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Inferencia Filogenética de Medusozoa (Cnidaria), con énfasis en Hydrozoa
Thesis · November 2005
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1 author:
Maximiliano Manuel Maronna University of São Paulo
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Dimensions of marine life – Patterns and process of diversification in planktonic and benthic cnidarians (Biota-FAPESP) View project
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Universidad Nacional de Misiones Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales
Licenciatura en Genética Tesina de Graduación
“INFERENCIA FILOGENÉTICA DE
MEDUSOZOA (CNIDARIA), CON ÉNFASIS
EN HYDROZOA”
Maximiliano Manuel Maronna
* 2005 * El siguiente trabajo de tesis para optar por el grado de Licenciado en Genética, ha sido realizado en el Laboratorio de Estudios en Medusozoa, Laboratorio de Sistemática Molecular; Departamento de Zoología, Instituto de Biociencias; Universidad de San Pablo, Brasil bajo la dirección del Prof. Dr. Antonio Carlos Marques.
Tesista: Maximiliano Manuel Maronna
Departamento de Zoologia
Instituto de Biociências
Universidade de São Paulo
São Paulo - Brazil
II
El placer más noble es el júbilo de comprender Leonardo da Vinci
Una política sin principios, una educación sin carácter, una ciencia sin humanidad, un comercio sin moralidad, no son apenas inútiles, sino positivamente peligrosos Sathya Sai Baba
III
A MIS PADRES VILMA Y JOSE LUIS
IV AGRADECIMIENTOS
- A mis padres VILMA y JOSÉ LUIS, por su respeto y paciencia; a mis hermanos LISANDRO, PABLO y NICOLÁS por todas las situaciones vividas con mis viejos y conmigo en mis años de Posadas y San Pablo. - ¡A mi querida abuela CARMEN, a quien siempre le resultó muy divertida esta cuestión de la genética! - A JULIE, por todo. - A MAURI, SILVINA y MAITE por hacerme el aguante en Rosario y la ¡MÚSICA!. A mis tíos JULIO y CRISTINA (y toda la familia) por acompañarme en mi estadía en Posadas. - A TIM MARQUES, por haberme abierto la puerta de su grupo de trabajo sin consesiones y sus enseñanzas; por confiar en mí desde el primer momento al comenzar el Lab. de Sistemática Molecular. A todo el grupo del lab de Medusozoa (André, Vanessa, Val, Portuga, Otto); a Juliana, William, Pedro, Fabio y todo el excelente grupo de estudiantes de posgrado del Instituto de Biociencias. ¡A Fernando Marques, por tantas charlas y noches con Frank Zappa en el lab! - Al Dr. Alvaro Migotto y Alberto Lindner por las muestras biológicas y secuencias de Hydrozoa. - A la Dra. Cristina Miyaki por permitirme hacer mis primeras “pruebas” en su lab y a Erica por su tiempo. - A mis ¡amigazos! de Posadas: “la 12”, ¡“los 4” por el 2005!, Laura, Gabi, Flavia, Vanesa, Gaby, Nico, José, Eze, Mario, Adrián, Kike, Rulo, Rulito, Lupa, Carlitos, Pablito...tanta gente que a lo largo de estos años me demostraron que los buenos se ven en las malas. ¡A Martín, Andrea y Maca por tanto aguante! A mis amigos de Teodelina Flavia, Emi, Vero, Andre, Pato, Cogote, Nacho, Pollero y Damián por estar ahí. - A C.J. Bidau por enseñarme tantas cosas, especialmente a pensar; al grupo del enano Baldo y Dardo que continúan hoy su legado en el Depto. de Genética. - A Vinicius (Ale y Víctor), nuestra segunda casa. - A los buenos profesores que a lo largo de estos años me han demostrado con su ejemplo como se debe comportar una persona de bien en el ámbito académico. - A los malos profesores que a lo largo de estos años me han demostrado con su ejemplo como no se debe comportar una persona de bien en el ámbito académico. - A los músicos y escritores que nos dan alas y espacio para sentirnos emocionados (de la forma que sea): - A los creadores y desarrolladores de Internet por generar y promover LA HERRAMIENTA (¡fuera de control!) de la información.
- A todos aquellos que se merecen un agradecimiento, pero no recuerdo sus nombres en este ¡brevísimo! instante.....y bue´, ¡cosas que pasan!
V
ÍNDICE GENERAL
Página
LISTADO DE TABLAS...... X
LISTADO DE FIGURAS...... XI
RESUMEN...... 1
SUMMARY...... 2
1. INTRODUCCIÓN...... 3
2. HIPÓTESIS...... 36
3. OBJETIVOS……………………………………...... 36
4. MATERIALES...... 37
5. MÉTODOS...... 46
6. RESULTADOS...... 73
7. EXPOSICIÓN DETALLADA DE FILOGENIAS Y DISCUSIÓN...... 79
CONSIDERACIÓNES FINALES...... 93
BIBLIOGRAFÍA…………………………………...... 96
VI
ÍNDICE ANALÍTICO
Página
Listado de figuras...... X
Listado de tablas ...... XI
Resumen...... 1
Summary...... 2
1. INTRODUCCIÓN ...... 3 SISTEMÁTICA Y DIVERSIDAD BIOLÓGICA ...... 3 SISTEMÁTICA FILOGENÉTICA ...... 4 - Caracteres y grupos en sistemática filogenética...... 6 - Cladogramas y árboles filogenéticos ...... 8 PARSIMONIA Principios básicos...... 10 Parsimonia e inferencia filogenética...... 11 Perspectivas filosóficas ...... 13 MEDUSOZOA...... 16 HYDROZOA...... 20 Evolución y sistemática ...... 20 Características físicas ...... 20 Distribución...... 23 Hábitat...... 23 Comportamiento...... 24 Biología reproductiva...... 25 CUBOZOA ...... 26 Evolución y sistemática ...... 26 Características físicas ...... 26 Distribución...... 27 Hábitat...... 27 Comportamiento...... 27 Biología reproductiva...... 28 STAUROZOA...... 28 Evolución y sistemática ...... 28
VII Características físicas ...... 29 Hábitat...... 30 Comportamiento...... 30 Biología reproductiva...... 31 SCYPHOZOA...... 31 Evolución y sistemática ...... 31 Características físicas ...... 32 Distribución...... 33 Hábitat...... 34 Comportamiento...... 34 Biología reproductiva...... 34
2. HIPÓTESIS ...... 36
3. OBJETIVOS...... 36
4. MATERIALES...... 37 INFORMACIÓN BIOLÓGICA Y FILOGENIAS Información molecular (ADN) y morfológica...... 37 ESTRUCTURA Y EVOLUCIÓN DEL ADNr 16S – 18S...... 39 Tasas de evolución...... 40 Evolución concertada ...... 40
5. MÉTODOS ...... 46 ANÁLISIS SIMULTÁNEO...... 46 - Acerca de los datos fósiles...... 47 CONSTRUCCIÓN DE CLADOGRAMAS...... 48 Algoritmos exactos ...... 48 Métodos Heurísticos...... 49 Adición por etapas...... 51 CARACTERES MOLECULARES Y SECUENCIAS ...... 52 - Estados de caracteres aditivos ...... 52 - Estados de caracteres no-aditivos ...... 53 - Estados de caracteres multiestado ...... 53 - Consideraciones computacionales...... 54 -- P, NP, y NPC ...... 54 INTERCAMBIO DE RAMAS ...... 55 HOMOLOGÍA DINÁMICA EN DATOS MOLECULARES...... 56 Alineamiento de optimización...... 57 División de secuencias genéticas...... 61 Consideración final...... 62
VIII ANÁLISIS DE GRANDES GRUPOS DE DATOS EN SISTEMÁTICA FILOGENÉTICA...... 62 Deriva de árboles (DFT)...... 64 Fusión de árboles (TF) ...... 65 MEDICIÓN DE SOPORTE...... 65 Soporte de Bremer ...... 66 Análisis de sensibilidad y congruencia ...... 66 PROTOCOLO DEL MÉTODO CLADÍSTICO (MODIFICADO DE WENZEL 2002) ...... 68 MATERIALES Y MÉTODOS PARA EL ESTUDIO REALIZADO ...... 70
6. RESULTADOS...... 73
7. EXPOSICIÓN DETALLADA DE FILOGENIAS Y DISCUSIÓN ...... 79 MEDUSOZOA...... 79 CLADO (SCYPHOZOA(STAUROMEDUSAE,CUBOZOA)) ...... 80 HYDROZOA...... 83 Trachylina...... 83 Hydroidolina ...... 84
8. CONSIDERACIONES FINALES...... 93 NUCLEÓTIDOS, CLADOGRAMAS Y FILOGENIAS ...... 93 MEDUSOZOA Y UN PASADO CON PRESENTE PROMISORIO...... 94
9. BIBLIOGRAFÍA ...... 96
IX
LISTA DE TABLAS Página
1. Clasificación de Cnidaria propuesta por Marques & Collins (2004)...... 19
2. Listado de especies (terminales) utilizados en el presente estudio...... 45
3. Matriz de costo de caracteres aditivos ...... 52
4. Matriz de costo de caracteres no-aditivos ...... 53
5. Matriz de costo de caracteres multiestado ...... 53
6. Matriz de costo de caracteres multiestado para estados nucleotídicos.... 54
7. Resumen de valores obtenidos en base a matrices de costo para datos moleculares y morfológicos. Valores para índice de congruencia (ILD)...... 73
8. Casos en los cuales el algoritmo TF permite alcanzar cladogramas más parsimoniosos...... 74
X LISTA DE FIGURAS
Página
1. Concepto de Hennig de relación ...... 5
2. Plesiomorfia y apomorfia son términos relativos ...... 6
3. Los tres tipos de grupos reconocidos por Hennig, definidos en términos de distribución de estados de carácter...... 7
4. Cladogramas y árboles...... 9
5. Relaciones entre caracteres...... 12
6. Congruencia de la hipótesis cladística basada en datos morfológicos (Marques & Collins 2004) y la hipótesis basada en datos moleculares (Collins 2002)...... 17
7. Anatomía básica de Hydrozoa...... 21
8. Anatomía básica de Cubomedusae...... 27
9. Anatomía de Stauromedusae...... 30
10. Anatomía básica de Scyphozoa ...... 32
11. Mapa genómico mitocondrial de Metridium senile...... 39
12. Estructura básica de la disposición de genes ARNr nuclear eucariota ...... 39
13. Modelo de escalada de colinas ...... 50
14. Ejemplo de intercambio de ramas por TBR...... 55
15. Cladograma con cinco taxones terminales (T1-T5) y cuatro nodos internos (A1-A4)...... 57
16. Un cladograma de 4 terminales (4 secuencias de una y dos bases) ...... 58
17. Determinación preliminar de la secuencia del nodo A3 de la figura 16...... 59
18. Determinación preliminar de la secuencia del nodo A2 de la figura 16...... 59
19. Determinación preliminar de la secuencia del nodo A1 de la figura 16...... 59
20. Determinación final de las secuencias hipotéticas ancestrales...... 60
21. Esquema ejemplo que resume el método de optimización OA ...... 60
22. Ilustración de la estrategia de división de secuencias...... 61
XI
23. Cladograma de gran tamaño, destacando sectores...... 63
24. Descripción de óptimos locales para el espacio de óptimos posibles del cladograma...... 63
25. Árbol filogenético más parsimonioso Medusozoa (consenso estricto, análisis simultáneo 1:1:2) ...... 75
26. Detalle de resultados de sensibilidad (tablas navajo) para los clados más relevantes del análisis de Medusozoa (consenso estricto, análisis simultáneo 1:1:2) ...... 76
27. Árbol filogenético más parsimonioso Medusozoa (consenso estricto, análisis molecular 1:1:2)...... 77
28. Árbol filogenético más parsimonioso Medusozoa (consenso estricto, análisis morfológico 1:1:1)...... 78
29. Árbol filogenético más parsimonioso Hydrozoa (consenso estricto, análisis molecular 1:1:1)...... 79
30. Detalle del clado Trachylina presente en fig. 29...... 83
31. Detalle del clado Aplanulata (ex Capitata) presente en fig. 29...... 85
32. Detalle del clado Plumularioidea (ex Conica) presente en fig. 29 ...... 86
33. Detalle del clado (Eudendriidae(Hydractiniidae,Clavidae)) presente en fig. 29...... 87
34. Detalle del clado “Capitata” presente en fig. 29...... 88
35. Detalle del clado Sertularioidea presente en fig. 29 ...... 89
36. Detalle del clado con miembros formales de Conica y Proboscidoidea (Leptothecata) presente en fig. 29...... 89
37. Detalle del clado Siphonophorae presente en fig. 25 (Cnidaria) ...... 91
XII
RESUMEN
La sistemática filogenética posee un criterio que promueve reflejar los patrones reales (o naturales, por un concepto purista) de descendencia con modificación que subyace en el centro de la biología evolutiva: un sistema filogenético, estando embasada en el paradigma evolucionista-darwinista. Los estudios sistemáticos realizados en los últimos 15 años para los miembros del grupo animal Cnidaria contienen una importante variedad de hipótesis acerca de las relaciones genealógicas propuestas entre especies actuales y extintas, obtenidas tanto a partir de datos moleculares como morfológicos. El reconocimiento de diferentes tipos de información para llevar a cabo inferencias filogenéticas, conllevó el planteamiento que toda la información disponible debe ser analizada en una única matriz (análisis simultáneo). Se utilizaron para el análisis simultáneo de Medusozoa 74 terminales, con 87 caracteres morfológicos (48 de ellos informativos para análisis filogenético) y secuencias (caracteres aprox.: 1850) del gen ribosomal nuclear 18S para cada terminal a excepción del terminal Conulatae. Por otra parte, para el análisis molecular de Hydrozoa fueron considerados 117 taxones terminales, los cuales presentan secuencias (caracteres aprox.: 400pb) del gen ribosomal mitocondrial 16S. El análisis desarrollado en el presente trabajo (optimización directa de caracteres moleculares y aplicación de algoritmos para matrices de gran tamaño; determinación del soporte de clados por sensibilidad y Bremer) ha permitido obtener propuestas de relaciones genealógicas similares generales en ambos estudios, y plantean la condición no monofilética tanto para unos pocos grupos de Medusozoa en general así como de numerosos grupos de Hydrozoa en particular.
1
SUMMARY
2 1. INTRODUCCIÓN
SISTEMÁTICA Y DIVERSIDAD BIOLÓGICA
Desde el surgimiento de la teoría evolutiva moderna, propuesta por Charles Darwin en 1859, una de las tareas de la biología ha sido el estudio de las relaciones genealógicas entre las especies. Esta tarea es especialmente importante ya que todas las diferencias que existen, sean de morfología, fisiología, ecología, en términos de comportamiento (etológicos), genética, o bien de distribución geográfica, han evolucionado, así como las especies en sí mismo en el curso de la filogénesis. La investigación de las relaciones filogenéticas entre las especies existentes y fósiles, y la expresión de los resultados de dicho estudio, es la tarea principal de la sistemática biológica moderna. Hasta el desarrollo de la sistemática filogenética, propuesta por el entomólogo alemán Willi Hennig en 1950, muchos investigadores consideraban que la finalidad de la sistemática biológica era clasificar organismos de acuerdo a su semejanza morfológica, todavía sin determinar cuales semejanzas (ancestrales o derivadas) eran adecuadas para definir las relaciones históricas entre los organismos, utilizando para esta finalidad un sistema de tipo jerárquico, pudiendo llevar a serios errores y malos entendidos a través de la relación formal entre los sistemas morfológicos y filogenéticos. Existen muchos ejemplos, por ejemplo en los inicios de la Taxonomía Evolutiva (también llamada Gradismo), donde el ancestro considerado (arquetipo) fue mal desarrollado o propuesto con serias consecuencias por ser denominado como ancestro “real” del grupo (Hennig 1965). En un sistema filogenético, el “iniciador” al cual cada agrupamiento se relaciona, es una comunidad reproductiva que en algún momento del pasado realmente existió como especie ancestral del grupo en cuestión, más allá de la mente que la concibe, y la cual está asociada por conexiones genealógicas con otros miembros del grupo, y sólo con éstos. En estas circunstancias, surgió el conflicto con las consideraciones de una sistemática formal (gradismo) y filogenética, acerca de si la finalidad de la rama de la biología llamada simplemente sistemática debe tratar siempre de expresar la semejanza morfológica de los organismos reflejada en su relación filogenética. Esta marcada diferencia entre el sistema morfológico jerárquico clásico y el sistema filogenético, igualmente jerárquico, no existiría si el grado de semejanza morfológica fuese una medida exacta del grado de la relación filogenética, lo cual no acontece siempre. Asimismo, la sistemática filogenética reemplazó a los previos métodos fenéticos numéricos; el feneticismo planteaba básicamente, que toda la similaridad es pertinente para definir relaciones de parentesco (Kitching et al. 2000).
3 SISTEMÁTICA FILOGENÉTICA
La propuesta de Willi Hennig era crear un sistema que reflejase los patrones reales (o naturales, por un concepto purista) de descendencia con modificación que subyace en el centro de la biología evolutiva: un sistema filogenético. Es evidente que la teoría henniguiana estaba embasada sobre el paradigma evolucionista- darwinista. La teoría de C. Darwin (1859) puede ser resumida en términos de tres principios evolutivos inclusivos: (i)- descendencia, (ii) con modificación, y (iii) debido a selección natural. Es una consecuencia de la evolución que las diferencias entre varios organismos tengan surgido a través de cambios en las características (caracteres) en el curso de un proceso histórico. Por lo tanto, no es el grado de semejanza o diferencia entre varios organismos el aspecto de mayor relevancia para la investigación de las relaciones filogenéticas, sino la conexión entre los caracteres coincidentes o divergentes con estados previos (Hennig 1965). Las generalizaciones descriptivas demandan una explicación, y generalizaciones y explicaciones son dos tipos básicos –llamado aquí universal (generalización) e histórica (explicación). Identificar el tipo de generalización descriptiva depende en la teoría general (ej: ley) que pueden ser racionalmente justificada como una explicación (Hull, 1974). La teoría darwiniana pertenece a cosas restrictas en términos espacio-temporales, tales como organismos y especies, los cuales están conectadas por descendencia, y son por lo tanto eventos necesariamente únicos. Según Arnold Kluge (1997), dar una explicación causal a un cierto evento específico significa deducir un enunciado describiendo este evento a partir de dos tipos de premisas: (i) desde ciertas leyes universales y (ii) desde algunos enunciados específicos o singulares, los cuales podemos llamar las condiciones iniciales específicas. Estas premisas son marcadas con L y C, respectivamente, junto con E determinando el evento, o efecto, en un modelo deductivo de explicación. La explicación es alcanzada al deducir efecto a partir de la causa, a la luz de una ley o de una teoría general. Resumiendo:
L, ley(es) explicativa(s) C, condición(es) iniciales especificas (causa) ------explicación E, evento específico (efecto)
Considerando que el objetivo de las investigaciones filogenéticas es descubrir el nivel de relación filogenética entre los miembros de un dado grupo de organismos, los problemas y los métodos de esta área de la biología pueden ser comprendidas sólo si tres preguntas son planteadas y respondidas: ¿que es una relación filogenética, como es establecida, y como es expresado el conocimiento adquirido de
4 manera tal que sea excluida toda forma de confusión o mala interpretación? (Hennig 1965). Alguna relación filogenética de diferente nivel o grado existe entre todos los seres vivos, más allá si conocemos dicho nivel o grado, como el resultado de una investigación en sistemática filogenética, puede ser representado en forma visual (que no conlleve confusión o mala interpretación), a través de un cladograma o bien un árbol de filogenia. Inicialmente en la sistemática filogenética, el término filogenia se utilizaba de modo genérico para designar cualquier diagrama ramificado que refleja relaciones filogenéticas entre especies y/o grupos monofiléticos supra-específicos. En la actualidad existe una distinción entre árbol filogenético y cladograma: cladograma es un dendrograma que expresa relaciones filogenéticas apenas entre taxones terminales (especies o grupos supra-específicos), evidenciadas por estados de características biológicas compartidas (sinapomorfias). En los cladogramas, las conexiones entre las especies son expresiones gráficas indicando historia común; un cladograma nunca incluye indicación de que una determinada especie es ancestral de otra, sino sólo que un grupo de especies debe haber tenido una especie ancestral común exclusiva de ese grupo, conforme lo indica una o más sinapomorfias (Amorim 1997). Un árbol filogenético, en cambio, es un dendograma que expresa relaciones filogenéticas tanto entre taxones terminales, así como entre especies ancestrales y especies descendientes, incluyendo el tiempo absoluto y eventos de especiación. Resulta evidente que los árboles filogenéticos contienen más afirmaciones que los cladogramas y corresponden a hipótesis más complejas.
A BDC
X t2
y t1
z t0
Figura 1. Concepto de Hennig de relación. Por ejemplo, C y D está considerado que están más relacionadas entre sí que con respecto a B porque comparten un ancestro común, x (el cual vivió en el momento t2), el cual no es compartido con B ni otro taxón. Balones negros son los terminales, balones blancos representan ancestrales y la flecha incorpora en concepto de tiempo relativo.
5
- Caracteres y grupos en sistemática filogenética
El primer paso para una comprensión adecuada del método filogenético es una interpretación adecuada del concepto de homología: la consideración de que estructuras diferentes en especies diferentes son homólogas implica que esas especies tienen un ancestro común el cual presentaba esa estructura. La existencia de estructuras homólogas en especies diferentes debe ser entendida como un resultado de copias de copias de la estructura original, existente en la especie ancestral más reciente común a las especies consideradas. En este sentido, resulta indiferente si es una estructura genotípica o de una expresión fenotípica de un genotipo. Willi Hennig innovó una distinción entre dos tipos de estados de caracteres, y esta distinción depende en donde ocurren en la inferencia histórica (filogenética) del grupo. El estado del caracter que se presenta en el morfotipo ancestral es llamado “plesiomórfico” (cercano a la morfología ancestral) y el caracter o estado derivado es llamado “apomórfico” (lejano a la morfología ancestral). Cabe destacar que los términos apomórfico y plesiomórfico son términos relativos a un problema sistemático particular. Los estados de caracteres usados para determinar relaciones genealógicas son los apomórficos, los cuales implican aceptar una teoría de transformación (ausencia Æ presencia, o condición a Æ a’). También fue reconocido un tercer de tipo de estado de caracter, que considera aquellos que son únicos para una especie o grupo de especies; estos son llamados autopomorfias.
ABC AB CD a aa` a` a`` a a`
a
(a) a (b) a
Figura 2. Plesiomorfia y apomorfia son términos relativos. (a) El estado del caracter “a” es plesiomórfico y “a`” es apomórfico. El estado “a” se presume que ha estado presente en el ancestro del cual se originan taxones B y C. (b) El estado del caracter “a’ ” es apomórfico con respecto a “a” pero plesiomórfico con respecto a “a’’ ”. Balones negros son los terminales, balones blancos representan estados ancestrales del carácter.
La teoría henniguiana también plantea tres tipos de grupos (originalmente en relación estricta a los caracteres), reconocidos a partir de las bases ancestro- descendientes:
6 - Un grupo monofilético contiene el ancestro más todos sus descendientes. - Un grupo parafilético es lo que queda luego de que una o mas partes que constituyen un grupo monofilético han sido removidas de un grupo mayor monofilético. Sólo los grupos monofiléticos deben ser reconocidos en una clasificación; los grupos parafiléticos resultan confusos porque no son reales, no poseen existencia histórica y no pueden ser reconocidos por una sola sinapomorfia (en el sentido hennigguiano son definidos por plesiomorfías). - Un grupo polifilético es definido en base del fenómeno de homoplasia, o sea, en caracteres no-homólogos, asumiendo que dicho estado de carácter no se encuentra presente en el ancestro común del grupo. Grupos polifiléticos son reconocidos por la distribución de caracteres homoplásicos en un cladograma o árbol filogenético.
Monofilético Homología = Sinapomorfia A B C D
Parafilético Simplesiomorfia A B C D
Polifilético Homoplasia ABCD
Figura 3. Los tres tipos de grupos reconocidos por Hennig, definidos en términos de distribución de estados de carácter. Grupos monofiléticos son descubiertos a través de homologías (sinapomorfias); grupos parafiléticos son aquellos basados en simplesiomorfias; grupos polifiléticos son considerados en caracteres homoplásicos.
A partir de la premisa que cada grupo irrespectivamente del rango al que pertenece debe estar establecido por la demostración de caracteres derivados (apomorfias), dos grupos monofiléticos los cuales forman un grupo monofilético de rango superior, deben ser llamados grupos-hermanos; los grupos hermanos son descubiertos por la identificación de los estados apomórficos inferidos, originados en su más próximo ancestro y compartido por sus descendientes (Kitching et al. 2000). Estas apomorfias compartidas, o sinapomorfias, pueden ser consideradas como homologías evolutivas, esto es, como estructuras heredadas del ancestro común más reciente; en un modelo deductivo histórico explicativo (Kluge 1999), con el cladograma y las relaciones de ancestralidad común, constituyen la condición inicial específica y la sinapomorfia el evento especifico a ser explicado; resumiendo
7 L, descendencia, con modificación C, cladograma ------explicación E, sinapomorfia
- Cladogramas y árboles filogenéticos
Los diagramas de filogenia, y la ordenación de los nombres de grupos monofiléticos en una secuencia jerárquica, son formas básicas comparables de presentación cuyo contenido es el mismo. Por lo tanto, todo lo que se pueda decir acerca de los métodos de sistemática filogenética se aplica irrespectivamente si los resultados buscados a través del uso de dichos métodos sean expresados sólo como un cladograma, o como un sistema filogenético en el sentido direccionado, en una lista con ordenación jerárquica de los nombres de los grupos monofiléticos. Las consecuencias del surgimiento independientemente de características derivadas para el método filogenético son profundas. Se utiliza el nombre homoplasia (combinación de los términos de origen griego plastós - “modelado o formado”, y homós –“mismo, el mismo”- entendiéndose como condición de estar “modelados de igual manera”) para denominar todos los casos de semejanza adquirida independientemente en la evolución de un grupo. Esa condición derivada final semejante puede surgir de tres maneras distintas: (1) en dos especies diferentes, una misma condición plesiomórfica es alterada de manera idéntica, produciendo en las dos especies una condición final semejante; (2) en dos especies diferentes, dos condiciones plesiomórficas diferentes son alteradas, pero resultan en condiciones finales semejantes. El objetivo del análisis filogenético es crear hipótesis de jerarquías de grupos hermanos y expresar los resultados en términos de diagramas de ramas. Estos diagramas son llamados cladogramas, referencia del hecho que procuran expresar unidades genealógicas o clados; el establecimiento de relaciones de grupos hermanos, y el concepto de dos taxones más relacionados entre sí que a un tercero (enunciado de tres-taxones) es fundamental en cladística. Los grupos hermanos son hipotetizados a través del análisis de caracteres; estos caracteres pueden ser morfológicos, fisiológicos, etológicos, ecológicos o moleculares. El único requerimiento para el análisis cladístico es trasladar lo que observamos en caracteres discretos, esto es, un carácter está presente o ausente; es un color u otro; es pequeño o grande; una base u otra, y así (Kitching et al. 2000). Un cladograma (diagrama con ramas) no implica eje temporal de manera absoluta; sólo es un diagrama que resume un patrón de distribución de caracteres. Los nodos del diagrama denotan una jerarquía de sinapomorfias, no existiendo implicación de ancestro y descendiente. La misma información puede ser anotada en una nota parentética o ilustrada como un diagrama de Venn; la información de los caracteres contenida en un diagrama de Venn es compatible con un número derivado de árboles evolutivos, los cuales incluyen un eje de tiempo absoluto e involucran los conceptos de ancestralidad y descendencia.
8 Algunos de los árboles posibles asumen que uno o más de los taxones son ancestros reales; otros árboles incluyen ancestros hipotéticos. Solo un árbol tiene la misma topología que el cladograma, y este es el que posee en todos los nodos ancestros hipotéticos (los otros árboles poseen uno o mas ancestros reales). La elección entre estos árboles depende de factores distintos a la distribución de caracteres en el material muestreado, el cual es el único contenido empírico. La selección de un árbol en preferencia de cualquier otro depende de cómo consideramos que es la manera más apropiada de relacionar los taxones entre sí (figura 3), como por ejemplo en base a nuestro conocimiento del grupo en estudio (Kitching et al. 2000); el punto de importancia es que los árboles evolutivos son enunciados precisos de una historia singular, pero cuya precisión es ganada a partir del criterio más allá de la distribución de caracteres. Estos árboles no pueden ser justificados en caracteres solamente.
a
A B C D
A B C D ABC,D
C D B b A B C D A D D
x x C
y B C
B z z y
A A
Figura 4. Cladogramas y árboles. a) Cladograma de la figura 1 replanteadas como diagrama de Venn y en notación parentética. b) 4 árboles posibles que pueden derivar del cladograma presente en (a).
La distinción entre cladogramas y árboles evolutivos es importante porque en ocasiones los cladogramas se mencionan como enunciados sobre evolución; para hacer esto, deberíamos estar preparados para aceptar la consideración inadecuada que, por ejemplo, la evolución es parsimoniosa o que la evolución procede exclusivamente por generación de ramas. Muchas de las críticas al cladismo son marcadas al hecho de que estas premisas son no realistas de evolución. De hecho lo son. Pero no son asunciones de la cladística, o de los cladogramas. Son asunciones de los árboles filogenéticos. El cladograma, como distribución de caracteres, es el punto de inicio de futuros análisis. En la práctica, muchos investigadores convierten
9 sus cladogramas en árboles para decir algo acerca de la evolución (Kitching et al. 2000).
PARSIMONIA
Principios básicos
En los inicios de la Sistemática filogenética, Willi Hennig defendía el análisis filogenético en los terrenos del principio auxiliar, el cual plantea que la homología debe ser presumida en ausencia de lo contrario, lo que conlleva al precepto que la homoplasia no debe ser postulada más allá de ser necesaria.
Willi Hennig (1965: 166-167) considera que “…la presencia de caracteres apomórficos en especies diferentes ‘siempre da lugar a la sospecha (!) de un parentesco’ (es decir, a la sospecha de pertenencia de las especies en cuestión a un grupo monofilético) ‘y que no debe aceptarse prematuramente un origen por convergencia’. Este hecho adquiere, entonces, el significado de un verdadero ‘principio auxiliar’, nombre que yo le había dado anteriormente (Hennig, 1953). Se estableció esto en base a la convicción de que ‘la sistemática filogenética dejaría de pisar suelo firme’ si la presencia de caracteres apomorfos en especies diferentes debería ‘ser considerada desde el comienzo como resultado de convergencias (o de paralelismos) y se exigiera en cada caso la comprobación de lo contrario’. Antes bien, todo el paso de las comprobaciones debería aplicarse para demostrar que ‘la posesión común de caracteres apomorfos en casos individuales solo pudiera deberse a convergencias (o paralelismos)’ ”.
Este principio auxiliar es considerado como un caso particular del principio de parsimonia, el cual es un criterio universal para escoger entre hipótesis alternativas de distribución de caracteres, tanto como es un criterio universal para escoger entre hipótesis científicas alternativas, por lo que la parsimonia es simplemente el criterio más robusto para elegir entre diferentes soluciones. No es un enunciado acerca de cómo la evolución puede o puede no haber sucedido (Farris, 1983). Las hipótesis de genealogías más parsimoniosas son aquellas que minimizan el requerimiento de hipótesis ad hoc de homoplasia; en general cladistas de padrón plantean que el uso de la parsimonia es básicamente una extensión de la Navaja de Occam (método científico general), y que los métodos de parsimonia son preferibles porque poseen menos asunciones a priori que los métodos que utilizan modelos evolutivos (Wenzel 2004). La idea es que si la inferencia filogenética consiste en obtener información de los caracteres para aprender acerca de la descendencia con modificación, entonces no deberíamos realizar asunciones acerca del proceso evolutivo, o nuestras conclusiones podrían ser sólo descubrimientos circulares de nuestras asunciones.
10 Consideraciones en estos puntos, es decir críticas a la parsimonia en la sistemática filogenética, incluyen:
1- Que debemos utilizar aquello que conocemos de otros estudios acerca del proceso (o causas) evolutivo para iluminar el estudio de interés, 2- Que la parsimonia en si misma es un modelo.
Acerca del primer punto, no existe relación necesaria entre reconocer patrones en si mismo y comprender los procesos (causas) que llevan a los patrones; por otro lado, no existe beneficio necesario para incorporar teorías de procesos acerca de cómo los nucleótidos deberían cambiar cuando la información puede hablar por si misma, simultáneamente informándonos de cuales cambios ocurrieron y donde; como Platnick (1979) mencionó, podemos organizar un clado llamado “arañas” sin necesidad de conocer la causa de dicho clado. La información es natural, pero las teorías son realizadas por científicos, por lo que la relación entre teoría del proceso y su información es asimétrico: la información no necesita teoría, pero la teoría necesita una cierta cantidad de información para servir como inspiración para la génesis de la teoría, y más para proveer corroboración de la teoría, y mas aún para ejecutar los cálculos para generar valores de interés al momento de comparar con la información natural que se cuenta, por lo que existe un riesgo en incluir una teoría del proceso cuando se utiliza información no familiar, porque si la teoría es errada o inadecuada, entonces una variedad de procesos que se aplican sólo para la teoría pero no para la información puede producir una falsa respuesta para comparar con la información natural. Esto es ciertamente verdadero para los testeos estadísticos o distribución de caracteres, y podría estar contenido también en la reconstrucción filogenética. En resumen, la información puede ser interpretada sin teorías del proceso, y las teorías del proceso pueden fácilmente producir interpretaciones equivocadas. La información no necesita una teoría del proceso, la información simplemente existe. Por el segundo aspecto, no hay una postura que la evolución es parsimoniosa. La parsimonia no es un modelo de evolución tanto como la parsimonia es un modelo de la física, o la química, o geología, etc. Estas asunciones tienen severas implicancias: si la tarea primaria del sistemático es descubrir patrones o dictarlos; todo método que descansa en un modelo supremo de pesaje no se encuentra lejos de la Taxonomía Evolutiva, en donde los procesos evolutivos eran manualmente mezclados con información para generar un árbol evolutivo que incluía tanto el patrón como el proceso (Wenzel 2002).
Parsimonia e inferencia filogenética
Un análisis cladístico ordena sinapomorfias en una estructura jerarquizada, al elegir la disposición de los taxones que conlleva la distribución del mayor número de caracteres de la manera más simple; de existir soluciones alternativas, entonces debemos elegir el patrón más simple (más parsimonioso) de distribución de los caracteres.
11 La distribución de caracteres también puede ser pensada como el número de pasos en un cladograma (longitud de un cladograma), siendo el número de pasos contados como el número de instancias donde un estado de carácter es modificado. La noción de pasos es un poco sutil, debido a que el caracter dado puede aparecer en un punto dado del cladograma y desaparecer de nuevo en otro punto; cada cambio, sea ganancia o perdida, es considerado un paso, y se considera que la solución más parsimoniosa es el cladograma óptimo, y los otros cladogramas (aquellos que requieren más del número mínimo de pasos para explicar la distribución de los caracteres) como subóptimos. Cualquier solución, o soluciones, que arribemos es una sumatoria de las relaciones entre los caracteres. Se especifica que dos caracteres son consistentes (en sentido estricto, “lógicamente consistentes”) entre sí cuando la información que aportan no es conflictiva (por ejemplo, en caso de conflicto definen un agrupamiento diferente para taxones similares) y un carácter resulta congruente con otro cuando la información que aportan es similar a la del otro carácter en análisis. Es posible que existan dos o mas soluciones igualmente parsimoniosas para un conjunto de caracteres; podemos realizar la combinación de aquellos elementos comunes a las diferentes soluciones al construir un árbol resumen (consenso) (Kitching et al. 2000). Aquellos caracteres que nos permiten especificar grupos monofiléticos son sinapomorfias. Grupos monofiléticos son descubiertos por la determinación de sinapomorfias, donde un aspecto relevante resulta la consideración de homología (Patterson 1982, de Pinna 1991) como sinónimos, es decir son igualados. Esto posee importantes consecuencias, ya que implica que las homologías son hipótesis; hipótesis a ser propuestas, testeadas y tal vez falseadas.
A BCD E 5 5
3 2 4 1 CONSISTENTE CONGRUENTE HOMOPLÁSICO O CONFLICTIVO
Figura 5. Relaciones entre caracteres. Caracter 1 es compartido por los taxones A, B y C. Caracter 2 es compartido sólo por D y E, definiendo un grupo diferente del correspondiente al caracter 1. Caracter 3, compartido por B y C define un subgrupo con respecto al grupo definido por el caracter 1. Caracter 4, presente en A, B y C define el mismo grupo que el definido por el caracter 1. Caracter 5, presente en D y E, define un grupo diferente (C+D) el cual no coincide con el grupo inicial planteado por el carácter 1. Con respecto al caracter 1, caracteres 2 y 3 son consistentes, el caracter 4 es congruente y el caracter 5 está en conflicto.
12 De acuerdo a Lakatos (1993: 116), la falsificación debe ser “sofisticada”, en el sentido de que existe una interacción entre evidencia (e) e hipótesis competitivas (h1, h2, h3…..hn) que “lleva al descubrimiento de nuevos hechos”.
Una hipótesis de homología es testeada por la congruencia con otros caracteres, resultando obvio el hecho que estas homologías son continuamente testeadas, por lo que la determinación de homología es el corazón del análisis cladístico. Es importante notar, sin embargo, que no es necesario apelar a ninguna teoría evolutiva específica en orden de determinar una homología; una teoría evolutiva puede ayudar a explicar una homología pero es innecesaria para descubrir homologías. Grupos monofiléticos pueden ser descubiertos a través de homologías, y son el único tipo de grupo que puede ser justificado por límites objetivos. Grupos parafiléticos son aquellos grupos reconocidos por simplesiomorfias, esto es, caracteres aplicables de manera adecuada a un nivel mas inclusivo en su jerarquía. Grupos polifiléticos son reconocidos por la distribución de caracteres homoplásicos. Al resultar analizado el concepto de homología (no referido por Popper), no todas las sinapomorfias putativas pueden ser explicadas en términos de ancestro común. Cuando dos sinapomorfias son incongruentes, ambas no pueden ser interpretadas como homólogas – el estado derivado – compartido de al menos dos de estos grupos debe haberse originado independientemente (Wenzel 2004). De este hecho uno puede derivar un modelo complementario para homoplasia, el cual debe implicar que “descendencia, con modificación”, puede también explicar homoplasia (Kluge 1999):
L, descendencia, con modificación C, cladograma ------explicación de orígenes independientes E, sinapomorfia como homoplasia
Perspectivas filosóficas
Una de las propiedades de la reciente revolución en los métodos filogenéticos es el hecho que la reconstrucción filogenética se encuadren dentro de los principios generales del método científico. Las filogenias que obtenemos en nuestros estudios suelen ser basadas en evidencia empírica y deben representar hipótesis testeables. Debido a que la información es adquirida por observación antes que por experimentación manipulativa, algunos científicos consideran la sistemática apenas como un sistema de descripción directo, pero esto es erróneo. Si nos detenemos en la matriz solamente, podríamos considerar que estamos realizando una descripción directa, pero el proceso de construir un árbol incluye los mismos elementos de las hipótesis clásicas, y sus testeo es realizado en la experimentación manipulativa (Wenzel 2004).
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El testeo de hipótesis es realizado en cada momento que existe un evento de homoplasia en el árbol (por supuesto que la homoplasia es una propiedad de los árboles; las matrices de datos por si mismas no exhiben homoplasias así como no exhiben monofiletismo). Más allá del hecho de que si el árbol más parsimonioso (o conjunto de árboles igualmente más parsimoniosos) posee un soporte débil o fuerte, el árbol más parsimonioso es siempre mejor corroborado que cualquier otro árbol más largo, y por eso es preferido con respecto a cualquier otra hipótesis de parentesco. En palabras de J. Farris (1983), la menor regresión lineal de puntos es preferible sobre otras líneas a través de una nube de puntos, y esta preferencia no se basa en si el parentesco es fuerte o débil. Esto es lo que acontece en los árboles obtenidos de un análisis de parsimonia. En los casos de homoplasia, cualquier homoplasia refuta un cladograma (puede ser lo que K. Popper definía como pensamiento empírico ingenuo, y algo que se debe evitar). El procedimiento adecuado es usar la homoplasia para elegir entre cladogramas alternativos, regresándonos al uso de la parsimonia como un criterio de optimización. La homoplasia sirve para rechazar hipótesis de parentesco que no son las mas parsimoniosas, donde en los cladogramas más parsimoniosos (según Kluge, 1999), los caracteres homoplásicos son considerados que representan enunciados erróneos (estados similares que no son efectivamente homólogos). Regresando a la analogía del análisis de regresión, la menor línea de puntos minimiza la variancia, pero es completamente muda acerca de como la variancia en sí misma es alta o baja. La única conclusión justa es que el “miedo” a la homoplasia per se no es razonable; por lo tanto objeciones a cierta información o al análisis de parsimonia, basado en el análisis de homoplasia, son también irrazonables. Es evidente que las dificultades en obtener filogenias precisas para algunos grupos podrían ser vistas como una limitación de la propuesta henniguiana de construir clasificaciones filogenéticas, una vez que la alteración de una filogenia aceptada para un grupo siempre resulta en algún grado de modificación en la clasificación filogenética de ese mismo grupo. Esa crítica, con todo, posee claras flaquezas: la primera es que la directriz de la sistemática filogenética es representar en las clasificaciones el conocimiento actual de las relaciones filogenéticas en un grupo, ya sean poco (o nada) el conocimiento para el grupo de organismos, o bien una filogenia completamente conocida. No se puede pretender que cualquier sistema de clasificación sea fijo si se fundamenta en un conocimiento que evoluciona continuamente. El principio general de las clasificaciones filogenéticas es que todos los taxones sean monofiléticos; esto confiere un significado muy particular a estas clasificaciones. Más allá que las clases sean parte del universo cognoscitivo, los taxones tanto en el nivel específico así como los niveles supra-específicos corresponden ontológicamente a entidades históricas que son descubiertas, y no inventadas.
14 La tarea del sistemático es obtener cladogramas y con base en ellos, crear un sistema de nombres para los taxones que refleje la filogenia en todos los niveles, donde las normas generales a seguir son (Amorim 1997):
1- Todos los taxones deben corresponder grupos monofiléticos o, si el monofiletismo no está determinado, esa duda debe estar claramente expresada. 2- Todos los niveles de generalidad conocidos del grupo deben ser expresados o deben ser posible de reconocimiento 3- Debe ser posible reconocer las relaciones de grupos hermanos, y 4- Debe ser posible reconocer a que grupo mayor un grupo menor esta subordinado.
15 MEDUSOZOA
Estudios sistemáticos “clásicos” para los miembros del grupo animal Cnidaria contienen una importante variedad de hipótesis acerca de las relaciones genealógicas propuestas entre especies actuales y extintas.
En los últimos 15 años se han realizado en el grupo animal Cnidaria los primeros estudios sistemáticos basados en los principios de la sistemática filogenética moderna, tanto para datos moleculares y morfológicos, iniciando una prolífica etapa de estudios evolutivos. Los resultados más relevantes con respecto a propuestas genealógicas tradicionales es la existencia del filo Cnidaria como grupo monofilético, con los subfilos hermanos Anthozoa (corales y anémonas) y Medusozoa (Petersen 1979) que incluye a las especies de hidras y medusas verdaderas, entre otros. La evidencia molecular sugiere que Anthozoa representa la clase más basal en el filo Cnidaria y el monofiletismo de Medusozoa se sustenta particularmente bien por la posesión de ADN mitocondrial lineal, en contraste con los miembros de Anthozoa y otros metazoarios (Brigde et al. 1992). Los estudios llevados a cabo por Collins (2002) y Marques & Collins (2004) para diferentes taxones miembros de Medusozoa, demuestran a la fecha que Hydrozoa sería un clado monofilético, mientras que grupos como Scyphozoa y Cubozoa poseen resultados diferentes, ya sea parafiletismo o bien politomias basales. En base a datos moleculares se propuso que los escifozoarios están más estrechamente relacionados a las cubomedusas; estos grupos comparten la forma del cuerpo y alguna similitud en los ciclos de vida. Otro punto relevante en los resultados de los análisis es la condición no monofilética de Scyphozoa. Por su parte, la clase Hydrozoa, considerada en el rango de superclase por algunos expertos, presenta politomias basales por falta de resolución de los caracteres en los grupos más inclusivos en ambos estudios y polifiletismo para diversos clados propuestos.
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Figura 6. Congruencia de la hipótesis cladística basada en datos morfológicos (izquierda, Marques & Collins 2004) y la hipótesis basada en datos moleculares (derecha, consenso estricto del árbol más parsimonioso y el árbol obtenido por máxima verosimilitud, Collins (2002)). La marca en Conulatae destaca que el grupo está extinto. Los tres índices de soporte mostrados en los nodos de las hipótesis son: índices bootstrap usando caracteres con pesaje y caracteres sin pesaje, respectivamente, e índices de soporte de Bremer. < indica que el índice bootstrap es menor de 50; modificado de Marques & Collins 2004.
La hipótesis filogenética generada por Marques & Collins (2004) sugiere que Hydrozoa es el grupo hermano (monofilético) de todos los demás miembros de Medusozoa. Dentro de Hydrozoa, Limnomedusae tiene una posición inestable, mientras que los otros grupos de Hydrozoa forman dos clados: Trachylina (Actinulida (Trachymedusae (Narcomedusae, Laingiomedusae))) y el llamado Hydroidolina (Leptothecata (Siphonophorae, Anthoathecata)) el cual se encuentra corroborado por datos moleculares (Collins 2002) y por otra hipótesis basada en caracteres morfológicos (Bouillon & Boero 2000). Por otra parte, el clado propuesto Hydroidomedusa en su sentido original que incluiría todos los Hydrozoa menos Siphonophorae (Bouillon et al. 1992; y ver Marques 2001) o en su forma corregida como un clado conteniendo Limnomedusae, Laingiomedusae, Leptothecata, Siphonophorae y Anthoathecata (Bouillon & Boero 2000) no es corroborado en ninguno de los análisis (Collins 2002, Marques & Collins 2004). Limnomedusae es identificado como el grupo basal de Hydrozoa, Trachylina o Hydroidolina. Estudios moleculares brindan soporte para una de estas hipótesis, aquella donde Limnomedusae es el grupo basal de un clado que contiene también Trachymedusae y Narcomedusae (Collins 2000, 2002). Los demás grupos de Hydrozoa (Actinulida, Trachymedusae, Narcomedusae y Laingiomedusae) forman un clado. No se poseen datos moleculares para Actinulida y Laingiomedusae, pero los estudios moleculares apoyan la hipótesis que Trachymedusae y Narcomedusae están relacionadas estrechamente (Collins 2002). Por esto, los resultados de los análisis moleculares (2002) y morfológicos (Marques & Collins 2004) son consistentes con las propuestas de Bouillon & Boero (2000). Los
17 resultados de Collins (2002) y Marques & Collins (2004) claramente demuestran que el grupo propuesto por Bouillon & Boero (2000, 2004), Hydroidomedusa (incluyendo Limnomedusae, Laingiomedusae, Leptothecata, Siphonophorae, Anthoathecata y la especie Polypodium hydriforme) no aparece en análisis estrictos. Laingiomedusae, por su parte, resulta un grupo problemático debido a la falta de datos de su estado de pólipo, reproducción y moleculares. Medusozoarios no miembros de Hydrozoa son también monofiléticos, pero Scyphozoa, como tradicionalmente es considerado, no lo es; en cambio, tres grupos de Scyphozoa forman un clado (Coronatae (Rhizostomae, Semaeostomeae)) el cual sería hermano al clado ((Stauromedusae, Conulatae) Cubozoa) (Marques & Collins 2004); sin embargo, resultados moleculares (Collins 2002) no lo soportan como clado, aunque no contradice per se su existencia (Collins 2004). Los resultados de Marques & Collins (2004) apoyan la hipótesis de que Conulatae y Stauromedusae se encuentran más relacionados entre si que con respecto a Coronatae, y por lo tanto Scyphozoa, como es tradicionalmente considerado, no es monofilético. Con respecto a Cubozoa, tanto Collins (2002) como Marques & Collins (2004), concluyen que los miembros de Cubozoa y Stauromedusae poseen una relación genealógica muy próxima. Marques & Collins (2004) presentan una nueva clase, Staurozoa (representada por las estauromedusas sésiles y los conulados fósiles) y redefinen Scyphozoa como aquellos grupos que se caracterizan por estrobilación y medusas juveniles distintivas (éfiras); asimismo, para los otros grupos de Scyphozoa (Coronatae, Rhizostomae y Semaostomeae) todas las hipótesis clásicas publicadas sugieren que estos dos últimos grupos se encuentran más relacionados entre que sí que con Coronatae. Reconocer Staurozoa como clase dentro de Cnidaria implica la hipótesis de Staurozoa como clado primario dentro de los cnidarios, siendo discreto históricamente y distintivo en su biología de Anthozoa, Cubozoa, Hydrozoa y Scyphozoa; implica, además, que Cnidaria es más diversa en un nivel básico de lo previamente considerado.
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Tabla 1. Clasificación de Cnidaria propuesta por Marques & Collins (2004) ------Filo Cnidaria Clase Anthozoa Subfilo Medusozoa Clase Staurozoa Orden Stauromedusae Orden Conulatae (extinto) Clase Cubozoa Clase Scyphozoa Orden Coronatae Subclase Discomedusae Orden Semaeostomeae Orden Rhizostomeae Clase Hydrozoa Orden Limnomedusae Subclase Trachylina Orden Actinulida Orden Trachymedusae Orden Narcomedusae Orden Laingiomedusae Subclase Hydroidolina Orden Leptothecata Orden Siphonophorae Orden Anthoathecata ------
A fines descriptivos de las propiedades de los miembros de Medusozoa, se reconoce:
Hydrozoa: caracterizado por la forma de medusa con desarrollo directo o producido por gemación lateral en los pólipos. Scyphozoa: caracterizado por la producción de la medusa por estrobilación de los pólipos.
19 Cubozoa: caracterizado por la producción de la medusa por metamorfosis completa del pólipo. Staurozoa: caracterizado por presencia de medusas bentónicas, ovarios complejos y plánulas no-ciliadas.
HYDROZOA (modificado de Boero & Bouillon 2004)
Evolución y sistemática
Los grupos miembro de Hydrozoa (114 familias) incluyen a los grupos Actinulida (orden con 2 familias), Narcomedusae (orden con tres familias), Trachymedusae (orden con cinco familias); Anthoathecata (orden con dos subórdenes, 49 familias), Laingiomedusae (orden con una familia), Leptothecata (orden con dos subórdenes, 34 familias), Limnomedusae (orden con tres familias), Siphonophorae (orden con 16 familias), y el género Polypodium (una sola especie). Hydrozoa es conocido desde el inicio del estudio moderno de los animales; muchas de las especies son Linneanas y fueron descriptas en el siglo dieciocho. Este grupo tiene representantes desde el Precámbrico (veléllidos). Debido a la rareza de estructuras de esqueleto, el registro fósil es fragmentario.
Características físicas
Los miembros de Actinulidae, Narcomedusae y Trachymedusae sólo presentan medusa (no hay fase de pólipo). El desarrollo es normalmente directo, estando los sexos separados; cada huevo fertilizado genera una larva plánula que desarrolla en una sola medusa, excepto en algunos miembros de Narcomedusae. No se forman medusas a través de un nódulo "medusario" llamado entocodon: la cavidad subumbrelar y el velo son formados por plegamiento y ahondamiento del ectodermo embrionario oral. Los tentáculos marginales primarios siempre se forman antes de la cavidad subumbrelar y el sistema gastrovascular. Los tentáculos marginales no presentan bulbos tentaculares. Los órganos sensoriales están en forma de estatocistos ecto-endodérmicos, con un eje endodérmico, creciendo fuera del canal circular, con células sensoriales caracterizadas por numerosas raicillas carentes de kinocilium, rodeado por estereocilias, inervadas por el anillo nervioso superior; los estatolitos son de origen endodérmico. La reproducción asexual sólo está presente en las larvas de tipo actínula y adultos de Narcomedusae. Los Actinulidae son todos miembros de la fauna intersticial; se parecen a larvas actínula, y sus estatocistos son las características más distintivas que ofrecen estas medusas altamente especializadas.
20 Por otra parte, las especies de Narcomedusae tienen una exumbrela chata con el margen lobulado, cortado por ranuras profundas y normalmente sin canales radiales llevan los gametos en el manubrio ancho. Sus fases intermedias tentaculadas post- embrionarias son las medusas juveniles y se llaman inadecuadamente "actínulas", como los pólipos juveniles de algunas especies de Anthoathecata. Los miembros de Trachymedusae poseen una forma de paraguas acampanado, con canales redondos y radiales. Los gametos maduran en los canales radiales. El manubrio está a menudo en un pedúnculo. El estado hidroide de la subclase Laingiomedusae es desconocido. Las medusas tienen forma de paraguas casi hemisférico, con el margen lobulado, dividido por ranuras o estructuras similares. Los canales radiales son cuatro, pero no siendo el típico canal circular, sino que presentan un cordón sólido de células endodérmicas alrededor del margen de la medusa. Los tentáculos son sólidos, insertados sobre el margen exumbrelar, en la exumbrela. El manubrio es simple, cuadrangular, tubular, o cónico; la apertura de la boca es simple, cuadrangular a redonda; los gametos están en cuatro agrupamientos en el manubrio, o como revestimiento epidérmico de las cavidades (con forma de bolsillo) interradiales del manubrio.
Figura 7. Anatomía básica de Hydrozoa. A- Colonia; B- Medusa. Ilustración: Patricia Ferrer, modificado del Grzimek’s Animal Life Encyclopedia (2004).
21 Los órdenes Limnomedusae, Laingiomedusae, Leptothecata, Siphonophorae y Anthoathecata presentan una sucesión de tres fases durante el desarrollo indirecto, siendo la plánula una gástrula con motilidad por cilios. Los hidroides bentónicos (unos pocos grupos poseen hidroides flotantes) desarrollados pueden ser solitarios, pero generalmente forman colonias modulares por gemación simple. Los pólipos pueden especializarse para diferentes funciones (dactilozoides defensivos, gonozoides reproductivos, gastrozoides nutritivos, etc.); éstos generan, por gemación asexual, hidromedusas nadadoras planctónicas solitarias, que representan el adulto sexual. Los órganos sensoriales de las formas pelágicas, cuando están presentes, son ocelos (Anthoathecata, algunos Leptothecata), o estatocistos (Leptothecata, Limnomedusae) y a veces cordyli de función desconocida también están presentes (Leptothecata); los sifonóforos por su parte, no tienen ningún órgano del sentido visible, y forman colonias polimórficas pelágicas. Las medusas están reducidas a menudo en esporosacos (gonóforos fijos), por lo que los hidroides, por paedomorfosis, secundariamente resultan las fases sexuales. La medusa brota vía un nódulo "medusario" o entocodon, formando una cavidad subumbrelar alineada por células del músculo estriado; los tentáculos marginales primarios siempre se desarrollan luego de la cavidad subumbelar y el sistema gastrovascular. Las fases embrionarias y larvales, la plánula y el pólipo, son típicamente diploblásticas; las fases sexuales adultas (hidromedusa) desarrollan un nódulo medusario característico. Sus ciclos de vida son frecuentemente estacionales y la fase del hidroide puede desarrollar varios tipos de estados latentes (frústulas, propágulos, quistes, un sistema de tipo estolón) para superar las condiciones ecológicas desfavorables. Los hidroides de la subclase Anthoathecata no tienen una vaina de protección de perisarco alrededor de los hidrantes, y se dicen que son atecados normalmente coloniales (el hidroide más famoso, Hydra, es un antoatecado pedomórfico solitario). Las colonias pueden ser monomórficas o polimórficas, mientras la estructura de los tentáculos son de dos tipos: los tentáculos filiformes, que no presentan agregaciones particulares de cnidocistos, mientras que los tentáculos del grupo Capitata tienen cnidocistos agrupados. Las medusas son típicamente de forma de campanilla; sus gónadas (agregados de gametos normalmente llamados gónadas) se ubican en el manubrio, a veces extendiéndose adelante, en la región proximal de los canales radiales. Sus órganos sensoriales marginales, si están presentes, son ocelos; los tentáculos marginales son periféricos huecos o sólidos, normalmente con bulbos tentaculares y la reproducción sexual ocurre a través de una plánula compleja. Los pólipos de la subclase Leptothecata son tecados: todas las partes de las colonias típicamente están protegidas por una estructura (perisarco) de quitina. El hidrante es protegido por una hidroteca, el nematóforo por una nematoteca, y el gonóforo por una gonoteca. Raramente, los hidrantes están desnudos. Las medusas son típicamente de forma de paraguas hemisférico o chato; las masas de gametos se confinan a los canales radiales, extendiéndose excepcionalmente hacia la parte proximal del manubrio; las especies que poseen órganos sensoriales son estatocistos ectodérmicos marginales, raramente cordyli y de vez en cuando los ocelos son adaxiales. Los tentáculos marginales son periféricos y huecos (excepto
22 en Obelia), con bulbos tentaculares; la reproducción sexual ocurre a través de una plánula compleja. Los hidroides del grupo Limnomedusae son muy simples; solitarios o coloniales; pequeños, sésiles; con o sin tentáculos; a menudo parecidos a la estructura de la plánula y con estructuras de gemación parecidos a la plánula o frústulas; no hay ninguna teca en el perisarco, pero los quistes y estolones son cubiertos por quitina. Las medusas normalmente tienen masas de gametas a lo largo de los canales radiales o, excepcionalmente, en el manubrio. Los tentáculos marginales son periféricos, huecos, sin un verdadero bulbo basal; su base normalmente posee un centro de endodermo empotrado en la mesoglea. Los órganos sensoriales marginales son estatocistos encerrados en tejido ecto-endodérmico, incluidos en la mesoglea cerca del canal del anillo o en el velo. Excepcionalmente, las medusas pueden ser formas medusoideas reducidas. La reproducción sexual genera una plánula simple, sin células glandulares embrionarias. La subclase Siphonophorae generalmente comprende especies flotantes pelágicas, natatorias, o especies flotantes de colonias modulares altamente polimórficas de zooides polipoides y medusoides atadas a un tallo o estolones, apoyados por un sistema natatorio y/o flotante o nectosoma (pneumatóforos y/o nectóforos). La especie Polypodium hydriforme Ussow, 1885, es el único miembro de Metazoa conocido adaptado al parasitismo intracelular. Polypodium tiene un ciclo de vida único, con una sucesión de fase libre y una fase intracelular; la fase parasitaria ocurre en huevos de especies Acipenseridae y Polyodontidae. La fase parasitaria más temprana conocida es una célula binucleada observada en los oocitos previtelogénicos del pez, y la fase libre (medusa) representa probablemente la fase sexual, por lo que las fases parasitarias se consideran como el polipoide.
Distribución
Los miembros de Hydrozoa son cosmopolitas, y pueden ser encontrados en todas las masas de agua del mundo, tanto marinas como de agua dulce.
Hábitat
Las medusas de Hydrozoa son en su gran mayoría planctónicas; su ocurrencia es de tipo estacional y pueden estar presentes en enjambres, transportados por las corrientes. Algunas medusas, sin embargo, pueden ser bentónicas. Los estados de pólipos son usualmente bentónicos, y viven pegados al fondo, aunque existen especies planctónicas, tales como la reconocida Velella velella. Hydrozoa se encuentra en todos los hábitats acuáticos, desde cavernas submarinas costeras hasta fosas de regiones de gran profundidad, desde lagos y estanques a costas rocosas e intersticios de arena. Los estadios de pólipo de muchas especies viven exclusivamente en ciertos tipos de substratos, usualmente otros organismos tales como peces, tunicados, poliquetos, briozoos, moluscos, crustáceos, esponjas, otros cnidarios, algas, etc., con los cuales tienen relaciones de
23 tipo simbiótico, ya sea desde formas de simple epibiosis hasta comensalismo, mutualismo, y parasitismo. La mayoría de las especies son carnívoras, usando su hábitat para adquirir posiciones favorables para capturar su presa. Los estadios planctónicos son transportados por las corrientes, pero también pueden moverse dentro de las masas de agua, buscando comida. La plánula decide la posición de las formas bentónicas, al momento de su establecimiento; las colonias son posicionadas en locaciones que aseguran un acceso de agua fresca alrededor de los hidrantes, incrementando el transporte de presas potenciales.
Comportamiento
Básicamente individuales, las medusas pueden ser reunidas por los vientos y corrientes para formar enjambres extensos, aunque no se conoce si poseen algún tipo de interacción social cuando se encuentran en contacto próximo. Las colonias de Hydrozoa, especialmente las polimórficas, han sido comparadas a superorganismos debido a la complejidad de funciones que realizan los diferentes tipos de zooides. Los zooides de una colonia usualmente derivan de una plánula única, resultando los miembros generados (clones) interconectados. Sin embargo, es posible que diferentes colonias surjan de sus tejidos o que el agregado de diferentes plánulas forme colonias coalescentes. En estos casos, diferentes individuos pueden hallarse en una conexión tan próxima que resulten en un individuo único, siendo posiblemente una de las formas mas extremas de organización social. La mayoría de las especies poseen sexos separados; la fertilización es usualmente interna, sin copulación. Los machos liberan el esperma en el agua, el cual nada activamente hacia los huevos que están todavía en el cuerpo materno (tanto en una medusa o en una colonia de pólipos). Los Hydrozoa son los primeros animales en donde se demuestra la existencia de la capacidad de atracción en el esperma, con atracción especie-específica de los espermas hacia los huevos. Para muchas especies de medusas, tanto los machos como las hembras engendran en el agua donde ocurre la fertilización, y también en este caso, los factores de atracción del esperma facilitan el encuentro de las gametas. Los miembros de la misma colonia realizan comportamientos coordinados que seguramente involucran comunicación. En Thecocodium brieni, por ejemplo, los dactilozoides capturan la presa con los tentáculos, mientras que los gastrozoides perciben que una presa está disponible y se extienden hacia los dactilozoides, despegando la presa de los tentáculos e ingiriéndola. Esta división del trabajo, que implica una gran coordinación, es frecuente en colonias polimórficas. Los animales planctónicos no muestran territorialidad particular, siendo por definición transportados por las corrientes aunque es probable que las medusas prevengan activamente estar en contacto demasiado cercano, para evitar interacciones competitivas mientras buscan alimento. La territorialidad es muy fuerte en los organismos sésiles, donde la competencia por la ocupación de espacio es muy evidente. La disposición de los dactilozoides en el borde de muchas colonias está relacionada con la defensa de territorio por el
24 crecimiento de animales próximos. Los pólipos alimenticios pueden comer larvas de establecimiento de especies potencialmente competitivas, previniendo la competencia por espacio. Cuando se encuentran hambrientos, tanto pólipos como medusas están siempre en búsqueda de alimento, con patrones de actividad especie-específicos, mientras que en caso de poseer el celenteron lleno de alimento, los tentáculos se presentan generalmente contraídos y no capturan presas, mostrándose algún tipo de control en la descarga de los cnidocistos.
Biología reproductiva
Nada es conocido acerca de cortejos y apareamiento. Los huevos son generados en masas por medusas hembras, o bien en gonóforos femeninos. De acuerdo a la especie, los huevos producidos pueden ser muchos y pequeños, o grandes y pocos (inclusive sólo uno por gonóforo). En las especies de Actinulidae, Narcomedusae y Trachymedusae, sin estadios de pólipo, es poca o nula la reproducción asexual en la medusa larval (conocida como actínula en Narcomedusae) de manera que cada evento de fertilización genera una o pocas medusas adultas. En los grupos Limnomedusae, Laingiomedusae, Leptothecata, Siphonophorae y Anthoathecata, la difundida reproducción asexual del pólipo puede ser considerada como una amplificación larval. Cada evento de fertilización, genera una única plánula que produce una colonia de pólipos que, en su momento, producirá muchas medusas adultas; la llamada larva plánula es simplemente una gástrula, por lo que resulta más un embrión que una larva. Una vez que las gametas son liberadas, antes o rápidamente después de la fertilización el desarrollo embrionario se produce fuera del cuerpo maternal. La plánula puede ser sólida (estereogástrula) o hueca (celoblástula); usualmente las especies con medusas en sus ciclos de vida poseen plánulas huecas que viven parte de sus vidas en una columna de agua, nadando con cilios o flagelos para alcanzar regiones de asentamiento. Las especies con medusas suprimidas frecuentemente producen plánulas sólidas que caen en el fondo y se asientan cerca de la colonia parental; los adultos, por definición, son las formas reproductivas sexuales en su ciclo de vida: si una medusa esta presente, es el adulto en el ciclo de vida. El estado de pólipo, en este contexto, es una larva especializada (y perenne) que produce un gran número de adultos a lo largo de su vida. En muchas especies, sin embargo, el estado de medusa puede estar reducido o inclusive suprimido, de manera que la larva, por pedomorfosis, resulta la forma sexualmente madura del ciclo de vida (Hydroidolina es el grupo más pedomórfico del reino animal).
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CUBOZOA (modificado de Matsumoto 2004)
Evolución y sistemática
Las cubomedusas fueron originalmente colocadas dentro de la clase Scyphozoa, pero recientes estudios apoyan a Cubozoa en un nivel de clase (recordando que el rango de taxón es una decisión meramente arbitraria y carente de significado biológico). Hay un orden, Cubomedusae, con dos familias, Chirodropidae y Carybdeidae; existe una sola especie fósil, Anthracomedusa turnbulli, la cual se encontró cerca de Chicago, Illinois, Estados Unidos. Este fósil fecha del período Pennsilvánico (aprox. 323-290 millones años de antigüedad), y con su forma cuadrada y tentáculos en racimos, era probablemente miembro de la familia Chirodropidae.
Características físicas
La característica clásica de las cubomedusas es su forma cuadrada. El manubrio y la boca se localizan dentro de la campana, y lóbulos presentes en el borde la campana forman un pliegue circular parecido al velo (velario), pero del cual solo participa en la formación la subumbrela. Los tentáculos se encuentran unidos a los pedalios, extensiones musculares de la campana. Chirodrópidos poseen múltiples tentáculos unidos a cada pedalio; los carybdeidos, por su parte, tienen sólo un tentáculo por cada pedalio. Dispuestos entre los pedalios se encuentran las únicas estructuras sensoriales, conocidas como ropalio, que presentan un estatocisto y seis ojos, de los cuales cuatro son ojos simples, y dos ojos relativamente complejos compuestos de una córnea epidérmica, una lente celular esférica, y una retina vertical, con presencia de opsinas sensibles a la luz azul, verde y ultravioleta en los ojos pequeños y grandes. El sistema nervioso de las cubomedusas es complejo comparado al de otros cnidarios; una red difusa de nervios sinápticos a lo largo de la región de la campana se conecta a un anillo de nervios subumbrelares y procesos nerviosos se extienden de este anillo en las bases del ropalio. El procesamiento de imágenes visuales probablemente ocurre en este anillo nervioso.
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Figura 8. Anatomía básica de Cubomedusae. Ilustración: Christina St. Clair, modificado del Grzimek’s Animal Life Encyclopedia (2004).
Distribución
Cubozoos pueden encontrarse en la mayoría de las aguas tropicales y subtropicales –Carybdea marsupialis y Carybdea rastoni se han encontrado también en aguas templadas. Es probable que los documentos de distribución estén incompletos ya que los cuerpos transparentes de estas medusas los hace muy difíciles de localizar a pesar de su distribución costera y poco profunda. Son predadores importantes en el ecosistema costero, alimentándose principalmente de peces y crustáceos.
Hábitat
El hábitat preferido de las cubomedusas parece estar por encima del substrato arenoso, localizándose durante el día justo por encima del fondo y acercándose, por la noche, a la superficie. La observación del campo es sumamente difícil, ya que las medusas reaccionan a la presencia de buzos escapándose rápidamente. Carybdea sivickisi posee almohadillas adhesivas en la exumbrela, lo que le permite adherirse a varios substratos en el suelo.
Comportamiento
27 Presentan la conducta más compleja dentro de los Cnidaria. Son nadadores activos, capaces de moverse de 3 a 6 metros por minuto; Son fototácticos (se mueven hacia la luz) y activos durante el día y la noche, aunque sólo pueden alimentarse durante la noche u horas previas al amanecer por lo que se considera que la visión tiene claramente un papel relevante en la alimentación y reproducción. Una característica, la forma de composición de las imágenes captadas por los ojos, es difícil de estudiar en el medio ambiente o el laboratorio ya que reaccionan a la presencia de sus observadores humanos alejándose rápidamente. La conducta de alimentación varía ligeramente entre las especies. La presa se captura con los tentáculos y se acerca hacia el pedalio, acortando el tentáculo. La medusa entonces puede mantenerse derecha en el agua o se vuelve al revés. El pedalio con la presa se dobla hacia el centro (hacia el manubrio), y la presa es ingerida.
Biología reproductiva
Poco es conocido sobre la biología reproductiva de los miembros de Cubozoa. El ciclo de vida incluye una fase béntica, donde el pólipo puede reproducirse asexualmente por gemación, y una fase pelàgica, la medusa. Los huevos y el esperma se fusionan para formar una larva ciliada (plánula) que se establece en el fondo y se convierte en pólipo. A diferencia de otros escifozoarios, los pólipos de Cubozoa no sufren estrobilación (reproducción asexual por la división apical del cuerpo en segmentos); el pólipo entero se vuelve la medusa juvenil. Carybdea sivickisi posee espermatóforos, proponiéndose que la hembra de C. sivickisi puede colectar cordones de esperma producidos por los machos. Otras cubomedusas pueden tener también fertilización interior, pero la mayoría libera sus gametas.
STAUROZOA
Evolución y sistemática
El grupo animal Stauromedusae posee aproximadamente 50 especies conocidas, distribuidas en 14 géneros y cuatro familias (Cleistocarpidae, Eleutherocarpidae, Kyopodidae y Tesseranthidae) donde la mayoría poseen menos de 5 centímetro de tamaño. De manera tradicional, Stauromedusae era considerada como miembro de Scyphozoa (en general como taxa orden). En la actualidad, sin embargo, resultados moleculares (Collins 2002) no soportan a Scyphozoa como clado monofilético en la visión tradicional, y Marques & Collins (2004) proponen en base a su estudio cladístico morfológico que Stauromedusae y el grupo extinto Conulatae forman un grupo propio (clase Staurozoa), resultando dicho grupo hermano de Cubomedusae. Según Marques & Collins (2004), Conulatae comprende el género fósil Conchopeltis y los mejor conocidos conulariideos, es un grupo extinto de animales
28 con dermatoesqueletos cónicos (cuadrados en corte transversal). Se ha pensado a menudo como uno de los primeros miembros de Cnidaria (Werner 1973; Salvini- Plawen 1978; Bouillon 1981; Nielsen 2001). Específicamente, Conulatae se ha comparado a Coronatae porque las pruebas de apatita de conulados y la teca quitinosa de pólipos de los miembros de Coronatae está similarmente compuesta de 2 capas, una capa exterior delgada y una capa interna relativamente más espesa (Werner 1966). Es más, las estructuras en las líneas medias y esquinas de los conulados recuerdan a las proyecciones en forma de espina en el interradii y perradii de los pólipos de Coronatae (Werner 1966; Van Iten et al. 1996). Por otro lado, el septo mineralizado del conulado Eoconularia loculata exhibe una ontogenia inferida como casi idéntica a la observada en los miembros de Stauromedusae en vías de desarrollo (Kiderlen 1937; Jerre 1994; Wade 1994). El análisis de Marques & Collins (2004) apoya la hipótesis que relaciona Conulatae y Stauromedusae más estrechamente entre sí que con respecto a Coronatae, por lo que Scyphozoa no sería monofilético. Collins (2002) al desarrollar un estudio molecular no posee la capacidad de analizar las relaciones genealógicas de Conulatae con los demás cnidarios, aunque sus resultados no contradicen per se la existencia de Staurozoa (Marques & Collins 2004, Collins 2004).
Características físicas
La biología de Stauromedusae posee propiedades distintivas, como las ultra estructuras de los ovarios y ocelos los cuales son muy diferentes de lo presentes en Coronatae, Semaeostomeae y Rhizostomeae (Eckelberger et al. 1993, Blumer et al. 1995). De hecho, los ovarios de las estauromedusas son más complejos que los de cualquier otro grupo de cnidarios. Los ciclos de vida de las especies del orden Stauromedusae poseen sólo una fase béntica (medusa), las cuales se adhieren a algas marinas o césped marino por un pedúnculo aboral. La plánulas de Stauromedusae son, al contrario de los demás cnidarios, no-ciliadas y con un número invariante de células endodérmicas adheridas sin división (Otto 1976 y 1978). Estas células son contráctiles y permiten el desplazamiento de la plánula (arrastrándose de forma análoga a los gusanos). Después de arrastrarse durante varios días, la larva se establece y desarrolla un pólipo juvenil. Luego, el fin oral del pólipo metamorfosea y asume varios caracteres que se parecen a los presentes en las medusas adultas de Cubozoa y Scyphozoa, incluso las estructuras huecas de origen tentacular (rhopalioideos), músculos circulares en corona, gónadas y ocelos (Kikinger & Salvini-Plawen 1995). Al mismo tiempo, la porción aboral del adulto retiene los caracteres de un polipoide como los septos gástricos y los músculos longitudinales Collins (2004). El cuerpo principal (cáliz), con forma de embudo o copa, crece hasta 3 centímetros de ancho con ocho brazos, cada uno llevando un racimo de hasta 100 tentáculos cortos con formas de clava. En el género Haliclystus, entre cada brazo hay un disco adhesivo por que el animal puede sujetarse para moverse. Las gónadas se extienden debajo de los brazos y la boca se localiza en la parte central interior del cuerpo en forma de chimenea. La coloración de las especies varía; pueden ser con sombras de verde, marrón, amarillo, o castaño y a menudo coincide
29 con el color del substrato, haciendo la medusa de éstos difícil de ver. Esta forma adulta es considerada el estado de medusa, y no hay fase nadadora (Purcell 2004).
Figura 9 - Anatomía de Stauromedusae (Mayer 1910), a partir de Collins (2004).
Hábitat La mayoría de los miembros de Stauromedusae se encuentran en aguas frías, a lo largo de las líneas costeras subpolares en otoño siendo comunes a lo largo de las costas rocosas tranquilas en Europa, América del Norte y Asia. Algunos también se han encontrado en regiones templadas en el hemisferio del sur. La mayoría de las especies de Stauromedusae se encuentran en regiones intertidales bajas hasta profundidades subtidales poco profundas, normalmente unidas a plantas del bentos (algas o césped marino). Una especie es conocida como miembro de las comunidades de las fosas hidrotérmicas profundas (Purcell 2004).
Comportamiento
Debido a que los miembros de Stauromedusae no nadan, tienen un limitado potencial de dispersión; la conducta del adulto generalmente es sencilla. Las especies de Stauromedusae se mueven alrededor en el substrato dando "salto mortales", qué logran alternando la adherencia del disco basal con la adherencia de
30 los tentáculos o almohadillas adhesivas localizadas entre los tentáculos de algunos géneros (Purcell 2004). Rara vez se han visto estauromedusas flotando libremente en el agua, después de haberse soltado al sustrato. Las larvas de Stauromedusae son plánulas alargadas simples; Estas larvas diminutas se mueven arrastrándose en una forma similar a los gusanos, por lo que poseen una menor habilidad de dispersión que la plánula planctónica típica, la cual nada utilizando sus cilios (Mills 2005). La conducta más notable de la medusa es la pulsación rítmica de la campana natatoria, que los mueve a través del agua para su alimentación y respiración. Las pulsaciones de nado son coordinadas por los centros nerviosos, localizados alrededor del borde de la campanilla. Al margen de la campanilla hay también estructuras sensoriales (ropalios con ocelos y estatocistos) que permiten reconocer la presencia de la luz y determinar su orientación en la columna de agua (Mills 2005).
Biología reproductiva
La reproducción sexual consiste en la liberación de cordones de esperma en el agua por los machos y se toman por las hembras durante la alimentación. Las gónadas se extienden debajo de los brazos y rodean la cavidad gastrovascular, por lo que los huevos pueden fertilizarse en el ovario o después de que se sueltan en la cavidad gastrovascular (Collins 2004). En la mayoría de las especies los huevos fertilizados desarrollan en larvas no-ciliadas pequeñas (plánulas) que se “arrastran” a un substrato conveniente, se adhieren, y desarrollan en pólipos. Los miembros de Stauromedusae se reproducen asexualmente brotando nuevos pólipos o quistes del cuerpo o del pie.
SCYPHOZOA (modificado de Purcell 2004)
Evolución y sistemática
La clase Scyphozoa incluye tres órdenes, Coronatae, Semaeostomeae y Rhizostomeae incluyendo 16 familias, 52 géneros y aproximadamente 150 especies. Las formas de pólipo y medusa ocurren en la mayoría de las especies, siendo la fase de medusa la más grande y prominente. El registro fósil de Scyphozoa es pobre. Impresiones radiales simétricas se han interpretado como formas primitivas de escifomedusas. Otro grupo fósil de que puede representar formas antiguas de pólipos son los conulados -aunque la propuesta cladística de Marques & Collins (2004) posee una diferente hipótesis de su genealogía-, los cuales eran similares a los pólipos modernos de Coronatae: estaban presentes desde el Proterozóico al Triásico tardío en el registro fósil conocido. Byroniidae, el orden extinto de Scyphozoa, se ubica desde el Cámbrico Superior al Ordovícico.
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Características físicas
La mayoría de las especies de la clase Scyphozoa tienen dos formas de vida: el estado predominante medusa (con campanilla hasta más de 2 metros de diámetro) y la fase pólipo, en general pequeña, discreta (menos de 4 milímetros de largo). La medusa presenta un cuerpo con forma de plato-paraguas, estando formado por dos capas epiteliales (la epidermis y gastrodermis) separadas por una capa espesa de mesoglea, un tejido conjuntivo gelatinoso que contiene las células; carecen de velo como el presente en Cubozoa e Hydrozoa y cerca del borde de la campanilla, en los órdenes Coronatae y Semaeostomeae se encuentran tentáculos utilizados para la alimentación. Los tentáculos tienen organelas microscópicas intracelulares (nematocistos) que liberan un hilo hueco de una estructura con forma de cápsula, inyectando una toxina o bien enredando presas pequeñas (el zooplancton, huevos de peces y larvas, o bien otras especies gelatinosas). En Semaeostomeae y Rhizostomeae, hay cuatro brazos en la boca (orales) en la parte inferior (cóncava) de la campanilla, que también poseen nematocistos con aguijones (utilizados para la captura de presas). Los pólipos, llamados escifistoma, pueden formar colonias de individuos por gemación o, en el caso de los pólipos de Coronatae, verdaderas colonias que tienen una vaina quitinosa. Los pólipos tienen forma de taza, adheridas al substrato por un pie (disco basal), y con la boca central rodeada por un solo anillo de tentáculos con nematocistos.
Figura 10. Anatomía básica de Scyphozoa. A- Medusa; B- Pólipo. Ilustración: Patricia Ferrer, modificado del Grzimek’s Animal Life Encyclopedia (2004).
32 La medusa en el orden Coronatae tiene una ranura profunda alrededor de la superficie aboral que separa la campanilla natatoria en un disco central y una zona periférica que presenta rebordes; los tentáculos surgen entre los rebordes en la región superior de la campanilla; dependiendo de las especies hay entre ocho y 36 tentáculos. La boca abre en un estómago grande con forma de bolsa en la parte inferior de la campanilla. La mayoría de las especies viven en las profundidades siendo las medusas pequeñas, con menos de 5 centímetros de diámetro o altura de la campanilla, con algunas especies alcanzando 15 centímetros de diámetro. Los pólipos conocidos son coloniales y cubiertos con una vaina de quitina. Las medusas adultas en el orden Semaeostomeae generalmente son grandes, algunas con más de 2 metros de diámetro, pero normalmente menores de 30 centímetros. La campanilla natatoria es llana a hemisférica en su forma, y el borde de la campanilla puede tener rebordes o ser liso; de ocho a centenares de tentáculos están presentes en el margen de la campanilla o debajo de ésa. En el centro del lado cóncavo de la campanilla existen cuatro brazos orales que llevan a la boca central. La campanilla posee rangos de color que van de translúcido a opaco y de blanco a la naranja oscura, y puede tener rayas radiales en algunas especies. La fase del pólipo es pequeña y puede formar grupos de individuos por gemación. Las medusas de Rhizostomeae también son grandes, con más de 2 metros en el diámetro. La campanilla natatoria es hemisférica y muy firme en textura, sin tentáculos en el borde. El margen de la campanilla tiene ocho o 16 rebordes; los cuatro brazos orales de la medusa están fusionados y normalmente con muchos tentáculos diminutos y bocas pequeñas para la alimentación. Puede haber proyecciones en forma de clava de los brazos orales. Las medusas son de tipo translúcidas a opacas, con colores que van del blanco al rojo oscuro; algunos tienen patrones que incluyen rayas y manchas. La fase del pólipo es pequeña y pueden formar racimos de individuos por gemación.
Distribución Escifozoarios se encuentran en todas las aguas marinas. Las medusas de Coronatae generalmente se encuentran a grandes profundidades, con temperaturas de 5-8°C, pero unas pocas especies se observan en aguas subtropicales y tropicales. Las especies de Semaeostomeae son las medusas grandes, predominantes en océanos templados y polares, y con presencia también en aguas subtropicales y tropicales; los escifistomas de esas especies sólo son activos en los meses calurosos, donde pueden tomar una condición de tipo inactiva (durmiente) y sobrevivir a través de los meses invernales. Las especies de Rhizostomeae viven principalmente en las aguas tropicales, con sólo unas especies encontradas en las regiones subtropicales o templadas. Las medusas de poca profundidad son observadas desde el final de la primavera al otoño temprano en aguas superficiales de climas templados y mares polares mientras que en las aguas tropicales, las especies de profundidad (las medusas) pueden estar presentes todo el año.
Hábitat
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Se encuentran en regiones de aguas de superficie hasta regiones de profundidades abisales, y los pólipos se adhieren a superficies duras, como conchas y piedras a varias profundidades, dependiendo de las especies. Las medusas de Coronatae típicamente se ubican a profundidades mesopelágicas (500-1.500 metros), pero unas pocas se encuentran casi en la superficie. Medusas de Semaeostomeae y Rhizostomeae ocurren más abundantemente cerca de la costa (150 metros), dónde los suministros de comida son mayores. Sus pólipos también se encuentran a profundidades poco profundas, a menudo en la parte inferior de estructuras, fuera de la luz directa. Algunas especies de Semaeostomeae se hallan en las grandes profundidades, y sus pólipos generalmente no son conocidos. No hay ninguna especie de Rhizostomeae de vida profunda conocida.
Comportamiento
La conducta de la medusa generalmente es sencilla; las medusas de Semaeostomeae y de Rhizostomeae nadan continuamente. Esto es importante para el intercambio de oxígeno que ocurre encima de la superficie del cuerpo y para la alimentación. La natación de varias especies está orientada contra el flujo en la columna de agua; el resultado es que nadan en la misma dirección y pueden concentrarse en las convergencias. Algunas especies suben por la noche en la columna de agua, y bajan en el día (migración vertical). El escifistoma (pólipo) puede moverse a través del llamado pie y sus extensiones. Se alimentan cuando la presa hace contacto con sus tentáculos, que tienen nematocistos que actúan paralizando o matando la presa, mientras que otros los enredan; la medusa contrae los tentáculos y acerca la presa a sus bocas.
Biología reproductiva
Generalmente se reproducen tanto asexualmente como sexualmente. Los pólipos se reproducen asexualmente brotando nuevos pólipos o quistes del cuerpo o del pie. Los pólipos también producen medusas por un proceso asexual llamado estrobilación. La estrobilación tiene lugar típicamente en un cierto momento del año y se activa por factores medioambientales que difieren en las especies; estos factores incluyen subida (primavera) o caída (otoño) de temperaturas o cambios en los niveles de luz. Durante la estrobilación, el pólipo sufre la segmentación oral transversa, formando de una a varias medusas pequeñas juveniles, llamadas éfiras. El proceso requiere de días a semanas, dependiendo de la temperatura. Las éfiras totalmente formadas se liberan por pulsaciones natatorias para luego crecer en la forma de medusa sexualmente madura al cabo de un mes o más. Las medusas de la mayoría de las especies tienen los sexos separados, pero unas pocas especies son hermafroditas secuenciales. Los machos y hembras son indistinguibles excepto por examen de gónadas. Ninguna unión o cópula ocurre: se sueltan los cordones de esperma en el agua por los machos y se toman por las hembras
34 durante la alimentación. Las gónadas rodean la cavidad gastrovascular, y los huevos pueden fertilizarse en el ovario o después de que se sueltan en la cavidad gastrovascular. En la mayoría de las especies los huevos fertilizados desarrollan en larvas ciliadas pequeñas (plánulas) que nadan a un substrato conveniente, se adhieren, y desarrollan en pólipos; en algunas especies el proceso es distinto: las plánulas se retienen por la hembra antes del asentamiento y otras no poseen estado de pólipo.
35 2. HIPÓTESIS
• Existe variabilidad en caracteres moleculares y morfológicos de los taxones (especies) considerados. • En caso de que la información utilizada y los análisis filogenéticos (criterio de parsimonia) resulten satisfactorios, se obtendrán propuestas genealógicas (previas o nuevas) para los taxones evaluados.
3. OBJETIVOS
• Determinación de grupos monofiléticos de rango basal (entre clados) y específicos (entre taxones terminales) por análisis simultáneo (18S y datos morfológicos) en el grupo Medusozoa en general, y determinación de grupos monofiléticos de rango basal (entre clados) y específicos (entre taxones terminales) por análisis molecular (16S) en el grupo Hydrozoa en particular. • Determinar los efectos de las matrices de costo para datos moleculares por análisis de sensibilidad y congruencia (Medusozoa). • Determinar índices de soporte para los clados obtenidos. • Determinar efecto de algoritmos para matrices de gran tamaño (TF) en la búsqueda de cladogramas más parsimoniosos (Medusozoa). • Corroboración de hipótesis de grupos monofiléticos de estudios evolutivos previos, así como propuestas genealógicas nuevas.
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4. MATERIALES
INFORMACIÓN BIOLÓGICA Y FILOGENIAS
Información molecular (ADN) y morfológica
La codificación de datos tanto moleculares como morfológicos (y la subsiguiente construcción de la matriz de datos) es una etapa crítica de todo análisis filogenético, y del cual va a depender la calidad de su resultado, o sea, del árbol más parsimonioso. Una codificación objetiva depende de diversos factores, mas aún si se atribuye un mismo código numérico (o por lo menos comparable, es decir homólogo putativo) entre los taxones que los comparten. Otro de los problemas que surjen son las dificultades para la definición precisa de los estados sin ambigüedades, la super- simplificación de una diversidad compleja de formas en un número limitado de estados discretos y dudas en cuanto a la independencia o redundancia de los caracteres (Amorim 1997). La sistemática molecular permite llevar a cabo estudios considerados intratables por morfología (Hillis 1987; Patterson 1987). Diversos genes pueden ser utilizados para estudiar las relaciones genealógicas entre especies, inclusive aquellas morfológicamente indistinguibles (Hillis & Moritz 1991). Un amplio rango de aplicaciones, desde el origen de la vida a eventos evolutivos relativamente recientes pueden ser desarrollados al estudiar los genes de los ARN ribosomales (ARNr), llamados colectivamente ADN ribosomal (ADNr) (Appels & Honeycutt 1986; Mindell & Honeycutt 1990). Diversos ARN ribosomales se combinan con proteínas ribosomales para generar los ribosomas, macromoléculas que dirigen la síntesis proteica a partir de ARN mensajero. Los ribosomas están compuestos de dos unidades principales, cada una con ARNr y proteínas distintivas. La subunidad principal contiene dos (procariotas) o tres (eucariotas) ARN ribosomales y alrededor de 30 (procariotas) a 40 (eucariotas) proteínas ribosomales. Una copia única esta presente por ribosoma; debido a que la síntesis proteica es un prerrequisito para la vida, ribosomas (y por lo tanto el ARNr) está universalmente presente en los sistemas biológicos celulares (Hillis & Dixon 1991). La teoría del origen endosimbionte de las mitocondrias plantea el origen xenógeno de la mitocondria, donde las mitocondrias son remanentes evolutivos de ancestros de tipo bacteriano los cuales fueron incorporados en formas celulares prototipo de las eucariotas, que poseían formas primitivas de genomas nucleares. Las relaciones endosimbióticas mantuvieron su coexistencia. A lo largo de los mas divergentes linajes animales, sea entre los vertebrados e invertebrados, un grupo casi idéntico de genes funcionales han sido mantenidos en el genoma mitocondrial (Zhang & Hewitt 1996).
37 El ADN ribosomal del núcleo eucariota típicamente (varia desde sólo una copia a varias miles) consiste en cientos de copias repetidas en tándem de la unidad de transcripción y de los espaciadores no transcriptos. En procariotas existen de una a varias copias de genes de ARNr, y los genes pueden organizarse en un único operón (usualmente separados por genes de ARNt) o pueden estar dispersos por todo el genoma (Hofman et al. 1979); Morgan 1982). Existen tres o cuatro ARNr característicos “no nucleares no eucariotas” (mitocondriales) en las especies, caracterizados por sus velocidades de sedimentación (unidades S, por Svedeberg). Los genes de los ARN ribosomales (sus nombres derivan de los valores de sedimentación de los ARN que codifican) son: 1- Subunidad mayor ADNr 16S [aprox. 1500 nucleótidos (nt)] en mitocondrias de vertebrados hasta 23S (aprox. 2900 nt) en la mayoría de los genomas procariotas, y con tamaños de hasta 4000 nt en la mayoría de los núcleos eucariotas (28S) (Gutell et al. 1990). 2- Subunidad menor ADNr, desde 12S en las mitocondrias de vertebrados (aprox. 900 nt) hasta 16S (aprox. 1500 nt) en procariotas hasta más de 18S (aprox. 1800 nt) en eucariotas (Neefs et al. 1990); 3- Subunidad ARNr 5.8S (aprox. 160nt) en eucariotas, el cual es derivado de una parte del gen ARNr 23S de las procariotas (Clark & Gerbi 1982) siendo todavía estructuralmente y funcionalmente muy relacionado al 23S; y 4- Subunidad ARNr 5S (aprox. 120 nt) fuertemente relacionado con los demás ARNr en los genomas procariotas, y encontrado en múltiples sitios del genoma nuclear de los eucariotas (forma parte de la subunidad mayor ribosomal) (Wolters & Erdmann 1988). En núcleos eucariotas, las secuencias espaciadoras transcriptas (ITS-1 y ITS-2) separan a las secuencias 18S, 5.8S y 28S, y un espaciador transcripto externo (ETS) es localizado aguas arriba del gen 18S; los espaciadores transcriptos contienen señales para el procesamiento del ARN transcripto primario. Copias adyacentes de ADNr se encuentran separadas por secuencias no espaciadoras no transcriptas (NTS). Estas regiones contienen elementos que sirven como amplificadores de la trascripción. En general, el genoma mitocondrial se encuentra como una única molécula circular, con tamaños de 13kb a 19kb (Saccone et al. 1999). En el filo animal Cnidaria, estudios de especies de los grupos Hydrozoa (Hydra fusca, Hydra attenuata), Scyphozoa (Cassiopea sp.) y Cubozoa (Carybdea marsupialis) moléculas de ADN linear se presentan tanto como una única molécula de ADN mitocondrial de 16kb o dos moléculas de 8kb cada una (Bridge et al. 1992). En las mitocondrias, Las subunidades mayor y menor (16S y 12S), son de 2 a 3 veces más pequeñas que las subunidades mayor y menor de las procariotas (23S y 16S, respectivamente). Sin embargo, todos los ARNr mitocondriales poseen la capacidad de definir estructuras que “recuerdan” al menos a las estructuras centrales de las correspondientes estructuras secundarias de los ARNr procariotas (Gray et al. 1984; Guttel et al. 1993; Okimoto et al. 1994; Pont-Kingdon et al. 1994; Beagley et al. 1998).
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Figura 11. Mapa genómico mitocondrial de Metridium senile (anémona de mar). La molécula contiene los genes de 13 proteínas de vías energéticas, dos ARNr y dos ARNt. Todos los genes son transcriptos en la dirección indicada por la flecha; modificado de Beagley et al. 1998.
ETS 18S ITS-1 5.8SITS-2 28S
Figura 12. Estructura básica de la disposición de genes ARNr nuclear eucariota (ADNr), con excepción de 5S (disperso en diversas posiciones del genoma nuclear).
Estructura y evolución del ADNr: Implicaciones para análisis filogenéticos
16S – 18S El ADNr ribosomal ha sido estudiado de manera extensa en sistemática filogenética de eucariotas, destacándose los genes de la subunidad menor nuclear 18S y la subunidad mayor 16S en mitocondrias. Debido que el ADNr 18S es una de las secuencias génicas mas “lentas” evolutivamente hablando, y que está presente de forma universal en todos los organismos superiores, ha permitido el estudio de eventos evolutivos ancestrales (Hillis et al. 1996). El hecho también de poseer una tasa lenta de cambio permite la construcción de todo tipo de primers universales, los cuales facilitan los esfuerzos de secuenciamiento de grupos no estudiados anteriormente. El gen 18S ha resultado de gran utilidad para la comparación entre filos eucariotas así como estudios inclusivos basales dentro de filos animales. Su utilidad ha quedado demostrada para la reconstrucción de eventos filogenéticos que empezaran desde el periodo Precámbrico. El gen mitocondrial 16S evoluciona mucho mas rápido que los genes nucleares eucariotas (debido a sistemas de reparación del ADN menos eficientes y un microambiente más “agresivo” con presencia de radicales producto de los procesos bioenergéticos), y en general se propone para estudios filogenéticos (generalmente) a partir del período Cenozoico (Swofford et al 1996). Un dato relevante es el hecho que el genoma mitocondrial de los miembros de Anthozoa estudiados a la fecha
39 poseen una tasa de cambio muy inferior a la los demás miembros de Metazoa; existen diversas propuestas para explicar este suceso (France & Hoover 2002; Shearer et al. 2002) destacándose la presencia del gen mtMSH el cual codificaría para un sistema de reparación.
Tasas de evolución Genes ribosomales son sumamente útiles debido a sus diversas regiones variables y tasas de evolución, brindando información para diversos análisis evolutivos. Por otra parte, regiones altamente conservadas en las secuencias permiten construir cebadores (“primers”) utilizados para el secuenciamiento tanto de ARNr como ADNr de numerosas especies, amplificación de secuencias por técnicas de PCR (reacción en cadena de polimerasa) y su uso en análisis con enzimas de restricción (Hillis et al. 1991) El proceso de selección de una secuencia genética que sea considerada apropiada para un estudio filogenético es probablemente el paso mas critico en cualquier análisis molecular filogenético; si la secuencia seleccionada es evolutivamente demasiada conservada (por ejemplo, todas las secuencias son prácticamente iguales en todos los taxones), considerable tiempo y recursos materiales serán aplicados de manera no productiva (Hillis & Dixon 1991). Por otro lado, secuencias que difieran entre los taxones hasta el punto que los alineamientos (definición de homologías primarias) sean muy cuestionables también no permiten obtener resultados (filogenias) robustas (Swofford et al 1996). Existen dos motivos principales que conllevan a resultados poco robustos: 1- el nivel de homoplasia (paralelismos, reversiones y convergencias) aumenta a medida que la probabilidad de cambio en cada posición crece; y 2- número de posibles alineamientos que sean igualmente posibles, resultan en análisis prohibitivamente largos.
Evolución concertada A medida que comienzan a realizarse estudios en detalle de los genes ribosomales nucleares, resultó evidente que las múltiples copias presentes en un genoma no evolucionan independientemente, sino de forma concertada (Arnheim et al. 1980; Arnheim 1983): es decir que cada grupo de genes ribosomales nucleares es de manera usual muy similar a las demás copias dentro de los individuos y las especies, a excepción de regiones que acumulan rápidamente diferencias en sus secuencias a nivel inter-especies. Las diferencias entre las secuencias dentro de los individuos son mayoritariamente variaciones de tamaño de las regiones NTS (Spencer 1987). Toda esta información obtenida conlleva a la consideración de que la baja variación entre los bloques de ADNr dentro de los individuos es homogeneizada (Hillis & Dixon 1991), tanto entre cromosomas homólogos como no homólogos que contienen copias de ADNr. Este fenómeno de homogeneización es llamado evolución concertada (Arnheim et al. 1980). Diversos procesos son candidatos a ser responsables de la evolución concertada, siendo los más destacados la recombinación desigual (Szostak & Wu 1980) y la conversión génica (Ernea & Corredor 1991).
40 Es debatido las contribuciones relativas de estos mecanismos, ya que la información empírica hasta el momento no permite discriminar de manera definitiva las posibilidades consideradas de acción en los procesos que generan el fenómeno de evolución concertada (Hillis & Mable 1996). Estudios de secuencias de ADNr han cambiado la visión de la diversidad biológica. Han tenido un impacto inmenso en la sistemática moderna, desde los estudios en los niveles más profundos del árbol de la vida, y para grupos en los cuales la morfología provee poca información susceptible de ser utilizada en una inferencia filogenética (Ej: organismos unicelulares). Son útiles también para la mayoría de los niveles de divergencia filogenética, desde el Precámbrico (subunidad menor nuclear), desde el Paleozoico hasta el Mesozoico (subunidad mayor mitocondrial), hasta el Cenozoico (ej: regiones espaciadoras y genes de organelas). Los genes ribosomales y sus secuencias espaciadoras son de las más versátiles para el análisis filogenético de la historia de la vida (Hillis & Mable 1996).
41
GENEBANK GENEBANK Especie 16S 18S Subclase (Clase) Orden Familia 16S 18S Medusozoa
Carukia barnesi X Cubozoa Cubomedusae Carybdeidae AF358107 Carybdea marsupialis X Cubozoa Cubomedusae Carybdeidae AF358106 Carybdea rastonii X Cubozoa Cubomedusae Carybdeidae AF358108 Carybdea sivickisi X Cubozoa Cubomedusae Carybdeidae AF358110 Carybdea xaymacana X Cubozoa Cubomedusae Carybdeidae AF358109 Darwin carybdeid X Cubozoa Cubomedusae Carybdeidae AF358105 Tripedalia cystophora X Cubozoa Cubomedusae Carybdeidae L10829 Chironex fleckeri X Cubozoa Cubomedusae Chirodropidae AF358104 Chiropsalmus sp. X Cubozoa Cubomedusae Chirodropidae AF358103 Bougainvillia sp. AGC-2001 X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Bougainvilliidae AF358093 Bougainvillia muscus X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Bougainvilliidae Candelabrum cocksii X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Candelabridae AY512520 Cladocoryne floccosa X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Cladocorynidae AY512535 Cladonema californicum X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Cladonematidae AF358085 Cladonema radiatum X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Cladonematidae AY512539 Rhizogeton nudus X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Clavidae Turritopsis nutricula X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Clavidae Corymorpha intermedia X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corymorphidae AY512526 Corymorpha nutans X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corymorphidae AY512527 Coryne eximia X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512541 Coryne japonica X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512540 Coryne muscoides X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY728042 Coryne pintneri X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512542 Coryne producta X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512543 Coryne pusilla X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae Z86107 Dipurena reesi X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512546 Dipurena simulans X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512547 Sarsia eximia X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae Sarsia lovenii X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AJ608796 Sarsia marii X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512544 Sarsia mirabilis X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512548 Sarsia tubulosa X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Corynidae AY512545 Eleutheria dichotoma X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eleutheriidae AY512538 Staurocladia bilateralis X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eleutheriidae AY512537 Staurocladia oahuensis X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eleutheriidae AY512536 Staurocladia wellingtoni X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eleutheriidae AF358084 Eudendrium capillare X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eudendriidae Eudendrium carneum X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eudendriidae Eudendrium racemosum X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eudendriidae AF358094 Eudendrium sp. 3 X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Eudendriidae Hydractinia borealis X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Hydractiniidae Podocoryne carnea X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Hydractiniidae AY512513 AF358092 Chlorohydra viridissima X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Hydridae AF358081 Hydra circumcincta X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Hydridae AY512521 AF358080 Hydra littoralis X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Hydridae AF358082 Hydra vulgaris X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Hydridae AF100773 U19547 Millepora sp. AGC-2001 X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Milleporidae AF358088 Moerisia sp. AGC-2001 X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Moerisiidae AY512534 AF358083 Pennaria disticha X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Pennariidae AY512533
42 Polyorchis haplus X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Polyorchidae AY512549 AF358089 Polyorchis penicillatus X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Polyorchidae AY512550 AF358090 Scrippsia pacifica X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Polyorchidae AY512551 AF358091 Porpita sp. AGC-2001 X X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Porpitidae AY512529 AF358086 Velella sp. AGC-2001 X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Porpitidae AF358087 Velella velella X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Porpitidae AY512528 Thecocodium quadratum X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Ptilocodiidae AY512514 Solanderia ericopsis X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Solanderiidae AY512530 Solanderia secunda X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Solanderiidae AJ133506 Ectopleura dumortieri X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Tubulariidae Ectopleura larynx X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Tubulariidae Ectopleura wrighti X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Tubulariidae AY512524 Hybocodon prolifer X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Tubulariidae AY512525 Tubularia indivisa X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Tubulariidae U19379 U19553 Zyzzyzus warreni X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Tubululariidae Zanclea costata X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Zancleidae AY512531 Zanclea sessilis X Hydroidolina (Hy) Anthoathecata Zancleidae AY512532 Aequorea aequorea X X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Aequoreidae AY512518 AF358076 Aequorea victoria X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Aequoreidae AF358077 Rhacostoma atlantica X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Aequoreidae Aglaophenia latecarinata X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Aglaopheniidae Aglaophenia picardi X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Aglaopheniidae Aglaophenia tubiformis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Aglaopheniidae Blackfordia virginica X X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Blackfordiidae AY512516 AF358078 Clytia gracilis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae Clytia gracilis 2 X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae AY346364 Clytia hemisphaerica X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae AY346366 Clytia hummelincki X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae AY346363 Clytia linearis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae AY346362 Clytia paulensis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae AY346361 Clytia sp. AGC-2001 X X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae AY512519 AF358074 Clytia viridicans X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae AY346365 Obelia geniculata Woods Hole X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae Obelia sp. X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae Z86108 Orthopyxis integra X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Campanulariidae Eugymnanthea japonica X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Eirenidae AY285162 Eugymnanthea inquilina 1 X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Eirenidae AY285163 Eutima sapinhoa X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Eirenidae Halopteris liechtensternii X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Halopterididae Monastaechas BR102 X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Halopterididae Kirchenpaueria halecioides X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Kirchenpaueriidae Kirchenpaueria pinnata X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Kirchenpaueriidae Melicertissa sp. AGC-2001 X X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Laodiceidae AY512515 AF358075 Tiaropsidium kelseyi X X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Mitrocomidae AY512517 AF358079 Octophialucium indicum X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Phialuciidae Antennella campanulaformis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Dentitheca bidentata X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Gymnangium hians X X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Z86122 Halopteris alternata X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Halopteris minuta X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Halopteris polymorpha X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Lytocarpia phyteuma X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Macrorhynchia philippina X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae
43 Plumularia hyalina X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Plumularia margaretta X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Plumularia setacea X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Plumularia spiralis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Plumularia strictocarpa X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Schizotricha tenella Woods Hole X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Plumulariidae Abietinaria abietina X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Abietinaria filicula X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Amphisbetia minima X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Diphasia digitalis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Diphasia fallax X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Dynamena crisioides X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Dynamena disticha X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Dynamena pumila X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Hydrallmania falcata X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Idiellana pristis X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Selaginopsis cornigera X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Z92899 Sertularella rugosa X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Sertularia cupressina X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Sertularia loculosa X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Sertularia marginata X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Sertularia perpusilla X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Sertularia unguiculata X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Thuiaria thuja X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Thyroscyphus marginatus X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Thyroscyphus2/03 X Hydroidolina (Hy) Leptothecata Sertulariidae Nanomia bijuga X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Agalmatidae AF358071 Muggiaea sp. AGC-2001 X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Diphyidae AF358073 Hippopodius hippopus X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Hippopodiidae AF358069 Physalia utriculus X X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Physaliidae AY512511 AF358066 Physalia physalis X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Physaliidae AF358065 Physophora hydrostatica X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Physophoridae AF358072 Nectopyramis sp. AGC-2001 X X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Prayidae AY512512 AF358068 Praya sp. AGC-2001 X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Prayidae AF358067 Sphaeronectes gracilis X Hydroidolina (Hy) Siphonophora Sphaeronectidae AF358070 Craspedacusta sinensis X Trachylina (Hy) Limnomedusae Olindiidae AY512507 Craspedacusta sowerbii X X Trachylina (Hy) Limnomedusae Olindiidae AF358057 Maeotias inexpectata X Trachylina (Hy) Limnomedusae Olindiidae AF358056 Maeotias marginata X Trachylina (Hy) Limnomedusae Olindiidae AY512508 Olindias phosphorica X Trachylina (Hy) Limnomedusae Olindiidae AY512509 Aegina citrea X X Trachylina (Hy) Narcomedusae Aeginidae AY512510 AF358058 Cunina frugifera X Trachylina (Hy) Narcomedusae Cuninidae AF358059 Solmissus marshalli X Trachylina (Hy) Narcomedusae Cuninidae AF358060 Haliscera conica X Trachylina (Hy) Trachymedusae Halicreatidae AF358064 Crossota rufobrunnea X Trachylina (Hy) Trachymedusae Rhopalonematidae AF358063 Liriope tetraphylla X X Trachylina (Hy) Trachymedusae Geryoniidae U19377 AF358061 Pantachogon haeckeli X Trachylina (Hy) Trachymedusae Rhopalonematidae AF358062 Atolla vanhoeffeni X (Scyphozoa) Coronatae Atollidae AF100942 Nausithoe rubra X (Scyphozoa) Coronatae Nausithoidae AF358095 Catostylus sp. X Discomedusae (Scy) Rhizostomeae Catostylidae AF358100 Stomolophus meleagris X Discomedusae (Scy) Rhizostomeae Stomolophidae AF358101 Chrysaora colorata X Discomedusae (Scy) Semaeostomeae Pelagiidae AF358098 Chrysaora melanaster X Discomedusae (Scy) Semaeostomeae Pelagiidae AF358099
44 Cyanea sp. X Discomedusae (Scy) Semaeostomeae Cyaneidae AF358097 Phacellophora camtschatica X Discomedusae (Scy) Semaeostomeae Aureliidae AF358096 Craterolophus convolvulus X (Staurozoa) Stauromedusae Cleistocarpidae AF099104 Haliclystus sanjuanensis X (Staurozoa) Stauromedusae Elutherocarpidae AF358102 Haliclystus sp. X (Staurozoa) Stauromedusae Elutherocarpidae AF099103
Anthozoa
Anthopleura kurogane X (Hexacorallia) Z21671 Anthopleura midori X (Hexacorallia) Z86098 Antipathes galapagensis X (Hexacorallia) AF100943 Antipathes lata X (Hexacorallia) Z92908 Parazoanthus axinellae X (Hexacorallia) U42453 Rhizopsammia minuta X (Hexacorallia) Z92907 Bellonella rigida X (Octocorallia) Z49195 Calicogorgia granulosa X (Octocorallia) Z92900 Pachycerianthus fimbriatus X (Octocorallia) AF358111 Virgularia gustaviana X (Octocorallia) Z86106
Tabla 2. Listado de especies (terminales) utilizados en el presente estudio. Hy significa Hydrozoa; Scy sifnifica Scyphozoa.
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5. MÉTODOS
La sistemática filogenética tiene un lugar particular entre las ciencias naturales, siendo estrictamente histórica en vez de experimental. Por supuesto, muchas de las restricciones de la sistemática son encontradas en todos los ámbitos de las ciencias; por ejemplo, ni la astronomía o la sistemática pueden realizar experimentos manipulativos para ver si lo que observan ocurrirá de nuevo en la evolución de los astros. Las ciencias que se enfocan en historia tienen particulares retos epistemológicos (reglas acerca de cómo establecemos la validez de lo que conocemos). Aún el hecho de que la sistemática filogenética no es una ciencia experimental con demostraciones conclusivas, es claro el reconocimiento de que el hecho más obvio por realizar es la reconstrucción de árboles evolutivos de la manera más “científica” en el método como sea posible (Wenzel 2002). En la filosofía cladística, se trata toda la información de la misma manera, al menos al inicio; esto es un problema también, porque nadie puede actualmente creer que la información es similar, pero al menos nosotros sabemos que este es el lugar desde donde comenzar (Wenzel 2002).
ANÁLISIS SIMULTÁNEO
El reconocimiento de diferentes tipos de información para llevar a cabo inferencias filogenéticas, como datos morfológicos, etológicos, moleculares, etc., conllevó que entre otros, Kluge (1989, citando a Carnap 1950) planteen que toda la información disponible debe ser analizada en una única matriz. La predictibilidad es un atributo deseado por los cladistas; Kluge (1989) y Kluge & Wolf (1993) argumentan este aspecto en que la estabilidad por es el objetivo per se de los estudios filogenéticos, donde la predictibilidad es maximizada por clasificaciones las cuales son estables luego de la adición de nuevos datos; estabilidad en este punto equivale a repetibilidad (Nixon & Carpenter 1996). Este principio ha sido denominado como el enfoque de evidencia total o enfoque de congruencia de caracteres (Kluge 1989) debido a que el cladograma final resulta puramente de la interacción de todos los caracteres disponibles. El primer análisis simultáneo realizado de datos moleculares y no-moleculares fue publicado por Mickevitch & Johnson (1976) (Schulmeister et al. 2002). Un cambio de terminología fue propuesto por Nixon y Carpenter (1996), que argumentaron que este enfoque sería mejor definirlo como análisis simultáneo ya que todos los investigadores utilizan (idealmente) toda la evidencia (total) posible, más allá de cómo se analiza dicha información (Kitching et al. 2000). La justificación de la aplicación de parsimonia es que minimiza hipótesis ad hoc de homoplasia (Farris 1983), y consideraciones ad hoc de homoplasia pueden ser minimizadas para todos los datos sólo dentro de un contexto de análisis simultáneo. La aplicación de técnicas de consenso a los resultados de análisis independientes de múltiples grupos de datos (análisis particionado) no mide el soporte relativo (en
46 términos de sinapomorfia) de los diferentes tipos de datos; por ejemplo, si un grupo de datos muestra 10 sinapomorfias para un grupo dado A+B y el otro grupo de datos contiene 3 sinapomorfias para el grupo dado B+C, el consenso no será resuelto, a pesar que el soporte para la primera alternativa es mucho mayor. El análisis simultáneo no sólo considera este aspecto de soporte relativo, sino que también tiene el potencial de determinar soporte oculto (“señales secundarias”, Gatesy et al. 1999). Por ejemplo, un grupo de datos puede contener 5 sinapomorfias para el grupo dado D+E y el secundo grupo de datos 5 sinapomorfias para E+F. Mirando los resultados por separado, parecería que el soporte es igual para ambas alternativas; sin embargo, en un análisis simultáneo puede ser descubierto que el secundo grupo de datos contenía 4 sinapomorfias adicionales a para D+E además de las cinco para E+F, por lo que el soporte total para D+E es mucho mayor que para E+F (Schulmeister et al. 2002).
- Acerca de los datos fósiles Kluge (1989) incluye a los fósiles en su concepto original de evidencia total, ampliado luego por Donoghue et al. (1989). Análisis los cuales incluyen terminales fósiles son susceptibles a problemas, debido a la gran cantidad de valores o estados “perdidos” (‘missing entries’) ya que usualmente han perdido completamente diversos tipos de características de los organismos (tales como “partes blandas” y datos moleculares). La combinación de estos grupos de datos típicamente resulta en un alto número de valores perdidos concentrados en los terminales fósiles, resultando en un fenómeno de “comodin” (Nixon & Carpenter 1992), con dichos terminales ubicados en posiciones radicalmente diferentes en árboles igualmente parsimoniosas (Nixon & Carpenter 1996). Lo mismo acontece al modificar la codificación de los caracteres informativos, ya que usualmente son pocos comparados con los que presentan los terminales no-fósiles. Valores perdidos en exceso, al relajar el rigor del test o examen de congruencia de caracteres, también pueden resultar en árboles inestables en la adición de nuevos datos (Nixon & Carpenter 1996), por lo que se considera más apropiado para análisis simultáneos no incluir el terminal fósil en la matriz molecular con la totalidad de los caracteres como valores perdidos, y sólo los datos morfológicos (en la matriz morfológica) determinen su relación genealógica con los demás miembros del grupo. El análisis simultáneo acepta que el objetivo de la cladística es maximizar el poder explicativo; es decir que promueve la explicación (relaciones genealógicas) acerca de la distribución de todos los caracteres disponibles en la forma más parsimoniosa posible ya que maximiza la congruencia entre diferentes fuentes de datos en inferencias filogenéticas, para establecer el objetivo primario: un cladograma, el cual luego puede ser base para inferencias filogenéticas en las cuales se hacen consideraciones evolutivas (de patrones y procesos) (Kitching et al. 2000). Otra visión de este aspecto es que cualquier análisis filogenético intenta maximizar las homologías; el método de examen de hipótesis de homologías es a través de la congruencia de caracteres, donde cuantos mas caracteres sean incluidos en el análisis como potenciales exámenes de homología, mas severo resulta ese examen y mas confidente resulta en su conclusión (Kitching et al. 2000).
47 CONSTRUCCIÓN DE CLADOGRAMAS
El primer método explícito de construcción de cladogramas fue propuesto por W. Hennig (1950, 1965) y es llamado como argumentación Henniguiana: este método considera la información que brinda cada caracter individualmente. Los grupos en los cladogramas son reconocidos por la posesión de apomorfias y, en la argumentación Henniguiana, estas apomorfias son identificadas a priori, es decir, los caracteres son polarizados en estados plesiomórficos y apomórficos antes de que el cladograma sea construido. Con grupos de datos pequeños y un bajo nivel de homoplasia, la argumentación Henniguiana es fácil y rápida de ser implementada. Sin embargo, muchos grupos de datos contienen números elevados de caracteres y taxones, así como niveles mayores de homoplasia, lo cual resulta el hecho de determinar los cladogramas mas parsimoniosos por la argumentación Henniguiana sea inaplicable en la práctica. Debido a esto, algoritmos computacionales han sido desarrollados para acelerar la búsqueda de los cladogramas más parsimoniosos (longitud mínima) (Kitching et al. 2000).
Algoritmos exactos Los algoritmos computarizados se dividen en dos grupos. Los métodos exactos son aquellos que garantizan que se encuentre uno o todos los cladogramas más cortos. El más sencillo de estos métodos consiste en el método exhaustivo, donde cada cladograma no enraizado completo posible es analizado y su longitud determinada; de esta forma es seguro que todos los cladogramas de longitud mínima son identificados. El procedimiento se resume de manera que cada n taxon es adicionado a cada rama de cada cladograma (cada de uno de los cuales posee n-1 taxón) generado en el paso previo, y es continuado hasta que todos los cladogramas para n taxones sean construidos. Por último, la longitud de todos estos cladogramas es calculada y el más corto es elegido como óptimo (más parsimonioso). Desafortunadamente, la búsqueda de los cladogramas mas parsimoniosos es lo que se llama en términos matemáticos un "problema duro" (requiere un número creciente exponencial de pasos para resolver la búsqueda a medida que aumenta el tamaño del problema). Para un cladograma que incluye n-1 taxones, existen 2n-5 posibles posiciones en las cuales ese n-nésimo taxón puede ser adicionado; así, existen 105 cladogramas dicotómicos no enraizados posibles para 6 taxones, más de 2x10 20 topologías para solo 20 taxones, mientras que el número posible excede 10 100 cuando se está en 63 taxones. Existe un método exacto que no requieren la construcción de todas las topologías posible y su análisis individual –el método rama y límite (del inglés branch-and- bound) (Kitching et al. 2000).El método comienza con el cálculo de un cladograma utilizando métodos heurísticos (explicación abajo). La longitud de este cladograma es retenido como longitud referencia o límite superior para utilizar durante las subsecuentes construcciones de cladogramas. El método branch-and-bound continúa de manera similar al método exhaustivo pero ahora a medida que se adicionan taxones, las longitudes de las ordenaciones parciales son calculadas en
48 cada paso y comparadas con aquellas del cladograma límite superior. Cuando la longitud de la construcción parcial excede la longitud del límite superior, esta “ruta” o guía de construcción del cladograma es abandonada, ya que la adición de nuevos taxones sólo puede resultar en un incremento de la longitud ya presente. De esta manera, el número de cladogramas completados que deben ser evaluados es reducido enormemente. Una vez que una guía o camino es completado y todos los taxones han sido adicionados, la longitud del cladograma resultante es una vez mas comparado con el límite superior; si su longitud es igual al límite superior, entonces este cladograma es retenido como una de las topologías óptimas y el proceso branch-and-bound continúa. Sin embargo, si la longitud es menor que el límite superior, entonces esta topología es superior y su longitud es sustituida como el nuevo límite superior. El procedimiento de reemplazo del límite superior es importante porque permite subsecuentes caminos a ser abandonados más rápidamente. Una vez que todos los posibles caminos han sido examinados, entonces el grupo de cladogramas óptimos ha sido encontrado. De esta forma, la técnica de forma implícita enumera y examina todas las posibles soluciones sin “visitar de facto” cada situación posible; se evalúan sub-soluciones parciales las cuales permiten a los algoritmos excluir grandes áreas de búsqueda en espacio improductivo, haciendo las soluciones exactas más tratables para problemas más grandes (Wheeler 2002). Es imposible a priori estimar el tiempo exacto requerido para desarrollar un análisis branch-and-bound, y es una función compleja de velocidad computacional, eficiencia del algoritmo y la presencia de cualquier homoplasia en la información. La mayoría de las aplicaciones branch and bound utilizan algoritmos para asegurar una reducción en la búsqueda y reducir el tiempo computacional; por ejemplo, métodos heurísticos pueden minimizar el estimado inicial del límite superior. Sin embargo, un análisis branch and bound es todavía costoso en tiempos computacionales para implementar y no debería ser considerado como única herramienta de análisis para grupos de datos con un número grande de taxones (Kitching et al. 2000).
Métodos heurísticos Para grandes sets de datos, métodos heurísticos o aproximados deben ser adoptados, los cuales generalmente utilizan técnicas de escaladas de colinas (hill- climbing); estos enfoques son esencialmente prueba y error y no garantizan encontrar todos o siquiera uno de los mínimos cladogramas; de esta forma la certeza de encontrar el resultado óptimo es sacrificado a favor de reducir los tiempos computacionales (Kitching et al. 2000). Como analogía, considere un grupo de escaladores los cuales están intentando alcanzar la cima de una montaña tan rápido como sea posible, con la ayuda de un mapa y una brújula; sin embargo, al iniciar su ascenso, entran en un “banco de niebla” que evita observar todo aquello fuera de su sector inmediato; la mejor opción que poseen los escaladores es escalar la montaña siguiendo la línea de ascenso más escarpada, ya que el mapa muestra que esta línea es siempre perpendicular al contorno de la línea que pasa a través de su posición actual: siguiendo esta línea, eventualmente alcanzaran la cima (Kitching et al. 2000). Sin embargo, si existe más de un pico en la montaña, o si posee colinas adicionales, entonces este enfoque podría brindar solo un resultado óptimo local, en
49 donde los escaladores alcanzarán el pico más elevado más cercano a su punto de inicio. Podrían existir uno o mas picos más elevados pero resultará imposible de alcanzar porque esto conllevaría el desplazamiento hacia abajo de su posición actual, y el descenso esta prohibido en la escalada de colinas (Kitching et al. 2000). Una estrategia que poseen los algoritmos matemáticos de escalada de colinas es el desplazarse horizontalmente de un pico a otro pico en un intento de moverse desde una cuesta que pueda llevar a un óptimo local a aquella cuesta que permita acceder al óptimo global (el pico o cima más alta verdadera); esto es permitido porque no conlleva descenso alguno, pero tal vez puede resultar que las cuestas estén demasiadas separadas para ser alcanzadas a través de este sistema. Estas unidades separadas son llamadas islas. Entonces, una manera de maximizar la chance de alcanzar el óptimo global es generar aleatoriamente diversos puntos de inicio de la escalada y elegir aquellos que llevan a la cima más elevada, con o sin saltos. Traduciendo de la analogía, el pico mas elevado se refiere al set o grupo de cladogramas de longitud mínima, el óptimo global y los algoritmos de intercambio de ramas (branch-swapping) son equivalentes a saltar entre diferentes colinas; pero rutinas de análisis de intercambio de ramas están limitadas a intentar siempre de disminuir la longitud del cladograma del cual parte o inicia. Por lo tanto, si el óptimo global existe dentro de un set alternativo de topologías que solo pueden ser alcanzadas desde la posición actual por intercambio de ramas diferentes de la actual, entonces el óptimo global nunca puede ser alcanzado desde ese punto de inicio. Este es el problema mencionado de islas de árboles: si múltiples islas existen (algo que usualmente es desconocido previo al análisis), entonces debemos realizar el esfuerzo para alcanzar la isla que incluya la solución mas parsimoniosa al realizar varios análisis (réplicas), cada uno de los cuales inicia desde un cladograma distintivo topológicamente (Kitching et al. 2000).
Figura 13. Modelo de escalada de colinas; Descripción de óptimos locales para el espacio de óptimos posibles del cladograma. El eje vertical representa la longitud posible de los cladogramas. Los puntos 7 y 4 y 5, por ejemplo, representan puntos de inicio de la búsqueda del cladograma más parsimonioso; los puntos alcanzados en el análisis serían respectivamente 1 (óptimo global) y 3 respectivamente, pero se detiene en éstos (modificado de Siddall 2002).
50
Adición por etapas La adición por etapas es el proceso donde los taxones son adicionados al cladograma en desarrollo en la fase de construcción de un análisis. Inicialmente, un cladograma de tres taxones es elegido, luego un cuarto taxón es adicionado, y así hasta finalizar el ingreso al cladograma en construcción de todos los terminales (taxones). Existen varias maneras para la selección de los tres taxones iniciales, la secuencia de adición de los taxones restantes, y la rama del cladograma parcial al cual cada uno será adicionado. Por ejemplo, el método más simple selecciona los tres primeros taxones de la matriz de datos para formar la red inicial y luego continúa adicionando los taxones restantes en el orden como (donde su nombre proviene del inglés, “as is”) se encuentran en la matriz de datos. El aumento en longitud que pueda resultar de unir un taxón a cada rama del cladograma parcial son calculados, y luego la rama seleccionada es la que conlleva el menor aumento en el número de pasos total del cladograma. El método de secuencia de adición aleatorio (“random”) funciona de manera más adecuada para todo tipo de datos; provee un número eficiente de puntos de inicio y asimismo mejora las chances de al menos uno de ellos permita obtener un óptimo global en vez de un óptimo local. También este método es considerado como una forma no rigurosa para evaluar la efectividad de los análisis heurísticos: al realizar un n número de réplicas utilizando secuencia de adición aleatoria, y el mismo set de cladogramas más parsimoniosos es encontrado en cada caso, podemos razonar, con alguna seguridad (a partir de estos resultados) que dichas topologías son los óptimos globales para dichos datos. Uno de los puntos más críticos con la adición secuencial es que no puede “retroceder” desde una posición dada: algoritmos con estas características son llamados “egoístas”. Esencialmente el problema consiste en su incapacidad para predecir el futuro, es decir cual de las múltiples opciones en un punto dado llevará finalmente al mejor resultado posible. La ubicación de un taxón en un momento de adición dado puede resultar óptimo, pero subsecuentemente resultar subóptimo una vez que otros taxones son adicionados a la red y que no hay retroceso. Una vez que un taxón ha sido adicionado a una rama en particular del cladograma parcial, las consecuencias de tal acto deben ser aceptadas para siempre en este “camino”. El problema es mayor cuando ocurre temprano en la adición de taxones en el cladograma en construcción. Estos “lazos” pueden surgir porque en un momento dado, la adición de dos o mas taxones puede aumentar la longitud de la topología en un mismo número de pasos mínimo, o puede ocurrir que adicionar un taxón dado defina el mismo costo a dos o más ramas diferentes, o que más de un cladograma más parsimonioso resulte encontrado. Una opción para llevar de la forma “mas profunda el análisis”, como si los escaladores realizaran más de una escalada de colina al mismo tiempo consiste en que los algoritmos retengan más de una topología en un paso dado. Esto simplemente se puede considerar como el grupo de topologías parciales más cortas en dicho evento de conflicto, generalmente definiendo a priori del análisis el número de topologías parciales susceptibles de ser retenidas, conllevando además la posibilidad de que topologías subóptimas finales puedan ser también retenidas para análisis.
51 Este procedimiento reduce el efecto de los lazos hasta cierto punto, (dependiendo del número de topologías retenidas) donde cada una de las alternativas es analizada.
CARACTERES MOLECULARES Y SECUENCIAS
Los caracteres consisten en secuencias moleculares no-alineadas, usualmente ácidos nucleicos. Dado la falta de un esquema de homología a priori, no sólo las transformaciones entre los estados de los nucleótidos varían con la topología en los cuales ellos se optimizan, sino que las correspondencias (homologías) también lo hacen. La tarea de optimizar estos caracteres, asignando homología dinámica es doblemente difícil. Deben determinarse las correspondencias entre homólogos y deben evaluarse simultáneamente con las transformaciones, requiriendo normalmente soluciones heurísticas, una vez que es virtualmente imposible asegurar-se de mirar todas las posibilidades existentes. Tradicionalmente, este tipo de información ha sido sometida a alineamiento múltiple previa codificación y analizados por métodos no-aditivos u optimización de la matriz, que evitan complejidades de cálculo en la optimización. La optimización heurística fue propuesta por Wheeler (1996), pero la discusión de estos rasgos en el contexto de alineación múltiple comienza con Sankoff & Rousseau (1975).
- Estados de caracteres aditivos Estados aditivos fueran definidos como un tipo de procedimiento para optimizar caracteres cualitativos (0, 1, 2, 3, 4, etc.) donde el costo de transformación entre los estados, definidos como los pasos, es la distancia aditiva entre ellos (descrito inicialmente para caracteres binarios por Farris 1970; también ver Kluge y Farris 1969). Así, una transformación entre los estados 1 y 4 tendría un costo de 3. Una implicación de este principio de codificación es que cada estado considera la suma anterior. Los estados forman una serie de transformación lineal dónde cada estado contiene todos los estados anteriores y homologías de forma lógica. Esta forma de codificación de caracteres es más frecuentemente usada para datos cualitativos anatómicos y otros datos no-secuenciales.
estado 0 1 2
0 - 1 2
1 1 - 1
2 2 1 -
Tabla 3. Matriz de costo de caracteres aditivos
52
- Estados de caracteres no-aditivos Fitch (1971) describió un procedimiento para optimizar caracteres de secuencias nucleotídicas que no realizara ninguna asunción sobre el orden de los estados posibles (no ordenados). Este procedimiento aplica costos iguales a todas las posibles transformaciones, independientemente de su distancia o diferencia. Todos los estados se pueden transformar entre sí y ninguna relación de homología anidada (como sucede en caracteres aditivos) entre los estados es implícito. Por lo tanto, cada estado compartido es evidencia de un grupo monofilético. Aunque este tratamiento de estados de caracteres se describió originalmente para secuencias de nucleótidos y aminoácidos, es usado para una variedad de datos cualitativos.
estado 0 1 2
0 - 1 1
1 1 - 1
2 1 1 -
Tabla 4. Matriz de costo de caracteres no-aditivos
- Estados de caracteres multiestado Sankoff y Rousseau (1975) utilizan programación dinámica para describir el caso general de caracteres cualitativos multiestados. Esta técnica permite al investigador asignar costos de transformación arbitraria (es decir, editar) entre los estados. El método es un acercamiento más general y puede implicar caracteres aditivos y caracteres non-aditivos como casos especiales.
estado 0 1 2
0 - 1 4
1 1 - 3
2 4 3 -
Tabla 5. Matriz de costo de caracteres multiestado
Estas matrices de caracteres son las usadas a menudo en los análisis de datos de secuencias moleculares pre-alineadas. Costos de transición-transversión pueden especificarse así como costos para eventos de inserción y deleción (indel) también llamados ‘gaps’ (del inglés, traducido: intervalo) en una matriz de costos de
53 transformación 5x5. La siguiente matriz tiene un costo de transición de 1, un costo de transversión de 2, y un costo de indel de 4.
estado A C G T -
A - 2 1 2 4
C 2 - 2 1 4
G 1 2 - 2 4
T 2 1 2 - 4
- 4 4 4 4 -
Tabla 6. Matriz de costo de caracteres multiestado para estados nucleotídicos
- Consideraciones computacionales Los dos problemas fundamentales, costos de cladogramas y la búsqueda de cladogramas, cada una presenta complejidades particulares. Esta situación resulta más difícil por el hecho que ellos ocurren como un par asociado. Determinar el costo de un cladograma dado está repetido encima de todos los cladogramas durante el proceso de búsqueda para alcanzar la topología óptima. El cálculo del costo de un cladograma dado para datos de secuencias no- alineadas y la búsqueda del cladograma óptimo son todos problemas NP-completo (Wheeler 2002).
-- P, NP, y NPC Los problemas de cálculo son clasificados según la complejidad de tiempo de sus soluciones algorítmicas. De manera sencilla, los problemas son “fáciles” o “duros.” Los problemas fáciles son aquéllos para los que existe una solución algorítmica de tiempo polinómico (P). Por esto, queremos decir que existe un algoritmo que puede resolver el problema a tiempo O(n k ) para alguna constante k. Los problemas duros (NP o de tiempo polinómico no determinado) exige tiempo super-polinómico para resolver el problema dado; si existe una solución, la solución podría verificarse en tiempo polinómico. Los problemas NP-completo (NPC) existirían en un mundo inferior dónde ninguna solución de tiempo polinómico conocida existe, pero por otra parte no hay ninguna prueba de su no-existencia (Wheeler 2002). Estos problemas frecuentemente son combinatoriamente expansivos con espacios de la solución que aumentan a un espacio factorial. Hay un gran número de problemas NPC (por ejemplo, el viajante de comercio o el plan del circuito) y si una solución de tiempo polinómica se encontrara para cualquiera de ellos, aplicaría para todos (Cormen et al. 2001).
54 Los problemas de NPC son duros en el sentido de cálculo. Esto tiene dos implicaciones prácticas para la investigación sistemática. El primero es que casi nunca se obtendrán soluciones exactas a cualquiera de los problemas planteados. Cuando los procedimientos heurísticos mejoran, así lo harán los análisis. El segundo es el empleo de cómputo paralelo para analizar los conjuntos de datos grandes y complejos.
INTERCAMBIO DE RAMAS
Algoritmos que realizan reordenamientos llamados intercambio de ramas resultan en general modelos de prueba y error, pero si una determinada topología mas corta existe, y suficientes rearreglos son realizados, entonces uno de estos rearreglos es probable de ser encontrado. En la práctica, la manipulación de la adición de secuencias por si solo generalmente conlleva a locales óptimos, por lo que realizar rearreglos predefinidos de los cladogramas parciales resulta de gran utilidad. Los métodos llamados de intercambio de ramas globales consisten en el corte del cladograma en dos o más subcladogramas y luego reconectarlos de varias maneras, con todas las recombinaciones posibles evaluadas. Poda y reinserción de subárboles -subtree pruning and regrafting SPR- corta y “retira” un subcladograma enraizado del cladograma principal. Este subcladograma retirado es luego reconectado en cada rama del cladograma remanente (uno por vez) y la longitud de cada topología obtenida es calculada. Todas las posibles combinaciones de corte y reconexión SPR son evaluadas (Kitching et al. 2000). Por otra parte, en división y reconexión de árboles –tree bisection and reconnection TBR- el subcladograma retirado del cladograma principal es re- enraizado antes de ser reconectado a cada rama del cladograma remanente. Todas las posibles divisiones, re-enraizamientos y reconexiones son evaluadas (Kitching et al. 2000).
B B D A B E F A E E A C D
C F C D F
Figura 14. Ejemplo de intercambio de ramas por TBR. El cladograma inicial es dividido en dos cladogramas no enraizados. Un cladograma es re-enraizado (entre B y A+C) y luego reasociado al otro cladograma (en el rama del taxón E) para generar una nueva topología; modificado de Kitching et al. 2000.
La efectividad para recuperar el grupo de topologías optimas es en el orden SPR, TBR. Más allá de la opción de retener todas las topologías igualmente óptimas en cualquiera de los pasos de adición de ramas, así como la retención de un valor dado de topologías subóptimas (ante la posibilidad de que una de ellas permita obtener el
55 cladograma optimo), SPR y TBR fallarán en obtener la topología óptima si las diferencias, por mas pequeñas que sean, se encuentran en partes separadas de los cladogramas (Goloboff 2002). Goloboff (1999) menciona que los términos SPR y TBR planteados por Swofford (1993), son los más utilizados en la actualidad; sin embargo, estos han sido utilizados previamente. Poda y reinserción de subárboles ha sido utilizado en el software PHYLIP (Felsenstein, 1993) desde 1981 como “rearreglo global”, y división y reconexión de árboles es igual al método “rompedor de ramas (bb)” utilizado en el software Hennig86 (Farris, 1988).
HOMOLOGÍA DINÁMICA EN DATOS MOLECULARES
El proceso de transformar observaciones de nucleótidos en declaraciones de homología y cladogramas involucra opciones en ambas formas de optimizar homología y las entidades que son homologadas en primer lugar. Básicamente, hay tres medios de diagnosticar en parsimonia caracteres secuenciales: alineamiento múltiple de secuencia seguida de análisis normal (Higgins et al., 1996; Wheeler y Gladstein, 1994), optimización de alineamiento (Wheeler, 1996), y optimización de estado fijo (Wheeler, 1999). Cada uno de estos métodos crea declaraciones de homología y parsimoniosamente los diagnostica en cladogramas. Alineamiento múltiple de secuencias precede el análisis del cladograma, mientras los otros dos métodos no “pre-procesan” los datos, procediendo directamente a la optimización del cladograma (Wheeler 2001). Pueden distinguirse las nociones de homología consideradas en estos tres métodos de análisis de dos maneras. Alineamiento múltiple y optimización de estado fijo plantean homologías putativas que son invariantes —estáticas— y cada cladograma candidato se diagnostica basado en el mismo juego de homologías putativas. El método optimización de alineamiento, sin embargo, crea las potencialmente homologías únicas para cada hipótesis histórica. Otra forma de distinguir entre los métodos es tratando las entidades como comparables. En el caso de alineación múltiple y optimización de alineación, los nucleótidos individuales son potencialmente homólogos, lo cual resulta opuesto para análisis de optimización de estado fijo, que trata los fragmentos enteros de secuencia como caracteres (Wheeler 2001). Una propuesta ante la falta de interacción entre las topologías analizadas y las homologías putativas es la optimización de alineación (OA; Wheeler, 1996). Este método directamente optimiza las variaciones de las secuencias, creando un único juego de homologías putativas (correspondencia de bases) para cada topología. No sólo los cambios de nucleótidos y eventos de inserción y deleción son minimizados: las correspondencias entre ellos son elegidos para minimizar la longitud del cladograma (Wheeler 2001).
56 Alineamiento de optimización
El alineamiento de optimización (OA) es un método aplicable a secuencias no alineadas que permite la creación de cladogramas óptimos sin el uso de alineamiento múltiple, tales como Sankoff y Cedergren, en que OA intenta determinar el costo mas parsimonioso de un cladograma directamente, mientras que el alineamiento múltiple genera grupos de caracteres en columnas-vectores, los cuales son analizados filogenéticamente en una operación separada. OA fue propuesto para permitir la optimización directa de secuencias de longitud diferentes en la búsqueda de topologías óptimas (Wheeler 2002). La determinación de la longitud, o costo, del cladograma se logra a partir de las secuencias determinadas y de una matriz de costos que especifica los costos de todas las transformaciones entre nucleótidos y eventos de inserción y deleción (indel). En este aspecto, el método es una generalización del método Sankoff y Rousseau (matriz de optimización de estados de caracteres), pero que permite la inserción y deleción de caracteres. Sankoff y Rousseau (1975) expanden el campo de optimización, permitiendo costos de transformación desiguales entre estados de caracteres, pero todavía depende de un alineamiento preexistente para saber que estados comparar. OA aumenta el campo de los eventos de transformación que pueden ser optimizados en un cladograma, incluyendo la creación y destrucción de caracteres (Wheeler 2002).
T4
T5 T3
A4
T2 A3
T1
A2
A1
Figura 15. Cladograma con cinco taxones terminales (T1-T5) y cuatro nodos internos (A1-A4) (a partir de Wheeler 2002)
El procedimiento aplicado en OA resulta en una combinación HSC-NW: un algoritmo de optimización de caracteres tipo Sankoff (HSC, del inglés ‘heuristic Sankoff cost’) y del procedimiento de alineamiento por parejas de Needleman y Wusch (NW). Los métodos de optimización de Farris, Fitch y Sankoff, por ejemplo, requieren que los caracteres de los descendientes a ser comparados u optimizados son conocidos. estos esquemas de optimización asumen que es sabido cual “A” en una secuencia corresponde con una “C” en otra; esto generalmente no es el caso para datos de secuencias de nucleótidos, debido a las secuencias de los taxones
57 terminales pueden variar en longitud; es decir que estos métodos de optimización necesitan de alineamiento previo (Wheeler 2002). El procedimiento es basado en la determinación heurística de secuencias ancestrales hipotéticas. El algoritmo empieza con un nodo interior (o vértice) con dos secuencias terminales consideradas como descendientes (el Fig. 1) (Wheeler 2001). La determinación de las secuencias ancestrales preliminares es encarado en la misma forma que la optimización de Sankoff analiza todos los posibles estados y elige el más parsimonioso, de manera que OA analiza todas las posibles correspondencias entre los nucleótidos de las secuencias descendientes para determinar el esquema de correspondencias y transformaciones que conllevará a la secuencia ancestral preliminar más parsimoniosa. Esto es realizado en una forma similar al procedimiento de alineamiento por parejas de NW: el procedimiento NW es modificado de manera tal que en vez de maximizar similaridad de secuencia, minimiza el costo de la secuencia ancestral hipotética, a través del algoritmo HSC (Wheeler 2002); es decir que procura minimizar es que el costo de peso de unión/intersección usualmente utilizado para diagnosticar hipótesis filogenéticas, y los gaps son optimizados por “fuera de las secuencias reales”, ya que las sucesiones reales no contienen gaps inequívocos (Wheeler 2001).
A C G T ( )
A 0 1 1 1 2 T4: G T3: GG
C 1 0 1 1 2 T2: A A3 G 1 1 0 1 2 T1: AA A2 T 1 1 1 0 2 A1 ( ) 2 2 2 2 0
Tabla 4 - Matriz de costos de transformación Figura 16. Un cladograma de 4 terminales (4 secuencias utilizada para el análisis el cladograma y de una y dos bases, con los correspondientes nodos ancestrales; secuencias de la figura 4; modificado de Wheeler modificado de Wheeler 2002. 2002.
58 T4 T4:- G - G T3:GG Æ G(G) COSTO = 2 T4:G - Æ (G)G - 0 2 T3:GG T4: G T3: GG
T4:G- - T2: A T3 Æ (G)(G)(G) G 2 0 T3:-GG G(G) COSTO = 2 (A3) T1: AA T4: - G - Æ (G)(G)(G) COSTO = 6 A2 G 4 2 T3:G -G G – o bien –G G G G G T4 - - G Æ (G)(G)(G) A1 T3:GG -
Figura 17. Determinación preliminar de la secuencia del nodo A3 de la figura 16. Existen 5 posibles caminos a través de la matriz y cinco secuencias ancestrales posibles preliminares; modificado de Wheeler 2002.
T2 T2:A - - A A3:G (G) Æ R COSTO = 1 T2: - A Æ (G)R - 0 2 A3:G (G) COSTO = 3 T4: G T3: GG
A3 T2:A - - Æ (A)(G) T2: A G 2 1 A3:- G (G) G(G) COSTO = 2 (A3) T1: AA T2: - A - Æ (G)(A) COSTO = 4 R COSTO = 1 (A2) (G) 2 1 A3:G - (G) A – T2 - - A Æ (G)(A) A1 A3:G (G) - G (G)
Figura 18. Determinación preliminar de la secuencia del nodo A2 de la figura 16. Existen 5 posibles caminos a través de la matriz y cinco secuencias ancestrales posibles preliminares; modificado de Wheeler 2002.
T4: G T3: GG A2 A2:R - - R T1:A A Æ A(A) T2: A COSTO = 2 G(G) COSTO = 2 (A3) A2: - R Æ (A)A - 0 2 T1:A A T1: AA R COSTO = 1 (A2)
T1 A2:R - - Æ (R)(A)(A) A 2 0 T1: - A A A(A) COSTO = 2 (A1) A2: - R - Æ (R)(R)(A) T1:A - A COSTO = 6 A 4 2 -R Æ(A)A A2 - - R Æ (A)(A)(R) A A T1:A A - R - ÆA(A) A A
Figura 19. Determinación preliminar de la secuencia del nodo A1 de la figura 16. Existen 5 posibles caminos a través de la matriz y cinco secuencias ancestrales posibles preliminares; modificado de Wheeler 2002.
59 SECUENCIA T4: G T3: GG ANCESTRO HIPOTÉTICO COSTO T2: A A 4 GG G G Å G(G)A3 G 3 G T1: AA A Å R A2 GG 5 A AA 7 A(A) A1
SECUENCIA ANCESTRO HIPOTÉTICO COSTO A 1 G(G) A G 2 A GG 5 AA A(A) 4 Figura 20. Determinación final de las secuencias hipotéticas ancestrales (desplazamiento ascendiente) de la figura 16; modificado de Wheeler 2002.
ACG ACGT
ACG- ACG(T/-) ACTA ACGT ACG(T/-) ACK*W* ACT ACT A ACK*W* ACT(W/-) ACA ACT - ACT(W/-) ACW* ACA - Figura 21. Esquema ejemplo que resume el método de optimización OA; las topologías de las secuencias requieren tres cambios nucleotídicos y dos indels; bases ambiguas de ancestros hipotéticos representadas con códigos IUPAC (ej: Y= T y C). Los asteriscos (*) denotan cambio de nucleótido. Las secuencias que no se presentan en cursiva son taxones terminales (modificado de Wheeler 1996).
Una segunda diferencia es que el producto de esta operación es una sola secuencia y un solo costo para producir esa secuencia a partir de sus descendientes. Esta secuencia se usa entonces como uno de los descendientes de su nodo parental, y esta operación es repetida. La suma de los pesos o costos de todos los eventos necesarios para formar los sucesivos nodos es el costo del cladograma, como ocurre en otros modelos de optimización de caracteres del tipo Sankoff. Después de este “desplazamiento descendiente”, un “desplazamiento ascendente” puede ser realizado para determinar el juego más parsimonioso de estados de caracter en cada posición para cada ancestro hipotético (Wheeler 2001). En el desplazamiento ascendente, el punto de inicio es el nodo raíz; no existe un pasaje ascendente real para este nodo, debido a que carece de ancestro. Los estados finales de la raíz son simplemente asignados a partir de los estados preliminares o estados finales del taxón que resulta como grupo externo. La determinación de la raíz puede afectar el comportamiento de los algoritmos de desplazamiento en descenso y ascenso. Ciertos caracteres pueden comportarse
60 “mejor” (generar cladogramas mas cortos) dependiendo de la raíz (Wheeler 2002). Desafortunadamente, es poco probable que estas raíces sean idénticas para todos los caracteres. Tal vez un sistema de raíces virtuales pueda ser diseñado de manera que cada carácter posea su mejor raíz propia, y luego optimizada a partir de este punto. El cladograma general final sería entonces desenraizado de manera explicita y presentado con un enraizamiento sólo al final del análisis (Wheeler 2002).
División de secuencias genéticas La optimización directa examina todas las homologías potenciales de nucleótidos entre dos secuencias por lo que el tiempo consumido es proporcional al producto de las longitudes de las secuencias comparadas. Aunque correcto, este procedimiento puede resultar prohibitivo en tiempos computacionales para fragmentos de gran tamaño de ADN (Giribet 2001). En los casos donde las secuencias exhiben regiones alternadas conservadas y variables (como dentro y entre las regiones cebadoras de PCR), el tiempo computacional requerido para el análisis puede ser disminuido dividiendo las secuencias en bloques (alineados o no alineados, dependiendo si existen diferencias de longitud entre los taxones para el bloque en particular) correspondientes a estas áreas. Debido que no se examinan las homologías de los nucleótidos por encima de cada bloque, la optimización dinámica procede más rápidamente. Una secuencia dividida en n fragmentos de longitud similar se logrará un factor de aceleración de aproximadamente n. Edgecombe et al. (1999) y Giribet et al. (2000) fueron los primeros en utilizar esta estrategia con el software de análisis filogenético POY, y los estudios de comportamiento por división de las secuencias utilizadas en los análisis filogenéticos realizados por Giribet (2001) han demostrado que la alteración de congruencia de los datos es nula en la mayoría de los casos, y mínima en muy pocos casos. Los cuidados a seguir con esta estrategia deben ser tomados en cómo se dividen las secuencias de ADN. Mientras la definición de bloques aumenta la eficacia computacional, se introducen hipótesis ad hoc (no testables) en el análisis. Es decir, se asume que los bloques son mutuamente exclusivos. Por ejemplo, si una partición crea tres fragmentos o bloques, el análisis asume que no hay ninguna homología entre el primer y segundo fragmento. El uso de secuencias “primers” es el procedimiento más conservador para bloques de datos genotípicos: Esta estrategia reduce la naturaleza ad hoc de las asunciones requeridas para la división de secuencias de ADN de gran tamaño.
Sectores “primers”
Secuencia 1 Secuencia 2 Secuencia 3 Secuencia 4 AB C D E FG Figura 22. Ilustración de la estrategia de división de secuencias. Una secuencia es determinada por el secuenciamiento de n fragmentos solapados que usan juegos de primers flanqueadores (A, B, C, etc.). Las secuencias contiguas resultan divididas usando las regiones primers como marcadores. El resultado: siete fragmentos, cada uno homólogo en todas las especies para el cual el gen fue
61 amplificado. En principio, esto no debe tener efecto en el análisis desde que la división separó nucleótidos no-homólogos.
Consideración final
La pregunta central que surge al aplicar estos métodos de análisis es cuales son las unidades a homologizar; OA y alineamiento múltiple pretenden perfeccionar numéricamente criterios similares, pero deben considerarse como medios diferentes de optimizar (Fig. 6) la misma cosa: el número mínimo de costos de transformaciones de nucleótidos e indels. En estas aplicaciones, OA es superior tanto en longitud (mínimo) del cladograma obtenido así como en congruencia topológica con respecto al alineamiento múltiple (Wheeler 2001). Las nociones diferentes de homología en los datos de secuencias afectan las hipótesis históricas y son fundamentales en nuestra elección entre hipótesis posibles.
ANÁLISIS DE GRANDES GRUPOS DE DATOS EN SISTEMÁTICA FILOGENÉTICA
Las dos técnicas computacionales heurísticas utilizadas para encontrar los cladogramas más parsimoniosos son los árboles de Wagner e intercambio de ramas. Un árbol de Wagner es un árbol creado por adición secuencial de taxones a la rama que resulte en el arreglo (topología) mas parsimonioso posible. En cada momento durante la adición de taxones, solo parte de los datos son utilizados: un taxón puede ser ubicado en alguna parte de la topología cuando sólo algunos taxones están presentes, pero podría ser ubicado mejor en otro lugar cuando todos los taxones son considerados. Por lo tanto, cual taxón/es han sido incorporados determina la forma del árbol de Wagner, por lo que diferentes secuencias de adición conllevará –para grupos de datos de gran tamaño- a diferentes resultados. El intercambio de ramas – ‘branch-swapping’ - es una conocida técnica para mejorar las búsquedas de topologías producidas por el método de Wagner. Para grupos de datos relativamente pequeños (ej: 30 o 40 taxones), TBR puede ser incapaz, a partir de ciertos árboles de iniciales, de encontrar las topologías mas parsimoniosas (Goloboff 2002). Las dos estrategias tradicionales acerca del problema de locales óptimos para el algoritmo TBR son el uso de múltiples puntos de inicio para TBR y la retención de topologías subóptimas durante el intercambio. El primero es más eficiente, donde los puntos de inicio para TBR más adecuados es a partir de realizar árboles de Wagner usando diferentes secuencias de adición para crear múltiples árboles de Wagner (típicamente aleatorización de la secuencia de adición de taxones a las topologías en análisis). La expectativa es que algunos de los árboles iniciales se encuentren cerca o en las colinas de los picos más altos.
62 Salvar demasiados árboles por réplica es una perdida de tiempo, porque los árboles obtenidos por intercambio difieren muy poco de las topologías originales y es poco probable que conlleven un nuevo óptimo (Goloboff 1999).
Figura 23. Cladograma de gran tamaño, destacando sectores; modificado de Goloboff 1999.
Técnicas tradicionales fallan debido a que cladogramas de gran tamaño pueden exhibir óptimos compuestos (Goloboff 1999): el algoritmo puede quedar “estancado” en locales óptimos para muchos grupos de sectores con 30-50 taxones, pero un árbol con por ejemplo 500 taxones tiene regiones o sectores los cuales pueden ser considerados como sub-problemas de 50 taxones. Cada uno de estos sub- problemas puede tener sus propios óptimos “locales” y “globales”.
Figura 24. Descripción de óptimos locales para el espacio de óptimos posibles del cladograma. El eje vertical representa la longitud posible de los cladogramas. A través de la adición de secuencias de forma aleatoria (RAS) + TBR es probable que se acceda a los puntos 1 y 3 y alcanzar los puntos 2, 4 o 5, pero se detiene en éstos. Para alcanzar el cladograma más corto como en 6 o el óptimo global en 7, técnicas cualitativamente diferentes son necesarias (modificado de Siddall 2002).
Un sector dado puede encontrarse con una configuración óptima local, pero resulta de cierta forma independiente de que otros sectores en la topología se encuentren asimismo en sus configuraciones óptimas. Si cinco sectores del árbol se encuentran en una configuración óptima, una nueva ronda de TBR podría encontrar otras configuraciones óptimas para otros sectores del árbol, pero es muy poco
63 probable también que encuentre los mismos cinco sectores que eran óptimos inicialmente, junto con los nuevos sectores óptimos (Goloboff 2002). Considerando un árbol de 500 taxones, donde el árbol obtenido posee 10 sectores diferentes (los cuales pueden poseer sus propios locales óptimos): si un análisis de TBR tiene una chance de 0,5 de encontrar la configuración óptima para un sector cualquiera, las chances de que un análisis de TBR encuentre la topología más parsimoniosa es de 0,5 10 , es decir menos de 1 en 1.000. Así, no sólo el número de rearreglos necesarios para completar TBR en topologías con más taxones crece exponencialmente, sino que también lo hace en número de réplicas de TBR que deberían ser realizadas para encontrar las topologías más parsimoniosas (Goloboff 2002).
Deriva de árboles (DFT) El algoritmo “deriva de árboles” (del inglés “Tree-drifting”; DFT) es una aplicación de reasociación simulada, una optimización general heurística que temporalmente acepta soluciones subóptimas como una forma de escape de locales óptimos. El DFT permite que las soluciones (cladogramas) subóptimas se acepten durante el intercambio de ramas, con una cierta probabilidad. La probabilidad de aceptar una solución subóptima depende de la diferencia de ajuste relativa (RFD) y la diferencia de longitud entre las nuevas y viejas soluciones. Dado dos cladogramas (A y B)
RFD AB = (F - C)/F, donde F es la suma de las diferencias de pasos para caracteres en los dos árboles para aquellos caracteres que definen el árbol A como mejor (la evidencia “favorable” al árbol A) y C es la suma de los caracteres que definen el árbol B como superior (la evidencia que “contradice” el árbol A). Las consideraciones de aceptación (probabilidad) están determinadas por: 1- Topologías candidatas que son mejores que el actual mejor cladograma/s con siempre aceptados. 2. Topologías candidatas que son tan buenas como el actual mejor cladograma/s son aceptados en un rango definido. 3. Topologías candidatas que sean peores que el actual mejor cladograma/s son aceptados en base a una probabilidad 1/(n + c - b), donde b es el mejor costo hasta ese momento, c es el costo del cladograma candidato y n el factor definido por el investigador. Durante el intercambio de ramas, un límite más bajo en RFD entre la topología original y la topología candidato puede estimarse rápidamente, comparándose la “caída en la longitud total cuando se añade una parte” al “aumento en la longitud total con el clado añadido en un determinado sitio” (Goloboff & Farris, 2001). Las soluciones resultantes que sean tán buenas o todavía mejores que la solución inicial (original) son las aceptadas. Determinar la viabilidad de una topología usando su diferencia básica de longitud y el valor de RDF es un criterio adecuado, porque esto en cuenta el conflicto real entre los caracteres (y el conflicto es a su vez lo que determina el óptimo local). Las variables F y C son calculados entre el árbol que está sufriendo intercambio de ramas actualmente y el árbol candidato, no entre la topología de entrada original y la topología candidato obliga a refugiarse en un árbol. Si la topología se acepta, el
64 intercambio de ramas continúa en la topología candidato. Una vez que un número dado de cambios, C, se han realizado al cladograma, una ronda de intercambio de ramas se realiza. La deriva entonces puede repetirse un número de veces D. El algoritmo DFTT resulta una modificación tanto de SPR y TBR.
Fusión de árboles (TF) Una manera eficiente de analizar grupos de datos de gran tamaño con locales compuestos resulta a través de estrategias de división, como el algoritmo ‘tree fuse’ TF (Goloboff 1999). Moilanen (1999) utilizó intercambio de sub-árboles como parte de su algoritmo de tipo genético (“selección natural”), pero solo intercambia subclados elegidos aleatoriamente, ubicándolos en una posición elegida aleatoriamente. A partir de de la optimización descendiente (‘down-pass’) de Gladstein (1997), TF realiza intercambios en grupos con cinco o más taxones, presentes en los consensos de ambos árboles, los cuales no se encuentran resueltos dicotómicamente (es muy poco probable que grupos de cinco taxones obtenidos por intercambio de ramas posean una configuración subóptima). Los grupos de intercambio son elegidos en un desplazamiento descendiente; si un grupo dentro de un sub-árbol ha sido seleccionado, el sub-árbol no es cambiado posteriormente (Goloboff 1999). TF (Goloboff 1999) parte de dos árboles y evalúa todos los posibles intercambios de sub-árboles con idéntica composición de taxones, donde dicho intercambio procura mejorar los árboles de inicio. TF resulta mas potente por sucesivos pares de fusiones de árboles, por lo que requiere de diversos árboles como datos de inicio para producir resultados; obtener dichos resultados requiere réplicas con adición de secuencias de forma aleatoria (RAS) y TBR. Una vez que árboles “cercanos” a las formas óptimas han sido obtenidos, TF produce mejoras en poco tiempo: considera que cada uno de los sectores se encontrará en al menos algunos de los árboles, y TF simplemente asocia juntos estos sectores óptimos para alcanzar la configuración óptima global. Esto permite realizar un uso correcto de árboles los cuales no son óptimos globalmente, pero al menos poseen algún/os sectores en configuración óptima (Goloboff 2002).
MEDICIÓN DE SOPORTE
El concepto de estructura cladística puede ser estudiada desde dos puntos de vista diferentes. El primero considera asignar “confianza” al cladograma más parsimonioso como un todo, mientras que el segundo examina el soporte producido a clados individuales dentro de los cladogramas más parsimoniosos y examina cuales de éstos son realmente soportados por la evidencia y cuales no (Siddall 2002). La forma más directa de evaluación del soporte de un clado dado puede ser realizada a partir del simple conteo del número de caracteres en la rama que lo posee; es decir, la longitud de la rama es igual al soporte de la rama (clado).
65 Soporte de Bremer
Un método propuesto como una forma precisa de medición del soporte de un clado dado es el número de pasos extra requeridos antes de que el clado en cuestión sea perdido del árbol de consenso estricto de los cladogramas cercanos a la longitud mínima. Este procedimiento a sido referido como soporte de Bremer (bi) (Kitching et al. 2000). Para realizar el cálculo de soporte de Bremer para un clado en particular del cladograma más parsimonioso, todos los cladogramas un paso mas largos que el mínimo son identificados. Luego, el consenso estricto de estos más el cladograma más parsimonioso es construido. Este proceso es repetido, aumentando el largo de las topologías subóptimas de a un paso por vez hasta que el clado en cuestión es perdido en el consenso. El número de pasos extra requeridos para alcanzar este punto es el soporte de Bremer para dicho clado. Cuando solo un cladograma más parsimonioso es encontrado para un grupo de datos, todos los clados presentes poseen un soporte de Bremer >1. Si existieran mas de un cladograma mas parsimonioso, entonces el cálculo del soporte de Bremer comienza con la construcción de un cladograma de consenso estricto o bien semi-estricto; algunos grupos serán necesariamente perdidos en este primer consenso y dichos grupos poseerán un valor Bremer de 0. Por esto, donde sea que exista múltiples cladogramas parsimoniosos, al menos un clado poseerá un soporte de Bremer de 0 (Kitching et al. 2000). El soporte de Bremer resulta por lo tanto una medida de “fortaleza” de la evidencia para un clado; cuando todos los caracteres son perfectamente congruentes, la reconstrucción más parsimoniosa es única y el soporte de Bremer iguala a la longitud de la rama. Si no, el soporte de un clado es reducido al grado de las hipótesis alternativas de agrupamiento igualmente parsimoniosas. Ninguno de los métodos de soporte considerados en la sistemática moderna (entre ellos el soporte de Bremer) definen “limites de confianza estrictos”, sin embargo el soporte de Bremer puede ser de gran utilidad como guía general en los resultados de una inferencia filogenética.
Análisis de sensibilidad y congruencia
Para determinar un cladograma a partir de datos de ADN, vía optimización directa, deben asignarse valores numéricos específicos por la alineación y los parámetros del análisis, normalmente llamados costo (peso) indel o gap (= inserción y deleción), costo de transversión, y costo de transición. Representan los pesos de transformación de los estados de los caracteres; el costo indel especifica el peso que se da a una inserción o al evento de deleción y los costos de transversión y transición son los pesos dados a las transformaciones de una base en otra base. Estos parámetros se expresan a menudo como proporciones de costos gap:transversión:transición; por ejemplo 4:2:1 (Schulmeister et al. 2002).
66 Estos valores parámetro son necesarios tanto para el proceso de alineación así como para el análisis filogenético. Normalmente, son bastante arbitrarios y sólo un grupo de parámetros son utilizados para el análisis. Sin embargo, los valores del parámetro pueden tener una influencia fuerte en el resultado de un análisis cladístico. Si un grupo aparece como monofilético o parafilético depende en muchos casos de los valores del parámetro gap:transversión:transición. Si sólo un análisis filogenético es realizado con un único parámetro de costos, permanece completamente desconocido cuánto resulta el resultado dependiente de éstos valores arbitrariamente escogidos. Para examinar la sensibilidad de un cladograma a la alineación y parámetros de análisis, y eliminar la arbitrariedad en la opción de estos valores, Wheeler (1995) introdujo el concepto de análisis de sensibilidad. En este análisis se comienza seleccionando varios parámetros, es decir, combinaciones de valores para las relaciones indel:transversión:transición que serán examinadas en el análisis de sensibilidad. Los datos moleculares se analizan separadamente y simultáneamente con los datos morfológicos para los juegos de parámetros seleccionados. Para elegir entre los juegos de parámetros, Wheeler (1995) consideró el uso de congruencia como un criterio externo. De las longitudes de los árboles de datos separados y los árboles simultáneos, la incongruencia de caracteres entre las particiones de datos individuales es calculada para cada parámetro determinado (Schulmeister et al. 2002). La combinación de valores del parámetro que minimiza la incongruencia (es decir, que maximiza la congruencia) es elegido como el mejor. El cladograma del análisis simultáneo que ha sido calculado con el juego de parámetros óptimos se presenta como la mejor hipótesis filogenética, porque es esta hipótesis la que minimiza la homoplasia extra, forzada en los datos a través de la combinación en un análisis simultáneo. Si un conjunto de datos se analiza con sólo un parámetro dado, se pasa por alto que los clados resultantes podrían depender fuertemente del costo del indel empleado y la relación transversion:transición. Uno de los méritos de un análisis de sensibilidad sensu Wheeler resulta en la determinación de hipótesis filogenéticas alternativas inherente en los datos, y la valoración de su estabilidad con respecto a los parámetros del análisis (Wheeler 1995). Una alternativa para determinar la congruencia entre diferentes grupos de datos para los mismos taxones terminales se realiza a partir de la congruencia estimada entre ellos (diferentes grupos de datos), siendo la congruencia de caracteres, o la congruencia entre las topologías mas parsimoniosas que resultan de análisis de los grupos de datos por separado; este procedimiento es llamado congruencia topológica o taxonómica (las expresiones congruencia de caracteres y congruencia taxonómica son también utilizados para describir análisis simultáneo y enfoque de consenso, respectivamente). Si diversos grupos de datos son analizados simultáneamente, la cantidad de incongruencia de caracteres o homoplasia presente entre todos los datos pueden ser distinguidos de aquellos que ocurren dentro de los grupos de datos por separado (incongruencia interna de grupos de datos) y la cantidad de homoplasia adicional que resulta solamente de combinar los diferentes grupos de datos (incongruencia entre grupos de datos): esta última puede ser calculada con la diferencia de longitud de incongruencia (ILD; Mickevitch & Farris 1981). Se define como la longitud de los cladogramas simultáneos menos la suma de las longitudes de los cladogramas individuales (análisis por separado) (Schulmeister et al. 2002).
67
ILD= (Longitud del cladograma simultáneo – Sumatoria de longitudes de los cladogramas separados) / Longitud del cladograma simultáneo. Puede examinarse bajo cuales combinaciones de parámetros un grupo dado de taxones resulta monofilético, representándose los resultados gráficamente en un cuadro de sensibilidad, llamado ´tabla navajo´. De esta manera, un análisis de sensibilidad puede discernir entre clados robustos (aquéllos que aparecen bajo la mayoría o todos los parámetros utilizados) y los clados inestables (aquéllos que sólo aparecen bajo uno o pocas combinaciones de parámetros). En otros términos, la robustez de un clado en el análisis de sensibilidad muestra cómo un clado estable es al concepto de relajación del criterio de optimización, que es así análogo al índice de decaimiento en el análisis de parsimonia. La estabilidad aquí resulta un tipo de medida de soporte (Schulmeister et al. 2002). Desde que los caracteres morfológicos no son influenciados por el costo de transición, transversión e indel, directamente sólo puede observarse sensibilidad del clado a los parámetros definidos para los datos moleculares. Pero en el análisis simultáneo, la sensibilidad de un clado causada por los datos moleculares puede compensarse por los datos morfológicos: si el apoyo morfológico para un clado es muy fuerte, puede aparecer en todos los árboles simultáneos aun cuando está presente en sólo unos o ninguno de los árboles moleculares. Comparando la sensibilidad del clado de los árboles moleculares a los árboles simultáneos se obtiene información sobre la fuerza del soporte morfológico en algunos casos (Schulmeister et al. 2002).
PROTOCOLO DEL MÉTODO CLADÍSTICO (MODIFICADO DE WENZEL 2002)
Prólogo: a partir de un problema (taxonómico o evolutivo) que parece relacionado a un grupo monofilético.
I- Establecer una matriz A. Determinar caracteres 1- rango de estados de caracteres (homologías primarias) B. Codificación de caracteres 1- rango de codificación: definición de adición de los estados de caracteres 2- rango de dependencia: ninguno (no implica polaridad) C. Elegir grupos externos para proveer raíz (por lo tanto polaridad) 1- dos o más taxones reales son preferibles a. cercanos es mejor que otros más distantes
II- Establecer un esquema de pesos A. Uniforme o diferencial 1- caracteres, estados de caracter
68 2- estático o dinámico a. función simple
III- Calcular el recorrido más corto a través de la matriz por homología dinámica (OA)* A. Decidir Homología de caracteres a partir de la variación observada 1- dentro de los caracteres, decidir los estados de homología específicos de cada topología analizadas B. Búsqueda de cladogramas más parsimoniosos (óptimos) 1- SPR y TBR 2- Deriva de árboles (DFT) a. DFT-SPR b. DFT-TBR C. Realizar consenso de los múltiples árboles 1- Consenso estricto D. Análisis de búsqueda - intercambios de óptimos globales en cladogramas de consenso 1- Intercambio de clados (sub-árboles) con idéntica composición de taxones en árboles sub- óptimos: fusión de árboles (TF) E. Informe de estadísticas de árboles 1- Longitud (el más corto, consenso) 2- CI, RI 3- Soporte: a. soporte de Bremer b. sensibilidad (tablas navajo)
IV- Volver al paso I: reconsiderar condiciones iniciales y repetir (réplicas)
Epílogo: publicar los árboles consenso y aquellos de interés particular (topologías, particiones, raíces, pesajes, etc). Reconocer grupos monofiléticos para conservar taxonomía cuando sea posible.
*Considerado para datos moleculares analizados en el software POY (Wheeler, Gladstein & De Laet 2003)
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MATERIALES Y MÉTODOS PARA EL ESTUDIO REALIZADO
Materiales1
> Análisis simultáneo (Medusozoa): • 74 terminales (73 representando especies y 1 representando el orden Conulatae) presentando 87 caracteres morfológicos, 48 de ellos informativos para análisis filogenético obtenidos de la matriz de datos extendida a partir de Marques & Collins (2004) y modificada la codificación para Conulatae (caracter 17 0→?; caracter 62 1→?). Las secuencias (caracteres aprox.: 1.850pb) del gen ribosomal nuclear 18S fueron obtenidas del sitio web Genebank.
> Análisis molecular (Hydrozoa):
• 117 taxones terminales (especies), los cuales presentan secuencias (caracteres aprox.: 400pb) del gen ribosomal mitocondrial 16S, obtenidas del sitio web Genebank (56 secuencias) y del Consorcio de Secuenciamiento de Hydrozoa, Universidad de Duke, E.E.U.U (61 secuencias).
Métodos
> Análisis simultáneo (Medusozoa)
Las secuencias fueron analizadas inicialmente en el software Bioedit 7.0 (Hall 2004) para definir los sectores “inicio y fin” así como bloques de ADN, a través de un alineamiento básico con el algoritmo incluido en el software Clustal X (Thompson et al. 1997). Eliminamos los sectores “inicio y fin” de las secuencias para definir una región básica de alineamiento; en total, eliminamos aprox. 20pb en cada sector observando muy poca variabilidad en los terminales para las regiones consideradas. Definimos los bloques de ADN para el análisis filogenético en el software POY (total de 24 bloques ADN siendo 11 bloques pre-alineados y 13 bloques no alineados). Después de la determinación de los bloques, eliminamos todos los gaps de los bloques no alineados, construyendo un matriz para ser utilizada en el paso siguiente, la producción de las hipótesis filogenéticas. Para esto, el software utilizado para el análisis de parsimonia (determinación de cladogramas óptimos) fue el POY (Parallel Objective Yet another parsimony) 3.0.11 (Wheeler, Gladstein & De Laet 2003); el software utilizado para visualización de resultados obtenidos en POY fue el
1 Ver tabla 2.
70 Winclada 1.00.08 (Nixon 2002). En total, realizamos tres análisis individuales por cada matriz de costo molecular, a saber, (1) un análisis sólo para la matriz morfológica, (2) un análisis sólo para la matriz molecular y (3) un análisis simultáneo de las matrices molecular y morfológica.
Protocolo general para los análisis: - Nro. de réplicas: 10. - Matrices de costo para datos moleculares: 10 ([1:1:1][1:1:2][2:1:1][2:1:2][2:2:1] [4:1:1][4:1:2][4:2:1][8:1:2] [8:2:1]); Matriz de costo único para datos morfológicos: 1 (no aditivos, no polarizados). - Grupo externo: Anthopleura kurogane (Anthozoa). - Adición de secuencias: aleatoria. - Algoritmos utilizados para búsqueda de cladogramas óptimos: TBR; Drift TBR; TF. - Análisis de Incongruencia (ILD). - Análisis de Bremer para el árbol filogenético más parsimonioso (análisis simultáneo). - Análisis de Sensibilidad.
> Análisis molecular (Hydrozoa)
Las secuencias fueron analizadas inicialmente en el software Bioedit 7.0 (Hall 2004) para definir los sectores “inicio y fin” así como bloques de ADN, a través de un alineamiento básico con el algoritmo incluido en el software Clustal X (Thompson et al. 1997). Eliminamos sectores “inicio y fin” de las secuencias para definir una región básica de alineamiento; definimos aprox. 400pb (región próxima al inicio de la secuencia ADNr 16S) para ser aplicados al análisis filogenético. Definimos los bloques de ADN para el análisis filogenético en el software POY: el total bloques ADN generados fueron 2 y ambos no alineados (aprox. 200pb cada bloque); luego de la determinación de los bloques, eliminamos todos los gaps de los bloques no alineados para ser utilizados en el paso siguiente. El software utilizado para el análisis de parsimonia (determinación de cladogramas óptimos) fue el POY (Parallel Objective Yet another parsimony) 3.0.11 (Wheeler, Gladstein & De Laet 2003); el software utilizado para visualización de resultados obtenidos en POY fue el Winclada 1.00.08 (Nixon 2002). Incluye un único análisis molecular con matriz de costo molecular.
Protocolo general para los análisis: - Nro. de réplicas: 50. - Matriz de costo para datos moleculares: 1 ([1:1:1].
71 - Grupo externo: Olindias phosphorica. - Adición de secuencias: aleatoria. - Algoritmos utilizados para búsqueda de cladogramas óptimos: TBR; Drift SPR; Drift TBR. - Análisis de Soporte (índices de consistencia y retención).
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6. RESULTADOS
El mejor resultado de los análisis simultáneos (mejor valor ILD) fue obtenido para la matriz de costo molecular 1:1:2, con una longitud (número de pasos) de 4.156, ILD = 0,0004812.
El mejor resultado del análisis molecular (16S) de Hydrozoa para la matriz de costo molecular 1:1:1, con una longitud (número de pasos) de 3.893; CI = 0,5 RI = 0,75.
Id:Tv:Ti Mol Morf Simult ILD
1:1:1 2.991 111 3.109 0,0022515
1:1:2 4.043 111 4.156 0,0004812
2:1:1 3.483 111 3.603 0,0024979
2:1:2 4.846 111 4.964 0,0014102
2:2:1 4.426 111 4.545 0,0017602
4:1:1 4.301 111 4.430 0,0040632
4:1:2 5.720 111 5.841 0,0017120
4:2:1 5.336 111 5.465 0,0032937
8:1:2 7.264 111 7.393 0,0024347
8:2:1 6.936 111 7.066 0,0026889
Tabla 7. Resumen de valores obtenidos (número de pasos) en base a matrices de costo para datos moleculares indel:transversión:transición (Id:Tv:Ti) y morfológicos (codificación binaria o multiestado, no ordenada). Valores para índice de congruencia (ILD): número de pasos para los cladogramas obtenidos análisis solo molecular (Mol), número de pasos para los cladogramas obtenidos en análisis simultáneo (Simult) y número de pasos para el cladograma obtenido en análisis morfológico (Morf).
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Id:Tv:Ti Mol Simult Hit/Mol TF/Mol Hit/Simul TF/Simul *Hit/Morf
1:1:1 2.991 3.109 3 no 5 no 10
1:1:2 4.043 4.156 1 no 1 si (1)
2:1:1 3.483 3.603 4 si (4) 2 si (2)
2:1:2 4.846 4.964 1 no 1 no
2:2:1 4.426 4.545 1 no 3 si (3)
4:1:1 4.301 4.430 2 no 3 no
4:1:2 5.720 5.841 1 si (3) 1 si (3)
4:2:1 5.336 5.465 1 si (7) 1 si (5)
8:1:2 7.264 7.393 3 no 4 no
8:2:1 6.936 7.066 1 si (1) 1 si (8)
Tabla 8. Casos en los cuales el algoritmo TF permite alcanzar cladogramas más parsimoniosos (si, no) y en los casos positivos, el número de pasos disminuido en cada situación (TF/Mol, TF/Simul y TF/Morfl). Número de ocasiones que se encontró el mismo número de pasos (diferentes cladogramas) en diferentes réplicas para cada matriz de costo de análisis molecular, simultáneo y morfológico: Hit/Mol, Hit/Simul y Hit/Morf, respectivamente. * A fines prácticos los resultados para el análisis morfológico Hit/Morf se colocan en posición de matriz molecular 1:1:1; TF no permite obtener en este caso un cladograma más óptimo. Las longitudes de los árboles más parsimoniosos obtenidos para cada caso (morfológico, molecular y simultáneo) junto con cada valor de ILD son definidos en la tabla. La tabla permite definir los casos donde se observaron efectos en la aplicación del algoritmo tree fuse (TF), así como los valores resultantes. La figura 25 detalla las relaciones genealógicas resultantes (árbol filogenético de consenso estricto) del análisis simultáneo 1:1:2 (más parsimoniosas), con la descripción de los grupos formales (familias, subórdenes, órdenes, subclases y clases) estudiadas en el análisis de Medusozoa, así como los valores del soporte de Bremer obtenidos para cada clado. La figura 26 detalla resultados de sensibilidad (tablas navajo) para los clados más relevantes del análisis (árbol filogenético de consenso estricto del análisis simultáneo 1:1:2). La figura 27 es el resultado (árbol de consenso estricto) del análisis molecular 1:1:2 y la figura 28 detalla el resultado del análisis morfológico. La figura 29 detalla las relaciones genealógicas resultantes (árbol filogenético) del análisis molecular de Hydrozoa 1:1:1, con la descripción de de los grupos formales (géneros, familias, superfamilias, subórdenes, órdenes, subclases y clases estudiadas en el análisis de Hydrozoa (marcador molecular 16S).
74 32 22 * Condición del clado: no monofilético 36** ** Enraizamiento posterior al análisis 22 36 37 19 25 FIG.25 31 33 Coronatae 28 22 24 Scyphozoa 34 Semaeostomeae Discomedusae 36 27 28 Rhizostomeae
15 (incluyendo P. camtschatica) 18 Stauromedusae 30 29 Chirodropidae 32 30 29 Cubozoa 13 15 Carybdeidae 33 21 24 27 Olindiidae Limnomedusae 25 Geryoniidae 23 18 Halicreatidae Trachymedusae 37 Trachylina 31 Rhopalonematidae 29 36 26 Cuninidae Narcomedusae 26 41 Hydridae Capitata* 26 Bougainvilliidae 32 Hydractiniidae Filifera* 40 Moerisiidae 37 Porpitidae 14 Milleporidae 37 33 Solanderiidae 23 34 Cladonematidae Capitata* Hydrozoa 16 Corynidae
27 Hydroidolina 24 36 Polyorchidae 44 48 Pyshaliidae 40 Amalgatidae Physophoridae 39 31 Diphyidae Siphonophorae 19 43 Sphaeronectidae 28 Hippopodiidae Prayidae 34 Eudendriidae Filifera* Laodiceidae 38 37 Aglaopheniidae 28 Sertulariidae 26 32 Campanulariidae Leptothecata 34 Mitrocomidae 25 32 Aequoreidae * Condición del clado propuesto: no monofilético Matrices de costo moleculares indel:transversión:transición
1:1:1 1:1:2 2:1:1 2:1:2 2:2:1
4:1:1 4:1:2 4:2:1 8:1:2 8:2:1
Semaeostomeae* Clado presente en todos los árboles Clado presente en 50% o más de todos los árboles Clado ausente en el 50% o menos de los árboles (Stauromedusae, Cubozoa)
FIG.26
Trachymedusae*
Narcomedusae
Hydridae basal (Hydroidolina)
Bougainvillia sp + P. carnea
Capitata
Obelia sp + (Clytia sp + Tiropsidium kelseyi) * Condición del clado: no monofilético
Anthozoa FIG.27
Scyphozoa
Cubozoa
Stauromedusae
Trachylina
Cnidaria Capitata* Medusozoa Leptothecata*
Hydrozoa Capitata
Hydroidolina
Filifera*
Siphonophorae
Filifera* Filifera* Leptothecata* * Condición del clado: no monofilético
Anthozoa FIG.28
Stauromedusae
Scyphozoa
Cubozoa
Trachylina* Cnidaria
Medusozoa
Anthoathecata
Hydrozoa
Hydroidolina Siphonophorae
Leptothecata Olindiidae Limnomedusae
Aeginidae Narcomedusae Geryoniidae Trachymedusae Subrayado: condición del clado no Aglaopheniidae monofilético *: formalmente miembro de Halopterididae Leptothecata Superfamilia Plumularioidea* **: formalmente (ex Conica) Plumulariidae miembro de Aglaopheniidae Anthoathecata
Plumulariidae FIG.29 Kirchenpaueriidae Candelabridae
Tubulariidae
Aplanulata** (ex CapitataFil) ) Corymorphidae Tubulariidae Hydridae
Prayidae Siphonophorae Physaliidae
Sertulariidae
Superfamilia Sertularioidea* (ex Conica) Pennariidae** Clavidae**
Sertulariidae
Aequoreidae Blackfordiidae Conica* Aequoreidae Campanulariidae Phialuciidae Campanulariidae
Proboscidoidea*
Mitrocomidae Eirenidae Conica* Campanulariidae Bougainvilliidae** Laodiceidae Cladocorynidae Solanderiidae Zancleidae
Porpitidae Cladonematidae Eleutheriidae Moerisiidae Capitata**
Corynidae
Polyorchidae
Corynidae
Ptilocodiidae
Eudendriidae Filifera**
Hydractiniidae Clavidae 7. EXPOSICIÓN DETALLADA DE FILOGENIAS Y DISCUSIÓN
MEDUSOZOA
Todos los análisis llevados a cabo en la consideración para el monofiletismo de Medusozoa corroboran este grupo histórico, además de la existencia de los grupos Octocorallia y Hexocorallia; el enraizamiento posterior al análisis (determinación de Anthozoa en el árbol) no afecta la estructura de los grupos básicos (subfilos) hermanos de Cnidaria. El hecho de que si el ancestro de Cnidaria era un pólipo o una medusa (o bien una actínula o plánula) ha sido motivo de debate por mas de un siglo (cf. Brooks 1886) y es todavía motivo de disputa. Si la hipótesis obtenida es tomada como una hipótesis de trabajo, el ancestro pólipo probablemente poseía septo completo; si era, además, portador de musculatura gastrodérmica o peridérmica no resulta definido. La probable simetría del ancestro cnidario es birradial, como previamente planteó Salvini-Plawen (1978, 1987). Este resultado refuerza la conclusión obtenida en un análisis reciente demostrando que los cnidarios antozoos y bilaterios comparten mecanismos moleculares responsables de la generación del eje corporal, y que resulta más probable que fueron heredados de un ancestro común birradial (Hayward et al. 2002). Siendo el cnidario ancestral un pólipo adulto, entonces la adición de un estadio de medusa al ciclo de vida es probable que haya surgido en el linaje de Medusozoa, sugiriendo la medusa como sinapomorfia del grupo (Marques & Collins 2004). En los resultados obtenidos en el estudio simultáneo, Medusozoa presenta un marcado soporte en la propuesta de dos grupos hermanos, uno de ellos contempla a (Scyphozoa(Stauromedusae,Cubozoa)) y el otro es el grupo Hydrozoa. Uno de los aspectos más relevantes del resultado simultáneo más parsimonioso (figura 25) es el hecho de que las propuestas genealógicas no coinciden en todos los clados obtenidos con los análisis particionados (molecular 1:1:2 y morfológico, figuras 27 y 28), demostrando la generación de propuestas históricas exclusivas (“segunda señal”) de los estudios simultáneos. En uno de los grupos hermanos principales obtenidos en el análisis, (Scyphozoa(Stauromedusae,Cubozoa)), el ancestro parece formar la medusa de la región oral del pólipo. En contaste, el hidrozoo ancestral probablemente desarrollaba medusas por medio de nódulos laterales de células indiferenciadas (entocodon) localizados entre el ectodermo y el endodermo (Marques & Collins 2004). A pesar de que estos dos tipos de formas de producción de medusas pueden haber evolucionado independientemente, resulta muy poco probable; se debe tener a consideración que los marcadores moleculares utilizados desconocen o carecen de toda consideración de homología morfológica, por lo que resultan sumamente útiles para estudios de grupos con diferentes fenómenos de metamorfosis. Hay un dualismo interpretativo aquí: por un lado, la similaridad en la morfología de medusa sugiere que es más probable que un proceso evolucionó a partir del otro. Al mismo
79 tiempo, por otro lado, los dos procesos son bastante diferentes, y es difícil imaginar como uno puede haber evolucionado del otro.
CLADO (SCYPHOZOA(STAUROMEDUSAE,CUBOZOA))
Medusozoa presenta un marcado soporte en la propuesta de dos grupos hermanos, uno de ellos contempla a Scyphozoa ((Coronatae,Conulatae)(Semaeostomeae,Rhizostomeae)) como grupo hermano de (Cubozoa, Stauromedusae), confirmando la existencia del suborden Discomedusae (Marques & Collins 2004). Marques & Collins (2004) obtienen como resultado de su estudio morfológico que Stauromedusae es el grupo hermano de Conulatae, proponiendo la clase Staurozoa. Los resultados en el análisis simultáneo plantea a Conulatae como grupo hermano de Coronatae, por lo que el grupo Staurozoa no sería real, al menos en el sentido original. La recodificación de Conulatae para el presente análisis así como el gran número de valores perdidos (missing data) para el grupo fósil serían los causales de la propuesta genealógica del presente análisis, demostrando su condición de “comodín” filogenético característico de terminales fósiles. Los resultados del análisis simultáneo asimismo confirmarían los argumentos que plantean la estrecha relación con el grupo Coronatae, basados en la similaridad de las pruebas apatiticas de los conularideos y la teca quitinosa de los pólipos de Coronatae (Werner 1966; Van Iten 1991; Van Iten et al. 1996). El análisis molecular de Collins (2002) posee resultados heterogéneos en sus resultados (árboles filogenéticos): el monofiletismo de Scyphozoa en su concepción formal no es soportado, y un grupo incluido tradicionalmente en Scyphozoa (Stauromedusae) se asocia como grupo hermano de Cubozoa con bajo valor de soporte de Bremer (bi = 4). Lo mismo acontece con el grupo formado por Coronatae, Rhizostomeae y Semaestomeae como grupo hermano del grupo Cubozoa y Stauromedusae (bi = 8). De esta manera Collins (2002) define que los taxones considerados miembros de Scyphozoa no formarían un clado natural: existiría parafiletismo con respecto a Cubozoa o con respecto a los demás medusozoarios. Marques & Collins (2004) determinan una estrecha vinculación entre Cubozoa y Stauromedusae, siendo parte de un grupo hermano de (Coronatae(Semaeostomeae,Rhizostomeae)). El grupo Semaeostomeae, para los taxones considerados en el estudio simultáneo de Medusozoa, es parafilético con altos niveles de soporte de sensibilidad y Bremer; los resultados moleculares de Collins (2002) brindan una información similar: los valores de soporte indicando que Semaestomeae es parafilético con respecto a Rhizostomeae son altos (bi = 23) para el clado obtenido, que contienen las especies Phacellophora camtschatica además de las especies analizadas de Rhizostomeae.
80 Coronatae resulta el grupo hermano de Rhizostomeae y Semaestomeae, una consideración planteada por Thiel (1966) a partir de evidencias morfológicas. Estos tres grupos poseen de manera exclusiva rebordes en las medusas adultas y medusas juveniles distintivas (éfiras), producidas por estrobilación. Las especies de Coronatae y Semaeostomeae desarrollan estrobilación “polidisco” (múltiples éfiras incipientes se desarrollan una encima de la siguiente. En contraste, los miembros de Rhizostomeae poseen estrobilación “monodisco”. En ambos casos, los pólipos que desarrollan estrobilación regeneran tentáculos luego de que la éfira es liberada, y este proceso se repite. Tanto los resultados del análisis simultáneo del presente estudio, así como los resultados a partir del marcador molecular ribosomal 18S (Collins 2002) y morfología (Mayer 1910; Uchida 1926; Thiel 1966) determinan que Semaeostomeae es parafilético con respecto a Rhizostomae, considerándose la estrobilación monodisco derivada del estado polidisco. El grupo Stauromedusae por su parte es el grupo hermano con respecto a los taxones miembro de las familias Chirodropidae y Carybdeidae (Cubozoa) en el árbol filogenético más parsimonioso del análisis simultáneo. Tanto el género Carybdea (Cubozoa) como el género Haliclystus (Stauromedusae) no serían monofiléticos, pero se debe considerar que hasta el momento el único marcador molecular aplicado para estudios filogenéticos en estos grupos es el gen ribosomal 18S, por lo que sería de gran utilidad la aplicación de otros marcadores moleculares (ejemplo, 28S) para la confirmación de que dichos géneros no serían parafiléticos y no en el caso de los resultados actuales la consecuencia de una “historia molecular” diferente a la de los taxones considerados (genes trees vs species trees). Collins (2002) obtiene es este aspecto resultados similares. Los ciclos de vida de las especies de Stauromedusae, cuyas partes son conocidas, son muy peculiares. Los adultos viven sujetos a un substrato, y a diferencia de la mayoría de los cnidarios, la plánula de las estauromedusas son no- ciliadas, contráctiles y permiten el desplazamiento de la plánula, con un número invariante de células endodérmicas adheridas no-divisibles. La larva se asienta y desarrolla un pólipo juvenil el cual metamorfea tomando algunas características similares a la de medusas adultas de otros escifomedusas y cubomedusas, por ejemplo estructuras primarias huecas en el origen tentacular. Al mismo tiempo, la porción aboral del adulto mantiene características de pólipo como septo gástrico y cuatro músculos circulares en corona, gónadas y ocelos rodeando la boca, precisamente como es observado en otras escifomedusas. Diversas propuestas históricas plantearon la relación próxima entre Cubozoa y Stauromedusae (Haeckel 1879, Uchida 1929). Collins 2002 considera prematura definir una opción de filogenia en las relaciones a los grupos Cubozoa, Scyphozoa y Stauromedusae, debido a que su análisis no logra definir relaciones entre Scyphozoa, Stauromedusae y Cubozoa de manera inequívoca: muchas de las características utilizadas para “aliar” Cubozoa y Stauromedusae es la pérdida derivada de caracteres de otros grupos de escifozoos, además de poseer caracteres tales como claustrum: una línea de tejido consistente en una doble capa de endodermo la cual conecta el septo (Thiel 1966). Marques & Collins 2004 obtienen en su análisis inicial (sin pesaje sucesivo) 48 árboles, donde los árboles de consenso estricto y semiestricto poseen topologías altamente politómicas, incluyendo solos tres
81 grupos monofiléticos, de los cuales uno de ellos resulta (Coronatae(Semaeostomae, Rhizostomae)), similar al análisis simultáneo del presente estudio. El estudio simultáneo determina una topología totalmente resuelta para estos grupos, siendo la propuesta (Stauromedusae,Cubozoa) altamente soportada tanto por valores de Bremer y presente en varios de los estudios de sensibilidad de matrices de costo molecular. Como fue previamente mencionado, la estrobilación es una característica de Scyphozoa, considerando dicho grupo (Coronatae(Semaeostomeae,Rhizostomeae)). Las estauromedusas (pólipos) desarrollan metamorfosis en su porción oral para dar forma al adulto y los pólipos de Cubozoa metamorfosean completamente en medusas simples. En todos los tres casos, la orientación de la boca adulta es la misma que en el pólipo. Se ha sugerido que la producción de medusas por metamorfosis de la región oral del pólipo es un carácter ancestral al grupo (Scyphozoa,Cubozoa), o incluso a Medusozoa (Collins 2002), a pesar de haber una ambigüedad en la optimización de este nodo en su árbol evolutivo. Asimismo, dichos análisis de sensibilidad permiten obtener interesantes resultados: en los casos donde el grupo (Stauromedusae,Cubozoa) no existe, Stauromedusae aparece como grupo hermano (basal) de un clado formado por Scyphozoa y Cubozoa en todos los casos. Este aspecto puede ser reflexionado de dos maneras distintas; por un lado el análisis de sensibilidad demuestra la relevancia de una exploración acerca de la optimización de caracteres moleculares al definir nuestra propuesta genealógica (más congruente y consistente) con respecto a todos los clados posibles de ser formados en el árbol filogenético. Por otro lado, dicho resultado estaría brindando “información adicional” de que Stauromedusae sería el grupo actual más primitivo (junto con Cubozoa como grupo hermano) del clado (Scyphozoa(Stauromedusae,Cubozoa)). Un raro y dudoso grupo no incluido en el análisis, Tesseranthinae, que algunos autores consideran como un representante de Stauromedusae, sólo posee miembros pelágicos (Mayer 1910; Goy 1979). Conocer de forma completa los ciclos de vida de los miembros de Stauromedusae, los modelos de desarrollo y sus consecuencias en la definición de la metamorfosis brindarían una importante información para la discusión de las formas ancestro-descendientes (posiciones filogenéticas) de los grupos Scyphozoa, Stauromedusae y Cubozoa, ya que al momento no resulta inequívoco si la estrobilación es la forma ancestral o bien derivada de la metamorfosis de dicho grupo. Asimismo, una mayor y mejor comprensión de los genes cuya expresión permiten el desarrollo de la fase de medusa en dichos subgrupos brindará la información adecuada a la hora de consideraciones de ortología y paralogía para dichos genes, así como también para las consideraciones de homología de las estructuras morfológicas desarrolladas durante las fases de metamorfosis en cada caso particular.
82 HYDROZOA
Los análisis, tanto simultáneos (altos niveles de soporte de Bremer y sensibilidad) en Medusozoa, así como el análisis molecular en el caso específico de Hydrozoa, brindan la misma información acerca de la existencia de los grupos hermanos (subclases): Trachylina e Hydroidolina. Asimismo, diversas propuestas de relaciones (Hyman 1940; Naumov 1960; Petersen 1979, 1990; Bouillon & Boero 2000) no son soportadas, generando propuestas (relaciones filogenéticos) hasta la fecha no reconocidas. Tanto los estudios simultáneos como el análisis molecular exclusivo (16S) demuestran la capacidad informativa de los datos aportados por los marcadores moleculares 16S y 18S, así como los datos presentes en la matriz morfológica. Las señales para familias propuestas son, en general, consistentes (monofiléticas), aunque las consideraciones (relaciones históricas) intra-familias y géneros claramente se sugiere ser consideradas en estudios a posteriori. Es también de considerar que futuros estudios moleculares con diferentes matrices de costo molecular y análisis de sensibilidad correspondientes brindarán la posibilidad de un estudio exhaustivo del soporte de los clados así como también la fiabilidad del marcador molecular utilizado (en este caso, 16S).
Trachylina
Consiste en (Limnomedusae(Trachymedusae,Narcomedusae)), resultando Limnomedusae basal, en los cuales parte de las especies poseen un ciclo de vida “característico” de Hydrozoa: una plánula que desarrolla en un pólipo bentónico con desarrollo de medusa a través del entocodon, siendo esta la condición plesiomórfica para Trachylina.
Figura 30. Detalle del clado Trachylina presente en fig. 29.
Prácticamente todos los miembros de Trachymedusae y Narcomedusae son holopelágicos, indicando que esta condición evolucionó en el mismo linaje y se ha planteado la posibilidad de que Trachymedusae sea parafilético (Collins 2002). El
83 árbol mas parsimonioso del análisis simultáneo posee una propuesta genealógica donde Liriope tetraphylla (formalmente miembro de Trachymedusae) es basal al grupo formado por los demás taxones muestreados de Trachymedusae y Narcomedusae; el análisis molecular 16S posee diferencias en las especies analizadas pero con resultados generales similares: las especies del género Craspedacusta se agrupan como hermanas del género Maeotias, mientras que Olindias phosphorica (Olindiasidae, Limnomedusae) resulta basal a (Narcomedusae, Trachymedusae). Marques & Collins (2004) plantean el poco soporte de datos morfológicos (sinapomorfias) para este grupo, y otros investigadores ya han considerado el hecho de este grupo resulte polifilético (cf. Marques & Collins 2004). Las especies de Trachymedusae poseen desarrollo directo, o bien una ontogenia que incluye una plánula ciliada con forma tentacular (larva actínula) entre las etapas de gástrula y medusa (Bouillon & Boero 2000). La mayoría de las narcomedusas parásitas (generalmente de otros cnidarios) poseen una forma de pólipo, pero como Bouillon (1987) menciona, dicha fase es extremadamente diferente de los pólipos de Hydrozoa típicos, como la forma de generación de la fase de medusa (reproducción asexual y posterior metamorfosis total a medusa). El estadio de “pólipo” de Narcomedusae es relativamente similar al fenómeno de metamorfosis de Cubozoa por lo que algunos investigadores (Petersen 1979; Bouillon 1987) plantearon la posible conexión con dicho grupo. Sin embargo, ninguno de los estudios a la fecha soportan esta consideración (Collins 2002; Marques & Collins 2004) incluyendo el presente estudio. Alternativamente se ha sugerido que la metamorfosis del narcopólipo es una autopomorfia par parte de los subgrupos de esta subclase, coincidiendo con los resultados del presente estudio. Trachylina no es un grupo rico en especies y a la fecha sólo un análisis cladístico (Marques & Collins 2004) ha sido desarrollado considerando la relación con otros grupos propuestos como miembros de Trachylina (Actinulidae y Laingiomedusae), donde las relaciones genealógicas obtenidas son (Actinulidae(Trachymedusae(Narcomedusae,Laingiomedusae))); Limnomedusae no resulta miembro del grupo Trachylina e Hydrozoa se encuentra en condición politómica. En dicho estudio el pesaje sucesivo permite obtener tres árboles mas parsimoniosos, totalmente resueltos, en donde Limnomedusae aparece en tres posiciones diferentes, ya sea como grupo basal de Hydrozoa, asociado a miembros de Trachymedusae (definiendo Trachylina de la misma forma que el presente estudio) o bien como grupo hermano de (Leptothecata (Siphonophorae, Anthoathecata). Un mayor número de taxones (y coincidentes en futuros análisis) brindaría información de gran relevancia para determinar las relaciones históricas existentes entre las especies de Trachymedusae, Actinulidae, Laingiomedusae, Narcomedusae y el grupo basal de Trachylina, Limnomedusae.
Hydroidolina
El grupo Hydroidolina resulta parte de los resultados de ambos estudios, así como se destaca que se obtiene como parte de resultados previos (Collins 2000; Collins 2002; Marques & Collins 2004).
84 Anthoathecata ha sido discutido como un posible grupo no monofilético (Schuchert 1996; Collins 2000; Collins 2002). Asimismo, los resultados plantean que sus subórdenes Capitata y Filifera no son monofiléticos. Por su parte, Leptothecata tampoco resulta monofilético ni sus subórdenes Proboscidoidea y Conica.
Figura 31. Detalle del clado Aplanulata (ex Capitata) presente en fig. 29.
El análisis simultáneo plantea a Hydridae como grupo hermano de los demás taxones de Hydroidolina; dicho grupo (Hydroidolina) contiene una multitud de especies que poseen especies coloniales con individuos polimórficos de manera casi exclusiva – con respecto a Cnidaria, especies polimórficas se hallan presentes en el grupo Octocorallia y en Medusozoa el género de Limnomedusae Monobrachium (Bouillon & Boero 2000). El único grupo principal dentro de Hydroidolina en donde las especies polimórficas no son encontradas es Hydridae, grupo de agua dulce (algo muy poco común para los cnidarios) caracterizados por la falta de fase de medusa, compartido en algunos limnomedusas y Polypodium (incertae sedis). Este resultado al no determinar la existencia de grupos hermanos de Hydridae y al resultar grupo basal de Hydroidolina, brinda información para el soporte de la hipótesis de un ancestro común de agua dulce de Hydrozoa y el parafiletismo de Anthoathecata; por otra parte el estudio específico de 16S aporta un número mayor de terminales e Hydridae mantiene una posición genealógica general similar, formando un grupo denominado Aplanulata (Collins, comentario personal) donde Hydridae es hermano de un grupo que incluye las familias Candelabridae, Corymorphidae y Tubulariidae. El nombre propuesto a este grupo se debe a la propuesta de Petersen (1990) como sinapomorfia a partir del desarrollo del cigoto a pólipo a través de una fase de estereogástrula no-ciliada, diferente de la larva plánula típica de los demás miembros de Hydrozoa. Otro aspecto a considerar en estos resultados es que todos los miembros de Aplanulata son miembros del grupo formal (suborden) Capitata (Anthoathecata), por lo que tanto Capitata (estenotelos siempre presentes en los pólipos y medusas; boca de medusa generalmente simple sin brazo oral ni tentáculos orales) como Anthoathecata no serían grupos monofiléticos.
85 La relación particular de Candelabridae, Tubulariidae y Corymorphidae también fue reconocida por hipótesis previas (Naumov 1960; Petersen 1990) y existiría parafiletismo de Tubulariidae y Corymorphidae, por lo que se debe considerar la pérdida de señal filogenética “real” del marcador molecular (16S) para dichas familias y los géneros, o bien reconsideraciones taxonómicas deberían ser discutidas a futuro. Aplanulata (taxones formalmente considerados miembros de Anthoathecata) resulta grupo hermano de la superfamilia Plumularioidea (formalmente considerada miembro de Conica, Leptothecata) en el análisis molecular (16S) específico de Hydrozoa. El monofiletismo de Plumularioidea, grupo caracterizado por hidroteca siempre uniseriada, sésil, hidrantes con hipostomios cónicos, nematóforos siempre presente usualmente con nematoteca protectora y una hilera simple de tentáculos filiformes es considerado a nivel de la superfamilia, pero se observa en los resultados parafiletismo para las familias Plumulariidae y Aglaopheniidae debido al terminal Gymnangium hians (Aglaopheniidae) que presenta diferente posición con respecto al resultado del estudio simultáneo, ya que agrupa con el único taxón de la familia Sertulariidae (Selaginopsis cornigera). A partir de este resultado (Aplanulata,Plumularioidea) resulta Leptothecata y Conica un grupo polifilético en su concepción formal.
Figura 32. Detalle del clado Plumularioidea (ex Conica) presente en fig. 29.
Debido a que este estudio se concentra en particular en la corroboración de las propuestas de familias y las relaciones supra-familiares, siendo además el primer análisis filogenético para miembros de la mayoría de las familias y géneros de Hydroidolina, los resultados plantean nuevamente la posibilidad de pérdida de señal filogenética “real” del marcador molecular, o bien que aspectos taxonómicos sean revisados. El grupo (Aplanulata,Plumularioidea) resulta hermano de un grupo el cual posee todos los demás miembros de Hydroidolina, y posee en condición basal a (Eudendriidae(Hydractiniidae,Clavidae)) en el estudio molecular 16S, mientras que el único terminal de Eudendriidae (Eudendrium racemosum) se agrupa como basal de un clado que reúne a todos los terminales miembros de Leptothecata estudiados en
86 el análisis simultáneo y que los presentes en el análisis simultáneo (para aquellos que se encuentran presentes) también forman un grupo monofilético.
Figura 33. Detalle del clado (Eudendriidae(Hydractiniidae,Clavidae)) presente en fig. 29.
El clado (obtenido en el análisis molecular 16S) (Eudendriidae(Hydractiniidae,Clavidae)) son todas familias formales del grupo (suborden) propuesto Filifera (hidroides coloniales, siempre con tentáculos filiformes excepto raros casos con dactilozooides y un cnidoma que nunca incluye estenotelos), así como también el terminal Thecocodium quadratum – en condición basal del grupo hermano de (Eudendriidae( (Hydractiniidae,Clavidae))). La familia Clavidae representada por dos terminales no resulta monofilético (Rhizogetum nudum agrupa con miembros de Sertulariidae, un resultado totalmente inesperado) por lo que es posible reflexionar que la optimización de los caracteres moleculares así como un mayor número de miembros de la familia Ptilocodiidae y Clavidae brinden una mayor información histórica a la hora de determinar si estos miembros formales de Filifera definirían un grupo monofilético. En el análisis simultáneo, los terminales de las familias representantes de Filifera (Bougainvilliidae y Hydractiniidae) resultan basales al clado formado por (Capitata2(Siphonophorae, Leptothecata)); el análisis molecular 16S resulta en una información general similar, sólo que el terminal de Bougainvilliidae agrupa con miembros del grupo formal Leptothecata (hermano de la familia Laodiceidae) siendo uno de los resultados más inesperados del estudio. Thecocodium quadratum resulta hermano de un clado formado por dos grandes grupos: por un lado un clado monofilético de numerosas familias del grupo formal Capitata, y el grupo hermano formado principalmente por familias de Leptothecata y Siphonophorae. Esta relación “general” (Filifera(Capitata(Leptothecata,Siphonophorae) se obtiene en el análisis simultáneo, por lo que el soporte de Bremer y particularmente el soporte de sensibilidad permite obtener topologías en ambos análisis cladísticos sin politomias basales de Hydrozoa e Hydroidolina. Las familias presentes en este grupo (miembros del suborden Capitata) no resultan monofiléticas (a excepción de Polyorchidae) así como los géneros
2 Sin consideración de Hydridae como miembro de Capitata.
87 analizados en el estudio molecular 16S. Los géneros Sarsia, Dipurena y Coryne y las consideraciones taxonómicas de las especies analizadas han sido discutidos recientemente (Schuchert 2001) por lo que se espera que futuros estudios morfológicos y moleculares brinden datos al respecto. Por otra parte en el análisis simultáneo Cladonematidae agrupa en condición basal con el terminal representante de Corynidae (Coryne pusilla) y dos especies de la familia Polyorchidae, donde dicha relación general (Corynidae,Polyorchidae) también se encuentra presente en el análisis 16S.
Figura 34. Detalle del clado “Capitata” presente en fig. 29.
En el análisis simultáneo las familias coinciden en ambos estudios: definen un grupo monofilético, donde Moerisiidae resulta basal, y Porpitidae es grupo hermano de (Solanderiidae, Milleporidae – no analizado en 16S). La única politomia del análisis 16S se ubica a la hora de definir las relaciones entre (Cladonematidae,Eleutheriidae), Porpitidae y (Zancleidae – no monofilético- (Cladocorynidae,(Solanderiidae,Zancleidae). Eleutheriidae (Kramp 1961; Bouillon & Boero 2000) incluye los géneros Eleutheria y Staurocladia los cuales poseen medusas con tentáculos ramificados con almohadillas adhesivas y consideradas relacionadas con Cladonematidae (entre otros, Petersen 1990) corroborado en el estudio presente.
Finalmente, el último clado está formado por un grupo definido por las especies analizadas en el estudio 16S representantes de Siphonophorae y su grupo hermano, formado en su mayoría de especies consideradas formalmente miembros de Leptothecata.
88
Figura 35. Detalle del clado Sertularioidea presente en fig. 29.
Las especies de la superfamilia Sertularioidea (hidróides coloniales usualmente erectos, raramente estoloniales; nematoteca ausente) definen un clado monofilético, pero la familia Sertulariidae y las especies analizadas de los géneros Sertularia y Dynanema no son soportadas por el análisis. Un resultado inesperado para los resultados de Hydroidolina es la presencia en este grupo de dos especies formalmente consideradas de Antoathecata que definen un clado (Pennaria disticha, Rhizogetum nudum) con las especies del género Thyroscyphus. El clado hermano correspondiente esta formado por las familias Campanulariidae (no monofilética), Aequoreidae (no monofilética), Phialuciidae, Tiaropsidae, Eirenidae, Laodiceidae, y Bougainvilliidae (tradicionalmente considerado miembro de Anthoathecata).
Figura 36. Detalle del clado con miembros formales de Conica y Proboscidoidea (Leptothecata) presente en fig. 29.
89 Melicertissa resulta (junto con Bougainvillia muscus) basal de este grupo en el análisis molecular 16S, el cual coincide de manera general con el análisis simultáneo. Las especies de Leptothecata estudiadas son todos miembros de este clado con las excepciones de Selaginopsis cornigera y Gymnangium hians. Asimismo, el género Clytia a excepción de Clytia hemisphaerica y Clytia hummelincki es monofilético. Debido a la disposición de los géneros no monofiléticos muy próximos, y el hecho de que habitualmente se encuentran asociados a terminales únicos representantes de familias, es de considerar la posibilidad de “ruido filogenético” al momento de la optimización de los caracteres moleculares. Leptothecata ha sido descrito como poseedor de dos subgrupos (subórdenes): Conica, que incluiría a Plumulariidae, Aequoreidae, Eirenidae y Proboscidoidea (hidrantes con un hipostomio esférico o con forma de trompeta, formando una cavidad pregástrica; medusas nunca poseen cordilos, cirros o ocelos) con las familias Campanulariidae y Phialuciidae. Los estudios tanto simultáneos y moleculares no soportan el orden Leptothecata, los subórdenes Conica y Proboscidea así como diversas familias, aunque se debe considerar que a excepción de unos pocos terminales con un comportamiento “confuso” (Bougainvillia muscus, Pennaria disticha y Rhizogetum nudum) en donde es posible sospechar de posible contaminación de las muestras secuenciadas, los taxones de tanto Leptothecata y Anthoathecata se definen en clados monofiléticos muy similares a los propuestos (especialmente familias), es decir que los terminales de dichos grupos formales no se “mezclan” en clados terminales. La posición filogenética de Siphonophorae, uno de los grupos animales polimórficos más extremos, ha sido largamente debatida: fue considerada como relacionada a Capitata (Haeckel 1888; Garstang 1946; Leloup 1955; Totton 1965), como grupo hermano de (Hydridae,Leptothecata) (Collins 2002) o como grupo hermano de Anthoathecata (Marques & Collins 2004). La consideración de grupo basal de Hydrozoa (Hyman 1940; Bouillon et al. 1992) resulta hoy descartada en todos los estudios sistemáticos modernos (Collins 2000; Marques 2001; Collins 2002; Marques & Collins 2004).
90
Figura 37. Detalle del clado Siphonophorae presente en figura 25 (Cnidaria).
Los resultados del estudio de Medusozoa y el específico de Hydrozoa brindan información similar: los terminales de Siphonophorae definen no sólo un grupo monofilético, sino por primera vez se define como grupo hermano de familias del grupo formal Leptothecata (con altos niveles de soporte de Bremer y sensibilidad). El resultado del estudio simultáneo brinda una propuesta genealógica (Physaliidae (Amalgatidae(Physophoridae(Diphyidae,Sphaeronectidae) (Hippopodiidae,Prayidae)))). Dentro de Siphonophorae las especies son clasificadas en tres grupos a partir de la presencia o ausencia de dos caracteres asociados con sus hábitos de vida pelágicos, las campanas natatorias (nectóforos) y flotantes (pneumatóforos). Las especies del grupo Physaliidae poseen pneumatóforos resultando dicho grupo basal y el sistema de flotación ancestral, mientras que los grupos que poseen sistemas natatorios (nectóforos) Amalgatidae y Physophoridae resultan formas animales (pelágicas) derivadas. Por último las especies que poseen ambos sistemas (nectóforos y pneumatóforos) resultan descendientes de los terminales que poseen sistemas natatorios. Esto implicaría que al inicio de la evolución de Siphonophorae, un sistema básico de flotación surge para establecimiento de la vida pelágica, y que los nectóforos surgen como un sistema de locomoción (carácter adaptativo) posterior y relacionado con los linajes de Amalgatidae y Physophoridae (probable pérdida de los pneumatóforos) y las especies que poseen ambas estructuras (ej: Prayidae). La única politomia (terminal) presente en el análisis filogenético simultáneo se encuentra en el grupo Siphonophorae en las relaciones entre los terminales de la familia Prayidae y el taxón terminal de la familia Hippopodiidae. El análisis de sensibilidad demostraría que el marcador 18S no resulta adecuado para la determinación de relaciones históricas entre dichos grupos. Asimismo, dicha politomia se encuentra presente en un trabajo previo (Collins 2002).
91 El estudio 16S posee sólo dos terminales por lo que a excepción de su posición general en la topología obtenida, no brinda información más allá de ser definir asimismo un grupo monofilético.
92 8. CONSIDERACIONES FINALES
Es lícito considerar que un estudio en términos de sistemática moderna, más que una conclusión final, brinda consideraciones (resultados) que promueven futuros estudios, con una mayor cantidad de datos (taxones, caracteres) los cuales desarrollados en un contexto científico adecuado fortalezcan el conocimiento genealógico existente entre los organismos biológicos, ya sea desechando propuestas no soportadas, manteniendo propuestas históricas formales o bien a través de nuevas hipótesis obtenidas.
NUCLEÓTIDOS, CLADOGRAMAS Y FILOGENIAS
Análisis convencionales de secuencias de ADN normalmente están basados en un paso preliminar de identificación de homología posicional llamado alineamiento múltiple. El alineamiento de secuencias de ADN (o secuencias de aminoácidos), definen una matriz estática de homologías primarias –alineamiento fijo – que convencionalmente constituye el primero de un proceso de dos pasos en el análisis filogenético; el segundo paso es la búsqueda del cladograma más parsimonioso. Un aspecto fundamental es que en la búsqueda del cladograma más parsimonioso nunca se investiga o testea las hipótesis de homología que se obtienen por el alineamiento inicial. Sin embargo, las homologías de los nucleótidos son cladograma-específico y no pueden tratarse objetivamente como conocimiento obtenido independientemente (o como conocimiento previo) del análisis filogenético (Giribet & Wheeler 2001). El análisis del dos pasos es la metodología normalmente utilizada, pero las homologías de los nucleótidos es necesariamente dependiente de la topología, sin tener en cuenta el algoritmo de alineamiento u optimización. Por consiguiente, inconsistencias lógicas pueden introducirse cuando las propuestas de homología de secuencias están rotas en dos pasos independientes (Wheeler 2002). Esta separación de alineación y búsqueda de cladograma resultan en un medio menos eficaz de descubrimiento de la solución global óptima, y a menudo lleva a la incompatibilidad del criterio de optimización aplicada en fases diferentes del análisis. Normalmente, la información de indel se trata de forma diferente en la etapa de homología (alineamiento) y en la etapa subsecuente, búsqueda del cladograma, como cuando se aplica algún costo a los gaps (como un quinto estado) durante la alineación pero son tratados como datos perdidos durante la búsqueda del cladograma (Giribet & Wheeler 2001). Mientras que algoritmos nuevos y más sofisticados para búsqueda del cladograma más parsimonioso han sido ampliamente adoptados, hay mucho menos atención prestada a la optimización de datos de las secuencias. Integrando la identificación de homología y búsqueda del cladograma más parsimonioso en un esquema de análisis
93 filogenético desarrollados en el software POY, las inconsistencias son eliminadas y la búsqueda para el cladograma óptimo es realizada de forma más eficaz. La violación más sobresaliente del criterio de reproducibilidad es la alineación manual. Cualquier procedimiento de alineación que depende del investigador para alinear visualmente normalmente los centenares o miles de nucleótidos obtenidos para estudios actuales será irreproducible y muy inclinado a parcialidades, excepto en el más trivial de los casos. Los casos simples comparativos también demuestran que errores de edición, como eliminar o insertar bases, entre otros problemas, podría ser común (Giribet et al. 2002). Las alineaciones manuales carecen generalmente de cualquier discusión explícita acerca de cómo se generan, o el razonamiento detrás de las hipótesis escogidas de homología primaria. Alineamientos múltiples utilizando algoritmos de programas como Clustal W (Thompson et al. 1994) resulta una mejor opción que el alineamiento manual, ya que al menos brinda repetitibilidad debido a que los costos de alineamiento, como costo de eventos indel, son consistentemente aplicados. Desafortunadamente, es muy habitual “refinamientos” posteriores manuales a la aplicación de algoritmos para “mejorar” la propuesta inicial generada por la aplicación del algoritmo (habitualmente también se eliminan partes del alineamiento en regiones de homologías poco “claras”) y la búsqueda del cladograma con la consideración de los gaps presentes como valores perdidos (“missing data”) ambos con una misma justificación: mejorar la señal filogenética esperada. La utilización de algoritmos adecuados para matrices de gran tamaño y considerando la naturaleza de los datos moleculares con respecto a las homologías demuestran en los estudios moleculares y simultáneos, con respecto al trabajo desarrollado previamente prácticamente con los mismos taxones (Collins 2000, Collins 2002), que es posible obtener topologías altamente resueltas a nivel de ramas basales así como también terminales. Por otra parte, el “camino” iniciado por el algoritmo de optimización dinámica y el software POY plantea futuros desarrollos, tales como incorporación de pesaje sucesivo para caracteres morfológicos (actualmente disponibles en otros softwares como PAUP*), “combinación” de matrices moleculares (una matriz particular para cada marcador molecular) en estudios simultáneos para más de un marcador molecular, así como posibles pesajes sucesivos moleculares ya sea para cada uno de los caracteres o bien para los diferentes clados obtenidos incluyendo análisis de sensibilidad para los grupos generados.
MEDUSOZOA Y UN PASADO CON PRESENTE PROMISORIO Ha sido reconocido en diversas revisiones que mucho es aún lo queda por conocer de aspectos básicos en la vida de los invertebrados marinos, como sucede con los ciclos de vida completos de numerosas especies de Medusozoa. Los diversos estudios evolutivos modernos en los últimos veinte años comienzan a brindar de manera inequívoca las principales relaciones históricas del subfilo Medusozoa (por ejemplo corroboración del linaje Hydrozoa), recientes análisis para
94 la diversa fauna de Medusozoa (particularmente Hydrozoa) están aportando valiosos datos y resultados, los cuales junto con el desarrollo de futuros estudios cladísticos simultáneos (combinando marcadores moleculares como 18S, 28S y 16S con matrices morfológicas) y el mapeo de características de los cnidarios en las propuestas filogenéticas enriquecerán las discusiones (escenario evolutivo) y en definitiva el conocimiento de la historia de Medusozoa (Cnidaria).
95 9. BIBLIOGRAFÍA
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