Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro De

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ALANA KARINA MIRANDA DA SILVA

PARASITOS APICOMPLEXA DE MATRIZES CAPRINAS DA RAÇA CANINDÉ, NA ESTAÇÃO EXPERIMENTAL TERRAS SECAS, RIO GRANDE DO NORTE

NATAL/RN

AGOSTO/2015

ALANA KARINA MIRANDA DA SILVA

PARASITOS APICOMPLEXA DE MATRIZES CAPRINAS DA RAÇA CANINDÉ, NA ESTAÇÃO EXPERIMENTAL TERRAS SECAS, RIO GRANDE DO NORTE

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Centro de Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto

DMP/CB/UFRN

Co-Orientadora: Prof. Drª. Maria de Fátima de Souza

DMP/CB/UFRN

Natal/RN

2015

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Silva, Alana Karina Miranda da. Parasitos apicomplexa de matrizes caprinas da raça Canindé, na estação experimental terras secas, Rio Grande do Norte / Alana Karina Miranda da Silva. – Natal, RN, 2015.

82 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto. Coorientadora: Profa. Dra. Maria de Fátima de Souza.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas.

1. Toxoplasma gondii. – Dissertação. 2. Eimeria. – Dissertação. 3. Teste ELISA. – Dissertação. I. Andrade Neto, Valter Ferreira de. II. Souza, Maria de Fátima. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616.993.1

ALANA KARINA MIRANDA DA SILVA

PARASITOS APICOMPLEXA DE MATRIZES CAPRINAS DA RAÇA CANINDÉ, NA ESTAÇÃO EXPERIMENTAL TERRAS SECAS, RIO GRANDE DO NORTE

______

Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto, Orientador

Departamento de Microbiologia e Parasitologia /CB/UFRN

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Profa. Dra. Maria de Fátima de Souza, Co-orientadora

Departamento de Microbiologia e Parasitologia/CB/UFRN

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Prof. Dr. Aurino Alves Simplício, Examinador

Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias (UAECIA)/UFRN

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Profa. Dra. Lilian Giotto Zaros de Medeiros, Examinadora

Departamento de Microbiologia e Parasitologia/CB/UFRN

Dedico esta dissertação a Deus por me permitir viver esse sonho. A minha mãe Rita e a minha avó Geralda por todo o apoio durante essa jornada.

AGRADECIMENTOS

A Deus por me propiciar viver esta etapa, por me dar forças para superar as adversidades e por me permitir realizar esse projeto.

A minha mãe Rita e minha avó Geralda por acreditar em que eu poderia alcançar e por apoiar esse momento de realização em minha vida. Tudo que sou e o que tenho devo a vocês.

Ao meu noivo Thiago Miranda que me acompanha desde o início dessa jornada, que me incentivou nos momentos que não tive força, que enxugou minhas lagrimas quando pensei não conseguir, que luta junto comigo por nossos sonhos. Obrigada por estar ao meu lado e me fazer acreditar que sou capaz.

A minha irmã Alane, meu cunhado Nailton e meu padrasto David por todo o apoio ao longo desse projeto. Aos meus sobrinhos Allan e Naiane por serem fontes de alegria em minha vida.

Ao professor Dr. Valter Ferreira pela confiança em meu trabalho e por compartilhar seu conhecimento.

À professora Dra. Fátima Souza por toda confiança, apoio, dedicação e carinho. Agradeço a Deus por poder ter sua presença em minha vida.

Ao professor Dr. Aurino Simplício pela colaboração e apoio na realização do trabalho em campo.

As professoras integrantes das bancas examinadoras, professora Dra. Lilian Giotto e professoora. Dra. Renata Antonaci por aceitarem o convite, pelas sugestões e contribuições apresentadas visando a valorização do trabalho.

Ao professor Dr. André Pinho pela contribuição com a ánalise estatística e sugestões fundamentais na elaboração desse trabalho.

Aos professores do programa de pós-graduação em Ciências Biológicas pela contribuição a minha formação.

Aos amigos que entenderam os momentos em que estive ausente, que compartilharam as angústias, que ouviram minhas lamentações e que principalmente me fizeram acreditar na realização desse sonho. Em especial a amiga Luciana, que viveu comigo o início do projeto e mesmo com a distância não deixou de acompanhar as etapas desse momento.

As amigas de laboratório Mariany, Beatriz e Jussara que compartilharam dias de trabalhos e aprendizados, que fizeram das horas no laboratório mais divertidas e prazerosas.

A amiga de laboratório Jully Anne, que depois de tantos dias juntas vivendo um mesmo momento tornou-se especial, foram horas de cumplicidade, de aprendizado, de trabalho e risadas compartilhadas.

Aos servidores Rízia Maria, Evanízia e Edson Santana pelo apoio técnico na execução desse trabalho.

Aos colaboradores de apoio técnico em especial a Fátima, Lindacir e Sr. Nilton que contribuíram para a execução e manutenção do trabalho no laboratório.

Aos colegas Cláudio Bruno, Valber, Mariane e Débora do Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose, pela ajuda no desenvolvimento dos experimentos.

Ao professor Dr. Hugo Alexandre e aos colegas do Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais pelo auxilio no desenvolvimento desse trabalho.

Aos dirigentes e funcionários da Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte, por ter permitido a realização desse trabalho e suporte para sua realização.

À CAPES pelo apoio financeiro.

Aos mestres e professores que já passaram por toda minha vida.

“Entrega teu caminho ao Senhor; confia Nele, e Ele o fará” (Salmos 37:5)

RESUMO

A caprinocultura é uma atividade amplamente explorada nos países tropicais e apresenta grande importância social e econômica. A despeito disso, muitas doenças afetam os caprinos dentre as quais, as parasitoses. Nesse contexto, alguns parasitos do filo Apicomplexa são de grande importância, devido às altas prevalências, impacto sobre a produtividade e a reprodução dos animais, além do caráter zoonótico de algumas espécies. O objetivo desse trabalho foi monitorar as infecções por Eimeria spp.,Criptosporidium spp.e Toxoplasma gondii em matrizes caprinas da raça Canindé, criadas em regime semi-intensivo, na Estação Experimental Terras Secas, Pedro Avelino, Rio Grande do Norte. As colheitas das amostras de fezes e de sangue foram realizadas no período de agosto de 2010 a julho de 2011. Para monitorar a infecção por Eimeria spp. foi realizada a contagem de oocistos por grama de fezes (OoPG) e a identificação das espécies com base em parâmetros morfológicos e morfométricos dos oocistos esporulados. A infecção por Cryptosporidium spp. foi verificada pela pesquisa de oocistos em esfregaços fecais corados pela técnica de Zielh-Neelsen modificado. Para monitorar as infecções por T. gondii foi realizado o teste ELISA convencional e de avidez. A análise estatistica para a correlação entre a média de eliminação de oocistos e a intensidade de chuvas foi verificada através do teste t para os coeficientes de regressão. E para a correlação entre a eliminação de oocistos e o estado reprodutivo das matrizes, foi feito uma analise de variância. As análises estatísticas foram feitas utilizando o programa R Core Team, versão 2015, admitindo-se nível de significância de 0,05%. Os oocistos de Eimeria foram detectados em 85,24% das amostras de fezes. Foram identificadas nove espécies de Eimeria: E. alijevi, E. arloingi, E. apsheronica, E. caprovina, E. christenseni, E. hirci, E. joechijevi, E. ninakohlyakimovae e E. caprina. A intensidade da precipitação mostrou relação com a eliminação de oocistos. Nos meses em que a intensidade pluviométrica foi superior a 100 mm houve maior eliminação de oocistos nas fezes (p=0,00). As matrizes gestantes e paridas eliminaram mais oocistos de Eimeria do que as secas, sendo essa diferença estatisticamente significante (p=0,00). Dos 405 esfregaços fecais examinados, nove apresentaram oocistos de Cryptosporidium spp., representando 2,20% das amostras; sendo os oocistos presentes em uma amostra colhida em agosto, uma em janeiro, três em fevereiro, três em março e uma em junho. Das 215 amostras de soro testadas pelo teste ELISA, 93 (43,26%) foram consideradas reativas para T.gondii. A maior taxa de reatividade foi verificada no mês de julho de 2011 (94,10%). Nas amostras consideradas reativas, foi realizado o teste ELISA de avidez de anticorpos das quais 65 (69,90%) apresentaram anticorpos de alta avidez, indicativo de infecção crônica e 28 (30,10%) apresentaram anticorpos de baixa avidez, indicativo de infecção aguda. A infecção por Eimeria spp. se constitui um problema para o rebanho já que as cinco espécies consideradas patogênicas para caprinos foram observadas com alta prevalência, ao longo de todo o período do estudo. A infecção por Cryptosporidium spp. apresenta baixo risco, mas este é contínuo, já que a eliminação de oocistos de Cryptosporidium spp. ocorreu em diversos momentos ao longo de tempo do estudo. O risco de transmissão vertical de T. gondii pode ser considerado alto, já que aproximadamente um terço dessas matrizes estava na fase aguda da infecção.

Palavras-chave: ELISA; OoPG; Eimeria; Cryptosporidium; Toxoplasma gondii.

ABSTRACT

The goat production is a widely exploited activity in tropical countries and has great social and economic importance. Despite this, many diseases affect goats among which, parasitosis. In this context, some parasites of the phylum Apicomplexa are of great importance, due to high prevalence, impact on productivity and reproduction of animals, in addition to zoonotic's characteristics of some species. The aim of this study was to monitor the infections by Eimeria spp., Cryptosporidium spp.e Toxoplasma gondii in goats matrices of Canindé breed, raised in semi-intensive regime at the Experimental Station Terras Secas, Pedro Avelino, Rio Grande do Norte. Crops of stool samples and blood were carried out from August 2010 to July 2011. To monitor Eimeria spp. Infection it was realized the oocyst count per gram of feces (OoPG) and the identification of species based on morphological and morphometric parameters of sporulated oocysts. The infection by Cryptosporidium spp. was verified by oocyst's search in fecal smears stained with modified Zielh- Neelsen technique. To monitor infection by T. gondii was performed the conventional ELISA and avidity. The statistical analysis of the correlation between the average oocysts disposal and intensity of rainfall was verified by the t test for the regression coefficients. And the correlation between the oocysts shedding and reproductive status of matrices, it was made an analysis of variance. Statistical analyzes were performed using the R Core Team program, version 2015, assuming a significance level of 0.05%. Eimeria oocysts were detected in 85.24% of feces samples. Nine species of Eimeria have been identified: E. alijevi, E. arloingi, E. apsheronica, and. caprovina, E. christenseni, E. hirci, E. joechijevi, E. Ninakohlyakimovae e, E. caprina. The intensity of rainfall is related to the elimination of oocysts in the months in which the rainfall intensity was greater than 100 mm there was a greater elimination of oocysts in the feces (p = 0.00). Pregnant and calved matrices tend to eliminate more oocysts of Eimeria than dry, and this difference was statistically significant (p = 0.00). Of 405 fecal smears examined, nine were Cryptosporidium spp, representing 2.20% of the samples.; being the oocysts present in a sample taken in August, one in January, three in February, three in March and one in June. Of the 215 serum samples tested by ELISA, 93 (43.26%) were considered reactive to T. gondii. The greater reactivity rate was observed in July 2011 (94.10%). In the samples considered reactive, it was performed the ELISA test of antibody avidity of which 65 (69.90%) had high avidity antibodies, indicative of chronic infection and 28 (30.10%) had low avidity, indicative of acute infection. The infection by Eimeria spp. constitutes a problem for the flock since the five considered pathogenic species for goats were observed with high prevalence throughout the study period. The infection by Cryptosporidium spp. a low risk, but this is continuous, since the elimination of Cryptosporidium spp. It occurred at several points over the study time. The risk of vertical transmission of T. gondii can be considered high, since approximately one third of matrices were in the acute phase of infection.

Key-Words: ELISA; OoPG; Eimeria; Cryptosporidium; Toxoplasma gondii.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1. Classificação taxonômica dos parasitos Apicomplexa 15 FIGURA 2. Etapas do ciclo de vida de um Eimeriidae 16 FIGURA 3. Etapas do ciclo de vida de Cryptosporidiidae 22 FIGURA 4. Estapas do ciclo de vida de Toxoplasma gondii 27 FIGURA 5. Divisão territorial do Estado do Rio Grande do Norte, 34 com destaque o município de Pedro Avelino FIGURA 6. Matrizes da raça Canindé confinadas no centro de 36 manejo, Pedro Avelino, RN FIGURA 7. Colheita de amostras fecais e sorológicas 37 FIGURA 8. Processamento das amostras para a contagem dos 39 oocistos por grama de fezes (OoPG) FIGURA 9. Processamento de coloração dos esfregaços fecais pela 41 técnica de Zielh-Neelsen FIGURA 10. Microplaca após o termino do teste ELISA 44 FIGURA 11. Delineamento experimental da sessão de material e 45 métodos GRÁFICO 1. Média da contagem de OoPG e nível de precipitação 48 pluvial GRÁFICO 2. Proporção das espécies de Eimeria spp. identificadas 50 em amostras fecais de matrizes caprinas da raça Canindé GRÁFICO 3. Frequência das espécies de Eimeria spp. identificadas 51 em amostras fecais de matrizes caprina da raça Canindé GRÁFICO 4. Índice de reatividade calculado para as amostras 54 sorológicas de matrizes caprinas Canindé GRÁFICO 5. Avidez de anticorpos anti-T. gondii em soros de matrizes 55 caprinas da raça Canindé

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Ocorrência e intensidade da infecção por Eimeria spp. 47 em amostras fecais de matrizes caprinas TABELA 2. Média de eliminação de oocistos, e número de matrizes 49 caprinas Canindé divididas por categorias TABELA 3. Ocorrência de Cryptosporidium spp. em amostras fecais 52 de matrizes caprinas, da raça Canindé TABELA 4. Soroprevalência para anti-T. gondii em matrizes 53 caprinas da raça Canindé TABELA 5. Porcentagem do número de matrizes em cada categoria 55 de acordo com o teste ELISA de avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii em soros de matrizes caprinas da raça Canindé

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 13 1.1 Eimeria e EIMERIOSE 15 1.1.1 Aspectos biológicos referentes ao gênero Eimeria 15 1.1.2 Epidemiologia da eimeriose 20 1.2 Cryptosporidium E CRIPTOSPORIDIOSE 21 1.2.1 Aspectos biológicos referentes ao gênero Cryptosporidium 21 1.2.2 Epidemiologia da criptosporidiose 25 1.3 Toxoplasma gondii E TOXOPLASMOSE 26 1.3.1 Aspectos biológicos referentes ao Toxoplasma gondii 26 1.3.2 Epidemiologia da toxoplasmose 28 1.3.3 Diagnóstico da toxoplasmose 30 1.3.4 Resposta imune na infecção por T. gondii 31 1.4 IMPORTÂNCIA DO ESTUDO INTEGRADO DAS INFECÇÕES 31 POR PARASITOS DO FILO APICOMPLEXA 1.5 OBJETIVO 33 1.5.1 Objetivos especifícos 33 2 MATERIAL E MÉTODOS 34 2.1 ÁREA DE ESTUDO 34 2.2 MANEJO DOS ANIMAIS 35 2.2.1 Animais experimentais e periodo de colheita 36 2.3 COLHEITA DO MATERIAL 37 2.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS 37 2.4.1 Processamento das amostras fecais 37 2.4.2 Diagnóstico de Eimeria spp. 38 2.4.2.1 Contagem de oocistos por grama de fezes (OoPG) 38 2.4.2.2 Identificação das espécies de Eimeria 39 2.4.3 Diagnóstico de Cryptosporidium spp. 40 2.4.4 Processamento das amostras sorológicas 41 2.4.5 Diagnóstico sorológico qualitativo de T. gondii 42 2.4.6 Teste ELISA de avidez de IgG 43

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 46 3 RESULTADOS 47 3.1 INFECÇÕES POR Eimeria SPP. 47 3.1.1 Dinâmica da infecção por Eimeria spp. 49 3.2 INFECÇÕES POR Cryptosporidium spp. 52 3.3 INFECÇÕES POR Toxoplasma gondii 53 3.1.1 Soroprevalência de anticorpos anti-T. gondii 53 3.3.2 Determinação da avidez de anticorpos anti-T. gondii 54 4 DISCUSSÃO 57 4.1 OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR Eimeria spp. 57 4.2 OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR Cryptosporidium spp. 61 4.3 PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI-T. gondii 63 5 CONCLUSÕES 67 REFERÊNCIAS 68 APÊNDICES 80

1 INTRODUÇÃO

A caprinocultura é uma atividade amplamente explorada nos países tropicais, com o objetivo de produção de carne e leite (HAMMERSCHMIDT et al., 2012). Na maioria dos países com regiões áridas e semiáridas, essa atividade apresenta grande importância social e econômica (SIMPLICIO et al., 2003). No Brasil, o rebanho efetivo de caprinos era de 8.646.463 animais no ano de 2012. Mas esse efetivo representava naquele ano um decréscimo de 7,9% em relação ao ano de 2011. Já no estado do Rio Grande do Norte, também em 2013, o efetivo do rebanho caprino era de 397.093 animais (INSTITUTO BRASILEIRO GEOGRAFIA ESTATÍSTICA, 2013). E no município de Pedro Avelino, em 2013, o efetivo total era de 19.467 cabeças (INSTITUTO BRASILEIRO GEOGRAFIA ESTATÍSTICA, 2013). No Nordeste do Brasil a produção de caprinos e ovinos é de grande importância, pois estes animais, na maioria das vezes, são explorados por pequenos produtores para a subsistência familiar, os quais usam a carne como fonte de proteína animal. Mas a criação desses pequenos ruminantes também tem sido feita objetivando a exploração econômica, de carne e leite. Dessa forma, a exploração de pequenos ruminantes pode tornar-se uma atividade que contribua com o desenvolvimento econômico dessa região. Diversas raças caprinas são criadas no Brasil, tais como Moxotó, Boer e Repartida. No Nordeste as raças nativas são bem adaptadas ao meio ambiente, sendo as mais importantes Moxotó, Repartida, Marota, Canindé e os caprinos sem raça definida (SRD). A raça caprina Canindé encontra-se em todo o nordeste brasileiro, pois são animais bem adaptados às regiões semiáridas. Apresenta pelagem preta com manchas claras que podem ser brancas, creme ou castanho (ELOY et al., 2007). Outras características dessa raça são: cabeça média cônica e alongada; orelhas curtas; chifres simétricos; olhos pretos ou castanhos; cascos escuros e fortes; tronco bem conformado; tórax largo; garupa de comprimento médio; membros de médio comprimento, fortes e bem aprumados (ANCOC) 1.

1 ANCOC: Associação Norte Riograndense de Criadores de Caprinos e Ovinos

A altura média dos animais dessa raça é de 60 cm para os machos e de 50 cm para as fêmeas. O peso médio dos machos adultos excede os 40 kg e o peso das fêmeas, em sua maioria, fica entre 30 e 35 kg. A pele desses animais é considerada como de excelente qualidade (BORGES; GONÇALVES, 2002). Em virtude da importância da caprinocultura, deve-se dar atenção ao regime de manejo, ao bem-estar do animal, e aos manejos alimentar, da nutrição e da promoção da saúde. É importante que produtores e manejadores permaneçam vigilantes a qualquer alteração (fisiológica, comportamental) dos animais, uma vez que isso poderá significar a ocorrência de enfermidade. Dentre as doenças que afetam esses animais encontram-se as parasitoses, sendo alguns parasitos do filo Apicomplexa de grande importância; isso devido a alta prevalência, ao impacto sobre a produtividade e a reprodução dos animais; e pelo caráter zoonótico que algumas espécies assumem. O filo Apicomplexa compreende seres unicelulares, caracterizados pela presença de um complexo apical, o qual, geralmente é constituído de anel polar, roptrias, micronemas, conóides, e microtúbulos subpeliculares presentes em algum momento do desenvolvimento. Microporos geralmente são presentes em alguma fase do desenvolvimento do parasito. Esses organismos não possuem cílios ou flagelos; exceto os microgametas de alguns grupos que são flagelados (LEVINE, 1973). Alguns gêneros e espécies são parasitos de importância para os pequenos ruminantes tais como, Eimeria spp., Cryptosporidium spp. e Toxoplasma gondii, cujas classificações taxonômicas (LEVINE, 1973) estão apresentadas na figura 1.

1Disponível em: < http://www.ancoc.com.br/raca/caninde/3> Acesso em 03 de ago. 2015.

FIGURA 1: Classificação taxonômica de alguns parasitos Apicomplexa que ocorrem em caprinos

Reino Protista

Sub-reino Protozoa

Filo Apicomplexa

Classe Coccidia Conoidasida

Ordem Eucoccidia Eucoccidiorida

Família Eimeriidae Cryptosporidiidae Sarcocystidae

Toxoplasma Gênero/espécie Eimeria Cryptosporidium gondii

A classificação filogenética aborda os apicomplexas em um supergrupo denominado SAR, composto por Stramenopiles,Rhizaria e Alveolates; neste está incluso o filo Apicomplexa. Antes de serem classificados como membros do SAR, Stramenopiles e Alveolates eram parte do supergrupo Chromalveolata (BURKI, 2014).

1.1 Eimeria E EIMERIOSE

1.1.1 Aspectos biológicos referentes ao gênero Eimeria

O gênero Eimeria apresenta ciclo de vida do tipo monoxeno, com três fases distintas, que são: esporogônica, merogônica e gametogônica. A primeira fase mencionada ocorre no meio ambiente e as demais no hospedeiro (FIG. 2).

FIGURA 2: Ciclo de vida de Eimeriidae: (a) ingestão de oocisto esporulado pelo hospedeiro; (b) liberação dos esporozoítos; (c-e) penetração dos esporozoítos na célula hospedeira e formação de merozoítos; (f-i) penetração em novas células epiteliais, formando novos merozoítos (variando de duas a quatro gerações); (j) liberação dos merozoítos; (k-n) formação de macrogametas; (o-r) formação de microgametas; (s) liberação do microgameta e penetração no macrogameta; (t) formação do oocisto; (u-x) esporulação do oocisto no meio ambiente

Fonte: http://biology.unm.edu/biology/coccidia/eimeriabiol.html. Com adaptação.

Quando ingeridos os oocistos esporulados liberam os esporozoítos, que penetram nas células intestinais do hospedeiro e se transformam em trofozoítos. Estes se transformam em esquizontes, que darão origem a merozoítos, caracterizando a fase merogônica. Os merozoítos penetram em novas células intestinais e diferenciam-se em macro e microgameta, ocorrendo a fecundação e originando o oocisto, o que caracteriza a fase gametogônica. Os oocistos não esporulados são eliminados nas fezes dos hospedeiros. No ambiente ocorre a esporulação dos oocistos em um intervalo de sete a 10 dias, caracterizando a fase esporogônica (FITZGERALD, 1980; FOREYT, 1990; FAYER, 1980). Para a esporulação dos oocistos são necessárias condições adequadas de temperatura (24 ºC a 32 ºC), boa oxigenação e umidade. A esporulação dos oocistos não ocorre em temperatura acima de 40 ºC, tornando-os inviáveis nessas condições;

bem como em temperaturas inferiores a -30 ºC. A viabilidade dos oocistos esporulados por longos períodos no ambiente depende de condições adequadas de temperatura e umidade (FOREYT, 1990). O oocisto esporulado de Eimeria é caracterizado por conter quatro esporocistos, cada um contendo dois esporozoítos. Esse é o elemento fundamental para a identificação das espécies com base nos parâmetros morfológicos e morfométricos. As estruturas do oocisto esporulado de Eimeria que irão auxiliar na identificação das espécies são: características das camadas (externa e interna), capuz micropilar quando presente, presença ou não de micrópila, presença ou não do corpo de Stieda, disposição dos esporozoítos dentro do esporocisto e distribuição dos grânulos dentro do esporocisto. Com base nessas características morfológicas são relatadas quinze espécies de Eimeria que parasitam caprinos em todo o mundo: Eimeria alijevi (KOTLAN, MOEST e VADJA, 1929); Eimeria apsheronica (MOUSSU E MAROTEL,1902); Eimeria arloingi (LEVINE E IVENS, 1970); Eimeria caprina (LIMA, 1979); Eimeria caprovina (LIMA, 1980); Eimeria christenseni (HONESS, 1910); Eimeria hirci (HONESS, 1942); Eimeria jolchijevi (CHRISTENSEN, 1938); Eimeria ninakohlyakimovae (YAKIMOFF E RASTEGAIEFF, 1930); Eimeria Korcharii (SPIEGL, 1925; Eimeria gilruthi Chatton, 1910; Eimeria hawkinsi Ray, 1952; Eimeria pallida (CHRISTENSEN, 1938); Eimeria punctata (LANDERS, 1955); Eimeria minasensis (SILVA E LIMA, 1998); Na literatura observa-se que existe uma estreita semelhança morfológica entre as espécies de Eimeria que parasitam caprinos e ovinos, porém a infecção pelas espécies deste gênero de parasito é classicamente considerada espécie- específica (MCDOUGALD, 1979; FAYER,1980), com exceção da E. caprovina que normalmente parasita caprinos, mas pode ocorrer em ovinos (LIMA, 1980). Os danos causados pela eimeriose são devidos à destruição das células das vilosidades intestinais. Apenas um oocisto ingerido pode levar a destruição de milhares de células, em decorrência de suas fases assexuada e sexuadas para a formação de novos oocistos. As células epiteliais são danificadas, e permitem o extravasamento do sangue, plasma e proteínas para o lúmen intestinal afetando o funcionamento do intestino, possibilitando também a invasão de bactérias nos tecidos (FOREYT, 1990; LIMA, 2004).

Na forma mais grave da doença pode ocorrer diarreia de odor fétido e coloração marrom escuro, com presença de sangue não metabolizado e fragmentos de mucosa intestinal; animais com falta de apetite, ligeiramente desidratados, pêlos arrepiados e sem brilho, além de debilidade orgânica generalizada. A diarreia em pequenos ruminantes pode persistir por vários dias até duas semanas e alguns animais podem morrer durante este período. Mas a maioria dos animais se recupera e a mortalidade é variável, ficando em torno de 10,00% dos animais afetados (LIMA, 2004; VIEIRA, 1997). As infecções naturais por Eimeria normalmente são mistas, envolvendo duas ou mais espécies. A intensidade da carga parasitária e as características clínicas da eimeriose serão determinadas pelo número de oocistos ingeridos, pela espécie de Eimeria envolvida, pelo número de células destruídas para a liberação dos oocistos (dependendo do número de gerações merogônicas e do número de merozoítos produzidos); pela idade, pelo estado fisiológico e imune do hospedeiro; e pelos fatores estressantes no ambiente, entre os quais umidade, temperatura e cobertura vegetal, que influenciam na esporulação dos oocistos, no tempo de sobrevivência no ambiente e sua infectividade. (FITZGERALD, 1980; FOREYT, 1990; LIMA, 2004). Animais jovens são mais susceptíveis às infecções por Eimeria, porém animais de todas as idades podem se infectar com carga parasitária variável, e também podem não apresentar sinais clínicos. Embora animais adultos possam apresentar manifestações subclínicas, esses animais representam grande importância na transmissão do parasito, em virtude da eliminação frequente de oocistos nas fezes por longos períodos, constituindo-se as principais fontes de infecção para a categoria mais susceptível (FOREYT, 1990; VIEIRA et al., 2004;VIEIRA, 2005). Em condição de estresse, observa-se o aumento de oocistos eliminados nas fezes de animais adultos, os quais podem apresentar sinais clínicos. Hassum e Menezes (2005) em estudo no Rio de Janeiro com pequenos ruminantes mostraram que em animais adultos a intensidade da infecção foi baixa, mas proporcionalmente elevada nos jovens; e que a taxa de eliminação de oocistos pelos reprodutores elevou na época de monta. Verificaram também maior eliminação de oocistos pelas fêmeas gestantes e lactantes em comparação com as que não estavam prenhas. As fêmeas periparturientes podem eliminar grandes quantidades de oocistos, e as fezes geralmente amolecidas e diarreicas facilitam a disseminação dos oocistos

no ambiente. Até o início do pastejo pelos lactentes, a contaminação fecal do úbere deve ser a principal fonte de infecção para esses animais (POUT et al., 1966; VIEIRA et al., 1999). A infecção por Eimeria é considerada uma doença insidiosa, podendo haver manifestações em diversos graus, variando desde casos assintomáticos até casos com diarreia mucossanguinolenta (FITZGERALD,1980; FOREYT 1990). A eimeriose clínica acontece mais esporadicamente, porém pode também trazer perdas econômicas ligadas às consequências diretas da diarreia sobre o crescimento e até a sobrevivência dos animais (CHARTIER; PARAUD, 2012). Já a eimeriose subclínica é causadora de prejuízos que, muitas vezes, são ignorados pelo produtor, mas que são constantes e de grande importância (SILVA et al., 2007). Nessa perspectiva, a queda na produtividade animal devida a eimeriose representa impacto econômico considerável. Isso porque os animais infectados necessitam de tempo adicional para recuperação de peso se comparado com os animais não infectados, da mesma idade e mantidos no mesmo sistema de manejo (FITZGERALD, 1980; FOREYT, 1990; VIEIRA 2005). Para o controle da eimeriose fazem-se necessárias a adoção de práticas adequadas de manejo e de promoção da saúde (ex. separação dos animais de acordo com a idade, reduzir a superlotação), associadas com a administração de quimioterápicos que juntos objetivam reduzir as taxas de infecção e prevenir ou minimizar os efeitos da doença clínica. Ressaltando-se que a manipulação desses fatores de predisposição é difícil em rebanhos explorados em regime de manejo extensivo (FITZGERALD,1980; FOREYT, 1990; LIMA, 2004; VIEIRA et al., 2005). Nesse contexto, os estudos epidemiológicos são fundamentais para a compreensão da dinâmica das infecções. A eimeriose em pequenos ruminantes é uma doença cosmopolita. No Brasil, os estudos revelam que a eimeriose está amplamente distribuída em todas as regiões em que foram pesquisadas em pequenos ruminantes e em animais de qualquer idade. Estudos no Nordeste iniciaram-se a partir da década de 1980, quando foi feito um levantamento sobre as espécies de Eimeria (LIMA, 2004; VIEIRA, 1999).

1.1.2 Epidemiologia da eimeriose

Norton (1986) em estudo na Inglaterra, encontrou 98,00% de prevalência de Eimeiria em 422 amostras fecais de caprinos, sendo os animais mais jovens os que apresentaram maiores prevalências. Nove espécies foram identificadas, e 65,00% das amostras apresentavam infecções mistas com três a cinco espécies. Chhabra e Pandey (1991) em estudo no Zimbabue, identificaram 12 espécies de Eimeria parasitando caprinos jovens e adultos, com maior prevalência de E. alijevi. No Brasil, Rebouças et al. (1992) em estudo com 256 amostras de fezes de caprinos jovens e adultos, verificaram prevalência de 122 (47,60%). As espécies E. pallida, E. ninakohlyakimovae, E. arloingi, E. apsheronica, E. alijevi, E. christenseni e E. hirci foram registradas pela primeira vez no estado de São Paulo por esse estudo. Já Silva e Lima (1998) descreveram a espécie Eimeria minasensis em estudos com cabras no estado de Minas Gerais. Vieira et al. (1997) demonstraram em cabras infectadas experimentalmente a ultraestrutura das fases endógenas de Eimeria ninakohlyakimovae nas células epitéliais do ceco e cólon. Martins Filho e Menezes (2001) no estado da Paraíba em estudo que incluiu 363 amostras fecais de caprinos verificaram a prevalência de 89,53% de infecção por Eimeria. Apesar da alta taxa de prevalência e das espécies identificadas terem sido as mais patogênicas, sinais clínicos não foram observados durante o período de estudo. As nove espécies identificadas foram: E. alijevi, E. apsheronica, E. arloingi E. caprina, E. caprovina, E. christenseni, E. hirci, E. jolchijevi e E. ninakohlyakimovae. Em Sobral, estado do Ceará, Cavalcante et al. (2012) relataram a prevalência de 72,00% de infecção por Eimeria em caprinos leiteiros e identificaram oito espécies. Já no estado do Rio Grande do Norte, o primeiro registro de Eimeria em caprinos foi realizado por Barbosa et al. (2003), em estudo no município de Mossoró. Amostras fecais de animais jovens e adultos de diferentes propriedades, criados sob o regime extensivo, foram examinadas para a quantificação de oocistos e identificação das espécies. Das 478 amostras analisadas 442 (98,48%) estavam

positivas para oocistos de Eimeria. Foram identificadas nove espécies de Eimeria parasitando esses animais.

1.2 Cryptosporidium e CRIPTOSPORIDIOSE

1.2.1 Aspectos biológicos referentes ao gênero Cryptosporidium

O gênero Cryptosporidium compreende parasitos eucariotos que possuem o complexo apical em algum estágio no ciclo de vida. As espécies deste gênero são parasitas intracelulares obrigatórios, que infectam as células epiteliais das microvilosidades do trato gastrintestinal de todas as classes de vertebrados, já tendo sido registrada a sua ocorrência em mais de 170 espécies de hospedeiros (O'DONOGHUE, 1995). O ciclo de vida dos parasitos do gênero Cryptosporidium é monoxeno e se completa no trato gastrintestinal do hospedeiro. Seu ciclo é complexo, consistindo em fases sexuada e assexuada (FIG. 3). A infecção se dá pela ingestão do oocisto esporulado, de parede fina que ao se romper libera seus quatro esporozoítos que irão penetrar nas células epiteliais do intestino, preferencialmente nas microvilosidades. Os esporozoítos sofrem mudanças e se diferenciam em trofozoítos. A fase assexuada acontece com a transformação de trofozoítos em merontes do tipo I, contendo oito merozoítos. A fase sexuada ocorre quando os merontes contendo quatro esporozoítos, denominados tipo II, se transformam em macro e microgametas. Então ocorre a fecundação originando os oocistos que serão eliminados nas fezes já esporulados (CABRAL et al., 2001;FAYER, 1980).

FIGURA 3: Etapas do ciclo de vida de Cryptosporidiidae: (a) ingestão de oocisto esporulado pelo hospedeiro; (b) liberação dos esporozoítos; (c-e) penetração dos esporozoítos na célula epiteliais do intestino e formação de merozoítos tipo I; (f) formando merozoítos tipo II, liberação dos merozoítos II e diferenciação dos gametas; (g) formação de macrogametas; (h) formação de microgametas; (i) fecundação; (j) formação do oocisto de parede espessa e sua liberação no ambiente; (k) formação do oocisto de parede delgada, responsável pela autoinfecção

Fonte: http://www.msgpp.org/cryptosporidium.shtml. Com adaptação.

Os oocistos de Cryptosporidium são altamente resistentes no ambiente externo, desde que eles não sejam expostos a temperaturas extremas ou a dessecação: o período de sobrevivência é de cerca de três meses em temperatura entre 15 e 20 ºC, e mais de um ano em temperatura entre quatro e seis graus Celsius. Temperaturas abaixo de 0 °C e acima de 65 °C são letais aos oocistos (FOREYT, 1990; ROBERTSON et al., 1992). A maioria dos desinfetantes químicos é ineficaz para desinfecção do ambiente contra esses oocistos (FAYER, 2007). Os oocistos medem entre quatro e seis micrômetros, apresenta forma esférica e estruturas internas escuras (FAYER, 2000). No interior dos oocistos esporulados encontram-se quatro esporozoítos e um corpo residual (FIG. 5), mas que não apresentam esporocistos como o gênero Eimeria. Existem dois tipos de oocistos: os de parede espessa (aproximadamente 80,00%) e os de parede delgada (aproximadamente 20,00%) (AKIYOSHI et al., 2003).

Como os oocistos das diferentes espécies são muito semelhantes, em termos morfológicos; por isso para a identificação se faz necessário associar elementos relativos à morfologia aos achados por técnicas moleculares e as informações sobre a origem dos oocistos (PARAUD; CHARTIER, 2012). Treze espécies de Cryptosporidium são relatadas em mamíferos: Cryptosporidium muris (TYZZER, 1907); Cryptosporidium parvum (TYZZER, 1912); Cryptosporidium wrairi (VETTERLING et al., 1971); Cryptosporidium felis (ISEKI, 1979); Cryptosporidium andersoni (LINDSAY et al., 2000); Cryptosporidium canis (FAYER et al., 2001); Cryptosporidium hominis (MORGAN-RYAN et al., 2002); Cryptosporidium suis (RYAN et al., 2004); Cryptosporidium bovis (FAYER et al., 2005); Cryptosporidium fayeri (RYAN et al., 2008); Cryptosporidium ryana (FAYER et al., 2008); e Cryptosporidium macropodum (POWER AND RYAN, 2008); Cryptosporidium xiaoi (FAYER E SANTIN, 2009). Em caprinos, três espécies têm sido identificadas C.parvum, C.xiaoi e C.hominis (PARAUD; CHARTIER, 2012). De acordo com Fayer (2010) essas espécies têm sido identificadas por combinações de características morfológicas, biológicas e moleculares. Infecções por Cryptosporidium spp. têm sido documentadas em vários países, e ocorrem pela ingestão de oocistos infectantes, que são transmitidos por contato direto animal-animal, por via fecal-oral,ou de forma indireta por contaminação fecal dos reservatórios de água ou dos alimentos. Em ambos os casos a superlotação favorece a transmissão, mas a contaminação do úbere tem sido apontada como um dos modos de transmissão mais comuns na pecuária (O'DONOGHUE, 1995; RAMIREZ et al., 2004). Dentre os fatores de risco associados à infecção por Cryptosporidium e à patofisiologia da criptosporidiose incluem-se, as condições de estresse devidas ao clima, alimentação e condições ambientais; o número de oocistos ingeridos e a resistência dos oocistos; idade do animal; doenças intercorrentes com outros agentes enteropatogênicos; e a qualidade do colostro (BOMFIM et al. 2005; LIMA, 2003; PARAUD; CHARTIER, 2012). O gênero Cryptosporidium é reconhecido como um importante enteropatógeno (CASTRO-HERMIDA et al., 2007). A infecção por esse parasito pode ter curso autolimitante ou crônico assintomático com baixa carga parasitária, o que ocorre comumente em animais adultos. Neste caso esses animais passam a

constituir fonte de infecção para animais jovens. A falta de sinais clínicos em animais adultos pode estar relacionada com a imunidade ou uma variação na infectividade e virulência do parasito (BOMFIM et al. 2005; CASTRO-HERMIDA et al., 2005; FAYER, 2000). A despeito disso, em ovelhas e cabras a infecção por Cryptosporidium pode resultar em diarreia, ganho de peso ineficiente, e até ocasionar a morte desses animais; sendo potencialmente grave em ruminantes jovens e imunodeficientes. Sendo assim, Cryptosporidium spp. é considerado um dos principais patógenos entéricos associados com diarreia neonatal em cabritos e cordeiros. Além disso, a associação da criptosporidiose com outras enteroparasitoses tem sido referida como causas para perdas econômicas em criações de pequenos ruminantes (PARAUD; CHARTIER, 2012; QUILEZ et al., 2008). A diarreia é o mais importante sinal clínico da criptosporidiose, geralmente observado por um período de dois a 12 dias e pode variar de leve a grave. As lesões entéricas atribuídas à infecção podem ser caracterizadas por grave atrofia e fusão das vilosidades (CASTRO-HERMIDA et al., 2007; FOREYT, 1990; SNODGRASS et al., 1984). Outros sinais clínicos que também podem ser observados na crisptosporidiose são depressão, anorexia e dor abdominal. Além de colecistite, hepatite, pancreatite e problemas respiratórios. Pode haver diferenças nos sintomas e taxas de mortalidade associadas com diferentes tipos de isolados de C. parvum em ruminantes, porém os fatores de virulência não foram identificados (PEREIRA et al., 2009; THOMPSON et al., 2005). O Cryptosporidium é considerado também um dos mais importantes agentes patogênicos de transmissão hídrica; podendo ser encontrado em fezes de animais, no solo e em alimentos contaminados. De importante relevância por seu potencial zoonótico, torna-se uma questão de saúde pública, em função da veiculação dos oocistos por água e alimentos. Seu potencial zoonótico varia de acordo com a espécie e os genótipos envolvidos (PARAUD; CHARTIER, 2012). O aspecto zoonótico da criptosporidiose recebeu maior atenção devido ao fato de que as infecções por esse patógeno podem ser fatais em indivíduos imunodeficientes. Dessa forma, a criptosporidiose tornou-se uma preocupação em animais de produção visto que estes podem ser fonte de infecção para humanos,

devido ao fato que os oocistos liberados nas fezes dos animais podem contaminar água de uso humano (MACKENZIE et al., 1994). A Infecção por Cryptosporidium é umas das causas não virais mais comuns de diarreia em animais e humanos, em todo o mundo; e para o controle da transmissão desse parasito as medidas preventivas são a melhor opção. Para isso faz-se necessário identificar os fatores de risco e proceder à aplicação adequada das medidas de controle, o que inclui a destruição dos oocistos em superfícies do alojamento dos animais, o isolamento de animais doentes e a garantia de que os animais jovens vão receber colostro do modo adequado (GRAAF et al., 1999; RAMIREZ et al., 2004).

1.2.2 Epidemiologia da criptosporidiose

Este gênero de parasito foi encontrado pela primeira vez em 1907, em camundongos. Anos mais tarde, em estudos com os mesmos mamíferos Tyzzer descreveu a espécie C. parvum. Em 1950, Salvin relatou um surto de criptosporidiose em aves domésticas. Em 1976 foi relatado o primeiro caso de cryptosporidiose humana e então esse protozoário passou a ser estudado e pesquisado de maneira mais efetiva (BORGES, 2007). Xiao et al. (1993) demonstraram a infecção de cordeiros neonatos, pela ingestão de oocistos de Cryptosporidium spp. provenientes das fezes de animais adultos assintomáticos. Todos os cordeiros recém-nascidos apresentaram oocistos nas fezes; e amostras fecais de 78,30% dos cordeiros mais velhos e 17,40% de ovelhas também foram positivas para oocistos de Cryptosporidium spp. Em caprinos, a infecção por Cryptosporidium spp. foi descrita pela primeira vez na Austrália, em um cabrito de duas semanas de idade que apresentava diarreia. A partir daí, surtos de diarreia devidos a criptosporidiose em cabritos foram relatados; portanto, Cryptosporidium spp. passou a ser considerado como sendo um dos principais enteropatógenos nesses animais (GRAAF et al., 1999). No Brasil, o primeiro encontro de Cryptosporidium spp. em caprinos foi relatado por Vieira et al. (1997), em estudos com caprinos lactantes através da análise das fezes e análise anatomopatológica.

No Rio de Janeiro, Bomfim et al. (2005) verificaram a eliminação de oocistos Cryptosporidium spp. em um trabalho com cabras leiteiras em seis propriedades e através da aplicação de questionários puderam correlacionar a infecção com fatores de risco, tais como idade, condições sanitárias e o tipo das instalações. No Rio Grande do Norte a infecção por Cryptosporidium spp. foi descrita pela primeira vez por Silva et al. (2009), em um estudo com cordeiros, no município de Lajes, através de exames coprológicos.

1.3 Toxoplasma gondii E TOXOPLASMOSE

1.3.1 Aspectos biológicos referentes ao Toxoplasma gondii

A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição mundial, causada pelo T. gondii um parasito intracelular obrigatório. Infecções por T. gondii são amplamente prevalentes em animais e humanos (DUBEY, 1998). O T. gondii apresenta seu ciclo de vida heteroxeno, tendo os felídeos como os hospedeiros definitivos, e os animais homeotérmicos, incluindo mamíferos e aves, como hospedeiros intermediários (DUBEY, 2004; ARAUJO-NETO et al., 2008). Esse parasito apresenta três fases infecciosas: os taquizoítos (individuais ou em grupos), os bradizoítos (em cistos teciduais) e os esporozoítos (em oocistos). Estas fases estão ligadas em um ciclo de vida complexo. No hospedeiro definitivo ocorre a fase sexuada e no hospedeiro intermediário acontece a fase assexuada. A fase sexuada inicia-se quando o hospedeiro definitivo ingere uma das formas infectantes. Neste, o parasito atinge as células intestinais, apresenta uma fase de multiplicação rápida e intensa, caracterizando a fase aguda da doença (DUBEY et al., 1998; GROSS et al., 1996). Mas também os parasitos podem diferenciar-se em microgametas e macrogametas, que após a fecundação e formação de uma parede dupla passam a ser chamados oocistos. Estes são eliminados junto com as fezes do felídeo para o meio ambiente, onde ocorre o

processo de esporogonia. Estes podem manter-se viáveis, por semanas ou meses, em condições adequadas de temperatura e umidade (FIG. 4).

FIGURA 4: Ciclo de vida do T.gondii

Fonte: Dubey, 2004. Com adaptação.

A parede do oocisto consiste de duas camadas, sem a presença de grânulos polares. Os oocistos não esporulados apresentam forma subesférica e medem 10 a 12 milímetros de diâmetro. Enquanto os oocistos esporulados medem de 11 a 13 mm de diâmetro, contendo cada oocisto dois esporocistos elipsoidais sem a presença de corpo de Stieda. Cada esporocisto contém quatro esporozoítos (DUBEY et al.,1998). Esse parasito apresenta importância médica e veterinária, como causa de abortos e de doenças congênitas em humanos e animais (TENTER, 2000). Em indivíduos imunocompetentes a gravidade da toxoplasmose é desconhecida, sendo geralmente assintomática, mas pode causar mortalidade em pessoas muito jovens e

em indivíduos imunocomprometidos. Muitos pacientes infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) apresentam infecção por T. gondii (DUBEY et al., 2012). Os seres humanos podem se infectar pela ingestão de cistos teciduais presentes em carne mal cozida; consumo de água ou de alimentos que contenham oocistos; ou pela ingestão acidental de oocistos do ambiente (DUBEY; JONES, 2008). E ainda pela infecção vertical, isto é, pela passagem de taquizoítos da mãe para o feto. Admite-se que a principal via de transmissão de T. gondii para caprinos e ovinos é a ingestão de pastagens e água contaminada com oocistos esporulados do parasito (SILVA et al., 2003). Além disso, esse parasito também pode ser transmitido verticalmente por taquizoítos que são passados para o feto através da placenta (TENTER et al., 2000). A toxoplasmose é uma infecção comum em ovinos e caprinos em todo o mundo, e pode resultar em distúrbios reprodutivos como a morte embrionária, aborto em qualquer fase da gestação, natimorto e o nascimento de animais fracos (GUIMARAES et al., 2013; MASALA et al, 2003). Segundo Dubey e Beattie (1988) embora casos de aborto e de mortalidade neonatal sejam os principais problemas clínicos relacionados à toxoplasmose, cabras adultas podem desenvolver problemas envolvendo órgãos, tais como, fígado, rins e cérebro. O interesse na obtenção de carne e produtos lácteos de origem caprina é fenômeno mundial, em cujo cenário o Brasil tem se destacado (MEDEIROS et al.,2014). Mas para ser competitivo para o mercado interno ou externo, um dos problemas a ser considerado e enfrentado é a toxoplasmose; e, nesse contexto, as contribuições dos estudos epidemiológicos são pertinentes e necessárias.

1.3.2 Epidemiologia da toxoplasmose

Feldman e Miller (1956), nos Estados Unidos, estudaram rebanhos caprinos e constataram pela primeira vez a presença de T. gondii nesses animais. Enquanto Munday e Mason (1979) relataram na Austrália os danos reprodutivos causados por T. gondii em caprinos.

Segundo Garcia et al. (2012),nos vários estudos epidemiológicos a respeito de toxoplasmose em rebanhos de pequenos ruminantes domésticos que têm sido realizados no Brasil, tem sido observado índices de prevalência que variam de 10,00% a 92,40%, de acordo com a área geográfica e a técnica de diagnóstico utilizada. Câmara et al. (2012) relataram que abortos em rebanhos caprinos afetam significativamente a produtividade desses animais e é considerado um problema comum na caprinocultura. Esses autores ressaltaram que as perdas reais devido à toxoplasmose são difíceis de estimar em pequenos ruminantes, pois a doença manifesta-se de forma esporádica e apenas uma pequena amostragem de fetos recorrentes de abortos é submetida ao diagnóstico laboratorial. No município de Uberlândia-MG, em estudo com 174 amostras de soro de caprinos, de diferentes rebanhos, que foram testados por hemaglutinação indireta (HAI), imunofluorescência indireta (IFI) e ensaio imunoenzimático (ELISA), verificou- se a prevalência de 19,00% de positividade para os soros testados por HAI; 19,5% para os soros testados por IFI; e 19,5% para os soros testados por ELISA (FIGUEIREDO et al., 2001). Mainardi et al. (2003) estudaram a soroprevalência em rebanhos caprinos no estado de São Paulo. Em sete regiões do estado, um total de 442 amostras de soro foi colhido e testado por IFI. Em todos os rebanhos foram encontrados animais reagentes totalizando 14,50% de positividade. Na região Sul, um estudo na grande Porto Alegre avaliou a soropositividade em 360 caprinos através de HAI e IFI. Verificou-se uma frequência de 19,40% de soropositividade por HAI (70 animais) e de 30,00% (108 animais) por IFI (MACIEL; ARAUJO, 2004). Estudos sobre a prevalência de T. gondii também têm sido realizados nas áreas semiáridas do Brasil. Em Pernambuco foram encontrados 40,40% de caprinos positivos para T. gondii numa amostragem sorológica colhida de 213 animais. Enquanto que em ovinos a prevalência foi de 35,30% em 173 soros analisados (SILVA et al., 2003). Alves et al. (1997) analisaram os níveis de aglutininas anti-Toxoplasma em soros de caprinos no estado da Paraíba, através da imunofluorescência indireta (IFI) em 631 amostras oriundas de cinco propriedades, nas quais observou-se taxas de positividade que variaram de 0 a 26,80%. Enquanto Faria et al. (2007),também no

estado da Paraíba, investigaram a prevalência de anticorpos anti-T. gondii em caprinos abatidos em matadouros e verificaram a ocorrência de 24,50% de positividade. Uzêda et al. (2004) em um estudo na Bahia, analisaram amostras de soro de nove rebanhos caprinos, de diferentes raças, categorias zootécnicas e idades. Dos 373 animais examinados 16,23% apresentaram reações positivas, por IFI, para anticorpos anti-T. gondii. E dentre as 283 amostras de soro analisadas, de fêmeas, 59 (20,80%) estavam positivas para T.gondii. Em estudo na microrregião do Seridó, Rio Grande do Norte, Araújo-Neto et al. (2008) verificaram a ocorrência de anticorpos anti-T. gondii em cabras e constataram a soroprevalência em 30,60% dos animais amostrados.

1.3.3 Diagnóstico da toxoplasmose

O diagnóstico de toxoplasmose é complexo e requer atenção, pois a infecção apresenta quadro clínico não específico o que pode ser facilmente confundido com outras patologias. A detecção pode ser feita por exames parasitológicos e sorológicos, entretanto a maioria dos portadores apresenta quadro assintomático o que faz necessário e importante a detecção de anticorpos específicos através da sorologia (FIGUEIREDO et al., 2001). Os testes parasitológicos são de baixa sensibilidade, o que na prática de diagnóstico não é viável sua utilização. Os testes sorológicos são mais utilizados para a pesquisa de anticorpos, principalmente da classe IgG. O teste de aglutinação tem sido utilizado para detectar aglutininas anti-T. gondii em diversas espécies hospedeira. Já a reação de IFI apresenta alta sensibilidade e especificidade para anticorpos anti-T. gondii. E o teste ELISA também vem sendo utilizado para pesquisa de anticorpos, mostrando também alta especificidade e sensibilidade (CLEMENTINO et al., 2007). A avaliação da avidez é baseada na dissociação dos complexos antígeno- anticorpo (Ag - Ac) pela ação de agentes desnaturantes de proteínas ou desestabilizantes de ligações de pontes de hidrogênio (BAHIA et al., 1995). A avidez dos anticorpos IgG específicos é capaz de distinguir entre infecções recentes e

antigas. Nas infecções recentes uma alta porcentagem desses anticorpos mostra baixa avidez para os antígenos específicos. Com o decorrer do tempo esses anticorpos mostram crescente avidez e afinidade para os antígenos específicos (CAMARGO et al., 1991)

1.3.4 Resposta imune na infecção por T. gondii

A resposta imune do hospedeiro ante a infecção por T. gondii é complexa e envolve resposta humoral e celular. A resposta humoral consiste na produção de imunoglobulinas específicas, principalmente IgM e IgG. A resposta celular é mediada por linfócitos T que secretam citocinas capazes de destruir os taquizoítos extracelulares. A resposta imune inata ativa macrófagos, polimorfonucleares, monócitos, células natural killer, lisoenzimas e interferon. Na resposta imunológica humoral ao T. gondii a imunoglobulina mais facilmente detectada no primeiro mês é IgM, com IgG tornando-se a imunoglobulina predominante a partir do segundo mês de infecção (ESTEBAN-REDONDO; INNES, 1997). A resposta imune adquirida é caracterizada pela presença de linfócitos T, linfócitos B e imunoglobulinas. Após a fase aguda a resposta ao parasito torna-se duradoura e protetora às reinfecções. A resposta de células T combinada com a produção IFN-γ desempenha um papel importante na imunidade na infecção por T. gondii. O IFN-γ pode atuar para inibir a replicação do taquizoíto em culturas de células (ESTEBAN-REDONDO; INNES, 1997; DUBEY et al., 1998).

1.4 IMPORTÂNCIA DO ESTUDO INTEGRADO DAS INFECÇÕES POR PARASITOS DO FILO APICOMPLEXA

A caprinocultura representa uma atividade de elevada importância econômica e social no Brasil, especialmente na região Nordeste. De maneira geral, caprinos e

ovinos são explorados em sistemas de manejo com uso reduzido de tecnologias e as práticas de produção ainda são poucos utilizados. Para implantação adequada de medidas de controle é necessário o conhecimento sobre os fatores que interferem na intensidade das infecções. O conhecimento sobre técnicas de diagnóstico, fatores de risco e epidemiologia das doenças parasitárias que acometem esses animais é necessário para que se possa estar atento aos sinais de infecções. Dessa forma, analisando a importância econômica como uma alternativa viável no semiárido, o impacto causado por essas parasitoses sobre a produtividade animal requer atenção, quanto ao regime de manejo, aos manejos da promoção da saúde, alimentar, da nutrição e reprodutivo e ao bem-estar dos animais. Por exemplo, apesar do crescente reconhecimento de Cryptosporidium spp. como um importante patógeno em caprinos, muitas características da doença são mal compreendidas. Estudos sobre a prevalência de Cryptosporidium spp. em animais de produção revelam que ruminantes são importantes reservatórios para este parasito, mas a maioria dos estudos são feitos com bovinos (QUILEZ et al., 2008). Ainda com relação a esse parasito é importante ressaltar que vários fármacos têm sido utilizados para o tratamento da criptosporidiose, mas sem eficácia no que concerna à eliminação do patógeno (PARAUD; PORS; CHARTIER, 2010). Nesse contexto, a hidratação tem sido a forma mais razoável para amenizar os sinais clínicos da criptosporidiose (NOORDEEN et al., 2012). Com relação à eimeriose, embora existam fármacos específicos para a eliminação do parasito, o tratamento do animal doente é considerado de valor relativo, pois se o tratamento for feito com base na sintomatologia, já houve a destruição do tecido do hospedeiro e as drogas em geral, não são capazes de promover sua regeneração (LIMA, 2004). Já no que concerne à toxoplasmose deve-se admitir que, em termos de produção animal, é um verdadeiro desafio. Seja no sentido de não se ter o diagnóstico da infecção em rotina e, por conseguinte, a possibilidade de tratamento específico; sejam pelas dificuldades de se adotar medidas de controle da infecção, especialmente quando os animais são criados de forma extensiva. Mas o fato é que esses parasitos infectam os animais, de forma concomitante. Como pertencem a um mesmo filo, compartilham moléculas que devem induzir a

formação de anticorpos com características moleculares semelhantes, de tal forma que pode haver reações cruzadas. Assim, além do valor do conhecimento epidemiológico a respeito de cada um desses patógenos, o estudo da ocorrência simultânea dos mesmos em cada animal contribui para uma interpretação mais adequada, especialmente dos achados em estudos imunológicos.

1.5 OBJETIVO GERAL

Monitorar as infecções por Eimeria spp.,Criptosporidium spp.e T. gondii em matrizes caprinas da raça Canindé, exploradas em regime semi-intensivo na Estação Experimental Terras Secas, Pedro Avelino, RN.

1.5.1 Objetivos específicos

Monitorar a ocorrência da infecção por espécies de Eimeria spp. e Cryptosporidium spp. por meio de análise coprológica; Estabelecer relação entre a precipitação pluvial e a taxa de eliminação de oocistos de Eimeria. Identificar as espécies de Eimeria no curso da infecção e a prevalência ao longo do estudo. Avaliar a soroprevalência de T. gondii. Determinar a avidez de anticorpos da classe IgG anti-T. gondii. Verificar a interferência das infecções concomitantes na alteração do perfil de resposta à infecção por T. gondii.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 ÁREA DE ESTUDO

As colheitas foram realizadas na Estação Experimental Terras Secas, da Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte (EMPARN), localizada no município de Pedro Avelino, Estado do Rio Grande do Norte (FIG. 5).

FIGURA 5: Divisão territorial do Estado do Rio Grande do Norte, em destaque ( ) o município de Pedro Avelino

Fonte:https://http://www.idema.rn.gov.br/anuario2013/mapas/politico_administrativo_png. Com adaptação.

O município de Pedro Avelino está situado na microrregião de Angicos, mesorregião Central potiguar e zona homogênea do planejamento Litoral Norte, Subzona de João Câmara. Abrange uma área de 952,759 Km²,dista cerca de 154

Km da capital Natal, localizado nas coordenadas 5º 31’ 18” de latitude Sul e 36º 23’ 17” de longitude oeste (IDEMA, 2013). O clima da região é considerado BSh semiárido, segundo a classificação de Köppen-Geiger2. A temperatura média anual é em torno de 26,1 ºC, estando a máxima em torno de 31,9 ºC e a mínima 21,5 ºC. A precipitação pluviométrica anual média observada em 2009 foi de 480,2 mm (IDEMA, 2009). A vegetação caracteriza-se como caatinga hiperxerófila, sendo densa e de estrutura irregular, e durante a época seca em sua maioria permanece sem folhas. Com abundância em cactáceas e plantas de baixo porte, dentre as espécies vegetais mais frequentes observa-se xique-xique (Pilosocereusgounellei), marmeleiro (Cydonia oblonga), jurema-preta (Mimosa hostilis) e facheiro (Pilosocereus pachycladus) (IDEMA, 2009).

2.2 MANEJO DOS ANIMAIS

No ano de 2011, o rebanho de pequenos ruminantes da Estação Experimental Terras Secas era constituído pela raça nativas de ovino Morada Nova e caprina Canindé, somando aproximadamente 180 matrizes das duas raças e oito reprodutores; destes cinco (05) eram caprinos e três (03) ovinos. Os animais eram identificados com colar e placa metálica numerada. As matrizes eram mantidas em regime de manejo semi-intensivo (FIG. 6), tendo como área de pastejo a caatinga. Os reprodutores permaneciam em regime intensivo e ambos, matrizes e reprodutores recebiam sal mineral. As crias tinham acesso a mistura concentrada a base de milho em grão triturado (60,00%), farelo de soja triturado (35,00%), sal mineral com monensina (3,00%) e cloreto de sódio (2,00%), a partir do 8° dia de nascimento até os 84 dias de vida quando ocorria o desmame. Os animais adultos não recebiam tratamento específico para eimeriose. O tratamento anti-helmíntico era feito no período da pré-monta, pré-parto ou na semana seguinte ao parto.

2 Classificação de Köppen: Sistema de classificação global dos tipos climáticos mais usados em geografia, climatologia e ecologia. Disponível em:

FIGURA 6: Matrizes caprinas da raça Canindé no Centro de manejo, Pedro Avelino, RN

Fonte: Batista, 2012.

2.2.1 Animais experimentais e período de colheita

Os animais usados foram matrizes da raça Canindé. O número de animais amostrados por colheita variou de 29 a 44, os quais eram escolhidos aleatoriamente do rebanho para monitoramento da infecção através de exames coprológicos e sorológicos. As colheitas ocorreram no período de agosto de 2010 a julho de 2011. As colheitas de fezes foram feitas em todos os meses de estudo e as colheitas das amostras de sangue foram realizadas a cada dois meses totalizando seis meses de coleta de material sorológico.

2.3 COLHEITA DO MATERIAL

As colheitas de fezes foram feitas diretamente da ampola retal, com o auxílio de uma cânula de silicone (FIG. 7A), para que não houvesse a contaminação das amostras. Estas foram acondicionadas em sacos de plásticos, os quais eram identificados com o número do animal. As colheitas de sangue foram feitas por punção da jugular com auxilio de tubos de coleta a vácuo tipo vacutainer®, sem anticoagulante (FIG. 7B). As amostras foram acondicionadas em caixa térmica contendo gelo reciclável e encaminhadas ao Laboratório de Helmintologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

FIGURA 7: Colheita de amostras fecais e sangue: (a) diretamente da ampola retal; (b) por punção da jugular.

A B

Fonte: Autoria própria.

2.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS

2.4.1 Processamento das amostras fecais

Para o monitoramento das infecções por Eimeria spp., as amostras fecais foram examinadas quantitativamente pela técnica de contagem de oocistos por

grama de fezes (OoPG) e, para as amostras positivas procedeu-se a esporulação dos oocistos para posterior identificação das espécies. Para o monitoramento da infecção por Cryptosporidium spp., as amostras fecais foram submetidas a procedimento de concentração por sedimentação espontânea em água.

2.4.2 Diagnóstico de Eimeria spp.

2.4.2.1 Contagem de oocistos por grama de fezes (OoPG)

A contagem dos oocistos por grama de fezes foi realizada de acordo com a técnica proposta por Gordon e Whitlock, modificada por Ueno e Gonçalves (1988). Foram pesados dois gramas de fezes que, em seguida, foram macerados. Procedeu-se a tamização desse material com 58 ml de solução de Sheather modificada, sendo esta saturada de sacarose, com densidade específica de 1200 (FIG. 8A). Com auxilio de agitador magnético, as fezes foram homogeneizadas com a solução saturada. Com uma pipeta de Pasteur coletava-se uma alíquota do material e então preenchia as duas áreas da câmara de McMaster (FIG. 8B). Após repouso por cinco minutos (FIG. 8C) a contagem dos oocistos era realizada em microscópio óptico, usando ocular 10x e objetiva 10x (FIG. 8D). O cálculo da contagem de OoPG foi realizado efetuando-se a soma do número de oocistos contados nos dois compartimentos da câmara de McMaster e multiplicando-se o resultado por 100.

FIGURA 8: Processamento para contagem de OoPG (A- tamização em solução de Sheather modificada; B- Preenchimento da câmara de McMaster; C- câmaras em repouso preparadas para leitura ; D- leitura em microscópio óptico)

A B

C D

Fonte: Autoria própria.

2.4.2.2 Identificação das espécies de Eimeria

Após a contagem dos oocistos por grama de fezes, as amostras positivas foram colocadas para esporular em solução aquosa de bicromato de potássio a 2,50% (p/v), em placas de Petri em temperatura ambiente durante um período de sete a dez dias (MCKENNA, 1972; DUSZYNSKI; WIIBER, 1997; VIEIRA et al., 1999). Por problemas de logística interna do laboratório, nos meses de dezembro de 2010 e janeiro de 2011 houve interrupção do processo de esporulação. Passado o período de esporulação dos oocistos, as amostras foram armazenadas em tubos Falcon de 15 ml e conservadas a 4 ºC até o momento de identificação das espécies. No momento da identificação, as amostras foram submetidas à centrifugação de 1500 rpm por cinco minutos. Após a centrifugação a fase líquida correspondente à solução de bicromato de potássio foi descartada. O sedimento foi suspenso em solução de Sheather modificada, dessa forma os oocistos foram separados da

amostra usando a técnica de centrífugo flutuação, conforme Duszynsky e Wiiber (1997). De acordo com McKenna (1972) foi feita a identificação de 100 oocistos selecionados aleatoriamente. O exame foi realizado em microscópio óptico usando as objetivas de 40x e 100x. Em amostras com número de oocisto menor que 100, foram identificados todos os oocistos presentes na lâmina. Para a identificação foram usados parâmetros morfológicos e morfométricos dos oocistos e esporocistos. Acoplada ao microscópio Olympus CX40, uma ocular micrometrada foi utilizada para a medição das estruturas. O fator de correção foi previamente calculado de acordo com Ueno e Gonçalves (1988). Parâmetros morfológicos foram usados como base para a identificação, sendo esses: tamanho, cor, presença ou não de capuz micropilar e micrópila, textura da parede externa, forma dos esporocistos, presença ou não de resíduo e corpo de Stieda dos esporocistos e disposição dos esporozoítos no esporocisto (AMARANTE; BARBOSA, 1992; HASSUM; VALLADARES; MENEZES, 2007; LEVINE, 1973; VERCRUYSSE, 1982; VIEIRA et al., 1999).

2.4.3 Diagnóstico de Cryptosporidium spp.

A sedimentação das amostras foi feita por um período de 24 horas. Passado esse tempo o sobrenadante foi desprezado e o sedimento subdividido em duas alíquotas que foram acondicionadas em tubos eppendorf e congeladas a -20 °C. Para se fazer o esfregaço foi usada uma alíquota correpondendo a cada amostra. Após o descongelamento, o material constante no tubo eppendorf foi transferido para um tubo Falcon de 15 ml e diluída em aproximadamente 10 ml de formalina e cerca de 5-6 ml de éter P.A. A solução foi homogenizada e centrifugada a 3500 rpm por dez minutos. Após a centrifugação o sobrenadante foi descartado. Com o sedimento foi realizado o esfregaço em lâmina de vidro. As lâminas secaram em temperatura ambiente. Após as lâminas estarem secas, foi feita a coloração por Zielh-Neelsen modificado. O esfregaço fecal foi fixado em metanol por dois minutos (FIG. 9A), e em seguida o excesso foi descartado. A lâmina foi colocada em recipiente contendo

fucsina básica por 40 minutos (FIG. 9B). Em seguida a lâmina foi coberta com descorante por 15 segundos (FIG. 9C), logo após foi colocada em um recipiente com azul de metileno por um minuto (FIG. 9D). Para finalizar, as lâminas foram lavadas em água corrente (FIG. 9E) e deixadas em temperatura ambiente para secar (FIG. 9F) para assim serem guardadas até o momento da leitura. Esta foi feita em microscópio ótico em aumento de 1000x. O tempo de coloração foi previamente testado e ajustado em busca de melhores resultados.

FIGURA 9: Processo de coloração por Zielh-Neelsen modificado (A- fixação do esfregaço; B- lâminas em fucsina; C- colocação do descorante; D- após coloração com azul de metileno; E- lavagem em água corrente; F- secagem em temperatura ambiente)

A B C

D E F Fonte: Autoria própria.

2.4.4 Processamento das amostras sorológicas

No dia da colheita, ao chegar no laboratório os tubos sem anticoagulante foram centrifugados para obtenção do soro, foram retiradas duas aliquotas e armazenado em freezer até a realização dos testes laboratoriais.

2.4.5 Diagnóstico sorológico qualitativo de T. gondii

Os soros foram testados através do teste imunoenzimático (ELISA-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) para a detecção de anticorpos IgG específicos anti- T. gondii. O teste ELISA foi realizado de acordo com Clementino et al. (2007), com modificações. Foram realizados testes prévios para padronização do protocolo para caprinos, e também para obtenção de controles negativos e positivos. As microplacas de poliestireno de 96 poços de fundo chato foram sensibilizadas com 100 µl de antígeno por cavidade, na concentração de 1µg/ml diluido em solução de coating buffer (solução tampão). A microplaca foi incubada em temperatura de 4 ºC durante a noite. Após o período de incubação, a solução de antígeno foi desprezada e a microplaca foi lavada quatro vezes com a solução salina contendo Tween20 a 0,05%. A microplaca foi seca por inversão sobre papel absorvente. Foram usados 200 µl/cavidade de solução de bloqueio para que houvesse o bloqueio dos sítios específicos, a microplaca ficou incubada em estufa por uma hora a 37 ºC. As amostras foram diluídas em solução PBS na proporção 1:400; 200 µl de cada amostra foi distribuído por cavidade na microplaca, em duplicata. Após esse procedimento a microplaca foi incubada por uma hora a 37 ºC. O controle conhecido como “branco” (PBS: 798 µl e água destilada: 2 µl), também foi distribuído em duplicata; enquanto o controle negativo foi ensaiado em quatro cavidades, por microplaca. Passado o período de incubação, a microplaca foi lavada três vezes conforme protocolo para avaliação de avidez (pag. 43). Foram adicionados a cada cavidade 100 µl de conjugado anti-IgG de marcado com peroxidase (Produto A-5420, SIGMA) diluído na proporção 1:5000 em PBS, posteriormente a microplaca foi incubada por uma hora a 37 ºC. Após esse periodo, foi realizada uma série de cinco lavagens com PBS - Tween20 a 0,05%. A solução contendo 3µg de σ-phenylenediaminedihychloride (Sigma), 15 ml de ácido cítrico e 03 ml de H2O2, foi usada para revelar a reação. Foram colocados 100 µl dessa solução, por cavidade na microplaca, e deixado em ambiente escuro a temperatura ambiente, por 20 minutos. A reação foi interrompida com a adição de 30

TM µL de H2SO4 por cavidade, e a leitura realizada em leitor GEN5 BioTek – versão 2.00.18, com comprimento de onda de 490 nm. O ponto de corte do teste ELISA foi calculado a partir da média das absorbâncias dos brancos, menos a média dos controles negativos, mais três vezes o desvio padrão dos controles negativos testados de cada microplaca. O índice de reatividade (IR) foi calculado a partir da média das absorbâncias dos soros testados, dividida pelo ponto de corte. Foram consideradas positivas as amostras cujo valor calculado do IR foi igual ou maior que um.

2.4.6 Teste ELISA de avidez de IgG

A avaliação da avidez de anticorpo IgG das amostras foi realizada usando ureia como agente para dissociação da ligação antígeno/anticorpo (BAHIA et al. 1995). Já o método usado foi padronizado por Clementino et. al. (2007). No teste ELISA de avidez, as amostras de soro também foram ensaiadas em duplicata. Após a distribuição das amostras na microplaca, estas foram incubadas por uma hora, a 37 ºC e em seguida invertida sobre papel absorvente, para secagem. Foram adicionados 100 µl por cavidade de ureia 6M diluida em PBS-Tween e a microplaca foi mantida em agitação por cinco minutos. Passado o período de agitação a solução foi desprezada. As duas lavagens seguintes foram realizadas com 100 µl de PBS- Tween e mantidas, sob agitação, em ciclos de cinco minutos. A partir da adição do conjugado anti-IgG o protocolo seguiu o teste ELISA convencional, como descrito anteriormente. A figura 10 mostra a microplaca após o término do procedimento laboratorial do teste ELISA de avidez de anticorpos. A avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii foi calculada como a razão entre a média das absorbâncias dos soros nas cavidades lavados com ureia pela média das absorbâncias dos soros não tratados com ureia. Os valores foram expressos em porcentagem, sendo considerados valores maior ou igual a 50,00% indicativo de toxoplasmose crônica e valores menor ou igual 50,00% indicativo de toxoplasmose aguda (SUARÉZ-ARANDA et al. 2000).

FIGURA 10: Microplaca finalizada pelo teste ELISA de avidez

Fonte: Autoria própria.

Uma síntese dos métodos e procedimentos usados nesse trabalho é mostrada na figura 11.

FIGURA 11: Delineamento experimental

Colheita das amostras na Estação Experimental, Pedro Avelino, RN

Exames sorológicos Exames coprológicos Periodicidade: Bimensal Periodicidade: Mensal Animais experimentais: 35 Animais experimentais: 35 matrizes matrizes

Eimeria spp. Cryptosporidium Contagem de spp. Toxoplasma gondii OoPG Obtenção da Gordon e Whitlock alíquota Obtenção do soro (1939), modificada (ARAÚJO et al., Centrifugação por Ueno e 2011) Gonçalves (1988)

Recuperação dos Confecção do oocistos esfregaço fecal Diagnóstico e Centrifugo- em lâmina de avidez anticorpos flutuação em vidro IgG solução de Sedimentação Teste ELISA Sheather por formol-éter modificado (CLEMENTINO et. al. (ARAÚJO et al., 2007) (DUSZYNSKY; WIIBER, 1977). 2011)

Identificação Coloração das espécies de Eimeria Técnica de Zielh-Neelsen De acordo com modificado parâmetros morfológicos e (ARAÚJO et al., morfométricos 2011)

2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A correlação entre a média de eliminação de oocistos e a intensidade de chuvas durante o período de estudo foi verificada através do teste t para os coeficientes da regressão. A correlação entre a eliminação de oocistos e o estado reprodutivo das matrizes, foi feito por análise de variância. As espécies de Eimeria identificadas foram relacionadas com o estado reprodutivo das matrizes. Para essa análise foi feito o teste de Qui quadrado de Pearson. Para verificar se houve interferência das infecções concomitantes na alteração do perfil de resposta ao T. gondii foi utilizado um modelo de regressão múltipla. Os animais foram agrupados em três categorias de acordo com a idade, para avaliar a relação com a avidez, o que foi feito usando o teste de Qui quadrado de Pearson. Para todas as análises foi usado o programa R Core Team, versão 2015, considerando o nível de significância de 0,05.

3 RESULTADOS

3.1 INFECÇÕES POR Eimeira spp.

Para a determinação da prevalência e carga parasitária das infecções por Eimeria no rebanho foram examinadas 427 amostra fecais; destas 364 estavam positivas para oocistos de Eimeria spp., representando 85,24%. A tabela 1 mostra os dados referentes às amostras coletadas, o número de amostras positivas e a contagem mínima e máxima dos oocistos.

TABELA 1: Ocorrência e intensidade da infecção por Eimeria spp. em amostras fecais de matrizes caprinas

Variáveis / Nº amostras Nº amostras OoPG Meses examinadas positivas (%) Mínimo e Máximo Ago/10 41 32 (78,05) 0 – 2000

Set/10 44 34 (77,28) 0 – 7800

Out/10 34 31(91,18) 0 – 3600

Nov/10 36 21 (58,33) 0 – 700

Dez/10 35 29 (82,86) 0 – 4000 Jan/11 29 22 (75,86) 0 – 1300 Fev/11 33 33 (100,00) 300 – 8800 Mar/11 33 33 (100,00) 100 – 2800 Abr/11 34 33 (97,06) 0 – 6700 Maio/11 35 34 (97,14) 0 – 3300 Jun/11 35 35 (100,00) 100 – 10000 Jul/11 34 28 (82,35) 0 1100 –

Durante todo o período experimental foi observada a eliminação de oocistos de Eimeria spp. A média total de eliminação variou de 236,11 a 2.731,25. Foi mais elevada nos meses de fevereiro (2.731,25) e março de 2011 (1.093,94) (GRÁF.1).

GRÁFICO 1: Média da contagem de OoPG e nível de precipitação pluvial

3 0 0 0 2 0 0

1 5 0 2 0 0 0

1 0 0 O o P G 1 0 0 0 5 0

0 0 Precipitação pluvial (mm)

J u l/1 1

Ab r /1 1

S e t/1 0

J a n /1 1

M a i/1 1

O u t/1 0

J u n /1 1

F e v /1 1

M a r /1 1

Ag o /1 0

D e z /1 0 N o v /1 0

O o P G Precipitação

Registra-se que a intensidade da precipitação tem relação com a eliminação de oocistos. Nos meses em que a intensidade pluviométrica foi superior a 100 mm houve maior eliminação de oocistos nas fezes (p=0,00). As matrizes foram divididas em três categorias gestantes, não gestantes e paridas; para que dessa forma pudesse ser feita avaliação da eliminação de oocistos de acordo com seu estado fisiológico. Verificou-se que nos meses de fevereiro e março houve maior eliminação de oocistos, quando houve maior número de matrizes gestantes e paridas (TAB. 2). As matrizes gestantes e paridas tendem a eliminar mais oocistos de Eimeria do que as não gestantes, sendo essa diferença estatisticamente significante (p=0,00).

TABELA 2: Média de eliminação de oocistos e número de matrizes caprinas Canindé divididas por categorias

Média eliminação Nº de matrizes Nº de matrizes não Mês OoPG gestantes/paridas gestantes Ago/10 481,82 0 40

Set/ 10 775,00 0 44 Out/ 10 827,27 0 34 Nov/10 236,11 0 36

Dez/10 684,85 15 18 Jan/10 341,38 13 16

Fev/10 2 731,25 23¹ 11 Mar/10 1 093,94 9¹,² 22

Abr/10 1 065,71 2² 33 Mai/10 968,57 0 35 Jun/10 800,00 0 35

Jul/10 273,53 0 34

¹Gestantes; ²Paridas

3.1.1 Dinâmica da infecção por Eimeria spp.

Foram identificadas nove espécies de Eimeria tendo como base parâmetros morfológicos e morfométricos. As espécies identificadas foram: E. alijevi, E. arloingi, E. apsheronica, E. caprovina, E. christenseni, E. hirci, E. joechijevi, E. ninakohlyakimovae e E.caprina. As espécies mais abundantes foram E. joechijevi com prevalência de 29,62%, e E. ninakohlyakimovae com 18,77% de ocorrência durante todo o período de estudo. A frequência de cada espécie está representada no gráfico 2.

GRÁFICO 2: Proporção das espécies de Eimeria spp. identificadas em amostras fecais de matrizes caprinas da raça Canindé

4 0

3 0

2 0

Porcentagem 1 0

E . h irc i E . a lije v i E. arloingi E . c a p rin a E. caprovina E. joechijevi E. apsheronica E. christenseni

E. ninakohlyakimovae

As espécies de Eimeria foram identificadas nas seguintes proporções: E. arloingi (10,56%), E. alijevi (10,41%), E. hirci (15,25%), E. joechijevi (29,62%), E. caprina(2,35%), E. christenseni (9,24%), E. caprovina (2,64%), E. ninakohlyakimovae ( 18,77%) e E. apsheronica (1,17%). O número de oocistos identificados por mês variou de zero em maio a 213 em setembro. A proporção dos oocistos identificados, por espécie e por mês está representada no gráfico 3.

GRÁFICO 3: Frequência das espécies de Eimeria spp. consideradas patogênicas identificadas em amostras fecais de matrizes caprina da raça Canindé

1 0 0 E. christenseni

8 0 E . h irc i

E . a lije v i 6 0

E. ninakohlyakimovae 4 0 E. arloingi Porcentagem

2 0

J u l/1 1 A g o /1 0 S e t/1 0 O u t/1 0 N o v /1 0 F e v /1 1 M a r/1 1 A b r/1 1 J u n /1 1 M a io /1 1 M ê s

Nota: No mês de maio não foi possível a identificação das espécies, os oocistos estavam danificados o que não favorecia uma identificação segura.

A composição porcentual das espécies de Eimeria em função do tempo de estudo está representada na tabela 3 (Apêndice A). E na tabela 4 (Apêndice B) constam os dados morfométricos dos oocistos identificados. São mostrados os valores máximos, mínimos e médios de comprimento e largura do oocisto e do esporocisto de cada espécie. Foi calculado o índice morfométrico de cistos e esporocistos, que corresponde a relação entre o diâmetro polar e o diâmetro equatorial. Os valores também estão representados como média e, mínimo e máximo, entre parêntesis. De acordo com a análise estatística não houve relação entre as espécies e a categoria gestante/parida e a categoria não gestantes.

3.2 INFECÇÕES POR Cryptosporidium spp.

Foram analisadas 405 amostras por meio de esfregaços fecais para pesquisa de oocistos de Cryptosporidium spp. Foram detectados oocistos em 2,20% das amostras, conforme mostra a tabela 3.

Tabela 3: Ocorrência de Cryptosporidium spp. em amostras fecais de matrizes caprinas, da raça Canindé

Nº amostras Nº de amostras fecais com oocistos de Meses examinadas Cryptosporidium (%)

Ago10 37 1 (2,70) Set/10 41 0 (0,00) Out/10 35 0 (0,00) Nov/10 34 0 (0,00) Dez/10 30 0 (0,00) Jan/11 29 1 (3,44) Fev/11 35 3 (8,58) Mar/11 34 3 (8,83) Abr/11 32 0 (0,00) Maio/11 31 0 (0,00) Jun/11 35 1 (2,35) Jul/11 32 0 (0,00) Total 405 9 / 2,20

Os oocistos foram encontrados nas amostras dos meses de agosto, janeiro, fevereiro, março e junho, sendo a maior incidência entre fevereiro e março. Durante o mês de fevereiro, de três matrizes que eliminaram oocistos duas estavam gestantes. No mês de março uma matriz estava periparturiente.

3.3 INFECÇÃO POR T.gondii

3.3.1 Soroprevalência de anticorpos anti-T. gondii

Um total de 215 amostras de soro foi testado por ELISA e destas 93 (43,26%) foram consideradas reativas para T. gondii. Os valores das amostras analisadas por mês, o número de amostras reativas e o respectivo porcentual estão representados na tabela 5. A maior soroprevalência foi verificada no mês de julho (94,10%), seguido pelo mês de abril com 48,60%; e a menor taxa de reatividade foi verificada no mês de outubro (17,10%). (TAB. 4)

Tabela 4: Soroprevalência para anti-T. gondii em matrizes caprinas da raça Canindé

Nº de amostras Nº de amostras Meses examinadas reativas (%)

Ago/10 41 14 (34,15) Out/10 35 6 (17,14) Dez/10 35 8 (22,86) Fev/11 35 16 (45,71) Abr/11 35 17 (48,57) Jul/11 34 32 (94,12) Total 215 93 (43,26)

O índice de reatividade calculado para as 215 amostras de soro variou de 0,46 a 3,27 sendo consideradas reativas aquelas que apresentaram valores maiores ou iguais a 1,00 (GRAF.4).

GRÁFICO 4: Índice de reatividade calculado para as amostras sorológicas de matrizes caprinas Canindé

Índice de reatividade0 (IR)

A g o /1 0 O u t/1 0 D e z /1 0 F e v /1 1 A b r/1 1 J u n /1 1

M ê s

3.3.2 Determinação da avidez de anticorpos anti-T. gondii

O teste ELISA de avidez foi realizado como indicativo de infecção aguda ou crônica. Das 93 amostras reativas, 65 (69,90%) apresentaram anticorpos de alta avidez, indicativo de infecção crônica e 28 (30,10%) apresentaram anticorpos de baixa avidez, indicativo de infecção aguda. O índice de avidez variou de 31,86 a 79,49. Índice de avidez maior ou igual a 50 foram considerados alta avidez (GRÁF. 5)

GRÁFICO 5: Avidez de anticorpos anti-T. gondii em soros de matrizes caprinas da raça Canindé

8 0

7 0

6 0

5 0

4 0

Índice de Avidez 3 0

2 0

J u l/1 1 A g o /1 0 O u t/1 0 D e z /1 0 F e v /1 1 A b r/1 1

M ê s

TABELA 5: Porcentagem do número de matrizes em cada categoria de acordo com o teste ELISA de avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii em soros de matrizes caprinas da raça Canindé

Categorias

Até 12 meses 01 a 05 anos Maior que 05 anos

Baixa Alta Baixa Alta Baixa Alta Mês avidez avidez avidez avidez avidez avidez (%) (%) (%) (%) (%) (%) Ago/10 28,57 71,43 - - - - Out/10 16,67 16,67 - - 16,67 50,00 Dez/10 - - 25,00 37,50 12,50 25,00 Fev/11 - - - 62,50 18,75 18,75 Abr/11 - - 23,53 23,53 17,65 35,29 Jul/11 - - 15,63 34,38 9,38 40,63 (-) não havia animais nessa faixa etária.

Não se observou diferença estatisticamente significante da interferência das infecções concomitantes em relação ao índice de reatividade dos anticorpos anti-T.

gondii. De modo semelhante também não se observou relação estatisticamente significante entre as categorias de idade e a avidez dos anticorpos anti-T. gondii.

4 DISCUSSÃO

4.1 OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR Eimeria spp.

A eliminação de oocistos de Eimeria ocorreu durante todo o período de estudo, com carga parasitária variando de 100 a 10.000 oocistos por grama de fezes e prevalência de 85,24%. Das quinze espécies descritas que parasitam caprinos, nove foram encontradas no presente estudo. Como o regime de manejo das matrizes é semi-intensivo, o ambiente de pastejo torna-se fonte de infecção, devido à contínua contaminação com as fezes dos animais, mesmo que de forma dispersa. Nesse sentido, Hassum e Menezes (2005) argumentaram que a infecção por Eimeria em animais a campo é constante, e que é certamente mantida pelos animais adultos e pelas condições ambientais favoráveis à disseminação e manutenção da viabilidade dos oocistos. Já nos currais, acredita-se que os animais ficam mais expostos aos oocistos, pois estes são depositados com as fezes e esporulam naturalmente e, se não houver a remoção do material fecal em curtos espaços de tempo, os oocistos vão se concentrando cada vez mais. Dessa forma, os oocistos podem ser suspensos na poeira e ingeridos diretamente pelo animal, podem aderir ao pêlo da matriz, e posteriormente ser ingerido pela cria lactente, ou contaminarem os cochos para ração e bebedouros. As infecções devem ocorrer de forma mais intensa nos meses com maior umidade do solo, já que se observou que a eliminação de oocistos foi significativamente mais elevada em meses com maior precipitação. Em estudos com caprinos na África do Sul e Nigéria, também foram observados maiores níveis de excreções de oocistos durante ou logo após a estação das chuvas (HARPER;PENZHORN, 1999; WOJI; LITTLE; IKWUEGBU, 1994). Mas aqui no Brasil essa relação tem sido pouco abordada. Indicadores ambientais, tais como, umidade, temperatura e cobertura vegetal têm sido implicados como fatores que influenciam na esporulação dos oocistos, no tempo de sobrevivência no ambiente e na sua infectividade. Dessa forma condições adequadas de temperatura e umidade são necessárias para a esporulação dos

oocistos excretados, o que favorece a maior contaminação dos animais (FOREYT, 1990; KHAN, et al. 2011). A infecção por Eimeria nesse estudo foi encontrada em fêmeas não gestantes, prenhas, puérperas e lactantes. Mas o pico de eliminação de oocistos ocorreu no mês de fevereiro, época em que havia matrizes gestantes no rebanho. O aumento de oocistos eliminados indica maior intensidade da infecção e deve está associado ao estado fisiólogico do animal e a outros fatores de estresse que possam interferir indiretamente na produção dos oocistos. Muitos autores têm associado o aumento na eliminação de oocistos no período do periparto e, principalmente na lactação, à diminuição da imunidade. Assim, Nunes, Cruz e Teixeira Neto (2015) acompanharam a eliminação de oocistos durante a gestação e a fase inicial da lactação em cabras e verificaram que a contagem de oocistos de Eimeria spp. que eram eliminados pelas fezes variou durante a gestação. Esses autores relataram que no período mais próximo do parto, a contagem chegou a 2.460 ± 207 oocistos por grama de fezes. Diferenças nas prevalências e diversidade das espécies de Eimeria dependem de fatores distintos. Os fatores biológicos, tais como, idade, estado imunológico e raça do hospedeiro; e caracteristicas do parasito que incluem potencial reprodutivo, cepa e virulência; e os ambientais influenciam na sobrevivência dos oocistos. Além disso, o regime de manejo e o tamanho da população podem sobrecarregar os fatores de resistência do animal e predispor à doença clínica (FOREYT, 1990; FAYER 1980; CATCHPOLE; NORTON; JOYNER, 1975). A prevalência da infecção por Eimeria nas amostras fecais das matrizes foi de 85,24%. Resultado comparáveis aos achados do estudo realizado por Barbosa et al. (2003) em estudo em vinte propriedades no município de Mossoró, Rio Grande do Norte, no qual a prevalência geral da infecção por Eimeria, entre animais jovens e adultos, foi de 92,48%. E também aos achados de um estudo com cabras leiteiras, realizado por Cavalcante et al. (2012), em Sobral, no estado do Ceará, onde os autores verificaram a infecção em 88,10% das amostras das matrizes. Mas se diferencia dos achados por Fonseca et al (2012) no município de Afonso Bezerra, em estudo com cabras exploradas para produção de leite. Esses autores encontraram prevalência geral de 42,33%, e de 37,80% para as matrizes. É importante mencionar que Afonso Bezerra é um município que faz fronteira com o

município de Pedro Avelino, onde foi realizado o presente estudo. Nesse sentido, diferenças específicas no manejo dos rebanhos ou nas condições para a análise das amostras devem ser fatores que influenciaram na diferença entre os resultados. Já que as condições climáticas são similares. A prevalência da infecção por esse gênero de parasito é elevada nos caprinos, em várias partes do mundo. Um estudo sobre ocorrência de Eimeria em 110 fêmeas caprinas na Polônia mostrou prevalência de 81,00%; enquanto no Sri Lanka a prevalência foi de 91,00% em animais juvenis, 88,00% das amostras de animais jovens e em 83,00% dos animais adultos (BALICKA-RAMISZ, 1999; FAIZAL; RAJAPAKSE, 2001). De forma similar, a diversidade das espécies de Eimeria que infecta os caprinos, bem como aquelas que ocorrem com maior frequência se diferenciam de acordo com os estudos. Em nosso trabalho, a espécie E. jolchijevi foi a mais prevalente; a espécie E. ninakohlyakimovae foi a segunda mais frequente e foi observada em todo o periodo de estudo, exceto no mês de junho. A espécie E. hirci foi a terceira mais frequente, seguida por E. arloingi, E.alijevi e E. christenseni. Essas são as espécies que são consideradas de maior importância patogênica para os caprinos (LIMA; 1980; LIMA 2004). Na Arábia Saudita, Alyousif et al. (1992) trabalhando com caprinos de ambos os sexos, verificaram a presença de dez espécies de Eimeria: E. aljevi, E. apsheronica, E. arloingi, E. caprina, E. caprovina, E. christenseni, E. hirci, E. jolchijevi, E. ninakohlyakimovae e E. punctata. As espécies mais frequentemente encontradas foram E.arloingi e E. hirci. Em estudo realizado no Norte da Jordânia por Abo-Shehada e Abo-Farieha (2003) foram identificadas oito espécies de Eimeria em 200 cabras em 13 propriedades diferentes. Das espécies encontradas as mais predominantes foram E. arloingi, E. ninakohlyakimovae e E. alijevi. O'callaghan (1989) em estudo no Sul da Austrália examinando cabras domésticas e selvagens avaliou a prevalência das espécies de Eimeria em animais jovens e adultos. Em cabras domésticas jovens, as espécies mais prevalentes foram E. christenseni, E. caprovina e E. jolchijevi. Um estudo realizado em São José do Rio Preto, no estado de São Paulo realizado por Freitas et al. (2005) usando 58 caprinos jovens e adultos, foram identificadas oito espécies de Eimeria. As espécies mais prevalentes foram E.

ninakohlyakimovae (77,60%) e E. jolchijevi (72,40%). Em um estudo com caprinos SRD, na mesorregião oeste do estado do Rio Grande do Norte, Ahid et al. (2009) encontraram como espécies mais prevalentes, E. ninakohlyakimovae (25,72%) e E. arloingi (21,96%). Conforme se observam nesses estudos, em diferentes partes do mundo e nas regiões Sudeste e Nordeste do Brasil, mesmo em proporções diferentes, as espécies que ocorrem com maior frequência, são também as mais patogênicas; exceto E. caprovina, referida no estudo realizado na Austrália. As nove espécies identificadas no presente estudo, também já foram relatadas parasitando caprinos no município de Nova Friburgo, na Região Serrana do estado do Rio de Janeiro, por Hassum e Menezes (2005); no município de Mossoró, por Barbosa et al. (2003); e no município de Afonso Bezerra, por Fonseca et al (2012); os dois últimos foram realizados no estado do Rio Grande do Norte. Em estudos realizados em Sobral, no estado do Ceará, por Cavalcante et al. (2012) e em São José do Rio Preto, São Paulo também foram relatadas todas as espécies de Eimeria identificadas neste estudo, exceto E. apsheronica. Certamente por se tratar de uma espécie que ocorre em baixa frequência. De acordo com Lima (2004) o diagnóstico da eimeriose é feito através da anamnese, em associação com informações sobre o regime de manejo e exploração, sinais clínicos, lesões intestinais macroscópicas à necropsia, demonstração do parasito nos tecidos e exame parasitológico de fezes. Mas a presença de oocistos nas fezes associada com diarreia, apesar de indicativas, não são suficientes para diagnosticar a eimeriose, pois um grande número dos oocistos encontrados pode ser de espécies que apresentam baixa patogenicidade. Além disso, outras doenças também causam diarreia como as verminoses, criptosporidiose e enterobacterioses. O controle da transmissão de Eimeria nos pequenos ruminantes deve ser realizado através de práticas adequadas de manejo e pela administração de quimioterápicos com o objetivo de impedir ou reduzir a infecção. Os quimioterápicos também podem ser usados como de forma de controle da morbidade (VIEIRA et al., 2004). Em animais a pasto comumente se encontram infecções em concomitância com espécies consideradas menos e mais patogênicas. O parasitismo por essas últimas pode resultar em grandes prejuízos para os animais (MCDOUGALD, 1979).

Sendo assim, a identificação das espécies favorece o controle adequado evitando perdas econômicas em consequência da alta morbidade das infecções.

4.2 OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR Cryptosporidium spp.

Os resultados desse estudo mostram que a infecção por Cryptosporidium spp. ocorreu somente em 2,20% (9/405) das matrizes caprinas, detectadas nos meses de agosto 2010, janeiro, fevereiro, março e junho de 2011. Poucos são os relatos sobre a prevalência de Cryptosporidium spp.em caprinos na literatura cientifica. Johnson et al. (1999), em Sultanato de Omã, relataram um surto em caprinos de idades variadas, cujos exames foram feitos através de analises histopatológicas e esfregaços fecais, nos quais foi evidenciada a presença do parasito. Noordeen et al. (2001), no Sri Lanka, observaram prevalência de 25,2% de oocistos de Cryptosporidium em caprinos com mais de 12 meses de idade, em esfregaços fecais corados por Ziehl-Neelsen. Delgado et al. (2003), em Portugal, estudaram a criptosporidiose em ruminantes silvestres do jardim zoológico de Lisboa. Foi realizada a colheita de 388 amostras fecais, das quais oito apresentaram oocistos de Cryptosporidium spp., representando 2,10%. Apesar de tratar-se de animais silvestres, em condições de cativeiro, a prevalência encontrada por esses autores foi semelhante a que foi encontrada em nosso estudo. Castro-Hermida et al. (2007) em estudo com ruminantes domésticos na Espanha, verificaram a presença de oocistos de Cryptosporidium spp. em 9,00% das amostras fecais de caprinos examinadas. Vieira et al. (1997) em estudo com 22 cabritos,infectados naturalmente, cuja idade variava de uma a duas semanas, observaram eliminação de oocistos nas fezes desses animais, os quais apresentavam sinais clínicos da criptosporidiose e alguns não conseguiram sobreviver. No Rio Grande do Norte a infecção por Cryptosporidium spp. foi descrita pela primeira vez por Silva (2009), em cordeiros, no município de Lajes, através de exames coprológicos. Dos 27 animais incluídos no estudo, 7,40% excretaram

oocistos de Cryptosporidium spp. nas fezes, sendo um cordeiro na terceira semana de idade e outro na quarta. Os animais adultos, devido a forte resposta imunitária, são geralmente considerados refratários a infecções pesadas por C. parvum; sendo esse tipo de infecção associada à doença clínica. No entanto, grande proporção de animais adultos, muitas vezes assintomáticos, assume o papel de reservatórios desses parasitos e, por conseguinte, se constituem fontes de contaminação para o meio ambiente (CASTRO-HERMIDA; GONZALEZ-WARLETA; MEZO, 2007; FOREYT, 1990). Em nosso estudo no mês de fevereiro de 2011, duas matrizes que eliminaram oocistos de Cryptosporidium spp. estavam gestantes. Já no mês de março, uma matriz que eliminou tais oocistos estava no puerpério. Sabe-se que no período do periparto, há o aumento na eliminação de oocistos de Cryptosporidium spp.; esse aumento tem sido relacionado à mudança na resposta imune dos animais durante a gestação e lactação (CASTRO-HERMIDA et al., 2005). Ortega-Mora et al (1999) analisaram amostras fecais de 14 ovelhas gestantes com histórico de diarréia neonatal causada por C. parvum, oriundas de duas fazendas. As amostras foram coletadas a partir da sexta semana antes do parto até a segunda semana após o nascimento das crias. Os autores relataram que a porcentagem de animais que eliminou oocistos aumentou na semana antes do parto, seguindo a mesma tendência após o parto. Na França, Castro-Hermida et al. (2005) também verificaram a presença de oocistos de C. parvum em cabras no período do periparto. Os autores observaram que a eliminação de oocistos se elevou de 36 para 1.000, sendo esse aumento, principalmente, na primeira semana após o parto. O'Donoghue (1995) relata que vários testes laboratoriais são utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. Métodos diretos e indiretos são usados, baseados na detecção do parasito em tecidos ou em amostras corporais. Isto porque mesmo quando os sinais clínicos da doença estão presentes não são suficientes para o diagnóstico, visto que os sinais são inespecíficos e podem ser atribuídos a outras doenças infecciosas. O diagnóstico parasitológico de criptosporidiose é difícil levando em consideração a identificação das espécies pelo oocisto, pois estes apresentam muitas semelhanças morfológicas, entre as espécies. Por outro lado, a escolha da

técnica para detecção e caracterização de Cryptosporidium spp. depende da sensibilidade, do nível de diferenciação, do tempo de resposta e de equipamento disponível (SUNNOTEl et al., 2006). As análises morfológicas são frequentemente usadas para exames de amostras biológicas e ambientais. Comumente os esfregaços fecais são corados pela técnica de Ziehl-Neelsen, a qual é recomendada e usada apesar de apresentar baixa sensibilidade (GARCIA et al., 1983). Mas para se proceder à diferenciação das espécies e a determinação da subtipagem, se fazem necessárias análises moleculares. Sendo assim, a infecção por Cryptosporidium spp. apresenta desafios de diversas ordens, que vão desde os adultos assintomáticos se constituírem fonte adicional de infecção para o ambiente e os recém-nascidos, até a possibilidade de ocorrência da criptosporidiose em animais mais velhos, desde que esses, infectados e assintomáticos, sejam submetidos a fatores estressantes, tais como superlotação, má nutrição e infecções concomitantes (JOHNSON at al., 1999).

4.3 PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS ANTI -T. gondii

Das 215 amostras de soro testadas por ELISA, 43,26% foram consideradas reativas para anticorpos anti-T. gondii; e 69,90% destas amostras apresentaram anticorpos de alta avidez. Significando que estes animais encontravam-se na fase crônica da infecção. A soroprevalência para toxoplasmose caprina é bastante variável nas diversas regiões do mundo; sendo que essa variabilidade é multifatorial, e, em parte deve está relacionada com os testes sorológicos usados. Além de fatores como idade, sexo, raça, hábitos alimentares, fatores epidemiológicos, manejo, infraestrutura sanitária e hídrica, condições ambientais e região geográfica (DUBEY, 1990; TENTER et al. 2000). Nesse sentido, em Uberlândia, estado de Minas Gerais, Figueiredo et al (2001) realizaram um estudo comparativo entre hemaglutinação indireta (HAI), imunofluorescência (RIFI) e os testes imunoenzimáticos (ELISA) para determinar a prevalência de anticorpos anti-T. gondii em caprinos. Os autores observaram a

soroprevalência geral de 18,40% em 174 amostras analisadas. Esses autores relatam que encontraram resultados concordantes entre os testes usados e concluíram que ambos são adequados para levantamentos epidemiológicos da infecção porT. gondii em caprinos. Em estudo com animais de produção no estado de São Paulo, Meireles, Galisteo Junior e Andrade Junior (2003) detectaram pelo teste ELISA anticorpos anti-T. gondii em 31,00% das ovelhas, 17,00% das cabras e em 11,00% (22/200) dos bovinos. No estado do Paraná, Garcia et al. (2012) em estudo soroepidemiológico para toxoplasmose caprina analisaram soros de 405 animais da mesorregião metropolitana de Curitiba. Por meio das técnicas de ELISA e RIFI, encontraram prevalências de 39,41% e 35,96%, respectivamente. Faria et al. (2007) no município de Patos, estado da Paraíba, verificaram a prevalência de 24,50% em 306 amostras de soros de caprinos analisadas por RIFI para a detecção de anticorpos anti-T. gondii. Cavalcante et al. (2008) no estado do Ceará, analisaram 2.362 amostras de soro de caprinos. A prevalência estimada pelo teste ELISA foi de 25,10%. E os fatores de risco identificados nas propriedades foram: idade dos animais, número de gatos, comedouro manufaturado com madeira e ausência de comedouro. Anderlini et al. (2011) em estudo que incluiu dez municípios do estado de Alagoas, analisaram 454 amostras de soros de animais, procedentes de 24 propriedades por meio da RIFI. A soroprevalência foi de 39,00%, com 95,80% das propriedades apresentando animais positivos. Santos et al. (2012) realizaram um estudo transversal com o objetivo de determinar fatores de risco associados com a prevalência de anticorpos anti-T. gondii, em rebanhos de caprinos leiteiros no estado da Paraíba. Amostras de soro de 975 caprinos leiteiros adultos, procedentes de 110 propriedades, foram examinadas por RIFI e a positividade verificada foi de 18,10%. Em Pernambuco, Bezerra et al. (2015) avaliaram 48 amostras de soro de cabras em lactação, por RIFI, para pesquisa de anticorpos anti-T. gondii e observaram positividade de 22,58%. No Rio Grande do Norte, o primeiro registro da soroprevalência anti-T. gondii em caprinos foi realizado por Araújo Neto et al (2008), na microrregião Seridó Oriental e a soroprevalência foi de 30,60%, pelo teste ELISA. Posteriormente, um

estudo com caprinos de corte e leiteiro, realizado por Medeiros et al. (2014) demonstrou soroprevalência de 47,10% para anticorpos anti-T. gondii, também por meio do teste ELISA. Nas infecções recentes por T. gondii uma alta porcentagem de anticorpos IgG mostra baixa avidez, ou seja baixa afinidade para os antígenos correspondentes. Com o decorrer do tempo, esses anticorpos vão apresentando avidez crescente, de modo que nas infecções de mais longa duração detectam-se anticorpos de alta avidez (CAMARGO et al. 1991). Bahia et al., (1995) avaliaram a avidez de anticorpos IgG, por meio da dissociação do complexo antígeno-anticorpo pela ureia. Esses autores analisaram amostras de soro de caprinos, pelo teste ELISA e observaram a queda da absorbância nos soros lavados com ureia. E concluíram que a absorbância decresce com o tempo de infecção. Esses achados forneceram fundamentos e práticas para o uso da determinação da avidez de anticorpos anti-T. gondii como marcador de infecção recente ou crônica na toxoplasmose. Já que à medida que a resposta imunológica torna-se amadurecida, os anticorpos da classe IgG aumentam sua avidez. Nesse sentido, um estudo realizado no estado de Minas Gerais, revelou que dentre 328 amostras de soro de caprinos reativa para anticorpos anti-T. gondii, 73,20% apresentavam anticorpos de alta avidez (CARNEIRO et al., 2009). No Rio Grande do Norte, Nunes et al. (2013) analisaram por meio do teste ELISA, a avidez de anticorpos anti-T. gondii em soro de caprinos no município de Mossoró. Das 125 amostras de soro analisadas, 94,40% apresentavam anticorpos IgG de alta avidez. Também Medeiros et al. (2014) analisaram 244 amostras de soro de caprinos de corte e leiteiros, pelo teste ELISA, e encontraram anticorpos de alta avidez em 89,60% das amostras reativas. Os achados sobre a avidez de anticorpos anti-T. gondii encontrados em estudos prévios realizados com caprinos no Rio Grande do Norte se assemelham aos encontrados no presente estudo. Até porque, em ambos os casos incluíam animais adultos. Portanto, com maior chance de apresentar infecção de mais longo prazo e, como consequência, anticorpos de alta avidez. Nessas condições as matrizes podem proteger suas crias, as quais mesmo que venham adquirir a infecção por T. gondii, espera-se que a carga parasitária seja baixa e por isso com menores danos. Por outro lado, esse porcentual alto de

animais com infecção crônica significa presença de cistos teciduais, o que pode representar risco para a saúde humana e animal. Isto porque quando cessar o papel desses animais enquanto matrizes, eles serão encaminhadas para o abate e o consumo por seres humanos ou outros animais, que são hospedeiros de toxoplasma.

5 CONCLUSÕES

A eliminação de oocistos de Eimeria ocorreu de forma contínua, com aumento na carga parasitária durante os meses com maior intensidade de chuva, e com a presença de matrizes gestantes e paridas no rebanho. Nove espécies de Eimeria foram identificadas neste estudo e as espécies E. ninakohlyakimovae, E. hirci, E. arloingi, E.alijevi e E. christenseni, que são as mais patogênicas, foram encontradas ao longo de todo o período experimental. A infecção por Cryptosporidium spp. apresentou baixa prevalência, mas com tendência de eliminação contínua de oocistos. O risco de transmissão vertical de T. gondii pode ser considerado alto.

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APÊNDICE A: Valor absoluto e proporção de oocistos de Eimeria identificados nas amostras fecais, de matrizes caprinas da raça Canindé, Estação Experimental Terras Secas, RN

Mês Espécie Ago Set Out Nov Fev Mar Abr Mai Jun Jul VA % VA % VA % VA % VA % VA % VA % VA % VA % VA % E. alijevi 10 7,14 14 6,57 20 21,98 2 10,00 1 20,00 7 17,07 6 4,35 0 0,00 3 60,00 9 31,03 E. apsheronica 3 2,14 3 1,41 2 2,20 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 E. arloingi 11 7,86 25 11,74 14 15,38 4 20,00 0 0,00 5 12,20 8 5,80 0 0,00 2 40,00 2 6,90 E. christenseni 22 15,71 18 8,45 13 14,29 0 0,00 0 0,00 6 14,63 3 2,17 0 0,00 0 0,00 1 3,45 E. caprina 5 3,57 6 2,82 3 3,30 0 0,00 0 0,00 0 0,00 1 0,72 0 0,00 0 0,00 1 3,45 E. caprovina 6 4,29 6 2,82 5 5,49 0 0,00 1 20,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 0 0,00 E. hirci 13 9,29 33 15,49 16 17,58 1 5,00 0 0,00 7 17,07 27 19,57 0 0,00 0 0,00 7 24,14 E. joechijevi 46 32,86 80 37,56 4 4,40 6 30,00 1 20,00 11 26,83 0 0,00 0 0,00 0 0,00 5 17,24 E. 24 17,14 28 13,25 14 15,38 7 35,00 2 40,00 5 12,20 44 31,88 0 0,00 0 0,00 4 13,79 ninakohlyakimovae

Nota: VA-Valor absoluto.

APÊNDICE B: Dados morfométricos das espécies de Eimeria identificadas em amostras fecais de matrizes caprinas da raça Canindé, Estação

Espécie Nº de Oocistos Esporocisto

Experimental Terras Secas, RN

medições Comprimento (µm) Largura (µm) Índice Morfométrico Comprimento (µm) Largura (µm) Índice Morfométrico E. alijevi 46 20,63 17,93 1,15 13,44 7,40 1,82 (18,00-24,00) (12,00-20,00) (1,5-1,2) (7,00-13,00) (5,00-8,00) (1,4-1,6) E. apsheronica 7 32,29 23,00 1,40 13,57 8,43 1,61 (27,00-40,00) (19,00-26,00) (1,42-1,54) (12,00-15,00) (7,00-10,00) (1,71-1,50) E. arloingi 57 29,77 20,68 1,44 13,44 7,40 1,82 (25,00- 36,00) (18,00-25,00) (1,39-1,44) (11,00-17,00) (5,00-10,00) (2,20-1,70) E. christenseni 38 35,50 24,61 1,44 14,87 8,55 1,74 (29,00-43,00) (20,00-38,00) (1,45-1,13) (12,00-19,00) (6,00-11,00) (2,00-1,73) E. caprina 18 31,16 22,61 1,38 14,00 7,94 1,76 (24,00-43,00) (19,00-29,00) (1,26-1,48) (10,00-18,00) (6,00-10,00) (1,67-1,80) E. caprovina 14 32,00 24,00 1,33 14,79 8,07 1,83 (26,00-42,00) (19,00-30,00) (1,37-1,40) (13,00-19,00) (7,00-10,00) (1,86-1,90) E. hirci 56 24,93 20,20 1,23 11,46 7,11 1,61 (20,00-32,00) (17,00-30,00) (1,18-1,07) (8,00-15,00) (6,00-9,00) (1,33-1,67) E. jolchijevi 54 29,63 21,50 1,38 13,70 7,89 1,74 (21,00-40,00) (17,00-27,00) (1,24-1,48) (11,00-16,00) (6,00-13,00) (1,83-1,23) E. 56 24,91 20,11 1,24 12,05 7,27 1,66 ninakohlyakimovae (20,00-30,00) (17,00-25,00) (1,18-1,20) (9,00-17,00) (5,00-9,00) (1,80-1,89)