Le Moustique Culex Pipiens, Vecteur Potentiel Des Virus West Nile Et Fièvre De La Vallée Du Rift Dans La Région Du Maghreb

L’UNIVERSITE MOHAMMED V-AGDAL

FACULTE DES SCIENCES RABAT

N° d’ordre: 2589

THESE DE DOCTORAT

Présentée par

Fadila Amraoui

Discipline: Biologie Spécialité: Virologie - Entomologie

Le moustique Culex pipiens, vecteur potentiel des virus West Nile et fièvre de la vallée du Rift dans la région du Maghreb

Soutenue le 10 juillet 2012

Devant le jury composé de: Président: Saaïd Amzazi, Professeur à la faculté des Sciences, Rabat

Examinateurs: Youssef Bakri, Professeur à la faculté des Sciences, Rabat Anna-Bella Failloux, Directeur du laboratoire Arbovirus et Insectes Vecteurs, Institut Pasteur, Paris, France M’hammed Sarih, Directeur du laboratoire Maladies Vectorielles, Institut Pasteur du Maroc M’hamed Tijane, Professeur à la faculté des Sciences, Rabat Avant propos

Cette thèse a été réalisée dans le cadre d’une collaboration entre le Laboratoire d’Immunologie et Biochimie à la Faculté des Sciences de Rabat, le Laboratoire des Arbovirus et Insectes Vecteurs à l’Institut Pasteur à Paris, France et le Laboratoire des Maladies Vectorielles à l’Institut Pasteur du Maroc.

Les travaux de cette thèse ont été effectués sous la direction de Mr M’hamed Tijane, Mme Anna-Bella Failloux et Mr M’hammed Sarih.

Je remercie vivement Mr M’hamed Tijane, Professeur à la Faculté des Sciences à Rabat et Directeur du Laboratoire Immunologie et Biochimie qui s’est toujours soucié de l’avancement de mes travaux tout au long de ces quatre années. Il a toujours fait preuve d’enthousiasme, de bonne humeur et d’encouragements qui m’ont remotivé dans les périodes difficiles.

Je remercie du fond du coeur Mme Anna-Bella Failloux, Chef du Laboratoire Arbovirus et Insectes Vecteurs à l’Institut Pasteur à Paris aussi bien pour son encadrement exemplaire et complet que pour m’avoir accompagné amicalement et fraternellement dans ce cheminement. Merci pour ses précieux conseils, ses encouragements ainsi que pour les corrections et les relectures de ce manuscrit. Son énergie, ses compétences et sa constante disponibilité m’ont beaucoup aidé pour mener à bien ce travail.

Je remercie chaleureusement Mr M’hammed Sarih, Responsable du Laboratoire des Maladies Vectorielles à l’Institut Pasteur du Maroc, de m’avoir fait confiance et proposé ce sujet alors même que je ne connaissais rien à l’entomologie. Merci pour son dynamisme, son soutien et ses conseils qui m’ont permis de mener à bien cette thèse.

Je remercie le Professeur Saaïd Amzazi, Doyen de la Faculté des Sciences de Rabat, d’avoir accepté de présider ce jury et de critiquer ce travail. Mes remerciements vont aussi à Mr Youssef Bakri, Professeur à la Faculté des Sciences de Rabat d’avoir eu l’amabilité de lire et de juger ce travail.

Les travaux de cette thèse ont été financés par l’Institut Pasteur à Paris, dans le cadre d’un projet ACIP, sous la référence A-08-2009. Je profite de cette occasion pour remercier l’Institut Pasteur à Paris pour ce financement et aussi pour m’avoir accordé une bourse de stage durant une année au Laboratoire Arbovirus et Insectes Vecteurs.

Je remercie le Centre National de la Recherche Scientifique et Technique de m’avoir accordé une bourse d’excellence pendant 18 mois et ce dans le cadre du programme des bourses de recherche initié par le ministère de l'Éducation Nationale, de l'Enseignement Supérieur, de la Formation des Cadres et de la Recherche Scientifique.

J’adresse toute ma gratitude et reconnaissance à tous les collègues des Instituts Pasteur à Alger et à Tunis qui ont participé activement à ce projet ACIP notamment, Messieurs Ali Bouattour, Ghazi Krida, Zoubir Harrat et Said Boubidi.

Je remercie Mme Michèle Bouloy de m’avoir accueilli dans son unité de Génétique Moléculaire des Bunyavirus à l’Institut Pasteur à Paris.

Quoique je fasse, je ne peux remercier assez tous les membres du Laboratoire Arbovirus et Insectes Vecteurs: Marie Vazeille, Laurence Mousson, Karima Zouache, Jocelyne Alexandre et Camilo Arias Goeta. Merci pour ces qualités humaines et scientifiques. Merci à Louis Lambrechts, parti sans trop s’éloigner, pour ses précieux conseils.

Je remercie Melle Najma Boudebouch du Laboratoire des Maladies Vectorielles pour son aide et le temps qu’elle a consacré pour moi.

Je tiens à remercier Mme Chafika Faraj de l’Institut National d’Hygiène à Rabat et tous les membres de son équipe qui m’ont initié à l’entomologie. Je remercie tout le personnel de santé publique qui a participé aux prospections des gîtes larvaires à Tanger, Marrakech, Mohammedia et Casablanca. Merci pour leur patience et aide ainsi que pour les récoltes abondantes de larves.

Je ne saurais jamais remercier ma famille et mes amis pour leur soutien permanent, leurs encouragements tout au long de mes études, sans lequel je ne serai jamais arrivée à ce stade de réussite. Comme vous êtes nombreux je ne peux nommer tout le monde, mais je sais que vous vous reconnaitrez. Travaux scientifiques

Articles publiés:

Fadila Amraoui, Ghazi Krida, Ali Bouattour, Adel Rhim, Jabeur Daaboub, Zoubir Harrat, Said-Chawki Boubidi, Mhamed Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux (2012). Culex pipiens, an experimental efficient vector of West Nile and Rift valley fever viruses in the Maghreb region. PLoS ONE 7(5): e36757. doi:10.1371/journal.pone.0036757

Fadila Amraoui, Mhamed Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux (2012). Molecular evidence of Culex pipiens form molestus and hybrids pipiens/molestus in Morocco, North Africa. Parasites & Vectors 5: 83. doi:10.1186/1756-3305-5-83

Communications:

Fadila Amraoui, Ali Bouattour, Ghazi Krida, Zoubir Harrat, Said Boubidi, Mhamed Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux. Vector competence of Culex pipiens for West Nile and Rift Valley Fever viruses in the Maghreb region. 8-10 novembre 2011. Institut Pasteur International Network Meeting (Paris, France). Commented Poster.

Fadila Amraoui, Ali Bouattour, Ghazi Krida, Zoubir Harrat, Said Boubidi, Mhamed Tijane, Mhammed Sarih, Anna-Bella Failloux. Vector competence of Culex pipiens for West Nile and Rift Valley Fever viruses in the Maghreb region. 16-18 novembre 2011. Journées Départementales de Virologie de l’Institut Pasteur de Paris (Le Touquet, France). Communication affichée. Résumé

Le virus West Nile (VWN) et le virus de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR) sont deux virus à ARN, transmis essentiellement par des moustiques.

Le VWN (Flaviviridae, Flavivirus) est largement reparti dans le monde. Il est maintenu au sein d’un cycle enzootique faisant intervenir les oiseaux comme hôtes amplificateurs. L'infection de l'homme et des équidés est accidentelle et les deux hôtes sont considérés comme des culs de sacs épidémiologiques. Par ailleurs, le VFVR (Bunyaviridae, Phlebovirus) est présent en Afrique sub-saharienne, en Egypte et dans la péninsule arabique. Le cycle de transmission du VFVR est complexe, varie selon la région géographique et touchant essentiellement le bétail et l’homme.

Le moustique Culex pipiens, largement reparti en Afrique du Nord, a été incriminé dans la transmission de VWN et du VFVR dans d’autres régions du monde. Dans ce travail, les populations de Cx. pipiens récoltées au Maroc, en Algérie et en Tunisie ont été infectées avec le VWN et le VFVR avec un titre viral respectif de 107,8 et 108,5 unité formant plage/mL. Les taux d’infection disséminée (TID) et de transmission (TT) ont été évalués à j14 et j21 post-infection. Toutes les populations testées ont été capables de disséminer le VWN au-delà du tube digestif ainsi que libérer des particules virales au niveau de la salive. Les TID varient de 59.1% à 100% et les TT de 25% à 83.3 %. Pour le VFVR, 69,2% des populations testées développent une infection disséminée avec des TID variant de 6.2% à 38,1%, et 77,8% présentaient des salives infectieuses avec des TT allant de 10% à 47.1%.

Par ailleurs, l’analyse moléculaire basée sur la diversité génétique de la région flanquante du microsatellite CQ11 a montré que Cx pipiens existe au Maroc sous la forme pipiens, la forme molestus et des formes hybrides pipiens/molestus. Ces différentes formes sont morphologiquement semblables mais présentent des caractères bio-écologiques différents pouvant influencer la transmission vectorielle du VWN et du VFVR.

Cx. pipiens est bon vecteur en conditions expérimentales pour le VWN et dans une moindre mesure, pour le VFVR. Cependant, les recherches doivent se poursuivre afin d’évaluer les compétences vectorielles respectives des différentes formes de Cx. pipiens ainsi que leurs préférences trophiques pour mieux appréhender leur rôles épidémiologiques. Ces données sont essentielles pour mesurer le risque d’introduction et d’installation de ces arboviroses dans le Maghreb, les pays du pourtour méditerranéen et également, en Europe.

Mots clés: Culex pipiens, virus West Nile, virus de la fièvre de la vallée du Rift, compétence vectorielle, taxonomie moléculaire, région du Maghreb. Abstract

West Nile virus (WNV) and Rift Valley fever virus (RVFV) are two emerging arboviruses causing epidemics outside their natural range of distribution.

WNV (Flaviviridae, Flavivirus) is one of the most broadly distributed arboviruses in the world, being found on all continents. Recent outbreaks of WNV were recorded all over the Mediterranean region. WNV has been isolated from horses and birds in Algeria, Morocco and Tunisia, indicating an active circulation of the virus in this region. Emergences may occur when adequate vector and susceptible vertebrate host populations intersect under permissive climatic conditions. Moreover, RVFV (Bunyaviridae, Phlebovirus) is endemic to countries bordering the Maghreb region. Illegal importations of viremic livestocks along trade routes have been suspected to introduce the virus and initiate local viral transmission.

Culex pipiens is widely found in North Africa. This species has been incriminated in the transmission of different arboviruses including WNV and RVFV. In this context, we define the importance of Cx. pipiens as vector of both viruses in the Maghreb region. For such, we experimentally infected field collected populations of Cx. pipiens from North Africa with WNV and RVFV at titers of 107,8and 108,5plaque forming units/mL. Disseminated infection and transmission rates were estimated 14-21 days following the exposure to the infectious blood-meal. We show that 14 days after exposure to WNV, all mosquito strains developed a high disseminated infection and were able to excrete infectious saliva. However, only 69.2% of mosquito strains developed a disseminated infection with RVFV Clone 13 strain, and among them, 77.8% were able to deliver virus through saliva. We showed that Cx. pipiens from the Maghreb are efficient experimental vectors to transmit WNV and to a lesser extent, RVFV.

Cx pipiens has two recognized forms ‘‘pipiens’’ and ‘‘molestus’’ which are morphologically indistinguishable with distinct behaviors and physiologies that may influence their vectorial status. In this study, we prospected for these forms in Morocco by using diagnostic primers designed for the flanking region of microsatellite CQ11. We established the presence of both forms of Cx. pipiens and their hybrids in Morocco.

Our findings should be confronted to parameters describing mosquito ecology and biology. Thus, North Africa should be considered as a bridge region between the Sub-Saharan region where both viruses are endemic circulating within a selvatic cycle and the northern latitudes such as Europe for emergence of vector borne pathogens. Unintentional introductions of birds or animals may have set the stage for the emergence of WNV and RVFV in Europe.

Key words: Culex pipiens, West Nile virus, Rift valley fever virus, vector competence, molecular identification, Maghreb region. Liste des abréviations

Ace2: Acetylcholine estérase 2 ADN: Acide désoxyribonucléique Ae: Aedes AN: anautogène ARN: Acide ribonucléique ARNi: ARN interférence ATP: Adénosine triphosphate AU: Autogène BSA: Bovine serum albumin C6/36: Cellules de moustique Aedes albopictus COI: Cytochrome oxydase I Cs: Culiseta Cx: Culex DC-SIGN: Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin dNTP: Désoxynucléotide triphosphate FITC: Isocyanate de fluorescéine FVR: Fièvre de la vallée de Rift FWN: Fièvre West Nile Imd: Immune deficiency Jak: Janus kinase L: Leishmania min: Minute mL: Millilitre NSs: Facteur de virulence P: Plamsodium PBS: Phsphate buffer salt Ph: Phlebotomus RE: Reticulum endoplasmique STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription SVF: Serum de veau foetal UFP: Unité formant plage VUSU: virus Usutu Vero: Cellules de reins de singe VFVR: Virus de la fièvre de la vallée de Rift VWN: Virus West Nile µL: Microlitre

Liste des figures

Figure 1. Mortalité humaine dûe aux maladies vectorielles.

Figure 2. Quelques arthropodes vecteurs existants au Maghreb

Figure 3. Distribution géographique du virus West Nile

Figure 4. Schéma de la structure (a) et du génome (b) d’un Flavivirus

Figure 5. Analyse phylogénétique du virus West Nile

Figure 6. Cycles de transmission du virus West Nile.

Figure 7. Cycle de réplication des Flavivirus

Figure 8. Répartition de la fièvre de la vallée du Rift en Afrique, à Madagascar et dans la péninsule arabique chez l’animal et chez l’homme

Figure 9. Schéma de la structure et du génome du virus de la fièvre de la vallée du Rift

Figure 10. Analyse phylogénétique du virus de la fièvre de la vallée du Rift

Figure 11. Cycles biologique du virus de la fièvre de la vallée du Rift

Figure 12. Schéma montrant le cheminement du virus dans le corps d’un moustique vecteur

Figure 13. La période d’incubation extrinsèque varie selon la température

Figure 14. Cycle biologique de Culex pipiens

Figure 15. Shéma récapitulatif des réactions antivirales chez la drosophile

Figure 16. Mécanisme de l’ARN interférence

Figure 17. Immunité antivirale innée et aquise chez l’homme

Figure 18. Sites de récolte de Cx. pipiens au Maroc, en Algérie et en Tunisie

Figure 19. Exemples de gîte larvaire de Culex pipiens.

Figure 20. Matériel utilisé lors de l’élevage de Culex pipiens.

Figure 21. Infections expérimentales des moustiques en laboratoire P3

Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de salivation forcée

Figure 23. Tissu de tête de moustique analysé par immunofluorescence Figure 24. Taux de transmission et nombre moyen des particules virales présentes dans la salive de Cx pipiens “Tabarka” infecté oralement par le VWN (A) et le VFVR (B)

Figure 25. Taux d’infection disséminée (A), taux de transmission (B) et nombre moyen de particules virales par salive (C) pour les populations naturelles de Culex pipiens, 14 jours après l’infection avec le virus West Nile

Figure 26. Taux d’infection disséminée, taux de transmission et nombre moyen de particules virales par salive de Culex pipiens, 14 (A, B, C) et 21 jours (D, E, F) après l’infection avec le virus de la fièvre de la vallée du Rift (souche avirulente Clone 13)

Figure 27. Profils des produits d’amplification du microsatellite CQ11 de Culex pipiens récolté à Casablanca (Maroc). Liste des tableaux

Tableau I. Les cas humains et équins recensés dans la région du Maghreb depuis l’emergence du virus West Nile en 1994

Tableau II. Principales épidemies de la fièvre de la vallée du Rift

Tableau III. Sensibilité des animaux au virus de la fièvre de la vallée du Rift

Tableau IV. Caractères éco-physiologiques des membres du complexe Cx. pipiens

Tableau V. Marqueurs moléculaires utilisés pour identifier certains membres du complexe Cx. pipiens

Tableau VI.Gîtes larvaires échantillonnés en 2010 en Algérie, au Maroc et en Tunisie

Tableau VII. Gîtes larvaires échantillonnés dans différentes régions du Maroc durant l’été 2010

Tableau VIII. Espèces de larves identifiées dans des gites larvaires riches en matières organiques

Tableau IX. Identification moléculaire des populations de Cx. pipiens provenant de Tanger, Casablanca/Mohammedia et Marrakech Sommaire

Introduction et rappels bibliographiques ...... 1 1. La situation des maladies vectorielles dans la région du Maghreb ...... 2 1.1. Les maladies vectorielles ...... 2 1.2. Les agents infectieux circulants au Maroc, en Algérie et en Tunisie ...... 3 1.2.1. Les protozoaires...... 4 1.2.2. Les bactéries ...... 5 1.2.3. Les arbovirus ...... 5 2. Le virus West Nile ...... 8 2.1. Historique ...... 8 2.2. La structure et le génome ...... 9 2.3. Les lignages ...... 10 2.4. Le cycle de transmission ...... 12 2.5. Le cycle de réplication virale ...... 13 2.6. Pathogénèse et vaccin ...... 14 3. Le virus de la fièvre de la vallée du Rift ...... 16 3.1. Historique ...... 16 3.2. La structure et le génome ...... 18 3.3. Le cycle de transmission ...... 21 3.4. Le cycle de réplication virale ...... 22 3.4. Pathogénèse et vaccin ...... 23 4. Les vecteurs du VWN et VFVR ...... 25 4.1. La transmission vectorielle et la notion de capacité vectorielle ...... 25 4.2. Les vecteurs du VWN ...... 27 4.3. Les vecteurs du VFVR ...... 27 4.4. Le complexe Culex pipiens...... 28 4.4.1. Position systématique ...... 28 4.4.2. Bio-écologie ...... 29 4.4.3. Les membres du complexe Cx. pipiens ...... 30 5. L’immunité antivirale ...... 34 5.1. Chez le moustique ...... 34 5.1.1. La voie Toll ...... 34 5.1.2. La voie Imd ...... 34 5.1.3. La voie Jak/STAT...... 35 5.1.4. L’ARN interférence ...... 35 5.2. Chez l’homme ...... 36 6. Objectifs de la thèse ...... 38

Matériels et méthodes ...... 40 1. Sites de récolte des moustiques ...... 41 2. Elevage des moustiques ...... 42 3. Infections expérimentales avec les virus WN et FVR ...... 44 3.1. Les populations de Culex pipiens ...... 44 3.2. Les souches virales ...... 45 3.3. Le repas sanguin infectieux ...... 45 3.4. La salivation forcée ...... 46 3.5. Le titrage des salives ...... 47 3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête ...... 47 4. Les analyses statistiques ...... 49 5. Taxonomie moléculaire de Culex pipiens au Maroc ...... 49 5.1. Populations de Cx. pipiens ...... 49 5.2. Extraction de l’ADN génomique ...... 50 5.3. Réaction PCR ...... 50

Résultats et discussion ...... 52 1. Compétence vectorielle de Culex pipiens vis-à-vis du virus West Nile et virus de la fièvre de la vallée du Rift ...... 53 1.1. Résultats ...... 53 1.1.1. Réceptivité au VWN ...... 53 1.1.2. Réceptivité au VFVR ...... 57 1.2. Discussion ...... 60 Article 1: Culex pipiens, an experimental efficient vector of West Nile and Rift valley fever viruses in the Maghreb region ...... 63 2. Le statut taxonomique du complexe Culex pipiens au Maroc ...... 72 2.1. Résultats ...... 72 2.2. Discussion ...... 74 Article 2: Molecular evidence of Culex pipiens form molestus and hybrids pipiens/molestus in Morocco, North Africa ...... 76

Conclusions et perspectives ...... 81

Références bibliographiques ...... 85

Introduction et rappels bibliographiques

1. La situation des maladies vectorielles dans la région du Maghreb

1.1. Les maladies vectorielles

Les maladies vectorielles sont des maladies pour lesquelles l’agent infectieux (virus, bactérie, protozoaire ou helminthe) est transmis d’un individu infecté à un autre, principalement par l’intermédiaire d’un arthropode hématophage (insecte ou acarien) (Rodhain & Perez, 1985). Il s’agit d’une transmission biologique ou active car l’agent infectieux accomplit un cycle d’amplification ou de développement au préalable chez l’arthropode vecteur, à la différence d’une transmission mécanique ou passive qui se traduit par un simple transport de l’agent pathogène.

Les maladies vectorielles sont largement répandues en zone intertropicale, elles se rencontrent également en zone tempérée voire septentrionale mais restent relativement rares. Cependant, les maladies vectorielles peuvent générer de fortes mortalités et morbidités chez l’homme (Figure 1; WHO, 2004). A l’exception de certaines maladies humaines comme la dengue urbaine, la plupart des maladies à transmission vectorielle sont des zoonoses (touchent les animaux) où l'homme est le plus souvent un hôte accidentel. Ces maladies ont une importance sanitaire et socio- économique qui s’est accentuée avec les changements que subit le monde. En effet, les changements climatiques et anthropiques déclenchent l’émergence, la réémergence ou la recrudescence inattendue de certaines maladies vectorielles. C’était le cas de l’introduction du VWN (CDC, 1999) en Amérique du Nord, l'apparition du virus de l'encéphalite japonaise en Australie (Mackenzie, 1999) et l’émergence du virus Usutu (VUSU) en Europe centrale (Weissenböck et al., 2001).

Figure 1. Mortalité humaine dûe aux maladies vectorielles. La carte montre la mortalité attribuée aux maladies à transmission vectorielle en fonction des pays (WHO, 2004).

1.2. Les agents infectieux circulants au Maroc, en Algérie et en Tunisie

Dans la région du Maghreb, plusieurs maladies vectorielles sont présentes et importantes sur le plan de la santé publique. Elles sont dûes à des virus, des bactéries ou des protozoaires et sont transmises par des arthropodes vecteurs, principalement des moustiques, des tiques, des phlébotomes, des moucherons (Culicoïdes), des poux ou des puces (Figure 2). La situation relative à ces maladies est abordée ci-dessous selon la nature de l’agent infectieux.

Figure 2. Quelques arthropodes vecteurs existants au Maghreb (a) Moustique (Culicidae), (b) Tique dure (Ixodidae), (c) Tique molle (Argasidae), (d) Phlébotome (Psychodidae) (e) Culicoïdes (Ceratopogonidae), (f) Poux (Pediculidae), (g) Puce (Pulicidae).

1.2.1. Les protozoaires

Dans la région du Maghreb, le paludisme est causé par deux parasites du genre Plasmodium: P. falciparum et P. vivax. Toutes les espèces de Plasmodium sont transmises par les moustiques du genre Anopheles. La Tunisie et le Maroc ont été respectivement certifiés exempts de paludisme en 1979 et en 2010 (Weekly Epidemiological Record, 2010). Quant à l’Algérie, le paludisme y est endémique mais à faible taux de transmission et le pays est en phase d’élimination du parasite (World Malaria report, 2011). Cependant, la région du Maghreb reste vulnérable à la maladie en raison de la persistance de vecteurs et la coexistence d'un réservoir constitué par les cas importés de l’Afrique subsaharienne (Aoun et al., 2010), comme l’attestent les deux cas autochtones à P. falciparum répertoriés au Maroc (EpiSouth Weekly Epi Bulletin, 2010).

Quatre espèces de Leishmania circulent dans la région du Maghreb et sont responsables de leishmaniose cutanée et/ou viscérale: L. infantum (Harrat & Belkaid, 2003; Postigo,2010), L. major (Benikhlef et al., 2004; Chelbi et al., 2009; Rhajaoui, 2011), L. tropica (Guilvard et al., 1991; Kharfi et al., 2003; Mihoubi et al., 2008; Postigo, 2010) et L. killicki, (Rioux et al., 1986; Harrat et al., 2009). Les vecteurs d’importance les plus répandus sont Phlebotomus papatasi, Ph. sergenti et Ph. perniciosus.

D’autres protozoaires du genre Babesia et Theileria (Darghouth et al., 1996; El Haj et al., 2002; Bouattour et al., 2004) qui sont transmis par des tiques au bétail constituent une entrave majeure au développement de l’élevage dans la région et dans d’autres régions du monde (Morzaria, 1991).

1.2.2. Les bactéries

Les bactéries sont transmises essentiellement par des tiques, des poux ou des puces et appartiennent aux genres: Anaplasma (Verhulst et al., 1983), Ehrlichia (Sarih et al., 2005), Bartonella (Bitam et al., 2008; Boudebouch et al., 2011), Borrelia (Sarih et al., 2009; Bouattour et al., 2010) et Rickettsia (Sarih et al., 2008; Bitam et al., 2009). En 2003, Yersinia pestis, agent responsable de la peste qui est transmis à l’homme par l’intermédiaire de puces infectées, réapparait en Algérie (Bertherat et al., 2007) où elle continue à se manifester (Bitam et al., 2010).

1.2.3. Les arbovirus

Les virus qui sont transmis par des arthropodes hématophages sont qualifiés d’arbovirus (arthropod-borne virus). Les arbovirus appartiennent à cinq familles de virus: Togaviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae et Reoviridae. Il en existe plus de 500 espèces dont une centaine peut être pathogène pour l’homme.

Dans le grand Maghreb, la fièvre catarrhale est une maladie virale affectant les ruminants domestiques et sauvages. Elle est due à un Orbivirus (Reoviridae) transmis par certaines espèces du genre Culicoides (moucherons hématophages). En 1956, la maladie fait son apparition en Afrique du Nord, précisément au Maroc (Placidi, 1957). Depuis, la maladie reste absente jusqu’à son apparition en Tunisie en 1999 (sérotype 2), en Algérie en 2000 (sérotype 2) et finalement, au Maroc en 2004 (sérotype 4). A partir de 2006, le sérotype 1 a été introduit dans la région du Maghreb et des foyers de la maladie continuent à être observés (2008, 2009, 2010, 2011) (ProMED-mail, 2011).

La fièvre West Nile a fait son apparition en Algérie en 1994 et était responsable de 20 cas dont 8 décès (Le Guenno et al., 1996). En 1997, une deuxième épidémie a été déclarée dans la région, en Tunisie, faisant 173 cas dont 8 décès (Triki et al., 2001). Au Maroc, c’est une épizootie qui a été rapportée en 1996 avec 42 équidés morts (El Harrak et al., 1997). Dès lors, le virus a sévi à plusieurs reprises au Maroc (2003, 2008 et 2010) et en Tunisie (2003, 2008 et 2011) laissant suggérer une circulation enzootique du virus (Tableau I; Schuffenecker et al., 2005; Garbouj et al., 2003; Figuerola et al., 2009; OIE 2010; ECDC 2011; Ben Hassine et al., 2011).

Tableau I. Les cas humains et équins recensés dans la région du Maghreb depuis l’emergence du virus West Nile en 1994

Pays Période Région Nombres de cas

Algérie 1994 (Aout-septembre) Timimoune 50 patients dont 20 cas cliniques (8 décès)

Maroc 1996 (Aout- octobre) Kenitra et Larache 94 équidés (42 morts) et 1 cas humain

2003 (Septembre) Kenitra 9 équidés

2010 (Août) Benslimane et 16 équidés Mohammedia

Tunisie 1997 (Septembre - Sfax et Mahdia 173 cas humains (8 décembre) décès)

2003 (Juillet -octobre) Sfax, Mahdia, Monastir, 31 cas humains Sousse et Gabés

2011 (Novembre) Province de Kebili 3 cas humains

En 1965, la peste équine africaine apparait au Maroc et s’étend rapidement en Algérie et en Tunisie (Rabah, 1966; Mornet et al., 1967; Sers, 1967; Laaberki, 1969).

Le virus réapparait au Maroc entre 1989 et 1991, avec une perte de 555 équins (Anonymous, 1992), le seul vecteur prouvé étant le moucheron Culicoides imicola.

La maladie épizootique hémorragique touche le bétail et le virus est transmis par des culicoïdes. En 2004 et 2006, une mortalité et une morbidité associées au virus ont été rapportées au Maroc et en Algérie (ProMED-mail, 2006).

Récemment, la fièvre à phlébotomes sicilienne a émergé en Algérie en 2008 (Izri et al., 2008). Le VUSU et le VFVR, ne se sont jamais manifestés dans la région du Maghreb. Cependant, des sérologies positives ont été mises en évidence dans leSud marocain (Figuerola et al., 2009; Ayari-Fakhfakh et al., 2011; El-Harrak et al., 2011).

2. Le virus West Nile

2.1. Historique

Le virus West Nile (VWN) ou virus du Nil occidental a été isolé pour la première fois en 1937 dans le district West Nile en Ouganda chez une femme souffrant d’une forte fièvre (Smithburn et al., 1940). Aujourd’hui, le virus est présent sur tous les continents à l’exception de l’Antarctique (Figure 3) faisant de lui le virus le plus répandu dans le monde (Kramer et al., 2008).

Figure 3. Distribution géographique du virus West Nile (en gris) (Mackenzie et al., 2004; Smith, 2007; Kilpatrick, 2011).

La première épidémie dûe au VWN a été rapportée en Israël (1951-1952; Bernkopf et al., 1953) où les premieres manifestations neurologiques sévères ont été rapportées en1957 et en 1962(Hayes, 1989). Le VWN a également sévi en France (1962; Joubert et al., 1970) et en Afrique du Sud (1974, 1986-1984; McIntosh et al., 1976; Jupp et al., 1986). A partir de 1994, le VWN regagne de l’activité dans l’ancien monde et des premiers cas humains ont été rapportés en Algérie (Le Guenno et al., 1996). L’arbovirus révèle une pathogénicité plus importante et est à l’origine de plusieurs épisodes

épidémiques observés chez l’homme et/ou les chevaux. En 1996, une épidémie éclate à Bucarest (Roumanie) avec plus de 500 cas d'encéphalite dont 17 mortelles (Tsai et al., 1998). En 1999, 40 décès sont rapportés dans les villes de Volzskii et Volvograd, en Russie (Platonov et al., 2001) et en 2000, 8 décès rapportés en Israël (Weinberger et al., 2001). Une situation différente est observée au Maroc (1996), en Italie (1998) et en France (2000, 2003, 2004 et 2006) où le virus a touché essentiellement les chevaux (El Harrak et al., 1997; Cantile et al., 2000; Murgue et al., 2001b; Zeller et al., 2004; Durand et al., 2005). En 1999, le VWN est introduit à New York (USA), 62 cas d'encéphalite humaine (7 décès), 20 cas équins (9 décès) ainsi qu’une grande mortalité aviaire ont été observés (Novello, 2000; Garmendia et al., 2001). Par la suite, le VWN va élargir son aire de distribution en atteignant l’ensemble des États-Unis ainsi qu’une grande partie du continent américain, du Canada (Pepperell et al., 2003) jusqu’en Argentine (Morales et al., 2006). En 2011, 712 et 110 cas ont été déclarés respectivement aux USA et Canada (CDC, 2011; PHAC, 2011) et 303 cas sont recensés entre l’Europe et ses pays voisins (ECDC, 2011).

2.2. La structure et le génome

Le VWN est un Flavivirus de la famille des Flaviviridae. C’est un virus sphérique de 50 nm de diamètre. Le génome viral est un ARN simple brin de polarité positive, comportant un seul cadre ouvert de lecture d’environ 11 000 nucléotides. Cet ARN code une polyprotéine d’environ 3400 acides aminés dont les clivages co et post- traductionnels génèrent trois protéines structurales (protéines C de la capside, prM /M de la membrane et E de l’enveloppe) et sept protéines non structurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) nécessaires à la réplication virale et qui jouent des rôles importants dans la transcription virale, la traduction, la réplication, la maturation, et l'évasion immunitaire (Diamond et al., 2009). L’ARN viral est flanqué à ses deux extrémités de séquences non codantes (NC) nécessaires à l’initiation de la réplication et de la traduction (Figure 4).

L’ARN viral se lie aux protéines de la capside et le tout est entouré d’une enveloppe dans laquelle sont ancrées 180 copies des protéines M et E fortement glycosylées (Mukhopadhyay et al., 2003).

(a) (b) Figure 4. Schéma de la structure (a) et du génome (b) d’un Flavivirus. Le virus est enveloppé et son génome est un ARN simple brin de polarité positive codant pour 3 protéines structurales (Capside, Membrane et Enveloppe) et 7 protéines non structurales (Petersen &Roehrig, 2001).

2.3. Les lignages

Des analyses phylogénétiques basées sur l’analyse des séquences nucléotidiques d’un fragment de 255 pb du gène codant pour la glycoprotéine E, ont montré que les isolats du VWN de différentes régions géographiques sont classés en deux lignages majeures (1 et 2), présentant 25 à 30% de différences nucléotidiques (Berthet et al., 1997; Lanciotti et al., 2002) et plusieurs sous-clades ou clusters (Figure 5a; Berthet et al., 1997; Lanciotti et al., 1999; Savage et al., 1999; Scherret et al., 2001; Charrel et al., 2003). Le lignage 1 regroupe des souches qui circulent en Afrique de l’Ouest, Moyen Orient, Europe de l’Est, Amérique du Nord et Australie. Le lignage 2 a une répartition géographique restreinte; il circule en Afrique sub-saharienne et Madagascar. Récemment, il a été retrouvé en Europe et plus précisement, en Hongrie, en Grèce et en Italie (Bakonyi et al., 2006; Bagnarelli et al., 2011; Papa et al., 2011). D’autres souches du VWN ont été isolées et présentent des différences génétiques considérables par rapport aux deux lignages 1 et 2 (Figure 5b; Lvov et al., 2004); le lignage 3 inclût le virus Rabensburg isolé en République Tchèque en 1997 (Bakonyi

10 et al., 2005), le lignage 4 est représenté par une seule souche isolée en Russie (Caucase en 1998; Bakonyi et al., 2005) et le lignage 5 correspond à une souche isolée en Inde en 1980 (Bondre et al., 2007).

a b

Figure 5. Analyse phylogénétique du virus West Nile (Lanciotti et al., 1999; Papa et al., 2011).

2.4. Le cycle de transmission

Après la découverte du VWN, des premiers travaux ont été conduits en Egypte, en couplant les volets entomologiques, vétérinaires et humains et ont révélé l’implication des moustiques de genre Culex comme vecteurs principaux et des oiseaux comme principaux hôtes amplificateurs qui développent une virémie suffisante pour permettre l’infection des moustiques lors de la prise du repas de sang. Après une période d'incubation extrinsèque, le moustique peut infecter d’autres oiseaux. Ainsi, le virus est maintenu dans un cycle enzootique «oiseau-moustique- oiseau». Ces travaux ont montré également la présence d’infections «cul de sac» chez le cheval et l’homme qui sont incapables de développer une virémie suffisante pour permettre par la suite l’infection du moustique (Work et al., 1953, 1955; Hurlbut, 1956; Hurlbut et al., 1956; Taylor et al., 1956). Le VWN a pu disséminer d’un pays à l’autre et d’un hémisphère à l’autre par l’intermédiaire des oiseaux migrateurs (Nir et al., 1967; Hannoun et al., 1969, 1972; Watson et al., 1972; Berthet et al., 1997). Dans le cas de l’introduction du virus de l’ancien vers le nouveau monde, il s’agit d’une introduction liée aux activités commerciales et non via la migration des oiseaux (Figure 6; Weaver & Barrett, 2004). D’autres cycles de transmission ont été décrits impliquant certains amphibiens ou reptiles comme hôtes amplificateurs (Kostyukov et al., 1985; Klenk et al., 2004).

Figure 6. Cycle de transmission du virus West Nile. Le VWN est maintenu au sein d’un cycle enzootique «moustique-oiseaux» et la contamination de l’homme et du cheval est accidentelle.

2.5. Le cycle de réplication virale

La premiere étape du cycle viral est l’attachement virus sur la surface cellulaire qui implique une interaction entre la protéine d’enveloppe E et des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire (Figure 7). Les récépteurs DC-SIGN, alphaVbeta3 integrin (Bogachek et al., 2010) et laminin-binding protein (Bogachek et al., 2008) ont été rapportés comme potentiel récepteurs. Un processus d’endocytose récepteur- dépendante conduit alors à l’internalisation de la particule virale dans une vésicule à clathrines (Chu & Ng, 2004). Une acidification de l’endosome s’opère entrainant un changement de conformation de la proteine E et induisant ainsi la fusion de l’enveloppe virale et de la membrane endosomale (Gollins & Porterfield, 1986). La nucléocapside est libérée dans le cytoplasme de la cellule hôte et l’ARN génomique est décapsidé. Ce dernier etant de polarité positive, fait office d’ARNm et est transcrit en une seule polyproteine. La maturation protéolytique de la polyprotéine virale, puis de ces produits de clivage, génère les trois protéines structurales et les sept protéines non-structurales. Les protéines virales NS3 et l’ARN polymérase ARN-dépendante NS5 (Rice et al., 1986; Poch et al., 1989) s’associent probablement à des protéines cellulaires pour former un complexe de réplication réalisant la synthèse de brins d’ARN (-). Ceux-ci servent à leur tour de matrice pour la synthèse de brins d’ARN (+) destinés soit à être traduits, soit à être encapsidés dans les virions en cours de maturation. Les proteines de capside s’assemblent avec l’ARN viral pour former la nucléocapside. Les nucléocapsides nouvellement formées seraient ensuite internalisées dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE) selon un processus de bourgeonnement. La membrane du RE, dans laquelle sont ancrées les protéines E et prM, formerait ainsi l’enveloppe des virions immatures. Ces derniers seraient ensuite transportés, dans des vésicules de sécrétion, vers l’appareil de Golgi. Dans le réseau trans- golgien, il a été démontré qu’une protéase cellulaire assure la maturation de l’enveloppe virale par le clivage de prM en M (Konishi & Mason, 1993). La libération des virions dans le milieu extracellulaire se ferait ensuite par exocytose au travers de la membrane plasmique (Mukhopadhyay et al., 2005).

Figure 7. Cycle de réplication des Flavivirus (Samuel, 2002).

2.6. Pathogénèse et vaccin

Après une piqure de moustique, le flavivirus infecte les kératinocytes (Lim et al., 2011) et les cellules dendritiques de Langerhans migrent aux ganglions lymphatiques où le virus se réplique (Ho et al., 2001; Libraty et al., 2001; Wu et al., 2001), dissémine par la suite via la circulation sanguine et infecte le rein et la rate, où une deuxième réplication a lieu. Selon le niveau de virémie, le virus peut traverser la barrière hémato-encéphalique, atteindre le cerveau et cause la méningo-encéphalite. La période d’incubation de l’arbovirus chez l’homme varie entre 2 et 14 jours. L’infection chez l’homme est souvent asymptomatique. Dans le cas contraire, elle se traduit par un syndrome pseudogrippal; fièvre, céphalées, myalgies, arthralgies, asthénie, éruption cutanée, pharyngite, manifestations digestives (nausées, vomissement, diarrhée, douleurs abdominales). Près de 1 % des personnes développant des signes cliniques présentent des formes graves avec des troubles neurologiques de type méningites aigues ou encéphalites (Gallian et al., 2005). Chez les équidés, l’infection varie de simple syndrome pseudo-grippal à une encéphalite mortelle. Les atteintes neurologiques touchent approximativement 10 % des chevaux infectés dont les signes cliniques sont les suivants: ataxie, contractions

14 musculaires, paralysie partielle, cécité apparente, mouvements d’appui de la tête, grincements de dents, désorientation, convulsions. L’affaiblissement, généralement localisé au niveau des membres postérieurs, est parfois suivi de paralysie. L’infection chez les oiseaux est généralement asymptomatique à l’exception de certaines espèces telles que les oies et les corbeaux.L’atteinte neurologique se manifeste sous diverses formes allant d’une incapacité à se tenir debout à une paralysie des pattes et des ailes.

Le traitement des infections dûes au VWN est purement symptomatique et aucun traitement spécifique n’est disponible actuellement. L’utilisation de la ribavirine et l’interferon α est discutable. En effet, la ribavirine inhibe la multiplication des virus en s’incorporant en tant que nucléoside défectueux à la place des nucléosides corrects durant la réplication du virus. Lorsque le virus pénètre dans la circulation sanguine, les leucocytes produisent l’interféron α qui active les cellules environnantes infectées et non infectées afin d’inhiber la synthèse protéique virale et d'autre part, de provoquer la décomposition de l'ARN viral. Au niveau des cellules de mammifères infectées par le VWN, la production d'interféron α est inhibée. Ainsi, le traitement par l'interféron permet de réactiver les cellules et par conséquent, les défenses immunitaires.

Il n’existe pas de vaccin humain. Cependant, le virus inactivé est utilisé comme vaccin aux USA pour prévenir l’infection chez le cheval ainsi que d’autres vaccins chimériques exprimant les protéines de la membrane et de l’enveloppe (DeFilette et al., 2012).

3. Le virus de la fièvre de la vallée du Rift

3.1. Historique

Le virus de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR) a été isolé en 1930 lors d’une épizootie au Kenya qui a provoqué la mort de 3500 agneaux et 1200 brebis (Daubney et al., 1931). Pendant plusieurs années, le virus a continué à être responsable d’épizooties en Afrique de l’Est et du Sud. Ce n’est qu’en 1975, qu’une première épizootie-épidémie éclate en Afrique du Sud où l’infection humaine est associée pour la première fois à des symptômes de fièvre hémorragique et d’encéphalite (McIntosh et al., 1980). Le VFVR atteint l’Egypte en 1977, touchant 200 000 personnes et faisant 598 décès (El-Akkad, 1978; Meegan, 1979). Depuis lors, des épidémies se sont succédées dans toute l’Afrique sub-saharienne; en Mauritanie en 1987 en provoquant 1264 cas dont 224 décès (Digoutte et al., 1989), à nouveau en Egypte en 1993 (Arthur et al., 1993) et en 1997 (Abd El-Rahim et al., 1999), au Kenya (Nord-Est) et en Somalie (Sud) en 1997-98 faisant 478 décès (Anonymous, 1998). En outre, le virus s'est étendu pour la première fois hors d'Afrique, gagnant l’Arabie Saoudite et le Yémen en 2000 (Ahmed, 2000) et faisant respectivement 884 cas humains dont 124 décès et 1087 cas humains dont 121 décès. En 2006-2007, une vaste épidémie sévit en Afrique de l’Est: au Kenya (684 cas dont 155 décès), en Tanzanie (264 cas dont 109 décès), en Somalie (114 cas dont 51 décès) et au Soudan (601 cas dont 211 décès). En 2008, un foyer est notifié en Afrique du Sud ainsi qu’à Madagascar (17 morts et plus de 400 cas humains) (Tableau II).

Tableau II. Principales épidemies de la fièvre de la vallée du Rift (Cêtre-Sossah & Albina, 2009)

Aujourd’hui, la fièvre de la vallée de Rift est présente en Afrique, à Madagascar et dans la péninsule arabique. Cependant, dans certains pays africains, la maladie ne s’est jamais manifestée malgré les sérologies positives détectées dans le bétail (Figure 8).

Figure 8. Répartition de la fièvre de la vallée du Rift en Afrique, à Madagascar et dans la péninsule arabique chez l’animal et chez l’homme (Chevalier et al., 2008).

3.2. La structure et le génome

Le VFVR, un Phlebovirus de la famille des Bunyaviridae, est un virus enveloppé de 90 à 110 nm de diamètre. Le génome du VFVR est un ARN simple brin de polarité négative et tri-segmenté: Le segment L (Large) code pour la protéine L qui est une ARN polymérase ARN dépendante. Le segment M (Medium) code pour une polyprotéine qui génère les glycoprotéines Gn, Gc et NSm après clivage post- traductionnel. Le segment S est traduit de manière ambisens : dans le sens du génome, il code pour une protéine non structurale NSs, et dans le sens antigénomique, pour la protéine N (Figure 9). Chaque ARN est associé à des protéines N et L et l’ensemble forme une ribonucléoprotéine. Les glycoprotéines Gn et Gc sont deux protéines de surface qui s’insèrent dans la membrane du virus, formant des spicules de 5 à 10 nm de longueur. Elles ont des propriétés hémagglutinantes et sont responsables de la fixation de la particule virale à la surface des cellules cibles, après reconnaissance de leurs récepteurs (encore inconnus). La protéine non structurale NSm n’est pas essentielle pour le déroulement du cycle viral (Won et al., 2006; Gerrard et al., 2007) et son rôle est encore inconnu (Bouloy & Weber, 2010) tandis que la protéine NSs

18 constitue le facteur de virulence. En effet, la proteine NSs forme des filaments dans le noyau de la cellule infectée et inhibe la transcription cellulaire.

Figure 9. Schéma de la structure et du génome du virus de la fièvre de la vallée du Rift. Le VFVR possede un génome de polarité négative ou ambisens et tri-segmenté (Segments L, M et S) (Pépin et al., 2010).

Les analyses phylogénétiques des séquences du segment M ont permis de définir trois lignées majeures: Afrique de l'Ouest, Afrique centrale-orientale et Egypte (Figure 10). Bien que la plupart des souches sont regroupées selon leur origine géographique, aucune corrélation entre le génotype viral et l'emplacement géographique n’a été observée (Bird et al., 2007).

Figure 10. Analyse phylogénétique du virus de la fièvre de la vallée du Rift (Pépin et al., 2010).

3.3. Le cycle de transmission

Le cycle de la fièvre de la vallée de Rift fait intervenir des moustiques du genre Aedes et/ou Culex. Les femelles infectées du genre Aedes sont capables de transmettre le virus à leurs descendants (transmission verticale). Les œufs sont capables de résister à la dessiccation durant de longues périodes jusqu’à la saison des pluies suivantes. A la mise en eau, les œufs infectés éclosent et donnent des adultes infectés. Lors d’un repas sanguin, la femelle transmet par piqure le virus aux animaux sauvages ou domestiques. C’est le cycle enzootique. Les animaux infectés vont servir de source de contamination pour d’autres moustiques et vont être à l’origine d’épizootie et/ou d’épidémie. Une autre possibilité serait que le virus soit conservé au sein d’un réservoir naturel. Certains rongeurs ont été proposés comme réservoir possible en Afrique du Sud (Pretorius et al., 1997). Le VFVR a été également isolé d’animaux sauvages et de moustiques en forêt tropicale suggérant un cycle selvatique (Sall, 1999). Le virus est également transmis par aérosols à partir de liquides biologiques ou de tissus d’animaux contaminés. C’est dans cette situation que l’homme se contamine en plus d’une transmission par des moustiques. Cependant, l’homme reste généralement considéré comme un “cul-de-sac épidémiologique”, car la transmission interhumaine n’a jamais pu être observée (Figure 11).

Figure 11. Cycle biologique du virus de la fièvre de la vallée du Rift. Le maintien du virus se fait dans des œufs d’Aedes et/ou dans des rongeurs ou des ruminants sauvages qui seraient le réservoir animal. Suite à de fortes pluies, la pullulation des moustiques infectés entrainerait la contamination des animaux d’élevage, c’est l’épizootie. Si cette derniere s’intensifie et se déplace en zone urbaine par le déplacement du bétail contaminé, l’homme peut alors être touché, c’est l’épidémie.

3.4. Le cycle de réplication virale

Comme tous les virus à ARN négatif, le génome est transcrit et répliqué seulement quand les proteines N et L lui sont associées sous forme de ribonucleoproteines (RNPs). Les RNPs se présentent sous forme circulaire et possedent une structure pseudo-hélicoidale. A la différence des ARN génomiques et anti-génomiques, les ARNm viraux possèdent à leur extremité 5’ une sequence additionnelle d’ARN coiffée et methylée d’origine cellulaire aquise par capture de coiffe (cap-snatching). Comme tous les Bunyavirus, le cycle a lieu dans le cytoplasme. Le virus bourgeonne au niveau des membranes de l’appareil de Golgi. Le site de bourgeonnement semble être determiné par les glycoprotéines Gn et Gc qui possèdent des signaux d’adressage aux membranes golgiennes (Gerrard & Nichol, 2002). Les glycoproteines de l’enveloppe semblent médier l’entrée du virus dans les cellules à travers des récepteurs qui pour la plupart des Bunyavirus, restent à identifier

(Bouloy & Weber, 2010).Cependant, une étude récente a montré que DC-SIGN sert de récepteur pour les Phlebovirus (Lozach et al., 2011).

3.4. Pathogénèse et vaccin

Le virus se réplique au niveau du foie, la rate et souvent le cerveau. Suite à une période d’incubation de 3 à 7 jours, l’homme développe une forme bénigne pseudo- grippale avec une hyperthermie, des céphalées, des myalgies et des nausées. Une proportion de personnes infectées de 3% à 20% développe des complications: une atteinte oculaire, une méningo-encéphalite ou une hépatite associée à un syndrome hémorragique. Les lésions rétiniennes peuvent provoquer une baisse définitive de l’acuité visuelle voire la cécité. La méningo-encéphalite peut entraîner des lésions nerveuses irréversibles (Alrajhi et al., 2004). Ces deux formes sont rarement mortelles. A l’inverse, la fièvre hémorragique est fatale dans la moitié des cas et apparait 3 à 6 jours après le début de la maladie (Peters & Meegan, 1981). Chez les animaux, la sensibilité à l’infection varie selon l’âge et l’espèce (Tableau III). L’infection est rarement mortelle pour les adultes, mais provoque des avortements chez les femelles en gestation et une mortalité importante chez les jeunes animaux (Easterday, 1965; Shimshony & Barzilai, 1983).

Tableau III. Sensibilité des animaux au virus de la fièvre de la vallée du Rift (Lefèvre, 1989)

Hautement Sensibles Modérément Faiblement Résistants sensibles sensibles sensibles (infection inapparente)

Agneaux Veaux Bovins Chameaux Oiseaux

Chevreaux Moutons Chèvres Chevaux Reptiles

Chiots Buffles Porcs Amphibiens

Chatons Chiens

Souris Chats

Hamsters Cobayes

Lapins

Il n’existe aucun traitement spécifique pour la FVR. Chez l’homme, un traitement symptomatique est mis en place dans les cas sévères afin d’améliorer l’état général du patient. L’usage d’interférons (α et β) ou de ribavirine est discutable.

Les vaccins existants sont divisés en deux groupes: les souches vivantes et les souches inactivées. La souche neurotrope Smithburn (Smithburn, 1949) est une souche atténuée qui induit une immunité de longue durée après une seule inoculation mais provoque des avortements et/ou des malformations fœtales. Dans cette catégorie, on cite deux autres candidats, la souche MP12 (obtenue à partir de la souche ZH548 après 12 passages en présence de l’agent mutagène 5 fluoro- uracyl (Caplen et al., 1985) et la souche Clone 13 (souche naturellement atténuée). Un autre vaccin R566, est obtenu par réassortiments entre les deux souches Clone13 et MP12. Les vaccins inactivés ont l’avantage de ne pas présenter d’effets néfastes mais l’immunité induite est de courte durée et nécessite des rappels annuels. La souche virale est généralement inactivée à l’aide de dérivé de formol comme la souche RVFV TSI-GSD-200 (Ikegami & Makino, 2009; Pépin et al., 2010; Boshra et al., 2011).

4. Les vecteurs du VWN et VFVR

4.1. La transmission vectorielle et la notion de capacité vectorielle

En conditions naturelles, le vecteur s’infecte lors d’un repas sanguin sur un hôte vertébré en phase de virémie. Par la suite, le vecteur devient infectant et peut transmettre le virus à un hôte naïf. En conditions de laboratoire, on reproduit ce cycle soit en utilisant des animaux comme hôtes donneurs ou receveurs soit en utilisant des méthodes artificielles qui consistent en une infection orale du vecteur puis à une recherche du virus dans la salive. Ces deux techniques permettent d’évaluer l’aptitude d’un arthropode à s’infecter, amplifier et transmettre le virus, autrement dit, elles permettent d’évaluer la compétence vectorielle. Quand un moustique ingère un repas sanguin contenant du virus (Figure 12, site A), ce dernier se retrouve dans la lumière de l’intestin moyen (Figure 12, site B). La prise du repas sanguin initie l’excrétion d’enzymes protéolytiques ainsi que la formation d’une membrane chitineuse nommée “la matrice péritrophique” (Figure 12, site C) qui entoure le bol alimentaire et protège l’épithélium intestinal des enzymes de la digestion. Pendant ce temps, le virus doit pénétrer dans les cellules intestinales (Figure 12, site D) avant que la membrane péritrophique ne devienne complètement imperméable sinon il sera piégé dans le bol alimentaire et détruit. Après une phase de réplication dans les cellules de l’épithélium intestinal, les virions sont libérés dans la cavité générale et disséminent dans les différents organes avec l’hémolymphe (Figure 12, site E). Ainsi, le virus infecte le corps gras, les tubes de Malpighi (Figure 12, site F), les ovaires (Figure 12, site G), la chaine nerveuse centrale et les glandes salivaires (Figure 12, site H). Une fois la barrière salivaire franchie, le virus se retrouve dans la salive qui est alors injectée lors d’une piqure de la femelle infectante. A savoir qu’une femelle infectée le restera toute sa vie. Le temps nécessaire pour que le virus progresse dans un moustique, depuis son ingestion jusqu’à ce qu’il se retrouve dans la salive, est appelé la période d’incubation extrinsèque (PIE) qui est un paramètre sensible à la température. En effet, quand on augmente la température d’incubation, on diminue la PIE (Figure13). La compétence vectorielle dépend des interactions moustique-virus qui vont permettre ou empêcher le développement de l’agent infectieux dans le corps de l’arthropode. Elle dépend de facteurs intrinsèques essentiellement d’origine

25 génétique (Beerntsen et al., 2000). Quant à la capacité vectorielle, elle dépend des interactions moustique-virus-environnement et plus précisément, de la densité du vecteur, ses préférences trophiques, sa durée de vie, sa durée d’incubation extrinsèque pour l’agent infectieux…(Macdonald, 1957).

Figure 12. Schéma montrant le cheminement du virus dans le corps d’un moustique vecteur. Aprés ingestion (A), le virus se retrouve dans le bol alimentaire et doit infecter les cellules intestinales (B, C et D) pour être libéré par la suite dans la cavité générale (E) et infecter les organes secondaires (F, G) y compris les glandes salivaires (H) (modifié à partir de Beerntsen et al., 2000).

Figure 13. La période d’incubation extrinsèque varie selon la température. La période d’incubation extrinsèque est la durée nécessaire pour qu’une femelle de moustique devienne infectante après un repas sanguin infecté. Cette période diminue en augmentant la température d’incubation (Focks et al., 1995).

4.2. Les vecteurs du VWN

Plus de 70 espèces de moustiques ont été trouvées naturellement infectées par le VWN, (Mononi et al., 2010). Cependant, elles ne sont pas toutes impliquées dans la transmission. En effet, une espèce naturellement infectée ne signifie pas automatiquement qu’elle soit vectrice. Elle a peut-être piqué un individu infecté et présentait du virus dans le repas de sang en cours de digestion. Les espèces impliquées dans la transmission du VWN appartiennent essentiellement au genre Culex. En Afrique et au Moyen Orient, le principal vecteur est Cx. univittatus associé à Cx. antennatus et Cx. pipiens en Égypte (Taylor et al.,1956), Cx. pipiens en Israël (Nir et al., 1972) et Culex theileri en Afrique du Sud (McIntosh et al., 1967). En Europe et Russie, les principaux vecteurs sont Cx. pipiens et Cx. modestus (Mouchet et al., 1970; Berezin, 1971; Savage et al., 1999) et en Asie, il s’agit de Cx. tritaeniorhynchus, Cx. quinquefasciatus et Cx. vishnui (Pavri & Singh, 1965; Akhter et al., 1982). Aux États-Unis, les espèces qui jouent un rôle dans la transmission du VWN sont Cx. tarsalis, Cx. pipiens, Cx. restuans, Cx. salinarius et Cx. erraticus au Nord (Andreadis et al., 2004; Lukacik et al.,2006; Gujral et al., 2007) et au Sud, Cx. quinquefasciatusassocié à Cx. nigripalpus à l’Est et Cx. tarsalis à l’Ouest (Reisen et al., 2004; Hayes et al., 2005a). Cx. nigripalpus, Cx. bahamensis et Cx. quinquefaciatus sont des vecteurs principaux du VWN en Amérique centrale et aux Caraïbes (Lefrançois et al., 2006; Barrera et al., 2008).

4.3. Les vecteurs du VFVR

En Afrique de l’Est, les principales espèces qui ont été trouvées naturellement infectées appartiennent aux genres Aedes (Ae. cumminsii, Ae. circumluteolus, Ae. mcintoshi) et Culex (Culex pipiens, Culex neavii, Cx. zombaensis et Culex antennatus), Mansonia africana, et Anopheles pharoensis (Hoogstraal et al., 1979; Meegan et al., 1980; Linthicum et al., 1985; Meegan & Bailey, 1989; Logan et al., 1991). En Afrique du Sud, le VFVR a été isolé d’Ae. circumluteolus, Ae. caballus, Ae. juppi, Ae. cinereus et de Cx. theileri (McIntosh & Jupp, 1981).

En Afrique de l’Ouest, Ae. vexans arabiensis, Ae. ochraceus et Ae. dalzieli sont des vecteurs enzootiques du virus au Sénégal où une autre espèce, Ae. vexans joue un rôle primordial dans le maintien du virus et notamment, dans la région de Ferlo (Fontenille et al., 1998; Chevalier et al., 2004). L’espèce Cx. poicilipes a été incriminée dans l’épizootie-épidémie de 1998 en Mauritanie (Diallo et al., 2005). Cx. quinquefacsiatus pourrait également jouer un rôle dans la transmission du VFVR (Marrama et al., 2005). Lors de l’épidémie du 1977 en Egypte, Culex pipiens fut la seule espèce trouvée naturellement infectée (Meegan et al., 1980). En Arabie saoudite et au Yémen, deux espèces ont été trouvées naturellement infectés. Il s’agit de Ae. vexans arabiensis et Cx. tritaeniorhynchus tandis que Ae. caspius et Cx. pipiens sont soupçonnées de jouer un rôle dans le cycle épidémiologique du VFVR (Jupp et al., 2002; Miller et al., 2002).

4.4. Le complexe Culex pipiens

4.4.1. Position systématique

Les moustiques appartiennent à la classe des insectes, à l’ordre des diptères et à la famille des Culicidés. Les moustiques sont cosmopolites et sont groupés en deux sous-familles, Culicinae et Anophelinae. Au Maroc, 42 espèces sont référencées et issues des genres: Anopheles, Aedes, Coquillettidia, Culex, Culiseta, Ochlerotatus, Orthopodomyia et Uranotaenia (Trari et al., 2002) dont l’espèce Culex pipiens. Sa classification est la suivante:

Règne : Animalia

Embranchement : Arthropoda

Sous-embranchement : Hexapoda

Classe : Insecta

Sous-classe : Pterygota

Ordre : Diptera

Sous-ordre : Nematocera

Famille : Culicidae

Sous-famille : Culicinae

Genre : Culex

Espèce : Culex pipiens

4.4.2. Bio-écologie

La vie du moustique Cx. pipiens est composée de deux phases distinctes: une phase aquatique et une phase aérienne (Figure 14). Après l’accouplement, les femelles prendront un repas sanguin nécessaire à l’élaboration des œufs. Cependant, les femelles de Cx. pipiens peuvent produire une première ponte sans repas sanguin: elles sont dites autogènes. Elles utilisent les réserves accumulées durant leur stade larvaire. Les œufs sont pondus dans l’eau, claire en général, mais on les trouve également dans les eaux polluées, chargées en matières organiques qui permettront aux larves de se nourrir. Les œufs sont déposés en une nacelle qui flotte sur l’eau. L’éclosion se produit environ 24 h à 48 h après l’oviposition. Les larves ont un mode de vie exclusivement aquatique, d’une durée de 5 à 6 jours. Elles subiront 4 mues avant de se transformer en nymphe. La nymphe ne se nourrit plus et de profondes modifications anatomiques s’opèrent. Aprés 2 à 3 jours, l’adulte est complètement formé dans son enveloppe nymphale. Le tégument se dessèche au contact de l’air et il se forme une déchirure en T sur sa face dorsale sous l’effet de l’augmentation de la pression interne. L’imago se dégage progressivement en se

29 gonflant d’air pour s’envoler après un temps nécessaire au déplissage des ailes et des pattes par augmentation de la pression de l’hémolymphe.

Figure 14. Cycle biologique de Culex pipiens.

4.4.3. Les membres du complexe Cx.pipiens

Le complexe Culex pipiens regroupe plusieurs espèces: Cx. pipiens Linnaeus, 1758 avec ses deux formes; la forme pipiens et la forme molestus Forskll,1775, Cx. quinquefasciatus Say, 1823, Cx. pallens Coquillett 1898, Cx. globocoxitus Dobrotworsky 1953 et Cx. australicus Dobrotworsky et Drummond, 1953. D’autres espèces sont étroitement liées ou suggérées appartenir à ce complexe telles que, Cx. vagans Wiedemann 1828, Cx. fatigans Wiedemann 1828, Cx. Pervigilans Von Bergroth 1889 et Cx. torrentium Martini, 1925, (Vinogradova 2003; Smith & Fonseca, 2004). Les membres de ce complexe présentent des caractères morphologiques semblables avec des différences éco-physiologiques qui se traduisent par leur capacité à produire une première ponte sans prendre de repas sanguin (autogénie versus anautogénie), à s’accoupler dans des espaces fermés (sténogamie versus eurygamie), à entrer en diapause durant la période hivernale (hétérodyname versus homodyname) (Tableau IV).

Chaque membre appartenant au complexe Cx. pipiens a une répartition géographique caractéristique. En effet, Cx. pipiens L. est présent en Europe, au Nord et au Sud de l’Afrique, en Asie non tropicale et en régions tempérées de l’Amérique du Nord et du Sud (Harbach et al., 1985; Vinogradova, 2000; Vinogradova, 2003). Cx. pipiens existe uniquement sous sa forme molestus au Japon, en Corée du Sud et en Australie (Vinogradova, 2000). Cx. quinquefasciatus est présent en région tropicale, subtropicale de l’Afrique et des Amériques et en Sud-Est de l’Asie et de l’Australie (Fonseca et al., 2006). Cx. pallens est distribué à l'Est de l'Oural à travers l'Asie tempérée (Fonseca et al., 2009). Cx. globocoxitus et Cx. australicus sont essentiellement limités à l’Australie. Cx. vagans est rencontrée en Chine, en Inde, en Corée, au Japon, et en Russie. Cx. fatigans et Cx. pervigilans sont rencontrés en Nouvelle Zélande et dans les îles avoisinantes (Belkin, 1968). Et finalement, Cx. torrentium est une espèce paléarctique présente en Europe et dans certaines régions asiatiques (Vinogradova, 2000).

Tableau IV. Caractères éco-physiologique des membres du complexe Cx. pipiens

Membre du complexe Autogénie Sténogame (S)/ Diapause Eurygame (E) Cx. pipiens forme pipiens - E + Cx. pipiens formemolestus + S - Cx. quinquefasciatus - S - Cx. pallens - S + Cx. globocoxitus ? ? - Cx. australicus - E - Cx. vagans - E + Culex fatigans ? ? - Cx. pervigilans ? ? ? Cx. torrentium - E + ?: non renseigné.

Le moustique Culex pipiens L. existe sous deux formes: une forme molestus et une forme pipiens.La forme molestus est autogène (capable de réaliser une première ponte sans prendre de repas de sang), sténogame (peut s’accoupler dans des

31 espaces confinés) et reste en activité durant la période hivernale (homodynamique). A l’inverse, la forme pipiens est anautogène (exigeant toujours un repas de sang pour réaliser une ponte), eurygame (s’accouple en plein air) et entre en diapause pendant l’hiver (hétérodynamique). De plus, la forme molestus et la forme pipiens se développent respectivement dans des gites épigés et hypogés en Russie et aux USA (Byrne & Nichols, 1999; Huang et al., 2008). Cependant, les deux formes peuvent cohabiter dans des gites hypogés ainsi qu’en gites épigés (Chevillon et al., 1995; Gomes et al., 2009; Reusken et al., 2010). Les deux formes semblent ne pas être isolées génétiquement et leurs hybrides sont présents aux USA, au Sud et au Nord de l’Europe (Fonseca et al., 2004; Gomes et al., 2009; Reusken et al., 2010). Les deux formes présenteraient des préférences trophiques différentes, la forme pipiens se nourrit principalement sur les oiseaux (ornithophile) et la forme molestus sur les mammifères (mammophile). Par ailleurs, les hybrides ont des préférences trophiques mixtes pour les oiseaux et les mammifères.

Cx. pipiens L. est le seul membre du complexe Culex pipiens présent en Afrique du Nord. C’est un vecteur compétent pour plusieurs agents pathogènes affectant l’homme et/ou l’animal tel est le cas du virus West Nile (Krida et al., 2010), le virus de la fièvre de la vallée de Rift (Hoogstraal et al., 1979; Meegan et al., 1980; Moutailler et al., 2008) et de filaires (Harb et al., 1993; Krida et al., 1998; Abdul- Hamid et al., 2009; Abdul-Hamid et al., 2011). Culex pipiens L. a déjà été décrit dans cette région. Il s’agit de descriptions basées sur des caractères morphologiques, physiologiques, reproductifs et écologiques (Roubaud, 1939; Knight & Malek, 1951; Gaud, 1953; Vermeil, 1954; Rioux, 1958; Senevet et al., 1958; Rioux, 1965; Pasteur et al., 1977; Himmi et al., 1995). Dans les zone urbaines, les populations de Cx. pipiens colonisent les gites hypogés et ont été décrites comme autogènes, sténogames et anthropophiles. Des populations anautogènes ont été également observées en gites épigés. A l’inverse, Cx. pipiens est anautogène, sténogame et anthropophile ou ornithophile en zones rurales. Cependant, ces caractères restent limités et une identification basée sur les différences génétiques semble nécessaire pour distinguer les membres du complexe Cx. pipiens. Dans cet objectif, plusieurs techniques ont été développées (Tableau V).

Tableau V. Marqueurs moléculaires utilisés pour identifier certains membres du complexe Cx. pipiens Marqueur Membres du complexe Cx. pipiens Références Ribosomal Cx. pipiens Crabtree et al. (1995) Cx. restuans Cx. salinarius Ribosomal Cx. pipiens Aspen et al. (2003) Cx. nigripalpus Nucléaire (Ace2) Cx. pipiens Smith & Fonseca (2004) Cx. quinquefasciatus Cx. pallens Cx. torrentium Cx. australicus Cx. pervigilans Nucléaire (Ace2) Cx. pipiens Aspen & Savage (2003) Cx. quinquefasciatus Nucléaire (Ace2) Cx. pallens Kasai et al. (2008) Cx. pipiens forme molestus Nucléaire (COI) Cx.pipiens forme pipiens Shaikevich (2007) Cx.pipiens forme molestus Nucléaire (CQ11) Cx.pipiens forme pipiens Bahnck & Fonseca (2006) Cx.pipiens forme molestus

5. L’immunité antivirale

5.1. Chez le moustique

Les insectes ne possédent que l'immunité innée pour lutter contre les pathogènes. La drosophile Drosophila melanogaster a servi de modèle pour étudier le système immunitaire des insectes notamment après le séquençage de son génome (Adams et al., 2000). Dans cette partie, nous allons evoqué que les voies inmpliquées dans la réponse antivirale.

5.1.1. La voie Toll

La voie Toll est impliqué dans la réponse antifongique et antibactérienne (Bactéries à Gram (+)) (Lemaitre et al., 1996). Après fixation des ligands sur le récepteur Toll, la voie de transduction faisant intervenir l’adaptateur moléculaire MyD88 est activée induisant ainsi la degradation de l’inhibiteur Cactus. Cette dégradation permet la translocation de Dif (Drosophila immunity factor) dans le noyau et l’activation de la transcription de peptides antimicrobiens tels la drosomycine et la défensine (Figure15; Hoffmann, 2003). En 2005, cette voie s’est révélée importante dans la réponse antivirale chez la Drosophile (Zambon et al., 2005). Des études plus récentes demontrent son implication chez le moustique Aedes aegypti suite à une infection par le virus de la dengue (Xi et al., 2008).

5.1.2. La voie Imd

La voie Imd (Immune deficiency) est impliquée dans la production des peptides antimicrobiens dirigés contre les Bactéries à Gram (-). L’activation de cette voie se fait par la reconnaissance de motifs présents à la surface des bactéries par les recepteurs PGRP-LC et PGRP-LE, ce qui entraine une cascade de signalisation et active la synthèse de diptéricine cécropine, drosocine et attacine (Figure 15).Cette voie est également impliquée dans la réponse antivirale chez la drosophile (Lemaitre et al., 1995).

5.1.3. La voie Jak/STAT

La voie Janus kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription (Jak/STAT) est activée chez la drosophile par la fixation du ligand Unpaired (UPD) sur le récepteur Domless (Dome). Ceci entraine le recrutement des facteurs STATs localisés dans le cytoplasme et qui transitent dans le noyau où ils vont assurer la transcription de certains facteurs (Figure15). En 2005, l’implication de cette voie dans la réponse antivirale a été demontrée pour la premiere chez la drosophile (Dostert et al., 2005).

Figure 15. Shéma récapitulatif des réactions antivirales chez la drosophile (Arjona et al., 2011).

5.1.4. L’ARN interférence

L’ARN interférence est la voie la plus etudiée en tant que réponse antivirale chez la drosophile. Elle a été decouverte chez les plantes en 1990 (Jorgensen and kaimenyi, 1990).

Les dsRNA sont fragmentés par une RNaseIII appelée Dicer2 en de nombreux petits fragments d’ARN appelés siRNA (small interfering RNA) de 20 à 25 paires de bases (Bernstein et al., 2001). R2D2 est le cofacteur de Dicer2 et va permettre la laison avec le compexe RISC (RNA- Induced Silencing Complex) contenant la proteine Argonaute2 (Ago2). Le complexe RISC guidé par le simple brin siRNA, va cibler de manière spécifique l’ARNm correspondant et entrainer sa dégradation (Figure16). Cette voie est activée chez Aedes aegypti après une infection par le virus de la dengue (Sanchez-Vargas et al., 2004; 2009) et également, chez Culex pipiens infecté par le VWN (Brackney et al., 2009).

Figure 16. Mécanisme de l’ARN interférence (Arjona et al., 2011).

5.2. Chez l’homme

L’immunité innée et aquise limitent la replication du virus dans les organes périphériques (Figure 17). L’interferon (IFN) α/β agit comme agent antiviral et limite le transfert et la réplication juste après l’infection. Les lymphocytes B et les anticorps de type IgM module la virémie sérique et prévient le passage au système nerveux central. De plus, le complément permet une réponse humorale et cellulaire efficace.

L’IFNγ contrôle la réplication virale à travers des mécanismes antiviraux directs et contribue à la génération d’une immunité adaptative. Les lymphocytes T (CD4+ et CD8+) participent à l’élimination du virus des organes periphériques. Quand le virus traverse la barrière hémato-encéphalique, les cytokines CXCL10 et CCL5 et leur récepteurs CXCR3 et CCR5 aident à recruter les lymphocytes T et les monocytes vers le SNC pour éliminer le virus des cellules infectées (Samuel & Diamond, 2006)

Figure 17. Immunité antivirale innée et aquise chez l’homme (Samuel & Diamond, 2006).

6. Objectifs de la thèse

L’émergence et la réémergence actuelles des maladies transmises par les arthropodes hématophages et notamment les arboviroses, représentent un risque majeur en santé animale et en santé publique (Gubler, 2002). L’expansion de ces maladies est en grande partie liée aux changements globaux dont l’intensification des échanges, l’instabilité politique, les changements climatiques, les changements de techniques agro-pastorales et l’urbanisation rendant ainsi les pays tempérés vulnérables aux maladies tropicales (Patz et al., 1996; Gratz, 1999).

La fièvre West Nile (FWN) et la fièvre de la vallée de Rift (FVR) sont des exemples d’arboviroses émergentes. Le virus West Nile (VWN) a longtemps été considéré comme peu pathogène (Rodhain & Perez 1985). Cependant, le VWN a regagné en activité dans le bassin méditerranéen à partir de 1994 et a suscité un grand intérêt dans les Amériques après son introduction aux USA en 1999 (Murgue et al., 2001a; Petersen & Hayes 2008). En parallèle, le virus de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR) traditionnellement endémique à l’Afrique sub-saharienne a émergé dans la péninsule arabique en 2000 (Ahmed, 2000). Ces deux arbovirus ont montré leur capacité à s’établir en dehors de leur aire de répartition en assurant un cycle de transmission entre des vecteurs et des hôtes vertébrés locaux. Dans la région du Maghreb, le VWN a été responsable d’épidémies en Algérie (1994) et en Tunisie (1997) et d’épizooties au Maroc (1996) (Le Guenno et al., 1996; Triki et al., 2001; El Harrak et al., 1997). Dès lors, des cas humains et équins ont été recensés au Maroc et en Tunisie en 2003, 2010 et 2011 (Garbouj et al., 2003; Schuffenecker et al., 2005; Ben Hassine et al., 2011; ECDC 2011). Par contre, le VFVR n’a jamais sévi jusqu’à présent dans le grand Maghreb.

Les deux arbovirus sont transmis par des moustiques appartenant au complexe Culex pipiens. Seule l’espèce Cx. pipiens pipiens existe dans la région du Maghreb. Cx. p. pipiens comprend deux formes morphologiquement identiques: la forme pipiens et la forme molestus ayant des caractères éco-biologiques et des préférences trophiques différentes pouvant influencer leurs rôles dans la transmission de certains agents pathogènes.

C’est dans ce contexte que s’inscrit ce travail de thèse sur l’étude du moustique Cx. pipiens, vecteur du VWN et VFVR dans la région du Maghreb. Ce travail a deux objectifs : i) évaluer la compétence vectorielle des populations de Cx. pipiens récoltées au Maroc, en Algérie et en Tunisie vis-à-vis des VWN et VFVR, ii) définir les formes de Cx.pipiens présentes dans la région du Maghreb en prenant le Maroc comme exemple.

Matériels et méthodes

1. Sites de récolte des moustiques

Durant l’été 2010, la récolte des larves de moustiques a été conduite dans trois régions différentes du Maroc: au Nord (Tanger), au Centre (Casablanca et Mohammedia) et au Sud (Marrakech). La même opération a été réalisée en Algérie et en Tunisie (Figure 18).

Figure 18. Sites de récolte de Cx. pipiens au Maroc, en Algérie et en Tunisie

Les récoltes des stades préimaginaux sont réalisées dans chaque gîte larvaire (Figure 19), selon la méthode de dipping. Cela consiste à se mettre sur le bord du gîte contre le soleil et réaliser cinq à dix prélèvements (selon les dimensions du gîte), sans répéter les prélèvements au niveau du même point. Le prélèvement est effectué en plongeant dans l’eau une louche en plastique et en la retirant d’un mouvement uniforme, tout en évitant les remous. Les larves récoltées sont transportées au laboratoire. Les larves de stade 4 sont triées et identifiées morphologiquement sous une loupe binoculaire en utilisant la clé d’identification à entrées multiples établie par Brunhes et al. (2000).

Figure 19. Exemples de gîte larvaire de Culex pipiens.

2. Elevage des moustiques

Une fois les larves de Cx. pipiens identifiées, elles sont réparties dans des bacs en plastique (25cm x 25cm; Figure 20a), à raison de 200 larves/bac, contenant 1 litre d’eau déchlorée et 2-3 croquettes pour chat. Par la suite, les nymphes sont récupérées et placées individuellement dans un tube de 50 mL (Falcon; Figure 20b) contenant de l’eau. On ferme le tube avec un morceau de tulle. Après émergence, l’adulte est libéré dans une cage (Figure 20c) puis récupéré à l’aide d’un aspirateur à bouche (Figure 20d) pour former des couples (Male/femelle). Chaque couple est placé dans une boite en plastique d’un volume de 1 litre (Figure 20e). La paroi interne de la boite est tapissée avec un papier buvard qui servira de support pour la femelle. Le couvercle de la boite est remplacé par une moustiquaire en tulle qui est tenue par un élastique. Deux morceaux de coton sont placés en continu sur la moustiquaire : le premier est imbibé de solution sucrée à 10% pour nourrir le couple et le deuxième est imbibé d’eau pour augmenter l’humidité au sein de la boite d’élevage. On met également à la disposition du couple un petit cristallisoir contenant de l’eau pour recevoir les pontes F1. Pour chaque population, 40 couples sont formés. Un premier lot de 20 couples ne reçoit pas de repas sanguin. Seuls les couples autogènes seront ainsi capables de produire une première ponte sans nécessiter un repas sanguin. Un second lot de 20 couples est destiné à recevoir un repas de sang. Pour ce faire, le sixième jour après

émergence, les femelles sont laissées à jeun pendant 24h. Au septième jour, les femelles sont transférées dans une grande cage (30x30x30 cm) et un coquelet est mis à la disposition des femelles. Une fois que les femelles sont gorgées, elles sont placées individuellement dans des boites d’élevage et les pontes anautogènes sont récupérées. Pour chaque population, les adultes F0 ont été congelés à -20°C pour l’analyse moléculaire. Les pontes F1 autogènes et anautogènes ont fait l’objet d’une évaluation de compétence vectorielle vis-à-vis de VWN et VFVR. Ces infections se font dans les conditions de sécurité qui relèvent de la manipulation d’un agent pathogène de classe 3. Pour ce faire, les pontes autogènes et anautogènes ont été envoyées à l’Institut Pasteur à Paris.

(a) (b) (c)

(d) (e) Figure 20. Matériel utilisé lors de l’élevage de Culex pipiens. Bac en plastique (a), tube pour nymphe (b), cage d’élevage pour adultes (c) aspirateur à bouche (d) et boite d’élevage pour couple (e).

3. Infections expérimentales avec les virus WN et FVR

3.1. Les populations de Culex pipiens

Les pontes F1 autogènes et anautogènes de chaque pays (Tableau VI) ont été mises à éclore dans de l’eau décolorée. Les larves ont été élevées jusqu’au stade nymphale. Les nymphes ont été récupérées et mises dans des cages en attendant l’émergence des adultes. Pour chaque population, deux types d’adultes sont obtenus: autogènes (AU) et anautogènes (AN). Une souche de Cx. pipiens ‘Tabarka’ récoltée en Tunisie et colonisée au laboratoire pendant plusieurs générations a été utilisée pour définir au préalable certains paramètres de la compétence vectorielle.

Tableau VI.Gîtes larvaires échantillonnés en 2010 en Algérie, au Maroc et en Tunisie

Autogène (AU) Type de Pays Ville Site Ou Echantillon gîte Anautogène (AN) AU A1_AU Timimoune Urbain Hypogé AN A1_AN AU A2_AU Chellal Urbain Hypogé AN A2_AN Algérie AU A3_AU Oued El Ksob Péri- urbain Epigé AN A3_AN AU A4_AU Bechelga Rural Epigé AN A4_AN

AU M1_AU Casablanca Urbain Hypogé AN M1_AN Maroc AU M2_AU Mohammedia Péri- urbain Hypogé AN M2_AN

AU T1_AU Tabarka Urbain Epigé AN T1_AN Tunisie AU T2_AU Nefza Rural Epigé AN T2_AN

3.2. Les souches virales

La souche avirulente Clone 13 du VFVR, a été isolée d’un cas humain bénin en République Centre Africaine en 1974 (Muller et al., 1995). Cette souche avirulente est défective pour le facteur de virulence, la protéine NSs. En effet, le gène est délété de 70% de sa phase ouverte de lecture. La souche du VWN a été isolée d’un cheval infecté en Camargue en 2000 (Murgue et al., 2001b). Les stocks viraux utilisés pour les infections orales des moustiques ont été produits après plusieurs passages (8 passages pour le VFVR et 4 passages pour le VWN) sur cellules Vero de rein de singe et un seul passage sur des cellules d’insectes C6/36 (Aedes albopictus). Les stocks viraux sont conservés à -80°C. Le titre viral des stocks viraux utilisé a été estimé en unité formant plage (UFP)/mL, par comptage des plages de lyse obtenues après infection de cellules Vero (Lignée cellulaire continue de rein de singe).

3.3. Le repas sanguin infectieux

Les femelles âgées de 7 jours sont mises à jeun 24 h avant l’infection. Le repas artificiel est constitué de deux tiers de globules rouges (lavés et remis en suspension dans du tampon PBS) et un tiers de suspension virale. Le titre viral du repas infectieux est de 107,8 UFP/mL pour le VWN et de 108,5UFP/mL pour le VFVR. Un phagostimulant, l’ATP, est rajouté dans le repas à une concentration de 5.10-3 M. Les femelles se gorgent à travers une membrane d’intestin de porc soutenant le sang infecté pendant 30 min. Ainsi, les femelles pleinement gorgées sont triées, placées dans des boites en carton et nourries avec un coton imbibé d’eau sucrée à 10 % (Figure 21).

Figure 21. Infections expérimentales des moustiques en laboratoire P3

3.4. La salivation forcée

Au terme de la période d’incubation qui a été définie à 14 jours pour le VWN, 14 et 21 jours pour le VFVR, les femelles sont immobilisées par le froid, les ailes et les pattes sont arrachées puis le proboscis est introduit dans un cône contenant 5 µL de sérum de veau fœtal (SVF; figure 22). Après 45 min, le contenu du cône est mis en suspension dans 45 µL du milieu Leibovitz L15 (Gibco, Invitrogen) à 10 % de SVF. Les salives et les femelles ayant salivé sont conservées à -80°C jusqu’à leur analyse. Le nombre de particules virales a été estimé en UFP/salive. Le taux de transmission (TT) représente le nombre de femelles ayant une salive infectée sur le nombre total de femelles testées.

Figure 22. Femelle en cours de récupération de sa salive en utilisant la technique de salivation forcée.

3.5. Le titrage des salives

Les cellules Vero sont cultivées, dans des plaque à 6 puits, en milieu de cultureDulbecco’s Minimum Eaggle medium Glutamax (Gibco, Invitrogen) supplémenté en SVF à 10% et en antibiotiques (pénicilline 1000 UI/mL et streptomycine 1 mg/mL). Le lendemain de la confluence des cellules, le tapis cellulaire est infecté avec des dilutions de 10 en 10 de la salive dans du milieu de culture. Un volume de 250 µL est utilisé comme inoculum et adsorbé pendant 1 h à 37°C. Par la suite, on rajoute du milieu de culture à 2% SVF, 1% antibiotique- antimycotique (Gibco, Invitrogen) et 1% d’agarose. Les cellules sont incubées à 37°C et dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant 4 (VWN) ou 5 jours (VFVR). Au terme de la période d’incubation, le milieu gélifié est éliminé et les cellules sont fixées et colorées avec une solution contenant du cristal violet (0,2%), de la formaldéhyde (10%) et de l’éthanol (20%). Les plaques sont lavées à l’eau puis séchées et les plages de lyses sont comptées. Le nombre de particules virales dans chaque salive est exprimé en UFP/salive.

3.6. L’immunofluorescence indirecte sur squashs de tête

La détection du virus se fait par immunofluorescence indirecte sur squash de tête des moustiques (Kuberski & Rosen, 1977). Pour ce faire, les femelles sont décapitées à l’aide d’un scalpel sur une lame de verre à la fin de la salivation. Une

47 dizaine de têtes sont ainsi placées sur la lame et écrasées à l’aide d’une seconde lame. Les lames sont séchées à l’air libre pendant 10 min puis fixées dans un bain d’acétone pur à -20°C pendant 20 min. Par la suite, les lames sont séchées et conservées à -80°C jusqu’à réalisation de la réaction d’immunofluorescence. L’anticorps primaire est une ascite de souris anti-virus diluée au PBS 1X (l’ascite anti-VFVR est diluée au 1/200 et l’ascite anti-VWN, au 1/100) qu’on dépose sur les squashs de tête. Les lames sont incubées 30 min à 37°C en chambre humide puis rincées 3 fois avec du PBS 1X et séchées. L’anticorps secondaire est une immunoglobuline anti-souris couplée à la fluorescéine (FITC) dilué au 1/100 et additionnée de bleu d’Evans. Le mélange est déposé sur les lames qui sont traitées de la même façon qu’auparavant. A la fin des rinçages, les préparations sont montées entre lame et lamelle avec du tampon phosphate glycériné à 10 % et à pH 8. La lecture des lames se fait sous microscope à épifluorescence. Les tissus infectés apparaissent en vert fluorescent et les tissus non infectés en rouge (Figure 23). Le taux d’infection disséminée (TID) représente le nombre de femelles ayant des squashs de tête positifs rapportés au nombre total de femelles testées. Les femelles présentant un squash de tête positif sont capables d’assurer la dissémination virale au-delà du tube digestif.

(a) (b) Figure 23. Tissus de tête de moustique analysé par immunofluorescence.Tissu infecté (a) et tissu non infecté (b)

4. Les analyses statistiques

Les taux d’infection disséminée et de transmission ont été comparés par le test exact de Fisher et les titres moyens des particules virales dans les salives ont été comparés en utilisant le test de Kruskall-Wallis et celui de Wilcoxon Rank-sum.

5. Taxonomie moléculaire de Culex pipiens au Maroc

5.1. Populations de Cx. pipiens

L’échantillonnage des larves (F0) a été conduit à Tanger, Casablanca, Mohammedia et Marrakech. Les gîtes larvaires sont hypogés ou épigés et classés en fonction de l’habitat: urbain (centre-ville), périurbain (à la périphérie de la ville) et rural (en retrait de toute agglomération humaine; Tableau VII). Les méthodes d’échantillonnage et d’élevage sont détaillées dans la partie 1.

Tableau VII. Gîtes larvaires échantillonnés dans différentes régions du Maroc durant l’été 2010

Ville Site Gîte Tanger Urbain Epigé Périurbain Epigé Rural Epigé

Casablanca/ Mohammedia Urbain Epigé Urbain Hypogé Périurbain Epigé

Marrakech Périurbain Epigé Rural Epigé Rural Hypogé

5.2. Extraction de l’ADN génomique

L’ADN des individus adultes de génération F0 est extrait par la technique DNAzol. Pour ce faire, chaque moustique est broyé au piston dans 250 µL de DNAzol puis le broyat est centrifugé 15 min à 15 000 rpm à +4°C. Après cette première étape où les protéines ont été précipitées, on transvase le surnageant dans un nouveau tube et on ajoute 125 µL d’éthanol 100 %. On agite doucement 1 à 2 min à température ambiante avant de centrifuger 15 min à 15 000 rpm à +4°C. On élimine délicatement le surnagent sans perdre le culot d’ADN qu’on lave avec 200 µL d’éthanol 70 %, puis on met les tubes à centrifuger pendant 15 min à 15 000 rpm à +4°C. Pour bien nettoyer le culot d’ADN, on réalise cette opération de lavage une deuxième fois. Pour finir, on sèche le culot jusqu’à évaporation complète de l’éthanol et on le reprend dans 30 µL d’eau pour préparation injectable (EPPI).

5.3. Réaction PCR

L’identification génétique des adultes appartenant au complexe Cx. pipiens repose sur l’amplification de la région flanquante du microsatellite CQ11 (Bahnck & Fonseca, 2006). Les amorces utilisées sont les suivantes: pipCQ11R 5‘-

CATGTTGAGCTTCGGTGAA-3’, molCQ11R 5‘-CCCTCCAGTAAGGTATCAAC-3’ et CQ11F2 5‘-GATCCTAGCAAGCGAGAAC-3’. Le mix est composé des deux amorces anti-sens à une concentration finale de 0,15 µM, l’amorce sens à 0,25 µM, du tampon (1X), des dNTP à 250 µM, du MgCl2 à 1,5 mM, de la BSA (Bovine serum slbumin) à 0,135µg/µL, d’une unité de Taq polymerase et de 5 µL de l’extrait d’ADN. Le programme d’amplification commence par 15 min à 94°C, 35 cycles de 94°C pendant 30s, 54°C pendant 30s et 72°C pendant 40s et pour finir, une phase d’élongation de 5 min à 72°C. Les produits de PCR sont séparés par électrophorèse sur un gel d’agarose à 2%.

Résultats et discussion

1. Compétence vectorielle de Culex pipiens vis-à-vis du virus West Nile et virus de la fièvre de la vallée du Rift

1.1. Résultats

1.1.1. Réceptivité au VWN

Des femelles de génération F6 de la souche Cx. pipiens ”Tabarka”, originaire de Tunisie, ont été exposées à un repas infectieux contenant du VWN à 107.8 UFP/mL. Des lots de 20 femelles ont été sacrifiés à 1, 2, 3, 6, 9, 14 et 21 jours après l’infection expérimentale. Les salives ont été récoltées en utilisant la technique de salivation forcée puis titrées sur cellules Vero. La figure 24A donne le taux de transmission (TT) et le nombre moyen de particules virales par salive exprimé en ème Log10 UFP/salive. Le VWN est détecté dans la salive dès le 3 jour après l’infection. A ce jour, le TT est de 5% et augmente légèrement jusqu’à J9 post- infection (pi). A J14 pi, 40% des salives testées sont infectées avec un nombre moyen de particules virales qui est de 1,9 ± 1,2 log10UFP. Chez les femelles sacrifiées une semaine après (J21 pi), le TT a doublé, il a atteint 80% tandis que le nombre de particules infectieuses a légèrement diminué (1,7 ± 0,9 log10UFP). Ainsi, le jour 14 pi a été choisi pour évaluer les taux de transmission et d’infection disséminée (TID) du VWN pour les populations naturelles de Cx. pipiens.

Des femelles de chaque population ont été exposées à un repas infectieux contenant du VWN à 107.8 UFP/mL. Quatorze jours après l’infection orale des femelles, toutes les populations testées développent une infection disséminée et présentent des salives infectées. Les TID varient de 59,1% à 100% (Figure 25A) et les TT de 25% à 83,3% (Figure 25B). Le nombre de particules infectieuses varient de

1,0 ± 0,6 log10PFU à 3,5 log10PFU (Figure 25C). Pour chaque site de récolte, on compare les TID et TT, de la population autogène (AU) et de la population anautogène (AN). Le statut des femelles (AU ou AN) n’influence pas le TID ni le TT à l’exception de deux cas pour lesquels une différence significative entre les femelles AU et AN a été observée; les TID des populations M1 (Maroc-Casablanca) (test exact de Fisher: p=0,02) et les TT des populations M2 (Maroc-Mohammedia) (test exact de Fisher: p=0,01). Egalement, le nombre moyen

53 de particules infectieuses par salive ne présente pas de différence significative (test de Kruskall-Wallis: p>0,05).

Figure 24. Taux de transmission et nombre moyen des particules virales présentes dans la salive de Cx pipiens ”Tabarka” infecté oralement par le VWN (A) et le VFVR (B)

1.1.2. Réceptivité au VFVR

Des femelles de la souche Cx. pipiens ”Tabarka” ont été exposées à un repas infectieux contenant du VFVR à 108,5 UFP/mL. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 24B. Le VFVR est détecté à partir de J3 après l’infection avec un TT de 10% et 1,3 ± 0,2 log10UFP/salive. Le TT reste stable jusqu’à J14 pi pour atteindre son maximum à J21 pi qui est de 40%. Parallèlement à cela, le nombre moyen de particules virales dans la salive est à son maximum à J6 avec 1,6 ± 0,4 log10 UFP et diminue progressivement de J9 à J21. Pour les populations récoltées sur le terrain, les taux d’infection disséminée (TID) et de transmission (TT) ont été estimés à J14 et à J21 pi.

Les populations ont été exposées à un repas infectieux contenant du VFVR à 108,5 UFP/mL. Quatorze jours après infection, 69,2% des populations testées (9/13) développent une infection disséminée avec des TID variant de 6,2% à 38,1% (Figure 26A). Parmi les 9 populations ayant des TID positifs, 77,8% (7/9) présentaient des salives infectieuses avec des TT allant de 10% à 47,1% (Figure 26B). Pour les populations A1-AU (Algérie-Timimoune autogène) et T1-AN (Tunisie-Tabarka anautogène), le virus a pu disséminer chez les femelles au-delà du tube digestif mais n’a pas pu infecter les glandes salivaires et se concentrer dans la salive. Les populations AU et AN, ne montrent pas de différence significative en ce qui concerne les TID et les TT (test exact de Fisher: p>0,05) à l’exception de la population T1 pour les TT (test exact de Fisher: p=0,004). Par ailleurs, la plupart des TT positifs sont observés chez les femelles AU (6 populations AU et une seule AN) avec un nombre de particules virales qui varie de 0,6 ± 0,5 log10UFP à 1,7 ± 0,7 log10UFP/salive (Figure 26C). En augmentant la période d’incubation extrinsèque de 14 à 21 jours, on note que 78,6% des populations testées (11/14) développent une infection disséminée dont les taux varient de 5% à 36% (Figure 26D). 91% (10/11) des populations présentaient des salives infectées. Les TT varient de 6,2% à 50% (Figure 26E). De plus, aucune différence significative entre les femelles AU et AN n’a été observée quand on compare les TID et les TT (test exact de Fisher: p>0,05). Sur la totalité des populations testées, 78,6% (11/14) présentaient des particules virales dans leurs salives dont le nombre varie de 0,3 log10UFP à 2,4 log10UFP/salive (Figure 26F).

L’augmentation de la période d’incubation extrinsèque (PIE) a fait augmenter la proportion des populations avec des TID et TT non nuls (de 69,2% à 78,6% pour les TID et de 53,8% à 78,6% pour les TT). De plus, le nombre de particules virales dans la salive augmente également en fonction de la PIE même si statistiquement cette différence n’est pas significative (test de Wilcoxon Rank-sum: p>0,05). Les femelles autogènes étaient plus capables d’assurer la dissémination et la transmission du VFVR à J14 et J21, avec des pourcentages respectifs de 61,5% et 57,1%.

Pour chaque population, les paramètres évalués à J14 (TID et TT) ont été comparés entre les infections avec le VWN et le VFVR. Pour les TID, toutes les populations présentaient des différences significatives entre les deux virus (test exact de Fisher: p<0,05). Concernant les TT, 4 populations des 13 testées présentaient des différences significatives (test exact de Fisher: p<0,05). Cependant, le nombre de particules virales présents dans la salive n’était pas significativement différent entre les deux virus (test de Wilcoxon Rank-sum: p>0,05).

1.2. Discussion

Le moustique Culex pipiens est omniprésent dans la région du Maghreb et est suspecté dans la transmission du VWN et VFVR. Ce travail a permis de démontrer que les populations de Cx. pipiens récoltés au Maroc, en Algérie et en Tunisie sont très réceptives au VWN et dans une moindre mesure au VFVR.

Après un repas infectieux, le virus ingéré doit franchir d’abord la barrière intestinale. Pour ce faire, le virus doit infecter les cellules du tube digestif et gagner l’hémocèle. Par la suite, le virus doit atteindre les glandes salivaires et se concentrer dans la salive, il s’agit de la barrière salivaire. La salive infectée est injectée lors de la prise de repas sanguin sur un hôte vertébré. L’ensemble des barrières peuvent s’opposer au passage du virus (barrières physiques et immunité) et leur efficacité détermine le degré de compétence vectorielle d’une espèce donnée. Pour les deux virus, VWN et VFVR, la période d’incubation extrinsèque est de 3 jours pour la colonie de Cx. pipiens ”Tabarka”, durée nécessaire à cette espèce pour devenir infectante après l’ingestion du virus.

Les populations de moustiques testées dans cette étude ont été collectées dans 8 sites différents de la région du Maghreb. Infectées oralement avec le VWN, toutes les populations étaient capables de développer une infection disséminée et de transmettre le virus. Ces résultats obtenus sont en accord avec le rôle important que joue Cx. pipiens dans le cycle de transmission du VWN. Les TID varient de 59% à 100% et les TT de 25% à 100%. Le nombre de particules virales dans la salive est variable et peut atteindre 12800 particules. Pour chaque couple virus-vecteur, la compétence vectorielle varie en fonction de la température, la durée d’incubation et la dose virale. Dans ce travail, le titre viral est de 107.8 UFP/mL et la température d’incubation est de 28°C. Ces deux facteurs affectent la dissémination virale (Anderson et al., 2010). En effet, la dose nécessaire pour infecter un vecteur doit dépasser le seuil minimum d’infectivité qui est de 105 UFP/mL pour Cx. pipiens (Turell et al., 2000). Quant aux températures élevées, elles amplifient la réplication virale (Reisen et al., 2006). Bien que Cx. pipiens présente une compétence vectorielle variable en fonction de la région géographique (Vaidyanathan &Scott, 2007; Reisen et al., 2008; Kilpatrick et

60 al., 2010), les populations de Cx. pipiens du Maghreb, se distinguent par une compétence comparable d’une région à l’autre.

Pour les infections avec le VFVR, on a utilisé la souche clone 13 qui est une souche avirulente avec une délétion de 70% du gène NSs qui joue un rôle important dans la pathogenèse du VFVR (Billecocq et al., 2004; Le May et al., 2004) ainsi que dans la réplication virale dans les moustiques. En effet, les moustiques infectés avec une souche virulente du VFVR montrent des taux d’infection disséminée plus important (Moutailler et al., 2010). Lors de cette étude, les moustiques infectés oralement avec le VFVR, ont été incubés à 28°C pendant 14 jours ou 21 jours. A J14 post-infection, 69,2% des populations testées ont développé une infection disséminée dont les taux ont pu atteindre 38,1%. Ces taux sont plus importants que ceux obtenus auparavant avec des populations de Cx. pipiens récoltées en Tunisie (Moutailler et al., 2008) et qui restent inférieurs à ceux des colonies de laboratoire (Faran et al., 1988). La plupart des populations (77,8%) sont capables de transmettre le virus avec un nombre maximal de particules virales de 620 particules par salive. La barrière intestinale semble être la plus importante barrière pour la dissémination du virus (Hardy et al., 1983). En effet, le virus est incapable de la franchir pour aller infecter les glandes salivaires d’où la compétence vectorielle modérée de Cx. pipiens vis à vis du VFVR (Turell et al., 1984). Quand on augmente la période d’incubation à 21 jours, 78,6% des populations de moustiques développent une infection disséminée dont 91% présentent des salives infectées. Ainsi, en incubant les moustiques infectés une semaine de plus, certaines populations finissent par transmettre le virus (Faran et al., 1987).

Pour chaque site de récolte, deux populations de femelles ont été testées, autogène (AU) et anautogène (AN). Les deux formes ne possèdent pas la même compétence vectorielle (Farajollahi et al., 2011). En effet, les résultats obtenus montrent que les femelles AU étaient plus capables d’assurer la dissémination et la transmission du VFVR, 14 jours après l’infection tandis que les femelles AN l’étaient à J21 pi. On peut suggérer que les épizooties sont initiées par des moustiques de genre Aedes et Ochlerotatus qui sont abondants en zones rurales (Rioux, 1958; Senevet & Andarelli, 1963; Krida et al., 2012). L’espèce Aedes vexans en Afrique de

61 l’Ouest est capable de transmettre le virus à ses descendants qui vont initier le cycle de transmission (Fontenille et al., 1995; Zeller et al., 1997; Fontenille et al., 1998; Traore-Laminaza et al., 2001). D’autres épizooties sont associées aux moustiques du genre Culex. En se basant sur nos résultats, on peut suggérer que les moustiques AN participent faiblement à la transmission du VFVR dans les zones rurales. Les moustiques AU peuvent jouer le rôle de vecteur-pont et transmettre le VFVR aux animaux et à l’homme. Ainsi, un cycle épizootique/épidémique peut être initié quand les moustiques AU deviennent abondants.

La région du Maghreb présente une frontière commune avec la Mauritanie où la FVR circule sous forme d’enzooties. En 2010, le virus a été rapporté dans une région extrêmement aride de la Mauritanie qui avoisine le Maroc et l’Algérie. Ceci, justifie la crainte d’une introduction du virus dans cette région (El Mamy et al., 2011). En effet, l’introduction du VFVR en Egypte 1977 et en Arabie saoudite 2000 était liée au trafic du bétail (Sall et al., 1998; Abd El-Rahim, 1999).

Article 1: Culex pipiens, an experimental efficient vector of West Nile and Rift valley fever viruses in the Maghreb region

2. Le statut taxonomique du complexe Culex pipiens au Maroc

2.1. Résultats

Afin d’identifier des gîtes larvaires de Cx.pipiens parmi ceux prospectés, des échantillons de larves ont été prélevés et identifiés morphologiquement. Les gîtes riches en matières organiques et souvent constitués d’eaux usées sont des gîtes caractéristiques de Cx. pipiens. Ce type de gîte est également colonisé par l’espèce Culiseta longiareolata. Dans certains gîtes, les deux espèces cohabitent. Dans la zone rurale de Marrakech, une autre espèce Cx. laticinctus est également présente (Tableau VIII). Les populations de larves de Cx. pipiens ont été récoltées dans 9 gîtes différents à travers trois régions du Maroc: Tanger, Casablanca/Mohammedia et Marrakech. Ensuite, ces larves ont été triées puis mis en élevage jusqu’au stade adulte. Au total, 214 adultes ont été caractérisés au niveau moléculaire. La figure 27 montre les profils caractéristiques de Cx. pipiens pipiens, Cx. pipiens molestus et leurs hybrides. La forme pipiens (200/200pb) représente 52,3% des adultes analysés, la forme molestus (250/250pb) représente 22% et la forme hybride (200/250pb) constitue 25,7%. Les résultats obtenus montrent, pour la première fois, la présence de Cx. pipiens sous la forme molestus au Maroc, ainsi que la présence des formes hybrides entre la forme pipiens et la forme molestus en Afrique du Nord. Indistinctement, les trois formes coexistent dans les gites hypogés et épigés, dans la zone urbaine périurbaine et rurale et à travers le Maroc (Tableau IX).

Tableau VIII. Espèces de larves identifiées dans des gites larvaires riches en matières organiques Ville Nombre de sites Espèces présentes prospectés Tanger Urbain 2 Cx. pipiens Suburbain 6 Cx. pipiens (4) Culiseta longiareolata (2) Rural 3 Cx. pipiens (2) Cs. longiareolata (1) Marrakech Urbain 0 - Suburbain 1 Cx pipiens et Cs. Longiareolata Rural 6 Cx. laticinctus (5) Cx. pipiens, Cs. longiareolata et Cx. laticinctus (1) Casablanca/ Urbain 2 Cx. pipiens Mohammedia Suburbain 2 Cx. pipiens

Figure 27. Profils des produits d’amplification du microsatellite CQ11 de Culex pipiens récolté à Casablanca (Maroc). M: marqueurs de poids moléculaire (100pb), 1: Culex. pipiens molestus du Japon, 2: Cx. pipiens forme molestus, 3: forme hybride, 4: Cx. pipiens forme pipiens.

Tableau IX. Identification moléculaire des populations de Cx. pipiens provenant de Tanger, Casablanca/Mohammedia et Marrakech Ville Site Gîte H (%) M (%) P (%) Mâle Femelle Total Tanger Urbain Epigé 21,7 8,7 69,6 13 10 23 Périurbain Epigé 13 34,8 52,2 11 12 23 Rural Epigé 29,2 8,3 62,5 12 12 24

Casablanca/ Urbain Epigé 51,8 17,2 31 15 14 29 Mohammedia Urbain Hypogé 15,6 59,4 25 17 15 32 Périurbain Epigé 28,6 17,8 53,6 14 14 28

Marrakech Périurbain Epigé 30,4 8,7 60,9 12 12 23 Rural Epigé 17,4 4,3 78,3 12 11 23 Rural Hypogé 11,1 33,3 55,6 5 4 9 (H: forme hybride; M: forme molestus; P: forme pipiens)

2.2. Discussion

Cette étude fournit une première évidence moléculaire de la présence de Culex pipiens sous la forme molestus, la forme pipiens et leurs hybrides au Maroc. La forme molestus a été décrite pour la première fois en Egypte. C’est une forme autogène, sténogame et qui colonise les sites hypogés dans les zones urbaines (Byrne & Nichols, 1999). Dans ce travail, les deux formes sont détectées dans les zones urbaines, sub-urbaine et rurales. De plus, elles cohabitent dans les sites épigés et hypogés comme cela a déjà été rapporté en gites épigés au Sud de l’Europe et aux USA (Chevillon et al., 1995; Fonseca et al.,2004; Gomes et al., 2009) ainsi qu’en gites hypogés au Nord de l’Europe (Reusken et al., 2010). Les formes hybrides ont été essentiellement rapportées aux USA (Fonseca et al., 2004; Huang et al., 2008) et au Sud de l’Europe (Gomes et al., 2009). Dans cette étude, les hybrides sont présents dans tous les gites échantillonnés. Ils ont une importance épidémiologique de part leurs préférences trophiques intermédiaires. En effet, ils piquent des hôtes aviaires et mammaliens, jouant ainsi le rôle de vecteurs ponts et

74 transmettant les pathogènes comme le VWN des oiseaux à l’homme (Spielman, 2001; Fonseca et al., 2004; Hamer et al., 2008).

Article 2: Molecular evidence of Culex pipiens form molestus and hybrids pipiens/molestus in Morocco, North Africa

Conclusions et perspectives

Ce travail a permis d’étudier le complexe Culex pipiens dans la région du Maghreb. Un premier volet avait pour objectif l’évaluation de la compétence vectorielle de Cx. pipiens vis-à-vis de deux arbovirus; le virus West Nile (VWN) et le virus de la fièvre de la vallée de Rift (VFVR). Le second volet a permis d’identifier les différentes formes de Cx. pipiens présentes dans le grand Maghreb.

Ce travail s’est inscrit dans le cadre d’un projet s’interessant à la région du Maghreb qui constitue une zone séparant l’Afrique subsaharienne et l’Europe et pouvant permettre la transition ou l’émergence de certains arbovirus dont le VWN et le VFVR. Au sein d’un groupe constitué d’équipes pluridisciplinaires du Maroc, de l’Algerie, de la Tunsisie et de la France et regroupant des entomologistes, des virologistes et des vétérinaires, nous avons montré que la transmission vectorielle est possible dans cette région surtout pour le moustique Cx. pipiens qui a été fortement suspecté dans la transmission du VWN et du VFVR (Faraj et al., 2006; Krida et al., 1997).

Le VWN a émergé d’une façon inattendue dans la région du Maghreb à partir de 1994 où il a été responsable de cas neurologiques sévères chez l’homme et le cheval. Par ailleurs, le VFVR ne s’est pas encore manifesté dans cette région. Cependant, des sérologies positives ont mis en évidence une circulation de cet arbovirus dans le Sud marocain chez des dromadaires (El Harrak et al., 2011).

Cx. pipiens est largement réparti dans la région du Maghreb. Ses larves ont été retrouvées dans une très grande variété de gîtes, hypogés ou épigés, urbains, peri- urbains ou ruraux. Dans ce travail, nous avons montré que Cx. pipiens dans la région du Maghreb est un bon vecteur expérimental du VWN et dans une moindre mesure pour le VFVR. Par conséquent, cette espèce pourrait jouer un rôle important dans la transmission de ces deux arbovirus sur l’ensemble de la région maghrébine.

Nos résultats montrent que les deux virus ne sont pas transmis avec la même efficacité. A chacune des étapes de sa progression dans l’insecte, depuis son ingestion jusqu’à sa sécrétion dans la salive, le virus doit faire face à différentes barrières. Elles peuvent concerner l’entrée du virus dans les tissus cibles grâce à la reconnaissance spécifique du virus par un récepteur membranaire, l’efficacité de

82 réplication virale régulée par les réponses antivirales du moustique, la sortie du virus des tissus où il s’est répliqué. L’efficacité de franchissement des différentes barrières se traduit par une différence de compétence vectorielle (Kramer & Ebel, 2003). En laboratoire, le VWN est plus efficacement transmis par Cx. pipiens que ne l’est le VFVR. Hormis la compétence vectorielle, d’autres facteurs en relation avec la biologie et l’écologie du moustique sont à prendre en compte dans l’évaluation des risques de transmission. En effet, la seule fois que le VWN a été détecté chez des moustiques, c’était en 1968 sur un pool de moustiques du genre Culex récoltés au sud de l’Algérie, bien avant l’émergence de cette fièvre dans la région du Maghreb (Pilo-Moron et al., 1968).

Nous avons montré que Cx. pipiens existe au Maroc sous la forme pipiens, la forme molestus et la forme hybride pipiens/molestus. Cette dernière forme a été mise en évidence pour la première fois en Afrique du Nord. La forme molestus est autogène (capable de produire une première ponte sans repas de sang) contrairement à la forme pipiens qui est anautogène. Nous avons donc évalué la compétence vectorielle vis-à-vis du VWN et VFVR en tenant compte du statut des femelles (autogènes ou anautogènes). Pour le VWN, aucune différence de compétence vectorielle n’a été observée entre les deux formes de l’espèce. Par contre, les femelles autogènes étaient plus efficaces à transmettrele VFVR. Les différentes formes de Cx. pipiens présentent des différences génétiques, ce qui peut leur conférer des compétences vectorielles différentes (Farajollahi et al., 2011). Ceci a été mis en évidence pour Cx. pipiens infecté par le VWN dans le nouveau monde. En effet, les moustiques de la forme pipiens et les hybrides sont plus sensibles à l’infection par le VWN (Kilpatrick et al., 2010; Farajollahi et al., 2011). Suite à ce travail, il serait intéressent d’identifier la forme de Cx. pipiens, la plus efficace pour transmettre l’un ou l’autre des deux virus en utilisant un typage moléculaire au lieu de se baser sur le caractère d’autogénie. En effet, l’autogénie est un trait génétique mais qui est modulé par l’environnement de la larve et essentiellemnt la photopériode, l’abondance de la nourriture et celle des larves en gîte (Eldridge, 1987).

Les préférences trophiques sont un caractère sous contrôle génétique (Bartholomay et al., 2010), qui diffère d’une espèce à l’autre et aussi, d’une forme à

83 l’autre d’une même espèce. En effet, la forme pipiens est décrite comme ornithophile, la forme molestus comme mammophile et leurs hybrides auraient des préférences trophiques mixtes piquant à la fois les oiseaux et les mammifères. L’étude des préférences trophiques serait un axe de recherche à développer pour mieux définir les contacts trophiques et ainsi, mieux définir le rôle vecteur de chaque forme de Cx. pipiens.

En théorie, les arbovirus peuvent être introduits par des vecteurs infectés ou un hôte vertébré en phase de virémie. Pour le VWN, les oiseaux migrateurs ont été, depuis longtemps, suspectés d’être à l’origine de l’introduction du VWN dans de nouvelles zones (Zeller & Murgue, 2001). Dans la région du Maghreb, des sérologies positives ont été mises en évidence chez des oiseaux et chez l’homme au Maroc suggérant une circulation enzootique du virus (Figuerola et al., 2009). Dans le cas du VFVR, l’introduction par importation de produits animaux ainsi que par voyageur contaminé est également probable. Cependant, seul l’introduction par le bétail est confirmée (Sall et al., 1998; Abd El-Rahim et al., 1999). Ceci peut être possible à partir de la Mauritanie, un pays endémique pour le VFVR, vers les pays du Maghreb.

Par conséquent, une surveillance des deux arbovirus doit être mise en place et de nombreux axes de recherche restent à être développés pour mieux définir la compétence des vecteurs, la réceptivité des animaux, les facteurs environnementaux conduisant à la survenue d’épizooties et les conditions de maintien du virus dans la nature (réservoirs).

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