ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ

ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ

“ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών προϊόντων”

ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Για την απόκτηση ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

«ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΝΕΩΝ ΣΥΝΘΕΤΙΚΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΗΣ Α-ΚΩΝΟΤΟΞΙΝΗΣ ΤΟΥ ΚΩΝΟΥ AUSTRALIS»

ΜΠΟΧΩΡΙΔΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ

ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΑΣ ΤΩΝ ΥΛΙΚΩΝ

ΠΑΤΡΑ 2017

UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENT OF CHEMITRY AND PHARMACY

POSTGRADUATE PROGRAM

“MEDICINAL CHEMISTRY: Drug discovery and design”

M.Sc.Thesis

« DESIGN AND DEVELOPMENT OF NEW SYNTHETIC ANALOGUES OF THE A-CONOTOXIN OF CONUS AUSTRALIS»

BOCHORIDIS JOHN

MATERIAL SCIENTIST

PATRA 2017

Επιβλέπουσα,

Μαγκαφά Βασιλική , Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών

Τριμελής εξεταστική επιτροπή

1. Μαγκαφά Βασιλική, Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών

2.Τσέλιος Θεόδωρος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών

3.Ζερβού Μαρία, Ερευνήτρια Β, ΙΒΦΧΒ, Εθνικό ίδρυμα ερευνών

Supervisor

Vasiliki Magkafa, Assistant Professor, Department of Pharmacy, University of Patras

Examiners Committee

1. Vasiliki Magkafa, Assistant Professor, Department of Pharmacy, University of Patras

2. Theodore Tselios , Associate Professor, Department of Chemistry, University of Patras.

3. Maria Zervou, Researcher B' Institute of Biology, Medicinal Chemistry and Biotechnology National Hellenic Research Foundation

i

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

Περίληψη vi Summary vii Συντομογραφίες viii Ευχαριστίες xi Α. Εισαγωγή 2 Α.1 ΘΑΛΑΣΣΙΟΙ ΚΩΝΟΙ ΚΑΙ ΚΩΝΟΤΟΞΙΝΕΣ 2

Α.1.1 Το σαλιγκάρι κώνου 2

A.1.1.1 Περιγραφή χαρακτηριστικών των Θαλάσσιων κώνων 5

Α.1.1.2. Ενδιαφέρον και επιστημονική προσέγγιση 6

Α.1.1.3. Βιολογία των θαλάσσιων κώνων 9

Α.1.1.4. Το δηλητήριο των θαλάσσιων κώνων 13

Α.1.1.5. Βιότοποι των θαλάσσιων κώνων 15

Α.1.2. Κωνοτοξίνες 16

Α.1.2.1. Ταξινόμηση και ονοματολογία 18

Α.1.2.1.1 Α-Υπεροικογένεια 19

Α.1.2.1.2 M-Υπεροικογένεια 20

Α.1.2.1.3 Ο-Υπεροικογένεια 21

Α.1.2.1.4 P-Υπεροικογένεια 21

Α.1.2.1.5 S-Υπεροικογένεια 22

Α.1.2.1.6 T-Υπεροικογένεια 22

Α.1.2.1.7 Ι-Υπεροικογένεια 22

Α.1.3 Ο σχηματισμός δισουλφιδικού δεσμού 23

Α.1.3.1. C-τερματική αμιδίωση 23

Α.1.3.2. Ν-τερματική κυκλοποίηση 24

Α.1.4 Φαρμακολογική δράση των Κωνοπεπτιδίων 24

Α.1.4.1 Κωνοτοξίνες που στοχεύουν κανάλια ιόντων 27

ii

Α.1.4.2 Δράσεις κωνοπεπτιδίων σε άλλους στόχους 28

Α.1.5 Επιστημονικές και ιατρικές εφαρμογές των κωνοτοξινών 29

Α.1.6. Προοπτικές και μελλοντικές κατευθύνσεις 30

Α.1.7 α- κωνοτοξίνες 32

Α.1.7.1. Conus Australis 33

Α.2. ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ 36

Α.2.1. Εισαγωγή 36

Α.2.2. Πεπτίδια- ανινοξέα-πεπτιδικός δεσμός 36

Α.2.3. Εισαγωγή στην πεπτιδική χημεία 38

Α.2.4. Σύνθεση πεπτιδίων κατά στάδια (step by step synthesis) 38

Α.2.5. Σύνθεση σε διάλυμα 39

Α.2.6 Σύνθεση σε στερεή φάση 40

Α.2.7. Το στερεό υπόστρωμα 41

Α.2.8. Προστατευτικές ομάδες 43

Α.2.9. Σχήματα προστασίας 44

Α.2.9.1. Οι Να προστατευτικές ομάδες 45

Α.2.9.2. Οι καρβοξυπροστατευτικές ομάδες 48

Α.2.9.3. Οι πλάγιες προστατευτικές ομάδες 49

Α.2.10. Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού 55

Α.2.11. Μέθοδος των καρβοδιϊμιδίων 56

Α.2.12. Μέθοδος σύζευξης με φωσφονικά-ουρονικά άλατα 57

A.2.13. Προβλήματα κατά την πεπτιδική σύνθεση 59

Α.2.13.1 Ρακεμίωση 59

Α.2.13.2. Οξείδωση μεθειονίνης 61 Α.2.13.3. Αλκυλιώσεις κατά την αποπροστασία 61 Α.2.13.4. Σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης 61 Α.2.13.5. Σχηματισμός πυρογλουταμινικού (pGlu) 62 Α.2.13.6. Σχηματισμός ασπαρτιμιδίου 62

iii

Α.2.13.7. Σχηματισμός νιτριλίου 63 Α.2.13.8. Συσσωμάτωση 63 Α.2.13.9. Σχηματισμός τριπεπτιδίου 64

Α.3. Αναλυτικές τεχνικές 65

A.3.1 Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Επίδοσης (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 65

A.3.2. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC ) 67 A.3.3. Φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry MS ) 67 Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 71

Β.1. Σκοπός 71

Β.1.2 Ορθογωνικός σχεδιασμός πεπτιδικών αναλόγων 71

Β.2 Μεθοδολογία 72

Β.2.1 Σύνθεση πεπτιδίων 72

Β.3 Αποτελέσματα πεπτιδικής σύνθεσης 74

Β.3.1. Σχηματισμός της πρώτης δισουλφιδικής γέφυρας 77

Β.3.2. Σχηματισμός της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας 80

B.4 Τελικά συμπεράσματα 91 Γ. Πειραματικό Μέρος 94

Γ.1. Συσκευές-Όργανα-Υλικά 94

Γ.2. Γενικές Πορείες Σύνθεσης 100

Γ.2.1. Στερεό υπόστρωμα 101

Γ.2.2. Ενεργοποίηση και σύζευξη Fmoc- Nα αμινοξέων 102

Γ.2.3. Διαδικασία πλύσεων 103

Γ.2.4. Γενική μέθοδος απομάκρυνσης της Να-Fmoc-ομάδας 103

Γ.2.5. Έλεγχος συνθετικής πορείας με δοκιμές

Kaiser και Chloranil 103

iv

Γ.2.6. Απομάκρυνση πεπτιδίου από ρητίνη

και απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων 105

Γ.2.7. Σχηματισμός Δισουλφιδικών Δεσμών 106

Γ.2.8. Έλεγχος ύπαρξης ελεύθερων σουλφυδρυλομάδων 107

Γ.3. Στάδια Σύνθεσης των πεπτιδίων 108

Γ.3.1 Γραμμικό πεπτίδιο

Aus-1Σ [Cys 2_9(Τrt), Cys 3_15(Acm)] 108

Γ.3.1.1: Διαδικασία σχηματισμού

της πρώτης δισουλφιδικής γέφυρας του αναλόγου Aus-1Σ 110

Γ.3.1.2: Διαδικασία σχηματισμού

της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας αναλόγου Aus-1Σ 111

Γ.3.2. Ανάλογο Aus-2Σ [Cys(2_15(Acm), 3_9(Trt)] 112

Γ.3.3. Ανάλογο πεπτίδιο Aus-1Σ (Αib8) = Aus-3Σ 114

Γ.3.4. Ανάλογο πεπτίδιο Aus-1Σ (Αib7) = Aus-4Σ 116

Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 120

v

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Οι Κωνοτοξίνες είναι μικρά νευροτοξικά πεπτίδια (10 έως 30 υπολείμματα αμινοξέων) που τυπικά έχουν έναν ή περισσότερους δισουλφιδικούς δεσμούς και προέρχονται από το δηλητήριo των θαλάσσιων σαλιγκαριών, το οποίο αποτελεί αντικείμενο μελέτης και έρευνας για την εύρεση πιθανών νέων δραστικών ενώσεων. Οι κωνοτοξίνες αυτές στοχεύουν διαφορετικούς υποδοχείς στο νευρικό σύστημα με υψηλή εκλεκτικότητα και ισχύ, αποτελώντας χρήσιμους φαρμακευτικούς δείκτες ή και φάρμακα. Μια ομάδα κωνοτοξινών είναι οι α-κωνοτοξίνες, οι οποίες έχουν παρουσιάσει αναλγητική δράση.

Οι α-κωνοτοξίνες είναι μια σειρά δομικών και λειτουργικών σχετικών πεπτιδίων, αποτελούμενα από δύο δισουλφιδικές γέφυρες, τα οποία αποτελούνται από 11 έως 16 αμινοξέα και είναι ανταγωνιστές των nAChRs. Η α-κωνοτοξίνη AusIA είναι ένα πεπτίδιο 16 αμινοξέων που απομονώνεται από το δηλητήριο του θαλάσσιου σαλιγκαριού Conus Australis. Το πεπτίδιο έχει την τυπική δομή α-κωνοτοξίνης CC- Xm-C-Xn-C, αλλά και οι δύο βρόχοι (m / n) περιέχουν 5 αμινοξέα, τα οποία ποτέ δεν έχουν περιγραφεί προηγουμένως. Τόσο σφαιρικά (globular) Cys(Ι-ΙΙΙ, ΙΙ-IV) όσο και κορδέλα (ribbon) Cys(Ι-ΙV, ΙΙ-ΙΙΙ) ισομερή της κωνοτοξίνης AusIA έδειξαν παρόμοια ισχύ επί των α7 nAChRs.

Στην παρούσα διατριβή ο αρχικός στόχος ήταν η σύνθεση των δύο ισομερών της κωνοτοξίνης AusIA σε υψηλή καθαρότητα και απόδοση με επιλεκτικό σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών χρησιμοποιώντας ορθογωνική στρατηγική οξείδωσης και ακολούθως η σύνθεση αναλόγων που περιλαμβάνουν τροποποιήσεις στη θέση 7 ή 8 του φυσικού μορίου.

Η σύνθεση των αναλόγων πραγματοποιήθηκε με την Fmoc/tBu μεθοδολογία επί στερεάς φάσεως, χρησιμοποιώντας ως στερεό υπόστρωμα την Sieber Amide ρητίνη. Ο σχηματισμός των τριών δισουλφιδικών γεφυρών επιτεύχθηκε σε ένα στάδιο στην υγρή φάση με την χρήση ρυθμιστικών αναγωγικών μέσων.

vi

SUMMARY

Conotoxins are small neurotoxic peptides (10 to 30 amino acid residues) that typically have one or more disulphide bonds; they originate from marine snail poisons, and they consist a subject of study and research for finding possible new active compounds. These conotoxins target different receptors in the nervous system with high selectivity and potency and hence they are useful pharmaceutical markers and / or drugs. A group of conotoxins are α-conotoxins, which they are proven to have analgesic activity.

Α-conotoxins are a series of structural and functional related peptides, consisting of two disulphide bridges, with eleven (11) to sixteen (16) amino acids and are antagonists of the nAChRs.

Α-conotoxin AusIA is an 16 amino acid peptide isolated from the venom of the Conus Australis marine snail. The peptide has the typical α-conotoxin structure CC- Xm-C-Xn-C, but both loops (m and n) contain 5 amino acids, which have never been described previously. Both globular Cys (I-III, II-IV) and ribbon Cys (I-IV, II-III) isomers of conotoxin AusIA showed similar potency on α7 nAChRs.

In the present study the original aim was to synthesize the two isomers of conotoxin AusIA in high purity and yield, by selective disulphide bond formation, using a rectangular oxidation strategy followed by the synthesis of analogs comprising modifications at position 7 or 8 of the native molecule.

The synthesis of the analogs was performed by the Fmoc / tBu solid phase methodology, using Sieber Amide resin as the solid support. The formation of the two disulphide bridges was achieved in one stage in the liquid phase using buffer reducing agents.

vii

Συντοµογραφίες

Οι συντµήσεις που χρησιµοποιούνται στην παρούσα διπλωματική εργασία έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχηµικής Ονοµατολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρµοσµένης Χηµείας και της Διεθνούς Ένωσης Βιοχημείας (IUB). Οι προτάσεις αυτές ανακοινώθηκαν το 1972 και συμπληρώθηκαν σταδιακά μέχρι το 1989 [IUPAC – IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN), Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides, Recommendations, Eur. J. Biochem., 138 (1984) 9, J. Biol. Chem., 264 (1989) 663] και παρουσιάζονται ολοκληρωμένες όσον αφορά την Πεπτιδική Χημεία στην αναφορά: Abbrevations and Symbols in peptide science: a revise guide and commentary, J Peptide Sci., 12 (2006),1.

Σύντμηση Αμινοξέων Ονομασία

Ala Αλανίνη Arg Αργινίνη Asn Ασπαραγίνη Cys Κυστεΐνη His Ιστιδίνη Pro Προλίνη Ser Σερίνη Val Βαλίνη Aib 2-αμινοϊσοβουτυρικό οξύ

Συντμήσεις Προστατευτικών Ομάδων

Boc : τριτοταγής βουτυλοξυκαρβονυλομάδα

Bzl : Βενζυλομάδα

Fmoc : 9-φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα

Mmt : 4-μεθοξυτριτυλομάδα

viii

Mtr : 4-μεθοξυ-2,3,6-τριμεθυλοφαινυλοσουλφονυλομάδα

Mtt : 4-μεθυλοτριτυλομάδα

Pbf : 2,2,4,6,7-πενταμεθυλο-διυδροβενζοφουρανο-5-σουλφονυλομάδα

Pmc : 2,2,5,7,8-πενταμεθυλο-χρωμανο-6-σουλφονυλομάδα tBu : τριτοταγής βουτυλομάδα

Tos : 4-τολουολοσουλφονυλομάδα ή τοζυλομάδα

Trt : τριφαινυλομεθυλομάδα ή τριτυλομάδα

Z : Βενζυλοξυκαρβονυλομάδα

Σύντμηση Ονομασία

RP-HPLC υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης ανάστροφης φάσης

Scavenger δεσμευτής (κατιόντων)

SPPS σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση

ΤΗF τετραϋδροφουράνιο

AA Αμινοξύ

AcCN Ακετονιτρίλιο

BuOH Βουτανόλη

CLT 2-χλωρο-τριφαινυλο- μεθυλο-ρητίνη

DCC Ν,Ν΄-δικυκλο- εξυλοκαρβοδιιμίδιο

ix

DCM Διχλωρομεθάνιο

DIC Ν,Ν΄- διισοπροπυλοκαρβοδιιμίδιο

DIEA N,N διισοπροπυλαμίνη

DMF Διμεθυλοφορμαμίδιο

DMSO Διμεθυλοσουλφοξείδιο

EDT 1,2-αιθανοδιθειόλη

Et2O Διαιθυλεθέρας

HOBt 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο i-PrOH Ισοπροπανόλη

MeOH Μεθανόλη

TFA τριφθοροξικό οξύ

TIS Τριισοπροπυλοσιλάνιο

x

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας φυσικών Προϊόντων από τον Οκτώβριο του 2015 έως τον Ιούνιο του 2017 στο πλαίσιο του μεταπτυχιακού Προγράμματος Ιατρική Χημεία- Σχεδιασμός Και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων.

Θερμές και ειλικρινείς ευχαριστίες θα ήθελα να απευθύνω στον επιβλέπουσα Καθηγήτριά μου Βασιλική Μαγκαφά, που με επέλεξε να συμμετέχω στην ερευνητική της ομάδα, για το συνεχές ενδιαφέρον της, την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, την καθοδήγηση και την συμπαράστασή της τόσο μέσα στο εργαστήριο ερευνητικά όσο και ψυχολογικά στο ατύχημα που μου προέκυψε σε αυτό το διάστημα. Καθ’ όλη τη διάρκεια στήριξε την προσπάθεια προσέγγισης του αντικειμένου μεταδίδοντας τη γνώση και την εμπειρία της, συμβουλεύοντάς με παραδειγματικά και συμβάλλοντας στην συγγραφή και παρουσίαση της διατριβής μου.

Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής τον Αναπληρωτή Καθηγητή Θεόδωρο Τσέλιο και την Ερευνήτρια κα. Ζερβού Μαρία για την συνεργασία και τις χρήσιμες συμβουλές της κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας ερευνητικής εργασίας.

Επιθυμώ επίσης να ευχαριστήσω την Επικ. Καθηγήτρια Φωτεινή Λάμαρη για την ενθάρρυνση, την εμπιστοσύνη και το ενδιαφέρον που μου έδειξε κατά τη διάρκεια του μεταπτυχιακού προγράμματος, είτε σε θέματα εργαστηριακής φύσεως, είτε σε θέματα γνωστικού και επιστημονικού περιεχομένου.

Ευχαριστώ τις/τους φίλες/φίλους συναδέλφους μου, που εργάζονται στο Εργαστήριο για την συμπαράσταση και την βοήθεια που μου προσέφεραν καθώς και για εύρυθμο κλίμα που υπάρχει στον χώρο των εργαστηρίων. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους άμεσα ή έμμεσα, βοήθησαν στην ολοκλήρωση αυτής της εργασίας

Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην οικογένεια μου και στους φίλους μου, για την ηθική υποστήριξη που μου πρόσφεραν και που ήταν δίπλα μου στις δύσκολες στιγμές το χρονικό αυτό διάστημα.

xi

xii

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.1 ΘΑΛΑΣΣΙΟΙ ΚΩΝΟΙ ΚΑΙ ΚΩΝΟΤΟΞΙΝΕΣ

Α.1.1 Το σαλιγκάρι κώνου

Το σαλιγκάρι του κώνου είναι ένα θαλάσσιο αρπακτικό σαλιγκάρι που χρησιμοποιεί ισχυρό δηλητήριο για να σκοτώσει το θήραμά του. Οι κωνοτοξίνες είναι μια ομάδα πλούσιων σε κυστεΐνες τοξινών που βασίζονται σε πεπτίδια στο δηλητήριο των κώνων σαλιγκαριών. Οι περισσότερες κονοτοξίνες περιέχουν πολλαπλές δισουλφιδικές γέφυρες. Οι δευτερεύουσες χρήσεις των κωνοτοξινών από τα σαλιγκάρια είναι προστασία έναντι των αρπακτικών και των ανταγωνιστών. Οι κωνοτοξίνες θεωρούνται από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Ασθενειών των Ηνωμένων Πολιτειών ως δυνητικοί παράγοντες στη βιοτρομοκρατία. Τα περισσότερα δηλητηριώδη ζώα (π.χ. φίδια και αρθρόποδα) παράγουν μόνο ένα ή λίγα δηλητήρια. Ένα ενιαίο κώνος σαλιγκάρι παράγει πάνω από 100 μεμονωμένες τοξίνες. Δεν θεωρούνται υψηλοί κίνδυνοι για τη βιοτρομοκρατία όλες οι κωνοτοξίνες.[2,4,5]

Τα σαλιγκάρια των κώνων ανήκουν στην τάξη Gastropoda, στη σειρά Sorbeoconcha, στην οικογένεια Conidae και στο γένος Conus. Τα κοχύλια των σαλιγκαριών κώνου είναι σπειροειδή και κωνικά, επομένως από εκεί προήλθε και το όνομά τους. Τα σαλιγκάρια των κώνων βρίσκονται σε θερμές θάλασσες και ωκεανούς σε ολόκληρο τον κόσμο, αλλά βρίσκονται κυρίως στην περιοχή Ινδο-Δυτικού Ειρηνικού. Υπάρχουν περίπου 700 είδη σαλιγκαριών κώνου και όλα είναι σαρκοφάγα. Τα περισσότερα σαλιγκάρια κώνου είναι νυχτερινοί κυνηγοί. Διαφορετικά είδη ειδικεύονται στην κατανάλωση ψαριών, σκουληκιών (π.χ. πολυχαιτίων) ή άλλων μαλακίων. Τα σαλιγκάρια κώνου που τρώνε ψάρια είναι piscivores. Τα μαλάκια τρώνε και άλλα σαλιγκάρια. Τα σαλιγκάρια κώνου που τρέφονται με σκουλήκια είναι vermivores.[2,4,5]

Το σιφόνι είναι η "μύτη" του σαλιγκαριού κώνου. Το σιφόνι χρησιμοποιείται για την ανίχνευση θήρας και για αναπνοή. Το proboscis είναι το εργαλείο κυνηγιού που χρησιμοποιείται από το σαλιγκάρι. Το proboscis είναι μια μακρά σωληνωτή μυϊκή επιμήκυνση του στόματος. Στην proboscis είναι τα harpoons (καμάκια) που περιέχουν τις τοξίνες. Η σύνθεση των κονοτοξινών λαμβάνει χώρα στα επιθηλιακά κύτταρα του αγωγού δηλητηρίου και στη συνέχεια εκκρίνεται στον αυλό του αγωγού δηλητηρίου.

2

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Το βολβό του δηλητηρίου συνδέεται με τον αγωγό δηλητηρίου. Η λειτουργία του βολβού δηλητηρίου είναι να συστέλλεται και να ωθεί το δηλητήριο στο χαρτόνι.[2,4,5]

Εικόνα Α.1.1. Το φυλογενετικό δένδρο μεταξύ των κοχυλιών (http://www.theconesnail.com). Υπάρχουν δύο τύποι κυνηγών. Οι κυνηγοί αγκίστρων και γραμμών χρησιμοποιούν ένα proboscis με ένα χαρτόνι που περιέχει τοξίνες για να παραλύσει το θήραμά τους. Οι καθαροί κυνηγοί ανοίγουν το στόμα τους για να πιάσουν πολλά ψάρια τη φορά. Μόλις εισέλθει στο στόμα ένα θανατηφόρο άρπαγμα σκοτώνει τα ψάρια. Κάθε harpoon απορρίπτεται μετά τη χρήση. Τα σαλιγκάρια έχουν περίπου 20 harpoons σε διάφορα στάδια ανάπτυξης.[2,4,5]

Εικόνα A.1.2. Δέκα διαφορετικά θαλάσσια σαλιγκάρια-κώνοι. Πάνω σειρά: Conus textile, Conus magus. Δεύτερη σειρά, από τα αριστερά προς τα δεξιά: Conus circumcisus, Conus geographus, Conus dusaveli. Τρίτη σειρά, από αριστερά προς τα δεξιά: Conus gloriamaris, Conus milneedwardsi. Τελευταία σειρά από τα αριστερά προς τα δεξιά: Conus ammiralis, Conus bandanus vidua, Conus hirasei. Ο

3

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

C. geographus είναι υπεύθυνος για την πλειοψηφία των ανθρώπινων θανάτων. Αυτό το είδος, μαζί με C. magus, C. circumcisus, και C. dusaveli, πιθανόν τρέφονται με ψάρια. Τα άλλα Conus τρέφονται με μαλάκια, εκτός από το C. hirasei, που πιθανόν τρέφεται με σκώληκες, αν και η βιολογία του δεν έχει μελετηθεί. (Baldomero M. Olivera, 1996).

Εικόνα A.2.3.: Προτεινόμενο μοντέλο της εξέλιξης των οικογενειών κωτοξίνης: η κωνοτοξίνη loci σε πατροπαράδοτες γενεαλογικές γενεές προκάλεσε την ποικιλομορφία των τόπων που εκφράζονται αποκλειστικά από σύγχρονα piscivores (ανοικτοί κύκλοι, εκφρασμένοι γεμάτοι κύκλοι, άγνωστος ή χαμένος κύκλος με κλειστό ερωτηματικό-άγνωστη έκφραση) . Οι κύκλοι χρησιμοποιούνται για να δηλώσουν τους κωνοτοξινικούς τόπους που υπάρχουν στους σύγχρονους και προγονικούς γενετικούς δεσμούς.[8] Σε μια γεωλογική χρονική κλίμακα, οι πραγματικοί κώνοι είναι μια πρόσφατα εξελιγμένη ομάδα. Το παλαιότερα επαληθεύσιμα απολιθώματα Conus εμφανίζονται καλά μετά την κρητιδική εξαφάνιση , ένα γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα την εξαφάνιση των δεινοσαύρων στη γη και τα αμμωνίτικα θαλάσσια περιβάλλοντα. Οι δεινόσαυροι παρείχαν την ευκαιρία για την άνοδο των θηλαστικών, η εξαφάνιση των αμμωνιτών ήταν πιθανώς βασικός παράγοντας την επιτυχίας των κώνων. Οι Αμμωνίτες πιστεύεται ότι ήταν μεταξύ τους κυριαρχούντα αρπακτικά σε πλούσιες, ρηχές θαλάσσιες κοινότητες, μια οικολογική θέση που καταλαμβάνουν σήμερα τα σαλιγκάρια των κώνων. Το γένος των κώνων επεκτείνεται σε ρυθμό εμψύχωσης. Τα -500 ζωντανά είδη το καθιστούν ίσως το μεγαλύτερο μοναδικό γένος μαλακίων. [8,42]

4

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.1.4. Αμμωνίτης, καλλιτεχνική αναπαράσταση.[8]

A.1.1.1 Περιγραφή χαρακτηριστικών των Θαλάσσιων κώνων

Τα θαλάσσια σαλιγκάρια παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία χρωμάτων και μοτίβων, ενώ συχνά εμφανίζονται τοπικές ποικιλίες και χρωματικές μορφές του ίδιου είδους. Αυτό έχει οδηγήσει στη δημιουργία ενός μεγάλου αριθμού γνωστών συνωνύμων και πιθανών συνωνύμων, καθιστώντας δύσκολη την παροχή ακριβούς ταξινομικής αποστολής για πολλά σαλιγκάρια σε αυτό το γένος. Από το 2009, έχουν εκχωρηθεί περισσότερα από 3.200 ονόματα διαφορετικών ειδών, με μέσο όρο 16 νέες ονομασίες που εισάγονται κάθε χρόνο.[36,50]

Τα κοχύλια των σαλιγκαριών κώνου ποικίλουν σε μέγεθος. Τα κοχύλια σχηματίζονται σχεδόν σαν το γεωμετρικό σχήμα γνωστό ως κώνος, όπως θα περίμενε κανείς από το λαϊκό και επιστημονικό όνομα. Το κέλυφος είναι πολυσυλλεκτικό και έχει τη μορφή ανεστραμμένου κώνου, ενώ το πρόσθιο άκρο είναι το στενό άκρο. Τα προεξέχοντα τμήματα της κορυφής των στροβίλων που

Εικόνα A.1.5. Ανατομία των κώνων.[36] σχηματίζουν τον κορμό είναι κατά το μάλλον ή ήττον σχήμα άλλου, πολύ πιο πεπλατυσμένου κώνου. Το διάφραγμα είναι επιμηκυμένο και στενό. Το κερατοειδές είναι πολύ μικρό.

5

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Το εξωτερικό χείλος είναι απλό, λεπτό και αιχμηρό, χωρίς κάλους, και έχει μια άκρη στο πάνω μέρος. Η κολουμέλα είναι ευθεία.

Τα μεγαλύτερα είδη σαλιγκαριών κώνου μπορούν να μεγαλώσουν μέχρι 23 cm (9,1 ίντσες) σε μήκος. Τα κελύφη των σαλιγκαριών κώνου είναι συχνά έντονα χρωματισμένα και έχουν ενδιαφέροντα σχέδια, αν και σε ορισμένα είδη τα χρωματικά μοτίβα μπορεί να είναι εν μέρει ή πλήρως κρυμμένα κάτω από ένα αδιαφανές στρώμα periostracum. Σε άλλα είδη, το ανώτατο στρώμα του κελύφους είναι το λεπτό περιτόσπασμα, μια διαφανής κιτρινωπή ή καστανή μεμβράνη.[36]

Εικόνα A.1.6.: Ανατομία των οργάνων και των λειτουργιών του κώνου. [3]

Α.1.1.2. Ενδιαφέρον και επιστημονική προσέγγιση

Φυσικά προϊόντα, όπως αυτά που απομονώνονται από φυτά, ζώα και μικρόβια, έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία των ανθρώπινων ασθενειών. Σήμερα, τα φυσικά προϊόντα ή τα παράγωγά τους εξακολουθούν να αντιπροσωπεύουν το ~ 50% όλων των εγκεκριμένων φαρμάκων (Harvey 2008). Ο αριθμός αυτός δεν πρέπει να αποτελεί έκπληξη, αφού τα εκατομμύρια χρόνια εξέλιξης έχουν συχνά διαμορφώσει αυτά τα μόρια σε προνομιούχες δομές που μπορούν να είναι αποτελεσματικές ακόμη

6

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

και μέσω της στοματικής οδού (Newman & Cragg 2009). Ενώ τα φυτικά εκχυλίσματα παραμένουν η κύρια πηγή νέων βιοενεργών, οι θαλάσσιοι οργανισμοί έχουν επίσης αξιολογηθεί ενεργά για μια σειρά θεραπευτικά χρήσιμων ιδιοτήτων, συμπεριλαμβανομένων των αντικαρκινικών και αναλγητικών ενεργειών (Molinski et al., 2009). [1]

Οι γνώσεις μας για τη θαλάσσια βιοποικιλότητα είναι πιθανώς υποτιμημένες, ειδικά όσον αφορά τις μορφές ζωής των βαθέων υδάτων, επειδή η πρόσβαση στον πόρο είναι πολύ περιορισμένη, καθιστώντας τη δειγματοληπτική προσπάθεια δύσκολη και δαπανηρή. Ωστόσο, τα αξιοσημείωτα ποσοστά επιτυχίας των θαλάσσιων ενώσεων στη διαλογή φαρμάκων έχουν διατηρήσει το ενδιαφέρον των φαρμακευτικών εταιρειών. Ως εκ τούτου, το κύριο εμπόδιο για την ανάπτυξη μιας ενεργού ένωσης θαλάσσης σε ένα φάρμακο παραμένει η προμήθεια ή η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων με βιώσιμο τρόπο. Πολλοί από τους θαλάσσιους οργανισμούς που ενδιαφέρουν είναι δύσκολο να αναπαραχθούν ή να αναπτυχθούν in vitro, υποδηλώνοντας ότι η μόνη πηγή της ένωσης είναι η άγρια συγκομιδή. Ενώ είναι αρκετά δύσκολο να εκτιμηθεί το πλήρες εύρος της θαλάσσιας βιοσκόπησης, έχουν προκύψει ανησυχίες για την υπερεκμετάλλευση ενδημικών ειδών ή μικρών τοπικών πληθυσμών.[1]

Εικόνα A.1.7.: Το θαλάσσιο σαλιγκάρι «κώνος μαγος» conus magus.[1]

7

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Πρόσφατα, η έγκριση του πρώτου ναρκωτικού που προέρχεται από το θαλάσσιο περιβάλλον για τη θεραπεία του δυσάρεστου πόνου έχει διεγείρει περαιτέρω προγράμματα ανεύρεσης φαρμάκων από θαλάσσιους οργανισμούς (Miljanich 2004). Αυτό το μόριο, ένα σύντομο πεπτίδιο που ονομάζεται ω-MVIIA ή Ziconotide και κυκλοφορεί στο εμπόριο ως Prialt, ανακαλύφθηκε αρχικά στο δηλητήριο του σαλιγκαριού κώνου του μάγου, Conus magus, ως ισχυρός αναστολέας διαύλων ασβεστίου τύπου Ν (Olivera κ.ά., 1985) . Πολλά άλλα "κωνοπεπτίδια" που στοχεύουν διαύλους ιόντων, μεταφορείς και υποδοχείς βρίσκονται σε διάφορα στάδια κλινικών δοκιμών για τη θεραπεία του πόνου, αλλά και εμφράγματος του μυοκαρδίου, επιληψίας και νευροεκφυλιστικών ασθενειών (Lewis 2009, Lewis & Garcia 2003). Ως αποτέλεσμα, τα δηλητήρια κώνου σαλιγκαριού θεωρούνται φαρμακολογικοί θησαυροί.[1]

Τα δηλητήρια του σαλιγκάριου κώνου δίνουν μεγάλη υπόσχεση για την ανακάλυψη νέων θεραπευτικών οδηγών, αλλά ξεπερνώντας τη σύνθετη φαρμακολογία τους και απομονώνοντας μικρά μεμονωμένα δραστικά συστατικά από τις χιλιάδες που υπάρχουν σε ένα μόνο δηλητήριο είναι πρόκληση και τυπικά απαιτεί σημαντική ποσότητα αρχικού υλικού. Ιστορικά, τα σαλιγκάρια των κώνων συλλέχθηκαν από την άγρια φύση, εκτομή του αδένα του δηλητηρίου, το δηλητήριο που εξήχθη από τον αγωγό δηλητηρίου και τα πεπτίδια δηλητηρίου δοκιμάστηκαν σε ζώα, απομονωμένα παρασκευάσματα ιστού ή σειρά βιολογικών δοκιμών. Όταν απαιτούνται περισσότερα υλικά για να χαρακτηριστούν τα δευτερεύοντα συστατικά, συλλέγονται και άλλα σαλιγκάρια, μερικές φορές δεκάδες έως εκατοντάδες σαλιγκάρια κώνου για να αποκτήσουν ένα μόνο μόριο ενδιαφέροντος (Wang et al., 2009). Αυτή η πρακτική έχει αμφισβητηθεί ως προς το αν είναι βιώσιμη και ηθικά αποδεκτή (Chivian et al., 2003). Ωστόσο, μια συλλογική απάντηση από τους ερευνητές διόρθωσε ότι οι περισσότερες παγκόσμιες ομάδες που δουλεύουν με δηλητήρια κώνου σαλιγκαριού περιορίζονται σε 15-20 δείγματα ανά είδος ανά έτος. Αυτός ο αριθμός υποβαθμίζεται από τις εκατοντάδες χιλιάδες σαλιγκάρια που συγκομίζονται για το εμπόριο κελυφών ανά τον κόσμο κάθε χρόνο. Οι ερευνητικές προσπάθειες για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων είναι ασφαλώς πιο πολύτιμες από τις διακοσμήσεις, με αποτελέσματα όπως φάρμακα που μπορούν να μας ωφελήσουν άμεσα. Για να επιτραπεί η πρόσβαση στα συστατικά από είδη που είναι μικρά ή πιο δύσκολα να συλλεχθούν, οι περισσότεροι ερευνητές δεσμεύονται να μειώσουν περαιτέρω τον αριθμό των ζώων που συλλέγονται από το

8

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

φυσικό περιβάλλον χρησιμοποιώντας μικροσκοπικές προσεγγίσεις όπως διαλογή υψηλής απόδοσης ή ακολουθία επόμενης γενιάς για επιτάχυνση της ανακάλυψης. [1,2]

Εικόνα A.1.7.: Διάφορα είδη επικίνδυνων σαλιγκαριών κώνου.[1]

Α.1.1.3. Βιολογία των θαλάσσιων κώνων

Το γένος Conus οφείλει πολλά από τα 60 εκατομμύρια χρόνια εξελικτικής επιτυχίας του ως θαλάσσιοι θηρευτές στην ξεχωριστή συσκευή δηλητηρίου. Η κύρια δομή, εξαιρετικά περίπλοκη, αποτελείτε από ενα διαμήκη εκκριτικό πόρο, μπορεί να κυμαίνεται από μήκος <2 έως 80 cm . Τα εκχυλίσματα ακατέργαστου δηλητηρίου μπορούν να δώσουν λίγα μικρογραμμάρια έως 10 γραμμάρια δηλητηρίου, ανάλογα με το είδος. Ιστολογική εξέταση του έχει δείξει ότι τα επιθηλιακά κύτταρα του πόρου του δηλητηρίου παρέχουν σαφή ένδειξη της εκκριτικής τους φύσης. Διαφορετικά τμήματα του αγωγού εκκρίματος δηλητηρίου έχουν διάφορους βαθμούς τοξικότητας, παρόλα αυτά οι παρατηρήσεις παραμένουν ανεξήγητες. Το harpuon radula παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της σύλληψης των θηραμάτων και του δηλητηρίου και αυτό το δόντι ολοκληρώνει την αλληλεπίδραση τερματικού μεταξύ αρπακτικού και θηράματος. Το κοίλο, χιτινώδες άλογο είναι ένα μοναδικό βλήμα που είναι μορφολογικά ειδικό για κάθε είδος Conus . Τα δομικά χαρακτηριστικά μπορούν σαφώς να συσχετιστούν με τη συγκεκριμένη διατροφή στους τύπους που παρατηρήθηκαν στους Conus. Τα σαλιγκάρια των κώνων είναι είτε: α) ψαράδες / ιχθυοφάγοι, β) μαϊκοί μαύροι / μαλακιοί, γ) Σαρκοφάγοι / σκουλήκια, ή (δ) παμφάγο. Αν και αντιπροσωπεύει μικρό αριθμό ειδών, το δηλητήριο των σαλιγκαριών του θηράματος θεωρείται απειλητικό για τον άνθρωπο, ενώ οι τροφές μαλακίων θεωρούνται επικίνδυνες, λόγω της επιθετικής τους φύσης – ανεπιβεβαίωτοι οι θάνατοι έχουν αποδοθεί σε ορισμένα μέλη. Τα περισσότερα θεωρούνται δειλά και μη απειλητικά, σε αντίθεση με τα προηγούμενα ομολόγα. Τέλος, τα παμφάγια είδη δεν δείχνουν προτιμησιακή συμπεριφορά διατροφής.

9

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Αυτές οι τέσσερις κατηγορίες διατροφής έχουν μερικές «γενικές» μορφολογικές διακρίσεις που περιλαμβάνουν μέγεθος ανοίγματος, το βάρος και τα γενικά σχέδια χρωματισμού.[1,33,34]

Εικόνα Α.1.8.: Διάγραμμα του μηχανισμού παραγωγής και έγχυσης του δηλητηρίου ενός σαλιγκαριού-κώνου. Προσαρμογή από το σχήμα. 3 του Kohn et αl. (1960).

Τα κοχύλια Vermivore είναι γενικά βαριά σε σύγκριση με άλλες κατηγορίες τροφοδοτικών και διαθέτουν ένα στενό παράλληλο διάφραγμα. Τα μαλάκια συνήθως τείνουν να έχουν πολλαπλές λευκές τέντες που σηματοδοτούνται σε καφέ φόντο μέσου σταθμισμένου κελύφους, με διαβαθμισμένο διάφραγμα. Ενώ τα κελύφη του piscivore είναι διακοσμημένα, τυπικά ελαφριά, σε σύγκριση, και έχουν τα μεγαλύτερα ανοίγματα φιλοξενούν θηράματα σπονδυλωτών. Παρά αυτές τις οριοθετήσεις, η ταξινόμηση σαλιγκαριών είναι μια επαχθή επιχείρηση λόγω των μορφολογικών διαφορών μεταξύ των ειδών. Τα σαλιγκάρια κώνου είναι νυχτερινά, αλλά δραστηριοποιούνται κυρίως γύρω από το ηλιοβασίλεμα και την ανατολή του ηλίου. Vermivores, πολυκάχαλοι / σκουλήκια με ραούλα που είναι στερεωμένα στο εκτεταμένο, ελεύθερα κινητό proboscis, όπως το θήραμα εισέρχεται στο νάρθηκα. Σε μια δεύτερη στρατηγική, το πόδι εντοπίζει και προσανατολίζει το θήραμα για κατανάλωση. Το πόδι μετακινεί το σκουλήκι στο βήμα και χρησιμοποιώντας μία "σπαγγέτι-πιπίλισμα" τεχνική προσέγγισης, με ή χωρίς ενεργό εξωραϊσμό, και καταπίνει το θήραμα.[3,34,36] .

10

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.1.9.: Χαρακτηριστική εικόνα του μηχανισμού παραγωγής και έγχυσης του δηλητηρίου ενός σαλιγκαριού-κώνου με το μηχανισμό «σπαγγέτι».[3]

Τα μαλάκια είναι επιθετικοί κυνηγοί, τρέφονται με μήτρες, trochus, cowries, συμπεριλαμβανομένων άλλων κώνων σαλιγκαριών. Τα διεγερμένα σαλιγκάρια χρησιμοποιούν το proboscis (προβοσκίδα) τους για να διερευνήσουν το περίβλημα του θηράματος και το στόμιο. Μόλις εντοπιστεί το θήραμα, βυθίζεται με πολλαπλές ραβδώσεις. Μερικές φορές, σε μια «ρουφηξιά» παρατηρείται πλεόνασμα δηλητηρίου και αυτή η δράση μπορεί να επαναληφθεί κατά τη διάρκεια της υποταγής των απεργιών. Το βήμα του κωνικού σαλιγκαριού εισέρχεται στην κοιλότητα κελύφους του θηράματος βοηθώντας τόσο μερική πέψη και μπορεί να υπάρξει παρέκταση. Το μη- πέψιμο υλικό και οι χρησιμοποιούμενες ράβδοι ανακουφίζονται μετά την πέψη. [3,41,43,]

Οι Piscivores χρησιμοποιούν επίσης δύο προσεγγίσεις τροφοδότησης. Το πρώτο είναι μέσω του "tag and reel" Harpooning, στην οποία η εκτεταμένη proboscis και η εσωτερικοποιημένη radula impale, έγχυση, παραλύουν τα ψάρια στο πλήρως αναπτυγμένο βήμα. Τα Conus geographus και Conus tulipa έχουν παρουσιάσει μια εναλλακτική «παθητική» στρατηγική. Το ανυποψίαστο ψάρι είναι "καθαρό" από το εκτεταμένο τρίγωνο, και το ξέσπασμα εμφανίζεται μετά την κατακρήμνιση, αλλά και παραλλαγές αυτής της συμπεριφορά παρατηρήθηκαν.[3]

11

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Το κοκτέιλ δηλητήριο, το οποίο προέρχεται από την παχυσαρκία, διαθέτει φαρμακολογική δράση για την παρεμπόδιση των προ- και μετα-συναπτικών διαύλων ιόντων στη νευρομυϊκή σύνδεση. Εγχυμένο δηλητήριο που περιέχει διάφορες α- και ω- κωνοτοξίνες παρέχει διπλή διασφάλιση πραγματοποιώντας ταχεία ακινητοποίηση θηραμάτων. Ο τερματισμός της δυναμικής διάδοσης επιτυγχάνεται με την ταυτόχρονη αναστολή της προ-συναπτικής εισροής Ca2 + μέσω διαύλων ασβεστίου με τάση και υποδοχείς ακετυλοχολίνης τύπου μετασυναπτικού μυός (AChR, α κωνοτοξίνες). Υπάρχουν άλλες συνεργειακές στρατηγικές, στις οποίες τα Conus πεπτίδια συνδυάζουν τη στόχευση στα διανεμητικά κανάλια νάτριο (NaV) και καλίου (KV) για την επαγωγή μιας διεγερτικής τοξικότητας σε θήραμα.. Αυτοί οι συνδυασμένοι μηχανισμοί εντείνουν την αποτελεσματικότητα του δηλητηρίου με ταχεία «αστραπή» την ακινητοποίηση του κτυπήματος. Τα κανάλια NaV ανοίγουν ταυτόχρονα (μέσω μ-κωνοτοξινών) παράλληλα με την απόφραξη των καναλιών KV (μέσω κ-κωνοτοξινών).[3,41]

Εικόνα Α.1.10.: Σκίτσο που αναπαριστά το «hook-and-line fishing» (επάνω) και το «net- fishing» (κάτω) των σαλιγκαριών-κώνων που κυνηγούν ψάρια. Τα Conus striatus, magus, και purpurascens είναι παραδείγματα «hook-and-line» ιχθυοφάγων κώνων. Είδη όπως Conus Tulipa και Conus geographus χρησιμοποιούν τη «net-fishing» στρατηγική (M. Olivera, Lecture, 1996).

12

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.1.1.4. Το δηλητήριο των θαλάσσιων κώνων

Εμφάνιση του δηλητηρίου. Τα αποκομμένα εκχυλίσματα δηλητηρίου του αδένα μπορεί να είναι αδιαφανή, ή γαλακτώδη σε λευκό έως κίτρινο του θείου χρώματος . Το γαλακτώδες δηλητήριο είναι καθαρό, εκτός από τα υδρόφοβα πεπτίδια, όπως αυτό παρουσιάζεται από τις δ-Κωνοτοξίνες. Το γαλακτώδες δηλητήριο αποτελείται από πρωτεΐνες και χαμηλού μοριακού βάρους οργανικές ενώσεις, με τα πεπτίδια να αποτελούν το κυρίαρχο συστατικό. Η πλειοψηφία του όγκου του δηλητηρίου είναι ισοδύναμη με το θαλασσινό νερό. Λυοφιλοποιημένο ή τηγμένο, το δηλητήριο, φυσικό (αφαλατωμένο) και συνθετικό, μπορεί να είναι χνουδωτό / πλούσιο, ηλεκτροστατικό και υδροσκοπικό.[3,62] Διαλυτότητα του δηλητηρίου. Οι συνθετικές και εκχυλισμένες κωνοτοξίνες / κωνοπεπτιδία είναι διαλυτές στο νερό, δημιουργώντας ένα ελαφρώς ημιδιαφανές διάλυμα το οποίο μπορεί να αφρίσει εάν αναταράσσεται. Τα εγγενή δηλητήρια περιέχουν μικρά αδιάλυτα σωματίδια ή κόκκους, τα οποία είναι έντονα σε ολόκληρο τον αγωγό του εκχυλίσματος του δηλητηρίου, μαζί με άλλα κυτταρικά συντρίμμια. Τα εκχυλίσματα δηλητηρίου απαιτούν φυγοκέντρηση και δευτερογενής εκχύλιση. Αυτή η διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα ένα ημιδιαφανές πεπτίδιο που περιέχει υπερκείμενο. Προς την επίτευξη μέγιστης διαλυτότητας, μικρές ποσότητες μη αναμίξιμου οργανικού διαλύτη, όπως ακετονιτρίλιο (5% ν / ν), προστίθενται σε υδατικούς διαλύτες. Η υπερήχηση μπορεί να βοηθήσει στην διάλυση πεπτιδικών υλικών.[3] Σταθερότητα του δηλητηρίου. Όταν φυλάσσονται σωστά υπό εργαστηριακές συνθήκες, οι κωνοτοξίνες / τα κωνοπεπτίδια είναι πολύ σταθερά. Λόγω της δισουλφιδικής σύνδεσης, υπάρχει υψηλό επίπεδο εγγενούς δομικής σταθερότητας στο εσωτερικό των κωνοτοξίνων. Ωστόσο, ως πεπτίδια, δεν είναι ανθεκτικά σε ενζυματικές πέψεις, μικροβιακή διάσπαση, δισουλφιδική αναγωγή ή χημική οξείδωση. Οποιαδήποτε χημική τροποποίηση στο φυσικό πεπτίδιο τυπικά θα οδηγήσει σε μείωση ή απομάκρυνση της βιολογικής δραστηριότητας. Αν και η θέρμανση οδηγεί στην υποβάθμισή τους, η παρατεταμένη έκθεση σε θερμότητα, όπως αυτόκλειστο μόνο, θεωρείται ως ένα αναποτελεσματικό μέτρο για την πλήρη εξάλειψη της βιολογικής λειτουργικότητας.[3,67] Συσκευή δηλητηρίου. Τα σαλιγκάρια των κώνων έχουν αναπτύξει μια εξειδικευμένη συσκευή δηλητηρίου για να υποτάξουν το θήραμά τους. Αποτελείται από έναν αδένα δηλητηρίου, σιελογόνους αδένες (και βοηθητικούς σιελογόνους αδένες),

13

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

έναν ραχιαίο σάκο, έναν φάρυγγα, έναν προβοσκίδα και μια radula (Marsh 1977). Το radula του κωνικού σαλιγκαριού λειτουργεί ως σύστημα απελευθέρωσης και είναι κοίλο και αγκαθωτό για να μοιάζει με μικροσκοπικό χαρτόνι μήκους έως 10 mm (Kohn et al., 1972). Αυτά τα harpoons παράγονται και αποθηκεύονται σε ένα εξειδικευμένο όργανο, τον ραβδοειδή σάκο, ο οποίος χωρίζεται σε δύο βραχίονες και συνδέεται με τον φάρυγγα. Ο βραχύς βραχίονας του ραδιοσφαιρικού σάκου περιέχει περιορισμένο αριθμό ώριμων, πλήρως διαμορφωμένων ραδίου, ενώ ο μακρύς βραχίονας είναι ο τόπος παραγωγής, όπου μπορούν να βρεθούν radula σε διαφορετικά στάδια της σύνθεσης. Ο συνολικός αριθμός radula που υπάρχει σε ένα ραδιενεργό σάκο εξαρτάται από το είδος και φαίνεται να ποικίλλουν ανάλογα με τις συνήθειες διατροφής (π.χ. μαλάκια σαλιγκάρια, που μπορούν να εισάγουν δηλητήριο πολλές φορές στο θήραμά τους, να παράγουν μεγαλύτερο αριθμό harpoons). Ενώ το σαλιγκάρι του κώνου είναι κυνηγός, ένα μόνο radula φορτώνεται από τον βραχύ βραχίονα του ραδιοσφαιρικού σάκου στην άκρη της μακριάς και επεκτάσιμης προβοσκίδας. Όταν το σαλιγκάρι αισθάνεται θήραμα, θα επεκτείνει την προβοσκίδα του και θα πυροδοτήσει το harpoon μέσω ισχυρής μυϊκής σύσπασης, εισάγοντας ένα ισχυρό δηλητήριο (Schulz et al., 2004). Η μέση επίθεση διαρκεί μόνο χιλιοστά του δευτερολέπτου και η λεία συνήθως παραλύεται μέσα σε ένα δευτερόλεπτο.[3,27,62] Οι κωνοτοξίνες και τα διάφορα ένζυμα παράγονται σε ένα μακρύ, σπειροειδές αγωγό συνδεδεμένο με τον φάρυγγα (απώτατο άκρο) δίπλα στον ριποκύτταρο και συνδέεται με έναν βολβό μυκήτρου στο άλλο άκρο (εγγύς άκρο). Ορισμένες τοξίνες εκφράζονται μόνο σε συγκεκριμένες περιοχές του αγωγού δηλητηρίου, όπως καταδεικνύεται χρησιμοποιώντας μεθόδους μοριακής βιολογίας και φασματομετρίας μάζας. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η σύγκριση των περιεχομένων του δηλητηρίου που εκχυλίστηκαν από τον πόρο και το εκτρεφόμενο δηλητήριο από το ίδιο ζώο αποκάλυψε σημαντικές διαφορές (Biass et al., 2009, Jakubowski et al., 2005). Πράγματι, ενώ μια σειρά ενώσεων ήταν κοινές σε αμφότερα τα δηλητήρια, μέχρι και το 50% των μαζών που ανιχνεύθηκαν στο δηλητήριο ήταν μοναδικές. Επομένως, άλλα όργανα, όπως οι σιελογόνοι αδένες, μπορούν να συμμετέχουν στην εκπόνηση του έγχυμου δηλητηρίου, όπως έχει αποδειχθεί.[3,62,67]

14

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.1.11.: Η συσκευή δηλητηρίου των σαλιγκαριών κώνου. Αυτό το πλαίσιο απεικονίζει τη συσκευή διάτμησης του δηλητηρίου.[62]

Α.1.1.5. Βιότοποι των θαλάσσιων κώνων

Γενικά, το γένος Conus εμφανίζεται σε όλους τους τροπικούς και υποτροπικούς ωκεανούς, αλλά είναι πολύ διαφορετικό στην περιοχή του Ινδο-Δυτικού Ειρηνικού (Rockel et al., 1995). Τα λίγα είδη που βρίσκονται πέρα από το παράλληλο των 40 ° Ν ή S εντοπίζονται στη Νότια Αφρική, τη Νότια Αυστραλία, τη Νότια Ιαπωνία και τη Μεσόγειο Θάλασσα. Αυτά τα θαλάσσια σαλιγκάρια βρίσκονται κυρίως σε περιοχές κοραλλιογενών υφάλων, συνήθως σε ρηχά νερά, κάτω από κοραλλιογενείς υφάλους, που κρύβονται στην άμμο ή κάτω από σωρούς βράχων ή ερείπια (Rockel et al., 1995). Η πυκνότητα και η ποικιλία των σαλιγκαριών κώνου μειώνονται δραματικά όταν το ποσοστό των ζωντανών κοραλλιών είναι υψηλότερο από 20% (Kohn 1983). Μπορεί να επιτευχθεί μια μέγιστη πυκνότητα 40 ατόμων ανά τετραγωνικό μέτρο, αλλά είναι συνήθως πολύ λιγότερη. Υπάρχουν επίσης μερικά σαλιγκάρια κώνου που ζουν μεταξύ των μαγγρόβιων, και ένας λογικός αριθμός ζωντανών υπεράκτιων ή στα βαθιά νερά μέχρι 400 μέτρα.[1,9]

15

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.1.12.: Είναι ο «κώνος ο γεωγράφος» conus geographus, ένα αρπακτικό θαλάσσιο σαλιγκάρι που έχει προκαλέσει δεκάδες θανάτους κολυμβητών και ψαράδων. Φαίνεται όμως ότι ο δολοφόνος δεν χρειάζεται καν να τσιμπήσει τη λεία του: απελευθερώνει στο νερό μια μορφή ινσουλίνης που προκαλεί στο θύμα υπογλυκαιμικό σοκ.[62]

Α.1.2. Κωνοτοξίνες

H κωνοτοξίνη είναι μια ομάδα νευροτοξικών πεπτιδίων που απομονώνονται από το δηλητήριο του θαλάσσιου σαλιγκαριού, γένος Conus. Οι κωνοτοξίνες, οι οποίες είναι πεπτίδια που αποτελούνται από 10 έως 30 υπολείμματα αμινοξέων, τυπικά έχουν έναν ή περισσότερους δισουλφιδικούς δεσμούς. Οι κωνοτοξίνες έχουν διάφορους μηχανισμούς δράσης, οι περισσότεροι από τους οποίους δεν έχουν προσδιοριστεί. Ωστόσο, φαίνεται ότι πολλά από αυτά τα πεπτίδια ρυθμίζουν τη δραστηριότητα των διαύλων ιόντων. Τις τελευταίες δεκαετίες οι κωνοτοξίνες αποτέλεσαν το αντικείμενο φαρμακολογικού ενδιαφέροντος.

Οι κωνοτοξίνες είναι υπερμεταβλητές ακόμη και εντός των ίδιων ειδών. Τα γονίδια που τα κωδικοποιούν δεν δρουν ενδογενώς και επομένως είναι λιγότερο συντηρημένα και πιο πιθανό να παρουσιάσουν επεισόδια γονιδιακής αλληλεπικάλυψης και μη ανωνυμικές μεταλλάξεις που οδηγούν στην ανάπτυξη νέων λειτουργιών. Αυτά

16

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

τα γονίδια θα βιώσουν λιγότερη επιλογή έναντι των μεταλλάξεων και επομένως οι μεταλλάξεις θα παραμείνουν στο γονιδίωμα περισσότερο, επιτρέποντας έτσι περισσότερο χρόνο για πιθανές ωφέλιμες νέες λειτουργίες. Η μεταβλητότητα στα συστατικά της κωνοτοξίνης μειώνει την πιθανότητα να αναπτύξουν αντίσταση οι οργανισμοί των θηραμάτων. Έτσι οι κώνοι σαλιγκάρια είναι υπό συνεχή επιλεκτική πίεση για να διατηρήσουν τον πολυμορφισμό σε αυτά τα γονίδια επειδή η αποτυχία τους να εξελιχθούν και να προσαρμοστούν θα οδηγήσει σε εξαφάνιση.

Εικόνα Α.1.13.: Ζωντανά σαλιγκάρια κώνου στο περιβάλλον τους. Τα σαλιγκάρια του κώνου είναι θαλάσσιοι αρπακτικοί που τρέφονται με σκουλήκια, μαλάκια και ψάρια. Στην πάνω πλευρά εμφανίζονται δύο είδη ψαριών, Conus geographus (αριστερά) και Conus striatus (δεξιά). Στο μεσαίο τμήμα απεικονίζονται δύο είδη μαλακίων, συγκεκριμένα ο Conus marmoreus (αριστερά) και το κώνος Conus (δεξιά). Ο κάτω πίνακας δείχνει δύο ποικιλίες Vermivorous, Conus coccineus (αριστερά) και Conus vitulinus (δεξιά). (Φωτογραφίες από Thierry Vulliet.)

17

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.1.2.1. Ταξινόμηση και ονοματολογία

Τα βιοενεργά συστατικά στο δηλητήριο του Conus καταδεικνύουν την ποικιλομορφία μεταξύ των ειδών. Ένα μεμονωμένο εκχύλισμα δηλητηρίου αεραγωγού μπορεί να περιέχει ~ 200 διαφορετικά φαρμακολογικά συστατικά, ενώ μόνο ~ 20% αυτών των στοιχείων εμφανίζονται στο δηλητήριο του γάλακτος. Το δηλητήριο μπορεί επίσης, να παρουσιάζει διαφορική έκφραση πεπτιδικής τοξίνης που οδηγεί σε παραλλαγή εντός δείγματος. Αυτή η μοναδική ικανότητα, για να μεταβάλλει τα συστατικά του δηλητηρίου, πιθανώς κάνει την παραγωγή ενός αποτελεσματικού αντίβαρου / αντινενίνη αδύνατη. Υπάρχουν περίπου 5500 μεμονωμένες ακολουθίες που προέρχονται από τον Conus, με ~ 80% προερχόμενες από γονιδιωματική προέλευση. Η πλειοψηφία αυτών των πεπτιδίων έχει οργανωθεί σε επτά κύριους Υπεροικογένειες (Α-, Μ-, Ο-, Ρ-, S-Τ- και Ι-Superfamilies). Αυτές οι ομάδες βασίζονται σε συνδυασμό της φαρμακολογικής τους εκλεκτικότητας, των πλαισίων τους κυστεϊνης, μαζί με την προ- προπεπτιδίου ομολογία γενετικής αλληλουχίας. Η σύμβαση ονοματοδοσίας του Conus εκχωρεί πρώτα α) Ελληνική επιστολή για την ένδειξη της φαρμακολογικής στόχευσης. Οι κύριες οικογένειες ενδιαφέροντος είναι οι α-, ω- , Μ-, δ-, κ-κωνοτοξίνες (βλέπε παρακάτω), ενώ άλλα βιοδραστικά πεπτίδια όπως κοναντοκίνες, οι contulakins, contryphans, και άλλα πεπτίδια Conus ορίζονται ως «conopeptides».[3,27]

Διακρίνοντας ανάμεσα σε αλληλουχίες κωνοτοξίνης / κωνοπεπτιδίου, ένα ή δύο γράμματα χρησιμοποιούνται για να υποδείξουν το είδος προέλευσης, το οποίο το πρώτο (κεφαλαίο) και το δεύτερο γράμμα (τυπικά ένα διαδοχικό μη φωνήεν) που προέρχεται από την ονομασία του είδους, δηλ. Tx = κλωστή Conus.Η χρήση ενός μόνο γράμματος στην ταξινόμηση προορίζεται τυπικά για τα είδη που παρουσιάζουν αλιεία, δηλαδή Μ = Conus magus. Η ονοματολογία Conus επηρεάζεται εν μέρει από τις δισουλφιδικές γέφυρες, οι οποίες είναι βασικές σχηματίζοντας και διατηρώντας τις απαραίτητες τρισδιάστατες δομές που μεταφέρουν βιολογική δραστηριότητα. Η ανάθεση ενός ρωμαϊκού αριθμού υποδηλώνει την κατηγορία δισουλφιδικού πλαισίου. Τέλος, ένα διαδοχικό κεφαλαίο γράμμα χρησιμοποιείται για να δηλώσει τη σειρά αυτού που έκανε την ανακάλυψη. Συνήθως το αρχικά περιγραφόμενο πεπτίδιο, εντός των επιμέρους ειδών, συχνά στερείται αυτό ονομασίας. Μια συζήτηση που περιγράφει τις μεγάλες περιγραφείσες υπεροικογένειες παρέχεται παρακάτω:[3,27]

18

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.1.14.: Οργανωτικό διάγραμμα για κωνοπεπτίδια, που δείχνει τις υπεροικογένειες, τα μοτίβα δισουλφιδικών δεσμών και τους γνωστούς φαρμακολογικούς στόχους. Τα κωνοπεπτίδια μπορούν να διαιρεθούν σε δύο ευρείες κατηγορίες, τις πλούσιες σε δισουλφιδικούς δεσμούς κωνοτοξίνες και τα μη-πλούσια σε δισουλφιδικούς δεσμούς πεπτίδια. Απεικονίζονται μόνο οι υπεροικογένειες για τα πλούσια σε δισουλφιδικούς δεσμούς κωνοτοξίνες. Απεικονίζονται επίσης, τα χαρακτηριστικά κυστεϊνικά μοτίβα στα πεπτίδια της κάθε υπεροικογένειας. Η χρησιμοποιούμενη ονοματολογία βασίζεται σε αυτήν που προτείνεται από McIntosh et al. (1999a, b) και Olivera (2002a). Σημειώστε ότι ο αριθμός των υπεροικογενειών των κωνοτοξινών συνεχίζει να αυξάνεται, με διάφορα νέα κυστεϊνικά μοτίβα να περιγράφονται πρόσφατα (π.χ. Μοller et al 2005). (Norton, Olivera 2006).

Α.1.2.1.1 Α-Υπεροικογένεια

Η A-υπεροικογένεια χωρίζεται σε τέσσερις οικογένειες τοξινών, α-, αΑ-, κΑ- και ρ-κωνοτοξίνες, που αποτελούνται από ~ 200 μεμονωμένες αλληλουχίες (εξαιρουμένων των αλληλουχιών πρόδρομων). Οι α- και αΑ-κωνοτοξίνες είναι ανταγωνιστές νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης (nAChR), οι ρ-κωνοτοξίνες έχουν δομικά παρόμοια διάταξη κυστεϊνης με τις α-κωνοτοξίνες αλλά είναι ανταγωνιστές 1Β-

19

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

αδρενοϋποδοχέα, ενώ οι κΑ-κωτοτοξίνες στοχεύουν τα κανάλια ιόντων καλίου (Κ +) και είναι τυπικά γλυκοζυλιωμένες και μεγαλύτερες σε μέγεθος. Οι κλασικές α- κωνοτοξίνες περιέχουν ~ 40 μεμονωμένα-απομονωμένα πεπτίδια δηλητηρίου και έχουν ανακαλυφθεί σε όλο το γένος. Αυτά κυμαίνονται από 12 έως 22 αμινοξέα (αα) και περιέχουν τέσσερις μονάδες κυστεϊνης που σχηματίζουν δύο δισουλφιδικούς δεσμούς. Η μετασυναπτική αναστολή στη νευρομυϊκή σύνδεση από α-κωνοτοξίνες έχει ως αποτέλεσμα την παράλυση και το θάνατο από αναπνευστική ανεπάρκεια. Άλλες α- κωνοτοξίνες έχουν τη δυνατότητα να διακρίνουν μεταξύ των διαφόρων υποτύπων AChR, όπως παρατηρήθηκε με την α-κωνοτοξίνη ΙmΙ που στοχεύει νευρωνικές ισομορφές.[3,42,46]

Α.1.2.1.2 M-Υπεροικογένεια

Η M-υπεροικογένεια αποτελείται από τρεις οικογένειες, ψ-, μ- και κΜ- κωνοτοξίνες. Περίπου 300 αλληλουχίες πεπτιδίων (εξαιρουμένων των αλληλουχιών πρόδρομων) εμπίπτουν σε αυτή την κατηγορία, μια μεγάλη πλειοψηφία περιγράφεται από γενετικές πηγές. Αυτά τα πεπτίδια περιέχουν δομικά 14-28 αα, έξι κυστεΐνες - που σχηματίζουν τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς σε ένα πλαίσιο CC-C-C-CC. Μερικά από τα μέλη περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις 4-trans-υδροξυπρολίνης, ένα PTM αα. Οι Ψ- κωνοτοξίνες στοχεύουν σε nAChRs, ως μη ανταγωνιστές, ενώ οι μ-κωνοτοξίνες μπλοκάρουν τα κανάλια NaV στο αναλγητικά κύτταρα του μυϊκού, καρδιακού, σκελετικού και νευρικού ιστού. Τα κανάλια NaV ρυθμίζονται γρήγορα με ηλεκτρική σηματοδότηση τόσο σε νευρωνικούς όσο και σε μυϊκούς κυτταρικούς τύπους. Οι Μ- κωτοξίνες GIIIA, GIIIB, και GIIIC αποτελούν παραδείγματα κωνοτοξινών από το C. geographus που δρουν σε κανάλια NaV στους μυς. Αυτά τα πεπτίδια λειτουργούν από κοινού με άλλα συστατικά του γαλακτωμένου δηλητηρίου προκαλώντας ταχεία παράλυση στα ψάρια. Σε μοριακό επίπεδο, δεσμεύονται επιλεκτικά στον πόρο του διαύλου ιόντων, εμποδίζοντας την ηλεκτροχημική ροή των ιόντων Na + μέσα στο κύτταρο. Αυτό το χαρακτηριστικό τα κάνει εξαιρετικά χρήσιμα για την ηλεκτροφυσιολογική έρευνα.[3,42,46]

20

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.1.2.1.3 Ο-Υπεροικογένεια

Η Ο-υπεροικογένεια είναι η μεγαλύτερη ομάδα, με ~ 500 αλληλουχίες πεπτιδίων (εξαιρουμένων των πρόδρομων αλληλουχιών), σε πέντε διαφορετικές οικογένειες, μΟ-, δ-, ω-, κ- και γ-κωνοτοξίνες. Υπάρχουν διαρθρωτικές ομοιότητες μεταξύ φαρμακολογικώς μη σχετιζόμενων κωτοτοξινών. Αυτή η υπεροικογένεια καθορίζεται κυρίως από ένα εξαιρετικά διατηρημένο δισουλφιδικό πλαίσιο των C-C- CC-C-C που συνήθως αναφέρεται ως σχέδιο «6/4-Cys βρόχου», το οποίο παρατηρείται στην ώριμη πεπτιδική αλληλουχία. Η αλληλεξάρτηση αυτής της υπεροικογένειας στη συνέχεια συνδυάζεται με την αλληλουχία πρόδρομων ομόλογων πεπτιδίων.

Φαρμακολογικά, οι οικογένειες μΟ- και δ-κωτοτοξίνης στοχεύουν κανάλια Nav αλλά δεν ανταγωνίζονται με τις μ-κωνοτοξίνες για τη θέση δέσμευσης των πόρων. Ενώ ω-, κ- και γ-κωνοτοξίνες στοχεύουν VGCC στόχους, κανάλια K + και κανάλια βηματοδότη, αντίστοιχα. Οι δ-κωνοτοξίνες τυπικά αποτελούνται από περίπου 30 αα, διατηρώντας τρεις δισουλφιδικές γέφυρες και επιδεικνύοντας μια χαρακτηριστική υδρόφοβη φύση. Οι ω-κωνοτοξίνες ακολουθούν αυτά τα ίδια βιοχημικά χαρακτηριστικά, αλλά στερούνται της υδροφοβικότητας. Γνωστά ως «πεπτίδια αναδευτήρα» αυτά επάγουν επίμονες δονήσεις όταν εγχέονται σε ποντικούς και έχουν παρουσιάσει μεγάλο φαρμακολογικό ενδιαφέρον. Η Ω-κωνοτοξίνη MVIIA, ένας επιλεκτικός τύπου Ν VGCC που απομονώθηκε από το C. magus, ήταν η πρώτη κωνοτοξίνη κλινικά εγκεκριμένη για τη θεραπεία του χρόνιου κατασταλτικού πόνου, κυρίως με στόχο τους ασθενείς έχουν υψηλές ανοχές στα οπιοειδή. Άλλες ω-κωνοτοξίνες υπόκεινται σε έρευνα ως θεραπευτικοί οδηγοί.[3,42,46]

Α.1.2.1.4 P-Υπεροικογένεια

Η P-υπεροικογένεια, η οποία αποτελείται από εννέα αλληλουχίες πεπτιδίων, έχει πάρει το όνομα της οικογένειας, τα «σπαστικά», επειδή επιδρώντας στον μοριακό τους στόχο εκδηλώνοντας σπαστικά παράλυση στον εξεταζόμενο οργανισμό. Επί του παρόντος, αυτά τα πεπτίδια έχουν απομονωθεί μόνο από τους κώνους molluscivorous και vermivorous, με την πλειοψηφία του να προέρχονται από γενετικές ακολουθίες. Ένα παράδειγμα σπαστικής-κωνοτοξίνης είναι το Tx9a, ένα πεπτίδιο PTM που βρίσκεται στο δηλητήριο του καναλιού του molluscivorous C. Textile. Η

21

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

φαρμακολογική στόχευση αυτής της μοναδικής οικογένειας πεπτιδίου είναι υπό μελέτη. [3,42,46]

Α.1.2.1.5 S-Υπεροικογένεια

Η S-υπεροικογένεια στοχεύει τον μυϊκό τύπο nAChR ή ανταγωνίζεται

ανταγωνιστικά τον υποδοχέα σεροτονίνης 5ΗΤ3 και αποτελείται από επτά πεπτίδια (εξαιρουμένων των προδρόμων αλληλουχιών). Απομονωμένα από όλους τους τύπους, αυτές οι αλληλουχίες είναι μοναδικές, τόσο σε μέγεθος (<40 αα) όσο και σε διάταξη δισουλφιδίου, τα οποία έχουν την υψηλότερη περιεκτικότητα που παρατηρείται σε οποιαδήποτε κωνοτοξίνη / κωνοπεπτίδιο με το σχηματισμό πέντε επιμέρους δισουλφιδικών δεσμών. Αυτοί που απομονώνονται από το δηλητήριο του piscivores επιδεικνύουν εκτεταμένο ΡΤΜ, συμπεριλαμβανομένης της βρωμοτρυπτοφάνης, όπως φαίνεται στην σ-κωνοτοξίνη GVIIIA από το C. geographus. [3,42,46]

Α.1.2.1.6 T-Υπεροικογένεια

Η T-υπεροικογένεια περιλαμβάνει τις οικογένειες τ- και χ-κωνοτοξίνης και αποτελείται από ~ 110 πεπτιδικές αλληλουχίες (εξαιρουμένων των προδρόμων αλληλουχιών). Με τα περισσότερα (<95%) να προέρχονται από γενετικές πηγές που αντιπροσωπεύουν όλες τις ομάδες διατροφής στο γένος. Η πλειοψηφία αυτών των πεπτιδίων έχουν τέσσερις κυστεΐνες σε πλαίσιο -CC-CC- που παράγουν δύο δισουλφιδικούς δεσμούς. Οι Τ-κωνοτοξίνες λειτουργούν ως προ-συναπτικοί αναστολείς διαύλων Ca2 + , ενώ οι χ-κωνοτοξίνες αναστέλλουν τη νορεπινεφρίνη ως μεταφορείς (ΝΕΤ). Οι χ-κωνοτοξίνες λαμβάνουν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω της φαρμακολογικής τους δράσης σε κλινικές δοκιμές φαρμάκων για την αντιμετώπιση του πόνου.[3,42,46]

Α.1.2.1.7 Ι-Υπεροικογένεια

Έχουν ανακαλυφθεί πολλά μέλη της υπεροικογένειας Ι, ~ 88 μεμονωμένες αλληλουχίες (εξαιρουμένων των προδρόμων αλληλουχιών), οι περισσότερες αντιπροσωπεύουν γενετικά προερχόμενες αλληλουχίες από τα vermivorous σαλιγκάρια

22

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

κώνου. Οι περισσότερες από αυτές τις αλληλουχίες παραμένουν φαρμακολογικώς ακαθόριστες. Αυτά τα πεπτίδια έχουν οκτώ τμήματα κυστεΐνης, με ένα μοτίβο -C-C- CC-CC-C-C-, και από εκείνα τα λίγα απομονωμένα φυσικά πεπτίδια αποδεικνύουν ότι περιέχουν πολλαπλές ΑΤS PTM. Παραδείγματα έχουν δείξει την κ-κωνοτοξίνη BtX (BeTx), απομονωμένη από Conus betulinus. Φαρμακολογικά, η BtX έδειξε να στοχεύει το κανάλι καλίου με ενεργοποιημένο με ασβέστιο, χωρίς να επηρεάζονται άλλες τάσεις- κανάλια. Η φαρμακολογική εκλεκτικότητα και διαφοροποίηση στην Ι-υπεροικογένεια προς τα κανάλια KV απεικονίζεται με κωνοτοξίνη ViTx (Conus virgo), η οποία κατέδειξε ειδική επιλεκτικότητα που αναστέλλει τους υποτύπους διαύλων ιόντων Κ + KV1.1 και KV1.3, αλλά όχι KV1.2 . Ωστόσο, ο ρόλος των PTM σε αυτή την τάξη είναι βασικά άγνωστος.[3,42,46]

Α.1.3 Ο σχηματισμός δισουλφιδικού δεσμού

Η βιολογική δραστηριότητα είναι αντανακλαστική στη φυσική τρισδιάστατη δομή. Στις κωνοτοξίνες, και μερικά κωνοπεπτίδια, αυτό μεταφέρεται με ειδικό, κατευθυνόμενο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ μεμονωμένων χαρακτηριστικών ομάδων κυστεϊνης. Κάθε κατηγορία φυσικών πεπτιδίων έχει ένα συγκεκριμένο μοτίβο συνδεσιμότητας. Η τροποποίηση της προκύπτουσας δομής αλλάζοντας τη συνδεσιμότητά τους μπορεί να οδηγήσει, ως επί το πλείστον, σε βιολογική αδράνεια. Αυτό το PTM αντιπροσωπεύει τις συνηθέστερες παρατηρήσεις στους κώνους.[3,67,69,72]

Α.1.3.1. C-τερματική αμιδίωση

Η καρβοξυτελική αμίδωση είναι κοινή στις περισσότερες κωνοτοξίνες. . Η παρουσία της μπορεί να είναι γενετικά προβλέψιμη, με ένα επίπεδο βεβαιότητας, με την καθιέρωση της περιοχής πλευρικής πλευρικής ακολουθίας της προβλέψιμης ώριμης πεπτιδικής τοξίνης. Η C-τερματική αμίδωση έχει ένα ρόλο στην δισουλφιδική συζευγμένη αναδίπλωση των κωνοτοξινών, οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν δομικά τη βιολογική δραστικότητα του πεπτιδίου, αλλά παρέχει επίσης ένα επίπεδο ενζυματικής αντοχής στην αποικοδόμηση καρβοξυπεπτιδάσης. Η απομάκρυνση του

23

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

από φυσικά πεπτίδια έχει επιδείξει μικρές μειώσεις στην ισχύ. Αυτό αντιπροσωπεύει το δεύτερο πιο κοινό PTM που παρατηρείται στους κώνους.[3,115]

Α.1.3.2. Ν-τερματική κυκλοποίηση

Μερικές κωνοτοξίνες περιέχουν ένα Ν-τελικό γλουταμικό οξύ. Αυτά τα υπολείμματα μπορούν να υποβληθούν σε Ν-Τερματική κυκλοποίηση μέσω Γλουταμινυλκυκλάσης για να σχηματιστεί πυρογλουταμικό οξύ. Αυτό εχει ως αποτέλεσμα αλλάζοντας την κατάσταση φόρτισης του Ν-τερματικού άκρου που μπορεί να επηρεάσει τη συγγένεια στόχου καθώς και την παροχή αντίστασης σε αποικοδόμηση ενδο-πεπτιδάσης. Αυτή η αλλαγή αντιπροσωπεύει μία από τις ελάχιστες παρατηρήσεις αα τροποποιήσεων στους κώνους.[3,79]

Α.1.4 Φαρμακολογική δράση των Κωνοπεπτιδίων

Πρώιμες εργαστηριακές μελέτες βρήκαν το δηλητήριο από το Conus geographus για να προκαλέσουν σπασμούς και αναπνευστική καταστολή (χωρίς άμεση ταυτόχρονη καρδιακή ανακοπή) σε ποντίκια. Σε απομονωμένους μύες το δηλητήριο του Conus geographus παρήγαγε μυική παράλυση. Οι κωνοτοξίνες λειτουργούν σε διάφορους νευροδιαβιβαστές στο σώμα, συμπεριλαμβανομένων των γλουταμινικών, αδρενεργικών, σεροτονινικών και χολινεργικών και ιόντων καναλιών νατρίου, καλίου και ασβεστίου.[4,17]

Οι κωνοτοξίνες ταξινομούνται από το Conoserver, μια βάση δεδομένων για τις κωνοτοξίνες που διατηρεί το Πανεπιστήμιο του Queensland, από την υπεροικογένεια των γονιδίων, το πλαίσιο της κυστεΐνης ή από φαρμακολογικές επιδράσεις. Υπάρχουν 18 υπεροικογένειες γονιδίων που χρησιμοποιούνται από το Conoserver. Η ταξινόμηση κωνοτοξινών από κυστεΐνες περιλαμβάνει την εξέταση του αριθμού των κυστεϊνών στο πεπτίδιο, το πρότυπο τους και τη συνδεσιμότητά τους μέσα στο πεπτίδιο. Οι φαρμακολογικές κατηγορίες περιλαμβάνουν τα άλφα (α), γάμα (γ), δέλτα (δ), έψιλον (ε), γιώτα (ι), κάπα (κ), μι (μ), χι Χ) και ωμέγα (ω). Ανατρέξτε στον πίνακα για τα φαρμακολογικά χαρακτηριστικά κάθε κατηγορίας. Δεν περιλαμβάνονται στο παραπάνω σύστημα ταξινόμησης οι κωνοτοξίνες, οι οποίες δρουν στους υποδοχείς Ν-μεθυλ-ϋ-

24

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ασπαρτικού. Οι κωνοτοξίνες που ρυθμίζουν τους υποδοχείς αγγειοπιεστίνης / οξυτοκίνης δεν περιλαμβάνονται επίσης στο σύστημα ταξινόμησης του Conoserver.[4,17,19]

Ένα από τα βασικά συστατικά του δηλητηρίου του Conus geographus είναι οι α- κωνοτοξίνες. Οι α-κωνοτοξίνες είναι ανταγωνιστές των νικοτινικών υποδοχέων. Οι νικοτινικοί υποδοχείς εξυπηρετούν μια ποικιλία λειτουργιών στο σώμα. Νικοτινικοί υποδοχείς χρειάζονται για τη συστολή του σκελετικού μυός. Η ακετυλοχολίνη απελευθερώνεται από έναν κινητικό νευρώνα. Η ακετυλοχολίνη στη συνέχεια προσκολλάται στους νικοτινικούς υποδοχείς του μυός. Αυτό ξεκινά μια φυσιολογική καταρράκτη προκαλώντας τη σύσπαση του μυός. Η φυσική παρεμπόδιση του νικοτινικού υποδοχέα με ένα φάρμακο ή τοξίνη θα σταματούσε τη σύσπαση και θα προκαλούσε παράλυση. Το διάφραγμα είναι ένας μυς που βρίσκεται κάτω από τους πνεύμονες και διαιρεί την κοιλιά από τη θωρακική κοιλότητα. Το διάφραγμα είναι ο πρωταρχικός μυς που αναγκάζει τους πνεύμονες να διογκωθούν και να ξεφουσκώσουν. Η παράλυση του διαφράγματος έχει ως αποτέλεσμα την παύση της αναπνοής. Η διπλωπία που αναφέρθηκε από τις ανθρώπινες εκθέσεις πιθανόν να προκύπτει από την παράλυση των εξωφραγματικών μυών.[4,19,20]

Οι νικοτινικοί υποδοχείς είναι οι κύριοι υποδοχείς στις συνάψεις των γαγγλίων. Νικοτινικοί υποδοχείς βρίσκονται επίσης στον εγκέφαλο. Οι πρώτες απομονωμένες α- κονοτοξίνες ήταν GI, GIA και GII και βρέθηκαν στο Conus geographus. Αυτές οι α- κωνοτοξίνες δεν επηρεάζουν το κεντρικό νευρικό σύστημα. Άλλες α-κωνοτοξίνες ήταν απομονωμένα διαφορετικά είδη συμπεριλαμβανομένων Conus magus, Conus striatus, Conus consors, Conus achatinus, και Conus ψευδής. Ένας αριθμός α-κωνοτοξινών βρέθηκε να έχει δράση στους νικοτινικούς υποδοχείς στον εγκέφαλο. Η πρώτη α- κωνοτοξίνη με κεντρική δράση ήταν η α-κωνοτοξίνη CTx ΙΜΙ που απομονώθηκε από το Conus imperialis, ένα σκουλήκι-τρώγων.[4,21]

Η αναστολή του νικοτινικού υποδοχέα δεν είναι ο μόνος μηχανισμός που προκαλεί παράλυση των μυών. Τα φαινόμενα παραλύσεως των μυών μπορούν να ληφθούν με αποκλεισμό των διαύλων ιόντων στους νευρώνες που τροφοδοτούν τους μύες ή με αποκλεισμό των διαύλων ιόντων στους μυς. Conus purpurascens, είναι piscivore που προκαλεί τόσο χαλαρή παράλυση όσο και «ξαφνικό τέτανο στο θήραμά του». Το Conus purpurascens χρησιμοποιεί α-κωνοτοξίνη PIVA και μ-κωνοτοξίνη

25

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

PIIIA για να παραλύσει το θηρίο ψαριών. Η α-κωνοτοξίνη στοχεύει τους νικοτινικούς υποδοχείς στους μυς. Η μ-κωνοτοξίνη στοχεύει τα κανάλια νατρίου στους σκελετικούς μύες. Αυτό το είδος χρησιμοποιεί επίσης κ-κωνοτοξίνη PVIIA και δ-κωνοτοξίνη PVIA για να προκαλέσει τον "ξαφνικό τέτανο του θήραμα" ακινητοποιώντας έτσι το θήραμα γρήγορα. Όλοι οι μύες του θύματος ψαριών έχουν συρρικνωθεί ταυτόχρονα. Τα ψάρια βιώνουν το φαρμακολογικό ισοδύναμο ηλεκτροπληξίας. Η Κ-κωνοτοξίνη PVIIA μπλοκάρει τους διαύλους καλίου. Το κάλιο χρειάζεται από τα κύτταρα για να αντιστρέψει το δυναμικό δράσης. Ο αποκλεισμός των διαύλων καλίου παρατείνει τη συστολή. Η PVIA δ-κωνοτοξίνης καθυστερεί την απενεργοποίηση του νατρίου παρατείνοντας έτσι το δυναμικό δράσης. Οι δ-κωνοτοξίνες από σαλιγκάρια κώνου μαλακίων, με την εξαίρεση του Am2766, δεν έχουν ενεργούς υποδοχείς στα θηλαστικά. Οι δ-κωνοτοξίνες των σαλιγκαριών κώνου αναστέλλουν την αδρανοποίηση του καναλιού Nav σε θηλαστικά. Οι νευρώνες, τα μυϊκά κύτταρα και τα καρδιομυοκύτταρα απαιτούν κανάλια Nav για φυσιολογική ηλεκτρική λειτουργία.[4]

Πίνακας Α.1.1.: Φαρμακολογικές κατηγορίες κωνοτοξινών

Family Physiological Effects Blocks nicotinic receptors. Produces muscle Alpha (α) paralysis Inhibits the fast inactivation of voltage Delta(δ) gated sodium channels Affects presynaptic calcium channels Epsilon (ε) needed for action potential activity Agonist at sodium gated channels with no iota (ι) delayed inactivation Anatagonist of potassium gated channels. Kappa (κ) Interferes with repolarization Mu (μ) Antagonist of sodium gated channels Impacts alpha-adrenal receptors, affecting Rho (ρ) blood pressure and smooth muscle Affexts serotonin activity. Impacts mood, Sigma (σ) appetite stress control Chi (χ) Affects neuronal aldenergic trans-porter Omega (ω) Works on voltage gated calcium channels

26

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Anatagonize glutamine, the mail excitatory neurotransmitter in the brain, at N-methyl- conantokins D-aspartate receptors Modulate vasopressin/oxytocin receptors. conopressins Increases blood pressure

Α.1.4.1 Κωνοτοξίνες που στοχεύουν κανάλια ιόντων

Τα δηλητήρια σαλιγκαριού κώνου είναι πολύ ισχυρά και δρουν ως εκλεκτικοί πεπτιδικοί ανταγωνιστές ή αγωνιστές συνδέτη ή διαύλους ιόντων με πύλη τάσης και υποδοχείς συζευγμένοι με πρωτεΐνη Ο (GPCR). Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChR) αναστέλλουν ανταγωνιστικά τις α- και α-Αο-τοξίνες, ενώ οι ψ-κωνοτοξίνες δείχνουν την ανεπιθύμητη αναστολή αυτής της οικογένειας υποδοχέων. Οι σ-κωνοτοξίνες ανταγωνίζονται τον σχετικό υποδοχέα 5-ΗΤ3 σεροτονίνης και οι κωνορεσίνες είναι αγωνιστές των υποδοχέων αγγειοπιεστίνης, μια οικογένεια GPCR. Οι ω-κωνοτοξίνες είναι αναστολείς των διαύλων ασβεστίου, οι κ-κωνοτοξίνες είναι αναστολείς διαύλων καλίου και μ-, καθώς και οι μ-κωνοτοξίνες, είναι αναστολείς διαύλων νατρίου, για να αναφέρουμε μερικές από τις οικογένειες των κωνοτοξινών. Η υψηλή δραστικότητα αυτών των τοξινών, οι οποίες είναι δυνητικά θανατηφόρες για τον άνθρωπο, μπορεί στο μέλλον να μετατραπεί προς όφελός μας από φαρμακολόγους οι οποίοι διερευνούν τη πιθανή χρήση τους ως βοηθητικά μέσα στην αναισθησία, τα αναλγητικά ή ως φάρμακα για τη θεραπεία καταστάσεων όπως Την επιληψία, τις καρδιαγγειακές παθήσεις και τις ψυχιατρικές διαταραχές. [6,47]

Το ισχυρό εμπορικό ενδιαφέρον για αυτά τα μόρια αντικατοπτρίζεται από περισσότερα από 100 διπλώματα ευρεσιτεχνίας και αιτήσεις διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας με τη λέξη «conotoxin (s)» στον τίτλο τους. Οι διαθέσιμες βιβλιοθήκες κοντοξίνης πιστεύεται ότι περιέχουν περισσότερα από 50.000 διαφορετικά μόρια. Οι κυριότεροι παίκτες στον τομέα της εμπορευματοποίησης κωνοτοξίνης είναι Cognetix, Neurex, AMRAD και Xenome. Η ζικονοτίδη, προηγουμένως αναφερόμενη ως CI1009 ή SNX111, είναι η συνθετική μορφή της ω-κωνοτοξίνης MVIIA, ειδικού για νευρώνες, αναστολέα διαύλων ασβεστίου τύπου Ν και του πρώτου φαρμάκου conotoxin για να λάβει μια επιστολή έγκρισης από τον FDA. Η ζικονοτίδη αναπτύχθηκε από το Neurex

27

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

ως ενδορραχιαία θεραπεία για χρόνιο πόνο. Σε αντίθεση με τη μορφίνη δεν προκαλεί ανάπτυξη ανοχής, δυσκοιλιότητας ή αναπνευστικής καταστολής. [6,7,47]

Άλλη ω-κωνοτοξίνη, AM336, βρίσκεται σε κλινική ανάπτυξη στο AMRAD για τη θεραπεία του σοβαρού πόνου που είναι ανθεκτικό στην morphine. Αυτό το μόριο ευρέθη ότι είναι 100 φορές πιο εκλεκτικό από το Ziconotide για τύπους Ν τύπου έναντι διαύλων ασβεστίου τύπου Ρ / Ο με μειωμένες ανεπιθύμητες νευρολογικές επιδράσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να είναι προτιμότερο να χορηγηθεί Ziconotide. Η GTS21, η 3- (2,4-διμεθοξυβενζυλιδενο) -αναβασεϊνη, είναι ένας επιλεκτικός μερικός αγωνιστής α 7 nAChR στην κλινική ανάπτυξη στο Taiho για τη θεραπεία της νόσου του Alzheimer και της σχιζοφρένειας. Η GTS21 απομονώθηκε από τον αμιντίνη σκώληκα Amphiporus lactifloreus. Η ένωση έχει αποδειχθεί ότι βελτιώνει τις μαθησιακές επιδόσεις και τη διατήρηση της μνήμης σε μοντέλα παθητικής αποφυγής σε αρουραίους βασιζόμενους σε nucleus basalis magnocellularis (NbM) καθώς και σε μοντέλα ενεργητικής αποφυγής σε ηλικιωμένους αρουραίους. Επίσης, μείωσε την απώλεια των νεοπροταγών κυττάρων σε αρουραίους που υπέστησαν βλάβη με NbM και ο κυτταρικός θάνατος επήχθη από β-αμυλοειδές ή γλουταμίδιο σε καλλιέργειες νευρωνικών κυττάρων.[6,7,47]

Α.1.4.2 Δράσεις κωνοπεπτιδίων σε άλλους στόχους

Ένας αριθμός κωνοπεπτιδίων στοχεύει υποδοχείς που συζευγνύονται με G πρωτεΐνη (Heinrich Terlau and Baldomero M. Olivera, 2004). Δύο από αυτούς είναι αγωνιστές: η conopressin-G είναι αγωνιστής του υποδοχέα βασοπρεσσίνης (Cruz LJ et al, 1987), και η G contulakin πιστεύεται ότι είναι ειδικός αγωνιστής ενός υποτύπου υποδοχέα της οικογένεια της νευροτενσίνης (Craig AG et al, 1999). Μόνο ένα πεπτίδιο

μέχρι στιγμής, η ρ-ΤΙΑ-κωνοτοξίνη, έχει αποδειχθεί ότι στοχεύει τον α1 αδρενεργικό υποδοχέα (Sharpe IA et al, 2001). Για ορισμένα πεπτίδια, όπως το πεπτίδιο tx5a ή αλλιώς TxIX, ο στόχος πιθανόν είναι είτε ένα κανάλι ιόντων ή ένας υποδοχέας συζευγμένος με G πρωτεΐνη (Rigby A.C et al, 1999; Walker C et al, 1999), καθώς έχει αποδειχθεί ότι το πεπτίδιο αυτό μειώνει την ροή των Ca+2 στο προσυναπτικό άκρο, αλλά ο πραγματικός μοριακός στόχος δεν έχει οριστικά προσδιοριστεί. Τέλος, μια

28

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

σειρά από πεπτίδια που είναι βιολογικά ενεργά έχουν χαρακτηριστεί βιοχημικά. Τέτοιο παράδειγμα είναι η χ-κωνοτοξίνη MrIA, που ονομάζεται επίσης mr5a, η οποία θα μας απασχολήσει σε αυτήν την διατριβή. Είναι μέλος της υπεροικογένειας Τ (McIntosh JM et al, 2000) και στοχεύει το μεταφορέα της νορεπινεφρίνης (Sharpe IA et al, 2001).

Α.1.5 Επιστημονικές και ιατρικές εφαρμογές των κωνοτοξινών

Οι κωνοτοξίνες χρησιμοποιούνται τόσο σε βασικές έρευνες επιστήμης όσο και σε θεραπευτικές έρευνες. Οι κωνοτοξίνες χρησιμοποιούνται ως εργαλεία έρευνας, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού του τρόπου λειτουργίας των συγκεκριμένων υποδοχέων και των διαύλων ιόντων. Οι κωνοτοξίνες έχουν δυνατούς ρόλους στην άμεση θεραπεία της νόσου. Οι ω-κωνοτοξίνες χρησιμοποιούνται στην έρευνα των νευροεπιστημών για να μελετήσουν τους υποτύπους των διαύλων ασβεστίου. Για την κατανόηση συγκεκριμένων διαύλων νατρίου χρησιμοποιείται μια ποικιλία κωνοτοξινών. [9,10]

Ορισμένες πιθανές φαρμακευτικές ουσίες προέρχονται από κωνοτοξίνες. Η ζικοσινίδη προέρχεται από τον Conus magus ω-κωνοτοξίνη MVIIA. Έχει εγκριθεί από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών για την αντιμετώπιση του αδικαιολόγητου πόνου με την επωνυμία Prialt®. Η Κ-κωνοτοξίνη PVIIA μπορεί να έχει καρδιοπροστατευτικά αποτελέσματα. Ανάλογα του α-CTx MII, ενός κεντρικά δραστικού νικοτινικού αναστολέα που προέρχεται από τον Conus geographus, μπορεί να έχει κάποιο ρόλο στη θεραπεία της νόσου του Parkinson. Άλλες κεντρικά δραστικές α-κωνοτοξίνες θεωρητικά θα μπορούσαν να είναι χρήσιμες στη θεραπεία της νόσου του Alzheimer, του εθισμού στη νικοτίνη και στη διαχείριση του πόνου. Οι προοπτικές θεραπευτικές ή ερευνητικές χρήσεις των κονγκαντοκινών περιλαμβάνουν τον πόνο, την επιληψία, το εγκεφαλικό επεισόδιο και τη νόσο του Parkinson. Η οικογένεια chi αναστέλλει τη μεταφορά νορεπινεφρίνης και συνεπώς είναι πιθανές θεραπείες για διαταραχή έλλειψης προσοχής / υπερκινητικότητας ή κατάθλιψη. Οι κωνοτοξίνες που εμποδίζουν τα κανάλια Nav1.6 και Nav1.2 μπορεί να μετριάσουν τη φλεγμονώδη διαδικασία στη σκλήρυνση κατά πλάκας. Άλλες κωνοξίνες μπορεί να

29

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

έχουν εφαρμογές για τη μελέτη της σχιζοφρένειας. Υπάρχουν εκτιμώμενες 50.000 έως 100.000 κωνοτοξίνες και περίπου 0.1% έχουν χαρακτηριστεί φαρμακολογικά.

Πίνακας Α.1.2. Κωνοπεπτίδια που αναπτύχθηκαν για την αντιμετώπιση καταστάσεων νευροπαθητικού πόνου (D. Alonso et al, 2003). Τα είδη Conus σημειώνονται ως p: ιχθυοφάγα, m: αυτά που τρέφονται με μαλάκια.

Α.1.6. Προοπτικές και μελλοντικές κατευθύνσεις

Προς το παρόν, μόνο μικρό ποσοστό του δηλητηρίου του Conus έχουν ερευνηθεί, και ακόμη και στο καλύτερα χαρακτηρισμένο δηλητήριο, μόνο ένα μικρό κλάσμα πεπτιδίων έχει χαρακτηριστεί βιοχημικώς ή φαρμακολογικά. Ωστόσο, αυτή η βάση δεδομένων εξακολουθεί να επιτρέπει πολλές γενικεύσεις. Πρώτον, υπάρχει αξιοσημείωτη φαρμακολογική και βιοχημική ποικιλομορφία μικρών περιορισμένων πεπτιδίων σε κάθε δηλητήριο Conus. Στο δηλητήριο Conus geographus, μικρά πεπτιδικά προσδέματα στοχεύουν διαύλους ασβεστίου, κανάλια νατρίου, υποδοχείς ακετυλοχολίνης και υποδοχείς NMDA. Ακόμη πιο ενδιαφέρον είναι ο πολύ

30

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

μεγαλύτερος αριθμός βιολογικά δραστικών πεπτιδίων στο ίδιο δηλητήριο για τα οποία δεν έχουν ακόμη ταυτοποιηθεί οι υποδοχείς. [8,76]

Εκτός από την πεπτιδική ποικιλομορφία σε ένα μεμονωμένο δηλητήριο, παρατηρείται μια καταπληκτική αλληλουχία υπερμεταβλητότητας μεταξύ των δηλητηρίων. Δεν έχουν ακόμη βρεθεί δύο είδη Conus με την ίδια αλληλουχία κωνοξίνης. Η παρούσα βάση δεδομένων είναι καλύτερη για τις παραλυτικές κωνοτοξίνες. Φαίνεται λογικό να περιμένουμε ότι κάθε δηλητήριο του Conus θα περιέχει κωνοτοξίνες άμεσα παραλυτικές στο θήραμα. Μια προφανής κατηγορία παραλυτικών είναι οι κωνοτοξίνες που αναστέλλουν τους υποδοχείς της ακετυλοχολίνης σε νευρομυϊκές ενώσεις. Τέτοιοι παράγοντες έχουν περιγραφεί σε όλα τα εξεζητημένα είδη ψαριών και είναι πολύ πιθανό να βρίσκονται σε δηλητήρια Conus και σε κυνήγι σκουληκιών και μαλακίων. Εντούτοις, οι τοξίνες στα είδη κυνηγιού ψαριών προφανώς επιλέγονται για να αναστέλλουν τους υποδοχείς ακετυλοχολίνης των ψαριών, ενώ οι αντίστοιχες τοξίνες στα δηλητήρια των ειδών Vermivorous Conus θα αλληλεπιδρούν βέλτιστα με τους υποδοχείς σκουληκιών.[8,16]

Μπορούμε να προεκτείνουμε από τα δεδομένα που έχουν ήδη συλλεχθεί ότι μια κωνοξίνη στόχος σε υποδοχέα ακετυλοχολίνης σε ένα είδος θα έχει μια σημαντικά διαφορετική αλληλουχία από εκείνη σε οποιοδήποτε άλλο είδος Conus. Έτσι, για το γένος στο σύνολό του, θα πρέπει να υπάρχουν κυριολεκτικά πάνω από χίλια διαφορετικά μικρά πεπτίδια που στοχεύουν σε υποδοχείς ακετυλοχολίνης. Φαίνεται πιθανό ότι μεγάλα σύνολα πεπτιδίων Conus θα στοχεύσουν ομοίως σε πολλούς άλλους υποδοχείς και κανάλια ιόντων. Το φαρμακολογικό δυναμικό τέτοιων σημαντικών συλλογών μικρών περιορισμένων πεπτιδίων που στοχεύουν σε μία κατηγορία υποδοχέων είναι τεράστια. Τα πεπτίδια με στόχο τον υποδοχέα ακετυλοχολίνης μπορούν να δοκιμαστούν σε διάφορους υποδοχείς ακετυλοχολίνης σε διαφορετικά φυλογενετικά συστήματα, όπως το σύνολο νευρωνικών υποδοχέων στον εγκέφαλο των θηλαστικών. Ενώ δεν μπορούμε να προβλέψουμε ποια πεπτίδια στη συλλογή θα έχουν υψηλή συγγένεια για ένα συγκεκριμένο υποτύπο υποδοχέα ακετυλοχολίνης του κεντρικού νευρικού συστήματος του θηλαστικού, το φυσικό ρεπερτόριο των κωνοτοξινών θα πρέπει να παρέχει πλούσια πηγή προσδεμάτων για διακρίσεις μεταξύ διαφορετικών υποτύπων στόχων υποδοχέα. Καθώς συλλέγονται περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το σχεδιασμό και τη σύνθεση κωνοτοξίνης στο φυσικό σύστημα, καθίσταται όλο και πιο εφικτό να εφαρμόζονται παρόμοιες στρατηγικές για

31

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

τη δημιουργία μορίων τύπου conotoxin in vitro. Μία ιδιαίτερα ελπιδοφόρα προσέγγιση είναι να συνδυάσει τη βιοχημεία της κωνοξίνης με τις πρόσφατα αναπτυχθείσες μεθόδους διαλογής πεπτιδίων, όπως η τεχνική βιβλιοθήκης fuse-πεπτιδίου fUSE των Scott και Smith.[8,32,36]

Πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι η προσθήκη μίας υπομονάδας κωνοτοξίνης ως σύντηξης σε μια πρωτεΐνη περιβλήματος φάγου δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα του φάγου . Επομένως, είναι εφικτή η κλωνοποίηση δισεκατομμυρίων αλληλουχιών που μοιάζουν με κωνοτοξίνη σε φορείς όπως ο φάγος fUSE και η διαλογή της βιβλιοθήκης συναφών με κωνοτοξίνη μονάδων για αλληλεπίδραση με κλωνοποιημένους στόχους υποδοχέα. Οι φάγοι που παρουσιάζουν συγγένεια για τον στόχο του υποδοχέα μπορούν στη συνέχεια να ενισχυθούν, να προσδιοριστεί η αλληλουχία του ϋΝΑ και να προβλεφθεί το πλούσιο σε δισουλφίδιο κωνοτοξίνη πεπτίδιο που συντίθεται και ελέγχεται για σύνδεση προς τον στόχο του υποδοχέα. Είναι επίσης εφικτές οι δοκιμές τροποποίησης για τον προσδιορισμό των εστιακών σημείων επαφής με τον δέκτη. Οθόνες κωνοτοξινών με οποιαδήποτε επιθυμητή φαρμακολογική ιδιαιτερότητα μπορούν εύκολα να σχεδιαστούν, Le. Μικρά πεπτίδια που έχουν πολύ υψηλή συγγένεια για έναν υποτύπο υποδοχέα αλλά δεν δεσμεύουν καθόλου άλλους στενά σχετικούς υποτύπους. Δεδομένου ότι αυτά τα πεπτίδια θα περιοριστούν διαμόρφωση λόγω πολλαπλών δεσμών δισουλφιδίου, τότε η τρισδιάστατη διαμόρφωσή τους θα μπορούσε να αναλυθεί. Αυτό ανοίγει την πόρτα σε καθαρές χημικές εφαρμογές. Για παράδειγμα, μπορούν να σχεδιαστούν κατάλληλα πεπτιδομιμητικά παράγωγα. Ο συνδυασμός μιας μοριακής γενετικής προσέγγισης που επιτρέπει τον έλεγχο των δισεκατομμυρίων αλληλουχιών με την διορατικότητα που παρέχει το σύστημα κωνοτοξίνης γεφυρώνει τη μοριακή γενετική και τη χημεία με τρόπο που θα επιτρέψει τις συναρπαστικές μελλοντικές εφαρμογές στη φαρμακευτική βιομηχανία και σε πολλούς άλλους τομείς της βιοτεχνολογίας.[8,9,63]

Α.1.7 α- κωνοτοξίνες

Τα σαλιγκάρια κώνου είναι δηλητηριώδη ζώα που μπορούν να βρεθούν σε όλους τους ωκεανούς όπου αναπτύσσουν μία δηλητηριώδη στρατηγική να επιτίθενται στη λεία τους ή να αμύνονται. Το δηλητήριο αυτών των ειδών περιέχει μια

32

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

αναμφισβήτητη πηγή μοναδικών και ισχυρών φαρμακολογικά δραστικών ενώσεων. Οι ενώσεις των πεπτιδίων τους, που ονομάζονται κωνοτοξίνες, δεν είναι ενδιαφέρουσες μόνο για την ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών συνδετών, αλλά είναι επίσης χρήσιμα προς μελέτη για το ευρύ φάσμα των στόχων τους.[21,22]

Μία οικογένεια κωνοτοξίνης ειδικότερα, οι α-κωνοτοξίνες, δρα επί των νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης (nAChRs) των οποίων οι δυσλειτουργίες παίζουν σημαντικούς ρόλους σε παθολογικές νόσους όπως η επιληψία, μυασθενικά σύνδρομα, σχιζοφρένεια, νόσος του Parkinson και η νόσος Alzheimer. [21,22]

Α.1.7.1. Conus Australis

Εδώ ορίζεται μία νέα υποκατηγορία της οικογένειας της α-κωνοτοξίνης. Καθαρίστηκε το δηλητήριο ενός ακόμη ανεξερεύνητου είδους κώνου, δηλ. conus australis, και απομονώθηκε ένα πεπτίδιο 16-αμινοξέων που ονομάζεται α-κωνοτοξίνη AusIA. Το

πεπτίδιο αυτό έχει την τυπική δομή της α-κωνοτοξίνης CC-Xm-C-Xn-C, αλλά και οι δύο βρόχοι (m/n) περιέχουν 5 αμινοξέα, που δεν έχουν περιγραφεί ποτέ ξανά στο παρελθόν. Χρησιμοποιώντας συμβατική ηλεκτροφυσιολογία, έχει ερευνηθεί η απόκριση του συνθετικά κατασκευασμένου σφαιρικά (Ι-ΙΙΙ,ΙΙ-IV) ή κορδέλα (I-IV,II-III) AusIA σε διαφορετικούς υποδοχείς νικοτινικής ακετυλοχολίνης. Ο a7 nAChR ήταν ο μόνος υποδοχέας που βρέθηκε ότι μπορεί να μπλοκαριστεί με παρόμοια ισχύ και από τις δύο πεπτιδικές διαμορφώσεις. Αυτό υποδηλώνει ότι αμφότερα τα A5 / 5 ισομερή κωνοτοξίνης μπορούν να είναι παρόντες στο δηλητήριο αδένα του C. Australis. H φασματοσκοπίας NMR έχει δείξει ότι δεν υπάρχουν δευτεροταγείς δομές που να ορίζουν την τρισδιάστατη τοπολογία του πεπτιδίου. Εξάλλου, η διαμόρφωση κορδέλα, η οποία γενικά θεωρείται ότι είναι μη-φυσική , είναι πιο σταθερή από το σφαιρικό ισομερές. Κατά συνέπεια, τα ευρήματά έχουν δείξει τη σχετική σημασία ταξινόμησης της α-κωνοτοξίνης, που θα μπορούσε να είναι χρήσιμη στο σχεδιασμό των νέων θεραπευτικών ενώσεων.[21,24,84]

33

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.1.15. Το conus australis, κοινή ονομασία του Αυστραλιανού κώνου, είναι ένα είδος θαλάσσιου σαλιγκαριού, ένα μαλάκιο θαλάσσιου γαστερόποδου στην οικογένεια Conidae.[6]

Το δηλητήριο από τα σαλιγκάρια κώνου (genus Conus) προσφέρουν μια μοναδική και εκτεταμένη πηγή χημικής πολυμορφίας καθώς οδηγούνται από εξελικτική πίεση για τη βελτίωση στη σύλληψη των θηραμάτων ή / και την προστασία του είδους. Αυτά τα σαλιγκάρια θεωρούνται ως εξειδικευμένα αρπακτικά τα οποία έχουν αναπτύξει κάποια εξελιγμένη πεπτιδική χημεία και νευροφαρμακολογία με την παραγωγή μίας δομικής και λειτουργικής ποικιλίας νευροτοξινών. Ως εκ τούτου, το δηλητήριο αδένα των κώνων αναγνωρίζεται ως μια αναδυόμενη πηγή θεραπευτικών βασιζόμενων σε πεπτίδια. Η ικανότητά τους να χρησιμοποιούν μια ποικίλη συστοιχία μικρών δισουλφιδίων-γεφυρωμένων πεπτιδίων, που ονομάζονται κωνοπεπτίδια ή κωνοτοξίνες, τα καθιστά πολύ μοναδικά. Μέχρι σήμερα, μόνο 0,1% από δυνητικά 500.000 συστατικών δηλητηρίου έχει λειτουργικά και δομικά διερευνηθεί. Η μεγαλύτερη ομάδα χαρακτηρισμένων Conus sp. πεπτιδίων είναι η οικογένεια της α-κωνοτοξίνης (που ανήκει στην Α-υπεροικογένεια), οι οποίοι είναι εκλεκτικοί ανταγωνιστές του μυϊκού και οι νευρωνικού υποτύπου υποδοχείς νικοτινικής ακετυλοχολίνης (nAChRs). Ενεργούν στη θέση πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης nAChR ως συναγωνιστικοί ανταγωνιστές και είναι από τα μικρότερα κωνοπεπτίδια (12-20 αμινοξέα). Οι άλφα-

κωνοτοξίνες έχουν ένα χαρακτηριστικό πλαίσιο CC-Xm-C-Xn-C και οι τέσσερις αυτές κυστεΐνες μπορούν να αποδώσουν τρεις πιθανές συνδέσεις δισουλφιδίων: σφαιροειδή (I-III, II-IV), κορδέλα (Ι-IV, II-III) και χάντρες (I-II, III-IV). Ωστόσο, οι φυσικές α-

34

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

κωνοτοξίνες συνήθως παρουσιάζουν την σφαιρική διαμόρφωση. Ο αριθμός των υπολειμμάτων που περιλαμβάνονται εντός των δύο βρόχων (m, n) της α-κωνοτοξίνης είναι η βάση για τη διαίρεση σε διάφορες δομικές υποομάδες (m, n: 3/5, 3/6, 4 / 2,4 / 3,4 / 5,4 / 6,4 / 7,4 / 8,5 / 2 και 5/8). Το πιο συχνά αναφερόμενο πλαίσιο είναι η 4/7 υποομάδα.[21,23,28]

Οι νικοτινικοί υποδοχείς ακετυλοχολίνης, είναι μέλος των συνδέτη-πύλη στα κατιονικά κανάλια, διαμεσολαβώντας στη γρήγορη συναπτική μετάδοση. Έχουν διανεμηθεί ευρέως σε όλο το περιφερειακό και κεντρικό νευρικό σύστημα τόσο σε πρωτόγονους όσο και σε εξελικτικά προηγμένους οργανισμούς. Κατά συνέπεια, οι δυσλειτουργίες του nAChR εμπλέκονται σε μια σειρά διαταραχές του κεντρικού νευρικού συστήματος (CNS) όπως επιληψία, νόσος Alzheimer, νόσος του Parkinson, σχιζοφρένεια, ο εθισμός στη νικοτίνη, πόνο, καρκίνο κ.λπ.[21,30,34]

Στα θηλαστικά υπάρχουν 16 διαφορετικές υπομονάδες nAChR: 9 α-υπομονάδες

(α1-7, α9 και α10), 4 β-υπομονάδες (β1-4), καθώς και γ, δ και ε υπομονάδες. Πέντε από αυτές τις υπομονάδες συνδυάζονται για να σχηματίσουν μυς nAChR υποτύπων

(α1β1γδ και α1β1δε) οι οποίες βρίσκονται αποκλειστικά σε νευρομυϊκές συνάψεις, ενώ

οι άλλες υπομονάδες (α2-α10, β2-β4) συναρμολογούνται σε πολυάριθμους ομομερείς (αποκλειστικά α-υπομονάδες) ή ετερομερείς ( α- και β-υπομονάδες) νευρωνικούς υποτύπους nAChR. Η συναρμολόγηση των διαφορετικών πενταμερών σχηματίζει ένα συγκρότημα ποικίλων υποτύπων nAChR με διαφορετικές φαρμακολογικές και βιοφυσικές ιδιότητες.[21,86,88]

Από όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη κωνοτοξίνη που έχει χαρακτηριστεί από τα είδη που έχουν βρεθεί στον Ινδικό Ωκεανό κοντά στο Ταμίλ Ναντού της Ινδίας. Η φασματοσκοπία NMR έχει δείξει ότι δεν υπάρχουν δευτεροταγείς δομές που να ορίζουν την τρισδιάστατη τοπολογία των πεπτιδίων. Επιπλέον, η διαμόρφωση κορδέλα, η οποία θεωρείται ότι είναι μη-φυσική, είναι πιο σταθερό από τη σφαιρική ισομορφή.[24,27,30]

35

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.2. ΠΕΠΤΙΔΙΚΗ ΣΥΝΘΕΣΗ Α.2.1. Εισαγωγή Οι πρωτεΐνες, όπως ακριβώς υποδηλώνει και η ελληνική τους ρίζα, είναι ενώσεις πρωταρχικής σημασίας για τη συγκρότηση και διατήρηση της ζωής. Απαντούν σε όλα τα βιολογικά συστήματα, ρυθμίζουν τις αναρίθμητες λειτουργίες τους, εμπλέκονται στις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου, επισήμανσης, επούλωσης και ανοσοαπόκρισης. Ένζυμα και αναστολείς τους, ορμόνες, μεταγραφικοί παράγοντες είναι όλες πρωτεΐνες στη φύση τους και οποιαδήποτε δυσλειτουργία τους οδηγεί σε νοσηρές καταστάσεις. Δικαίως λοιπόν οι πρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί (ενώσεις της ζωής).[72]

Η ιστορία της πεπτιδικής χημείας ξεκίνησε με τον Emil Fisher το 1901, όταν συνέθεσε το πρώτο διπεπτίδιο, γλυκυλ-γλυκίνη. Λίγο παραπάνω από 100 χρόνια μετά, η πεπτιδική χημεία έχει εξελιχθεί δραματικά για να φτάσουμε σήμερα να έχουμε πρόσβαση σε πάρα πολλές πρωτεΐνες ανοίγοντας νέους ορίζοντες στο χώρο της φαρμακευτικής. Την επαναστατική εισαγωγή του στερεού υποστρώματος και της συνδυαστικής χημείας ήρθαν να συμπληρώσουν σύγχρονες πεπτιδικές τεχνικές και να αποδείξουν ότι μπορούν να συναγωνιστούν τις βιοτεχνολογικές μεθόδους επιτρέποντας τη χημική σύνθεση μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών. Έτσι πιο ευέλικτες, οι χημικές μέθοδοι δεν περιορίζονται στα πλαίσια του ριβοσώματος και είναι σε θέση να παρέχουν τη δυνατότητα εισαγωγής φυσικών και μη αμινοξέων καθώς και χημικών τροποποιήσεων στα πρωτεϊνικά μόρια που μας επιτρέπουν να διεισδύσουμε σε μοριακό επίπεδο, να κατανοήσουμε τις πολύπλοκες δράσεις τους και να επέμβουμε ρυθμίζοντας τις λειτουργίες τους.[71,72]

Α.2.2. Πεπτίδια- ανινοξέα-πεπτιδικός δεσμός Χημικώς οι πρωτεΐνες είναι υψηλού βαθμού βιοπολυμερή που απαρτίζονται από πολυπεπτιδικές αλυσίδες, δομικά συστατικά των οποίων είναι τα 20 φυσικώς απαντώμενα αμινοξέα. Στην εικόνα Α.2.1, φαίνεται δομή ενός α-αμινοξέος. Στο κέντρο του τετραέδρου βρίσκεται ο α-άνθρακας, ενώ οι 4 κορυφές του καταλαμβάνονται από μια αμινομάδα, μια καρβοξυλομάδα, ένα άτομο υδρογόνου και μία πλευρική αλυσίδα, χαρακτηριστική για το κάθε αμινοξύ.[71]

36

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.2.1. Δομή α-αμινοξέος. 19 από τα 20 αμινοξέα είναι πρωτοταγείς αμίνες, εκτός της Pro που είναι δευτεροταγής, με το άτομο αζώτου και τον α-άνθρακα να αποτελούν τμήμα ενός πυρρολιδινικού δακτυλίου. Με εξαίρεση τη Gly, σε όλα τα αμινοξέα το α-άνθρακα είναι ασύμμετρο και επομένως μπορούν να απαντήσουν σε δύο εναντιομερείς μορφές D- και L-, ωστόσο στη φύση συναντάται μόνο το L- ισομερές.

Εικόνα Α.2.2. Σχηματισμός ενός πεπτιδικού δεσμού Η ικανότητα των αμινοξέων να πολυμερίζονται και να σχηματίζουν πεπτίδια και πρωτεΐνες οφείλεται στην ύπαρξη των δύο δραστικών ομάδων στο μόριο τους, της βασικής αμινομάδας και της όξινης καρβοξυλομάδας, αντίδραση μεταξύ των οποίων με απόσπαση ενός μορίου νερού οδηγεί στη δημιουργία ενός ομοιοπολικού αμιδικού δεσμού, γνωστού ως πεπτιδικού δεσμού.

37

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ο πεπτιδικός δεσμός απαντάται σε δύο δομές συντονισμού, οπότε και εμφανίζει σημαντικό χαρακτήρα διπλού (⁓40%), όπως φαίνεται στην εικόνα Α.2.3, με όλα τα συμμετέχοντα άτομα C,O, N, H να βρίσκονται στο ίδιο επίπεδο, ιδιότητα στην οποία αποδίδεται και η παρατηρούμενη γεωμετρική ισομέρεια cis- trans. Από τις δύο διαμορφώσεις η ενεργειακά ευνοούμενη είναι η trans, με μία αναλογία trans/cis περίπου 1000:1, με εξαίρεση τον πεπτιδικό δεσμό X-Pro, όπου η τάση να επικρατήσει η cis διαμόρφωση αυξάνεται περισσότερο από 300 φορές.[71,72]

Α.2.3. Εισαγωγή στην πεπτιδική χημεία

Η βασική ιδέα πάνω στην οποία στηρίχτηκε ο Emil Fischer για τη χημική σύνθεση πεπτιδίων ήταν να ‘μπλοκαριστεί’ η καρβοξυλομάδα ενός αμινοξέος και η αμινομάδα ενός δεύτερου. Στη συνέχεια η ενεργοποίηση της ελεύθερης καρβοξυλομάδας θα οδηγούσε στον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού και με εκλεκτική απόσπαση των προστατευτικών των προστατευτικών ομάδων θα απελευθερωνόταν το διπεπτίδιο. Ο Fischer δεν βρήκε ποτέ μια κατάλληλη άμινο- προστατευτική ομάδα που να μπορεί να απομακρύνεται, κάτι που ήρθαν στη συνέχεια να καταφέρουν οι Bermann και Ζέρβας με επιτυχία. Από τότε μέχρι σήμερα η πεπτιδική χημεία έχει εξελιχθεί δραματικά, ωστόσο διέπεται στην πραγματικότητα από τις ίδιες εκείνες πρώτες αρχές.[72]

Α.2.4. Σύνθεση πεπτιδίων κατά στάδια (step by step synthesis)

Στη σύνθεση πεπτιδίων κατά στάδια η πεπτιδική αλυσίδα, ξεκινώντας από ένα αμινοξύ, οικοδομείται με την προσκόλληση ενός αμινοξέος τη φορά, με κατεύθυνση από το C- προς το N- άκρο. Όλες οι δραστικές ομάδες που δεν συμμετέχουν στο σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού προστατεύονται για την αποφυγή παραπροϊόντων. Μετά τη σύζευξη των αμινοξέων απομακρύνεται εκλεκτικά μόνο εκείνη η ομάδα που επιβάλλει η σύνθεση ώστε να είναι δυνατή η επέκταση της πεπτιδικής αλυσίδας, μέχρι την ολοκλήρωσή της όπου και απελευθερώνεται το πεπτίδιο από όλες τις προστατευτικές του ομάδες. Η σύνθεση πεπτιδίων κατά στάδια περιορίζεται σε πεπτίδια μικρού μεγέθους.

38

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι ανάγκες για σύνθεση μεγαλύτερων πεπτιδίων πέρα από τα όρια που τοποθετεί η βήμα προς βήμα μεθοδολογία οδήγησαν στην ανάπτυξη τεχνικών όπως η συμπύκνωση πεπτιδικών τμημάτων (fragment condensation) και η χημική σύνδεση (chemical ligation), που θα συζητηθούν εκτενέστερα σε επόμενες παραγράφους.[71,72]

Α.2.5. Σύνθεση σε διάλυμα

Η σύνθεση πεπτιδίων, όπως περιγράφτηκε παραπάνω, μπορεί να πραγματοποιηθεί τόσο σε υγρή (liquid phase peptide synthesis, LPPS) όσο και σε στερεή φάση (solid phase peptide synthesis, SPPS).

Κάτα τη σύνθεση σε υγρή φάση όλες οι διεργασίες επιμήκυνσης της πεπτιδικής αλυσίδας λαμβάνουν χώρα σε διάλυμα. Πλεονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν ο κοθαρισμός των ενδιάμεσων προϊόντων και η ταυτοποίησή τους πριν χρησιμοποιηθούν στο επόμενο βήμα της σύνθεσης, εξασφαλίζοντας προϊόντα υψηλής καθαρότητας. Ωστόσο είναι εξαιρετικά χρονοβόρα και επίπονη διαδικασία και έτσι με την εισαγωγή του σετερεού υποστρώματος το 1963 από τον Bruce Merrifield σιγά σιγά εγκαταλείφθηκε και σήμερα σχετίζεται σχεδόν μόνο με την τεχνική της τμηματικής συμπύκνωσης.[71]

39

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.2.3. Σύνθεση σε διάλυμα[71]

Α.2.6 Σύνθεση σε στερεή φάση

Στην σύνθεση πεπτιδίων σε στερεή φάση η πεπτιδική αλυσίδα αναπτύσσεται ενώ βρίσκεται δεσμευμένη σε ένα στερεό υπόστρωμα (πολυμερές). Μπορούν να χρησιμοποιηθούν περίσσειες αντιδραστηρίων για να γίνει η αντίδραση γρηγορότερη και πιο ποσοτική. Οι περίσσειες και τα διαλυτά παραπροϊόντα απομακρύνονται στη συνέχεια εύκολα και γρήγορα με απλές διηθήσεις. Δεν είναι βέβαια δυνατή η απομάκρυνση παραπροϊόντων επίσης δεσμευμένων στο στερεό υπόστρωμα, τα οποία παραμένουν μέχρι το τέλος της σύνθεσης. Όμως η ταχύτητα και η απλότητα της μεθόδου, καθώς και η δυνατότητα αυτοματισμού της, την κατατάσσουν στη βασικότερη τεχνική πεπτιδικής σύνθεσης. [71]

40

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.2.4. Σύνθεση σε στερεή φάση[71]

Α.2.7. Το στερεό υπόστρωμα

Το πρώτο πολυμερές που χρησιμοποίησε ο Merrifield ήταν ένα συμπολυμερές στυρολίου-διβινυλβενζολίου (PS-DVB) με ποσοστό DVB 2%, το οποίο μειώθηκε όμως σε 1% για να δώσει ένα συμπολυμερές με καλύτερες διογκωτικές ικανότητες. Από τον Merrifield και μετά προτάθηκαν και άλλου τύπου πολυμερή όπως τα πολυαμιδικού, τα οποία ωστόσο δεν επικράτησαν λόγω των μικρών υποκαταστάσεων και μειωμένων διογκωτικών ιδιοτήτων τους. Έτσι οι ρητίνες που χρησιμοποιούνται σήμερα στην πεπτιδική σύνθεση είναι κατά κανόνα πολυμερή PS-DVB που φέρουν δραστικές ομάδες, οι οποίες κατανέμονται τόσο στο εξωτερικό όσο και στο εσωτερικό των πόρων του πολυμερούς με αποτέλεσμα, ανάλογα με την πολικότητα, οι πόροι του πολυμερούς

41

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

να διογκώνονται σε διάφορους διαλύτες. Το σύνολο σχεδόν των αντιδράσεων λαμβάνει χώρα μέσα στους πόρους του πολυμερούς και ακριβώς για το λόγο αυτό οι αντιδράσεις επιλέγονται να γίνονται με διαλύτες που διογκώνουν την ρητίνη. [71,72]

Στις συνθήκες της πεπτιδικής σύνθεσης το στερεό υπόστρωμα θα πρέπει να παραμένει σταθερό, δηλαδή δεν θα πρέπει να διασπάται ο δεσμός μεταξύ μορίου και πολυμερούς. Το πολυμερές θα πρέπει να διαθέτει ικανοποιητικό ποσοστό δραστικών ομάδων, ώστε να μπορεί να συνδεθεί η πεπτιδική αλυσίδα και μετά το τέλος της σύνθεσης να αποδεσμευτεί εύκολα και με ικανοποιητική απόδοση. Επιπλέον θα πρέπει να επιτρέπει την άμεση και χωρίς στερεοχημικούς περιορισμούς αλληλεπίδραση της αναπτυσσόμενης αλυσίδας και των αντιδραστηρίων. Τέλος, καλείται να ελαχιστοποιεί την αλληλεπίδραση ανάμεσα στις δεσμευμένες αλυσίδες.

Σήμερα έχουν αναπτυχθεί πάρα πολλές ρητίνες και ανάλογα με την χαρακτηριστική τους ομάδα ή την ενδιάμεση ομάδα- συνδέτη (linker), η οποία έχει προσδεθεί στο πολυμερές με κάποια χημική τροποποίηση, καθορίζουν αν το τελικό πεπτίδιο θα απελευθερωθεί με το C- τελικό του άκρο ως οξύ, αμίδιο, ή τροποποιημένο (πχ. Εστέρας). Οι συνθήκες διάσπασης επίσης υποδεικνύουν αν το πεπτίδιο θα απομονωθεί στην πλήρως αποπροσταυμένη μορφή του ή διατηρώντας τις πλάγιες προστατευτικές του ομάδες.

Ρητίνες που απελευθερώνουν πεπτίδια-οξέα συνήθως είναι πολυμερείς αλκοόλες και πολυμερή αλογονίδια (κατά κανόνα χλωρίδια) και επομένως η δέσμευση του C- τελικού αμινοξέος με τη ρητίνη γίνεται μέσω εστερικού δεσμού με αντίδραση της καρβοξυλομάδας του αμινοξέος απευθείας με την χαρακτηριστική ομάδα. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα τέτοιων ρητινών φαίνονται στην παρακάτω εικόνα Α.2.6.

42

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.2.5. Αντιπροσωπευτικές ρητίνες που απελευθερώνουν πεπτίδια-οξέα.[71]

Α.2.8. Προστατευτικές ομάδες

Απαραίτητη προϋπόθεση για να λάβει χώρα ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού εκλεκτικά, χωρίς παράπλευρες αντιδράσεις, αποτελεί η προστασία όλων των δραστικών ομάδων που δεν συμμετέχουν στο δεσμό. Όλες οι προστατευτικές ομάδες, πλευρικές και μη, θα πρέπει να εισάγονται όσο το δυνατόν πιο εύκολα, εκλεκτικά και να είναι φθηνές. Παράλληλα θα πρέπει να παραμένουν σταθερές κάτω από τις συνθήκες της δεδομένης αντίδρασης και φυσικά όταν απαιτείται η απομάκρυνση τους αυτή να γίνεται εύκολα, γρήγορα και ποσοτικά χωρίς τον σχηματισμό παραπροϊόντων. Ειδικά όσον αφορά την προστασία της α-αμινομάδας θα πρέπει να είναι δυνατή η απομάκρυνση της εκλεκτικά χωρίς να επηρεάζονται οι προστατευτικές ομάδες των πλευρικών αλυσίδων. [71]

43

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.2.9. Σχήματα προστασίας

Στην πεπτιδική σύνθεση χρησιμοποιούνται δύο βασικά σχήματα προστασίας: α. Boc/Bzl και β.Fmoc/tBu, οπότε ανάλογα με τη χρήση τους συχνά γίνεται λόγος για Boc- και Fmoc- χημεία. Στην Boc- χημεία η προστατευτική ομάδα που χρησιμοποιείται για την παροδική προστασία της α-αμινομάδας είναι η tert-βουτυλοξυ-καρβονυλ- ομάδα (Boc), η οποία διασπάται κάτω από όξινες συνθήκες (>40% TFA), ενώ οι πλάγιες προστατευτικές ομάδες είναι βενζύλ-τύπου παράγωγα (Bzl) και απομακρύνονται σε ισχυρά όξινο περιβάλλον (υγρό HF). Παρόλο που η Boc/Bzl μεθοδολογία πλεονεκτεί στη σύνθεση δύσκολων πεπτιδίων καθώς η χρήση του TFA διασπά σχηματιζόμενες δευτεροταγείς δομές οδηγώντας σε ποσοτικότερες αντιδράσεις αποπροστασίας της αμινομάδας, η επανειλημμένη χρήση ισχυρών και τοξικών οξέων την καθιστά δύσχρηστη και πιο δαπανηρή ιδιαίτερα όταν εφαρμόζεται σε μεγάλη κλίματα. Σε αντίθεση, το Fmoc/tBu σχήμα προστασίας στηρίζεται σε ορθογωνικές συνθήκες διάσπασης της Να- και των πλάγιων προστατευτικών ομάδων. Έτσι, ως Να- προστατευτική ομάδα χρησιμοποιείται η 9-φλουορενυλ-μεθοξυ-καρβονυλ-ομάδα (Fmoc), η οποία διασπάται με επίδραση βάσεων, και ως πλευρικές προστατευτικές, οι ευαίσθητες σε οξέα (TFA), tert-βουτυλοξυ-(tBu) και τριτυλ-τύπου (Trt) ομάδες. Η χρήση ηπιότερων αντιδραστηρίων σε συνδυασμό με την απλότητα της μεθόδου καθιερώνουν την Fmoc/tBu στην πιο δημοφιλή μεθοδολογία στην SPPS. Στην εικόνα Α.2.7 που ακολουθεί φαίνονται οι συνήθεις ομάδες που χρησιμοποιούνται στην Fmoc- χημεία, οι πλευρικές αλυσίδες που αυτές προστατεύουν καθώς και οι συνθήκες διάσπασής τους.[71,72]

44

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.2.6. Προστατευτικές ομάδες στην fmoc/tBu μεθοδολογία.[71]

Α.2.9.1. Οι Να προστατευτικές ομάδες

Η προστασία της αμινομάδας επιτυγχάνεται ελαττώνοντας τον πυρηνόφιλο χαρακτήρα του αζώτου, ώστε να αποφευχθεί η αντίδρασή του με ενεργοποιημένα καρβόξυ παράγωγα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται ομάδες οι οποίες μειώνουν την ηλεκτρονιακή πυκνότητα του αζώτου μέσω μεσομέρειας (π.χ. ουροθενικού τύπου ομάδες, όπως Boc, Fmoc) ή μέσω επαγωγικού φαινομένου (π.χ. ο- νιτροφαινυλσουλφενυλομάδα, Nps) ή μειώνουν τη δραστικότητα της αμινομάδας λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης (π.χ. τριτυλομάδα, Trt). Οι σημαντικότερες και ευρύτερα χρησιμοποιούμενες είναι οι ουρεθανικού τύπου.

45

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.2.7. Αμινοπροστατευτικές ομάδες (Α) ουροθενικού τύπου, (Β) ο- νιτροφαινυλσουλφενυλομάδα, (Γ) Τριτυλ-τύπου.[71,72]

Πίνακας Α.2.1.: Οι Να προστατευτικές ομάδες.

Να προστατευτική ομάδα Τύπος Συνθήκες Βιβλιογραφία Απομάκρυνσης Τριφαινυλμεθυλ- ή τριτυλ- (Trt)

H2/Pd, Helferich et al.,1925

ΤFA,

Τριτυλ AcOH Zervas et al., 1956 C

9-φλουρενυλ-μεθοξυ- καρβονυλ-(Fmoc) Δευτεροταγείς Caprino et al., 1970, αμίνες ή αλκάλια 1972 (π.χ. πιπεριδίνη σε

DMF) H CH2 OC O

Tριτoταγής βουτυλοξυ- Ουροθενικού καρβονυλ- (Boc) ΤFA, CH3 O McKay et al., 1957 HCl / AcOH 3 C OCH C

CH3

46

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

9-φλουρενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα (Fmoc)

Η εισαγωγή της Fmoc-ομάδας μπορεί να επιτευχθεί με επίδραση Fmoc-Cl ή Fmoc-ΟSu στο αμινοξύ σε μίγμα αλκαλικού διαλύματος/διοξάνης (Carpino και Han, 1970, 1972, Paquet, 1982) (Εικόνα Α.2.9). Επίσης έχει χρησιμοποιηθεί και η σιλυλ- μέθοδος (Bolin et al., 1989) κατά την οποία αρχικά σχηματίζεται ο σιλυλεστέρας του αμινοξέος, που στη συνέχεια αντιδρά με Fmoc-Cl σε DCM παρουσία DIPEA και τελική υδρόλυση του σιλυλεστέρα προς το Fmoc- αμινοξύ.

R R 10% Na2CO3/διοξάνη Fmoc CH C OH Fmoc-OSu + NH2 CH C OH NH O O SuOH Εικόνα Α.2.8.: Εισαγωγή της Fmoc-ομάδας με χρήση Fmoc-ΟSu.

Η απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας γίνεται σε βασικές συνθήκες με β- απόσπαση. Συνήθως χρησιμοποιείται διάλυμα 20-50% πιπεριδίνης (δευτεροταγής αμίνη) σε DMF.

Εικόνα Α.2.9.: Μηχανισμός διάσπασης της Fmoc ομάδας με πιπεριδίνη.

Τριτοταγής βουτυλοκαρβονυλομάδα (Boc) Η εισαγωγή της Boc-ομάδας στο αμινοξύ γίνεται εύκολα κυρίως με τριτοταγή

βουτυλοξυκαρβονυλ-ανυδρίτη (Boc2O) και μια βάση (Morroder et al., 1976). Η ομάδα Boc μπορεί να συνδυαστεί με Bzl- τύπου πλάγιες προστατευτικές ομάδες λόγω της σταθερότητάς της σε συνθήκες καταλυτικής υδρογονόλυσης. Η απομάκρυνσή της

47

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

γίνεται σε ήπια όξινες συνθήκες χρησιμοποιώντας συνήθως TFA σε διχλωρομεθάνιο ή HCl σε οξικό οξύ.

Εικόνα Α.2.10.: Μηχανισμός διάσπασης της Boc-ομάδας με επίδραση οξέων.

Η Boc-ομάδα όπως και η Fmoc-ομάδα συνδυάζουν την εύκολη εισαγωγή, την επαρκή προστασία της αμινομάδας, την εύκολη απομάκρυνση αλλά και την επαρκή προστασία του χειρόμορφου κέντρου του αμινοξέος από ρακεμίωση. Συγκριτικά, η Boc-ομάδα έχει το πλεονέκτημα πως συνδυάζεται με Bzl-τύπου πλάγιες προστατευτικές ομάδες λόγω της σταθερότητας της σε συνθήκες καταλυτικής υδρογόνωσης. Σημαντικό μειονέκτημα της όμως είναι ότι κατά την απομάκρυνση της με οξέα τα σχηματιζόμενα τριτοταγή βουτυλοκατιόντα καθώς και ο τριτοταγής βουτυλεστέρας μπορούν να προσβάλλουν τις πυρηνόφιλες θέσεις του πεπτιδίου, όπως οι δραστικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων Trp, Tyr, Met. Αντίθετα η Fmoc-ομάδα μπορεί να συνδυαστεί με πλάγιες προστατευτικές ομάδες που απομακρύνονται σε όξινες συνθήκες (Ζ-, Boc- και tBu-) ενώ τα χημικά είδη που παράγονται κατά τη διάρκεια της απομάκρυνσης της δεν προκαλούν παράπλευρες αντιδράσεις.[71]

Α.2.9.2. Οι καρβοξυπροστατευτικές ομάδες

Οι καρβοξυλομάδες των αμινοξέων είναι λιγότερο δραστικά πυρηνόφιλα από τις αμινομάδες τους. Ωστόσο η προστασία αυτών που δε συμμετέχουν στον πεπτιδικό

48

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

δεσμό είναι απαραίτητη για λόγους αύξησης της διαλυτότητας σε οργανικούς διαλύτες, για ευκολότερη απομόνωση των προϊόντων και ελαχιστοποίηση της ρακεμίωσης. Η προστασία των καρβοξυλομάδων γίνεται με τη μετατροπή τους σε εστέρες. Στον παρακάτω πίνακα αναγράφονται κάποιες από τις καρβοξυπροστατευτικές ομάδες.

Πίνακας Α.2.2.: Οι καρβοξυ-προστατευτικές ομάδες.

Καρβοξυ-προστατευτική ομάδα Συνθήκες απομάκρυνσης Βιβλιογραφία Τριτυλ-βουτυλ-(tBu) CH3 TFA, ισχυρά οξέα Kappeler and Schwyzer, 1961 CH C 3

CH3

Βενζυλ-(Bzl) H2/Pd, HBr/AcOH, Cipera and Nichols. 1995 CH2 HF

Διφαινυλμεθυλ-(Dpm) Hardegger et al., 1948 H2/Pd,

TFA Hiskey and Adams, 1965

Α.2.9.3. Οι πλάγιες προστατευτικές ομάδες

Η προστασία των πλάγιων δραστικών ομάδων των αμινοξέων είναι απαραίτητη για την αποφυγή παράπλευρων αντιδράσεων κατά τη διάρκεια σύνθεσης του πεπτιδίου. Προστασία της ε-αμινομάδας της Λυσίνης (Lys)

Η προστασία της ε-αμινομάδας της Lys είναι απαραίτητη, προς αποφυγή παραγωγής διακλαδισμένων πεπτιδίων, από την αντίδραση της με το ενεργοποιημένο καρβοξυπαράγωγο. Οι ομάδες που χρησιμοποιούνται για την πλευρική προστασία της Lys είναι η Boc- και η Mtt-. H απομάκρυνση της Μtt ομάδας γίνεται σε πολύ ήπια όξινες συνθήκες και μπορεί να συνδυαστεί με tBu-, Βοc-, Pbf-, Pmc- προστατευτικές ομάδες καθώς και να απομακρυνθεί εκλεκτικά σε σχέση με αυτές παρουσία τριαιθυλσιλανίου (TES) για τη δέσμευση των τριτυλοκατιόντων. Πίνακας Α.2.3.: Προστατευτικές ομάδες της ε-αμινομάδας της Lys.

49

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Συνθήκες Προστατευτική ομάδα Lys Βιβλιογραφία αποπροστασίας tert-βουτυλοξυ- καρβονυλομάδα-(Boc) 90% v/v TFA, 30min Chang et al., 1980

4-μεθυλ-τριτυλομάδα -(Mtt) 1% v/v TFA σε DCM, 30min Aletras et al., 1995 AcOH-TFE-DCM (1:2:7), 1h

Προστασία της υδροξυλομάδας των Σερίνη (Ser), Θρεονίνη (Thr) και τυροσίνη (Tyr)

Η προστασία των υδροξυλομάδων αυτών των αμινοξέων είναι απαραίτητη για την αποφυγή αλκυλίωσης τους κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης. Η προστασία τους επιτυγχάνεται με τη μετατροπή τους σε αιθέρα. Οι ομάδες που χρησιμοποιούνται είναι η tBu- και η Τrt- ομάδα. Για τη Tyr χρησιμοποιείται και η Clt.

50

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Πίνακας Α.2.4.: Προστατευτικές ομάδες της υδροξυλομάδας των Ser, Thr, Tyr.

Προστατευτική ομάδα Συνθήκες Βιβλιογραφία Ser,Thr,Tyr αποπροστασίας tert-βουτυλομάδα-(tBu) Beyerman και Bontekoe, 1961 90% v/v TFA, 30min

Callahan et al., 1963

τριτυλομάδα-(Trt)

(R1=H) 2-χλωροτριτυλομάδα-(Clt)

(R1=Cl) 1-5% v/v TFA σε Barlos et al., 1991,1998 DCM, 2-5min

Προστασία της καρβοξυλομάδας του Ασπαραγινικού (Asp) και του Γλουταμινικού (Glu) Αν και η καρβοξυλομάδα δεν είναι νουκλεόφιλη, είναι σημαντική η προστασία της προς αποφυγή διακλαδιδμένων πεπτιδίων. Ο συνήθης τρόπος προστασίας της καρβοξυλομάδας είναι η εστεροποίηση της. Ως προστατευτική ομάδα χρησιμοποιείται η tert-βουτυλομάδα (tBu).

51

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Πίνακας Α.2.5.: Προστατευτική ομάδα της καρβοξυλομάδας των Asp, Glu.

Προστατευτική ομάδα Asp, Glu Συνθήκες αποπροστασίας Βιβλιογραφία

tert-βουτυλομάδα-(tBu)

Schwyzer και 90% v/v TFA, 30min Dietrich, 1961

Προστασία του πλευρικού αμιδίου των Ασπαραγίνη (Asn) και Γλουταμίνη (Gln)

Για την αποφυγή παράπλευρων αντιδράσεων το αμίδιο της Asn και Gln συνήθως προστατεύεται με Trt- ομάδα.

Πίνακας Α.2.6.: Προστατευτική ομάδα του αμιδίου της Asn και της Gln.

Προστατευτική ομάδα Asn, Gln Συνθήκες αποπροστασίας Βιβλιογραφία τριτυλομάδα-(Trt)

Sieber και 90% v/v TFA, 30-60min Riniker, 1991

Προστασία του ιμιδαζολίου της Ιστιδίνης (His)

Η προστασία του ιμιδαζολίου της His είναι απαραίτητη λόγω του ότι μπορεί να ακυλιωθεί από ενεργοποιημένα καρβοξυπαράγωγα. Επίσης, παρουσιάζει υψηλά ποσοστά ρακεμίωσης λόγω της ηλεκτραρνητικότητας του ιμιδαζολικού δακτυλίου και λόγω του πυρηνόφιλου χαρακτήρα του π-ατόμου του αζώτου.

52

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Για την προστασία του ιμιδαζολίο της His χρησιμοποιείται κυρίως η Trt- ομάδα, η οποία εντοπίζεται στο τ-άτομο αζώτου μειώνοντας επίσηςτον πυρηνόφιλο χαρακτήρα του π-αζώτου με στερεοχημική παρεμπόδιση. Πίνακας Α.2.7.: Προστατευτική ομάδα του ιμιδαζολίου της His.

Προστατευτική ομάδα His Συνθήκες αποπροστασίας Βιβλιογραφία τριτυλομάδα-(Trt)

50% v/v TFA σε DCM, Sieber και Riniker, 1987 30min

Προστασία της γουανιδινομάδας της Αργινίνης (Arg)

Η γουανιδινομάδα έχει ισχυρά βασικό και πυρηνόφιλο χαρακτήρα, με αποτέλεσμα εύκολα να ακυλιώνεται κατά τη διάρκεια της πεπτιδικής σύνθεσης. Επίσης, το Νδ μπορεί να προσβάλλει την ενεργοποιημένη καρβοξυλομάδα σχηματίζοντας δ λακτάμη. Συνεπώς ιδανική θα ήταν η προστασία και των τριών ατόμων αζώτου της γουανιδινομάδας, συνήθως όμως προστατεύεται το ένα ή τα δύο άτομα. Ως προστατευτικές ομάδες χρησιμοποιούνται η Pbf ή η Pmc. To μειονεκτήμα τους είναι ότι τα κατιόντα που δημιουργούνται κατά την απομάκρυνσή τους προσβάλουν τις δραστικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων Trp, Tyr και Met. Για να παρεμποδιστούν αυτές οι παράπλευρες αντιδράσεις χρησιμοποιούνται στο διάλυμα αποπροστασίας κατάλληλες ενώσεις (scavengers) που δεσμεύουν τα ηλεκτρόφιλα είδη που παράγονται.

53

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Πίνακας Α.2.8.: Προστατευτικές ομάδες της γουανιδινομάδας της Arg.

Προστατευτική ομάδα Arg Συνθήκες αποπροστασίας Βιβλιογραφία 2,2,4,6,7-πενταμεθυλ-διυδρο- βενζοφουραν-5-σουλφονυλ- ομάδα-(Pbf) 95% v/v TFA, 30min (1.2-1.4 ταχύτερη από την Carpino et al., 1993 Pmc)

2,2,5,7,8-πενταμεθυλχρομαν-6- σουλφονυλ-ομάδα-(Pmc) 50% v/v TFA σε DCM, 1h Ramage και Green, TFA-ανισόλη (9:1), 30min 1987 TFA-ανισόλη-EDT-EMS Ramage et al., 1991 (95:3:1:1), 1.5h

Προστασία του ινδολικού δακτυλίου της Τρυπτοφάνης (Trp)

Οι προστατευτικές ομάδες που συνδέονται με το άτομο του Ν του ινδολικού δακτυλίου, έλκουν ηλεκτρόνια απενεργοποιώντας το αρωματικό σύστημα, δηλαδή τον ινδολικό δακτύλιο, το οποίο μπορεί να προσβληθεί από ηλεκτρόφιλα κατιόντα τα οποία μπορεί να σχηματιστούν κατά την αποπροστασία, με επίδραση οξέων. Η προστατευτική ομάδα που χρησιμοποιείται είναι η Boc- (White, 1992). Σε περίπτωση που δεν υπάρχει προστασία, οι παράπλευρες αντιδράσεις περιορίζονται με τη χρήση scavengers, ανισόλη ή 1,2-αιθανοδιθειόλη (Lundt et al., 1978, Sharp et al., 1973), στο διάλυμα της τελικής αποπροστασίας.

54

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Πίνακας Α.2.9.: Προστατευτική ομάδα του ινδολικού δακτυλίου της Trp.

Προστατευτική ομάδα Trp Συνθήκες αποπροστασίας Βιβλιογραφία tert-βουτυλοξυ- καρβονυλομάδα-(Boc) 90% v/v TFA, 1h ακολουθούμενη από 1% aq. White, 1992 TFA, 1-2h

Προστασία της σουλφυδρυλομάδας της Κυστεΐνης (Cys) Ελεύθερη η σουλφυδρυλομάδα, ως καλύτερο πυρηνόφιλο απο τις α-αμινομάδες των αμινοξέων, θα αντιδράσει με τα ενεργοποιημένα καρβοξυπαράγωγα, σχηματίζοντας διακλαδισμένα προϊόντα. Για την προστασία της χρησιμοποιούνται οι Trt- και Mmt- ομάδες. Κατά την αποπροστασία, το καρβοκατιόν που θα σχηματιστεί, είναι πιθανό να ξαναπροστεθεί στη θειολομάδα, γι’ αυτό κρίνεται απαραίτητη η χρήση scavengers, όπως η 1,2- αιθανοδιθειόλη. Πίνακας Α.2.10.: Προστατευτικές ομάδες της σουλφυδρυλομάδας της Cys.

Προστατευτική ομάδα His Συνθήκες αποπροστασίας Βιβλιογραφία

τριτυλομάδα-(Trt)

90% v/v TFA, 30-60 min Hiskey et al., 1966

4-μεθοξυ-τριτυλομάδα-(Mmt) 0.5% v/v TFA σε DCM-TES (95:5), 30-60 min Barlos et al., 1996

3% v/v TFA, 5-10 min

55

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.2.10. Μέθοδοι σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού

Ο πεπτιδικός δεσμός για να σχηματιστεί απαιτεί υψηλή ενέργεια. Η σύζευξη λοιπόν δυο αμινοξέων απαιτεί την ηλεκτρόφιλη ενεργοποίηση της α-καρβοξυλομάδας, έτσι ώστε να καταστεί αυτός ο άνθρακας πιο ηλεκτρόφιλος και άρα πιο επιδεκτικός στην πυρηνόφιλη προσβολή από την α-αμινομάδα. Η επιλογή της μεθόδου σύζευξης γίνεται έτσι ώστε ο πεπτιδικός δεσμός να σχηματίζεται κάτω από ήπιες συνθήκες, γρήγορα, με υψηλή απόδοση και οι παράπλευρες αντιδράσεις και το ποσοστό ρακεμίωσης του ενεργοποιημένου αμινοξέος να περιορίζονται στο ελάχιστο δυνατό. Ανάμεσα στα πιο δημοφιλή αντιδραστήρια ενεργοποίησης που χρησιμοποιούνται στη σύγχρονη πεπτιδική χημεία διακρίνονται τα καρβοδιιμίδια, τα φωσφονικά και τα ανάλογά τους γουανιδινικά, σε συνδυασμό με πρόσθετα αντιδραστήρια υδροξυλαμινικού τύπου.

Α.2.11. Μέθοδος των καρβοδιϊμιδίων

Η χρήση των καρβοδιϊμιδίων ως αντιδραστηρίων σύζευξης έγινε για πρώτη φορά το 1955 από τους Sheehan και Hess. Τα πιο γνωστά αντιδραστήρια της κατηγορίας είναι το δίκυκλοεξυλο-καρβοδιϊμίδιο (DCC) και το δι-ισοπρόπυλο- καρβοδιϊμίδιο (DIC). Συνήθως χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με πρόσθετα αντιδραστήρια όπως το 1-υδροξυβενζοτριαζόλιο (HOBt) και το 1-υδροξυ-7- αζαβενζοτριαζόλιο (HOAt), γιατί τα ενεργοποιημένα ενδιάμεσα που προκύπτουν (Ο- ακυλ-ισοουρία) είναι υπερδραστικά και άρα μη εκλεκτικά στις αντιδράσεις τους, οδηγώντας σε παραπροϊόντα. (πχ. Ρακεμίωση, σχηματισμός νιτριλίων).

Αρχικά λαμβάνει χώρα μια αντίδραση προσθήκης του καρβόξυ-συστατικού σε έναν από τους δυο διπλούς δεσμούς του καρβοδιϊμιδίου προς σχηματισμό ενός ενεργού ενδιάμεσου εστέρα, Ο-ακυλ-ισοουρία. Ο εστέρας αυτός μπορεί στη συνέχεια είτε να

56

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

προσβληθεί απευθείας από την ελεύθερη αμινομάδα, είτε να αντιδράσει με ένα δεύτερο μόριο αμινοξέος προς σχηματισμό συμμετρικού ανυδρίτη ή να μετατραπεί ταχέως in situ με την επίδραση HOBt σε έναν λιγότερο δραστικό, ωστόσο ικανό, εστέρα να ακυλιώσει το άμινο-συστατικό. Η αντίδραση προχωράει ταχύτερα σε μη-πολικούς διαλύτες όπως το DCM, χωρίς να υπάρχει πρόβλημα με τη χρήση DMF, με την προϋπόθεση ότι η ενεργοποίηση προηγείται της σύζευξης.

Εικόνα Α.2.11.: Δημιουργία πεπτιδικού δεσμού με τη χρήση DCC/HOBt.

Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί ο σχηματισμός παραπροϊόντων ουρίας, τα οποία αν και αδρανή, πολλές φορές απομακρύνονται δύσκολα. Το DIC δίνει περισσότερο διαλυτά παραπροϊόντα ουρίας σε σύγκριση με το DCC και σε συνδυασμό με τις αλλεργιογόνες ιδιότητες του τελευταίου και την τάση του να αφυδατώνει τα πλευρικά αμίδια των Asn και Gln προς νιτρίλια, έχουν περιορίσει τη χρήση του σε αντιδράσεις υγρής φάσης. Όντας εξαιρετικά υγροσκοπικό συνήθως χρησιμοποιείται στην μορφή υδροχλωρικού άλατος.

Α.2.12. Μέθοδος σύζευξης με φωσφονικά-ουρονικά άλατα

Τα φωσφονικά αντιδραστήρια ενεργοποίησης (πχ. BOP, PyBOP) και τα ανάλογά τους (που φέρουν άτομο άνθρακα στη θέση του φωσφόρου) ουρονικά (πχ. HBTU, TBTU) περιέχουν στη δομή τους ένα ισοδύναμο HOBt και η ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας γίνεται in situ με μετατροπή της στον αντίστοιχο δραστικό OBt-

57

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

εστέρα, παρουσία τριτοταγούς βάσης, όπως η DIEA. Τα εν λόγω αντιδραστήρια παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα:

Πίνακας Α.2.11.: Φωσφονιακά και Ουρονιακά παράγωγα.

Όνομα (Σύντμηση) Χημικός τύπος Βιβλιογραφία

Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ- τρις(διμεθυλαμινο)- Castro et al., 1975 φωσφονίου BOP

Εξαφθοροφωσφορικό άλας του βενζοτριαζολυλοξυ- πυρρολιδινο-φωσφονίου Coste et al., 1990 PyBOP

Εξαφωσφορικό άλας της 2- (1Η βενζοτριαζολυλ)- Κnorr et al., 1989 1,1,3,3-τετραμεθυλουρίας HBTU

Τετραφθοροβορικό άλας της 2-(1Η βενζοτριαζολυλ)- Κnorr et al., 1989 1,1,3,3-τετραμεθυλουρίας TBTU

Τα αντιδραστήρια αυτά αντιδρούν μόνο με καρβοξυλικά ανιόντα, γι’ αυτό είναι απαραίτητη η προσθήκη μιας οργανικής βάσης στο μίγμα της αντίδρασης, όπως η Ν,Ν- διϊσοπροπυλαιθυλαμίνη (DIPEA) και η κολλιδίνη (2,4,6 τριμέθυλο πυριδίνη), μετατρέποντας τα Fmoc-αμινοξέα στους αντίστοιχους OBt εστέρες. Οι βασικές

58

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

συνθήκες στις οποίες πραγματοποιείται η ενεργοποίηση και σύζευξη οδηγούν σε ταχύτατες συζεύξεις μεγαλύτερες από αυτές που παρατηρούνται σε συζεύξεις με DCC/HOBt. Οι βασικές συνθήκες όμως, αυξάνουν τον κίνδυνο ρακεμίωσης. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιούνται HOBt ή HOAt ενώ πρόσφατα άρχισαν να χρησιμοποιούνται το εξαφθοροφωσφορικό άλας της Ο-(7-αζαβενζοτριαζολυλ)-1,1,3,3- τετραμεθυλουρίας (HATU) και το εξαφθοροφωσφορικό άλας του αζαβενζοτριαζολυλοξυ-τρις-πυρρολιδινο-φωσφονίου (PyAOP) που φαίνεται να μειώνουν τη ρακεμίωση.

Εικόνα Α.2.12.: Μηχανισμός σύζευξης με PyBOP.[71]

Εικόνα Α.2.13.: Μηχανισμός σύζευξης με ουρονιακά άλατα.[71]

A.2.13. Προβλήματα κατά την πεπτιδική σύνθεση

Κατά την πεπτιδική σύνθεση, υπάρχει πάντα η πιθανότητα να λάβουν μέρος κάποιες παράπλευρες αντιδράσεις κατά τη διάρκεια της ενεργοποίησης, της σύζευξης ή

59

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

της αποπροστασίας. Μερικά από τα πιο συνήθη προβλήματα που παρουσιάζονται κατά την πεπτιδική σύνθεση είναι τα εξής: Α.2.13.1 Ρακεμίωση

Από τα 20 φυσικά αμινοξέα που απαντούν στις πρωτεΐνες, με εξαίρεση τη Gly, όλα έχουν ασύμμετρο το α-άτομο άνθρακα και δύο από αυτά, η Ile και η Thr, έχουν ένα επιπλέον χειρικό κέντρο στις πλευρικές τους αλυσίδες. Οι βιολογικές ιδιότητες των πρωτεϊνών και πεπτιδίων σχετίζονται άμεσα με τη στερεοχημική δομή των ασύμμετρων ατόμων άνθρακα, επομένως η διατήρηση της στερεοχημείας είναι τεράστιας σημασίας στην πεπτιδική σύνθεση.

Σε όλα τα οπτικώς ενεργά αμινοξέα ο ένας από τους υποκαταστάτες του αύμμετρου α-άνθρακα είναι ένα όξινο άτομο υδρογόνου, του οποίου η οξύτητα αυξάνεται κατά την ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας, με κίνδυνο την απόσπασή του. Το σχηματιζόμενο καρβανιόν μπορεί να πρωτονιωθεί και από τις δύο πλευρές προς δύο εναντιομερείς μορφές D- και L-. Στην πράξη ωστόσο ρακεμίωση με απευθείας απόσπαση του α-υδρογόνου σπανίως παρατηρείται. Αυτό που συνήθως συμβαίνει είναι ρακεμίωση μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει αποπρωτονίωση και διάνοιξη του δακτυλίου μιας ενδιάμεσης οξαζολόνης, η οποία σχηματίζεται με πυρηνόφιλη πρσβολή στην ενεργοποιημένη καρβοξυλομάδα. (εικόνα Α.2.14).

Εικόνα Α.2.14.: Ρακεμίωση μέσω οξαζολόνης.[71]

60

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Οι οξαζολόνες σχηματίζονται εύκολα στην περίπτωση καρβόξυ- ενεργοποιημένων πεπτιδίων και Να-προστατευμένων αμινοξέων με ουρεθανικού τύπου ομάδες. Ωστόσο οι οξαζολόνες των Να-προστατευμένων αμιονοξέων με ουρεθανικού τύπου ομάδες, όπως η Fmoc-ομάδα, αντιστέκονται στην αποπρωτονίωση, πιθανότατα επειδή η απόσπαση του πρωτονίου θα οδηγούσε σε μια όχι και τόσο ευνοϊκά σταθερή κατάσταση (δύο αρνητικά φορτία πολύ κοντά). Έτσι, η ρακεμίωση μέσω οξαζολόνης σχετίζεται κατά κανόνα με την τμηματική σύνθεση ενώ σπάνια συμβαίνει στη σύνθεση πεπτιδίων κατά στάδια.

Α.2.13.2. Οξείδωση μεθειονίνης Η κύρια παράπλευρη αντίδραση της Met είναι η όξινα καταλυόμενη οξείδωση του θειοαιθέρα της σε σουλφοξείδιο κατά τη διάρκεια της αποπροστασίας ή ακόμα και από το οξυγόνο του ατμοσφαιρικού αέρα. Η μετατροπή του σουλφοξειδίου σε θειοαιθέρα επιτυγχάνεται με χρήση NH4I/TFA (Huang και Rabenstein, 1999). Α.2.13.3. Αλκυλιώσεις κατά την αποπροστασία

Τα κατιόντα που δημιουργούνται κατά την απομάκρυνση των πλάγιων προστατευτικών ομάδων προσβάλλουν τις δραστικές πλευρικές ομάδες των αμινοξέων, όπως της Trp, Tyr και Met. Για να παρεμποδιστούν αυτές οι παράπλευρες αντιδράσεις, χρησιμοποιούνται στο διάλυμα αποπροστασίας κατάλληλες ενώσεις (scavengers) που δεσμεύουν τα ηλεκτρόφιλα είδη που παράγονται. Χαρακτηριστικά παραδείγματα δεσμευτών είναι η ανισόλη, η θειοανισόλη, η 1,2- αιθανοδιθειόλη (EDTH), η διθειοθρεϊτόλη, ενώ και η προσθήκη νερού στο διάλυμα έχει αποδειχθεί ότι είναι πολλές φορές χρήσιμη.

Ανάλογα με τα αμινοξέα που απαρτίζουν το πεπτίδιο και τις προστατευτικές ομάδες που έχουν επιλεγεί, επιλέγεται ο κατάλληλος δεσμευτής ή μίγμα αυτών. Πρέπει να σημειωθεί ότι για κάθε διαφορετική μέθοδο απόσπασης και αποπροστασίας οι

61

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

δεσμευτές που χρησιμοποιούνται σπανίως παραμένουν οι ίδιοι. Η 1,2– αιθανοδιθειόλη αποτελεί μια πολύ καλή επιλογή για κατιόντα τα οποία προέρχονται από tBu–, Boc– και Trt–ομάδες. Α.2.13.4. Σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης

C-τελικά διπεπτίδια που περιέχουν προλίνη ή/και γλυκίνη φαίνεται να κυκλοποιούνται με ιδιαίτερη ευκολία προς την αντίστοιχη δικετοπιπεραζίνη (DKP), η οποία σχηματίζεται με πυρηνόφιλη προσβολή της ελεύθερης αμινομάδας στην καρβονυλομάδα του εστερικού σεσμού.

Εικόνα Α.2.15. Σχηματισμός δικετοπιπεραζίνης

Ο σχηματισμός DKP οδηγεί όχι μόνο σε μειωμένες αποδόσεις αλλά και σε πεπτιδικές αλυσίδες μειωμένες κατά το C-τελικό διπεπτίδιο, που προκύπτουν από ακυλίωση της καινούριας ρητίνης που σχηματίστηκε κατά την αποκοπή του C-τελικού διπεπτιδίου. Διπεπτίδια, τα οποία είναι δεσμευμένα στη ρητίνη μέσω τριτυλ-εστέρων, όπως η CTC- ρητίνη, ανθίστανται στη DKP λόγω στερεοχημικών παρεμποδίσεων.

Α.2.13.5. Σχηματισμός πυρογλουταμινικού (pGlu)

Όταν το Glu είναι το Ν-τελικό αμινοξύ και έχει πλευρική προστασία Bzl-τύπου, κατά την απομάκρυνση της Ν-Fmoc μπορεί να σχηματιστεί πυρογλουταμινικό. Επίσης, όταν η Gln είναι το Ν-τελικό αμινοξύ και χωρίς πλάγια πλευρική προστασία μπορεί σε όξινα υδατικά μέσα να δώσει pGlu. Περιορισμός του σχηματισμού pGlu επιτυγχάνεται είτε κρατώντας το χρόνο αποπροστασίας στο ελάχιστο είτε χρησιμοποιώντας άλλες πλευρικές προστατευτικές ομάδες.

Α.2.13.6. Σχηματισμός ασπαρτιμιδίου

Ο σχηματισμός ασπαρτιμιδίου, όξινα ή βασικά καταλυόμενος, είναι ίσως η πιο συνηθισμένη παράπλευρη αντίδραση που συναντάται κατά την πεπτιδική σύνθεση. Η αντίδραση περιλαμβάνει πυρηνόφιλη προσβολή του αζώτου, που είναι προσκολλημένο στην α-καρβοξυλομάδα του ασπαραγινικού οξέος ή της ασπαραγίνης, στον καρβονυλικό άνθρακα της πλευρικής αλυσίδας προς σχηματισμό κυκλικού ιμιδίου (ασπαριμιδίου). Η αντίδραση εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση του οξέος ή της 62

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

βάσης καθώς και από την πεπτιδική αλληλουχία και τις προστατευτικές ομάδες. Οι πιο ευπαθείς αλληλουχίες είναι: -Asp(tBu)-Y, όπου Υ=Gly, Asn (Trt). Ισχυρές βάσεις, όπως το DBU, ευνοού το σχηματισμό ασπαρτιμιδίου, χωρίς περαιτέρω διάνοιξη του δακτυλίου του, όπως συμβαίνει στην περίπτωση της πιπεριδίνης. (εικόνα Α.2.16)

Εικόνα Α.2.16. Σχηματισμός ασπαρτιμιδίου με επίδραση πιπεριδίνης

Α.2.13.7. Σχηματισμός νιτριλίου

Κατά την ενεργοποίηση της Asn και όταν δεν είναι προστατευμένο το πλευρικό αμίδιο μπορεί να σχηματιστεί κυανοαναλίνη (νιτρίλιο). Για την αποφυγή του παραπάνω προτείνεται η χρήση προσχηματισμένων ενεργών εστέρων, όπως Fmoc-Asn-OPfp ή η χρήση πλευρικής προστασίας. Επίσης, σε υδατικά μέσα κυρίως με βασικές συνθήκες μπορεί να σχηματιστεί ασπαρτιμίδιο, όπως και στην περίπτωση του Asp(OtBu), μόνο που εδώ λαμβάνει χώρα προσβολή του πλευρικού αμιδίου από το άζωτο που είναι ενωμένο με την α-καρβοξυλομάδα της Asn. Α.2.13.8. Συσσωμάτωση

Όσο μεγαλώνει η πεπτιδική αλυσίδα (συνήθως μετά το πέμπτο αμινοξύ) δεσμοί υδρογόνου και υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις ενοχοποιούνται για σχηματισμό δευτεροταγών δομών και συσσωματωμάτων (aggregates) είτε με το στερεό υπόστρωμα είτε με τις άλλες αναπτυσσόμενες αλυσίδες. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε ανικανότητα διόγκωσης του πεπτιδίου-στερεού υποστρώματος σε συνδυασμό με αδυναμία των αντιδραστηρίων να εισχωρήσουν στους πόρους του πολυμερούς, με αποτέλεσμα οι συζεύξεις και οι επακόλουθες διασπάσεις της Fmoc-ομάδας να μην ολκληρώνονται.

63

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.2.17. α) πλήρως διογκωμένη ρητίνη-ξεδιπλωμένες αναπτυσσόμενες πεπτιδικές αλυσίδες, β) πλήρως διογκωμένη ρητίνη-σχηματισμός ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου, γ) μη-διογκωμένη ρητίνη-ξεδιπλωμένες πεπτιδικές αλυσίδες, δ) διαμοριακές αλληλεπιδράσεις αναπτυσσόμενων αλυσίδων. Η συσσωμάτωση φαίνεται να εξαρτάται από την πεπτιδική αλληλουχία και τη φύση των προστατευτικών ομάδων. Έτσι αλυσίδες πλούσιες σε β-υποκατεστημένα αμινοξέα (πχ. Val, Ile, Leu) και ογκώδεις στερεοχημικά παρεμποδιζόμενες ομάδες συχνά αντιπροσωπεύουν «σύσκολες περιοχές». Η χρήση υψηλών θερμοκρασιών και πολικών απρωτικών διαλυτών, όπως το DMF και με ακόμη μεγαλύτερη επιτυχία το NMP, βελτιώνουν σημαντικά τις σύσκολες συζεύξεις αυξάνοντας τη διεισδυτικότητα στους πόρους της ρητίνης. Σε πολυμερή υποστρώματα με μεγάλη πυκνότητα πεπτιδικών αλυσίδων αυξάνεται ο πολυαμιδικός χαρακτήρας οδηγώντας σε απώλεια των διογκωτικών ιδιοτήτων. Έτσι συνίσταται οι υποκαταστάσεις να επιλέγονται ώστε το πεπτιδικό περιεχόμενο να μην ξεπερνάει το 50% του πεπτιδίου-στερεού υποστρώματος. Α.2.13.9. Σχηματισμός τριπεπτιδίου

Στο ελαφρά όξινο περιβάλλον, κατά τη διάρκεια της σύζευξης του δεύτερου αμινοξέος, κάποιο ποσοστό του μόλις σχηματιζόμενου διπεπτιδίου μπορεί να αποκοπεί και να αντιδράσει με το εστεροποιημένο στη ρητίνη αμινοξύ. Η παράπλευρη αυτή αντίδραση φαίνεται να εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το αμινοξύ που είναι δεσμευμένο στη ρητίνη (πχ. η Gly ευνοεί το σχηματισμό τριπεπτιδίου). Διεξαγωγή της αντίδρασης σε ήπια βασικές ή ουδέτερες συνθήκες ή/ και χαμηλές θερμοκρασίες περιορίζουν στο ελάχιστο αν όχι εντελώς το σχηματισμό του ανεπιθύμητου τριπεπτιδίου.

64

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Α.3. Αναλυτικές τεχνικές

A.3.1 Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Επίδοσης (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) Έπειτα από την ολοκλήρωση σύνθεσης ενός πεπτιδίου απαιτείται ο καθαρισμός του όπως και ο έλεγχος της καθαρότητας του. Η ανάλυση και ο καθαρισμός των πεπτιδίων επιτυγχάνεται με μια σειρά τεχνικών διαχωρισμού, τόσο σε παρασκευαστικό επίπεδο, με σκοπό την απομόνωση ενός ή περισσοτέρων συστατικών από ένα μίγμα, όσο και σε αναλυτικό επίπεδο, με σκοπό τον προσδιορισμό και την ταυτοποίηση μερικών ή όλων των συστατικών του μίγματος. Η υγρή χρωματογραφία υψηλής επίδοσης HPLC είναι μια τέτοια τεχνική και αποτελεί εξέλιξη της υγρής χρωματογραφίας στήλης. Η HPLC αποτελείται από μια στήλη που περιέχει ένα υλικό πλήρωσης (στατική φάση), μια αντλία που κινεί την κινητή φάση προς τη στήλη και έναν ανιχνευτή που δείχνει τους χρόνους συγκράτησης των μορίων. Ο χρόνος συγκράτησης ποικίλει ανάλογα με τις φυσικές και χημικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της στατικής φάσης, των συστατικών των μορίων που αναλύονται και των διαλυτών που χρησιμοποιούνται (κινητή φάση). Το προς ανάλυση δείγμα εισάγεται στη ροή της κινητής φάσης. Η κίνηση του δείγματος μέσα στη στήλη επιβραδύνεται εξ’αιτίας των αναπτυσσόμενων αυτών αλληλεπιδράσεων. Το ποσοστό συγκράτησης εξαρτάται από τη φύση του δείγματος, τη στατική φάση και τη σύσταση της κινητής φάσης. Με τη χρήση στήλης με μικρό μέγεθος σωματιδίων υλικού πλήρωσης (η διάμετρος των κόκκων στην HPLC είναι ≤5μm) αυξάνεται η ταχύτητα, καθώς αυξάνει και η απαιτούμενη πίεση, δίνοντας στα συστατικά λιγότερο χρόνο να διαχυθούν μέσα στη στήλη. Επίσης, αυξάνεται η επιφάνεια επαφής ανάμεσα στην κινητή και τη στατική φάση, με αποτέλεσμα μεγάλη διαχωριστική ικανότητα. Η κινητή φάση αποτελείται από ένα μίγμα διαλυτών (πολικός/άπολος) , οι οποίοι πρέπει να αναμιγνύονται και να μην

απορροφούν στο UV. Συνήθως ως πολικός διαλύτης χρησιμοποιείται το Η2Ο και οι οργανικοί διαλύτες AcN (ακετονιτρίλιο), MeOH (μεθανόλη), THF (τετραϋδροφουράνιο), PrOH (προπανόλη) ή i-PrOH (ισοπροπανόλη) ως άπολοι.

65

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εικόνα Α.3.1. Σχηματική παράσταση μιας διάταξης HPLC (προσφορά της Perkin-Elmer Corporation, Norwalk, CT).[48]

Η χρωματογραφία HPLC που χρησιμοποιεί μη πολική στατική φάση καλείται χρωματογραφία ανάστροφης φάσης (Reversed-phase chromatography, RPC). Ανάστροφης φάσης λέγεται αφού κανονικής φάσης θεωρείται η υγρή χρωματογραφία που χρησιμοποιεί μια υδρόφιλη επιφάνεια από silica ή alumina με μεγαλύτερη συγγένεια δέσμευσης για πολικές ενώσεις. Η εισαγωγή αλκυλ-ομάδων επάνω στην επιφάνεια της στατικής φάσης έχει ως αποτέλεσμα τα πολικά συστατικά να συγκρατούνται περισσότερο χρόνο (Molnar και Horvarth, 1976). Επομένως, η HPLC ανάστροφης φάσης (RP-HPLC ή RPC) αποτελείται από μια μη πολική στατική φάση και μια μεταβαλλόμενης πολικότητας, υδατικής φύσης κινητή φάση. Ως στατική φάση

συνήθως χρησιμοποιείται μια silica (σιλάνια) μετά από αντίδρασή της με RMe2SiCl,

όπου R είναι μια ευθύγραμμη αλκυλομάδα, όπως C18H37 ή C8H17. Για δέσμευση των σιλανομάδων που δεν έχουν αντιδράσει χρησιμοποιείται χλωροτριμεθυλοσιλάνιο. Με τη χρήση των παραπάνω υλικών αυξάνεται ο χρόνος συγκράτησης για τα μη πολικά συστατικά, ενώ τα πολικά μόρια εκλούονται πιο γρήγορα. Όσο μεγαλύτερη είναι η αλκυλομάδα που δεσμεύεται στην επιφάνεια της στατικής φάσης τόσο αυξάνεται η υδροφοβικότητά της. Έτσι για παράδειγμα, μια μη πολική ουσία συγκρατείται σε μια στήλη C-18 σε μεγαλύτερο βαθμό απ’ ότι σε μια στήλη C-8 και στην C-8 σε μεγαλύτερο βαθμό απ’ ότι σε μια στήλη C-4.

Μια επιπλέον βελτίωση της HPLC είναι η ικανότητα μεταβολής της σύστασης της κινητής φάσης κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, και καλείται βαθμιδωτή έκλουση

66

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

(gradient elution). Έτσι, για την ανάλυση και τον καθαρισμό πεπτιδίων χρησιμοποιείται

η RP-HPLC μεταβαλλόμενης σύστασης, με τη χρήση Η2Ο και AcN ως κινητή φάση. Οι διαλύτες έχουν pH=2 με την προσθήκη 0,08-0,1% TFA (τριφθοροξικό), όπου όλες οι αμινομάδες του πεπτιδίου είναι πρωτονιωμένες.

A.3.2. Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) Η TLC είναι μια χρωματογραφική τεχνική η οποία βρίσκει μεγάλη εφαρμογή στην ανάλυση και ταυτοποίηση οργανικών ενώσεων. Η ακίνητη φάση σε αυτή τη μέθοδο επιστρώνεται επάνω σε πλαστική ή από αλουμίνιο πλάκα. Υπάρχουν πολυάριθμα μέσα επίστρωσης, όπως η Silica gel, αλούμινα, κυτταρίνη και πολυαμίδιο. Αυτά τα υλικά είναι συνήθως αναμεμιγμένα με μικρή ποσότητα γύψου (10-15%) για καλύτερη προσκόλληση επάνω στο φορέα επίστρωσης. Ο διαλύτης, ή το μίγμα διαλυτών, στον οποίο πραγματοποιείται η χρωματογραφία αποτελεί την κινητή φάση, και συχνά αναφέρεται και ως διαλύτης ανάπτυξης. Ως διαλύτες ανάπτυξης χρησιμοποιούνται διάφοροι οργανικοί διαλύτες καθώς μπορεί να περιέχεται και νερό. Μερικά από τα πιο συνηθισμένα συστήματα διαλυτών που χρησιμοποιούνται στην

πεπτιδική σύνθεση είναι τα εξής: (CH3)2CO/AcOH (98:2), BuOH/AcOH/H2O (3:1:1),

AcN/H2O (5:1).

Η εμφάνιση του χρωματογραφήματος γίνεται είτε α) με υπεριώδη ακτινοβολία UV, όταν χρησιμοποιούνται ειδικές πλάκες φθορίζουσες στο UV, είτε β) με ειδικά αντιδραστήρια ψεκασμού, όταν ουσίες που χρωματογραφούνται μπορούν να δώσουν έγχρωμα παράγωγα με τα αντιδραστήρια που ψεκάζονται. Τα αμινοξέα δίνουν έγχρωμα προϊόντα όταν χρησιμοποιείται η νινυδρίνη ως αντιδραστήριο ψεκασμού.

A.3.3. Φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry MS) Η φασματομετρία μάζας (Mass Spectrometry MS) είναι μια αναλυτική τεχνική, η οποία χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της μάζας μιας χημικής ένωσης. Μέσω ιονισμού της χημικής ουσίας, μας παρέχονται σημαντικές πληροφορίες μετά από θραυσμάτωση των φορτισμένων σωματιδίων της. Τα ιόντα σε ένα φασματόμετρο μαζών διαχωρίζονται σύμφωνα με το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους (m/z) και ανιχνεύονται ανάλογα με την αφθονία τους. Η αναλογία μάζας-φορτίου των σωματιδίων μπορεί να υπολογιστεί με βάση τη συμπεριφορά των ιόντων, καθώς αυτά

67

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

διέρχονται από τα ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία που παράγονται από το όργανο της MS. Ένα όργανο MS αποτελείται από μία πηγή ιονισμού, η οποία μετατρέπει τα μόρια ενός δείγματος σε ιόντα, έναν αναλυτή μάζας, ο οποίος ταξινομεί τα ιόντα με βάση το λόγο μάζα/φορτίο (m/z) εφαρμόζοντας ηλεκτρικά και μαγνητικά πεδία, και τέλος έναν ανιχνευτή, ο οποίος καταγράφει είτε το επαγόμενο φορτίο είτε το παραγόμενο ρεύμα όταν ένα ιόν περνάει από μια κατάλληλα επιστρωμένη επιφάνεια ή χτυπάει σε αυτή. Το σήμα που παράγεται στον ανιχνευτή μετά από επεξεργασία με Η/Υ θα δώσει το φάσμα μάζας με τη μορφή ενός γραφήματος, όπου η τετμημένη είναι ο λόγος μάζα/φορτίο (m/z) και τεταγμένη, η σχετική ένταση (%) ως προς τη βασική κορυφή (Sparkman, 2000).

Εικόνα Α.3.2. Συσκευή για ιονισμό με ηλεκτροψεκασμό. (Από το J.B. Fenn et al., Science,1989,246,65

Για την πραγματοποίηση ποιοτικών και ποσοτικών αναλύσεων με ένα φασματόμετρο μάζας, απαιτείται: α) να παράγει ιόντα από το δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί στη πηγή ιονισμού (Ionization Source), β) να διαχωρίζει τα ιόντα αυτά ανάλογα με το m/z στον αναλυτή (Analyzer), γ) να ανιχνεύει τα παραγόμενα ιόντα μετρώντας το λόγο m/z και την αφθονία του στον ανιχνευτή (Detector) και δ) να ελέγχει το όργανο και να επεξεργάζεται τα δεδομένα μέσω υπολογιστή (Computer) (De Hoffman και Stroobant, 2002).

68

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Ο ιονισμός από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI) είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στη φασματομετρία μάζας για την παραγωγή ιόντων (φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό, electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS). Στον ιονισμό από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό ένα διάλυμα εισάγεται μέσα σε ένα μικρό, φορτισμένο και συνήθως μεταλλικό τριχοειδές (Fenn et al., 1990). Αυτό το διάλυμα περιέχει την προς μελέτη ουσία διαλυμένη σε μια μεγάλη ποσότητα διαλύτη, ο οποίος συνήθως είναι πιο πτητικός από την ουσία. Ένα φυσικό αέριο-φορέας, όπως άζωτο, συνήθως χρησιμοποιείται για τη μετατροπή του υγρού σε σπρέι και την εξάτμιση του διαλύτη σε σταγονίδια. Καθώς ο διαλύτης εξατμίζεται, τα μόρια της ουσίας έρχονται πιο κοντά, απωθούνται και δημιουργούν μικρότερα σταγονίδια. Αυτή η διαδικασία καλείται σχάση Coulomb επειδή προκαλείται από απωθητικές δυνάμεις Coulomb μεταξύ των φορτισμένων μορίων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται μέχρι να προκύψουν πολλαπλά φορτισμένα σωματίδια της προς ανάλυση ουσίας, τα οποία οδηγούνται προς τον αναλυτή μάζας του φασματομέτρου. Στη φασματομετρία μάζας ιονισμού από ηλεκτρικό πεδίο με ψεκασμό (ESI-MS) τα παρατηρούμενα ιόντα μπορεί να είναι ψευδομοριακά ιόντα που σχηματίζονται από την προσθήκη ενός πρωτονίου (ένα ιόν υδρογόνου) και συμβολίζονται ως [M + H]+, ή από ένα άλλο κατιόν, όπως ιόν νατρίου, [M + Na]+, ή από την απομάκρυνση ενός πρωτονίου, [M − H]−. Συνήθως παρατηρούνται και πολλαπλά φορτισμένα ιόντα, όπως [M + 2H]2+. Για μεγάλα μακρομόρια μπορεί να υπάρξουν πολλές βαθμίδες φόρτισης και το φορτίο μπορεί να φτάσει για παράδειγμα μέχρι και [M + 25H]25+. Όλα αυτά τα ιόντα έχουν τον ίδιο αριθμό ηλεκτρονίων, καθώς ούτε προστίθενται ούτε αφαιρούνται ηλεκτρόνια, αντίθετα με κάποια άλλα είδη ιονισμών (ΕΙ, ιονισμός με ηλεκτρονιακή πρόσκρουση).

69

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

70

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Β. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Β.1. Σκοπός

Οι κωνοτοξίνες είναι μικρά νευροτοξικά πεπτίδια (10-30 αμινοξέα) που τυπικά έχουν έναν ή περισσότερους δισουλφιδικούς δεσμούς και προέρχονται από το δηλητήριο των θαλάσσιων σαλιγκαριών, το οποίο αποτελεί αντικείμενο μελέτης και έρευνας για την εύρεση πιθανών νέων δραστικών ενώσεων.

Οι α-κωνοτοξίνες είναι μια σειρά δομικών και λειτουργικών σχετικών πεπτιδίων, αποτελούμενα από δύο δισουλφιδικές γέφυρες, τα οποία αποτελούνται από 11 έως 16 αμινοξέα και είναι ανταγωνιστές των nAChRs. Αυτά τα πεπτίδια υποδιαιρούνται σε τέσσερις ομάδες με βάση τον αριθμό καταλοίπων μεταξύ της δεύτερης και τρίτης κυστεΐνης και την απόσταση μεταξύ της τρίτης και της τέταρτης κυστεϊνης στις τοξίνες.

Η α-κωνοτοξίνη AusIA είναι ένα πεπτίδιο 16 αμινοξέων που απομονώνεται από το δηλητήριο του θαλάσσιου σαλιγκαριού Conus Australis. Το πεπτίδιο έχει την τυπική δομή α-κωνοτοξίνης CC-Xm-C-Xn-C, αλλά και οι δύο βρόχοι (m/n) περιέχουν 5 αμινοξέα, γεγονός το οποίο ποτέ δεν είχε περιγραφεί προηγουμένως στη βιβλιογραφία. Τα απομονωμένα ισομερή [σφαιρικό (globular) Cys(Ι-ΙΙΙ, ΙΙ-IV) και κορδέλα (ribbon) Cys(Ι-ΙV, ΙΙ-ΙΙΙ)] της κωνοτοξίνης AusIA έδειξαν παρόμοια ισχύ επί των α7 nAChRs.

Στην παρούσα εργασία ο αρχικός στόχος ήταν η σύνθεση των δύο ισομερών της κωνοτοξίνης AusIA σε υψηλή καθαρότητα και απόδοση με επιλεκτικό σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών χρησιμοποιώντας ορθογωνική στρατηγική οξείδωσης και ακολούθως η σύνθεση αναλόγων που περιλαμβάνουν τροποποιήσεις στη θέση 7 ή 8 του φυσικού μορίου.

Β.1.2 Ορθογωνικός σχεδιασμός πεπτιδικών αναλόγων

Κατά την παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε ορθογωνική σύνθεση των ισομορφών της κωνοτοξίνης AusIA, χρησιμοποιώντας διαφορετικούς τρόπους οξείδωσης στα δύο φυσικά γραμμικά πεπτίδια της κωνοτοξίνης (με εναλλαγή κυστεϊνών στις δισουλφιδικές γέφυρες). Για την επίτευξη αυτού του σκοπού οι Cys οι οποίες θα συμμετείχαν στη δημιουργία της πρώτης δισουλφιδικής γέφυρας είχαν προστατευθεί με την Trt ομάδα η οποία απομακρύνεται με τις όξινες συνθήκες που 71

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

επικρατούν κατά την απομάκρυνση του πεπτιδίου από την ρητίνη, ενώ οι Cys οι οποίες θα συμμετείχαν στη δημιουργία της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας είχαν προστατευθεί με την Acm ομάδα η οποία η οποία είναι σταθερή σε όξινες συνθήκες και απομακρύνεται με ειδικά αντιδραστήρια. Μετά την διευκρίνιση των συνθηκών δημιουργίας των δύο δισουλφιδικών γεφυρών με μεθόδους οξείδωσης που οδηγούν ι) σε επαναλήψιμα αποτελέσματα και ιι) σε προϊόντα υψηλής καθαρότητας και απόδοσης συντέθηκαν επιπλέον και δύο πεπτιδικά ανάλογα με αλλαγές στις θέσεις 7 και 8 της αλυσίδας των αμινοξέων. Συγκεκριμένα κάθε αμινοξύ στις θέσεις 7 και 8, αντικαθίσταται από το 2-αμινοϊσοβουτυρικό οξύ Aib που είναι ισχυρός επαγωγέας έλικας στα πεπτίδια, με σκοπό την μελέτη αλλαγής της δραστικότητας του φυσικού πεπτιδίου.

Πίνακας Β.1.1.: Ονομασία και αλληλουχία των τεσσάρων συντιθέμενων πεπτιδίων

Ονομασία Αλληλουχία

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Aus-1Σ H2NSer -Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Pro -Ala -Cys - 10 11 12 13 14 15 16 [Cys (2_9, 3_15)] Arg -His -Asn -His -Pro -Cys -Val -NH2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Aus-2Σ H2NSer -Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Pro -Ala -Cys - 10 11 12 13 14 15 16 [Cys(3_9, 2_15)] Arg -His -Asn -His -Pro -Cys -Val -NH2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Aus-3Σ H2NSer -Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Pro -Aib -Cys - 10 11 12 13 14 15 16 [8_Aib, Ala] Arg -His -Asn -His -Pro -Cys -Val -NH2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Aus-4Σ H2NSer -Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Aib -Ala -Cys - 10 11 12 13 14 15 16 [7_Aib, Pro] Arg -His -Asn -His -Pro -Cys -Val -NH2

Β.2 Μεθοδολογία

Β.2.1 Σύνθεση πεπτιδίων

Τα ανάλογα συντέθηκαν με τη μεθοδολογία σύνθεσης πεπτιδίων επί στερεάς φάσης Fmoc/tBu χρησιμοποιώντας ως στερεό υπόστρωμα τη ρητίνη Sieber Amide.

72

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Εικόνα Β.2.1.: Χημικός τύπος της Sieber Amide ρητίνης.

Η σύνθεση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με σταδιακή προσθήκη των αμινοξέων στην πεπτιδική αλληλουχία χρησιμοποιώντας ως αντιδραστήρια διισοπροπυλοκαρβοδιιμίδιο 1-υδροξυβενζοτριαζόλη (DIC/HOBt) σε διμεθυλοφορμαμίδιο (DMF).

Η τελική διάσπαση των αναλόγων από το στερεό υπόστρωμα μαζί με την απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων πλευρικής αλυσίδας επιτεύχθηκε με επεξεργασία με ένα διάλυμα (10 ml/g πεπτιδική ρητίνη) τριφθοροοξικού οξέος (TFA) /1,2-αιθανοδιθειόλης (EDT)/τριαιθυλοσιλάνιο (TES)/νερό (92: 4,0: 2,0: 2,0, ο/ο) για 3,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε αδρανείς συνθήκες με παροχή Ar.

Η δημιουργία της πρώτης δισουλφιδικής γέφυρας πραγματοποιήθηκε μετά την παραλαβή των γραμμικών πεπτιδίων μέσω δύο μεθόδων: I) της μεθόδου διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO)/νερού και II) μέσω της μεθόδου υπεροξειδίου του υδρογόνου σε θερμοκρασία δωματίου.

Ο δεύτερος δισουλφιδικός δεσμός επιχειρήθηκε να δημιουργηθεί με μετατροπή των κύκλο[Cys (Acm)] πεπτιδίων με δύο μεθόδους: I) με τη μέθοδο ιωδίου και II) με τη μέθοδο σιλυλοχλωριδίου-σουλφοξειδίου.

Ο σχηματισμός των δισουλφιδικών δεσμών παρακολουθήθηκε είτε με τη δοκιμή του Ellman είτε με αναλυτική HPLC.

Τα προϊόντα καθαρίστηκαν με χρωματογραφία διήθησης πηκτής σε Sephadex G-15 χρησιμοποιώντας 15% οξικό οξύ ως διαλύτη έκλουσης. Τα κατάλληλα κλάσματα συνενώθηκαν και λυοφιλοποιήθηκαν.

73

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Ο τελικός έλεγχος επιτυγχάνεται με αναλυτική χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού HPLC (Συσκευή: Waters 2695) σε υπόστρωμα ανάστροφης φάσης XB- C18 Aeris peptide 3,6u της εταιρείας Phenomenex (150x4.60 mm) με γραμμική έκλουση από 5 έως 60% ακετονιτρίλιο (0.1% TFA) για 19 λεπτά σε ρυθμό ροής 1 ml / min και ανίχνευση UV στα 214 και 254 nm.

Β.3 Αποτελέσματα πεπτιδικής σύνθεσης

Η σύνθεση των γραμμικών πεπτιδίων της παρούσας εργασίας επιτελέστηκε βάση της κλασσικής Fmoc/t Bu μεθοδολογίας σε στερεή φάση, επί της Sieber Amide ρητίνης. Όλα τα γραμμικά πεπτίδια συντέθηκαν με αποδόσεις από 68% έως 80% υπολογισμένη επί της ποσότητας του συνδέτη αρχικά συζευγμένου με τη ρητίνη και η καθαρότητα των ακατέργαστων γραμμικών αναλόγων κυμαίνονταν από 78-85%. (Πίνακας Β.3.1) Τα πεπτίδια εν συνεχεία υπέστησαν οξείδωση για την παραλαβή των τελικών προϊόντων με τις δύο δισουλφιδικές γέφυρες. Η ανάλυση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε με χρωματογραφία RP-HPLC και φασματομετρία μάζας (ESI-MS). Αρχικά παρατίθενται τα φάσματα HPLC των γραμμικών πεπτιδίων, μετά την παραλαβή τους από την ρητίνη και εφόσον προϋπήρξε καθαρισμός και λυοφιλοποίηση.

Γράφημα Β.3.1: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του γραμμικού πεπτιδίου Aus-1S. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)].

74

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.2: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του γραμμικού πεπτιδίου Aus-2S. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min[(A):

διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)].

Γράφημα Β.3.3: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του γραμμικού πεπτιδίου Aus-3S. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min

75

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)].

Γράφημα Β.3.4: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του γραμμικού πεπτιδίου Aus-4S. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)].

Πίνακας Β.3.1: Αναλυτικά χαρακτηριστικά των συντιθέμενων γραμμικών πεπτιδίων με την Fmoc/tBu μεθοδολογία.

Ανάλογα Απόδοση Καθαρότητα ΗPLC MWcalc Rf

(%) (%) tR (min)

Aus-1Σ 94 96 6,3514 1909,134 0,35 [Cys (2_9, 3_15)]

Aus-2Σ 95 92 6,1835 1909,134 0,35 [Cys(3_9, 2_15)]

Aus-3Σ 89 94 6,6509 1922,694 0,37 [9_Aib, Ala]

Aus-4Σ 86 94 6,1161 1897,094 0,36 [10_Aib, Pro]

76

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Β.3.1. Σχηματισμός της πρώτης δισουλφιδικής γέφυρας

Για την επίτευξη της πρώτης δισουλφιδικής γέφυρας χρησιμοποιήθηκαν δύο

μέθοδοι οξείδωσης: α) η μέθοδος με το H2O2 και β) η μέθοδος με το DMSO όπως περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Γ.2.7. Τα αποτελέσματα και με τις δύο μεθόδους ήταν ικανοποιητικά τόσο σε απόδοση όσο και σε καθαρότητα, παρ’ όλα αυτά

όμως καταλήξαμε στη μέθοδο με τη χρήση H2O2 αντί της μεθόδου με χρήση DMSO διότι ο χρόνος της αντίδρασης είναι εξαιρετικά μικρότερος και ακόμη στη μέθοδο με το DMSO παρουσιάστηκε ιδιαίτερη δυσκολία στην απομάκρυνσή του κατά τη διαδικασία παραλαβής του πεπτιδίου. Ενδεικτικά, παρακάτω παρουσιάζονται χρωματογραφήματα HPLC των τεσσάρων συντιθέμενων πεπτιδίων μετά την επίτευξη του πρώτου δισουλφιδικού δεσμού και εφόσον προϋπήρξε καθαρισμός και λυοφιλοποίηση.

Γράφημα Β.3.1.1: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο

οξείδωσης με Η2Ο2. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)]

77

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.1.2: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο οξείδωσης με DMSO. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)]

Γράφημα Β.3.1.3: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-2S με την μέθοδο

οξείδωσης με H2O2. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)]

78

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.1.4: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-3S με την μέθοδο

οξείδωσης με H2O2. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)]

Γράφημα Β.3.1.5: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-4S με την μέθοδο

οξείδωσης με H2O2. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)]

79

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Β.3.2. Σχηματισμός της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας

Για την επίτευξη της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας χρησιμοποιήθηκε αρχικά η

μέθοδος οξείδωσης με 5 ισοδύναμα Ι2 (2,5 ισοδύναμα για κάθε Cys (Acm) όπως περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Γ.2.7. Ενδεικτικά, παρακάτω παρουσιάζονται χρωματογραφήματα HPLC για τα δύο γραμμικά πεπτίδια Aus-1S και Aus-2S στη συγκεκριμένη μέθοδο.

Γράφημα Β.3.2.1[α]: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την

μέθοδο οξείδωσης με 5eq I2 Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

80

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.2.1[β]: ESI-MS του οξειδωμένου πεπτιδίου Aus-1S της κορυφής tR2:7,1345min.

Γράφημα Β.3.2.2: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-2S με την μέθοδο

οξείδωσης με 5eq I2. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

81

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Όπως φαίνεται από τα παραπάνω χρωματογραφήματα η οξείδωση με 5eq Ι2 (45 min) για την επίτευξη της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας ενώ οδηγεί στο σωστό προϊόν η απόδοση και η καθαρότητα αυτού δεν ήταν ικανοποιητική. Γι’ αυτό

αποφασίστηκε αρχικά να επαναληφθεί η πειραματική πορεία με τα 5eq I2 και να συλλέγεται δείγμα από την αντίδραση σε διάφορους χρόνους για να παρατηρηθεί η πορεία της με τον χρόνο. Παρακάτω, παρουσιάζονται χρωματογραφήματα HPLC για το γραμμικό πεπτίδιο Aus-1S στη συγκεκριμένη μέθοδο όπου σε συγκεκριμένους χρόνους αντίδρασης συλλέχθηκε δείγμα και πραγματοποιήθηκε εξουδετέρωση της περίσσειας ιωδίου σύμφωνα με την παράγραφο Γ.2.7.

Γράφημα Β.3.2.3: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο

οξείδωσης με 5eq I2 σε χρόνο αντίδρασης 45 λεπτά. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

82

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.2.4: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο

οξείδωσης με 5eq I2 σε χρόνο αντίδρασης 1,30h . Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

Γράφημα Β.3.2.5: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο

οξείδωσης με 5eq I2 σε χρόνο αντίδρασης 3h . Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

83

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

Γράφημα Β.3.2.6: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο

οξείδωσης με 5eq I2 σε χρόνο αντίδρασης 24h . Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)] Από τα παραπάνω χρωματογραφήματα διαπιστώνεται ότι η αύξηση του χρόνου αντίδρασης δεν οδηγεί σε ικανοποιητικά αποτελέσματα ως προς την εικόνα του προϊόντος.

Γι’ αυτό το λόγο εν συνεχεία δοκιμάστηκαν πειραματικές πορείες όπου αυξήθηκαν τα ισοδύναμα ιωδίου. Παρακάτω, παρουσιάζονται χρωματογραφήματα HPLC για τα γραμμικά πεπτίδια στη μέθοδο οξείδωσης με 25 και 50 ισοδύναμα ιωδίου όπως αυτές περιγράφονται στην παράγραφο Γ.2.7.

84

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.2.7: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο

οξείδωσης με 25eq I2 . Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

Γράφημα Β.3.2.8: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-2S με την μέθοδο

οξείδωσης με 25eq I2 . Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

85

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.2.9: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο

οξείδωσης με 50eq I2 . Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

Στη μέθοδο οξείδωσης με 25 ισοδύναμα ιωδίου η εικόνα του προϊόντος και πάλι

δεν ήταν ικανοποιητική. Στη μέθοδο όμως οξείδωσης με 50eq I2 η εικόνα ήταν αρκετά καλή όσον αφορά την εικόνα του τελικού προϊόντος, ωστόσο ο καθαρισμός ωστόσο του πεπτιδίου από τα άλατα μετά την εξουδετέρωση της μεγάλης περίσσειας του ιωδίου κατέστη πολύ δύσκολος. Παρατήρηση: Όπως προαναφέρθηκε, στη μέθοδο οξείδωσης με τη χρήση ιωδίου, δοκιμάστηκαν πολλές πειραματικές πορείες που αναφέρονται στη βιβλιογραφία και μερικές φορές με παραλλαγές για την καλύτερη επίτευξη της αντίδρασης. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι η αντίδραση δεν είναι αρκετά σταθερή, τα άλατα επηρεάζουν το εκάστοτε πεπτίδιο κάθε φορά και είναι πολύ δύσκολη η απομάκρυνσή τους. Όπως φαίνεται και στα παραπάνω χρωματογραφήματα, η απόδοση και η καθαρότητα της αντίδρασης αλλάζει κάθε φορά.

Εφόσον, η μέθοδος οξείδωσης με ιώδιο δεν είχε τα επιθυμητά αποτελέσματα για την επίτευξη της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας, δοκιμάστηκε η μέθοδος με το σιλάνιο όπως αυτή περιγράφεται στην παράγραφο Γ.2.7.4. Παρακάτω παρατίθενται τα χρωματογραφήματα HPLC και οι μάζες ESI-MS των ολοκληρωμένων πεπτιδίων με τις

86

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

δύο δισουλφιδικές γέφυρες, όπου η δεύτερη έχει επιτευχθεί με τη μέθοδο οξείδωσης με σιλάνιο, και αφού έχει επέλθει καθαρισμός και λυοφιλοποίηση.

Γράφημα Β.3.12: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-1S με την μέθοδο οξείδωσης με σιλάνιο και ESI-MS του οξειδωμένου αναλόγου. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

tR(οξειδ.): 6,6337min, M(οξειδ.)=1762,48.

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

87

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.13: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-2S με την μέθοδο οξείδωσης με σιλάνιο και ESI-MS του οξειδωμένου αναλόγου. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

TR(οξειδ.): 6,4001min, M(οξειδ.)=.1761,67

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

88

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.14: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-3S με την μέθοδο οξείδωσης με σιλάνιο και ESI-MS του οξειδωμένου αναλόγου. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

TR(οξειδ.): 7,7331min, M(οξειδ.)= 1777,02

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcCN 0,01%(v/v)]

89

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γράφημα Β.3.15: Αναλυτικό χρωματογράφημα HPLC του πεπτιδίου Aus-4S με την μέθοδο οξείδωσης με σιλάνιο και ESI-MS του οξειδωμένου αναλόγου. Στήλη: Phenomenex C18,250x4,6mm, 5μm. Συνθήκες: 5% (B) σε 19min 60% (B), ροή: 1ml/min.

TR(οξειδ.): 6,5335 min, M(οξειδ.)= 1750,54

[(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)]

90

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πίνακας Β.3.2: Αναλυτικά χαρακτηριστικά των συντιθέμενων πεπτιδίων με την Fmoc/tBu μεθοδολογία μετά τον σχηματισμό των δύο δισουλφιδικών γεφυρών.

ΗPLC Ανάλογα Απόδοση (%) Καθαρότητα M.B tR (min)

Aus-1Σ [Cys (2_9, 56 86 6,6337 1762,48 3_15)]

Aus-2Σ [Cys(3_9, 52 82 6,4001 1761,67 2_15)]

Aus-3Σ 48 78 7,7331 1777,02 [9_Aib, Ala]

Aus-4Σ 51 78 6,5335 1750,54 [10_Aib, Pro]

B.4 Τελικά συμπεράσματα

Κατά τη σύνθεση των γραμμικών αναλόγων της παρούσας εργασίας δεν παρατηρήθηκε ιδιαίτερη δυσκολία πέρα από κάποιες επανασυζεύξεις που ίσως να χρειάστηκαν κυρίως για το αμινοξύ ιστιδίνη όπως φαίνεται αναλυτικά και στους πίνακες του Γ κεφαλαίου. Τα πεπτίδια παρελήφθησαν σε αρκετά υψηλές αποδόσεις και καθαρότητα. Αντίθετα, δυσκολίες κατά την οξείδωση των αναλόγων και την δημιουργία των δύο δισουλφιδικών δεσμών παρατηρήθηκαν σε όλα τα πεπτίδια με αναμενόμενες ωστόσο αποδόσεις και τελική καθαρότητα. Κατά την οξείδωση των αναλόγων η απόδοση της σύνθεσης δεν μειώνεται πολύ στα συγκεκριμένα ανάλογα.

Πιο συγκεκριμένα.

Ι) Δεν παρατηρήθηκαν ιδιαίτερα προβλήματα κατά την πρώτη οξείδωση. Και οι δύο μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ανέδειξαν ποιοτικά και ποσοτικά αποτελέσματα.

Ωστόσο επιλέχθηκε και προτιμήθηκε η μέθοδος με τη χρήση H2O2 αντί της μεθόδου με χρήση DMSO διότι ο χρόνος της αντίδρασης είναι εξαιρετικά μικρότερος. Ακόμη στη

91

Β.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

μέθοδο με το DMSO παρουσιάστηκε ιδιαίτερη δυσκολία στην απομάκρυνσή του κατά τη διαδικασία παραλαβής του πεπτιδίου.

ΙΙ) Όσον αφορά την δεύτερη οξείδωση για την επίτευξη της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας παρουσιάστηκαν έντονα προβλήματα στην μέθοδο με τη χρήση ιωδίου. Με τη συγκεκριμένη μέθοδο και σε όλες τις παραλλαγές όσον αφορά το χρόνο αντίδρασης και τα ισοδύναμα ιωδίου που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αρκετές οι φορές που υπήρξαν θετικά αποτελέσματα όσον αφορά την παραλαβή διοξειδωμένου προϊόντος αν και με εξαιρετικά μειωμένη απόδοση τις περισσότερες φορές λόγω αλάτων και παραπροϊόντων που αλλοίωναν την εικόνα του πεπτιδίου. Επειδή τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μεθόδου δεν ήταν πάντα επαναλήψιμα και ικανοποιητικά οδηγηθήκαμε στη μέθοδο οξείδωσης με τη χρήση σιλανίου. Τα αποτελέσματα με τη χρήση της συγκεκριμένης μεθόδου ήταν ιδιαίτερα ικανοποιητικά τόσο σε απόδοση όσο και σε καθαρότητα των συντιθέμενων πεπτιδίων.

92

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

93

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Γ. Πειραματικό Μέρος

Γ.1. Συσκευές-Όργανα-Υλικά

Η σύνθεση των αναλόγων πραγματοποιήθηκε με την Fmoc/tBu μεθοδολογία σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση επί της Sieber Αmide ρητίνης. Η συσκευή στην οποία πραγματοποιήθηκε η ανοικοδόμηση των αλληλουχιών των νέων αναλόγων, αποτελείται από μία υάλινη φιάλη αντίδρασης (vessel) (2 x 10 ή 3 x 15 cm) εφοδιασμένη στο πάνω μέρος με άνοιγμα και βιδωτό πώμα (κατασκευασμένο συνήθως από Teflon) και στο κάτω μέρος με πορώδες φίλτρο (G-2), στρόφιγγα και ακροφύσιο για την απόρριψη των υγρών από τις διηθήσεις με εφαρμογή κενού. (Σχήμα Γ.1).

Σχήμα Γ.1.: Φιάλη αντίδρασης για σύνθεση πεπτιδίων σε στερεή φάση (SPPS) .

Ο καθαρισμός των crude πεπτιδίων έγινε με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (size exclusion chromatography) ή αλλιώς χρωματογραφία διηθήσεως πηκτής (gel filtration chromatography) χρησιμοποιώντας Sephadex G-15 και εκλούτη διάλυμα AcOH 25%. Η ροή του εκλούτη ρυθμίζεται με τη βοήθεια αντλίας (Pharmacia LKB-Pumb) στα 6ml/hr. Στη χρωματογραφία πηκτής

94

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Σχήμα Γ.2: Ενδεικτική απεικόνιση στήλης χρωματογραφίας πηκτής

απομακρύνονται τα μικρότερα πεπτιδικά μόρια, καθώς και οποιασδήποτε μορφής άλατα. Το Sephadex είναι ένα προϊόν ευρείας χρήσης, το οποίο παρασκευάζεται από τις δεξτράνες των πολυσακχαριτών με διασταυρώσεις από επιχλωρυδρίνη. Με κατάλληλες συνθήκες μπορεί να ελεγχθεί ο αριθμός των δεσμών διασταύρωσης και συνεπώς το μέγεθος των πόρων. Κάθε Sephadex τύπου G είναι κατάλληλο για τον διαχωρισμό ουσιών των οποίων τα μοριακά βάρη βρίσκονται σε μια ορισμένη περιοχή. Ο διαχωρισμός αυτός στηρίζεται στο γεγονός ότι ανάλογα με την έκταση των δεσμών διασταύρωσης υπάρχει και ένα οριακό μέγεθος για το μόριο που του επιτρέπει να εισχωρεί στο εσωτερικό του. Τα μεγαλύτερα μόρια διέρχονται ταχύτερα μέσα από τη στήλη, ενώ τα μικρότερα, λόγω διαφορετικού βαθμού εισχώρησης στο εσωτερικό των πόρων, καθυστερούν σημαντικά. Για τη χρησιμοποίηση του Sephadex είναι αναγκαία η διόγκωσή του, η οποία πραγματοποιείται συνήθως με υδατικά διαλύματα (στην προκειμένη περίπτωση με οξικό οξύ 25%), οπότε και λαμβάνει τη μορφή gel.

Η καθαρότητα των πεπτιδίων πριν και μετά την χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού ελεγχόταν με αναλυτική χρωματογραφία υψηλής απόδοσης στη συσκευή Waters 2695. Η στήλη η οποία χρησιμοποιήθηκε για τις συγκεκριμένες μετρήσεις είναι η XB-C-18 Aeris pepetide 3,6u της Phenomenex με διαστάσεις 150*4.60mm .

95

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Εικόνα Γ.1: Συσκευή αναλυτικής χρωματογραφίας HPLC WATERS 2965 (Tμήμα Φαρμακευτικής, Eργαστήριο Φαρμακογνωσίας).

Για την ανίχνευση των προϊόντων μετρήθηκε η απορρόφηση στα 214 και 254 nm στην αναλυτική κλίμακα (με ροή 1ml/min), με φωτόμετρο-ανιχνευτή Waters 2484. Το διάλυμα έκλουσης ήταν μίγμα ακετονιτριλίου/νερού γραμμικά διαβαθμιζόμενης συγκέντρωσης, στο οποίο η συγκέντρωση TFA ήταν 0,1%. Η μεταβολές της σύστασης του συστήματος διαλυτών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής:

(A): διάλυμα TFA σε H2O 0,01%(v/v), (B): διάλυμα TFA σε AcN 0,01%(v/v)  5% B έως 60% B για 19 min και ροή 1 ml/min

 5% B έως 75% B για 19 min και ροή 1 ml/min

 5% B έως 95% Β για 19 min και ροή 1 ml/min

 5% B έως 75% Β για 36 min και ροή 1 ml/min

96

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Σχήμα Γ.2.: Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (HPLC) (εικόνα από την σελίδα της Sigma-Aldrich της εταιρείας Merck).

Τα φάσματα μάζας καταγράφηκαν με χαμηλή διαχωριστική ικανότητα σε φασματόμετρο μάζας κάτω από συνθήκες ιονισμού δια ψεκασμού ηλεκτρονίων (ESI- MS) με τη συσκευή Waters 2695 separation model, Photodial Array Detector: Waters 2996. Η καταγραφή των φασμάτων πραγματοποιήθηκε στο κέντρο ενόργανης ανάλυσης του τμήματος Γεωλογίας. Η επεξεργασία έγινε με το λογισμικό: massLynx. V4.1. Η φασματομετρία μάζας είναι μία ευαίσθητη τεχνική για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό χημικών ενώσεων. Βασίζεται στον διαχωρισμό των μαζών φορτισμένων σωματιδίων (κυρίως κατιόντων) με την βοήθεια κατάλληλης διάταξης (μαγνητική, τετραπόλου, χρόνου πτήσης) και την εύρεση της αντιστοιχίας των μαζών των λαμβανομένων ιόντων με την δομή της πρόδρομης ένωσης. Η αντιστοιχία αυτή προϋποθέτει την γνώση των διαδικασιών ιονισμού και επιπλέον του μηχανισμού της πιθανής θραυσματοποίησης των ιόντων.

Η λυοφιλοποίση των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκε σε συσκευή της εταιρίας Labconco, εφοδιασμένη με αντλία Edwards. Μεταξύ της αντλίας κενού και του της συσκευής λυοφιλοποίησης έχει συνδεθεί παγίδα λαδιού η οποία, σε περιπτώσεις βραχυκύκλωσης ή διακοπής ρεύματος, προφυλάσσει τον κάδο ψύξης του λυοφιλοποιητή από τυχόν διαρροές λαδιού.

97

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Εικόνα Γ.2: Επάνω: Συσκευή λυοφιλοποιητή LABCONCO (freeze dry system- freezone 6) Κάτω: αντλία κενού EDWARDS (Τμήμα Φαρμακευτικής, Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας).

Για την συμπύκνωση υπό ελαττωμένη πίεση των ενδιάμεσων διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκε η συσκευή Büchi (Rotavapor R-200 και Heatinh Bath B-490).

98

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Εικόνα Γ.3: Συσκευή συμπύκνωσης Büchi Rotavapor R-200 (Τμήμα Φαρμακευτικής, Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας).

Τα αμινοξέα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν προέρχονται από τις εταιρείες Bachem Inc., Nova-Biochem και Chemical and Biochemical Laboratories of Patras SA. Η Sieber Amide ρητίνη ήταν της εταιρείας Novabiochem (Πίνακας Γ.1.1.).

99

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πίνακας Γ.1.1. Τα αμινοξέα που χρησιμοποιήθηκαν για την σύνθεση των αναλόγων της παρούσας εργασίας και οι εταιρείες από τις οποίες προμηθεύτηκαν.

Αμινοξέα Εταιρεία Fmoc-Ser(tBu)-OH CBL LOT:IFAA-1190.040507 Fmoc-Cys(Trt)-OH CBL LOT:3179 Fmoc-Cys(Acm)-OH Novabiochem 04-12-1014;A31231 Fmoc-Ala-OH CBL LOT:2221 Fmoc-Arg(Pbf)-OH CBL LOT:3386 Fmoc-Asn(Trt)-OH CBL iFAA-1015040915 Fmoc-Pro-OH CBL LOT:2857 Fmoc-His(Trt) OH CBL LOT:2460 Fmoc-Val-OH CBL LOT:2255 Fmoc-Aib-OH CBL

Γ.2. Γενικές Πορείες Σύνθεσης

Στην Fmoc/tBu επί στερεής φάσης μεθοδολογία που ακολουθείται, η σύνθεση της πεπτιδικής αλυσίδας πραγματοποιείται από το C-τελικό προς το N-τελικό άκρο του πεπτιδίου, με το C-τελικό αμινοξύ να συνδέεται με ομοιοπολικό δεσμό σε μία χαρακτηριστική ομάδα ενός αδιάλυτου-στις συνθήκες σύνθεσης- υποστρώματος. Η αντίδραση προχωράει με διαδοχικούς κύκλους απομάκρυνσης της Nα-προστατευτικής ομάδας και σύζευξης του επόμενου αμινοξέος. Ανάμεσα στους κύκλους παρεμβάλλονται εκπλύσεις με κατάλληλους διαλύτες προκειμένου να απομακρυνθούν

100

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

τυχόν αδιάλυτα παραπροϊόντα, αλλά και να προετοιμαστεί το στερεό υπόστρωμα για την επόμενη αντίδραση. Για τη σύζευξη των αμινοξέων εφαρμόστηκε πρωτόκολλο σύνθεσης, το οποίο έχει αναπτυχθεί στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων όπως περιγράφεται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας Γ.2.1).

Πίνακας Γ.2.1. Πρωτόκολλο πεπτιδικής σύνθεσης

Διαδικασία Αντιδραστήρια/Διαλύτες Αριθμός επαναλήψεων/Διάρκεια 1. Διόγκωση ρητίνης DMF (3x1min) 2. Fmoc-αποπροστασία 20% πιπεριδίνη σε DMF (1x5min) 3. Έκπλυση ρητίνης DMF (1x1min) 4. Fmoc-αποπροστασία 20% πιπεριδίνη σε DMF (1x10min) 5. Έκπλυση ρητίνης DMF (1x1min) 6. Fmoc-αποπροστασία 20% πιπεριδίνη σε DMF (1x5min) 7. Έκπλυση ρητίνης DMF x2 (3x1min) x2 iPrOH x2 (2x1min) x2 αιθέρας (2x3min) 8. Διόγκωση ρητίνης DMF (3x2min) 9. Ενεργοποίηση Α.Α Ανάλογα με τα αντιδραστήρια Εξαρτάται από την μέθοδο σύζευξης που που επιλέχθηκε χρησιμοποιούνται κάθε φορά. 10. Σύζευξη Fmoc A.A ενεργοποιημένο Ανάλογα με τα αντιδραστήρια σύζευξης που χρησιμοποιούνται 11. Έκπλυση ρητίνης DMF x2 (3x1min) x2 iPrOH x2 (2x1min) x2 διαιθυλαιθέρας (2x3min)

Γ.2.1. Στερεό υπόστρωμα

Το στερεό υπόστρωμα αποτελείται από κόκκους συνθετικής ρητίνης, που φέρει σε ορισμένη υποκατάσταση κέντρα, χημικά τροποποιημένα με την εισαγωγή

101

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

χαρακτηριστικής ομάδας. Σήμερα, υπάρχει η δυνατότητα επιλογής ρητινών “φορτωμένων” με αμινοξύ (οπότε στην στην περίπτωση αυτή η σύνθεση ξεκινά ουσιαστικά από το δεύτερο από το τέλος αμινοξύ) ή ρητινών από τις οποίες παραλαμβάνεται πεπτίδιο υπό τη μορφή αμιδίου.

Το πρώτο βήμα είναι η πολύ καλή διόγκωση του στερεού υποστρώματος, έτσι ώστε τα ενεργά κέντρα να είναι προσβάσιμα από το πρώτο αμινοξύ που θα προστεθεί. Σε περίπτωση ρητίνης που φέρει προστατευτική ομάδα (όπως στην παρούσα εργασία), προηγείται η απομάκρυνση αυτής με διάλυμα πιπεριδίνης 20% σε DMF.

Γ.2.2. Ενεργοποίηση και σύζευξη Fmoc- Nα αμινοξέων

Η σύζευξη των Fmoc-Nα-αμινοξέων πραγματοποιείται με τέσσερις διαφορετικούς συνδυασμούς αντιδραστηρίων σύζευξης. Αναλυτικότερα:

1) Ενεργοποίηση με την μέθοδο DIC/HOBt. Για τον σκοπό αυτό προζυγισμένη ποσότητα του Fmoc-Nα-αμινοξέος και του HOBt διαλύονται στην ελάχιστη δυνατή ποσότητα DMF. Το διάλυμα ψύχεται στους 0οC και προστίθεται η ανάλογη ποσότητα DIC. Ακολουθεί ανάδευση για 10 min στον πάγο, και για άλλα 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα προστίθεται στην συσκευή της σύνθεσης. Η αντίδραση σύζευξης ολοκληρώνεται σε 3h. Ακολουθεί απομάκρυνση του διαλύματος με διήθηση υπό κενό και πλύσεις διαδοχικά με DMF/iPrOH. Η αναλογία που χρησιμοποιείται είναι Fmoc- AA-OH/DIC/HOBt 1:1,1:1,5.

2) Ενεργοποίηση με την μέθοδο των ουρονικών παραγώγων, με αντιδραστήρια σύζευξης τα: TBTU/DIEA ή collidine/ΗΟBt. Προζυγισμένη ποσότητα των Fmoc-Nα- αμινοξέος, TBTU και HOBt διαλύονται στην ελάχιστη δυνατή ποσότητα DMF. Εν συνεχεία προστίθεται η μισή ποσότητα DIEA, το διάλυμα αφήνεται για ενεργοποίηση για 5min και προστίθεται στην συσκευή της σύνθεσης μαζί με την υπόλοιπη ποσότητα DIEA. Η Collidine χρησιμοποιείται αντί για DIEA όταν το αμινοξύ που προστίθεται είναι κυστεΐνη. Η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 1-2h. Κατά την διάρκεια της αντίδρασης ελέγχεται συνεχώς το pH και διατηρείται στην περιοχή 7,5-8 με προσθήκη DIEA ή collidine, αντίστοιχα. Η αναλογία Fmoc-Α.Α/ TBTU/DIEA ή collidine/HOBt είναι: 1/1/2/1.5. Όπως και πριν, μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, το διάλυμα απομακρύνεται με διήθηση υπό κενό και ακολουθούν πλύσεις διαδοχικά με DMF/iPrOH.

102

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

3) ενεργοποίηση με τηΝ μέθοδο των ουρονικών παραγώγων και αντιδραστήρια σύζευξης ΗATU/DIEA σε αναλογία Fmoc-Α.Α/ ΗATU/DIEA:1./1/2. Η μεθοδολογία είναι η ίδια όπως αναφέρθηκε παραπάνω.

Σε όλες τις μεθόδους που αναφέρθηκαν το Fmoc-αμινοξύ που προστίθεται στην πεπτιδική αλυσίδα είναι σε 2 ή 3 φορές μοριακή περίσσεια ως προς την υποκατάσταση της ρητίνης και ο έλεγχος της πορείας της σύζευξης γίνεται με test Kaiser ή test Chloranil.

Γ.2.3. Διαδικασία πλύσεων

Μετά από κάθε σύζευξη ή απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας, ακολουθούν

πλύσεις της ρητίνης με DMF και iPrOH και ακολουθεί ξήρανση με Et2O όπως περιγράφεται στον πίνακα Γ.2.1.

Γ.2.4. Γενική μέθοδος απομάκρυνσης της Να-Fmoc-ομάδας

Η απομάκρυνση της Fmoc-προστατευτικής ομάδας επιτυγχάνεται με κατεργασία της ρητίνης σε διάλυμα 20% (v/v) πιπεριδίνης σε DMF για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί δεύτερη κατεργασία για 10 min από το ίδιο διάλυμα και μία τρίτη για άλλα 5min. Ενδιάμεσα στην δεύτερη και τρίτη κατεργασία με το διάλυμα πιπεριδίνης πραγματοποιείται μια πλύση με DMF. Μετά το πέρας των 20 min ακολουθεί διαδικασία των πλύσεων που περιγράφεται στον πίνακα Γ.2.1. Ο έλεγχος της πορείας της αντίδρασης γίνεται με το Kaiser test, ή με το Chlοranil test. Σε περίπτωση αποτυχίας της απομάκρυνσης μπορεί να επαναληφθεί σε μικρότερους χρόνους (5 min και 10 min ή 5 min και 5 min). Ακόμη υπάρχει η δυνατότητα πολλαπλών σύντομων προσθηκών πιπεριδίνης (5*2 min ή 5*3min).

Τέλος, όπου απαιτούνται ισχυρότερες συνθήκες (για παράδειγμα δύσκολων πεπτιδικών αλληλουχιών ή σύνθεση προχωρημένου σταδίου, όπου η στερεοδιάταξη του πεπτιδίου είναι τέτοια που εμποδίζει την εύκολη πρόσβαση των αντιδραστηρίων) μπορεί να χρησιμοποιηθεί διάλυμα DMF/DBU/Piperidine σε αναλογία 96:2:2 (v/v).

Γ.2.5. Έλεγχος συνθετικής πορείας με δοκιμές Kaiser και Chloranil

Ο έλεγχος της πορείας της αντίδρασης σύζευξης και της αποπροστασίας γίνεται με τη μέθοδο Kaiser και Chloranil. Με τις δοκιμές αυτές ανιχνεύονται ελεύθερες

103

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

αμινομάδες. Έτσι, θετικό αποτέλεσμα δηλώνει ημιτελή αντίδραση συζεύξεως, ενώ το αρνητικό δηλώνει ότι η αντίδραση συζεύξεως ήταν ποσοτική.

Στη δοκιμή Kaiser (Kaiser, E., et al, 1970), σε ένα δείγμα πεπτιδίου-ρητίνης (3 έως 5 mg) προστίθενται κατά σειρά 2-3 σταγόνες από τα παρακάτω διαλύματα:

 Διάλυμα 1: 500mg νινυδρίνης σε 10 ml 1-βουτανόλης  Διάλυμα 2: 80g φαινόλης σε 20 ml 1-βουτανόλης  Διάλυμα 3: 2 ml υδατικού διαλύματος 0,001 M KCN σε 98 ml πυριδίνης

Το μίγμα θερμαίνεται για 5min στους 1050C. Στην περίπτωση όπου το διάλυμα παραμένει κίτρινο και οι κόκκοι της ρητίνης λευκοί, η δοκιμή θεωρείται αρνητική ως προς την ύπαρξη ελεύθερης αμινομάδας. Αν το χρώμα των κόκκων, του διαλύματος ή και των δυο γίνει μπλε προς μωβ, η δοκιμή κρίνεται θετική οπότε απαιτείται επανασύζευξη ή ακετυλίωση των ελεύθερων αμινομάδων της ρητίνης. Σημειώνεται ότι η δοκιμή Kaiser έχει σχεδόν απόλυτη ευαισθησία για την ανίχνευση πρωτοταγών αμινομάδων, ενώ είναι αδύνατον να προσδιοριστούν οι ελεύθερες ιμινομάδες (π.χ. προλίνη). Η νινυδρίνη αντιδρά με την Να-αμινομάδα των αμινοξέων σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση και δίνει το μωβ του Ruhemann.

Σχήμα Γ.3.1. Δοκιμή Kaiser

Με τη δοκιμή Chloranil σε αντίθεση με τη δοκιμή Kaiser μπορούν να προσδιοριστούν και οι ελεύθερες ιμινομάδες.

104

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Ο έλεγχος με την δοκιμή Chloranil (Vojkovsky, T., 1995) γίνεται ως εξής: σε δείγμα του πεπτιδίου-ρητίνης προστίθενται 50μL κορεσμένου διαλύματος αντιδραστηρίου Chloranil σε τολουόλιο και 200μL ακετόνης στην περίπτωση των δευτεροταγών αμινών ή ακεταλδεΰδης για τις πρωτοταγείς αμίνες. Το δείγμα αναδεύεται για 5 min. Χρώση των κόκκων προς πρασινο-μπλε φανερώνει ημιτελή αντίδραση (Σχήμα Γ.3.2.).

Σχήμα Γ.3.2. Δοκιμή Chloranil

Γ.2.6. Απομάκρυνση πεπτιδίου από ρητίνη και απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων

Μετά την ολοκλήρωση της σύνθεσης της πεπτιδικής αλληλουχίας ακολουθεί η αποκοπή του πεπτιδίου από το στερεό υπόστρωμα, μαζί με την απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων των πλευρικών αλυσίδων στα διάφορα αμινοξέα. Η πλέον διαδεδομένη διαδικασία περιλαμβάνει κατεργασία με TFA, ωστόσο οι όξινες συνθήκες δημιουργούν μια σειρά κατιόντων που εύκολα μπορούν να επηρεάσουν ευαίσθητα σημεία μέσα στο μόριο, οδηγώντας σε σημαντικό αριθμό παραπροϊόντων. Η ελαχιστοποίηση των παραπροϊόντων μπορεί να επιτευχθεί με την προσθήκη, στο διάλυμα της αντίδρασης, ενώσεων που δεσμεύουν τα παραγόμενα κατιόντα. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν μερικοί από τους ευρύτερα χρησιμοποιούμενους δεσμευτές κατιόντων (scavengers) όπως:

HS-CH2CH2-SH

Ανισόλη 1,2-αιθανοδιθειόλη (EDT)

105

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

τρι-ισοπρόπυλο-σιλάνιο

Πριν την κατεργασία της ρητίνης με τον διάλυμα του σπασίματος είναι απαραίτητη η απομάκρυνση της Να-τελικής Fmoc προστατευτικής ομάδας και εν συνεχεία το πολύ καλό πλύσιμο της ρητίνης και ξήρανση με διαιθυλαιθέρα.

Το σύστημα το οποίο επιλέχθηκε για την απομάκρυνση του πεπτιδίου από την ρητίνη και την ταυτόχρονη απομάκρυνση των πλάγιων προστατευτικών ομάδων ήταν

το TFA/TIS/H2O/EDT σε αναλογίες 92:2:2:4 (v/v)..

Η πεπτιδορητίνη μεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη και το διάλυμα προστίθεται υπό ανάδευση κατά τα 2/3 στην αρχή σε διάταξη με παγόλουτρο και παροχή αργού και το υπόλοιπο 1/3 μετά από μία περίπου ώρα. Η διάρκεια της αντίδρασης εξαρτάται από το μήκος της πεπτιδικής αλυσίδας, τα περιεχόμενα αμινοξέα καθώς και της προστατευτικές ομάδες των πλευρικών τους αλυσίδων. Οι συνθήκες αυτές περιγράφονται για κάθε ανάλογο ξεχωριστά στο κεφάλαιο Γ.3.

Γ.2.7. Σχηματισμός Δισουλφιδικών Δεσμών

Τα ανάλογα που συντίθονται έχουν δύο δισουλφιδικούς δεσμούς. Ο εκλεκτικός σχηματισμός των δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ συγκεκριμένων κυστεϊνών γίνεται επιλέγοντας κυστεΐνες με διαφορετικές S-προστατευτικές ομάδες, ανά δύο ίδιες και εκλεκτική απομάκρυνση αυτών. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις μέθοδοι:[17,18,76,87]

Γ.2.7.1) Κατά την πρώτη μέθοδο η οξείδωση των SH-ομάδων πραγματοποιείται με υδατικό διάλυμα 15%-20% DMSO σε όγκο τέτοιο ώστε να ισχύει 1,2mL διαλύματος/mg πεπτιδίου. Η ολοκλήρωση της αντίδρασης απαιτεί από 24-48 ώρες και ελέγχεται με δοκιμή Ellman. Στις περιπτώσεις εκείνες που υπάρχουν προβλήματα διαλυτότητας του πεπτιδίου στο διάλυμα, ένα μέρος του νερού αντικαθίσταται με ακετονιτρίλιο.[17,18,76,87]

Γ.2.7.2) Στην δεύτερη μέθοδο η οξείδωση των SH-ομάδων πραγματοποιείται

με αραιό υδατικό διάλυμα H2O2 30%. Πιο αναλυτικά, παρασκευάζεται διάλυμα αραιού

106

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

H2O2 όπου σε 980μl νερού τοποθετούνται 20μl H2O2 30%. Έπειτα, προετοιμάζεται το διάλυμα του πεπτιδίου όπου προστίθεται διάλυμα AcCN/νερού στο πεπτίδιο (1:1, v/v) ώστε να ισχύει 1,0mL διαλύματος/mg πεπτιδίου. Ακολούθως, προστίθενται μερικές

σταγόνες NH4OH μέχρι το pΗ του διαλύματος να φτάσει στο 8-8.5. Στη συνέχεια,

τοποθετείται η απαιτούμενη ποσότητα αραιού διαλύματος H2O2 και το διάλυμα της αντίδρασης αφήνεται σε ήπια ανάδευση για 2 ώρες. Στο τέλος, αφού γίνει το απαραίτητο τεστ (Ellman) για τον έλεγχο της οξείδωσης, τοποθετείται στάγδην TFA έως ότου το pΗ του διαλύματος φτάσει στην τιμή 2.[17,18]

Γ.2.7.3) Στη τρίτη μέθοδο χρησιμοποιείται η οξείδωση μέσω ιωδίου. Στη μέθοδο αυτή οι κυστεΐνες είναι προστατευμένες συνήθως με ακεταμιδομεθυλομάδα ή τριφαινυλομάδα (Kamber, B. Et al,1980; Marayama, T. Et al, 1999). Πιο αναλυτικά, το

πεπτίδιο διαλύεται σε διάλυμα CH3COOH/H2Ο σε αναλογία 4:1 (v/v) και σε όγκο τέτοιο ώστε να προκύψει διάλυμα με συγκέντρωση 2mg/ml. Εν συνεχεία προστίθενται

ισοδύναμα Ι2 (έγιναν δοκιμές με 5, 25 και 50 ισοδύναμα). Το διάλυμα αναδεύεται για 30-45min μέχρι να ολοκληρωθεί η αντίδραση. Ο έλεγχος γίνεται με δοκιμή Ellman. Η

απομάκρυνση του Ι2, πραγματοποιείται με την προσθήκη 3Μ διαλύματος θειοθειικού

νατρίου (Na2S2O3) μέχρι να επέλθει πλήρως αποχρωματισμός. Το πεπτίδιο παραλαμβάνεται με λυοφιλοποίηση. [17,18]

Γ.2.7.4) Στην τέταρτη μέθοδο χρησιμοποιείται η οξείδωση με σιλάνιο. Πιο αναλυτικά, το πεπτίδιο διαλύεται σε ποσότητα τριφθοροξικού οξέος τέσσερις φορές τα mmol του πεπτιδίου. Προστίθενται 10 ισοδύναμα διφαινυλο σουλφοξείδιο [PhS(O)Ph],

100 ισοδύναμα ανισόλης και 100 ισοδύναμα τριχλωρο-μεθυλο-σιλάνιο (MeSiCl3). Το διάλυμα αναδεύεται υπό αδρανείς συνθήκες (ατμόσφαιρα Αr) για 24 ώρες. Ακολουθεί συμπύκνωση υπό ελαττωμένη πίεση. Στο ελαιώδες υπόλειμμα προστίθενται διάλυμα 15% οξικού οξέος και διαιθυλαιθέρας όπου γίνονται 3 εκχυλίσεις για την

απομάκρυνση των PhS(O)Ph & MeSiCl3. Συλλέγεται η υδατική φάση και το πεπτίδιο παραλαμβάνεται με λυοφιλοποίηση. [17,18,76,87]

Γ.2.8. Έλεγχος ύπαρξης ελεύθερων σουλφυδρυλομάδων

Η δοκιμή Ellman (Ellman, G.L, 1959) χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της ύπαρξης ελεύθερων σουλφυδρυλομάδων. Η δοκιμή βασίζεται στην αντίδραση του 5, 5’-διθειο-δις(2 νιτροβενζοϊκό οξύ) (DNTB) με αλειφατικές θειόλες, η οποία οδηγεί στο

107

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

σχηματισμό ενός κίτρινου ανιόντος, όπου η βέλτιστη απορρόφηση του είναι στα 412nm (Σχήμα Γ.2.3). Η απορρόφηση του διαλύματος μπορεί να μετρηθεί ώστε να καθοριστεί και η συγκέντρωση των θειολών. Η δοκιμή πραγματοποιείται ως εξής: σε μία πλάκα TLC τοποθετούνται πέντε σταγόνες από το διάλυμα της οξείδωσης και μία σταγόνα από το διάλυμα Ellman [40mg 5,5'-δισουλφονοδιυλ δις- (2-νιτροβενζοϊκό οξύ) σε ρυθμιστικό διάλυμα με pH 8]. Η εμφάνιση κίτρινου ή πορτοκαλί χρώματος υποδηλώνει την ύπαρξη ελεύθερων σουλφιδρυλομάδων. Εάν οι σταγόνες του διαλύματος οξείδωσης δεν χρωματιστούν από την προσθήκη της σταγόνας Ellman τότε η οξείδωση έχει ολοκληρωθεί.

Σχήμα Γ.2.3. Δοκιμή Ellman

Γ.3. Στάδια Σύνθεσης των πεπτιδίων

Η σύνθεση όλων των αναλόγων πραγματοποιείται με την Fmoc/tBu μεθοδολογία σε στερεά φάση «βήμα προς βήμα». Παρακάτω περιγράφονται τα στάδια της σύνθεσης ξεχωριστά για κάθε πεπτίδιο.

Γ.3.1 Γραμμικό πεπτίδιο Aus-1Σ [Cys 2_9(Τrt), Cys 3_15(Acm)]

Στο ανάλογο Aus-1Σ, με μοριακό βάρος 1909,234, χρησιμοποιείται για την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας ως στερεό υπόστρωμα η ρητίνη Sieber Amide υποκατάστασης 0.65mmol/g και για την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού, η μέθοδος DIC/HOBt. Χρησιμοποιείται περίσσεια αμινοξέος 2 φορές την θεωρητική τιμή υποκατάστασης της ρητίνης με αναλογίες αμινοξύ/HOBt/DIC: 1/1,5/1. Η διάρκεια κάθε σύζευξης είναι 2 ώρες.

108

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πίνακας: Γ.3.1. Αλληλουχία του Aus-1Σ

Κωδικός Αλληλουχία 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aus-1Σ H2NSer -Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Pro -Ala -Cys -Arg - 11 12 13 14 15 16 His -Asn -His -Pro -Cys -Val -NH2 Πίνακας: Γ.3.2. Ποσότητες των αμινοξέων που χρησιμοποιήθηκαν για το ανάλογο Aus-1Σ

Ονομασία Μ.Β Ποσότητα Διάρκεια Test (mg) (ώρες) Chloranil Fmoc-Val-OH 339,4 68,56 overnight* (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 83,72 2 (-) Fmoc-Pro-OH 337,4 68,15 2 (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 125,18 2 (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 120,53 Overnight (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 125,18 2 (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 131,058 2 (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 118,31 2 (-) Fmoc-Ala-OH 311,3 62,88 Overnight (-) Fmoc-Pro-OH 337,4 68,15 2 (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 120,53 2 (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 131,058 Overnight (-) Fmoc-Ala-OH 311,3 62,88 2 (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 83,72 2 (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 118,31 Overnight (-) Fmoc-Ser(tBu)-OH 383,4 77,45 2 (-)

*στη σύζευξη overnight, η ποσότητα του HOBt που προστίθεται είναι 50% πάνω από αυτή που έχει υπολογισθεί, δηλαδή 69,6mg.

Οι κυστεΐνες στις θέσεις 2 και 9 είναι προστατευμένες με Trt-ομάδα, ενώ οι κυστεΐνες στις θέσεις 3 και 15 με την Acm-ομάδα. Η διαδικασία της σύνθεσης περιγράφεται στον πίνακα Γ.2.1.

109

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Μετά την προσθήκη και του τελευταίου αμινοξέος στην πεπτιδική αλυσίδα ακολουθεί η απόσπαση του πεπτιδίου από το στερεό υπόστρωμα. Κατά την συγκεκριμένη διαδικασία χρησιμοποιούνται 10ml διαλύματος 92% τριφθοροξικού

οξέος TFA, 2% τριεθυλο- σιλανίου TES, 2% υπερκάθαρου νερού H2O και 4% αιθανο- διθειόλης EDT. Το διάλυμα τοποθετείται με ιδιαίτερη προσοχή στο πεπτίδιο ώστε να μην υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα. Στην περίπτωση που υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα προστίθεται διχλωρομεθάνιο ώστε να παρασυρθούν οι κόκκοι στο διάλυμα. Ακολούθησε ανάδευση υπό αδρανείς συνθήκες για 3 ώρες και 30 λεπτά. Ακόμη επισημαίνεται ότι στην πρώτη 1,30 ώρα ανάδευσης τοποθετήθηκε παγόλουτρο στη διάταξη. Ακολουθεί έκπλυση της ρητίνης με διχλωρομεθάνιο σε ηθμό πορώδους No 4. Το διήθημα συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση και το ελαιώδες υπόλειμμα καταβυθίζεται έπειτα από κατεργασία με διαιθυλαιθέρα. Τέλος, ζυγίζεται σε ζυγό ακριβείας το πεπτίδιο, συλλέγεται και σφραγίζεται ερμητικά κλειστά σε ειδικό φυαλίδιο.

Εν συνεχεία, ακολουθείται διαδικασία οξειδώσεων για την απομάκρυνση των Trt και Acm αντίστοιχα ομάδων από τις κυστεΐνες για τη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών.

Γ.3.1.1: Διαδικασία σχηματισμού της πρώτης δισουλφιδικής γέφυρας του αναλόγου Aus-1Σ

Για την οξείδωση των Cys 2_9 χρησιμοποιήθηκαν δύο πειραματικές μεθόδοι.

Σύμφωνα με τη μέθοδο στην παράγραφο Γ.2.7.2 σε 50mg πεπτιδίου

τοποθετούνται 50ml διαλυτών AcCN/H2O σε αναλογία 1:1. Στη συνέχεια ρυθμίζεται το pH, του διαλύματος με το πεπτίδιο, στο 7-8 τοποθετώντας στάγδην διάλυμα 25%

NH4OH. Έπειτα τοποθετούνται 130μL αραιού διαλύματος H2O2. Ακολουθεί ανάδευση 1 ώρα και 45 λεπτά, όπου μετά το πέρας της ανάδευσης πραγματοποιείται τεστ Ellman για τον έλεγχο των ελεύθερων σουλφυδριλικών ομάδων. Τέλος, προστίθεται στάγδην TFA για την ρύθμιση του pH στην τιμή 2. Το δείγμα τοποθετείται για λυοφιλοποίηση για 24 ώρες.

110

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Σύμφωνα με τη μέθοδο στην παράγραφο Γ.2.7.1 ποσότητα 50mg από το πεπτίδιο αφήνεται 24-48 ώρες σε 50ml υδατικό διάλυμα 25% DMSO για να δημιουργηθεί ο δισουλφιδικός δεσμός. Η πορεία της αντίδρασης παρακολουθείται με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Για κάθε mg απροστάτευτου πεπτιδίου

απαιτείται 1ml διαλύματος 25% DMSO σε H2O. Τέλος το δείγμα τοποθετείται για λυοφιλοποίηση για 24 ώρες.

Γ.3.1.2: Διαδικασία σχηματισμού της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας αναλόγου Aus-1Σ

Στην δεύτερη οξείδωση, για την απομάκρυνση των Acm ομάδων από τις Cys 3_15 και ταυτόχρονη δημιουργία του δισουλφιδικού δεσμού, χρησιμοποιήθηκαν 4 πειραματικές πορείες.

Σύμφωνα με τη μέθοδο στην παράγραφο Γ.2.7.3 όπου στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία χρησιμοποιούνται 2,5 ισοδύναμα μεθανολικού ιωδίου για κάθε

Acm ομάδα. Σε 50mg πεπτιδίου τοποθετούνται αντίστοιχα 50ml διαλυτών AcCN/H2O σε αναλογία 1:1. Εν συνεχεία, τοποθετούνται 260μL μεθανολικού ιωδίου και το μίγμα αφήνεσαι σε ανάδευση για 1.45 h. Για την εξουδετέρωση του ιωδίου και την

ολοκλήρωση της αντίδρασης χρησιμοποιείται διάλυμα θειοθειικού νατρίου (Νa2S2O3) σε νερό 0,5Μ, όπου απαιτήθηκαν περίπου 2ml. Τέλος το δείγμα τοποθετείται για λυοφιλοποίηση για 24 ώρες.

Σύμφωνα με τη μέθοδο στην παράγραφο Γ.2.7.3 όπου στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία χρησιμοποιούνται 12,5 ισοδύναμα μεθανολικού ιωδίου για κάθε Acm ομάδα. Σε 50mg πεπτιδίου προετοιμάζονται αντίστοιχα 50ml διαλυτών

AcOH/H2O σε αναλογία 4:1. Τα 25ml της ποσότητας των διαλυτών τοποθετούνται στο πεπτίδιο και στο υπόλοιπο μισό διαλύονται 79,3125mg ιωδίου. Εν συνεχεία, εντός χρόνου 10 λεπτών τοποθετείται, στάγδην, το διάλυμα του πεπτιδίου στο διάλυμα του ιωδίο και ακολουθεί ανάδευση για 45 λεπτά. Για την εξουδετέρωση του ιωδίου και την

ολοκλήρωση της αντίδρασης χρησιμοποιείται διάλυμα θειοθειικού νατρίου (Νa2S2O3) σε νερό 1,5Μ. Τέλος το δείγμα τοποθετείται για λυοφιλοποίηση για 24 ώρες.

111

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Σύμφωνα με τη μέθοδο στην παράγραφο Γ.2.7.3 όπου στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία χρησιμοποιούνται 25 ισοδύναμα μεθανολικού ιωδίου για κάθε Acm

ομάδα. Σε 50mg πεπτιδίου προετοιμάζονται αντίστοιχα 50ml διαλυτών AcOH/H2O σε αναλογία 4:1. Τα 25ml της ποσότητας των διαλυτών τοποθετούνται στο πεπτίδιο και στο υπόλοιπο μισό διαλύονται 317,25mg ιωδίου. Εν συνεχεία, εντός χρόνου 10 λεπτών τοποθετείται, στάγδην, το διάλυμα του πεπτιδίου στο διάλυμα του ιωδίο και ακολουθεί ανάδευση για 45 λεπτά. Για την εξουδετέρωση του ιωδίου και την ολοκλήρωση της

αντίδρασης χρησιμοποιείται διάλυμα θειοθειικού νατρίου (Νa2S2O3) σε νερό 3Μ. Τέλος το δείγμα τοποθετείται για λυοφιλοποίηση για 24 ώρες.

Στην πειραματική πορεία με τη χρήση ιωδίο για τον σχηματισμό της δεύτερης δισουλφιδικής γέφυρας, εκτός από δοκιμές στα ισοδύναμα του ιωδίου, έγιναν και δοκιμές όσον αφορά το χρόνο της αντίδρασης. Πιο συγκεκριμένα, έγιναν δοκιμές για χρόνο αντίδρασης 1,5h, 3h και overnight.

Σύμφωνα με τη μέθοδο στην παράγραφο Γ.2.7.4 όπου στη συγκεκριμένη πειραματική πορεία σε 25mg πεπτιδίου,ως διαλύτης χρησιμοποιείται TFA σε ποσότητα 4 φόρες τα mmol του πεπτιδίου και συγκεκριμένα 4,8ml. Έπειτα, προστίθενται 24,3mg διφαίνυλο-σουλφοξείδιο (PhS(O)Ph) και 131μL ανισόλης. Στη συνέχεια, στο μίγμα

τοποθετούνται 141μL μεθύλ-3χλωρο-σιλάνιο (MeSiCl3) και ακολουθεί ανάδευση υπό αδρανής συνθήκες για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά το πέρας της αντίδρασης πραγματοποιείται συμπύκνωση του δείγματος χρησιμοποιώντας ως διαλύτη διχλωρομεθάνιο. Ακολουθεί προσθήκη 15% AcOH και αιθέρα όπου συλλέγεται η υδατική φάση και τοποθετείται για λυοφιλοποιήση για 24 ώρες.

Μετά το πέρας της εκάστοτε οξείδωσης, το πεπτίδιο καθαρίζεται με χρωματογραφία πηκτής σε Sephadex G-15 χρησιμοποιώντας σαν εκλούτη διάλυμα AcOH 25%. Ο πλήρης καθαρισμός του πεπτιδίου επιτυγχάνεται με τη χρησιμοποίηση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης, σε ημιπαρασκευαστική

στήλη C18 και εκλούτη σύστημα διαλυτών AcCN/H2O (0,1% TFA) μεταβαλλόμενης σύστασης συνολικά από 5-60% σε 19 λεπτά και σε μήκη κύματος 220 και 254nm.

Γ.3.2. Ανάλογο Aus-2Σ [Cys(2_15(Acm), 3_9(Trt)]

Στο ανάλογο Aus-2Σ, με μοριακό βάρος 1909,234, χρησιμοποιείται για την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας ως στερεό υπόστρωμα η ρητίνη Sieber Amide

112

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

υποκατάστασης 0.65mmol/g και για την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού, η μέθοδος DIC/HOBt. Χρησιμοποιείται περίσσεια αμινοξέος, 2 φορές την θεωρητική τιμή, και οι αναλογίες είναι: αμινοξύ/HOBt/DIC: 1/1,5/1. Η διάρκεια κάθε σύζευξης είναι 2 ώρες.

Πίνακας: Γ.3.3. Αλληλουχία του Aus-2Σ

Κωδικός Αλληλουχία

1 2 3 4 5 6 7 8 9 Aus-2Σ H2NSer -Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Pro -Ala -Cys - 10 11 12 13 14 15 16 Arg -His -Asn -His -Pro -Cys -Val -CONH2

Πίνακας: Γ.3.4. Ποσότητες των αμινοξέων που χρησιμοποιήθηκαν για το ανάλογο Aus-2Σ

Ονομασία Μ.Β Ποσότητα Διάρκεια Test (mg) (ώρες) Chloranil Fmoc-Val-OH 339,4 57,7 2 (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 70,46 2 (-) Fmoc-Pro-OH 337,4 57,36 2 (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 105,35 2 (+) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 105,35 2 (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 101,44 2 (+) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 101,44 2 (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 105,35 2 (+) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 105,35 2 (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 110,3 2 (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 99,6 2 (-) Fmoc-Ala-OH 311,3 53 2 (-) Fmoc-Pro-OH 337,4 57,36 2 (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 101,44 2 (+) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 101,44 2 (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 110,3 2 (-) Fmoc-Ala-OH 311,3 52,92 Overnight* (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 52,92 2 (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 70,46 Overnight (-)

113

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Fmoc-Ser(tBu)-OH 383,4 65,19 2 (-) *στη σύζευξη overnight, η ποσότητα του HOBt που προστίθεται είναι 50% πάνω από αυτή που έχει υπολογισθεί, δηλαδή είναι 69,6mg.

Οι κυστεΐνες στις θέσεις 3 και 9 είναι προστατευμένες με Trt-ομάδα, ενώ οι κυστεΐνες στις θέσεις 2 και 15 με την Acm-ομάδα. Η διαδικασία της σύνθεσης περιγράφεται στον πίνακα Γ.2.1.

Μετά την προσθήκη και του τελευταίου αμινοξέος στην πεπτιδική αλυσίδα ακολουθεί η απόσπαση του πεπτιδίου από το στερεό υπόστρωμα. Κατά την συγκεκριμένη διαδικασία χρησιμοποιούνται 10ml διαλύματος 90% τριφθοροξικού

οξέος TFA, 4% τριεθυλ-σιλανίου TES, 4% υπερκάθαρου νερού H2O και 2% αιθαν- διθειόλη EDT. Το διάλυμα τοποθετείται με ιδιαίτερη προσοχή στο πεπτίδιο ώστε να μην υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα. Στην περίπτωση που υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα προστίθεται διχλωρομεθάνιο ώστε να καταβυθιστούν οι κόκκοι στο διάλυμα. Ακολούθησε ανάδευση υπό αδρανείς συνθήκες για 4 ώρες. Ακόμη επισημαίνεται ότι στην πρώτη 1,30 ώρα ανάδευσης τοποθετήθηκε παγόλουτρο στη διάταξη. Ακολουθεί έκπλυση της ρητίνης με διχλωρομεθάνιο σε ηθμό πορώδους No 4. Το διήθημα συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση και το ελαιώδες υπόλειμμα καταβυθίζεται έπειτα από κατεργασία με διαιθυλαιθέρα. Τέλος, ζυγίζεται σε ζυγό ακριβείας το πεπτίδιο, συλλέγεται και σφραγίζεται ερμητικά κλειστά σε ειδικό φυαλίδιο.

Για την οξείδωση των κυστεϊνών και για τον καθαρισμό του πεπτιδίου ακολουθούνται οι μέθοδοι που περιγράφηκαν στην παράγραφο Γ.3.1.1 και Γ.3.1.2.

Γ.3.3. Ανάλογο πεπτίδιο Aus-1Σ (Αib8) = Aus-3Σ

Στο ανάλογο Aus-3Σ, με μοριακό βάρος 1922.694, χρησιμοποιείται για την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας ως στερεό υπόστρωμα η ρητίνη Sieber Amide υποκατάστασης 0.65mmol/g και για την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού, η μέθοδος DIC/HOBt. Χρησιμοποιείται περίσσεια αμινοξέος, 2 φορές την θεωρητική τιμή, και οι αναλογίες είναι: αμινοξύ/HOBt/DIC: 1/1,5/1. Η διάρκεια κάθε σύζευξης είναι 2 ώρες.

114

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πίνακας: Γ.3.5. Αλληλουχία του Aus-3Σ

Κωδικός Αλληλουχία

2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aus-3Σ H2NSer1-Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Pro -Aib -Cys -Arg - 11 12 13 14 15 16 His -Asn -His -Pro -Cys -Val -NH2

Πίνακας: Γ.3.6. Ποσότητες των αμινοξέων που χρησιμοποιήθηκαν για το ανάλογο Aus-3Σ

Ονομασία Μ.Β Ποσότητα Διάρκεια Test (mg) (ώρες) Chloranil Fmoc-Val-OH 339,4 68,56 Overnight* (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 83,72 2 (-) Fmoc-Pro-OH 337,4 68,15 Overnight (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 125,18 2 (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 120,53 Overnight (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 125,18 2 (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 131,058 Overnight (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 118,31 2 (+) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 118,31 Overnight (-) Fmoc-Aib-OH 325,36 65,73 2 (-) Fmoc-Pro-OH 337,4 68,15 2 (+) Fmoc-Pro-OH 337,4 68,15 2 (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 120,53 2 (+) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 120,53 Overnight (+) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 120,53 2 (+) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 120,53 2** (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 131,058 2** (-) Fmoc-Ala-OH 311,3 62,88 2 (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 83,72 Overnight (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 118,31 2 (-) Fmoc-Ser(tBu)-OH 383,4 77,45 Overnight (-)

115

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

*στη σύζευξη overnight, η ποσότητα του HOBt που προστίθεται είναι 50% πάνω από αυτή που έχει υπολογισθεί, δηλαδή είναι 69,6mg.

**στη συγκεκριμένη περίπτωση, λόγω δυσκολίας σύζευξης του αμινοξέος στην πεπτιδική αλυσίδα χρησιμοποιήθηκαν τα αντιδραστήρια σύζευξης HATU/DIEA σε ποσότητες 76,81mg και 70,37mg αντίστοιχα.

Οι κυστεΐνες στις θέσεις 2 και 9 είναι προστατευμένες με Trt-ομάδα, ενώ οι κυστεΐνες στις θέσεις 3 και 15 με την Acm-ομάδα. Στην θέση 8 της πεπτιδικής αλυσίδας τοποθετήθηκε το αμινοξύ Aib στη θέση του αμινοξέος Ala. Η διαδικασία της σύνθεσης περιγράφεται στον πίνακα Γ.2.1.

Μετά την προσθήκη και του τελευταίου αμινοξέος στην πεπτιδική αλυσίδα ακολουθεί η απόσπαση του πεπτιδίου από το στερεό υπόστρωμα. Κατά την συγκεκριμένη διαδικασία χρησιμοποιούνται 10ml διαλύματος 90% τριφθοροξικού

οξέος TFA, 2.5% τριεθυλo- σιλανίου TES, 2.5% υπερκάθαρου νερού H2O και 5% αιθανo-διθειόληw EDT. Το διάλυμα τοποθετείται με ιδιαίτερη προσοχή στο πεπτίδιο ώστε να μην υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα. Στην περίπτωση που υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα προστίθεται διχλωρομεθάνιο ώστε να παρασυρθούν οι κόκκοι στο διάλυμα. Ακολούθησε ανάδευση υπό αδρανείς συνθήκες για 4 ώρες. Ακόμη επισημαίνεται ότι στις πρώτες 2 ώρες ανάδευσης τοποθετήθηκε παγόλουτρο στη διάταξη. Ακολουθεί έκπλυση της ρητίνης με διχλωρομεθάνιο σε ηθμό πορώδους No 4. Το διήθημα συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση και το ελαιώδες υπόλειμμα καταβυθίζεται έπειτα από κατεργασία με διαιθυλαιθέρα. Τέλος, ζυγίζεται σε ζυγό ακριβείας το πεπτίδιο, συλλέγεται και σφραγίζεται ερμητικά κλειστά σε ειδικό φυαλίδιο.

Για την οξείδωση των κυστεϊνών και για τον καθαρισμό του πεπτιδίου ακολουθούνται οι μέθοδοι που περιγράφηκαν στην παράγραφο Γ.3.1.1 και Γ.3.1.2.

Γ.3.4. Ανάλογο πεπτίδιο Aus-1Σ (Αib7) = Aus-4Σ

Στο ανάλογο Aus-4Σ, με μοριακό βάρος 1897.094, χρησιμοποιείται για την ανοικοδόμηση της πεπτιδικής αλυσίδας ως στερεό υπόστρωμα η ρητίνη Sieber Amide υποκατάστασης 0.65mmol/g και για την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού, η μέθοδος

116

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

DIC/HOBt. Χρησιμοποιείται περίσσεια αμινοξέος, 2 φορές την θεωρητική τιμή, και οι αναλογίες είναι: αμινοξύ/HOBt/DIC: 1/1,5/1. Η διάρκεια κάθε σύζευξης είναι 2 ώρες.

Πίνακας: Γ.3.7. Αλληλουχία του Aus-4Σ

Κωδικός Αλληλουχία 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Aus-4Σ H2NSer -Cys -Cys -Ala -Arg -Asn -Aib -Ala -Cys -Arg - 11 12 13 14 15 16 His -Asn -His -Pro -Cys -Val -NH2 Πίνακας: Γ.3.8. Ποσότητες των αμινοξέων που χρησιμοποιήθηκαν για το ανάλογο Aus-4Σ

Ονομασία Μ.Β Ποσότητα Διάρκεια Test (mg) (ώρες) Chloranil Fmoc-Val-OH 339,4 64,49 overnight* (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 78,75 2 (-) Fmoc-Pro-OH 337,4 64,11 Overnight (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 117,75 2 (+) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 117,75 Overnight (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 113,38 2 (-) Fmoc-His(Trt)-OH 619,7 117,75 2 (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 123,28 Overnight (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 111,29 2 (-) Fmoc-Ala-OH 311,3 59,15 Overnight (-) Fmoc-Aib-OH 325,36 61,82 2 (-) Fmoc-Asn(Trt)-OH 596,7 113,38 Overnight (-) Fmoc-Arg(Pbf)-OH 648,8 123,28 2 (-) Fmoc-Ala-OH 311,3 59,15 2 (-) Fmoc-Cys(Acm)-OH 414,47 78,75 Overnight (-) Fmoc-Cys(Trt)-OH 585,7 111,29 2 (-) Fmoc-Ser(tBu)-OH 383,4 72,85 2 (-) *στη σύζευξη overnight, η ποσότητα του HOBt που προστίθεται είναι 50% πάνω από αυτή που έχει υπολογισθεί, δηλαδή είναι 65,46mg.

117

Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Οι κυστεΐνες στις θέσεις 2 και 9 είναι προστατευμένες με Trt-ομάδα, ενώ οι κυστεΐνες στις θέσεις 3 και 15 με την Acm-ομάδα. Στην θέση 7 της πεπτιδικής αλυσίδας τοποθετήθηκε το αμινοξύ Aib στη θέση του αμινοξέος Pro. Η διαδικασία της σύνθεσης περιγράφεται στον πίνακα Γ.2.1.

Μετά την προσθήκη και του τελευταίου αμινοξέος στην πεπτιδική αλυσίδα ακολουθεί η απόσπαση του πεπτιδίου από το στερεό υπόστρωμα. Κατά την συγκεκριμένη διαδικασία χρησιμοποιούνται 10ml διαλύματος 90% τριφθοροξικού

οξέος TFA, 2.5% τριεθυλ-σιλανίου TES, 2.5% υπερκάθαρου νερού H2O και 5% αιθαν- διθειόλη EDT. Το διάλυμα τοποθετείται με ιδιαίτερη προσοχή στο πεπτίδιο ώστε να μην υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα. Στην περίπτωση που υπάρχουν κόκκοι ρητίνης στα τοιχώματα προστίθεται διχλωρομεθάνιο ώστε να παρασυρθούν οι κόκκοι στο διάλυμα. Ακολούθησε ανάδευση υπό αδρανείς συνθήκες για 4 ώρες. Ακόμη επισημαίνεται ότι στις πρώτες 2 ώρες ανάδευσης τοποθετήθηκε παγόλουτρο στη διάταξη. Ακολουθεί έκπλυση της ρητίνης με διχλωρομεθάνιο σε ηθμό πορώδους No 4. Το διήθημα συμπυκνώνεται υπό ελαττωμένη πίεση και το ελαιώδες υπόλειμμα καταβυθίζεται έπειτα από κατεργασία με διαιθυλαιθέρα. Τέλος, ζυγίζεται σε ζυγό ακριβείας το πεπτίδιο, συλλέγεται και σφραγίζεται ερμητικά κλειστά σε ειδικό φυαλίδιο.

Για την οξείδωση των κυστεϊνών και για τον καθαρισμό του πεπτιδίου ακολουθούνται οι μέθοδοι που περιγράφηκαν στην παράγραφο Γ.3.1.1 και Γ.3.1.2.

118

Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

119 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[1]. Sebastien Dutertre and Richard J. Lewis*, The Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland, St Lucia, Queenland, Australia- CONE SNAIL BIOLOGY, BIOPROSPECTING AND CONSERVATION.

[2]. Jutty Rajan Prashanth, Andreas Brust, Ai-Hua Jin, Paul F Alewood, Sebastien Dutertre & Richard J Lewis*, Centre for Pain Research, Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Queensland, Australia, Institut des Biomolecules Max Mousseron, Universille Montpellier, 2 CNRS, Montpellier Cedex, France- Cone snail venomics: from novel biology to novel therapeutics

[3]. Jon-Paul Bingham, Robert K. Likeman, Joshua S. Hawley, Peter Y.C. Yu and A. Halford, Department of Molecular Biosciences and Bioengineering, University of Hawaii, Honolulu, HI, 96822, USA, Directorate of Army Health, Department of Defense, Canderra, ACT, 2600 Australia, Department of Medicine, Tripler Army Medical Center, 1 Jarrerr White Road, Honolulu, HI, 96859, USA- CONOTOXINS

[4]. Peter D. Anderson and Gyula Bokor, CBRN Consultant, Randolph, MA, USA, Staff Psychiatrist, Taunton State Hspital, Taunton, MA, USA- CONOTOXINS: Potencial Weapons from the Sea.

[5]. Sebastien Dutertre, Ai-hua Jin, Quentin Kaas, Alun Jonest, Paul F. Alewood and Richard J. Lewis- Deep Venomics Reveals the Mechanism for Expanded Peptide Diversity in Cone Snail Venom.

[6]. Burkhard Haefner, DDT Vol. 8, No. 12 June 2003- Drugs from the deep: marine natural products as drug candidates.

[7]. A.J. Kohn and J.W. Nybakken, Department of Zoology, University of Washington, Seattle, Washington, USA- Ecology of Conus on Eastern Indian Ocean Fringing Reefs: Diversity of Species and Resource Utilization, Marine Biology 29, 211- 234 (1975)

[8]. Baldomero M. Olivera, Jean Rivier, Jamie K. Scott, David R. Hillyard, and Lourdes J. Cruz- Minireview Conotoxins, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 266, No. 33, Issue of November 25, pp. 22067-22070, 1991.

120 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[9]. BALDOMERO M. OLIVERA, CRAIG WALKER, G. EDWARD CARTIER, DAVID HOOPER, AMEURFINA D. SANTOS, ROBERT SCHOENFELD, RESHMA SHETTY, MAREN WATKINS, PRADIP BANDYOPADHYAY AND DAVID R. HILLYARD, Departments of Biology and Pathology, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112, USA- Speciation of Cone Snails and Interspacific Hyperdivergence of Their Venom Peptides, Potential Evolutionary Significance of Introns,

[10]. Bruce G. Livett, David W. Sandall, David Keays, John Down, Ken R. Gayler, Narmatha Satkunanathan, Zeinab Khalil, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Bio21 molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, Victoria 3010, Australia, National Ageing Research Institute, University of Melbourne, Victoria 3010, Aystralia- Therapeutic applications of conotoxins that target the neuronal nicotinic acetylcholine receptor, Toxicon 48 (2006) 810-829.

[11]. Norelle L. Daly and David j. Craik, The University of Queensland, Institute for Molecular Bioscience and Australian Research Council Special Research Centre for Functional and Applied Genomics, Brisbane, QLD, Australia- Critical Review_ Structural Studies of Conotoxins, IUBMB Life, 61(2): 144-150, February 2009

[12]. G. Edward Cartier, Doju Yoshikami, William R. Gray, Siqin Luo, Baldomero M. Olivera, and J. Michael McIntosh from the Department of Biology and Psychiatry, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112- A New a-Conotoxin Which Targets α3β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors, vol. 271, No. 13, Issue of March 29, pp. 7522-7528, 1996

[13]. J. Michael McIntosh, Arik Hasson, Micha E. Spira, William R. Gray, Wenqin Li, Maren Marsh, David R. Hillyard, and Baldomero M. Olivera from the Departments of Biology, Pathology, and Psychiatry, University of Utah, Salt Lake City, Utah, 84112, the Department of Neurobiology, Institute of Life Sciences, The Hebrew University of Jerusalem, Jerusalem 91904 Israel, and The Interuniversity Institute for Marine Sciences, Eilat 88103, Israel- A New Family of Conotoxins That Blocks Voltage-gated Sodium Channels, vol. 270 No. 28, Issue of July 14, pp. 16796-16802, 1995.

121 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[14]. O. Buczek, G. Bulaj and B.M. Olivera Department of Biology, University of Utah, Salt Lake City, Utah 84112 (USA)- Conotoxins and the posttranslational modification of secreted gene products, Cell. Mol. Life Sci. 62 (2005) 3067-3079

[15]. Robert W Janes- α- Conotoxins as selective probes for nicotinic acetylcholine receptor subclasses.

[16]. Jutty Rajan Prashanth, Richard J. Lewis- An efficient transcriptome analysis pipeline to accelerate venom peptide discovery and characterization, Toxicon.

[17]. Κ. Μ. Bhaskara Reddy, Y. Bharathi Kumari, Dokka Mallikharjunasarma, Kamana Bullijatu, Vanjivaka Sreelatha, and Kuppanna Ananda, Chemical Research Division, Mylan Laboratories Ltd., Anrich Industrial Estate, Bollaram, Hyderabad 502325, India, Department of Chemistry, College of Engineering, Jawaharlal Nehru Technological University Hyderabad, Kukatpally, Hyderabad 500085, India- Large Scale Solid Phase Synthesis of Peptide Drugs: Use of Commercial Anion Exchange Resin as Quenching Agent for Removal of Iodine during Disulphide Bond Formation, Hindawi Publishing Corporation, Interational journal of peptides Volume 2012, Article ID 323907, 8 pages.

[18]. David Andeu, Fernando Albericio, Nuria A. Sole, Mark C. Munson, Marc Ferrer, and George Barany- Formation of Disulfide Bonds in Synthetic Peptides and Proteins.

[19]. D. W. Samdall, N. Satkunanathan, D. A. Keays, M. A. Polidano, X. Liping, V. Pham, J. G. Down, Z. Khalil, B. G. Livett, and K. R. Gayler, Department of Biochemistry and Molecular Biology and National Ageing Research Institute, The University of Melbourne, Victoria 3010, Australia- A Novel α- Conotoxin Identified by Gene Sequencing Is Active in Suppressing the Vascular Response to Selective Stimulation of Sensory Nerves in Vivo, Biochemistry 2003, 42, 6904-6911.

[20]. Baldomero M. Olivera- “Conus” Venom Peptides: Reflections from the Biology of Clades and Species, Annual Review of Ecology and Systematics, Vol. 33 (2002), pp. 25-47.

[21]. Eline K.M. Lebbe, Steve Peigneur, Mohitosh Maiti, Bea Mille, Prabha Devi, Samuthirapandian Ravichandran, Eveline Lescrinier, Etienne Waelkens, Lisette

122 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

D’ Souza, Piet Hedewijn, Jan Tytgat, Toxicology and Pharmacology, University of Leuven KU Leuven, O&N2 P.O Box 922, Herestraat 49, 3000 Leuven, Belgium, Laboratory of Medicinal Chemistry, University of Leuven- KU Leuven, Rega Institute for Medical Research, Dept. of Pharmaceutical & Pharmacological Sciences, Minderbroedrsstraat 10, 3000 Leuven, Belgium, CSIR- National institute of Oceanography, Dona Paula, 403 004 Goa, India, Center of Advanced Study in Marine Biology, Annamalai University, Parangipettai, 608 502 Tamil Nadu, India, Laboratorium voor Proteine Fosforylatie en Proteomics, University of Leuven- KU Leuven, O&N I-P.O. Box. 901, Herestraat 49, 3000 Leuven Belgium- Discovery of a new subclass of α- conotoxins in the venom of Conus australis, Toxicon xxx (2014) 1- 10.

[22]. Helena Safavi- Hemami, Grzzegorz bulaj, Baldomero M. Olivera, Nicholas A. Williamson and Anthony W. Purcell from the Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3010 Victoria, Australia and the Departments of Medicinal Chemistry and Biology, University of Utah, Salt lake City, Utah 84108- Identification of Conus Peptidylpropyl Cis-Trans Isomerases (PPlases) and Assessment of Their Role in the Oxidative Folding of Conotoxins, The Journal of Biologiacal Chemistry Vol. 285 No. 17 pp. 12735-12746

[23]. Richard J. Clark, Harald Fischer, Simon T. Nevin, David J. Adams and David J. Craik‡- The Synthesis, Structural Characterization, and Receptor Specificity of the α-Conotoxin Vc1.1.

[24]. Olivera B. M, Rivier J, Clark C, Ramilo CA, Corpuz GP, AbogadieFC, Mena EE, Woodward SR, Hillyard DR, and Cruz LJ- Diversity of Conus neuropeptides. Science, (1990)249: 257–263.

[25]. Kenichi Akaji, Tadashi Tatsumi, Makoto Yoshida, Tooru Kimura, Yoichi Fujiwara, and Yoshiaki Kiso from the Department of Medicinal Chemistry, Kyoto Pharmaceutical University, Yamashina- Ku, Kyoto 607, Japan, Received November 18,1991- Disulfide Bond Formation Using the Silyl Chloride- Sulfoxide System for the Synthesis of a Cystine Peptide, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4137-4143.

123 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[26]. Alan Cuthbertson and Bard Indrevoll, Amersham Health As, Department of Medicinal Chemistry, Oslo, Norway- Regioselective Formation, Using Orthogonal Cysteine Protection, of an α- Conotoxin Dimer Peptide Containing Four Disulfide Bonds, Organic Letters 2003 Vol. 5, No.16 2955-2957.

[27]. Olivera BM. E.E.- Just Lecture, Conus venom peptides, receptor and ion channel targets, and drug design: 50 million years of neuropharmacology. Mol Biol Cell,(1997), 8(11): 2101– 2109.

[28]. Cruz LJ and White J.-,Clinical toxicology of Conus snail stings. In:Clinical Toxicology of Animal Venoms, edited by Meier J and White J. Boca Raton, FL: CRC, 1995.

[29]. Kohn AJ, Saunders PR, and Wiener S.- Preliminary studies on the venom of the marine snail Conus. Ann NY Acad Sci (1960), 90: 706–725.

[30]. Olivera BM- Conus venom peptides, receptor and ion channel targets and drug design: 50 million years of neuropharmacology (1997), (EE Just Lecture, 1996). Mol Biol Cell 8: 2101–2109.

[31]. Olivera BM, Gray WR, Zeikus R, McIntosh JM, Varga J, RivierJ, De Santos V, and Cruz LJ- Peptide neurotoxins from fish hunting cone snails. Science (1985), 230: 1338– 1343.

[32]. Halai, R. and D.J. Craik- Conotoxins: natural product drug leads. Nat Prod Rep, (2009),26(4): p. 526-36.

[33]. Olivera B. M., Gray W. R., Zeikus R, McIntosh J. M., Varga J, RivierJ, De Santos V, and Cruz L. J.- Peptide neurotoxins from fish hunting cone snails. Science (1985), 230: 1338– 1343.

[34]. Olivera B. M.- Conus venom peptides, receptor and ion channel targets and drug design: 50 million years of neuropharmacology (1997), (EE Just Lecture, 1996). Mol Biol Cell 8: 2101–2109.

[35]. Olivera B. M. E.E.- Just Lecture, (1996), Conus venom peptides, receptor and ion channel targets, and drug design: 50 million years of neuropharmacology. Mol Biol Cell, (1997), 8(11): 2101–2109.

124 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[36]. Olivera B. M., Gray W. R., Zeikus R, McIntosh J. M., Varga J, RivierJ, De Santos V, and Cruz L. J.- Peptide neurotoxins from fish hunting cone snails. Science (1985), 230: 1338– 1343.

[37]. Olivera, B.M.- Conus venom peptides: Reflections from the biology of clades and species. Annual Review of Ecology and Systematics, (2002), 33:p. 25-47.

[38]. Ebbing Gammon- Γενική Χημεία (έκτη έκδοση), Τραύλος Εκδοτικός Οίκος.

[39]. P. W. Atkins- Φυσικοχημεία Τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης.

[40]. P. W. Atkins- Φυσικοχημεία Τόμος ΙΙΙ, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης.

[41]. Chan W.C, White P.D.- Formation of disulfides: Dimethylsylphoxide-mediated oxidation,Fmoc-Solid Peptide synthesis,(2000), 3.3.2.1,94

[42]. Chan W.C, White P.D.- Formation of disulfides: Oxidation in the presence of redox buffers,Fmoc-Solid Peptide synthesis,(2000),3.3.2.2: 95

[43]. Chan W.C, White P.D.- Fmoc-Solid Peptide synthesis,(2000), 3.3.2.1: 94

[44]. Chan W.C, White P.D.- Formation of disulfides Air Oxidation, Fmoc-Solid Peptide synthesis,(2000), 3.3.2.1: 94

[45]. Chan W.C, White P.D.- Formation of disulfides:From free thiol precursorsFmoc- Solid Peptide synthesis,(2000), 3.3.2.1:92

[46]. Chan W.C, White P.D.- Formation of disulfides: General strategies,Fmoc-Solid Peptide synthesis,(2000), 3.3.2.1:91

[47]. Chan W.C, White P.D.- Formation of disulfides, Fmoc-Solid Peptide synthesis, (2000), 3.3.1:91

[48]. D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman,- “Αρχές Ενόργανης Ανάλυσης”, Εκδόσεις Κωσταράκη, (2002). [49]. Barlos, K.; Chatzi, O.; Gatos, D.; Stavropoulos, G.- (Int. J. Pept. Protein Res (1991), 37, 513 [50]. Sheehan JC, Hess G. P. - A new method forming peptide bonds , J. Am.Chem. Soc.,(1955) 77:1067-1085 [51]. Han, Y. and Barany, G.- J. Org. Chem.,(1997), 62, 3841

125 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[52]. Mizoguchi, T. and Igeta, H.J.- Org. Chem., (1966),31:1188 [53]. Zervas, L. and Photaki, I- J. Am. Chem. Soc.,(1962), 84:3387,b) Hiskey, R.E. [54]. Albericio, F., Grandas, G., Porta, A., Pedroso, E. and Giralt, E.- Snthesis, (1987)56:271 [55]. White, P.- In: Peptides 1990 (Smith, J.A., Rivier, J.E. eds. ), (1992), ESCOM, Leiden, 537. [56]. Beyerman, H.C., and Bontekoe, J.S.Proc. Chem. Soc.(1961),249. [57]. .Kimmerlin, T., Seebach, D.- J. Peptide Res.(2005), 65: 229. [58]. Verdier L, Al-Sabi A, Rivier JE, Olivera BM, Terlau H, Carlomagno T.- Identification of a novel pharmacophore for peptide toxins interacting with K+ channels. J Biol Chem. [59]. Al-Sabi A, Lennartz D, Ferber M, Gulyas J, Rivier JE, Olivera BM, Carlomagno T, Terlau H.- κM-conotoxin RIIIK, structural and functional novelty in a K+ channel antagonist. Biochemistry.(2004), 43(27):8625–8635. [60]. Ferber M, Sporning A, Jeserich G, DeLaCruz R, Watkins M, Olivera B. M., Terlau H.- A novel Conuspeptide ligand for K+ channels. J Biol Chem.(2003), 278(4):2177–2183. [61]. Imperial JS, Silverton N, Olivera BM, Bandyopadhyay P, Sporning A, Ferber M, Terlau H.- Using chemistry to reconstruct evolution: On the origins of fish-hunting in venomous cone snails. Proc Am Phil Soc.(2007),151(2):185–200. [62]. Terlau H, Olivera B.M.- venoms: A rich source of novel ion channel-targeted peptides. Physiol Rev.(2004),84(1):41–68. [63]. Green BR, Catlin P, Zhang MM, Fiedler B, Bayudan W, Morrison A, Norton RS, Smith BJ, Yoshikami D, Olivera BM, Bulaj G.- Conotoxins containing nonnatural backbone spacers: Cladistic-based design, chemical synthesis, and improved analgesic activity. Chem Biol. (2007):14(4):399–407. [64]. Valentino K, Newcomb R, Gadbois T, Singh T, Bowersox SS, Bitner S, Justice A, Yamashiro D, Hoffman BB, Ciaranello R, Miljanich G.- et al. A selective N-type calcium channel antagonist protects against neuronal loss after global cerebral ischemia. Proc Natl Acad Sci USA(1993);90:7894–7897. [65]. D. R. Hillyard, V. D. Monje, I. M. Mintz, B. P. Bean, L. Nadasdi, J. Ramachandran, G. Miljanich, A. Azimi-Zoonooz, J. M. McIntosh, L. J. Cruz, J. S. Imperial, B. M. Olivera.- Neuron, (1992),969.

126 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[66]. Vernon D Twede, George Miljanich, Baldomero M Olivera and Grzegorz Bulaj.- Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of leeds. Curr Opin Drug Discov Devel.(2009), 12(2), 231-239. [67]. Miljanich, G. P.; Ramachandran, J.- Antagonists of neuronal calcium channels: structure, function, and therapeutic implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, (1995), 35, 707-734. [68]. Kerr, L. M.; Yoshikami, D.- A venom peptide with a novel presynaptic blocking action. Nature,(1984),308, 282-284. [69]. Richard T. Layer, and J. Michael McIntosh.- Conotoxins: Therapeutic Potential and Application. Mar. Drugs,(2006),4, 119-142. [70]. Fawaz Aldabbagh.- Amino Acids, Peptides and Proteins, Organic Chemistry, Natural Product Chemistry. [71]. Γάτος Δημήτριος.- Πεπτιδική και Συνδυαστική Χημεία (Σημειώσεις), Πάτρα 2016 [72] Μαγκαφά Βασιλική.- Γενικές Αρχές Πεπτιδικής Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας Και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Πάτρα 2015. [73]. French, R. J., & Terlau, H.- Sodium channel toxins—Receptor targeting and therapeutic potential. Current Medicinal Chemistry, (2004), 11, 3053–3064. [74]. Catteral, W. A.- From ionic currents to molecular mechanisms: the structure and function of voltage-gated sodium channels. Neuron(2000), 26, 13-25. [75]. Goldin, A. L., Barchi, R. L., Caldwell, J. H., Hofmann, F., Howe, J. R., Kallen, R. G.,Mandel, G., Meiseler, M. H., and Netter, Y. B.- Nomenclature of voltage-gated sodium channels. Neuron (2000),28, 365-368. [76]. Walewska, A., Skalicky, J. J., Davis, D. R., Zhang M-M., Lopez-Vera, E., Watkins, M.,Han, T. S., Yoshikami, D., Olivera, B. M., and Bulaj, G.- NMR-based mapping of disulfide bridges in cysteine-rich peptides: application to the mu-conotoxin SxIIIA. J. Am. Chem. Soc. (2008),130(43), 14280-14286. [77]. Wood, J. N., Boorman, J. P., Okuse, K., and Baker, M. D.- Voltage-gated sodium channels and pain pathways. J. Neurobiol. (2004),61, 55-71. [78]. Kalso, E.- Sodium channel blockers in neuropathic pain. Curr. Pharm. Des. (2005), 11, 3005-3011 [79]. Clare, J. J., Tate, S. N., Nobbs, M., and Romanos, M. A.- Voltage-gated sodium channels as therapeutic targets. Drug Discov. Today(2000),5, 506-520.

127 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[80]. J. Ekberg, D.J. Craik, D.J. Adam S.- International Journal of Biochemistry & Cell Biology(2008),40 2363–2368. [81]. Cest`ele, S., & Catterall, W.- .Molecular mechanisms of neurotoxin action on voltagegated sodium channels. Biochimie,(2004),82, 883–892. [82]. Ekberg, J., & Adams, D. J.- Neuronal voltage-gated sodium channel subtypes: Key roles in inflammatory and neuropathic pain. International Journal of Biochemistry and Cell Biology,(2006),38, 2005–2010. [83]. Li, R.A.; Hui, K.; French, R.J.; Sato, K.; Henrikson, C.A.; Tomaselli, G.F.; Marbán, E.- Dependence of α -conotoxin block of sodium channels on ionic strength but not the permeating [Na+]: Implications for the distinctive mechanistic interactions between Na+ and K+ channel pore-blocking toxins and their molecular targets . J. Biol. Chem. (2003), 278, 30912–30919. [84]. Choudhary, G.; Aliste, M.P.; Tieleman, D.P.; French, R.J. Dudley, S.C.- Jr. Docking orientation of α -conotoxin GIIIA in the sodium channel outer vestibule. Channels (2007), 1, 344–352. [85]. Cestele, S.; Catterall, W.A.- Molecular mechanisms of neurotoxin action on voltagegated sodium channels. Biochimie (2000),82, 883–892. [86]. Catterall, W.A.; Cestele, S.; Yarov-Yarovoy, V.; Yu, F.H.; Konoki, K.; Scheuer, T.- Voltage-gated ion channels and gating modifier toxins. Toxicon (2007), 49, 124–141. [87]. Lester, H. A., Dibas, M. I., Dahan, D. S., Leite, J. F., and Dougherty, D. A.- Cys loop receptors: new twists and turns. Trends Neurosci. (2004),27(6), 229-336. [88]. Sine, S. M., and Engel, A. G. (2006) Recent advances in Cys-loop receptor structure and function.- Nature 440, 448-455. [89]. Verdier, L., Al-Sabi, A., Rivier, J. E. F., Olivera, B. M., Terlau, H., and Carlomagno, T.- Identification of a novel pharmacophore for peptide toxins interacting with K+channels. J. Biol. Chem.(2005),280(22), 21246-21255. [90]. Ferber, M., Sporning, A., Jeserich, G., DeLaCruz, R., Watkins, M., Olivera, B. M., and Terlau, H.- A novel Conus peptide ligand for K+ channels. J. Biol. Chem. (2003),278(4), 2177-2183. [91]. Olivera, B. M., and Cruz, L. J.- Conotoxins, in retrospect. Toxicon.(2001),39, 7-14. [92]. Terlau, H.; Olivera, B.M.- Conus venoms: a rich source of novel ion channel- targeted peptides.Physiol. Rev. (2004), 84,41–68.

128 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[93]. Frederic Le Gall] Phillipe Favreau, Evelyne Benoit,, Cesar Mattei, Francoise Bouet, Jean -Louis Menou, Andre Menez, Yves Letourneux and Jordi Molgo.- A new conotoxin isolated from Conus consors venom acting selectively on axons and moto nerve terminals through a Na+- dependent mechanism. Eyropean Journal of Neuroscience (1999),11:31343142. [94]. Daniel Biass, sebastien Dutertre, Alain Gerbault, Jean–Louis Menou, Robin Offord, Phillipe Favreau, Reto Stocklin.- Comperative proteomic study of the venom of the piscivorous cone snail Conus consors. Journal of Proteomics 72(2009):210-218. [95]. Farveau P.- Physico- chemical and pharmacological study of new toxins from the piscivorous cone snail Conus consors, Phd thesis (1999),pp.143-162. [96]. Heinrich T and Baldomero M.Olivera.- Conus Venoms: A rich Source of Novel Ion Channel-TargetedPeptides.(2004), Rhysiol Rev 84: 54-55. [97]. Σπανοπούλου Άννα.- Συνθετική Παρασκευή αναλόγων κωνοπεπτιδίων του θαλάσσιου οργανισμού Conus Consors, μεταπτυχικακό δίπλωμα ειδίκευσης, Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πάτρα 2012. [98]. Ταπεινού Ανθούλα.- Σχεδιασμός Και Σύνθεση με Μικροκύματα Πεπτιδικών Αναλόγων Ανοσοκυρίαρχων Επιτόπων Των Προτεϊνών MBP, PLP και MOG της μυελίνης συζευγμένων με μαννάνη, Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης, Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Χημείας. [99]. Heinrich T and Baldomero M.Olivera.- Conus Venoms: A rich Source of Novel Ion Channel-Targeted Peptides. Rhysiol Rev (2004), 84: 47-48. [101]. McIntosh JM, Jones RM.- Cone venom––from accidental stings to deliberate injection. Toxicon, (2001), 39(1): 1447–1451. [102]. Jimenez EC, Shetty RP, Lirazan M, Rivier J, Walker C, Abogadie FC, Yoshikami D.- et al. Novel excitatory Conus peptides define a new conotoxin superfamily. J Neurochem, (2003), 85(3): 610–621 722. [103]. .Olivera BM.- Conus venom peptides: reflections from the biology of clades and species. Annu Rev Ecol Syst (2002), 33: 25–42. [104]. McIntosh JM, Santos AD, and Olivera BM.- Conus peptides targeted to specific nicotinic acetylcholine receptor subtypes. Annu Rev Biochem(1999),68: 59–88. [105]. Olivera, B.M.- Conus peptides: biodiversity-based discovery and exogenomics. J Biol Chem, (2006),281(42): p. 31173-7.

129 Δ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[106]. Βασίλης Ρούσσης- Βιοδραστικά Προϊόντα Θαλλάσιας Προέλευσης, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων. [107]. John McMurry- Οργανική Χημεία Τόμος Ι, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης.

130