Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117 - 130 ISSN: 1829-6327, E-ISSN: 2442 Terakreditasi No: 21/E/KPT/2018

KONFIRMASI JENIS DAN KERAGAMAN GENETIK SENGON RESISTEN DAN RENTAN INFEKSI KARAT TUMOR MENGGUNAKAN PENANDA DNA KLOROPLAS (Species Confirmation and Genetic Diversity of Gall- Resistant and Susceptible Sengon Using Chloroplast DNA Marker)

Hasyyati Shabrina1*, Ulfah J. Siregar2, Deden D. Matra3, dan/and Iskandar Z. Siregar2*

1Program Studi Silvikultur Tropika, Sekolah Pascasarjana IPB University, Jl. Ulin, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680 West Java, . Telp : +62 251 8622642; Email: [email protected] 2Departemen Silvikultur, Fakultas Kehutanan IPB University Jl. Ulin, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680 West Java, Indonesia. Telp : +62 251 8622642; Email: [email protected] 3Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian IPB University Jl. Meranti, Kampus IPB Dramaga Bogor 16680 West Java, Indonesia. Telp : +62 251 8629353; Email: [email protected]

E-mail : *[email protected]; [email protected]; [email protected]; *[email protected]

Tanggal diterima: 27 Juni 2020; Tanggal direvisi: 16 Oktober 2020; Tanggal disetujui: 19 Oktober 2020

ABSTRACT Sengon () plantations, particularly in Java, have been facing threats from gall-rust disease caused by the pathogen falcatariae, which has caused considerable economic losses. Other species with morphological similarities with F. moluccana raises the question of whether the infected and non-infected sengon are the same species. This study aimed to confirm the haplotype of infected and non-infected sengon by gall-rust and compare them with a morphologically similar species of Albizia chinensis using the psbA-trnH intergenic spacer region molecular marker on chloroplast DNA. Wet wood samples from 32 infected plants and 32 non-infected plants were collected from Bogor and Ciamis, West Java, for analysis and comparison with A. chinensis sequences from the same gene region. The results showed that the infected and non-infected sengon came from the same haplotype with a genetic distance of 0 and InDel diversity of 0,031. Meanwhile, from 380 parallel aligned sites, there were 27 different sites between F. moluccana and A. chinensis. The genetic distance of the two species was classified as very low at 0.017. The psbA-trnH intergenic spacer region sequences of sengon in this study were the first to be uploaded to GenBank and can be accessed with accession numbers of LC456638.1 to LC456701.1.

Keywords: Chloroplast DNA, gall-rust, psbA-trnH intergenic spacer, sengon

ABSTRAK Hutan tanaman sengon (Falcataria moluccana), khususnya di Pulau Jawa, pada umumya menghadapi serangan penyakit karat tumor yang disebabkan oleh patogen Uromycladium falcatariae, sehingga menimbulkan kerugian ekonomi yang cukup besar. Adanya spesies lain yang memiliki kemiripan morfologi dengan F. moluccana menimbulkan pertanyaan

117 Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117-130 apakah sengon yang terserang dan tidak terserang karat tumor merupakan jenis yang sama. Penelitian ini bertujuan untuk mengonfirmasi jenis sengon yang terserang dan tidak terserang karat tumor dan membandingkan dengan spesies yang mirip secara morfologi, yaitu Albizia chinensis menggunakan penanda molekuler daerah psbA-trnH intergenic spacer pada DNA kloroplas. Sampel kayu basah dari 32 tanaman terserang dan 32 tanaman yang tidak terserang karat tumor diambil dari Bogor dan Ciamis, Jawa Barat, untuk dianalisis dan dibandingkan dengan sekuens A. chinensis dari wilayah gen yang sama. Hasil analisis menunjukkan bahwa sengon yang terserang dan tidak terserang berasal dari haplotipe yang sama dengan jarak genetik 0 dan keragaman InDel sebesar 0,031. Sementara itu, dari 380 situs yang sejajar, terdapat 27 situs yang berbeda antara F. moluccana dan A. chinensis. Jarak genetik kedua jenis tersebut tergolong sangat rendah yaitu 0,017. Sekuens daerah psbA-trnH intergenic spacer sengon dalam penelitian ini merupakan yang pertama diunggah di GenBank dan dapat diakses dengan nomer aksesi LC456638.1 sampai LC456701.1.

Kata kunci: DNA kloroplas, karat tumor, psbA-trnH intergenic spacer, sengon

I. PENDAHULUAN disebabkan cendawan patogen Sengon (Falcataria moluccana (Miq.) Uromycladium falcatariae (Doungsa-ard, et Barneby & J.W.Grimes) merupakan spesies al., 2015). Penyakit tersebut menyebabkan dengan sebaran alami di Indonesia, yaitu di pertumbuhan jaringan yang abnormal yang , Papua, dan Sulawesi Selatan dapat menyebabkan kematian jaringan bahkan tanaman, sehingga berdampak pada (Krisnawati, et al., 2011). Sengon menurunnya kualitas dan kuantitas produksi merupakan jenis yang menempati urutan lima besar dalam produksi kayu bulat kayu (Budiman & Rianti, 2012). Beberapa Indonesia tahun 2017 (Badan Pusat penelitian terdahulu (Baskorowati, et al., Statistik, 2018) serta menyumbang 54,87% 2012; Baskorowati & Nurrohmah, 2011; dari total kayu bulat yang dihasilkan di Rohandi & Gunawan, 2019; Setiadi, et al., Pulau Jawa (Badan Pusat Statistik, 2019). 2014) menunjukkan adanya provenans Produksi sengon yang tinggi di Indonesia tertentu yang lebih toleran terhadap dikarenakan spesies tersebut merupakan serangan karat tumor tetapi hasil penelitian jenis yang memiliki sifat cepat tumbuh, tersebut tidak dianalisis secara molekuler. sehingga banyak ditanam di hutan tanaman, Selain F. moluccana, saat ini beredar terutama hutan rakyat khususnya di Jawa. juga sengon merah (Albizia chinensis Sifat cepat tumbuh tersebut menyebabkan (Osbeck) Merr.) yang memiliki kenampakan mirip dengan F. moluccana cepatnya return ekonomi yang diperoleh oleh petani sengon et al., 2013). Kayu dari segi warna dan bentuk anak daun serta sengon dimanfaatkan untuk papan bentuk pohon (US Forest Service Pacific penyekat, tiang pengecoran semen dalam Island Ecosystems Risk, 2013; 2018). konstruksi, industri korek api dan pensil, Sengon merah di Indonesia juga mulai bahan baku pulp dalam industri pulp dan dibudidayakan di beberapa tempat, kertas, kayu lapis, konstruksi ringan, peti diantaranya, yaitu Jawa Tengah (Purnomo, kemas, kerajinan dan kayu energi et al., 2018), Sumatera Utara (Utomo, et al., (Hardiatmi, 2010). Selain itu, serbuk 2019), Banten (Iskandar et al., 2018), dan gergajinya juga dimanfaatkan sebagai Bandung (Withaningsih et al., 2019). Akan media untuk budi daya jamur tiram putih tetapi, meskipun memiliki kemiripan secara (Reyeki, 2013). morfologi, sifat fisik dan mekanik kayu sengon dan sengon merah agak berbeda Berkembangnya hutan tanaman sengon dengan pesat juga diikuti dengan adanya (The International Tropical Timber ancaman penyakit karat tumor yang Organization, 2020a; 2020b). Sementara itu, penggantian jenis bahan baku kayu

118 Konfirmasi Jenis dan Keragaman Genetik Sengon Resisten dan Rentan Infeksi Karat Tumor Menggunakan Penandan DNA Kloroplas Hasyyati Shabrina, Ulfah J. Siregar, Deden D. Matra, dan/and Iskandar Z. Siregar sengon dengan kayu lain akan berimbas baik dibandingkan matK, rbcL, dan ITS pada penambahan biaya untuk penggantian (Pang et al., 2012) alat untuk menyesuaikan sifat fisik kayu. Penelitian ini bertujuan untuk Selain itu, permintaan pasar terhadap mengkonfirmasi jenis sengon yang produk-produk dari kayu sengon juga belum terserang dan tidak terserang karat tumor dapat digantikan oleh kayu lain, sehingga menggunakan penanda molekuler yang pengendalian serangan penyakit karat tumor berasal dari daerah psbA-trnH intergenic pada hutan tanaman sengon perlu dilakukan spacer pada DNA kloroplas dan untuk menjaga produktivitas kayu sengon menganalisis keragaman genetik sengon dan kualitas kayu yang dihasilkan agar berdasarkan penanda tersebut. pasokan kayu ke industri tetap terjaga keberlanjutannya. II. METODOLOGI Hal lain yang menyebabkan pentingnya dilakukan konfirmasi genetik, yaitu dalam A. Lokasi Penelitian beberapa penelitian, sengon diberikan keterangan nama ilmiah yang sama dengan Sampel diambil dari 32 lokasi yang sengon merah (A. chinensis (Artati, Y., terdiri dari 16 lokasi di Ciamis dan 16 lokasi Jaung, W., Juniwaty, K.S., Andini, S., Lee, di Bogor, Jawa Barat. Sepasang sampel S.M., Segah, H., & Baral, H., 2019; Ota, yang terdiri dari satu pohon yang terserang 2019; Surjosatyo A., Dewantoro, B.R., (rentan) karat tumor dan satu pohon yang Saragih, B.R., Nainggolan, F., Dwianto, W., tidak terserang (resisten) (Lelana, 2018) & Darmawan, T., 2018). Selain itu, muncul yang selanjutnya dalam penelitian ini diberi pertanyaan apakah sengon yang terserang kode “R” untuk sampel resistan dan “S” dan tidak terserang karat tumor merupakan untuk sampel rentan, diambil dari setiap sengon jenis yang sama. Oleh karena itu, plot. Adapun intensitas penyakit karat perlu juga dilakukan analisis molekuler tumor pada 32 plot tersebut berkisar antara untuk identifikasi apakah sengon yang tidak 0,87-91,67% (Shabrina, 2020). Kedua terserang penyakit tersebut merupakan jenis pohon tersebut harus benar-benar sengon yang berbeda. berdekatan untuk meminimalisir bias Salah satu metode yang dapat lingkungan. Lokasi penelitian dapat dilihat digunakan untuk mengonfirmasi suatu pada Gambar 1. spesies, yaitu penggunaan penanda molekuler untuk DNA barcoding. Penanda B. Metode molekuler yang dapat digunakan untuk 1. Pengambilan sampel tujuan tersebut salah satunya, yaitu menggunakan penanda dari DNA kloroplas Sebanyak 64 sampel dikumpulkan dari yang sifatnya merupakan conserved region. 32 plot dengan masing-masing dua tanaman Daerah psbA-trnH intergenic spacer untuk setiap plot. Sampel yang dikoleksi merupakan sekuens pendek pada berupa kayu dari tanaman yang terserang angiospermae dengan panjang 200–500 dan tanaman yang tidak terserang karat pasang basa (basepair/bp) (Štorchová & tumor dan keduanya sangat berdekatan. Olson, 2007) Sekuens tersebut dapat Tanaman yang diambil kayunya berumur 2– teramplifikasi dengan baik pada DNA yang 4 tahun. Kriteria tanaman yang diambil terdegradasi dari kayu (Yu, et al., 2016). sebagai sampel mengacu pada Baskorowati Daerah tersebut dapat menjadi kandidat et al., (2012), yaitu untuk sengon yang tidak DNA barcode yang lebih variatif terserang karat tumor memiliki skor dibandingkan penanda matK dan rbcL keparahan 0 sedangkan untuk yang (Newmaster & Ragupathy, 2009) dan terserang memiliki skor 4-5. Sampel kulit memiliki efisiensi identifikasi yang lebih bagian dalam dan kayu luar dikumpulkan dengan cara dicongkel menggunakan

119 Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117-130 parang. Sampel kemudian dibersihkan isopropanol dingin sebanyak 500 µL dan dengan alkohol kemudian dimasukkan ke NaCl 5 M sebanyak 300 µL kemudian dalam plastik ziploc berisi gel silika dan diinkubasi selama minimal satu jam di sesegera mungkin disimpan dalam freezer freezer suhu -20°C. Setelah itu, tabung dengan suhu minimal -20 °C. mikro sampel disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. 2. Ekstraksi DNA Cairan yang berada dalam tabung mikro DNA diekstraksi menggunakan metode dibuang, sehingga tersisa endapan DNA. (Shabrina, H., Siregar, U.J, Matra, D.D, Endapan tersebut dicuci dengan etanol 70% Siregar, I.Z., Kamiya, K., 2019), yaitu tanpa sebanyak 300 µL kemudian disentrifugasi menggunakan nitrogen cair. Kayu yang dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 sudah diserut halus sebanyak 0,2 g menit. Cairan etanol kemudian dibuang dan kemudian dimasukkan ke dalam tabung tersisa pelet DNA yang sudah bersih. mikro dan dibekukan pada suhu -30°C Tabung mikro kemudian dikeringkan di selama 24 jam. Kayu dihancurkan dalam desikator berisi gel silika. DNA menggunakan TissueLyzer II Qiagen dilarutkan dengan menambahkan bufer Tris dengan bantuan bola besi mikro EDTA (TE) 1×. DNA hasil ekstraksi diuji (microbeads). Serbuk kayu kemudian pada gel agarosa 1% dengan bufer Tris dimasukkan ke dalam 500 µL bufer Acetic Acid EDTA (TAE) 1×. Pewarnaan ekstraksi yang dibuat menggunakan cetyl DNA pada agarosa dilakukan dengan trimethyl ammonium bromide (CTAB) perendaman dalam larutan ethidium 10%, polyvinyl pyrrolidon (PVP) 1%, bromida (EtBr) 0,5 µg/ml. Visualisasi DNA ethylenediamine tetraaceticacid (EDTA) dilakukan dengan UV transilluminator. 0.5 M, natrium klorida (NaCl) 5M, Tris 1M dan β-merkaptoetanol 1%. Campuran dalam 3. Polymerase Chain Reaction (PCR) tabung mikro dihomogenkan dengan vortex PCR dilakukan dengan primer lalu diinkubasi pada suhu 65°C dalam trnH(GUG) (5’-ACTGCCTTGATCCACT waterbath selama satu jam dengan dibolak- TGGC-3’) -psbA (5’- GCAAGCTCCATCT balik setiap 15 menit. Setelah itu, tabung ACAAATGG-3’) (Hamilton, 1999). Reaksi mikro sampel disentrifugasi dengan amplifikasi dilakukan menggunakan Go kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Taq mastermix (Promega) yang Supernatan kemudian dipindahkan ke komposisinya disajikan pada Tabel 1. PCR tabung mikro baru dan ditambahkan dilakukan dengan siklus: pre-denaturasi 2 klorofom:isoamilalkohol (24:1) sebanding menit pada suhu 95°C; diikuti 35 siklus dengan volume supernatan. Tabung mikro denaturasi 1 menit pada 95°C, annealing 1 kemudian disentrifugasi dengan kecepatan menit pada 55°C, dan ekstensi selama 1 10.000 rpm selama 10 menit dan supernatan menit pada 72°C; diikuti tahapan final dipindahkan ke tabung mikro baru. extension selama 10 menit pada 72°C. Supernatan kemudian ditambahkan

120 Konfirmasi Jenis dan Keragaman Genetik Sengon Resisten dan Rentan Infeksi Karat Tumor Menggunakan Penandan DNA Kloroplas Hasyyati Shabrina, Ulfah J. Siregar, Deden D. Matra, dan/and Iskandar Z. Siregar

Gambar (Figure) 1. Peta lokasi pengambilan sampel (Sampling location map)

Tabel (Table) 1. Komposisi pereaksi PCR (PCR Reagan composition) No. Komponen (Component) Volume (Volume) Konsentrasi (µl) (Concentration) 1. Primer trnH (trnH primer) 1 10 pmol/µL 2. Primer psbA (psbA primer) 1 10 pmol/µL 3. DNA cetakan (DNA template) 1 25 ng/µL 4. Air bebas nuklease (Nuclease-free 7 - 5. water) 10 - GoTaq mastermix Total (Total) 20 -

4. Sequencing BigDye ver. 1.1, dan 1 µL produk Hasil amplifikasi kemudian purifikasi. Siklus PCR seperti siklus PCR dipurifikasi dengan metode exonuclease biasa dengan suhu annealing 50°C shrimp alkaline phosphatase (EXOSAP) sebanyak 25 siklus. Tahapan selanjutnya, yaitu presipitasi ethanol untuk (Werle, E., Schneider, C., Renner, M., Volker, M., & Fiehn, W., 1994). Hasil menghilangkan residu PCR. Pelet DNA purifikasi kemudian di PCR sekuens dengan hasil presipitasi kemudian ditambahkan primer psbA saja, mengikuti protokol dari dengan 13 µL Formamide dan diinkubasi heat shock pada suhu 95°C selama tiga BigDyeTM (ThermoFisher) dengan reaksi 6,5 µL nuclease-free water, 1µL 5x menit kemudian dipulihkan dengan sequencing buffer, 0,5 µL primer, 1 µL pendinginan di es. Sampel kemudian disekuens dengan mesin alat ABI PRISM®

121 Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117-130

3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem) III. HASIL DAN PEMBAHASAN dengan waktu satu jam untuk setiap sampel. A. Hasil

5. Analisis Data Proses PCR berhasil dilakukan dan menghasilkan pita tunggal. Ukuran produk Data hasil sekuens daerah psbA-trnH berkisar pada ukuran 500 bp (Gambar 2.). intergenic spacer kemudian diolah Hasil PCR tersebut dapat langsung menggunakan perangkat lunak ATGC for digunakan pada tahap sequencing tanpa Windows Genetyx v.13.0.2 (Genetyx perlu melakukan ekstraksi produk PCR dari Corporation, 2015). Analisis homologi gel agarosa. dilakukan dengan membandingkan sekuens Produk PCR yang dihasilkan pada GenBank menggunakan basic local menggunakan penanda psbA-trnH alignment search tools (BLAST) intergenic spacer memiliki ukuran 457–458 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). bp dengan rata-rata kandungan GC sebesar Analisis jarak genetik dilakukan 27,7%. Sekuens yang diperoleh kemudian dengan menentukan model algoritma disejajarkan dengan sekuens pada basis data terbaik dengan nilai Bayesian Information di GenBank menggunakan BLAST. Criterion (BIC) (Bhat & Kumar, 2010) dan Hasil penyejajaran menunjukkan Akaike Information Criterion corrected sekuens psbA-trnH intergenic spacer (AICc) (Hurvich & Tsai, 1993) terendah. sengon memiliki kesamaan 100% dengan Model yang memenuhi kriteria tersebut dan bagian dari plastid sengon (nukleotida memiliki jumlah variabel terkecil yaitu nomor 124 sampai 547 dari 179.652 Tamura-3-parameter (Tamura, 1992) yang nukleotida) dan memiliki kemiripan yang mempertimbangkan perbedaan mutation tinggi (Total skor 100 dengan eigenvalue rate secara transversi dan transisi serta bias 0,0) dengan spesies-spesies lain dalam kandungan GC. Dendrogram dikonstruksi famili Fabaceae, terutama yang termasuk menggunakan metode maximum likelihood dalam clade Caesalpinioideae. Tiga sekuens dengan 10.000 bootstraps (Neubig, et al., selain sengon dengan kemiripan tertinggi 2012). Analisis jarak genetik dan konstruksi berasal dari sekuens Pithecellobium dendrogram dilakukan dengan perangkat clypearia (Total skor 767, Query cover lunak MEGA-X (Kumar, et al., 2018). 100%) dan Parachidendron pruinosum Analisis keragaman genetik dilakukan (Total skor 752, 752, query cover 100%). menggunakan perangkat lunak DNAsp Sekuen yang dihasilkan dari penelitian (Rozas, J., Ferrer-Mata, A., Sanchez- merupakan sekuen psbA-trnH intergenic DelBarrio, J.C., Guirao-Rico, S., Librado, spacer dari sengon yang pertama kali P., Ramos-Onsins, S.E., & Sanchez-Gracia, diunggah di GenBank dan dapat diakses A., 2017). Sekuens kloroplas (plastid) dengan nomor aksesi LC456638.1 sampai sengon dan daerah psbA-trnH intergenic LC456701.1. spacer sengon merah digunakan sebagai Analisis menggunakan model Tamura- pembanding dalam analisis jarak genetik. 3-parameter menunjukkan bahwa tidak ada Sekuens plastid sengon untuk identifikasi jarak genetik antar individu, populasi, dan diunduh dari http://ncbi.nlm.nih.gov region. Dendrogram (Gambar 3) dengan kode aksesi NC_047364 (Zhang et menunjukkan individu-individu sengon al., 2020). Sekuens sengon merah diunduh tidak membentuk pengelompokan tertentu. dari http://ncbi.nlm.nih.gov dengan kode Selanjutnya, hanya terdapat satu aksesi aksesi KR532922.1 dan KR532923.1 yang memiliki perbedaan insersi satu basa (Huang, X.C., Ci, X.Q., Conran, J.G., & Li, (B3_R, individu tidak terserang karat tumor J.et al., 2015). dari Bogor) dari 64 aksesi. Berdasarkan analisis keragaman, dari seluruh aksesi hanya terdapat satu haplotipe (Keragaman

122 Konfirmasi Jenis dan Keragaman Genetik Sengon Resisten dan Rentan Infeksi Karat Tumor Menggunakan Penandan DNA Kloroplas Hasyyati Shabrina, Ulfah J. Siregar, Deden D. Matra, dan/and Iskandar Z. Siregar haplotipe Hd=0,00). Insersi-Delesi atau Hasil analisis jarak genetik antara InDel adalah mutasi yang berupa sekuens sengon dengan sekuens A. penambahan atau pengurangan basa chinensis menunjukkan sengon yang nukleotida pada DNA, bahkan dengan sampelnya diambil untuk penelitian ini ukuran <1kbp (Sehn, 2015). Analisis sebagai aksesi semuanya merupakan jenis Insersi-delesi (InDel) menunjukkan hanya sengon yang sama dan terpisah dengan A. ada satu InDel yang terdeteksi dengan nilai chinensis (Gambar 4). Sengon yang diambil keragaman InDel sebesar 0,031 sehingga sebagai pembanding bervariasi dari Bogor terdapat dua haplotipe InDel. Perbedaan dan Ciamis serta aksesi yang terserang dan InDel disajikan pada Tabel 2. Insersi yang tidak terserang karat tumor, termasuk aksesi terjadi pada aksesi B3_R yaitu penambahan B3_R yang memiliki satu situs InDel. Jarak basa sitosin (C) pada nukleotida nomor 85. genetik antara sengon dengan A. chinensis berdasarkan region psbA-trnH intergenic spacer sebesar 0,017.

Gambar (Figure) 2. Hasil PCR psbA-trnH intergenic spacer pada sengon, M: 1kb DNA ladder; 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: sampel sengon resisten; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16: sampel sengon rentan (PCR Results of psbA-trnH intergenic spacer on sengon, M: 1kb DNA ladder; 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: resistant sengon sample; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14: susceptible sengon sample)

Tabel (Table) 2. Polimorfisme InDel pada sekuens psbA-trnH intergenic spacer sengon (InDel Polymorphism of psbA-trnH intergenic spacer sequence in sengon) Aksesi Nomor situs (Site number) (Accession) 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 1. C15_R_psbA A T A A T T A A T - T T A T T G T T C T 2. C6_S_psbA A T A A T T A A T - T T A T T G T T C T 3. B12_R_psbA A T A A T T A A T - T T A T T G T T C T 4. B3_S_psbA A T A A T T A A T - T T A T T G T T C T 5. B3_R_psbA A T A A T T A A T C T T A T T G T T C T Keterangan (Remarks): B = Sampel dari Bogor (Sample from Bogor), C = Sampel dari Ciamis (Sample from Ciamis), R = Sampel resisten (resistant Sample), S = Sampel rentan (Susceptible sample)

123 Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117-130

Gambar (Figure) 3. Dendrogram sengon berdasarkan sekuens daerah psbA-trnH intergenic spacer; ●: sengon resisten. (Sengon dendrogram based on the psbA- trnH intergenic spacer region sequence; ●: resistant sengon)

Gambar (Figure) 4. Dendrogram sengon dan sengon merah berdasarkan sekuens daerah psbA-trnH intergenic spacer (Sengon and red sengon dendrogram based on psbA-trnH intergenic spacer region sequences)

124 Konfirmasi Jenis dan Keragaman Genetik Sengon Resisten dan Rentan Infeksi Karat Tumor Menggunakan Penandan DNA Kloroplas Hasyyati Shabrina, Ulfah J. Siregar, Deden D. Matra, dan/and Iskandar Z. Siregar

Tabel (Table) 3. Polimorfisme sekuens daerah psbA-trnH intergenic spacer pada sengon dan sengon merah (Polymorphisms in psbA-trnH intergenic spacer region sequences of sengon and red sengon) Aksesi Nomor situs (Site number) (Accession) 1 46 50 53 150 152 153 154 155 156 157 198 202 203 204 205 206 207 238 261 319 339 345 346 347 348 349 350  B11_S T T - A G T A A G A A C T T T T T T T - A G ------ B3_R T T C A G T A A G A A C T T T T T T T - A G ------ C10_S T T - A G T A A G A A C T T T T T T T - A G ------ C16_R T T - A G T A A G A A C T T T T T T T - A G ------ C5_R T T - A G T A A G A A C T T T T T T T - A G ------o KR532922.1 T G - C ------A ------C A C A G A A G G A o KR532923.1 T G - C ------A ------C A C A G A A G G A Keterangan (Remarks) : ●=Sampel sengon F. moluccana (Sengon F. moluccana samples), ○=Sampel sengon merah A. chinensis (Red sengon samples A. chinensis)

B. Pembahasan K.E., Chow, A., Estes, S., Lynch, M., & Pada angiospermae, daerah psbA-trnH Thomas, W.K., 2004). Sementara itu, intergenic spacer yang merupakan daerah daerah tersebut mampu membedakan non-coding, adalah salah satu daerah yang tanaman yang memiliki taksa yang banyak digunakan untuk DNA barcoding berdekatan, seperti sengon dan sengon dan dapat mengamplifikasi sampel dari merah. Hal tersebut sesuai dengan patahan akar yang sangat kecil yang di penelitian Kamiya, K., Harada, K., Nanami, ambil dari dalam tanah (Kress, 2017). S., Itoh, A., & Diway, B.M., (2016) yang menyatakan bahwa daerah tersebut mampu Region tersebut merupakan salah satu bagian dari DNA plastid kloroplas yang mengidentifikasi jenis-jenis dengan memiliki variasi tinggi serta mudah kekerabatan sangat dekat. Perbedaan pada teramplifikasi serta mempunyai tingkat 27 situs dan penyejajaran dengan sekuens resolving yang cukup baik pada tingkat plastid sengon menunjukkan bahwa sengon spesies (Kress, W.J., García-Robledo, C., yang tidak terserang karat tumor di Uriarte, M., & Erickson, D.L., 2015). Gao, lapangan merupakan satu spesies yang T., Ma, X., & Zhu, X., (2013) menyatakan sama dengan yang terserang karat tumor, bahwa ukuran rata-rata hasil PCR psbA- yaitu F. moluccana dan berbeda dengan trnH intergenic spacer pada tanaman dari sengon merah A. chinensis. famili Fabaceae berada pada kisaran 249– Hasil penelitian ini berbeda dengan 515 bp. Daerah psbA-trnH intergenic penelitian pada tanaman kakao dengan beberapa tipe fenotipe di Soconusco, spacer merupakan daerah yang pendek sehingga keberhasilan amplifikasinya Meksiko, yang juga merupakan tanaman tinggi (100%), sesuai dengan hasil budi daya tetapi memiliki 12 haplotipe penelitian Yu M., Jiao, L., Guo, J., menggunakan penanda yang sama dengan Wiedenhoeft, A.C., He, T., Jiang, X., & yang digunakan dalam penelitian ini Yin, Y., (2017). (Gutiérrez-López, N., Ovando-Medina, I., Variasi genetik pada daerah psbA-trnH Salvador-Figueroa, M., Molina-Freaner, F., intergenic spacer cukup tinggi menurut Du, Avendaño-Arrazate, C.H., & Vázquez- Z.Y., Qimike, A., Yang, C.F., Chen, J.M., Ovando, A., 2016). Sampel resisten dan & Wang, Q.F., (2011) karena terdapat rentan dengan kode B1_R dan B1_S, yang banyak InDel dan homopolymer run. merupakan sampel dari satu plot yang sama Homopolymer run sendiri merupakan basa di Bogor juga dianalisis transkriptomnya menggunakan metode Next-generation nukleotida tunggal yang berulang atau mikrosatelit mononukleotida (Denver, sequencing (NGS) menunjukkan bahwa D.R., Morris, K., Kewalramani, A., Harris, kedua sampel resisten dan rentan tersebut memiliki ekspresi gen yang berbeda

125 Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117-130

(Shabrina, H., Siregar, U.J., Matra, D.D., B. Saran Siregar, I.Z., 2019). Sengon dalam Perlu dilakukan analisis terhadap penelitian ini hanya memiliki satu macam sampel sengon terserang dan tidak terserang haplotipe berdasarkan sekuens daerah karat tumor dari populasi lain serta psbA-trnH intergenic spacer. Meskipun penggunaan penanda plastid yang lebih berasal dari dua tipe individu (rentan dan banyak. resisten) serta dari wilayah yang berbeda, hasil penelitian ini menunjukkan bahwa terkadang haplotipe berdasarkan daerah UCAPAN TERIMA KASIH tertentu tidak terkait dengan sifat fenotipe Terima kasih kepada (Buntjer, J.B., Sørensen, A.P., & Peleman, KEMENRISTEKDIKTI RI 2016-2019 J.D., 2005) dalam hal ini sifat resistensi yang telah mendanai penelitian ini melalui tanaman. hibah dana kompetitif skema penelitian Keragaman genetik yang tinggi Program Magister Menuju Doktor untuk merupakan salah satu potensi resistensi Sarjana Unggul (PMDSU). Terima kasih tanaman menghadapi laju evolusi patogen kepada Bapak Adung dan Bapak Edi yang jauh lebih cepat. Sementara itu, erosi Pramudia (Bogor), Bapak Mod (Ciamis) genetik yang merupakan efek samping dari yang telah membantu dalam pengumpulan kegiatan budi daya tanpa memperhatikan sampel. Terima kasih kepada Dr. Koichi keragaman genetik akan menyebabkan Kamiya dan Ehime University yang telah hilangnya keragaman dan sifat penting, memberikan kesempatan untuk melakukan termasuk resistensi (Liu et al., 2016). analisis laboratorium. Sementara itu, keragaman genetik sengon di hutan tanaman khususnya di Pulau Jawa cenderung rendah (Siregar & Olivia, 2012; DAFTAR PUSTAKA Yuskianti & Shiraishi, 2017). Tidak adanya Akinnagbe, A., Gailing, O., Finkeldey, R., variasi haplotipe dan keragaman genetik & Lawal, A. (2019). Towards yang rendah kemungkinan disebabkan oleh conservation of genetic variation of rendahnya keragaman genetik pada tropical tree species with differing populasi asal benih yang ditanam successional status: The case of (Akinnagbe, et al., 2019). Mansonia altissima A. Chev and Triplochiton scleroxylon K. Schum. IV. KESIMPULAN DAN SARAN Tropical Conservation Science, 12, 1– 9 A. Kesimpulan https://doi.org/10.1177/19400829198 Penggunaan penanda daerah psbA- 64267. trnH intergenic spacer mengkonfirmasi Artati, Y., Jaung, W., Juniwaty, K.S., bahwa sengon yang terserang dan tidak Andini, S., Lee, S.M., Segah, H., & terserang karat tumor merupakan jenis Baral, H. (2019). Bioenergy Falcataria moluccana dengan haplotipe production on degraded land: yang sama. Perbedaan genetik sengon dan Landowner perceptions in Central sengon merah, yaitu terdapat pada 27 situs Kalimantan, Indonesia. Forests, 10(2), yang berbeda dari 380 situs pada daerah 1–12. psbA-trnH intergenic spacer dengan jarak https://doi.org/10.3390/f10020099 genetik antar dua spesies tersebut yaitu Badan Pusat Statistik. (2018). Statistik 0,017. Haplotipe yang diperoleh dari Produksi kehutanan 2017. Jakarta: penelitian kemungkinan tidak terkait Badan Pusat Statistik. dengan sifat fenotipe resistensi terhadap Badan Pusat Statistik. (2019). Statistik karat tumor. Produksi Kehutanan 2018. Jakarta: Badan Pusat Statistik.

126 Konfirmasi Jenis dan Keragaman Genetik Sengon Resisten dan Rentan Infeksi Karat Tumor Menggunakan Penandan DNA Kloroplas Hasyyati Shabrina, Ulfah J. Siregar, Deden D. Matra, dan/and Iskandar Z. Siregar

Baskorowati, L., & Husna Nurrohmah, S. (2013). Analisis finansial agroforestry (2011). Variasi ketahanan terhadap sengon di Kabupaten Ciamis (Study penyakit karat tumor pada sengon kasus di Desa Ciomas Kecamatan tingkat semai. Jurnal Pemuliaan Panjalu). Jurnal Penelitian Tanaman Hutan, 5(3), 129-138. Agroforestry, 1(1), 13-30. https://doi.org/10.20886/jpth.2011.5.3 Doungsa-ard, C., McTaggart, A.R., .129-138 Geering, A.D.W., Dalisay, T.U., Ray, Baskorowati, L., Susanto, M., & J., & Shivas, R.G. (2015). Charomaini, M. (2012). Genetic Uromycladium falcatarium sp. nov., variability in resistance of Falcataria the cause of gall rust on moluccana (Miq.) Barneby & J.W. Paraserianthes falcataria in south- Grimes to gall rust disease. Indonesian east Asia. Australasian Plant Journal of Forestry Research, 9(1), 1- Pathology, 44(1), 25-30. 9. https://doi.org/10.1007/s13313-014- https://doi.org/10.20886/ijfr.2012.9.1. 0301-z 1-9 Du, Z.Y., Qimike, A., Yang, C.F., Chen, Bhat, H., & Kumar, N. (2010). On the J.M., & Wang, Q.F. (2011). Testing derivation of the Bayesian Information four barcoding markers for species Criterion. Akses tanggal 14 Juli 2020, identification of Potamogetonaceae. dari Journal of Systematics and Evolution, http://nscs00.ucmerced.edu/~nkumar4 49(3), 246-251. /BhatKumarBIC.pdf https://doi.org/10.1111/j.1759- Budiman, B., & Rianti, I.P. (2012). Teknik 6831.2011.00131.x. Pengendalian Penyakit Karat Puru Gao, T., Ma, X., & Zhu, X. (2013). Use of Pada Pohon Sengon Gambaran Umum the psbA-trnH region to authenticate Karat Puru Penyebab Penyakit Karat medicinal species of Fabaceae. Puru Sejarah Penyakit Karat Puru. Biological and Pharmaceutical Akses tanggal 21 Mei 2016, dari Bulletin, 36(12), 1975-1979. http://bp2sdmk.dephut.go.id/emagazin https://doi.org/10.1248/bpb.b13- e/index.php/teknis/25-teknik- 00611. pengendalian-penyakit-karat-puru- Genetyx Corporation. (2015). GENETYX pada-pohon-sengon.htm Ver. 13. Akses tanggal 20 Desember Buntjer, J.B., Sørensen, A.P., & Peleman, 2018, dari J.D. (2005). Haplotype diversity: The https://www.genetyx.co.jp/updates/ge link between statistical and biological netyx_13 association. Trends in Plant Science, Gutiérrez-López, N., Ovando-Medina, I., 10(10), 466–471. Salvador-Figueroa, M., Molina- https://doi.org/10.1016/j.tplants.2005. Freaner, F., Avendaño-Arrazate, C.H., 08.007. & Vázquez-Ovando, A. (2016). Denver, D.R., Morris, K., Kewalramani, A., Unique haplotypes of cacao trees as Harris, K.E., Chow, A., Estes, S., revealed by trnH-psbA chloroplast Lynch, M., & Thomas, W.K. (2004). DNA. PeerJ, 2016(4), 1-18. Abundance, distribution, and mutation https://doi.org/10.7717/peerj.1855. rates of homopolymeric nucleotide Hamilton, M.B. (1999). Four primer pairs runs in the genome of Caenorhabditis for the amplification of chloroplast elegans. Journal of Molecular intergenic regions with intraspecific Evolution, 58(5), 584-595. variation. Molecular Ecology, 8(3), https://doi.org/10.1007/s00239-004- 521–523. 2580-4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ Diniyati, D., Achmad, B., & Santoso, H.B. 10199016.

127 Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117-130

Hardiatmi, S.J. . (2010). Investasi tanaman https://doi.org/10.1111/jse.12254. kayu sengon dalam wanatani cukup Krisnawati, H., Varis, E., Kallio, M., & menjanjikan. Jurnal Inovasi Kanninen, M. (2011). Paraserianthes Pertanian, 9(2), 17-21. falcataria (L.) Nielsen: Ekologi, Huang, X.C., Ci, X.Q., Conran, J.G., & Li, silvikultur dan produktivitas. In J. (2015). Application of DNA Paraserianthes falcataria (L.) Nielsen: barcodes in Asian tropical trees - A Ekologi, silvikultur dan produktivitas. case study from Xishuangbanna CIFOR. Nature Reserve, Southwest China. https://doi.org/10.17528/cifor/003482. PLoS ONE, 10(6), 1-17. Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., https://doi.org/10.1371/journal.pone.0 & Tamura, K. (2018). MEGA X: 129295. Molecular evolutionary genetics Hurvich, C.M., & Tsai, C.L. (1993). A analysis across computing platforms. corrected akaike information criterion Molecular Biology and Evolution, for vector autoregressive model 35(6), 1547-1549. selection. Journal of Time Series https://doi.org/10.1093/molbev/msy09 Analysis, 14(3), 271-279. 6. https://doi.org/10.1111/j.1467- Lelana, N.I. (2018). Epidemiologi dan 9892.1993.tb00144.x. Keragaman Patogen Karat Puru Iskandar, B.S., Iskandar, J., & Partasasmita, Sengon Di Indonesia. Disertasi. IPB R. (2018). Strategy of the outer baduy University, Bogor. community of South Banten Liu, H.L., Zhang, R.Q., Geng, M.L., Zhu, (Indonesia) to sustain their swidden J.Y., An, J.C., & Ma, J.L. (2016). farming traditions by temporary Chloroplast analysis of Zelkova migration to non-baduy areas. schneideriana (Ulmaceae): Genetic Biodiversitas, 19(2), 453-464. diversity, population structure, and https://doi.org/10.13057/biodiv/d1902 conservation implications. Genetics 12. and Molecular Research, 15(1), 1-9. Kamiya, K., Harada, K., Nanami, S., Itoh, https://doi.org/10.4238/gmr.15017739 A., & Diway, B.M. (2016). Molecular . phylogeny and evolution of tropical Neubig, K.M., Whitten, W.M., Williams, forest trees. Proceedings of the N.H., Blanco, M.A., Endara, L., Symposium “Frontier in Tropical Burleigh, J.G., Silvera, K., Cushman, Forest Research: Progress in Joint J.C., & Chase, M.W. (2012). Generic Projects between the Forest recircumscriptions of oncidiinae Department Sarawak and the Japan (Orchidaceae: Cymbidieae) based on Research Consortium for Tropical maximum likelihood analysis of Forests in Sarawak,” 30-37. combined DNA datasets. Botanical http://hdl.handle.net/2433/227106. Journal of the Linnean Society, 168(2), Kress, W.J., García-Robledo, C., Uriarte, 117–146. M., & Erickson, D.L. (2015). DNA https://doi.org/10.1111/j.1095- barcodes for ecology, evolution, and 8339.2011.01194.x. conservation. Trends in Ecology and Newmaster, S.G., & Ragupathy, S. (2009). Evolution, 30(1), 25–35. Testing plant barcoding in a sister https://doi.org/10.1016/j.tree.2014.10. species complex of pantropical Acacia 008. (, Fabaceae). Molecular Kress, W. J. (2017). Plant DNA barcodes: Ecology Resources, 9(SUPPL. 1), 172- Applications today and in the future. 180. https://doi.org/10.1111/j.1755- Journal of Systematics and Evolution, 0998.2009.02642.x. 55(4), 291-307. Ota, M. (2019). From joint forest

128 Konfirmasi Jenis dan Keragaman Genetik Sengon Resisten dan Rentan Infeksi Karat Tumor Menggunakan Penandan DNA Kloroplas Hasyyati Shabrina, Ulfah J. Siregar, Deden D. Matra, dan/and Iskandar Z. Siregar

management to more smallholder- 8. based community forestry: prospects Sehn, J.K. (2015). Insertions and deletions and challenges in Java, Indonesia. (indels). In Clinical Genomics (pp. Journal of Forest Research, 24(6), 129-150). Elsevier. 371-375. https://doi.org/10.1016/B978-0-12- https://doi.org/10.1080/13416979.201 404748-8.00009-5. 9.1685063. Setiadi, D., Susanto, M., & Baskorowati, L. Pang, X., Liu, C., Shi, L., Liu, R., Liang, D., (2014). Ketahanan serangan penyakit Li, H., Cherny, S.S., & Chen, S. karat tumor pada uji keturunaan (2012). Utility of the trnH-psbA sengon (Falcataria moluccana) di intergenic spacer region and its Bondowoso, Jawa Timur. Jurnal combinations as plant DNA barcodes: Pemuliaan Tanaman Hutan, 8(1), 1- A meta-analysis. PLoS ONE, 7(11), 1– 13. 9. Shabrina, H. (2020). Pendekatan genomika https://doi.org/10.1371/journal.pone.0 ekologi untuk pemuliaan sengon 048833. (Falcataria moluccana) resisten karat Purnomo, D., Budiastuti, M.S., Sakya, A.T., tumor (Uromycladium falcatarium). & Cholid, M.I. (2018). The potential of Disertasi. IPB University, Bogor. turmeric (Curcuma xanthorrhiza) in Shabrina, H., Siregar, U.J., Matra, D.D., agroforestry system based on silk tree Kamiya, K., & Siregar, I.Z. (2019). (Albizia chinensis). IOP Conference Short communication: DNA extraction Series: Earth and Environmental from stored wood of Falcataria Science, 142(1), 12034. moluccana suitable for barcoding https://doi.org/10.1088/1755- analysis. Biodiversitas, 20(6), 1748– 1315/142/1/012034. 1752. Reyeki, S. (2013). Pemanfaatan serbuk https://doi.org/10.13057/biodiv/d2006 gergaji kayu sengon (Albizia 35. falcataria) dan bekatul sebagai media Shabrina, H., Siregar, U.J., Matra, D.D., & tanam budidaya jamur tiram putih Siregar, I.Z. (2019). The dataset of de (Pleurotus ostreatus) dengan novo transcriptome assembly of penambahan serbuk sabut kelapa Falcataria moluccana cambium from (Cocos nucifera). Skripsi. Universitas gall-rust (Uromycladium falcatarium) Muhammadiyah Surakarta, Surakarta. infected and non- infected tree. Data in Rohandi, A., & Gunawan. (2019). Brief, 26, 4-7. Ketahanan sengon provenan Papua Siregar, U.J., & Olivia, R.D. (2012). umur 2 tahun terhadap karat tumor Keragaman genetik populasi sengon pada uji resistensi di Ciamis, Jawa (Paraserianthes falcataria (L) Barat. Jurnal Agroforestri Indonesia, Nielsen) pada hutan rakyat di Jawa 2(1), 37–50. berdasarkan penanda RAPD. Jurnal https://doi.org/10.20886/jai.2019.2.1. Silvikultur Tropika, 3(2), 1-7. 37-50. Štorchová, A.H., & Olson, M.S. (2007). Rozas, J., Ferrer-Mata, A., Sanchez- The architecture of the chloroplast DelBarrio, J.C., Guirao-Rico, S., psbA-trnH non-coding region in Librado, P., Ramos-Onsins, S.E., & angiosperms. Plant Systematics and Sanchez-Gracia, A. (2017). DnaSP 6: Evolution, 268(1), 235-256. DNA sequence polymorphism Surjosatyo, A., Dewantoro, B.R., Saragih, analysis of large data sets. Molecular B.R., Nainggolan, F., Dwianto, W., & Biology and Evolution, 34(12), 3299- Darmawan, T. (2018). Selecting and 3302. testing of wind turbine blades of the https://doi.org/10.1093/molbev/msx24 local-wood growing fastly on local

129 Jurnal Penelitian Hutan Tanaman Vol 17 No. 2, Desember 2020, 117-130

wind characteristics. IOP Conference purification of PCR products for direct Series: Earth and Environmental sequencing. Nucleic Acids Research, Science, 105(1), 12095. 22(20), 4354–4355. https://doi.org/10.1088/1755- Withaningsih, S., Parikesit, Iskandar, J., & 1315/105/1/012095. Putri, R. (2019). Socio-ecological Tamura, K. (1992). Estimation of the perspective of local bio-resources number of nucleotide substitutions based production system of palm sugar when there are strong transition- and palm flour from aren (Arenga transversion and G+C-content biases. pinnata): Case study of Sukaresmi Molecular Biology and Evolution, Village, West Bandung, Indonesia. 9(4), 678-687. Biodiversitas, 20(7), 1990-1997. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals https://doi.org/10.13057/biodiv/d2007 .molbev.a040752. 27. The International Tropical Timber Yu, M., Jiao, L., Guo, J., Wiedenhoeft, Organization. (2020a). Albizia A.C., He, T., Jiang, X., & Yin, Y. (Albizia chinensis). Akses tanggal 11 (2017). DNA barcoding of vouchered Februari 2020, dari xylarium wood specimens of nine http://www.tropicaltimber.info/specie/ endangered Dalbergia species. Planta, albizia-albizia-chinensis/ 246(6), 1165-1176. The International Tropical Timber https://doi.org/10.1007/s00425-017- Organization. (2020b). Falcata 2758-9 (Paraserianthes falcataria). Akses Yu, M., Liu, K., Zhou, L., Zhao, L., & Liu, tanggal 11 Februari 2020, dari S. (2016). Testing three proposed http://www.tropicaltimber.info/specie/ DNA barcodes for the wood falcata-paraserianthes-falcataria/ identification of Dalbergia odorifera US Forest Service Pacific Island T. Chen and Dalbergia tonkinensis Ecosystems Risk. (2013). Albizia Prain. Holzforschung, 70(2), 127-136. chinensis (Osbeck). Akses tanggal 3 https://doi.org/10.1515/hf-2014-0234. Januari 2020, dari Yuskianti, V., & Shiraishi, S. (2017). http://www.hear.org/pier/species/albiz Genetic diversity and genetic ia_chinensis.htm. relationship of sengon (Falcataria US Forest Service Pacific Island moluccana) revealed using single Ecosystems Risk. (2018). Falcataria nucleotide polymorphism (SNP) moluccana. Akses tanggal 3 Januari markers. Indonesian Journal of 2020, dari Forestry Research, 4(2), 85-94. http://www.hear.org/pier/species/falca https://doi.org/10.20886/ijfr.2017.4.2. taria_moluccana.htm. 85-94. Utomo, S.W., Sudarna, & Pratiwi, D.M. Zhang, R., Wang, Y.H., Jin, J.J., Stull, (2019). Revisit the green barrier G.W., Bruneau, A., Cardoso, D., De development for ammonia exposure Queiroz, L.P., Moore, M. J., Zhang, preventive countermeasure at urea S.D., Chen, S.Y., Wang, J., Li, D.Z., fertilizer Z Factory in South Sumatera, Yi, T.S., & Smith, S. (2020). Indonesia. IOP Conference Series: Exploration of Plastid Phylogenomic Earth and Environmental Science, Conflict Yields New Insights into the 399(1), 12093. Deep Relationships of Leguminosae. https://doi.org/10.1088/1755- Systematic Biology, 69(4), 613-622. 1315/399/1/012093. https://doi.org/10.1093/sysbio/syaa01 Werle, E., Schneider, C., Renner, M., 3. Volker, M., & Fiehn, W. (1994). Convenient single-step, one tube

130