Genetica della Trasformazione Neoplastica per laurea magistrale in Biologia Cellulare e Molecolare e Scienze Biomediche 6 CFU- da 14 marzo a 3 giugno 2016
Lunedi 11-13 aula T7 Mercoledi 9-11 aula T7
Metodologia di Esame: Prova scritta su 7 argomenti, con valutazione e ammissione all’orale sopra 18/30 Prova orale comprendente esposizione critica di un articolo proposto dal docente, scelto dallo studente, comunicato per e-mail al docente almeno due giorni prima dell’esame
1 http://www.facebook.com/pages/Genetica-MolecolareTorVergata/361032020588840? sk=wall&filter=12
Genes-Proteins: OMIM, GeneCards e tutte le banche dati collegate Phosphosite, Smart, MINT,
Pathway: KEGG, Reactome, http://www.signaling-gateway.org
Cell lines and genes: cancer genome project :http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/
2 http://signor.uniroma2.it/index.jsp
virus virus Le tre teorie: Virus, radiazioni, prodotti chimici
3 La natura del cancro
Deriva da tessuti normali- Inizio monoclonale
Avviene in cellule specializzate di tutti i tipi
Il rischio di sviluppare un tumore è aumentato da molteplici cause esterne (incluso lo stile di vita)
La genesi dei tumori è multistep
Origine virale, origine chimica, origine fisica
La teoria del cancro causato da irritazione: uno stile di vita, il chimney sweeper (lo spazzacamino) ed il Tar (catrame) cancer Più di 200 applicazioni di Catrame sull’orecchio di coniglio causarono carcinoma a cellule squamose
Katsusaburo Yamagiwa, the first to prove chemical carcinogenesis
4 La maggior parte dei tumori richiede decine di anni per svilupparsi
3-metilcolantrene, benzopirene, dibenzantracene….
Figure 11.2 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Benzopirene è un procarcinogeno In tar, fumo, Carne in barbecue Lega la G (come aflatossine)
Il citocromo 450 1A1 lo ossida a Benzopyrene7-8 epoxide
Causa TRANSVERSIONE G >T
5 Danneggiamento di basi: Rottura del legame base-zucchero, Sito APURINICO, Blocco della replicazione, Apoptosi Aflatossina B1
Benzopirene
Translesion DNA synthesis in the context of cancer research Philip A Knobel and Thomas M Marti Cancer Cell International 2011, 11:39 doi:10.1186/1475-2867-11-39
BenzoPyrene
6 Un soppressore dei tumori mutato da benzene
P53 è trovata mutata nei tumori del polmone, in fumatori con una forte prevalenza di TRANSVERSIONI G=C to T=A
P04637 - P53_HUMAN
LUNG CANCER (Carcinoma)
Small Cell Lung Cancer SCLC 20% (Smokers Cancer)
Non Small Cell Lung Cancer NSCLC 80%: 1-Adenocarcinoma (Women, Bronchioalveolar) 40% 2- Squamous Cell Carcinoma/Epidermoid 30% 3- Large cell Carcinoma/Undifferentiated 10%
7 Le mutazioni più frequenti in tumore al polmone sono TRASVERSIONI, alcuni siti sono specifici
The Mutagenic Signature of the carcinogen:
GC to AT transversion in codon 157 e 158 in Lung (by benzene)
High frequency of C->T transition at dipyrimidine sites in skin cancer (by UV irradiation)
Transversion at codon 249 in liver cancer (by aflatoxin)
8 TEST di AMES : Test di Carcinogenicità/POTENZIALE MUTAGENICO DI UNA SOSTANZA
Ceppi di Salmonella typhimurium auxotrofi per istidina
I ceppi mutanti hanno frameshift o point mutations. Quindi revertono o con indel o point mutations Una sostanza che reverte a prototrofi, è capace di mutagenizzare, quindi è un carcinogeno
Bruce Ames 1973
Carcinogens can function as mutagen - Bruce Ames 1975
procarcinogens Cytochrome P-450 in liver S9 fraction
9 Food andAgriculture Organizations data 2012
Carcinogenicità
POTENZIALITA’ MUTAGENICA
10 I tumori sono crescite monoclonali
11 A tumor of the Ab-producing cells of the Bone marrow Linfociti B
Il primo biomarcatore di tumori : Catena leggera (kappa o lambda) di un anticorpo scoperta da Henry BENCE-JONES nel 1847, marker tumorale del mieloma multiplo
Una proteina di circa 25 kDa, presente nel sangue ed urine (perchè overespressa) che è prodotta da un clone di cellule B (origine monoclonale dei tumori)
12 Nomenclatura 80% Carcinoma= epithelial from ecto-meso-endoderm Squamous cell carcinoma= protective layers Adenocarcinoma= secretory epithelium
2% Sarcomas= mesenchymal-mesodermal origin (fibroblasti, adipociti (liposarcoma), osteoblasti, miociti (rabdomiosarcoma o leiomiosarcoma)
Hematopoietic= circulatory and immune system (leukemia, lymphoma B /T, myeloid leukemia) Lymphomas= Linfociti B e T
Neuroectodermal= nervous system (glioma, schwannoma)
Classificazione non classica
Melanomi da cresta neurale
Small-cell lung Carcinoma con cellule di tipo neurosecretorie che rispondono a stimoli di signaling neuronale e sono di origine neuroectodermica o endodermica
13 Laboratory Inves ga on (2006) 86, 425–444. doi:10.1038; 2006 Func onal facets of the pulmonary neuroendocrine system R Ilona Linnoila
PULMONARY NEURO ENDOCRINE Cells
RAS MYC ErbB2 p16INK4a RB EML4-ALK RARbeta TP53 RASSF1
14 Multistep tumorigenesis pathogenesis of carcinoma
N:Neoplasia CIS: carcinoma In Situ
Figure 11.7 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
PDAC Adenocarcinoma Duttale Pancreatico Il killer silenzioso
Modello genetico di progressione dell’adenocarcinoma pancreatico. Ogni grado di PanIN Neoplasia Intraepiteliale Pancreatica, è caratterizzato da un distinto modello di processi molecolari che si attivano in seguito a presenza di irregolarità genetiche che colpiscono geni specifici (Bardeesy N et al., 2002). I gradi 1A, 1B, 2 e 3 rappresentano un crescente riscontro di atipie citologiche caratteristiche della cellula neoplastica
15 i) Cancer progression is fueled largely by genetic hits inflicted by mutagenic cancerogenesis, TUMOR INITIATOR
ii) Nongenotoxic –nonmutagenic agents but toxic and mitogenic are Tumor Promoting Agents TPA that drive forwards multi-step tumorigenesis
Cancer is a microevolutionary progress: cell divide and accumulate gene mutations over time
Modello di neoplasia epiteliale: Carcinoma chimicamente indotto
Topi trattati con:
DMBA carcinogeno/mutageno (7,12 DiMethylBenzAnthracene) Produce mutazione missenso attivante in H-ras codon61 CAA->CTA nei cheratinociti ( TUMOR INITIATOR)
TPA tumor promoter/proinflammatory (Phorbol 12-Tetradecanoate 13-Acetate, functional mimic of DAG):induce PKCalfa->IKK- >NF-kB->TNFalfa, COX2, cycD1, BclxL Applicazioni multiple causano papillomi benigni e (raramente) Progrediscono a carcinomi squamosi, se avvengono ulteriori mutazioni in p53, INK4alfa/ARF)
16 Initiation- Promotion- Progression-
Human “tumor promoters” often act through cytotoxic, mitogenic Mechanism and drive clonal expansion also through chronic inflamation
Ex: Carcinoma Epatico indotto da infezione virale ( Epatite B)- Carcinoma della colecisti indotto da infiammazione da calcoli formati da precipitatodi bile- Aspirina , sulindac e altri NSAID riducono incidenza di carcinomi-
Hepatocellular carcinoma by hepatitis B chronic inflamation- Gall bladder carcinoma due to gallstones, precipitates from the bile-
Many of the cell phenotypes conferred by the inflamation associated prostaglandins are uncanny similar to those conferred by oncogenes
Loss of contact inhibition Ancorage independent growth proliferation
17 (Infezione cronica)
AKT IκB kinase (IKK)
IAP-1 Inhibitor of Apoptosis
Bcl-Xl B-cell Lymphoma,extra large
COX-2 cycloossigenase
Proprietà delle cellule trasformate (tumorali): • morfologia alterata (metaplasia/displasia/anaplasia) • mancanza inibizione da contatto •(alterazioni ciclo cellulare e interazioni cellula-cellula) •crescita più rapida (alterazioni segnali di trasduzione) • richiedono meno/no siero (stimolazione autocrina/recettori) • crescita in agar (alterate interazioni cellula-matrice e cell-cell) • aneuploidia (numero cromosomi alterato) •Secrezione PROTEASI (digestione matrice extracellulare,metastasi) •Stimolazione NUOVA ANGIOGENESI •Alterati DIFFERENZIAMENTO e APOPTOSI
18 ADATTAMENTI REVERSIBILI:
IPERTROFIA risulta da una aumentata produzione di proteine (spesso in tessuti che non si possono dividere, es. Miocardio, muscolo scheletrico)
Sensori meccanici-à MAP kinase, JAK-STAT, PI3K/AKT= Ipertrofia fisiologica
IGF1, TGFbeta, FGF—Recettori associati a proteine G= Ipertrofia patologica ,es Ipertrofia ventricolare sinistra in ipertesi
Aumento Fattori di Trascrizione (miocardio: GATA4, NFAT, MEF2)
Metaplasia/cambio di forma= Conversione fenotipica reversibile di un tipo cellulare in un altro avente la stessa differenziazione ONTOGENETICA , transdifferenziamento (infiammazioni croniche (fumo), polipi intestinali, esofago di Barrett) Displasia/forma anormale= Cambiamento reversibile nella proliferazione e crescita (esposizione a radiazioni, idrocarburi, virus (papilloma, verruca) Iperplasia/aumento di numero Fisiologica Compensatoria=Proliferazione di cellule con corredo genetico normale (cardiomiociti dopo infarto) Iperplasia Patologica= Proliferazione con corredo genetico Normale Neoplasia: Proliferazione di cellule con corredo genetico patologico Sono tumori maligni o benigni Anaplasia: Cellula indifferenziata
19 STEP BY STEP: Accumulo di alterazioni genetiche e progressione tumorale LOH Chr.5q
K-RAS LOH chr.18q Epitelio Normale—---Iperplasia Aumento numero----Adenoma….Carcinoma Neoplasia---Metastasi Anaplasia
Alternative genetic paths to Barrett’s esophagus
Cellula squamosa esofago
Figure 11.11b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
20 Neoplasie
Ogni tumore ha origine da cellule che hanno acquisito queste proprietà:
Indipendenza da segnali di crescita esterni
Evitare Apoptosi
Insensibilità a fattori Antiproliferativi esterni
Stimolo di Angiogenesi Invasione di altri tessuti E neo-vascolarizzazione
Replicazione indefinita By Hanahan and Weinberg
21 Cambiamenti Evasione del Metabolici sistema immune
Instabilità genomica Infiammazione e Mutazioni GOF/LOF Pro-tumore
Cell 144, March 4, 2011
22 Cellule normali Cellule trasformate displasiche
Regolazione della divisione cellulare da “inibizione da contatto”
23 Le cellule tumorali perdono la “inibizione da contatto” La inibizione da densità, cioè da consumo di fattori di crescita
In plasma EGF: 1 nanogram/ml In serum and saliva: EGF 1-5 nanogram/ml In tears and sperm: 5-50 nanogram/ml IN BILE, URINE, MILK, PROSTATE FLUID: 50-500 NG/ML
HeLa 35.000/65.000 EGFR / cell human uterine squamous carcinoma Keratinocytes 40.000 Fibroblast 70.000-150.000 COS-1 400.000 African Green Monkey SV40-tran. kidney fibroblast Hek293 <15000 Human Embrionic Kidney
24 caderine
Integrine
ECM
Fibronectina= glicoproteina dimerica 2500aa; Collagene conferisce resistenza; Proteoglicani con glicosamminoglicani GAG glicosamminoglicani idrofilici, ialurano; Condroitinsolfato; Laminina;
25 INTEGRINE
Legame fisico cellula-ECM e trasduzione segnali
26 Alfa7beta1 pax7 satellite Itga7 Itgb1à laminin
Three main functions of integrins are: 1- Attachment of the cell to the ECM.(integrine, laminine…) 2- Signal transduction from the ECM to the cell 3- Facilitate motility
Nature Genetics 17, 318 - 323 (1997) doi:10.1038/ng1197-318 Absence of integrin alpha7 causes a novel form of muscular dystrophy
Ulrike Mayer, Klaus von der Mark ligands of integrins are fibronectin, vitronectin, collagen, and laminin.
27 Integrin Signaling:out-in Attacco a ECM- Quindi : Sopravvivenza, Proliferazione
OUTSIDE
Signal transduction: ExtraCellularMatrix-integrine- FAK-GRB2_SOS-RAS-ERK
Inside the cell
28 ANOIKIS Integrin signal= Anchorage/RAS signaling ECMàIntegrins betaà FAK activation autophosphorylation à SRC docking and phosphorylation->PI3K, PLCgamma àSOS dockingàRAS activation-àERK
No Integrin signal= No ECM attachment No growth, no division, programmed cell death
ONCOGENIC RAS mimicks anchorage= Cells expressing Oncogenic RAS grow without attachment (ANCHORAGE INDEPENDENT GROWTH) Oncogenic RAS mimicks growth factor presence: Cells grow In low serum
Figure 9. A model for FAK in invadopodia regulation
A balance between tyrosine phosphorylation at focal adhesions and invadopodia is required for proper dynamics and cell migration
Chan et al. J. Cell Biol. 2009:185:357-370
© 2009 Chan et.al.
29 When cancer cells can't let go
Like a climber scaling a rock face, a migrating cancer cell has to keep a tight grip on the surface but also let go at the right moment to move ahead. The focal adhesion kinase, FAK, coordinates these processes to permit forward movement.
Tyrosine phosphorylation of paxillin, FAK, and p130CAS: effects on cell spreading and migration
Signaling in-out
SHP2
30 SCAvenger Receptor Hepato Class A Cellular Member 5 Carcinoma
Huang J, Zheng DL, Qin FS, Cheng N, Chen H, Wan BB et al. Genetic and epigenetic silencing of SCARA5 may contribute to human hepatocellular carcinoma by activating FAK signaling. J Clin Invest 2010; 120: 223–241 doi: 10.1172/JCI38012 .
The calpains are a conserved family of cysteine proteinases (Calcium-dep) that catalyse the controlled proteolysis of many specific substrates. Calpain activity is implicated in several fundamental physiological processes, including cytoskeletal remodelling, MIGRATION, INVASION. Calpain expression is increased during tumorigenesis
Turnover of Focal Enhancement of Membrane adhesions and matrix metalloproteinase
Nature Reviews Cancer 11, 364-374 (May 2011) | doi:10.1038/nrc3050 Sarah J. Storr , Stewart G. Martin The calpain system and cancer
31 The transcription factor SNAILS is a Master EMT Regulator The scavenger receptor classA member5 is a tumor metastasis suppressor
SNAILS----| SCARA5 -----| FAK SNAILS----| CADHERIN Epitelial
Zinc finger protein
Human lung carcinoma
IN-OUT-IN
32 http://www.genome.jp/kegg/pathway/hsa/hsa04510.html
*
*
Embriology Healing Immunity Metastasis
33 Chemiochine C3a, C5a Formilpeptidi
3 P-Selectin Glycoprotein 2 Ligand
1
TNFalfa IL-1B IL6 M1 ROS
1 macrophage produceTNFalfa, interleukin-8, IL-1= leukocyte is attracted 2 Endothelial cells in blood vessels express E-selectin and display P-selectins 3 P-Selectin-Glycoprotein-Ligand bind at low affinity (Velcro like)
34 PECAM-1/CD31 HOMOPHILIC INTERACTION , JAM.1, CD99 DIAPEDESIS The leukocyte squeeze in ameboid fashion Switch of heterophilic interactions between tightly from apposed Default low affinity (selectin) endothelial cells: the point of no To high affinity (integrin) return
35 Vena Cava >>Polmoni Vena Porta> Fegato
Carcinoma polmonare > metastasi cerebrali (carotidi) Carcinoma mammella > metastasi ossea (sistema venoso del Batson) Osteosarcoma > metastasi polmonare Tumore al colon > metastasi al fegato (vena Porta)
36 Come studio la migrazione?
INVASION ASSAY Boyden Chamber Transwell Assay
Count Cells under microscope and/or quantify after extraction Solution colorimetric (560nm) or Fluorescent (480nm)
37 Boyden Chamber Assay
CytochalasinD Micotoxin that Inhibits actin polimerization
Figure 1. Human Fibrosarcoma HT-1080 Cell Invasion. HT-1080 and NIH3T3 (negative control) were seeded at 300,000 cells/well and allowed to invade toward 10% FBS for 24 hrs in the presence or absence of 2 μM Cytochalasin D. Invasive cells on the bottom of the invasion membrane were stained (top panel picture) and quantified at OD 560nm after extraction (bottom panel figure).
38 Cell Migration
CellProfiler cell Image analysis software
39 Fibroblasti embrionali di topo
http://www.lgcpromochem.com/atcc/
40 Un focus di fibroblasti embrionali di pollo indotto dal virus del sarcoma di Rous Focus Assay per perdita di inibizione da contatto
Test di Trasformazione cellulare
Test di formazione di foci (Harry Rubin e Howard Temin, 1958): foci di cellule addensate e morfologicamente alterate. Test basato sulla perdita di inibizione da contatto su fibroblasti embrionali di topo BALB/c 3T3
Crescita in agar: Le cellule trasformate non debbono attaccarsi ad Una superficie solida prima di potersi dividere. Test basato sulla Indipendenza da legame integrine-matrice extracellulare
Ridotta richiesta di siero: richiedono meno del 5% di siero. Basato su attivazione di segnali di proliferazione e capacità autocrine
41 Crescita senza supporto
Mammosfere : tumor stem cells
42 Mammospheres 1st generation MCF7 p9
Ctrl Metformin 10 mM
Inhibition of 100 micron Notch???? diameter
These ‘tumor stem cells’ share the properties of self-renewal Only a minority of cells in human and differentiation with their normal cancers are capable of self renewal. stem cell counterparts, although in tumors these processes are deregulated.
100 cells
Epitelial, Myoep., Alveolar
Differenziazione cellulare Differenziazione strutturale
43 Test di Trasformazione cellulare
Test di formazione di foci (Harry Rubin e Howard Temin, 1958): foci di cellule addensate e morfologicamente alterate. Test basato sulla perdita di inibizione da contatto su fibroblasti BALB/c 3T3
Crescita in agar: Le cellule trasformate non hanno bisogno di attaccarsi ad una superficie solida prima di potersi dividere. Test basato sulla Indipendenza da legame integrine-matrice extracellulare
Ridotta richiesta di siero: richiedono meno del 5% di siero. Basato su attivazione di segnali di proliferazione (RAS) e capacità autocrine
Omofiliche -Calcio
I 4 tipi di Molecole di carboidrati Adesione Cell-cell Eterofiliche -Calcio
Molecole adesione cell-cell
44 AJ Caderina-Actina
DS Cad-filamenti intermedi
Integrine- filamenti intermedi
The integrity of the cadherin-catenin complex is negatively regulated by phosphorylation of beta- catenin by receptor tyrosine kinases (RTKs) and cytoplasmic tyrosine kinases (Fer, Fyn, Yes, and Src), which leads to dissociation of the cadherin-catenin complex
Recettori per fattori di crescita: giunzioni serrate (tight junction) TGFβRI e II, IGF-1R, EGFR, c-Met Claudina, occludina F-actina
giunzioni aderenti (adherens junctions)
p120 cat.
E-caderina β cat. vinculina α cat. F-actina
45 46 Importanza delle caderine
Nei tumori diminuiscono per varie cause:
Mutazioni LOF Overespressione di fattori che le destabilizzano Overespressione di repressori trascrizionali
Soppressione epigenetica della espressione Degradazione da proteasi
CADH1=E cadherin chr.16q22
30 mutazioni germinali in tumori, OMIM 192090 UniProtKB: P12830
882AA : 25/30 mutazioni inattivanti- 5/30 sono missense
47 La E-caderina è un TSG:
Le mutazioni sono distribuite lungo tutto il gene
Le mutazioni sono missense, non sense, splicing, frame shift
60% dei tumori presenta mutazioni in CDH1, insieme con concomitante perdita dell’allele wt.
Spesso si riscontra perdita delle caderine per attivazione di proteasi da influsso di calcio (intracellulare), caspase3 o gamma-secretase. Oppure metallo proteasi di matrice
Mol Cell Biol. 2007 May;27(10):3804-16. Epub 2007 Mar 12.Casein kinase 1 is a novel negative regulator of E-cadherin-based cell-cell contacts.Dupre-Crochet S, Figueroa A, Hogan C, Ferber EC, Bialucha CU, Adams J, Richardson EC, Fujita Y.
E-CADERINA P12830
S846D
CK1 casein kinase IC261 Fosforila S846 Phosphorylated S846 E-CADH has weaker interaction with beta-catenin
48 MYC, CyclinD
Le caderine prevengono la localizzazione nucleare della Beta-catenina Giunzioni Aderenti
A road to cancer : tightly regulated self renewal system subverted in cancer Wingless in Drosophila and int-1 in mouse (Insertion of Mammary Tumor Virus) WNT1 protooncogene 370 AA- 12 genes in homo sapiens- secreted lipid-modified signaling glycoproteins (350–400 aa)
49 Nusse R, van Ooyen A, Cox D, Fung YK, Varmus H (1984). "Mode of proviral activation of a putative mammary oncogene (int-1) on mouse chromosome 15". Nature 307 (5947): 131–6. doi: 10.1038/307131a0. PMID 6318122. Nüsslein-Volhard C, Wieschaus E (October 1980). "Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila". Nature 287 (5785): 795–801. doi:10.1038/287795a0. PMID 6776413
1995 Nobel Price
Eric Christiane
19x
Giunzioni Aderenti
Glycogen synthase kinase
50 Lipoprotein Receptor Related Protein. LRP
Casein Kinase CK-1 Glycogen Synthase Kinase GSK Adenomatous Polyposis Coli APC
Beta-Transducin Repeat Containing Protein
Co-repressors
CONCENTRATIONS
total Dsh 100 nM total APC 100 nM total TCF 15 nM total GSK3 50 nM total axin 0.02 nM total β-catenin 35 nM free phosphorylated β-catenin 1 nM 10 milioni di molecole / cellula
DISSOCIATION CONSTANTS
binding of GSK3 to (APC.axin) 10 nM binding of APC to axin 50 nM binding of β-catenin to (APC.axin.GSK) 120 nM binding of β-catenin to TCF 30 nM binding of β-catenin to APC 1200 nM
FLUXES
degradation flux of β-catenin via the proteasome 25 nM/h Share of degradation of β-catenin via unphosphorylated form 1.5 %
CHARACTERISTIC TIMES Half life beta –catenin : 20 minutes—2 HOURS phosphorylation/dephosphorylation of APC and axin 2.5 min GSK3 association/dissociation 1 min Axin degradation 6 min
51 P35222 (CTNNB1) Catenin beta-1
Ser 45 priming site (by CK1,2 CaseinKinase ) , Sà F, P in hepatocellular carcinoma
Ser 23, 29, 33, 37 phosphorylated by GSK3beta, targets to Proteosomal degradation
Mutated in several cancers “PGE2 prostaglandins activate Wnt” suggests that chronic inflammation-related increase of PGE2 may lead to activation of Wnt pathway in different tissues, resulting in carcinogenesis.[3]
Target gene of catenin: Overexpression of MYC is implicated in the etiology of a variety of hematopoietic tumors. A chromosomal aberration involving MYC may be a cause of a form of B-cell chronic lymphocytic leukemia. Translocation t(8;12)(q24;q22) with BTG1. Chromosomal aberrations involving MYC are usually found in Burkitt lymphoma. Translocations t(8;14), t(8;22) or t(2;8) which juxtapose MYC to one of the heavy or light chain immunoglobulin gene loci. Transcription factor that binds DNA in a non-specific manner, yet also specifically recognizes the core sequence 5'- CAC[GA]TG-3'. Activates the transcription of growth-related genes.
DESTRUCTION COMPLEX Machinery for Beta-catenin proteolysis
CTNNB1
Fbox S-phase Kinase Cullina
52 BETA-TRCP: The WD40 repeat (also known as the WD or beta- transducin repeat) is a short structural motif of approximately 40 amino acids, often terminating in a tryptophan-aspartic acid (W-D) dipeptide. Tandem copies of these repeats typically fold together to form a type of circular solenoid protein domain called the WD40 domain. beta TRCP is a F-box protein that constitutes one of the four subunits of ubiquitin protein ligase complex called SCFs (Skp1 Sphase Kinase-Cul1 Cullin-F-box protein)
WNT pathway nell’adesione,proliferazione, mantenimento stato indifferenziato Se l’attività di GSK-3beta è inibita dall’attivazione della via di WNT o se APC non funziona (come nel cancro del colon), la beta- catenina non viene fosforilata e si accumula ad alti livelli nel citoplasma (emivita di 2 ore).
La beta-catenina trasloca nel nucleo dove lega i fattori di trascrizione T-cell factor/Lymphoid enhancing factor TCF/ LEF1 modulando insieme ad essi l’espressione di geni implicati nella proliferazione cellulare e nella progressione tumorale. http://www.stanford.edu/~rnusse/pathways/targets.html
53 WNT signal
S45
CREB binding protein Q92793
54 GSK3 Binding protein Casein kinase
Half life from 20 minutes to 2hrs
D1 cyclin
GSK modulates Cyclin D at transcriptional and post Myc, Jun translational levels
55 Planar Cell Polarity Signaling controls cell polarity and movement during development
RhoA (Ras Homologue memberA) requires DVL (dishevelled) and a formin homology protein called Daam1 (Dishevelled Associated Activator of Morphogenesis 1) RhoA activates ROCK
56 Cellule tumorali non hanno inibizione da contatto
S45
57 Mancanza di E-caderina
a: E-caderina b: beta-catenina c: DAPI Beta-cell carcinoma Da Rat Ins-promoter Sv40 antigen- transgenic mouse
COSMIC catalogue of Somatic Mutations in cancers Carcinoma , small intestine COSMIC
58 2012 GENI MUTATI
APC CDH1 CDKN2A CDKN2a(p14) CTNNB1
KRAS MLH1 NF1 NF2 PI3KCA PTEN RB1
SMAD4 SMARCa4 TP53
CDH1 Cadherin trovato mutato, ma in introne e non in coding sequence In omozigosi. Quindi, le caderine subiscono downregolazione E, meno spesso, mutazioni
Meccanismi Down-regulation caderine (e.g.,maintenance of embryonic mesoderm, EMT) • Regolazione trascrizionale: - repressori trascrizionali come le proteine Snail, Slug e SIP1 e il fattore di trascrizione E12/ E47 legano le box E2 nel promotore del gene della E-caderina reprimendone l’espressione.
5’CACCTG CACCTG
59 Meccanismi down-regulation caderine • Inibizione proteica: - la dysadherin (FXYDQ96DB9) è una glicoproteina di membrana che regola negativamente i livelli proteici della E-caderina, senza colpire l’m-RNA. - Questo meccanismo induce sperimentalmente metastasi.
• Fosforilazione della tirosina: - EGFR, c-MET (HGFR), FGFR e SRC possono fosforilare E-caderina, N-caderina, alfa-catenina, beta-catenina e p120-catenina portando al disassemblamento del CCC (Cytoplasmic Cell Adhesion Complex) e alla distruzione dell’adesione cellulare. • PTP1B fosfatase lega N-caderina e promuove legame con catenina
Meccanismi Down-regulation caderine
• Degradazione : - Hakai (una E3-ligasi) si lega specificatamente alla E-caderina fosforilata sulla tirosina e la ubiquitina. La E-caderina viene marcata per la degradazione tramite il proteosoma.
Inibitori del proteosoma vengono utilizzati come chemoterapici antitumorali (PATENT Chiron Corporation)
60 Meccanismi Down-regulation caderine
• Epigenetica: Ipermetilazione: in seguito ad inattivazione trascrizionale, il gene della E- caderina è epigeneticamente silenziato da ipermetilazione che porta a un’ulteriore regolazione negativa dell’espressione della E-caderina.
• Degradazione proteolitica: le metalloproteasi di matrice (MMPs) degradano la E- caderina dando origine a una proteina ridotta di 80 KDa che promuove l’invasione tumorale regolando positivamente le MMPs.
Swissprot entry P12830 CADH1 882AA • TISSUE SPECIFICITY: Non-neural epithelial tissues.•PTM: During apoptosis or with calcium influx, cleaved by a membrane-bound metalloproteinase (ADAM10), PS1/gamma-secretase and caspase-3 to produce fragments of about 38 kDa (E-CAD/CTF1), 33 kDa (E-CAD/ CTF2) and 29 kDa (E-CAD/CTF3), respectively. Processing by the metalloproteinase, induced by calcium influx, causes disruption of cell-cell adhesion and the subsequent release of beta-catenin into the cytoplasm. The residual membrane-tethered cleavage product is rapidly degraded via an intracellular proteolytic pathway.
DISEASE: Defects in CDH1 are involved in dysfunction of the cell-cell adhesion system, triggering cancer invasion (gastric, breast, ovary, endometrium and thyroid), metastasis and cause of hereditary diffuse gastric cancer (HDGC) [MIM:137215]. Defects in CDH1 are a cause of susceptibility to endometrial cancer [MIM:608089]
61 EPIGENETICA : IPERMETILAZIONE e Spegnimento delle Caderine
Reprimere la trascrizione: la metilazione del DNA
•La metilazione nei vertebrati avviene esclusivamente sui residui di C nel dinucleotide CpG
•Le sequenze CpG sono sotto-rappresentate nel genoma (probabilmente per la tendenza •della 5-metilcitosina a venire deaminata e mutata in T) -> ma presente nei promotori • dei geni dove causa repressione della trascrizione
62 CpG ISLANDS (CGI)
• Short sequences (1000 base pairs (bp) long) rich in GC and CpG • Predominantly NON METHYLATED • Most, perhaps all, CGIs are sites of transcription initiation
CpG islands and the regulation of transcription Aimée M. Deaton and Adrian Bird
PROMOTORI con normale quantità di CpG sono solitamente attivi la metilazione non partecipa normalmente a regolare la trascrizione di geni i cui promotori sono ricchi di CpG
PROMOTORI IMPOVERITI di CpG la cui attivazione è controllata dalla metilazione; la metilazione delle CpG blocca l’accesso sul promotore del complesso di attivazione trascrizionale la metilazione delle CpG aiuta il reclutamento di complessi proteici che fungono da inibitori della trascrizione “HISTONE CODE”: ü LA METILAZIONE DEL RESIDUO DI Lys9 H3 E’ ASSOCIATA ALLA CROMATINA TRASCRIZIONALMENTE INATTIVA tale processo è coinvolto nello stabilire i siti del DNA che devono essere metilati; ü LA METILAZIONE DEL RESIDUO DI Lys4 H3 E’ ASSOCIATA ALLA CROMATINA TRASCRIZIONALMENTE ATTIVA
63 • In cellule non embrionali, 80% dei CpG sono metilati, ad eccezione delle isole CpG dei promotori • Le DNA metil-transferasi (Dnmt) hanno particolare affinità per le sequenze emi-metilate: tendono quindi a metilare il nuovo filamento che si è formato su uno stampo metilato-> mantenimento del pattern di metilazione (modificazione epigenetica - memoria cellulare)
Metilazione e regolazione genica da codice istonico:
Dnmt metilano il DNA = modificazione epigenetica Il DNA metilato non e’ efficientemente legato da attivatori trascrizionali ma viene legato da proteine che legano metil- citosine (MeCP2, MBD1-4) e repressori trascrizionali Questi a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC - deacetilasi di istoni > repressione della trascrizione. Anche alcune Dnmt reclutano HDACs e viceversa
64 Transcription
La metilazione è regolata durante lo sviluppo:
Parental imprints derived from gametogenesis are retained faithfully in the zygote as well as some other marks. However, others are reprogrammed dynamically to meet the need of becoming totipotent
65 Figure 2 Imprint life cycle.
Philippe Arnaud Reproduction 2010;140:411-423
© 2010 Society for Reproduction and Fertility
Reprod Biol Endocrinol. 2009; 7: 59. Published online 2009 Jun 5. doi: 10.1186/1477-7827-7-59
66 Le principali funzioni della metilazione sono collegate alla repressione della trascrizione: •Difesa contro i trasposoni: la metilazione e’ fondamentale per mantenere silenti i genomi dei trasposoni e dei retrotrasposoni. Ad esempio : LINE1 è controllato da metilazione e proteine ADAR Che bloccano il complesso RNA:proteine che retrotrasportano mRNA al nucleo •Regolazione genica: la metilazione contribuisce a stabilire e mantenere uno stato trascrizionalmente inattivo (eterocromatina)
•Imprinting parentale: emizigosi da metilazione
• Quindi la metilazione del DNA rappresenta un meccanismo di memoria cellulare, che non puo’ dare inizio al silenziamento genico ma che lo individua, propaga e rafforza: • Metil-DNA…> Transcriptional repressor..> Histone Deacetylase..> silenziamento genico
67 68 EPIGENETICA e TUMORI
Blocco del differenziamento Leucemia Promielocitica
Eliminazione dell’isolamento fra loop di geni ad attività coordinata Glioblastoma multiforme
AML è molto eterogeneo, cara erizzato da un aumento (>20%) di cellule ematopoie che immature che proliferano (mieloblas ) nel midollo o nel sangue senza differenziare.
Meccanismi Patogene ci:
Geni di Classe1 MIELOPROLIFERAZIONE: Sono inizialmente coinvol geni codifican protein- rosina chinasi o GTPasi, che causano crescita incontrollata in presenza di mutazioni in geni che bloccano apoptosi (Flt3, N-RAS, Kit, cABL, JAK2)
Geni di Classe2 BLOCCO DEL DIFFERENZIAMENTO : Even PRECOCI che coinvolgono I fa ori di trascrizione muta o trasloca (AML-ETO, PML-RARalfa) o altre proteine che governano il differenziamento (NPM1 nucleolar, ubiquitarious phosphoprotein, CEBPA fa ore di trascrizione che blocca a vazione dei granuloci ) che spesso presentano mutazioni
69 LEUCEMIA PROMIELOCITICA ACUTA (Acute promyelocy c leukemia) t(15;17) (q22;q12); PML-RARalfa
Prognosi favorevole. Tra abile con ATRA (All-Trans Re noid Acid 10exp-6 M) che induce il differenziamento terminale dei blas
Cara erizato dal riarrangiamento PML- RARalfa (Re noic Acid Receptor alfa)-
La cellula di origine è “commi ed” verso granuloci e monoci (non precursori di megacarioci o eritroblas ) . Successivamente, quando il tumore occupa troppo posto , anche anemia e trombocitopenia sono rileva
PML si concentra nei PML-NB Nuclear Bodies, è ubiquitario ed espresso a bassi livelli Ha un RING (Really Interes ng New Gene)Zinc-finger DOMAIN Ha un dominio di Protein-protein interac on al C-terminale con il quale forma mul meri
70 -Tumore da blocco del differenziamento-
Acute Promyelocytic Leukemia t(15;17)(q22;q21)
Traslocazione Reciproca di RARalfa (Retinoid Acid Receptor,, Cromosoma 17) e PML (Promyelocytic Leukemia, chr.15)
Questa nuova proteina chimerica lega il DNA, aumenta L’interazione fra HDAC (deacetilasi istoniche) e NCOR (Nuclear Corepressor) ed impedisce la trascrizione dei geni Del differenziamento.
Leucopenia Coagulopatia Diagnosi al microscopio Cura urgente FAGGOT CELLS
Metilazione e regolazione genica: APL Acute Promyelocytic Leukemia • Il pattern di metilazione dei geni è alterato nelle cellule tumorali, e metilazione alle isole CpG di certi geni è associata al loro silenziamento specifico
• es. The fusion oncoprotein PML-RAR Retinoic Acid Receptor, come proteina chimerica da traslocazione t(15;17), lega il promotore del gene Retinoic Acid receptor β e causa il reclutamento di DNMT -> metilazione -> MBD -> HDAC> deacetilazione> inattivazione trascrizionale gene Differenziation= acido retinoico ATRA RARbeta---> APL Blocco HDAC= TSA tricostatin, sodio valproato Acute Promyelocytic leukemia ( 10% ) • Accumulo Leucociti immaturi 5-azacitidina non metilabile • Diminuzione piastrine e rossi
71 PML and PML-NBs: hubs of a proapoptotic transcriptional network
Le cellule con PML-RARalfa NON vanno in apoptosi nè se indotte da TNFalfa , nè per mancanza di siero (serum starvation)
De-SUMOYLATION
CBP/p300 Acetyl Transferase
PML aumenta l’a vità e la stabilità Di P53 e la Apoptosis –p53 e nucleo dipendente
72 FAS, TGFbeta induced Death-associated APOPTOSIS protein 6
desumoyla on
Possible model of DAXX- Titra on of DAXX By PML: to inhibit transcrip on of an -apipto c PML cooperation in the genes induction of apoptosis
LEUCEMIA ACUTA MIELOIDE con traslocazioni e mutazioni di geni che codificano fa ori di trascrizione del differenziamento ematopoie co, la cui perdita di funzione risulta in blocco del differenziamento e proliferazione di blas immaturi
AML-associated chromosome aberra ons o en affect the components of the core binding factor (CBF) complex, i.e., RUNX1 (CBFA2, AML1) and core-binding factor, beta subunit (CBFB) proteins.
RUNX1/AML1(chr.21) Runt-related transcrip on factor 1/core factor subunit alfa ( RUNX1-RUNX1T1 fusion) (AML1-ETO) t(8;21) the fusion protein AML1-ETO (Histone deacetylase)= BLOCCO DEL DIFFERENZIAMENTO. Non sono trascri I geni C-FMS (CSF1R— colony s mula ng factor 1 receptor), P14ARF (CDKN2A— cyclin-dependent kinase inhibitor 2A) and CEBPA
CBFB (chr.16) Core-binding factor, beta subunit: allosteric agent per il legame al DNA di alfa factor RUNX1 (CBFB-MYH11 miosina heavy-chain t16;16)
73 EPIGENETICA e TUMORI
Blocco del differenziamento Leucemia Promielocitica
Eliminazione dell’isolamento fra loop di geni ad attività coordinata Glioblastoma multiforme IDH1mutato
Mutazioni nel gene che codifica per ISOCITRATE DEHYDROGENASE I sono associate al glioblastoma multiforme PRIMARIO
74 GBM SECONDARIO: I pazien IDH1 muta Mostrano migliore sopravvivenza
Prima ipotesi
IDH1 Isocitrate dehydrogenase wt= Citrate -àalfa ketoglutarate C5H6O5 IDH1 mutant = Citrate -à C5H8O5 ----| TET enzyme TET enzyme removes METHYL group from DNA
If IDH1 is mutated, TET is inhibited, DNA is hypermethylated (CpG metilator phenotype), TSG are silenced
Ipotesi non accettata perchè in questi tumori il cambio di metilazione non correla con un forte cambio di espressione genica (trascrittoma e esoma)
75 Seconda Ipotesi
In addition to promoters, gene expression is regulated by the 3D structure of TOPOLOGICAL ASSOCIATED DOMAINS (TAD).
- IDH1 mutato blocca TET ( che non demetila più efficientemente) - Alcuni siti CCCTC per legare CTCF sono metilati - Se sono metilati, CTCF NON si lega. CTCF è una proteina “Insulator”, - Se non si lega I TAD non sono più isolati
- Singoli ONCOGENI VENGONO IPERATTIVATI DA ENHANCER situati IN ALTRI TAD
Cancer: Oncogene brought into the loop Matthew R. Grimmer & Joseph F. Costello Nature 529, 34–35 (07 January 2016) doi:10.1038/nature16330
TAD PGFGRA
900.000 basi
TAD Topological Associated Domain,within which gene activity is Coordinated
76 Imprinting
• Espressione Genica dipendente dall’origine Parentale dell’allele.
• L’allele imprinted è spento.
77 Chr 11 imprinted region
Embryonal Rabdo Myo Sarcoma
• ERMS hanno perdita di chr 11p15.5 di origine materna • I geni imprinted in 11: IGF2 espressione paterna (maternally imprinted), • H19 e p57KIP2 espressione Materna (Paternally imprinted TSG ) • The imprining of p57KIP is leaky • Amplificazione di MYCn
78 l’iperme lazione di questa regione in entrambi i cromosomi, che porta inevitabilmente ad una sovraespressione di Igf2 , è stata osservata in diversi pi di tumori maligni.
Erasure of imprin ng: H19 high –interagisce con histone methyl transferasi EZH2 (polycomb repressor of transcrip on) --à Low espression of NKD1 Naked cu cle1 ( passive antagonist of Wnt that blocks beta-catenin). In glioblastoma mul forme o tumori alla vescica , H19 è molto espresso perchè la me lazione è bassa .
Gli Rhabdomiosarcomi ERMS umani che hanno perdita chr 11 p15.5 materno, perdono l’espressione di H19 e p57KIP2 (sono TSG paternally imprinted):
Loss of imprin ng: L’iperme lazione di questa regione in entrambi i cromosomi, che porta inevitabilmente ad una sovraespressione di Igf2 , è stata osservata in diversi pi di tumori maligni.
79 The Increasing Complexity of the Oncofetal H19 Gene Locus:
Functional Dissection and Therapeutic Intervention Imad Matouk 1,2,*, Eli Raveh 1, Patricia Ohana 1, Rasha Abu Lail 1, Eitan Gershtain 1, Michal Gilon 1, Nathan De Groot 1, Abraham Czerniak 3 and Abraham Hochberg 1
H19 spinge alla staminalità E crescita incontrollata ( GBM)
SMAD an -differen a on
80 H19 è espresso abbondantemente in tesuti embrionali e represso dopo la nascita. Rimane espresso nel muscolo scheletrico (eRMS). miR675-3p ; miR675-5p ------| SMAD anti- differentiation transcription factor for bone
Paxillin-dependent regulation of IGF2 and H19 gene cluster expression J. Cell Sci. August 15, 2015 128: 3106-3116
81 82 Modificazioni epigenetiche, trascrizione e ambiente
•In quanto reversibili, i cambiamenti epigenetici possono essere modificati dall’ambiente •Sia ipo- che iper-metilazione sono stati associati all’invecchiamento (perdita generica di metilazione, ipermetilazione di geni specifici: silenziamento di soppressori tumorali?) •Vitamine quali l’acido folico (vit.B9), che sono importanti per l’attività degli enzimi che forniscono gruppi metilici, hanno effetti notevoli sull’incidenza di tumori (cancro al colon) •Dieta scarsa in folati -> instabilità genomica e ipometilazione •Dieta scarsa di gruppi metilici -> cancro del fegato, e ipometilazione+sovraespressione di oncogeni (c-ras, c-myc, c-fos)
83 T308 S473
MAFbx:Muscle Atrophy F-Box MURF1: Muscle Ring Finger1 LC3:microtubule associated Light Chain3 ( essential for autophagy, with BCL2/ adenovirus E1B Interacting Protein 3, BNIP3
84 85