Capuñay Reyes Patricia Pamela.Pdf

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS II Actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de BIOQUIMICA Rapidithrix thailandica s80 de playa LagunaY Grande – Paracas

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE FARMACIA BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA DE

AUTOR:

• CAPUÑAY REYES, Patricia Pamela BIBLIOTECA

ASESOR:

• Mg. GANOZA YUPANQUI, Mayar Luis

TRUJILLO – PERÚ 2019

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DEDICATORIA

A DIOS

Quien inspiro mi espíritu para la

realización de este estudio, por darme

salud y bendición para alcanzar mis

metas como persona y como

profesional.

A MIS PADRES BIOQUIMICA LauraY Reyes y Rolando Capuñay Por brindarme su apoyo emocional e

incondicional, ya que son el principal

cimiento para la construcción de mi FARMACIA carrera profesional, dándome la DE motivación necesaria para seguir

adelante.

BIBLIOTECA A MI HERMANA

Rosa Capuñay Reyes

Por su apoyo moral, por brindarme

cariño, comprensión y apoyo a lo largo

de mi vida profesional.

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AGRADECIMIENTO

A la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, por

el apoyo en la infraestructura y la facilidad de brindar los equipos para realizar el

presente trabajo de investigación.

Al proyecto: PIBA-2-P-247-14-FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterial marina

del Perú: potencial fuente de biomoléculas antibióticas contra patógenos multidrogo

resistentes”, con convenio de adjudicación N° 092-2014-FONDECYT-DE por el

apoyo en el presente trabajo de investigación.

Al Mg. Mayar Luis Ganoza Yupanqui por haber sido un guía y haberme brindado su

confianza, enseñanzas, le agradezco por todo el tiempoBIOQUIMICA y dedicación que me brindó Y para llevar a cabo este proyecto de investigación.

A todos mis amigos del proyecto de investigación, quisiera darles las gracias por los

buenos momentos que hemos compartido, que me han demostrado su apoyo, brindado FARMACIA

sus ánimos y consejos durante el DEperiodo de mi tesis.

BIBLIOTECA

Patricia Pamela Capuñay Reyes

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PRESENTACIÓN

Señores miembros del jurado dictaminador:

Dando cumplimiento a lo establecido por el reglamento de trabajos de investigación

de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, me

es grato someter a vuestra consideración y elevado criterio profesional el presente

Informe de Investigación intitulado: “Actividad antibiótica de las fracciones del

extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80 de playa Laguna Grande – Paracas” BIOQUIMICA Dejo a su criterio, señores miembros del jurado la calificaciónY del presente trabajo de

Investigación Científica.

FARMACIA

Trujillo, enero del 2018

BIBLIOTECA

______

CAPUÑAY REYES, Patricia Pamela

iii

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JURADO DICTAMINADOR

______Dr. Julio Víctor CAMPOS FLORIAN (Presidente)

BIOQUIMICA Y

______Mg. Mayar Luis GANOZA YUPANQUI FARMACIA(Asesor) DE

BIBLIOTECA

______Dr. Roberto Osmundo YBAÑEZ JULCA (Miembro)

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RESUMEN

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la actividad antibiótica de las

fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80 de playa Laguna

Grande – Paracas. La bacteria se hizo crecer en medio líquido usando caldo marino,

se empleó acetona como solvente de extracción. El extracto se concentró a presión

reducida hasta sequedad. Luego se realizó un fraccionamiento cromatográfico

utilizando Sephadex LH-20 como fase estacionaria y metanol como fase móvil. Se

recolectaron tres fracciones según la coloración presentada (verde claro, verde oscuro

y beisch). Para la actividad antibiótica se preparó una concentración de 20 mg/mL,

determinándose mediante el método de difusión en agar por discos y se contrastó a BIOQUIMICA Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARMY ) TCC 43300, Staphylococcus

aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Bacillus subtilis ATCC 6633 y

Pseudomonas aeruginosa. Se determinó la concentración mínima inhibitoria (CMI)

por microdilución y la concentraciónFARMACIA mínima bactericida (CMB), en caldo y agar

Mueller Hinton respectivamente.DE Se observó que la fracción 3 presentó mayor halo de inhibición (13 mm) frente a SARM ATCC 43300 y S. aureus ATCC 25923, a

diferencia de fracción 2 que presentó un menor halo de inhibición (11 mm) y fracción

1 que no presentó halo frente a los agentes patógenos. La fracción 3 además presentó BIBLIOTECA una CMI y CMB de 0,13 mg/mL. Se concluye que la fracción 3 del extracto con

acetona presentó mayor actividad bactericida frente a SARM ATCC 43300 y S.

aureus ATCC 25923. Se determinó además el R푓 de la fracción 3 que presentó 2

manchas (0,78; 0,85).

Palabras claves: Rapidithrix thailandica s80; concentración mínima inhibitoria;

concentración mínima bactericida; actividad antibiótica.

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ABSTRACT

The objective of this study was to evaluate the antibiotic activity of the fractions of

the crude extract of Rapidithrix thailandica s80 from Laguna Grande beach - Paracas.

The bacterium was grown in liquid medium using marine broth, acetone was used as

extraction solvent. The extract was concentrated under reduced pressure to dryness.

Then a chromatographic fractionation was performed using Sephadex LH-20 as a

stationary phase and methanol as the mobile phase. Three fractions were collected

according to the presented color (light green, dark green and beisch). For the antibiotic

activity, a concentration of 20 mg/mL was prepared, determined by the disk agar

diffusion method and compared to methicillin-resistant Staphylococcus aureus BIOQUIMICA (MRSA) ATCC 43300, Staphylococcus aureus ATCCY 25923, Escherichia coli ATCC

25922, Bacillus subtilis ATCC 6633 and Pseudomonas aeruginosa. The minimum

inhibitory concentration (MIC) was determined by microdilution and the minimum

bactericidal concentration (MBC), inFARMACIA Mueller Hinton broth and agar, respectively. It

was observed that fraction 3 showedDE greater inhibition halo (13 mm) against ATCC 43300 MRSA and S. aureus ATCC 25923, unlike fraction 2 that had a lower inhibition

halo (11 mm) and fraction 1 that did not present halo against pathogens. Fraction 3

also presented a MIC and MBC of 0.13 mg / mL. It is concluded that fraction 3 of the BIBLIOTECA acetone extract showed higher bactericidal activity against ATCC 43300 and S. aureus

ATCC 25923 MRSA. We also determined the R푓 of fraction 3 that presented 2 spots

(0.78, 0.85).

Keywords: Rapidithrix thailandica s80; minimum inhibitory concentration;

minimum bactericidal concentration; antibiotic activity

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ÍNDICE

RESUMEN……………………………………………………………...... v

ABSTRACT…….………....……………………………..………………… vi

I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………...... 1

II. MATERIAL Y MÉTODO…………………………………………...... 7

III. RESULTADOS………………….…………………………………….. 15 BIOQUIMICA IV. DISCUSIÓN………………………………………………………...... Y .. 20

V. CONCLUSIONES……………………………………………………… 25

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………FARMACIA ……………...... 26

DE ANEXOS...…………………………………………………...... ………….... 31

BIBLIOTECA

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I. INTRODUCCIÓN

Debido a la selección y diseminación de poblaciones de microorganismos resistentes, es

imperativo buscar nuevos antimicrobianos, más eficientes y de mayor espectro y

tolerancia para combatirlos. Se considera que el estudio de los metabolitos secundarios

obtenidos a partir de microorganismos marinos es una potencial fuente para el

descubrimiento de nuevos agentes antimicrobianos [1,2].

En los últimos años, se ha hecho evidente la importancia del estudio de la microbiología

marina para comprender su papel en los procesos biológicos que ocurren en el océano;

por lo cual se han realizado múltiples investigaciones encaminadas principalmente hacia BIOQUIMICA la caracterización de los microorganismos marinos [3Y].

Muchos organismos marinos que incluyen bacterias, hongos y algas mayores, así como

algunos invertebrados son actualmente considerados como virtuales fuentes promisorias FARMACIA de sustancias bioactivas. Hallazgos de nuevos microorganismos marinos muestran la DE existencia de cepas nativas que producen una variedad de metabolitos secundarios

química y biológicamente interesantes para el desarrollo y producción de nuevos

compuestos de importancia en la industria farmacológica, cosmética, entre otras [4,5].

BIBLIOTECA La lista de compuestos obtenidos a partir de microorganismos acuáticos incluye

antimicrobianos, anticancerígenos y antiinflamatorios, muchos de los cuales pertenecen

a clases químicas no descritas en microorganismos terrestres [6,7].

Rapidithrix thailandica s80 es una bacteria marina con actividad antibiótica, este género

pertenece a la familia, Flammeovirgaceae; phylum Bacteroidetes. Son Gram negativos,

quimioheterotróficos no fructíferos que se encuentran en una gran variedad de ambientes

incluyendo suelo, sedimento acuático, agua dulce y salada, en la superficie de los

organismos, el intestino de los animales, e incluso en los tejidos de los artrópodos [8].

Este género representa una proporción sustancial de la comunidad bacteriana en

ecosistemas costeros y desempeñan un papel importante. Cada año se describe un número

creciente de nuevas especies de Bacteroidetes, la mayoría procedentes de ambientes

marinos [8].

Las células son filamentos no ramificados y se mueven por deslizamiento. Son aerobios

estrictos, es decir necesita de un ambiente que contenga oxígeno diatómico para poder

existir y desarrollarse adecuadamente. Además, la temperatura óptima es de 25 – 30 °C. BIOQUIMICA El intervalo de pH para el crecimiento es 5-10. Positiva en las pruebas de oxidasa, Y fosfatasa alcalina y negativo en las pruebas de catalasa, lipasa. Exhiben una potente

actividad antibacteriana contra bacterias Gram negativas y Gram positivas, en especial

contra Staphylococcus aureus [9]. FARMACIA

Ariakemicinas A (1) y B (2), antibióticosDE péptidos no ribosómicos, fueron descubiertos a

partir del extracto de fermentación de la bacteria del deslizamiento marino Rapidithrix

sp. Estos metabolitos son isómeros posicionales con respecto a un doble enlace y

cromatográficamente inseparable, haciendo que la estructura se estudie en una base de BIBLIOTECA mezcla [8-11].

Las ariakemicinas están compuestas de treonina, dos ω-amino- (ω-3) -metil carboxílico

ácidos con unidades de dieno o trieno, y ácido δ-isovanilloilbutírico. La quinona

respiratoria principal es MK-7. Los principales ácidos grasos celulares son

16:1 15:0. La conexión entre las unidades A y B de la molécula arikemicina es a través

de una cetona y la presencia de enlaces amida entre las unidades es evidente para una

mejor extracción de esta biomolécula con el solvente acetona [10].

La cromatografía en capa fina (thin layer chromatography o TLC) es una técnica analítica

rápida y sencilla, muy utilizada en Química. Entre otras cosas permite, determinar el

grado de pureza de un compuesto, se puede determinar así, por ejemplo, la efectividad de

una etapa de purificación, comparar muestras, etc. Si dos muestras corren igual en placa

podrían ser idénticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma

sustancia [24].

La cromatografía en capa fina es una técnica muy utilizada para la separación de

pigmentos de plantas, el fundamento del método fisicoquímico,BIOQUIMICA se basa en la separación, Y identificación y cuantificación de sustancias de interés biológico, las cuales han sido

transportadas por una fase móvil y retenida por una fase estacionaria inmóvil [25].

La muestra aplicada es adsorbida en FARMACIAla superficie del material por capilaridad, mediante

fuerzas electrostáticas, fuerzas DE de van der waals, puentes de hidrógeno, efectos

inductivos, entre otros, las moléculas que tienen menor peso molecular migran más rápido

en dirección de la solución en movimiento, mientras que las de mayor peso molecular

demoran en pasar. Al término de la separación de los compuestos, se revelan con BIBLIOTECA sustancias coloreadas o reactivos de comprobación [24,25].

León y Liza (2010), realizaron un estudio de actividades prospectivas de muestreo de

invertebrados intermareales en la Bahía de Ancón (Lima–Perú) con el objetivo de

seleccionar bacterias marinas productoras de sustancias antimicrobianas. El estudio

comprendió el aislamiento de bacterias en agar marino, pruebas de susceptibilidad

antimicrobiana in vitro y observaciones de microscopía electrónica. Se reporta el

aislamiento, caracterización fenotípica y propiedades antimicrobianas de diez cepas de

bacterias marinas que inhiben a patógenos de humanos (E. Coli, B. Subtilis, S. aureus).

Los resultados indicarían que los invertebrados marinos serían fuentes de bacterias

productoras de sustancias antibióticas [4].

Leiva y Mantilla (2003), investigaron la capacidad antimicrobiana de la microbiota

bacteriana viable que se aíslo de aguas y sedimentos marinos en Chile, en 3 sitios de la

costa de Valdivia: Los Molinos, San Ignacio y Playa Rosada. Para los cuales utilizaron

agar marino junto a cierta concentración de nutrientes para el aislamiento de bacterias.

En la cual concluyeron que en las aguas y sedimentos marinos del litoral de la costa

Valdiviana serían un importante reservorio de bacteriasBIOQUIMICA antagónicas, constituyendo una Y fuente potencial de nuevos agentes antimicrobianos, ya que mostraron actividad contra

S. aureus [13].

Kanjana y Sangnoi (2007), realizaronFARMACIA un estudio que fue establecer la posición

taxonómica de bacterias recuperadasDE del mar de Andamán a lo largo de la costa sur de Tailandia. Las posiciones taxonómicas de tres cepas de bacterias marinos, TISTR 1736,

TISTR 1741 y TISTR 1750, aislados de la costa sur de Tailandia se evaluaron mediante

el uso de un enfoque polifásico. El análisis filogenético basado en las secuencias de genes BIBLIOTECA de ARNr 16S indicó que los tres aislamientos formaron un linaje distinto dentro de la

familia Flammeovirgaceae, phylum Bacteroidetes, y se relaciona con el género

Flexithrix. Sobre la base de fenotípica, taxonómica, genotípica y datos filogenéticos, se

consideran estas bacterias marinas para representar una nueva especie de un nuevo

género, para el cual el nombre Rapidithrix thailandica está propuesto. La cepa tipo de

Rapidithrix thailandica es TISTR 1750 [11].

Akkharawit y Yutthapong (2014), realizaron una investigación de una bacteria marina

descrito recientemente, Rapidithrix thailandica cepa TISTR 1741, se aisló a partir de

muestras de biofilm recogidos del mar de Andaman en Tailandia. Cuatro litros de caldo

de fermentación de R. thailandica TISTR 1741 cultivada en VY/2 medio se extrajeron

con metanol para dar un compuesto nuevo derivado amino fenil pirrolidona con actividad

antibacteriana. Las propiedades de la estructura química y físico-químicas fueron

investigados por técnicas de espectrometría. El compuesto 1 exhibió una inhibición

selectiva contra resistentes a la vancomicina Enterococcus faecalis (VRE) con el MIC de

5,97 mM [10].

Naoya y Kyoko (2008), realizaron una investigación deBIOQUIMICA la bacteria marina Rapidithrix sp. Y Se descubrieron las biomoléculas Ariakemicinas A y B, a partir del extracto de

fermentación con el solvente metanol, estos metabolitos eran isómeros de posición con

respecto a un doble enlace y cromatográficamente inseparables. Las ariakemicinas se

componían de treonina, dos ω-aminoFARMACIA- (ω-3) –metilcarboxílico. Los antibióticos

inhibieron selectivamente el crecimieDE nto de bacterias Gram-positivas [9].

Oraphan y Supreeya (2008), realizaron una investigación donde se informó sobre la

actividad inhibidora de la acetilcolinesterasa de derivados de pirrol, un nuevo alcaloide BIBLIOTECA que posee un esqueleto de pirrol [2,3-c] quinolina sin precedentes a partir de un nuevo

deslizamiento marino la bacteria Rapidithrix thailandica. Las fermentaciones a gran

escala de las cepas TISTR 1749 y SH5.13.2 se realizaron en leche descremada. Se

recogieron y se eluyeron con metanol, y cada extracto se sometió a la cromatografía [16].

Se realizó entonces el presente estudio, con la finalidad de evaluar la actividad antibiótica

de las fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80. En esta oportunidad

se trabajó con el solvente acetona. A partir de los resultados obtenidos, se eligió que

fracción del extracto crudo es el que proporciona una mejor actividad antibiótica frente a

estos agentes patógenos.

Objetivo general

• Evaluar la actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80 de playa Laguna Grande – Paracas.

Objetivos específicos

• Determinar la actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de BIOQUIMICA Rapidithrix thailandica s80 mediante el método de difusión en agar por Y discos sobre bacterias patógenas.

• Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de las fracciones

del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80, mediante microdilución FARMACIA sobre bacterias patógenas. DE • Determinar la concentración mínima bactericida (CMB) de las fracciones

del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80 en agar Mueller Hinton

sobre bacterias patógenas. BIBLIOTECA • Determinar los R푓 de las fracciones del extracto crudo de Rapidithrix

thailandica s80 mediante cromatografía en capa fina.

II. MATERIAL Y MÉTODO

2.1 MATERIAL

2.1.1 Material biológico • Bacteria marina Rapidithrix thailandica s80

• Staphylococcus aureus resistente a meticilina (SARM) ATCC 43300

• Staphylococcus aureus ATCC 25923

• Pseudomonas aeruginosa

• Bacillus subtilis ATCC 6633

• Escherichia coli ATCC 25922

BIOQUIMICA 2.1.2 Material de laboratorio Y • Asa bacteriológica

• Asa de Drigalski

• Espátula de metal FARMACIA • Frascos de vidrio de boca ancha de tamaño mediano DE • Matraces Erlenmeyer de 50, 250, 500, 1000 mL

• Mecheros de vidrio

• Placas estériles de poliestireno de 96 pocillos con fondo plano

• PlacasBIBLIOTECA Petri de vidrio de 90 mm x 15 mm

• Probetas de 100 y 500 mL

• Tubo de polipropileno estéril con tapa de 50 mL

• Cubeta de cromatografía

2.1.3 Medios de cultivo, Reactivos y colorantes • Agar marino

• Agar nutritivo

• Caldo Mueller-Hinton

• Agar Mueller-Hinton

• Caldo marino

• NaCl 0,9%

• Medio TSB (Tryptic Soy Broth)

• Agua destilada

• Resazurina BIOQUIMICA • Sephadex LH-20 Y

2.1.4 Medicamentos • Ciprofloxacino

• Amikacina FARMACIA

• Gentamicina DE

• Penicilina

• Oxacilina

• Ampicilina. BIBLIOTECA

2.1.5 Solvente • Acetona (J.T. Baker)

• Metanol (J.T. Baker)

• Diclorometano (J.T. Baker)

2.1.6 Equipos • Refrigeradora “Coldex”

• Autoclave “Airshoft”

• Nefelómetro de Mc Farland (1,5 x 108 cél/mL)

• Estufa “Memmert”

• Balanza analítica “Radwag”

• Plancha de calentamiento “IKA C-MAG HS 10”

• Centrífuga “Hettich”

• Cámara de Bioseguridad clase II tipo A2 “Biobase” BIOQUIMICA • Rotavapor “Heidolph” Y

• Shaker “Marconi”

• Ultracongeladora “Arctiko”

• Sonicador “Branson” FARMACIA

• Vortex “HeidolphDE”

2.1.7 Otros • Etanol 96º GL BIBLIOTECA • Algodón

• Franela

• Etiquetas

• Tijera

• Plumón marcador para vidrio

• Guantes estériles

• Papel para film

• Cinta de embalaje

• Folder de manila

• Papel de aluminio

• Lápices

• Tubos eppendorf

2.2 MÉTODO

2.2.1 Bacteria marina de estudio

Bacteria marina Rapidithrix thailandica s80 proporcionado por el proyecto PIBA-

2-P-247-14-FONDECYT: “Biodiversidad mixobacterial marina del Perú: BIOQUIMICA potencial fuente de biomoléculas antibióticasY contra patógenos multidrogo

resistentes”.

2.2.2 Obtención de extracto FARMACIA Se preparó caldo marino, luego se esterilizó en la autoclave a 121 °C por 30 DE minutos. Se dejó enfriar y se llevó los matraces a la cabina de bioseguridad para

sembrar la bacteria marina, luego se colocó en la incubadora con agitación

(shaker) a 30 °C a 130 rpm por 48 horas [1,6,7].

De cada BIBLIOTECAmatraz se repartió 25 mL en los tubos de polipropileno estéril con tapa

de 50 mL Se pasó a sonicar por 15 minutos. Una vez sonicado las muestras se

empezó con las extracciones [1,6-8].

A los tubos de polipropileno estéril con tapa que contenían la muestra, se le

agregó 25 mL del solvente acetona. Posteriormente se centrifugó a 5000 rpm por

10 minutos.

Se extrajo todo el componente menos denso de los tubos de polipropileno estéril

con tapa y se agregó en los balones de vidrio y posteriormente fué llevado al

rotaevaporador hasta sequedad. Se resuspendió con 1 mL del solvente (acetona)

y se colocó en los tubos eppendorf previamente tarados a temperatura ambiente

hasta sequedad [1,6,7].

2.2.3 Obtención de las fracciones del extracto crudo

Para aislar los principales compuestos retenidos en el extracto crudo, se usó un

método cromatográfico usando como fase estacionaria Sephadex LH-20 y como

fase móvil metanol. Se recolectó cada fracción del extracto crudo según la BIOQUIMICA coloración presentada [17-19]. Y

2.2.4 Determinación de la actividad antibiótica

Se realizó una concentración de 20 mg/mL. La actividad antibiótica de los

extractos de la bacteria RapidithrixFARMACIA thailandica s80 se evaluó en placas de agar

Mueller Hinton. [1,15,19].DE Para la actividad antibiótica se necesitó reactivar: SARM ATCC 43300,

E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25923, B. subtilis ATCC 6633 y

P. aeruginosa en medio agar nutritivo. En el caso de B. subtilis, se utilizó medio BIBLIOTECA TSB [5,12,21].

2.2.4.1 Preparación del inóculo Luego de 18-24 horas se resuspendieron las bacterias en un tubo con 10 mL de

solución salina estéril 0,85%. Se homogenizó y se ajustó la turbidez equivalente

al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland [1,19].

2.2.4.2 Prueba de la actividad antibiótica mediante el método de difusión en agar por discos Se sembró sobre la placa la bacteria previamente cultivada en forma uniforme. Se

tuvo un control para cada bacteria, la cual fue con medicamentos ya diluidos y

preparados a una concentración para poder ser trabajada. Los medicamentos con BIOQUIMICA los que se trabajó fueron: ciprofloxacino (513Y µg/mL), amikacina (833 µg/mL),

gentamicina (2064 µg/mL), penicilina (31,98 µg/mL), oxacilina (533 µg/mL),

ampicilina (266 µg/mL). Una vez cultivada la bacteria en forma uniforme, se

colocó 3 discos de papel filtro de 6 mm de diámetro aproximadamente, luego se FARMACIA

agregó 10 µL de cada fracciónDE del extracto crudo en cada disco. Se llevó a la incubadora a 37 °C durante 24 horas. Para la lectura de la actividad antibiótica se

midió las zonas de inhibición [1,15,20,21].

2.2.4.3 Determinación de la concentración mínima inhibitoria mediante

microdiluciónBIBLIOTECA

Fueron repartidos 50 µL de caldo Mueller Hinton en cada pocillo. Se agregó 50

µL de la fracción del extracto crudo de la bacteria al primer pocillo, a partir del

primer pocillo se realizó dilución al medio. De la suspensión del inóculo se

distribuyó 50 µL en todos los pocillos. En el pocillo 11 se tuvo un control positivo

que contiene: caldo Mueller Hinton con extracto. En el pocillo 12 se tuvo un

control negativo que contiene: caldo Mueller Hinton con cepa patógena. Las

placas fueron incubadas a 37 °C por 18-24 horas. Para la lectura se usó rezasurina

(10 µL) en cada pocillo. Se incubó por una 1 hora a 37 °C.

Los positivos se tornaron un color azul (no hubo crecimiento) y los negativos un

color rosado (si hubo crecimiento). Finalmente se realizó la lectura de forma

semicuantitativa de acuerdo a las diluciones realizadas. Se tomó como MIC el

ultimo pocillo de color azul [1,15,20,21].

2.2.4.4 Determinación de la concentración mínima bactericida

Se utilizó agar Mueller Hinton en placas estériles. Para determinar la CMB se

extrajo 5 µL de los tres primeros pocillos positivoBIOQUIMICAs y el primer pocillo negativo. Y Las placas se dejaron incubar durante 18-24 horas a 37 °C. Finalmente se hizo la

lectura de las placas en la cabina de bioseguridad pasado el tiempo señalado. Se

trata de un método cualitativo donde se reportó si hubo crecimiento o no de la FARMACIA bacteria [15]. DE

2.2.4.5 Relación de la capacidad bactericida o bacteriostática de los extractos

crudos de Rapidithrix sp. sobre agentes patógenos

Se realizóBIBLIOTECA teniendo en cuenta la relación entre la Concentración mínima bactericida y la Concentración mínima inhibitoria (CMB/CMI). Si la relación

CMB/CMI= 1 a 2, la actividad se consideró como bactericida y si la relación

CMB/CMI= 3 a 16, la actividad se consideró como bacteriostático [13,18].

2.2.5 Determinación del R푓 de las fracciones mediante Cromatografía en capa fina

después de la obtención de las fracciones del extracto crudo

En un vial se colocó con una pipeta una pequeña cantidad de muestra disuelta en

metanol (que cubra el fondo del vial y un poco más). Un vial para cada fracción

respectivamente. Las tres disoluciones de las muestras en metanol estuvieron ya

preparadas para empezar a trabajar.

En una placa de TLC nueva se trazó con lápiz una línea a 1,5 mm del borde

inferior y se señalaron sobre ella dos puntos equidistantes y no demasiado cerca

del borde. Con ayuda de un capilar se tomó una muestra de un vial. Se pinchó

brevemente tres veces en el punto para conseguir una mancha de pequeño tamaño BIOQUIMICA que dé mejor resolución. Y La placa de TLC se depositó dentro de una cubeta de cromatografía, a la que

previamente se añadió una pequeña cantidad del eluyente (diclorometano:

metanol). Se tapó la cubeta y se dejó que el eluyente ascienda por capilaridad. FARMACIA Antes de que el frente del disolvente llegue al otro extremo de la placa, éste se DE sacó de la cubeta con unas pinzas y con un lápiz se hizo una señal indicando hasta

dónde ha llegado el eluyente. Tras dejar evaporar el disolvente de la placa, se

reveló la placa utilizando el visor de UV. El resultado es la visualización de una

o más manchaBIBLIOTECAs en la placa que indica la presencia de uno o más compuestos.

Para calcular el R푓 se aplicó la siguiente expresión: R푓 = distancia recorrida por

el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y) [24,25].

III. RESULTADOS

Tabla 1. Diámetros de las zonas de inhibición de las fracciones del extracto crudo de la bacteria Rapidithrix thailandica s80 y de los medicamentos a 20 mg/mL.

Diámetro de halo (mm) Fracciones del extracto crudo S.aureus SARM E. coli B. subtilis P. aeruginosa ATCC ATCC ATCC ATCC 25923 43300 25922 6633

Fracción 1 NH NH NH NH NH

Fracción 2 11 11 NH 9 7 BIOQUIMICA

Y Fracción 3 13 13 NH 12 8

Ciprofloxacino 2 6 24 --- 26 24 (513 µg/mL) FARMACIA

DE Amikacina ------21 20 --- (833 µg/mL)

Gentamicina ------18 20 18 (2064 µg/mL) BIBLIOTECA Penicilina (31,98 µg/mL) --- NH ------NH

Oxacilina (533 µg/mL) 24 22 ------

Ampicilina (2064 µg/mL) ------20 ------

NH: No hubo halo de inhibición mm: milímetros S.aureus: Staphylococcus aureus SARM: Staphylococcus aureus resistente a meticilina E. coli: Escherichia coli B. subtilis: Bacillus subtilis P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa 15

Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria (CMI) de las fracciones del extracto crudo de la bacteria Rapidithrix thailandica s80

CMI (mg/mL) Fracciones del extracto crudo S.aureus SARM E. coli B. subtilis P. ATCC ATCC ATCC ATCC aeruginosa 25923 43300 25922 6633

Fracción 2 0,40 0,40 1,60 0,40 0,80

Fracción 3 0,13 0,13 1,0BIOQUIMICA0 0,25 1,00 Y

S.aureus: Staphylococcus aureus SARM: Staphylococcus aureus resistente a meticilina E. coli: Escherichia coli B. subtilis: Bacillus subtilis P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa FARMACIA

BIBLIOTECA

Tabla 3. Concentración mínima bactericida (CMB) de las fracciones del extracto crudo de la bacteria Rapidithrix thailandica s80.

CMB (mg/mL) Fracciones del extracto crudo S.aureus SARM E. coli B. subtilis P. aeruginosa ATCC ATCC ATCC ATCC 25923 43300 25922 6633

Fracción 2 0, 40 0,80 1,60 0,80 1,60

Fracción 3 0,13 0,25 1,00 BIOQUIMICA0,50 1,00 Y

S.aureus: Staphylococcus aureus SARM: Staphylococcus aureus resistente a meticilina E. coli: Escherichia coli B. subtilis: Bacillus subtilis P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa FARMACIA DE

BIBLIOTECA

Tabla 4. Relación de la concentración mínima bactericida y concentración mínima inhibitoria de las fracciones del extracto crudo de la bacteria Rapidithrix thailandica s80.

Relación de la CMB/CMI Fracciones del extracto crudo S.aureus SARM E. coli B. subtilis P. ATCC ATCC ATCC ATCC aeruginosa 25923 43300 25922 6633

Fracción 2 1 2 1 2 2 bactericida bactericida bactericida bactericida bactericida

Fracción 3 1 2 1 BIOQUIMICA 2 1 bactericida bactericida bactericidaY bactericida bactericida

CMB/CMI= 1 a 2, bactericida CMB/CMI= 3 a 16, bacteriostático FARMACIA

BIBLIOTECA

Tabla 5. Determinación del R푓 de las fracciones del extracto crudo de la bacteria Rapidithrix thailandica s80.

Fracciones del extracto Manchas Cálculo del 퐑풇 crudo

Fracción 1 A 0,92

B 0,25

BIOQUIMICA C 0,45 Y D 0,61 Fracción 2 E 0,70 F 0,85

FARMACIA

G 0,78

Fracción 3 F 0,85

BIBLIOTECA A, B, C, D, E, F, G: manchas de las fracciones del extracto crudo de la bacteria Rapidithrix thailandica s80.

IV. DISCUSION

El estudio de la actividad antibiótica de los microorganismos marinos es muy común hoy

en día, diversos estudios han validado científicamente la eficacia que presentan estas

bacterias marinas que son capaces de producir sustancias antimicrobianas capaces de

inhibir a patógenos de humanos [4].

Para aislar los principales compuestos retenidos en el extracto crudo, se usó un método

cromatográfico usando como fase estacionaria Sephadex LH-20 y como fase móvil

metanol. Se recolectó cada fracción del extracto crudo según la coloración presentada

(verde claro, verde oscuro y beish).

La cromatografía en columna de Sephadex LH-20 es una técnica que ofrece varias BIOQUIMICA características que la hacen particularmente útil en esteY tipo de procedimientos, se utiliza

entre otras cosas para la purificación de preparativos naturales de bajo peso

molecular [24].

Una vez obtenido las tres fraccionesFARMACIA del extracto crudo se realizó los ensayos

correspondientes con el fin de obtenerDE la mejor fracción con actividad antibiótica.

Para la determinación de la actividad antibiótica, en la tabla 1 se resume la medida de los

diámetros de las zonas de inhibición de las fracciones del extracto crudo de la bacteria

marina Rapidithrix thailandica s80, que fue trabajado en una concentración de 20 mg/µL BIBLIOTECA y este fue evaluado frente a diferentes agentes patógenos como: S. aureus, SARM, E. coli,

B. subtilis y P. aeruginosa, los resultados muestran diferencias en su espectro inhibitorio.

No todas las fracciones del extracto crudo fueron positivos a los ensayos, solo fracción 2

y 3, destacando la fracción 3 del extracto crudo quien mostró un incremento en la

intensidad antibiótica, por su mayor actividad inhibitoria tanto a Gram positivas como a

Gram negativas (excepto E. coli), inhibió a 4 agentes patógenos de un total de 5,

mostrando su mayor actividad antibiótica frente a S. aureus y SARM (13 mm).

Fracción 2, también desarrolló actividad inhibitoria, la actividad antagónica se dirigió

principalmente sobre SARM (11 mm). Si se comparan los halos de inhibición producidos

por la fracción 3 del extracto crudo frente a los agentes patógenos ensayados, con la

fracción 2 del extracto crudo, se observa que Fracción 3 produjo una mayor actividad

antibiótica frente a estos agentes patógenos.

En contraste, ninguna fracción del extracto crudo presentó actividad contra la bacteria

Gram negativa E. coli. Del total de muestras con actividad, fracción 2 y 3 presentaron

antagonismo sobre bacterias Gram positivas.

La actividad inhibitoria que presenta la bacteria marina Rapidithrix tailandica expresa el

potencial de la actividad antibacteriana presente en estaBIOQUIMICA bacteria marina. Esta actividad Y fue evaluada mediante la prueba de difusión en agar. Las pruebas de susceptibilidad

fueron realizadas frente a bacterias Gram positivas destacando la actividad frente a

S. aureus (16 mm). Los resultados indican que esta bacteria marina es una fuente de

bacterias productoras de sustancias antibióticasFARMACIA [8,9]. DE La tabla 2 presenta los valores de la concentración mínima inhibitoria de las fracciones

del extracto crudo de la bacteria Rapidithrix thailandica s80. Los dos extractos fueron

disueltos en DMSO y diluidos en forma seriada. Como observamos nuevamente fracción

3 fue seleccionadaBIBLIOTECA por presentar la mayor actividad frente a S. aureus y SARM, esta correspondió con la más baja concentración empleada (0,13 µg/mL). Siendo la CMI para

E. coli de 1,00 µg/mL. Se observa que la fracción 2 tiene un CMI no tan similar con la

fracción 3 para estos agentes patógenos.

Las dos fracciones (2 y 3) reaccionaron frente a los diferentes patógenos ensayados

(excepto E. coli), que no se encontró ningún tipo de inhibición.

La concentración mínima inhibitoria presentada por la fracción 3 frente a las bacterias

Gram-positivas y Gram negativas (excepto E. coli) reviste gran interés debido a que esta

indica, que la muestra como tal puede ser considerada dentro de aquellos extractos que

poseen gran potencial como agentes antimicrobianos [7,21].

Con respecto a la concentración mínima bactericida, la cual es definida como la

concentración más baja del agente antimicrobiano necesario para inhibir el 99% del

inoculo inicial después de incubación por 24 horas bajo condiciones estandarizadas.

En la tabla 3 se puede observar que la fracción 3, de las 5 bacterias patógenas trabajadas,

tres fueron eliminados a una concentración de 0,13 µg/mL. Este ensayo es una prueba

que se realizó posterior a la determinación de la concentracBIOQUIMICAión mínima inhibitoria, aquí Y se puede reafirmar que la fracción 3 del extracto crudo, teniendo una concentración de

0,13 µg/mL es capaz de inhibir el crecimiento de agentes patógenos.

En la tabla 4 se tiene la relación entre la concentración mínima inhibitoria y la FARMACIA concentración mínima bactericida y se puede observar que todas las fracciones presentan DE valores entre 1 y 2 por lo tanto se les considera que tienen acción bactericida contra todos

los agentes patógenos ensayados [13,22]

La cromatografía en capa fina es una técnica analítica rápida y sencilla, que nos permite

determinar la identificaciónBIBLIOTECA de compuestos de una mezcla mediante la formación del

cromatograma, además comparar diferentes muestras entre sí y mediante el cálculo del

R푓 se puede determinar de qué sustancia se trata la muestra [24-25].

En la Tabla 5 determinamos el R푓 de las fracciones del extracto crudo de la bacteria

marina Rapidithrix thailandica s80. El valor del R푓 depende de las condiciones en las

cuales se corre la muestra. En esta oportunidad para la fase móvil se utilizó como eluyente

la mezcla de los solventes diclorometano: metanol (6:1).

El factor de retención R푓 es la distancia que cada compuesto se desplaza en la placa y a

la vez es característico de los mismos. La placa con la fracción 1, presentó un R푓 푑e 0,92

y presentó una sola mancha. Se puede observar que fracción 1 presentó un R푓 diferente

al resto de las fracciones y no se encontró muchos compuestos y esto se puede relacionar

con los ensayos de actividad antibiótica que no presentó buenos resultados.

A diferencia de la placa con la fracción 2 que presentó cinco manchas con los siguientes

R푓: 0,25; 0,45; 0,61; 0,70; 0,85. Se puede observar que encontramos diferentes

compuestos en la placa, desde compuestos polares hasta apolares según el R푓 presentado,

entonces si se compara con los ensayos de actividad antibiótica realizados se puede

observar que por los compuestos que presentó son los queBIOQUIMICA les dan esa actividad antibiótica Y frente a los agentes patógenos trabajados.

La fracción 3 presentó dos manchas con un R푓: 0,78 y 0,85. Se puede decir que los

compuestos encontrados son apolares y son los que le dan la actividad antibiótica al FARMACIA extracto ya que al no presentar muchas manchas se dice que el extracto se encuentra puro DE y es así que tiene una buena actividad antibiótica frente a los patógenos ensayados.

Los solventes que fueron usados como componentes en la fase móvil son de pureza

apropiada y de baja viscosidad, miscibles entre sí, uno de los parámetros fisicoquímicos BIBLIOTECA que es de gran importancia es la fuerza de elución, que se refiere a la capacidad de la

mezcla de los solventes para eluir los solutos en la fase estacionaria [24,25].

Para la elección de la mejor fracción de extracto crudo de la bacteria marina, de acuerdo

a los resultados obtenidos encontramos que la fracción 3 es el solvente con el que se

obtuvo mejores resultados tanto en su actividad antibiótica como en su concentración

mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida.

Se puede decir que el extracto de esta fracción es la que tiene las biomoléculas

Ariakemicinas A y B, que son las responsables del efecto antibiótico de la bacteria marina

que al ser trabajado con un buen solvente como la acetona permitió una mejor extracción

y así obtener buenos resultados.

Fracción 3 del extracto crudo cumplió con los requerimientos para todos los ensayos

realizados, además de ser la fracción que se encuentra más pura sus compuestos,

sorprendentemente, tales compuestos biológicamente activos son de gran interés para la

industria farmacéutica, debido a su utilidad potencial en la medicina moderna y la

investigación biomédica [6,15,19].

BIOQUIMICA Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

V. CONCLUSIONES

• La mejor actividad antibiótica de las fracciones del extracto crudo de la bacteria marina Rapidithrix thailandica s80, fue la Fracción 3 que presentó actividad bactericida.

• La concentración mínima inhibitoria de la fracción del extracto crudo de la

bacteria marina Rapidithrix thailandica s80, fue 0,13 µg/mL para la Fracción 3,

que fue capaz de inhibir el crecimiento de S. aureus ATCC 25923 y SARM

ATCC 43300. BIOQUIMICA

Y • La concentración mínima bactericida de la fracción del extracto crudo de la

bacteria marina Rapidithrix thailandica s80, en agar Mueller Hinton, fue

0,13 µg/mL para la Fracción 3. FARMACIA

DE • Se determinaron los R푓 de la fracción 3 del extracto crudo de la bacteria marina

Rapidithrix thailandica s80 que presentó dos manchas: 0,78; 0,85.

BIBLIOTECA

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BIOQUIMICA Y

FARMACIA

BIBLIOTECA

ANEXOS

A B

Anexo 1. Halos de inhibición sobre B. subtilis. A. control B. fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80 BIOQUIMICA Y

C D

FARMACIA

BIBLIOTECA

Anexo 2. Halos de inhibición sobre S. aureus. C. control D. fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80.

A B

Anexo 3. Halos de inhibición sobre MRSA. A. control B. fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80. BIOQUIMICA Y C D

FARMACIA

BIBLIOTECA

Anexo 4. Halos de inhibición sobre E. coli. C. control D. fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80.

A B

BIOQUIMICA Anexo 5. Halos de inhibición sobre P. aeruginosa. YA. control B. fracciones del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80.

FARMACIA

BIBLIOTECA

1,6 mg/mL

0,8

0,4

0,2

0,1

0,05

0,025

0,0125 BIOQUIMICA Y 0,00625

0,003125

control +

FARMACIA control -

Anexo 6. Concentración mínima inhibitoria de la fracción 2 del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80. frente a: P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, MRSA y B. subtilis.

BIBLIOTECA

1,0 mg/mL

0,5

0,25

0,125

0,0625

0,03125 BIOQUIMICA Y 0,015625

0,0078125

0,00390625 FARMACIA control + DE

control -

Anexo 7. Concentración mínima inhibitoria de la fracción 3 del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80. frente a: S. aureus, MRSA, B. subtilis, P. aeruginosa. y BIBLIOTECA E.Coli

A B C

BIOQUIMICA Anexo 8. Concentracion Minima Bactericida de la fracciónY 2 del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80. frente: A. S. aureus. B. SARM C. E. coli

A B C FARMACIA

BIBLIOTECA

Anexo 9. Concentracion Minima Bactericida de la fracción 3 del extracto crudo de Rapidithrix thailandica s80. frente a: A. S. aureus B. E. Coli C. MRSA

A B C

F F E A D BIOQUIMICA Y C

FARMACIAB

Anexo 9. CromatografíaBIBLIOTECA en capa fina de los extractos crudos de Rapidithrix thailandica s80. De: A. fracción 1 (1 mancha) B. fracción 2 (5 manchas) C. fracción 3 (2 manchas)