs repetitivos terminais para a região proximal do cromossomo protossexual. Esses sítios foram amplificados no braço curto de um cromossomo, levando à diferenciação do W (Schemberger et al. 2014). No entanto, ​ ​ nenhuma ITS foi identificada em C. gibbus, assim como em S. taeniurus e M. ​ ​ ​ ​ elongatus, o que pode refletir rearranjos cromossômicos não-robertsonianos durante a ​ formação do W (Terencio et al. 2012b; Barros et al. 2018; presente estudo). É ​ ​ ​ ​ importante notar que os rearranjos ocorrem de diferentes maneiras, inclusive pode levar

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à perda imediata de sequências teloméricas e, nestes casos, não haverá formação de nenhuma ITS. Como sequências teloméricas intersticiais são redundantes, elas podem estar sujeitas à pressão seletiva mais relaxada. Portanto, quaisquer vestígios de ITS, mesmo que retidas durante estágios iniciais do processo, podem desaparecer gradualmente ao longo do tempo evolutivo (Slijepcevic 1998; Ocalewicz 2013). No caso específico de C. gibbus, a ocorrência de uma inversão cromossômica não pode ser ​ ​ descartada completamente. Os cromossomos sexuais possuem diferentes padrões de herança e diferenciação, quando comparados aos autossômicos, sendo esperado que DNAs repetitivos, como os microssatélites (SSRs), estejam diferencialmente envolvidos na evolução desses cromossomos (Cioffi et al. 2017). Dentre os SSR, os dinucleotídeos são ​ ​ frequentemente encontrados no genoma, estando (CA) em maior abundância e ​10 frequência, na maioria dos vertebrados, sendo a taxa de evolução de dinucleotídeos maior em peixes de nadadeira raiada (Adams et al. 2016), embora tri- e ​ ​ tetranucleotídeos, como (GATA)n, já tenham sido encontrados e relacionados com a ​ ​ diferenciação e evolução de cromossomos sexuais (Lui et al. 2015; Ziemniczak et al. ​ ​ ​ 2015; Rovatsos et al. 2016; Cioffi et al. 2017). ​ ​ ​ ​ Embora a repetição (GATA) possa estar intimamente ligada com a ​n diferenciação molecular dos cromossomos sexuais, como observado em Characidium ​ (Pucci et al. 2016; 2018), este microssatélite não parece ter sido envolvido neste ​ ​ processo em C. gibbus, uma vez que foi detectado apenas no par 18, enquanto os ​ ​ cromossomos sexuais aparentemente originaram-se do par 17. A restrição dessas sequências em um único par de cromossomos, como observado em C. gibbus, é um ​ ​ padrão anteriormente encontrado apenas em Halobatrachus didactylus, um peixe da ​ ​ família Batrachoididae (Merlo et al. 2007). Em cobras Caenophidians, a sequência ​ ​ (GATA) está intimamente relacionada à sequência (GACA) no W (Augstenová et al. ​n ​n ​ 2017), indicando que essas sequências podem desempenhar um papel crucial na formação de heterocromatina neste cromossomo (Singh 2011). Porém, em C. gibbus, ​ ​ essas sequências encontradas no par 18 (e não no par 17, que originou os cromossomos sexuais) sugerem que estejam desempenhando um papel estrutural nesse par cromossômico.

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Deviantart

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Resumo

Cynodontidae é uma pequena família de peixes carnívoros da ordem Characiformes, formada por apenas oito espécies, agrupadas nos gêneros: Cynodon, Hydrolycus e ​ ​ ​ Raphiodon. Além disso, é o clado basal da superfamília Curimatoidea. Embora o ​ conhecimento científico sobre a posição filogenética desta família tenha avançado, pouco ainda se sabe a respeito da evolução cromossômica de suas espécies. Assim, este estudo traz evidências da evolução cariotípica de Cynodontidae a partir de análises citogenéticas convencionais e do mapeamento de DNAs repetitivos (DNAr e sequência telomérica) nas espécies R. vulpinus e H. armatus coletadas na Amazônia brasileira e de ​ ​ dados disponíveis na literatura. 2n = 54 é um caracter conservado dentro Curimatoidea, inclusive em espécies de Cynodontidae. Embora todas as espécies apresentem número diploide conservado a macroestrutura cariotípica é variável, indicando a ocorrência de rearranjos que não envolvem o centrômero na diferenciação das espécies desta família e superfamília. A existência de rearranjos não-robertsonianos, envolvidos na diferenciação do grupo, pode ainda ser evidenciada pelo mapeamento de DNAs repetitivos.

Palavras-chave: DNAr, FISH, Characiformes, Curimatoidea. ​

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Introdução

Cynodontidae é uma família de peixes da ordem Characiformes, encontrada na América do Sul e com maior distribuição na Amazônia (Arendt 1997; Toledo-Piza 2000, Van der Sleen e Albert 2018). Desde sua descoberta, as espécies de Cynodontidae passaram por diversas reclassificações (e.g. Howes 1976; Lucena e Menezes 1998; ​ ​ Toledo-Piza 2000; Calcagnoto et al. 2005; Mirande 2010; Oliveira et al. 2011; Silva ​ ​ ​ ​ 2011; Mattox e Toledo-Piza 2012). Até recentemente, Cynodontidae era composta por duas subfamílias não-monofiléticas: Cynodontinae com os gêneros Cynodon, ​ ​ Rhaphiodon e Hydrolycus e a subfamília Roestinae composta por Roestes e ​ ​ ​ Giubertollus (e.g. Howes 1976; Lucena e Menezes 1998; Toledo-Piza 2000). ​ Entretanto, Oliveira et al. (2011), não recuperaram Roestes e Gilbertolus como ​ ​ ​ proximamente relacionado à Cynodontinae, alocarando esses dois gêneros em Acestrorhynchidae; e elevaram Cynodontidae em nível de família. Dessa forma, Cynodontidae ficou composta por Cynodon com as espécies Cynodon gibbus, C. ​ ​ ​ ​ meionactus e C. septenarius, possuindo como grupo-irmão o clado formado por ​ ​ Rhaphiodon vulpinus (gênero monotípico) e Hydrolycus, composto pelas espécies ​ ​ Hydrolycus armatus, H. scomberoides, H. wallacei e H. tatauaia (Oliveira et al. 2011; ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ Toledo-Piza 2018).

De acordo com a filogenia molecular de Characiformes mais recente (Betancur-R et al. 2018), Cynodontidae é o clado basal de Curimatoidea, uma ​ ​ superfamília composta por Hemiodontidae, Serrasalmidae, Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidae, Curimatidae e Anostomidae, que têm 2n = 54 como número diploide basal (Muramoto et al. 1968; Porto et al. 1993; Moreira Peres et al. ​ ​ ​ ​ ​ 2006; Venere et al. 2008; Terencio et al. 2012b; Traldi et al. 2016). Entretanto, em ​ ​ ​ ​ ​ ​ Serrasalmidae o 2n varia de 54 a 62 (Nakayama et al. 2012; Ribeiro et al. 2014; ​ ​ ​ ​ Favarato et al. 2019) e em Curimatidae varia de 48 a 102 (Feldberg et al. 1992, 1993). ​ ​ ​ ​ Em Curimatoidea a diversificação cromossômica parece vir de pequenas alterações na microestrutura do cariótipo, envolvendo a região organizadora de nucléolo (RON), o padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva (Porto et al. 1993; ​ Galetti Jr et al. 1994; Galetti Jr. 1998, Sampaio et al. 2016) e sua composição (Terencio ​ ​ ​ ​ et al. 2013; 2015; Barros et al. 2016; Pinheiro et al. 2016; Traldi et al. 2016; 2019), o ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ que torna estes marcadores citogenéticos relevantes para o grupo, permitindo inferências sobre o caminho evolutivo de suas espécies. Nas famílias Serrasalmidae e

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Curimatidae, as mais variáveis cromossomicamente, é possível encontrar ainda a presença de cromossomos supranumerários, além da variação de sítios de DNAr 18S (Sampaio et al. 2011; Favarato et al. 2019) ​ ​ ​ ​ Com relação à Cynodontidae, todas as espécies até agora analisadas apresentam 2n = 54 cromossomos (Martinez et al. 2004; Pastori et al. 2009; Pinheiro-Figliuolo et ​ ​ ​ ​ ​ al. 2020). Cynodon gibbus da Amazônia central apresenta um sistema de cromossomos ​ ​ sexuais do tipo ZZ/ZW (Pinheiro-Figliuolo et al. 2020), enquanto Rhaphyodon vulpinus ​ ​ ​ apresenta duas fórmulas cariotípicas (FC) em populações do da bacia dos rios Paraná-Paraguai (Martinez et al. 2004, Pastori et al. 2009). A região organizadora de ​ ​ ​ nucléolo (RON) é do tipo simples e o padrão de heterocromatina, no caso de R. vulpinus ​ é composto por marcações pálidas nas porções centroméricas, terminais em poucos pares, e em porções intersticiais nos braços curtos de três pares cromossômicos (Martinez et al. 2004; Pastori et al. 2009). Já, C. gibbus apresenta heterocromatina na ​ ​ ​ ​ ​ ​ porção proximal do braço curto de alguns pares e marcações pálidas nas porções terminal e centromérica. Os cromossomos sexuais apresentam ausência de heterocromatina no Z e no W está presente apenas na porção pericentromérica. Ainda, C. gibbus não possui sequências teloméricas intersticiais (ITS) (Pinheiro-Figliuolo et al. ​ ​ 2020).

Considerando que as espécies de Cynodontidae até agora estudadas apresentam número diploide conservado, mas fórmulas cariotípicas variáveis, e diferentes padrões de distribuição de heterocromatina (Martinez et al. 2004; Pastori et al. 2009; ​ ​ ​ Pinheiro-Figliuolo et al. 2020), a qual normalmente abriga diferentes frações repetitivas ​ ​ de DNA entre espécies (Terencio et al. 2013; Barros et al. 2016; Traldi et al. 2016; ​ ​ ​ ​ ​ ​ 2019), os principais objetivos deste trabalho foram investigar a organização cromossômica de Raphiodon vulpinus e Hydrolycus armatus e efetuar inferências ​ ​ ​ evolutivas a partir das relações entre dados citogenéticos e filogenias moleculares anteriormente propostas (i.e. Oliveira et al. 2011; Silva 2011; Betancurt-R et al. 2018). ​ ​ ​ ​ Material e Métodos

Amostragem e citogenética convencional

Com a licença permanente de coleta concedida pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) (Número da licença 5659-1) foram realizadas coletas periódicas, onde coletamos as três espécies (Tabela 1). O estudo foi aprovado

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pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA (045/2017 e SEI 01280.000804/2018-29), Brasil.

Tabela 1. Espécies, número de indivíduos por sexo, pontos de coleta e número dos vouchers das espécies analisadas no presente trabalho. ♂ = macho; ♀ = fêmea. *Indivíduos ​ analisados por Figliuolo et al. 2020. ​ ​ ​ Espécie Nº indivíduos/ Local – GPS Vouchers Sexo Cynodon gibbus* 2 ♂; 5 ♀ Lago Catalão (2°33’28,4”S, INPA-ICT ​ ​ ​ 60°46’29.7”W) 59499

Arquipélago de 2 ♂; 4 ♀ ​ ​ ​ Anavilhanas (2°37’28,5”S, 60°58’16,8”W) Raphiodon vulpinus 10♂; 8 ♀ Lago Catalão (2°33’28,4”S, INPA-ICT ​ ​ ​ 60°46’29,7”W) 59500 Hydrolycus armatus 6 ♂; 4 ♀ Rio Araguaia (5°22′34″S, INPA-ICT ​ ​ ​ 48°43′08″W) 59501

As preparações cromossômicas foram obtidas de acordo com o protocolo de Bertollo et al. (2015). A heterocromatina constitutiva foi detectada utilizando o ​ protocolo de Sumner (1972) e para detecção das regiões organizadoras do nucléolo Ag-RON foi utilizado o protocolo de Howel e Black (1980).

Preparação das sondas de hibridização derivadas de sequências repetitivas

As sondas de DNAr 5S e 18S das três espécies foram isoladas e amplificadas segundo Gross et al. (2010) e Martins e Galetti Jr. (1999), respectivamente. A sonda ​ ​ padrão de motivo telomérico de vertebrado (TTAGGG) para R. vulpinus e H. armatus ​n ​ ​ foram isoladas e amplificadas, seguindo os protocolos de Ijdo et al. (1991). ​ ​ Hibridização fluorescente in situ ​ A hibridização fluorescente in situ (FISH) foi baseada no protocolo de Pinkel ​ et al. (1986). As sondas foram marcadas via nick translation, utilizando biotina ​ ​ 14-dATP (Bionick labeling system - Invitrogen) no caso do DNAr 18S ou digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix - Roche) para as outras sondas, seguindo as recomendações do fabricante. Posteriormente, as lâminas foram desnaturadas em formamida a 70% / 2x SSC a 70 °C, pH 7. Foi colocado 20 µL de uma solução de hibridação (100 ng de cada sonda, formamida deionizada a 50%, tampão

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SSC 20x e sulfato de dextrano a 10%) em cada lâmina e a mistura foi hibridizada a 37 °C por 24h em uma câmara úmida, contendo água destilada. Para detecção do sinal as lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos. Em seguida, foi colocado sobre cada lâmina 50μL de anti digoxigenina-rodamina ou 30 μL de avidina-FITC 0,07% em tampão C (0,1 M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15 M de NaCl) e as lâminas foram cobertas com lamínulas e deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água destilada. Os cromossomos foram contracorados com DAPI (1,2 µg / mL) e montados em solução antifade (Vector, Burlingame, CA, EUA).

Análises microscópicas

As imagens foram obtidas, utilizando um microscópio Olympus BX51 (Olympus Corporation, Ishikawa, Japão) equipado com CoolSNAP. Os cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) ou acrocêntricos (a), seguindo Levan et al. (1964). O número fundamental (NF) foi ​ determinado de acordo com o número de braços cromossômicos, considerando m, sm, st como tendo dois braços e a como tendo um braço.

Obtenção de dados para Inferências evolutivas

As inferências evolutivas foram realizadas a partir da comparação entre a compilação dos dados citogenéticos aqui obtidos, associados a todos os dados citogenéticos disponíveis na literatura sobre as espécies de Cynodontidae (Martinez et ​ al. 2004; Pastori et al. 2009; Pinheiro-Figliuolo et al. 2020) e a compilação das ​ ​ ​ ​ ​ filogenias moleculares, envolvendo o grupo (Oliveira et al. 2011; Silva 2011; ​ ​ Betancur-R et al. 2018). ​ ​ Resultados

As espécies Raphiodon vulpinus e Hydrolycus armatus analisadas no presente ​ ​ trabalho apresentaram número diploide igual a 54 cromossomos, sem diferenças intraespecíficas e interpopulacionais.

Raphiodon vulpinus

Rhaphiodon vulpinus apresentou uma fórmula cariotípica (FC) igual a 32m+12sm+8st+2a, número fundamental (NF) igual a 106 (Figura 1a). Heterocromatina constitutiva foi observada na porção terminal de todos os cromossomos, com grande acúmulo no braço curto (p) dos pares 12, 13, 19, 20, 21, 22, 24, 25 e 26; no braço longo ​ ​

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(q) e porção pericentromérica dos pares 9 e 18, bem como em uma grande porção do ​ ​ braço q do par 23 (Figura b). A RON está localizada na porção terminal do braço q do ​ ​ par 19, coincidente com heterocromatina, estando os sítios de DNAr 18S presentes ​ ​ apenas nesta região (Figura 3a, b). Sítios de DNAr 5S foram evidenciados na porção terminal do braço p do par 18, coincidente com heterocromatina (Figura 3c). Sequências ​ teloméricas foram encontradas nas porções terminais de todos os cromossomos e ITS na porção centromérica dos pares 8, 9 e 11 e na porção intersticial do braço q dos pares 18 ​ ​ e 24 (Figura 1c).

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Figura 1. Cariótipo de Rhaphiodon vulpinus: a em coloração convencional com ​ ​ ​ Giemsa; b Distribuição de heterocromatina constitutiva; c Sequências teloméricas. ​ ​ Barra indica 10µm.

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Hydrolycus armatus

Hydrolycus armatus apresentou FC igual a 26m+20sm+4st+4a, número ​ fundamental (NF) igual a 104, pouca heterocromatina constitutiva, com predominância na porção terminal (Figura 2a). Heterocromatina constitutiva foi evidenciada na porção centromérica de oito pares cromossômicos e ausência em oito pares (Figura b). A RON está presente na porção terminal do braço q do par 14 coincidente com heterocromatina ​ (Figura 3d), estando os sítios de DNAr 18S presentes apenas nesta região (Figura 3e). Os sítios de DNAr 5S foram evidenciados na porção proximal do braço q no par 17 ​ (Figura 3f). Sequências de DNA telomérico foram encontradas nas porções terminais de todos os cromossomos e ITS na porção centromérica do par 14 e porção proximal do braço q do par 19 (Figura 2c). ​ ​

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Figura 2. Cariótipo de Hydrolycus armatus: a em coloração convencional com Giemsa; ​ ​ ​ b distribuição de heterocromatina constitutiva; c Sequências teloméricas. Barra indica ​ 10µm.

Cynodon gibbus

Figlioulo et al. (2020) analisaram esta espécie com as técnicas convencionais e ​ ​ encontraram 2n=54 também. Aqui apresentamos os dados referentes à RON que está presente na porção proximal do braço q do par 20, coincidente com heterocromatina ​

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(Figura 3g), estando os sítios de DNAr 18S presentes apenas nesta região (Figura 3h). Os sítios de DNAr 5S estão presentes na porção intersticial do braço q no par 3 (Figura ​ 3i).

Figura 3. Nas caixas estão evidenciados os pares portadores de Região Organizadora de ​ Nucléolo (a, d, g); DNAr 18S (sinal em verde) (b, e, h); DNAr 5S (sinal em vermelho) ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ (c, f, i) para as espécies R. vulpinus, H. armatus e C. gibbus. ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​

Dados para inferências evolutivas

A compilação de dados citogenéticos disponíveis na literatura e os descritos no presente trabalho está apresentada na Tabela 2 e a plotagem destes nas árvores filogenéticas vigentes na Figura 4. Estes resultados revelam número diploide de 54 cromossomos como conservado dentro da família, bem como conservação de DNAr (18S e 5S) simples em espécies de todos os gêneros, presença de cromossomo sexual diferenciado no clado basal (Cynodon gibbus), presença de ITS apenas em espécies de ​ ​ clados derivados. Além disso, duas fórmulas cariotípicas são encontradas para R. ​ vulpinus (34m-sm+20st-a e 32m+12sm+8st+2a), variação no padrão de heterocromatina e de localização das regiões organizadoras de nucléolo.

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Tabela 2. Dados Citogenéticos de Cynodontidae. 2n= Número diploide; FC = Fórmula cariotípica; HC = Heterocromatina constitutiva; RON = Região Organizadora de Nucléolo; 5S = DNAr 5S; 18S = DNAr 18S; m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; st = subtelocêntrico; a = acrocêntrico; p= braço curto; q = braço longo; t = terminal; i = intersticial; c = ​ ​ ​ centromérica; - = dados inexistente. Referências: 1 = Martinez et al. 2004; 2 = Pastori et al. ​ ​ ​ 2009; 3 = Pinheiro-Figliuolo et al. 2020; 4 = Presente trabalho. ​ ​ Espécie Localidade 2n FC HC RON 5S R. vulpinus Rio Paraná (Paraná, Brasil) 54 32m+12sm+8st+2a - 23st tq - ​ R. vulpinus Rio Paraná (Missiones, 54 34m-sm+20st-a t, c, i simples - Argentina) pt ​ R. vulpinus Lago Catalão (Amazonas, Brasil) 54 32m+12sm+8st+2a t, c, p, q 19 tq 18 tp ​ ​ ​ ​ ​ C. gibbus Lago Catalão (Amazonas, Brasil) 54 33m + 17sm + 4st ♀ t, c, pq 20 pq 3 iq ​ ​ ​ Anavilhanas (Amazonas, Brasil) 34m + 16sm + 4st ♂ H. armatus Rio Araguaia (Pará, Brasil) 54 26m+20sm+4st+4a t, c 14 tq 17 pq ​ ​

Figura 4. Idiograma mostrando a compilação de dados citogenéticos disponíveis para as ​ espécies C. gibbus, H. armatus e R. vulpinus. * Pastori et al. 2009 ** Martinez et al. 2004 * ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​

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Dados de RON e Heterocromatina constitutiva informados sem precisão de localização cromossômica. Árvore filogenética adaptada de Oliveira et al. (2011), Silva (2011) e ​ ​ Betancur-R (2018).

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Discussão

Considerando a proposta filogenética de Betancur-R et al. (2018), onde ​ ​ Cynodontidae é o clado basal de Curimatoidea, verificamos que os dados citogenéticos corroboram sua relação com as demais famílias pertencentes a esta superfamília (Hemiodontidae, Serrasalmidae, Parodontidae, Prochilodontidae, Chilodontidae, Curimatidae e Anostomidae) e não com os e não com Acestrorhynchidae e Characidae como sugerido por Lucena e Menezes (1998) e Menezes (2003). Pois, considerando o número diploide, verificamos 2n=54 como basal e/ou modal para todas as famílias de Curimatoidea, incluindo Cynodontidae, sendo um caracter plesiomorfico (Muramoto et ​ al. 1968; Feldberg et al. 1992, 1993; Porto et al. 1993; Moreira Peres et al. 2006; ​ ​ ​ ​ ​ ​ Venere et al. 2008; Terencio et al. 2012b; Nakayama et al. 2012; Ribeiro et al. 2014; ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ Traldi et al. 2016; Favarato et al. 2019). Já em Acestrorhynchidae e Characidae o 2n é ​ ​ ​ menor e variável (2n=50 e 2n =50-52, respectivamente) (Martinez et al. 2004; Pastori et ​ ​ ​ al. 2009; Arrai 2011; Campos et al. 2020; Pinheiro-Figliuolo et al. 2020). Assim, ​ ​ ​ ​ ​ podemos sugerir 2n = 54 como um caráter ancestral em Curimatoidea sensu Betancur-R et al. (2018) e os 2n diferentes de 54 (2n = 48-102) caracteres derivados (Feldberg et al. ​ ​ 1992, 1993; Nakayama et al. 2012; Ribeiro et al. 2014; Favarato et al. 2019). ​ ​ ​ ​ ​ ​ Embora Cynodontidae apresente 2n = 54 como conservado dentro da família, ocorrem variações nas fórmulas cromossômicas, de forma que espécies derivadas (R. ​ vulpinus e H. armatus) possuem cromossomos acrocêntricos, que não são encontrados ​ ​ em C. gibbus, espécie basal (Cynodon) (Martinez et al. 2004; Pastori et al. 2009; ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ presente estudo). Todavia, a existência de cromossomos sexuais diferenciados apenas em C. gibbus parece ser recente, indicanto uma apomorfia no clado. Isso indica que ​ rearranjos não-robertsonianos estiveram envolvidos na diversificação do grupo, uma vez que o número diploide é conservado entre as espécies já estudadas.

A presença de rearranjos não-robertsonianos no curso evolutivo de Cynodontidae é verificada também pela variação interespecífica da localização dos sítios de DNAr 5S e 18S. No caso do DNAr 5S, este está localizado no par 3, distal do braço q para Cynodon gibbus, enquanto em clados derivados ele está em posições ​ ​ ​ diferentes: em H. armatus no par 17, intersticial do braço q e em R. vulpinus no par 18, ​ ​ ​ terminal do braço p, coincidindo com a heterocromatina constitutiva. O mesmo ocorre ​ ​ com o DNAr 18S, que em C. gibbus está no par 20, proximal, braço q, em R. vulpinus ​ ​ ​ ​ ​ ​ no par 19, terminal braço q e em H. armatus está no par 14, terminal braço q. Além ​ ​ ​ ​

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disso, a associação do DNAr 18S com heterocromatina constitutiva nas três espécies pode não ser aleatória, mas para a manutenção destas sequências, auxiliando na regulação da expressão gênica (Mazzucheli e Martins 2009).

O padrão de DNAr 5S simples e na porção intersticial de dado cromossomo parece ser ancestral e vantajoso para a organização genômica em peixes, de acordo com grande parte dos mapeamentos cromossômicos já realizados (revisado de Cioffi e Bertollo 2012). Assim é plausível que este padrão ancestral também esteja presente em Cynodontidae, haja vista que C. gibbus (clado basal) o possui, sendo este padrão ​ também encontrado no clado derivado, em H. armatus, mas não em R. vulpinus. Além ​ ​ ​ ​ disso, a associação dos DNAr 5S com eucromatina em C. gibbus e H. armatus reforça a ​ ​ hipótese do DNAr 5S simples e localizado na porção intersticial de um determinado cromossomo ser ancestral, haja vista a grande pressão seletiva atuante em regiões eucromáticas (Ridley 2006).

Uma característica marcante dos cariótipos de Cynodontidae é a pequena quantidade de heterocromatina constitutiva. Nota-se acúmulo de heterocromatina constitutiva em porções centroméricas e proximais em muitos cromossomos de C. ​ gibbus. Esta característica é similar ao encontrado em H. armatus, embora em uma ​ ​ ​ menor quantidade de cromossomos. Ainda, é possível observar um pequeno aumento de heterocromatina constitutiva em porções terminais dos cromossomos de H. armatus, ​ ​ quando comparado à espécie basal. Um padrão completamente distinto é encontrado na espécie R. vulpinus, mas ainda com pouca heterocromatina constitutiva inclusive na ​ ​ porção terminal dos cromossomos. A pouca heterocromatina constitutiva na região terminal dos cromossomos das espécies de Cynodontidae pode estar relacionada à existência de sequências homólogas subteloméricas nos cromossomos dessas espécies, uma vez que estas sequências podem impedir a disseminação da heterocromatina para regiões vizinhas, que sejam ricas em genes, impedindo a supressão dos genes dentro destas regiões (Tashiro et al. 2017). ​ ​ Eventualmente, sequências teloméricas são encontradas em outras porções cromossômicas que não a terminal, indicando possíveis rearranjos cromossômicos, que podem ser evidenciados com o mapeamento por FISH destas sequências (Pinheiro et al. ​ ​ 2016). Para Cynodontidae, clados derivados apresentaram sequências teloméricas intersticiais ou intracromossômicas (ITS) em porções centroméricas e intersticiais, reafirmando a presença de prováveis rearranjos não-robertsonianos, envolvidos no

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processo de sua diferenciação cromossômica, como já encontrado na diferenciação de outros grupos de Curimatoidea (Moreira Peres et al. 2006; Terencio et al. 2012b; Traldi ​ ​ ​ ​ et al. 2016), embora estes processos ainda não estejam totalmente esclarecidos. Uma ​ vez que ITSs são sequências redundantes e sujeitas a uma pressão seletiva muito relaxada, podendo desaparecer gradualmente ao longo da evolução ou serem perdidas imediatamente após a ocorrência do rearranjo (Slijepcevic 1998; Ocalewicz 2013). Entretanto, as ITSs, detectadas pela FISH, foram encontradas associadas à heterocromatina constitutiva (het-ITS) em R. vulpinus (possivelmente os pares 9 e 18) e ​ short ITS (s-ITS) associada à eucromatina nos pares 8, 11 e 24. Em H. armatus, s-ITS ​ ​ caracterizam os pares 14 e 19. As het-ITS geralmente surgem como sequências curtas, advindas de mecanismos de reparo, fusão ou transposição (Bouffler et al. 1993; ​ Garrido-Ramos et al. 1998; Slijepcevic 1998; Nergadze et al. 2004; Bolzán e Bianchi ​ ​ ​ 2006; Nergadze et al. 2007). Já, as s-ITS surgem por mutações aleatórias, seguidas de ​ ​ expansão da sequência, escorregão da DNA polimerase, crossing-over desigual, translocações terminais, inserção de repetições teloméricas durante o reparo de quebras no DNA de fita dupla ou pela duplicação ou transposição de genes (Messier et al. 1996; ​ Nergadze et al. 2004; Ruiz-Herrera et al. 2008; Bolzán 2012). ​ ​ ​ ​ A classificação das ITS, encontradas nas espécies analisadas no presente trabalho, permite reafirmar que eventos não-robertsonianos estão envolvidos na evolução cromossômica de Cynodontidae, haja vista que não foram encontradas het-ITS restritas em todo o cariótipo das espécies analisadas. Het-ITS restritas formam uma classe de ITS limitadas a regiões heterocromáticas e de distribuição randômica, comumente em regiões centroméricas de todos os cromossomos de uma determinada espécie (Schmid et al. 2010; Schmid e Steinlein 2016). Normalmente, a conformação ​ ​ desse tipo de ITS gera maior propensão a quebras cromossômicas, o que poderia aumentar o número diploide (Schmid et al. 2010; 2016), o que não aconteceu em ​ ​ Cynodontidae.

A existência de rearranjos não-robertsonianos também é observada na espécie do gênero monotípico Rhaphiodon que apresenta variações cromossômicas, mas ​ manutenção de 2n (Martinez et al. 2004; Pastori et al. 2009; presente estudo). Segundo ​ ​ ​ o estudo de genética de populações de Silva (2011), R. vulpinus possui três populações ​ na América do Sul, sendo uma ao leste Amazônico (rios Araguaia e Xingu), onde populações do rio Xingu apresentam variações morfologicas tendo em vista o maior

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número de escamas na linha lateral e raios na nadadeira anal (Toledo-Piza 2000); uma nas demais bacias Amazônicas e outra no sistema Paraná-Paraguai. Estes dados foram parcialmente corroborados com as análises citogenéticas, uma vez que os dados de R. ​ vulpinus aqui encontrados apontam uma conservação de fórmula cariotípica (FC) para uma população da Amazônia central (32m+12sm+8st+2a) e uma do sistema Paraná-Paraguai região do estado do Paraná (Brasil) (32m+12sm+8st+2a) (Martinez et ​ al. 2004), mas com variação na localização da RON e no padrão de distribuição da ​ heterocromatina constitutiva (Figura 4). Por outro lado, Pastori et al. (2009) mostram a ​ existência de outra FC (34m-sm+20st-a) para esta espécie também do rio Paraná, região da Argentina.

O fato dos estudos citogenéticos apontarem a existência de duas fórmulas cariotípicas distintas em R. vulpinus (Martinez et al. 2004, Pastori et al. 2009) nas ​ ​ ​ bacias dos rios Paraná-Paraguai e o estudo de Silva (2011) mostrar uma única população para o referido sistema pode indicar: I) a ocorrência de divergência na montagem dos cariótipos para os espécimes dessa região, uma vez que a maior variação está na quantidade de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos; ou II) a existência de dois cariomorfos nesse sistema hidrológico, haja vista a existência de fragmentação da região, intercalando áreas favoráveis e desfavoráveis à ocupação (Agostinho et al. 2005; Silva 2011), uma vez que as diferentes fórmulas cariotípicas ​ ​ encontradas se referem a regiões geográficas distintas (Martinez et al. 2004, Pastori et ​ ​ al. 2009). Diferentes FC já foram observadas em Serrasalmus spilopleura ​ (Serrasalmidae) e Apareiodon affinis (Parodontidae) na bacia dos rios Paraná-Paraguai ​ (Cestari e Galetti 1992; do Nascimento et al. 2018). ​ ​ A variação cariotípica encontrada em populações de R. vulpinus (uma na bacia ​ Amazônica e duas do sistema Paraná-Paraguai) pode nos levar a inferir que a macroestrutura cromossômica destas populações já está se diferenciando, principalmente, em relação à posição/localização da RON e ao padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva, sugerindo que estas populações estão em processo de diferenciação, o que poderá levar à especiação. Este possível evento de especiação pode ser resultado de um impedimento de fluxo gênico entre as populações desta espécie, advindas de isolamento geográfico, uma vez que sua distribuição é muito ampla e, na realidade, podemos estar lidando com um complexo de espécies. Porém, coletas de exemplares em toda sua distribuição ainda se fazem necessárias.

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Eventos de especiação por isolamento geográfico em populações de R. ​ vulpinus são reforçados por Silva (2011), que de acordo com dados de microssatélites, hipotetizou um contato secundário, relativamente recente, da fauna do rio Madeira com a da bacia do rio Paraná, que pode estar refletida na conservação da macroestrutura cromossômica de populações de R. vulpinus do sistema Paraná-Paraguai e Amazônica. ​ ​ Até o presente momento nenhum dado citogenético de populações de R. vulpinus do ​ leste Amazônico existe na literatura. Possível evento de especiação foi relatado para o peixe-cachorro, Acestrorhynchus microlepis (Acestrohynchinae), espécie com ​ ​ características ecológicas semelhantes à Cynodontidae, do lago Catalão (Amazonas, Brasil) e córrego Apeu (Pará, Brasil) (Campos et al. 2020). Para os autores, a distância e ​ ​ isolamento geográfico entre as duas populações teria minimizado o fluxo gênico e permitindo a fixação de rearranjos específicos como inversão pericêntrica e translocação, envolvendo os pares portadores de RON (Campos et al. 2020), ​ ​ semelhantemente ao que pode estar acontecendo com Rhaphiodon vulpinus. Entretanto, ​ ​ o gênero precisa de uma extensa revisão integrativa para averiguar se estamos diante de diferentes espécies ou de um complexo de espécies.

Portanto, os dados cromossômicos mostraram que, embora inúmeros rearranjos ​ cromossômicos (principalmente não-robertsonianos) estejam envolvidos na diferenciação das espécies estudadas, o número diploide permanece o mesmo (2n=54), sugerindo uma tendência à conservação do número diploide dentro da família Cynodontidae. A presença de rearranjos não-robertsonianos e ação de DNAs repetitivos envolvidos na diferenciação do grupo é notável, uma vez que foram encontradas ITSs em duas espécies e variação na posição/localização cromossômica dos DNAr 18S e 5S entre elas.

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Alice Pattullo

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Resumo

Cromossomos de espécies de Cynodontidae possuem pouca heterocromatina, incluindo a porção terminal. Curiosamente em Cynodon gibbus a porção terminal é rica em DNAs ​ repetitivos como retroelementos transponíveis e sequências microssatélites. Assim, este estudo visou compreender a composição cromossômica terminal de duas espécies de Cynodontidae e investigar a possível tendência a acúmulo de DNAs repetitivos na porção terminal dos cromossomos de C. gibbus (investigada anteriormente), Hydrolycus ​ ​ ​ armatus e Rhaphiodon vulpinus. O mapeamento de sequências repetitivas, ​ principalmente microssatélites, sugere uma tendência de acúmulo destas sequências nas porções terminais dos cromossomos, e sua influência na diferenciação das três espécies.

Palavras-chave: Characiformes, FISH, Microssatélites, Rex, Telômero. ​ ​ ​

Introdução

A porção terminal dos cromossomos possui uma estrutura composta por três regiões, sendo uma região proximal chamada subtelomérica, uma região intersticial (região telomérica intersticial), que separa a extremidade cromossômica do restante do cromossomo e comumente é rica em DNAs repetitivos, e uma sequência telomérica que é um DNA repetitivo localizado na extremidade do cromossomo (de Lange 2018; Baird 2018; Srinivas et al. 2020). ​ ​ O subtelômero é uma região com alta taxa evolutiva, transcricionalmente ativa, e com sequências de proteínas teloméricas e DNAs repetitivos (Mefford e Trask 2002). Sua função está também relacionada à participação no processo de reconhecimento cromossômico, manutenção da estabilidade cromossômica e regulação da expressão gênica (Calderon et al. 2014; Tashiro et al. 2017; van Emden et al. 2019). ​ ​ ​ ​ ​ ​ Já, a sequência telomérica é uma região altamente conservada, de forma que (TTAGGG) é a mais difundida entre os vertebrados (Silvestre e Londono-Vallejo ​n 2012), sendo possível também encontrar esta sequência em espécies de corais, esponjas e vermes (Teixeira e Gilson 2005; Gomes et al. 2010). Os eucariotos que não ​ apresentam tal sequência, comumente possuem pequenas variações, como a planta

Arabidopsis thaliana (TTTAGGG)n (Richards e Ausubel 1988; Fuchs et al. 1995), ​ ​ ​ enquanto grandes variações acontecem em grupos de fungos mais distantes, a exemplo de Candida albicans (ACGGATGTCTAACTTCTTGGTGT) (Teixeira e Gilson 2005). ​ ​n 53

Ainda, sequências teloméricas podem se associar a nucleossomos, ao complexo de proteínas Shelterin e a fatores de transcrição cromossomal com objetivo de neutralizar ameaças à integridade do genoma, impedindo fusões de ponta a ponta, de rupturas acidentais de fita dupla (DSBs) e da perda recorrente de DNA, que ocorre durante a replicação (McClintock 1938; Muller 1938; McClintock 1941; Muller 1941; Aksenov e Mirkin 2019), motivo pelo qual a maquinaria de reparo e replicação visa manter o comprimento do telômero (Lundblad e Blackburn 1993).

Outra característica da região cromossômica terminal é que ela é comumente rica em heterocromatina, possivelmente para supressão de recombinações ectópicas e atuação indesejada de elementos transponíveis (Grewal e Jia 2007; Amaral et al. 2017). ​ As regiões heterocromáticas são frequentemente compostas por DNAs repetitivos (Grewal e Jia 2007). Estas sequências são subdivididas em DNAs repetitivos dispersos no genoma, como elementos transponíveis e DNAs repetitivos in tandem como DNAs ​ ​ satélites e os DNAs ribossomais (DNAr) (Phillips e Reed 1996; Kidwell 2002; Sumner 2003; Suntronpong et al. 2017). DNAs repetitivos sofrem baixa pressão seletiva, ​ ficando mais suscetíveis a mutações, em comparação a outras regiões genômicas. Portanto, o estudo destas sequências, elucidando a distribuição de DNAs repetitivos ao longo de cromossomos, é um dos elementos essenciais em genética evolutiva para a compreensão da organização e evolução de genomas (Artoni et al. 2015). ​ ​ Estudos dessa natureza em Cynodontidae, caraciformes conhecidos como peixes cachorra, são encontrados em uma espécie de cada gênero da família (Pinheiro-Figliuolo et al. 2020; Pinheiro-Figliuolo et al. in prep.). Cynodontidae é ​ ​ ​ ​ composta por oito espécies divididas em três gêneros: Cynodon Spix 1829 que é o ​ grupo-irmão do clado composto por Hydrolycus Müller & Troschel 1844 e Raphiodon ​ ​ Agassiz 1829 (Oliveira et al. 2011; Silva 2011). Esta família, como as demais de ​ ​ Curimatoidea, possui um número diploide conservado (2n = 54) e, portanto, o processo de diversificação de suas espécies pode estar envolvido com a organização diferencial da fração repetitiva de DNA dos genomas, como já encontrado em outros Characiformes como Curimatidae (Pinheiro et al. 2016) e Prochilodontidae (Terencio et ​ ​ ​ al. 2015). ​ No genoma de espécies de Cynodontidae as regiões terminais, bem como todas as porções cromossômicas, parecem ser pobres em heterocromatina (Martinez et al. ​ ​ 2004; Pastori et al. 2009; Pinheiro-Figliuolo et al. 2020; Pinheiro-Figliuolo et al. in ​ ​ ​ ​ ​ 54

prep.), porém ricas em DNAs repetitivos como retroelementos transponíveis e sequências microssatélites (SSR) (Pinheiro-Figliuolo et al. 2020). O mapeamento físico ​ ​ cromossômico de DNAs repetitivos realizado em C. gibbus mostrou retroelementos ​

Rex1, Rex3, Rex6 e os microssatélites (GA)15, (CA)15, (CAC)10, (CAT)10 e (GACA)8 ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ acumulados, preferencialmente, nas regiões terminais dos cromossomos, incluindo telômeros (Pinheiro-Figliuolo et al. 2020). Portanto, embora estes DNAs repetitivos ​ estejam dispersos de maneira sutil ao longo dos cromossomos seu maior acúmulo permanece nas porções terminais. Isso nos levou a indagar se este é um padrão dentro de Cynodontidae e qual sua influência no processo evolutivo desta família. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar a composição cromossômica da porção terminal dos cromossomos de H. armatus e C. gibbus, visando compreender sua importância na ​ ​ ​ evolução cromossômica de Cynodontidae.

Material e Métodos

Amostragem e citogenética convencional

Foram estudados citogeneticamente 28 exemplares de Cynodontidae, coletados na Amazônia (Brasil), sendo 10 machos e 8 fêmeas de Raphiodon vulpinus do lago ​ Catalão (AM) (2°33’28,4”S, 60°46’29,7”W) e 6 machos e 4 fêmeas de Hydrolycus ​ armatus do rio Araguaia (PA) (5°22’34”S, 48°43’08”W). As coletas foram realizadas com a licença permanente concedida pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) (Número da licença 5659-1) e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA (045/2017 e SEI 01280.000804/2018-29), Brasil.

As preparações cromossômicas foram obtidas de acordo com o protocolo de Bertollo et al. (2015). ​ ​ Preparação das sondas de hibridização derivadas de sequências repetitivas

Sondas dos retrotransposons Rex 1, Rex 3 e Rex 6 foram isoladas e ​ ​ ​ ​ amplificadas, seguindo os protocolos de Volff et al. (2000), Volff et al. (1999) e ​ ​ ​ ​

Shimoda et al. (1999), respectivamente. Os motivos microssatélite (GA)15, (CA)15, ​ ​ ​ ​ ​

(CAC)10, (CAT)10, (GACA)8 e (GATA)8 foram marcados diretamente com Cy3 durante ​ ​ ​ ​ ​ ​ a síntese (Kubat et al. 2008). ​ ​

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FISH

A hibridização fluorescente in situ (FISH) foi baseada no protocolo de Pinkel ​ et al. (1986). Para isso, as sondas foram marcadas pelo método de nick translation, ​ ​ utilizando digoxigenina-11-dUTP (Dig-Nick Translation mix - Roche), seguindo as recomendações do fabricante. Em seguida, as lâminas foram desnaturadas em formamida a 70% / 2x SSC a 70 °C, pH 7, seguido de desidratação em uma série crescente de etanol (70, 85 e 100%), por 5 minutos em cada concentração. Posteriormente, 20 µL de uma solução de hibridação (100 ng de cada sonda, formamida deionizada a 50%, tampão SSC 20x e sulfato de dextrano a 10%) foram adicionados em cada lâmina e a mistura foi hibridizada a 37 °C por 24h em uma câmara úmida, contendo água destilada. Para detecção do sinal as lâminas foram incubadas em tampão NFDM por 15 minutos. Em seguida, foi colocado sobre cada lâmina 50μL de anti digoxigenina-rodamina e as lâminas foram cobertas com lamínulas e deixadas por 60 minutos em câmara úmida com água destilada. Os cromossomos foram contracorados com DAPI (1,2 µg / mL) e montados em solução antifade (Vector, Burlingame, CA, EUA).

Análises microscópicas

Pelo menos 30 metáfases de cada indivíduo foram analisadas para confirmar o 2n, a estrutura do cariótipo e os padrões de DNAs repetitivos. As imagens foram obtidas, utilizando um microscópio Olympus BX51 (Olympus Corporation, Ishikawa, Japão) equipado com CoolSNAP. Os cromossomos foram classificados em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) ou acrocêntricos (a), seguindo Levan et al. (1964). O número fundamental (NF) foi determinado de acordo ​ com o número de braços cromossômicos, considerando m, sm, st como tendo dois braços e a como tendo um braço.

Resultados

Raphiodon vulpinus

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O retroelemento Rex 6 está disperso ao longo de todos os cromossomos (Figura ​ 1a), enquanto marcações dos retroelementos Rex 1 e Rex 3 não foram detectadas (Figura ​ ​ 1b, c).

Figura 1. a Hibridização de sequências repetitivas de DNA Rex 6 (sinais em vermelho) ​ ​ ​ em cromossomos metafásicos de Rhaphiodon vulpinus. Cromossomos metafásicos de R. ​ ​ ​ vulpinus com ausência de hibridização de: b Rex 1e c Rex 3. Barra indica 10µm. ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​

Sequências microssatélites (CA)15, (GA)15, (GATA)8 e (GACA)8 estão ​ ​ ​ ​ ​ ​ majoritariamente localizadas na porção terminal de alguns cromossomos (Figura 2a, b, c, d), enquanto que (CAT) e (CAC) não foram visualizados (Figura 2e, f). Os ​10 ​10 microssatélites (CA)15 estão localizados na porção biterminal de 12 pares ​ ​ cromossômicos, porção terminal de 14 pares e ausente em um par (Figura 2a). As sequências microssatélite (AG) estão na porção biterminal de 13 pares ​15 cromossômicos, porção terminal de nove pares e ausente em cinco pares (Figura 2b). Os microssatélites (GATA)8 estão na porção biterminal de um par cromossômico, porção ​ ​

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terminal de seis pares, porção proximal de q em um par, par 8, e ausente em 19 pares ​ ​ (Figura 2c). E o motivo (GACA) está localizado na porção biterminal de um par ​8 cromossômico, porção terminal de 14 pares e ausente em 12 pares (Figura 2d).

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Figura 2. Sequências de microssatélites (sinais em vermelho) hibridizadas em ​ cromossomos mitóticos de Rhaphiodon vulpinus: a (CA)15; b (AG)15; c (GATA)8; d ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ (GACA) Cromossomos metafásicos de C. gibbus com ausência de hibridização de: e ​8. ​ (CAT)10 e f (CAC)10. Barra indica 10µm. ​ ​ ​ ​ ​ ​

Hydrolycus armatus

Os retroelementos Rex 1, Rex 3 e Rex 6 estão dispersos ao longo de todos os ​ ​ ​ ​ cromossomos (Figura 3a, b, c).

Figura 3. Hibridização de sequências repetitivas de DNA (sinais em vermelho) em ​ cromossomos metafásicos de Hydrolycus armatus: a Rex1; b Rex3; c Rex6. Barra indica ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ 10µm.

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Sequências microssatélites (CA) e (GA) estão majoritariamente localizadas ​15 ​15 na porção terminal de todos cromossomos e (GATA)8 em um único par (Figura 4a, b, c, ​ ​ d), enquanto os motivos (CAT)10, (CAC)10 e (GACA)8 não foram evidenciados nos ​ ​ ​ ​ cromossomos (Figura 4d, e, f). O microssatélite (CA)15 está na porção biterminal de 23 ​ ​ pares cromossômicos e porção terminal de quatro pares. Além disso, está presente na porção centromérica do par 14 e porção intersticial dos pares 16 e 17 (Figura 4a). O motivo (AG) foi evidenciado na porção biterminal de 26 pares cromossômicos, porção ​15 terminal de um par e porção intersticial de q no par 1 (Figura 4b). E a sequência ​

(GATA)8 está localizada na porção proximal de q no par 6 (Figura 4c). ​ ​ ​ ​

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Figura 4. Sequências de microssatélites (sinais em vermelho) hibridizadas em ​ cromossomos mitóticos de Hydrolycus armatus: a (CA)15; b (AG)15; c (GATA)8; ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ Cromossomos metafásicos de H. armatus com ausência de hibridização de: d (CAT)10; ​ ​ ​ e (CAC)10; f (GACA)8. Barra indica 10µm. ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ Discussão

Os dados aqui apresentados e os demonstrados por Pinheiro-Figliuolo et al. ​ (2020) mostram a existência de um padrão de acúmulo de DNAs repetitivos na porção terminal dos cromossomos em Cynodontidae, principalmente microssatélites. Cynodon ​ gibbus possui ainda DNA repetitivo do tipo Rex na porção terminal dos seus ​ 61

cromossomos (Pinheiro-Figliuolo et al. 2020) (Figura 5), o que nos leva a questionar ​ ​ por qual motivo DNAs repetitivos, principalmente microssatélites, se acumulam na porção terminal dos cromossomos nessas espécies e qual a razão da variação intra- e interespecífica.

Figura 5 Idiograma com as diferenças citogenéticas encontradas em R. vulpinus, H. ​ ​ ​ armatus e C. gibbus a partir de marcadores utilizados no presente trabalho, em ​ Pinheiro-Figliuolo et al. (2020) para C. gibbus e heterocromatina constitutiva e ITS de ​ ​ ​ Pinheiro-Figliuolo et al. (in prep.). Dados de microssatélites e Rex mostram apenas os ​ ​ ​ ​ ​ cromossomos onde estas sequências estão compartimentalizadas. Traço ( _ ) em C. ​ gibbus indica a localização do cromossomo sexual, que está representado na caixa. ​

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Para responder a primeira questão é necessário considerar que a região terminal, bem como as demais regiões cromossômicas de C. gibbus, H. armatus e R. vulpinus, ​ ​ ​ ​ ​ apresentam uma pequena quantidade de heterocromatina constitutiva e, portanto, as frações repetitivas de DNA estão em maior densidade na porção eucromática dos cromossomos das três espécies (Pinheiro-Figliuolo 2020; Pinheiro-Figliuolo in prep.). ​ ​ Além disso, que existe uma interação evolutiva importante entre DNAs repetitivos e heterocromatina, de forma que os elementos repetitivos inseridos nela possivelmente não serão deletados e sim propagados (Cioffi e Bertollo 2012), haja vista a diferente pressão seletiva atuante nas porções heterocromáticas e eucromáticas do genoma (Ridley 2006). Se levarmos em conta a grande quantidade de DNAs repetitivos em porções terminais nas três espécies e a não coincidência com heterocromatina constitutiva podemos sugerir que, ao longo do curso evolutivo destas espécies, em decorrência da alta pressão seletiva em regiões eucromáticas, as sequências repetitivas aqui estudadas (microssatélites e Rex) foram sendo deletadas e, por algum motivo, ​ ​ permaneceram na porção terminal dos cromossomos, possivelmente atuando na estrutura dos telômeros, já que tanto regiões subteloméricas quanto regiões teloméricas intersticiais são ricas em DNAs repetitivos (Srinivas et al. 2020). ​ ​ Para o segundo questionamento, a busca pelo motivo da variação na composição da porção terminal das três espécies, temos que levar em consideração também a pouca quantidade de heterocromatina em regiões terminais dos cromossomos de espécies de Cynodontidae (Pinheiro-Figliuolo in prep.) e a associação de microssatélites com ​ ​ elementos transponíveis (Pinheiro-Figliuolo et al. 2020). A pouca quantidade de ​ ​ heterocromatina pode estar permitindo a conversão gênica, transposição, deslizamento de DNA polimerase durante a replicação, excisão e a altas taxas de recombinação não-alélicas dessas regiões, ou seja, mutações na porção terminal dos cromossomos de cada espécie, e recombinação intra-cromossômica, causando a contração e expansão dos DNAs repetitivos aqui estudados (Kim et al. 2018; Pinheiro-Figliuolo et al. 2020). ​ ​ ​ ​ A associação entre sequências microssatélites e Rex, no caso de Cynodontidae, ​ ​ verificamos que esta existe em C. gibbus, o que pode levar à expansão de SSR quando ​ ​ os ETs estiverem ativos e até formar recombinação homóloga, de forma a gerar rearranjos cromossômicos como deleção, inversão, translocação e duplicação (Ozouf-Costaz et al. 2004; Pinheiro-Figliuolo et al. 2020). O mesmo não ocorre para ​ ​ ​

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grupos que divergiram posteriormente (H. armatus e R. vulpinus), já que Rex 1, 3 e 6 ​ ​ ​ ​ ​ ​ ​ não se apresentam acumulados em nenhuma região específica dos cromossomos de H. ​ armatus e R. vulpinus. Portanto, outros mecanismos, como os relacionados à ​ ​ heterocromatina, estariam envolvidos na dispersão de sequências repetitivas na porção telomérica das duas espécies.

É importante ressaltar que o fato de R. vulpinus não apresentar sinais de Rex 1 ​ ​ e 3 em cromossomos mitóticos não significa que estas sequências não estejam presentes ​ em seus genomas. Isso porque a técnica FISH em cromossomos mitóticos possui limitações (Kearney 2001). Além disso, a ausência de sinais pode estar relacionada a fatores ambientais, a exemplo do que ocorreu em espécies de Semaprochilodus (da ​ ​ Silva et al. 2020). Em cromossomos de S. taeniurus de ambientes não antropizados os ​ ​ ​ elementos transponíveis do tipo Rex1 e 3 não foram detectados, mas em indivíduos ​ ​ provenientes de ambientes poluídos estas sequências sofreram amplificação e foram detectadas pela FISH em metáfases mitóticas (da Silva et al. 2020). ​ ​ Associação de elementos transponíveis e sequências microssatélites, conforme encontrado em C. gibbus, foi observada em Toxotes chatareus (Carangiformes) da ​ ​ ​ Tailândia, onde Rex 6 e microssatélites foram encontrados associados ao longo dos ​ cromossomos e, em grandes blocos, em um par cromossômico (Supiwong et al. 2017). ​ ​ Elementos transponíveis podem acumular-se em regiões heterocromáticas, intergênicas ou próximas a genes (Kidwell 2005). Normalmente, essa localização não é ao acaso e sim a partir de alguma relação com características específicas de regiões do genoma hospedeiro (Kidwell e Lisch 2000).

No presente estudo foi possível observar um maior acúmulo de motivos microssatélites di-nucleotídeos nas espécies de Cynodontidae, sendo sintênicos (CA) e ​15 (GA) na porção terminal dos cromossomos das três espécies, o que indica que tais ​15 di-nucleotídeos possivelmente são oriundos de uma espécie ancestral. Isso porque, segundo Adams et al. (2016), di-nucleotídeos frequentemente são encontrados no ​ genoma de teleósteos e (CA) é o que está em maior abundância e frequência, não só em ​n teleósteos, mas em vertebrados, em geral. Assim, é possível que estes microssatélites estejam desempenhando uma função estrutural nos cromossomos, uma vez que foram encontrados compartimentalizados em regiões terminais. Adicionalmente a isso, é importante ressaltar que, embora possam estar desempenhando uma função estrutural, a

-2 -6 alta taxa de mutação de microssatélites, 10 a 10 ,​ pode afetar significativamente a ​ ​ 64

evolução genômica por meio de mecanismos, como reorganização cromossômica (Pardue et al. 1987; Schlötterer 2000; revisado em Li et al. 2002). ​ ​ ​ ​ Estes dados indicam que o mapeamento físico cromossômico de sequências repetitivas é importante para entender o padrão de organização e evolução cromossômica, bem como demonstrar que as mesmas podem estar desempenhando funções específicas no genoma das espécies de Cynodontidae e que, o conhecimento destas sequências é essencial para compreensão da composição não só da fração heterocromática constitutiva dos genomas, mas também de regiões eucromáticas dos cromossomos.

Desta forma, os dados aqui apresentados apontam uma tendência de acúmulo de sequências repetitivas, principalmente microssatélites, nas porções terminais dos cromossomos de espécies de Cynodontidae, indicando uma possível função estrutural na região do telômero das espécies: Cynodon gibbus, Hydrolycus armatus e ​ ​ ​ Rhaphyodon vulpinus.

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CONCLUSÃO Os dados cromossômicos analisados mostraram que, embora inúmeros rearranjos cromossômicos (principalmente não-robertsonianos) estejam envolvidos na diferenciação das espécies estudadas, o número diploide permanece o mesmo 2n=54. Isso sugere uma tendência à conservação do número diploide na família Cynodontidae. Além disso, as espécies de Cynodontidae apresentam tendência a acúmulo de sequências de DNAs repetitivos na porção terminal de todos os cromossomos.

Os dados de Raphiodon vulpinus encontrados demonstram a existência de ​ mesma fórmula cariotípica em populações da Amazônia Central e do sistema Paraná-Paraguai na região do Paraná. Com base na variação cariotípica observada e extensa distribuição geográfica do táxon ao longo da America do Sul, supõe-se que R. vulpinus pode abrigar um complexo de espécies, o que ​ carece de novas investigações integrando dados moleculares, citogenéticos e morfológicos;

As evidências deste estudo fornecem insights importantes da diferenciação dos ​ cromossomos sexuais de Cynodon gibbus, particularmente o acúmulo diferencial ​ ​ de sequências repetitivas de DNA, como elementos transponíveis e microssatélites, na porção pericentromérica do cromossomo W. Embora essas repetições tenham obviamente desempenhado um papel na diferenciação dos cromossomos sexuais em C. gibbus, sua exata contribuição ao processo ​ ​ permanece em grande parte incerto;

A distribuição de heterocromatina e DNAs repetitivos nas espécies de Curimatoidea, com cromossomos sexuais ZZ/ZW, apoia a conclusão de que este processo em Cynodontidae ocorreu de forma independente daqueles que ocorreram em outros Curimatoidea. Por tanto, esses dados fornecem insights ​ sobre a evolução de cromossomos sexuais em Curimatoidea, mostrando que a existência de cromossomos sexuais com heteromorfismo na fêmea é um caracter pleisiomorfico da superfamília, contudo em Cynodontidae a origem do cromossomo sexual aparentemente recente parece ser recorrende de mutação de ​ novo; ​

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É notável a existência de rearranjos não-robertsonianos e ação de DNAs repetitivos envolvidos na diferenciação do grupo, uma vez que foram encontrados além de mesmo número diploide entre as espécies, ITSs e variação na localização cromossômica dos DNAr 18S e 5S em espécies do clado derivado.

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