Změny Metabolomu Slunečnice Roční Vlivem Těžkých Kovu – Nový Ukazatel Účinnosti Fytoremediačních

Mendelova univerzita v Brně

Agronomická fakulta

Ústav biologie rostlin

Změny metabolomu slunečnice roční vlivem těžkých kovu – nový ukazatel účinnosti fytoremediačních

technologií

Dizertační práce

Vedoucí práce: Vypracovala: prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Mgr. Olga Kryštofová

Brno 2013

Prohlášení Prohlašuji, že jsem dizertační práci na téma Změny metabolomu slunečnice roční vlivem těžkých kovu – nový ukazatel účinnosti fytoremediačních technologií vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury.

Dizertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího dizertační práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

dne ……………………………………….

Olga Kryštofová ……………………….

Poděkování

Zpracovaná disertační práce byla finančně podpořena z prostředků specifického vysokoškolského výzkumu prostřednictvím projektu IGA AF č. DP 6/2009, IP 7/2010 a

TP 1/2010.

Dále děkuji iniciativě UNEP.

Velmi děkuji Renému Kizekovi za vedení, podporu, všestrannou pomoc a čas, který mi věnoval.

Velké děkuji, patří také Vojtovi Adamovi za morální a duševní podporu a rady při zpracování této práce a nejbližším kolegům z laboratoře LMN za příjemnou pracovní atmosféru a toleranci.

Nakonec bych chtěla z celého srdce poděkovat svým rodičům za podporu při studiu, bez které bych nebyla tam, kde jsem a tím, kým jsem.

Tato práce vznikla v rámci projektu CEITEC - Středoevropského technologického institutu s pomocí výzkumné infrastruktury financované projektem CZ.1.05/1.1.00/02.0068 z Evropského fondu regionálního rozvoje.

ABSTRAKT

Cílem této dizertační práce je zhodnotit možnosti využití slunečnice roční pro fytoremediace půd obsahující nadlimitní koncentrace těžkých kovů. Pro naše experimenty byla vybrána Helianthus annuus L., protože splňuje podmínky pro fytoremediace. Ze skupiny těžkých kovů jsme pro naše experimenty vybrali kadmium, protože je hojně obsaženo v hnojivech, olovo, jehož koncentrace v životním prostředí velmi vzrostla díky používání olovnatých paliv, a stříbro, které může být potenciálně problematickým kovem díky svému využití v nanotechnologiích. Pro hodnocení vhodnosti rostliny pro fytoremediační účely byly hodnoceny změny v aktivitách vybraných enzymů (ALT, AST, ureáza), v koncentracích specifických peptidů (GSH, GSSG, PC) a schopnost příjmu a distribuci působících těžkých kovů.

Klíčová slova: slunečnice, těžké kovy, markery

ABSTRACT

The aim of this thesis is to evaluate the possibility of using sunflower for phytoremediation technologies of soil polluted with over-limiting concentrations of heavy metals. Helianthus annuus L. was selected for our experiments due to its phytoremediation properties. As heavy metals, cadmium, which is abundantly contained in fertilizers, lead, of which concentrations in the environment greatly increased thanks to the using of leaded fuels, and silver, which can be considered as an environmental issue due to its using in nanotechnology, were used. Changes in the activities of chosen enzymes (ALT, AST, urease), concentrations of specific peptides (GSH, GSSG, PC) and the ability to receive and distribute heavy metals were used to evaluate the suitability of plants for phytoremediation purposes.

Keywords: sunflower, heavy metals, markers

OBSAH

OBSAH ...... 7

1 ÚVOD ...... 10

2 CÍLE PRÁCE ...... 11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ...... 12

3.1 Omické vědy ...... 12

3.2 Těžké kovy ...... 13 3.2.1 Kadmium ...... 14 3.2.1.1 Historie ...... 14 3.2.1.2 Fyzikální a chemické vlastnosti ...... 15 3.2.1.3 Využití ...... 15 3.2.1.4 Toxicita ...... 16 3.2.1.5 Příjem kadmia rostlinou ...... 17 3.2.1.6 Vliv kademnatých iontů na rostliny ...... 18 3.2.2 Olovo ...... 21 3.2.2.1 Historie ...... 21 3.2.2.2 Fyzikální a chemické vlastnosti ...... 21 3.2.2.3 Využití ...... 22 3.2.2.4 Toxicita ...... 23 3.2.2.5 Příjem a transport olova v rostlině ...... 23 3.2.2.6 Vliv olova na rostliny ...... 25 3.2.3 Stříbro ...... 26 3.2.3.1 Historie ...... 26 3.2.3.2 Fyzikální a chemické vlastnosti ...... 27 3.2.3.3 Využití ...... 28 3.2.3.4 Toxicita ...... 28 3.2.3.5 Příjem a transport stříbra v rostlině ...... 29 3.2.3.6 Vliv stříbra na rostliny ...... 30

3.3 Obrana rostliny ...... 31

3.4 Metabolismus síry ...... 31 3.4.1 Sirné sloučeniny v rostlinách ...... 33 3.4.1.1 Obsah thiolových sloučenin ...... 33

3.5 Stresové proteiny ...... 38 3.5.1 Aminotransferázy ...... 39 3.5.2 Ureáza ...... 40

3.6 Antioxidační aktivita ...... 41 3.6.1 Stanovení intenzity stresové reakce ...... 41 3.6.1.1 Metoda ABTS ...... 42 3.6.1.2 Metoda DPPH ...... 42 3.6.1.3 Metoda FRAP ...... 43 3.6.1.4 Metoda Free Radical ...... 43

3.7 Fytoremediace ...... 43 3.7.1 Fytoextrakce ...... 44 3.7.2 Fytostabilizace ...... 46 3.7.3 Rhizofiltrace ...... 46 3.7.4 Kontaminace životního prostředí těžkými kovy a fytoremediace ...... 47 3.7.5 Proč využívat či nevyužívat fytoremediace ...... 48

3.8 Rostlinný materiál ...... 49 3.8.1 Helianthus annuus L. (Slunečnice roční) ...... 49

4 MATERIÁL A METODY ...... 50

4.1 Chemikálie ...... 50

4.2 Rostlinný materiál a jeho příprava ...... 50 4.2.1 Hydroponické kultury ...... 50 4.2.2 Příprava vzorku ...... 51

4.3 Detekce thiolů pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí ...... 52

4.4 Laserem indukovaná ablační spektrometrie ...... 52

4.5 Spektromentrické analýzy za využití automatického analyzátoru BS – 200 ...... 53 4.5.1 Enzymatická aktivita ureázy ...... 53

4.5.2 Enzymatická aktivita L-alanin(2-oxoglutarát) aminotransferázy ...... 53 4.5.3 Enzymatická aktivita L-aspartát(2-oxoglutarát) aminotransferázy ...... 54 4.5.4 Stanovení antioxidační aktivity pomocí DPPH• testu ...... 54 4.5.5 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS ...... 54 4.5.6 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRAP ...... 55 4.5.7 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody Free Radicals ...... 55

4.6 Stanovení svěží hmotnosti ...... 56

4.7 Fotografická dokumentace ...... 56

5 VÝSLEDKY A DISKUZE ...... 57

5.1 Optimalizace metod pro stanovení vybraných markerů v rostlinných vzorcích . 58

5.2 Vlivu kovů na rostliny – optimalizace metod pro stanovení obsahu kovu ...... 82

5.3 Bioindikace znečištění těžkými kovy pomocí rostlin ...... 105 5.3.1 Bioindikace znečištění olovnatými ionty ...... 105 5.3.2 Bioindikace znečištění stříbrnými ionty ...... 126

6 ZÁVĚR ...... 147

7 LITERATURA ...... 148

8 SEZNAM OBRÁZKŮ ...... 176

9 SEZNAM TABULEK ...... 177

10 SEZNAM ZKRATEK ...... 178

1 ÚVOD

Rostliny, jsou živé organismy, které nás obklopují a jejichž přítomnost a důležitost si leckdy neuvědomujeme. Tyto organismy mají a stále budou mít pro náš život klíčovou roli. Jsou pro nás zdrojem kyslíku i potravy, ale mohou být také použity jako prostředek nápravy našich chyb (tj. průmyslové kontaminace půd, vod a vzduchu). Na poli vědy se v dnešní době rozvíjí nové odvětví, které má v úmyslu využít rostlin pro regeneraci půd, které člověk svým neuváženým konáním znečistil. Toto odvětví se nazývá fytoremediace. K tomu, aby mohly být rostliny použity ve fytoremediacích, je zapotřebí laboratorních testů. Tyto testy sledují parametry morfologické a biochemické.

Mezi parametry, které můžeme sledovat, patří intermediáty a produkty primárního a sekundárního metabolismu. Jejich koncentrace se mění dle výše stresu či intenzity obranné reakce, které vyvolává působící stresor. Díky změnám v jejich koncentracích, případně díky změnám enzymatických aktivit můžeme posoudit, zda je rostlina schopna růst na kontaminovaných půdách, tedy, zda je pro fytoremediační procesy vhodná, nebo zda má potenciál pro genetickou úpravu, díky které, by se zlepšily její fytoremediační vlastnosti (např. existují rostliny, které jsou schopny růst na vysoce kontaminovaných půdách, ale nejsou schopny anorganické kontaminanty transportovat do nadzemních částí a zde je uskladnit).

Mezi nejčastěji sledované metabolomické parametry patří intenzita stresové reakce, která se stanovuje například na základě antioxidační aktivity, pro kterou je charakteristická zvýšená tvorba volných radikálů. Tyto radikály, pokud se jim rostlina účinně nebrání, způsobují nevratné poškození buněk. Jako obranné mechanismy vůči jejich negativnímu působení jsou používány antioxidační enzymy. Zvýšená enzymatická aktivita může podpořit tvorbu sloučenin, které jsou schopny tyto radikály zneškodnit, nebo mohou zabránit jejich samotné tvorbě.

Ačkoliv fytoremediace nejsou v našich končinách stále běžné, jejich využívání se však stále zvyšuje. Důvodů je hned několik. V první řadě to je neinvazivní metoda, která je veřejností dobře přijímána, a dále jsou to ekonomické náklady, které jsou nízké ve srovnání se standardními postupy. Hlavní, co musíme při jejím použití zvážit je čas, který rostliny potřebují na svůj vývoj a splnění funkce remediátora.

2 CÍLE PRÁCE

1. Optimalizace metod pro stanovení vybraných markerů v rostlinných vzorcích

2. Vlivu kovů na rostliny – optimalizace metod pro stanovení obsahu kovu

3. Bioidikace znečištění těžkými kovy pomocí rostlin

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1 Omické vědy

Od konce druhé poloviny 20 století dochází na vědeckém poli k masivnímu rozvoji nových vědních oborů s příponou – omika, které svůj název odvozují z řečtiny s významem znamenající „vše, úplný“. Jedná se o genomiku, transkriptomiku, proteomiku a metabolomiku. Všechny tyto „omické“ vědy mají kromě stejné přípony společné to, že se zabývají biochemickými procesy v živých organismech na různých úrovních, ať už na úrovni DNA, RNA, proteinů či metabolitů (Obr. 1). Metabolity se zabývá vědní obor metabolomika, což je nejkomplexnější ze zmíněných omických věd. Jedním z podoborů je i metalomika, která shrnuje poznatky o osudu iontů kovů v živých organismech.

Metabolismus

Genomika DNA Metabolity

Metabolomika = Transcriptomika RNA složitost Proteomika Protein Zvyšující se chemická seZvyšující Metabolomika Metabolity

Obr. 1. Návaznost omických věd

První publikace spadající do oboru omických věd se objevují od roku 1961(Yamamoto a Anderson, 1961). Jedná se tedy o nejstarší omickou vědu. Oproti tomu nejmladší vědou je metabolomika, která spatřuje světlo světa až od roku 2000 (Fiehn, a kol., 2000). Všeobecně lze pozorovat v oblasti omických věd za posledních 15 let markantní nárůst ve vědecké a publikační činnosti, který tvoří více než 400 % (Obr. 2). Současně přibývá i počet „omik“, kterých je dnes už více než stovka.

Genomika Transcriptomika Proteomika

16000 1400 7000 14000 1200 6000 12000 1000 5000 10000 800 4000 8000 600 3000 6000 4000 400 2000 et publikací 200 č 2000 1000 0 0 0 Po 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Roky publikování Roky publikování Roky publikování

Metabolomika Omické vědy celkem

1600 25000 1400 1200 20000 1000 15000 800 600 10000 et publikací 400 č 200 5000 Po 0 0 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Roky publikování Roky publikování

Obr. 2: počet publikací za posledních 15 let na WOS. Pro hledání byla použita následující klíčová slova: genomic*, transcriptomic*, proteomic*, metabolomic*

3.2 Těžké kovy

Za 300 let průmyslového rozvoje člověka vstoupilo do životního prostředí velké množství látek, které se do té doby vyskytovaly pouze ve stopových množstvích nebo v množstvích přirozených (= přírodní zdroje). Látky, jejichž koncentrace v životním prostředí vzrostla díky antropogenní činnosti člověka (= antropogenní zdroje), se označují jako polutanty (kontaminanty) životního prostředí a lze je rozdělit do několika skupin. Podle chemické povahy je můžeme dělit na anorganické a organické, podle skupenství na plynné, pevné a kapalné, či podle jejich chování na reaktivní a inertní.

Jedním ze stále rozšiřujících se kontaminantů anorganické povahy jsou těžké kovy. Do této skupiny patří především arzen (As), kadmium (Cd), rtuť (Hg) a olovo (Pb) (Clemens, 2006). Jejich nebezpečnost spočívá ve schopnosti akumulace v zemědělských plodinách. Ty představují významnou trofickou úroveň, a tedy umožňují jejich vstup do potravního řetězce. Mezi nejvýznamnější účinky na živé organizmy patří inhibiční vliv na růst živočichů (Animalia), rostlin (Plantae), hub (Fungi) a bakterií (Bacteria). Nejedná se ovšem jen o prosté ovlivnění růstu, jak vy se mohlo na první pohled zdát,

na základě chemické podobnosti nahradit podobné kovy ve struktuře enzymů (př. kadmium versus zinek) (Kovalchuk a Kovalchuk, 2008, Peng, a kol., 2008). Významná je také jejich schopnost generovat reaktivní formy kyslíku, které díky své reaktivnosti mohou dále poškodit řadu biomolekul včetně proteinů a nukleových kyselin (Gichner, a kol., 2008).

Toxicita daného těžkého kovu je dána jeho chemickou formou, oxidačním stavem a schopností vazby na ligand(y). Těžké kovy vytvářejí elektrofilní kationy, pro něž je typická silná afinita k síře. Díky tomu velmi aktivně atakují sulfhydrylové skupiny (- SH) nacházející se převážně v proteinech včetně enzymů (zde cysteinylové zbytky), které se významnou měrou podílí na stabilizaci struktury proteinů. Po interakci s těžkým kovem enzym ztrácí svoji správnou funkci a bývá nejčastěji degradován. Kromě -SH skupin se ionty těžkých kovů mohou vázat i na karboxylové skupiny a aminoskupiny, které jsou charakteristické pro sloučeniny související s přenosem genetické informace. Tato skutečnost dělá z těžkých kovů potencionální genotoxikanty.

Velký rozdíl v toxicitě daného kovů je dán i tím, zdali je kov ve formě anorganické či organické, což se zásadně odráží v jeho příjmu a dalším transportu, případně akumulaci. Tento rozdíl je pak patrný na intenzitě toxického působení. Nejvíce toxické jsou organokovové sloučeniny. Jejich vyšší toxicita spočívá v jejich lipofilním charakteru, díky němuž mohou snadno a beze změny procházet přes buněčné membrány, a také v pomalé dealkylaci na anorganické soli (Manahan, 2000)

3.2.1 Kadmium

3.2.1.1 Historie

Bylo objeveno v roce 1817 profesorem Friedrichem Stromeyerem z Univerzity v Göttingemu v hornině zvané kalamín (dnes smithsonit, chemicky ZnCO3), která se používala jako zinková ruda. Od druhé poloviny 19. století byly sloučeniny kadmia využívány zejména v malířství jako pigmenty (kadmiová žluť – CdS), později následovalo (od druhé poloviny 20. století) využití kadmia v průmyslu jako součásti slitin. (Greenwood N.N., 1993)

3.2.1.2 Fyzikální a chemické vlastnosti

Kadmium (Cd) je stříbřitý chalkofilní kov vyskytující se v anorganických i organických sloučeninách v oxidačním stupni +2. V přírodě se nachází ve velmi malém množství. Poměrné množství kadmia v zemské kůře je asi 0.15 – 0.50 mg·kg-1 (např. minerál greenockit – CdS). Jako ryzí kov se prakticky nevyskytuje, nejčastěji se vyskytuje jako příměs zinkových a olověných rud, se kterými se získává. (Greenwood N.N., 1993)

Z přirozených zdrojů kadmia je nejvýznamnější vulkanická aktivita. Z antropogenních zdrojů se do ovzduší kadmium dostává při těžbě a zpracování rud, ve kterých je obsaženo (vyskytuje se v rudách se zinkem v poměru 1:100 až 1:1000) (IRZ; (Pacyna, a kol., 2009, Unterbrunner, a kol., 2007)) dále z vyluhovaných hornin, fosfátových hnojiv a díky spalování fosilních paliv (Obr. 3).

přirozené emise 6%

povrchové úpravy 38% odpady 41%

baterie 13%

automobilová doprava hnojiva 1% 1%

Obr. 3: Schéma procentuálního zastoupení hlavních zdrojů kadmia, podle informací Ministerstva životního prostředí, Integrovaného registru znečišťování a UNEP

3.2.1.3 Využití

Pro svoji schopnost chránit železo před korozí je kadmium používáno jako příměs do slitin, které se používají při výrobě plechů (především v automobilovém průmyslu), jako součást elektrod v alkalických akumulátorech a jako stabilizátor plastů a barevný pigment v plastech a nátěrových hmotách. Kromě průmyslu představuje zemědělství další významný zdroj kadmia antropogenního původu, a to díky používání minerálních a organických hnojiv (superfosfáty), kde je kadmium přítomno, byť ve velmi malých koncentracích, čistírenských kalů a aplikací některých pesticidů. (Unterbrunner, a kol., 2007).

Využití kademnatých rud člověkem v průmyslu, zemědělství a spalování pohonných hmot a olejů vede ke zvyšování jeho koncentrace v životním prostředí přibližně 8x oproti přirozené emisi (Unterbrunner, a kol., 2007).

3.2.1.4 Toxicita

Kadmium je poměrně vzácný prvek, který má esenciální podobu (enzym karbon anhydráza EC 4.2.1.1, Thalassiosira weissflogii) (Park, a kol., 2007). Přesto je jeho i malá koncentrace pro organismus toxická (tolerovaná denní dávka kadmia pro dospělého člověka činí 67 – 83 mg).

Kadmium má podobnou elektronegativitu a podobné chemické vlastnosti jako esenciální těžký kov zinek a to způsobuje, že se toxicita kadmia projevuje výhradně tehdy, když nahrazuje zinek v životně důležitých proteinech (zinkové prsty). K tomu přispívá i stejný mechanismus příjmu a transportu těchto dvou kovů v rostlinách. Iontový poloměr zinku (0.074 nm) je však nižší než iontový poloměr kadmia (0.097 nm), a to při společném vstupu kovů ulehčuje zinku, aby přednostně obsadil cílová místa v proteinech, a tím celkově snižoval vazbu a následnou toxicitu kadmia. Pokud ale dojde pouze k příjmu kadmia, dochází k nahrazení zinku v proteinech a k narušení jejich funkcí, např. katalytické v případě enzymů. Kadmium je kumulativní jed, jehož obsah v organismu se zvyšuje se stoupajícím věkem (Clemens, 2006).

Kadmium je jedním z nejtoxičtějších těžkých kovů jak pro rostliny, tak i pro živočichy. Mechanismus účinku se projevuje narušením základních biochemických procesů, což může mít za následek i narušení základních fyziologických procesů. Kadmium je tedy rovněž genotoxické se schopností indukovat široké spektrum mutací (bodové mutace, chromosomální aberace), které mohou vést k tvorbě defektních proteinů nebo přímo k buněčné smrti (Coen, a kol., 2001, Zhang a Xiao, 1998). Kromě mutagenních účinků mají vysoké koncentrace kadmia rovněž karcinogenní účinky pro většinu živočichů (Degraeve, 1981).

3.2.1.5 Příjem kadmia rostlinou

Kadmium je dobře biodostupné, a proto se velmi dobře kumuluje živých organismech. Jeho setrvání v organismu živočichů je dlouholeté (i několik desítek let), u rostlin to bývá po celou dobu jejich života.

Rostlinami je přijímáno převážně kořeny, existuje však i mimokořenový příjem kadmia přímo z atmosféry listy (povrchová kontaminace rostliny). Příjem kadmia kořeny rostlin lineárně závislý na koncentraci volných Cd2+ iontů v prostředí. Pohyb ke kořenům se děje difúzí a hromadným půdním tokem, v bezprostřední blízkosti kořenů dochází k chelataci kovu organickými kyselinami vylučovanými rostlinou, zvyšuje se difúzní gradient a urychluje se příjem prvku (DalCorso, a kol., 2008, Domazlicka a Opatrny, 1989).

Procesy bioakumulace kadmia a dalších těžkých kovů závisí na faktorech vnějšího prostředí, a to na koncentraci kumulovaného iontu a jeho formě, obsahu organických a dalších komplexotvorných látek v prostředí, teplotě, hodnotě pH prostředí a dalších faktorech (Salt, a kol., 1995, Zhao, a kol., 2003). Obecně platí, že při identické koncentraci kadmia v půdě jeho obsah v pletivech rostlin se vzrůstající hodnotou pH půdy klesá. V souvislosti s příjmem kadmia byla dokázána ochranná úloha vápníku před jeho fytotoxickým působením (Somashekaraiah, a kol., 1992). Dále bylo zjištěno, že příjem kadmia z půdy může ovlivňovat kationtová výměnná kapacita a obsah dostupného fosforu v půdě, a také interakce s některými mikroelementy, zejména se zinkem (Tang, a kol., 2009).

Předpokládá se, že toxicita kadmia je spojena s jevem kompetitivní inhibice, kdy kadmium soutěží o podobná vazebná místa jako zinek, ale funkčně zinek nesubstituuje, což znamená, že daný protein (enzym) je nefunkční. Dochází tedy k restrikci příjmu zinku a navození zinkové deficience (DalCorso, a kol., 2008, Domazlicka a Opatrny, 1989, Nagajyoti, a kol., 2010).

Obsah kadmia v rostlinách však není pouze funkcí koncentrace kovu v prostředí a délky expozice, ale kolísá rovněž v závislosti na druhu rostliny, případě odrůdě a rostlinné části. Nejvyšším obsahem kadmia v rostlinách se zpravidla vyznačují pletiva kořenů, následují listy, stonky, plody a hlízy. Nejnižší obsah vykazují semena (Domazlicka a Opatrny, 1989)(Tab. 1).

Tab. 1: Přehled rostlin vyžívajících se pro sledování kumulace a vlivu kadmia

Maximální Rostlinný druh koncentrace Reference (µmol·l-1)

Glycine max L. 0.5 (Cataldo, a kol., 1983)

(Han, a kol., 2006, Mullins a Sommers, 1986, Perriguey, a Zea mays L. 100 kol., 2008, Redjala, a kol., 2009)

Lupinus albus L. 5 (Costa a Morel, 1993)

Lactuca sativa L. 5 (Costa a Morel, 1994)

Pisum sativum L. 100 (Cohen, a kol., 1998)

Triticum astivum L. 1.5 (Hart, a kol., 2002, Hart, a kol., 1998)

Triticum turgidum L. 1.8 (Harris a Taylor, 2001, Hart, a kol., 2002, Hart, a kol., 1998)

(Lombi, a kol., 2002, Lombi, a kol., 2001, Redjala, a kol., Thlapsi caerulescens L. 50 2009, Zhao, a kol., 2002)

Arabidopsis halleri L. 10 (Zhao, a kol., 2006)

Oryza sativa L. 50 (He, a kol., 2007)

Solanum melongena L. 1.2 (Mori, a kol., 2009)

Solanum torvum Sw. 1.2 (Mori, a kol., 2009)

3.2.1.6 Vliv kademnatých iontů na rostliny

Mezi zjevné, a tudíž nejčastěji popisované symptomy fytotoxicity kadmia patří chlorózy listů, hnědnutí kořenových vlásků, případně špiček kořenů, červenohnědé zbarvení listové žilnatiny a výskyt fialovohnědých skvrn na listech, v extrémních případech usychání a opad listů (Berkelaar a Hale, 2000, Domazlicka a Opatrny, 1989, Nagajyoti, a kol., 2010). Kadmium ovlivňuje řadu biochemických procesů, které v konečném důsledku vedou k inhibici růstu a snížené tvorbě biomasy. Na druhou stranu, nízké koncentrace kadmia v prostředí mají na tvorbu biomasy stimulační účinky (Arduini, a kol., 2004). Vyšší koncentrace kadmia naopak inhibuje růst kořenů i nadzemních částí rostlin a iniciuje tvorbu laterálních kořenů (Lux, a kol., 2004).

Z metabolických drah kadmium významně ovlivňuje fotosyntetické procesy. Zvýšený obsah kadmia v půdě vede k výrazné inhibici fotosyntézy exponovaných rostlin. Příčiny inhibice čisté fotosyntézy lze spojovat s lineárním poklesem rychlosti transpirace v důsledku kadmiem indukovaného uzavření průduchů, případně se vzrůstajícím odporem průduchů a listového mezofylu k příjmu CO2. (Domazlicka a Opatrny, 1989, Sandalio, a kol., 2001, Unterbrunner, a kol., 2007)

Dlouhodobá expozice rostlin kadmiu ovlivňuje syntézu chlorofylu a karotenoidů (Larsson, a kol., 1998). Jejich snížený obsah v listech je důsledkem buď enzymatické degradace pigmentů, nebo důsledkem inhibice biosyntézy (Obr. 4) (Somashekaraiah, a kol., 1992, Stobart, a kol., 1985).

Cd2+ 2+ 2‐oxoglutarát Mg

NEBO +

glycin 5‐ aminolevulová kyselina

Sukcinyl CoA protoporfyrin

Mg‐protoporfyrin

Cd2+

Cd Cd

NADPH, H+

protochlorofylid chlorofylid a chlorofyl a

Obr. 4: Inhibice biosyntézy chlorofylu kadmiem, upraveno dle Stobarta et al. (Stobart, a kol., 1985)

Dalším z fyziologických procesů, které kadmium ovlivňuje, je i respirace. Expozice rostlin nízkým koncentracím kadmia (do 1.35 µmol·l-1) respiraci stimuluje (Kesseler a Brand, 1995). Příčinou stimulačního působení kadmia na dýchání je pravděpodobně redukovaná fotofosforylace, proces, kdy je fosfátová skupina přenášena na substrát, kterým je ADP. To vede ke snížené produkci ATP. Díky tomu se zvyšuje požadavek na tvorbu ATP cestou oxidativní fosforylace. Vyšší koncentrace kadmia působí na respiraci inhibičně (Domazlicka a Opatrny, 1989). Ionty kadmia inhibují oxidativní

fosforylaci v mitochondriích a zvyšují pasivní propustnost mitochondriální membrány pro H+ (Unterbrunner, a kol., 2007).

Vadnutí rostlin jako důsledek fytotoxického působení kadmia bylo popsáno u mnoha rostlinných druhů (Das, a kol., 1997, Dietz a Schnoor, 2001, Jadia a Fulekar, 2008, Nagajyoti, a kol., 2010, Somashekaraiah, a kol., 1992, Tang, a kol., 2009). Příčiny tohoto jevu jsou spatřovány v inhibici transpirace spojené s uzavřením průduchů, případně v redukci podílu xylému schopného vedení vody ve stonku, v redukovaném průměru trachejí a ucpávání elementů xylému produkty degradace buněčných stěn. Tím je ovlivněn vodní provoz a celkově je snížena tolerance rostlin k vodnímu stresu. Dochází k poklesu elasticity buněčných stěn, čímž způsobuje ztrátu turgoru při vyšším vodním potenciálu a vyšším relativním obsahu vody v listech. (Domazlicka a Opatrny, 1989, Greger a Johansson, 1992, Unterbrunner, a kol., 2007)

Kadmium také inhibuje oxidativní fosforylaci v mitochondriích (Kesseler a Brand, 1995), významně ovlivňuje výměnu kationtů přes cytoplasmatickou membránu (Obata, a kol., 1996) a silně ovlivňuje aktivitu několika enzymů, jako je glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (EC 1.1.1.49), glutamátdehydrogenáza (EC 1.4.1.2), RuBisCo (EC 4.1.1.39) a dalších (Mattioni, a kol., 1997, Siedlecka, a kol., 1997, Vanassche a Clijsters, 1990). Vlivem kadmia však dochází i ke zvýšení aktivity některých enzymů, příkladem mohou být enzymy skupiny peroxidáz zabezpečující univerzální obranu rostlin (Chen a Kao, 1995, Vanassche a Clijsters, 1990).

Kademnaté ionty indukují u rostlin oxidativní stres (di Toppi a Gabbrielli, 1999, Hendry, a kol., 1992, Somashekaraiah, a kol., 1992), který je charakteristický prudkou přechodnou tvorbou velkého množství aktivních forem kyslíku (ROS) (Mittler, 2002). Tyto vysoce reaktivní molekuly, zejména hydroxylový radikál, působí destruktivně na lipidy, nukleové kyseliny a proteiny, což vede nejen ke změnám jejich struktury, ale také funkce. ROS však mohou fungovat také jako signální molekuly kontrolující obranné procesy rostlinného organismu a hrající významnou roli v procesu programované buněčné smrti (např. peroxid vodíku) (Pasqualini, a kol., 2003, Semenza, 1999, Vacca, a kol., 2004).

3.2.2 Olovo

3.2.2.1 Historie

Olovo (Pb) patří mezi kov nejdéle využívaný lidmi. První zmínky se o něm objevují již ve Starém zákoně. Chemický symbol pochází z latinského názvu plumbum (= těžký), ve starém Egyptě se používalo při glazování keramiky (7000 až 5000 př. nl.), Římané ho využívali pro budování rozvodu vody i pro kanalizaci a skladování vína (Greenwood N.N., 1993).

Olovo je odnepaměti spojováno s otravami. Alchymistické rukopisy staré Číny popisují příznaky akutní otravy olovem po požití „elixíru nesmrtelnosti“, do kterého se sloučeniny obsahující olovo přidávaly. Staří Římané, kteří ho široce využívali v souvislosti s pokročilejšími technologiemi, si jedovatost olova a jeho sloučenin sice uvědomovali, avšak nebezpečí plynoucí z jejich užívání podceňovali. Přehlíželi totiž účinek dlouhodobého působení malých dávek, vedoucích k chronickým otravám a duševním poruchám (Navrátil a Rohovec, 2006). Existují zprávy o otravě olovem i z nedávné minulosti, a to převážně z rozvojových zemí, kde expozice olovu představuje velký problém (Busse, a kol., 2008, Dai a Fan, 2007, Ogawa, a kol., 2008, Were, a kol., 2008). Jeho slitiny s cínem, antimonem nebo stříbrem vykazují výborné vlastnosti při mechanickém spojování kovových předmětů pájením a jako pájky jsou doposud široce používány (Greenwood N.N., 1993).

3.2.2.2 Fyzikální a chemické vlastnosti

Olovo je nízko tavitelný, měkký, velmi těžký, toxický kov. Vyskytuje se ve dvou mocenstvích Pb2+ a Pb4+. Za normálních podmínek je olovo odolné a neomezeně stálé vůči atmosférickým vlivům. (Greenwood N.N., 1993)

Jedná se o nejrozšířenější toxický kov (13 mg·kg-1). Toto rozšíření souvisí s faktem, že tři ze čtyř přirozených izotopů olova (206Pb, 207Pb, 208Pb) vznikají v rozpadové řadě (na prvním místě) jako stabilní produkty přirozených rozpadových řad jednotlivých prvkových izotopů. Pouze 204Pb (asi 1.4 %) radioaktivním rozpadem nevzniká. Změny izotopového složení (zastoupení izotopů) olova podle jeho původu také vysvětlují proměnlivost jeho atomové hmotnosti a omezenou přesnost, se kterou může být stanovena. Nejdůležitější olověnou rudou je galenit (PbS), dále cerrusit (PbCO3), 21

anglesit (PbSO4), pyromorfit Pb5(PO4)3Cl a mimetesit Pb5(AsO4)3Cl. (Greenwood N.N., 1993)

Vstup olova do životního prostředí je možný působením povětrnostních podmínek z hornin a sopečných vyvřelin, které přirozeně obsahují sloučeniny olova. Nezanedbatelný je i jeho antropogenní původ, kdy je olovo a jeho sloučeniny uvolňováno z továrních a výfukových plynů vznikajících při spalování pohonných hmot, z barev, komunálního odpadu (baterie), při pokovování a konečné úpravě výrobků. Je rovněž součástí hnojiv a pesticidů (Eick, a kol., 1999) (Obr. 5).

přirozené emise 6%

povrchové úpravy 38% odpady 41%

baterie 13%

automobilová doprava hnojiva 1% 1%

Obr 5: Schéma procentuálního zastoupení hlavních zdrojů olova v životním prostředí. Zdroj: Ministerstvo životního prostředí, Integrovaný registr znečišťování a UNEP.

3.2.2.3 Využití

Díky své schopnosti pokrývat se na vzduchu vrstvou oxidu, a tím se pasivovat, se kovové olovo v minulosti hojně využívalo na výrobu ochranných obalů kabelů a k výrobě vodovodních a odpadních trubek. Kvůli vysoké toxicitě olova bylo od tohoto využití postupně odstoupeno a zůstalo již jen jeho využití pro výrobu akumulátorových desek a jako ochranná vrstva proti radioaktivnímu záření. Velké množství olova bylo a stále je využíváno ve formě slitin (zejména s cínem), které nacházejí využití jako různé pájky či pro výrobu ložisek. Některé sloučeniny olova jsou využívány jako pigmenty (PbO), nebo byly v minulosti používány jako přísada do pohonných hmot (tetraethyloovo). (Greenwood N.N., 1993)

3.2.2.4 Toxicita

Olovo a jeho sloučeniny jsou historicky nejznámější toxické látky. Jejich nebezpečnost spočívá ve schopnosti hromadit se v organismech a tak vyvolávat chronickou otravu. V životním prostředí je poměrně rozšířeným prvkem (vzduch 0.005-0.5µg·m-3, půda cca 10 mg·kg-1), a proto je třeba na něj pohlížet z hlediska účinnost vstřebávání. (Stohs a Bagchi, 1995)

Olovo je přijímáno do organismu stejnými transportními mechanismy jako vápenaté ionty. Při nedostatku železa v potravě dochází k vazbě olova na červené krvinky, díky čemuž dochází k usnadnění transportního mechanismu olova v organismu (Stohs a Bagchi, 1995). Olovo je také přijímáno plícemi, významná je také možnost expozice organokovovým sloučeninám olova, které vykazují vysokou lipofilitu, a tedy dobrý průchod kožní bariérou.

Akutní otravy olovem jsou poměrně vzácné. Nejvýraznějším příznakem akutní otravy olovem bývá ovlivnění nervové soustavy (svalová slabost), nebo rozklad červených krvinek s následným poškozením ledvin. Při chronické otravě dochází k postižení celé řady orgánových systémů a biochemických pochodů. (Dai a Fan, 2007, Stohs a Bagchi, 1995)

3.2.2.5 Příjem a transport olova v rostlině

Olovo je rostlinami přijímáno z půdního roztoku, případně z aerosolu. Obsah olova v rostlině se liší nejen v závislosti na jejím druhu, stáří, rostlinné morfologii a anatomii, ale také například na vzdálenosti od expozičního zdroje (např. od silnice) a na jiných faktorech. Olovo je převážně akumulováno kořeny (Salt, a kol., 1995), přičemž většina přijatého olova je deponována v kořenech a jen malá část je transportována do nadzemních částí. Histochemické sledování semenáčků ječmene a kukuřice ukázalo, že v kořenech je olovo distribuováno přes vnější část kořenové čepičky (slizový obal kořene, povrch kořenové čepičky) a rhizodermální buňky dále do středního válce. Olovo téměř není dále transportováno přes endodermis do stélé, což indikuje jen velmi omezený transport olova do nadzemních částí, a na stranu druhou mechanismy, které umožňují deponovat olovo v základním pletivu kortexu, zejména v buněčných stěnách. Dále se dá usuzovat na zásadní roli endodermis v transportu olova, která představuje

bariéru pro vstup olova do nadzemních částí (Sobotik, a kol., 1998). Vstup do rostliny je možný i přes listy. Rozsah, kterým olovo vstupuje do rostliny pomocí listů, je závislý na schopnosti listů absorbovat olovo ze vzdušných zdrojů, což je závislé nejen na morfologické stavbě a charakteru listů, ale také na jejich anatomické stavbě (Hasegawa, a kol., 2000).

Množství naakumulovaného olova v kořenech je závislé na jeho množství v půdním roztoku, chemické podobě, velikosti půdních částic, velikosti kořenového povrchu (absorpční plocha), která odráží morfologické aspekty kořenového systému, mykorhizaci a rychlosti transpiračního toku (do Nascimento a Xing, 2006) (Tab. 2). Transport olova z půdy do kořenových buněk probíhá přes buněčnou stěnu. Zde se váže na látky pektinové povahy (homogalakturonan a rhamnogalakturonan I) (Polec-Pawlak, a kol., 2007) nebo je po překonání cytoplazmatické membrány transportováno přes vápníkové kanály (Marshall, a kol., 1994, Seregin a Kozhevnikova, 2008).

Tab. 2: Přehled rostlin využívaných pro sledování kumulace a vlivu olova

Maximální Rostlinný druh koncentrace Reference (µmol·l-1)

Brassica carinata A. Braun 50 (Marchiol, a kol., 2004, Soriano a Fereres, 2003)

(Clemente, a kol., 2006, Clemente, a kol., 2005, Brassica juncea L. 55 Marchiol, a kol., 2004)

Brassica napus L. 39 (Marchiol, a kol., 2004)

Glycine max L. 72 (Fellet, a kol., 2007)

Helianthus annuus L. 5 (Fellet, a kol., 2007, Marchiol, a kol., 2007)

Hordeum vulgare L. 27 (Soriano a Fereres, 2003)

Lolium perenne L. 140 (Alvarenga, a kol., 2009)

Medicago sativa L. 2.1 (Pajuelo, a kol., 2007)

Oryza sativa L. 6 (Murakami a Ae, 2009)

Phaseolus vulgaris L. 1 (Luo, a kol., 2005, Luo, a kol., 2008)

Pisum sativum L. 1.4 (Chen, a kol., 2004)

Raphanus sativus L. 28 (Marchiol, a kol., 2004)

Sorghum bicolor L. 100 (Fellet, a kol., 2007, Marchiol, a kol., 2007)

Zea mays L. 257 (Fellet, a kol., 2007, Luo, a kol., 2005)

Zadržování olova v kořenech je založeno na jeho vázání do iontově výměnných míst na buněčných stěnách, extracelulárním srážení a tvorbě precipitátů, nejčastěji uhličitanů, zadržujících se v buněčné stěně. Bylo zjištěno, že přidání syntetických chelátů (např. EDTA) v kombinaci s nízkým pH vede k omezení vazebné kapacity buněčných stěn pro olovo a dále je transportováno do nadzemních částí (De la Rosa, a kol., 2007, Jarvis a Leung, 2002).

3.2.2.6 Vliv olova na rostliny

Přítomnost olova v nízkých koncentracích stimuluje rostlinný růst. To bylo prokázáno ve studii Tang a kol., kteří aplikovali olovo ve formě Pb(NO3)2 rostlinám (Tang, a kol., 2009). Při vyšších koncentracích však dochází k narušení jak biochemických procesů, zejména metabolismu vápníku a enzymatických systémů (inhibice řady enzymů), tak i procesů fyziologických, zejména příjmu CO2 (snížení) a příjmu a vedení vody. Olovo působí inhibičně na buněčné dělení. Mezi viditelné symptomy fytotoxicity olova patří projevy chlorózy, přičemž pletiva kolem svazků cévních listů zůstávají zelená, později se zbarvují žlutozeleně a listy jsou celkově zakrnělé (Sharma a Dubey, 2005).

První nespecifické symptomy toxicity olova v rostlině zahrnují velmi rychlou inhibici růstu kořenů, celkovou inhibici růstu nadzemních částí (zakrnělý růst) a chlorózu (Burton, a kol., 1984). I malé množství olova po vstupu do buňky negativně ovlivňují celou řadu procesů. Bylo zjištěno, že ionty olova ovlivňují permeabilitu biomembrán a enzymové aktivity (inhibice), z fyziologických procesů na orgánové úrovni a úrovni intaktní rostliny pak fotosyntézu, příjem jiných iontů kovů včetně esenciálních, respiraci, a vodní režim. Ovlivňují rovněž biosyntézu a transport růstových regulátorů. Vysoká koncentrace olova může indukovat buněčnou smrt (Seregin a Ivanov, 2001). Olovo rovněž zpomaluje klíčení semen a růst klíčních rostlin. Koncentrace olova 1 mmol·l-1 způsobuje snížení klíčivosti o 14-30 % a redukuje růst klíčních rostlin rýže (Oryza sativa L.) o 13-45 % (Verma a Dubey, 2003). Při experimentu s cibulí (Alium cepa L.) exponovanou olovu byl potvrzen jeho negativní

vliv nejen na růst kořene, ale také na vlastní mitózu a chromozómy (Padmavathiamma a Li, 2007, Wierzbicka, 1994). Shrnutí působení Pb po vstupu do rostliny je ukázáno na schématu (Obr. 6).

Snižuje Zvyšuje

Vodní režim • Plocha listů • Látky udržující turgor a buněčnou stěnu • Otevírání průduchů

Příjem živin • Příjem kationtů Mitotické deformace • Příjem aniontů • Nepravidelný tvar • Soudržnost DNA na úrovni • Elektronový transport chromozomů a vznik zlomů Respirace • Protonový transport • Degradace DNA • Aktivita enzymů Krebsova cyklu

• Elektronový transport Fotosyntéza • Aktivita enzymů Krebsova cyklu • Syntéza chlorofylů a aktivita NADP+ oxidoreduktáz

Obr. 6: Schematické znázornění ovlivnění metabolických pochodů v rostlině po vstupu olova. Olovo ovlivňuje vodní režim, příjem živin, způsobuje mitotické nepravidelnosti v jádře, narušuje respiraci a fotosyntézu. [upraveno podle (Sharma a Dubey, 2005)]

3.2.3 Stříbro

3.2.3.1 Historie

Stříbro je ušlechtilý kov využívaný člověkem již od starověku. Prvotní využití bylo nejen ve šperkařství, ale také v běžném životě, kde díky používání stříbrných misek a pohárů a díky antimikrobiálním účinkům stříbra mohli lidé déle skladovat potraviny a vodu. Díky neustálým bojům středověké šlechty o moc a z toho plynoucích obav z otravy tehdejší vzdělanci zjistili, že pokud se jed nalil do stříbrné nádoby, nebo do nádoby, kde bylo rozpuštěné stříbro, voda změnila svou barvu, a díky tomu poznali, že je voda otrávená. (Greenwood N.N., 1993)

Novodobé používání stříbra začalo v 19. století, kdy skupinka amerických lékařů začala sloučeninami stříbra, zejména dusičnanem stříbrným, úspěšně léčit zhoubné

onemocnění kůže, infekce a urychlovali proces hojení. Nyní je stříbro široce využíváno zejména v průmyslu, ale také ve velmi moderním oboru nanotechnologií (Huang, a kol., 2007).

3.2.3.2 Fyzikální a chemické vlastnosti

Svůj latinský název získalo od sanskrtského výrazu argentos (= jasný). Jedná se o ušlechtilý kov bílé barvy, měkký, snadno kujný a tažný. V přírodě se vyskytuje jak v kovové formě, tak ve formě sloučenin, zejména sulfidu (minerály argentit a akantit, které se vyskytují často společně se sulfidy jiných kovů např. olova, mědi, železa a zlata). Výskyt stříbra v zemské kůře je poměrně vzácný. Průměrný obsah v půdě činí kolem 0.07 – 0.1 mg·kg-1. V mořské vodě činí jeho koncentrace přibližně 3 µg·l-1. (Greenwood N.N., 1993)

Patří mezi přechodné prvky, které mají valenční elektrony v d-sféře. To mu zajišťuje vysokou stabilitu, což je příčinou jeho omezené schopnosti vystupovat ve větším počtu oxidačních stavů. Má velkou afinitu k síře, což se projevuje vznikem sulfidu a černáním stříbrných předmětů a malou afinitou ke kyslíku, proto jsou jeho oxidy málo stálé. Z fyzikálního pohledu se čisté stříbro se vyznačuje nejvyšší tepelnou a elektrickou vodivostí ze všech kovů a zároveň nízkou kontaktní rezistencí. Díky těmto vlastnostem a vysoké poddajnosti a kujnosti je používáno v celé řadě aplikací. (Greenwood N.N., 1993)

Do životního prostředí se stříbro vstupuje především díky průmyslové těžbě, metalurgii, v menší míře díky umělému vyvolávání srážek (krystalky jodidu stříbrného vytváří kondenzační jádra v oblacích), fotografickému a elektrotechnickému průmyslu (Purcell a Peters, 1998)(Obr. 7). Tyto zdroje představují zdroj kontaminace ekosystémů (Gorsuch a Klaine, 1998, Hirsch, 1998).

zdravotnictví přirozené emise 2% 9% chemický průmysl fotografický 5% průmysl 36% výroba šperků 19%

eletrotechnický průmysl 29%

Obr 7: Schéma procentuálního zastoupení hlavních zdrojů stříbra. Zdroj: Ministerstvo životního prostředí, Integrovaný registr znečišťování a UNEP

3.2.3.3 Využití

Čisté stříbro je využíváno ve šperkařství, v optickém průmyslu kde se využívá díky své vysoké odrazivosti k výrobě kvalitních zrcadel, či při výrobě CD a DVD nosičů. Jako součást různých slitin louží v elektrotechnice, v lékařství a některé jeho sloučeniny jsou díky fotosenzitivním vlastnostem nezbytné pro fotografický průmysl. Nověji se ukazuje, že stříbrné částice mohou nacházet uplatnění i v nanotechnologických postupech a aplikacích. (Greenwood N.N., 1993)

3.2.3.4 Toxicita

Toxicita těžkých kovů a jejich jednotlivých sloučenin je závislá na rozpustnosti ve vodě. Stříbro v iontové formě je jedním z nejtoxičtějších těžkých kovů. Na rozdíl od rtuti převážná většina stříbrných iontů v životním prostředí rychle přechází do nerozpustných sloučenin, především sulfidů a chloridů, a proto stříbrné ionty nepatří k nejzávažnějším toxickým látkám z řad těžkých kovů (Koontz a Berle, 1980, Wood, a kol., 1999). Akutní toxicita jednotlivých sloučenin stříbra se tedy výrazně liší v závislosti na jejich rozpustnosti ve vodě a v závislosti na pH okolního prostředí (WHO).

Nebezpečnost sloučenin stříbra (zejména stříbrných iontů) spočívá v jejich schopnosti vazby na proteiny, která se uskutečňuje především pomocí thiolových skupin cysteinových zbytků. Dále bylo zjištěno, že v přítomnosti potenciálního zdroje volných radikálů dochází k oxidativnímu poškození DNA s následnými zlomy (Hossain a Huq, 2002), možná je i vazba stříbrných iontů na polysacharidy buněčné stěny (Hall, 2002). 28

3.2.3.5 Příjem a transport stříbra v rostlině

Většina stříbra je v rostlinách deponována v kořenech (Koontz a Berle, 1980). V nadzemních částech rostliny je stříbro transportováno a akumulováno převážně ve mladších listech v případě jednoděložných rostlin, v případě dvouděložných rostlin je rozdílná distribuce stříbra v nadzemních částech méně zjevná, nicméně zůstává podobná (Koontz a Berle, 1980). Některé rostlinné druhy jsou schopny akumulovat vysoké koncentrace stříbra (Tab. 3). Do roku 2008 nebyl však známý žádný rostlinný druh, který by byl schopen hyperakumulace stříbra (Borovicka, a kol., 2007, Harris a Bali, 2008).

Tab. 3: Přehled rostlin vyžívajících se pro sledování kumulace a vlivu stříbra (Krizkova, a kol., 2009)

Maximální Rostlinný druh koncentrace Reference (µmol·l-1)

(Gubbins, a kol., 2011, Naumann, a kol., 2007, Lemna minor L. 1.5 Topp, a kol., 2011)

(Fjallborg, a kol., 2006, Kanchana, a kol., 2011, Lactuca sativa L. 37 Ratte, 1999, Zhang a Hasenstein, 1999)

Lolium perenne L. 1.8 (Jo, a kol., 2009, Ratte, 1999, Ward, a kol., 1979)

Zea mays L. 1.8 (Krizkova, a kol., 2009, Motte, a kol., 1988, WHO)

Lycopersicon esculentum L. 920 (Chen, a kol., 1997, WHO)

Phaseolus radiatus L. 920 (Lee, a kol., 2012, WHO)

Avena sativa L. 1 (Hirsch, 1998)

Brassica rapa L. 1 (Hirsch, 1998)

Glycine max L. 1 (Hirsch, 1998)

Spinacia oleracea L. 1 (Hirsch, 1998)

Brassica rapa subsp. campestris 1 (Hirsch, 1998)

Brassica juncea L. 1 (Harris a Bali, 2008)

Amanita strobiliformis (Paulet ex 0.01 (Borovicka, a kol., 2007) Vittad.)

Medicago sativa L. 0.01 (Harris a Bali, 2008)

Cinnamomum camphora (L.) J. 0.01 (Huang, a kol., 2007) Presl

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 0.01 (Navabpour, a kol., 2003)

3.2.3.6 Vliv stříbra na rostliny

Byla publikována řada prací zabývající se ekotoxikologickými studiemi vlivu stříbra na různé modelové organismy (vodní rostliny, bezobratlí a ryby) (Call, a kol., 1999, Campbell, a kol., 2002, Ratte, 1999). Z těchto studií je zřejmé, že je stříbro ve své rozpustné formě schopno ovlivňovat celou řadu procesů, a to ve všech organismech.

Bylo zjištěno, že suchozemské rostliny jsou nejcitlivější na působení stříbra ve stadiu klíčení, kde byl negativní efekt pozorován již při koncentraci stříbrných iontů 750 – 7500 µg·l-1 (Ratte, 1999), a letální efekt u vzrostlých rostlin byl pozorován již od koncentrace 10 000 µg·l-1 (Hirsch, 1998, WHO).

Z biochemického hlediska expozice rostlinného organismu iontům stříbra má za následek vznik volných ROS a indukci tvorby fytochelatinů (Figueroa, a kol., 2008, Grill, a kol., 1985, Howe a Merchant, 1992, Le Faucheur, a kol., 2006, Maitani, a kol., 1996, Murphy a Taiz, 1995, Perrein-Ettajani, a kol., 1999), aktivují se fytochelatinsyntházy (Chen, a kol., 1997, Maier, a kol., 2003) přičemž ve studiích bylo prokázáno, že Ag+ je po Cd2+ druhý nejúčinnější aktivátor těchto enzymů (Grill, a kol., 1985). Autory Navabpour et al. (Navabpour, a kol., 2003) byla potvrzena indukce exprese metalothioneinu podobných proteinů.

U enzymů rostlin byla inhibice stříbrnými ionty zjištěna u téměř 70 z nich, převážně hydroláz, oxidoreduktáz a transferáz (citace). Stříbrné ionty jsou také schopny inhibovat působení ethylenu (Serek, a kol., 2006), a proto jsou rutinně užívány pro studium jeho role v rostlinném organismu a to jak u celistvých rostlin, tak i u explantátových kultur (Veen, 1983). Ve velmi malých množstvích (5 nmol·l-1) inhibují stříbrné ionty aktivitu plastidové lyso-PC acyltransferázy, která hraje významnou roli v procesu biosyntézy plastidových membránových lipidů (Akermoun, a kol., 2002).

3.3 Obrana rostliny

Obranyschopnost rostlin je klíčová pro jejich existenci v prostředí, kde je ohrožují biotické a abiotické stresové faktory (Farmer a Davoine, 2007). Během vývoje se rostliny vybavily velkým množstvím obranných drah, při kterých vznikají a zpětně se regenerují sloučeniny, které umožňují rostlinám aktivně ovlivňovat jak stresové faktory, tak i následky vzniklé jejich působením (Ernst, 1996).

Makrobiogenní sloučenina síra dokáže díky svým fyzikálně chemickým vlastnostem tvořit organické sloučeniny, které mají mimo jiné i značné detoxikační schopnosti (Jacob, a kol., 2003). Jedná se o síru obsahující obranné sloučeniny (SDCs), mezi které se řadí thioly a jejich deriváty, jednoduché těkavé sloučeniny síry patřící do skupiny fytoalexinů a sekundární metabolity glukosinoláty. Nesmí opomenout proteinogenní aminokyselinu methionin, který se účastní reakcí syntézy S-adenosyl- methioninu (SAM), jednoho z nejvýznamnějších metylačních činidel v organismech (Ibar a Orellana, 2007).

Nejpočetnější skupina thiolů je charakteristická především přítomností sulfhydrylové skupiny (-SH) ve své struktuře. Tato skupina propůjčuje thiolům schopnost zhášet reaktivní formy kyslíku (ROS), které vznikají při metabolizaci kyslíku (Baker a Orlandi, 1995, Moran, a kol., 2001), nebo jsou generovány jako odpověď na přítomnost toxických látek, které narušují celkový metabolismus rostlin (těžké kovy, halogenované uhlovodíky, atd.) (Maksymiec, 2007). Rostlinné thioly fytochelatiny, oligomery glutathionu, dokáží navíc efektivně detoxikovat přímo toxické kovy v rostlinách.

3.4 Metabolismus síry

Sloučeniny síry se vyskytují napříč živočišnou a rostlinnou říší a jsou nezbytné pro život všech organismů. Síra se nachází ve dvou důležitých aminokyselinách cysteinu (Cys) a methioninu (Met), které se účastní jak primárního, tak i sekundárního metabolismu. Cystein jako první uhlovodíková sloučenina asimilační dráhy síry slouží jako donor síry pro Met, glutathion (GSH), vitaminy (biotin, thiamin), kofaktory (železo-vázající sirné klastry, hem), sulfátové estery (koenzym A), na síru bohaté

proteiny a sirné sloučeniny hrající roli ve vývoji a v růstu rostlinných buněk (Droux, 2004, Tanaka a Tanaka, 2007)(Obr. 8).

Obr. 8: Síra je z prostředí transportována ve formě síranových solí, pomocí vysoce afinitních transportérů (1). Sírany jsou převážně transportovány do nadzemních částí. Díky energetické náročnosti probíhá následný proces v listech, přičemž dojde k aktivaci ATP za katalýzy enzymu ATP sulfurylázy (2). Vzniklý produkt APS (adenosin 5´-fosfosulfát) je redukován APS reduktázou (3). V tomto kroku vystupuje redukovaný glutathion jako donor elektronů. Alternativně může být APS aktivován enzymem APS kinázou (4) a je přeměněn na PAPS (3´-fosfoadenylylsulfát). Ten je využit pro syntézu dalších sloučenin síry. Síra ve formě siřičitanového anionu je redukována sulfit reduktázou (6) na H2S, který se sloučí s O- acetylserinem, vznikajícím v reakci (7), za vzniku aminokyseliny cysteinu. Reakce probíhá za katalýzy O-acetyl(thiol)lyázy (8). Cystein jako primární produkt asimilace síry je zakomponován především v proteinech bohatých na síru (SRPs) a v glutathionu (GSH). Dále je donorem redukované síry pro biosyntézu glukosinolátů a pro syntézu fytoalexinů kamalexinu a brasininu. Nakonec může být H2S uvolněn z Cys pomocí desulfurhydrázy (9). Elementární

0 2- síra (S ) může být uvolňována z GSH, ale mechanizmus dosud nebyl popsán. Přebytek SO3 je 2- enzymem sulfid oxidázou oxidován na SO4 . Jako akceptor elektronů je použit O2 a reakcí vzniká H2O2, který může způsobit obrannou reakci (5). Asimilace síry [reakce (2), (3), (6), (8)] je lokalizována v plastidech, zatímco vytváření H2S je situováno v plastidech, mitochondriích a cytosolu. Výskyt sulfid oxidázy je spojován s peroxizomy (Hansch a Mendel, 2005) (schéma upraveno podle (Droux, 2004, Rausch a Wachter, 2005)).

3.4.1 Sirné sloučeniny v rostlinách

3.4.1.1 Obsah thiolových sloučenin

Mezi důležité zástupce stresových proteinů patří thiolové sloučeniny. Jedná se o organické sloučeniny síry odvozené od alkoholů záměnou jednoho kyslíku v -OH skupině za síru. Významnými zástupci biologicky aktivních thiolových sloučenin jsou cystein, glutathion, fytochelatin a metalothionein, u rostlin metallothioninu podobné proteiny. Díky -SH skupině mohou thiolové sloučeniny tvořit disulfidické můstky, které stabilizují sekundární strukturu bílkovin. Jednou z dalších biologických funkcí je jejich podíl na detoxikačních mechanismech organismu. Celkový obsah thiolových sloučenin v živých organismech je tudíž závislý na přítomnosti toxických látek a stávají se tak důležitým biomarkerem toxicity. (Ernst, a kol., 2008, Petrlova, a kol., 2006)

3.4.1.1.1 Sulfan

Zda sulfan (sirovodík) (H2S) patří do skupiny síru obsahující obranných sloučenin (SDCs), je stále nejasné. Původně bylo předpokládáno jeho uvolnění z Cys pomocí reverzibilní O-acetylserin(thiol)lyázy, ale v nedávné době bylo identifikováno a funkčně charakterizováno několik specifických desulfuryláz (Riemenschneider, a kol., 2005). Role jednotlivých enzymů není dosud známa, ale exprese a aktivita L-cystein desulfurylázy je indukována okamžitě po útoku patogenního organismu (Bloem, a kol.,

2007), což naznačuje roli H2S při rostlinné obraně. Uvnitř buňky je H2S v rovnováze s (HS-) (Bloem, a kol., 2007).

3.4.1.1.2 Na síru bohaté proteiny

Do skupiny na síru bohatých proteinů (SRPs) se řadí defensiny a thioniny. Defensiny a thioniny jsou na cystein bohaté proteiny (několik desítek zbytků), u nichž cystein pomáhá stabilizovat strukturu pomocí disulfydických můstků (Bohlmann a Apel, 1991, Garcia-Olmedo, a kol., 1998, Thomma, a kol., 2002). Některé isoformy jsou součástí obranného systému rostlin, ale jiné jsou indukovány jako odpověď na patogenní útok (Hilpert, a kol., 2001, Nibbe, a kol., 2002). V in vivo biologických experimentech bylo prokázáno, že tyto proteiny jsou toxické pro široké spektrum hub, některým skupinám Gram-pozitivních bakterií, řasám, hmyzu a hlístům (Bohlmann a Apel, 1991). Zvýšená exprese SRPs v transgenních rostlinách může mít za následek rezistenci k patogenním plísním, což zdůrazňuje funkci jejich v rostlinné obraně (Gao, a kol., 2008, Peschen, a kol., 2004).

3.4.1.1.3 Glukosinoláty

Patří mezi síru obsahující sekundární metabolity. Jedná se o sekundární metabolity charakteristické pro poměrně úzkou skupinu rostlinných druhů řazených do řádu Brassicales (např. Brassicaceae, Tropaeolaceae, Resedaceae). Jsou to deriváty aminokyselin a obsahují dva atomy síry, přičemž jeden získávají z cysteinu a další z PAPS (Wittstock a Halkier, 2002), nebo z Met (Textor, a kol., 2004). Kombinace glukosinolatů a enzymu štěpícího thioglykosidickou vazbu, thioglukosidázy, funguje jako dvojitá obrana rostlin. Při jejich kontaktu jsou glukosinoláty přeměněny na několik nestálých hydrolytických produktů, zahrnujících nitrily, kyanáty, isokianáty a epithionitrily dle typu glukosinolátu a pH prostředí (Lambrix, a kol., 2001). Diskutován je antimikrobiální potenciál těchto látek. Některé práce udávají, že tyto sloučeniny potlačují také mikrobiální růst (Manici, a kol., 1997, Smith a Kirkegaard, 2002, Smolinska, a kol., 2003). Na druhou stranu existují studie, které neprokázaly souvislost glukosinolátů a antimikrobiálního účinku (Sexton, a kol., 1999, Tierens, a kol., 2001).

3.4.1.1.4 Glutathion

Glutathion je jedna z nejvýznamnějších thiolových sloučenin vyskytujících se jak v rostlinné, tak i v živočišné říši. První zmínka o glutathionu je z roku 1888, kdy byla prokázána jeho přítomnost v kvasinkách. Jeho struktura byla popsána až v roce 1935 (Meister a Anderson, 1983).

Vyskytuje se ve všech živých organismech, od kvasinek po člověka. Redukovaný glutathion (GSH) je redoxní pufr chránící cytosol a ostatní části buněk před reaktivními kyslíkovými radikály (ROS), které jsou indukovány v souvislosti s biotický a abiotickým stresem. V organismech se vyskytuje ve dvou formách, a to jako redukovaný glutathion (GSH) (Obr. 9 A, B) a oxidovaný glutathion (GSSG) (Obr. 9 C, D). Obě formy glutathionu jsou ve vzájemném poměru, jehož narušení může indikovat stres vyvolaný různými stresovými faktory (Anderson, 1998, Asensi, a kol., 1999) (Karabal, a kol., 2003) (Goupil, a kol., 2009).

GSSG vzniká vytvořením disulfidického můstku mezi dvěma molekulami GSH, kdy dva vzniklé atomy H+ se zapojí do glutathion-askorbátového cyklu, který se podílí na eliminaci ROS. Zpětná regenerace molekuly GSSG probíhá za katalýzy glutathion reduktázou a oxidace NADPH (Ogawa, 2005, Paradiso, a kol., 2008). Koncentrace glutathionu v rostlinných pletivech se pohybuje v rozmezí 0.1-10.0 mmol·l-1 (Meister a Anderson, 1983).

Ve „vyšších“ rostlinách glutathion plní několik důležitých funkcí, jako je udržování redoxní rovnováhy buňky (Dalle-Donne, a kol., 2007, Mohanpuria, a kol., 2007) a detoxikace těžkých kovů a xenobiotik (Semane, a kol., 2007) (Rausch, a kol., 2007, Schroder, a kol., 2007). V návaznosti na tyto funkce je využíván jako signální molekula v buňce. Redoxní potenciál GSH/GSSG páru není pouze ovlivněn poměrem GSH/GSSG, ale také i změnami v GSH syntéze nebo degradaci (Blum, a kol., 2007) (Schroder, a kol., 2009).

GSH GSSG

OH HO O O NH2

H2N HO O O NH O NH HN O S S O HN

O SH HN NH O O OH

O H2N HO O HO A B CD

Obr. 9: Struktura redukovaného (GSH) glutathionu (A, B) a oxidovaného (GSSG) glutathionu (C, D).

3.4.1.1.5 Fytochelatiny

Fytochelatiny (PC) jsou posttranslačně syntetizované polythioly hrající důležitou roli v detoxikaci těžkých kovů. Jejich přítomnost byla dokázána jak v organismech vystavených působení těžkých kovů, tak v organismech vyskytujících se daleko od kontaminovaných míst. (Clemens a Persoh, 2009). Poprvé byly popsány v kvasince Schizosaccharomyces pombe Linder (Kondo, a kol., 1984) a dále pak v rostlinách Acer pseudoplatanus L. a Silene cucubalus Wib. (Grill, a kol., 1985) a řase Chlamydomonas reinhardtii Dangeard (Hanikenne, 2003, Howe a Merchant, 1992). Všechny fytochelatiny se skládají z dipeptidické repetice γ-Glu-Cys, která se opakuje 2-11krát (nejčastěji ale 2-5krát) (Obr. 10) a je zakončena jednou molekulou aminokyseliny Gly (Grill, a kol., 1985, Rauser, 1990). Existují i strukturní analogy přítomné pouze v určitých organismech, které mají místo Gly jinou aminokyselinou (Ala, Ser a Glu) (Cobbett, 2000), nebo nejsou terminovány třetí aminokyselinou vůbec. Takové látky se označují desglycin fytochelatiny (Des-Gly-PC) (Zenk, 1996). PCs jsou neribozomálně enzymaticky syntetizovány z GSH pomocí fytochelatin syntetázy (PCS) (Clemens, 2006). Biosyntéza a role PCs v detoxikaci težkých kovů byla nejlépe prostudována u rostliny Arabidopsis thaliana exponované Cd2+ iontům (Hirata, a kol., 2005).

SH O H N COOH H HN N H COOH O n+1n PCn

Obr. 10: Obecný vzorec PCs, kde n = 2-11x

Ukládání těžkých kovů ve vakuolách bývá zprostředkováno buď pomocí Cd/H+ antiporterů, nebo ATP-dependentními ABC transportéry, které jsou uloženy v tonoplastu (Rea, a kol., 1998, Salt, a kol., 1995, Salt a Wagner, 1993). Nasyntetizované PCs vytvářejí s přítomnými ionty kovů komplex M-PC (M = iont kovu). Stabilizace tohoto komplexu ve vakuole probíhá přes méně stabilní kyseliny obsahující hydrogen sulfidový anion za vzniku nízkomolekulárního komplexu LMW- M-PC. Ve vakuole se z jednotlivých LMW komplexů tvoří vysokomolekulární HMW komplexy za spotřeby energie ve formě ATP. Vzniklý HMW komplex díky své velikosti pravděpodobně není schopen překonat tonoplast vakuoly a zůstává zde uložen. (Hall, 2002, Supalkova, a kol., 2007). Schéma je ukázáno na Obr. 11.

Jak velký je podíl fytochelatinů na množství naakumulovaného kovu nebylo dosud zcela objasněno. Existují indicie, že některé rostliny jsou schopné hyperakumulovat těžké kovy i při potlačených mechanismech pro syntézu PCs. Příkladem jsou Thlaspi caerulescens J. et C. Presl a Arabidopsis halleri (L.) O'Kane & Al-Shehbaz, které vykazují přirozený potenciál hypertolerance k Cd2 +, která zřejmě není závislá na tvorbě fytochelatinů. (Clemens a Persoh, 2009, Verbruggen, a kol., 2009).

BUNĚČNÁ VAKUOLA STĚNA

-Glu-Cys peptid

S2- LMW Cd-complex CYTOSOL (4) Cd2+ HMW Cd,S-complex (1) Cd2+ 2+ PC Cd H+ H+

degradace

H+ Cd2+

H+ (3) LMW Cd-complex

(2) Cd2+ GS2-M

Obr. 11: Schématické znázornění detoxikačního mechanismu iontů těžkého kovu v rostlinné buňce. Ionty jsou do buňky přenášeny pomocí membránových transportérů typu ZIP, IRT, navíc je možné, že se transportu účastní i vápníkové kanály (1). V cytosolu jsou ionty kovů chelatovány; možným ligandem (jedním z možných) je GSH, kdy vzniká komplex GS2-M (bisglutathionato – M komplex). GS2-M aktivuje enzym fytochelatin syntetázu (PCS) a zahajuje se tak syntéza fytochelatinů (PC) (2), které tvoří s kovem LMW komplexy. Ty jsou za spotřeby energie získané z ATP přeneseny pomocí ABC transportéru transportovány (3) do vakuoly. Ve vakuole dochází ke spojování jednotlivých LMW komplexů inkorporací s redukovanou sírou (S2-) (4) do většího celku nazývaného vysokomolekulární komplex (HMW). Je pravděpodobné, že se kov dostává z vakuoly zpět do cytosolu, ale tento mechanismus nebyl dosud objasněn (upraveno podle (Clemens, 2006)).

3.5 Stresové proteiny

Pod vlivem kteréhokoliv ze stresových faktorů dochází často již během několika desítek minut k velmi dramatickým změnám v kvalitativním a kvantitativním zastoupení proteinů v buňkách. Tvorba některých proteinů prudce stoupá, u jiných se naopak zastavuje. V hojné míře se však také syntetizují proteiny, které se za normálních okolnosti vůbec nedají v buňkách detekovat (Gloser, a kol., 1998). Z několika desítek proteinů, jejichž syntéza se působením určitého stresoru prudce zvyšuje (stresové proteiny), se jen malá část z nich pravidelně vyskytuje i u jiných typů stresů, resp.

stresových faktorů. Indukce zbývající části stresových proteinů je specificky vázána na určitý stresový faktor (Gloser, a kol., 1998). Nově tvořené stresové proteiny mají velmi rozmanitou velikost i funkci. Je velmi snadné rozdělit je pomocí běžných detekčních metod (dvojrozměrné gelové elektroforézy) do skupin podle hmotnosti. Mnohem obtížnější je určit jejich funkci. Většina z proteinů, jejichž tvorba je indukována nespecificky, tedy různými typy stresu, patří do některé z těchto tří funkčních skupin:

1. molekulární chaperony – speciální proteiny, které v buňce pomáhají skládat právě vytvořené proteiny (které po translaci opouštějí velkou podjednotku ribozomu). Kontrolují a zabezpečují správnou prostorovou strukturu proteinů a brání vzniku nesprávných vazeb (HSP proteiny) (Lindquist a Craig, 1988).

2. proteázy – enzymy produkované buňkami, které štěpí proteiny. Hydrolyzují peptidické vazby aminokyselin, pomocí kterých aminokyseliny drží v peptidickém řetězci.

3. ubikvitin – protein sloužící k označení molekul proteinů, u kterých došlo k velkým nenapravitelným změnám v konformaci (protein je pak degradován ubikvitin- proteázovým systémem).

Jejich intenzivní tvorba souvisí s nárůstem počtu poškozených proteinů v různých buněčných strukturách (Gloser, a kol., 1998).

3.5.1 Aminotransferázy

Aminotransferázy (EC 2.6.1.1) se nacházejí u všech rostlin v různých částech buněk. Jejich aktivita zahrnuje především: redistribuci N, syntézu vybraných aminokyselin, fotorespiraci, syntézu sekundárních metabolitů a udržování hladin aminokyselin. Aminotransferázy nepodléhají výraznější metabolické kontrole. Jejich aktivita je převážně kontrolována koncentrací substrátu a produktu. V některých specializovaných případech je patrná regulace vyššího stupně (C4 rostliny regulují koncentraci aspartát aminotransferáza a alanin aminotransferáza pomocí malátu (Hatch a Mau, 1973)).

L-alanin(2-oxoglutarát) aminotransferáza (ALT) (EC 2.6.1.2) a L-aspartát(2- oxoglutarát) aminotransferáza (AST) (EC 2.6.1.1) jsou intracelulární enzymy, které katalyzují přenos aminoskupin z aminokyselin na 2-oxokyseliny. Tento vratný proces umožňuje v organismu deaminaci aminokyselin a naopak jejich biosyntézu z uhlíkatých prekurzorů. Podílejí se na vzájemných transformacích aminokyselin, např. při syntéze aminokyselin z oxokyselin citrátového cyklu nebo oxokyselin vznikajících při fotosyntéze. (Gyamfi, a kol., 1999)

Koenzymem aminotransferáz je pyridoxal-5-fosfát, který je u rostlinných aminotransferáz obvykle vázán pevněji než u aminotransferáz živočišného původu. Změny v dislokaci koenzymu mohou být u rostlin znakem metabolických a genetických odchylek. Při stanovení aktivity aminotransferáz záleží na čistotě enzymového preparátu a důležitá je také volba vhodného postupu purifikace. (Hatch a Mau, 1973)

3.5.2 Ureáza

Rostliny obsahují velké množství enzymů, kterým je věnována značná pozornost, a jedním z nich je ureáza. Poprvé byla izolována z Cannavalia enzyformis (L.) DC. (Fabacae) v roce 1926 a své jméno získala podle své funkce, tedy enzymu, který je schopen štěpit močovinu na amoniak a oxid uhličitý (Sumner, 1926).

Později se podařilo prokázat, že enzym ureáza (EC 3.5.1.5, močovina amidohydroláza) je obecně rozšířeným enzymem u rostlin, a je také přítomna u řady eukaryotických mikroorganismů a baktérií (Mobley a Hausinger, 1989, Witte, a kol., 2005, Witte, a kol., 2005, Witte, a kol., 2002). U vyšších živočichů nebyla dosud přítomnost ureázy prokázána. Nejvyšší aktivita ureázy byla pozorována v zárodečných rostlinných pletivech, a to především v semenech řady druhů z čeledí Fabaceae a Curcubitaceae (de Melo, a kol., 2007, Kojima, a kol., 2006, Koller, a kol., 2000, Polacco a Winkler, 1984, Thoren, 2007, Varel, a kol., 2007, Yang, a kol., 2006). U vyvíjejících se embryí byl popsán vysoce aktivní izoenzym ureázy. Bylo zjištěno, že enzym vykazuje absolutní substrátovou specifitu, což znamená, že hydrolyzuje pouze močovinu a nereaguje s žádnou jinou strukturně podobnou sloučeninou (Dixon, a kol., 1975). Většina metod pro stanovení ureázy je založena na studiu její enzymové aktivity, tedy rozkladu substrátu (močoviny) (Tripathi, a kol., 2004).

3.6 Antioxidační aktivita

Antioxidační aktivita je definována jako schopnost sloučeniny (směsi látek) inhibovat oxidační degradaci jiných sloučenin (Sochor, a kol., 2010). Je ukazatelem míry stresové reakce probíhající v organismu, při kterých vznikají volné radikály. Volnými radikály rozumíme reaktivní atomy nebo molekuly, v jejichž elektronovém obalu se nachází obvykle jeden, případně i více volných elektronů (Sochor, a kol., 2010). Reakce vyvolaná těmito radikály způsobuje změny ve struktuře buněk (reakce s biomolekulami), dochází k poškození rostlinných pletiv, orgánů a důležitých funkcí v organismu. Narušují správnou tvorbu biologicky významných sloučenin, jako jsou lipidy, nukleové kyseliny a bílkoviny, způsobují u nich změnu struktury a tím modifikují jejich funkci. (Fidler a Kolářová, 2009).

3.6.1 Stanovení intenzity stresové reakce

Intenzitu stresu stanovujeme pomocí antioxidantů, které chrání organismy před negativními účinky volných radikálů. Antioxidanty jsou molekuly, které mohou zabraňovat nebo omezovat oxidační poškození látek (Fidler a Kolářová, 2009). Tyto obranné mechanismy jsou především enzymatické (superoxiddismutáza (EC 1.15.1.1), glutation peroxidáza (EC 1.11.1.9), kataláza (EC 1.11.1.6)), ale také neenzymatické povahy (α – tokoferol, kyselina L-askorbová, glutathion, koenzym Q10, flavonoidy, albumin, atd.). Princip tohoto obranného mechanismu spočívá ve schopnosti jmenovaných sloučenin poskytnout volný radikál, který se sloučí za vzniku neutrální molekuly s reaktivním radikálem (Shao, a kol., 2008).

Antioxidační aktivita může být měřena chemickými nebo fyzikálními metodami. Chemické metody jsou založeny na použití činidel, která při chemické reakci s volnými kyslíkovými radikály tvoří různě barevné produkty, jejichž vzniku brání ve vzorku obsažené antioxidanty. Intenzita zbarvení vzorku se měří z pravidla spektrofotometricky (Sochor, a kol., 2010). V posledních letech vznikla celá řada metod umožňujících měření antioxidační aktivity. Tyto metody jsou principiálně odlišné a postupně dochází k vývoji jejich modifikací.

Obecně lze chemické metody pro stanovení antioxidační aktivity rozdělit do dvou základních skupin. První z nich je založena na eliminaci generovaného volného radikálu

(ABTS, DPPH) a druhá je založena na hodnocení redoxních vlastností látek (FRAP, Free Radical).

Metody založené na eliminaci volného radikálu:

3.6.1.1 Metoda ABTS

Metoda ABTS bývá označována také jako metoda TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity). Jedná se o jednu ze základních a nejčastěji užívaných metod pro stanovení antioxidační aktivity. Tato metoda využívá zhášení radikálového kationu ABTS·+ (2,2´-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonát)) (reakce 3). (Sochor, a kol., 2010)

3+ 4+ HX-Fe + H2O2 → X-[Fe =O] + H2O

ABTS· + X-[Fe4+=O] → ABTS·+ + HX-Fe3+

Reakce 3: princip průběhu zhášení ABTS·

Reakce probíhající při měření touto metodou jsou sledovány spektrofotometricky na základě změny absorpčního spektra (nejčastěji se měří absorbance při 734 nm). (Sochor, a kol., 2010, Stratil, a kol., 2006)

3.6.1.2 Metoda DPPH

Tato metoda je určena především pro posuzování antiradikálové aktivity čistých látek i různých směsných vzorků – biologických matric. Je založena na reakci testované látky se stabilním radikálem 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu. (Sochor, a kol., 2010, Stratil, a kol., 2006) Využívá podobně jako je tomu u metody ABTS zhášecí schopnosti radikálu DPPH, což je stabilní volný radikál, který může být díky své struktuře akceptorem atomu vodíku a přejít do formy stabilní diamagnetické molekuly. Z důvodu redukce radikálu dochází tedy ke vzniku DPPH-H (difenylpikrylhydrazin). (Sochor, a kol., 2010) Při tomto testu se po redukci antioxidantem (AH) nebo radikálem (R·) roztok odbarví. Míru tohoto odbarvení lze stanovit spektrofotometricky při vlnové délce 515 nm (Parejo, a kol., 2000)(reakce 4)

DPPH· + AH → DPPH· -H + A.

DPPH· + R· → DPPH· –R

Reakce 4: Rovnice redukce radikálu DPPH·

Metody založené na hodnocení redoxních vlastností látek:

3.6.1.3 Metoda FRAP

Metoda FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) spočívá v redukci téměř bezbarvých, případně lehce nahnědlých železitých komplexů TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S- triazin) s chloridem železitým (FeCl3), které se účinkem redukce barví do modra za vzniku železnatého komplexu. (Sochor, a kol., 2010) Tyto komplexy jsou spektrofotometricky měřitelné při vlnové délce 593 nm. (Stratil, a kol., 2006)

Nevýhodou metody FRAP jsou její omezení spočívající v měření při nefyziologicky nízkých hodnotách pH (3.6) a v neschopnosti zachycení polyfenolických látek a thiolů, které s komplexem pomalu reagují. (Sochor, a kol., 2010, Stratil, a kol., 2006)

3.6.1.4 Metoda Free Radical

Stanovování volných radikálů metodou Free Radical spočívá ve schopnosti chlorofylinu, což je sodno-měďnatá sůl chlorofylu, odevzdávat a přijímat elektrony za současné stabilní změny absorpčního maxima. (Sochor, a kol., 2010)

3.7 Fytoremediace

Rostliny jsou schopné metabolizovat a degradovat mnohé látky znečišťující životní prostředí - polutanty. Některé mohou v pletivech (orgánech) akumulovat toxické kovy v takovém množství, že se často hovoří o hyperakumulaci, a o takových rostlinách jako o hyperakumulátorech. Hyperakumulace kovů je vlastnost rostlin, která se vyskytuje u druhů, které často rostou v lokalitách, které jsou na kovy bohaté. Jako ukazatel schopnosti hyperakumulace rostliny se používá tzv. translokační faktor. Jedná se o poměr stanoveného množství kovu v nadzemní části ku množství stanoveného

kovu v kořenové části rostliny. Za hyperakumulátory jsou pak označeny rostliny, které mají tento poměr vyšší jak 1.

Hyperakumulátory jsou obecně minoritní složkou vegetace ve většině evropských a severoamerických oblastí. Baker a Brooks definovali pro některé kovy mezní koncentraci kovu v nadzemních částech rostlin, při které rostliny nejeví známky toxicity, (Baker a Brooks, 1989, Broadley, a kol., 2007) a proto je lze považovat za hyperakumulátory daného kovu. Stanoveny byly hodnoty vyšší než 100 mg·kg-1 DW pro kademnaté ionty, 1 000 mg·kg-1 DW pro nikelnaté, měďnaté, kobaltnaté a olovnaté ionty, a 10 000 mg·kg-1 pro ionty zinku a manganu. Ačkoli byly tyto mezní hodnoty stanoveny bez obecné diskuze, jsou přibližně o jeden řád vyšší než ty, které se uvádí pro běžné druhy (Salt a Kramer, 2000).

V současné době je známo více než 400 druhů rostlin s hyperakumulačními schopnostmi, které patří do 45 různých čeledí. Z dvouděložných hyperakumulátorů se nejčastěji studují rostliny z čeledí Brassicaceae, s rody Thlaspi, Alyssum a Brassica (např. Thlaspi caerulescens J. & C. Presl., T. rotundifolium (L.) Gaudin, Brassica juncea (L.) Czern, Cardaminopsis spp., Alyssum spp.) a Fabaceae. Mezi významné jednoděložné hyperakumulátory patří rostliny z čeledi Poaceae, např. Agrostis castellanea Boiss. & Reut., Arrhenatherum elatius (L.) Beauv., Festuca ovina L. (Ernst, a kol., 1992, Prasad a Freitas, 2003).

Výše uvedené rostlinné druhy a mnohé další lze využít pro různé fytoremediační techniky. Tyto techniky lze využít pro „ozdravení“ půdy (vody) buď od organických polutantů (např. pesticidy, průmyslové chemikálie a vedlejší produkty vzniklé při výrobě průmyslových chemikálií), anebo od anorganických polutantů (těžké kovy). Z fytoremediačních technik jsou pro remediaci těžkých kovů nejpoužívanější fytoextrakce, hned za nimi následuje fytostabilizace a rhizofiltrace.

3.7.1 Fytoextrakce

Principem metody je absorpce kovu rostlinnými kořeny a jeho následný transport a zakoncentrování v nadzemních částech. Po určité době, většinou po uplynutí vegetační sezóny u jednoletých rostlin, jsou nadzemní části rostlin sklizeny a zlikvidovány jako

nebezpečný odpad, nebo pokud je to ekonomicky výhodné, jsou zpracovány pro extrakci přijatého kovu. (Lasat, 2002)

Fytoextrakce je možná pouze v případě, je-li kov obsažen v takové části půdního horizontu který je v dosahu kořenů, je-li biodostupný a má-li rostlina genetickou dispozici k jeho příjmu. Kovy obsažené v kontaminovaných půdách lze rozdělit do dvou skupin. Na kovy pro rostliny převážně snadno biodostupné (Cd, Ni, Zn, As, Se, Cu) a na kovy s nízkou biologickou dostupností (Pb, Cr, U, Hg). Podle toho, do které skupiny kontaminující kov patří, se volí i druh fytoextrakce (Adriano, a kol., 2004, Van Nevel, a kol., 2007). Fytoextrakce může být buď kontinuální, nebo chemicky vylepšená. První využívá přirozených hyperakumulačních rostlin se schopností akumulovat mimořádně vysoký obsah kovu v nadzemních částech. Bohužel tento druh fytoextrakce je charakteristický pro kovy, které jsou sice v půdě nahromaděné ve vysoké koncentraci, ale nejsou hlavním znečišťujícím kovy (Ni, Zn, Cu) (Adriano, a kol., 2004). Proto se využívá druhého způsobu fytoextrakce, kdy je do půdy přidáno chelatační činidlo, které zvyšuje mobilitu kovu v půdě, a tak zvyšuje možnost příjmu kovu rostlinou. Toto chelatační činidlo může být vpraveno do půdy buď přirozenou cestou, nebo mechanicky. Přirozenou cestou se rozumí výsadba vhodných rostlinných druhů, které jsou schopny pomocí kořenů do půdy vylučovat např. organické kyseliny (kyselina jablečná, citronová) čímž snižují pH půdního roztoku a umožňují tak uvolnění nasorbovaných iontů kovů z půdních částic. Tento způsob je u rostlin běžný, protože si jím běžně zajišťují mobilizaci kovů nezbytných pro jejich existenci (Zn, Fe, Mn a další) (Lestan, a kol., 2008). Mechanickou cestou je myšleno přidání syntetických organických chelatačních činidel, které mohou, díky koordinačním vazbám s iontem kovu, tvořit komplex a tím zvyšovat jeho mobilitu v půdním prostředí. Jako syntetická chelatační činidla byla již vyzkoušena EDTA, CDTA, DTPA či EGTA (Lestan, a kol., 2008). Nevýhodou těchto činidel je, že některá jsou pro rostliny toxické a nejsou příliš specifická k určitému kovu. Díky těmto nevýhodám tak může docházet k urychlení úhynu rostliny či k zbytečnému uvolnění iontů kovů, které nepatří mezi kontaminující, ale jsou v půdě přítomny v mnohem vyšší koncentraci než kontaminující kov (např. Fe a Ca). Další nevýhodou mechanické cesty je, že i přes snahu kontrolovaného uvolňování kovu z půdních částic dochází k jeho nadměrnému vylučování a tím k nechtěnému znečištění spodních vod (Lestan, a kol., 2008).

I přes zmíněná úskalí, která sebou použití fytoextrakce nese, se jedná o nejúčinnější a k přírodě nejšetrnější techniku pro remediace těžkých kovů. Proto má tato technika, pokud bude používaná uváženě, velký potenciál rozvoje a využití.

3.7.2 Fytostabilizace

Principem metody je mechanická stabilizace půdy na základě imobilizace kontaminantů v půdě a podzemní vodě. Rostliny přispívají k imobilizaci pomocí absorpce a akumulace kořeny, adsorpce na kořeny nebo vysrážením kontaminantu v kořenové zóně. Díky tomu dochází k zabránění transportu kontaminantu a snižuje se tak možné riziko kontaminace okolí zapříčiněné erozí, transportem nebo vymýváním. (Certini, 2005)

Fytostabilizace se využívá zejména pro remediaci půd obsahujících vysoké koncentrace kovových iontů či radionuklidů. V menší míře ji lze použít i v případě znečištění organickými sloučeninami. Využívá se například na místech, kde chybí přirozená vegetace z důvodu vysoké kontaminace kovů. Je známá celá řada rostlinných druhů tolerantních k vysokým koncentracím těžkých kovů v půdě (Baker a Brooks, 1989) a většina těchto rostlin roste v místech těžby a zpracování rud (Mendez a Maier, 2008) (Baker, a kol., 1994). Vzhledem k vysokému stupni resistence vůči vysokým obsahům těžkých kovů v půdě některých druhů trav, jako je např. Festuca ovina L., Festuca rubra L., Agrostis capillaris L. a Agrostis stolonifera L., jsou tyto trávy vhodné pro revegetaci odkrytých kontaminovaných míst (Ernst, 1996).

3.7.3 Rhizofiltrace

Rhizofiltrace je metoda využívající adsorpce nebo vysrážení kontaminantu na kořenech rostliny nebo absorpce kořeny, přičemž kontaminant je přijímán z okolní vody. Proto je tato metoda vhodná zejména pro čištění povrchových i podzemních vod.

Ideální rostliny pro rhizofiltraci by měly mít rozsáhlý kořenový systém a měly by být schopné akumulovat kov především v kořenech. Jako nejúčinnější rostliny pro rhizofiltraci se ukázaly být Helianthus annuus L. a Brassica juncea (L.) Czern., pro svůj bohatý kořenový systém a vysokou rychlost růstu (Vamerali, a kol., 2010). Helianthus

annuus L.efektivně odstraňuje Cd, Cr, Cu, Ni, Pb a Zn z vod, kdežto hořčice absorbuje Pb a U (Hooda, 2007, Meyers, a kol., 2008). Využití nacházejí i vodní rostliny, ale jejich nevýhodou je malý vzrůst. Uplatňuje se Eichhornia crassipes (Mart.) Solms, Lemna minor L., Myriophyllum spicatum L., či vodní kapradina Azolla filiculoides Lam. (Dushenkov, a kol., 1995).

Pro odstranění radioaktivních izotopů (izotopy Cs a Sr) byly v Černobylu s úspěchem použity Helianthus annuus L. a Brassica juncea (L.) Czern..

3.7.4 Kontaminace životního prostředí těžkými kovy a fytoremediace

Mezi nejzávažnější kontaminanty anorganické povahy patří těžké kovy. Těžké kovy lze definovat mnoha způsoby. Nejčastěji se používají dvě definice. První definuje těžké kovy jako chemické prvky, mezi které patří zejména přechodné kovy, některé polokovy, lanthanoidy a aktinoidy. Dle druhé definice mezi těžké kovy patří kovy, jejichž hustota je větší než 5 g·cm-3. Ať už budeme uznávat kteroukoliv z definic, společnou vlastností pro všechny těžké kovy je schopnost ukládat se v živých organismech (rostlinách i živočiších) a vstupovat tak do potravního řetězce, kde se mohou kumulovat až do koncentrací, které jsou pro organismu smrtelné.

Studiem rostlinných druhům schopným odolávat vlivu těžkých kovů (TK) a navíc je i akumulovat se zabývají pracoviště po celém světě (Arthur, a kol., 2005, Callahan, a kol., 2006, Memon a Schroder, 2009, Shah a Nongkynrih, 2007). Výsledky těchto studií přispívají nejen k lepšímu pochopení základních biologických mechanismů probíhajících v živých organismech, ale také při tvorbě nových biotechnologických postupů a zařízení. Rostliny, které jsou schopny těžké kovy akumulovat bez projevů toxicity a zpomalení růstu (naopak za podmínky dostatečné tvorby biomasy), mohou být využity ve fytoremediačních technologiích (Chaney, a kol., 1997, Mazen, 2004, Memon a Schroder, 2009, Shah a Nongkynrih, 2007, Vandecasteele, a kol., 2005). Fytoremediační technologie je efektivní, neinvazivní metoda sloužící k odstranění environmentálního znečištění (Arthur, a kol., 2005).

Existuje mnoho studií zabývajících se vlivem těžkých kovů na rostliny včetně Helianthus annuus L. (Azevedo, a kol., 2005, Jadia a Fulekar, 2008, January, a kol., 2008, Niu, a kol., 2007). Tyto práce se převážně věnují hledání odolného kultivaru

Helianthus annuus L., který bude mít dobré akumulační vlastnosti a bude splňovat všechny podmínky kladené na rostliny využitelné ve fytoremediaci. Při výzkumech se nejčastěji aplikují dva pohledy na to, jak posoudit vhodnost rostliny pro akumulaci těžkého kovu. Za prvé je to základě srovnávání schopnosti různých kultivarů Helianthus annuus L. hromadit ve svých pletivech těžký kov a za druhé je to na základě výběru kultivarů ovlivněných těžkým kovem s nejlepšími morfogenetickými znaky. Díky těmto dvěma směrům bude jednou možné zvolit vhodný genotyp, který může být použitelný pro fytoremediace těžkých kovů, nebo napomohou ke zvolení vhodných rodičů pro vývoj lepších kultivarů (dos Santos, a kol., 2000, Santos, a kol., 2002).

3.7.5 Proč využívat či nevyužívat fytoremediace

Po přečtení této kapitoly nám už zbývá položit si jen otázku, proč bychom se měli zabývat právě fytoremediacemi. Odpovědí je mnoho. Pro většinu lidí je nejpřijatelnější odpověď poukazující na jejich estetický vliv na prostor, v němž žijeme. Jen málo kdo z nás by vyměnil pohled do zeleného parku za pohled na téměř měsíční planinu, na které se bude pohybovat pouze těžká technika těžící kontaminovanou horninu. Pro ekonomy se naskytuje jako snadná odpověď, že se jedná o levnou technologii, která potřebuje jen jednu investici, kterou je čas. A pro ekology je přijatelné, že touto technikou dochází jen v malé míře poškození životního prostředí a že kontaminovaná půda může zůstat na místě a je možné ji využít i na jiné účely.

Jak je vidět, kladů má tato technologie dostatek. Ovšem existují i zápory. Pro lidi je největší z nich riziko vstupu kontaminantu do potravního řetězce. Z vědeckého a procesního hlediska je pak velkou obtíží nalezení „ideální“ rostliny tj. takové rostliny, která má dostatečnou toleranci k danému kontaminantu, umí dobře a snadno transportovat kontaminant z kořenové části do nadzemní a také takové rostliny která tvoří dostatečné množství biomasy v jednom vegetačním období.

3.8 Rostlinný materiál

3.8.1 Helianthus annuus L. (Slunečnice roční)

Jednoletá statná, až 2 m vysoká rostlina, s mohutným kořenem. Lodyha je vzpřímená, pevná, jednoduchá, vyplněná dření, drsně chlupatá. Listy jsou střídavé, řapíkaté, srdčitě vejčité, se 3 páry žilek, špičaté, krátce drsně chlupaté, na okraji pilovité. Lodyhy jsou zakončeny velkými, v průměru až 40 cm širokými, dlouze stopkatými, převislými úbory. Zákrov je střechovitý, dvou- i víceřadý, složený z vejčitých, špičatých, štětinatě brvitých listenů. Lůžko úboru je masité, lysé. Jazykovité květy jsou zlatožluté, sterilní, terčovité jsou oboupohlavné, pravidelné, nahnědlé. Plod je obvejčitá, žlutá až černá pýřitá nažka. Kvete od srpna do října

Jedná se o terofyt, rozšířený v teplejší oblasti Severní Ameriky a Mexika. Jako významná olejnatá rostlina se pěstuje v Evropě a Africe. Plody obsahují 20 – 45 % kvalitního oleje, který je používán zejména v potravinářství a ve farmaceutickém průmyslu. Helianthus annuus L. (Obr. 12) je též významnou medonosnou rostlinou.

Systematické zařazení Helianthus annuus L. dle APG:

Plantae Angiosperms

Eudicots

Core eudicots

Asterids

Euasterids Brunlales Apiales Paracryphiales Dipsacales Asterales Escalloniales Aquifoliales Boraginaceae Solanales Lamiales Gentlanales Garryales Ericales Comales Caryophyllales Santalales Berberidopsidales Dilleniaceae Saxifragales Vitales Geraniales Myrtales Crossosomatales Picramniales Sapindales Huerteales Brassicales Malvales Zygophyllales Malpighiales Oxalidales Celastrales Fabales Rosales Fagales Cucurbitales Gunnerales Trochodendrales Buxales Proteales Sabiaceae Ranunculales Ceratophyllales Acorales Alimatales Petrosaviales Discoreales Pandanales Liliales Asparagales Dasypogonaceae Arecales Poales Zingiberales Commelinales Chloranthales Laurales Magnoliales Canellales Piperales Austrobaileyles Nymphaeales Amborellales

Čeleď: Asteraceae Podčeleď: Asteroideae Nadtribus: Helianthodae Tribus: Helianthae Podtribus: Heliantinae Rod: Helianthus Druh: Helianthus annuus Obr. 12: Helianthus annuus L. (Slunečnice roční)

4 MATERIÁL A METODY

4.1 Chemikálie

Acetonitril a methanol (HPLC čistota) byly získány od firmy Merck (Darmstadt, Německo). Standard PC, jsme získali od firmy Clonestar Brno (Česká republika).

Ureáza EC 3.5.1.5 (Jack Beans, type III; 45 000 IU/g), Cd(NO3)2 a všechny další chemikálie byly zakoupeny u firmy Sigma-Aldrich (USA) v ACS čistotě pokud není uvedeno jinak. Zásobní roztoky standardů (koncentrace 1000 g·ml-1) byly připraveny v ACS vodě (Sigma-Aldrich, USA) a uchovány ve tmě při 4°C. Pracovní roztoky byly ze zásobních roztoků připravovány každý den nové. Všechny roztoky byly před HPLC analýzou filtrovány přes teflonový filtr 0.45 µm (MetaChem, Torrance, CA, USA). Hodnoty pH byly měřeny s použitím WTW inoLab Level 3 (Weilheim, Německo), spojeným s osobním počítačem (Weilheim). pH-elektroda (SenTix-H) byla pravidelně kalibrována souborem WTW pufrů. Voda byla demineralizována pomocí reverzní osmózy na přístrojích Aqua Osmotic 02 (Aqua Osmotic, Tišnov, Česká republika) a dále čištěná pomocí Millipore RG (Millipore Corp., USA, 18 M). Chemikálie potřebné na přípravu kultivačních médií byly zakoupeny od firmy Duchefa, KNO3.

4.2 Rostlinný materiál a jeho příprava

4.2.1 Hydroponické kultury

Nažky Helianthus annuus L. se nechaly nejdříve vyklíčit ve tmě na mokrém filtračním papíře ve speciálních nádobách při teplotě 23 ±2 °C. Po deseti dnech byly sazenice umístěny do hydroponických nádob. Tyto nádoby obsahovaly destilovanou vodu obohacenou o těžký kov o definované koncentraci a byly umístěny v kultivační místnosti o definované teplotě (23.5-25°C), pravidelném světelném režimu light flux 40 µmol·m-2·s-1 (12 hodin den 12 hodin noc) a za konstantní vlhkosti (71-78%). Pro analýzu byly zpracovány vzorky z nadzemních částí a kořene.

Obr. 13: Hydroponické pěstování Helianthus annuus L.

4.2.2 Příprava vzorku

Navážky rostlinného materiálu o hmotnosti přibližně 0,2 g byly homogenizovány v mikrozkumavkách pomocí kapalného dusíku homogenizační vrtačkou (ULTRA- TURRAX T8, IKA, Německo) za stálého chlazení po dobu 1 minuty. Následně byl přidán 1 ml 0.2 mol·l-1 fosfátového pufru, pH 7.2 a pokračovalo se v homogenizaci dalších 5 minut. Získaný homogenát byl následně třepán na třepačce Vortex-2 Genie (Scientific Industries, New York, USA) při teplotě 4 °C po dobu 30 min. Pevný podíl homogenátu byl odstraněn centrifugací pomocí Universal 32 R (Hettich-Zentrifugen GmbH, Tuttlingen, Německo) po dobu 30 min při 14000 g a teplotě 4 °C. Odebraný supernatant byl přefiltrován přes membránový filtr (0.45 µm Nylon filtr disk, Millipore, Billerica, MA, USA) a odebrán do nových mikrozkumavek. Takto připravený kapalný vzorek byl podroben analýze.

4.3 Detekce thiolů pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí

HPLC-ED systém byl složen ze dvou chromatografických pump Model 582 ESA (ESA Inc., Chelmsford, MA, USA), chromatografické kolony s reverzní fází Polaris C18A (150 × 4,6; 3 µm velikost částic, Varian Inc., CA, USA) a osmi-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Detektor byl složen z průtočné analytické komůrky (Model 6210, ESA, USA) obsahující čtyři cely, které byly řazeny sériově. Každá cela obsahovala jednu pracovní uhlíkovou elektrodu, dvě referenční (hydrogenpaládiová) a dvě pomocné elektrody (uhlíková). Chromatografická kolona a elektrochemický detektor byly termostatovány na 30 °C. Vzorek (10 µl) byl injektován automaticky a vzorky byly uchovány v autosampleru při 4 °C. (Krizkova, a kol., 2008)

4.4 Laserem indukovaná ablační spektrometrie

Vzorky listů byly použity v čerstvém stavu, tzn. bez jakékoli předchozí úpravy a byly odebrány ze 14 dnů staré rostliny. Pro tvorbu mikroplazmatu byl použit pulzní Nd:YAG laser (Brilliant B, Quantel, Francie) pracující na druhé harmonické frekvenci (532 nm), délkou pulzu laseru ~ 5 ns, průměrem laserového paprsku 8 mm a opakovací frekvencí 10 Hz. Energie pulzu byla 10 mJ (měřena pomocí termohlavice Coherent FieldMaster ve spojení s LM-P10, USA). K zaostření laserového paprsku na povrch vzorku byla použita křemenná čočka s ohniskovou vzdáleností 30 mm. Vzorky listů uchycené do držáku byly umístěny do ablační komory (TESCAN s.r.o., Česká republika). Ablace byla provedena za atmosférického tlaku na vzduchu. Pohyb vzorku mezi měřeními byl umožněn pomocí translátoru (s přesností 2 µm ve směru x, y, z). Nastavění vzorku do ohniskové vzdálenosti fokusačního objektivu a následující ablační proces byl kontrolován CCD kamerou. Záření mikroplazmatu bylo snímáno objektivem a 3 m optickým kabelem a vedeno na vstupní štěrbinu monochromátoru s optickou délkou 0.32 m (Triax 320, Jobin Yvon, Francie) a třemi mřížkami s 1200 vrypy/mm, 2400 a 3600 vrypy/mm. K měření byla použita mřížka s 2400 vrypy/mm a šířka vstupní štěrbiny byla nastavena na 50 µm. K detekci byl použit ICCD detektor (Horiba, Jobin Yvon, Francie). (Krizkova, a kol., 2008)

4.5 Spektromentrické analýzy za využití automatického analyzátoru BS – 200

Spektrometrické analýzy byly prováděny pomocí automatického biochemického analyzátoru BS-200 (Mindray, Čína). Reagencie a vzorky byly umístěny v reakčním disku, který byl chlazen na 4 °C. Odtud byly roztoky pipetovány do plastových kyvet umístěných v kyvetovém prostoru vyhřívaném na 37 °C, kde probíhala inkubace. Kyvety se vzorkem byly po přidání dalších reagencí pečlivě promíchány. V následujících odstavcích je popsáno nastavení automatického biochemického analyzátoru pro stanovení vybraných enzymů.

4.5.1 Enzymatická aktivita ureázy

Ureáza byla stanovena dle autorů Witte a Medina-Escobar (Witte a Medina-Escobar, 2001) pomocí chemikálií dodaných firmou Sigma-Aldrich (ACS čistota). Nastavení automatického biochemického analyzátoru: k 10 µl reálného vzorku anebo standardu, kterým byl roztok NH4Cl, bylo přidáno 448 µl chlornanového roztoku a 42 µl fenolového roztoku. Vše bylo promícháno a inkubováno 15 min při 37 °C. Po uplynutí 15 min byla změřena absorbance při vlnové délce 630 nm (analyzátor měří rozdíl mezi 630 a 670 nm). (Krizkova, a kol., 2008)

4.5.2 Enzymatická aktivita L-alanin(2-oxoglutarát) aminotransferázy

Nejdříve se manuálně při laboratorní teplotě do mikrozkumavky napipetovalo 250 µl substrátu předehřátého na 37 °C, který se skládá z 0.1 mol·l-1 DL-α-alaninu, 2 mmol·l-1 2-oxoglutarátu v 0.1 mol·l-1 fosfátovém pufru o pH 7.4 a k němu se přidalo 50 µl vzorku. Vzniklá směs se nechala inkubovat při 37 °C 60 minut. Po uplynutí této doby se ke směsi přidalo 250 µl 2,4-dinitrofenylhydrazinu v 1 mol·l-1 kyselině chlorovodíkové. Vše se pečlivě promíchalo a mikrozkumavky vložily do automatického analyzátoru BS-200.

Experimentální parametry BS-200: 30 µl vzorku je napipetováno do kyvety a inkubováno po dobu 20 min při 37 °C. Poté je přidáno 180 µl NaOH a po 10 minutách je měřena absorbance při vlnové délce 510 nm. (Krystofova, a kol., 2009)

4.5.3 Enzymatická aktivita L-aspartát(2-oxoglutarát) aminotransferázy

Nejdříve se manuálně při laboratorní teplotě do mikrozkumavky napipetovalo 250 µl substrátu předehřátého na 37 °C, který se skládá z 0.1 mol·l-1 L-aspartátu, 2 mmol·l-1 2-oxoglutarátu v 0.1 μmol·l-1 fosfátovém pufru o pH 7.4 a k němu se přidalo 50 µl vzorku. Vzniklá směs se nechala inkubovat při 37 °C 60 minut. Po uplynutí této doby se ke směsi přidalo 250 µl 2,4-dinitrofenylhydrazinu v 1 mol·l-1 kyselině chlorovodíkové. Vše se pečlivě promíchalo a mikrozkumavky vložily do automatického analyzátoru. Experimentální parametry BS-200: 30 µl vzorku bylo napipetováno do kyvety a inkubováno po dobu 20 min při 37 °C. Poté bylo přidáno 180 µl NaOH a po 10 minutách byla měřena absorbance při vlnové délce 510 nm. (Krystofova, a kol., 2009)

4.5.4 Stanovení antioxidační aktivity pomocí DPPH• testu

Stanovení spočívá v reakci testované látky se stabilním radikálem difenylpikryhydrazylem – DPPH (1,1-difenyl-2-(2,4,6,-trinitrofenyl)hydrazyl), kdy při reakci dochází k redukci radikálu za vzniku DPPH-H.

Postup měření pro automatický analyzátor: Do plastových kyvet bylo pipetováno 200 µl 9.5·10-5 mol·l-1 roztoku DPPH, následně bylo přidáno 20 µl vzorku či standartu (kyselina gallová, trolox) a vše bylo pečlivě promícháno. Po dobu 25 minut byla zaznamenávána v 15 sekundových intervalech absorbance při vlnové délce λ = 515 nm (Sochor, a kol., 2010).

4.5.5 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody ABTS

Metod je založena na neutralizaci radikálkationtu vzniklého jedno elektronovou oxidací syntetického chromoforu ABTS• (2,2‘-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonátu) na radikál ABTS• – e- ABTS•+.

Postup měření pro automatický analyzátor: Do plastových kyvet bylo pipetováno 245 µl roztoku 7 mmol·l-1 ABTS• s 4.95 m mol·l-1 peroxodisíranem draselným, následně bylo přidáno 5 µl vzorku či standartu (kyselina gallová, trolox) a vše bylo pečlivě

promícháno. Po dobu 25 minut byla zaznamenávána v 15 sekundových intervalech absorbance při vlnové délce λ = 670 nm (Sochor, a kol., 2010).

4.5.6 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody FRAP

Postup měření pro automatický analyzátor: Do plastových kyvet bylo pipetováno 245 µl 10 m mol·l-1 TPTZ rozpustit v 40 m mol·l-1 HCl smíchaného s 20 m mol·l-1

FeCl3·6H2O a acetátovým pufrem pH 3,6 v poměru 1:1:10, následně bylo přidáno 5 µl vzorku či standartu (kyselina gallová). Po dobu 25 minut byla zaznamenávána v 15 sekundových intervalech absorbance při vlnové délce λ = 604 nm (Sochor, a kol., 2010).

4.5.7 Stanovení antioxidační aktivity pomocí metody Free Radicals

Stanovení volných radikálů je založeno na schopnosti chlorofylinu (sodno-měďnatá sůl chlorofylu) přijímat a odevzdávat elektrony za současné stabilní změny absorpčního maxima. Tento efekt je podmíněn alkalickým prostředím a přídavkem katalyzátoru.

Postup měření pro automatický analyzátor: Pro stanovení byl použit komerčně dodávaný kit od firmy Sedium, který obsahoval reakční pufr, koncentrát chlorofylu a katalyzátor. Tyto roztoky byly smíchány v poměru dle pokynů výrobce. Do plastových kyvet bylo pipetováno 200 µl připravené reagencie, následně bylo přidáno 8 µl vzorku či standartu (kyselina gallová, trolox) a vše bylo pečlivě promícháno. Absorbance byla měřena po dobu 10 minut a zaznamenávána v 15 sekundových intervalech při λ = 450 nm. Získané výsledky byly vyhodnoceny pomocí kalibrační křivky (Sochor, a kol., 2010Sochor, a kol., 2010).

4.6 Stanovení svěží hmotnosti

Pro stanovení svěží hmotnosti byly rostliny zváženy na Sartorius R160P vahách (Sartorius GmbH, Goettingen, Německo) ihned po odebrání, omytí a osušení filtračním papírem.

4.7 Fotografická dokumentace

Fotografie rostlin kukuřice byly snímány na začátku experimentu a dále v stanovených intervalech až do konce experimentu pomocí Olympus C-4040 Z00M kamery (Olympus, Japonsko) s Olympus SZH 10 čočkami (zvětšení 0.7). Získané obrázky byly transportovány do osobního počítače a dále zpracovávány.

5 VÝSLEDKY A DISKUZE

Výsledková část předkládané dizertační práce je přiložena ve formě publikací v odborných časopisech a dále doplněna o komentáře autorky. U každé práce je vyznačen i podíl autorky na vytvoření publikace, se kterým souhlasí všichni uvedení spoluautoři.

1. SOCHOR, J.; RYVOLOVA, M.; KRYSTOFOVA, O.; SALAS, P.; HUBALEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; HAVEL, L.; BEKLOVA, M.; ZEHNALEK, J.; PROVAZNIK, I.; KIZEK, R. Fully automated spectrometric protocols for determination of antioxidant activity: Advantages and disadvantages. Molecules, 2010, roč. 15. č. 12, s. 8618-8640. ISSN 1420-3049. IF = 1.988

Podíl autorky Kryštofová O.: 10 % textové části práce a 25% experimentální práce

2. KRYSTOFOVA, O.; TRNKOVA, L.; ADAM, V.; ZEHNALEK, J.; HUBALEK, J.; BABULA, P.; KIZEK, R. Electrochemical microsensors for the detection of cadmium(II) and lead(II) ions in plants. Sensors, 2010, roč. 10. č. 6, s. 5308-5328. ISSN 1424-8220. IF = 1.771

Podíl autorky Kryštofová O.: 30 % textové části práce a 60% experimentální práce

3. KRYSTOFOVA, O.; SHESTIVSKA, V.; GALIOVA, M.; NOVOTNY, K.; KAISER, J.; ZEHNALEK, J.; BABULA, P.; OPATRILOVA, R.; ADAM, V.; KIZEK, R. Sunflower plants as bioindicators of environmental pollution with lead(II) ions. Sensors, 2009, roč. 9. č. 7, s. 5040-5058. ISSN 1424-8220. IF = 1.821

Podíl autorky Kryštofová O.: 30 % textové části práce a 80 % experimentální práce

4. KRIZKOVA, S.; RYANT, P.; KRYSTOFOVA, O.; ADAM, V.; GALIOVA, M.; BEKLOVA, M.; BABULA, P.; KAISER, J.; NOVOTNY, K.; NOVOTNY, J.; LISKA, M.; MALINA, R.; ZEHNALEK, J.; HUBALEK, J.; HAVEL, L.; KIZEK, R. Multi-instrumental analysis of tissues of sunflower plants treated with silver(I) ions – Plants as bioindicators of environmental pollution. Sensors, 2008, roč. 8. č. 1, s. 445-463. ISSN 1424-8220. IF = 1.573

Podíl autorky Kryštofová O.: 20 % textové části práce a 45 % experimentální práce 57

5.1 Optimalizace metod pro stanovení vybraných markerů v rostlinných vzorcích

SOCHOR, J.; RYVOLOVA, M.; KRYSTOFOVA, O.; SALAS, P.; HUBALEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; HAVEL, L.; BEKLOVA, M.; ZEHNALEK, J.; PROVAZNIK, I.; KIZEK, R. Fully automated spectrometric protocols for determination of antioxidant activity: Advantages and disadvantages.

Molecules, 2010, roč. 15. č. 12, s. 8618-8640. ISSN 1420-3049. IF = 1.988

Podíl autorky Kryštofová O.: 10 % textové části práce a 25% experimentální práce

Cílem naší práce bylo stanovit omezení, časové průběhy reakcí a reakční kinetiku, šesti rozdílných fotometrických testů (DPPH, TEAC, FRAP, DMPD, Free Radicals a Blue

CrO5) pro stanovení antioxidační aktivity v biologickém vzorku při plně automatizovaném uspořádání. Všechny metody byly kalibrovány na automatickém analyzátoru (BS-200) i na dvoupaprskovém UV-VIS spektrofotometru SPECORD 210 na standardní látky trolox a kyselinu galovou v koncentračním rozmezí 0.1-1 mmol·l-1. U obou přístrojů jak automatickém analyzátoru (BS-200) i na dvoupaprskovém UV-VIS spektrofotometru SPECORD 210, jsme získaly kalibrační křivky s vysokým koeficientem determinace (r2 = 0.97 – 0.99) a nízkými směrodatnými odchylkami (v rozsahu 1.50 – 2.50%). Ovšem pokud bychom chtěli analyzovat velké množství vzorků je výhodnější použít automatický analyzátor, protože díky automatizaci lze eliminovat chyby pipetováním, snížit spotřebu chemikálií, které jsou u dvoupaprskovém UV-VIS spektrofotometru větší, a zabráníme také chybám lidského faktoru. Další nespornou výhodou automatického analyzátoru je možnost měřit až 40 vzorků najednou což nabízí velkou časovou úsporu.

Molecules 2010, 15, 8618-8640; doi:10.3390/molecules15128618

OPEN ACCESS molecules ISSN 1420-3049 www.mdpi.com/journal/molecules Article Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages

Jiri Sochor 1,8, Marketa Ryvolova 2, Olga Krystofova 2, Petr Salas 1, Jaromir Hubalek 3, Vojtech Adam 2, Libuse Trnkova 4, Ladislav Havel 5, Miroslava Beklova 6, Josef Zehnalek 2, Ivo Provaznik 7 and Rene Kizek 2,*

1 Department of Breeding and Propagation of Horticultural Plants, Faculty of Horticulture, Mendel university in Brno, Valticka 337, CZ-691 44 Lednice, Czech Republic 2 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic 3 Department of Microelectronics, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Udolni 53, CZ-602 00 Brno, Czech Republic 4 Research Centre for Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlarska 2, CZ-611 37 Brno, Czech Republic 5 Department of Plant Biology, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic 6 Department of Veterinary Ecology and Environmental Protection, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences, Palackeho 1-3, CZ-612 42 Brno, Czech Republic 7 Department of Biomedical Engineering, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Kolejni 4, CZ-612 00 Brno, Czech Republic 8 Department of Natural Drugs, Faculty of Pharmacy University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences, Palackeho 1-3, CZ-612 42 Brno, Czech Republic

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected]; Tel.: + 420 545 133 350.

Received: 19 October 2010; in revised form: 22 November 2010 / Accepted: 26 November 2010 / Published: 29 November 2010

Abstract: The aim of this study was to describe behaviour, kinetics, time courses and limitations of the six different fully automated spectrometric methods - DPPH, TEAC,

FRAP, DMPD, Free Radicals and Blue CrO5. Absorption curves were measured and absorbance maxima were found. All methods were calibrated using the standard compounds Molecules 2010, 15 8619

Trolox® and/or gallic acid. Calibration curves were determined (relative standard deviation was within the range from 1.5 to 2.5 %). The obtained characteristics were compared and discussed. Moreover, the data obtained were applied to optimize and to automate all mentioned protocols. Automatic analyzer allowed us to analyse simultaneously larger set of samples, to decrease the measurement time, to eliminate the errors and to provide data of higher quality in comparison to manual analysis. The total time of analysis for one sample was decreased to 10 min for all six methods. In contrary, the total time of manual spectrometric determination was approximately 120 min. The obtained data provided good correlations between studied methods (R = 0.97 – 0.99).

Keywords: antioxidant activity; spectrometry; trolox; gallic acid

Abbreviations: ABTS – 2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); ACS – chemicals meeting the specifications of the American Chemical Society; AH – antioxidant; CrO5 - chromium peroxide; DMPD – N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzene; DMSO –

dimethyl sulfoxide; DPPH – 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; FeCl3 – ferric chloride; FR – free radical; FRAP – Ferric Reducing Antioxidant Power; HCl – hydrochloric acid; OS – oxidative stress; PC – personal computer; R• – radical; TEAC – Trolox® Equivalent Antioxidant Capacity; TPTZ – 2,4,6-tripyridyl-s-triazine; Trolox® – 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid; UV-VIS – ultraviolet - visible spectrum

1. Introduction

Free radicals (FRs) are naturally formed in a wide range of biological as well as chemical systems. They are chemical stable atoms and molecules, which have one (or rarely more) free electron/electrons in the electron envelope [1-3]. Almost all biomolecules, but mainly biomembranes, proteins and nucleic acids, may be attacked by reactive free radicals. Free radicals are responsible for many pathological processes, or they can be generated as the result of the pathological stage and cause important secondary damage to biological systems and cells [1,4-7]. Connections between free radicals and some serious diseases, including Parkinson´s and Alzheimer´s disease, atherosclerosis, heart attacks, and chronic fatigue syndrome, have been demonstrated. However, short-term oxidative stress (OS), the unbalance between the formation and scavenging of the reactive oxygen species, may be important in the prevention of aging due to the triggering the process known as mitohormesis [6,8-13]. On the average, 65 – 70 % of the population is excessively impacted by oxidative stress caused by FRs. Therefore, OS monitoring is an important part of reasonable health prevention [4,8,9,14-18]. The protective system of the organisms is based on the activity of specific enzymes (especially superoxide dismutase, glutathione peroxidase, catalase, glutathione reductase) as well as non- enzymatic compounds with antioxidant activity (α-tocopherol, L-ascorbic acid, glutathione, coenzyme Q10, flavonoids, albumin and other still unidentified molecules) called antioxidants [1,8,10-12,15,19- 22]. This intricately linked system provides a hydrogen radical, which is able to react with the reactive free radical forming a neutral compound [14,23]. The antioxidant activity is one of the ways how to

Molecules 2010, 15 8620 define the ability of an organism to protect itself against free radicals. It is defined as an ability of the compound (or mixture of compounds) to inhibit oxidative reaction of various biomolecules (e.g. prevent the peroxidation of lipids). Methods of the antioxidant activity determination are usually based on the direct reaction of the studied molecule with radicals (scavenging) or on the reaction with transition metals [3,14,17,24]. Determination of the antioxidant activity is one of the ways how to biologically and nutritionally evaluate the quality of the fruit. It has been proved that antioxidant activity depends on the type of phenolics present in the fruit, as some phenolic compounds exhibit higher antioxidant activity than others [7,9,19-22,25-29]. It is assumed that the ability of plant polyphenols to scavenge reactive oxygen radicals participates in the protective mechanism of plants. Due to the chemical diversity of antioxidants present in fruit, their strictly defined content is unavailable. In spite of the fact that total amount of antioxidants in various fruit types need not to represent the total antioxidant capacity [2,4,5,7,9,19-22,25,26,28-35], almost all phenolic compounds in fruits demonstrate some antioxidant activity [1-4,7,9-13,16-27,29,32-40]. However, detection of therapeutically active components in a biological matrix is a very complex procedure, and their determination differs in individual studies [41-45]. This study is focused on the optimization and precise description of six photometric protocols for automated detection of the antioxidant activity of biological samples (to express the antioxidant activity of the blood serum, various fruits and food products). These methods are mutually compared and their advantages and disadvantages, including usage of manual and automated analyzer, are discussed.

2. Results and Discussion

In the field of chemical analyses and biological evaluation of the antioxidant characteristics several methods enabling determination of the antioxidant activity have been suggested and optimized [3,14,15,17,39]. These methods are principally different and their modifications are still progressively developing. Their importance lies in the characterization of the antioxidant activity under conditions similar to physiological conditions, however, the majority of these methods are not optimized for fully automated analysis [28]. In the first part of our study, protocols, in which individual methods are characterized in detail including preparation of reagents, conditions and processes of measurements as well as calculating of the data obtained for determination of antioxidant activity for individual tests, are described.

2.1. Protocols

2.1.1. Determination of antioxidant activity by the DPPH• test

The DPPH• test is based on the ability of the stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical to react with hydrogen donors. The DPPH• radical displays an intense UV-VIS absorption spectrum. In this test, a solution of radical is decolourized after reduction with an antioxidant (AH) or a radical (R•) in accordance with the following scheme: DPPH• + AH → DPPH•-H + A•, DPPH• + R• → DPPH•-R [39]. This method is very simple and also quick for manual analysis.

Molecules 2010, 15 8621

Reagent preparation: 0.95 mmol·L-1 solution of radical DPPH• (m = 0.00374 g/100 mL). First, this amount is dissolved in 50 mL of DMSO and after dissolution made up to a volume of 100 mL with ACS water. The solution can be used for 7 days when stored at 4 °C and in the dark. Measurement procedure for an automated analyzer: A 200 µL volume of reagent is incubated with 20 µL of sample (gallic acid, Trolox®). Absorbance is measured after 1,520 seconds at λ = 510 nm. To calculate the antioxidant activity, the values determined before decrease of the absorbance (224th th second of measurement – A224) and the last measurement value (1520 second of measurement –

A1520) are used. Resulting value is calculated in accordance with the following formula:

A = A1520-A224.

2.1.2. Determination of antioxidant activity by the ABTS test

The ABTS radical method is one of the most used assays for the determination of the concentration of free radicals. It is based on the neutralization of a radical-cation arising from the one-electron oxidation of the synthetic chromophore 2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) • • •+ (ABTS ): ABTS – e- ABTS . This reaction is monitored spectrophotometrically by the change of the absorption spectrum. Results obtained using this method are usually recalculated to Trolox® concentration and are described as “Trolox® Equivalent Antioxidant Capacity” (TEAC). For chemically pure compounds, TEAC is defined as the micromolar concentration of Trolox® equivalents demonstrating the same antioxidant activity as a tested compound (at 1 mmol·L-1concentration) [17]. Reagent preparation: Seven mmol·L-1 ABTS• (m = 0.03841 g/10 mL) and 4.95 mmol·L-1 potassium peroxodisulphate (m = 0.01338 g/10 mL) are mixed and dissolved in ACS water. The solution is then diluted with ACS water in a 1:9 v/v ratio (10 mL is quantitatively transferred into 100 mL calibrated flask and diluted). The solution is incubated for 12 hours in the dark and the reagent is usable for seven days if stored in the dark at 4 °C. Measurement procedure for an automated analyzer: A 245 µL volume of reagent is pipetted into a plastic cuvette with subsequent addition of 5 µL of sample (gallic acid, Trolox®). Absorbance is measured at λ = 670 nm after 1,520 seconds. For calculating the antioxidant activity, values before th decrease of the absorbance (224 second of measurement – A224) and the last measurement value th (1,520 second of measurement – A1520) are used. Resulting value is calculated in accordance with following formula: A = A1520-A224.

2.1.3. Determination of antioxidant activity by the FRAP method

The FRAP method (Ferric Reducing Antioxidant Power) is based on the reduction of complexes of

2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) with ferric chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O), which are almost colourless, and eventually slightly brownish. This chemical forms blue ferrous complexes after its reduction. The method has its limitations, especially in measurements under non-physiological pH values (3.6). In addition, this method is not able to detect slowly reactive polyphenolic compounds and thiols [16,34]. Reagent preparation: Solution 1: 10 mmol·L-1 solution of TPTZ (m = 0.07802 g/25 mL), in 40 mM of hydrochloric acid. Solution 2: 20 mM solution of ferric chloride hexahydrate (m = 0.13513 g/25 mL) in ACS water. Solution 3: 20 mM acetate buffer, pH 3.6 (weight of sodium acetate trihydrate is 0.27216 g

Molecules 2010, 15 8622

in 100 mL ACS water, adjusted to the desired pH using HCl). These three solutions (TPTZ, FeCl3, acetate buffer) are mixed in a 1:1:10 ratio. Reagent can be used for seven days if stored at 4°C in the dark. Measurement procedure for an automated analyzer: A 245 µL volume of reagent is pipetted into a plastic cuvette with subsequent addition of a 5 µL sample (gallic acid, Trolox®). Absorbance is measured for 1,520 seconds at primary λ = 578 nm and secondary at λ = 630 nm wavelengths. For calculating the antioxidant activity, the differential absorbance (primary absorbance - secondary absorbance) is used.

2.1.4. Determination of antioxidant activity by the DMPD method

The compound N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzene (DMPD) is converted in solution to a relatively stable and coloured radical form by the action of ferric salt. After addition of a sample containing free radicals, these are scavenged and as a result of this scavenging, the coloured solution is decolourized [46,47]. Reagent preparation: Solution 1: acetate buffer (0.2 mol·L-1, pH 5.25); 1a) 2.17 g of sodium acetate trihydrate is dissolved in 80 mL of ACS water; 1b) 300 µL of concentrated acetic acid (>99.5 %, v/v) is diluted to a volume of 20 mL with ACS water. These two solutions are mixed to reach pH = 5.5. -1 Solution 2: 0.74 mmol·L ferric chloride: 1 mg of FeCl3·6H2O is dissolved with ACS water to a volume of 5 mL. Solution 3: 36.7 mmol·L-1 DMPD: 25 mg of DMPD is dissolved in 5 mL of ACS water. This solution must be prepared at the time of use due to its low stability. These three solutions (solutions No. 1, 2 and 3) are mixed in a 20:1:1 (v/v/v) ratio. Measurement procedure for an automated analyzer: A 200 µL volume of reagent is pipetted into a plastic cuvette. Then, 5 µL of sample (gallic acid, Trolox®) is added. Absorbance is measured at λ = 510 nm for 1,520 seconds. For calculating of the antioxidant activity, values before decrease of th th absorbance (224 second of measurement – A224) and last (1520 second of measurement – A1520) are used. Resulting value is calculated in accordance with following formula: Differential absorbance

A = A1520 – A224.

2.1.5. Determination of antioxidant activity by the Free Radicals method

This method is based on ability of chlorophyllin (the sodium-copper salt of chlorophyll) to accept and donate electrons with a stable change of maximum absorption. This effect is conditioned by an alkaline environment and the addition of catalyst [48]. Reagent preparation: 5 mL of reaction buffer (100 mmol·L-1 HCl) is diluted with 45 mL of ACS water. To this solution, 100 µL of chlorophyllin is added. After its complete dissolution, 0.25 mL of catalyst is added. Reaction buffer is stable for one month when stored at 2 - 8 °C in the dark. Measurement procedure for an automated analyzer: Into a plastic cuvette, a 200 µL volume of prepared reagent is pipetted. Next, 8 µL of sample (gallic acid, Trolox®) is added. Absorbance is measured at λ = 450 nm for 560 seconds. For calculating of the antioxidant activity, values before th decrease of the absorbance (224 second of measurement – A224) and the last value of measurement th (560 second of measurement – A560) are used. The resulting value is calculated in accordance with the following formula: A = A560-A224.

Molecules 2010, 15 8623

2.1.6. Determination of antioxidant activity by the Blue CrO5method

Chromium peroxide (CrO5) is very strong pro-oxidant produced in an acidic environment by ammonium dichromate in the presence of H2O2. It is a deep blue potent oxidant compound, miscible and relatively stable in polar organic solvents that can be easily measured by spectrometry [49,50]. Reagent preparation: Solution 1: 1a) 10 mL of solution of sulphuric acid (25 mmol·L-1; 13.4 µL of 98.8 % sulphuric acid diluted with ACS water to a volume of 10 mL); 1b) 10 mL of 20 mmol·L-1 ammonium dichromate solution (50.4 mg of ammonium dichromate dissolved in ACS water); 1c) 30 mL of 99.5 % DMSO (v/v). These three solutions are mixed in a 1:1:3 ratio (v/v/v). Solution 2: 1.6 mol·L-1 solution of hydrogen peroxide. Measurement procedure for an automated analyzer: 400 µL of solution 1 is mixed with 4 µL of sample (gallic acid, Trolox®, -tocopherol). This solution is incubated for 192 seconds. The first th absorbance is measured at the 416 second (A416). Subsequently, 40 µL of solution 2 is added and the solution is incubated for 192 seconds with measurement of the second absorbance (A608). Measurements are carried out at λ = 546 nm. Resulting absorbance was calculated in accordance with the formula A = A608 – A416.

2.2. Analytical evaluation

Our experimental work was focused on the determination of limitations, time courses of reactions, including reaction kinetics, of the six different automated spectrometric tests - DPPH, TEAC, FRAP,

DMPD, Free Radicals and Blue CrO5. The entire process of automatic detection proceeds as follows: a dosing needle pipettes the reagents into the cell heated to 37 °C at time T0. This cycle lasts 224 seconds. Subsequently, the sample is pipetted into the cell and there is a change in absorbance. In addition to other methods, at Blue CrO5 method reagents are also pipetted in the 416th second. For manually measuring of courses of spectral curves, from which their absorbance and the most suitable wavelengths for the measurement of the antioxidant activity for individual methods were determined, a SPECORD 210 spectrophotometer was used. For all methods, time courses of reactions and their reaction kinetics were determined. In the case of measurement of the spectra, eight concentrations of gallic acid (1; 5; 10; 50; 100; 250; 500, and 1,000 µg·mL-1) and eight concentrations of Trolox® (10; 20; 50; 100; 250; 500; 750, and 1,000 µmol·L-1) were used. For measuring the calibration curves, the following concentrations of gallic acid – 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12.5; 15; 17.5; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 750 and 1,000 µg·mL-1 and Trolox® concentrations of 10; 20; 30; 40; 50; 80; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 550; 600; 650; 700; 750; 800; 850; 900; 950 and 1,000 µmol·L-1 were used. The calibration curves were measured at constant wavelengths, which were determined on the basis of the spectral courses. Moreover, time courses of the reaction and reaction kinetics were measured at all abovementioned concentrations of both standards. Concentrations of 1, 100 and 1 000 µg·mL-1 for gallic acid and concentrations 10, 100 and 1,000 µmol·l-1 for Trolox® are shown in the figures below.

Molecules 2010, 15 8624

2.2.1. Analytical evaluation of the DPPH• test

Figures 1(a) and 1(b) show absorption maximum of the DPPH test, which was λ = 530 nm for both standards. Due to limitation of the automated analyzer, all samples were measured at λ = 510 nm. Time courses of DPPH test measured using automated analyzer are shown in Figures 1(c) and 1(d). Firstly, DPPH reagent was pipetted into a cuvette. In the 224th second, gallic acid/Trolox® was added. In the case of gallic acid, a slight reduction of absorbance was observed with increasing time (Figure 1c). Therefore, it is necessary to analyze samples within 1,592 seconds. For Trolox®, the absorbance was constant (Figure 1d).

Figure 1. DPPH absorption spectra (400 – 700 nm) for gallic acid (a) and Trolox® (b). Dependence of absorbance of DPPH radical with gallic acid (c) and Trolox® (d) on time.

2.2.2. Analytical evaluation of the ABTS test

Figures 2(a) and (b) show the absorption maximum of the ABTS test, which was λ = 646 nm for both standards. Due to limitations of the automated analyzer, all samples were measured at an absorbance λ = 670 nm. Time courses of ABTS test reactions measured using the automated analyzer are shown in Figures 2(c) and 2(d). The procedure was identical to the DPPH test. Firstly, the reaction reagent ABTS was pipetted into the cuvette. In the 224th second, gallic acid/Trolox® was added. In the case of gallic acid, a slight decrease of absorbance was observed with increasing time (Figure 2c). In the case of the Trolox® standard the absorbance was constant from the 224th to the 1592th second (Figure 2d).

Molecules 2010, 15 8625

Figure 2. ABTS absorption spectra (450 – 700 nm) for gallic acid (a) and Trolox® (b). Dependence of absorbance of ABTS radical with gallic acid (c) and Trolox® (d) on time.

2.2.3. Analytical evaluation of the FRAP method

Figures 3(a) and (b) show absorption maximum of the FRAP method, which was λ = 596 nm for both standards. To obtain more accurate data, measurements at two different wavelengths, primary absorbance λ = 578 nm and secondary absorbance λ = 630 nm, were carried out. The absorbance of gallic acid and FRAP reagent was enhanced with increasing time (Figure 3c). FRAP reagent with Trolox® also demonstrated a clearly evident increasing tendency. Based on the results obtained, the absorbance measured in the 1520th second was used for the subsequent calculation (Figure 3d).

2.2.4. Analytical evaluation of the DMPD method

Based on the courses of the DMPD absorption spectra with gallic acid (Figure 4a) and Trolox® (Figure 4b), it is clearly evident that the highest absorbance can be measured at two wavelengths: λ = 515 nm and λ = 553 nm. With respect to limitations of the automated analyzer, we chose λ = 510 nm for our subsequent experiments. A decrease in the absorbance was observed with increasing antioxidant activity expressed as increasing concentration of gallic acid as well as Trolox®. The reaction kinetics for gallic acid and DMPD radical were very dynamic during 1,592 seconds (Figure 4c). In the case of low concentrations, an increase in the absorbance was observed (to a concentration of 5 µg·mL-1) . With increasing concentration of Trolox®, the absorbance decreased to the 560th second and increased from the 576th second (Figure 4d).

Molecules 2010, 15 8626

Figure 3. FRAP absorption spectra (450 – 700 nm) for gallic acid (a) and Trolox® (b). Dependence of absorbance of FRAP with gallic acid (c) and Trolox® (d) on time.

Figure 4. DMPD absorption spectra (450 – 700 nm) for gallic acid (a) and Trolox® (b). Dependence of absorbance of DMPD with gallic acid (c) and Trolox® (d) on time.

2.2.5. Analytical evaluation of the Free Radicals method

The course of the Free Radicals absorption spectrum with Trolox® did not change with the increasing concentration of Trolox® (Figure 5b). This phenomenon was verified also by the time course of the reaction (Figure 5d), where all studied concentrations demonstrated relatively the same or

Molecules 2010, 15 8627 very similar absorbance values. The absorbance enhanced linearly with the increasing wavelength for gallic acid. Its increasing tendency is also well evident in curves demonstrating the time dependence. The absorption maximum was 510 nm, which was also suitable for setting our automated analyzer, so all values were obtained by measuring at 510 nm. At the 512th second the absorbance was constant, thus, this absorbance was used for the following calculation (Figure 5c).

Figure 5. Free Radicals absoprtion spectra (450 – 700 nm) for gallic acid (a) and Trolox® (b). Dependence of absorbance of Free Radicals with gallic acid (c) and Trolox® (d) on time.

2.2.6. Analytical evaluation of the Blue CrO5 method

It is well evident from the absorption spectra (Figures 6a,b) as well as from time courses of the reactions (Figure 6d,e) that absorbences were practically constant at various concentrations of Trolox® and gallic acid. This fact is caused by inability of gallic acid and Trolox® to react with the oxidant

CrO5. Due to this fact, we used -tocopherol in this experiment (Figures 6c,f). The absorption maximum was measured at 608 nm. Due to limitations of the automatic analyser, a wavelength of 546 nm was used for the subsequent experiments. The absorbance time course demonstrates its great increase after addition of reagents (solution of sulphuric acid, solution of ammonium dichromate and DMSO). After a 416 second long incubation, hydrogen peroxide was added into the cuvette. Subsequently, a decrease of absorbance was determined. After a 192 seconds long incubation, the absorbance of reagents and tocopherol did not change. Values measured in 608th second were used for the calculation of the antioxidant activity.

Molecules 2010, 15 8628

® Figure 6. Blue CrO5 absorption spectra (450 – 700 nm) for gallic acid (a), Trolox (b) and ® δ tocopherol (c). Dependence of absorbance of Blue CrO5 with gallic acid (c), Trolox (d) and δ tocopherol (c) on time.

2.3. Calibration

All methods were calibrated on both the automated analyzer (BS-200) and a two beam UV-VIS spectrophotometer SPECORD 210 on standards of the antioxidants - Trolox® and gallic acid (the blue

CrO5 method was also calibrated on δ-tocopherol). Further, calibration curves were measured. In an effort to achieve reliable data, all measurement methods were repeated five times. Average values were calculated from these data. The most important aspect was the duration of the analysis itself. Time of analysis ranged from 10 minutes (Blue CrO5 method) to 25 minutes (DPPH test) in the case of use of the manual spectrophotometer. Including the time needed for pipetting of the individual samples, manual manipulation with cuvettes, operation of the apparatus and evaluation of data, the time of measurement for one sample varied from 15 to 30 minutes. In the case where all six methods are used, measurement of one sample takes 120 – 150 minutes. Using an automated analyzer, 40 samples can be measured in one run. In addition, manipulation with samples, including pipetting and recalculation of the measured data (methods are automatically calibrated), is fully automated. In this case, the time of analysis of a set of samples (40) varies from 35 minutes (Blue CrO5 method) to 80 minutes (DPPH test), which means from 1 to 2 minutes per sample. For all six methods used, analysis of one sample takes 10 minutes. Due to automation, errors incoming from handling of a sample and consumption of all chemicals are reduced.

2.3.1. Calibration of the DPPH• test

Dependences of the rising signal intensity of coloured product on concentration of gallic acid (a) and Trolox® (b) related to percentage of inhibition are shown in Figures 7(a) and 7(b). The method of determination of the antioxidant activity based on the DPPH• test can only be used for samples with low antioxidant activity values (gallic acid: 1 – 10 µg·mL-1, Trolox®: 10 – 150 µmol·L-1). In the case of

Molecules 2010, 15 8629 higher concentrations, the absorbance did not change. Due to this fact, it is necessary to dilute analysed samples to the measurable range mentioned above. The calibration curve equation related to standard of gallic acid was y = -0.103 ln(x) - 0.0931 with confidence coefficient R2 = 0.996 and relative standard deviation 1.8 % within the concentration range from 1 to 10 µg·mL-1 (Figure 7c). For the Trolox® standard, this equation was determined as y = -0.0015x - 0.0516 with R2 = 0.996 with relative standard deviation 2.4 % related to Trolox® concentration within a concentration range from 10 to 150 µmol·L-1 (Figure 7d).

Figure 7. Dependences of absorbance of colour product on concentration of gallic acid (a) and Trolox® (b). Calibration curves for DPPH test related to equivalent of gallic acid (c) and Trolox® (d) expressed as the percentage of inhibition.

2.3.2. Calibration of the ABTS method

Changes of absorbance expressed as percentage of inhibition for individual concentrations of gallic acid (a) and Trolox® (b) are shown in Figures 8(a) and 8(b). Based on the calibration by gallic acid, ABTS radical can be used for determination of the antioxidant activity up to 20 µg·mL-1 and in the case of Trolox® up to the 550 mmol·L-1. At higher concentrations, the percentage of inhibition remained constant, which makes determination of higher concentrations practically impossible. The calibration curve equation related to the gallic acid standard was y = -0.0111x - 0.0196 with a confidence coefficient R2 = 0.996 and a relative standard deviation of 2.1 % within a concentration range from 1 to 20 µg·mL-1 (Figure 8a). For the Trolox® standard, this equation was determined as y = -0.0005x - 0.0129 with R2 = 0.999 with a relative standard deviation of 1.5 % within a concentration range from 10 to 550 µmol·L-1 (Figure 8b).

Molecules 2010, 15 8630

Figure 8. Dependence of absorbance of colour product on concentration of gallic acid (a) and Trolox® (b). Calibration curves for ABTS method related to equivalent of gallic acid (c) and Trolox® (d) expressed as percentage of inhibition.

2.3.3. Calibration of the FRAP method

This method has limitations for gallic acid in concentrations higher than 300 µg·mL-1 (Figure 9a). Calibration on a Trolox® standard showed that linearity was only not reached for the two lowest values and the bottom limit for the calibration curve was 30 µmol·L-1 (Figure 9b). The calibration curve equation related to the gallic acid standard was y = 0.0763x + 0.0572 with a confidence coefficient R2 = 0.999 and relative standard deviation 1.5 % within the 1 – 300 µg·mL-1 concentration range (Figure 9c). For the Trolox® standard, this equation was determined as y = 0.8286x + 0.2101 with R2 = 0.996 and relative standard deviation 1.5 % within the concentration range from 30 to 1,000 µmol·L-1 (Figure 9d).

2.3.4. Calibration of the DMPD method

The absorbances showed a decreasing tendency for gallic acid at concentrations higher than 25 µg·mL-1 (Figure 10a). The calibration curve equation of the gallic acid standard was y = -0.0598x + 0.1801 with a confidence coefficient R2 = 0.999 and relative standard deviation 2.3 % for concentrations within the 1 – 25 µg·mL-1 range (Figure 10c). For the standard of Trolox®, this dependence was determined by the equation y = -0.0839x + 0.2579 with R2 = 0.997 with a relative standard deviation of 1.9 % within a concentration range from 50 to 650 µmol·L-1 (Figure 10d).

Molecules 2010, 15 8631

Figure 9. Dependences of absorbance of colour product on concentration of gallic acid (a) and Trolox® (b). Calibration curves for FRAP method related to equivalent of gallic acid (c) and Trolox® (d) expressed in units of absorbance.

Figure 10. Dependences of absorbance of colour product on concentration of gallic acid (a) and Trolox® (b). Calibration curves for DMPD method related to equivalent of gallic acid (c) and Trolox® (d) expressed in units of absorbance.

Molecules 2010, 15 8632

2.3.5. Calibration of the Free Radical method

The Trolox® standard is not suitable for calibration of the Free Radical method (Figure 11b). The concentration of gallic acid on the other hand correlated with absorbance for all concentrations used except 1 µg·mL-1 (Figure 11a). The calibration curve equation for the gallic acid standard was y = 0.035x + 0.2667 with a confidence coefficient R2 = 0.996 and relative standard deviation 1.5 % (Figure 11c).

Figure 11. Dependences of absorbance of colour product on concentration of gallic acid (a) and Trolox® (b). Calibration curve for the Free radical method related to equivalents of gallic acid (c), expressed in units of absorbance.

2.3.6. Calibration of the Blue CrO5 method

In the case of the Blue CrO5 method, it was not possible to establish a relevant calibration dependence for gallic acid and Trolox® (see Figures 12a, b), so -tocopherol was chosen as the most suitable standard for comparing antioxidant activity (Figure 12c) [43, 44]. A calibration curve was obtained for the concentration range from 5 to 80 µmol·L-1 of tocopherol. The calibration curve obtained (Figure 12d) had the following parameters: y = 2.5396x + 0.330 with a confidence coefficient R2 = 0.973 and relative standard deviation 2.5 % .

Molecules 2010, 15 8633

Figure 12. Dependences of absorbance of colour product on concentration of gallic acid

(a), trolox (b) and tocopherol (c). Calibration curves for Blue CrO5 method related to equivalent of tocopherol (d) expressed in units of absorbance.

3. Experimental

3.1. Apparatus

In this study, a BS-200 automated spectrophotometer (Mindray, China) was used. It is composed of cuvette space tempered to 37±1 °C, reagent space with a carousel for reagents and preparation of samples (tempered to 4±1 °C) and an optical detector. Transfer of samples and reagents is provided by robotic arm equipped with a dosing needle (error of dosage up to 5 % of volume). Cuvette contents are mixed by an automatic mixer including a stirrer immediately after addition of reagents or samples. Contamination is reduced due to its rinsing system, including rinsing of the dosing needle as well as the stirrer by MilliQ water. For detection itself, the following range of wave lengths can be used - 340, 405, 450, 510, 546, 578, 630, and 670 nm. In addition, a Specord 210 two beam UV-VIS spectrophotometer (Chromspec, Czech Republic) with cooled semiconductor detector for measurement within range from 190 to 1,100 nm with control by an external PC with the programme WinASPECT was used as the manual instrument in this study. Laboratory scales (Sartorius, Germany) and pipettes (Eppendorf Research, Germany) were used.

3.2. Chemicals

Trolox®—A water soluble derivative of vitamin E (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carboxylic acid), standard of gallic acid, free DPPH• radical (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), dimethyl sulfoxide (DMSO), the synthetic chromophore ABTS• (2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid)), potassium peroxodisulfate, TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine), ferric chloride

Molecules 2010, 15 8634 hexahydrate, sodium acetate trihydrate, hydrochloric acid, sulphuric acid, DMPD (N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzene), ammonium dichromate, hydrogen peroxide, δ-tocopherol, ACS water, 99% methanol (v/v) were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). Reaction buffer, chlorophyllin concentrate and its catalyst were purchased from Sedium R&D (Czech Republic).

3.3. Standards

As standards, Trolox® in 25 different concentrations - 10; 20; 30; 40; 50; 80; 100; 150; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 550; 600; 650; 700; 750; 800; 850; 900; 950, and 1,000 µmol·L-1 and gallic acid in 35 different concentrations - 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12; 15; 17; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 450; 500; 750, and 1,000 µg·mL-1 were used. For the blue CrO5 method, δ-tocopherol in concentrations 2; 5; 7.5; 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; and 100 mmol·L-1 was prepared. Stock solutions of Trolox® was prepared by diluting Trolox® with 99% methanol (v/v) in a concentration of 10 mmol·L-1. Working standard solutions were prepared daily by dilution of the stock solutions with ACS water to the concentration of 1 mmol·L-1 and lower. δ- Tocopherol was diluted with 99% methanol to a concentration of 1 mmol·L-1 and subsequently diluted to the final, abovementioned concentrations as needed. Stability of Trolox® standard solution is 24 hours at 4 °C. Stock solution of gallic acid is stable for 72 hours at 4 °C.

3.4. UV-Vis spectrometric protocols

3.4.1. DPPH

A volume of 1,000 µL of reagent was pipetted into plastic cuvettes. Subsequently, a volume of 100 µL of the standard (gallic acid, Trolox®) was added. Absorbance was measured at λ = 510 nm. For calculation value of absorbance of reagent itself (AR) and value determined after 25 minutes of incubation A25 was used. Resulting value was calculated in accordance with following formula:

A = A25-AR.

3.4.2. ABTS

A volume of 980 µL of reagent and subsequently a volume of 20 µL of measured sample (gallic acid, Trolox®) was added into plastic cuvettes. Absorbance was measured at λ = 670 nm. For calculation of the absorbance of the reagent itself (AR) and value determined after 25 minutes of incubation A25 was used. Resulting value was calculated in accordance with following formula:

A = A25-AR

3.4.3. FRAP

A volume of 980 µL of reagent and subsequently a volume of 20 µL of measured sample (gallic acid, Trolox®) was pipetted into plastic cuvettes. Absorbance was measured after 25 minutes of incubation at primary λ = 578 nm and secondary λ = 630 nm wave lengths. The obtained values of absorbance were subtracted (primary absorbance - secondary absorbance = differential absorbance). For calculating of antioxidant activity, differential absorbance was used.

Molecules 2010, 15 8635

3.4.4. DMPB

A volume of 1,000 µL of reagent was added into plastic cuvettes with subsequent addition of 25 µL of sample (gallic acid, Trolox®). Absorbance was measured at λ = 510 nm. For calculation of the absorbance value of the reagent itself (AR) and value of absorbance determined after 25 minutes of incubation (A25) was used. Resulting value was calculated in accordance with following formula: differential absorbance = A25 – AR.

3.4.5. Free radicals

A volume of 1,000 µL of prepared reagent was pipetted into plastic cuvettes with immediate addition of 40 µL of sample (gallic acid, Trolox®). Absorbance was measured after 9 minutes at

λ = 450 nm. For calculation of the absorbance value of the reagent itself (AR) the absorbance determined after 25 minutes of incubation (A25) was used. Resulting value was calculated in accordance with following formula: A = A25-AR.

3.4.6. Blue CrO5

Solution No. 1 (1,200 µL) was pipetted into plastic cuvettes and mixed with sample solution (12 µL, gallic acid, Trolox®, -tocopherol). Incubation took 3 minutes. After that, the first value of absorbance (A1) was determined. Subsequently, a volume of 120 µL of reagent No. 2 was added and incubated for 3 minutes. After this incubation, a second absorbance value was determined at

λ = 546 nm (A2). Resulting absorbance was calculated according to the formula A = A2 - A1.

3.5. Descriptive statistics

Data were processed using MICROSOFT EXCEL® (USA) and STATISTICA.CZ Version 8.0 (Czech Republic). Results are expressed as mean ± standard deviation (S.D.) unless noted otherwise (EXCEL®).

4. Conclusions

The aim of this study was to find and describe the limitations, time courses of reactions, and reaction kinetics of six different photometric protocols. The study resulted in the optimization, automation and precise description of protocols of six photometric methods, namely the DPPH, TEAC,

FRAP, DMPD, Free Radicals Kit and Blue CrO5 assays, which cand be used for the determination of antioxidant activity. On the basis of our measurements of standard compounds—Trolox®, gallic acid and tocopherol— calibration curves with high confidence coefficients (r2 = 0.97 – 0.99) were determined (Tables 1, 2 and 3). In addition, standard deviations were very low, within the 1.50 to 2.50 % Range. Each technique is based on different principles and enables determination of the antioxidant activity of specific groups of compounds. These techniques have their limitations, thus, it is necessary to determine antioxidant activity using different techniques with appropriate dilution of analysed samples.

Molecules 2010, 15 8636

Time of analysis is also a very important parameter. In the case of fully automated analysis, the duration of analysis varied from 1 to 2 min per sample (including pipetting), in comparison with a manual measurement, at which duration of a measurement varied from 20 to 40 min per sample. Due to the automation of measurements, numerous operation and handling errors are eliminated. In addition, consumption of all chemicals used is reduced. In the case of fully automated analyses, it is possible to analyze more samples in one run.

Table 1. Summarization of the parameters for individual methods related to the standard of gallic acid (n = 5).

Wavelength Interaction Measuring Confidence Standard Method Calibration equation [nm] Time [sec.] range [µg·mL-1] coefficient [R2] deviation [%] DPPH 510 1296 1 – 10 y = -0.103ln(x) - 0.0931 0.996 1.80 ABTS 670 1296 1 – 20 y = -0.0111x - 0.0196 0.996 2.10 FRAP 578/630 1296 1 – 300 y = 0.076x + 0.057 0.999 1.50 DMPD 510 1296 1 – 25 y = -0.060x + 0.180 0.999 2.30 FR 450 560 1 – 1000 y = 0.035x + 0.267 0.996 1.50

Table 2. Summarization of the parameters for individual methods related to the standard of Trolox® (n = 5).

Wavelength Interaction Measuring range Confidence Standard Calibration equation Method [nm] Time [sec.] [µmol·L-1] coefficient [R2] deviation [%] DPPH 510 1296 10 – 150 y = -0.0015x - 0.0516 0.996 2.40 ABTS 670 1296 10 – 550 y = -0.0005x - 0.0129 0.999 1.50 FRAP 578/630 1296 30 – 1000 y = 0.829x + 0.210 0.996 1.50 DMPD 510 1296 50 – 650 y = -0.084x + 0.257 0.997 1.90 FR 450 560 — — — —

Table 3. Summarization of the parameters for individual methods related to standard of δ- tocopherol (n = 5).

Wavelength Interaction Measuring Confidence Standard Calibration equation Method [nm] Time [sec.] range [µmol·L-1] coefficient [R2] deviation [%]

CrO5 546 224 5 - 80 y = 2.530x + 0.3300 0.973 2.50

Acknowledgements

Financial support from the grants IGA ZF MENDELU 9/2010/591, 2B08020 NPV II, QI91A032, REMEDTECH GA CR 522/07/0692 and GACR 102/09/H083 is gratefully acknowledged.

References and Notes

1. Beklova, M.; Zitka, O.; Gazdik, Z.; Adam, V.; Hodek, P.; Stiborova, M.; Horna, A.; Kizek, R. Electroanalytical techniques for determination of flavonoids. Toxicol. Lett. 2008, 180, S230-S230.

Molecules 2010, 15 8637

2. Ling, L.T.; Radhakrishnan, A.K.; Subramaniam, T.; Cheng, H.M.; Palanisamy, U.D. Assessment of Antioxidant Capacity and Cytotoxicity of Selected Malaysian Plants. Molecules 2010, 15, 2139-2151. 3. RiceEvans, C.A.; Miller, N.J.; Paganga, G. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic. Biol. Med. 1996, 20, 933-956. 4. Blazekovic, B.; Vladimir-Knezevic, S.; Brantner, A.; Bival Stefan, M. Evaluation of Antioxidant Potential of Lavandula x intermedia Emeric ex Loisel. 'Budrovka': A Comparative Study with L. angustifolia Mill. Molecules 2010, 15, 5971-5987. 5. Gan, R.Y.; Kuang, L.; Xu, X.R.; Zhang, Y.A.; Xia, E.Q.; Song, F.L.; Li, H.B. Screening of Natural Antioxidants from Traditional Chinese Medicinal Plants Associated with Treatment of Rheumatic Disease. Molecules 2010, 15, 5988-5997. 6. Gazdik, Z.; Krska, B.; Adam, V.; Saloun, J.; Pokorna, T.; Reznicek, V.; Horna, A.; Kizek, R. Electrochemical Determination of the Antioxidant Potential of Some Less Common Fruit Species. Sensors 2008, 8, 7564-7570. 7. Gursoy, N.; Tepe, B.; Sokmen, M. Evaluacion of the chemical composition and antioxidant activity of the peel oil of citrus nobilis. Int. J. Food Prop. 2010, 13, 983-991. 8. Diopan, V.; Babula, P.; Shestivska, V.; Adam, V.; Zemlicka, M.; Dvorska, M.; Hubalek, J.; Trnkova, L.; Havel, L.; Kizek, R. Electrochemical and spectrometric study of antioxidant activity of pomiferin, isopomiferin, osajin and catalposide. J. Pharm. Biomed. Anal. 2008, 48, 127-133. 9. Romero, M.; Rojano, B.; Mella-Raipan, J.; Pessoa-Mahana, C.D.; Lissi, E.; Lopez-Alarcon, C. Antioxidant Capacity of Pure Compounds and Complex Mixtures Evaluated by the ORAC- Pyrogallol Red Assay in the Presence of Triton X-100 Micelles. Molecules 2010, 15, 6152-6167. 10. Schlesier, K.; Harwat, M.; Bohm, V.; Bitsch, R. Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods. Free Radic. Res. 2002, 36, 177-187. 11. Sulc, M.; Lachman, J.; Hamouz, K.; Dvorak, P. Impact of phenolic content on antioxidant activity in yellow and purple-fleshed potatoes grown in the Czech Republic. Biol. Agric. Hortic. 2008, 26, 45-54. 12. Wondrak, G.; Villeneuve, N.F.; Lamore, S.D.; Bause, A.S.; Jiang, T.; Zhang, D.D. The Cinnamon-Derived Dietary Factor Cinnamic Aldehyde Activates the Nrf2-Dependent Antioxidant Response in Human Epithelial Colon Cells. Molecules 2010, 15, 3338-3355. 13. Zima, A.; Hosek, J.; Treml, J.; Muselik, J.; Suchy, P.; Prazanova, G.; Lopes, A.; Zemlicka, M. Antiradical and Cytoprotective Activities of Several C-Geranyl-substituted Flavanones from Paulownia tomentosa Fruit. Molecules 2010, 15, 6035-6049. 14. Antolovich, M.; Prenzler, P.D.; Patsalides, E.; McDonald, S.; Robards, K. Methods for testing antioxidant activity. Analyst 2002, 127, 183-198. 15. de Diego-Otero, Y.; Romero-Zerbo, Y.; el Bekay, R.; Decara, J.; Sanchez, L.; Rodriguez-de Fonseca, F.; del Arco-Herrera, I. alpha-Tocopherol Protects Against Oxidative Stress in the Fragile X Knockout Mouse: an Experimental Therapeutic Approach for the Fmr1 Deficiency. Neuropsychopharmacology 2009, 34, 1011-1026.

Molecules 2010, 15 8638

16. Ou, B.X.; Huang, D.J.; Hampsch-Woodill, M.; Flanagan, J.A.; Deemer, E.K. Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays: A comparative study. J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3122-3128. 17. Re, R.; Pellegrini, N.; Proteggente, A.; Pannala, A.; Yang, M.; Rice-Evans, C. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 1999, 26, 1231-1237. 18. Shimoda, K.; Hamada, H. Synthesis of β-Maltooligosaccharides of Glycitein and Daidzein and their Anti-Oxidant and Anti-Allergic Activities. Molecules 2010, 15, 5153-5161. 19. Karimi, E.; Oskoueian, E.; Hendra, R.; Jaafar, H.Z.E. Evaluation of Crocus sativus L. Stigma Phenolic and Flavonoid Compounds and Its Antioxidant Activity. Molecules 2010, 15, 2644-2656. 20. Kaurinovic, B.; Vlaisavljevic, S.; Popovic, M.; D., V.; Djurendic-Brenesel, M. Antioxidant Properties of Marrubium peregrinum L. (Lamiaceae) Essential Oil. Molecules 2010, 15, 5943-5955. 21. Klejdus, B.; Mikelova, R.; Petrlova, J.; Potesil, D.; Adam, V.; Stiborova, M.; Hodek, P.; Vacek, J.; Kizek, R.; Kuban, V. Determination of isoflavones in soy bits by fast column high- performance liquid chromatography coupled with UV-visible diode-array detection. J. Chromatogr. A. 2005, 1084, 71-79. 22. Zitka, O.; Huska, D.; Adam, V.; Horna, A.; Hubalek, J.; Beklova, M.; Kizek, R. Liquid chromatography with electrochemical detection as a tool for study of oxidative stress in organisms. Toxicol. Lett. 2009, 189, S126-S126. 23. Parr, A.J.; Bolwell, G.P. Phenols in the plant and in man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. J. Sci. Food Agric. 2000, 80, 985-1012. 24. Record, I.R.; Dreosti, I.E.; McInerney, J.K. Changes in plasma antioxidant status following consumption of diets high or low in fruit and vegetables or following dietary supplementation with an antioxidant mixture. Br. J. Nutr. 2001, 85, 459-464. 25. Kolarovic, J.; Popovic, M.; Zlinska, J.; Trivic, S.; Vojnovic, M. Antioxidant Activities of Celery and Parsley Juices in Rats Treated with Doxorubicin. Molecules 2010, 15, 6193-6204. 26. Rop, O.; Reznicek, V.; Valsikova, M.; Jurikova, T.; Mlcek, J.; Kramarova, D. Antioxidant Properties of European Cranberrybush Fruit (Viburnum opulus var. edule). Molecules 2010, 15, 4467-4477. 27. Sochor, J.; Salas, P.; Zehnalek, J.; Krska, B.; Adam, V.; Havel, L.; Kizek, R. An assay for spectrometric determination of antioxidant activity of a biological extract. Listy Cukrov. Reparske. 2010, 126, 408-409. 28. Sochor, J.; Zitka, O.; Skutkova, H.; Pavlik, D.; Babula, P.; Krska, B.; Horna, A.; Adam, V.; Provaznik, I.; Kizek, R. Content of phenolic compounds and antioxidant capacity in fruits of selected genotypes of apricot with resistance against Plum pox virus. Molecules 2010, 15, 6285-6305.

Molecules 2010, 15 8639

29. Tavares, L.; Carrilho, D.; Tyagi, M.; Barata, D.; Serra, A.T.; Duarte, C.M.M.; Duarte, R.O.; Feliciano, R.P.; Bronze, M.R.; Chicau, P.; Esprito-Santo, M.D.; Ferreira, R.B.; dos Santos, C.N. Antioxidant Capacity of Macaronesian Traditional Medicinal Plants. Molecules 2010, 15, 2576-2592. 30. Corona-Bustamante, A.; Viveros-Paredes, J.M.; Flores-Parra, A.; Peraza-Campos, A.L.; Martinez- Martinez, F.J.; Sumaya-Martinez, M.T.; Ramos-Organillo, A. Antioxidant Activity of Butyl- and Phenylstannoxanes Derivedfrom 2-, 3- and 4-Pyridinecarboxylic Acids. Molecules 2010, 15, 5445-5459. 31. Gazdik, Z.; Reznicek, V.; Adam, V.; Zitka, O.; Jurikova, T.; Krska, B.; Matuskovic, J.; Plsek, J.; Saloun, J.; Horna, A.; Kizek, R. Use of Liquid Chromatography with Electrochemical Detection for the Determination of Antioxidants in Less Common Fruits. Molecules 2008, 13, 2823-2836. 32. Gazdik, Z.; Zitka, O.; Petrlova, J.; Adam, V.; Zehnalek, J.; Horna, A.; Reznicek, V.; Beklova, M.; Kizek, R. Determination of Vitamin C (Ascorbic Acid) Using High Performance Liquid Chromatography Coupled with Electrochemical Detection. Sensors 2008, 8, 7097-7112. 33. Hodek, P.; Hanustiak, P.; Krizkova, J.; Mikelova, R.; Krizkova, S.; Stiborova, M.; Trnkova, L.; Horna, A.; Beklova, M.; Kizek, R. Toxicological aspects of flavonoid interaction with biomacromolecules. Neuroendocrinol. Lett. 2006, 27, 14-17. 34. Jerkovic, I.; Marijanovic, Z. Oak (Quercus frainetto Ten.) Honeydew Honey-Approach to Screening of Volatile Organic Composition and Antioxidant Capacity (DPPH and FRAP Assay). Molecules 2010, 15, 3744-3756. 35. Li, B.; Lu, F.; Suo, X.; Nan, H.; Li, B. Antioxidant Properties of Cap and Stipe from Coprinus comatus. Molecules 2010, 15, 1473-1486. 36. Gil, M.I.; Tomas-Barberan, F.A.; Hess-Pierce, B.; Holcroft, D.M.; Kader, A.A. Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 4581-4589. 37. Howell, W.E.; Eastwell, K.C.; Li, T.S.C. Heat treatment, chemo-therapy and hydroponic culture for obtaining virus-free trees of sweet cherry, in: M.F. Clark (Ed.), Proceedings of the 18th International Symposium on Virus & Virus-Like Diseases of Temperate Fruit Crops - Top Fruit Diseases, Vols 1 and 2, International Society Horticultural Science, Leuven 1, 2001, pp. 455-457. 38. Huska, D.; Krystofova, O.; Adam, V.; Soukupova, I.; Beklova, M.; Trnkova, L.; Kizek, R. Comparison of electrochemical and spectrometric detection of-SH moieties. Amino Acids 2009, 37, 34-35. 39. Parejo, L.; Codina, C.; Petrakis, C.; Kefalas, P. Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH center dot (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) free radical assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2000, 44, 507-512. 40. Sulc, M.; Lachman, J.; Hamouz, K.; Orsak, M.; Dvorak, P.; Horackova, V. Selection and evaluation of methods for determination of antioxidant activity of purple- and red-fleshed potato varieties. Chem. Listy 2007, 101, 584-591. 41. Adam, V.; Mikelova, R.; Hubalek, J.; Hanustiak, P.; Beklova, M.; Hodek, P.; Horna, A.; Trnkova, L.; Stiborova, M.; Zeman, L.; Kizek, R. Utilizing of square wave voltammetry to detect flavonoids in the presence of human urine. Sensors 2007, 7, 2402-2418.

Molecules 2010, 15 8640

42. Mikelova, R.; Hodek, P.; Hanustiak, P.; Adam, V.; Krizkova, S.; Havel, L.; Stiborova, M.; Horna, A.; Beklova, M.; Trnkova, L.; Kizek, R. Determination of isoflavones using liquid chromatography with electrochemical detection. Acta Chim. Slov. 2007, 54, 92-97. 43. Klejdus, B.; Mikelova, R.; Adam, V.; Zehnalek, J.; Vacek, J.; Kizek, R.; Kuban, V. Liquid chromatographic-mass spectrometric determination of genistin and daidzin in soybean food samples after accelerated solvent extraction with modified content of extraction cell. Anal. Chim. Acta 2004, 517, 1-11. 44. Klejdus, B.; Vacek, J.; Adam, V.; Zehnalek, J.; Kizek, R.; Trnkova, L.; Kuban, V. Determination of isoflavones in soybean food and human urine using liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. B. 2004, 806, 101-111. 45. Klejdus, B.; Mikelova, R.; Petrlova, J.; Potesil, D.; Adam, V.; Stiborova, M.; Hodek, P.; Vacek, J.; Kizek, R.; Kuban, V. Evaluation of isoflavones distribution in soy plants and soybeans by fast column high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector. J. Agr. Food Chem. 2005, 53, 5848-5852. 46. Gulcin, I.; Bursal, E.; Sehitoglu, M.H.; Bilsel, M.; Goren, A.C. Polyphenol contents and antioxidant activity of lyophilized aqueous extract of propolis from Erzurum, Turkey. Food Chem. Toxicol. 2010, 48, 2227-2238. 47. Jagtap, U.B.; Panaskar, S.N.; Bapat, V.A. Evaluation of Antioxidant Capacity and Phenol Content in Jackfruit (Artocarpus heterophyllus Lam.) Fruit Pulp. Plant Food Hum. Nutr. 2010, 65, 99-104. 48. Votruba, M.; Stopka, P.; Hroudova, J.; Vesely, K.; Nejedlova, L. A simple method for quantitative estimation of free radicals in serum. Klin. Biochem. Met. 1999, 7, 96-101. 49. Charalampidis, P.S.; Veltsistas, P.; Karkabounas, S.; Evangelou, A. Blue CrO5 assay: A novel spectrophotometric method for the evaluation of the antioxidant and oxidant capacity of various biological substances. Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 4162-4168. 50. Grampp, G.; Landgraf, S.; Wesierskia, T.; Jankowska, B.; Kalisz, E.; Sabou, D.M.; Mladenova, B. Kinetics of the formation of the blue complex CrO(O-2)(2) formed by dichromate and H2O2 in acid solutions. A stopped-flow investigation using rapid-scan UV-VIS detection. Mon. Chem. 2002, 133, 1363-1372.

Sample Availability: Samples of the compounds of interest are available from the authors.

© 2010 by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

5.2 Vlivu kovů na rostliny – optimalizace metod pro stanovení obsahu kovu

KRYSTOFOVA, O.; TRNKOVA, L.; ADAM, V.; ZEHNALEK, J.; HUBALEK, J.; BABULA, P.; KIZEK, R. Electrochemical microsensors for the detection of cadmium(II) and lead(II) ions in plants.

Sensors, 2010, roč. 10. č. 6, s. 5308-5328. ISSN 1424-8220. IF = 1.771

Podíl autorky Kryštofová O.: 30 % textové části práce a 60% experimentální práce

V naší práci porovnávali tři různé z elektrochemické techniky za účelem zjištění jejich potenciálu pro minaturizaci. Klasická diferenční pulsní voltametrie na uhlíkové elektrodě byla porovnávána s Micropotencistetem, který byl navržen na VUT v Brně a s ampérometrickým měřením, které bylo provedeno s multi-mode Potenciostat BioStat obsahující pracovní uhlíkovou elektrodu, stříbrnou referent elektrodu s vrstvou AgCl a kontrolní zlatou elektrodou.

Mikropotenciostat byl dále experimentálně tetován pro sledování obsahu kademnatých a olovnatých iontů v extraktech rostlin. Cílem je, aby pomocí těchto postupů bylo možné sledovat obsahy iontů těžkých kovů v sériích biologických vzorků. Pro tento účel byl navržen jednoduchý experiment s obilkami Zea mays L. a Helianthus annuus L.. K experimentu bylo využito pět koncentrací kadmia a olova (0, 10, 50, 100 a 500 μmol·l-1). Obilky byly umístěny na filtrační papír smáčeném roztokem obsahujícím kademnaté nebo olovnaté ionty, ponechány v temnu při teplotě 23 °C a po 7 dnech odebrány. Všechny části rostlin byly omyty v destilované vodě a roztoku EDTA a následně použity pro analýzu.

V první řadě byl zhodnocen vliv těžkých kovů na klíčení experimentálních rostlin. Na základě vyhodnocení růstových charakteristik bylo potvrzeno, že Cd2+ i Pb2+ způsobují se zvyšující se koncentrací působícího kovu růstovou inhibici jak nadzemních tak kořenových částí rostlin Helianthus annuus L. roční. Dále bylo zjištěno, že Pb2+ má vyšší inhibiční účinky než Cd2+. Podíváme-li se se podrobněji na působení jednotlivých

koncentrací, pak zjistíme, že u koncentrace 50 µmol·l-1 Cd2+ i Pb2+ rostliny tvořily více biomasy oproti ostatním koncentracím působících kovů. Tento trend se nám potvrdil jak v případě svěží hmotnosti, tak v případě sušiny i růstu.

Následně byly rostliny rozděleny na nadzemní a kořenovou část a v jednotlivých částech byl stanoven obsah kovu. Na základě analýzy jsme zjistili, že klíční rostliny přijímali těžké kovy. Výrazný nárůst obsahu kademnatých i olovnatých iontů byl pozorován v kořenové části, zatím co v nadzemních částech byl obsah analyzovaných kovů oproti kořenovým částem nižší.

Kromě obsahu kovů byla u klíčních rostlin stanovena i aktivita aminotransferáz (ALT, AST). Porovnáním s kontrolou bylo analýzou zjištěno, že kadmium zvyšuje pouze aktivitu AST v kořenové části klíčků Helianthus annuus L. u všech aplikovaných koncentrací a to o 10 až 21 %. Aktivita ALT byla jak v nadzemní, tak kořenové části v porovnání s kontrolou výrazně snížená. V nadzemní části bylo u ALT snížení až o 40 % a v kořenové až o 35%. Olovo naopak stimulovalo aktivitu AST jak v nadzemní, tak kořenové části klíčků Helianthus annuus L. a ALT v kořenové části. Aktivita AST byla v nadzemní části zvýšená u aplikovaných koncentrací 50, 100 a 500 µmol·l-1 roztoku iontů olova a to o 5 %. V kořenové části klíčků Helianthus annuus L. byla aktivita AST zvýšená u aplikovaných koncentrací 10, 50 a 100 µmol·l-1 a to o 2 – 13 %. Aktivita ALT v kořenové části u klíčních rostlin Helianthus annuus L. byla vyšší o 35 % v porovnání s kontrolou.

Sensors 2010, 10, 5308-5328; doi:10.3390/s100605308 OPEN ACCESS sensors ISSN 1424-8220 www.mdpi.com/journal/sensors

Article Electrochemical Microsensors for the Detection of Cadmium(II) and Lead(II) Ions in Plants

Olga Krystofova 1, Libuse Trnkova 2,3, Vojtech Adam 1, Josef Zehnalek 1, Jaromir Hubalek 4, Petr Babula 5 and Rene Kizek 1,*

1 Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University in Brno, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic; E-Mails: [email protected] (O.K.); [email protected] (V.A.); [email protected] (J.Z.) 2 Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlarska 2, CZ-611 37 Brno, Czech Republic; E-Mail: [email protected] (L.T.) 3 Research Centre for Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlarska 2, CZ-611 37 Brno, Czech Republic 4 Department of Microelectronics, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Udolni 53, CZ-602 00 Brno, Czech Republic; E-Mail: [email protected] (J.H.) 5 Department of Natural Drugs, Faculty of Pharmacy, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackeho 1-3, CZ-612 42 Brno, Czech Republic; E-Mail: [email protected] (P.B.)

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected].

Received: 13 February 2010; in revised form: 4 April 2010 / Accepted: 19 April 2010 / Published: 27 May 2010

Abstract: Routine determination of trace metals in complex media is still a difficult task for many analytical instruments. The aim of this work was to compare three electro-chemical instruments [a standard potentiostat (Autolab), a commercially available miniaturized potentiostat (PalmSens) and a homemade micropotentiostat] for easy-to-use and sensitive determination of cadmium(II) and lead(II) ions. The lowest detection limits (hundreds of pM) for both metals was achieved by using of the standard potentiostat, followed by the miniaturized potentiostat (tens of nM) and the homemade instrument (hundreds of nM). Nevertheless, all potentiostats were sensitive enough to evaluate contamination of the environment, because the environmental limits for both metals are higher than detection limits of the instruments. Further, we tested all used potentiostats and working electrodes on analysis of environmental samples (rainwater, flour and plant Sensors 2010, 10 5309

extract) with artificially added cadmium(II) and lead(II). Based on the similar results obtained for all potentiostats we choose a homemade instrument with a carbon tip working electrode for our subsequent environmental experiments, in which we analyzed maize and sunflower seedlings and rainwater obtained from various sites in the Czech Republic.

Keywords: heavy metals; lead; cadmium; miniaturization; screen printed electrode; amperometry; voltammetry; plant; maize; sunflower; water

1. Introduction

Heavy metal ions are natural components of Earth’s crust. Their content in soil varies from very low (femtograms) to high (milligrams). However due to anthropogenic activities their content can be elevated at the site of the action. High concentrations of heavy metal ions can injure human health and pollute the environment. It is a common knowledge that toxic heavy metal ions (lead, cadmium and mercury) are able to enter organisms and interfere with several important metabolic processes. The presence of toxic ions in a plant cell damages homeostasis, transpiration, etc. [1]. Plants are capable of surviving this abiotic stress due to a number of protective mechanisms [2-4]. The result is that the plant lives and develops in the polluted environment and, moreover, accumulates the heavy metal ions in its tissues. If such plants are harvested, the foodstuffs derived from them may pose a threat to animal and human health [5,6]. Due to the above-mentioned facts the development of simple analytical instruments, methods and procedures with low detection limits are needed [7]. Analytical methods and instruments for detection of cadmium(II) [8-11] and lead(II) [12-16] ions have been reviewed several times. Electrochemical ones are among the very sensitive analytical methods available for detection of heavy metal ions [17-19]. The classic instrument consists of a potentiostat/galvanostat with an electrochemical cell including three electrodes (working, reference and auxiliary). However the current trend of analytical techniques is to miniaturize the whole instrument due to the many advantages of small devices including portability, low costs and less demands on service and operations, sufficient sensitivity and selectivity [20,21]. As the working electrode, a hanging mercury drop electrode (HMDE) is commonly used [22]. The HMDE can be also modified with biologically active substances to improve the sensitivity or selectivity of heavy metal ion detection [23-26]. Due to the adverse effects of Hg(II) and many restrictions for usage of this metal, carbon electrodes have been promoted as an alternative [27-29]. Moreover, in the miniaturization of whole instruments, carbon electrodes have many advantages compared to HMDE [20,21]. Screen-printed carbon electrodes belong to the most suitable carbon electrodes for in situ environmental analysis [30-34]. Besides the electrodes, the potentiostat controlling the electrode system also has to be miniaturized, portable and easy-to-use. The aim of this work was to utilize and compare electrochemical instruments for the easy and sensitive determination of heavy metal ions. The instruments were further employed to analyse real samples.

Sensors 2010, 10 5310

2. Results and Discussion

2.1. Automated Electrochemical Detection of Cadmium(II) and Lead(II) Ions at a Hanging Mercury Drop Electrode―Metrohm Potentiostat

Electrochemical detection of cadmium(II) and lead(II) ions at a mercury working electrode is routinely used. Redox signals for cadmium were observed at –0.6 V and for lead at about –0.4 V versus Ag/AgCl 3M KCl. Stripping techniques markedly lowered the detection limits for these ions [35-42]. The metals are preconcentrated by electrodeposition into a small volume mercury electrode. The preconcentration is done by cathodic deposition at a controlled time and potential. The deposition potential is usually 0.3–0.5 V more negative than the standard redox potential for the least easily reduced metal ions to be determined. The metal ions reach the mercury electrode by diffusion and convection, where they are reduced and concentrated as amalgams [43]. Typical DP voltammograms of cadmium(II) and lead(II) ions measured with HMDE using automated electrochemical analyser are shown in Figure 1. The calibration curves were strictly linear with detection limits on the order of hundreds of pM. Relative standard deviation did not exceed 2%.

Figure 1. (A) DP voltammograms of lead(II) and cadmium(II) ions: a (Pb2+ 10.0 µM, Cd2+ 10.0 µM ); b (Pb2+ 15.6 µM, Cd2+ 25.0 µM ); c (Pb2+ 32.3 µM, Cd2+ 100.0 µM ); d (Pb2+ 62.5 µM, Cd2+ 175.0 µM ); e (Pb2+ 125.0 µM, Cd2+ 250.0 µM ). (B) The dependence of peak height on concentration of the metals as follows for cadmium (0.75–100 µM) and for lead (0.5–1,000 µM); in insets: for cadmium (0.75–12.5 µM) and for lead (0.5–15.6 µM). Potentiostat: Autolab.

Sensors 2010, 10 5311

2.2. Electrochemical Detection of Cadmium(II) and Lead(II) Ions―PalmSens potentiostat

Differential pulse anodic stripping voltammetry using HMDE as a working electrode is among the most sensitive analytical techniques used for heavy metal ion detection. However, from a technological point of a view, the non-solid electrodes have much more lower miniaturization potential than solid electrodes, like silver, gold, carbon or platinum. The printing of electrodes is a promising technology for further miniaturization. Screen-printing is an undemanding non-vacuum method for spreading of thixotropic materials. Single layers are created by pressing the paste on the substrate through the screen. The advantage of this technique is its simplicity, high mechanical and electric properties, easy connection to other circuits and particularly, low-cost [44], yet despite the many advantages of printed electrodes, their fabrication requires sophisticated technological equipment including highly professional servicing. Based on the aforementioned facts, we tested two miniaturized electrode systems, both connected to a PalmSens potentiostat, for detection of cadmium and lead ions (Figure 2). The first system uses screen-printed carbon electrodes (Figure 2A) and the second commercially available pipette tips (Figure 2B).

Figure 2. Photos of screen printed carbon electrode and/or carbon tips electrode connected to PalmSens potentiostat.

Cadmium and lead electrochemical analysis – PalmSens potentiostat

Home made electrode holder reference electrode

auxiliary working electrode electrode

potentiostat

Screen printed carbon electrode carbon printed Screen electrochemical cell

peristaltic pump

reference electrode working electrode waste auxiliary electrode

Carbon tips electrode tips Carbon

electrochemical cell

Sensors 2010, 10 5312

A pipette tip (1 ml, Tosoh, Japan) is made from polymeric material and coated by graphite. The presence of such polymeric and carbon-based material enables us to use this accessory as a working electrode, because it is of conductive resin. Based on the mentioned facts, these electrodes can be used for detection of substances undergoing reduction and/or oxidation on the surface of such electrodes without any pre-treatment procedures. We investigated dependence of cadmium(II) ions peak height on time of accumulation of these ions on both working electrodes (SPE―screen-printed electrodes and CTE―carbon tip electrodes). Cadmium(II) ions adsorb well on the surface of SPE and CTE, because the cadmium(II) ion peak was enhanced with the increasing accumulation time (Figure 3A). In the case of SPE the highest signal was determined after a 240 s long accumulation. The cadmium(II) ion peak detected at CTE was enhanced over the whole tested interval (Figure 3A).

Figure 3. Differential pulse voltammetric detection of cadmium(II) ions at SPE and/or CTE connected to PalmSens potentiostat. (A) The dependence of cadmium(II) ions peak height on accumulation time (concentration of Cd(II) is 20 µM), in inset: typical DP voltammograms of cadmium(II) ions measured at various times of accumulation with CTE. (B, C) Calibration curves. (D) DP voltammograms of various concentrations of cadmium(II) ions measured with SPE. Experimental parameters were as follows: initial potential 0 V, end potential –0.8 V, potential step 5 mV.

Microdetection of cadmium(II) ions in acetate buffer

A 1 B SPE-PalmSens CTE-PalmSens 600 0.9

0.8 500 A)

0.7 A) µ

n 400 A)

µ 0.6

0.5 3nA time (s) 300

0.4 200

Peak height ( height Peak Peak height ( height Peak Peak height Peak( 0.3 100 0.2

0.1 -1.0 -0.5 0.0 0 Potential (V) 0 0 50 100 150 0 100 200 300 Time of accumulation (s) Cadmium concentration (µM)

18 Microdetection of cadmium(II) ions in flour D C 16 SPE CTE

14 15

12 A)

µ 10 10 8

5 6

Peak height Peak( Peak height Peak(nA) 4 0 500 2 -0.8 250 -0.6 -0.4 125 0 -0.2 62.5 0 2 10 14 18 22 50 0 0.0 Cadmium contamination of flour (mM)

Sensors 2010, 10 5313

Typical DP voltammograms of cadmium(II) ions measured with the carbon tip electrode after various accumulation times are shown in the inset of Figure 3A. Peak potential is –0.64 V and it gradually shifts to more negative potentials with increasing heavy metal concentration. We also determined that the working electrode prepared from a pipette tip provides repeatable electrochemical signals for the heavy metals ions of interest with relative standard deviation (R.S.D.) lower than 9% (n = 5), whereas R.S.D. of measurements with SPE was 3.8%. In spite of the fact that SPE gave results with lower R.S.D., CTE had higher sensitivity (approximately 2) to cadmium(II) ions. Based on the aforementioned results, we used an accumulation time of 180 s for the measurement of dose-response curves. The obtained curves were strictly linear within a concentration interval from 1 to 500 µM with regression equations y = 0.0292x – 0.3462, R2 = 0.9952 (SPE, Figure 3B) and y = 0.029x – 0.410, R2 = 0.9950 (CTE, Figure 3C). DP voltammograms of various concentrations of cadmium(II) ions measured with SPE are shown in Figure 3D. Detection limits of cadmium(II) ions estimated by diluting (time of accumulation 180 s) were 50 nM for SPE and 20 nM for CTE.

Figure 4. Microdetection of lead(II) ions at carbon tip. (A) The dependence of lead(II) ions peak height on time of accumulation, in inset: typical DP voltammograms of lead(II) ions under various times of accumulation. (B) Calibration curve. (C) DP voltammograms of various concentrations of lead(II) ions. (D) Detection of lead(II) ions in contaminated flour.

Sensors 2010, 10 5314

Concerning the detection of lead(II) ions at the SPE and CTE, we also measured the dependence of peak height on accumulation time (Figure 4A). The trend was similar to the cadmium-dependences. The lead(II) ions peak measured with SPE was enhanced up to 240 s and then decreased slightly, which could be attributed to saturation of the working electrode or changes in the physico-chemical properties of the electrode due to the long interaction with heavy metal ions. A-CTE-measured-curve was enhanced over the whole tested interval (Figure 4A). Typical voltammograms of lead(II) ions measured with the carbon tip under various times of accumulation are shown in the inset of Figure 4A. The signal potential is –0.43 V and gradually shifts to more negative potentials with increasing heavy metal concentration. Like cadmium(II) ions, the R.S.D. of CTE measurements was higher (9.1%, n = 5) in comparison with SPE (4.2%, n = 5), however, the sensitivity of CTE to lead(II) ions was more than three times higher compared to SPE. Based on the fore-mentioned results, we used accumulation time of 240 s for the measurement of dose-response curves. The obtained curves were strictly linear within concentration interval from 40 to 500 µM with regression equations y = 0.0242x + 0.0656, R2 = 0.9981 (SPE, Figure 4B) and y = 0.073x + 0.314, R2 = 0.9980 (CTE, Figure 4C). DP voltammograms of various concentrations of lead(II) ions measured with SPE are shown in Figure 4D. Detection limits of lead(II) ions estimated by diluting (time of accumulation 240 s) were 500 nM for SPE and 150 nM for CTE.

2.3. Cadmium and Lead Ions Detection by Micropotentiostat

For the next experiments we fabricated a simple micropotentiostat [45]. The apparatus consists of the 10 × 10 cm printed circuit board mounted with SMD devices (Figure 5). The potentiostat on a chip is built into this board. The apparatus is connected to a PC by a USB connector and basic instructions are transmitted into the chip thanks to a control program. Electrodes are connected with the micropotentiostat via a 3-way TRIAD connector.

Figure 5. Photo of homemade potentiostat with chip and controlling circuits.

Sensors 2010, 10 5315

Cadmium(II) and lead(II) ion detection were carried out at SPE and CTE by differential pulse voltammetry in plastic electrochemical cell with low volume of 0.2 M acetate buffer (500 µl) as supporting electrolyte. DP voltammogram of 100 µM cadmium(II) ions measured with SPE is shown in Figure 6A. The potential of cadmium(II) ions peak was –0.65 V. Compared to previous measurements the potential is shifted by more than 50 mV to negative values. This fact is probably caused by the materials used for printing the working electrode. For measuring dose-response curves we choose the previously optimized accumulation time of 180 s. Calibration curves for cadmium(II) ions measured with SPE and/or CTE are shown in Figures 6B and/or 6C, respectively.

Figure 6. Cadmium(II) ions. (A) DP voltammogram of cadmium(II) ions detected at SPE. Calibration curves measured with (B) SPE and/or (C) CTE. Lead(II) ions. (A) DP voltammogram of lead(II) ions detected at SPE. Calibration curves measured with (B) SPE and/or (C) CTE. Poteniostat: homemade. Experimental parameters were as follows: initial potential 0 V, end potential –0.8 V, potential step 5 mV.

Both calibration curves were linear with regression equations y = 0.024x – 0.019, R2 = 0.9956 (SPE, Figure 6B) and y = 0.045x – 0.018, R2 = 0.9920 (CTE, Figure 6C). Moreover, it clearly follows from the results obtained that a peak height measured with CTE is approximately two times higher compared to SPE. Nevertheless, R.S.D. of CTE’s measurements was again higher (9.5%, n = 5)

Sensors 2010, 10 5316 compared to SPE (3.6%, n = 5). Detection limits of cadmium(II) ions estimated by diluting (time of accumulation 180 s) were 500 nM for SPE and 150 nM for CTE. The potential of the obtained lead(II) ions peak measured with CPE was app. –0.45 V (Figure 6D). The shift of potential compared to HMDE analyses was approximately same as in case of cadmium(II) ions. In the case of lead(II) ions detection, we used accumulation time of 240 s to measure dose-response curves. Both calibration curves were linear with regression equations y = 0.0158x + 0.0073, R2 = 0.992 (SPE, Figure 6B) and y = 0.036x – 0.018, R2 = 0.995 (CTE, Figure 6C). A peak height measured with CTE is approximately two times higher compared to SPE. Nevertheless, R.S.D. of CTE’s measurements was again higher (9.1%, n = 5) compared to SPE (3.2%, n = 5). Detection limits of cadmium(II) ions estimated by diluting (time of accumulation 180 s) were 1 µM for SPE and 500 nM for CTE.

2.4. Comparison of the Potentiostats and Working Electrodes Used for Detection of Cadmium(II) and Lead(II) Ions

In the previous paragraphs we showed the use of three various electrochemical systems for detection of cadmium(II) and lead(II) ions. The first (Autolab) potentiostat used with HMDE was the most sensitive, with detection limits in the pM range. This instrument, however, is the largest among the tested potentiostats, using HMDE and therefore its potential for usage in situ is doubtful. The second tested potentiostat was a readily portable instrument called PalmSens with SPE and/or CTE as working electrodes. The detection limits were down to tens of nM for cadmium(II) ions and hundreds of nM for lead(II) ions. This instrument was less sensitive compare to Autolab but utilizable for in situ measurements. The great advantages of this potentiostat are low cost, good portability and the ability to use commonly available pipette tip as working electrode. The sensitivity of this instrument is sufficient for analysis of environmental samples. Our home-made potentiostat connected with SPE and/or CTE was also less sensitive to the heavy metal ions of interest compared to the Autolab with detection limits of hundreds of nM for cadmium(II) and units of µM for lead(II) ions. Much worse sensitivity can be associated with higher noise of the instruments and much lower range of measured currents. Nevertheless, this potentiostat is sensitive enough to evaluate contamination of the environment, because the environmental limits for both metals are higher than the detection limits of this instrument (Table 1). Further, we tested all used potentiostats and working electrodes for the analysis of environmental samples (rainwater, flour and plant extract) with artificially added cadmium(II) and lead(II). The samples of contaminated flour were weighed and added to acetate buffer. These solutions were vortexed for 15 minutes. Further, samples were centrifuged and the supernatants obtained were analysed by the previously described electrochemical instruments. Rainwater was used without any pretreatment. Preparation of plant tissues is described in the Experimental section. We were able to quantify cadmium(II) and lead(II) ions simultaneously due to their different peaks potentials. Recovery expressed as ratio between found and given concentration of a heavy metal was higher than 80% for all potentiostats (Table 2). This shows that all instruments can be used for analysis of environmental samples. Based on the similar results obtained for all potentiostats we choose the homemade instrument with CTE in our subsequent environmental experiments.

Sensors 2010, 10 5317

Table 1. Detection of cadmium and lead―analytical parameters.

Calibration curve Linear Potential LOD LOC Relative standard Element equations R2 dynamic (V) (nM) (µM) deviation (%) (nA)―HMDE range (µM)

Cd a,b –0.595 I = 0.6419c – 1.132 0.9970 0.2–150 100 0.25 1.5 Pb a,b –0.405 I = 0.6138c + 2.7051 0.9976 2.5–1,000 500 1.0 1.9

Calibration curve Linear Potential LOD LOC Relative standard Element equations R2 dynamic (V) (nM) (µM) deviation (%) (nA)―SPE-PalmSens range (µM)

Cd a,b –0.725 I = 4.955c – 0.713 0.9980 0.5–100 100 0.3 2.5 Pb a,b –0.455 I = 34.37c – 93.81 0.9969 6–100 500 1.1 2.0

Calibration curve Linear Potential LOD LOC Relative standard Element equations R2 dynamic (V) (nM) (µM) deviation (%) (µA)―CTE-PalmSens range (µM)

Cd a,b –0.640 I = 0.0292c – 0.3462 0.9952 1–500 50 0.1 3.8 Pb a,b –0.455 I = 0.0242c + 0.0656 0.9981 5–500 500 1.0 4.3

Calibration curve Linear Potential LOD LOC Relative standard Element equations R2 dynamic (V) (nM) (µM) deviation (%) (nA)―SPE-HomeMic range (µM)

Cd a,b –0.663 I = 24.41c – 18.13 0.9953 2–100 500 1.0 5.8 Pb a,b –0.453 I = 15.68c + 12.11 0.9902 5–100 800 1.2 6.9

Calibration curve Potential Linear dynamic LOD LOC Relative standard Element equations R2 (V) range (µM) (nM) (µM) deviation (%) (nA)―CTE-HomeMic

Cd a,b –0.685 I = 2.20c – 1.99 0.9900 2–100 650 1.2 8.8 Pb a,b –0.457 I = 1.53c + 1.39 0.9922 5–100 880 1.8 7.3 a..... time of accumulation 120 s at accumulation potential –1 V b..... number of measurement ( n = 6) I..... peak current c.... element concentration

Sensors 2010, 10 5318

Table 2. Comparison of detection of cadmium(II) and lead(II) ions artificially added to various types of samples (rainwater, flour and plant extract, n = 5).

Metal Added SPE-PalSens SPE-HomeMic CTE-PalmSens CTE-HomeMic HMDE (samples) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) (µM) a Cd 50 49.5 ± 5.5 52.5 ± 10.5 50.8 ± 7.5 53.5 ± 11.8 50.5 ± 3.5 a Pb 50 50.4 ± 6.6 54.0 ± 12.0 50.5 ± 4.5 55.5 ± 10.9 50.3 ± 4.5 a Cd 10 9.5 ± 6.5 10.5 ± 8.8 10.3 ± 7.5 10.0 ± 6.8 10.5 ± 3.3 a Pb 10 9.9 ± 5.9 11.0 ± 9.3 10.8 ± 8.5 10.5 ± 10.8 10.3 ± 4.5 a Cd, Pb 5 4.7 ± 0.8/4.8 ± 0.6 4.9 ± 0.5/4.8 ±0.4 5.3. ± 0.4/4.8 ± 0.4 5.2. ± 0.3/4.9 ± 0.3 5.0. ± 0.2/4.9 ± 0.3 Cd, Pb in 5 4.8 ± 0.7/4.9 ± 0.8 5.1 ± 0.6/4.9 ± 0.6 5.5. ± 0.7/5.3 ± 0.5 5.3. ± 0.3/5.0 ± 0.2 5.0. ± 0.1/4.9 ± 0.3 b rainwater Cd, Pb in 5 4.4 ± 0.8/4.5 ± 0.8 4.3 ± 0.7/4.6 ± 0.7 4.5. ± 0.7/4.6 ± 0.5 4.7. ± 0.6/4.6 ± 0.6 4.7. ± 0.5/4.6 ± 0.7 c flour Cd, Pb in 5 4.1 ± 0.9/4.7 ± 0.8 4.6 ± 0.9/4.8 ± 0.9 4.5. ± 0.7/4.6 ± 0.7 4.5. ± 0.9/4.6 ± 0.8 4.6. ± 0.6/4.7 ± 0.7 d plant a ...samples in 0.2 M acetate buffer, pH 5.0 b ...1.7 ml rain wather in 0.2 M acetate buffer, pH 5.0 c ....0.1 g flour extract in 0.2 M acetate buffer, pH 5.0 d ...0.1 g plant extract in 0.2 M acetate buffer, pH 5.0 SPE-PalmSens ... Screen Printed Electrode connected with PalmSens micropotentiostat SPE-HomeMic ... Screen Printed Electrode connected with Homemade micropotentiostat CTE-PalmSens ... Carbon Tips Electrode connected with PalmSens micropotentiostat CTE-HomeMic ... Carbon Tips Electrode connected with Homemade micropotentiostat HMDE ... Hanging Mercury Drop Electrode connected with Autolab potentiostat

2.5. Determination of Cadmium(II) and Lead(II) Ions in Maize and Sunflower Seedlings

The homemade micropotentiostat was further used to detect cadmium(II) and lead(II) ions in extracts of plants with the aim of monitoring levels of these heavy metals ions in series of biological samples. For this purpose the simple biological experiment was designed. Maize and sunflower kernels were placed onto filter paper. These kernels were treated with cadmium(II) or lead(II) ions (0, 10, 50, 100 and 500 µM) for seven days in dark at 23 °C. Samples were collected at the end of the treatment. Sampled seedlings were carefully rinsed with distilled water and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution, divided into roots and shoots and analysed. Primarily, we aimed our attention at basic growth and biochemical parameters of sunflower seedlings treated with cadmium(II) and lead(II) ions. Both heavy metal ions had an adverse effect on fresh weight and growth of roots and shoots of the seedlings (Figure 7A, B). However, activities of aspartate transaminase (AST) and alanine transaminase were affected differently by cadmium(II) and lead(II) ions. AST activity was higher or similar in plants treated with Cd(II) and/or Pb(II) compared to control plants. Nevertheless, activity of ALT decreased in roots and increased in shoots of plants treated with Cd(II). In plants treated with Pb(II) ALT activity increased in roots and was similar in shoots. The content Cd(II) and/or Pb(II) of in plants treated with 10 and 50 µM was under detection limit of the instrument used (Figure 7C, D). It follows from the results obtained that content of both metal ions enhanced significantly (*p < 0.05) with increasing

Sensors 2010, 10 5319 concentration of a metal and time of the treatment. Higher content was determined in roots compared to shoots in case of both metal ions.

Figure 7. Sunflower seedlings. Changes in fresh weight, growth, AST and ALT activities in sunflower seedlings treated with (A) cadmium(II) ions and/or (B) lead(II) ions. Content of (C) cadmium(II) ions and /or (D) lead(II) ions in shoots and roots of the treated seedlings.

shoot

AST (µkat/l) AST

ALT (µkat/l) ALT Growth (cm per plant) per (cm Growth Fresh weight(g per plant) per weight(g Fresh root *

Cadmium concentration (µM)

- Cadmium concentration (µM) concentration plantin Cadmium

Experimental Experimental day 0 10 50 100 500 Cadmium concentration (µM) Cadmium concentration (µM)

ALT (µkat/l) ALT

AST (µkat/l) AST Fresh weight(g per plant) per weight(g Fresh

Growth (cm per plant) per (cm Growth *

Lead concentration (µM)

- Lead concentration in plant (µM) inplant concentration Lead

Experimental Experimental day Lead concentration (µM) 0 10 50 100 500 Lead concentration (µM)

Maize seedlings were prepared like the above-mentioned sunflower seedlings. Both heavy metal ions had an adverse effect on fresh weight and growth of roots and shoots of the seedlings (Figure 8A, B). The effect of heavy metal ions on activities of ALT and AST was also negative. In almost all experimental groups the activities decreased or were similar to control plants. The content Cd(II) and/or Pb(II) of in plants treated with 10 and 50 µM was again under the detection limit of the instrument used as in the case of sunflower seedlings (Figure 8C, D). It follows from the results obtained that content of both metal ions enhanced significantly (*p < 0.05) with increasing concentration of a metal and time of the treatment. Higher content was determined in roots compared to shoots in case of both metal ions.

Sensors 2010, 10 5320

Figure 8. Maize seedlings. Changes in fresh weight, growth, AST and ALT activities in maize seedlings treated with (A) cadmium(II) ions and/or (B) lead(II) ions. Content of (C) cadmium(II) ions and /or (D) lead(II) ions in shoots and roots of the treated seedlings.

maize

shoot * ALT (µkat/l) ALT

AST (µkat/l) AST root

Growth (cm per plant) per (cm Growth * Fresh weight(g per plant) per weight(g Fresh

7 - Cadmium concentration (µM)

Cadmium concentration (µM) concentration plantin Cadmium Experimental Experimental day Cadmium concentration (µM) 0 10 50 100 500 Cadmium concentration (µM)

Fresh weight(g per plant) per weight(g Fresh

AST (µkat/l) AST ALT (µkat/l) ALT

Growth (cm perplant) (cm Growth * Lead concentration (µM)

7 -

(µM) inconcentration plant Lead Experimental Experimental day Lead concentration (µM) 0 10 50 100 500 Lead concentration (µM)

2.6. Cadmium(II) and Lead(II) Ions Monitoring in Wetlands

One of the most important aims of analytical chemistry is the monitoring of heavy metal ions levels in living environment. In situ analysis can bring a plenty of otherwise very hardly pursuable information and data. If we automate whole process of measurement, we have at our disposal a tool for on-line monitoring of environmental targets. It is clear that there is great demand on the ability of these instruments to carry out simultaneous analysis of target analysis. We attempted to detect cadmium(II) and lead(II) ions in rainwater (sampling times from 14th November 2007 to 31st July 2008, sampling place: Boritov, Czech Republic). Well developed and separated voltammetric signals at their characteristic potentials (Cd–0.6 V and Pb–0.4 V) were obtained (inset in Figure 9A). Moreover, we detected zinc(II) ions. The total amount of cadmium and lead was determined in units of µM (Figure 9A). In addition, we analysed water samples obtained from the Zidlochovice area (southern Moravian region, Czech Republic). Three different samples from three different sampling places in the locality were tested. We did not detect some of the monitored heavy metal (Figure 9B, C). In locality 2, we

Sensors 2010, 10 5321 determined the cadmium(II) ions at 10 µM. In locality 3, the cadmium(II) ions concentration was very high and ranged about 110 µM; lead(II) ions were also detected and their content was 5 µM.

Figure 9. (A) Concentration of zinc(II), cadmium(II) and lead(II) ions in rainwater sampled from 14th November 2007 to 31st July 2008 in Boritov, Czech Republic. Concentration of (B) cadmium(II) ions and/or (C) lead(II) ions in water samples obtained from the Zidlochovice area (southern Moravian region, Czech Republic). The metal ions were determined by using homemade potentiostat and CTE as working electrode.

3. Experimental Section

3.1. Chemicals, Materials and pH Measurements

Chemical used was purchased from Sigma Aldrich Chemical Corp. (USA) in ACS purity unless noted otherwise. The stock standard solutions was prepared with ACS water (Sigma-Aldrich, USA) and stored in the dark at –4 °C. Working standard solutions were prepared daily by dilution of the stock solutions. The pH value was measured using WTW inoLab Level 3 with terminal Level 3 (Weilheim, Germany), controlled by the personal computer program (MultiLab Pilot; Weilheim, Germany). The pH-electrode (SenTix-H, pH 0–14/3M KCl) was regularly calibrated by set of WTW buffers (Weilheim, Germany). Deionised water underwent demineralization by reverse osmosis using the

Sensors 2010, 10 5322 instruments Aqua Osmotic 02 (Aqua Osmotic, Tisnov, Czech Republic) and then it was subsequently purified using Millipore RG (Millipore Corp., USA, 18 MΏ–MiliQ water.

3.2. Plant Cultivation

Maize (Zea mays L.) and sunflower (Heliantus annuus L.) were used in our experiments. Maize and sunflower kernels were germinated on wet filter paper in Petri dish in Versatile Environmental Test Chamber (MLR-350 H, Sanyo, Japan) for 7 days in dark at a temperature 23.5–25 °C and humidity 71–78%. Before germination, CdCl2 and/or Pb(NO3)2 were added to Petri dish with kernels in the following concentrations 0, 10, 50, 100 and 500 µM. Kernels germinated without heavy metals additions were used as a control. Seedlings of each concentration were harvested at the end of the treatment (7th day) and their roots were rinsed three times in distilled water and 0.5 M EDTA. In addition, each harvested seedling was divided into shoots and roots.

3.3. Sample Preparation

Weighed plant tissues (approximately 0.2 g) were transferred to a test-tube, and liquid nitrogen was added. The samples were frozen to disrupt the cells. The frozen sample was transferred to a mortar and ground for 1 minute. Then, 1,000 μL of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.2) was added to the mortar, and the sample was ground for 5 minutes. The homogenate was transferred to a new test-tube. The mixture was homogenised by shaking on a Vortex–2 Genie (Scientific Industries, New York, USA) at 4 °C for 30 minutes. The homogenate was centrifuged (14,000 g) for 30 minutes at 4 °C using a Universal 32 R centrifuge (Hettich-Zentrifugen GmbH, Tuttlingen, Germany). Before the analysis the supernatant was filtered through a membrane filter (0.45 μm Nylon filter disk, Millipore, Billerica, Mass., USA).

3.4. Automated Spectrometric Measurements

Spectrometric measurements were carried using an automated chemical analyser BS-200 (Mindray, China). Reagents and samples were placed on cooled sample holder (4 °C) and automatically pipetted directly into plastic cuvettes. Incubation proceeded at 37 °C. Mixture was consequently stirred. The washing steps by distilled water (18 mΩ) were done in the midst of the pipetting. Apparatus was operated using software BS-200 (Mindray, China) [46,47].

3.4.1. Determination of ALT (AST) activity

We pipetted 250 µL of substrate consisting of 0.2 M DL-α-alanine (L-aspartate) and 2 mM 2-oxoglutarate in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) at 37 °C to 50 µl of plant substrate in a plastic microtube. The resulting mixture was incubated at 37 °C for 60 minutes. After that 250 µL of 2,4-dinitrophenylhydrazine in 1 M hydrochloric acid was added to the mixture. The microtube was carefully stirred and loaded into an automatic biochemical analyzer BS-200 (Mindray, China). Experimental parameters of BS-200 were as follows: 30 µL of the previously prepared mixture was pipitted to cuvette and incubated at 37 °C for 20 minutes. Further, 180 µL of 1 M NaOH was added. Ten minutes later, the absorbance was measured at 510 nm.

Sensors 2010, 10 5323

3.5. Autolab

Differential pulse voltammetric measurements were performed with 747 VA Stand instrument connected to 746 VA Trace Analyzer and 695 Autosampler (Metrohm, Switzerland), using a standard cell with three electrodes. The three-electrode system consisted of hanging mercury drop electrode (HMDE) as working electrode, an Ag/AgCl/3 M KCl reference electrode and a glassy carbon auxiliary electrode. For smoothing and baseline correction the software GPES 4.9 supplied by EcoChemie was employed. Acetate buffer (0.2 M CH3COOH + 0.2 M CH3COONa) was used as the supporting electrolyte. The measurements were performed at room temperature.

3.6. PalmSens

Differential pulse voltammetric measurements were performed with PalmSens instrument connected to PC (PalmSens, The Netherlands), using a miniaturised cell with three electrodes. The three-electrode system consisted of SPE and/or CTE as working electrode, an miniaturized Ag/AgCl/3 M KCl reference electrode (CH Instruments, USA) and a platinum wire auxiliary electrode. For smoothing and baseline correction the PalmSens software supplied by PalmSens was employed. The supporting electrolytes as acetate buffer (0.2 M CH3COOH + 0.2 M CH3COONa) were used according to Vacek et al. [48]. The measurements were carried in low volume plastic cell (1 mL of supporting electrolyte) at room temperature.

3.7. Homemade Potentiostat

The potenciostat was designed at Brno University of Technology, Czech Republic. The chip was designed using AMIS CMOS 0.7 µm technology and fabricated under the Europractice program. Memory cells of 48 bytes were implemented with the potentiostat using VERILOG [45]. The integrated measurement system has two sections. Analogue section is designed for regulation of the potential and for measuring current (1 nA to 10 mA). Digital part includes PROM memory, control logic, multiplexers and shift registers. Specification of the type, series and calibration data of the sensor are stored in the PROM of the chip. This apparatus consists of basic plate on which the connector TX721 1115 with 2.54 mm pin spacing and the connector 0039532035 from the manufacturer Molex with pin spacing 1.25 mm are placed. The whole microchip is powered by 5 V. The designed analogue ground is at potential of 2.5 V inside the microchip which provides ±2.5 V to supply the analogue part (Figure 5). The instrument is controlled by the computer program for cyclic and differential pulse voltammetry. The three-electrode system consisted of SPE and/or CTE as working electrode, an Ag/AgCl/3 M KCl reference electrode (Metrohm, Switzerland) and carbon auxiliary electrode. Measurements were carried out with the same standard cell as for Autolab potentiostat. The supporting electrolytes as acetate buffer (0.2 M CH3COOH + 0.2 M CH3COONa) were used. The measurements were performed at room temperature.

3.8. Fabrication of Screen Printed Electrodes

A screen-printed working electrode was fabricated using standard thick-film cermet paste on an alumina substrate with dimension 25.4 × 7.2 mm. Paste used for leads and contact pads was AgPdPt

Sensors 2010, 10 5324 based paste type ESL 9562-G (ESL Electroscience, UK). The working electrode was fabricated from carbon paste BQ-221 (DuPont, USA). Isolation has been made from dielectric paste ESL 4913-G (ESL Electroscience, UK).

3.9. Biotope Knizeci Forest and Rainfall Water

Wetland biotope originated during recultivation interventions nearby Nosislav (Czech Republic) in 1998. The samples of water were collected in habitat to monitor heavy metal content. Rainfall water was sampled in Boritov, Czech Republic.

3.10. Descriptive Statistics

Data were processed using MICROSOFT EXCEL® (USA) and STATISTICA.CZ Version 8.0 (Czech Republic). Results are expressed as mean ± standard deviation (S.D.) unless noted otherwise (EXCEL®). Statistical significances of the differences were determined using STATISTICA.CZ. Differences with p < 0.05 were considered significant and were determined by using of one way ANOVA test (particularly Scheffe test), which was applied for means comparison.

4. Conclusions

In spite of the fact the capability and sensitivity of analytical instrumentation have increased in recent years, the routine determination of trace metals in complex media, such as lake water, is still difficult [49]. There are at least two challenging areas in trace metal analysis, being the speciation of inorganic and organic forms; and the trace and ultra trace determination in complex matrices, such as biological fluids and tissues, environmental materials and oils. For these purposes low cost and readily portable sensors and biosensors can be used [23-26,50-60]. In the present study we report on the use of several electrochemical instruments to detect cadmium(II) and lead(II) ions. Considering the fact that we used a homemade micropotentiostat and carbon tips as a working electrode, we proposed an easy-to-use and low cost apparatus still sensitive enough to analyse real samples such as tissues of plants and waters.

Acknowledgements

Financial support from MSMT INCHEMBIOL 0021622412, GACR 522/07/0692, GACR 204/09/H002 and GACR 102/08/1546 is greatly acknowledged. The authors wish to express their thanks to Tomas Trnka for technical assistance.

Sensors 2010, 10 5325

References

1. Di Tioppi, S.L.; Gabbrielli, R. Response to cadmium in higher plants. Environ. Exp. Bot. 1999, 41, 105-130. 2. Petrek, J.; Baloun, J.; Vlasinova, H.; Havel, L.; Adam, V.; Vitecek, J.; Babula, P.; Kizek, R. Image analysis and activity of intracellular esterases as new analytical tools for determination of growth and viability of embryonic cultures of spruce (Picea sp.) treated with cadmium. Chem. Listy 2007, 101, 569-577. 3. Supalkova, V.; Huska, D.; Diopan, V.; Hanustiak, P.; Zitka, O.; Stejskal, K.; Baloun, J.; Pikula, J.; Havel, L.; Zehnalek, J.; Adam, V.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Kizek, R. Electroanalysis of plant thiols. Sensors 2007, 7, 932-959. 4. Supalkova, V.; Petrek, J.; Baloun, J.; Adam, V.; Bartusek, K.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Diopan, V.; Havel, L.; Kizek, R. Multi-instrumental investigation of affecting of early somatic embryos of spruce by cadmium(II) and lead(II) ions. Sensors 2007, 7, 743-759. 5. Zehnalek, J.; Adam, V.; Kizek, R. Influence of heavy metals on production of protecting compounds in agriculture plants. Lis. Cukrov. Reparske 2004, 120, 222-224. 6. Zehnalek, J.; Vacek, J.; Kizek, R. Application of higher plants in phytoremetiation of heavy metals. Lis. Cukrov. Reparske 2004, 120, 220-221. 7. Soylak, M.; Narin, I.; Divrikli, U.; Saracoglu, S.; Elci, L.; Dogan, M. Preconcentration-separation of heavy metal ions in environmental samples by membrane filtration-atomic absorption spectrometry combination. Anal. Lett. 2004, 37, 767-780. 8. Sneddon, J.; Vincent, M.D. ICP-OES and ICP-MS for the determination of metals: Application to oysters. Anal. Lett. 2008, 41, 1291-1303. 9. Ferreira, S.L.C.; de Andrade, J.B.; Korn, M.D.A.; Pereira, M.D.; Lemos, V.A.; dos Santos, W.N.L.; Rodrigues, F.D.; Souza, A.S.; Ferreira, H.S.; da Silva, E.G.P. Review of procedures involving separation and preconcentration for the determination of cadmium using spectrometric techniques. J. Hazard. Mater. 2007, 145, 358-367. 10. Pyrzynska, K. Online sample pretreatment systems for determination of cadmium by the ETAAS method. Crit. Rev. Anal. Chem. 2007, 37, 39-49. 11. Davis, A.C.; Wu, P.; Zhang, X.F.; Hou, X.D.; Jones, B.T. Determination of cadmium in biological samples. Appl. Spectrosc. Rev. 2006, 41, 35-75. 12. Yantasee, W.; Lin, Y.; Hongsirikarn, K.; Fryxell, G.E.; Addleman, R.; Timchalk, C. Electrochemical sensors for the detection of lead and other toxic heavy metals: The next generation of personal exposure biomonitors. Environ. Health Perspect. 2007, 115, 1683-1690. 13. Korn, M.D.A.; dos Santos, D.S.S.; Welz, B.; Vale, M.G.R.; Teixeira, A.P.; Lima, D.D.; Ferreira, S.L.C. Atomic spectrometric methods for the determination of metals and metalloids in automotive fuels―A review. Talanta 2007, 73, 1-11. 14. Korn, M.D.A.; de Andrade, J.B.; de Jesus, D.S.; Lemos, V.A.; Bandeira, M.; dos Santos, W.N.L.; Bezerra, M.A.; Amorim, F.A.C.; Souza, A.S.; Ferreira, S.L.C. Separation and preconcentration procedures for the determination of lead using spectrometric techniques: A review. Talanta 2006, 69, 16-24. 15. Shaw, M.J.; Haddad, P.R. The determination of trace metal pollutants in enviromental matrices using ion chromatography. Environ. Int. 2004, 30, 403-431. 16. Lin, T.J.; Chung, M.F. Using monoclonal antibody to determine lead ions with a localized surface plasmon resonance fiber-optic biosensor. Sensors 2008, 8, 582-593.

Sensors 2010, 10 5326

17. Lewen, N.; Mathew, S.; Schenkenberger, M.; Raglione, T. A rapid ICP-MS screen for heavy metals in pharmaceutical compounds. J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 35, 739-752. 18. Szlyk, E.; Szydlowska-Czerniak, A. Determination of cadmium, lead, and copper in margarines and butters by galvanostatic stripping chronopotentiometry. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4064-4071. 19. Mikkelsen, O.; Schroder, K.H. Amalgam electrodes for electroanalysis. Electroanalysis 2003, 15, 679-687. 20. May, L.M.; Russell, D.A. Novel determination of cadmium ions using an enzyme self-assembled monolayer with surface plasmon resonance. Anal. Chim. Acta 2003, 500, 119-125. 21. Pei, J.H.; Tercier-Waeber, M.L.; Buffle, J. Simultaneous determination and speciation of zinc, cadmium, lead, and copper in natural water with minimum handling and artifacts, by voltammetry on a gel-integrated microelectrode array. Anal. Chem. 2000, 72, 161-171. 22. Fernandez-Bobes, C.; Fernandez-Abedul, M.T.; Costa-Garcia, A. Anodic stripping of heavy metals using a hanging mercury drop electrode in a flow system. Electroanalysis 1998, 10, 701-706. 23. Adam, V.; Hanustiak, P.; Krizkova, S.; Beklova, M.; Zehnalek, J.; Trnkova, L.; Horna, A.; Sures, B.; Kizek, R. Palladium biosensor. Electroanalysis 2007, 19, 1909-1914. 24. Adam, V.; Petrlova, J.; Potesil, D.; Zehnalek, J.; Sures, B.; Trnkova, L.; Jelen, F.; Kizek, R. Study of metallothionein modified electrode surface behavior in the presence of heavy metal ions-biosensor. Electroanalysis 2005, 17, 1649-1657. 25. Krizkova, S.; Adam, V.; Petrlova, J.; Zitka, O.; Stejskal, K.; Zehnalek, J.; Sures, B.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Kizek, R. A suggestion of electrochemical biosensor for study of platinum(II)-DNA interactions. Electroanalysis 2007, 19, 331-338. 26. Petrlova, J.; Potesil, D.; Zehnalek, J.; Sures, B.; Adam, V.; Trnkova, L.; Kizek, R. Cisplatin electrochemical biosensor. Electrochim. Acta 2006, 51, 5169-5173. 27. Wu, K.B.; Hu, S.S.; Fei, J.J.; Bai, W. Mercury-free simultaneous determination of cadmium and lead at a glassy carbon electrode modified with multi-wall carbon nanotubes. Anal. Chim. Acta 2003, 489, 215-221. 28. Yantasee, W.; Lin, Y.H.; Fryxell, G.E.; Busche, B.J. Simultaneous detection of cadmium, copper, and lead using a carbon paste electrode modified with carbamoylphosphonic acid self-assembled monolayer on mesoporous silica (SAMMS). Anal. Chim. Acta 2004, 502, 207-212. 29. Hu, C.G.; Wu, K.B.; Dai, X.; Hu, S.S. Simultaneous determination of lead(II) and cadmium(II) at a diacetyldioxime modified carbon paste electrode by differential pulse stripping voltammetry. Talanta 2003, 60, 17-24. 30. Palchetti, I.; Cagnini, A.; Mascini, M.; Turner, A.P.F. Characterisation of screen-printed electrodes for detection of heavy metals. Mikrochim. Acta 1999, 131, 65-73. 31. Guell, R.; Aragay, G.; Fontas, C.; Antico, E.; Merkoci, A. Sensitive and stable monitoring of lead and cadmium in seawater using screen-printed electrode and electrochemical stripping analysis. Anal. Chim. Acta 2008, 627, 219-224. 32. Roa, G.; Ramirez-Silva, M.T.; Romero-Romo, M.A.; Galicia, L. Determination of lead and cadmium using a polycyclodextrin-modified carbon paste electrode with anodic stripping voltammetry. Anal. Bioanal. Chem. 2003, 377, 763-769.

Sensors 2010, 10 5327

33. Cooper, J.; Bolbot, J.A.; Saini, S.; Setford, S.J. Electrochemical method for the rapid on site screening of cadmium and lead in soil and water samples. Water Air Soil Pollut. 2007, 179, 183-195. 34. Palchetti, H.; Laschi, S.; Mascini, M. Miniaturised stripping-based carbon modified sensor for in field analysis of heavy metals. Anal. Chim. Acta 2005, 530, 61-67. 35. Locatelli, C. Peak area: The instrumental datum to improve the determination at ultratrace level concentration of mercury(II) at gold electrode. Electroanalysis 2008, 20, 1330-1338. 36. Locatelli, C. Voltammetric analysis of trace levels of platinum group metals principles and applications. Electroanalysis 2007, 19, 2167-2175. 37. Locatelli, C. Voltammetric peak area as instrumental datum. A possibility to improve the determination at ultratrace level concentration of platinum group metals (PGMs) and lead― Application to particulate matter. Electroanalysis 2007, 19, 445-452. 38. Locatelli, C. Possible interference in the sequential voltammetric determination at trace and ultratrace concentration level of platinum group metals (PGMs) and lead―Application to environmental matrices. Electrochim. Acta 2006, 52, 614-622. 39. Locatelli, C. Simultaneous square wave, stripping voltammetric determination of platinum group metals (PGMs) and lead at trace and ultratrace concentration level―Application to surface water. Anal. Chim. Acta 2006, 557, 70-77. 40. Locatelli, C.; Melucci, D.; Torsi, G. Determination of platinum-group metals and lead in vegetable environmental bio-monitors by voltammetric and spectroscopic techniques: critical comparison. Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 1567-1573. 41. Locatelli, C. Overlapping voltammetric peaks―An analytical procedure for simultaneous determination of trace metals. Application to food and environmental matrices. Anal. Bioanal. Chem. 2005, 381, 1073-1081. 42. Paneli, M.G.; Voulgaropoulos, A. Applications of Adsorptive Stripping Voltammetry in the Determination of Trace and Ultratrace Metals. Electroanalysis 1993, 5, 355-373. 43. Wang, J. Analytical Electrochemistry; VCH Publishers: New York, NY, USA, 1994. 44. White, N.M.; Turner, J.D. Thick-film sensors: Past, present and future. Meas. Sci. Technol. 1997, 8, 1-20. 45. Fujcik, L.; Prokop, R.; Prasek, J.; Hubalek, J.; Vrba, R. New CMOS potentiostat as ASIC for several electrochemical microsensors construction. Microelectron. Int. 2009, 27, 3-10. 46. Adam, V.; Zitka, O.; Dolezal, P.; Zeman, L.; Horna, A.; Hubalek, J.; Sileny, J.; Krizkova, S.; Trnkova, L.; Kizek, R. Lactoferrin isolation using monolithic column coupled with spectrometric or micro-amperometric detector. Sensors 2008, 8, 464-487. 47. Krystofova, O.; Shestivska, V.; Galiova, M.; Novotny, K.; Kaiser, J.; Zehnalek, J.; Babula, P.; Opatrilova, R.; Adam, V.; Kizek, R. Sunflower plants as bioindicators of environmental pollution with lead(II) ions. Sensors 2009, 9, 5040-5058. 48. Vacek, J.; Petrek, J.; Kizek, R.; Havel, L.; Klejdus, B.; Trnkova, L.; Jelen, F. Electrochemical determination of lead and glutathione in a plant cell culture. Bioelectrochemistry 2004, 63, 347-351. 49. Burham, N.; Abdel-Azeem, S.M.; El-Shahat, M.F. Separation and determination of trace amounts of zinc, lead, cadmium and mercury in tap and Qaroun lake water using polyurethane foam functionalized with 4-hydroxytoluene and 4-hydroxyacetophenone. Anal. Chim. Acta 2006, 579, 193-201.

Sensors 2010, 10 532 8

50. Petrlova, J.; Krizkova, S.; Zitka, O.; Hubalek, J.; Prusa, R.; Adam, V.; Wang, J.; Beklova, M.; Sures, B.; Kizek, R. Utilizing a chronopotentiometric sensor technique for metallothionein determination in fish tissues and their host parasites. Sens. Actuator B-Chem. 2007, 127, 112-119. 51. Hubalek, J.; Hradecky, J.; Adam, V.; Krystofova, O.; Huska, D.; Masarik, M.; Trnkova, L.; Horna, A.; Klosova, K.; Adamek, M.; Zehnalek, J.; Kizek, R. Spectrometric and voltammetric analysis of urease-Nickel nanoelectrode as an electrochemical sensor. Sensors 2007, 7, 1238-1255. 52. Supalkova, V.; Petrek, J.; Havel, L.; Krizkova, S.; Petrlova, J.; Adam, V.; Potesil, D.; Babula, P.; Beklova, M.; Horna, A.; Kizek, R. Electrochemical sensors for detection of acetylsalicylic acid. Sensors 2006, 6, 1483-1497. 53. Huska, D.; Zitka, O.; Adam, V.; Beklova, M.; Krizkova, S.; Zeman, L.; Horna, A.; Havel, L.; Zehnalek, J.; Kizek, R. A sensor for investigating the interaction between biologically important heavy metals and glutathione. Czech J. Anim. Sci. 2007, 52, 37-43. 54. Vitecek, J.; Petrlova, J.; Petrek, J.; Adam, V.; Potesil, D.; Havel, L.; Mikelova, R.; Trnkova, L.; Kizek, R. Electrochemical study of S-nitrosoglutathione and nitric oxide by carbon fibre NO sensor and cyclic voltammetry―possible way of monitoring of nitric oxide. Electrochim. Acta 2006, 51, 5087-5094. 55. Verma, N.; Singh, M. Biosensors for heavy metals. Biometals 2005, 18, 121-129. 56. Rudnitskaya, A.; Legin, A.; Seleznev, B.; Kirsanov, D.; Vlasov, Y. Detection of ultra-low activities of heavy metal ions by an array of potentiometric chemical sensors. Microchim. Acta 2008, 163, 71-80. 57. Hwang, G.H.; Han, W.K.; Park, J.S.; Kang, S.G. Determination of trace metals by anodic stripping voltammetry using a bismuth-modified carbon nanotube electrode. Talanta 2008, 76, 301-308. 58. Zhu, L.D.; Tian, C.Y.; Yang, R.L.; Zhai, J.L. Anodic stripping voltammetric determination of lead in tap water at an ordered mesoporous carbon/Nafion composite film electrode. Electroanalysis 2008, 20, 527-533. 59. Adami, M.; Marco, S.; Nicolini, C. A potentiometric stripping analyzer for multianalyte screening. Electroanalysis 2007, 19, 1288-1294. 60. Li, G.; Wan, C.D.; Ji, Z.M.; Wu, K.B. An electrochemical sensor for Cd2+ based on the inducing adsorption ability of I. Sens. Actuator B-Chem. 2007, 124, 1-5.

© 2010 by the authors; licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an Open Access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

5.3 Bioindikace znečištění těžkými kovy pomocí rostlin

5.3.1 Bioindikace znečištění olovnatými ionty

KRYSTOFOVA, O.; SHESTIVSKA, V.; GALIOVA, M.; NOVOTNY, K.; KAISER, J.; ZEHNALEK, J.; BABULA, P.; OPATRILOVA, R.; ADAM, V.; KIZEK, R. Sunflower plants as bioindicators of environmental pollution with lead(II) ions.

Sensors, 2009, roč. 9. č. 7, s. 5040-5058. ISSN 1424-8220. IF = 1.821

Podíl autorky Kryštofová O.: 30 % textové části práce a 80 % experimentální práce

V této práci byl studován vliv olova na rostliny Helianthus annuus L. za využití multiinstrumentálního přístupu. Navíc byla předvedena možnost aplikace metody spektrometrie laserem indukovaného mikroplazmatu (LIBS) pro monitoring akumulace olova a hořčíku u různých typů rostlinného materiálu. Využití LIBS pro stanovení iontů kovů bylo demonstrováno na listech Helianthus annuus L., Zea mays L. a Lactuca sativa L..

Rostliny Helianthus annuus L. byly vystaveny působení chelátu olova v různých koncentracích (0,10,50,100,500 µM) po dobu osmi dnů. Z námi získaných výsledků vyplývá, že celkové množství proteinů díky těžkým kovům dramaticky snižuje jak v nadzemních tak kořenových částech rostlin. Při sledování aktivity tří vybraných enzymů (AST, ALT, ureasa) bylo možné pozorovat snížení aktivity AST a ALT v nadzemních částech rostlin a naopak zvýšení aktivity AST a ALT v kořenových částech. V případě ureázové aktivity byla pozorována mírně zvýšená aktivita enzymu jak v nadzemní tak kořenové části rostliny. Množství cysteinu, GSH, GSSG a PC2 bylo rozdílné v nadzemní a kořenové části rostlin. Množství cysteinu se v kořenové části rostlin mírně snižoval s délkou expozice rostlin. Množství GSH se zvyšovalo jak v nadzemních tak kořenových částech rostliny v závislosti na aplikované koncentraci

105

chelátu olova a době expozice. V nadzemních částech rostlin byl jasně zřetelný nárůst hladiny GSSG.

Prostorová distribuce olova a hořčíku získaná ablací vzorku listu Helianthus annuus L. exponovaného 50 µmol·l-1 chelátu olova ukazuje, že olovo se soustřeďuje zejména kolem hlavních cévních svazků listů, zatím co rozložení hořčíku je poměrně homogenní. Na základě získaných dat jsme zjistili, že metoda LIBS je aplikovatelná na monitorování mechanismů transportu a uskladnění olova a hořčíku v listech rostlin vystavených vlivu iontů těžkých kovů.

106

Sensors 2009, 9, 5040-5058; doi:10.3390/s90705040 OPEN ACCESS sensors ISSN 1424-8220 www.mdpi.com/journal/sensors Article Sunflower Plants as Bioindicators of Environmental Pollution with Lead (II) Ions

Olga Krystofova 1, Violetta Shestivska 1,2, Michaela Galiova 3, Karel Novotny 3, Jozef Kaiser 4, Josef Zehnalek 1, Petr Babula 5, Radka Opatrilova 5, Vojtech Adam 1,6 and Rene Kizek 1,*

1 Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic 2 Department of Plant Biology, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic 3 Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlarska 2, CZ-611 37 Brno, Czech Republic 4 Institute of Physical Engineering, Faculty of Mechanical Engineering, Brno University of Technology, Technicka 2896/2, CZ-616 69 Brno, Czech Republic 5 Department of Natural Drugs, Faculty of Pharmacy, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences, Palackeho 1-3, CZ-612 42 Brno, Czech Republic 6 Department of Animal Nutrition and Forage Production, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic

* Author to whom correspondence should be addressed; E-Mail: [email protected]

Received: 31 May 2009; in revised form: 22 June 2009 / Accepted: 24 June 2009 / Published: 25 June 2009

Abstract: In this study, the influence of lead (II) ions on sunflower growth and biochemistry was investigated from various points of view. Sunflower plants were treated with 0, 10, 50, 100 and/or 500 µM Pb-EDTA for eight days. We observed alterations in growth in all experimental groups compared with non-treated control plants. Further we determined total content of proteins by a Bradford protein assay. By the eighth day of the experiment, total protein contents in all treated plants were much lower compared to control. Particularly noticeable was the loss of approx. 8 µg/mL or 15 µg/mL in shoots or roots of plants treated with 100 mM Pb-EDTA. We also focused our attention on the activity of alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) and urease. Activity of the enzymes increased with increasing length of the treatment and applied concentration Sensors 2009, 9 5041

of lead (II) ions. This increase corresponds well with a higher metabolic activity of treated plants. Contents of cysteine, reduced glutathione (GSH), oxidized glutathione (GSSG) and phytochelatin 2 (PC2) were determined by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Cysteine content declined in roots of plants with the increasing time of treatment of plants with Pb-EDTA and the concentration of toxic substance. Moreover, we observed ten times higher content of cysteine in roots in comparison with shoots. The observed reduction of cysteine content probably relates with its utilization for biosynthesis of GSH and phytochelatins, because the content of GSH and PC2 was similar in roots and shoots and increased with increased treatment time and concentration of Pb- EDTA. Moreover, we observed oxidative stress caused by Pb-EDTA in roots where the GSSG/GSH ratio was about 0.66. In shoots, the oxidative stress was less distinctive, with a GSSG/GSH ratio 0.14. We also estimated the rate of phytochelatin biosynthesis from the slope of linear equations plotted with data measured in the particular experimental group. The highest rate was detected in roots treated with 100 µM of Pb-EDTA. To determine heavy metal ions many analytical instruments can be used, however, most of them are only able to quantify total content of the metals. This problem can be overcome using laser induced breakdown spectroscopy, because it is able to provide a high spatial-distribution of metal ions in different types of materials, including plant tissues. Data obtained were used to assemble 3D maps of Pb and Mg distribution. Distribution of these elements is concentrated around main vascular bundle of leaf, which means around midrib.

Keywords: phytoremediation; heavy metals; sunflower; lead ions; high performance liquid chromatography with electrochemical detection; spectrometry; laser induced breakdown spectroscopy

1. Introduction

Environmental remediation deals with the removal of contaminants from soil, groundwater, sediment, surface water etc. for the general protection of human health and the environment [1]. Remediation processes can be expensive, as the are mostly ex-situ methods involving excavation of impacted soils and subsequent treatment at the surface. Therefore new, efficient, inexpensive and non- environmentally disruptive technologies are still developing. One of the groups of such new technologies is called bioremediation. It involves the treatment of environmental problems through organisms. Microorganisms (e.g., Desulfomonile, Clostridium, Pseudomonas, Acinetobacter) and plants (e.g., Betula, Populus) are most commonly used for these purposes [2-7]. If plants are used, we call this process phytoremediation [1,8-10]. A range of processes mediated by plants are useful in treating environmental problems. Plants can chemically modify toxic substances as a direct result of plant metabolism (phytotransformation), can reduce the mobility of substances in the environment (phytostabilization) or uptake and concentrate substances from the environment into the plant biomass (phytoextraction). The scheme of various ways how to a plant metabolizes or deposit the pollutant is shown in Figure 1.

Sensors 2009, 9 5042

Figure 1. Phytoremediation can occur through a series of complex interactions between plants, microbes, and the soil, including accumulation, hyperaccumulation, exclusion, volatilization, and degradation of the target pollutant. Plants also stabilize mobile contaminated sediments by forming dense root mats inside soil.

Volatilization Transpiration Mercury, Selenium

Accumulation

Heavy metals, Radionuclides, Metabolites

Rhizosphaeric metabolism

Metals, Organics, Radionuclides

Inorganics Organics Heavy metals, Radionuclides Chlorinated hydrocarbons

Most toxic substances (organic pollutants, heavy metals) come from anthropogenic activities such as mining, traffic, heavy industry, etc. [11-13]. Contrary to organic pollutants, heavy metals cannot be degraded or destroyed. To a small extent they enter our bodies via food, drinking water and air. As trace elements, some heavy metals (e.g., copper, selenium, zinc) are essential to maintain the metabolism of the human body. However, others such as cadmium, lead, and mercury are toxic at all. At higher concentrations both groups of heavy metals (toxic and essential) can lead to poisoning [13]. Heavy metals are also dangerous because they tend to bioaccumulate. Lead is one of the most dangerous and toxic heavy metals. Levels of lead in the environment are not stable and vary according to industrial production, urbanization, climate changes and many other factors [14]. The levels of lead in the environment vary between 4 and 20 mg/g of dust. Uncontaminated waters contain lead in concentrations ranging from 0.001 to 0.06 mg/L. In soils, levels of lead reach 5 to 30 mg per kg of soil. When lead is added into petrol as an additive, the highest lead levels are determined on the surfaces of leaves, from where lead enters the food chain, as well as soil or water. Lead is present in soils as salts in soluble as well as insoluble forms. Lead contamination in the soil is known to inhibit seed germination [15,16]. The inhibition of germination by exogenously supplied Pb2+ is a possible effect of interference with some important enzymes involved in the process. Photosynthesis is considered as one of the metabolic processes most sensitive to Pb2+ toxicity [17]. Closing of the stomata, disruption of the chloroplastic organization, change in the metabolites of photosynthesis and replacement of essential ions like magnesium are the main effects on photosynthesis of lead toxicity [14,18-21]. The

Sensors 2009, 9 5043 metal has also been reported to inhibit photosynthesis in isolated chloroplasts. There have been also published data reporting on inhibition of enzymes crucial for nitrogen assimilation [14].

Figure 2. Experimental arrangement of LIBS: 1 – Nd:YAG laser, 2 – modulator of second harmonic frequency, 3 – periscope, 4 – CCD camera, 5 – ablation chamber, 6 – fibre optic system, 7 – monochromator, 8 – ICCD camera.

As we mentioned above for the particular example of lead ions, there are many mechanisms and pathways which can be affected by heavy metals [22-25]. Protective mechanisms of a plant cell against the toxic effects of heavy metals mainly involve synthesis of compounds rich in cysteine called phytochelatins. Their synthesis comes from the most abundant thiol – reduced glutathione. To detect these compounds many various methods and techniques have been employed [23,24,26-30], including sensors and biosensors [31-33]. However, uptake and transport as well as storage of heavy metals through plant tissues remain still unclear. To consider whether a specific plant species is able or not able to remediate the polluted environment, not only heavy metals content in the plant tissues, but also the distribution of such metal ions in the tissues must be analysed. Analytical methods and instruments for detection of lead (II) ions have been reviewed several times [34-38]. The diagnostic techniques enabling monitoring high spatial- and lateral-distribution of elements within different plant structures include mainly X-ray imaging methods [39-41]. X-ray microscopy and micro-radiography investigations usually make use of soft X-rays generated by plasma laser, microfocus X-ray sources and synchrotron radiation [42]. Although the X-ray radiation based methods are relatively high-cost and availability of the experimental apparatus is limited due to possibility of “in-situ” analysis only, it offers new aspects for studying the distribution of heavy metals. However, X-ray imaging methods are intensively investigated in our laboratories; recently we have been focusing also on the realization of spatially-resolved spectro-chemical analysis by utilizing laser-ablation based techniques. Laser induced breakdown spectroscopy (LIBS, Figure 2) is a type of atomic emission spectroscopy which utilises a highly energetic laser pulse as the excitation source and is able to provide high spatial- distribution of metal ions in different types of materials [43-45]. The character of the ablative process

Sensors 2009, 9 5044 depends on the features of the laser used (wavelength, pulse duration, power and energetic profile of the rays), surrounding atmosphere and the features of the sample itself (matrix, absorption characteristics, its structure) [46]. LIBS method is one of analytical instruments which makes qualitative and quantitative analysis and also monitoring of element distribution in different types of samples possible. The main advantage of this method is that it requires no, or minimal sample pretreatment and enables multi-elemental analysis with high three-dimensional resolution. A limiting factor is especially the diameter of laser ray. In this study, the influence of lead (II) ions on sunflower plants (Figure 3) was investigated from various points of view. We aimed our study at common growth parameters, morphological changes, total protein content, activity of certain enzymes, level of stress induced thiols and spatial distribution of lead.

Figure 3. Pictures of sunflower plants in the second, sixth and eighth experimental day after Pb-EDTA application (0, 10, 50, 100 and 500 µM). 2nd day

6th day

8th day 10 cm 10

0 µM 10 µM 50 µM 100 µM 500 µM

Sensors 2009, 9 5045

2. Results and Discussion

2.1. Morphological changes

Lead is a poisonous metal that has many adverse effects on plants and animals. Sunflower plants were treated with 0, 10, 50, 100 and/or 500 µM Pb-EDTA for eight days. We observed alterations in growth in all experimental groups compared with non-treated control plants. Plants exposed to lead (II) ions grew faster in comparison with control plants, except for the highest applied concentration. This phenomenon probably relates to the stimulatory effects of the presence of Pb-EDTA, because control plants were cultivated in distilled water only, where no other nutrients are present. In addition we observed chlorosis on plants treated with the highest concentration (Figure 3). When we compared the fresh weight of plants treated with lead (II) ions with the non-treated experimental group, it was possible to clearly notice the effect of applied Pb-EDTA concentration on the aerial parts of plants, except for the highest applied concentration (Figure 4 A).

Figure 4. Changes of (A) fresh and (B) dry weights of sunflower plants exposed to Pb- EDTA. Dry mass was obtained by drying to the constant weight at 105 °C in the oven. All data were obtained by subtraction from control plants. The experiment was carried in triplicates.

A B Shoot 0.4 Shoot 0.04

0.02 0.3 0.00

0.2 -0.02 -0.04 10 µM Pb2+ 0.1 2+ -0.06 50 µM Pb 100µM Pb2+ -0.08 0.0 500µM Pb2+ -0.10 0.4 10 µM Pb2+ 0.010

2+ 0.3 50 µM Pb 0.005 Fresh weight (g) weight Fresh 2+ 0.2 100µM Pb

Dry weight (g) 0.000 500µM Pb2+ 0.1 -0.005 0 -0.010 -0.1 -0.015 -0.2 Root Root

-0.3 -0.020

-0.4 -0.025 2468 2468 Length of treatment (d) Length of treatment (d)

Sensors 2009, 9 5046

Nevertheless, the adverse effect of lead (II) ions is shown on dependence of dry weight on length of the treatment and applied concentration (Figure 3B). Determined change is probably connected with increased water uptake of plants exposed to stress caused by heavy metals. This hypothesis is supported by results reporting on nuclear magnetic resonance analysis of early somatic embryos clusters [29]. In the case of change in fresh weight of roots, increases by the sixth and eighth day were detected, except for the highest applied concentration. Dry weight of roots decreased, except on the second day of the treatment for all experimental groups (Figure 4 A,B).

2.2. Total protein content

Heavy metals taken up by plants or induce stress reactions, which manifest as enhancements of the levels of certain molecules. Firstly, the level of mRNA is enhanced with subsequent changes in protein profile. Therefore, we determined total content of proteins by a Bradford protein assay. Total content of proteins slightly increased in both aerial parts and roots in the second day. From the fourth day of the treatment, a decrease of total content of proteins occurred. In eighth day of the experiment this loss was approx. 8 µg/mL or 15 µg/mL in shoots or roots of plants treated with 100 mM Pb-EDTA (Figure 5). Total content of proteins is dramatically reduced thanks to the heavy metal ions. This trend matches well with the dry weight dependence (Figures 4 and 5).

Figure 5. Changes in total protein content in sunflower plants exposed to Pb-EDTA. All data were obtained by subtraction from control plants. The experiments were carried out in triplicate. Shoot 2

-2

-4

-6 10 µM Pb2+ 50 µM Pb2+ -8 100µM Pb2+ -1010 500µM Pb2+

0 Total protein content (mg/ml) protein Total -5

-10

-15 Root

-20 2468 Length of treatment (d)

Sensors 2009, 9 5047

2.3. Determination of plant enzymes’ activity

There is still not much available information about the significance of some commonly analyzed enzymes as markers of stress reactions in plants. In several papers, we have demonstrated that some enzymes (such as aminotransferases or urease) can participate in plant stress reactions [22,26,47-51]. Thus, we focused our attention on the activity of alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST) and urease. Transaminases catalyze the transfer of the amino groups of amino acids to 2-oxo- acids. In plants, transaminases participate very effectively in transformations of nitrogen compounds. They are important for the synthesis of amino acids from oxo-acids in the citrate cycle and for other crucial biochemical pathways. They also play key roles in the synthesis of secondary metabolites as well as chlorophyll. In roots AST and ALT activities were increased during the experiments in comparison to control plants (Figure 6). This increase corresponds well with the higher metabolic activity. Urease activity was enhanced in aerial plant parts as well as in roots with increasing length of exposition and applied concentration slightly (data not shown).

Figure 6. Changes of AST and ALT activities in sunflower plants exposed to Pb-EDTA. All data were obtained by subtraction from control plants. The experiment was carried in triplicates.

Shoot AST Shoot ALT 0 0

-2 -0.2

-4 -0.4

-6 -0.6

-8 -0.8 10 µM Pb2+ 10 µM Pb2+ 5 -1016 Root 50 µM Pb2+ 50 µM Pb2+

2+ 2+ 100µM Pb 4 100µM Pb 12 2+ 2+ 500µM Pb Catalytic activity (µkat/l) 500µM Pb

Catalytic activity Catalytic (µkat/l) Root 3 8

4 2

0 1

-4 0 2468 2 4 6 8 Length of treatment (d) Length of treatment (d)

2.4. Content of low molecular mass thiols

Low molecular mass compounds rich in cysteine moieties play a very important role in the ability to withstand or even hyperaccumulate heavy metals ions. Due to this, we paid attention to such compounds. Particularly, the contents of cysteine, reduced glutathione (GSH), oxidized glutathione

Sensors 2009, 9 5048

(GSSG) and PC2 were determined by high performance liquid chromatography with electrochemical detection (Figure 7). Contents of cysteine differed markedly in shoots and roots. Cysteine content declined in the roots of plants as the time of the treatment of plants with Pb-EDTA and concentration of toxic substance increased. Moreover, we observed ten times higher content of cysteine in roots in comparison with shoots. The observed reduction of cysteine content probably relates to its utilization for the biosynthesis of GSH and phytochelatins. Content of GSH was similar in roots and shoots and increased with increasing time of the treatment and concentration of Pb-EDTA (Figure 7). We plotted the dependence with linear regression to estimate the rate of synthesis of GSH. The rate expressed as the slope of the linear equation was 0.531x and 0.635x for roots and shoots, respectively, where “x” is concentration of applied Pb-EDTA.

Figure 7. Changes of cysteine, GSH, GSSG and PC2 contents in sunflower plants exposed to Pb-EDTA. All data were obtained by subtraction from control plants. The experiment was carried out in triplicate.

shoot Cys GSH GSSG PC2

2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 8 root 2+

Cysteine content (µg/g) 10 µM Pb Phytochelatin2 contentPhytochelatin2 (µg/g) 50 µM Pb2+

2+ Oxidized glutathione content (µg/g)

100µM Pb content glutathione Reduced (µg/g) 500µM Pb2+

2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 8 2 4 6 8 Length of treatment (d) Length of treatment (d) Length of treatment (d) Length of treatment (d)

It is a common knowledge that heavy metals induce generation of free oxygen species, which subsequently damage cell compartments (membranes, nucleic acids). Oxygen radicals can be scavenged by various mechanisms inside a cell [52]. Low molecular mass thiols are able to react with oxygen radicals via formation of disulphides. One of the most studied and well known reactions of such type is the redox cycling of GSH into GSSG [53]. In our experiment, GSSG levels gradually increased (Figure 7). We observed oxidative stress caused by Pb-EDTA in roots when the GSSG/GSH ratio was about 0.66. In shoots, the oxidative stress was less distinctive, with a GSSG/GSH ratio of

Sensors 2009, 9 5049

0.14. It follows from the results obtained that only a small part of the up-taken lead(II) ions is transported into shoots (stems, leaves). The content of PC2 in roots and shoots is shown in Figure 7. With increasing time of the treatment and concentration of Pb-EDTA the content was markedly enhanced. Moreover, the ability of plants to withstand oxidative stress caused by heavy metal depends also on rate of phytochelatin biosynthesis. Therefore, we again estimated the rate of phytochelatin biosynthesis via the slope of the linear equations plotted with data measured in each particular experimental group. The highest rate was detected in roots treated with 100 µM of Pb-EDTA (11.200) followed by 50 µM (13.270), 500 µM (7.100) and 10 µM (6.500). Compared to roots, the rate of phytochelatin biosynthesis was lower in shoots. The highest rate was detected in shoots treated with 50 µM of Pb-EDTA (4.600) followed by 100 µM (4.500), 500 µM (4.300) and 10 µM (2.719). It can be concluded that protective metabolic pathways of plants treated with 50 and 100 µM of Pb-EDTA was stimulated to withstand the adverse effect of heavy metal ions.

2.5. Monitoring of lead and magnesium distribution by LIBS

To determine heavy metal ions many analytical instruments can be used, however, most of them are only able to quantify total contents of the metals [38,54-60]. This problem can be overcome using LIBS, because it is able to provide high spatial-distribution of metal ions in different types of materials [19,20,22,42,61,62]. Recently, we published the first experimental data focused on utilization of the LIBS technique for analysis of biological samples exposed to various heavy metals. It was demonstrated that the mentioned techniques are a unique analytical tool that can provide biologically interesting data [61,62]. The laser-generated patterns consisting of precisely ablated micro-craters have been utilized for mapping the lead and magnesium distribution on 4.5 × 2 mm2 leaf sections of sunflower samples. Measurement of optical emission of atoms by ICCD camera was carried out under optimized conditions. A typical LIBS spectrum after application of one laser pulse is shown in Figure 8.

Figure 8. Typical LIBS spectrum after application of one laser pulse to a sample of common sunflower leaf exposed to 0.5 mM Pb-EDTA for 3 days. Intensity (A.U) Intensity

Wavelength (mm)

Pb and Mg lines were identified in the measured spectral range. The analytical line of Pb (I) at 283.31 nm was used for detection of Pb (I). From the emission lines of magnesium, the 277.98 nm

Sensors 2009, 9 5050

Mg (I) analytical line was selected. It was not possible to use other magnesium emission lines due to detector saturation. Subtraction of background was realized and the area under the emission line was calculated for all measurements.

Figure 9. Spatial distribution of lead and magnesium in plant leaves: A – maize (Zea mays), B – sunflower (Helianthus annuus) and C – lettuce (Lactuca sativa) exposed to 0.5 mM Pb-EDTA for 5 days (maize, lettuce) and 3 days (sunflower). Ration scale represents 500 µm, vascular bundles are identified by lines. These plants were exposed to 0.5 mM Pb-EDTA for five days. Distance (mm) Distance Distance (mm) Distance

Distance (mm) Distance (mm) Distance (mm) Distance (mm) Distance

Distance (mm) Distance (mm)

The data were used to assemble 3D Pb and Mg distribution maps. The Pb and Mg distribution in samples of maize leaf was relatively homogenous (Figure 9A). The three-dimensional distribution of Pb and Mg obtained by ablation of sunflower leaf samples exposed to 0.5 mM Pb-EDTA and the

Sensors 2009, 9 5051 ablative patterns are shown in Figure 9B. The midrib is clearly evident in the sample due to distribution of Pb in this area. The distribution of Mg ions in this sample is homogenous, like in maize leaves. In the case of leaf samples of lettuce plant exposed to 0.5 mM Pb-EDTA, the highest content of both elements was determined in the midrib. This fact is clearly shown in Figure 9C. We also investigated the distribution of Pb and Mg in leaf samples of the same plants treated with 1 mM Pb- EDTA (3D maps on the right side in Figure 9). In these samples, we can see a heterogeneous distribution of Mg ions as well as Pb ions. Distribution of these elements is concentrated around the main vascular bundle of leaf, which means around the midrib. In all samples, LIBS measurements were compared with those obtained by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry [41,42,63]. The results obtained were in good agreement. In the view using LIBS for monitoring of element accumulation in plant materials, the instrumentation is supplemented by software, which enables fully automated measurement [46].

3. Material and Methods

3.1. Chemicals

Acetonitrile and methanol (HPLC purity) were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). Urease EC 3.5.1.5 (Jack Beans, type III; 45,000 IU/g) was purchased from Sigma Aldrich (St. Louis,

MI, USA). Standards PC2, PC5 and DesGlyPC with purity higher than 90% were synthesized at Clonestar Biotech (Brno, Czech Republic). All other used chemical were also purchased from Sigma Aldrich, unless noted otherwise. The standard stock solutions (100 µg/mL) were prepared in ACS water (ie, chemicals that meet the specifications of the American Chemical Society) and stored in dark at 4 °C.

3.2. Cultivation of plants and sample preparation

Sunflower plants (Helianthus annuus L., Compositae) were used in our experiments. Sunflower kernels were germinated in the dark on wet filter paper in special vessels at 23 ± 2 °C. After ten days, maize seedlings were placed into vessels containing distilled water and cultivated in a Versatile Environmental Test Chamber (MLR-350 H, Sanyo, Japan) for eight days with 14 h daylight per day (maximal light intensity was about 100 μE/m2s1) at a temperature 23.5–25 °C and humidity 71–78%. After that, Pb-EDTA was added to the cultivation solution at final concentrations of 0, 10, 50, 100 and 500 µM. Plants grown without Pb-EDTA were used as a control. The sunflower plants placed in the vessels that distilled water with addition of Pb-EDTA (0, 10, 50, 100 and 500 µM) were grown for six days. Four plants each were harvested at certain time intervals (2nd, 4th, 6th and 8th day of the experiments), and their roots were rinsed three times in distilled water and 0.5 M EDTA. In addition, each harvested plant was divided into shoots (aerial plant parts) and roots. Fresh weight of the samples was measured immediately after the rinsing by using a Sartorius scale.

Sensors 2009, 9 5052

3.3. Sample preparation for thiol determination

Weighed plant tissues (approximately 0.2 g) were transferred to a test-tube, and liquid nitrogen was added. The samples were frozen to disrupt the cells [48]. The frozen sample was transferred to mortar and ground for 1 min. Then, 1,000 μL of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.2) was added to the mortar, and the sample was grinding for 5 min. The homogenate was transferred to a new test-tube. The mixture was homogenised by shaking on a Vortex–2 Genie (Scientific Industries, New York, USA) at 4 °C for 30 min. The homogenate was centrifuged (14,000 g) for 30 min at 4 °C using a Universal 32 R centrifuge (Hettich-Zentrifugen GmbH, Tuttlingen, Germany). Before the analysis the supernatant was filtered through a membrane filter (0.45 μm Nylon filter disk, Millipore, Billerica, MA, USA).

3.4. High performance liquid chromatography with electrochemical detection

The HPLC-ED system consisted of two solvent delivery pumps operating in the range of 0.001- 9.999 mL·min-1 (Model 582 ESA Inc., Chelmsford, MA), a Metachem Polaris C18A reverse-phase column (150 × 4.6; 3 µm particle size, Varian Inc., CA, USA) and a CoulArray electrochemical detector (Model 5600A, ESA). The electrochemical detector includes three flow cells (Model 6210, ESA, USA). Each cell consists of four analytical cells. One cell contains the working carbon porous electrode, two auxiliary and two reference electrodes. Both the detector and the reaction coil/column were thermostatted. The sample (10 μL) was injected using autosampler (Model 540 Microtiter HPLC, ESA, USA). For other experimental conditions see [24,28].

3.5. Automated spectrometric measurements

Spectrometric measurements were carried using an automated chemical analyser BS-200 (Mindray, China). Reagents and samples were placed on cooled sample holder (4 °C) and automatically pipetted directly into plastic cuvettes. Incubation proceeded at 37 °C. The mixture was consequently stirred. The washing steps with distilled water (18 mΩ) were done in the midst of the pipetting. The apparatus was operated using the BS-200 software (Mindray, China).

Urease activity determination – indophenol assay (Berthelot method). Plant tissues samples (approximately 2 g) were homogenized in mortar for five minutes. Then twenty millilitres of 30% ethanol was added and this solution was poured into a bottle (50 mL) and vortexed at 300 rpm, 8 °C for 30 minutes using a vortexer (GFL, Germany). The extract was centrifuged for 10 min at 5,000 g (Hettich, Germany) and then the supernatant was collected. The supernatant (10 µL) was mixed with

448 µL of hypochlorite solution (12% NaOCl, 0.4 M Na2HPO4 and 0.37 M NaOH, adjusted to pH 12) and with 42 µL of phenol solution (sodium nitroprusside, 7% phenol). This mixture was stirred and incubated for 15 min at 37 °C. After this incubation the differences of absorption at 630 and 670 nm were measured [47,64].

ALT and AST activity determination. For standardization of determination of ATL and AST, sodium pyruvate (2 mM) in the concentration range 0–1.25 μkat/L was used. Into a test-tube containing

Sensors 2009, 9 5053

100 μL of sample or standard, 250 μL of substrate (for ALT DL-alanine 0.2 M, 2-oxoglutarate 2 mM, 0.1 M phosphate buffer pH 7.4; for AST L-aspartate 0.1 M, 2-oxoglutarate 2 mM, 0.1 M phosphate buffer pH 7.4) were added and this mixture was incubated for 60 min at 37°C in a thermostatted box. After 30 min the test-tubes were taken out the box and analysed using automated analyzer. The incubated solution (45 μL) was added to 45 μL of solution containing 2,4-dinitrophenylhydrazine (1 mM in 1 M HCl). This mixture was stirred and incubated for 10 min at 37 °C. Further, 180 μL of sodium hydrate (0.4 M) was added and newly stirred. Absorbance was measured after 10 min. at wavelength 530 nm.

Bradford protein assay. To 10 μL of sample 190 μL of Bradford reagent was added [65]. After 5 min of incubation at room temperature absorbance was measured at 595 nm against a blank sample (10 μL phosphate buffer and 190 μL Bradford reagent). Bradford reagent consists of 100 mg Coomassie Brilliant Blue G250, 50 mL 96% ethanol (v/v), 1,000 mL 8.5% phosphoric acid (v/v), 200 mL 0.1 M phosphate buffer pH 7.6). Total protein concentration was determined from calibration curve prepared by dilution of bovine serum albumin solution with the phosphate buffer within the concentration range from 0.05 to 1 mg/mL.

3.6. Laser induced breakdown spectroscopy

To realize the measurements with high-spatial resolution, the sample holder with the investigated species was placed to the stage with precision movements (2 µm in x, y and z direction) inside the ablation chamber (Tescan, Czech Republic). The single-shot LIBS analysis was performed in air under atmospheric pressure. The ablation spot was targeted and controlled for each shot by a CCD camera placed outside of the chamber. The LIBS micro-plasma was created using the second harmonic (532 nm) of a Nd:YAG laser system (Quantel, Brilliant B). The laser pulse width was ~5 ns and the beam diameter 8 mm. The energy of the laser pulse was 10 mJ (at the sample). The laser-induced plasma was produced by focusing the laser beam with a 30 mm focal-length glass doublet (Sill Optics). Imaging system consisting of two quartz objectives was used to collect the LIBS micro- plasma radiation. Subsequently, the radiation was transported by a 3 m fibre optic system onto the entrance slit of the 0.32 m monochromator (Jobin Yvon TRIAX 320). In this study the grating 2,400 g/mm of the monochromator and 50 µm entrance slit were used. The dispersed spectrum of the plasma radiation was detected by an ICCD camera (Jobin Yvon Horiba). The time-resolved measurements were realized triggering the camera by the Q-switch signal of the laser. The detector was gated 1 µs after the Q-switch signal and the observation window was 10 µs. The lead-content within the leaf was detected by monitoring the 283.31 nm Pb (I) line in the created micro-plasmas.

4. Conclusions

We have demonstrated the ability of a laser-ablation based analytical method (LIBS) to map the distribution of lead and magnesium in the leaves of sunflower plants. Moreover, we have shown that the combination of LIBS with other precise analytical techniques such as high performance liquid

Sensors 2009, 9 5054 chromatography with electrochemical detection and automated spectrometric analysis can provide many interesting results.

Acknowledgements

The authors gratefully acknowledge support from the Grant Agency of the Czech Republic (522/07/0692 and 204/09/H002) and DP 6/2009 IGA MZLU.

References and Notes

1. Macek, T.; Kotrba, P.; Svatos, A.; Novakova, M.; Demnerova, K.; Mackova, M. Novel roles for genetically modified plants in environmental protection. Trends Biotechnol. 2008, 26, 146–152. 2. Novakova, M.; Mackova, M.; Sylvestre, M.; Macek, T. Preparation of genetically modified plants containing bacterial dioxygenase – Tool for preferable phytoremediation. J. Biotechnol. 2007, 131, S36–S36. 3. Najmanova, J.; Mackova, M.; Macek, T.; Kotrba, P. Preparation of transgenic flax with enhanced metal tolerance. J. Biotechnol. 2007, 131, S38–S39. 4. Pavlikova, D.; Macek, T.; Mackova, M.; Sura, M.; Szakova, J.; Tlustos, P. The evaluation of cadmium, zinc and nickel accumulation ability of transgenic tobacco bearing different transgenes. Plant Soil Environ. 2004, 50, 513–517. 5. Pavlikova, D.; Macek, T.; Mackova, M.; Szakova, J.; Balik, J. Cadmium tolerance and accumulation in transgenic tobacco plants with a yeast metallothionein combined with a polyhistidine tail. Int. Biodeterior. Biodegrad. 2004, 54, 233–237. 6. Macek, T.; Mackova, M.; Pavlikova, D.; Szakova, J.; Truksa, M.; Cundy, S.; Kotrba, P.; Yancey, N.; Scouten, W.H. Accumulation of cadmium by transgenic tobacco. Acta Biotechnol. 2002, 22, 101–106. 7. Francova, K.; Macek, T.; Demnerova, K.; Mackova, M. Transgenic plants – A potential tool for decontamination of environmental pollutants. Chem. Listy 2001, 95, 630–637. 8. Garbisu, C.; Alkorta, I. Phytoextraction: a cost-effective plant-based technology for the removal of metals from the environment. Bioresour. Technol. 2001, 77, 229–236. 9. Salt, D.E.; Blaylock, M.; Kumar, N.; Dushenkov, V.; Ensley, B.D.; Chet, I.; Raskin, I. Phytoremediation – A novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants. Bio-Technology 1995, 13, 468–474. 10. Fernandes, J.C.; Henriques, F.S. Biochemical, physiological, and structural effects of excess copper in plants. Bot. Rev. 1991, 57, 246–273. 11. Li, X.D.; Poon, C.S.; Liu, P.S. Heavy metal contamination of urban soils and street dusts in Hong Kong. Appl. Geochem. 2001, 16, 1361–1368. 12. Little, P.; Martin, M.H. Biological monitoring of heavy-metal pollution. Environ. Pollut. 1974, 6, 1-19. 13. Jarup, L. Hazards of heavy metal contamination. Br. Med. Bull. 2003, 68, 167–182. 14. Singh, R.P.; Tripathi, R.D.; Sinha, S.K.; Maheshwari, R.; Srivastava, H.S. Response of higher plants to lead contaminated environment. Chemosphere 1997, 34, 2467–2493.

Sensors 2009, 9 5055

15. Sawidis, T. Effect of cadmium on pollen germination and tube growth in Lilium longiflorum and Nicotiana tabacum. Protoplasma 2008, 233, 95–106. 16. Pandey, S.; Gupta, K.; Mukherjee, A.K. Impact of cadmium and lead on Catharanthus roseus – A phytoremediation study. J. Environ. Biol. 2007, 28, 655–662. 17. Doumett, S.; Lamperi, L.; Checchini, L.; Azzarello, E.; Mugnai, S.; Mancuso, S.; Petruzzelli, G.; Bubba, M. Heavy metal distribution between contaminated soil and Paulownia tomentosa, in a pilot-scale assisted phytoremediation study: influence of different complexing agents. Chemosphere 2008, 72, 1481–1490. 18. Malkowski, E.; Kita, A.; Galas, W.; Karcz, W.; Kuperberg, J.M. Lead distribution in corn seedlings (Zea mays L.) and its effect on growth and the concentrations of potassium and calcium. Plant Growth Regul. 2002, 37, 69–76. 19. Kaiser, J.; Malina, R.; Galiova, M.; Novotny, K.; Diopan, V.; Adam, V.; Kizek, R. Employment of laser spectrometry in heavy metal analysis. Lis. Cukrov. Repar. 2007, 123, 332–332. 20. Stejskal, K.; Diopan, V.; Adam, V.; Zehnalek, J.; Trnkova, L.; Havel, L.; Galiova, M.; Malina, R.; Novotny, K.; Kaiser, J.; Kizek, R. Study of effects of lead ions on sugar beet. Lis. Cukrov. Repar. 2008, 124, 116–119. 21. Stejskal, K.; Supalkova, V.; Baloun, J.; Diopan, V.; Babula, P.; Adam, V.; Zehnalek, J.; Trnkova, L.; Havel, L.; Kizek, R. Affecting of sugar beet (Beta vulgaris var. Altissima) by lead chelate. Lis. Cukrov. Repar. 2007, 123, 351–355. 22. Krizkova, S.; Ryant, P.; Krystofova, O.; Adam, V.; Galiova, M.; Beklova, M.; Babula, P.; Kaiser, J.; Novotny, K.; Novotny, J.; Liska, M.; Malina, R.; Zehnalek, J.; Hubalek, J.; Havel, L.; Kizek, R. Multi-instrumental analysis of tissues of sunflower plants treated with silver (I) ions – Plants as bioindicators of environmental pollution. Sensors 2008, 8, 445–463. 23. Supalkova, V.; Huska, D.; Diopan, V.; Hanustiak, P.; Zitka, O.; Stejskal, K.; Baloun, J.; Pikula, J.; Havel, L.; Zehnalek, J.; Adam, V.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Kizek, R. Electroanalysis of plant thiols. Sensors 2007, 7, 932–959. 24. Potesil, D.; Petrlova, J.; Adam, V.; Vacek, J.; Klejdus, B.; Zehnalek, J.; Trnkova, L.; Havel, L.; Kizek, R. Simultaneous femtomole determination of cysteine, reduced and oxidized glutathione, and phytochelatin in maize (Zea mays L.) kernels using high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A 2005, 1084, 134–144. 25. Vacek, J.; Petrek, J.; Kizek, R.; Havel, L.; Klejdus, B.; Trnkova, L.; Jelen, F. Electrochemical determination of lead and glutathione in a plant cell culture. Bioelectrochemistry 2004, 63, 347–351. 26. Petrek, J.; Baloun, J.; Vlasinova, H.; Havel, L.; Adam, V.; Vitecek, J.; Babula, P.; Kizek, R. Image analysis and activity of intracellular esterases as new analytical tools for determination of growth and viability of embryonic cultures of spruce (Picea sp.) treated with cadmium. Chem. Listy 2007, 101, 569–577. 27. Zitka, O.; Stejskal, K.; Kleckerova, A.; Adam, V.; Beklova, M.; Horna, A.; Supalkova, V.; Havel, L.; Kizek, R. Utilizing electrochemical techniques for detection of biological samples. Chem. Listy 2007, 101, 225–231.

Sensors 2009, 9 5056

28. Petrlova, J.; Mikelova, R.; Stejskal, K.; Kleckerova, A.; Zitka, O.; Petrek, J.; Havel, L.; Zehnalek, J.; Adam, V.; Trnkova, L.; Kizek, R. Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution-liquid chromatography with Coul-Array detection. J. Sep. Sci. 2006, 29, 1166–1173. 29. Supalkova, V.; Petrek, J.; Baloun, J.; Adam, V.; Bartusek, K.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Diopan, V.; Havel, L.; Kizek, R. Multi-instrumental investigation of affecting of early somatic embryos of spruce by cadmium (II) and lead (II) ions. Sensors 2007, 7, 743–759. 30. Ryant, P.; Dolezelova, E.; Fabrik, I.; Baloun, J.; Adam, V.; Babula, P.; Kizek, R. Electrochemical determination of low molecular mass thiols content in potatoes (Solanum tuberosum) cultivated in the presence of various sulphur forms and infected by late blight (Phytophora infestans). Sensors 2008, 8, 3165–3182. 31. Lima, P.R.; Santos, W.J.R.; Oliveira, A.B.; Goulart, M.O.; Kubota, L.T. Electrocatalytic activity of 4-nitrophthalonitrile-modified electrode for the L-glutathione detection. J. Pharm. Biomed. Anal 2008, 47, 758–764. 32. Gutscher, M.; Pauleau, A.L.; Marty, L.; Brach, T.; Wabnitz, G.H.; Samstag, Y.; Meyer, A.J.; Dick, T.P. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nat. Methods 2008, 5, 553–559. 33. Timur, S.; Odaci, D.; Dincer, A.; Zihnioglu, F.; Telefoncu, A. Biosensing approach for glutathione detection using glutathione reductase and sulfhydryl oxidase bienzymatic system. Talanta 2008, 74, 1492–1497. 34. Korn, M.D.A.; de Andrade, J.B.; de Jesus, D.S.; Lemos, V.A.; Bandeira, M.; dos Santos, W.N.L.; Bezerra, M.A.; Amorim, F.A.C.; Souza, A.S.; Ferreira, S.L.C. Separation and preconcentration procedures for the determination of lead using spectrometric techniques: a review. Talanta 2006, 69, 16–24. 35. Korn, M.D.A.; dos Santos, D.S.S.; Welz, B.; Vale, M.G.R.; Teixeira, A.P.; Lima, D.D.; Ferreira, S.L.C. Atomic spectrometric methods for the determination of metals and metalloids in automotive fuels – a review. Talanta 2007, 73, 1–11. 36. Lin, T.J.; Chung, M.F. Using monoclonal antibody to determine lead ions with a localized surface plasmon resonance fiber-optic biosensor. Sensors 2008, 8, 582–593. 37. Shaw, M.J.; Haddad, P.R. The determination of trace metal pollutants in enviromental matrices using ion chromatography. Environ. Int. 2004, 30, 403–431. 38. Yantasee, W.; Lin, Y.; Hongsirikarn, K.; Fryxell, G.E.; Addleman, R.; Timchalk, C. Electrochemical sensors for the detection of lead and other toxic heavy metals: the next generation of personal exposure biomonitors. Environ. Health Perspect. 2007, 115, 1683–1690. 39. Janssens, K.H.A.; Adams, F.C.V.; Rindby, A. X-ray fluorescence analysis, John Wiley & Sons: Chichester , UK, 2000. 40. Jorks, S. X-ray microscopy. Instrumentation and biological application, Springer-Verlag: New York, NY, USA, 1987. 41. Kaiser, J.; Reale, L.; Ritucci, A.; Tomassetti, G.; Poma, A.; Spano, L.; Tucci, A.; Flora, F.; Lai, A.; Faenov, A.; Pikuz, T.; Mancini, L.; Tromba, G.; Zanini, F. Mapping of the metal intake in plants by large-field X-ray microradiography and preliminary feasibility studies in microtomography. Eur. Phys. J. D 2005, 32, 113–118.

Sensors 2009, 9 5057

42. Kaiser, J.; Samek, O.; Reale, L.; Liska, M.; Malina, R.; Ritucci, A.; Poma, A.; Tucci, A.; Flora, F.; Lai, A.; Mancini, L.; Tromba, G.; Zanini, F.; Faenov, A.; Pikuz, T.; Cinque, G. Monitoring of the heavy-metal hyperaccumulation in vegetal tissues by X-ray radiography and by femto-second laser induced breakdown spectroscopy. Microsc. Res. Tech. 2007, 70, 147–153. 43. Becker, J.S.; Su, J.; Zoriya, M.V.; Dobrowolska, J.; Matusch, A. Imaging mass spectrometry in biological tissues by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. Eur. J. Mass Spectrom. 2007, 13, 1–6. 44. DeLucia, F.C.; Samuels, A.C.; Harmon, R.S.; Walters, R.A.; McNesby, K.L.; LaPointe, A.; Winkel, R.J.; Miziolek, A.W. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS): a promising versatile chemical sensor technology for hazardous material detection. IEEE Sens. J. 2005, 5, 681–689. 45. Martin, M.Z.; Wullschleger, S.D.; Garten, C.T.; Palumbo, A.V. Laser-induced breakdown spectroscopy for the environmental determination of total carbon and nitrogen in soils. Appl. Optics 2003, 42, 2072–2077. 46. Russo, R.E.; Mao, X.L.; Gonzalez, J.J.; Mao, S.S. Femtosecond laser ablation ICP-MS. J. Anal. At. Spectrom. 2002, 17, 1072–1075. 47. Hubalek, J.; Hradecky, J.; Adam, V.; Krystofova, O.; Huska, D.; Masarik, M.; Trnkova, L.; Horna, A.; Klosova, K.; Adamek, M.; Zehnalek, J.; Kizek, R. Spectrometric and voltammetric analysis of urease - nickel nanoelectrode as an electrochemical sensor. Sensors 2007, 7, 1238– 1255. 48. Petrek, J.; Vitecek, J.; Vlasinova, H.; Kizek, R.; Kramer, K.J.; Adam, V.; Klejdus, B.; Havel, L. Application of computer imaging, stripping voltammetry and mass spectrometry to study the effect of lead (Pb-EDTA) on the growth and viability of early somatic embryos of Norway spruce (Picea abies/L./Karst.). Anal. Bioanal. Chem. 2005, 383, 576–586. 49. Vitecek, J.; Petrlova, J.; Petrek, J.; Adam, V.; Havel, L.; Kramer, K.J.; Kizek, R. Application of fluorimetric analysis of plant esterases to study of programmed cell death and effects of cadmium (II) ions. Biol. Plant. 2007, 51, 551–555. 50. Vitecek, J.; Adam, V.; Petrek, J.; Vacek, J.; Kizek, R.; Havel, L. Esterases as a marker for the growth of BY-2 tobacco cells and early somatic embryos of the norway spruce. Plant. Cell. Tiss. Org. 2004, 79, 195–201. 51. Vitecek, J.; Petrlova, J.; Adam, V.; Havel, L.; Kramer, K.J.; Babula, P.; Kizek, R. A fluorimetric sensor for detection of one living cell. Sensors 2007, 7, 222–238. 52. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 2002, 82, 47–95. 53. Noctor, G.; Foyer, C.H. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 1998, 49, 249–279. 54. Adam, V.; Zehnalek, J.; Petrlova, J.; Potesil, D.; Sures, B.; Trnkova, L.; Jelen, F.; Vitecek, J.; Kizek, R. Phytochelatin modified electrode surface as a sensitive heavy metal ion biosensor. Sensors 2005, 5, 70–84. 55. Adam, V.; Petrlova, J.; Potesil, D.; Zehnalek, J.; Sures, B.; Trnkova, L.; Jelen, F.; Kizek, R. Study of metallothionein modified electrode surface behaviour in the presence of heavy metal ions- biosensor. Electroanalysis 2005, 17, 1649–1657.

Sensors 2009, 9 5058

56. Adam, V.; Hanustiak, P.; Krizkova, S.; Beklova, M.; Zehnalek, J.; Trnkova, L.; Horna, A.; Sures, B.; Kizek, R. Palladium biosensor. Electroanalysis 2007, 19, 1909–1914. 57. Das, A.K.; de la Guardia, M.; Cervera, M.L. Literature survey of on-line elemental speciation in aqueous solutions. Talanta 2001, 55, 1–28. 58. Rizk, N.M.H.; Abbas, S.S.; Hamza, S.M.; El-Karem, Y.M.A. Thiopental and phenytoin as novel ionophores for potentiometric determination of lead (II) ions. Sensors 2009, 9, 1860–1875. 59. Bondarenko, O.; Rolova, T.; Kahru, A.; Ivask, A. Bioavailability of Cd, Zn and Hg in soil to nine recombinant luminescent metal sensor bacteria. Sensors 2008, 8, 6899–6923. 60. Prasek, J.; Adamek, M.; Hubalek, J.; Adam, V.; Trnkova, L.; Kizek, R. New hydrodynamic electrochemical arrangement for cadmium ions detection using thick-film chemical sensor electrodes. Sensors 2006, 6, 1498–1512. 61. Galiova, M.; Kaiser, J.; Novotny, K.; Novotny, J.; Vaculovic, T.; Liska, M.; Malina, R.; Stejskal, K.; Adam, V.; Kizek, R. Investigation of heavy-metal accumulation in selected plant samples using laser induced breakdown spectroscopy and laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry. Appl. Phys. A-Mater. Sci. Process. 2008, 93, 917–922. 62. Kaiser, J.; Galiova, M.; Novotny, K.; Cervenka, R.; Reale, L.; Novotny, J.; Liska, M.; Samek, O.; Kanicky, V.; Hrdlicka, A.; Stejskal, K.; Adam, V.; Kizek, R. Mapping of lead, magnesium and copper accumulation in plant tissues by Laser-Induced Breakdown Spectroscopy and Laser- Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Spectrochim. Acta, Part B 2009, 64, 67–73. 63. Kaiser, J.; Galiova, M.; Novotny, K.; Reale, L.; Stejskal, K.; Samek, O.; Malina, R.; Palenikova, K.; Adam, V.; Kizek, R. Utilization of the Laser Induced Plasma Spectroscopy for monitoring of the metal accumulation in plant tissues with high spatial resolution. Formatex: Badajoz, Spain, 2007; 434–441. 64. Witte, C.P.; Medina-Escobar, N. In-gel detection of urease with nitroblue tetrazolium and quantification of the enzyme from different crop plants using the indophenol reaction. Anal. Biochem. 2001, 290, 102–107. 65. Bradford, M.M. Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248–254.

© 2009 by the authors; licensee Molecular Diversity Preservation International, Basel, Switzerland. This article is an open-access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution license (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).

5.3.2 Bioindikace znečištění stříbrnými ionty

KRIZKOVA, S.; RYANT, P.; KRYSTOFOVA, O.; ADAM, V.; GALIOVA, M.; BEKLOVA, M.; BABULA, P.; KAISER, J.; NOVOTNY, K.; NOVOTNY, J.; LISKA, M.; MALINA, R.; ZEHNALEK, J.; HUBALEK, J.; HAVEL, L.; KIZEK, R. Multi-instrumental analysis of tissues of sunflower plants treated with silver(I) ions – Plants as bioindicators of environmental pollution.

Sensors, 2008, roč. 8. č. 1, s. 445-463. ISSN 1424-8220. IF = 1.573

Podíl autorky Kryštofová O.: 20 % textové části práce a 45 % experimentální práce

Cílem naší práce bylo zjistit odpověď rostlin Helianthus annuus L. na stres vyvolaný stříbrnými ionty. Rostliny Helianthus annuus L. byly vystaveny Ag1+ o koncentracích 0; 0.1; 0.5 a 1 mmol·l-1 po dobu 96 hodin. Následně jsme se zaměřili naši pozornost na sledování základních změn v morfologii a v distribuci iontů v rostlinných pletivech a na stanovení změn obsahu vybraných stresových markerů (celkový obsah proteinů, aktivita ureázy).

Sledováním morfologických změn bylo zjištěno, že rostliny vystavené působení Ag1+ vykazují růstovou depresi, barevné změny a sníženou tvorbu kořenových vlásků. Na základě autofluorescence anatomických struktur, jako je lignifikace buněčné stěny, bylo možné určit změny nadzemních a kořenových částech, zejména u cévních svazků a v rozvoji sekundárního tloustnutí. Byly dobře pozorovány rozdíly v organizaci cévních svazků, vývoj parenchymatické dřeně v kořenu a snížení počtu cévních svazků floému. Navíc s rostoucí koncentrací Ag1+ poklesla vitalita rhizodermalních buněk. Rhizodermalní buňky brzy nekrotizovaly a byly nahrazeny buňkami exodermis.

Dále jsme použili laser indukovaného spektroskopie pro stanovení prostorové distribuce Ag1+ v rostlinných pletivech. Bylo zjištěno, že Ag1+ se akumulovaly především v kořenové části rostlin.

Nakonec byly zkoumány základní biochemické ukazatele stres, který mohou stříbrné ionty způsobovat. První ukazatel byl celkový obsah bílkovin. V kořenech obsah

126

bílkovin výrazně klesal se zvyšující se koncentrací Ag1+ a dobou působení. Nadzemní části, v porovnání s kořeny, vykazovaly méně viditelné změny v obsahu bílkovin. Porovnáme-li tedy celkový obsah bílkovin v nadzemních a kořenových částech, můžeme předpokládat zvýšený transport bílkovin z kořenů do nadzemních částí. Tento jev může být spojeny s kaskádou procesů souvisejících s fotosyntézou. Druhý biochemické parametry, kterým jsme zabývali, byla aktivita enzymu ureázy. Pokud jsme porovnali její aktivitu v rostlinách vystavených působení Ag1+ s kontrolou, zjistili jsme, že přítomnost Ag1+ výrazně zvyšuje aktivitu ureázy u všech aplikovaných koncentrací.

Rostlin mají potenciál být využity jako bioindikátor kvality životního prostředí. Nejdříve je, ale nezbytné pochopit fyziologické procesy, které jsou spojeny s rostlinnou reakcí na stres. K tomu by mohli napomoci i námi získané výsledky.

127

Sensors 2008, 8, 445-463 sensors ISSN 1424-8220 © 2008 by MDPI www.mdpi.org/sensors Full Paper Multi-instrumental Analysis of Tissues of Sunflower Plants Treated with Silver(I) Ions – Plants as Bioindicators of Environmental Pollution

Sona Krizkova 1, Pavel Ryant 2, Olga Krystofova 3, Vojtech Adam 1,4, Michaela Galiova 3, Miroslava Beklova 5, Petr Babula 6, Jozef Kaiser 7, Karel Novotny 3, Jan Novotny 7, Miroslav Liska 7, Radomir Malina 7, Josef Zehnalek 1, Jaromir Hubalek 8, Ladislav Havel 9 and Rene Kizek 1,*

1 Department of Chemistry and Biochemistry, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic 2 Department of Agrochemistry, Soil Science, Microbiology and Plant Nutrition, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic 3 Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, CZ-625 00 Brno, Czech Republic 4 Department of Animal Nutrition and Forage Production, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic 5 Department of Veterinary Ecology and Environmental Protection, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences, Palackeho 1-3, CZ-612 42 Brno, Czech Republic 6 Department of Natural Drugs, Faculty of Pharmacy, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences, Palackeho 1-3, CZ-612 42 Brno, Czech Republic 7 Institute of Physical Engineering, Faculty of Mechanical Engineering, Brno University of Technology, Technicka 2896/2, CZ-616 69 Brno, Czech Republic 8 Department of Microelectronics, Faculty of Electrical Engineering and Communication, Brno University of Technology, Udolni 53, CZ-602 00 Brno, Czech Republic 9 Department of Plant Biology, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-613 00 Brno, Czech Republic

* Author to whom correspondence should be addressed; e-mail:[email protected]

Received: 26 December 2007 / Accepted: 15 January 2008 / Published: 24 January 2008

Abstract: The aim of this work is to investigate sunflower plants response on stress induced by silver(I) ions. The sunflower plants were exposed to silver(I) ions (0, 0.1, 0.5, and 1 mM) for 96 h. Primarily we aimed our attention to observation of basic physiological parameters. We found that the treated plants embodied growth depression, coloured Sensors 2008, 8 446

changes and lack root hairs. Using of autofluorescence of anatomical structures, such as lignified cell walls, it was possible to determine the changes of important shoot and root structures, mainly vascular bungles and development of secondary thickening. The differences in vascular bundles organisation, parenchymatic pith development in the root centre and the reduction of phloem part of vascular bundles were well observable. Moreover with increasing silver(I) ions concentration the vitality of rhizodermal cells declined; rhizodermal cells early necrosed and were replaced by the cells of exodermis. Further we employed laser induced breakdown spectroscopy for determination of spatial distribution of silver(I) ions in tissues of the treated plants. The Ag is accumulated mainly in near-root part of the sample. Moreover basic biochemical indicators of environmental stress were investigated. The total content of proteins expressively decreased with increasing silver(I) ions dose and the time of the treatment. As we compare the results obtained by protein analysis – the total protein contents in shoot as well as root parts – we can assume on the transport of the proteins from the roots to shoots. This phenomenon can be related with the cascade of processes connecting with photosynthesis. The second biochemical parameter, which we investigated, was urease activity. If we compared the activity in treated plants with control, we found out that presence of silver(I) ions markedly enhanced the activity of urease at all applied doses of this toxic metal. Finally we studied the effect of silver(I) ions on activity of urease in in vitro conditions.

Keywords: Silver; Heavy metals; Plant biosensor; Sensors; Biochemical marker

1. Introduction

1.1 Silver ions and their effects on organisms

Due to many anthropogenic activities environment have been polluting by number of organic as well as inorganic compounds [1]. Therefore the concentration of these undesirable and in most cases highly toxic substances have enhanced [2]. The mechanism of their effects can be very heterogeneous. Because of these reasons the new procedures and technologies not only to monitor of levels of contamination but also to remediate the polluted environment have been still developing and suggesting. The ions of heavy metals and their compounds are considered as one of the most toxic substances polluting all parts of environment. Photographical industry, following electrochemistry and medicine are the main sources of one of the most toxic heavy metal ions, silver(I) ions. In water silver(I) can be found in many forms both as inorganic and organic compounds. Due to competing equilibria and kinetics in water hydrated silver ions, Ag+, may be also present in surface waters, which relates to the fact that Ag+ has been shown to be highly toxic to aquatic life [3-5]. In the light of these facts the foundation called “The Silver Council”, which was established in 1998, elaborated the basic characteristics of environmental norms for silver ions entering to environment from industry [6]. However the toxic effect of silver(I) ions on the organisms is still unclear.

Sensors 2008, 8 447

There have been suggested several mechanisms of silver ions effects on vitally important functions and processes. One of the most discussed is the interactions between Ag+ and DNA, which have been studied by number of analytical methods (infrared and UV spectrometry, circular dichroism etc.) [7,8]. It was observed that silver ions bind rapidly on N7 guanine in dsDNA and, thus, interfere the replication processes [8]. It is generally known that prokaryotic as well as eukaryotic organisms intensively protect themselves against effects of heavy metals. The both groups of organisms have developed various strategies how they can detoxify xenobiotics. One of the common ones is synthesis of low molecular peptides and proteins rich in cysteine. In general plants synthesize peptides called phytochelatins [9,10] and animals low molecular proteins called metallothioneins [11].

1.2 Bio-indicators

Numerous of plant and animal species can be used as bio-indicators of heavy metals pollution of the environment [12-19]. Aquatic animals, most of all various species of fishes, are very suitable for these purposes [20-22]. Nevertheless the question is how to asses the quality of the environment of interest through using of such living bio-indicators [23]. To assess the quality of the environment the investigations of the changes in behaviour, morphology, habitation or changes of basic morphometric properties (body weight, colour, length, etc.) are often used. All these data are only of qualitative character and are hardly to obtain due to requirements on large population of the target specie and the time period of the experiment. On the other hand, experiments using plants can be appropriate way how to substitute animal tests because no harming of animals and low demands on equipment.

1.3 Silver ions analysis

A determination of silver(I) ions in waters is difficult because the formation of a number of silver complexes with inorganic as well as organic compounds that however depress the acute silver toxicity [6,24,25]. The determination of silver ions is usually carried out by atomic absorption spectrometry [26,27]. To enhance the sensitivity of an analysis the pre-concentration of the silver ions in a sample is need. These processes prolong the total time of the analysis as well as enhance the cost of such experiment [27-29]. The electrochemical methods are alternative analytic techniques that make the silver ions determination possible in nM concentrations, mainly using carbon electrodes [30-36]. The modification of the surface of the carbon electrodes represents a unique tool for detection of heavy metal ions, peptides, proteins, nucleic acids and others [37-46]. The aim of this work is to investigate sunflower plants response on stress induced by silver(I) ions. For this purpose we employed multi-instrumental apparatus to detect and investigate total protein content, urease activity, spatial distribution of the heavy metal ions, and physiological and anatomical changes in the treated plants.

Sensors 2008, 8 448

2. Material and Methods

2.1 Chemicals and pH measurements

Urease EC 3.5.1.5 (Jack Beans, type III; 45 000 IU/g) was purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Acetic acid was purchased from Fluka (USA). All other reagents used were purchased from Sigma Aldrich in ACS purity unless noted otherwise. Stock standard solutions were prepared by ACS water (Sigma-Aldrich, USA) and stored in the dark at temperature of -20 °C. Working standard solutions were prepared daily by dilution of the stock solutions. All solutions were filtered through a 0.45 μm Nylon filter discs (Millipore, Billerica, Mass., USA) prior to HPLC analysis. The pH value was measured using WTW inoLab Level 3 with terminal Level 3 (Weilheim, Germany), controlled by the personal computer program (MultiLab Pilot; Weilheim, Germany). The pH-electrode (SenTix-H, pH 0–14/3M KCl) was regularly calibrated by set of WTW buffers (Weilheim, Germany).

2.2 Plants, cultivation conditions and a sample preparation

Sunflower plants (Helianthus annuus L.) were used in our experiments. The sunflower seeds were germinated on wet filter paper in special vessels at 25 ± 2 °C in dark (box Chirana, Czech Republic). After 10 days, the sunflower seedlings were placed into vessels containing tap water and cultivated in Versatile Environmental Test Chamber (MLR-350 H, Sanyo, Japan) for eight days with 14 hours long daylight per day (maximal light intensity was about 100 μE.m-2s-1) at a temperature 22 °C and humidity 65 %. Further AgNO3 was added to the cultivation solution at final concentrations of 0 (control sample), 0.1, 0.5 and 1 mM. The sunflower plants placed in the vessels that contained tap water with addition of silver(I) ions were treated for five days. Seven plants from each experimental group were harvested at certain time intervals during the experiment, and their roots were rinsed three times in distilled water and 0.5 M EDTA. Prior to their analysis each harvested plant was divided into leaves, stem and root.

2.3 Laser spectrometry

The LIBS experimental setup used is shown in Fig. 1. The second harmonic (532 nm) of the Nd:YAG laser system (Brilliant B, Quantel, France) was used to create the LIBS micro-plasma by focusing the laser beam with a 16 mm focal-length glass doublet (Sill Optics, Germany). The laser pulse width was ~ 5 ns and beam diameter 8 mm. The energy of the laser pulse (~10 mJ at the sample) was set and controlled by an energy meter (Field Master LM-P10, Coherent, USA). The sample was placed to the sample holder inside the ablation chamber (Tescan, Czech Republic) to the stage with precision movements (2 µm in x, y and z direction). The LIBS analysis was performed in air on atmospheric pressure. The ablation spot was targeted and controlled for each shot by a CCD camera placed outside of the chamber. For the temporally and spectrally resolved analysis the LIBS plasma radiation was collected with quartz objectives and transported by a 3 m fiber optic system onto the entrance slit of the 0.32 m monochromator (TRIAX 320, Jobin Yvon, France). In this study, the grating 2400 g/mm of the monochromator and 50 µm entrance slit were used. As a detector

Sensors 2008, 8 449 an ICCD camera (Horiba, Jobin Yvon, France) was employed. The camera was triggered by the Q-switch signal of the laser.

Figure 1. The LIBS experimental setup. 1 – Nd:YAG ablation laser, 2 – focusing optics, 3 – the analyzed sample, 4 – collecting optics, 5 – optical fiber, 6 – monochromator, 7 – ICCD camera, 8 – personal computer.

2.4 Automated spectrometric measurements

Spectrometric measurements were carried using an automated chemical analyser BS-200 (Mindray, China). Reagents and samples were placed on cooled sample holder (4 °C) and automatically pipetted directly into plastic cuvettes. Incubation proceeded at 37°C. Mixture was consequently stirred. The washing steps by distilled water (18 mΩ) were done in the midst of the pipetting. Apparatus was operated using software BS-200 (Mindray, China).

2.4.1 Urease activity determination – An indophenol assay (Berthelot method)

Plant tissues samples (approximately 2 grams) were homogenized in mortar for five minutes. Then twenty millilitres of 30% ethanol was added and this solution was poured into a bottle (50 ml) and vortexed at 300 rpm, 8 °C for 30 minutes using vortex (GFL, Germany). The extract was centrifuged for 10 min at 5 000 g (Hettich, Geramy) and then the supernatant was collected. The supernatant (10

µl) was mixed with 448 µl of hypochlorite solution (12% NaOCl, 0.4 M Na2HPO4 and 0.37 M NaOH, adjusted to pH 12) and with 42 µl of phenol solution (sodium nitroprusside, 7% phenol). This mixture was stirred and incubated for 15 min at 37°C. After this incubation the differences of absorption at 630 and 670 nm were measured.

Sensors 2008, 8 450

2.4.2 Protein determination – Biuret test

Weighed plant tissues (approximately 0.2 g) were transferred to a test-tube. Then, liquid nitrogen was added to the test-tube, and the samples were frozen to disrupt the cells. The frozen sample was transferred to mortar and spread for 1 min. Then exactly 1,000 μl of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.2) was added to mortar, and the sample was spread for 5 min. The homogenate was transferred to a new test-tube. The frozen samples were homogenised by shaking on a Vortex–2 Genie for 5 min at 4 °C (Scientific Industries, USA) and sonicated using a Bandelin Sonopuls HD 2070 for 10 s at 7 W (Germany). The homogenate was centrifuged (14 000 × g) for 15 min at 4°C using a Universal 32 R centrifuge (Hettich-Zentrifugen, Germany). The supernatant was filtered through a 0.45 μm Nylon filter discs (Millipore, Billerica, Mass., USA) prior to analysis. For determination of the total protein content the biuret solution (15 mM potassium sodium tartrate,

100 mM NaI, 15 mM KI and 5 mM CuSO4). As a standard albumin (1 mg in 1 ml of phosphate buffer, pH 7) was used. The measurement was done as follows: 180 µl of the biuret solution was mixed with 45 µl of real or standard sample; after stirring and incubating (10 min. at 37°C) the absorbance at 546 nm was measured.

2.5 Anatomical analysis of plant samples

The observations were performed with fresh stem sections of plants. Lignified cell walls were visualized by ultraviolet (UV) excitation without additional fluorescent staining. At each experimental group of plants 25 – 30 sections were evaluated. All observations were performed on fluorescent microscope (Olympus AX 70) equipped with broad spectrum UV excitation.

2.6 Statistical analysis

Data were processed using MICROSOFT EXCEL® (USA) and analyzed by the QCExpert software (TriloBite, Statistical Software, Czech Republic) using analysis of variance (ANOVA). Results are expressed as mean ± S.D. unless noted otherwise. Statistical significance of the differences between weight and area of clusters was determined. Differences with p < 0.05 were considered significant.

3. Results and Discussion

In the case of silver ions toxicity the attention is devoted to aquatic organisms [1,47-53], mainly to fishes due to extremely low lethal doses, which vary from units to ten of micrograms per litre [3,4,48- 56]. On the other hand it is little known about the influence of silver ions on plants. It is well known that a presence of a toxic metal in a plant cell results in synthesis of stress plant peptides and proteins. These biologically active molecules can be used for evaluation of chronic as well as acute toxicity of a toxic metal or as biomarkers of assessment of environmental pollution (Fig. 2).

3.1 Physiological changes in sunflower plants exposed to silver(I) ions

To investigate influence of silver(I) ions on plant we selected sunflower plants (Helianthus annuus L., Asteraceae, syn. Compositae). The sunflower plants were exposed to silver(I) ions (0, 0.1, 0.5, and 1

Sensors 2008, 8 451 mM) for 96 h. The images of the plants in time scale of the treatment are shown in Fig. 3. It clearly follows from the figures that the plants exposed to silver(I) ions embody growth depression; only control set of the plants demonstrates leaves growth. The root system of the plants exposed to silver(I) ions shows also physiological changes compared to control plants. Particularly we observed growth depression and coloured changes that indicate the entry of silver ions to the plants. Moreover the sunflower plants treated with silver(I) ions lack root hairs (Fig.3).

Heavy metal pollution

Quality of environment

Biochemical marker

Figure 2. The scheme of environment quality assessment based on determination of biochemical markers presented in plants.

3.2 Changes in the treated plants fresh weight

At the end of each experimental day the part of the plants were harvested and weighed. Based on these results the growth curves were determined (Fig. 4). The control plants demonstrated moderate loss of fresh weight (Fig. 4 whole plant) because of their cultivation in distilled water without macro- and microelements supplement. This effect is mostly observable at shoots; root systems were more stimulated (Fig. 4). The influence of silver(I) ions on sunflower plants growth parameters was well evident. Rate of loss of plants fresh weight enhanced with the increasing silver(I) ions doses and with the time of the exposure. This effect was more evident at the shoot parts of the plants (hypocotyls, stems) in comparison with the root system. The decrease in the fresh weight is probably connected with an increase in a metabolic activity of the plants exposed to silver(I) ions due to very limited supply of inorganic as well as organic compounds needed for plant development. In addition we found that the content of chlorophylls (chlorophyll a and chlorophyll b) was lower in the plants treated with silver(I) ions compared to the control group of the plants. This indicates the damage of photosynthetic processes and the decrease of the total energetic metabolism of the plants treated with silver(I) ions.

Sensors 2008, 8 452

1. day 3. day 5 cm 5 cm

Control 0.1mM 0.5 mM 1 mM Control 0.1mM 0.5 mM 1 mM

2. day 4. day 5 cm 5 cm

Control 0.1mM 0.5 mM 1 mM Control 0.1mM 0.5 mM 1 mM

Figure 3. Images of the sunflower plants during 96 h treatment with silver(I) ions.

root whole plant control shoot control control Ag 0.1mM Ag 0.1mM Ag 0.1mM 1.2 Ag 0.5 mM 0.35 Ag 0.5 mM Ag 1 mM Ag 0.5 mM Ag 1 mM 0.8 Ag 1 mM 1.0 0.25 0.8 0.6

0.6 0.15 0.4 Fresh weight (g) Fresh weight (g) Fresh weight (g) 0.4 0.2 0.05 0.2 1234 1234 1234 Treatment time (d) Treatment time (d) Treatment time (d)

Figure 4. Fresh weight changes (whole plant, shoot and root) of sunflower plants exposed to various doses of silver(I) ions for 96 h.

3.3 Anatomical changes of sunflower shoots (hypocotyls, stems) and roots

Using of autofluorescence of anatomical structures, such as lignified cell walls, it was possible to determine the changes of important shoot and root structures, mainly vascular bungles and development of secondary thickening. The differences in vascular bundles organisation, parenchymatic pith development in the root centre and the reduction of phloem part of vascular bundles are well observable (Fig. 5). The most important changes in hypocotyls anatomy were as follows: the increased robustness of cuticle, increase of lignification and suberinization of the cell walls of epidermis and

Sensors 2008, 8 453 outer cortex, and changes in new vascular bundles differentiation with increasing silver(I) ions dose. These hallmarks can be related to changes of water transport caused by silver(I) ions. Very evident and characteristic changes were determined in root structure. With increasing silver(I) ions concentration the vitality of rhizodermal cells declined; rhizodermal cells early necrosed and were replaced by the cells of exodermis. Changes were well evident in the structure of stele, mainly in pith development. Deposition of silver in the pitch cell walls as well as in inner xylem parts was expressively evident in connection with increasing silver(I) ions concentration.

Figure 5. Sunflower shoot. Transverse stem section of sunflower cultivated without (A) and treated with silver(I) ions – 0.1 mM (B), 0.5 mM (C) and 1.0 mM (D) at fourth day of the treatment. Blue fluorescence – lignified cell walls. E – epidermis, C – cortex, P – phloem, X – xylem, Pi – pith. Sunflower root. Transverse root section of sunflower cultivated without (A) and treated with silver(I) ions – 0.1 mM (B), with detail (C) at fourth day of the treatment. Magnification × 100.

3.4 Spatial distribution of silver(I) ions in the plant tissues

Laser Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) is a simple spectrochemical sensor technology. LIBS utilises the emission of a high-temperature microplasma created by focusing a laser beam to the surface of the investigated sample. The spectrum of light emission is collected by a detector and its intensity at specific wavelengths is recorded [57]. The method allows real-time multi-element analysis in-situ and even remotely. The advantages of this method, i.e. usually none or very simple sample preparation, together with the capability of analysis with high spatial resolution [58] make it possible to utilize it in a wide-range of applications [57,58]. Basically, the achievable spatial resolution of LIBS

Sensors 2008, 8 454 is determined by the size of the laser craters produced within the material [57]. However, LIBS as a technique for simultaneous multi-elemental analysis is dating from the 1980s [59,60], as an emerging chemical sensor has picked up considerably during the past decade [57]. Recently, the LIBS was exploit among other for monitoring of accumulation of selected chemical elements in different structures of plant species [61-63]. The single-shot LIBS analysis was performed along the ~25 mm long Helianthus annuus L. stem sections. The LIBS’s ICCD detector was gated 1 µs after the Q-switch signal and the observation window was 10 µs. Typical LIBS spectrum is shown in Fig. 6aA), together with a photograph of LIBS ablation craters (Fig. 6B). For Ag and Cu detection the 328.07 nm Ag(I) and 324.75 nm Cu(I) lines were used, respectively. For the mapping the background was subtracted (for each shot) and the area under the selected peak (for appropriate chemical element) was calculated.

Figure 6. The typical LIBS spectrum with the 328.07 nm Ag(I) and 324.75 nm Cu(I) lines used in the analysis (A) together with the image of three ablation craters (B). The bar on B has a length of 500 μm.

Figure 6 demonstrates the capability of LIBS to signalize the trends in accumulation of different elements in selected structures of the sample. To trace the uptake of Ag and Cu in the investigated area of the leaf samples, a statistical analysis was carried out on the intensity data set from each sample. Because the measured intensity values had a log-normal distribution the average of the logarithm of intensity values was calculated [64]. From these data we found that in the leaves of the plants the overall Cu content follows the changes in the Ag content. The distribution of Cu and Ag along the stem sections for different days of treatment is shown in Figs. 7 and 8. The LIBS analysis was finished on the closer part of stem towards the root system (position ~25 mm on the sample). These graphs clearly demonstrate the advantage of the spatially- resolved LIBS analysis. While the overall content of the Ag and Cu follows each other (Fig. 7), the

Sensors 2008, 8 455 spatial distribution of these elements is different. The Ag is accumulated mainly in near-root part of the sample (Fig. 8A), on contrary the Cu is spread more uniformly within the stem (Fig. 8B).

Figure 7. The average intensities calculated from logarithm of intensity data obtained from LIBS analyses.

A C

B D

Figure 8. Accumulation of silver (A) and copper (B) along the investigated stem samples. Maps of the accumulated silver (C) and copper (D) measured by the LIBS technique for quasy 3D analyses of the stem sample of interest.

Sensors 2008, 8 456

The possibility to utilize LIBS for 3D analysis of element distribution within the sample is examined in Fig. 8C,D. The different layers were monitored with four subsequent laser pulses. We should note that in spite to the fact that on the frame of this exploratory study the depth of ablation craters was not measured, the different distribution of elements within the analyzed layers is clearly observable. On the ongoing work an upgrade of the instrumental device for simultaneous LIBS – laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) is planned. Utilizing such an apparatus, also the calibration for the main components will be possible, using selected calibration standards and measuring the depth of the ablation-craters.3.5 Biochemical indicators of environmental stress.

3.5.1 The total protein content

At the plants treated with silver(I) ions the changes were observable also in total content of proteins determined using biuret reaction. For this purpose automatic analyzer BS-200 was used. The calibration curve obtained (albumin was selected as standard) was strictly linear within the range from 1 to 1000 mg/ml (Fig. 9A). The level of water soluble proteins was markedly lower in root system, where also the difference between control plants and plants treated with silver(I) ions was mostly distinctive. In addition the total content of proteins expressively decreased with increasing silver(I) ions dose and the time of the treatment (Fig. 9B). Shoots of sunflower plants demonstrated less distinct proteins content in plants treated with silver(I) ions in comparison with root system (Fig. 9C). As we compare the results obtained by protein analysis – the total protein contents in shoot as well as root parts – we can assume on the transport of the proteins from the roots to shoots. This phenomenon can be related with the cascade of processes connecting with photosynthesis.

A BCSunflower root Sunflower shoot 0.6 0.6 4.5 control 0.1 mM 4.0 0.5 0.5 0.5 mM 3.5 1 mM 0.4 0.4 3.0

2.5 0.3 0.3 2.0 0.2 Absorbance 0.2 1.5

0.1 y = 0.0006x + 0.0162 1.0

Total content of proteins (mg/ml) content Total 0.1 of proteins (mg/ml) content Total R2 = 0.9996 0.5 0.0 0.0 0.0 0 500 1000 1234 1234 Albumin concentration (µg/ml) Treatment time (d) Treatment time (d)

Figure 9. Total content of proteins soluble in water determined spectrometrically using biuret reaction. The dependence of signal height on albumin concentration (A). Total content of proteins in root (B) and shoots (C) of sunflower plants exposed to silver(I) ions.

Sensors 2008, 8 457

3.5.2 Urease activity

One of the crucial plant enzymes, which are extremely sensitive to presence of heavy metals ions, is urease. Due to this feature the number of different biosensors to detect heavy metals was proposed [65,66]. All experiments appear from enzymes that are very carefully purified. However investigation of enzyme activities for environment pollution assessment is also interesting. Sunflower plants demonstrate measurable level of urease activity. Because of this fact we aimed on the monitoring of urease activity. For our purposes the methodology enabling urease activity determination using automated detection was optimised. Automated spectrophotometric analysator BS-200 was used. The principle of this method is based on the fact that urease decomposes carbamide into ammonia that is subsequently detectable as coloured product [65,67]. The strictly linear calibration curve is shown in Fig. 10A. Relative standard deviation was about 1.5 % and the analysis of 40 samples was realized within 30 min. For the examination of the activity of enzyme urease under our experimental conditions enzyme kinetic was observed. The measurements resulted in Michaelis-Menten constant Km 3.8 µM (Fig. 10B).

A 0.8 B 0.005 y = 0.0004x + 0.0118 Km 3.8 µM R2 = 0.9975 0.7

0.004 0.6

0.5 (1/µM/min) 0 0.003

0.4 0.14

Absorbance 0.12

0.10 0.002 0.3

0.08 Enzyme rate1/v

0.06

0.2 (1) Absorbance 0.04 0.001 0.02 y = 0.0003x + 0.0209 R2 = 0.9953 0.1 0.00 0 100 200 300 Concentration of NH (µM) 4 0.0 0

0 500 1000 1500 2000 -0.5 0.0 0.5 1.0

Concentration of NH4 (µM) Concentration of urea (1/S) (1/µM)

Figure 10. Spectrometric automated analysis of urease activity. The dependence of total amount of released ammonia on height of the obtained signal (A). Enzyme kinetic of soybean urease (B).

Sensors 2008, 8 458

AB Sunflower root Sunflower shoot 50 10 control control 0.1 mM 0.1 mM 0.5 mM 40 8 0.5 mM 1 mM 1 mM

30 (µM) 6 (µM) 4 4

20 4 Content of NH Content of NH 10 2

0 0 1234 1234 Treatment time (d) Treatment time (d)

Figure 11. The changes in urease activity in sunflower plants exposed to silver(I) ions, roots (A) and shoots (B).

Sunflower plants demonstrated higher urease activity in root system in comparison with shoots (Fig. 11A,B). The activity in roots was app. five times higher compared to shoots. If we compared the activity in treated plants with control, we found out that presence of silver(I) ions markedly enhanced the activity of urease at all applied doses of this toxic metal.

100

10 IU

Absorbance (%)

85 0204060 Silver(I) ions concentration (mM)

Figure 12. The changes of activity of commercially available urease in the presence of silver(I) ions.

Sensors 2008, 8 459

3.6 The changes of urease activity in the presence of silver(I) ions

In addition we were interested in the issue how can the presence of silver(I) ions influence the activity of purified urease. Into the solution of urea (1 mM) silver(I) ions at final concentrations 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 60; 80 and/or 100 µM were added. To this solution urease (10 IU) was added and mixture was incubated for 60 s at 37 °C under shaking (300 rpm). The samples were analysed using procedure described above. Urease activity was inhibited by silver(I) ions; concentrations higher than 20 mM quickly led to reduction in urease activity (Fig. 12).

4. Conclusion

The plants would be used as simple bioindicators of the quality of environment [68-73]. However it is absolutely necessary to understand some physiological processes that are connected with the plant response on stress. The data obtained are, despite of this fact, very encouraging to perform deeper research in this area.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge the Grant Agency of the Czech Republic (grant No. GA CR 526/07/0674) for financial support to this work.

References

1. Galvez, F.; Hogstrand, C.; McGeer, J.C.; Wood, C.M. The physiological effects of a biologically incorporated silver diet on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquat. Toxicol. 2001, 55, 95- 112. 2. Davis, A.; Drexler, J.W.; Ruby, M.V.; Nicholson, A. Micromineralogy of Mine Wastes in Relation to Lead Bioavailability, Butte, Montana. Environ. Sci. Technol. 1993, 27, 1415-1425. 3. Hogstrand, C.; Wood, C.M. Toward a better understanding of the bioavailability, physiology and toxicity of silver in fish: Implications for water quality criteria. Environ. Toxicol. Chem. 1998, 17, 547-561. 4. Mann, R.M.; Ernste, M.J.; Bell, R.A.; Kramer, J.R.; Wood, C.M. Evaluation of the protective effects of reactive sulfide on the acute toxicity of silver to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Environ. Toxicol. Chem. 2004, 23, 1204-1210. 5. Hogstrand, C.; Wood, C.M. Toward a better understanding of the bioavailability, physiology and toxicity of silver in fish: Implications for water quality criteria. Environ. Toxicol. Chem. 1998, 17, 547-561. 6. Gorsuch, J.W.; Klaine, S.J. Toxicity and fate of silver in the environment. Environ. Toxicol. Chem. 1998, 17, 537-538. 7. Song, Y.M.; Lu, X.L.; Yang, M.L.; Zheng, X.R. Study on the interaction of platinum(IV), gold(III) and silver(I) ions with DNA. Transit. Met. Chem. 2005, 30, 499-502. 8. Hossain, Z.; Huq, F. Studies on the interaction between Ag+ and DNA. J. Inorg. Biochem. 2002, 91, 398-404. 9. Clemens, S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants. Biochimie 2006, 88, 1707-1719.

Sensors 2008, 8 460

10. Zenk, M.H. Heavy metal detoxification in higher plants - A review. Gene 1996, 179, 21-30. 11. Hamer, D.H. Metallothionein. Annu. Rev. Biochem. 1986, 55, 913-951. 12. Giordani, T.; Natali, L.; Maserti, B.E.; Taddei, S.; Cavallini, A. Characterization and expression of DNA sequences encoding putative type-II metallothioneins in the seagrass Posidonia oceanica. Plant Physiol. 2000, 123, 1571-1581. 13. Sochova, I.; Hofman, J.; Holoubek, I. Using nematodes in soil ecotoxicology. Environ. Int. 2006, 32, 374-383. 14. Fichez, R.; Adjeroud, M.; Bozec, Y.M.; Breau, L.; Chancerelle, Y.; Chevillon, C.; Douillet, P.; Fernandez, J.M.; Frouin, P.; Kulbicki, M.; Moreton, B.; Ouillon, S.; Payri, C.; Perez, T.; Sasal, P.; Thebault, J. A review of selected indicators of particle, nutrient and metal inputs in coral reef lagoon systems. Aquat. Living Resour. 2005, 18, 125-147. 15. Bebianno, M.J.; Geret, F.; Hoarau, P.; Serafim, M.A.; Coelho, M.R.; Gnassia-Barelli, M.; Romeo, M. Biomarkers in Ruditapes decussatus: a potential bioindicator species. Biomarkers 2004, 9, 305-330. 16. Conti, M.E.; Cecchetti, G. Biological monitoring: lichens as bioindicators of air pollution assessment - a review. Environ. Pollut. 2001, 114, 471-492. 17. McGeoch, M.A. The selection, testing and application of terrestrial insects as bioindicators. Biol. Rev. Cambridge Philosophic. Soc. 1998, 73, 181-201. 18. Leyval, C.; Turnau, K.; Haselwandter, K. Effect of heavy metal pollution on mycorrhizal colonization and function: physiological, ecological and applied aspects. Mycorrhiza 1997, 7, 139- 153. 19. Petrlova, J.; Krizkova, S.; Zitka, O.; Hubalek, J.; Prusa, R.; Adam, V.; Wang, J.; Beklova, M.; Sures, B.; Kizek, R. Utilizing a chronopotentiometric sensor technique for metallothionein determination in fish tissues and their host parasites. Sens. Actuator B-Chem. 2007, 127, 112-119. 20. Lessire, F.; Delaunois, A.; Gustin, P.; Ansay, M. Biomarkers and bioindicators in vertebrates: importance in evaluation of quality of an ecosystem. Ann. Med. Vet. 1997, 141, 281-290. 21. Kafka, Z.; Puncocharova, J. Bioindicators in the environment monitoring. Chem. Listy 2000, 94, 909-912. 22. Wyrobek, A.J.; Schmid, T.E.; Marchetti, F. Cross-species sperm-FISH assays for chemical testing and assessing paternal risk for chromosomally abnormal pregnancies. Environ. Mol. Mutagen. 2005, 45, 271-283. 23. Sures, B. Environmental parasitology: relevancy of parasites in monitoring environmental pollution. Trends Parasitol. 2004, 20, 170-177. 24. Purcell, T.W.; Peters, J.J. Sources of silver in the environment. Environ. Toxicol. Chem. 1998, 17, 539-546. 25. Purcell, T.W.; Peters, J.J. Historical impacts of environmental regulation of silver. Environ. Toxicol. Chem. 1999, 18, 3-8. 26. Saeki, S.; Kubota, M.; Asami, T. Determination of silver in plants by flame atomic absorption spectrometry. Int. J. Environ. Anal. Chem. 1996, 64, 179-183. 27. Shamspur, T.; Mashhadizadeh, M.H.; Sheikhshoaie, I. Flame atomic absorption spectrometric determination of silver ion after preconcentration on octadecyl silica membrane disk modified with bis[5-((4-nitrophenyl)azosalicylaldehyde)] as a new Schiff base ligand. J. Anal. At. Spectrom. 2003, 18, 1407-1410.

Sensors 2008, 8 461

28. Raoof, J.B.; Ojani, R.; Kiani, A. Kinetic determination of silver ion by its perturbation on Belousov-Zhabotinskii oscillating chemical reaction using potentiometric method. Anal. Sci. 2004, 20, 883-886. 29. Safavi, A.; Iranpoor, N.; Saghir, N. Directly silica bonded analytical reagents: synthesis of 2- mercaptobenzothiazole-silica gel and its application as a new sorbent for preconcentration and determination of silver ion using solid-phase extraction method. Sep. Purif. Technol. 2004, 40, 303-308. 30. Schildkraut, D.E.; Dao, P.T.; Twist, J.P.; Davis, A.T.; Robillard, K.A. Determination of silver ions at sub microgram-per-liter levels using anodic square-wave stripping voltammetry. Environ. Toxicol. Chem. 1998, 17, 642-649. 31. Zhang, S.B.; Zhang, X.J.; Lin, X.Q. An ethylenediaminetetraacetic acid modified carbon paste electrode for the determination of silver ion. Chin. J. Anal. Chem. 2002, 30, 745-747. 32. Guo, S.X.; Khoo, S.B. Highly selective and sensitive determination of silver(I) at a poly(8- mercaptoquinoline) film modified glassy carbon electrode. Electroanalysis 1999, 11, 891-898. 33. Ye, X.Z.; Yang, Q.H.; Wang, Y.; Li, N.Q. Electrochemical behaviour of gold, silver, platinum and palladium on the glassy carbon electrode modified by chitosan and its application. Talanta 1998, 47, 1099-1106. 34. Wang, J.; Lu, J.M.; Farias, P.A.M. Remote electrochemical monitoring of trace silver. Anal. Chim. Acta 1996, 318, 151-157. 35. Mikelova, R.; Baloun, J.; Petrlova, J.; Adam, V.; Havel, L.; Petrek, J.; Horna, A.; Kizek, R. Electrochemical determination of Ag-ions in environment waters and their action on plant embryos. Bioelectrochemistry 2007, 70, 508-518. 36. Stejskal, K.; Krizkova, S.; Adam, V.; Sures, B.; Trnkova, L.; Zehnalek, J.; Hubalek, J.; Beklova, M.; Hanustiak, P.; Svobodova, Z.; Horna, A.; Kizek, R. Bio-assessing of environmental pollution via monitoring of metallothionein level using electrochemical detection. IEEE Sens. J. 2007, in press. 37. Svancara, I.; Ogorevc, B.; Hocevar, S.B.; Vytras, K. Perspectives of carbon paste electrodes in stripping potentiometry. Anal. Sci. 2002, 18, 301-305. 38. Svancara, I.; Ogorevc, B.; Novic, M.; Vytras, K. Simple and rapid determination of iodide in table salt by stripping potentiometry at a carbon-paste electrode. Anal. Bioanal. Chem. 2002, 372, 795- 800. 39. Barek, J.; Muck, A.; Wang, J.; Zima, J. Study of voltammetric determination of carcinogenic 1- nitropyrene and 1-aminopyrene using a glassy carbon paste electrode. Sensors 2004, 4, 47-57. 40. Svancara, I.; Kalcher, K.; Diewald, W.; Vytras, K. Voltammetric determination of silver at ultratrace levels using a carbon paste electrode with improved surface characteristics. Electroanalysis 1996, 8, 336-342. 41. Svancara, I.; Vytras, K.; Barek, J.; Zima, J. Carbon paste electrodes in modern electroanalysis. Crit. Rev. Anal. Chem. 2001, 31, 311-345. 42. Lawrence, N.S.; Deo, R.P.; Wang, J. Biocatalytic carbon paste sensors based on a mediator pasting liquid. Anal. Chem. 2004, 76, 3735-3739. 43. Blaedel, W.J.; Wang, J. Mixed Immobilized Enzyme-Porous Electrode Reactor. Anal. Chem. 1980, 52, 1426-1429. 44. Kizek, R.; Vacek, J.; Trnkova, L.; Klejdus, B.; Kuban, V. Electrochemical biosensors in agricultural and environmental analysis. Chem. Listy 2003, 97, 1003-1006.

Sensors 2008, 8 462

45. Masarik, M.; Kizek, R.; Kramer, K.J.; Billova, S.; Brazdova, M.; Vacek, J.; Bailey, M.; Jelen, F.; Howard, J.A. Application of avidin-biotin technology and adsorptive transfer stripping square- wave voltammetry for detection of DNA hybridization and avidin in transgenic avidin maize. Anal. Chem. 2003, 75, 2663-2669. 46. Petrlova, J.; Masarik, M.; Potesil, D.; Adam, V.; Trnkova, L.; Kizek, R. Zeptomole detection of streptavidin using carbon paste electrode and square wave voltammetry. Electroanalysis 2007, 19, 1177-1182. 47. Berry, W.J.; Cantwell, M.G.; Edwards, P.A.; Serbst, J.R.; Hansen, D.J. Predicting toxicity of sediments spiked with silver. Environ. Toxicol. Chem. 1999, 18, 40-48. 48. Bury, N.R.; McGeer, J.C.; Wood, C.M. Effects of altering freshwater chemistry on physiological responses of rainbow trout to silver exposure. Environ. Toxicol. Chem. 1999, 18, 49-55. 49. Bury, N.R.; Galvez, F.; Wood, C.M. Effects of chloride, calcium, and dissolved organic carbon on silver toxicity: Comparison between rainbow trout and fathead minnows. Environ. Toxicol. Chem. 1999, 18, 56-62. 50. Bianchini, A.; Wood, C.M. Mechanism of acute silver toxicity in Daphnia magna. Environ. Toxicol. Chem. 2003, 22, 1361-1367. 51. Bianchini, A.; Bowles, K.C.; Brauner, C.J.; Gorsuch, J.W.; Kramer, J.R.; Wood, C.M. Evaluation of the effect of reactive sulfide on the acute toxicity of silver (I) to Daphnia magna. part 2: Toxicity results. Environ. Toxicol. Chem. 2002, 21, 1294-1300. 52. Bianchini, A.; Grosell, M.; Gregory, S.M.; Wood, C.M. Acute silver toxicity in aquatic animals is a function of sodium uptake rate. Environ. Sci. Technol. 2002, 36, 1763-1766. 53. Call, D.J.; Polkinghorne, C.N.; Markee, T.P.; Brooke, L.T.; Geiger, D.L.; Gorsuch, J.W.; Robillard, K.A. Silver toxicity to Chironomus tentans in two freshwater sediments. Environ. Toxicol. Chem. 1999, 18, 30-39. 54. Karen, D.J.; Ownby, D.R.; Forsythe, B.L.; Bills, T.P.; La Point, T.W.; Cobb, G.B.; Klaine, S.J. Influence of water quality on silver toxicity to rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), fathead minnows (Pimephales promelas), and water fleas (Daphnia magna). Environ. Toxicol. Chem. 1999, 18, 63-70. 55. Morgan, T.P.; Wood, C.M. A relationship between gill silver accumulation and acute silver toxicity in the freshwater rainbow trout: Support for the acute silver biotic ligand model. Environ. Toxicol. Chem. 2004, 23, 1261-1267. 56. Ratte, H.T. Bioaccumulation and toxicity of silver compounds: A review. Environ. Toxicol. Chem. 1999, 18, 89-108. 57. Miziolek, A.W.; Palleschi, V.; Schecher, I. Laser-Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS), Cambridge University Press, 2006; 58. Buckley, S.G. LIBS comes on strong. Laser Focus World 2006, 42, 95-98. 59. Radziemski, L.J.; Loree, T.R.; Cremers, D.A.; Hoffman, N.M. Time-Resolved Laser-Induced Breakdown Spectrometry of Aerosols. Anal. Chem. 1983, 55, 1246-1252. 60. Cremers, D.A.; Radziemski, L.J. Detection of Chlorine and Fluorine in Air by Laser-Induced Breakdown Spectrometry. Anal. Chem. 1983, 55, 1252-1256. 61. Martin, M.Z.; Wullschleger, S.D.; Garten, C.T.; Palumbo, A.V.; Smith, J.G. Elemental analysis of environmental and biological samples using laser-induced breakdown spectroscopy and pulsed Raman spectroscopy. J. Dispersion Sci. Technol. 2004, 25, 687-694.

Sensors 2008, 8 463

62. Samek, O.; Lambert, J.; Hergenroder, R.; Liska, M.; Kaiser, J.; Novotny, K.; Kukhlevsky, S. Femtosecond laser spectrochemical analysis of plant samples. Laser Phys. Lett. 2006, 3, 21-25. 63. Kaiser, J.; Samek, O.; Reale, L.; Liska, M.; Malina, R.; Ritucci, A.; Poma, A.; Tucci, A.; Flora, F.; Lai, A.; Mancini, L.; Tromba, G.; Zanini, F.; Faenov, A.; Pikuz, T.; Cinque, G. Monitoring of the heavy-metal hyperaccumulation in vegetal tissues by X-ray radiography and by femto-second laser induced breakdown spectroscopy. Microsc. Res. Tech. 2007, 70, 147-153. 64. Limpert, E.; Stahel, W.A.; Abbt, M. Log-normal distributions across the sciences: Keys and clues. Bioscience 2001, 51, 341-352. 65. Hubalek, J.; Hradecky, J.; Adam, V.; Krystofova, O.; Huska, D.; Masarik, M.; Trnkova, L.; Horna, A.; Klosova, K.; Adamek, M.; Zehnalek, J.; Kizek, R. Spectrometric and voltammetric analysis of urease – Nickel nanoelectrode as an electrochemical sensor. Sensors 2007, 7, 1238-1255. 66. Xu, Z.; Chen, X.; Qu, X.H.; Jia, J.B.; Dong, S.J. Single-wall carbon nanotube-based voltammetric sensor and biosensor. Biosens. Bioelectron. 2004, 20, 579-584. 67. Witte, C.P.; Medina-Escobar, N. In-gel detection of urease with nitroblue tetrazolium and quantification of the enzyme from different crop plants using the indophenol reaction. Anal. Biochem. 2001, 290, 102-107. 68. Petrek, J.; Vitecek, J.; Vlasinova, H.; Kizek, R.; Kramer, K.J.; Adam, V.; Klejdus, B.; Havel, L. Application of computer imaging, stripping voltammetry and mass spectrometry for study of the effect of lead (Pb-EDTA) on growth and viability of early somatic embryos of Norway spruce (Picea abies /L./ Karst.). Anal. Bioanal. Chem. 2005, 383, 576-586. 69. Supalkova, V.; Beklova, M.; Baloun, J.; Singer, C.; Sures, B.; Adam, V.; Huska, D.; Pikula, J.; Rauscherova, L.; Havel, L.; Zehnalek, J.; Kizek, R. Affecting of aquatic vascular plant Lemna minor by cisplatin revealed by voltammetry. Bioelectrochemistry 2007, in press. 70. Supalkova, V.; Huska, D.; Diopan, V.; Hanustiak, P.; Zitka, O.; Stejskal, K.; Baloun, J.; Pikula, J.; Havel, L.; Zehnalek, J.; Adam, V.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Kizek, R. Electroanalysis of plant thiols. Sensors 2007, 7, 932-959. 71. Supalkova, V.; Petrek, J.; Baloun, J.; Adam, V.; Bartusek, K.; Trnkova, L.; Beklova, M.; Diopan, V.; Havel, L.; Kizek, R. Multi-instrumental investigation of affecting of early somatic embryos of Spruce by cadmium(II) and lead(II) ions. Sensors 2007, 7, 743-759. 72. Vitecek, J.; Adam, V.; Petrek, J.; Vacek, J.; Kizek, R.; Havel, L. Esterases as a marker for the growth of BY-2 tobacco cells and early somatic embryos of the norway spruce. Plant. Cell. Tiss. Org. 2004, 79, 195-201. 73. Zitka, O.; Stejskal, K.; Kleckerova, A.; Adam, V.; Beklova, M.; Horna, A.; Havel, L.; Kizek, R. Utilizing of electrochemical techniques for detection of biological samples. Chem. Listy 2007, 101, 225-231.

6 ZÁVĚR

Geonomické studie ukázaly, že je nutné soustředit pozornost na další „omy“, díky jejichž studiu budeme schopni lépe porozumět dějům probíhajícím nejen na úrovni buňky ale také celistvého organismu. Jednou z progresivních oblastí omických věd je metabolomika. V překládané doktorské dizertační práci jsme zaměřili naši pozornost na studium změn metabolomu Helianthus annuus L., která byla vystavena působení iontů těžkých kovů. Pro účely komplexní hodnocení působení iontů kovů jsme sledovali řadu metabolomických parametrů, jako aktivita vybraných enzymů (ALT, AST, ureáza) a peptidů (GSH, GSSG, PC) souvisejících s obranou rostliny pro negativnímu působení iontů těžkých kovů. Jsme se zaměřili na studium transportu a ukládání těžkých kovů v rostlinných pletivech. Samotné metodické postupy, které byly automatizovány a ověřeny analýzou velkého množství biologického materiálu, nám daly možnost nového pohledu na metabolické změny u Helianthus annuus L. vystavených působení kademnatých, olovnatých a stříbrných iontů.

Kromě schopnosti přijímat těžké kovy, rostliny Helianthus annuus L. vykazovaly změny v aktivitě sledovaných enzymů a v obsahu vybraných obraných thiolů v takové míře, že lze usuzovat na aktivní kooperaci enzymatických a ne-enzymatických obranných mechanismů, které jsou postupně spouštěny. Získané výsledky nám ukázaly, že všechny sledované markery souvisí s detoxikací těžkých kovů, ale jejich zapojení závisí na dávce iontu těžkého kovu. Díky pozorovanému postupnému zapojování jednotlivých mechanismů lze říci, že jsou rostliny Helianthus annuus L. schopny odolat zvýšenému stresu spojeného s působením iontů těžkých kovů. Dále byl potvrzen potenciál Helianthus annuus L. přijímat těžké kovy a v menší míře je transportovat do nadzemních částí, což je klíčová vlastnost pro využití těchto rostlin ve fytoremediačních technologiích. Pozorovaný transport ovšem nebyl srovnatelný s definicí, kterou musí splňovat zařazení těchto rostlin do hyperakmulutátorů. Avšak pomocí genetických modifikací by bylo možné tuto vlastnost zlepšit.

147

7 LITERATURA

ADRIANO, D. C.; WENZEL, W. W.; VANGRONSVELD, J.; BOLAN, N. S. Role of assisted natural remediation in environmental cleanup. Geoderma, 2004, roč. 122. č. 2-4, s. 121-142. ISSN 0016-7061.

AKERMOUN, M.; TESTET, E.; CASSAGNE, C.; BESSOULE, J. J. Inhibition of the plastidial phosphatidylcholine synthesis by silver, copper, lead and mercury induced by formation of mercaptides with the lyso-PC acyltransferase. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids, 2002, roč. 1581. č. 1-2, s. 21-28. ISSN 1388-1981.

ALVARENGA, P.; GONCALVES, A. P.; FERNANDES, R. M.; DE VARENNES, A.; VALLINI, G.; DUARTE, E.; CUNHA-QUEDA, A. C. Organic residues as immobilizing agents in aided phytostabilization: (I) Effects on soil chemical characteristics. Chemosphere, 2009, roč. 74. č. 10, s. 1292-1300. ISSN 0045- 6535.

ANDERSON, M. E. Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chemico-Biological Interactions, 1998, roč. 112. č., s. 1-14. ISSN 0009-2797.

ARDUINI, I.; MASONI, A.; MARIOTTI, M.; ERCOLI, L. Low cadmium application increase miscanthus growth and cadmium translocation. Environmental and Experimental Botany, 2004, roč. 52. č. 2, s. 89-100. ISSN 0098-8472.

ARTHUR, E. L.; RICE, P. J.; ANDERSON, T. A.; BALADI, S. M.; HENDERSON, K. L. D.; COATS, J. R. Phytorernediation - An overview. Critical Reviews in Plant Sciences, 2005, roč. 24. č. 2, s. 109-122. ISSN 0735-2689.

ASENSI, M.; SASTRE, J.; PALLARDO, F. V.; LLORET, A.; LEHNER, M.; GARCIA-DE-LA ASUNCION, J.; VINA, J., Ratio of reduced to oxidized glutathione as indicator of oxidative stress status and DNA damage. Oxidants and Antioxidants, Pt A. San Diego: Academic Press Inc, 1999 (vol 299). ISBN 0076-6879

148

AZEVEDO, H.; PINTO, C. G. G.; SANTOS, C. Cadmium effects in sunflower: Nutritional imbalances in plants and calluses. Journal of Plant Nutrition, 2005, roč. 28. č. 12, s. 2221-2231. ISSN 0190-4167.

BAKER, A. J. M.; BROOKS, R. R. Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements - A review of their distribution ecology and phytochemistry. Biorecovery, 1989, roč. 1. č., s. 81-126. ISSN

BAKER, A. J. M.; MCGRATH, S. P.; SIDOLI, C. M. D.; REEVES, R. D. The Possibility of in-Situ Heavy-Metal Decontamination of Polluted Soils Using Crops of Metal-Accumulating Plants. Resources Conservation and Recycling, 1994, roč. 11. č. 1-4, s. 41-49. ISSN 0921-3449.

BAKER, C. J.; ORLANDI, E. W. Active Oxygen in Plant Pathogenesis. Annual Review of Phytopathology, 1995, roč. 33. č., s. 299-321. ISSN 0066-4286.

BERKELAAR, E.; HALE, B. The relationship between root morphology and cadmium accumulation in seedlings of two durum wheat cultivars. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique, 2000, roč. 78. č. 3, s. 381-387. ISSN 0008-4026.

BLOEM, E.; HANEKLAUS, S.; SALAC, I.; WICKENAUSER, P.; SCHNUG, E. Facts and fiction about sulfur metabolism in relation to plant-pathogen interactions. Plant Biology, 2007, roč. 9. č. 5, s. 596-607. ISSN 1435-8603.

BLUM, R.; BECK, A.; KORTE, A.; STENGEL, A.; LETZEL, T.; LENDZIAN, K.; GRILL, E. Function of phytochelatin synthase in catabolism of glutathione- conjugates. Plant Journal, 2007, roč. 49. č. 4, s. 740-749. ISSN 0960-7412.

BOHLMANN, H.; APEL, K. Thionins. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1991, roč. 42. č., s. 227-240. ISSN 0066-4294.

BOROVICKA, J.; RANDA, Z.; JELINEK, E.; KOTRBA, P.; DUNN, C. E. Hyperaccumulation of silver by Amanita strobiliformis and related species of the section Lepidella. Mycological research, 2007, roč. 111. č., s. 1339-1344. ISSN 0953-7562.

BROADLEY, M. R.; WHITE, P. J.; HAMMOND, J. P.; ZELKO, I.; LUX, A. Zinc in plants. New Phytol., 2007, roč. 173. č. 4, s. 677-702. ISSN 0028-646X.

149

BURTON, K. W.; MORGAN, E.; ROIG, A. The Influence of Heavy-Metals Upon the Growth of Sitka-Spruce in South-Wales Forests .2. Greenhouse Experiments. Plant and Soil, 1984, roč. 78. č. 3, s. 271-282. ISSN 0032-079X.

BUSSE, F.; OMIDI, L.; LEICHTLE, A.; WINDGASSEN, M.; KLUGE, E.; STUMVOLL, M. Lead poisoning due to adulterated marijuana. New England Journal of Medicine, 2008, roč. 358. č. 15, s. 1641-1642. ISSN 0028-4793.

CALL, D. J.; POLKINGHORNE, C. N.; MARKEE, T. P.; BROOKE, L. T.; GEIGER, D. L.; GORSUCH, J. W.; ROBILLARD, K. A. Silver toxicity to Chironomus tentans in two freshwater sediments. Environmental Toxicology and Chemistry, 1999, roč. 18. č. 1, s. 30-39. ISSN 0730-7268.

CALLAHAN, D. L.; BAKER, A. J. M.; KOLEV, S. D.; WEDD, A. G. Metal ion ligands in hyperaccumulating plants. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 2006, roč. 11. č. 1, s. 2-12. ISSN 0949-8257.

CAMPBELL, P. G. C.; ERRECALDE, O.; FORTIN, C.; HIRIART-BAER, W. R.; VIGNEAULT, B. Metal bioavailability to phytoplankton - applicability of the biotic ligand model. Comparative Biochemistry Physiology C-Toxicology & Pharmacology, 2002, roč. 133. č. 1-2, s. 189-206. ISSN 1532-0456.

CATALDO, D. A.; GARLAND, T. R.; WILDUNG, R. E. Cadmium uptake kinetics in intact soybean plants Plant Physiology, 1983, roč. 73. č. 3, s. 844-848. ISSN 0032-0889.

CERTINI, G. Effects of fire on properties of forest soils: a review. Oecologia, 2005, roč. 143. č. 1, s. 1-10. ISSN 0029-8549.

CLEMENS, S. Evolution and function of phytochelatin synthases. Journal of Plant Physiology, 2006, roč. 163. č. 3, s. 319-332. ISSN 0176-1617.

CLEMENS, S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants. Biochimie, 2006, roč. 88. č. 11, s. 1707-1719. ISSN 0300- 9084.

CLEMENS, S.; PERSOH, D. Multi-tasking phytochelatin synthases. Plant Science, 2009, roč. 177. č. 4, s. 266-271. ISSN 0168-9452.

150

CLEMENTE, R.; ALMELA, C.; BERNAL, M. P. A remediation strategy based on active phytoremediation followed by natural attenuation in a soil contaminated by pyrite waste. Environmental Pollution, 2006, roč. 143. č. 3, s. 397-406. ISSN 0269-7491.

CLEMENTE, R.; WALKER, D. J.; BERNAL, M. P. Uptake of heavy metals and As by Brassica juncea grown in a contaminated soil in Aznalcollar (Spain): The effect of soil amendments. Environmental Pollution, 2005, roč. 138. č. 1, s. 46-58. ISSN 0269-7491.

COBBETT, C. S. Phytochelatin biosynthesis and function in heavy-metal detoxification. Current Opinion in Plant Biology, 2000, roč. 3. č. 3, s. 211-216. ISSN 1369-5266.

COEN, N.; MOTHERSILL, C.; KADHIM, M.; WRIGHT, E. G. Heavy metals of relevance to human health induce genomic instability. Journal of Pathology, 2001, roč. 195. č. 3, s. 293-299. ISSN 0022-3417.

COHEN, C. K.; FOX, T. C.; GARVIN, D. F.; KOCHIAN, L. V. The role of iron- deficiency stress responses in stimulating heavy-metal transport in plants. Plant Physiology, 1998, roč. 116. č. 3, s. 1063-1072. ISSN 0032-0889.

COSTA, G.; MOREL, J. L. Cadmium uptake by Lupinus Albus (L) - Cadmium excretion, a possible mechanism of cadmium tolerance. Journal of Plant Nutrition, 1993, roč. 16. č. 10, s. 1921-1929. ISSN 0190-4167.

COSTA, G.; MOREL, J. L. Efficiency of H+-ATPase activity on cadmium uptake by 4 cultivars of lettuce. Journal of Plant Nutrition, 1994, roč. 17. č. 4, s. 627-637. ISSN 0190-4167.

DAI, Y. H.; FAN, Z. Y. Lead poisoning in Chinese children: risk factors and preventive measures. World Journal of Pediatrics, 2007, roč. 3. č. 2, s. 85-86. ISSN 1708- 8569.

DALCORSO, G.; FARINATI, S.; MAISTRI, S.; FURINI, A. How plants cope with cadmium: Staking all on metabolism and gene expression. Journal of Integrative Plant Biology, 2008, roč. 50. č. 10, s. 1268-1280. ISSN 1672-9072.

151

DALLE-DONNE, I.; ROSSI, R.; GIUSTARINI, D.; COLOMBO, R.; MILZANI, A. S- glutathionylation in protein redox regulation. Free Radical Biology and Medicine, 2007, roč. 43. č. 6, s. 883-898. ISSN 0891-5849.

DAS, P.; SAMANTARAY, S.; ROUT, G. R. Studies on cadmium toxicity in plants: A review. Environmental Pollution, 1997, roč. 98. č. 1, s. 29-36. ISSN 0269-7491.

DE LA ROSA, G.; PERALTA-VIDEA, J. R.; CRUZ-JIMENEZ, G.; DUARTE- GARDEA, M.; MARTINEZ-MARTINEZ, A.; CANO-AGUILERA, I.; SHARMA, N. C.; SAHI, S. V.; GARDEA-TORRESDEY, J. L. Role of ethylenediaminetetraacetic acid on lead uptake and translocation by tumbleweed (Salsola kali L.). Environmental Toxicology and Chemistry, 2007, roč. 26. č. 5, s. 1033-1039. ISSN 0730-7268.

DE MELO, W. J.; AGUIAR, P. D.; DE MELO, G. M. P.; DE MELO, V. P. Nickel in a tropical soil treated with sewage sludge and cropped with maize in a long-term field study. Soil Biology & Biochemistry, 2007, roč. 39. č. 6, s. 1341-1347. ISSN 0038-0717.

DEGRAEVE, N. Carcinogenic, Teratogenic and Mutagenic Effects of Cadmium. Mutation Research, 1981, roč. 86. č. 1, s. 115-135. ISSN

DI TOPPI, L. S.; GABBRIELLI, R. Response to cadmium in higher plants. Environmental and Experimental Botany, 1999, roč. 41. č. 2, s. 105-130. ISSN 0098-8472.

DIETZ, A. C.; SCHNOOR, J. L. Advances in phytoremediation. Environmental Health Perspectives, 2001, roč. 109. č., s. 163-168. ISSN 0091-6765.

DIXON, N. E.; GAZZOLA, C.; BLAKELEY, R. L.; ZERNER, B. Jack-Bean Urease (EC 3.5.1.5) - Metalloenzyme - Simple Biological Role for Nickel. Journal of The American Chemical Socienty, 1975, roč. 97. č. 14, s. 4131-4133. ISSN 0002-7863.

DO NASCIMENTO, C. W. A.; XING, B. S. Phytoextraction: A review on enhanced metal availability and plant accumulation. Scientia Agricola, 2006, roč. 63. č. 3, s. 299-311. ISSN 0103-9016.

152

DOMAZLICKA, E.; OPATRNY, Z. The effect of cadmium on tobacco cell culture and the selection of potentially Cd-resistant cell-lines. Biologia Plantarum, 1989, roč. 31. č. 1, s. 19-27. ISSN 0006-3134.

DOS SANTOS, C. L. V.; GOMES, S.; CALDEIRA, G. Comparative responses of Helianthus annuus plants and calli exposed to NaCl: II. Selection of stable salt tolerant calli cell lines and evaluation of osmotic adjustment and morphogenic capacity. Journal of Plant Physiology, 2000, roč. 156. č. 1, s. 68-74. ISSN 0176- 1617.

DROUX, M. Sulfur assimilation and the role of sulfur in plant metabolism: a survey. Photosynthesis Research, 2004, roč. 79. č. 3, s. 331-348. ISSN 0166-8595.

DUSHENKOV, V.; KUMAR, P.; MOTTO, H.; RASKIN, I. Rhizofiltration - The use of plants to remove heavy-metals from aqueous streams. Environmental Science & Technology, 1995, roč. 29. č. 5, s. 1239-1245. ISSN 0013-936X.

EICK, M. J.; PEAK, J. D.; BRADY, P. V.; PESEK, J. D. Kinetics of lead adsorption/desorption on goethite: Residence time effect. Soil Science, 1999, roč. 164. č. 1, s. 28-39. ISSN 0038-075X.

ERNST, W. H. O. Bioavailability of heavy metals and decontamination of soils by plants. Applied Geochemistry, 1996, roč. 11. č. 1-2, s. 163-167. ISSN 0883- 2927.

ERNST, W. H. O.; KRAUSS, G. J.; VERKLEIJ, J. A. C.; WESENBERG, D. Interaction of heavy metals with the sulphur metabolism in angiosperms from an ecological point of view. Plant Cell and Environment, 2008, roč. 31. č. 1, s. 123- 143. ISSN 0140-7791.

ERNST, W. H. O.; VERKLEIJ, J. A. C.; SCHAT, H. Metal tolerance in plants. Acta Botanica Neerlandica, 1992, roč. 41. č. 3, s. 229-248. ISSN 0044-5983.

FARMER, E. E.; DAVOINE, C. Reactive electrophile species. Current Opinion in Plant Biology, 2007, roč. 10. č. 4, s. 380-386. ISSN 1369-5266.

FELLET, G.; MARCHIOL, L.; PEROSA, D.; ZERBI, G. The application of phytoremediation technology in a soil contaminated by pyrite cinders. Ecological Engineering, 2007, roč. 31. č. 3, s. 207-214. ISSN 0925-8574.

153

FIDLER, M.; KOLÁŘOVÁ, L. Analýza antioxidantů v chmelu a pivu. Chemické Listy, 2009, roč. 103,. č., s. 232−235. ISSN

FIEHN, O.; KOPKA, J.; DORMANN, P.; ALTMANN, T.; TRETHEWEY, R. N.; WILLMITZER, L. Metabolite profiling for plant functional genomics. Nature Biotechnology, 2000, roč. 18. č. 11, s. 1157-1161. ISSN 1087-0156.

FIGUEROA, J. A. L.; WROBEL, K.; AFTON, S.; CARUSO, J. A.; CORONA, J. F. G.; WROBEL, K. Effect of some heavy metals and soil humic substances on the phytochelatin production in wild plants from silver mine areas of Guanajuato, Mexico. Chemosphere, 2008, roč. 70. č. 11, s. 2084-2091. ISSN 0045-6535.

FJALLBORG, B.; LI, B.; NILSSON, E.; DAVE, G. Toxicity identification evaluation of five metals performed with two organisms (Daphnia magna and Lactuca sativa). Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2006, roč. 50. č. 2, s. 196-204. ISSN 0090-4341.

GAO, B.; LIU, Y.; SUN, K.; LIANG, X. R.; PENG, P.; SHENG, G.; FU, J. Precise determination of cadmium and lead isotopic compositions in river sediments. Analytica Chimica Acta, 2008, roč. 612. č. 1, s. 114-120. ISSN 0003-2670.

GARCIA-OLMEDO, F.; MOLINA, A.; ALAMILLO, J. M.; RODRIGUEZ- PALENZUELA, P. Plant defense peptides. Biopolymers, 1998, roč. 47. č. 6, s. 479-491. ISSN 0006-3525.

GICHNER, T.; PATKOVA, Z.; SZAKOVA, J.; ZNIDAR, I.; MUKHERJEE, A. DNA damage in potato plants induced by cadmium, ethyl methanesulphonate and gamma-rays. Environmental and Experimental Botany, 2008, roč. 62. č. 2, s. 113-119. ISSN 0098-8472.

GLOSER, J.; HAVEL, L.; KERKULE, J.; MACHACKOVA, I.; NATR, L.; PRASIL, I.; PROCHAZKA, S.; SLADKY, Z.; SANTRUCEK, J.; SEBANEK, J.; TESAROVA, M.; VYSKOT, B., Fyziologie rostlin. Praha: Academia, 1998. ISBN 80-200-0586-2

GORSUCH, J. W.; KLAINE, S. J. Toxicity and fate of silver in the environment. Environmental Toxicology and Chemistry, 1998, roč. 17. č. 4, s. 537-538. ISSN 0730-7268.

154

GOUPIL, P.; SOUGUIR, D.; FERJANI, E.; FAURE, O.; HITMI, A.; LEDOIGT, G. Expression of stress-related genes in tomato plants exposed to arsenic and chromium in nutrient solution. Journal of Plant Physiology, 2009, roč. 166. č. 13, s. 1446-1452. ISSN 0176-1617.

GREENWOOD N.N., E. A., Chemie prvků. Praha: Informatorium, 1993. ISBN 80- 85427-38-9

GREGER, M.; JOHANSSON, M. Cadmium effects on leaf transpiration of sugar beet (Beta Vulgaris). Physiologia Plantarum, 1992, roč. 86. č. 3, s. 465-473. ISSN 0031-9317.

GRILL, E.; WINNACKER, E. L.; ZENK, M. H. Phytochelatins - the Principal Heavy- Metal Complexing Peptides of Higher-Plants. Science, 1985, roč. 230. č. 4726, s. 674-676. ISSN 0036-8075.

GUBBINS, E. J.; BATTY, L. C.; LEAD, J. R. Phytotoxicity of silver nanoparticles to Lemna minor L. Environmental Pollution, 2011, roč. 159. č. 6, s. 1551-1559. ISSN 0269-7491.

GYAMFI, M. A.; YONAMINE, M.; ANIYA, Y. Free-radical scavenging action of medicinal herbs from Ghana Thonningia sanguinea on experimentally-induced liver injuries. General Pharmacology, 1999, roč. 32. č. 6, s. 661-667. ISSN 0306-3623.

HALL, J. L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of Experimental Botany, 2002, roč. 53. č. 366, s. 1-11. ISSN 0022-0957.

HAN, F.; SHAN, X. Q.; ZHANG, S. Z.; WEN, B.; OWENS, G. Enhanced cadmium accumulation in maize roots - the impact of organic acids. Plant and Soil, 2006, roč. 289. č. 1-2, s. 355-368. ISSN 0032-079X.

HANIKENNE, M. Chlamydomonas reinhardtii as a eukaryotic photosynthetic model for studies of heavy metal homeostasis and tolerance. New Phytologist, 2003, roč. 159. č. 2, s. 331-340. ISSN 0028-646X.

HANSCH, R.; MENDEL, R. R. Sulfite oxidation in plant peroxisomes. Photosynthesis Research, 2005, roč. 86. č. 3, s. 337-343. ISSN 0166-8595.

155

HARRIS, A. T.; BALI, R. On the formation and extent of uptake of silver nanoparticles by live plants. Journal of Nanoparticle Research, 2008, roč. 10. č. 4, s. 691-695. ISSN 1388-0764.

HARRIS, N. S.; TAYLOR, G. J. Remobilization of cadmium in maturing shoots of near isogenic lines of durum wheat that differ in grain cadmium accumulation. Journal of Experimental Botany, 2001, roč. 52. č. 360, s. 1473-1481. ISSN 0022-0957.

HART, J. J.; WELCH, R. M.; NORVELL, W. A.; KOCHIAN, L. V. Transport interactions between cadmium and zinc in roots of bread and durum wheat seedlings. Physiologia Plantarum, 2002, roč. 116. č. 1, s. 73-78. ISSN 0031- 9317.

HART, J. J.; WELCH, R. M.; NORVELL, W. A.; SULLIVAN, L. A.; KOCHIAN, L. V. Characterization of cadmium binding, uptake, and translocation in intact seedlings of bread and durum wheat cultivars. Plant Physiology, 1998, roč. 116. č. 4, s. 1413-1420. ISSN 0032-0889.

HASEGAWA, P. M.; BRESSAN, R. A.; ZHU, J. K.; BOHNERT, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 2000, roč. 51. č., s. 463-499. ISSN 1040-2519.

HATCH, M. D.; MAU, S. L. Activity, location, and role of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase isoenzymes in leaves with C4 pathway photosynthesis. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1973, roč. 156. č. 1, s. 195-206. ISSN 0003-9861.

HE, J. Y.; ZHU, C.; REN, Y. F.; JIANG, D. A.; SUN, Z. X. Root morphology and cadmium uptake kinetics of the cadmium-sensitive rice mutant. Biologia Plantarum, 2007, roč. 51. č. 4, s. 791-794. ISSN 0006-3134.

HENDRY, G. A. F.; BAKER, A. J. M.; EWART, C. F. Cadmium Tolerance and Toxicity, Oxygen Radical Processes and Molecular Damage in Cadmium- Tolerant and Cadmium-Sensitive Clones of Holcus-Lanatus L. Acta Botanica Neerlandica, 1992, roč. 41. č. 3, s. 271-281. ISSN 0044-5983.

HILPERT, B.; BOHLMANN, H.; OP DEN CAMP, R.; PRZYBYLA, D.; MIERSCH, O.; BUCHALA, A.; APEL, K. Isolation and characterization of signal

156

transduction mutants of Arabidopsis thaliana that constitutively activate the octadecanoid pathway and form necrotic microlesions. Plant Journal, 2001, roč. 26. č. 4, s. 435-446. ISSN 0960-7412.

HIRATA, K.; TSUJI, N.; MIYAMOTO, K. Biosynthetic regulation of phytochelatins, heavy metal-binding peptides. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005, roč. 100. č. 6, s. 593-599. ISSN 1389-1723.

HIRSCH, M. P. Availability of sludge-borne silver to agricultural crops. Environmental Toxicology and Chemistry, 1998, roč. 17. č. 4, s. 610-616. ISSN 0730-7268.

HOODA, V. Phytoremediation of toxic metals from soil and waste water. Journal of Environmental Biology, 2007, roč. 28. č. 2, s. 367-376. ISSN 0254-8704.

HOSSAIN, Z.; HUQ, F. Studies on the interaction between Ag+ and DNA. Journal of Inorganic Biochemistry, 2002, roč. 91. č. 2, s. 398-404. ISSN 0162-0134.

HOWE, G.; MERCHANT, S. Heavy Metal-Activated Synthesis of Peptides in Chlamydomonas-Reinhardtii. Plant Physiol., 1992, roč. 98. č. 1, s. 127-136. ISSN 0032-0889.

HOWE, G.; MERCHANT, S. Heavy Metal-Activated Synthesis of Peptides in Chlamydomonas-Reinhardtii. Plant Physiology, 1992, roč. 98. č. 1, s. 127-136. ISSN 0032-0889.

HUANG, J. L.; LI, Q. B.; SUN, D. H.; LU, Y. H.; SU, Y. B.; YANG, X.; WANG, H. X.; WANG, Y. P.; SHAO, W. Y.; HE, N.; HONG, J. Q.; CHEN, C. X. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles by novel sundried Cinnamomum camphora leaf. Nanotechnology, 2007, roč. 18. č. 10, s. ISSN 0957-4484.

CHANEY, R. L.; MALIK, M.; LI, Y. M.; BROWN, S. L.; BREWER, E. P.; ANGLE, J. S.; BAKER, A. J. M. Phytoremediation of soil metals. Current Opinion Biotechnology, 1997, roč. 8. č. 3, s. 279-284. ISSN 0958-1669.

CHEN, J. J.; ZHOU, J. M.; GOLDSBROUGH, P. B. Characterization of phytochelatin synthase from tomato. Physiolgia Plantarum, 1997, roč. 101. č. 1, s. 165-172. ISSN 0031-9317.

157

CHEN, S. L.; KAO, C. H. Cd Induced Changes in Proline Level and Peroxidase- Activity in Roots of Rice Seedlings. Plant Growth Regulation, 1995, roč. 17. č. 1, s. 67-71. ISSN 0167-6903.

CHEN, Y. H.; LI, X. D.; SHEN, Z. G. Leaching and uptake of heavy metals by ten different species of plants during an EDTA-assisted phytoextraction process. Chemosphere, 2004, roč. 57. č. 3, s. 187-196. ISSN 0045-6535.

IBAR, C.; ORELLANA, A. The import of S-Adenosylmethionine into the golgi apparatus is required for the methylation of homogalacturonan. Plant Physiology, 2007, roč. 145. č. 2, s. 504-512. ISSN 0032-0889.

JACOB, C.; GILES, G. L.; GILES, N. M.; SIES, H. Sulfur and selenium: The role of oxidation state in protein structure and function. Angewandte Chemie- International Edition, 2003, roč. 42. č. 39, s. 4742-4758. ISSN 1433-7851.

JADIA, C. D.; FULEKAR, M. H. Phytoremediation: The application of vermicompost to remove zinc, cadmium, copper, nickel and lead by sunflower plant. Environmental Engineering and Management Journal, 2008, roč. 7. č. 5, s. 547- 558. ISSN 1582-9596.

JANUARY, M. C.; CUTRIGHT, T. J.; VAN KEULEN, H.; WEI, R. Hydroponic phytoremediation of Cd, Cr, Ni, As, and Fe: Can Helianthus annuus hyperaccumulate multiple heavy metals? Chemosphere, 2008, roč. 70. č. 3, s. 531-537. ISSN 0045-6535.

JARVIS, M. D.; LEUNG, D. W. M. Chelated lead transport in Pinus radiata: an ultrastructural study. Environmental and Experimental Botany, 2002, roč. 48. č. 1, s. 21-32. ISSN 0098-8472.

JO, Y. K.; KIM, B. H.; JUNG, G. Antifungal Activity of Silver Ions and Nanoparticles on Phytopathogenic Fungi. Plant Disease, 2009, roč. 93. č. 10, s. 1037-1043. ISSN 0191-2917.

KANCHANA, A.; AGARWAL, I.; SUNKAR, S.; NELLORE, J.; NAMASIVAYAM, K. Biogenic silver nanoparticles from spinacia oleracea and lactuca sativa and their potential antimicrobial activity. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 2011, roč. 6. č. 4, s. 1741-1750. ISSN 1842-3582.

158

KARABAL, E.; YUCEL, M.; OKTEM, H. A. Antioxidant responses of tolerant and sensitive barley cultivars to boron toxicity. Plant Science, 2003, roč. 164. č. 6, s. 925-933. ISSN 0168-9452.

KESSELER, A.; BRAND, M. D. The Mechanism of the Stimulation of State-4 Respiration by Cadmium in Potato-Tuber (Solanum-Tuberosum) Mitochondria. Plant Physiology and Biochemistry, 1995, roč. 33. č. 4, s. 519-528. ISSN 0981- 9428.

KOJIMA, S.; BOHNER, A.; VON WIREN, N. Molecular mechanisms of urea transport in plants. Journal of Membrane Biology, 2006, roč. 212. č. 2, s. 83-91. ISSN 0022-2631.

KOLLER, G.; MODER, M.; CZIHAL, K. Peroxidative degradation of selected PCB: a mechanistic study. Chemosphere, 2000, roč. 41. č. 12, s. 1827-1834. ISSN 0045- 6535.

KONDO, N.; IMAI, K.; ISOBE, M.; GOTO, T.; MURASUGI, A.; WADANAKAGAWA, C.; HAYASHI, Y. Cadystin-a and Cadystin-B, Major Unit Peptides Comprising Cadmium Binding Peptides Induced in a Fission Yeast ----- Separation, Revision of Structures and Synthesis. Tetrahedron Letters, 1984, roč. 25. č. 35, s. 3869-3872. ISSN 0040-4039.

KOONTZ, H. V.; BERLE, K. L. Silver Uptake, Distribution, and Effect on Calcium, Phosphorus, and Sulfur Uptake. Plant Physiol., 1980, roč. 65. č. 2, s. 336-339. ISSN 0032-0889.

KOVALCHUK, I.; KOVALCHUK, O. Transgenic plants as sensors of environmental pollution genotoxicity. Sensors, 2008, roč. 8. č. 3, s. 1539-1558. ISSN 1424- 8220.

KRIZKOVA, S.; ADAM, V.; KIZEK, R. Phytotoxicity of Silver Ions. Chemicke Listy, 2009, roč. 103. č. 7, s. 559-568. ISSN 0009-2770.

159

with silver(I) ions - Plants as bioindicators of environmental pollution. Sensors, 2008, roč. 8. č. 1, s. 445-463. ISSN 1424-8220.

KRYSTOFOVA, O.; SHESTIVSKA, V.; GALIOVA, M.; NOVOTNY, K.; KAISER, J.; ZEHNALEK, J.; BABULA, P.; OPATRILOVA, R.; ADAM, V.; KIZEK, R. Sunflower Plants as Bioindicators of Environmental Pollution with Lead (II) Ions. Sensors, 2009, roč. 9. č. 7, s. 5040-5058. ISSN 1424-8220.

LAMBRIX, V.; REICHELT, M.; MITCHELL-OLDS, T.; KLIEBENSTEIN, D. J.; GERSHENZON, J. The Arabidopsis epithiospecifier protein promotes the hydrolysis of glucosinolates to nitriles and influences Trichoplusia ni herbivory. Plant Cell, 2001, roč. 13. č. 12, s. 2793-2807. ISSN 1040-4651.

LARSSON, E. H.; BORNMAN, J. F.; ASP, H. Influence of UV-B radiation and Cd2+ on chlorophyll fluorescence, growth and nutrient content in Brassica napus. Journal of Experimental Botany, 1998, roč. 49. č. 323, s. 1031-1039. ISSN

LASAT, M. M. Phytoextraction of toxic metals: a review of biological mechanisms. Journal of Environmental Quality, 2002, roč. 31. č., s. 109–120. ISSN 0047- 2425.

LE FAUCHEUR, S.; SCHILDKNECHT, F.; BEHRA, R.; SIGG, L. Thiols in Scenedesmus vacuolatus upon exposure to metals and metalloids. Aquatic Toxicology, 2006, roč. 80. č. 4, s. 355-361. ISSN 0166-445X.

LEE, W. M.; KWAK, J. I.; AN, Y. J. Effect of silver nanoparticles in crop plants Phaseolus radiatus and Sorghum bicolor: Media effect on phytotoxicity. Chemosphere, 2012, roč. 86. č. 5, s. 491-499. ISSN 0045-6535.

LESTAN, D.; LUO, C. L.; LI, X. D. The use of chelating agents in the remediation of metal-contaminated soils: A review. Environmental Pollution, 2008, roč. 153. č. 1, s. 3-13. ISSN 0269-7491.

LINDQUIST, S.; CRAIG, E. A. The heat-shock proteins. Annual Review of Genetics, 1988, roč. 22. č., s. 631-677. ISSN 0066-4197.

LOMBI, E.; TEARALL, K. L.; HOWARTH, J. R.; ZHAO, F. J.; HAWKESFORD, M. J.; MCGRATH, S. P. Influence of iron status on cadmium and zinc uptake by different ecotypes of the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Plant Physiology, 2002, roč. 128. č. 4, s. 1359-1367. ISSN 0032-0889. 160

LOMBI, E.; ZHAO, F. J.; MCGRATH, S. P.; YOUNG, S. D.; SACCHI, G. A. Physiological evidence for a high-affinity cadmium transporter highly expressed in a Thlaspi caerulescens ecotype. New Phytologist, 2001, roč. 149. č. 1, s. 53- 60. ISSN 0028-646X.

LUO, C. L.; SHEN, Z. G.; LI, X. D. Enhanced phytoextraction of Cu, Pb, Zn and Cd with EDTA and EDDS. Chemosphere, 2005, roč. 59. č. 1, s. 1-11. ISSN 0045- 6535.

LUO, C. L.; SHEN, Z. G.; LI, X. D. Hot NTA application enhanced metal phytoextraction from contaminated soil. Water Air and Soil Pollution, 2008, roč. 188. č. 1-4, s. 127-137. ISSN 0049-6979.

LUX, A.; SOTTNIKOVA, A.; OPATRNA, J.; GREGER, M. Differences in structure of adventitious roots in Salix clones with contrasting characteristics of cadmium accumulation and sensitivity. Physiologia Plantarum, 2004, roč. 120. č. 4, s. 537-545. ISSN 0031-9317.

MAIER, T.; YU, C.; KULLERTZ, G.; CLEMENS, S. Localization and functional characterization of metal-binding sites in phytochelatin synthases. Planta, 2003, roč. 218. č. 2, s. 300-308. ISSN 0032-0935.

MAITANI, T.; KUBOTA, H.; SATO, K.; YAMADA, T. The composition of metals bound to class III metallothionein (phytochelatin and its desglycyl peptide) induced by various metals in root cultures of Rubia tinctorum. Plant Physiolgy, 1996, roč. 110. č. 4, s. 1145-1150. ISSN 0032-0889.

MAKSYMIEC, W. Signaling responses in plants to heavy metal stress. Acta Physiologiae Plantarum, 2007, roč. 29. č. 3, s. 177-187. ISSN 0137-5881.

MANAHAN, S. E., Enviromental chemistry. Boston: Lewis Publisher, 2000. ISBN 1- 56670-492-8

MANICI, L. M.; LAZZERI, L.; PALMIERI, S. In vitro fungitoxic activity of some glucosinolates and their enzyme-derived products toward plant pathogenic fungi. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, roč. 45. č. 7, s. 2768-2773. ISSN 0021-8561.

MARCHIOL, L.; FELLET, G.; PEROSA, D.; ZERBI, G. Removal of trace metals by Sorghum bicolor and Helianthus annuus in a site polluted by industrial wastes: 161

A field experience. Plant Physiology and Biochemistry, 2007, roč. 45. č. 5, s. 379-387. ISSN 0981-9428.

MARCHIOL, L.; SACCO, P.; ASSOLARI, S.; ZERBI, G. Reclamation of polluted soil: Phytoremediation potential of crop-related Brassica species. Water Air and Soil Pollution, 2004, roč. 158. č. 1, s. 345-356. ISSN 0049-6979.

MARSHALL, J.; CORZO, A.; LEIGH, R. A.; SANDERS, D. Membrane Potential- Dependent Calcium-Transport in Right-Side-out Plasma-Membrane Vesicles from Zea-Mays L Roots. Plant Journal, 1994, roč. 5. č. 5, s. 683-694. ISSN 0960-7412.

MATTIONI, C.; GABBRIELLI, R.; VANGRONSVELD, J.; CLIJSTERS, H. Nickel and cadmium toxicity and enzymatic activity in nitolerant and non-tolerant populations of Silene italica pers. Journal of Plant Physiology, 1997, roč. 150. č. 1-2, s. 173-177. ISSN 0176-1617.

MAZEN, A. M. A. Accumulation of four metals in tissues of Corchorus olitorius and possible mechanisms of their tolerance. Biologia Plantarum, 2004, roč. 48. č. 2, s. 267-272. ISSN 0006-3134.

MEISTER, A.; ANDERSON, M. E. Glutathione. Annual Review of Biochemistry, 1983, roč. 52. č., s. 711-760. ISSN 0066-4154.

MEMON, A. R.; SCHRODER, P. Implications of metal accumulation mechanisms to phytoremediation. Environmental Science and Pollution Research, 2009, roč. 16. č. 2, s. 162-175. ISSN 0944-1344.

MENDEZ, M. O.; MAIER, R. M. Phytostabilization of mine tailings in arid and semiarid environments - An emerging remediation technology. Environmental Health Perspectives, 2008, roč. 116. č. 3, s. 278-283. ISSN 0091-6765.

MEYERS, D. E. R.; AUCHTERLONIE, G. J.; WEBB, R. I.; WOOD, B. Uptake and localisation of lead in the root system of Brassica juncea. Environmental Pollution, 2008, roč. 153. č. 2, s. 323-332. ISSN 0269-7491.

MITTLER, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science, 2002, roč. 7. č. 9, s. 405-410. ISSN 1360-1385.

162

MOBLEY, M. L.; HAUSINGER, R. P. Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterization. Microbiological Reviews, 1989, roč. 53. č., s. 85- 108. ISSN 0146-0749.

MOHANPURIA, P.; RANA, N. K.; YADAV, S. K. Cadmium induced oxidative stress influence on glutathione metabolic genes of Camellia sinensis (L.) O. Kuntze. Environmental Toxicology, 2007, roč. 22. č. 4, s. 368-374. ISSN 1520-4081.

MORAN, L. K.; GUTTERIDGE, J. M. C.; QUINLAN, G. J. Thiols in cellular redox signalling and control. Current Medical Chemistry, 2001, roč. 8. č. 7, s. 763- 772. ISSN

MORI, S.; URAGUCHI, S.; ISHIKAWA, S.; ARAO, T. Xylem loading process is a critical factor in determining Cd accumulation in the shoots of Solanum melongena and Solanum torvum. Environmental and Experimental Botany, 2009, roč. 67. č. 1, s. 127-132. ISSN 0098-8472.

MOTTE, P.; MOSEN, H.; BRONCHART, R.; DELTOUR, R. Ultrastructural- localization of argyrophilic proteins in nucleoli of Zea Mays by 2 silver staining techniques. Biology of the Cell, 1988, roč. 64. č. 1, s. 97-100. ISSN 0248-4900.

MULLINS, G. L.; SOMMERS, L. E. Cadmium and zinc influx characteristics by intact corn (Zea Mays L) seedlings. Plant and Soil, 1986, roč. 96. č. 2, s. 153-164. ISSN 0032-079X.

MURAKAMI, M.; AE, N. Potential for phytoextraction of copper, lead, and zinc by rice (Oryza sativa L.), soybean (Glycine max L. Merr.), and maize (Zea mays L.). Journal of Hazardous Materials, 2009, roč. 162. č. 2-3, s. 1185-1192. ISSN 0304-3894.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, roč. 15. č. 3, s. 473-497. ISSN 0031-9317.

MURPHY, A.; TAIZ, L. Comparison of Metallothionein Gene-Expression and Nonprotein Thiols in 10 Arabidopsis Ecotypes - Correlation with Copper Tolerance. Plant Physiology, 1995, roč. 109. č. 3, s. 945-954. ISSN 0032-0889.

163

NAGAJYOTI, P. C.; LEE, K. D.; SREEKANTH, T. V. M. Heavy metals, occurrence and toxicity for plants: a review. Environmental Chemistry Letters, 2010, roč. 8. č. 3, s. 199-216. ISSN 1610-3653.

NAUMANN, B.; EBERIUS, M.; APPENROTH, K. J. Growth rate based dose-response relationships and EC-values of ten heavy metals using the duckweed growth inhibition test (ISO 20079) with Lemna minor L. clone St. Journal of Plant Physiology, 2007, roč. 164. č. 12, s. 1656-1664. ISSN 0176-1617.

NAVABPOUR, S.; MORRIS, K.; ALLEN, R.; HARRISON, E.; A-H-MACKERNESS, S.; BUCHANAN-WOLLASTON, V. Expression of senescence-enhanced genes in response to oxidative stress. Journal of Experimental Botany, 2003, roč. 54. č. 391, s. 2285-2292. ISSN 0022-0957.

NAVRÁTIL, T.; ROHOVEC, J. Olovo. Vesmir, 2006, roč. 85. č. 9, s. ISSN 0042-4544.

NIBBE, M.; HILPERT, B.; WASTERNACK, C.; MIERSCH, O.; APEL, K. Cell death and salicylate- and jasmonate-dependent stress responses in Arabidopsis are controlled by single cet genes. Planta, 2002, roč. 216. č. 1, s. 120-128. ISSN 0032-0935.

NIU, Z. X.; SUN, L. N.; SUN, T. H.; LI, Y. S.; WANG, H. Evaluation of phytoextracting cadmium and lead by sunflower, ricinus, alfalfa and mustard in hydroponic culture. Journal of Environmental Sciences-China, 2007, roč. 19. č. 8, s. 961-967. ISSN 1001-0742.

OBATA, H.; INOUE, N.; UMEBAYASHI, M. Effect of Cd on plasma membrane ATPase from plant roots differing in tolerance to Cd. Soil Science and Plant Nutrition, 1996, roč. 42. č. 2, s. 361-366. ISSN 0038-0768.

OGAWA, K. Glutathione-associated regulation of plant growth and stress responses. Antioxidants & Redox Signaling, 2005, roč. 7. č. 7-8, s. 973-981. ISSN 1523- 0864.

OGAWA, M.; NAKAJIMA, Y.; KUBOTA, R.; ENDO, Y. Two cases of acute lead poisoning due to occupational exposure to lead. Clinical Toxicology, 2008, roč. 46. č. 4, s. 332-335. ISSN 1556-3650.

164

PACYNA, J. M.; PACYNA, E. G.; AAS, W. Changes of emissions and atmospheric deposition of mercury, lead, and cadmium. Atmospheric Environment, 2009, roč. 43. č. 1, s. 117-127. ISSN 1352-2310.

PADMAVATHIAMMA, P. K.; LI, L. Y. Phytoremediation technology: Hyper- accumulation metals in plants. Water Air and Soil Pollution, 2007, roč. 184. č. 1-4, s. 105-126. ISSN 0049-6979.

PAJUELO, E.; CARRASCO, J. A.; ROMERO, L. C.; CHAMBER, M. A.; GOTOR, C. Evaluation of the metal phytoextraction potential of crop legumes. regulation of the expression of O-acetylserine (Thiol) Lyase under metal stress. Plant Biology, 2007, roč. 9. č. 5, s. 672-681. ISSN 1435-8603.

PARADISO, A.; BERARDINO, R.; DE PINTO, M. C.; DI TOPPI, L. S.; STORELLI, M. M.; TOMMASI, F.; DE GARA, L. Increase in ascorbate-glutathione metabolism as local and precocious systemic responses induced by cadmium in durum wheat plants. Plant and Cell Physiology, 2008, roč. 49. č. 3, s. 362-374. ISSN 0032-0781.

PAREJO, L.; CODINA, C.; PETRAKIS, C.; KEFALAS, P. Evaluation of scavenging activity assessed by Co(II)/EDTA-induced luminol chemiluminescence and DPPH center dot (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 2000, roč. 44. č. 3, s. 507-512. ISSN 1056-8719.

PARK, H.; SONG, B.; MOREL, F. M. M. Diversity of the cadmium-containing carbonic anhydrase in marine diatoms and natural waters. Environmental Microbiology, 2007, roč. 9. č. 2, s. 403-413. ISSN 1462-2912.

PASQUALINI, S.; PICCIONI, C.; REALE, L.; EDERLI, L.; DELLA TORRE, G.; FERRANTI, F. Ozone-induced cell death in tobacco cultivar Bel W3 plants. The role of programmed cell death in lesion formation. Plant Physiology, 2003, roč. 133. č. 3, s. 1122-1134. ISSN 0032-0889.

PENG, K. J.; LUO, C. L.; LOU, L. Q.; LI, X. D.; SHEN, Z. G. Bioaccumulation of heavy metals by the aquatic plants Potamogeton pectinatus L. and Potarnogeton malaianus Miq. and their potential use for contamination indicators and in

165

wastewater treatment. Science of the Total Environment, 2008, roč. 392. č. 1, s. 22-29. ISSN 0048-9697.

PERREIN-ETTAJANI, H.; AMIARD, J. C.; HAURE, J.; RENAUD, C. Effects of metals (Ag, Cd, Cu) on the biochemical composition and compartmentalization of these metals in two microalgae Skeletonema costatum and Tetraselmis suecica. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1999, roč. 56. č. 10, s. 1757-1765. ISSN 0706-652X.

PERRIGUEY, J.; STERCKEMAN, T.; MOREL, J. L. Effect of rhizosphere and plant- related factors on the cadmium uptake by maize (Zea mays L.). Environmental and Experimental Botany, 2008, roč. 63. č. 1-3, s. 333-341. ISSN 0098-8472.

PESCHEN, D.; LI, H. P.; FISCHER, R.; KREUZALER, F.; LIAO, Y. C. Fusion proteins comprising a Fusarium-specific antibody linked to antifungal peptides protect plants against a fungal pathogen. Nature Biotechnology, 2004, roč. 22. č. 6, s. 732-738. ISSN 1087-0156.

PETRLOVA, J.; MIKELOVA, R.; STEJSKAL, K.; KLECKEROVA, A.; ZITKA, O.; PETREK, J.; HAVEL, L.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; KIZEK, R. Simultaneous determination of eight biologically active thiol compounds using gradient elution-Liquid Chromatography with Coul-Array detection. Journal of Separation Science, 2006, roč. 29. č. 8, s. 1166-1173. ISSN 1615-9306.

POLACCO, J. C.; WINKLER, R. G. Soyaben leaf urease: a seed enzyme. Plant Physiol., 1984, roč. 74. č., s. 800-803. ISSN 0032-0889.

POLEC-PAWLAK, K.; RUZIK, R.; LIPIEC, E.; CIURZYNSKA, M.; GAWRONSKA, H. Investigation of Pb(II) binding to pectin in Arabidopsis thaliana. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2007, roč. 22. č. 8, s. 968-972. ISSN 0267- 9477.

PRASAD, M. N. V.; FREITAS, H. M. D. Metal hyperaccumulation in plants - Biodiversity prospecting for phytoremediation technology. Electronic Journal of Biotechnology, 2003, roč. 6. č. 3, s. 285-321. ISSN 0717-3458.

PURCELL, T. W.; PETERS, J. J. Sources of silver in the environment. Environmental Toxicology and Chemistry 1998, roč. 17. č. 4, s. 539-546. ISSN 0730-7268.

166

RATTE, H. T. Bioaccumulation and toxicity of silver compounds: A review. Environmental Toxicology and Chemistry, 1999, roč. 18. č. 1, s. 89-108. ISSN 0730-7268.

RAUSER, W. E. Phytochelatins. Annual Review of Biochemistry, 1990, roč. 59. č., s. 61-86. ISSN 0066-4154.

RAUSCH, T.; GROMES, R.; LIEDSCHULTE, V.; MULLER, I.; BOGS, J.; GALOVIC, V.; WACHTER, A. Novel insight into the regulation of GSH biosynthesis in higher plants. Plant Biology, 2007, roč. 9. č. 5, s. 565-572. ISSN 1435-8603.

RAUSCH, T.; WACHTER, A. Sulfur metabolism: a versatile platform for launching defence operations. Trends in Plant Science, 2005, roč. 10. č. 10, s. 503-509. ISSN 1360-1385.

REA, P. A.; LI, Z. S.; LU, Y. P.; DROZDOWICZ, Y. M.; MARTINOIA, E. From vacuolar GS-X pumps to multispecific ABC transporters. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1998, roč. 49. č., s. 727-760. ISSN 1040-2519.

REDJALA, T.; STERCKEMAN, T.; MOREL, J. L. Cadmium uptake by roots: Contribution of apoplast and of high- and low-affinity membrane transport systems. Environmental and Experimental Botany, 2009, roč. 67. č. 1, s. 235- 242. ISSN 0098-8472.

RIEMENSCHNEIDER, A.; WEGELE, R.; SCHMIDT, A.; PAPENBROCK, J. Isolation and characterization of a D-cysteine desulfhydrase protein from Arabidopsis thaliana. Febs Journal, 2005, roč. 272. č. 5, s. 1291-1304. ISSN 1742-464X.

SALT, D. E.; BLAYLOCK, M.; KUMAR, N.; DUSHENKOV, V.; ENSLEY, B. D.; CHET, I.; RASKIN, I. Phytoremediation - a Novel Strategy for the Removal of Toxic Metals from the Environment Using Plants. Bio-Technology, 1995, roč. 13. č. 5, s. 468-474. ISSN 0733-222X.

SALT, D. E.; KRAMER, U., Mechanisms of metal hyperaccumulation in plants. In: RASKIN, I.; ENSLEY B., eds. Phytoremediation of toxic metals: using plants to clean up the environment. New York: Wiley, 2000. ISBN 0471192546

167

SALT, D. E.; PRINCE, R. C.; PICKERING, I. J.; RASKIN, I. Mechanisms of cadmium mobility and accumulation in Indian Mustard. Plant Physiology, 1995, roč. 109. č. 4, s. 1427-1433. ISSN 0032-0889.

SALT, D. E.; WAGNER, G. J. Cadmium transport across tonoplast of vesicles from oat roots - Evidence for a Cd2+/H+ antiport activity. Journal of Biological Chemistry, 1993, roč. 268. č. 17, s. 12297-12302. ISSN 0021-9258.

SANDALIO, L. M.; DALURZO, H. C.; GOMEZ, M.; ROMERO-PUERTAS, M. C.; DEL RIO, L. A. Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants. Journal of Experimental Botany, 2001, roč. 52. č. 364, s. 2115-2126. ISSN 0022-0957.

SANTOS, C.; CALDEIRA, G. Callus formation and plant regeneration from protoplasts of sunflower calli and hypocotyls. Acta Soc. Bot. Pol., 1998, roč. 67. č. 1, s. 31- 36. ISSN 0001-6977.

SANTOS, C. V.; FALCAO, I. P.; PINTO, G. C.; OLIVEIRA, H.; LOUREIRO, J. Nutrient responses and glutamate and proline metabolism in sunflower plants

and calli under Na2SO4 stress. Journal of Plant Nutrition and Soil Science- Zeitschrift fur Pflanzenernahrung und Bodenkunde., 2002, roč. 165. č. 3, s. 366- 372. ISSN 1436-8730.

SEMANE, B.; CUYPERS, A.; SMEETS, K.; VAN BELLEGHEM, F.; HOREMANS, N.; SCHAT, H.; VANGRONSVELD, J. Cadmium responses in Arabidopsis thaliana: glutathione metabolism and antioxidative defence system. Physiologia Plantarum, 2007, roč. 129. č. 3, s. 519-528. ISSN 0031-9317.

SEMENZA, G. L. Perspectives on oxygen sensing. Cell, 1999, roč. 98. č. 3, s. 281-284. ISSN 0092-8674.

SEREGIN, I. V.; IVANOV, V. B. Physiological aspects of cadmium and lead toxic effects on higher plants. Russian Journal of Plant Physiology, 2001, roč. 48. č. 4, s. 523-544. ISSN 1021-4437.

SEREGIN, I. V.; KOZHEVNIKOVA, A. D. Roles of root and shoot tissues in transport and accumulation of cadmium, lead, nickel, and strontium. Russian Journal of Plant Physiology, 2008, roč. 55. č. 1, s. 1-22. ISSN 1021-4437.

168

SEREK, M.; WOLTERING, E. J.; SISLER, E. C.; FRELLO, S.; SRISKANDARAJAH, S. Controlling ethylene responses in flowers at the receptor level. Biotechnology Advances, 2006, roč. 24. č. 4, s. 368-381. ISSN 0734-9750.

SEXTON, A. C.; KIRKEGAARD, J. A.; HOWLETT, B. J. Glucosinolates in Brassica juncea and resistance to Australian isolates of Leptosphaeria maculans, the blackleg fungus. Australasian Plant Pathology, 1999, roč. 28. č. 2, s. 95-102. ISSN 0815-3191.

SHAH, K.; NONGKYNRIH, J. M. Metal hyperaccumulation and bioremediation. Biologia Plantarum, 2007, roč. 51. č. 4, s. 618-634. ISSN 0006-3134.

SHAO, H. B.; CHU, L. Y.; LU, Z. H.; KANG, C. M. Primary antioxidant free radical scavenging and redox signaling pathways in higher plant cells. International Journal of Biological Sciences, 2008, roč. 4. č. 1, s. 8-14. ISSN 1449-2288.

SHARMA, P.; DUBEY, R. Lead toxicity in plants. Braz. J. Plant Physiol., 2005, roč. 17. č. 1, s. 35-52. ISSN 1677-0420.

SCHRODER, P.; LYUBENOVA, L.; HUBER, C. Do heavy metals and metalloids influence the detoxification of organic xenobiotics in plants? Environmental Science and Pollution Research, 2009, roč. 16. č. 7, s. 795-804. ISSN 0944- 1344.

SCHRODER, P.; SCHEER, C. E.; DIEKMANN, F.; STAMPFL, A. How plants cope with foreign compounds - Translocation of xenobiotic glutathione conjugates in roots of barley (Hordeum vulgare). Environmental Science and Pollution Research, 2007, roč. 14. č. 2, s. 114-122. ISSN 0944-1344.

SIEDLECKA, A.; KRUPA, Z.; SAMUELSSON, G.; OQUIST, G.; GARDESTROM, P. Primary carbon metabolism in Phaseolus vulgaris plants under Cd/Fe interaction. Plant Physiology and Biochemistry, 1997, roč. 35. č. 12, s. 951-957. ISSN

SMITH, B. J.; KIRKEGAARD, J. A. In vitro inhibition of soil microorganisms by 2- phenylethyl isothiocyanate. Plant Pathology, 2002, roč. 51. č. 5, s. 585-593. ISSN 0032-0862.

169

SMOLINSKA, U.; MORRA, M. J.; KNUDSEN, G. R.; JAMES, R. L. Isothiocyanates produced by Brassicaceae species as inhibitors of Fusarium oxysporum. Plant Disease, 2003, roč. 87. č. 4, s. 407-412. ISSN 0191-2917.

SOBOTIK, M.; IVANOV, V. B.; OBROUCHEVA, N. V.; SEREGIN, I. V.; MARTIN, M. L.; ANTIPOVA, O. V.; BERGMANN, H. Barrier role of root system in lead-exposed plants. Journal of Applied Botany-Angewandte Botanik, 1998, roč. 72. č. 3-4, s. 144-147. ISSN 0066-1759.

SOCHOR, J.; RYVOLOVA, M.; KRYSTOFOVA, O.; SALAS, P.; HUBALEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; HAVEL, L.; BEKLOVA, M.; ZEHNALEK, J.; PROVAZNIK, I.; KIZEK, R. Fully Automated Spectrometric Protocols for Determination of Antioxidant Activity: Advantages and Disadvantages. Molecules, 2010, roč. 15. č. 12, s. 8618-8640. ISSN 1420-3049.

SOMASHEKARAIAH, B. V.; PADMAJA, K.; PRASAD, A. R. K. Phytotoxicity of Cadmium Ions on Germinating Seedlings of Mung Bean (Phaseolus-Vulgaris) - Involvement of Lipid Peroxides in Chlorophyll Degradation. Physiologia Plantarum, 1992, roč. 85. č. 1, s. 85-89. ISSN

SOMASHEKARAIAH, B. V.; PADMAJA, K.; PRASAD, A. R. K. Phytotoxicity of cadmium ions on germinating seedlings of mung bean (Phaseolus Vulgaris) - involvement of lipid peroxides in chlorophyll degradation. Physiologia Plantarum, 1992, roč. 85. č. 1, s. 85-89. ISSN 0031-9317.

SORIANO, M. I. A.; FERERES, E. Use of crops for in situ phytoremediation of polluted soils following a toxic flood from a mine spill. Plant and Soil, 2003, roč. 256. č. 2, s. 253-264. ISSN 0032-079X.

STOBART, A. K.; GRIFFITHS, W. T.; AMEENBUKHARI, I.; SHERWOOD, R. P. The effect of Cd-2+ on the biosynthesis of chlorophyll in leaves of barley. Physiologia Plantarum, 1985, roč. 63. č. 3, s. 293-298. ISSN 0031-9317.

170

STOHS, S. J.; BAGCHI, D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions. Free Radical Biology and Medicine, 1995, roč. 18. č. 2, s. 321-336. ISSN 0891-5849.

STRATIL, P.; KLEJDUS, B.; KUBAN, V. Determination of total content of phenolic compounds and their antioxidant activity in vegetables - Evaluation of spectrophotometric methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, roč. 54. č. 3, s. 607-616. ISSN 0021-8561.

SUMNER, J. B. The isolation and crystallization of the enzyme urease. Journal of Biologcal Chemistry, 1926, roč. 69. č., s. 435-441. ISSN

SUPALKOVA, V.; HUSKA, D.; DIOPAN, V.; HANUSTIAK, P.; ZITKA, O.; STEJSKAL, K.; BALOUN, J.; PIKULA, J.; HAVEL, L.; ZEHNALEK, J.; ADAM, V.; TRNKOVA, L.; BEKLOVA, M.; KIZEK, R. Electroanalysis of plant thiols. Sensors, 2007, roč. 7. č. 6, s. 932-959. ISSN 1424-8220.

TANAKA, R.; TANAKA, A. Tetrapyrrole biosynthesis in higher plants. Annual Review of Plant Biology, 2007, roč. 58. č., s. 321-346. ISSN 1040-2519.

TANG, Y.-T.; QIU, R.-L.; ZENG, X.-W.; YING, R.-R.; YU, F.-M.; ZHOU, X.-Y. Lead, zinc, cadmium hyperaccumulation and growth stimulation in Arabis paniculata Franch. Environmental and Experimental Botany, 2009, roč. 66. č. 1, s. 126-134. ISSN 0098-8472.

TEXTOR, S.; BARTRAM, S.; KROYMANN, J.; FALK, K. L.; HICK, A.; PICKETT, J. A.; GERSHENZON, J. Biosynthesis of methionine-derived glucosinolates in Arabidopsis thaliana: recombinant expression and characterization of methylthioalkylmalate synthase, the condensing enzyme of the chain-elongation cycle. Planta, 2004, roč. 218. č. 6, s. 1026-1035. ISSN 0032-0935.

THOMMA, B.; CAMMUE, B. P. A.; THEVISSEN, K. Plant defensins. Planta, 2002, roč. 216. č. 2, s. 193-202. ISSN 0032-0935.

THOREN, A. K. Urea transformation of wetland microbial communities. Microbial Ecology, 2007, roč. 53. č. 2, s. 221-232. ISSN 0095-3628.

TIERENS, K.; THOMMA, B. P. H.; BROUWER, M.; SCHMIDT, J.; KISTNER, K.; PORZEL, A.; MAUCH-MANI, B.; CAMMUE, B. P. A.; BROEKAERT, W. F. Study of the role of antimicrobial glucosinolate-derived isothiocyanates in

171

resistance of arabidopsis to microbial pathogens. Plant Physiology, 2001, roč. 125. č. 4, s. 1688-1699. ISSN 0032-0889.

TOPP, C.; HENKE, R.; KERESZTES, A.; FISCHER, W.; EBERIUS, M.; APPENROTH, K. J. A novel mechanism of abscission in fronds of Lemna minor L. and the effect of silver ions. Plant Biology, 2011, roč. 13. č. 3, s. 517- 523. ISSN 1435-8603.

TRIPATHI, R. N.; NATH, N.; GANDHI, A. P. Studies on the quality of canned baked soybeans. Journal of Food Science and Technology-Mysore, 2004, roč. 41. č. 2, s. 131-134. ISSN 0022-1155.

UNTERBRUNNER, R.; PUSCHENREITER, M.; SOMMER, P.; WIESHAMMER, G.; TLUSTOS, P.; ZUPAN, M.; WENZEL, W. W. Heavy metal accumulation in trees growing on contaminated sites in Central Europe. Environmental Pollution, 2007, roč. 148. č. 1, s. 107-114. ISSN 0269-7491.

VACCA, R. A.; DE PINTO, M. C.; VALENTI, D.; PASSARELLA, S.; MARRA, E.; DE GARA, L. Production of reactive oxygen species, alteration of cytosolic ascorbate peroxidase, and impairment of mitochondrial metabolism are early events in heat shock-induced programmed cell death in tobacco bright-yellow 2 cells. Plant Physiology, 2004, roč. 134. č. 3, s. 1100-1112. ISSN 0032-0889.

VAMERALI, T.; BANDIERA, M.; MOSCA, G. Field crops for phytoremediation of metal-contaminated land. A review. Environmental Chemistry Letters, 2010, roč. 8. č. 1, s. 1-17. ISSN 1610-3653.

VAN NEVEL, L.; MERTENS, J.; OORTS, K.; VERHEYEN, K. Phytoextraction of metals from soils: How far from practice? Environmental Pollution, 2007, roč. 150. č. 1, s. 34-40. ISSN 0269-7491.

VANASSCHE, F.; CLIJSTERS, H. Effects of Metals on Enzyme-Activity in Plants. Plant Cell and Environment, 1990, roč. 13. č. 3, s. 195-206. ISSN 0140-7791.

VANDECASTEELE, B.; MEERS, E.; VERVAEKE, P.; DE VOS, B.; QUATAERT, P.; TACK, F. M. G. Growth and trace metal accumulation of two Salix clones on sediment-derived soils with increasing contamination levels. Chemosphere, 2005, roč. 58. č. 8, s. 995-1002. ISSN 0045-6535.

172

VAREL, V. H.; WELLS, J. E.; MILLER, D. N. Combination of a urease inhibitor and a plant essential oil to control coliform bacteria, odour production and ammonia loss from cattle waste. Journal of Applied Microbiology, 2007, roč. 102. č. 2, s. 472-477. ISSN 1364-5072.

VEEN, H. Silver Thiosulfate - an Experimental Tool in Plant-Science. Scientia Horticulturae, 1983, roč. 20. č. 3, s. 211-224. ISSN 0304-4238.

VERBRUGGEN, N.; HERMANS, C.; SCHAT, H. Molecular mechanisms of metal hyperaccumulation in plants (vol 181, pg 759, 2009). New Phytologist, 2009, roč. 182. č. 3, s. 781-781. ISSN 0028-646X.

VERMA, S.; DUBEY, R. S. Lead toxicity induces lipid peroxidation and alters the activities of antioxidant enzymes in growing rice plants. Plant Science, 2003, roč. 164. č. 4, s. 645-655. ISSN 0168-9452.

WARD, N. I.; ROBERTS, E.; BROOKS, R. R. Silver uptake by seedlings of Lolium Perenne L and Trifolium Repens L. New Zealand Journal of Science, 1979, roč. 22. č. 2, s. 129-132. ISSN 0028-8365.

WERE, F. H.; NJUE, W.; MURUNGI, J.; WANJAU, R. Use of human nails as bioindicators of heavy metals environmental exposure among school age children in Kenya. Science of the Total Environment, 2008, roč. 393. č. 2-3, s. 376-384. ISSN 0048-9697.

WHO, I., CICAD 44. Silver and silver compounds. Environmental aspects, 2002, roč. č., s. 42 ISSN

WIERZBICKA, M. Resumption of Mitotic-Activity in Allium-Cepa L Root-Tips During Treatment with Lead Salts. Environmental and Experimental Botany, 1994, roč. 34. č. 2, s. 173-180. ISSN 0098-8472.

WITTE, C. P.; MEDINA-ESCOBAR, N. In-gel detection of urease with nitroblue tetrazolium and quantification of the enzyme from different crop plants using the indophenol reaction. Analytical Biochemistry, 2001, roč. 290. č. 1, s. 102-107. ISSN 0003-2697.

WITTE, C. P.; ROSSO, M. G.; ROMEIS, T. Identification of three urease accessory proteins that are required for urease activation in Arabidopsis. Plant Physiolgy, 2005, roč. 139. č. 3, s. 1155-1162. ISSN 0032-0889. 173

WITTE, C. P.; TILLER, S.; ISIDORE, E.; DAVIES, H. V.; TAYLOR, M. A. Analysis of two alleles of the urease gene from potato: polymorphisms, expression, and extensive alternative splicing of the corresponding mRNA. Journal of Experimental Botany, 2005, roč. 56. č. 409, s. 91-99. ISSN 0022-0957.

WITTE, C. P.; TILLER, S. A.; TAYLOR, M. A.; DAVIES, H. V. Leaf urea metabolism in potato. Urease activity profile and patterns of recovery and distribution of N- 15 after foliar urea application in wild-type and urease-antisense transgenics. Plant Physiolgy, 2002, roč. 128. č. 3, s. 1129-1136. ISSN 0032-0889.

WITTSTOCK, U.; HALKIER, B. A. Glucosinolate research in the Arabidopsis era. Trends in Plant Science, 2002, roč. 7. č. 6, s. 263-270. ISSN 1360-1385.

WOOD, C. M.; PLAYLE, R. C.; HOGSTRAND, C. Physiology and modeling of mechanisms of silver uptake and toxicity in fish. Environmental Toxicolgy Chemistry, 1999, roč. 18. č. 1, s. 71-83. ISSN 0730-7268.

YAMAMOTO, N.; ANDERSON, T. F. Genomic masking and recombination between serologically unrelated phages P22 and P221. Virology, 1961, roč. 14. č. 4, s. 430-&. ISSN 0042-6822.

YANG, Z. X.; LIU, S. Q.; ZHENG, D. W.; FENG, S. D. Effects of cadmium, zinc and lead on soil enzyme activities. Journal Environmental Science, 2006, roč. 18. č. 6, s. 1135-1141. ISSN 1001-0742.

ZENK, M. H. Heavy metal detoxification in higher plants - A review. Gene, 1996, roč. 179. č. 1, s. 21-30. ISSN 0378-1119.

ZHANG, N. G.; HASENSTEIN, K. H. Initiation and elongation of lateral roots in Lactuca sativa. International Journal of Plant Sciences, 1999, roč. 160. č. 3, s. 511-519. ISSN 1058-5893.

ZHANG, Y.; XIAO, H. Antagonistic effect of calcium, zinc and selenium against cadmium induced chromosomal aberrations and micronuclei in root cells of Hordeum vulgare. Mutation Research, 1998, roč. 420. č. 1-3, s. 1-6. ISSN 1383- 5718.

ZHAO, F. J.; HAMON, R. E.; LOMBI, E.; MCLAUGHLIN, M. J.; MCGRATH, S. P. Characteristics of cadmium uptake in two contrasting ecotypes of the

174

hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Journal of Experimental Botany, 2002, roč. 53. č. 368, s. 535-543. ISSN 0022-0957.

ZHAO, F. J.; JIANG, R. F.; DUNHAM, S. J.; MCGRATH, S. P. Cadmium uptake, translocation and tolerance in the hyperaccumulator Arabidopsis halleri. New Phytologist, 2006, roč. 172. č. 4, s. 646-654. ISSN 0028-646X.

ZHAO, F. J.; LOMBI, E.; MCGRATH, S. P. Assessing the potential for zinc and cadmium phytoremediation with the hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. Plant and Soil, 2003, roč. 249. č. 1, s. 37-43. ISSN 0032-079X.

175

8 SEZNAM OBRÁZKŮ

Obr. 1. Návaznost omických věd

Obr. 2: počet publikací za posledních 15 let na WOS. Pro hledání byla použita následující klíčová slova: genomic*, transcriptomic*, proteomic*, metabolomic*

Obr. 3: Schéma procentuálního zastoupení hlavních zdrojů kadmia, podle informací Ministerstva životního prostředí, Integrovaného registru znečišťování a UNEP

Obr. 4: Inhibice biosyntézy chlorofylu kadmiem, upraveno dle Stobarta et al. (Stobart, a kol., 1985)

Obr 5: Schéma procentuálního zastoupení hlavních zdrojů olova v životním prostředí. Zdroj: Ministerstvo životního prostředí, Integrovaný registr znečišťování a UNEP.

Obr. 6: Schematické znázornění ovlivnění metabolických pochodů v rostlině po vstupu olovo. Olovo ovlivňuje vodní režim, příjem živin, způsobuje mitotické nepravidelnosti v jádře, narušuje respiraci a fotosyntézu. [upraveno podle (Sharma a Dubey, 2005)]

Obr 7: Schéma procentuálního zastoupení hlavních zdrojů stříbra. Zdroj: Ministerstvo životního prostředí, Integrovaný registr znečišťování a UNEP

Obr. 8: Síra je z prostředí transportována ve formě síranových solí, pomocí vysoce afinitních transportérů (1).

Obr. 9: Struktura redukovaného (GSH) glutathionu (A, B) a oxidovaného (GSSG) glutathionu (C, D).

Obr. 10: Obecný vzorec PCs, kde n = 2-11x

Obr. 11: Schématické znázornění detoxikačního mechanismu iontů těžkého kovu v rostlinné buňce.

Obr. 12: Slunečnice roční (Helianthus annuus L.)

Obr. 13: Hydroponické pěstování Helianthus annuus L.

176

9 SEZNAM TABULEK

Tab. 1: Přehled rostlin vyžívajících se pro sledování kumulace a vlivu kadmia

Tab. 2: Přehled rostlin vyžívajících se pro sledování kumulace a vlivu olova

Tab. 3: Přehled rostlin vyžívajících se pro sledování kumulace a vlivu stříbra

177

10 SEZNAM ZKRATEK

ABC transportér - ATP Binding Cassette Transportér

ABTS - 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) = 2,2‘-azinobis(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina)

ADP - adenosine diphosphate = adenosindifosfát

ALT - Alanine transaminase = L-alanin(2-oxoglutarát) aminotransferáza

APS reduktáza - adenosine 5'-phosphosulfate reductase = adenosin 5´-fosfosulfát reduktáza

AST - aspartate transaminase = L-aspartát(2-oxoglutarát) aminotransferáza

ATP - adenosine triphosphate = adenosintrifosfát

BAP - 6-benzylaminopurine = 6-benzylaminopurin

CCD kamera - Charge-coupled device kamera

CDTA - Cyclohexanediaminetetraacetic Acid = cyklohexandiamintetraoctová kyselina

Cys - cysteine = cystein

DMPD - N, N-dimethyl-1,4-diaminobenzene = N,N-dimethyl-1,4-diaminobenzen

DNA - deoxyribonucleic acid = deoxyribonukleová kyselina

DPPH - 1,1-diphenyl-2-(2,4,6-trinitrophenyl)picrylhydrazyl = 1,1-difenyl-2-(2,4,6,- trinitrofenyl)hydrazyl

DTPA - diethylenetriaminepentaacetic acid = diethylentriaminpentaoctová kyselina

DW – Dry weight = suchá hmotnost

EDTA - ethylenediaminetetraacetic acid = ethylendiamintetraoctová kyselina

EGTA - ethylene glycol tetraacetic acid = ethylenglykoltetraoctová kyselina

FRAP - Ferric Reducing Antioxidant Power

GA3 - Gibberellic acid = giberelová kyselina

Glu - glutamine = glutamin

Gly – glycine = glycin

178

GSH – reduced glutathione = redukovaný glutathion

GSSG - oxidized glutathione = oxidovaný glutathion

HMW - High molecular complex = vysokomolekulární komplex

HPLC-ED - High Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection = vysoko účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickou detekcí

HSP protein - Heat shock protein = protein teplovního šoku

ICCD detektor - intensified charge coupled device detektor

IRT - iron transporter proteins = železo přenášející protein

IRZ - integrovaný registr znečišťování

LIBS - Laser-Induced Breakdown Spectroscopy = Laserem indukovaná ablační spektrometrie

LMW - Low molecular complex = nízkomolekulární komplex

LMW-M-PC - nízkomolekulární komplex - kov - fytochelatin

Met - methionine = methionin

M-PC - metal-phytochelatin complex = kov-fytochelatin komplex

MS médium - Murashige a Skoog médium

NAA - α-naphthaleneacetic acid = α-naftyloctová kyselina

NADPH - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase = Nikotinamid adenin dinukleotid fosfát - oxidáza

Nd:YAG laser - neodymem dopovaný yttrito-hlinitý granátový laser

PAPS - 3´-phosphoadenosine-5´-phosphosulfate = 3-fosfoadenosin-5-fosfosulfát

PC - phytochelatin = fytochelatin

PCs - phytochelatin synthase = fytochelatin syntáza

PVP - polyvinylpyrrolidone = polyvinylpyrrolidon

ROS - Reactive oxygen species = reaktivní formy kyslíku

RuBisCo - Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase = ribulosa-1,5-bisfosfát- karboxyláza/oxygenáza

179

SAM - S-adenosylmethionine = S-adenosylmethionin

SRPs - Sulphur-rich proteins = na síru bohaté proteiny

TEAC - Trolox equivalent antioxidant capacity = Trolox eqvivalent antioxidační kapacity

TK - těžké kovy

TPTZ - 2,4,6-tripyridyl-S-triazine = 2,4,6-tripyridyl-S-triazin

UNEP - United Nations Environment Programme

UV-VIS - ultrafialové - viditelné

WHO - world Health Organization = Světová zdravotnická organizace

ZIP - zinc transporter proteins = zinek přenášející protein

180