Newcastle Disease Viren Als Rekombinante Vektorimpfstoffe Gegen Viruserkrankungen Von Vögeln Und Säugetieren

Newcastle Disease Viren als rekombinante Vektorimpfstoffe gegen Viruserkrankungen von Vögeln und Säugetieren

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Universität Greifswald

vorgelegt von

Magdalena Murr

Greifswald, 24.04.2020

Dekan: Prof. Dr. G. Kerth

1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter

2. Gutachter: Prof. Dr. Asisa Volz

Tag der Promotion: 22.09.2020

Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...... 1 1.1 Das Newcastle Disease Virus (NDV) ...... 1 1.1.1 Die taxonomische Einordnung und Pathotypen ...... 1 1.1.2 Die Virusmorphologie und Genomorganisation ...... 2 1.1.3 Der virale Replikationszyklus ...... 4 1.1.4 Die Virulenzdeterminanten des NDV ...... 4 1.2 Die Newcastle-Krankheit (ND) ...... 6 1.2.1 Die Historie und aktuelle Verbreitung der ND ...... 6 1.2.2 Das Wirtsspektrum und Krankheitsbild der ND ...... 6 1.2.3 Die Diagnose und Prävention der ND ...... 7 1.3 Die Generierung rekombinanter NDV und deren Anwendung als virale Vektorvakzinen ...... 9 1.3.1 NDV als viraler Vektor ...... 9 1.3.2 NDV im Einsatz als Vektorvakzine ...... 10 1.3.2.1 Die Wirkweise einer rekombinanten NDV-Vektorvakzine (im Geflügel) ...... 10 1.3.2.2 NDV als virale Vektorvakzine im Wirtschaftsgeflügel ...... 11 1.3.2.3 NDV als virale Vektorvakzine in Säugetier-Spezies ...... 14 1.4 Das hochpathogene aviäre Influenzavirus (HPAIV)...... 18 1.4.1 Die taxonomische Einordnung und Begriffsbestimmung ...... 18 1.4.2 Die Virusmorphologie und Genomorganisation ...... 18 1.4.3 Der virale Replikationszyklus ...... 19 1.4.4 Die Virulenzdeterminanten des AIV ...... 19 1.5 Die hochpathogene aviäre Influenza (HPAI) H5N1 ...... 20 1.5.1 Die Historie der Erkrankung und das aktuelles Tierseuchengeschehen ...... 20 1.5.2 Das Wirtsspektrum und Krankheitsbild der HPAI ...... 22 1.5.3 Die Diagnose bzw. der Nachweis der HPAI ...... 23 1.6 Impfungen des Geflügels gegen die HPAI ...... 23 1.6.1 Inaktivierte Vakzinen ...... 24 1.6.2 Rekombinante Vektor-basierte Vakzinen ...... 24 1.6.3 In der Entwicklung befindliche AIV-Vakzinen ...... 26 Inhaltsverzeichnis

1.7 Das Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer/ Das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (PPRV) ...... 28 1.7.1 Die Virustaxonomie und -struktur ...... 28 1.7.2 Der virale Replikationszyklus ...... 29 1.7.3 Die Virulenzdeterminanten des PPRV ...... 29 1.8 Die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) ...... 29 1.8.1 Historie der Erkrankung und aktuelles Tierseuchengeschehen ...... 29 1.8.2 Die Wirte und das Krankheitsbild der PPR...... 31 1.8.3 Die Diagnose der PPR ...... 32 1.9 Die Immunisierung gegen die PPR ...... 32 1.9.1 Attenuierte Lebendvakzinen...... 33 1.9.2 Inaktivierte Vakzinen ...... 33 1.9.3 Rekombinante Vektor-basierte Lebendvakzinen ...... 33 1.9.4 In der Entwicklung befindliche PPRV-Vakzinen ...... 34 2 Zielstellung der Arbeit ...... 35 3 Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse ...... 37 3.1 Coexpression of soluble and membrane bound AIV H5 by recombinant NDV leads to an increase in antigen levels ...... 37 3.2 Protection of chickens with maternal immunity against avian influenza virus (AIV) by vaccination with a novel recombinant Newcastle disease virus vector ...... 38 3.3 A novel recombinant Newcastle disease virus vectored DIVA vaccine against peste des petits ruminants in goats ...... 39 3.4 W protein expression by Newcastle disease virus ...... 40 4 Zusammenfassung der Arbeit ...... 42 5 Literaturverzeichnis...... 44 6 Publikationen ...... 75 6.1 Coexpression of soluble and membrane bound AIV H5 by recombinant NDV leads to an increase in antigen levels ...... 75 6.2 Protection of chickens with maternal immunity against avian influenza virus (AIV) by vaccination with a novel recombinant Newcastle disease virus vector ...... 87 6.3 A novel recombinant Newcastle disease virus vectored DIVA vaccine against peste des petits ruminants in goats ...... 123 Inhaltsverzeichnis

6.4 W protein expression by Newcastle disease virus ...... 149 7 Eigenanteil an den zur Dissertation eingereichten Publikationen ...... 160 8 Anhang ...... 162 Publikationen ...... 162 Tagungsbeiträge ...... 163 Eigenständigkeitserklärung ...... 165 Danksagung ...... 166

1 Einleitung

Die Entwicklung neuer Impfstoffe in der Veterinärmedizin erfolgt mit dem Ziel, Tierseuchen in ihrer Ausbreitung einzudämmen oder besser noch auszurotten. Dabei sollten Tiere vor Infektionen mit virulenten Wildtypviren geschützt und Virusreplikation und -transmission verhindert werden. Das Beispiel der Eradikation der Rinderpest 2011 zeigt, dass Impfstoffe das leisten können. Damit sie sich für den kommerziellen Einsatz eignen, sollten Impfstoffe sicher, kostengünstig und schnell herzustellen sein. Weltweit werden klassische Impfstoffe wie inaktivierte Vollvirusvakzinen oder attenuierte Lebendvakzinen für die Prävention und Kontrolle vieler Tierseuchen verwendet. Deren Einsatz ist jedoch nicht immer sicher bzw. effektiv genug. Aktuell wird daher an alternativen Impfstoffen, wie Peptidvakzinen, DNA-Vakzinen und rekombinanten Lebendvakzinen geforscht. Die rekombinanten Lebendvakzinen basieren auf viralen Vektoren, die das protektive Antigen eines anderen viralen Pathogens exprimieren. Sie induzieren eine systemische humorale - und zelluläre Immunantwort. Zusätzlich ist es möglich, immunisierte von Wildtypvirus-infizierten Tieren (DIVA, differentiation between vaccinated and infected animals) zu unterscheiden, ein wichtiges Werkzeug in der sero-epidemiologischen Überwachung einer Tierseuche. Das Newcastle Disease Virus (NDV), der Erreger der hochansteckenden atypischen Geflügelpest, ist für die Entwicklung rekombinanter Vektorvakzinen ein gut geeigneter Vektor und Gegenstand dieser Arbeit.

1.1 Das Newcastle Disease Virus (NDV) 1.1.1 Die Taxonomische Einordnung und Pathotypen NDV verursachen die Newcastle-Krankheit (Newcastle disease, ND), eine schwerwiegende und hochkontagiöse Infektion bei Vögeln. Sie wird auch als atypische Geflügelpest bezeichnet und führt besonders bei Wirtschafts- und Nutzgeflügel zu hohen ökonomischen Verlusten. In der EU ist die ND anzeigepflichtig. NDV wird innerhalb der Ordnung Mononegavirales, der Familie Paramyxoviridae dem Genus Orthoavulavirus zugeordnet. Dieser wurde 2018 ausgehend von der vorherigen Genusbezeichnung Avulavirus durch das internationale Komitee der Virustaxonomie (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) umbenannt. Die aviären Orthoavulaviren werden in 12 Serogruppen eingeteilt [1-4], wobei NDV der Serogruppe 1 (Avian Orthoavulavirus 1) zugeordnet wird [5].

1 Einleitung

Die verschiedenen NDV-Stämme werden aufgrund ihrer unterschiedlichen Virulenz für Hühner in fünf Pathotypen eingeteilt [1,6,7]. Velogene, virulente Stämme sind für akute, letale Infektionen des Geflügels verantwortlich. Je nachdem, ob neben dem Respirationstrakt primär auch der Darmtrakt oder das zentrale Nervensystem betroffen ist, werden viszerotrop- und neutrotrop-velogene Stämme unterschieden. Mesogene, moderat virulente Stämme verursachen ebenso Infektionen des Respirationstrakts und des zentralen Nervensystems, jedoch sind hauptsächlich jüngere Tiere betroffen und die Infektionen verlaufen milder und gehen mit niedrigeren Mortalitätsraten einher. Bei Infektionen mit lentogenen, nicht- virulenten Stämmen werden in der Regel keine oder nur milde respiratorische klinische Zeichen bei Hühnern beobachtet. Avirulent-enterische Stämme verursachen keine Klinik, sie replizieren primär im Darmtrakt der Hühner.

1.1.2 Die Virusmorphologie und Genomorganisation Das NDV-Partikel besitzt eine pleomorphe Gestalt von 200 bis 300 nm Durchmesser. Die Oberflächenglykoproteine, das Fusionsprotein (F) und das Hämagglutinin-Neuraminidase- Protein (HN), sind in der viralen Hüllmembran mittels einer Transmembrandomäne (TMD)

verankert. Das F-Protein besteht aus den Untereinheiten F1 (verfügt über eine TMD) und F2, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Unterhalb der Hüllmembran, die aus einer Phospholipid-Doppelschicht besteht, befindet sich das Matrixprotein (M), das die räumliche Verbindung der zytoplasmatischen Domänen der Oberflächenproteine zum helikalen Nukleokapsid im Inneren des Virions herstellt. Dort befindet sich die genomische RNA, die mit dem Nukleoprotein (NP), dem Phosphoprotein (P) und der RNA-abhängigen RNA- Polymerase, dem L-Protein (L) zum Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex assoziiert vorliegt [8] (Abbildung 1). Das NDV-Genom ist nicht segmentiert, einzelsträngig und weist eine negative Polarität auf. NDV-Stämme kommen natürlicherweise mit drei verschiedenen Genomlängen vor und werden in Klasse I- und II-Viren eingeteilt. Klasse I-Viren besitzen ein Genom von 15 198 Nukleotiden (nt), sind in der Regel avirulent und werden aus Wasser- und Watvögeln isoliert [9-11]. Die Klasse II-Viren besitzen eine Genomlänge von 15 186 nt (Isolate ab 1930) oder 15 192 nt (Isolate ab 1960), werden v. a. aus Hühnern isoliert und in zehn Genotypen unterteilt [11]. NDV der Genotypen I und II weisen eine niedrige Virulenz auf und werden z. B. als Lebendvakzinen gegen die ND im Geflügel eingesetzt. Die Genotypen V, VI, VII und VIII sind

2 Einleitung dagegen durch eine hohe Virulenz gekennzeichnet. Sie stellen die aktuell vorherrschenden Genotypen dar und zirkulieren weltweit [12]. Die Einführung von fünf weiteren Genotypen (XI bis XV) wird diskutiert [13].

Hämagglutinin-Neuraminidase-Protein

Fusionsprotein

Matrixprotein Nukleoprotein Phosphoprotein RNA-abhängige RNA-Polymerase Virale RNA

Abb. 1: Schematische Darstellung des Newcastle Disease Virus-Partikels.

Die Gesamtgenomlänge der NDV muss immer ein Vielfaches von sechs betragen. Die als „rule- of-six“ bekannte, spezifische Genomlänge wurde erstmals 1993 für das Sendai Virus beschrieben und ist für die effiziente Replikation verschiedener Paramyxoviren von Bedeutung [14]. Das NDV-Genom wird durch zwei regulatorische Sequenzen, die Leadersequenz (lea) (55 nt) am 3‘-Ende sowie die Trailersequenz (trail) (114 nt) am 5‘-Ende flankiert, die für die Replikation des Genoms essentiell sind. Die viralen Strukturproteine werden von den für die entsprechenden Proteine kodierenden Genen, die in der Reihenfolge: 3‘- NP, P, M, F, HN, L -5‘ angeordnet sind, kodiert. Jedes Gen stellt eine individuelle Transkriptionseinheit dar, die aus konservierten Genstart

(GS)- (3‘-UGCCCAUCU/CU-5‘) und Genend (GE) -Sequenzen (3‘-AAUU/CC/UU5-6-5‘), sowie unterschiedlich langen 3‘- und 5‘- nicht-translatierten Sequenzen (non-coding regions, ncr) bestehen und die die kodierende Sequenz (open reading frame, orf) flankieren. Intergene Regionen (igr) trennen die Gene voneinander und variieren in der Länge zwischen 1 und 47 nt. Dabei variiert die Länge der igr zwischen dem NP- und dem P-Gen zwischen 1 und 2 nt, während die übrigen igr in ihrer Länge konstant sind [15-19] (Abbildung 2).

3 Einleitung

lea 2 nt 1 nt 1 nt 31 nt 47 nt trail

3‘ NP P M F HN L 5‘

GS HN GE

ncr orf ncr

Abb. 2: Schematische Darstellung des NDV-Genoms. Leader- (lea) und Trailersequenz (trail) flankieren das Genom, intergene Regionen (igr), die zwischen 1 und 47 nt lang sind, trennen die einzelnen Gene voneinander. Diese bestehen aus Genstart (GS)- und Genend (GE)-Sequenzen, den nicht-translatierten Sequenzen (ncr) sowie der für das jeweilige Protein kodierenden Sequenz (orf).

1.1.3 Der virale Replikationszyklus Die Viruspartikel binden mittels des HN an Sialinsäure-haltige Moleküle auf der Oberfläche von z. B. Epithelzellen des Respirationstraktes [20]. Daraufhin erfolgt die pH-unabhängige

Fusion der viralen Hüllmembran mit der Plasmamembran, die durch das Fusionspeptid der F1- Untereinheit vermittelt wird [21-23]. Zu einem geringen Anteil können Viruspartikel auch durch Rezeptor-vermittelte oder Calveolae-abhängige Endozytose in die Zelle aufgenommen werden [24,25]. Im Zytoplasma werden zunächst die viralen Gene, beginnend am 3‘-Ende des Genoms, sequentiell, d.h. durch einen Start-Stopp-Mechanismus, der durch die GS- und GE- Sequenzen eines jeden Gens bestimmt wird, durch die virale Polymerase in positiv orientierte mRNA transkribiert. Anschließend erfolgt die Translation der mRNA an zellulären Ribosomen des Zytoplasmas (M, NP, L, P, V und W) und des rauen Endoplasmatischen Retikulums (rER) (HN und F). Nach Akkumulation der viralen Proteine wird ausgehend vom viralen Genom ein vollständiger, komplementärer, positiv orientierter Gegenstrang (Antigenom) synthetisiert. Dieser assoziiert mit NP, P und L zum RNP, der als Matrize für die Bildung neuer genomischer RNA dient [26,27]. Anschließend assemblieren die Viruspartikel an der Plasmamembran und werden durch Abknospung nach außen freigesetzt [28,29].

1.1.4 Die Virulenzdeterminanten des NDV

Für die Infektiösität eines NDV-Partikels ist die Aktivierung des F-Vorläuferproteins (F0) durch

enzymatische Spaltung in die Untereinheiten F1 und F2 wichtigste Voraussetzung [30-33]. Lentogene Stämme sind durch eine monobasische Aminosäuresequenz 112(G/E)-(K/R)-Q-

118 (G/E)-R↓L-I an der proteolytischen Spaltstelle des F0 charakterisiert. Diese wird von extrazellulär im Respirations- und Verdauungstrakt vorkommenden Trypsin-ähnlichen

4 Einleitung

Proteasen gespalten, wodurch sich die Infektion auf diese Organbereiche beschränkt. Die polybasische Aminosäuresequenz 112(R/K)-R-(Q/R)-(R/K)-R↓F-I118 meso- und velogener Stämme wird jedoch von ubiquitär vorkommenden, Furin-ähnlichen Proteasen gespalten, wodurch systemische Infektionen resultieren [31,34]. Die Bedeutung der F0- Spaltstellensequenz als Hauptdeterminante der Virulenz des NDV konnte durch Generierung entsprechender Virusrekombinanten bestätigt werden [35-42]. Das HN vermittelt die Bindung von NDV an zelluläre Rezeptoren und bestimmt so den Zelltropismus. Im Zuge der Rezeptorbindung induziert es eine Konformationsänderung im F und somit dessen Fusionsaktivität. Bei der Abknospung neu gebildeter Viruspartikel spaltet es mittels der Neuraminidase-Aktivität Sialinsäure, um das Aggregieren der Viruspartikel zu verhindern. Da es eine zentrale Rolle für die Replikation spielt, besitzt es auch einen Einfluss auf den Grad der Virulenz [41,43-51]. Die Proteine des RNP (NP, P und L) sind an der Replikation des viralen Genoms beteiligt. Ihr Einfluss auf die Replikationseffizienz und die Virulenz wurde gezeigt [52,53]. Das M-Protein hat eine zentrale Rolle in der Morphogenese neuer Viruspartikel und während des Knospungsprozesses. Einzelmutationen konnten einen Einfluss auf die virale Replikationseffizienz und Pathogenität belegen [54-56]. An einer uracilreichen Region im P-Gen, der Editierungssequenz, kann es während der Transkription des P-Gens zum Einbau eines oder zweier zusätzlicher Guanosin-Reste durch die virale Polymerase kommen [57]. Die daraus resultierende Verschiebung des Leserahmens ab der Editierungsstelle führt zu der Entstehung zweier weiterer mRNA-Spezies, die für die Nicht- Strukturproteine V und W kodieren [27,58,59]. Das V-Protein ist in der Lage, das angeborene Immunsystem der Wirtszelle zu schwächen, indem es die Expression von Interferonen (IFN) und proinflammatorischen Zytokinen durch die Wirtszelle limitiert und den Wirtszelltod durch Apoptose hemmt [60-67]. Das IFN-antagonistische Potential der V-Proteine von NDV unterschiedlicher Pathogenität ist dabei unterschiedlich stark ausgeprägt und stellt somit einen möglichen weiteren Virulenzfaktor dar [43,68]. Des Weiteren beeinflusst V die virale Replikationseffizienz in-vitro und in-vivo [69-71]. Während die Existenz der W-mRNA schon lange bekannt ist, konnte das Protein erst vor Kurzem nachgewiesen und näher charakterisiert werden [72]. Western Blot - und massenspektrometrische Analysen gereinigter Virionen des lentogenen NDV Clone 30 konnten die Inkorporation des Proteins in Viruspartikel zeigen. Eine Funktion im viralen Replikationszyklus konnte ihm noch nicht zugeordnet werden, jedoch wird

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vermutet, dass es ähnlich wie das Nipah Virus W-Protein immunmodulatorische Eigenschaften hat und somit indirekt die Virulenz beeinflusst [61,73,74].

1.2 Die Newcastle-Krankheit (ND) 1.2.1 Die Historie und die aktuelle Verbreitung der ND Die Erstbeschreibung eines ND-Ausbruchs in einer Geflügelfarm in der Nähe der englischen Stadt Newcastle-upon-Tyne stammt von 1927, wodurch die Krankheit ihren Namen erhielt [75]. Es existieren auch Berichte über das Auftreten einer Geflügelerkrankung in Mitteleuropa und Korea, die der ND ähnlich war und bereits vor 1926 auftrat, was darauf hindeutet, dass die ND bereits vor der Erstbeschreibung weit verbreitet war [76-78]. Sukzessive wurden ND- Ausbrüche im Zeitraum von 1928 bis 1933 aus verschiedenen Teilen der Welt, wie z. B. England, Korea, Japan, den Philippinen, Indien, Sri Lanka und Australien gemeldet. Auf den Philippinen wurden nicht nur Infektionen von Hühnern, sondern auch Enten, Puten, Tauben, Papageien und Wildvögeln nachgewiesen [79]. Während es in vielen Ländern Westeuropas, den Vereinigten Staaten von Amerika (USA), Kanada, Brasilien, Chile und Argentinien gelungen ist, das Auftreten der ND-Infektionen im domestizierten Geflügel stark zu minimieren, ist sie noch immer in weiten Teilen Zentral- und Südamerikas, Asiens, des mittleren Ostens und Afrikas endemisch [80,81].

1.2.2 Das Wirtsspektrum und Krankheitsbild der ND Über 200 Vogelarten gelten als Wirte für NDV, wobei Wasser- und Wildvögel Reservoire darstellen, aus denen die Viren neu in Geflügelpopulationen eingebracht werden können [78,82,83]. In den USA und Kanada stellen Kormorane das wichtigste Wildreservoir dar [84,85]. Die Infektion erfolgt respiratorisch durch die Inhalation virushaltiger Partikel oder fäkal-oral durch die Aufnahme kontaminierter Nahrung. Die Inkubationszeit beim Huhn beträgt 2-15 Tage, ist dabei aber auch abhängig vom Virusstamm, Alter und Immunstatus des Wirts. Infektionen mit velogenen Stämmen führen bei Küken schnell zum Tod, ohne dass typische Symptome sichtbar werden. Die Infektion erwachsener Hühnern kann asymptomatisch verlaufen, aber auch länger andauern und ist dann mit einer charakteristischen Symptomatik verbunden. Dazu gehören allgemeine Trägheit und Schwäche der Tiere, z.T. Paralyse der Beine und Flügel, Muskeltremor, erhöhte Atemfrequenz, Ödembildung an Augen und Kopf,

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Durchfall, Torticollis (Schiefhals), Opisthotonus (Krämpfe und Überstreckung der Rückenmuskulatur) und eine verminderte Legeleistung. Mildere Infektionen lento- oder mesogener Stämme betreffen v.a. den Respirationstrakt [8,86-88]. NDV besitzt geringes zoonotisches Potential, d. h. Infektionen des Menschen sind nur bei nahem Kontakt mit erkrankten Tieren möglich. Diese kennzeichnen sich meist durch Konjunktividen, die selbst limitierend sind. Ein Bericht über einen immunsupprimierten Patienten, aus dessen Lunge NDV nach einer tödlichen Pneumonie isoliert wurde, deutet jedoch darauf hin, dass auch schwere Krankheitsverläufe möglich sind. Über eine Übertragung des Virus von Mensch zu Mensch wurde jedoch noch nicht berichtet [1,89,90].

1.2.3 Die Diagnose und Prävention der ND Bei Verdacht auf ND wird entsprechendes Probenmaterial im embryonierten Hühnerei oder in der Zellkultur zur Virusanzucht vermehrt. Der Virusnachweis bzw. die -identifizierung kann klassischerweise durch den Hämagglutinationshemmtest (HAH) mit Hilfe spezifischer Antiseren erfolgen. Mittlerweile werden molekulare Methoden, wie die reverse Transkriptase-quantitative Echtzeit-PCR (reverse transcriptase quantitative real-time PCR, RT- qPCR) bevorzugt verwendet. Dabei werden nach erfolgter Virusanzucht und RNA-Extraktion spezifische Genabschnitte amplifiziert und durch eine Fluorochrom-gekoppelte Sonde quantifiziert [12,91,92]. Anschließend wird die Pathogenität des Virusisolats durch die Bestimmung des intrazerebralen Pathogenitätsindexes (ICPI) und/oder der mittleren Sterbezeit von Hühnerembryonen (mean death time, MDT) ermittelt. Zusätzlich kann die Sequenz der proteolytischen F-Spaltstelle durch RT-PCR und anschließende Sequenzierung bestimmt werden (Tabelle 1).

Tabelle 1: Einordnung der Pathogenität von NDV-Stämmen anhand des ICPI, der MDT und der proteolytischen Spaltstellensequenz des F-Proteins. Pathotyp ICPI MDT Aminosäuresequenz (112-118) der proteolytischen Spaltstelle des F-Proteins 112 118 Lentogen < 0,7 > 90 h monobasisch (G/E)-(K/R)-Q-(G/E)-R↓L-I 112 118 Mesogen 0,7-1,5 60-90 h polybasisch (R/K)-R-(Q/R)-(R/K)-R↓F-I 112 118 Velogen >1,5 < 60 h polybasisch (R/K)-R-(Q/R)-(R/K)-R↓F-I

Laut OIE-Richtlinien ist eine Infektion mit NDV anzeigepflichtig, wenn das Virusisolat einen ICPI > 0,7 aufweist bzw. sich mind. drei basische Aminosäuren (Arginin und Lysin) am C-Terminus

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der F2-Untereinheit des Fusionsproteins (zwischen den Aminosäuren 113-116) und ein

Phenylalanin am N-Terminus der F1-Untereinheit befinden. Kann die proteolytische F- Spaltstellensequenz nicht eindeutig dargestellt werden, muss die Bestimmung des ICPI erfolgen. Um NDV-spezifische Serumantikörper nachzuweisen, werden der HAH-Test sowie verschiedene kommerziell erhältliche ELISA verwendet [93]. Die Impfung gegen die ND ist die wichtigste Maßnahme, um die Infektion in Endemiegebieten einzudämmen, sowie ihren Ausbruch in ND-freien Regionen zu verhindern. Es sind sowohl attenuierte Lebend- und inaktivierte Virusvakzinen als auch rekombinante Vektorimpfstoffe kommerziell verfügbar [1,8]. Mesogene NDV-Stämme (z. B. Hertfordshire, Mukteshwar, Komarov, Roakin) sind i. d. R. nur wenig attenuiert und fallen laut EU-Richtlinie unter die Anzeigepflicht, da diese einen ICPI von > 0,7 aufweisen und eine entsprechende Klinik in Hühnern hervorrufen können. Daher werden sie nur in sehr wenigen Regionen und bei Hühnern ab einem Alter von vier Wochen als Lebendimpfvirus appliziert. Lentogene NDV- Stämme (z. B. LaSota, Clone 30, VG/GA, F, Hitchner B1) und apathogen-enterische (z. B. V4, Ulster 2C) besitzen einen niedrigen ICPI < 0,7 und können daher auch bei Eintagsküken als Lebendvakzine für die Primärimmunisierung eingesetzt werden [94-101]. In Mexiko und Südkorea kommen rekombinante Genotyp-angepasste chimäre Impfviren zum Einsatz. Hier sind die Oberflächenproteine F und HN der Vakzineviren LaSota oder Hitchner B1 (Genotyp II) durch die homologen Gene der lokal prävalenten Wildtypviren der Genotypen V oder VII ersetzt [102,103]. Inaktivierte Vakzinen werden v.a. bei Lege- und Bruthennen als Boosterimmunisierung eingesetzt [104]. Zugelassene Vektorvakzinen basieren auf Geflügelpockenviren (FPV) (Poxviridae) oder Herpesviren der Truthähne (HVT) (Herpesviridae), die die NDV-Oberflächenproteine exprimieren [105,106].

8 Einleitung

1.3 Die Generierung rekombinanter NDV und deren Anwendung als virale

Vektorvakzinen 1.3.1 NDV als viraler Vektor Mit der Etablierung eines reversen genetischen Systems für das NDV wurde es möglich, dessen Genom gezielt zu manipulieren [35,107,108]. Die Insertion eines Fremdgens als zusätzliche Transkriptionseinheit in das NDV-Genom unter Berücksichtigung der „rule-of-six“ bietet außerdem die Möglichkeit der Expression eines zusätzlichen, dem Vektorvirus fremden Proteins. Fremdgene sind durch die NDV-spezifischen GS- und GE-Sequenzen und zum Teil auch durch ncr eines NDV-Gens, die es umgeben, charakterisiert. Krishnamurthy et. al (2000) inserierten das für die Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) kodierende Gen zwischen das HN- und das L-Gen des rekombinanten NDV Beaudette C. Die Expression des Reporterproteins war stabil, das rekombinante Virus zeigte jedoch verminderte Replikationstiter und eine geringere Virulenz [108]. Die Insertion des CAT-Gens am 3‘-Ende des viralen Genoms führte zu einer Steigerung der Proteinexpression und des Replikationstiters [109]. Ebenso konnte für ein rekombinantes lentogenes NDV Clone 30, welches das Gen für das grüne Fluoreszenzprotein GFP zwischen dem F- und dem HN-Gen trägt, eine stabile Expression des inserierten Gens und eine unbeeinträchtigte Replikation und Virulenz gezeigt werden [110]. Der für andere Paramyxoviren beschriebene Transkriptionsgradient, d. h. abfallende Mengen an transkribierter mRNA entsprechend der Position auf dem Genom in Richtung von 3‘ nach 5‘, kann, zu mindestens bezüglich der Fremdgenexpression für NDV, nicht eindeutig bestätigt werden. Während einige Studien gezeigt haben, dass sich die Insertion eines zusätzlichen Gens proximal zum 3’-Ende des Genoms (3’ von NP, zwischen P- und M-Gen) günstig auf die Fremdgenexpression auswirkt [109,111-113], beschrieben andere, dass ein Transgen an unterschiedlichen Stellen des NDV-Genoms inseriert werden kann, ohne, dass Replikationseffizienz der Viren oder Genexpressionslevel signifikant beeinflusst werden [114,115]. Deutlich ist, dass die Insertion in die igr zwischen dem NP- und dem P-Gen zu hohen Expressionslevel führte, aber zu einer stark verminderten Replikationseffizienz, die wahrscheinlich durch ein unausgeglichenes Mengenverhältnis zwischen NP und P verursacht wurde [113,115,116]. Um das Genom nicht durch eine weitere Transkriptionseinheit zu erweitern und damit eventuell vorhandene Defizite in der Replikationseffizienz zu bewirken, wurde der orf eines Reportergens direkt hinter das Translationsstoppkodons eines viralen

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Gens mit einer vorangestellten Ribosomenbindestelle (IHRES, internal ribosomal entry site) inseriert [117]. Der direkte Vergleich zu anderen NDV-Rekombinanten fehlte jedoch. In NDV wurden bisher Fremdgene bis zu einer Länge von ca. 4 kb und mehrere zusätzliche Transkriptionseinheiten stabil eingebaut [118-121]. Um noch größere Gene einzubauen und multivalente Vakzinen herzustellen, können auch rekombinante NDV mit einem segmentierten Genom generiert werden [122].

1.3.2 NDV im Einsatz als Vektorvakzine Ziel der entwickelten NDV-Vektorviren ist die Anwendung als Vakzine zur Immunisierung des Geflügels, von Säugetieren und des Menschen. Der Vorteil des NDV als Vektor ist dabei, dass ein Transgen in einem sehr günstigen Verhältnis zu den Genen des NDV-Vektors exprimiert wird, da NDV im Vergleich zu anderen viralen Vektoren (z. B. Pocken-, Herpes- oder Adenoviren) ein relativ kleines Genom besitzt, welches für nur sechs Gene kodiert. Hohe Virustiter sind für die Herstellung eines Impfvirus entscheidend und wird durch die effektive Replikation von NDV im embryonierten Hühnerei möglich. NDV repliziert im Zytoplasma der infizierten Zelle und integriert sein Genom nicht in das der Wirtszelle.

1.3.2.1 Die Wirkweise einer rekombinanten NDV-Vektorvakzine (im Geflügel) Nach der Applikation eines rekombinanten NDV, das z. B. das Oberflächenprotein Hämagglutinin (HA) eines hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) exprimiert, in den oberen Respirationstrakt des Wirtes, werden Epithelzellen der respiratorischen Schleimhaut infiziert, in denen das Virus replizieren kann. Neu gebildete Viruspartikel werden durch antigenpräsentierende Zellen, wie die dendritischen Zellen und die Makrophagen, die sich in den Schleimhäuten befinden, phagozytiert. In den lymphatischen Organen präsentieren sie virale Vektor- und Fremdgen-spezifische Peptide im Kontext der MHC I- und II-Moleküle (major histocompatibility complex, Histokompatibilitätsmolekül) auf ihrer Oberfläche [123]. Diese werden von naiven T-Zellen erkannt, die sich in der Folge in T-Helferzellen und zytotoxische T-Zellen differenzieren. T-Helferzellen sind nun in der Lage, die Differenzierung der B-Zellen in Antikörper-sekretierende Plasmazellen zu bewirken [124-126]. Die Antikörper sind spezifisch gegen die Proteine des NDV, aber gegen das AIV HA gerichtet. Ist der immunisierte Wirt nun einer Infektion mit virulenten Wildtypviren (HPAIV) ausgesetzt, binden die AIV-HA-spezifischen Antikörper das HA auf der Oberfläche des HPAIV und neutralisieren

10 Einleitung dieses. Diese gebildeten Virus-Antikörper-Komplexe werden gezielt von phagozytierenden Zellen, wie Granulozyten und Makrophagen erkannt und beseitigt. Außerdem sind sie in der Lage das Komplementsystem zu aktivieren, welches die Lyse des Virus einleiten kann. Im Falle der Infektion einer wirtseigenen Zelle, erkennen die zytotoxischen T-Zellen die viralen Peptide, die im Zuge der viralen intrazellulären Replikation durch die MHC I-Moleküle auf der Oberfläche der infizierten Epithelzellen präsentiert werden und leiten deren Eliminierung durch die Induktion der Apoptose und der Sekretion zytotoxischer Granula ein [127-129].

a) c)

Abb. 3: Vereinfachte, schematische Darstellung der Wirkweise einer rekombinanten Newcastle Disease Virus (NDV)-Vektorvakzine, die das Hämagglutinin (HA) eines aviären Influenzavirus (AIV) exprimiert. a) Dendritische Zellen (DC) nehmen das Vakzineviruspartikel auf, prozessieren dieses und präsentieren Peptide des NDV (grün) sowie des AIV-HA (gelb) im Kontext der MHC I- und II-Moleküle den naiven T-Zellen, die sich in CD4+ T-Helferzellen (CD4) und CD8+ zytotoxische T-Zellen (CD8) differenzieren. b) Differenzierte T-Helferzellen können die Differenzierung der B-Zellen in Plasmazellen induzieren, die NDV- und AIV-HA-spezifische Antikörper bilden. c) AIV-HA-spezifische Antikörper binden und neutralisieren Viruspartikel im Zuge einer Wildtypvirus-Infektion und verhindern das binden der HPAIV an die Wirtsepithelzellen.

1.3.2.2 NDV als virale Vektorvakzine im Wirtschaftsgeflügel Die hochpathogene aviäre Influenza (HPAI), die infektiöse Bursitis (IBD), sowie die infektiöse Laryngotracheitis (ILT) und die infektiöse Bronchitis (IB) sind hochkontagiöse, virale Infektionen des Wirtschaftsgeflügels. Für alle Erkrankungen ist bekannt, dass Lebendvakzinen während der in-vivo-Passage im Tier antigene Varianten bilden und sich zu Viren höherer

11 Einleitung

Virulenz verändern können. Lebendvakzinen gegen die IBD verursachen zusätzlich Atrophien der Bursa, für ILT-Vakzinen ist die Entstehung latenter Infektionen bekannt. Bei der Immunisierung gegen die HPAI kann es zum Reassortment mit zirkulierenden AIV und der Entstehung von HPAIV kommen. Exprimiert NDV zusätzlich das protektive Oberflächenantigen eines dieser aviären Pathogene, kann es als bivalentes Vakzinevirus und sichere Alternative dienen (Tabelle 2). Da NDV im oberen Respirationstrakt des Geflügels repliziert, induziert es neben der systemischen auch eine lokale mukosale Immunantwort und ist daher für die Massenapplikation über ein Spray oder Trinkwasser wirksam, die auch bereits bei Eintagsküken im Brutbetrieb erfolgen kann. Dies stellt einen großen Vorteil gegenüber inaktivierten Vakzinen dar. Da diese nicht mehr replikationsfähig sind, müssen sie individuell und parenteral appliziert werden, um eine systemische Immunantwort auszulösen, was jedoch den Kosten- und Zeitaufwand erhöht. Mittlerweile existieren sehr viele experimentelle Studien, die den Schutz von Hühnern gegen Infektionen mit HPAIV (Orthomyxoviridae) (s. a. 1.6.2), Viren der infektiösen Bursitis (IBDV) (Birnaviridae), Viren der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV) (Herpesviridae) und Viren der infektiösen Bronchitis (IBV) (Coronaviridae) untersuchen und teilweise sehr gute Protektionsraten erzielen (Tabelle 2). Weitere Anwendungen einer NDV-Vektorvakzine gegen Infektionen mit dem aviären Metapneumovirus (Pneumoviridae) bei Puten, dem Tembusu virus (Flaviviridae) bei Enten, Parvo- (Parvoviridae) und Astroviren (Astroviridae) bei Gänsen sind beschrieben [130-133].

12 Einleitung

Referenz [111] [134] [135] [136] [137] [138] [139] [140] [141] [142] [143]

NDV (100 %), IBV (60 %) (60 IBV %), (100 NDV Belastungsinfektion und Schutz und Belastungsinfektion %) (90 %),IBDV (90 NDV %) (100 IBDV %), (100 NDV %) (83 IBDV %), (100 NDV %) (100 %),IBDV (80 NDV %) (100 ILTV %), (100 NDV %) 90 (> ILTV %), (100 NDV %) ILTV(100 %) (100 NDV %) (100 IBV %) (93 IBV %) (100 IBV %), (100 NDV %) (100 NDV %) (100 IBV %) (90 IBV %), (100 NDV

Vektorvakzinen für die Prävention der infektiösen infektiösen der Prävention die für Vektorvakzinen

Virusder infektiösenBronchitis

dosis, dosis,

3 3

Antikörper

, 1x , d) (1

8d)

, o.n. ,

undILTV

, 1x (1 1x ,

/ILTV

, 1x (14 d) (14 1x , , 2x (14 + 28 d) 28 + (14 2x , (11x , d) (11x , d) 18d*) + (42x , d) 28 + (14 2x , d) 28 oder (11x , (11x , d) 14d) + (12x , (11x , d)

, 2x (1 + 14d) + (12x , b b b b b b b b b b

ovo

o.n. Immunisierungsroute, Immunisierungsroute, (Tage) Küken Alter der und (2d) 1x okular, 23d) + (2 2x okular, in n. i. o.n. o.n. NDV o.n. o.n. o.n. o.n. o.n. o.n. o.n.

Vakzine

maternaleNDV

irus

V IBDV IBDV IBDV ILTV ILTV IL IBV IBV I IBV IBV

Virusder infektiösenLaryngotracheitis;

2 2

Fremdgen VP2 VP2 VP2 gD gB gD, gD S2 S1 S S S1 Epitope des

okulonasal

Cl30

Stamm

oostimmunisierungdurch IBV inaktivierte

NDV LaSota LaSota F LaSota LaSota LaSota LaSota LaSota LaSota LaSota LaSota

Virusder infektiösenBursitis;

intranasal;

Bursitis, der infektiösen Laryngotracheitis und der infektiösen Bronchitis bei Hühnern. bei Bronchitis infektiösen der und Laryngotracheitis infektiösen der Bursitis, Tabelle 2: Übersicht über einige der Anwendungen rekombinanter NDV rekombinanter Anwendungen der einige über Übersicht 2: Tabelle

* 1 1 a

13 Einleitung

1.3.2.3 NDV als virale Vektorvakzine in Säugetier-Spezies Schon früh wurde beschrieben, dass auch Säugetierspezies, wie z. B. Mäuse, Hamster, Kaninchen, Schafe und Schweine für experimentelle Infektionen mit NDV empfänglich sind [144-146]. Jedoch erst die Immunisierung von Mäusen mit einem rekombinanten NDV, welches das HA des Influenzavirus H1N1 exprimierte, zeigte das Potential des NDV als viralen Vektor für Säugetiere und für eine mögliche Anwendung auch beim Menschen. Die vakzinierten Mäuse induzierten eine NDV- und HA-spezifische Immunantwort, die sie vor einer letalen Belastungsinfektion mit H1N1 schützen [147]. Als Modellorganismen für eine mögliche Anwendung in der Humanmedizin wurden außerdem Grüne Meerkatzen, Rhesusaffen und Meerschweinchen genutzt, um rekombinante NDV als Vektorvakzine gegen verschiedene humane Infektionen, wie z.B. Ebola, AIDS oder HPAI zu untersuchen (Tabelle 3). Für die Anwendung als Vektorvakzinevirus in wirtschaftlich genutzten Säugetieren wurde NDV ebenfalls evaluiert. Subbiah et al. infizierten Kälber mit lentogenem NDV LaSota über eine kombinierte intranasale-intratracheale (i. n./i. t.) Route. Die Tiere induzierten NDV-spezifische Antikörper, die im HAH und im Virusneutralizationstest (VNT) nachgewiesen werden konnten [148]. Spätere Studien anderer Gruppen belegten die Sicherheit und Immunogenität des lentogenen NDV LaSota nachdem es Rindern, Schweinen, Schafen bzw. Pferden appliziert wurde (Tabelle 3). In den genannten Studien, bei denen es sich hauptsächlich um Immunisierungsstudien handelte, konnte gezeigt werden, dass NDV in der Lage ist, eine robuste systemische und mukosale Immunantwort gegen diese unterschiedlichen transgen exprimierten Proteine zu induzieren. Im Gegensatz zum Geflügel zeigen auch mesogene NDV-Stämme im Säugetier einen attenuierten Phänotyp. In einigen Studien wurde berichtet, dass mesogene Stämme eine höhere Genexpression und bessere Protektion aufweisen, andere konnten dies jedoch nicht bestätigen. Die Untersuchung der Lunge eines Affen, der mit einem rekombinanten NDV auf Basis des mesogenen NDV Beaudette C immunisiert wurde, zeigte ein stark lokal begrenztes Replikationsverhalten auf und deutet auf die geringe Ausbreitung des mesogenen NDV hin [149]. In Kälbern, die mit rekombinantem NDV LaSota i. n./i. t. immunisiert wurden, konnte keine hämatogene Streuung oder nasale Ausscheidung des Impfvirus detektiert werden [150,151]. Dies deutet darauf hin, dass sowohl lento- als auch mesogene NDV-Stämme hinsichtlich ihrer Ausbreitung und Replikation in Primaten und Säugetieren attenuiert sind.

14 Einleitung

Jedoch besteht bei einer Anwendung mesogener NDV die Gefahr, dass das Virus in die Umwelt und in eine Vogelpopulation gelangen könnte. Während beim Geflügel die okulonasale (o. n.) Applikation bevorzugt wird, konnte bei Kälbern gezeigt werde, dass eine alleinige i. n. Immunisierung nicht ausreicht, um eine Immunantwort zu induzieren [151]. Dasselbe wurde bei Primaten beobachtet. Die zusätzliche Virusapplikation in den unteren Respirationstrakt war erforderlich [152]. Der Temperaturunterschied zwischen oberem und unterem Respirationstrakt sowie zwischen den Spezies könnte ursächlich sein. NDV ist als aviäres Virus an Vögeln angepasst, die mit 42 °C eine deutlich höhere Körpertemperatur als Säugetiere (37 °C) aufweisen. Bei Säugetieren ist der obere Respirationstrakt zusätzlich noch kühler als der untere und könnte eine geringere Infektionseffizienz der Epithelzellen verursachen. Bei kleineren Säugetieren, wie Meerschweinchen und Mäusen, hat es keinen Einfluss und eine alleinige i. n. Immunisierung ist ausreichend, um die Bildung von Antikörpern zu induzieren [119,153-155]. Die intramuskuläre (i. m.) Immunisierung von Großsäugetieren induzierte eine robuste Immunantwort während die i. n./i. t. Applikation dagegen kontrovers diskutiert wird. Bei Kälbern wurden bereits nach einmaliger Applikation Antikörper detektiert [148], bei Schafen dagegen war die parenterale Inokulation wirksamer [156]. Langzeitstudien in Schweinen und Schafen zeigen, dass Fremdgen-exprimierende NDV- Rekombinanten eine humorale Immunantwort über mehrere Wochen aufrechterhalten können, die dann auch noch protektiv ist [157,158].

15 Einleitung

[149] Referenz [147] [155] [159] [160] [161] [162] [163] [153,164] [154,165] [118,166] [167]

CoV

- Belastungsinfektion H1N1 RSV H5N1 HPAIV - SARS H5N1 HPAIV - - - - -

Mäuse, Meer Mäuse, Tiermodell Mäuse Rhesusaffen, Grünmeerkatzen Mäuse Mäuse Grünmeerkatzen Grünmeerkatzen Grünmeerkatzen Rhesusaffen Meerschweinchen Mäuse schweinchen Meerschweinchen

Vektorvakzinen für die Prävention verschiedener viraler viraler verschiedener Prävention die für Vektorvakzinen

er er NDV

D D

CoV

A D

3 F

G G

1 1

- -

HPIV Virus H1N1 RSV HPAIV H5N1 HPAIV H5N1 SARS HPAIV H5N1 EBOV HIV Norovirus HIV SIV

HN p55(gag), Fremdgen HA F HA HA S NA HA, GP gp140 gp120, gp160, + VP2 VP1 gp140 gp120, gp160, gp160

1 1

BC BC

CS CS CS/HN

- - -

(2x)

(1x)

F/HN

)

dosis

mut

(2x) (2x) (2x) (2x) Aerosol als oder (2x APMV2/8

d d d d d

Stamm, Immunisierungs Stamm,

(2x)

(1x) m. i. oder (2x) (2x)

oder i. p. oder i.

(3x)

/i. t. /i. t. /i. t. /i. t. /i. t. /i.

c c b c c c c c c c c

v. n. n. p. n. n. n. n. n. n. n. n.

LaSota NDV und route B1 Hitchner i. C LaSota/Beaudette i. B1 Hitchner i. LaSota i. C Beaudette i. C/LaSota Beaudette i. C Beaudette i. C/LaSota Beaudette i. LaSota i. C LaSota/Beaudette i. i. LaSota LaSota AKO C Beaudette i.

Tabelle 3: Übersicht über einige der Anwendungen rekombinant Anwendungen der einige über Übersicht 3: Tabelle Säugetiere. der und Menschen des Erkrankungen

16 Einleitung

E E

[119] [168] [148] [150] [151,169] [156] [158] [157] [170] [171] [172] [173]

r r HN LaSota;v.

Virus des Virus bovinen

) ode ) P

mut

Virus;

- - - BHV - - RABV - CDV - VSV -

bovinesHerpesvirus Typ 1;

thogenes aviäres thogenes Influenzavirus;

Virus;

vesikuläresStomatitis

hochpa

D D

Katzen

rschweinchen

Virus;

flächenproteine F undHN aviären des Orthoavulavirus

Meerschweinchen Mee Kälber Kälber Schafe Kälber, Schafe Hunde, Schweine Nerze Pferde Mäuse Kälber

Nil

West

SimianesImmundefizienz

Poliovirus EBOV - BHV RVFV - RABV NiV CDV WNV VSV BEFV

CS, Oberflächenproteine CS, bzw. F Sequenzabschnitte (F

intramuskulär

; ;

;

Ektodomänender Ober

respiratorischesSynzytialvirus;

Virus Virus Typ 1;

canineStaupevirus;

Beaudette C

intratracheal

pro

d d

Virus;

3CD P1 GP - gD + Gc Gn - G G F, H F, PrM/E G G

g g

Nipah

intranasa

c c

/i. d. /i.

; ;

nsequenz (CS)v.

HumanesImmundefizienz

Rabiesvirus;

oder s. c. s. oder

(2x) (1x)

Spaltstelle

humanesParainfluenzavirus Typ 3;

e e

(1x)

- e e

B B

APMV3

Ebolavirus;

intraperitoneal

F F

Virus;

(1x)

;

, i. m. i. ,

d d d

(2x) (2x) (2x) (2x) (2x)

(2x) (2x) (2x) t. i. oder m. i. oder m. i. oder

e e e e e

t. /i. t. /i.

c c c c c c c

n. n. n. n. n. n. m. m. n.

i. LaSota C Beaudette i. LaSota i. LaSota i. LaSota i. LaSota i. (2x) LaSota i. LaSota m. i. LaSota i. LaSota m. i. LaSota i. LaSota m. i.

Influenzavirus;

intravenös proteolytischeF

CS der CS aviärenOrthoavulaviren Serogruppe 2 oder 8; Serogruppe3 Coronavirus; Rifttalfieber Ephemeralfiebers a a 1 A

17 Einleitung

1.4 Das hochpathogene aviäre Influenzavirus (HPAIV) 1.4.1 Taxonomische Einordnung und Begriffsbestimmung Aviäre Influenza Viren (AIV) gehören der Spezies Influenza A Virus an und werden der 2018 neu gebildeten Ordnung Articulavirales, der Familie Orthomyxoviridae und dem Genus Alphainfluenzavirus, vormals Influenzavirus A, dessen einziger Vertreter sie sind, zugeordnet (Quelle: https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_9th_report/negative-sense-rna-viruses- 2011/w/negrna_viruses/209/orthomyxoviridae; aufgerufen: 22.03.2020). Es sind umhüllte Viren mit einem einzelsträngigen, negativ orientierten RNA-Genom, welches aus acht Segmenten besteht. Entsprechend ihrer Oberflächenproteine, dem Hämagglutinin (HA) und der Neuraminidase (NA) werden sie in unterschiedliche Subtypen eingeteilt. Zurzeit sind 16 HA und 9 NA AIV-Subtypen bekannt [174-176]. Genomische RNA zweier neuartiger Influenza A Virussubtypen, die als H17N10 und H18N11 bezeichnet werden, wurde aus Fledermäusen in Guatemala bzw. Peru isoliert [177,178]. Während sich einige Viren der Subtypen H1, H2 oder H3 an den Menschen oder das Schwein angepasst haben, können Viren der Subtypen H5 und H7 von einer in Vögeln niedrig pathogenen Form (LPAIV) zu hochpathogenen Viren (HPAIV) mutieren, die sich klinisch als systemische und schwerwiegende Infektion des Geflügels, der hochpathogenen aviären Influenza (HPAI), auch als klassische Geflügelpest bezeichnet, zeigt.

1.4.2 Die Virusmorphologie und Genomorganisation Die AI-Virionen sind sphärisch bis pleomorph (120 nm), können aber auch eine filamentöse Gestalt mit mehreren hundert nm Länge aufweisen. In der Hüllmembran sind die Oberflächenproteine HA, NA und das Matrixprotein 2 (M2) verankert. Das AIV-HA liegt in den

Untereinheiten HA1 und HA2 im Viruspartikel vor. Das HA2 besitzt die TMD und ist über

Disulfidbrückenbindungen mit HA1 verbunden. Das Matrixprotein 1 (M1) befindet sich unter der Hüllmembran und interagiert sowohl mit den zytoplasmatischen Domänen der Oberflächenproteine als auch mit dem viralen RNP im Inneren des helikalen Nukleokapsids. Jedes der genomischen RNA-Segmente ist mit Nukleoproteinen (NP) und mit je einem Molekül des trimeren Polymerasekomplexes, bestehend aus den drei Untereinheiten PB1 (basisches Polymeraseprotein 1), PB2 (basisches Polymeraseprotein 2) und PA (saures Polymeraseprotein) zum RNP assoziiert [179,180]. In jedem Genomsegment wird die kodierende Sequenz durch 3‘- und 5‘-ncr sowie durch spezifische Verpackungssequenzen, die

18 Einleitung eine effiziente Verpackung der Genomsegmente in neue Viruspartikel regulieren, flankiert. Des Weiteren kodiert das Genom für die Nicht-Strukturproteine 1 und 2 (NS1 und NS2) [181].

1.4.3 Der virale Replikationszyklus Die Influenzaviren binden mittels des HA an Sialinsäure-haltige Rezeptoren auf der Oberfläche empfänglicher Zellen. AIV bevorzugen dabei Moleküle, in denen die Sialinsäure in einer α2,3- glykosidischen Bindung mit der benachbarten Galaktose verbunden ist [182]. Anschließend werden Viruspartikel über Rezeptor-vermittelte Endozytose in die Zelle aufgenommen [183]. Durch einen pH-abhängigen Aktivierungsmechanismus des HA vermittelt dieses die Fusion der viralen Hüllmembran mit der Endosomenmembran [184]. Die viralen RNP werden ins Zytoplasma freigesetzt und zum Nukleus transportiert, in dem Transkription und Replikation durch den RNA-abhängigen RNA-Polymerasekomplex stattfinden [185-188]. Die synthetisierten viralen mRNA werden ins Zytoplasma transportiert [189]. Dort findet die Translation der viralen Proteine an zytosolischen Ribosomen (PB1, PB2, PA, NP, NS1, NS2 und M1) oder an Ribosomen des rER (HA, NA und M2) statt. Kernlokalisierungssequenzen der neu synthetisierten Proteine NP, PB1, PB2 und PA vermitteln deren Transport in den Zellkern, wo sie bei der Synthese neuer mRNA sowie bei der Replikation des Genoms beteiligt sind [190]. Zunächst werden komplementäre positivsträngige RNA-Segmente gebildet, die mit NP und dem Polymerasekomplex zu RNP assemblieren und anschließend die Matrize für die Synthese neuer genomischer RNA bzw. RNP sind. M1, NS2 bzw. PB2 vermitteln den nukleären Export der RNP in das Zytoplasma und anschließend zur Zytoplasmamembran [191,192]. Die Transmembranproteine HA, NA und M2 werden vesikulär durch das rER und das Golgi Netzwerk, in dem die proteolytische Spaltung des HA der HPAIV stattfindet, zur Zellmembran transportiert. Dort kommt es zum Zusammenbau neuer Viruspartikel, die dann durch Abknospung nach außen freigesetzt werden [181,193,194].

1.4.4 Die Virulenzdeterminanten des AIV Die wichtigste Virulenzdeterminante der AIV stellt das HA bzw. die Aminosäuresequenz an der proteolytischen Spaltstelle dar. Die Spaltung in die zwei Untereinheiten, HA1 und HA2, ist Voraussetzung für die Fusionsaktivität des HA. LPAIV sind durch eine monobasische Aminosäuresequenz (z. B. RETR↓G) charakterisiert, die durch Trypsin-ähnliche Proteasen, die sich v.a. im Respirations- und Verdauungstrakt der Vögel befinden, gespalten werden. Daher

19 Einleitung

beschränken sich LPAIV-Infektionen auf diese Organbereiche. HPAIV besitzen dagegen eine Spaltstellensequenz mit mehreren basischen Aminosäuren (z. B. RRRKKR↓G), die durch ubiquitär vorkommende Furin-ähnliche Proteasen gespalten wird und daher eine systemische Replikation erfolgen kann [195,196]. Die experimentelle Insertion mehrerer basischer Aminosäuren im Bereich der HA-Spaltstellensequenz von LPAIV, die nicht den Subtypen H5 oder H7 angehören, führt zum starken Anstieg der Virulenz der rekombinanten AIV und belegen die Bedeutung der HA-Spaltstellensequenz [197-199]. Das Maß der Virulenz der HPAIV wird jedoch auch durch andere Gensegmente beeinflusst [200-203]. Für die NA konnte mehrfach gezeigt werden, dass eine Deletion im Stielbereich des Proteins ein wichtiger Schritt für die Anpassung der AIV aus Wasservögeln an andere Geflügelspezies darstellt [204-206]. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass AIV, die in Säugetieren replizieren, Einzelmutationen im PB2 besitzen [207-211]. Für das NS1 wurde beschrieben, dass es IFN-antagonistische Eigenschaften aufweist [212-217].

1.5 Die hochpathogene aviäre Influenza (HPAI) (H5N1) 1.5.1 Die Historie der Erkrankung und das aktuelle Tierseuchengeschehen Das erste Auftreten des AIV H5N1 in einer hochpathogenen Form (A/Goose/Guangdong/1/96) wurde 1996 in einer Gänsefarm in der Provinz Guangdong, im Südosten Chinas beschrieben [218,219]. Die Morbidität lag bei 40 %. 1997 folgten weitere Ausbrüche in Hong Kong und die erstmalige Übertragung des Virus auf den Menschen. In Folge dessen wurden rund 1,5 Millionen Hühner in Hong Kong vorsorglich getötet [220]. Seitdem evolviert HPAIV H5N1 durch shift- und drift-Mechanismen, d. h. durch ständige Mutation v. a. der Oberflächenproteine HA und NA (drift) und durch Reassortierung der genomischen RNA- Segmente (shift) mit anderen AIV und bildet so neue Virusvarianten, die mittlerweile in zehn Kladen eingeteilt werden [221,222]. Nach dem erstmaligen Auftreten des Virus 1996 wurde 2002 ein neuartiger Genotyp in Geflügelfarmen in China isoliert. Dieser breitete sich in den folgenden zwei Jahren in Asien aus (Kambodscha, Japan, Südkorea, Laos, Thailand, Vietnam) [223] und wurde 2005 durch einen neuen Genotyp (Klade 2.2) abgelöst, der das erste größere Infektionsgeschehen von HPAIV H5N1 in Wildvögeln in China verursachte [224,225]. Zwischen 2005 und 2006 kam es zu einer massiven Ausbreitung des Erregers nach Europa, dem mittleren Osten und Afrika, mit dem Höhepunkt 2006 als aus über 60 Ländern Infektionen in Geflügelbeständen gemeldet wurden.

20 Einleitung

Die meisten der betroffenen Länder konnten die Infektionen durch „stamping out“-Verfahren, d. h. gezieltes Töten infizierter und Kontakttiere, sowie dem Errichten von Sperrzonen und Handelsrestriktionen unter Kontrolle bringen. Bangladesch, China, Ägypten, Indien, Indonesien und Vietnam gelten jedoch weiterhin als Endemiegebiete für HPAIV H5N1 beim Geflügel [226]. Ausgehend von der Klade 2.2 breiten sich aktuell Viren der Klade 2.3.4.4 hochgradig aus [227]. Dazu gehören v. a. Reassortanten des H5N1, die das N2, N3, N5, N6 oder N8 tragen und für die meisten Infektionen nach 2010 in domestizierten Geflügel und Wildvögeln verantwortlich sind [222,227-235]. 2016 bis 2017 kam es z. B. zu einer HPAIV- Epidemie in Europa, die durch die Subtypen H5N8 und H5N5 ausgelöst wurden (Tabelle 4) [236,237]. 2014/2015 wurde die erste Infektion mit HPAIV H5N1 in den USA registriert. Dieses Virus entstand durch die Reassortierung, ausgehend von einem H5N8 Virus [238-240].

Tabelle 4: Überblick über die weltweite Anzahl der an die OIE gemeldeten HPAIV-Fälle in Geflügelfarmen, sowie Anzahl gestorbener und getöteter Tiere. Die Anzahl der betroffenen Länder je Kontinent sowie die verursachenden HPAIV Subtypen sind angegeben (World Animal Health Information Database (WAHIS Interface)-Immediate notifications and Follow-ups; https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/Immsummary). Anzahl Anzahl Anzahl der Anzahl der betroffenen Länder je Kontinent Jahr gestorbener getöteter Fälle sowie zirkulierende Subtypen Tiere Tiere Asien (20): H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N8 Afrika (7): H5N1 2015 4 588 857 2 304 139 29 900 461 Amerika (3): H5N1, H5N2, H5N8, H7N3 Europa (9): H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H7N7 Asien (19): H5N1, H5N2, H5N6, H5N8 Afrika (7): H5N1, H5N8 2016 2 494 079 1 910 588 39 959 736 Amerika (2): H7N3, H7N8 Europa (18): H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H7N7 Asien (20): H5N1, H5N2, H5N6, H5N8, H7N9 Afrika (9): H5N1, H5N8 2017 4 418 699 2 611 842 50 908 711 Amerika (2): H7N3 Europa (22): H5N1, H5N5, H5N6, H5N8 Asien (19): H5N1, H5N2, H5N6, H5N8, H7N9 Afrika (6): H5N1, H5N8 2018 3 199 558 2 458 894 15 268 842 Amerika (1): H7N3 Europa (4): H5N2, H5N6, H5N8 Asien (13): H5N1, H5N2, H5N5, H5N6, H5N8, H7N9 2019 924 185 645 025 3 794 479 Afrika (4): H5N1, H5N2, H5N6, H5N8 Amerika (1): H7N3 Europa (3): H5N8

21 Einleitung

1.5.2 Das Wirtsspektrum und Krankheitsbild der HPAI Hauptwirte der HPAIV und der LPAIV stellen die Hühnervögel (Ordnung Galliformes) dar, aber ebenso können auch domestizierte Enten, Gänse, Laufvögel, Tauben und Käfigvögel infiziert werden [241-246]. LPAIV zirkulieren asymptomatisch in Wildvögeln, v.a. bei aquatisch lebenden Spezies wie Enten, Gänsen, Schwänen, Möwen, Seeschwalben und Watvögeln, die als natürliche Reservoirspezies gelten [247-249]. Der Eintrag der LPAIV in das Wirtschaftsgeflügel kann zu deren Anpassung an den neuen Wirt führen, sie können in diesem zirkulieren oder zu HPAIV evolvieren, wenn es sich um LPAIV der Subtypen H5 oder H7 handelt [250-252]. Das HPAIV H5N1 und dessen Reassortanten (z. B. H5N8) werden auch regelmäßig aus erkrankten Wildvögeln isoliert. Inwieweit diese jedoch als Reservoir für HPAIV H5N1 angesehen werden können, ist noch nicht ausreichend geklärt [218,225,253-257]. HPAIV H5N1 wurden auch aus verschiedenen klinisch kranken Säugetier-Spezies, z.B. Katzen, Hunden, Schweinen, Pferden, Eseln, Nerzen oder wilden Säugetieren isoliert [258-266]. Die Inzidenz für eine Übertragung des HPAIV H5N1 vom Geflügel auf den Menschen ist niedrig, kommt aber sporadisch vor. Die dann oft schweren respiratorischen Infektionen verlaufen zu ca. 50 % tödlich und traten erstmals 1997 zu Beginn der Pandemie in Hong Kong auf [267,268]. Seit dem Wiederauftreten und der starken Verbreitung des Virus 2003 meldet die WHO 861 Fälle von humanen HPAIV H5N1-Infektionen, von denen 455 tödlich ausgingen. Die meisten Fälle melden die endemisch infizierten Länder (China, Ägypten, Vietnam, Indonesien), sowie Kambodscha (Quelle: https://www.who.int/influenza/human_animal_interface/2020_01_20_tableH5N1.pdf?ua=1 ; aufgerufen: 22.03.2020). Die Weiterverbreitung von Mensch zu Mensch ist sehr selten, wird aber beschrieben [269]. Die Inkubationszeit der HPAI bei Hühnern, Puten und anderem Geflügel variiert zwischen einigen Stunden und Tagen für das individuelle Tier und bis zu 2 Wochen bei einer Herde. Die Mortalität kann in wenigen Tagen 100 % betragen. In akuten Verläufen werden Zyanosen und Ödeme des Kopfes, des Kammes und des Kehllappens beobachtet, blutiger oraler und nasaler Ausfluss, sowie hämorrhagische Einblutungen in das subkutane Gewebe der Ständer und Füße. Grünlich gefärbter Durchfall kommt häufig ebenso vor. Bei perakuten Verläufen können klinische Krankheitszeichen auch gänzlich fehlen. Tiere, die eine akute Phase überlebt haben, können infolge der Infektion des ZNS neurologische Störungen entwickeln,

22 Einleitung die sich klinisch als Torticollis, Opisthotonus, Gleichgewichtsstörungen und Paralyse äußern [241,242,270-272].

1.5.3 Die Diagnose bzw. der Nachweis der HPAI Der Virusnachweis aus Probenmaterial kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Die klassischen Methoden stellen die Virusisolierung und -anzucht aus Tupfer- oder Organproben im embryonierten Hühnerei dar. Der Agargelelektroimmundiffusionstests (AGID) und der Solid-Phase Antigen-Capture ELISA (AC-ELISA) wurden entwickelt, um spezifisch das NP- oder das M-Antigen der Influenza A-Viren nachzuweisen [273], deren Subtyp mittels des HAH und der Hilfe monospezifischer Antiseren und des Neuraminidase-Hemmtests bestimmt werden kann. Sehr verbreitet werden jedoch heute molekulare Methoden wie die RT-PCR oder die RT- qPCR verwendet, bei der nach erfolgter RNA-Extraktion spezifische Genabschnitte amplifiziert und detektiert werden. Durch das spezifische Amplifizieren von Segmenten des HA wird der Subtyp bestimmt [274-280]. Die Pathogenität des Virusisolats wird mithilfe des intravenösen Pathogenitätsindexes (IVPI) ermittelt. Die OIE definiert alle AIV, die einen IVPI > 1,2 aufweisen als HPAIV und dementsprechend anzeigepflichtig. Alle bis jetzt natürlich vorkommenden HPAIV gehören den Subtypen H5 oder H7 an. Dazu zählen auch H5- oder H7-Subtypen mit niedriger Virulenz in Hühnern, wenn sie eine HA-Spaltstellensequenz besitzen, die denen der HPAIV ähneln [281]. Infektionen mit AIV des H5- oder H7-Subtypes, die eine niedrige Virulenz in Hühnern und eine monobasische HA-Spaltstellensequenz aufweisen, werden als LPAIV definiert und sind nicht anzeigepflichtig. Für den Nachweis AIV-spezifische Serumantikörper werden kommerziell erhältliche ELISA und der HAH durchgeführt [282].

1.6 Impfungen des Geflügels gegen die HPAI Eine protektive Immunität des Geflügels gegen AIV wird hauptsächlich durch das HA und zu einem geringeren Anteil auch durch das NA vermittelt. Nur in vier Ländern (China, Ägypten, Vietnam und Indonesien) existieren dauerhafte Impfkampagnen gegen HPAI. In vielen anderen Ländern ist die Immunisierung des Geflügels dagegen verboten, wird jedoch im Falle eines Ausbruchsgeschehen in einigen Ländern zeitlich begrenzt erlaubt. Unabhängig von der Art der verwendeten Vakzine hat sich gezeigt, dass Genotyp-angepasste Impfviren einen besseren Schutz gegen zirkulierende Wildtypviren

23 Einleitung

vermitteln, da diese sich durch die ständige antigene Drift, der das HA unterlegen ist, kontinuierlich verändern [283,284].

1.6.1 Inaktivierte Vakzinen Inaktivierte Vollvirusvakzinen werden sowohl aus homologen HPAIV- als auch heterologen LPAIV-Stämmen hergestellt [285-291]. Mit Hilfe der reversen Genetik können auch rekombinante Impfviren generiert werden, die die DIVA-Strategie möglich machen. So werden z. B. aus den Mensch-adaptierten H1N1-Stämmen A/PR/8/34 und A/WSN/33 Reassortanten generiert, deren HA und NA durch die eines aktuell zirkulierenden HPAIV ersetzen werden [292-295]. Die Immunisierung des Geflügels zur Kontrolle der HPAI wurde erstmals 1995 in Mexiko eingesetzt, als dort ein Ausbruch mit HPAIV H5N2 erfolgte. Mithilfe einer inaktivierten Vakzine auf Basis eines LPAIV H5N2 konnte der HPAIV-Stamm eradiziert werden [296]. Auch Pakistan nutzte 1995 eine homologe inaktivierte Vakzine, um einen Ausbruch mit HPAIV H7N3 zu bekämpfen. Genetisch ähnliche Viren wurden jedoch 2004 immer noch isoliert [297]. Die Immunisierung gegen HPAIV H5N1 begann 2002 in Hong Kong mit dem Wiederauftreten des HPAIV H5N1 in dieser Region. 2004 folgten Indonesien und China. Weitere Impfprogramme wurden ab 2006 in den Ländern Elfenbeinküste, Ägypten, Frankreich, Kasachstan, Mongolei, Niederlande, Russland, Sudan, Pakistan und Vietnam durchgeführt. 2005 verwendete Nordkorea eine homologe Vakzine während eines Ausbruchsgeschehens mit HPAIV H7N7. Zwischen 2002 und 2010 wurden über 113 Billionen Impfdosen, die sich zu 95,5 % aus inaktivierten Vakzinen und zu 4,5 % aus rekombinanten Vektorvakzinen zusammensetzen, für die Immunisierung des Geflügels verwendet. Die Hauptverbraucher waren: China (90,99 %), Ägypten (4,65 %), Indonesien (2,32 %) und Vietnam (1,43 %), alles Länder, in denen HPAIV H5N1-Infektionen des Geflügels gemeldet wurden [298-300].

1.6.2 Rekombinante Vektor-basierte Vakzinen Mittlerweile stehen in einigen Ländern zugelassene rekombinante Vektorvakzinen für die Bekämpfung der HPAI im Geflügel zur Verfügung. Dazu zählen NDV- und FPV-basierte Vakzinen, die das HPAIV H5 exprimieren und die 4,5 % der genutzten Impfdosen im Zeitraum zwischen 2002 und 2010 ausmachen, die hauptsächlich in China eingesetzt wurden [299,300]. Aktuell wird die rekombinante FPV/AIV-H5-Vakzine in Mexiko, El Salvador und Guatemala für

24 Einleitung die Immunisierung gegen das endemisch auftretende LPAI H5N2 genutzt. Eine rekombinante HVT/AIV-H5-Vakzine wurde für die Anwendung in Hühnern in den USA und Ägypten 2012 lizensiert, die in Ägypten auch zum Einsatz kommt. Rekombinante HVT, die das AIV-H5 sowie rekombinante FVP, die das AIV-H5 oder -H7 exprimieren, induzierten eine stabile Immunantwort in Hühnern und eine entsprechende Protektion. Jedoch müssen diese Vektorvakzinen parenteral appliziert werden, was einen deutlichen Personal- und Zeitaufwand bedeutet [301-309]. Vektoren, wie NDV oder auch ILTV [310-312], sind für die Massenapplikation per Spray oder Trinkwasser tauglich und können daher bereits in Brutbetrieben eingesetzt werden [313,314]. Die Protektionseffizienz rekombinanter NDV-basierter AIV-H5-Vakzinen wurde ausreichend in spezifisch pathogenfreien Hühnern evaluiert und belegt (Tabelle 5). Den NDV-Rekombinanten ist dabei gemein, dass das exprimierte Fremdgen nachweislich in das Viruspartikel eingebaut wird. Um diesen Einbau zu verbessern, wird oft die Ektodomäne des AIV-HA an die TMD und die zytoplasmatische Domäne des NDV-F fusioniert. Ob damit ein höherer Grad an Protektion verbunden ist, ist jedoch nicht ausreichend geklärt. Einen anderen Ansatz stellt die Insertion eines löslichen HA in den NDV-Vektor da. Da das Protein nicht in die NDV-Hüllmembran eingebaut wird, wird ein unveränderter Zelltropismus erwartet und damit eine Erhöhung der Sicherheit der Vakzine [315]. Um die Gefahr der Reassortierung zu unterbinden, wird nur der kodierende Bereich, ohne Verpackungssignalsequenzen, in das vom NDV zusätzlich exprimierte Gen inseriert. Zur weiteren Erhöhung der Sicherheit wird häufig die polybasische HA-Spaltstellensequenz durch Mutation in eine monobasische umgewandelt. Untersuchungen des Einflusses der Koexpression des AIV-HA und -NA auf die Protektionseffizienz in Hühnern fielen uneinheitlich aus, deuten aber eher darauf hin, dass der Effekt gering ist [114,316]. Küken immunisierter bzw. natürlich infizierter Legehennen in HPAI-Endemiegebieten weisen nach dem Schlupf eine maternale Immunität gegen das entsprechende AIV auf. Durch die weit verbreitete Immunisierung des Geflügels gegen die ND, die Mareksche Krankheit, die ILT oder die Geflügelpocken können Küken zusätzlich maternale Antikörper gegen NDV, HVT, ILTV oder FPV aufweisen. Diese beeinträchtigen die Protektionseffizienz einer aktiven Immunisierung, unabhängig davon, ob vektorbasierte Lebendvakzinen oder inaktiverte Influenzaviren verwendet werden [317-326]. Im Falle der NDV-basierten Vektorvakzinen konnte die maternale NDV-Immunität durch die Substitution der Oberflächenproteine F und HN gegen

25 Einleitung

die anderer aviärer Orthoavulaviren der Serogruppen 2 oder 8 überwunden werden [327,328]. An der Überwindung maternaler AIV-Antikörper wird intensiv geforscht.

1.6.3 In Entwicklung befindliche AIV-Vakzinen Von Viren, Pflanzenzellen oder Hefen rekombinant exprimiertes AIV-HA kann als sogenannte Subunit-Vakzine zur Immunisierung von Hühnern verwendet werden und ist in der Lage, diese gegen die HPAI zu schützen. Obwohl solche Vakzinen die Voraussetzung für die DIVA-Strategie erfüllen, ist deren Herstellung für den kommerziellen Gebrauch momentan noch zu zeit- und kostenintensiv [329-332]. Ähnliches gilt auch für DNA-Vakzinen, bei denen es sich um Plasmid-DNA, die für AIV-H5 oder -H7 kodiert, handelt. Nach der Immunisierung von Mäusen oder Hühnern wird, ähnlich wie bei Lebendvakzinen, die humorale und zelluläre Immunantwort stimuliert und eine protektive Immunantwort aufgebaut. Jedoch ist auch diese Technologie teuer und Mehrfachinokulationen sind notwendig [333-338].

26 Einleitung

346]

Referenz [339] [340] [341] [342] [159,284,343 [315] [313] [314]

%)*

HPAIV H7N7 (40 %) (40 H7N7 HPAIV %) (100 H5N1 HPAIV Belastungsinfektion und und Belastungsinfektion Schutz %) vNDV(40 %) vNDV(90 %) (100 H7N7 HPAIV %) vNDV(100 %) (100 H7N1 HPAIV %) vNDV(100 %) (100 H5N2 HPAIV vNDV(100 %) (100 H5N1 HPAIV %) (50 H5N1 HPAIV %) (90 H5N2 HPAIV %) (90 H5N1 HPAIV %) (100 H5N1 HPAIV

)

Belastungsinfektionnicht in jeder Studieintegriert

+ 28 +

alter alter (Tage)

Vektorvakzinen für die Prävention der hochpathogenen aviären aviären der für hochpathogenen Prävention die Vektorvakzinen

* NDV *

rungsroute, rungsroute,

, 1x (42 d) 1x (42 ,

x x (1d)

, 1x (21 d) d) (21 1x , d) (21 1x , 21 14, 7, (1, 1x , d) (42 1x , 1 ,

a a a a

dosen und und dosen

oder 42 d) 42 oder Immunisie - d) (14 1x okular, ( 2x okular, o.n. o.n. o.n. m. i. t. o.n./i. d) (14 1x Spray, o.n 1x (1d) Trinkwasser,

intramuskulär

okulonasal

intratracheal

a b c

Virus LPAIVH7N2 LPAIVH7N2 H7N1 HPAIV H5N2 HPAIV H5N1 HPAIV H5N1 HPAIV H5N1 HPAIV H5N1 HPAIV

Fremdgen HA HA HA HA HA sHA HA HA

Spaltstellensequenz

Stamm

one 30 one

Beaudette C, VG/GA C, Beaudette NDV B1 Hitchner B1 Hitchner Cl 30 Clone 30, Clone LaSota, Herts/33 LaSota LaSota

polybasischeNDV F monobasischeNDV F

Tabelle 5: Übersicht über einige der Anwendungen rekombinanter NDV rekombinanter der 5: Tabelle einige über Anwendungen Übersicht Hühnern. bei Influenza

2 1

27 Einleitung

1.7 Das Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer/ Das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (PPRV) 1.7.1 Die Virustaxonomie und -struktur Das Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer ist als das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (peste des petits ruminants virus, PPRV) bekannt und wurde 2016 durch die ICTV umbenannt, wird nachfolgend aber weiterhin als PPRV geführt. Es verursacht die gleichnamige hochansteckende Erkrankung Pest der kleinen Wiederkäuer (peste des petits ruminants, PPR) bei Schafen und Ziegen sowie wildlebenden kleinen Wiederkäuer, die oftmals an ihr versterben. Es wird dem Genus Morbillivirus innerhalb der Familie Paramyxoviridae und der Ordnung Mononegavirales zugeordnet [347,348]. Innerhalb des Genus weist es eine hohe genetische Ähnlichkeit zum Morbillivirus der Rinderpest auf. Das RNA-Genom umfasst 15 948 nt, ist einzelsträngig, nicht-segmentiert und weist eine negative Polarität auf. Es kodiert für die viralen Oberflächenproteine, das Hämagglutinin (H) und das Fusionsprotein (F), das Matrixprotein (M) sowie für die Proteine des RNP, das Nukleoprotein (N), das Phosphoprotein (P) und die RNA-abhängige RNA-Polymerase (large- protein, L) in der Reihenfolge 3`- N, P, M, F, H, L -5’ [349-351]. Durch den Beginn der Transkription am zweiten Startkodon des P-Gens entsteht eine mRNA, die für das Nichtstrukturprotein C kodiert. Das zweite Nichtstrukturprotein V entsteht durch die Editierung der P-mRNA während der Transkription. Die Organisation der Gene als Transkriptionseinheiten sowie die Struktur des ca. 400-500 nm großen, umhüllten Virions sind der des NDV sehr ähnlich [348,349,352-354]. Die unterschiedlichen PPRV-Stämme gehören einem Serotyp an, werden aber in vier genetisch unterscheidbare Linien eingeteilt, die auch geographisch differenziert auftreten. Viren der Linie I sind seit 1970 in Westafrika und seit kürzerer Zeit auch in Zentralafrika verbreitet, während Viren der Linie II auf Länder Westafrikas und Viren der Linie III auf Ostafrika beschränkt bleiben. Historisch betrachtet waren Viren der Linie IV auf den Mittleren Osten und Asien beschränkt, mittlerweile werden sie aber in allen betroffenen Gebieten isoliert und verdrängen zunehmend die Viren anderer Linien [352,355-361].

1.7.2 Der virale Replikationszyklus Das H-Protein vermittelt die Adsorption des Virus an die zellulären Oberflächenrezeptoren, das Lymphozytenaktivierungsmolekül (SLAM/CD150) oder Nectin-4 [362-366]. Der

28 Einleitung

Immunzellrezeptor SLAM wird auf der Oberfläche von Lymphozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen, jedoch nicht auf Epithelzellen exprimiert, während Nectin-4 ein epithelialer Zellrezeptor ist und nicht auf Lymphozyten und dendritischen Zellen exprimiert wird [362,367]. Nach respiratorischer Infektion werden die Viren zunächst von Makrophagen und dendritischen Zellen, die sich intraepithelial und in der Lamina propria der respiratorischen Schleimhaut befinden, über SLAM aufgenommen. Diese transportieren die Viren lymphogen in die regionalen Lymphknoten, in denen die Virusreplikation stattfindet. Von dort erfolgt die weitere hämatogene bzw. lymphogene Ausbreitung in sekundär lymphatische Organe, sowie die Schleimhäute des Respirations- und Gastrointestinaltraktes, deren Befall durch Nectin-4 vermittelt wird [367,368]. Die Transkription und Translation der mRNA sowie die Replikation des viralen Genoms und anschließende Assemblierung und Knospung neuer Viruspartikel verläuft ähnlich wie bei NDV [354].

1.7.3 Die Virulenzdeterminanten des PPRV

Die Spaltung des PPRV-F0-Vorläuferproteins ist ebenso wie bei NDV entscheidend für die Infektiösität des Virus, da nur biologisch aktives F die Fusion und somit Infektion einer Zelle vermittelt [27,349,369]. Die proteolytische Spaltung findet an einer Arginin-reichen Sequenz, 104(G/R)-R-T-R-R108 durch ubiquitär vorkommende Furin-ähnlichen Proteasen statt [370]. Dieser Vorgang ist bei allen PPRV gleich und beeinflusst nicht den Grad der Virulenz. Diese ist hauptsächlich von der Wirtspezies und deren Alter und Immunstatus etc. abhängig. Für einzelne Proteine, z. B. N, P und V konnten immunmodulatorische Funktionen, wie die Blockierung der IFN-Antwort des angeborenen Immunsystems nachgewiesen werden [371- 375].

1.8 Die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) 1.8.1 Die Historie und das aktuelle Tierseuchengeschehen der PPR Erstmals wurde 1942 eine Rinderpest (RP)-ähnliche Erkrankung in kleinen Wiederkäuern in Westafrika (Elfenbeinküste) beschrieben [376]. Erst 1979 erkannte man, dass es sich beim auslösenden Agens um eine distinkte Virusspezies handelte [348]. Aufgrund der zur RP ähnlichen Symptomatik, wurde es PPR genannt. Bis 1979 gab es bestätigte Fälle der PPR in fast allen Ländern Westafrikas (Nigeria, Senegal, Togo und Benin). 1982 folgte der erste Bericht aus Ostafrika, aus dem Sudan. Indien war das erste Land Asiens, das 1989 PPR diagnostizierte, gefolgt von Pakistan 1994. Zwischen 1993 und 1995 breitete sich die

29 Einleitung

Erkrankung in den Ländern der arabischen Halbinsel, Südasiens und des mittleren Ostens weiter aus. Besonders in den letzten 15 Jahren kamen weitere Ausbrüche auf dem afrikanischen Kontinent, sowohl im südlichen Teil, z. B. in Tansania (2008), Sambia (2015), der Demokratischen Republik Kongo und Angola (2012), als auch in Nordafrika, wie z. B. in Tunesien (2006), Marokko (2008 und 2015) und Algerien (2011 und 2016) hinzu. In Asien wurden Ausbrüche in Tibet (2007), China (2013-2014) und Kasachstan (2014) registriert. Seit 2012 ist PPR auch im asiatischen Teil der Türkei präsent und mit zwei Ausbrüchen, in Georgien (2016) und Bulgarien (2018), mittlerweile auch in Europa angekommen [352,357- 361,377,378]. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die PPR bereits vor den ersten Berichterstattungen endemisch in den betroffenen Gebieten vorkam, jedoch mit der RP verwechselt wurde. Bis diese 2011 als ausgerottet erklärt wurde, wurden auch kleine Wiederkäuer gegen die RP vakziniert und waren durch kreuzprotektive Antikörper auch gegen PPR geschützt [379]. Der Wegfall der Impfung aufgrund der Ausrottung der RP begünstigte möglicherweise die Ausbreitung der PPR nach 2011. Laut Informationen der OIE wurden bis jetzt PPR-Ausbrüche aus über 70 Ländern gemeldet, jeweils ca. 50 % davon befinden sich auf dem afrikanischen bzw. asiatischen Kontinent (Tabelle 6). Die jährlichen Verluste, die sich v.a. aus dem Tod der Tiere ergeben, werden auf 1.4 bis 2.1 Billionen US Dollar pro Jahr geschätzt, jedoch mit steigender Tendenz durch die steigende Weltbevölkerung und den wachsenden Bedarf an Produkten kleiner Wiederkäuer [380]. Tabelle. 6: Überblick über die weltweite Anzahl der an die OIE gemeldeten PPR-Fälle in Farmen und Naturparks, sowie die Anzahl gestorbener und getöteter Tiere. Die Anzahl der betroffenen Länder je Kontinent (in Klammern) sowie die jeweils betroffene Tierspezies sind angegeben (World Animal Health Information Database (WAHIS Interface)-Immediate notifications and Follow-ups; https://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/Immsummary). Anzahl der Anzahl Anzahl Anzahl betroffenen Jahr gestorbener getöteter Betroffene Tierspezies der Fälle Länder je Tiere Tiere Kontinent Afrika (5) 2015 24 455 17 355 206 Schaf, Ziege Asien (3) Schaf, Ziege, Kamel, Afrika (6) Nubischer Steinbock, 2016 56 291 26 486 345 Asien (4) Kropfgazelle, Mongolischer Europa (1) Saiga, Sibirischer Steinbock Schaf, Ziege Nubischer Afrika (4) Steinbock, Kropfgazelle, 2017 29 433 22 647 206 Asien (3) mongolischer Saiga,

Sibirischer Steinbock

30 Einleitung

Afrika (6) 2018 32 958 21 444 3189 Asien (4) Schaf, Ziege Europa (1) Afrika (5) 2019 27 643 19 094 206 Asien (4) Schaf, Ziege Europa (1)

1.8.2 Die Wirte und das Krankheitsbild der PPR Neben Schaf und Ziege, die zu den Hauptwirten des PPRV zählen [381], sind auch viele andere kleine wildlebende Wiederkäuer natürlicherweise empfänglich. Inwiefern PPRV innerhalb dieser Spezies zirkuliert und ob es wieder auf domestizierte kleine Wiederkäuer übertragen werden kann, ist noch nicht ausreichend geklärt [382-384]. Rinder werden als „Dead-end“- Wirte angesehen, d.h. sie können sich infizieren, zeigen aber keine oder nur subklinische Zeichen der Infektion und sind nicht in der Lage, den Erreger weiterzugeben [385-391]. Es existieren darüber hinaus eine Reihe anderer Tierspezies, wie z. B. Kamele, Büffel, Hunde, asiatische Löwen und Schweine, die, wenn auch selten, als mögliche Wirte für PPRV in Betracht gezogen werden und deren Rolle in der Transmission zwischen den Spezies und der generellen Ausbreitung der PPR diskutiert wird [359,392-403]. Der akute Krankheitsverlauf der PPR bei Ziegen ist durch eine Inkubationszeit von vier bis sechs Tagen und das plötzliche Einsetzen von hohem Fieber (bis 41 °C) gekennzeichnet. Gleichzeitig zeigen sich die Tiere träge und erschöpft. Typisch ist der zunächst wässrige und später mukopurulente okulare, nasale und orale Ausfluss. Hinzu kommen erosive Läsionen und Ulzerationen in der Mundhöhle, die nekrotisch werden können, gefolgt von einer Stomatitis, z. T. blutigem Durchfall, und in schweren Verläufen einer Bronchopneumonie. Die Tiere dehydrieren, werden zunehmend schwächer und versterben häufig. Die Mortalitätsraten schwanken zwischen 50 und 90 % und sind u.a. vom Virusstamm, der Tierspezies, dem Alter und Immunstatus der Tiere abhängig. Bei subakut verlaufender PPR sind die Mortalitätsraten niedriger und die Tiere ca. 10 bis 15 Tage nach Infektion rekonvaleszent, während bei perakuten Verläufen Todesraten von bis zu 100 % zu verzeichnen sind [368,382,404,405]. Wie die Morbilliviren im Allgemeinen, ist auch PPRV durch einen starken Lymphotropismus gekennzeichnet [406]. Dieser führt bei Infektionen mit virulenten Stämmen zu einer starken Immunsuppression und verminderten Antikörperantwort infolge der Leukopenie. Bei nicht virulenten Vakzinestämmen wird nur eine geringgradige, transiente Leukopenie beobachtet, die die Antikörperantwort nicht beeinträchtig [368,406].

31 Einleitung

1.8.3 Die Diagnose der PPR Die Diagnose der PPR kann durch den direkten Erregernachweis durch die Anzucht in einer Zellkultur erfolgen. PPRV-Nukleinsäure muss aus Blut oder Organmaterial extrahiert werden, dann mittels RT-PCR oder RT-qPCR amplifiziert und nachgewiesen werden [355,407-415]. Als Alternative für die Vervielfältigung von Nukleinsäure kann die isothermale Amplifikation verwendet werden, die ohne Thermocycler-Geräte auskommt [416]. Der Nachweis von PPRV-Antigenen und -Antikörpern erfolgt mittels ELISA [390,417-420]. Virus-neutralisierende Antikörper werden durch den VNT nachgewiesen [404,421].

1.9 Die Immunisierung gegen die PPR In PPR-Endemiegebieten wird die Immunisierung domestizierter kleiner Wiederkäuer umfangreich durchgeführt und in Ausbruchsgeschehen neben Quarantäne- und Desinfektionsmaßnahmen wichtiger Bestandteil der Kontrolle und Prävention. In bis dato PPR- freien Gebieten steht die Tötung infizierter Tiere im Vordergrund. Die protektive Immunität wird hauptsächlich durch das Oberflächenprotein H, aber auch durch F vermittelt.

1.9.1 Attenuierte Lebendvakzinen Als noch kein effektiver Impfstoff gegen PPR verfügbar war, wurde ein durch Passage in Zellkultur attenuiertes RPV als heterologe Lebendvakzine für die Kontrolle und Prävention der PPR eingesetzt [422]. Diese vermittelte einen Schutz von ca. einem Jahr bei kleinen Wiederkäuern [379,423]. Im Zuge der Ausrottung der RP wurde die Impfung jedoch später eingestellt, um die Handhabung lebender RPV zu verhindern und RP-freie Zonen definieren zu können [390]. Die erste homologe PPR Vakzine leitete sich von dem afrikanischen PPRV- Stamm Nigeria 75/1 der Linie II ab, wurde ebenso durch Zellpassage attenuiert und zunächst weltweit in allen Endemiegebieten eingesetzt. Sie vermittelt mindestens einen dreijährigen Schutz und verhindert das Ausscheiden virulenter Wildtypviren [424-428]. Nachfolgend wurden die Vakzineviren Sungri/96, Arasur/87 und Coimbatore/97, ausgehend von Linie IV- Viren, für den Einsatz in Indien hergestellt, um Linien-spezifisch zu immunisieren und die weitere Vermischung der Viren unterschiedlicher Linien zu verhindern [429-431]. Diese attenuierten Vakzinen sind bis heute die einzig zugelassenen Impfstoffe gegen die PPR.

32 Einleitung

Da Morbilliviren sehr temperaturempfindlich sind, ist das Einhalten der Kühlketten bei Lebendvakzinen erforderlich, was logistisch oft problematisch ist, besonders, da die PPR- Endemiegebiete sich größtenteils in Regionen warmen Klimas befinden. Es existieren viele Ansätze, um die Thermostabilität der attenuierten Lebendvakzinen zu verbessern, z. B. durch die Nutzung thermoadaptierter Vero-Zellen für die Virusanzucht [432,433], den Einsatz verschiedener Thermostabilisatoren wie Lactalbumin, Sucrose, Trehalose oder Gelatin-

Sorbitol, in Verbindung mit Deuterium (D2O) und speziellen Gefriertrocknungsmethoden [433- 439].

1.9.2 Inaktivierte Vakzinen Für die Immunisierung von Tieren außerhalb der endemisch PPRV infizierten Gebiete wurden auch inaktivierte Vakzinen getestet [440,441]. Diese setzten sich allerdings nicht durch, da Mehrfachapplikationen notwendig sind, um eine Immunantwort, die von relativ kurzer Dauer war, zu induzieren.

1.9.3 Rekombinante Vektor-basierte Lebendvakzinen Zunächst wurden auf Vakzinia- oder Ziegenpockenviren (Poxviridae) basierende heterologe Vakzine generiert, die das F oder H des RPV exprimierten [442,443]. Diese waren in der Lage, Ziegen gegen eine PPRV-Belastungsinfektion zu schützen, jedoch können sie wahrscheinlich die Replikation von PPR-Wildtypviren nicht vollständig unterbinden. Homologe Vektor-basierte Vakzinen, wie rekombinante Ziegenpockenviren, die das PPRV-F oder -H exprimieren, sind ebenfalls in der Lage, Ziegen nach einmaliger Immunisierung gegen PPR zu schützen [444,445]. Eine pre-existierende Vektorvirusimmunität kann sich jedoch effizienzmindernd auswirken [446-448]. Des Weiteren haben sich rekombinante Adenoviren (Adenoviridae), die das PPRV-H oder -F exprimieren sowohl bei Schafen als auch Ziegen immunogen und protektiv gezeigt [449-453]. Die Dauer der Immunantwort muss jedoch für diesen Vektor noch evaluiert werden. Ein rekombinantes Vakziniavirus, welches PPRV-H exprimiert, schützte Ziegen vor einer letalen PPRV Infektion, diese war jedoch erst nach zweimaliger Applikation wirksam [454]. Weiterhin ist ein rekombinantes chimäres RPV, bei dem M, F und H des RPV gegen die entsprechenden Gene des PPRV substituiert wurden, in der Lage, Ziegen vor einer Wildtyp- PPRV-Infektion zu schützen [455]. Ziegen, die mit rekombinanten Baculoviren (Baculoviridae),

33 Einleitung

die PPRV-H exprimierten, inokuliert wurden, induzierten spezifische Antikörper [456]. Ebenso reagierten Mäuse, die mit rekombinanten Baculoviren immunisiert wurden, die die immundominante Ektodomäne des PPRV-F exprimierten [457]. Die Protektionseffizienz dieser Vektoren muss jedoch noch mit einer Belastungsinfektion untersucht werden. Erste experimentelle Studien eines rekombinanten PPRV-H exprimierenden bovinen Herpesvirus-4 (Herpesviridae) beschrieben die Induktion neutralisierender Antikörper in Mäusen [458].

1.9.4 In Entwicklung befindliche PPRV-Vakzinen Die durch Baculoviren in Insektenzellen rekombinant exprimierten PPRV-Proteine N, M und HN bilden Virus-ähnliche Partikel (VLP), die aus den Insektenzellen durch Knospung freigesetzt werden. Diese sind in der Lage, sowohl bei Mäusen als auch Ziegen die Bildung neutralisierender Antikörper zu induzieren [459-461]. Immunisierungsstudien bei Schafen und Mäusen mit Plasmiden, die entweder für Anteile von PPRV-H-spezifischen idiotypischen Antikörpern oder für PPRV-H oder -F kodieren, belegten die Immunogenität der DNA-Vakzinen bei den Tieren [462-464].

2 Zielstellung der Arbeit

Das Ziel der Arbeit war, das bereits etablierte NDV-Vektorsystem zur Expression von Fremdgenen weiter zu verbessern und für andere tierpathogene Krankheitserreger zu nutzen [107,110,342]. Viren der hochpathogen aviären Influenza (HPAI) und der Newcastle-Krankheit (ND) sind weltweit verbreitet und führen beim Geflügel zu schweren systemischen Erkrankung, der klassischen (HPAI) bzw. atypischen (ND) Geflügelpest. Beide Erkrankungen sind aufgrund des dramatischen Verlaufes in Deutschland und der Europäischen Union (EU) anzeigepflichtig. Die rekombinanten, auf NDV basierenden und durch die Expression des Hämagglutinins (HA) des HPAIV-H5-Subtypes gegen HPAI gerichteten Vektorvakzineviren zeigten, dass sie spezifisch- pathogenfreie Hühner sowohl gegen die ND als auch gegen die HPAI schützen und gleichzeitig eine Unterscheidung zwischen AI-infizierten und NDV/AIV-H5-geimpften Tieren (differentiation of infected and vaccinated animals, DIVA) ermöglichen [284,342]. Die Schutzwirkung von Hühnern, die aufgrund vorhergehender Infektionen oder der Immunisierung der Elterntiere, maternale Antikörper gegen AI aufweisen, ist bisher nicht zufriedenstellend. Aus diesem Grund sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, ob die Expressionshöhe der Fremdgens HA (H5) durch den Einbau eines zusätzlichen Transgens, welches für ein lösliches Protein des gleichen H5-Antigens kodiert, erreicht werden kann. Um zu zeigen, ob Hühnerküken, die maternale AIV-spezifische Antikörper tragen, durch die Immunisierung mit einem H5-überexprimierenden NDV vor einer HPAIV-Infektion geschützt sind, sollte ein Tierversuch mit Hühnern unterschiedlichen Alters durchgeführt werden. Da die Nutzung des NDV als Vektorvirus auch für Viruserkrankungen von Säugetieren möglich ist, sollte eine entsprechende Virusrekombinante als Impfvirus gegen die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR), eine schwere Erkrankung kleiner domestizierter und wildlebender Wiederkäuer, die durch das Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer (small ruminant morbillivirus), ehemals das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (PPRV), ausgelöst wird, untersucht werden. Die lizensierten attenuierten PPRV-Levendvakzinen sind bei Schafen und Ziegen protektiv, jedoch sehr temperatursensibel und eignen sich nicht für die Differenzierung immunisierter von infizierten Tieren. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine NDV- basierte Vakzine, die das protektive PPRV-Hämagglutinin exprimiert, Ziegen vor einer letalen PPRV-Infektion schützt und die Anforderungen an eine hohe Thermostabilität und die Kompatibilität mit der DIVA-Strategie erfüllt.

35 Zielstellung der Arbeit

Die rekombinanten Vakzineviren sind hinsichtlich ihrer Replikationseffizienz und der Virulenz in unterschiedlichen Wirten stark durch die Eigenschaften des NDV-Vektors charakterisiert. Da bekannt ist, dass vom P-Gen durch die mRNA-Editierung zwei zusätzliche mRNA-Spezies transkribiert werden, und das daraus resultierende V-Protein Einfluss auf die Virulenz des Virus hat, war der Nachweis des zweiten möglichen Proteins W Voraussetzung, dessen Einfluss auf die Eigenschaften des NDV zu untersuchen.

3 Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse

3.1 Coexpression of soluble and membrane bound AIV H5 by recombinant NDV leads to an increase in antigen levels M. Murr, A. Karger, C. Steglich, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer Publiziert in: Journal of General Virology [121]

Rekombinante Newcastle Disease Viren (NDV), die heterologe Fremdgene anderer viraler Pathogene exprimieren, sind vielfältig in ihrer Anwendung als Vektorvakzine beschrieben. NDV, die das Hämagglutinin (HA) eines hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) exprimieren, sind in der Lage, spezifisch-pathogenfreie Hühner gleichzeitig gegen die Newcastle Krankheit (ND) und die hochpathogene aviäre Influenza (HPAI) zu schützen [342]. Das natürlicherweise membrangebundene HA wird mittels der Transmembrandomäne (TMD), wie die Oberflächenproteine des NDV, in der NDV-Hüllmembran verankert, während für lösliches HA die Sekretion und extrazelluläre Trimerisierung, sowie die Immunogenität in Hühnern gezeigt werden konnte [315,465]. Für die Wirksamkeit einer Vakzine ist die Expressionsstärke des protektiven Antigens von großer Bedeutung und sollte bei gleichbleibender Replikationseffizienz möglichst hoch sein. Ausgehend von der existierenden NDV-Rekombinante rNDVH5, die das HA des HPAIV H5N1 exprimiert, wurde ein neues rekombinantes NDV generiert, welches neben dem membrangebundenen, ein lösliches HA exprimiert (rNDVsolH5_H5) und in-vitro vergleichend mit rNDVH5 und rNDVsolH5, einer Rekombinante, die nur das lösliche Protein exprimiert, untersucht. Western Blot-Analysen bestätigten den Einbau des membrangebundenen H5 in das ND-Viruspartikel und dessen Akkumulation in infizierten Zellen, während das lösliche H5 aufgrund der fehlenden TMD nur im Zellkulturüberstand infizierter Zellen zu detektieren war. Bei konfokalmikroskopischen Analysen konnte 24 h nach der Infektion ein unterschiedliches intrazelluläres Verteilungsmuster beider Proteinvarianten in infizierten Zellen beobachtet werden. Während rNDVH5- und rNDVsolH5_H5-infizierte Zellen auch 48 h nach der Infektion H5-spezifische Fluoreszenzsignale zeigten, konnte H5 in rNDVsolH5-infizierten Zellen aufgrund dessen Sekretion nicht mehr nachgewiesen werden. Die zweite heterologe und zusätzliche Transkriptionseinheit des löslichen H5 in rNDVsolH5_H5 beeinträchtigte weder die Replikationseffizienz im embryonierten Hühnerei und in der Zellkultur, noch die Pathogenität des Virus. Massenspektrometrische Analysen ergaben, dass

37 Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse

die Koexpression des löslichen und membrangebundenen H5 die Menge des exprimierten H5 im Vergleich zu rNDVH5 um das 5,25-fache steigerte. Somit kann dieses rekombinante NDV, besonders in Situationen, in denen die generierte rNDVH5-Vakzine nicht ausreichend schützt, wie z. B. bei vorhandener maternaler AIV-Immunität, ein mögliches Vakzinevirus sein.

3.2 Protection of chickens with maternal immunity against avian influenza virus (AIV) by vaccination with a novel recombinant Newcastle disease virus vector M. Murr, C. Grund, A. Breithaupt, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer Eingereicht am 06.02.2020 in: Avian Diseases (in revision)

Hühnerküken weisen in Endemiegebieten der hochpathogenen aviären Influenza (HPAI) häufig maternale aviäre Influenzavirus-spezifische Antikörper (AIV-MDA) auf, die mit der aktiven Immunisierung der Küken gegen die HPAI interferieren und diese negativ beeinflussen. Um zu untersuchen, ob ein erhöhtes Level des protektiven Hämagglutinins (HA) den Block der AIV-MDA überwinden kann, wurden ein-, zwei- oder drei-Wochen-alte AIV-MDA+- Hühnerküken mit der auf dem lentogenen NDV Clone 30 basierenden Rekombinanten rNDVsolH5_H5, die das HA des HPAIV H5N1 überexprimiert, okulonasal immunisiert und je drei Wochen später mit dem homologen HPAIV H5N1 infiziert. Unabhängig von der Höhe der AIV-MDA replizierte das rekombinante Vakzinevirus in allen Küken, konnte aber nur in den zwei- und drei-Wochen-alten Küken eine intrinsische AIV-H5-spezifische Immunantwort induzieren, während eine NDV-spezifische Immunantwort in allen Küken nachgewiesen wurde. Die zur Ausscheidung und Serologie erhaltenen Daten nach der Immunisierung deuten auf einen spezifischen Block des exprimierten H5-Antigens durch die AIV-MDA hin, während die Replikation des Impfvirus nicht beeinträchtigt war. 40 % der im Alter von einer Woche immunisierten Küken waren trotz der nicht detektierbaren Immunantwort gegen AIV-H5 vor einer HPAIV-Belastungsinfektion geschützt und zeigten keine Krankheitszeichen. Die Protektionsrate steigerte sich entsprechend der Immunantwort zu 85 % bei zwei-Wochen-alten Küken und 100 % bei drei-Wochen-alten Küken. Einige der Küken der beiden jüngsten Gruppe überlebten die akute Erkrankungsphase, zeigten aber typische ZNS-Spätfolgen. Die Letalitätsrate der entsprechenden nicht-immunisierten AIV- MDA+-Kontrollgruppen betrug jeweils 100 %, die Überlebensdauer war jedoch durch eine

38 Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse

Abstufung von der Gruppe mit den jüngsten zu der Gruppe mit den ältesten Küken charakterisiert. Alle immunisierten Küken wiesen eine signifikante Reduktion der Replikation des HPAI- Wildtypvirus und in der Folge eine stark verminderte oropharyngeale und kloakale Ausscheidung, verglichen mit den entsprechenden Kontrolltieren, auf. In diesem Tierversuch konnte gezeigt werden, dass das kürzlich generierte rekombinante ND- Vakzinevirus rNDVsolH5_H5, drei-Wochen-alte AIV-MDA+-Hühnerküken zuverlässig vor der HPAI H5N1 schützt. In jüngeren Küken wird die Interferenz der AIV-MDA mit der aktiven Immunisierung deutlich und deutet darauf hin, dass die Impfung sehr junger Küken gegen die HPAI in Endemieregionen problematisch und nicht zu empfehlen ist.

3.3 A novel recombinant Newcastle disease virus vectored DIVA vaccine against peste des petits ruminants in goats M. Murr, B. Hoffmann, C. Grund, A. Römer-Oberdörfer, T. C. Mettenleiter Eingereicht am 30.03.2020 in: Vaccines (accepted, 24.04.2020)

Die Pest der kleinen Wiederkäuer (peste des petits ruminants, PPR) ist eine anzeigepflichtige, hoch kontagiöse Infektion der domestizierten und wildlebenden kleinen Wiederkäuer, die endemisch in weiten Teilen Afrikas, des Mittleren Ostens und Zentral- und Ostasiens auftritt und durch das Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer (small ruminant morbillivirus), das unter seiner alten Bezeichnung, als Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (peste des petits ruminants virus, PPRV) bekannt ist, ausgelöst wird. In Endemiegebieten der PPR werden attenuierte Lebendvakzinen für die Prävention eingesetzt. Diese sind allerdings temperatursensibel und erfordern eine kontinuierliche Kühlung während des Transports und der Lagerung, was besonders in den warmen Klimazonen liegenden Endemiegebieten problematisch sein kann. Für die von der OIE und FAO angestrebte globale Ausrottung der PPR bedarf es zudem einer Vakzine, die immunisierte von infizierten Tieren (differentiation of infected and vaccinated animals, DIVA) unterscheiden kann, um später PPR-freie Regionen definieren zu können. Dies ist durch die aktuell verwendeten PPRV-Vakzinen nicht gegeben. Eine Rekombinante, die auf dem lentogenen Newcastle Disease Virus (NDV) Clone 30 basiert und das protektive Hämagglutinin (H) des PPR- Wildtypvirus Kurdistan/11 exprimiert, ist durch einen intrazerebralen Pathogenitätsindex

39 Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse

(ICPI) von 0,08 charakterisiert und eignet sich damit als mögliches Vakzinevirus gegen die PPR. In-vitro Analysen bestätigten die Expression des Transgens sowie die virale Replikationsfähigkeit nicht nur in aviären, sondern auch in caprinen und ovinen Zelllinien. Die

Inaktivierung des rekombinanten NDV (rNDV_HKur) verlief bei 25 und 37 °C langsamer als es für attenuierte PPRV-Lebendvakzinen beschrieben wurde und deutet auf eine höhere intrinsische Temperaturstabilität von NDV hin. Die zweimalige aufeinanderfolgende subkutane Applikation des rekombinanten Vakzinevirus bei Ziegen induzierte PPRV- spezifische neutralisierende Antikörper, die einen Schutz vor einer intranasalen Belastungsinfektion mit virulentem PPRV Kurdistan/11 drei Wochen nach der Immunisierung vermittelte. Nach der Belastungsinfektion konnten weder klinische Erkrankungszeichen noch eine hämatogene Streuung des PPR-Wildtypvirus in den Tieren beobachtet werden. Die nasale, orale, okulare und fäkale Virusausscheidung war im Vergleich zu Ziegen, die nicht oder nur mit parentalen NDV immunisiert waren, signifikant reduziert. Die einmalige

Immunisierung mit rNDV_HKur ergab keine messbare Immunantwort bei den Ziegen, jedoch war die Infektion der Tiere durch einen deutlich abgemilderten Krankheitsverlauf im Vergleich zu den ungeimpften Kontrolltieren gekennzeichnet. Es konnte gezeigt werden, dass die NDV/PPRV-Vektorvakzine für die Kontrolle und Prävention der PPR geeignet ist, da sie einen Schutz vor der PPR und eine stark verminderte Virusreplikation bei Ziegen vermittelt, die vergleichbar zu der kommerziell erhältlichen PPRV- Lebendvakzine Nigeria 75/1 ist, aber mit einer höheren Temperaturstabilität und der vorliegenden DIVA-Eigenschaft deutliche Vorteile hat.

3.4 W protein expression by Newcastle disease virus J. Karsunke, S. Heiden, M. Murr, A. Karger, K. Franzke, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer Publiziert in: Virus Research [72]

Das Phosphoprotein (P)-Gen des Newcastle Disease Virus (NDV) kodiert für das Strukturprotein P sowie die Nichtstrukturproteine V und W, die durch die kotranskriptionelle Editierung entstehen. Alle drei Proteine besitzen einen identischen N-Terminus, unterscheiden sich jedoch in ihren C-Termini. Während die Expression des V-Proteins und dessen Inkorporation in Viruspartikel bereits gezeigt werden konnte [58,466], war die Existenz eines W-Proteins, abgesehen von dessen mRNA-Spezies, noch nicht belegt.

40 Zusammenfassende Darstellung und Diskussion der Ergebnisse

Um die Expression des W-Proteins in-vitro nachzuweisen und dieses näher zu charakterisieren, wurde ein W-spezifisches Peptidantiserum in Kaninchen hergestellt, welches W in infizierten Zellen detektierte. Analysen NDV Clone 30 infizierter Zellen ließen eine nukleäre Akkumulation des W-Proteins, die auf eine zweiteilige nukleäre Lokalisationssignalsequenz (NLS) im C-Terminus des Proteins zurückzuführen ist, erkennen. Rekombinante NDV, die W-Proteine exprimierten, die durch Mutationen in der Aminosäuresequenz der NLS charakterisiert sind, bestätigten die Funktionalität der NLS. Western Blot - und massenspektrometrische Analysen gereinigter Virionen belegten den Einbau des W-Proteins in das NDV-Partikel. Die Replikationskinetik einer Virusrekombinante (rNDVGuPdedVded), die durch Deletionen in der Editierungsstelle des P-Gens und einem zusätzlich inserierten V-Gen, das nicht in der Lage ist, W Protein zu exprimieren, gekennzeichnet ist, zeigte keinen messbaren Einfluss des W Proteins auf die in-vitro Replikationseffizienz.

4 Zusammenfassung der Arbeit

Rekombinante Vektorvakzinen, basierend auf Viren der Newcastle-Krankheit (NDV) haben sich als kostengünstig, schnell herstellbar und sicher für die Applikation bei Geflügel und Säugetieren erwiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei rekombinante Vakzineviren, die das lentogene NDV Clone 30 als Vektor nutzen, für die Prävention der hochpathogenen aviären Influenza (HPAI) bei Hühnerküken, die maternale aviäre Influenzavirus-spezifische Antikörper (AIV-MDA) aufweisen, und die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) bei Ziegen evaluiert. Während bekannt ist, dass rekombinante NDV/AIV-H5-Vakzineviren in spezifisch pathogenfreien Eintagsküken eine protektive Immunantwort induzieren, ist diese bei Küken in HPAI-Endemiegebieten meist durch vorhandene AIV-MDA negativ beeinflusst. Durch die Generierung einer NDV-Rekombinanten (rNDVsolH5_H5), die das HA des HPAIV H5N1 von zwei individuellen Fremdgenen exprimiert, konnte eine Überexpression des H5 und in Folge der okulonasalen Immunisierung von zwei- und drei-Wochen-alten AIV-MDA+-Küken die Überwindung der AIV-MDA und die Bildung von wirtseigenen AIV-H5-spezifischen Antikörpern erreicht werden. Die in Folge einer HPAIV H5N1-Belastungsinfektion vermittelten Protektionsraten beliefen sich auf 85 % bei zwei-Wochen-alten und auf 100 % bei drei- Wochen-alten Hühnern, deren Ausscheidung des virulenten Wildtypvirus im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant reduziert war. Auch wenn das rekombinante Impfvirus in ein- Wochen-alten AIV-MDA+-Küken replizieren konnte, weist die Schutzrate von 40 % darauf hin, dass die Immunisierung sehr junger AIV-MDA+-Küken nicht zu empfehlen ist.

Die subkutane Immunisierung von Ziegen mit dem rekombinanten Vektorvirus rNDV_HKur, das das Hämagglutinin des Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer (small ruminant morbillivirus, PPRV) exprimiert, schützte diese vor einer virulenten Wildtypvirus-Infektion. Nach zweimaliger Applikation wurden, wie nach der Impfung mit einer atttenuierten PPRV- Lebendvakzine, weder Erkrankungszeichen beobachtet noch eine hämatogene Streuung und nur geringgradige Replikation bzw. Ausscheidung des PPR-Wildtypvirus nachgewiesen, was auf die Bildung PPRV-neutralisierender Antikörper nach der Immunisierung zurückzuführen ist. Somit konnte gezeigt werden, dass sich das rekombinante NDV/PPRV-H für die Prävention der PPR bei Ziegen eignet. Mit NDV als Vektorvirus konnten nachweislich die Anforderungen

42 Zusammenfassung der Arbeit sowohl bezüglich der DIVA-Applikation als auch einer hohen Thermostabilität erreicht werden. Um NDV als Vektorvirus gezielt zu verändern bzw. für dessen unterschiedliche Anwendungen zu verbessern, ist es von Vorteil die Funktion der einzelnen viralen Proteine zu kennen. Mit dem erstmaligen Nachweis der Expression des W-Proteins können nun mit Hilfe des generierten W-spezifischen Peptidantiserums weitere in-vitro- und in-vivo-Analysen erfolgen, um dessen Funktion im viralen Replikationszyklus näher zu untersuchen.

5 Literaturverzeichnis

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6 Publikationen 6.1 Coexpression of soluble and membrane bound AIV H5 by recombinant NDV leads to an increase in antigen levels

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6.2 Protection of chickens with maternal immunity against avian influenza virus (AIV) by vaccination with a novel recombinant Newcastle disease virus vector

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Protection of chickens with maternal immunity against avian influenza virus (AIV) by

vaccination with a novel recombinant Newcastle disease virus vector

Magdalena Murr (1), Christian Grund (2), Angele Breithaupt (3), Thomas C. Mettenleiter, Angela

Römer-Oberdörfer (1)

(1) Institute of Molecular Virology and Cell Biology, (2) Institute of Diagnostic Virology, (3) Department of Experimental

Animal Facilities and Biorisk Management,, Friedrich-Loeffler-Institute, Federal Research Institute for Animal Health,

Südufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems, Germany

Corresponding author: Angela Römer-Oberdörfer

Südufer 10, D- 17493 Greifswald-Insel Riems

Tel.: +49 38351 71107

E-Mail: [email protected]

Abstract: 300 words Text: 4,982 words

Figures: 6

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Summary

Newcastle disease virus (NDV) vectors expressing avian influenza virus (AIV) hemagglutinin

(HA) of subtype H5 protect specific pathogen free (SPF) chickens from Newcastle disease (ND) and avian influenza (AI).

Protection from ND of chickens with maternally derived NDV immunity was achieved after the replacement of the surface proteins F and HN of NDV with those of avian paramyxovirus serotype 8. However, maternal anti-AIV antibodies (AIV-MDA+) still interfered with active immunization, resulting in inefficient protection.

To overcome this disadvantage, we inserted a transgene encoding a truncated soluble hemagglutinin (HA) in addition to the gene encoding membrane-bound HA from highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) H5N1 into lentogenic NDV Clone 30 genome

(rNDVsolH5_H5). The biallelic expression increased the total amount of HA, expressed by the recombinant virus 5.25-fold compared to a single membrane-bound expressing NDV.

Vaccination of three-weeks-old AIV-MDA+ chickens with rNDVsolH5_H5 and subsequent challenge infection with HPAIV H5N1 three weeks later resulted in 100 % protection.

Vaccination of younger chickens with higher AIV-MDA levels one week and two weeks after hatch, resulted in protection rates of 40 and 85 %, respectively. However, all vaccinated chickens showed strongly reduced shedding of challenge virus, compared to age-matched, non- vaccinated control chickens. All control chickens succumbed to the HPAIV infection with a grading in disease progression between the three groups, indicating the influence of AIV-MDA even at a low level. Furthermore, the shedding and serological data gathered after immunization indicate sufficient replication of the vaccine virus. This leads to the assumption that lower protection rates in younger AIV-MDA+ chickens are caused by an H5 antigen-specific block and not by the interference of the AIV-MDA and the vaccine virus itself.

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In summary, solid protective efficacy and reduced virus transmission were achieved in three-

weeks-old AIV-MDA+ chickens, which is relevant especially in regions endemically infected

with HPAIV H5N1.

Key Words

Avian influenza, H5N1, Newcastle disease, vector vaccine, DIVA, maternal immunity

Abbreviations

DIVA = differentiation infected from vaccinated animals, dpc = days post challenge, dpv =

days post vaccination, EID50 = 50 % egg infectious dose, F = fusion protein, GEQ = genome

equivalents, HA = hemagglutinin, HI = hemagglutination inhibition, HN = hemagglutinin-

neuraminidase, HPAIV = highly pathogenic avian influenza, HVT = turkey herpesvirus, ICPI

= intracerebral pathogenicity index, Ig = Immunoglobulin, L = RNA-dependent RNA-

polymerase, M = matrix protein, MDA = maternally derived antibodies, MDT = mean death

time, NA = neuraminidase, NDV = Newcastle disease virus, NP = nucleoprotein, OIE = World

organization for animal health, P = phosphoprotein, RT-qPCR = quantitative real-time PCR,

SPF = specific pathogen free

90 Publikationen

Introduction

Avian influenza viruses (AIV) belong to the family Orthomyxoviridae, which includes enveloped viruses with a segmented, single-stranded, negative-sense RNA genome (1).

Depending on their surface glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), AIV strains are classified into different subtypes. At present, there are 16 HA and 9 NA AIV subtypes, including subtypes H5 and H7. AIV specifying H5 or H7 can mutate from low- to highly pathogenic AIV (HPAIV) and cause a disease that induces mortality up to 100 % in gallinaceous birds, and in consequence is notifiable to the OIE (2). Genomic RNA from novel influenza A virus subtypes designated as H17N10 and H18N11 were isolated from bats in

Guatemala and Peru, respectively (3, 4).

HPAIV H5N1 (A/Goose/Guangdong/1/96) emerged in 1996 and was first described in domestic geese in China (5, 6), followed by outbreaks in poultry in Hong Kong 1997. Moreover, the virus was transmitted to humans causing lethal infections (7, 8). HPAI had re-emerged in

Asia since 2003, and spread to Europe, Africa and the Middle East since 2005, causing outbreaks in wild birds and poultry. At its peak in 2006, HPAIV H5N1 infections in poultry have been reported in over 60 countries. Most of them accomplished eradication of the virus by stamping out procedures. However, Bangladesh, China, Egypt, India, Indonesia and Vietnam are meanwhile endemically infected with HPAIV H5N1 in poultry. In four of these countries

(Vietnam, Egypt, Indonesia, China), vaccination has been implemented to control the disease, as it leads to an increased resistance in poultry, reduced virus replication in the host and prevents further spreading of the virus between the susceptible animal populations and the transmission to humans (9, 10).

Vaccination and recurring infections in poultry cause high seroprevalence rates for H5N1 in their offspring. These maternally derived antibodies (MDA) protect chickens immediately after hatch against homologous AIV-infections. However, this passive immunity wanes after a few days (11), and unfortunately, even at low level still interferes with active immunization. Neither

91 Publikationen

conventional inactivated whole AIV preparations (11, 12, 13, 14, 15, 16) nor live recombinant

vector vaccines (17, 18, 19, 20, 21) convey sufficient protection in AIV-MDA+ chickens. These

studies indicated that the degree of interference correlates with the age of the chickens, with a

stronger interference in younger (one-day or one-week-old) than older (three-week-old)

chickens. Here, we performed a comprehensive investigation whether a newly generated

recombinant H5 expressing NDV protects AIV-MDA+ chickens of different ages from a lethal

HPAIV H5N1 infection. Considering the age dependent interference of MDA with vaccine

viruses, the experiment was done with three groups of different age.

NDV, systematically named Avian Orthoavulavirus 1, belongs to the genus Orthoavulavirus

within the family Paramyxoviridae (22, 23). The single-stranded, negative-sense genomic RNA

comprises about 15 kb and contains six genes which encode eight viral proteins. These are the

nucleoprotein (NP), phosphoprotein (P), matrix protein (M), fusion protein (F), hemagglutinin-

neuraminidase protein (HN) and the RNA dependent RNA-polymerase or large protein (L).

They are arranged in the order 3’-NP, P, M, F, HN, L-5’ (24). The non-structural proteins V

and W emerge from the P gene while transcription by mRNA-editing (25). NDV is the causative

agent of the Newcastle disease (ND) affecting birds of various species. Ever since its first

description in 1926 (26), ND is endemic in various countries of Africa, Asia, Central and South

America causing outbreaks with high mortality and subsequently significant economic losses

for the poultry industry.

To control and prevent ND, vaccination with inactivated or live vaccines is common. Vaccine

strains typically exhibit a lentogenic pathotype and feature an attenuated phenotype in chickens,

whereas mesogenic and velogenic NDV strains are moderately or highly virulent, causing

severe respiratory clinical signs. The pathogenicity of a particular NDV strain is assessed by

determining the intracerebral pathogenicity index (ICPI) in one-day-old chickens. Lentogenic

NDV exhibit an ICPI < 0.7, whereas a value > 1.5 characterizes velogenic NDV.

92 Publikationen

Live vaccine viruses can be administered by eye drop, drinking water or by spray even in one- day-old-chickens, inducing protection after a single immunization.

Recombinant NDV expressing HPAIV HA are able to protect chickens by inducing neutralizing

AIV antibodies and therefore a protective immune response including the reduction of virus shedding and transmission after a lethal HPAIV challenge infection (27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,

34, 35, 36). However, pre-existing immunity against NDV and/or AIV interfered with vaccination efficacy. To overcome NDV maternal immunity, we replaced the NDV F and HN proteins against homologous proteins from APMV-8 (37). To evade AIV maternal immunity, we inserted two open reading frames into a recombinant NDV (rNDV), to express membrane- bound and soluble forms of the AIV HA of HPAIV H5N1 (A/chicken/Vietnam/P41/05). The double insertion of AIV H5 resulted in an HA overexpression confirmed by mass spectrometric analyses (Murr et al., 2020, in submission). Since rNDVsolH5_H5 expressed fivefold more H5 than a single H5 expressing rNDV (rNDVH5), it was assumed that this vaccine virus might has the potential to overcome AIV-MDA in chickens.

Methods and Materials

Viruses

Recombinant rNDVsolH5_H5, expressing the soluble and membrane-bound H5 from HPAIV

H5N1 (A/chicken/Vietnam/P41/05, GenBank accession no. AM183672) simultaneously, was described recently (Murr et al., 2020 in submission). HPAIV H5N1 (A/duck/Vietnam/TG24-

01/05) was obtained from the German National Reference Laboratory for avian influenza (T.

Harder, FLI Insel Riems).

Determination of pathogenicity

The ICPI was determined in one-day-old specific pathogen free (SPF) chickens following the standard protocol (38). Ten one-day-old SPF-chickens were inoculated intracerebrally with 100

93 Publikationen

µl of a 10-1 dilution of rNDVsolH5_H5. Mortality and clinical signs were monitored daily for

8 days.

Animal Experiments

Vaccination and challenge infection experiments were carried out in the BSL-3 animal facility

of the FLI Insel Riems. All animal experiments were approved by the animal welfare committee

(Landesamt für Landwirtschaft und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, Thierfelder Straße

18, 18059 Rostock, LALLF MV/TSD/7221.3-1-005/19) and supervised by the commissioner

for animal welfare at the FLI, representing the institutional Animal Care and Use Committee

(ACUC). Chickens showing severe clinical distress during the experiment were euthanized

immediately. Criteria for euthanasia were either dyspnea, apathy, somnolence, akinesia or

deficit motor activity, respectively. Chickens with maternally derived AIV immunity, were bred

at FLI from layer hens (strain M11, provided by S. Weigend, FLI Mariensee), vaccinated with

inactivated recombinant influenza virus PR8-H5 (TT05), kindly provided by Martijn Langereis

(MSD Animal Health). The H1N1 A/Puerto Rico/8/34 vector harbors the HA from highly

pathogenic H5N1 A/turkey/Turkey/1/2005.

6 Twenty AIV-MDA+ chickens were vaccinated oculonasally with 10 EID50/animal of

rNDVsolH5_H5 either one week (group V1), two weeks (group V2) or three weeks (group V3)

after hatch. Additionally, 16 AIV-MDA+ chickens per vaccination day remained unvaccinated

and served as challenge controls (group C1-C3). SPF-chickens (white Leghorn) without a

maternal immunity hatched at FLI from embryonated eggs (VALO BioMedia, Osterholz-

Scharmbeck, Germany) and served as infection controls. Oropharyngeal and cloacal swabs

were taken from 10 chickens of each group on day 2, 4, 7 and 10 post vaccination (dpv) to assay

virus replication and shedding of vaccine virus.

6 All chickens were challenged by oculonasal inoculation with 10 EID50/animal of HPAIV

H5N1 A/duck/Vietnam/TG24-01/05 three weeks pv. Clinical signs were monitored daily and

94 Publikationen annotated as 0 = healthy, 1 = slightly sick, 2 = severely sick and 3 = dead over a period of 14 days. The clinical score corresponds to the sum of the evaluated health conditions, referred to the number of observed animals and the monitored days. Shedding of challenge virus was monitored by oropharyngeal and cloacal swabs, taken from 10 chickens from each group on day 2, 4, 7 and 10 post challenge infection (dpc). Brain samples were taken from one vaccinated chicken each of group V1 and V2, which suffered under pronounced neurological disorders and were euthanized on day 10 or 14 pc. They were investigated for histopathological lesions and viral antigen.

All remaining chickens were euthanized three weeks after the challenge infection at the end of the trial. Blood samples were taken from 10 chickens from each vaccinated and control group prior to immunization and challenge infection and from all surviving chickens at the end of the trial. Sera were tested for presence of antibodies against NDV and AIV.

Virus shedding

RNA from oropharyngeal and cloacal swabs was isolated automatically (Biosprint 96, QIAgen) using the NucleoMag® VET Kit (Machery-Nagel). Reverse transcriptase and quantitative real- time PCR (RT-qPCR) was used to detect genomic RNA targeting the NDV NP (37), AIV H5

(40) or AIV M genes (Pan-Influenza A-real-time RT-PCR assay modification of (40, 41) in swabs taken after vaccination or challenge infection, respectively. The calculation of detected virus as genomic equivalents (GEQ) used calibration curves of defined RNA standards, which were included in each RT-qPCR run. All RT-qPCR assays were combined with a heterologous internal control, described for the detection of pestiviruses (42). All RT-qPCR reactions were performed in 25 μl volumes using the AgPath-ID RT-PCR kit (Ambion, Austin, TX, USA) and run on a CFX96 thermocycler machine (Bio-Rad). CT values of 40 were set as cut-off representing a GEQ/ml of 1000.

95 Publikationen

Serology

Serum antibody titers against AIV H5 and NDV were determined using the hemagglutination

inhibition (HI) assay according to the standard protocol (43). rNDV and inactivated HPAIV

H5N1 (A/chicken/Vietnam/P41/05-R75/05) served as antigens.

Serum antibody titers against AIV NP were determined using a commercial ELISA

(Multispecies Influenza A Antibody test kit, BioChek, Berkshire, United Kingdom).

Histolopathology and immunohistochemistry

Formalin-fixed sagittal brain sections were processed for paraffin-wax embedding according to

standardized procedures. Sections were stained with hematoxylin-eosin for light microscopical

examination of the cerebrum, cerebellum, and brain stem. Immunohistochemical detection of

influenza A virus matrix protein was performed on consecutive slides using the avidin-biotin-

peroxidase complex method as described previously (44) using a mouse monoclonal antibody

(M21C64R3, ATCC, Manassas, VA).

Statistics

Differences between groups were analyzed using the Mann-Whitney U test for two groups and

the Kruskal-Wallis test for comparison of three groups of unpaired samples. Correction for

multiple comparison was performed using Dunn’s test. The significance level are indicated as

* (0.01-0.05), ** (0.001-0.01), *** (0.0001-0.001) and **** (< 0.0001). Statistical analyses

were performed using GraphPad Prism Software Version 7.05 (San Diego, CA, USA).

Results

Determination of pathogenicity

Pathogenicity of vaccine virus rNDVsolH5_H5 was assessed by the determination of the mean

death time (MDT) in ECE and the ICPI in one-day-old chickens. It yielded an MDT of > 90 h

96 Publikationen

(Murr et al., 2020, in submission) and an ICPI of 0.00, confirming the lentogenic pathotype that is a prerequisite for a vaccine virus.

Vaccination of AIV-MDA+ chickens with rNDVsolH5_H5

Three groups of 20 AIV-MDA+ chickens each were vaccinated oculonasally with rNDVsolH5_H5 either one week (group V1), two weeks (group V2) or three weeks (group V3) after hatch. The vaccine virus was well tolerated by all chickens, inducing no clinical signs after inoculation. The mean HI-titers, illustrating the MDA against AIV-H5 on the day of immunization, correlated with the age of the animals and were 23.8±1.23 in the youngest and

22.4±0.97 in the middle-aged group. No AI antibodies were detectable by HI-assay in the oldest chickens (Fig. 1A). Following vaccination of chickens one week after hatch, MDA decreased to a very low level 21 dpv, whereas in chickens vaccinated at 2 weeks of age a slight increased average titer of 23.7±0.95 was observed. All chickens vaccinated at 3 weeks of age seroconverted and exhibited an average titer of 25.2±0.92, whereas none of the control chickens displayed any remaining MDA at this time point.

These results demonstrate an interference of the recombinant NDV-H5 vaccine virus and the

AIV-MDA, dependent on the amount of MDA present. The presence of viral vector specific

RNA was detected in almost all oropharyngeal swab samples until 7 dpv, and in two of the youngest chickens (group V1) until 10 dpv (Fig. 2A). Oropharyngeal shedding peaked in all groups on 4 dpv. Notably, chickens of group V3 shed less virus than chickens of group V2 on

4 dpv and less than chickens of group V1 on 7 dpv. Additionally, less animal swab samples were positive. Cloacal virus shedding was present only at a low level and detected in total, in 5

(V1) and 4 (V3) chickens either on 2 or 4 dpv (data not shown). In agreement with the local replication of the lentogenic recombinant ND vector vaccine virus, all vaccinated chickens, irrespective of age, developed NDV specific antibodies with HI-titers of 25.8±0.63, 26.0±0.94, and

25.8±0.63 for groups V1, V2, and V3 respectively (Fig. 1B).

97 Publikationen

These results confirm the age dependent interference of MDA and suggest that AIV-MDA do

not generally interfere with replication of the vaccine virus, but rather induce an antigen specific

block. Accordingly, oropharyngeal swab samples also tested positive for AIV H5 specific RNA

in a similar manner as for NDV, underlining these findings (Fig. 2B).

Protection of vaccinated AIV-MDA+ chickens against homologous HPAIV H5N1

infection

6 Three weeks after vaccination, all chickens were oculonasally inoculated with 10 EID50/animal

of homologous HPAIV H5N1 Vietnam.

All non-vaccinated control chickens developed symptoms of an acute HPAI, namely ruffled

feathers, hunched back, conjunctivitis, missing escape behavior, missing reflexes and

hemorrhages, and all animals were dead after either 6 days (C1), 4 days (C2) or 2 days (C3)

post challenge infection (dpc), resulting in increasing clinical scores of 2.603, 2.779 and 2.915,

respectively. Irrespective of the group, all non-vaccinated SPF-control chickens were dead after

2 days (Fig. 3A-C). These results suggest that MDA even at an undetectable level influence the

outcome of challenge infection of unvaccinated animals. Challenged chickens in C1 survived

slightly longer as they showed a later average onset of clinical disease, starting 1 dpc with only

two severely sick chickens whereas already seven chickens with similar clinical signs were

present in group C2. Only two of the chickens in group C3 were still healthy 1 dpc, while the

others were already dead or sick. In contrast, this age-dependent effect was not observed in

SPF-chickens.

Concerning the protection rate of vaccinated chickens, a similar effect was observed as for the

antibody response. In chickens of the youngest group (V1), that were one week old at time point

of vaccination, only 40 % were protected from lethal infection with HPAIV H5N1 (Fig. 4A).

Sick chickens started to exhibit acute clinical signs of an HPAIV infection between 2-6 dpc. In

the group vaccinated two weeks after hatch (V2), an increase of the protection rate was observed

98 Publikationen with 85 % (17/20) of chickens (V2) surviving the challenge infection without showing any clinical signs (Figure 4B), whereas within the oldest group (V3) all vaccinated animals were protected from clinical signs at any dpc (Fig. 4C).

Besides the described acute clinical signs in group V1, two chickens in this group also displayed neurological disorders, like torticollis, paralysis and incoordination, which became apparent on

9 and 10 dpc after the acute mortality phase. In one of these chickens, the neurological disorders were only slight and sporadic, and did not interfere with overall behavior including feed and water intake. Accordingly, the animal was assessed as “slightly sick”, and survived the observation period of 14 dpc. The other chicken showed a severe torticollis and strongly reduced orientation skills and was euthanized on 10 dpc.

In contrast, in group V2, in which no acute deaths were registered, three chickens became sick, displaying CNS disorders similar to the animals from group V1. Clinical signs started either 5 dpc, 7 dpc or 10 dpc and increased gradually until animals were euthanized on 9 dpc, 8 dpc and

14 dpc, respectively.

Histopathology and immunohistochemistry

Since HPAIV infections are also characterized by virus infection of the central nervous system, brain samples from one chicken each of group 1 (V1) and 2 (V2) which showed pronounced neurological disorders were subjected to histopathological examination.

AIV antigen was not detected by immunohistochemistry, most likely due to clearance of the virus infection. However, the cerebrum and brain stem showed minimal to moderate meningeal and/or perivascular infiltration by mononuclear immune cells in both animals, partially associated with foci of gliosis (astrocytes and microglia). The lesion were interpreted to be cleared foci of virus replication.

99 Publikationen

Viral shedding after HPAIV H5N1 challenge infection

All non-vaccinated MDA+ control chickens shed HPAIV oropharyngeally (Fig. 5A) as well as

cloacally (Fig. 5B). It is striking that the viral load of the swab samples was higher from animals

that were dead at the time of sampling (red dots) compared to chickens that were alive (black

dots). Accordingly, the quantity of viral RNA in samples from the oldest group (C3) with

mortality of 100 % on 2 dpc was significantly higher than from chickens of group C1 with 7

sampled chickens that were still alive and clinically inconspicuous (Fig. 5A).

Vaccinated chickens shed significantly less virus than their non-vaccinated counterparts (Fig.

5C, D). This difference is especially prominent in group V3, in which oropharyngeal viral

shedding occurred mainly on 2 dpc. On 4 and 7 dpc, only one out of ten chickens of group V3

tested positive for HPAIV H5N1 (10 %) with significantly less viral RNA than was detected in

swabs of chickens of groups V1 and V2, which were all clinical healthy at that time point,

except for one chicken in V1 which was starting to show signs of disease. In the younger

animals, virus shedding was observed in 87.5 % (7/8) and 80 % (8/10) of vaccinated chickens

on 4 dpc. Like in the control groups, animals that died on the day of sampling (red dots) or went

on to develop severe clinical signs (blue dots) displayed a tendency to shed higher amounts of

challenge virus oropharyngeally than chickens that were clinically protected. Cloacal shedding

was observed in all groups at a low level (Fig. 5D), clearly lower than in non-vaccinated MDA+

control chickens (Fig. 5B).

Serology after HPAIV H5N1 challenge infection

All chickens that survived HPAIV challenge infection, exhibited high AIV antibody titers three

weeks after challenge infection (Fig. 1A). Antibody titers varied between 24 to 29 with average

titers of 27.6±2.45, 26.8±178 and 26.4±1.43 for group V1-V3, respectively.

For the vaccinated chicken that displayed neurological disorders in group V1 and was

euthanized 10 dpc, an HI-titer of 28 was determined; no blood was taken from the second

100 Publikationen affected animal. In group V2, the three affected chickens that were euthanized either on 8, 9 or

14 dpc, had AIV HI-titers of 29, 211 and 210, which are even slightly higher than the average titer of the completely protected chickens in this group.

Whereas chickens, vaccinated with a recombinant HA expressing virus only, develop AIV- specific antibodies against H5, AIV infected animals are exposed to all viral antigens and develop a broader range of antibodies, which allows the differentiation of vaccinated from infected animals (DIVA). Sera of ten rNDVsolH5_H5 vaccinated chickens per group taken 21 dpv and sera of all surviving chickens taken 21 dpc were tested for AIV NP-specific antibodies, using a commercial competitive ELISA (cELISA) (Fig. 6). All vaccinated chickens were seronegative for AIV NP antibodies prior to challenge infection. Seroconversion rates after challenge infection differed between groups and were 62.5 % (5/8), 29.4 % (5/17) and 15 %

(3/20) in V1, V2 and V3, respectively (Figure 6). Decreasing seroconversion parallels increasing protection after challenge infection of vaccinated animals.

Discussion

AIV-MDA+ chickens were vaccinated with a Clone 30 based NDV vector, co-expressing the

AIV HA of HPAIV H5N1 (Vietnam) as soluble (solH5) and membrane-bound (H5) proteins, either at one week (V1), two weeks (V2) or three weeks (V3) after hatch. Subsequent homologous HPAIV H5N1 challenge infection followed three weeks later. Dependent on their age and the estimated half-life of 4.2 days of AIV MDA in broiler chickens (15), differences in

MDA levels were observed in AIV-MDA+ chickens before vaccination (Figure 1A). Although no antibodies were detectable anymore in non-vaccinated AIV-MDA+ control chickens at challenge infection when they were four weeks (C1), five weeks (C2) or six weeks (C3) of age, a delay in mortality that was 100 % in all groups, was observed from 6 dpc (C1) to 4 dpc (C2) and 2 dpc (C3), while all MDA negative SPF-chickens succumbed to the infection 2 dpc. Most likely, MDA have declined to levels that were undetectable by HI-assay, but still biologically

101 Publikationen

relevant leading to this delay in onset of mortality as it was already described for chickens with

AIV (H5N1)-MDA, which were not detectable at challenge infection on four weeks after hatch,

also resulting in 100 % mortality 6 dpc (46).

Vaccination with rNDVsolH5_H5 interfered with AIV MDA in the group of one-week-old

chickens (V1), where no endogenous immune response could be noticed 21 dpv (Figure 1A).

However, 40 % survived the HPAIV challenge infection, indicating again that low antibody

titers that cannot be detected by HI-assay, can influence the outcome after challenge infection

which matches results of other investigations (19, 32, 47, 48). The onset of clinical disease in

this group (V1) was observed around 2-6 dpc, which is delayed compared to the unvaccinated

control group 1 (C1), in which onset of clinical signs already took place 1 dpc and which

resulted in 100 % mortality (Figure 3 and 4). The high percentage of dead chickens of group

V1 demonstrate that the HPAI infection in most cases spread faster than the immune system of

the animal was able to induce an immune response, possibly caused by individual differences

of the animals regarding their physical and immunological conditions. However, the difference

in mortality rates and clinical disease between vaccinated (V1) and control (C1) AIV-MDA+

chickens is striking, although in both groups no AIV H5 antibodies were detectable by HI-assay

prior to the challenge infection (Figure 1, 6).

Immunization of two-week-old chickens (V2) resulted in a detectable HI-titer that was slightly

higher than the level of AIV-MDA before vaccination, indicating successful induction of an

anti-H5 immune response, leading to a protection rate of 85 % (Fig. 1A, 4B). The best outcome

was achieved with chickens vaccinated three weeks post hatch (group V3), which were all

protected from a challenge infection with a lethal dose of HPAIV H5N1 (Fig. 4C). At this time

point of vaccination, MDA had declined to a low level and did not influence the immune

response to the vaccine virus (Fig. 1A).

These results confirm that the level of AIV MDA influences the outcome of active

immunization and therefore the protection rate after challenge infection. The protective vaccine

102 Publikationen efficacy behaves inversely to the protective efficacy or level of AIV MDA. However, even an immune response, which is undetectable by HI-assay is able to affect disease progression by delaying mortality in unvaccinated MDA+ chickens (C1) or by conveying protection in vaccinated chickens (V1). Paralleling the protection rate, virus shedding after challenge infection was clearly reduced in oldest vaccinated chickens (V3) in regard to the amount and duration of virus shedding not only compared to the age-matched control chickens (C3) but also to the younger vaccinated chickens of group V1 and V2, demonstrating satisfying protection and strong reduction in virus transmission (Fig. 5C, D).

All surviving chickens were clinically healthy throughout the observation period and yielded high anti-AIV-H5 titers after HPAIV H5N1 challenge infection. NDV specific antibody titers induced by the vector were independent of the presence of AIV MDA and also comparable between the groups, as known for SPF chickens in previous experiments (34, 36) (Fig. 1B).

This result indicates that the replication of the vaccine virus was not affected by AIV-MDA, although H5 is incorporated into the NDV virion (Murr et al, 2020; in submission).

Chickens did not display AIV NP specific immunity after vaccination, whereas the presence of

NP antibodies was verified after challenge infection, confirming the applicability of DIVA strategy (Fig. 6). Seroconversion rates correlated with the observed protection rate. Since a primary immune response requires a longer time to emerge than a secondary booster response, it is reasonable to suggest that protected chickens eliminated HPAIV H5N1 challenge virus faster than the immune system could react to it, as was described before (37).

Our results indicate that an active immunization of AIV-MDA+ chickens is not recommendable at an age younger than 14 days. Although 100 % protection was not achieved in the vaccinated two-week-old group (V2), no acute disease pattern was observed as it was in youngest chickens

(V1). The three sick animals in V2 together with two affected animals in V1 showed neurological disorders (discoordination in movements, torticollis and partial paralysis) which appeared between 5-10 dpc when almost all acutely diseased animals were already dead.

103 Publikationen

Histopathology and immunohistochemistry revealed pathological changes in the cerebrum and

brain stem of affected animals, indicating an incursion of HPAIV into the central nervous

system. However, the infection could be cleared by the immune system since AIV antigen was

not detected in the brains samples and oropharyngeal and cloacal swabs were negative for

challenge virus at that time point. However, the damage to the brain apparently resulted in the

described clinical outcome.

The vaccination time point of 14 days after hatch seems to be crucial, since it was observed that

protection by AIV-MDA decreases strongly between day 7 and 14 after hatch. A homologous

challenge infection in chickens with MDA to AIV H5N2 resulted in 100 % protection on day 3

after hatch, when chickens still displayed HI-titers of 26 and in 90 % protection on day 10 after

hatch with HI-titers dropped to 24 (12). Only 9.4 % chickens that possessed MDA to a

recombinant H5N7 with HI-titers between 0 and 26, survived after a homologous challenge

infection on day 14 after hatch (14).

Dependent on the vaccine virus, inconsistent results are presented in other studies in younger

chickens. A prime-boost-vaccination with an inactivated H5N1 influenza vaccine, first in one-

week-old, and subsequently five-week-old AIV-MDA+ chickens resulted in only 88 %

protection (13). A more promising approach used immunization in one-day-old AIV-MDA+

chickens with a recombinant turkey herpesvirus (HVT)-H5 vector vaccine, followed by

vaccination with an inactivated H5N1 influenza vaccine on day 8, leading to 90 % protection

after challenge on day 35 of age (49). A fowl pox virus vector vaccine provided similar results

(46). Lardinois et al. (2016) reported about a NDV LaSota derived H5 expressing vector, that

conveyed only 25 % protection after a prime-boost oculonasal vaccination in one-day-old, and

subsequently two-week-old chickens, that had AIV-MDA to H5N1 (19). Protective efficacy

could be increased by passively transferred H5N9 antibodies, which mimic MDA and presented

only 80 % HA similarity to the AIV HA of H5N1 containing vaccine virus in 8-day-old-

chickens (18). A recent publication reported that NDV-H5 did not convey sufficient protection

104 Publikationen in AIV MDA+ one-day-old chickens, whereas HVT-H5 did. In contrast, 3-weeks-old chickens were better protected by these two investigated vaccine viruses (HVT-H5, NDV-H5) than younger ones (17). These results indicate that the chance to successfully vaccinate AIV-MDA+ chickens rises with increasing age, demonstrated by the 100 % protection that was achieved in the present study in 3-week-old AIV-MDA+ chickens by an HA-overexpressing vaccine virus.

It has been argued that the immune organs and functions of the embryo and the newly hatched chickens are not entirely developed since secondary immune organs still undergo structural organization, and vaccination immediately after hatch would not activate B-cell responses properly. It was shown that vaccination after hatch lead to lower antibody titers compared to a vaccination that is performed 14 days after hatch (50). However, NDV vector specific immune reaction was similar at 21 dpv in all groups, indicating that the development of the immune system does not influence the immune response from one week after hatch.

However, only little is known about the mechanism of interference of AIV-MDA with AIV-

HA expressing live vaccine viruses that are applied by the oculonasal route. MDA may neutralize NDV by binding and preventing attachment of the virus to the host cell. However,

MDA comprises about 30 % of Immunoglobulin (Ig) Y and only 1 % of IgM and IgA that are present in the hen’s plasma and transferred over the yolk sac to the offspring as shown for NDV and infectious bronchitis virus (51). It is assumed that only small amounts of IgY transudates from the serum onto mucosal surfaces of the upper respiratory tract which could be part of the neutralizing response (52, 53, 54, 55). The virus shedding data gathered after immunization supports the assumption that MDA do not directly, or only partially, neutralize the virus particle, because replication of vaccine virus was observed until 7 dpv and even 10 dpv in oropharyngeal swabs of the youngest chickens (Figure 2A). Accordingly, viral RNA from the inserted AIV H5 could be detected in oropharyngeal swabs until 10 dpv in all groups (Figure

2B). Additionally, all vaccinated chickens seroconverted towards an NDV immunity 21 dpv,

105 Publikationen

displaying NDV-specific HI-titers that were similar in all groups independent of the AIV-MDA

status (Figure 1B). It is most likely that interference takes place between AIV-MDA and the

AIV-HA antigen.

Immunizations using trimeric soluble AIV-HA antigens were proven to be efficacious (56, 57,

58), confirming the immunogenic potential of soluble proteins. It was hypothesized that the

soluble HA protein expressed by recombinant vaccine virus rNDVsolH5_H5 reaches the

vascular system straight after infection of epithelial cells and the beginning of protein

expression, where it neutralizes AIV-MDA or gets taken up by phagocytosing cells. In parallel,

vaccine virus particles would be able to replicate and express immune response triggering

antigens. However, the relative contribution of the soluble H5 to the immune response in

vaccinated chickens has not been further investigated, yet.

In summary, vaccination of three-weeks-old AIV-MDA+ chickens with a NDV vector co-

expressing soluble and membrane bound AIV H5 resulted in 100 % protection from a lethal

HPAIV H5N1 infection three weeks after vaccination. High MDA level in younger chickens

interfere with the antigen, caused by an unknown mechanism which is not affecting viral

vaccine replication, as shedding and serological data gathered after immunization indicate

sufficient replication of the vaccine virus leading to the assumption of an antigen-specific block

in AIV-MDA+.

Thus, our protocol should be applicable for vaccination under circumstances of high levels of

MDA in chicken populations e.g. in countries extensively practicing vaccination and/or

harbouring endemically circulating virus.

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Acknowledgement

We like to thank Martina Lange, Diana Parlow and Cornelia Illing for excellent technical

assistance, Olayinka Asala and all animal care takers of the FLI Riems for their support during

the animal trial. This work was funded in parts by MSD Animal Health.

Figure legends

Figure 1: Serology by HI-assay. AIV-MDA+ chickens were vaccinated with rNDVsolH5_H5,

either one week (V1), two weeks (V2) or three weeks (V3) of age, and challenge infection was

carried out with HPAIV H5N1 Vietnam three weeks later. A) Serum samples of ten chickens

per group were collected to determine AIV-H5 specific MDA prior to vaccination (0 dpv), and

AIV-H5 seroconversion prior to challenge infection (21 dpv). Serum from all surviving

chickens were tested for AIV-H5 specific antibodies at the end of the trial (21 dpc). B) Serum

samples of ten chickens per group were collected to determine NDV specific antibodies prior

(0 dpv), and after vaccination (21 dpv).

The arithmetic mean and standard deviation are shown. The number of seropositive chickens

(HI-titer > 23) referred to the number of tested chickens is shown. Numbers above datasets

indicate significant differences between respective groups on the same day. The significance

114 Publikationen level (P value) are indicated as * (0.01-0.05), ** (0.001-0.01), *** (0.0001-0.001) and **** (<

0.0001).

Figure 2: Virus shedding after vaccination. Oropharyngeal swab samples of AIV-MDA+ chickens, vaccinated with rNDVsolH5_H5 at either one week (V1), two weeks (V2) or three weeks (V3) of age, were collected at indicated days after vaccination (dpv) and analyzed by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) to detect NDV NP gene specific RNA. Values were transformed to genome equivalents (GEQ) using calibration curves of defined RNA standards that were included with each RT-qPCR run. The number of positive swabs by RT-qPCR is shown below the datasets. Numbers above datasets indicate significant differences between respective groups at the same day. The significance level (P value) are indicated as * (0.01-

0.05), ** (0.001-0.01), *** (0.0001-0.001) and **** (< 0.0001).

Figure 3: Clinical course after HPAIV H5N1 Vietnam infection of non-vaccinated AIV-

MDA+ chickens. Non-vaccinated AIV-MDA+ (black) and SPF (red) chickens were infected with HPAIV H5N1 at an age of four weeks (C1), five weeks (C2), or six weeks (C3), respectively. Clinical signs were scored daily as 0 (healthy), 1 (slightly sick), 2 (severely sick) and 3 (dead) over a period of 14 days. The clinical score, representing the total score, referred to the number of animals and number of observation days, is given.

Figure 4: Clinical course after HPAIV H5N1 Vietnam infection of vaccinated AIV-MDA+ chickens. AIV-MDA+ chickens were vaccinated with rNDVsolH5_H5 either at one week

(V1), two weeks (V2) or three weeks (V3) of age, and challenged with HPAIV H5N1 Vietnam three weeks later at an respective age of four, five, or six weeks. Clinical signs were scored daily as 0 (healthy), 1 (slightly sick), 2 (severely sick) and 3 (dead) over a period of 14 days.

115 Publikationen

The clinical score, representing the total score, referred to the number of animals and number

of observation days, is given.

Figure 5: Virus shedding of vaccinated and unvaccinated AIV-MDA+ chickens after

HPAIV H5N1 challenge infection. AIV-MDA+ chickens were rNDVsolH5_H5 vaccinated

either at one week (V1), two weeks (V2) or three weeks (V3) of age and together with

unvaccinated AIV-MDA+ and SPF control chickens (C1-C3) challenged with HPAIV H5N1

Vietnam three weeks later at an respective age of four, five and six weeks. Oropharyngeal (A,

C) and cloacal (B, D) swab samples of non-vaccinated (A, B) and vaccinated (C, D) AIV-

MDA+ chickens were collected at indicated days after challenge infection. Chickens were

either alive (black dots), still alive but died later (blue dots) or already dead (red dots) while

swabbing. Samples were analyzed by quantitative real-time PCR (RT-qPCR) to detect AIV M

gene specific RNA. Values were transformed to genome equivalents (GEQ) using calibration

curves of defined RNA standards that were included with each RT-qPCR run. The number of

positive swabs by RT-qPCR is shown below the datasets. Numbers above datasets indicate

significant differences between respective groups at the same day. The significance level (P

value) are indicated as * (0.01-0.05), ** (0.001-0.01), *** (0.0001-0.001) and **** (< 0.0001).

Figure 6: Serology by competitive ELISA. AIV-MDA+ chickens were vaccinated with

rNDVsolH5_H5 either one week (V1), two weeks (V2) or three weeks (V3) of age and

challenged with HPAIV H5N1 Vietnam three weeks later. In order to apply the DIVA

(Differentiation between vaccinated and infected animals)-strategy, serum samples of ten

chickens of each group were collected to determine AIV-NP antibodies after vaccination (21

dpv) and AIV-NP seroconversion after challenge infection (21 dpc). Number of seropositive

chickens (ratio of sample/negative control < 0.6) in reference to the total number of tested

chickens is shown.

116 Publikationen

117 Publikationen

118 Publikationen

119 Publikationen

120 Publikationen

121 Publikationen

122 Publikationen

6.3 A novel recombinant Newcastle disease virus vectored DIVA vaccine against peste des petits ruminants in goats

123 Publikationen

124 Publikationen

125 Publikationen

126 Publikationen

127 Publikationen

128 Publikationen

129 Publikationen

130 Publikationen

131 Publikationen

132 Publikationen

133 Publikationen

134 Publikationen

135 Publikationen

136 Publikationen

137 Publikationen

138 Publikationen

139 Publikationen

140 Publikationen

141 Publikationen

142 Publikationen

143 Publikationen

144 Publikationen

145 Publikationen

146 Publikationen

147 Publikationen

148 Publikationen

6.4 W protein expression by Newcastle disease virus

149 Publikationen

150 Publikationen

151 Publikationen

152 Publikationen

153 Publikationen

154 Publikationen

155 Publikationen

156 Publikationen

157 Publikationen

158 Publikationen

159

7 Eigenanteil an den zur Dissertation eingereichten Publikationen

Coexpression of soluble and membrane bound AIV H5 by recombinant NDV leads to an increase in antigen levels M. Murr, A. Karger, C. Steglich, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer

Mein Eigenanteil an der Publikation besteht aus der Generierung der NDV-Rekombinanten rNDVsolH5 und rNDVsolH5_H5 und deren Charakterisierung. Im Einzelnen wurden dazu die Virusanzucht und –passage in embryonierten Hühnereiern (ECE), Replikationskinetiken in ECE und in Zellkultur, Western Blot-Analysen der Zellkulturproben und gereinigter Virionen, sowie konfokalmikroskopische Präparate dieser und zum Vergleich herangezogener Virusrekombinanten (rNDVsolH5, rNDVsolH5_H5, rNDV, rNDVH5) angefertigt und ausgewertet. Die Erstfassung des Manuskriptes (außer des Massenspektrometrieteils) und die Abbildungen 1-4 wurden von mir erstellt, die dazugehörigen statistischen Berechnungen durchgeführt und gemeinsam mit den Ko-Autoren finalisiert.

Protection of chickens with maternal immunity against avian influenza virus (AIV) by vaccination with a novel recombinant Newcastle disease virus vector M. Murr, C. Grund, A. Breithaupt, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer

Die Planung und Durchführung des Tierversuchs habe ich gemeinsam mit PD Dr. Grund vorgenommen. Dabei war ich maßgeblich bei der Überwachung des Schlupfs der Tiere, an der Virusinokulation, an den Krankheitsverlaufskontrollen, sowie der Entnahme von Tupferproben beteiligt. Die sich anschließende Probenbearbeitung und Auswertung, d. h. RNA-Extraktion aus Tupferproben, Durchführung der RT-qPCR, der ELISA und des Hämagglutinationshemmtestes wurde von mir durchgeführt. Ich habe alle Abbildungen der Publikation erstellt, sowie die dazugehörigen statistischen Analysen vorgenommen. Die Erstfassung des Manuskriptes wurde von mir erstellt und gemeinsam mit den Ko-Autoren finalisiert.

160 Eigenanteil an den zur Dissertation eingereichten Publikationen

A novel recombinant Newcastle disease virus vectored DIVA vaccine against peste des petits ruminants in goats M. Murr, B. Hoffmann, C. Grund, A. Römer-Oberdörfer, T. C. Mettenleiter

Ich habe die NDV-Rekombinante rNDV_HKur generiert, sowie die in vitro-Charakterisierung (Replikationskinetiken, Western Blot-Analysen, Konfokalmikroskopie) der

Virusrekombinanten rNDV und rNDV_HKur durchgeführt und ausgewertet. Zusätzlich zur

Charakterisierung des rNDV_HKur habe ich die Passage in der Zellkultur und die Analysen zur Thermostabilität vorgenommen. Der Tierversuch wurde gemeinsam von Dr. Bernd Hoffmann und mir geplant (inklusive des Tierversuchsantrages) und durchgeführt. Dabei war ich an der Erkrankungsverlaufskontrolle und der Probennahme beteiligt. Die folgende Bearbeitung und Analyse der Proben, d. h. die RNA-Extraktion aus Blut, Tupferproben und Organen, die Durchführung der RT-qPCR, die Durchführung der ELISA und des Virusneutralisationstestes wurde von mir durchgeführt. Ich habe alle Abbildungen der Publikation erstellt, sowie die dafür notwendigen statistischen Analysen vorgenommen. Die Erstfassung des Manuskriptes habe ich geschrieben und gemeinsam mit den Ko-Autoren finalisiert und als korrespondierender Autor eingereicht.

W protein expression by Newcastle disease virus J. Karsunke, S. Heiden, M. Murr, A. Karger, K. Franzke, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer

Für dieses Manuskript habe ich die Virusreinigung der NDV-Rekombinanten rNDVW-NLSmut und die anschließenden Western Blot-Analysen vorgenommen. An der Finalisierung des Manuskriptes war ich beteiligt.

______Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter Dr. Angela Römer-Oberdörfer

______Magdalena Murr

161

8 Anhang

Publikationen

Coexpression of soluble and membrane bound AIV H5 by recombinant NDV leads to an increase in antigen levels M. Murr, A. Karger, C. Steglich, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer Publiziert in: Journal of General Virology [121]

A novel recombinant Newcastle disease virus vectored DIVA vaccine against peste des petits ruminants in goats M. Murr, B. Hoffmann, C. Grund, A. Römer-Oberdörfer, T. C. Mettenleiter Eingereicht am 30.03.2020 in: Vaccines (accepted; 24.04.2020)

W protein expression by Newcastle disease virus J. Karsunke, S. Heiden, M. Murr, A. Karger, K. Franzke, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer Publiziert in: Virus Research [72]

162 Anhang

Tagungsbeiträge

27th Annual Meeting of the Society for Virology 22.03. – 25.03.2017, Marburg, Deutschland, Poster “Generation of recombinant Newcastle disease virus expressing Peste des petits ruminants virus surface glycoproteins” M. Murr, B. Hoffmann, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer

6th FLI Junior Scientist Symposium 20.09. – 22.09.2017, Braunschweig, Deutschland, Vortrag “Recombinant Newcastle disease virus expressing Peste des petits ruminants virus surface glycoproteins a potential vaccine virus?” M. Murr, B. Hoffmann, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer

2nd Paramyxovirus-Meeting 18.03. – 19.03.2019, Langen, Deutschland, Vortrag “Newcastle disease virus as vector virus” M. Murr, J. Veits, C. Steglich, C. Grund, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer

Viruses 2020 - Novel Concepts in Virology 05.02. – 07.02.2020, Barcelona, Spanien, Poster “Protection of chickens with maternal avian influenza virus (AIV) immunity after vaccination with a recombinant AIV Newcastle disease vector” M. Murr, C. Grund, A. Karger, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer

3nd Paramyxovirus-Meeting 23.03. – 24.03.2020, Greifswald-Insel Riems, Deutschland, Vortrag “Protection of chickens with maternal avian influenza virus (AIV) immunity after vaccination with a recombinant AIV-Newcastle disease vector” M. Murr, C. Grund, A. Karger, T. C. Mettenleiter, A. Römer-Oberdörfer (Verschoben aufgrund der Covid-19-Pandemie)

163 Anhang

30th Annual Meeting of the Society for Virology 25.03. – 27.03.2020, Berlin, Deutschland, Vortrag “Towards the next epizootic disease eradication: Protective efficacy of recombinant Newcastle disease virus (NDV) expressing the surface hemagglutinin protein of small ruminant morbillivirus (SRMV)” M. Murr, B. Hoffmann, C. Grund, A. Römer-Oberdörfer, T. C. Mettenleiter (Verschoben aufgrund der Covid-19-Pandemie)

164 Anhang

Eigenständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch- Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Greifswald noch einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde. Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen als die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.

______Magdalena Murr

165 Anhang

Danksagung

„Ein guter Anfang braucht Begeisterung, ein gutes Ende Disziplin.“ – Hans-Jürgen Quadbeck-Seeger in: „Der Wechsel allein ist das Beständige“, 2002

Nachdem ich vor dreieinhalb Jahren die Arbeit im Rahmen meiner Dissertation aufgenommen habe, bin ich nun sehr stolz diese zu Ende zu bringen. Ich möchte jedoch all diejenigen Menschen nicht vergessen, ohne die meine Doktorarbeit nicht möglich gewesen wäre.

Mein besonderer Dank geht an meinen Doktorvater Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Thomas C. Mettenleiter für die Möglichkeit meine Doktorarbeit am Friedrich-Loeffler-Institut anfertigen zu können sowie für die hervorragende Betreuung und Unterstützung bei der Umsetzung der gesamten Arbeit. Du hast stets ein offenes Ohr für mich und stehst mir mit gutem Rat und Tat zur Seite, hab‘ vielen Dank!

Ein ganz besonderer Dank geht außerdem an Frau Dr. Angela Römer-Oberdörfer, die mich in die Welt der NDV eingeführt hat und meine Arbeit mit viel Engagement und Geduld betreut hat. Vielen Dank für die enorme Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit, die Hilfestellungen, die schnellen Korrekturen, die kritischen und die lieben Worte. Du hast mich gefördert und gefordert, Dich für mich und mit mir gefreut und ich danke Dir dafür!

Frau Martina Lange möchte ich sehr herzlich für die gute Zusammenarbeit im Labor bedanken. Wir haben viel zusammen gelacht und auch geschimpft und besonders in der letzten Zeit hast Du mir viel Stress vom Hals gehalten. Es ist wahrlich ein Segen Dich im Labor zu haben.

Ein ganz liebes Dankeschön geht an meine ehemalige Laborkolleginnen Constanze und Julia, die mich besonders in der Anfangsphase meiner Dissertation begleitet und mich immer unterstützt haben.

Ich danke PD Dr. Christian Grund für sein Engagement mich in die tierexperimentelle Arbeit einzuführen und die ND/Influenza-Tierversuche zu begleiten. Unsere lustigen und hoch philosophischen Mittagspausen sind unvergessen!

166 Anhang

Ich danke Dr. Bernd Hoffmann dafür, dass er mich vorübergehend in seinem Labor aufgenommen hat, mir die Durchführung des PPR-Tierversuches ermöglicht und diesen so engagiert geleitet hat.

Außerdem möchte ich mich bei allen Mitarbeitern und Mitarbeiterinnen des FLI bedanken, die mich unterstützt haben und zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Allen voran Prof. Timm Harder für seine Bereitschaft mich in seinem Labor während der Tierversuche arbeiten zu lassen sowie seine Unterstützung bei allmöglichen Fragen und Problemen, Dr. Axel Karger, der viel Arbeit und Zeit in die massenspektrometrischen Analysen gesteckt hat sowie allen Tierpflegern für ihre Unterstützung während der Tierversuche.

Ein ganz lieber Dank geht außerdem an Conny, Annika, Diana und Claudia für die vielen schönen Momente abseits der Werkbank.

Zu guter Letzt geht mein Dank an meine Freunde, meine Familie und meinen Partner, die meine Motivation und mein Antrieb sind.

167