Estudo Metagenômico De Arbovírus E Outros Vírus De Rna De Vertebrados Em Roedores E Marsupiais Procedentes Do Município De Viseu, No Estado Do Pará-Brasil

INSTITUTO EVANDRO CHAGAS NÚCLEO DE ENSINO E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM VIROLOGIA

NELIELMA GARCIA DE OLIVEIRA PRESTES

ESTUDO METAGENÔMICO DE ARBOVÍRUS E OUTROS VÍRUS DE RNA DE VERTEBRADOS EM ROEDORES E MARSUPIAIS PROCEDENTES DO MUNICÍPIO DE VISEU, NO ESTADO DO PARÁ-BRASIL

Ananindeua 2019

NELIELMA GARCIA DE OLIVEIRA PRESTES

ESTUDO METAGENÔMICO DE ARBOVÍRUS E OUTROS VÍRUS DE RNA DE VERTEBRADOS EM ROEDORES E MARSUPIAIS PROCEDENTES DO MUNICÍPIO DE VISEU, NO ESTADO DO PARÁ-BRASIL

Dissertação apresentada para obtenção de grau de Mestre em Virologia pelo Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas

Área de concentração: Biologia de Agravos por Agentes Virais na Amazônia

Orientadora: Profª. Drª. Ana Cecilia Ribeiro Cruz Coorientador: Prof. Dr. Sandro Patroca da Silva

Ananindeua 2019

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca do Instituto Evandro Chagas

Prestes, Nelielma Garcia de Oliveira. Estudo metagenômico de arbovírus e outros vírus de RNA de vertebrados em roedores e marsupiais procedentes do município de Viseu no Estado do Pará- Brasil. / Nelielma Garcia de Oliveira Prestes. – Ananindeua, 2019. 88 f.: il.; 30 cm

Orientadora: Dra. Ana Cecília Ribeiro Cruz Coorientador: Dr. Sandro Patroca da Silva Dissertação (Mestrado em Virologia) – Instituto Evandro Chagas, Programa de Pós-Graduação em Virologia, 2019.

1. Metagenômica viral. 2. Vírus de RNA. 3. Arbovírus. 4. Hepacivírus. I. Cruz, Ana Cecília Ribeiro, orient . II. Silva, Sandro Patroca da, coorient. III. Instituto Evandro Chagas. IV. Título.

CDD: 579.2562

NELIELMA GARCIA DE OLIVEIRA PRESTES

ESTUDO METAGENÔMICO DE ARBOVÍRUS E OUTROS VÍRUS DE RNA DE VERTEBRADOS EM ROEDORES E MARSUPIAIS PROCEDENTES DO MUNICÍPIO DE VISEU, NO ESTADO DO PARÁ-BRASIL

Dissertação apresentada para obtenção de grau de Mestre em Virologia pelo Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas

Área de concentração: Biologia de Agravos por Agentes Virais na Amazônia

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

Dr. Rommel Thiago Juca Ramos Universidade Federal do Pará

Drª. Lívia Carício Martins Instituto Evandro Chagas

Drª. Flávia Barreto dos Santos Instituto Oswaldo Cruz

Dr. Samir Mansour Mores Casseb (Suplente) Instituto Evandro Chagas

Dedico este trabalho aos dois homens da minha vida. Meu esposo Edbruno Prestes por sua compreensão, amor e companheirismo e ao meu filho Benjamim Prestes que chegou a este mundo para completar a Graça de Deus em nossas vidas.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar ao Senhor Deus todo poderoso por permitir minha vivência neste mundo abençoado, por estar realizando grandes projetos em minha vida e por sempre estar conduzindo meus passos para crescer na fé.

A minha orientadora Profa. Dra. Ana Cecília por todos os ensinamentos, paciência, orientação, apoio e por acreditar na minha capacidade profissional em conduzir esse projeto até o fim. Além de ser uma pessoa ótima, de grande coração e de vasto conhecimento.

Ao meu co-orientador Dr. Sandro Patroca por sua incrível paciência, apoio e por seu vasto conhecimento transmitido com muita satisfação e de várias formas possíveis para melhor compreensão de minha parte e pela sua imensa dedicação em passar seus ensinamentos em biologia molecular e bioinformática.

Ao meu esposo Edbruno Prestes pela sua paciência em mais essa etapa que passamos juntos, pelo seu companheirismo, cumplicidade, amorosidade e por sempre está ali para ouvir minhas queixas e me aconchegar em todos os momentos. Além de me apoiar e dar forças em tudo o que faço e ter sempre um sorriso e uma palavra confortadora nos momentos difíceis que passamos.

Mesmo ainda muito bebê, ao meu filho Benjamim Prestes pelo momento único e abençoado que ele está me fazendo passar e sentir.

Aos meus pais Leomário e Nelia por estarem ao meu lado nesse momento importante e incrível que estou vivendo e pelo apoio em minhas escolhas profissionais e a todos os meus irmãos que também nos bastidores torcem pela minha felicidade.

As minhas colegas Andressa Aragão e Camila Braga por me deixarem acompanhar suas análises para aprender as técnicas necessárias. Além, é claro de muitos risos e papos descontraídos. Em especial a Andressa por ter separado um espaço em seu tempo para me ajudar em uma parte das análises.

Ao Laboratório do Centro de Genômica e Biologia de Sistemas da Universidade Federal do Pará pela parceria e colaboração para esta pesquisa (Dr. Rommel Ramos).

À CAPES e ao Instituto Evandro Chagas pelo fornecimento de subsídios financeiros necessários para realizar essa pesquisa;

Ao Programa de Pós-Graduação em Virologia do Instituto Evandro Chagas

“Paciência vale mais que valentia, e dominar a si mesmo vale mais que conquistar uma cidade”

Provérbios 16, 32.

RESUMO

A metodologia metagenômica está em crescente desenvolvimento para a identificação de genomas virais, caracterizando as informações biológicas desses agentes sem necessidade de isolamento e cultivo em laboratório com o auxílio de tecnologias avançadas para a geração e processamento de milhões de leituras. Neste contexto propõe-se investigar a presença de arbovírus e outros vírus de RNA de vertebrados em roedores e marsupiais procedentes do município de Viseu, no Estado do Pará-Brasil. Um total de 10 amostras (fígado, vísceras e cérebro) de roedores e marsupiais foram submetidos a extração e purificação de RNA, síntese do DNA complementar (cDNA), sequenciamento através da tecnologia Illumina NextSeq e análise bioinformática. No geral os gêneros virais detectados neste trabalho foram: Ortobunyavirus, Hepacivirus, Gammaretrovirus, Betaretrovirus, Epsilonretrovirus, Alpharetrovirus, Pestivirus, Parapoxivirus, Amdoparvovirus , além de vírus de RNA não classificados em nenhum dos gêneros conhecidos. Este estudo apresentou diversidades de agentes virais, com predominância de gêneros da família Retroviridae e dessas detecções apenas o vírus Caraparu (CARV) membro do gênero Ortobunyavirus representa risco a saúde humana. A análise filogenética para os hepacivírus (Hepacivirus de roedor e Hepacivirus F ) detectados neste estudo, apresentaram similaridade com o Rodent Hepacivirus isolado do roedor da espécie Proechimys simispinosus , agrupando-se no mesmo clado. Os domínios da poliproteína apresentaram semelhança com os Hepacivirus nas regiões que codificam proteínas estruturais (Core e Env.), não estruturais (NS2, NS4b, NS5a_1a e NS5a_1b), com uma estrutura da peptidase (S29) responsável pela clivagem das proteínas estruturais e com um domínio que corresponde a família Flaviviriade (Flavi_DEAD). Diante disso, os achados deste estudo podem contribuir para o conhecimento científico sobre as comunidades virais que circulam em pequenos animais (roedores e marsupiais) nas proximidades da cidade de Viseu, mesmo que muitos deles não sejam nocivos para a saúde humana. Com isso, estudos contínuos nesses e em outros mamíferos devem ser realizados para obter informações das espécies virais circulantes e de possíveis novas descobertas de vírus e fontes de infecções zoonóticas, nessa e em outras regiões da Amazônia brasileira. Palavras-chave : Metagenômica viral; vírus de RNA; Arbovírus; Hepacivirus.

ABSTRACT

The metagenomics methodology is under development for the identification of viral genomes, characterizing the biological information of these agents without the need for isolation and cultivation in laboratory with the aid of advanced technologies for the generation and processing of millions of readings. In this context it is proposed to investigate the presence of arboviruses and other RNA viruses from vertebrates in rodents and marsupials coming from the city of Viseu, Para - Brazil. A total of 10 rodent and marsupial samples (liver, viscera and brain) were submitted to RNA extraction and purification, complementary DNA (cDNA) synthesis, sequencing by Illumina NextSeq and bioinformatic analysis. Primarily, the viral genera detected in this work were: Ortobunyavirus, Hepacivirus, Gammaretrovirus, Betaretrovirus, Epsilonretrovirus, Alpharetrovirus, Pestivirus, Parapoxivirus, Amdoparvovirus , and RNA viruses not classified in any of the known genera. This study presented viral agents diversity, with predominance of genera of the Retroviridae family and from these detections only the Caraparu virus (CARV ) member of the genus Ortobunyavirus poses a risk to human health. Phylogenetic analysis for hepacivirus (Rodent Hepacivirus and Hepacivirus F ) detected in this study, showed similarity with Rodent Hepacivirus isolated from rodent species Proechimys simispinosus , grouping in the same clade. The polyprotein domains were similar to Hepaciviruses in regions encoding structural (Core and Env), Nonstructural (NS2, NS4b, NS5a_1a and NS5a_1b) proteins, with a peptidase structure (S29) responsible for the cleavage of structural proteins and with a domain that corresponds to the Flaviviridae family (Flavi_DEAD). Thus, the findings of this study may contribute to the scientific knowledge about the viral communities that circulate in small animals (rodents and marsupials) near the city of Viseu, even though many of them are not harmful to human health. Therefore, ongoing studies on these and other mammals should be performed to obtain information on circulating viral species and possible new discoveries of viruses and sources of zoonotic infections in this and other regions of the Brazilian Amazon. Keywords : Viral metagenomics; RNA virus; Arbovirus; Hepacivirus.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ASFV – vírus Africano Suíno SLEV – vírus da Encefalite Saint Loius

BSQV – vírus Bussuquara SNG – sequenciamento de nova geração

BTV – vírus da Língua Azul SVS – Secretaria de Vigilância em Saúde

CARV – vírus Carajás EEEV – vírus da Encefalomielite Equina Leste CARV – vírus Caraparu VEEV – vírus da Encefalomielite Equina CHIKV – vírus Chikungunya Venezuelana

CHPV – vírus Chandipura VMUC – vírus Mucambo

COCV – vírus Cocal VSAV – vírus da Estomatite Vesicular CPCV – vírus Cacipacoré Alagoas

DENV – vírus Dengue VSIV – vírus da Estomatite Vesicular Indiana DNA – ácido desoxirribonucleico VSNJV – vírus da Estomatite Vesicular HFV – Hepacivirus F Nova Jersey

IEC – Instituto Evandro Chagas WEEV – vírus da Encefalomielite Equina Oeste ILHV – vírus Ilheus WNV – vírus do Nilo ocidental ISFV – vírus Isfahan YFV – vírus da Febre Amarela JEV – vírus da Encefalite Japonesa ZIKV – vírus Zika MARV – vírus Marabá

MAYV – vírus Mayaro ONNV – vírus O’nyong-nyong

OROV – vírus Oropouche

PIRYV – vírus Piry

RHV – Hepacivirus de roedor

RNA – Ácido ribonucleico

ROCV – vírus Rocio rRNA – RNA ribossomal

RRV – vírus Ross river

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ...... 11 2 OBJETIVOS ...... 13 2.1 GERAL ...... 13 2.2 ESPECIFICOS ...... 13 3 JUSTIFICATIVA ...... 14 4 REVISÃO DA LITERATURA ...... 16 4.1 ARBOVÍRUS ...... 16 4.1.1 Família Togaviridae ...... 17 4.1.2 Família Flaviviridae ...... 20 4.1.3 Ordem Bunyavirales** ...... 22 4.1.4 Família Reoviridae ...... 24 4.1.4 Família Rhabdoviridae ...... 26 4.2 TRANSMISSÃO DOS ARBOVIRUS ...... 27 4.3 ESTUDOS DE ARBOVIRUS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA...... 28 4.4 ECOLOGIA DE OUTROS VÍRUS DE RNA QUE INFECTAM PEQUENOS MAMÍFEROS ... 30 4.5 METAGENÔMICA ...... 32 5 MATERIAL E MÉTODOS ...... 37 5.1 LOCAL DE ESTUDO ...... 37 5.2 ASPECTOS ÉTICOS ...... 37 5.3 AMOSTRAGEM ...... 38 5.3.1 Coleta dos espécimes biológicos ...... 38 5.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS ...... 39 5.4.1 Extração, purificação e qualidade do RNA ...... 39 5.4.2 Síntese do DNA complementar (cDNA) ...... 40 5.4.3 Sequenciamento ...... 40 5.5 BIOINFORMÁTICA ...... 40 5.5.1 Pré-processamento dos Dados Brutos ...... 40 5.5.2 Montagem De Novo ...... 41 5.5.3 Curadoria e Análise filogenética ...... 41 5.5.4 FastViromeExplorer ...... 43 6 RESULTADOS ...... 44 6.1 PROCESSAMENTO DOS DADOS ...... 44 6.2 REPRESENTAÇÃO TAXONÔMICA DOS VIRUS DETECTADOS ...... 47 6.2.1 Gêneros virais ...... 47

6.2.2 Espécies virais ...... 50 6.2.3 Análise filogenética dos hepacivírus detectados ...... 50 6.2.4 Famílias virais detectadas pelo FastViromeExplorer ...... 52 7 DISCUSSÃO ...... 53 8 CONCLUSÃO ...... 58 REFERÊNCIAS ...... 60 APÊNDICE A – Gráficos de classificação taxonômica gerados pelo FastViromeExplorer das amostras MA7049-Fígado, MA7050-Fígado, MA7053-Fígado e Vísceras, MA7054-Fígado e Vísceras, RO22799-Fígado e Vísceras, RO22876-Cérebro e RO22878-Cérebro ...... 74 ANEXO A – Gráficos gerados pelo Megan após análise pelo Diamond (Blastx) dos arquivos brutos (R1 e R2) das amostras MA7049-Fígado, MA7050-Fígado, MA7053-Fígado e Vísceras, MA7054- Fígado e Vísceras, RO22799-Fígado e Vísceras, RO22876-Cérebro e RO22878-Cérebro...... 77 ANEXO B – Gráficos gerados pelo Megan pós-montagem de novo através dos programas SPAdes e IDBA-UD das amostras MA7053-Fígado e Vísceras, MA7054-Fígado e Vísceras, RO22799-Fígado e Vísceras, RO22876-Cérebro e RO22878-Cérebro...... 82 ANEXO C – Certificado de aprovação do CEUA para manipulação de material biológico armazenado ...... 88

1 INTRODUÇÃO As doenças infecciosas diferenciam-se de outras doenças humanas por apresentarem características particulares que as tornam grandes desafios para saúde pública, como o seu caráter repentino e explosivo a nível global, as diversas formas de transmissão, a relação restrita com ecossistemas, o comportamento humano e a capacidade de prevenção, controle e erradicação (FAUCI; MORENS, 2012). Muitas dessas doenças infecciosas que acometem os seres humanos têm origem zoonótica e a maioria delas é mantida em natureza em ciclos envolvendo um vetor artrópode e um animal vertebrado não humano (NORRIS, 2004). As arboviroses são exemplos clássicos de zoonoses que se mantêm em ciclos silvestres e são geograficamente distribuídas em todos os continentes (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1997). No Brasil, especialmente a Região Amazônica apresenta condições climáticas propícias para a manutenção de muitos arbovírus devido à grande diversidade de fauna e flora, com abundante variedade de dípteros hematófagos e animais vertebrados silvestres coabitando nesse ecossistema. Nesse âmbito a ocupação e exploração desordenada da Amazônia Legal tem ocasionado um grande aumento no desmatamento e desequilíbrio de seu ecossistema, o que pode contribuir para o aparecimento de maior número de doenças silvestres de importância à saúde pública e veterinária (VASCONCELOS et al., 2001). Apesar da dificuldade da realização de estudos utilizando técnicas de sequenciamento de nova geração, este método possui características que o leva a ser mais rápido, preciso e seguro para a detecção de uma ampla diversidade de genomas virais em amostras biológicas procedentes de uma variedade de espécies de vertebrados, invertebrados e até do próprio ambiente (água e solo) que podem ser importantes em estudos ecoepidemiológicos na região Amazônica. O município de Viseu, região de coleta dos animais deste estudo, situa-se no litoral do nordeste paraense apresentando mais de 56 mil habitantes e sua economia é voltada principalmente para a agropecuária, setor industrial e de prestação de serviços, a pesca, o extrativismo e a agricultura, especialmente no cultivo de mandioca (Manihot esculenta ). No município predominam-se áreas de vegetação de mangue, várzeas, florestas mistas com palmeiras e vegetação de restinga, além de ser uma área rica em diversidades de animais silvestres e também de animais de criação domésticas (aves, suínos e bovinos). Diante do que foi exposto, neste estudo será empregada uma metodologia que está em crescente desenvolvimento, à abordagem metagenômica para identificação de genomas de possíveis arbovírus e outros vírus de RNA de vertebrados em amostras de pequenos mamíferos (roedores e marsupiais) com intuito de contribuir para o conhecimento cientifico 12

de quais espécies virais podem estar circulantes entre esses pequenos animais no Município de Viseu, no Estado do Pará.

2 OBJETIVOS 2.1 GERAL Investigar a presença de genoma de arbovírus e outros vírus de RNA de vertebrados em roedores e marsupiais procedentes do município de Viseu, no Estado do Pará.

2.2 ESPECIFICOS - Realizar a análise de dados metagenômicos a partir do processamento de amostras de tecidos oriundos de roedores e marsupiais; - Identificar a diversidade de populações virais em animais pertencentes à classe de mamíferos das ordens Rodentia e Marsupialia; - Identificar genoma de vírus novos e associados aos roedores e marsupiais por análise metagenômica; - Determinar a classificação taxonômica dos vírus detectados por estudo filogenético.

3 JUSTIFICATIVA A emergência e reemergência de doenças em regiões do Brasil estão associadas principalmente a alterações ambientais relacionadas ao comportamento humano junto à natureza, como por exemplo, a exploração dos recursos naturais que são oferecidos pelo rico ecossistema do país, os excessivos desmatamentos, crescimento populacional desordenado, expansão agrícola, ecoturismo, construção de hidroelétricas e outros que propiciam o desenvolvimento de novos ciclos e formas endêmicas de muitas doenças, inclusive das arboviroses (VASCONCELOS et al., 2001). A Amazônia brasileira é uma região que sofre grandes impactos ambientais devido ao seu uso inadequado e apresenta no seu histórico de desmatamento um aumento de 29% no ano de 2016, em que foram medidos 7.989 km 2 de área, distribuídos entre os estados que compõem a Amazônia Legal, sendo os estados com maior índice Pará, Mato Grosso, Rondônia, Amazonas e Acre (INPE, 2016). A Região Amazônica favorece a existência e manutenção de arbovírus e outras espécies virais pela sua diversidade em animais silvestres e invertebrados, e por sua condição climática torna-se importante fator para a manutenção de ciclos de transmissão envolvendo esses vírus. Por conta disso, o desequilíbrio ecológico causa efeitos drásticos que podem culminar no aparecimento de novas doenças ou aumentar o índice de doenças infecciosas existentes. Além disso, muitos animais silvestres, incluindo os mamíferos, as aves e diversas espécies de invertebrados que servem de reservatórios para arbovírus e outras espécies de vírus de RNA, migram para regiões urbanas e periurbanas, passando a conviver com as populações residentes dessas áreas (DASZAK et al., 2001; WHITEMAN, 2007). A importância de estudos das arboviroses na Região Amazônica brasileira possibilita maior conhecimento sobre a circulação das diferentes espécies de arbovírus, bem como, possíveis descobertas de novos arbovírus e de outros vírus de RNA que infectam animais vertebrados. No estado do Pará, especialmente a Região Nordeste apresenta um ecossistema rico em fauna e flora, contudo é uma região que apresenta um dos maiores índices de degradação florestal o que implica no desequilíbrio do habitat natural de muitos animais silvestres e no ciclo de transmissão silvestre de doenças infecciosas. Poucos estudos ecoepidemiológicos relacionados à ocorrência de arbovírus e outros vírus de RNA que infectam vertebrados mamíferos, especialmente roedores e marsupiais na região Nordeste do Estado do Pará são realizados. Contudo, a realização de estudos de monitoramento de espécies virais a partir de amostras obtidas de seus hospedeiros silvestres 15

que estejam em contato próximo ou não com humanos, possibilitam a prevenção e controle de eventos epizoóticos, surtos e até epidemias envolvendo esses hospedeiros. Com base nisso, a utilização da análise metagenômica possibilita a identificação de genomas virais através de sequenciamento de nova geração intensificando o acesso às informações biológicas desses agentes pelo fornecimento de dados mais completos e precisos. Neste contexto, aplicar técnicas inovadoras e rápidas como a abordagem metagenômica a estudos ecoepidemiológicos para identificação de agentes virais, favorecem o aprimoramento, sensibilidade e segurança dos resultados.

4 REVISÃO DA LITERATURA

4.1 ARBOVÍRUS O termo “ arthropod-borne vírus” foi proposto para determinar um grupo de vírus zoonóticos que se propagam em artrópodes e são transmitidos biologicamente a hospedeiros vertebrados. Devido à ampla diversidade dos hospedeiros vertebrados (aves, mamíferos, repteis e anfíbios) a competência de infecção e transmissão do vetor é primordial para a manutenção do ciclo desse grupo viral, como por exemplo, fatores de susceptibilidade genética, replicação viral, temperatura, barreiras do intestino e outros. (PEREIRA, 2001; FAUQUET et al., 2005). Nos hospedeiros vertebrados esses vírus podem provocar uma viremia por tempo e títulos satisfatórios que permitem a infecção do vetor invertebrado, propiciando uma replicação produtiva e persistente a fim de viabilizar novos vírus para infectar novos hospedeiros (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009). Os arbovírus são causadores de grandes epidemias de forma frequente com impactos importantes para a saúde dos humanos e animais. Dessa forma, pessoas que entram em contato mais próximo com as regiões de mata e com reservatórios ou vetores desses vírus (ciclo enzoótico), são as mais susceptíveis a contrair a infecção, assim sendo, os humanos tornam-se hospedeiros acidentais para a maioria dos arbovírus (VASCONCELOS et al., 1992; CRUZ et al., 2009). Por consequência disso, durante a infecção em diferentes organismos os vírus podem passar pelo processo de seleção nos hospedeiros e assim produzir cepas virulentas e mais adaptáveis às condições ambientais e imunológicas nas infecções em novos hospedeiros (FIGUEIREDO, 2007). Apesar da preocupação crescente acerca dos impactos ocasionados pelas doenças causadas por arbovírus, a maioria delas ainda permanece pouco estudada e, portanto, as informações sobre o aspecto zoonótico, a distribuição geográfica, notificações de incidência e prevalência, assim como as ações de vigilância epidemiológica ainda são muito deficientes, fazendo com que as arboviroses permaneçam negligenciadas pelos serviços de saúde pública (KUNIHOLM et al., 2006). Taxonomicamente os arbovírus foram classificados em diferentes famílias de acordo com suas propriedades físico-químicas, sendo elas: Togaviridae , Flaviviridae , Peribunyaviridae, Reoviridae , Rhabdoviridae e Asfaviridae . Em sua grande maioria apresentam genoma de ácido ribonucleico (RNA), exceto o vírus Africano Suíno (VAFS) membro da família Asfaviridae que possui genoma de ácido desoxirribonucleico (DNA) 17

(FAUQUET et al., 2005; WEAVER, 2006; ICTV, 2017). Dentre essas famílias, às que comportam arbovírus de grande importância para a saúde pública ( Togaviridae , Flaviviridae , Peribunyaviridae**, Reoviridae , Rhabdoviridae ) (LOPES; NOZAWA; LINHARES, 2014), serão detalhadas nas subseções.

4.1.1 Família Togaviridae A família Togaviridae possui o gênero Alphavirus , o qual apresenta aproximadamente 31 membros de interesse para a arbovirologia, já que podem infectar e causar doenças em algumas espécies de animais domésticos (equídeos, aves), silvestres (mamíferos e aves) e esporadicamente humanos (FAUQUET et al., 2005; CASSEB et al., 2013). Os alfavírus são esféricos, envelopados com tamanho de 70 nm de diâmetro e são constituídos por membrana de natureza lipoproteica e um nucleocapsídeo onde se encontra o genoma viral, o que se constitui de RNA fita simples linear de polaridade positiva com tamanho entre 9,7 a 11,8 kb que codifica três proteínas estruturais, a proteína cápside (C) e duas glicoproteínas do envelope (E1 e E2), além de dois pequenos peptídeos (E3 e 6K) e quatro proteínas não estruturais (nsP1-4) importantes para a replicação viral (MURRAY; ROSENTHAL; PFALLER, 2009; GRIFFIN, 2007). A morfologia e genoma dos alfavírus estão representados na Figura 1. A transmissão dos alfavírus em sua maioria ocorre por artrópodes, principalmente por mosquitos da família Culicidae e podem infectar uma variedade de vertebrados, assim como o homem, no qual pode ocasionar sintomas inespecíficos comuns aos outros arbovírus. As aves e algumas espécies de mamíferos servem de hospedeiros primários e amplificadores para esses vírus (FLORES, 2007; FAUQUET et al., 2005). Onze tipos têm sido associados em causar doenças em humanos e pelo menos sete deles responsáveis por epidemias: vírus da Encefalomielite Equina Leste (EEEV), vírus da Encefalomielite Equina Oeste (WEEV), vírus da Encefalomielite Equina Venezuelana (VEEV), vírus Chikungunya (CHIKV), vírus O’nyong-nyong (ONNV), vírus Ross river (RRV) e vírus Mayaro (MAYV) (NUNES et al., 2015). Dentre essas espécies um dos maiores destaques epidemiológicos na região amazônica é o MAYV (AZEVEDO et al., 2009).

Figura 1 – Morfologia e genoma dos Alphavírus

Fonte: Adaptado de ViralZone, 2017.

O MAYV foi isolado pela primeira vez em 1954, a partir de amostras de sangue de trabalhadores rurais febris em Trinidad e Tobago (ANDERSON et al., 1957). No Brasil o primeiro isolamento registrado foi no ano de 1955 de amostras de moradores das margens do Rio Guamá, no estado do Pará, e posteriormente em outras áreas do norte do país e na bacia do rio Amazonas (GRIFFIN, 2007). Dentre os registros de epidemias ocasionados pelo MAYV a mais extensa ocorreu no município de Belterra no estado do Pará, do qual foram confirmados centenas de casos através do isolamento viral e conversão sorológica. Nesse período foi descrito pela primeira vez o perfil clínico e epidemiológico do MAYV (PINHEIRO et al., 1981a; VASCONCELOS; NUNES, 2013). Além do Brasil, o MAYV tem sido isolado de amostras biológicas de animais vertebrados silvestres, mosquitos e de humanos em outras regiões tropicais das Américas como Bolívia, Colômbia, Guiana, Peru, Suriname e Venezuela (MOURÃO et al., 2012; BATISTA et al., 2013) 19

Os artrópodes vetores são do gênero Haemagogus , que coabitam as florestas com os hospedeiros vertebrados (primatas não humanos) e mantém em natureza o ciclo principal envolvendo esses vírus (Figura 2), e, além disso, o vírus tem sido detectado em outros tipos de hospedeiros como as aves, marsupiais e répteis. Em humanos, os casos são esporádicos e tornam-se susceptíveis a infecção pelo contato com regiões de floresta, principalmente aqueles que residem às proximidades ou que entram em contato por motivos profissionais ou de lazer. Quando são infectados podem progredir com sintomas como febre, cefaleia, mialgia, erupções cutâneas e artralgia (FIGUEIREDO, 2007; GRIFFIN, 2007). No ano de 2008, um surto de doença febril foi registrado em Pau D’Arco no município de Santa Bárbara, no estado do Pará, com soropositividade para o MAYV em 36 pessoas (AZEVEDO et al., 2009). Em outro estudo de vigilância sorológica para arbovírus realizado em Juruti, também no estado do Pará foram testados 1.597 soros humanos e 671 amostras apresentaram anticorpos para vários arbovírus e destes, 20 foram positivos para o MAYV (CRUZ et al., 2009). Em outro estudo que realizou um levantamento soroepidemiológico humano na Reserva Extrativista do Cajari no Amapá, foram testados 306 soros para pesquisa de 19 arbovírus, dos quais 53 pessoas apresentaram-se positivas para o MAYV (SOUTO; SOUTO, 2012). No ano de 2008, estimou-se que cerca de dois milhões de pessoas em Manaus no Estado do Amazonas foram infectadas (MOURÃO et al., 2012). Mais recentemente, segundo o informe da semana epidemiológica realizada pelo Ministério da Saúde, entre dezembro de 2014 e janeiro de 2016 foram registrados 343 casos humanos suspeitos de doença febril causada pelo MAYV identificados em onze estados brasileiros, distribuídos nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste com destaque para os estados de Goiás apresentando 183 casos e o estado do Pará com 68 casos. Isso torna a doença febril por MAYV um problema de saúde pública (BRASIL, 2016).

Figura 2 – Representação esquemática do ciclo de transmissão do MAYV

Fonte: Adaptado de Miranda, 2013.

4.1.2 Família Flaviviridae A família Flaviviridae é composta pelos gêneros Flavivirus , Pestivirus, Hepacivirus e Pegivirus , porém o gênero Flavivirus é o único que possui arbovírus (SIMMONDS et al., 2017). Dentre os flavivírus que são de interesse para saúde pública por causarem doenças em humanos e possíveis epidemias, pode-se destacar o vírus da Febre Amarela (YFV), vírus Dengue (DENV), vírus Rocio (ROCV), vírus da Encefalite Saint Loius (SLEV), vírus da Encefalite Japonesa (JEV), vírus do Nilo ocidental (WNV) e o vírus Zika (ZIKV) (SILVA, 2010; ZHANG et al., 2003; SALVADOR; FUJITA, 2016). Os flavivírus possuem partícula envelopada de capsídeo icosaédrico que envolve o genoma viral com aproximadamente 50 nm de diâmetro. O genoma é composto de RNA fita simples de polaridade positiva com cerca de 11 kb e codifica três proteínas estruturais: capsídeo (C), envelope (E) e pré-membrana (prM/M) que ao ser clivada gera a proteína M e sete não estruturais responsáveis por funções vitais dos flavivírus como a replicação, virulência e patogenicidade, que são a NS2a, NS2b, NS3, NS4b e NS5 (Figura 3) (LINDENBACH; THIEL; RICE, 2007; SANTOS; ROMANOS; WIGG, 2008; ROBY et al., 2015). 21

No Brasil pelo menos 13 arbovírus do gênero Flavivirus são circulantes, entre eles: ZIKV, DENV sorotipos 1, 2, 3 e 4, YFV, vírus Ilheus (ILHV), ROCV, vírus Bussuquara (BSQV) e o vírus Cacipacoré (CPCV) (BALEOTTI; MORELI; FIGUEIREDO, 2003; GUBLER; KUNO; MARKOFF, 2007; SALVADOR; FUJITA, 2016). O primeiro isolamento do BSQV ocorreu no Brasil no ano de 1956 em Belém, no estado do Pará a partir de um primata não humano sentinela da espécie Alouatta beelzebul (GOMES; CAUSEY, 1959). Posteriormente o vírus foi isolado de roedores do gênero Proechimys sp. na Amazônia brasileira (WOODALL, 1967). O BSQV apresenta ampla distribuição pela ocorrência em outros países da América Central, Caribe e na América do Sul (LOPES et al., 2014). O BSQV é transmitido principalmente pelo mosquito do gênero Culex sendo os roedores seus principais hospedeiros vertebrados silvestres, porém sem descartar a importância dos primatas não humanos também como potenciais hospedeiros (LOPES et al., 2014). Em humanos apenas um relato de infecção foi descrita em 1971 no estado do Pará, no qual o paciente manifestou sintomas de quadro febril agudo, acompanhando por cefaleia, artralgia e anorexia (FIGUEIREDO, 2000; FIGUEIREDO, 2007). O CPCV foi isolado pela primeira vez em 1997 no município de Oriximiná, no Pará, a partir de uma ave da espécie Formicarius analis (FIGUEIREDO, 2000). Além das aves, o vírus tem sido isolado no Brasil de outros animais silvestres como morcegos, primatas não humanos, répteis, roedores e marsupiais (BATISTA et al., 2011; GIBRAIL, 2015). A transmissão pode ocorrer por diferentes espécies de vetores artrópodes pertencentes aos gêneros Sabethes e Culex (LOPES et al., 2014). No entanto, em um estudo realizado no estado do Amazonas esse vírus foi isolado de mosquito da espécie Aedes aegypti , sugerindo que a transmissão por esse potencial vetor poderia levar a grandes epidemias em áreas urbanas (FIGUEIREDO, 2010). O primeiro caso em humano foi registrado em 2007 de um paciente do município de Theobroma, no estado de Rondônia que foi a óbito. Devido á sintomatologia apresentada pelo paciente, inicialmente suspeitou-se da infecção pelo YFV, porém a confirmação da infecção pelo CPCV foi obtida através da identificação por RT-PCR seguido de sequenciamento gênico, o qual apresentou similaridade de 91% com o isolado de aves migratórias (BATISTA, 2011). Filogeneticamente esse vírus faz parte do ramo dos vírus da Encefalite Japonesa (JEV), SLEV, BSQV, ROCV, ILHV e Iguape, todos com capacidade de causar encefalites (BATISTA et al., 2001; BALEOTI; MORELI; FIGUEIREDO, 2003). 22

Figura 3 – Estrutura e genoma do gênero Flavivirus

Fonte: Adaptado de ViralZone, 2017.

4.1.3 Ordem Bunyavirales** Em 2016 o International comittee on taxonomy of viruses (ICTV) elevou a taxonomia da família Bunyaviridae para uma ordem Bunyavirales , a qual agrupa atualmente 42 gêneros distribuídos em 17 famílias, dentre elas: Tospoviridae, Hantaviridae, Phasmaviridae, Nairoviridae, Fimoviridae, Jonviridae, Feraviridae e Peribunyaviridae . Na família Peribunyaviridae estão incluídos os gêneros Herbevirus e Orthobunyavirus . Com a nova classificação taxonômica, dentre os Orthobunyavirus brasileiros estão: os vírus Marituba, Guamá, Oropouche, Tacaiuma, Guaroa e Caraparu (ICTV, 2016). Os Orthobunyavirus são esféricos, medindo de 80 a 120 nm de diâmetro, apresentando um envoltório de lipoproteínas com projeções proteicas na superfície. O genoma é constituído por três segmentos de RNA, denominados de L, M e S, de fita simples e polaridade negativa ou ambisense com tamanho total entre 11 a 19 kb (FAUQUET et al ., 2005). A estrutura do vírion e o genoma dos Orthobunyavirus estão representados na Figura 4. 23

A grande maioria dos vírus desse gênero é transmitida por mosquitos, e algumas espécies podem ser transmitidas por carrapatos e culicóides e utilizam uma grande variedade de animais vertebrados como hospedeiros amplificadores e de manutenção dos ciclos na natureza (VASCOCELOS et al., 2013a). Alguns desses vírus têm sido relacionados com doenças em humanos. Dentre eles se destaca o vírus Oropouche (OROV) que tem causado importantes episódios epidêmicos de doença febril, denominado de febre do Oropouche, associado a milhares de casos humanos nos últimos 50 anos, principalmente na Amazônia brasileira (NUNES et al., 2007; VASCONCELOS et al., 2009) e com estimativa de 500 mil casos ocorridos no Brasil nesse período (NUNES et al., 2005; MOURÃO et al., 2009).

Figura 4 – Estrutura morfológica e organização genômica dos Orthobunyavirus

Fonte: Adaptado de ViralZone, 2017.

O primeiro isolamento do OROV ocorreu na década de 1950 em Trinidad e posteriormente em áreas tropicais da América Central e do Sul, especialmente nas regiões da bacia amazônica. Do ano de 1960 a 1980 a presença do OROV foi detectada em áreas do norte do Estado do Pará, com registro nesse período de uma grande epidemia em Belém que acometeu cerca de 11 mil pessoas. De 1980 a 2004, o OROV mostrou-se como um perigoso 24

potencial de epidemias, espalhando-se para outros estados brasileiros, incluindo Amazonas, Acre, Rondônia, Tocantins e Maranhão (PINHEIRO et al., 1962; NUNES et al., 2005). A transmissão do OROV foi apresentada a partir de um estudo realizado por pesquisadores do Instituto Evandro Chagas em 1981, no qual foi feito um levantamento sorológico em animais da fauna do Estado do Pará para tentar determinar possíveis hospedeiros silvestres e/ou domésticos, bem como seus insetos vetores, com a aplicação de várias técnicas, como ensaio de neutralização in vitro , inibição de hemaglutinação e isolamento viral (PINHEIRO et al., 1981b). A partir desse estudo foram evidenciados dois ciclos distintos (silvestre e urbano) de manutenção do OROV em natureza. No ciclo silvestre, observa-se como hospedeiros reservatórios as preguiças, primatas, marsupiais e aves, sendo o principal vetor o mosquito Aedes serratus . No ciclo urbano o homem é seu hospedeiro reservatório e o vetor é o Culicoides paraenses conhecido popularmente na Amazônia brasileira como “maruim” (PINHEIRO et al., 1981b). No Brasil o OROV é um dos arbovírus mais frequente em causar doença febril (FIGUEIREDO, 2007). No entanto, a patogênese da infecção desse vírus ainda é pouco esclarecida. Em um estudo de infecções experimentais por OROV em Hamster, mostraram que metade dos animais estudados apresentou tremores, paralisia, calafrios e alguns deles foram a óbito com presença de elevados títulos virais em amostra de sangue, cérebro e fígado (RODRIGUES et al., 2011). Apesar de esclarecimentos da ocorrência de muitos arbovírus na Amazônia, muitos casos prováveis de arboviroses ainda permanecem sem diagnósticos, possivelmente por conta das manifestações clínicas muitas vezes apresentarem-se leves e autolimitadas, com a recuperação completa dos pacientes em poucos dias. No caso de quadros febris por OROV não deve ser diferente já que o diagnóstico para este vírus pode ser facilmente confundido com outras doenças febris agudas endêmicas na região Amazônica, como a dengue e a malária (MOURÃO et al., 2005).

4.1.4 Família Reoviridae A família Reoviridae é composta por 15 gêneros distintos, entre eles os que infectam animais são: Orthoreovirus, Orbivirus, Coltivirus e Rotavirus . No Brasil 69 tipos de Orbivirus já foram identificados, mas nenhum com associação a doenças humanas na Amazônia brasileira (VASCONCELOS et al., 2013; ICTV, 2017). 25

Os Orbivirus medem aproximadamente 68 a 70 nm de diâmetro, não envelopado, icosaédrico e apresentam RNA fita dupla segmentado com 3,0 kb que codifica sete proteínas estruturais (VP1-7) e três não estruturais (NS1 a NS3) (ALFIERI et al., 2007) (Figura 5). Um dos membros desse gênero é o vírus da Língua Azul (BTV) que está relacionado a sérios problemas sanitários e econômicos devido comprometer a produção animal e o comercio internacional, por infectar principalmente ovinos e bovinos que servem como reservatórios desses vírus (RADOSTITS et al., 2007; ALFIERI et al., 2012). O BTV apresenta 26 sorotipos conhecidos mundialmente, sendo relatados principalmente nos Estados Unidos, Austrália, África do Sul e Europa (MAAN et al., 2012; MACLACHLAN; MAYO, 2013). No Brasil, apenas dois sorotipos (4 e 12) já foram descritos. O sorotipo 4 foi isolado de bovinos em 1980, em 2013 e 2014 de ovinos no Rio de Janeiro (BALARO et al., 2014) e o sorotipo 12 isolado de ovinos e caprinos no Paraná no ano de 2001 (CLAVIJO et al., 2002).

Figura 5 – Estrutura genômica dos Orbivirus

Fonte: Adaptado de ViralZone, 2017.

A transmissão do BTV ocorre através da picada de mosquitos do gênero Culicoides sp , conhecidos no Brasil como “maruim”, “mosquito-polvora” ou “mosquito de sangue” e podem infectar uma grande variedade de animais domésticos e selvagens, incluindo ovinos, caprinos, bovinos e bubalinos, sendo que os ovinos apresentam maior severidade da doença (VERWOERD; ERASMUS, 2004). Apesar dos bovinos também apresentarem importância epidemiológica, a infecção apresenta-se de forma subclínica (MACLACHILAN et al., 2009). A manifestação clinica corresponde à febre, hiperemia da mucosa oral e nasal, edema de língua (que permanece para fora da boca) e lábios, petéquias no focinho e mucosas oral e conjuntival, e, nos casos mais graves a doença se manifesta como escoriações e erosões no 26

focinho e lesões necróticas na cavidade oral, dentre outras manifestações que podem levar os animais a óbito (VERWOERD; ERASMUS, 2004; ALFIERI et al., 2007).

4.1.4 Família Rhabdoviridae A família Rhabdoviridae apresenta mais de 185 vírus distintos, isolados de variedades de animais (vertebrados e invertebrados) e plantas, distribuídos em sete gêneros, dos quais apenas três infectam mamíferos: Lyssavirus (gênero que possui o vírus da raiva), Vesiculovirus e o recente proposto Curiovirus (VASCONCELOS et al., 2013; ICTV, 2017). Os vírus dessa família são envelopados, com nucleocapsídeos helicoidais, apresentando formato de projétil e possui genoma de RNA fita simples, polaridade negativa, medindo entre 11-15 kb e codifica cinco proteínas (G, L, M, P e N) (Figura 6) (LYLES; RUPPRECHT, 2007). Um dos membros da família Rhabdovirirdae é o gênero Vesiculovirus (VSV) , que possui nove espécies, sendo eles: vírus Carajás (CARV), vírus Piry (PIRYV), v írus Marabá (MARV), v írus Chandipura (CHPV), v írus da Estomatite Vesicular Nova Jersey (VSNJV), vírus da Estomatite Vesicular Indiana (VSIV), v írus da Estomatite Vesicular Alagoas (VSAV), v írus Cocal (COCV) e v írus Isfahan (ISFV) (ICTV, 2011). Os vírus Marabá e Carajás foram isolados a partir de um grupo (70 e 100 respectivamente) de Flebotomíneos ( Lutzomya spp. ), capturados em Serra Norte, Município de Marabá, no Estado do Pará, Brasil a partir de um estudo realizado no ano de 1984 (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1984). Apesar dos 30 anos de isolamento, pouco se sabe sobre esses vírus. No entanto, em um trabalho que objetivou descrever a neuropatologia do MARV, mostrou nas infecções intranasais de camundongos recém-nascidos, necrose e picnose de neurônios em regiões do sistema nervoso central, com destaque para cerebelo, hipocampo e Striatum (GOMES-LEAL et al., 2006). Outro estudo experimental descreveu alterações anatomopatológicas distribuídas em várias regiões do encéfalo, com a presença de edema, necrose, infiltrado infamatório e picnose, disseminação do antígeno viral no parênquima encefálico, bem como aumento da expressão de moduladores inflamatórios em camundongos adultos infectados pelo MARV (FARIAS, 2014).

Figura 6 – Estrutura morfológica e genoma da família Rhabdoviridae

Fonte: Adaptado de ViralZone, 2017.

Nas infecções experimentais pelo CARV, Gomes-Leal et al. (2006), observaram que os animais apresentaram manifestações visíveis da infecção após dois dias pós-inoculação com óbitos no terceiro dia, e presença de antígenos virais distribuídos em células das meninges, neurônios corticais, cerebelo e nos vasos sanguíneos, além da presença de necrose e grande número de células picnóticas no cerebelo.

4.2 TRANSMISSÃO DOS ARBOVIRUS Os ciclos de transmissão dos arbovírus ocorrem tanto em áreas silvestres como em áreas urbanas e rurais, onde numerosas espécies de dípteros hematófagos (mosquito, maruim, flebotomíneos) e animais vertebrados (silvestres e urbanos, inclusive humanos) convivem diretamente. Devido às diversidades e elevados números dessas espécies, a manutenção dos arbovírus em natureza é constante (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1997). Nas áreas de mata os ciclos podem variar em sua complexidade, a qual pode ser simples com o envolvimento de um único artrópode e um animal vertebrado e até aqueles mais complexos, envolvendo vários vetores e vertebrados silvestres. Dentre as classes de vertebrados que tem maior envolvimento com a transmissão de arbovírus além das aves, estão os mamíferos, principalmente roedores e primatas não humanos. Dessa forma, as arboviroses são consideradas doenças zoonóticas devido à origem silvestre e a sua manutenção em 28

natureza entre vertebrados não humanos e artrópodes (VASCONCELOS et al., 2001; VASCONCELOS et al., 2013). Os seres humanos podem ser infectados quando entram em contato com ciclos naturais desses vírus (ciclo enzoótico) e quando retornam para as áreas urbanas os vírus são transmitidos entre humanos-mosquitos e mosquitos-humanos, sendo o homem o único hospedeiro amplificador. Em ciclos epizoóticos rurais os animais domésticos e mosquitos são os envolvidos, e, na presença de um hospedeiro intermediário resulta na amplificação da transmissão e em grandes reservatórios de vírus, causando efeitos de “viral spillover” (quebra de barreira da espécie hospedeira do vírus) para hospedeiros finais (Figura 7) (WAVER, 2013). Nos artrópodes também pode ocorrer à transmissão sexual e transovariana (através dos ovos), e posteriormente podem transmitir aos seus hospedeiros vertebrados, inclusive os humanos ao realizarem sua primeira alimentação. Este mecanismo se torna importante fator para a manutenção de alguns arbovírus devido à infecção nos artrópodes permanecer para a vida toda que varia entre 30 a 40 dias (VASCONCELOS et al., 2013).

Figura 7 - Ciclos de transmissão e exposição humana a arbovírus.

Fonte: Adaptado de Iranpour et al., 2016.

4.3 ESTUDOS DE ARBOVIRUS NA AMAZÔNIA BRASILEIRA No Brasil, cerca de 210 espécies de arbovírus já foram isoladas, e, em estudos realizados na Amazônia brasileira demonstraram que 110 dessas espécies são novos para o 29

mundo e muitos nunca foram registrados fora país. Desses, 36 são comprovadamente causadores de doenças em humanos. Diante desses dados a Amazônia consiste nos maiores reservatório de arbovírus no mundo (VASCONCELOS et al., 1998; VASCONCELOS et al., 2013). Woodall (1967) apresentou uma revisão de dados de estudos epidemiológicos e de isolamentos realizados na região Amazônica e destacou a presença de anticorpos para diferentes espécies de arbovírus em vários animais vertebrados (roedores, marsupiais e répteis) e invertebrados (mosquitos). Na época foram isolados de roedores dos gêneros Proechimys sp, Oryzomys sp e Nectomys sp os vírus EEEV , BSQV , Caraparu (CARV), Mucambo (MUCV), Guamá, Pixuna, Itaqui, Murutucu, Nepuyo, Oriboca, Catu, Moju, Guajará, Icoaraci, Bujaru, Irituia , dentre outros . De marsupiais dos gêneros Didelphis sp, Marmosa sp, Metachirus sp , Metachirops sp e Calluromys , detectaram o vírus Oriboca, EEEV, MUCV, SLEV, Apeú, Itaqui, Murutucu, Guamá, Itaporonga e Piry . Além disso, os vírus Timbó , Chaco e Marco foram detectados em amostras de Ameiva ameiva (lagarto) e de artrópodes do gênero Culex sp e Haemagogus spp ., foram isolados o MAYV, EEEV, BSQV, CARV e MUCV. Em um estudo soro-epidemiológico realizado na região amazônica foi demonstrado à presença de anticorpos para diversos tipos de arbovírus em roedores da espécie Proechimys Guyannensis capturados na área da província mineral de Carajás, Estado do Pará. No estudo, foi observada a presença de anticorpos para o SLEV, CPCV, ILHV e o CARV (MORAES, 2016). Embora a concentração de arbovírus seja em maior número na região Amazônica brasileira, outras regiões do país também apresentam registros de arboviroses. Dentre as principais epidemias que ocorrem na Amazônia ou em outras regiões do país estão aquelas causadas principalmente pelos DENV, OROV, MAYV e YFV (TRAVASSOS DA ROSA et al., 1997) e pelos mais recentes ZIKV e CHIKV (BRASIL, 2017). Em estudos soro-epidemiológicos realizados em algumas regiões brasileiras, demostraram a prevalência de anticorpos em equídeos em decorrência de infecção por VEEV, EEEV e WEEV. Os dados apresentaram sorologia positiva nesse grupo de animais para regiões da Amazônia, especialmente nos estados do Pará e Rondônia (AGUIAR et al., 2008; CAMPOS et al., 2013), no Pantanal do Mato Grosso do Sul (PAUVOLID-CORRÊA et al., 2013), no estado de São Paulo (CUNHA et al., 2009), no ecossistema Pantaneiro e Cerrado do norte-matogrossense (MELO et al., 2012) e a detecção de VEEV e EEEV no estado de Minais Gerais (LARA et al., 2014). Quando os animais são infectados por esses agentes sofrem com 30

doenças neurológicas, denominadas de Encefalite Equina, com manifestações clinicas distintas. Além disso, muitas das infecções são assintomáticas, sendo que os animais jovens são os mais susceptíveis (RIET-CORREA, 2007). Além disso, o EEEV tem registro de isolamento a partir de roedores e marsupiais que atuam como hospedeiros em ciclos secundários no solo silvestre. Isso, possivelmente mostra- se como a causa da infecção humana e de equinos, caso estejam próximos a regiões de floresta (VASCONCELOS et al., 2013).

4.4 ECOLOGIA DE OUTROS VÍRUS DE RNA QUE INFECTAM PEQUENOS MAMÍFEROS A degradação e consequente fragmentação do habitat natural de muitos animais por atividades antrópicas podem levar ao desaparecimento local das espécies que são restritas de áreas florestais, caso o habitat não favoreça qualidade suficiente para manter a viabilidade das populações. Por outro lado, espécies que podem ser adaptáveis são favorecidas em outras áreas pelo fornecimento de alimentos das agriculturas, levando ao aumento populacional em grandes proporções. Além disso, pode ocasionar a circulação de zoonoses em muitas dessas regiões sendo inclusive potencializada pelo contato desses animais silvestres com animais domésticos e humanos (MILLS, 2005). As doenças emergentes são grandes preocupações para a saúde pública mundial devido à relação com determinantes sociais, econômicos e ambientais. Essas doenças infecciosas por sua maioria são zoonoses, a qual cerca de 70% delas é de origem silvestre (JONES et al., 2008). Muitas dessas infecções zoonóticas dependem da interação dos agentes patogênicos a outros nichos com a adaptação a novos hospedeiros, sendo esse fator favorecido por ações antropogênicas que incluem os desmatamentos, exploração do solo, extração de recursos naturais e sistemas de produção pecuária, dentre outros (VASCONCELOS et al., 2001). As zoonoses são distribuídas entre diversos hospedeiros reservatórios, dos quais a maioria pertence ao grupo dos pequenos mamíferos. Dentre eles destacam-se os roedores e marsupiais que apresentam condições favoráveis que os classificam como excelentes reservatórios, por conta das altas taxas de reprodução e disseminação por áreas florestais e inclusive aquelas habitadas pelos humanos em relação a outros animais silvestres (MIILS, 2006). Os roedores e marsupiais apresentam um papel importante para a manutenção de algumas espécies de arbovírus, bem como, para outros vírus de RNA como os hantavírus, 31

arenavírus, coronavírus, astrovírus, picobirnavírus, ortopoxivírus, dentre outros. (PHAN et al., 2011; MACKENZIE; JEGGO, 2013). O gênero Hantavirus compreende em mais de 80 espécies virais, os quais podem infectar humanos através da inalação de aerossóis contendo partículas virais, formadas a partir de excretas de roedores infectados, podendo desenvolver manifestações patológicas distintas como a Febre Hemorrágica com Síndrome Renal (FHSR) e a Síndrome Cardiopulmonar por Hantavirus (OLIVEIRA et al., 2014). No Brasil foram identificados nove genótipos de hantavírus em 12 espécies de roedores, os quais ao serem infectados seguem com infecção crônica e aparentemente assintomática (OLIVEIRA et al., 2014). Além da transmissão clássica aos humanos, outras formas alternativas já foram descritas, como através de mordeduras de roedores e contato do vírus com regiões de mucosa da boca, olhos e nariz (PEREIRA, 2006). O gênero Arenavirus pertence à família Arenaviridae e seus membros causam infecções crônicas em roedores nativos que habitam a Europa, África e Américas. Nesses animais as infecções são assintomáticas e ao entrarem em contato com as habitações humanas podem transmitir esses vírus aos humanos através da inalação de aerossóis contendo partículas virais, formadas a partir das excretas deixadas no ambiente (BUCHMEIER; DE LA TORRE; PETERS, 2007). As doenças causadas por esses vírus são de elevada letalidade, sendo caracterizadas por febres hemorrágicas e meningites em humanos. Das espécies conhecidas pelo menos 10 são capazes de adoecer os humanos e são distribuídos mundialmente, sendo a maioria identificada na América do Sul (BRIESE et al., 2009). Os coronavírus da família Coronaviridae têm a capacidade de infectar uma grande variedade de animais, causando doenças respiratórias, hepáticas, neurológicas e entéricas. Esses vírus são distribuídos amplamente entre os humanos, outros mamíferos (morcegos, roedores e marsupiais) e nas aves (LAU et al., 2014). O Betacoronavirus é um gênero dessa família que possui vírus que infectam humanos (coronavírus humano HKU1 e coronavírus humano OC43), associadas a infecções do trato respiratório superior e inferior e roedores como o vírus da hepatite de ratos (MHV) que causa infecções, hepáticas, entéricas e neurológicas e o coronavírus de rato (RCoV) que causa infecções do trato superior e inferior (MASTERS; PERLMAN, 2013; MIURA et al., 2007). Os astrovírus pertencem à família Astroviridae que é composta por dois gêneros: Astrovirus e Mamastrovirus , também são capazes de infectar espécies de aves e mamíferos respectivamente (FAUQUET et al., 2005). O gênero Mamastroviru s compõe astrovírus com 32

relatos de infecções em mamíferos, incluindo bovinos, ovinos, felinos, suínos, roedores, humanos, dentre outros (LI et al., 2010; RIVERA et al., 2010; PHAN et al., 2011). Recentemente algumas espécies de astrovírus identificadas de espécimes humanos foram relacionadas geneticamente com astrovírus de animais, sugerindo que tais espécies têm origem zoonótica (KAPOOR et al., 2009). Os astrovírus são agentes infecciosos que acometem principalmente crianças de menor faixa etária, causando nesses indivíduos gastroenterites com quadros de vômitos, dores abdominais e febre. Estes são transmitidos via fecal-oral, normalmente de pessoa a pessoa (GABBAY et al., 2007). A maioria das infecções não humanas por astrovírus são identificadas em dois grupos de mamíferos, sendo eles: roedores e morcegos que são ricos em espécies. Essa diversidade genética de pequenos mamíferos, mostra que podem torna-se hospedeiros e potenciais disseminadores de uma ampla gama de cepas virais. Tal como ocorre com animais de criação agrícola, a densidade de espécies de animais silvestres (pequenos mamíferos) e sua aproximação com habitações humanas parecer ser um importante fator para a transmissão e infecção nesses animais (CHU et al., 2008; PHAN et al., 2011) Phan et al. (2011) realizaram um estudo metagenômico para descrever a diversidade viral de roedores silvestres que vivem em contato com humanos. Eles analisaram 105 espécimes desses animais e detectaram a presença de vírus de insetos (família Iridoviridae ) e plantas (família Nanoviridae ), possivelmente refletindo a dieta dos roedores, além, de vários vírus de mamíferos incluindo a primeira detecção de sapelovirus e astrovírus de ratos, novos picornavirus e picobirnavírus. Nesse contexto, a ocupação e adaptação de pequenos roedores e marsupiais em diferentes biomas possibilita maior interação com outros animais silvestres, bem como, com os seres humanos. Essa aproximação se dá por meio de drásticos impactos ambientais que consequentemente podem levar a alterações distintas nas abundantes comunidades de pequenos mamíferos, os quais ocupam de forma desordenada diferentes habitats, influenciando diretamente na dinâmica de transmissão natural dos ciclos silvestres de muitos agentes virais (KRUSE et al., 2004; MILLS, 2005).

4.5 METAGENÔMICA A análise metagenômica de uma forma geral é aplicada em estudos que visam investigar genomas de microrganismos diretamente do ambiente, sem a necessidade do cultivo em laboratório. Essa metodologia tem sido utilizada para analisar amostras ambientais 33

(água, solo ou sedimento), biológicas (aspirados do trato respiratório, fezes, sangue, soro humano ou de animais) e dentre outras, as quais pode haver a presença de grande diversidade de agentes microbianos (SIMON; DANIEL, 2009; BLOMSTRÖM, 2011). O desenvolvimento da abordagem metagenômica foi proposto com o intuito de auxiliar os métodos clássicos empregados na microbiologia para melhorar o entendimento sobre a diversidade de microrganismos nos mais variados biomas, tendo em vista, que são evidenciados como não cultiváveis uma grande maioria de microrganismos presentes nos ambientes do planeta (HANDELSMAN, 2004). Dessa forma, a metagenômica abre um caminho para ter acesso de uma forma mais completa a análise da grande diversidade de microrganismos existentes no ambiente, permitindo a realização de estudos genômicos funcionais dos membros de sua microbiota e a recuperação de sequencias genômicas de agentes microbianos ainda não caracterizados (YANG et al., 2011; FREY et al., 2014). O crescimento acentuado dos estudos metagenômicos de forma qualitativa e quantitativa tornou-se possível pelo desenvolvimento de novas tecnologias de sequenciamento genômico de alto rendimento com a capacidade de produção maciça de uma grande quantidade de dados em um curto período de tempo (THOMAS; GILBERT; MEYER, 2012). Diante disso, a abordagem metagenômica é uma ferramenta promissora que além de possibilitar o acesso à genomas de organismo incultiváveis, contribui com respostas para questões biológicas até então não obtidas (GARZA; DUTILH, 2015). Muitos agentes virais podem ser identificados por uma ampla gama de técnicas com base em comparações com outros vírus conhecidos. Dentre essas metodologias incluem, cultura celular, microscopia eletrônica, inoculação em camundongos e sorologia, porém, apresentam limitações como, por exemplo, muitos vírus não infectam linhagens celulares em cultivo, além disso, algumas culturas selecionam os vírus que são adaptados a ela impossibilitando a visão de outras espécies virais que infectam outros hospedeiros, assim sendo, não conseguem ser isolados e nem estudados por técnicas sorológicas (BEXFIELD; KELLAM, 2011). Diante disso, a metagenômica viral busca identificar as diversidades de vírus, bem como seu genoma completo, presentes em diferentes biomas de forma a detectar não apenas grupos conhecidos, mas também para a descoberta de novos membros para a ciência, sem a necessidade de empregar técnica de isolamento ou cultivo viral (HALL et al., 2015). Neste contexto a análise metagenômica compreende em três etapas principais de grande importância para a interpretação e sucesso da análise, sendo elas: processamento da amostra (concentração e purificação das partículas virais ou do ácido nucleio viral, extração, 34

transcrição reversa de RNA para cDNA), sequenciamento dos fragmentos de ácidos nucléicos e a bioinformática para a análise das sequências obtidas (AMBROSE; CLEWLEY, 2006; THURBER et, al., 2009; LI; DELWART, 2011). O sequenciamento desses fragmentos pode ser feito através de plataformas de sequenciamento de alto rendimento que apresentam alta sensibilidade e geram quantidades de sequências muito maiores que as técnicas tradicionais por clonagem em hospedeiro bacteriano (TANG; CHIU, 2010; MOKILI; ROHWER; DUTILH, 2012). O processamento das amostras é a primeira fase de um estudo metagenômico para obtenção do material de interesse e depende da tecnologia de sequenciamento que será utilizada, podendo ser necessário empregar tratamentos de amplificação e concentração de ácido nucleico. No entanto, na maioria das amostras o ácido nucléico de origem viral é constituído de uma pequena porção de toda a massa genômica. Desse modo, para que apenas o ácido nucléico do agente viral seja obtido de forma preservada e sem interferências de detecção, os genomas provenientes dos hospedeiros e bactérias considerados contaminantes, devem ser eliminados precisamente (THOMAS; GILBERT; MEYER, 2012; LAW et al., 2013). Nessa etapa podem ser empregadas técnicas de homogeneização, filtração e ultracentrifugação do material (MOKILI; ROHWER; DUTILH, 2012). O processo de fragmentação das amostras deve ser criterioso e analisado para que haja a garantia da extração e qualidade do ácido nucléico alvo de todas as células presentes na amostra, com quantidades suficientes para a produção da biblioteca metagenômica e sequenciamento com mínima contaminação possível, pois as técnicas de sequenciamento empregadas na metagenômica utilizam os genomas das bibliotecas para amplificações aleatórias, ou seja, quanto menor for à contaminação dos ácidos nucléicos maior é a chance de detectar as sequências virais de interesse para estudos (THOMAS; GILBERT; MEYER, 2012). Diante disso, técnicas de purificação do material genético viral é uma etapa fundamental para os estudos metagenômicos antes da amplificação, pois minimizam os contaminantes advindos dos hospedeiros, proporcionando maior enriquecimento da amostra, bem como, podem aumentar a sensibilidade do estudo (RAJENDHRAN; GUANASEKARAN, 2008; THOMAS; GILBERT; MEYER, 2012). As tecnologias de sequenciamento de alto rendimento ou sequenciamento de nova geração (SNG) foram disponibilizadas comercialmente a partir de 2005, e desde então apresentam rápida evolução, possibilitando sequenciamento em larga escala, gerando milhões de leituras em uma única corrida, sendo, portanto mais rápido e com custo de sequenciamento mais acessível (MARDIS, 2011). Dentre os sequenciadores que são muito utilizados para 35

sequenciamento de genomas completos de vários organismos em metagenômica estão: 454 GS FLX (Roche), MiSeq, NextSeq e HiSeq (Illumina), Ion Torrent Pront (Life Technologies) e SOLiD (ABI) (LIU et al., 2012). Simultaneamente ao crescimento de dados gerados pelo SNG, muitas ferramentas computacionais e algoritmos mais eficientes têm sido desenvolvidos, com intuito de acelerar as análises dessa grande quantidade de dados, e, por conta disso, a análise bioinformática tornou-se um dos mais importantes e fundamentais processos para o ramo da metagenômica (BZHALAVA; DILLNER, 2013). O primeiro estudo voltado a metagenômica viral ocorreu em 2002 pelo uso da técnica de shotgun através do sequenciamento de Sanger, o qual descreveu duas comunidades virais de origem marinha não-cultiváveis provenientes de amostras coletadas de um canal de Fiesta Island em San Diego e Scripps Pier na California, nos Estados unidos. (BREITBART et al., 2002). Os mesmos pesquisadores apresentaram em 2003 um novo estudo que apresentou resultados de grupo viral não-cultivável detectados de amostras fecais humanas, por análise metagenômica (BREITBART et al., 2003). Depois disso, outros protocolos têm sido desenvolvidos para capturar as diversidades microbianas ainda desconhecidas e favorecer estratégias para superar as barreias que ainda existem sobre o entendimento das espécies (SINGH et al., 2009). Palacios et al., (2008) aplicaram a analise metagenômica para elucidar a etiologia de uma virose que resultou na morte de três pacientes transplantadas na Austrália que receberam fígado e rins de um único doador falecido por hemorragia cerebral. Nesse estudo foi detectada uma sequência de arenavírus do Velho Mundo, associado ao vírus da coriomenigite linfocítica, com a utilização de sequenciamento em larga escala de nova geração. As infecções das pacientes receptoras foram comprovadas por testes complementares sorológicos. No estudo publicado por Chen et al., (2011) foi associada a morte de primatas (Cellicebus cupreus ) devido a uma pneumonia aguda, com a infecção por adenovírus até então não identificado e que inclusive apresenta capacidade de infectar humanos. A descoberta foi possível através da utilização das técnicas de NSG (Illumina). Em 2014, um grupo de pesquisadores empregou a abordagem metagenômica viral através das plataformas de sequenciamento Roche 454 e Illumina MiSeq, para detectar arbovírus conhecidos e novos a partir de mosquitos coletados em campo na Austrália. Eles foram capazes de detectar muitos vírus de animais pertencentes às famílias Flaviviridae e Reoviridae e também identificaram o vírus Ross River , dois novos membros da família Rhabdoviridae derivados de dípteros e mamíferos, denominados de vírus North Creek 36

(NORCV) e vírus Beaumont (BEAUV) e dois novos Orthobunyavirus , chamados de vírus Murrumbidgee (MURBV) e vírus Salt Ash (SASHV) (COFFEY et al., 2014). No Brasil alguns trabalhos utilizando metagenômica viral com SNG vêm sendo realizados. Ullmann (2014) desenvolveu protocolos utilizando o sequenciamento pela plataforma MiSeq Illumina para a detecção de genomas virais de soro e sangue, coletados de primatas não humanos do Novo Mundo procedentes do Centro Nacional de Primatas (Belém- PA), do Parque Ecológico do Tiete (São Paulo) e do Refúgio Biológico Bela Vista (Foz do Iguaçu, PR). O estudo identificou diferentes famílias virais nos conjuntos amostrais e detectou sequência de genoma completo de um novo membro do gênero Hepacivirus , pertencente à família Flaviviridae . Em um estudo realizado por Conteville (2016) com a utilização da tecnologia HiSeq 500 Illumina foi detectado Parvovirus B19 e vírus da Hepatite A, além de agentes bacterianos infecciosos como N. meningitidis e S. pneumoniae de amostras de soro e vísceras de casos fatais de pacientes com suspeita clínica de dengue ou febre amarela. A utilização da metagenômica para análise de diferentes amostras tem possibilitado descobertas de numerosas sequências de genomas de origem viral. No entanto, esses novos dados ainda são insuficientes para a identificação de hospedeiros e a potencialidade de virulência dos vírus. Porém, a catalogação desses dados genômicos nas bases públicas é de suma importância, tendo em vista, que esses resultados proporcionarão futuramente novas pesquisas para a descoberta dos hospedeiros desses vírus, possibilitando inclusive mais conhecimentos sobre sua patogenia. Além disso, apesar da metagenômica contribuir para aumentar significativamente o número de descobertas virais, novas associações de doenças causadas por seus respectivos agentes virais, não tem ocorrido na mesma proporção devido essa associação não depender apenas do encontro do vírus em pacientes, mas também da investigação completa sobre a relação vírus-doença (CASTRIGNANO; NAGASSE- SUGAHARA, 2015).

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 LOCAL DE ESTUDO Os materiais biológicos oriundos de roedores e marsupiais foram coletados no município de Viseu, pertencente à Mesorregião do Nordeste Paraense, situado no litoral do estado (destacado em amarelo e verde) (FIGURA 8), distanciando-se 320 km de Belém. De acordo com o último senso realizado pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) no ano de 2010, o município possuía uma população de 56.716 habitantes, com temperaturas mínima e máxima variando em média 21°C e 34°C, respectivamente (IBGE, 2017).

Figura 8 – Mapa da Mesorregião do Nordeste Paraense, com o respectivo Município de estudo, Viseu/PA-Brasil

Fonte: Santos, 2015.

5.2 ASPECTOS ÉTICOS Este projeto possui aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto Evandro Chagas CEUA/IEC, protocolo nº 03/2018, em anexo e seus dados são relacionados a um projeto maior intitulado: “Estudo ecoepidemiológico de patógenos emergentes e 38

reemergentes em áreas de alterações ambientais nas mesorregiões metropolitana de Belém e Nordeste do Estado do Pará”, sob o Protocolo n° 28/2014, com aprovação em 25/09/2014 sob Certificado n° 021/2014.

5.3 AMOSTRAGEM 5.3.1 Coleta dos espécimes biológicos Neste estudo foi utilizado um total de 10 amostras, sendo seis de marsupiais e quatro de roedores (fígado, pool de vísceras e cérebro), disponibilizadas pelo projeto Pro-Amazônia coletadas no município de Viseu (TABELA 1).

Tabela 1 – Amostras coletadas dos animais de estudo ID N AMOSTRA ESPÉCIE ANO MA7049 1 Fígado Marmosa murina 2014 MA7050 1 Fígado Marmosa murina 2014 MA7053 1 Fígado Metachirus sp. 2014 MA7053 1 Vísceras ( Pool ) Metachirus sp. 2014 MA7054 1 Fígado Philander sp. 2014 MA7054 1 Vísceras ( Pool ) Philander sp. 2014 RO22799 1 Fígado Proechimys sp. 2014 RO22799 1 Vísceras ( Pool ) Proechimys sp. 2014 RO22876 1 Cérebro Proechimys sp. 2015 RO22878 1 Cérebro Proechimys sp. 2015

A coleta foi realizada pela equipa técnica da seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do IEC, desenvolvidos de acordo com as normas e critérios de biossegurança da Instituição. As capturas seguiram em duas excursões, sendo uma em época chuvosa no mês de dezembro de 2014 e outra em época seca no mês de agosto de 2015, em períodos de 15 dias. Os pequenos mamíferos não voadores foram capturados por armadilhas de contenção viva do tipo gaiola (Tomahawk) e de alumínio (Sherman), distribuídas em áreas com distância de 10 metros entre si. Em cada ponto foram colocadas duas armadilhas, sendo uma no solo e outra no sub-bosque, de 1 a 2 metros de altura do solo. Após as anotações dos dados morfométricos e identificação dos espécimes, a coleta de sangue dos roedores seguiu por punção retroorbital e dos marsupiais através da veia caudal, pós-sedação. A partir disso, as amostras foram depositadas em tubos estéreis com e sem anticoagulante. Na Figura 9, estão 39

representados os pontos de coleta dos animais deste estudo (roedores e marsupiais), sendo que os pontos de A1 a C3 representam os locais de captura desses animais. Para a coleta de vísceras pelo menos cinco animais de cada espécie foram selecionados e sacrificados. O procedimento foi realizado a partir da sedação por via intramuscular com posterior eutanásia pela superdosagem de lidocaína no forâmen magno, conforme recomendações do Conselho Nacional de Experimento Animal (CONCEA). Os animais foram necropsiados e fragmentos de diferentes tipos de tecidos foram coletados em duplicata dos órgãos. No IEC todas as amostras foram mantidas em freezer a -70ºC

Figura 9 – Pontos de coleta dos animais de estudo

Fonte: Laboratório de Geoprocessamento /IEC/SVS/MS .

5.4 PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS 5.4.1 Extração, purificação e qualidade do RNA Para a extração de RNA das amostras de fígado, cérebro e pool vísceras dos roedores e marsupiais, foi utilizado um pequeno fragmento de tecido (aproximadamente 5mg) colocados em microtubo de polipropileno de 2 ml (individualmente por amostra), estéril e livre de DNase e RNase, para serem macerados juntamente com 350 µl do tampão de homogeneização que acompanha o kit de extração e uma esfera de tungstênio medindo 3 mm de diâmetro no equipamento TissueLyser II (QIAGEN) numa frequência de 25 Hz durante 1 minuto. No processo de extração do RNA total foi utilizado o kit Maxwell 16 LEV simplyRNA 40

Tissue Kit , com o sistema de extração e purificação automatizado Maxwell® 16 (PROMEGA) de acordo com as instruções de preparo do fabricante. Após a extração e purificação do RNA total, foi realizada uma avaliação quanto a sua quantificação e qualidade usando o equipamento Qubit® 2.0 Fluorometer , juntamente com o kit Qubit™ RNA HS Assay (INVITROGEN) e o equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) através do kit Agilent RNA 6000 Pico, seguindo os protocolos dos fabricantes, respectivamente, e em seguida o RNA foi armazenado a -80ºC até a etapa seguinte.

5.4.2 Síntese do DNA complementar (cDNA) A síntese do cDNA a partir do RNA purificado, foi realizado utilizando o kit cDNA Synthesis System (Roche Diagnostics) juntamente com o primer randômico (400 μM Roche Primer “random”), seguindo as orientações do fabricante. A purificação do cDNA foi feita por esferas magnéticas AMPure bead .

5.4.3 Sequenciamento O cDNA purificado foi utilizado na preparação da biblioteca genômica empregando a metodologia descrita no kit Nextera XT DNA Library Preparation ( Illumina ). Antes do sequenciamento o produto da biblioteca foi avaliado em uma etapa de checagem, quanto a sua qualidade e quantidade. A quantidade de moléculas de cDNA foi estimada usando o Qubit® 2.0 Fluorometer e o kit Qubit® dsDNA HS Assay Kits, e o tamanho dos fragmentos produzidos na biblioteca foi observado usando o kit High Sensitivity DNA Analysis Kits (Agilent Technologies) utilizando o equipamento Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Após isso, o sequenciamento foi realizado utilizando a metodologia de síntese através da plataforma NextSeq (Illumina) com a utilização do kit NextSeq 500/550 Mid Output (300 ciclos), utilizando a metodologia paired-end de acordo com as instruções do fabricante.

5.5 BIOINFORMÁTICA 5.5.1 Pré-processamento dos Dados Brutos A demultiplexação e conversão dos arquivos BCL para o formato FASTQ (formato padrão para as próximas etapas das análises) dos dados gerados pelo sequenciador NextSeq Illumina foram realizados pelo Laboratório do Centro de Genômica e Biologia de Sistemas da Universidade Federal do Pará, utilizando o programa bcl2fastq Conversion v.2.20.0. A partir desse processo, foram gerados dois arquivos fastq, R1 e R2, sendo que os dois arquivos (leituras brutas) foram agrupados em apenas um para as análises. A etapa de tratamento dos dados brutos, foi realizada na Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas. Na primeira etapa foi utilizado o programa 41

SortMeRNA v.2.1 para a remoção do RNA ribossomal (rRNA) (KOPYLOVA et al., 2012), sequências redundantes, aquelas que apresentaram 100% de identidade entre si foram removidas, utilizando o CD-HIT (FU et al., 2012). Em seguida foi utilizado o programa Trim Galore v.0.4.5 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) para remover leituras curtas (menores que 75 nt), restos de adaptadores e leituras com bases indeterminadas (leituras com mais de um N) e para fazer o FastQC do dado tratado. Posteriormente foi utilizado o programa DIAMOND (BUCHFINK; XIE; HUSON, 2015) para anotação das leituras utilizando a base de dados de proteínas RefSeq viral para cada arquivo, levando-se em consideração os valores de E-value e identidade aminoacídica. Os arquivos de saída gerados pelo DIAMOND foram convertidos em arquivos de saída tabular no BLAST. Esse processo foi feito para gerar gráficos no programa Megan v. 6.8 (HUSON et al., 2007; HUSON, 2016) (FIGURA 10A).

5.5.2 Montagem De Novo Os arquivos gerados na etapa de tratamento do dado foram utilizados para a montagem através da metodologia De Novo utilizando os programas MetaSPAdes (BANKEVICH et al., 2012) e IDBA-UD (PENG et al., 2012). Os valores de k-mer para MetaSPAdes foram de 21,33,55,77 e para IDBA-UD de 20, 40, 60, 80 e 100. Posteriormente foi utilizado o programa DIOMAND (BUCHFINK; XIE; HUSON, 2015) para anotação dos contigs gerados por ambos os montadores utilizando a base de dados de proteínas RefSeq viral levando-se em consideração os valores de E-value e identidade aminoacídica (FIGURA 10B) e posteriormente foram analisados pelo Megan para a geração de gráficos taxonômico.

5.5.3 Curadoria e Análise filogenética Os contigs que apresentaram relação com o objetivo principal do estudo foram analisados e curados pelo programa Geneious versão 9.1.4 (https://www.geneious.com/), e posteriormente analisados pelo programa Blastx disponível no site do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast). Todos os contigs filtrados pelo Megan foram comparados no banco de dados de proteínas Swiss-Prot (http://web.expasy.org), que consiste em uma base de dados de proteínas curado que fornece um elevado nível de anotação, mínima redundância e alto grau de integração com outras bases de dados (BAIROCH, 2000). O alinhamento múltiplo das sequencias nucleotídicas identificadas neste estudo, foram alinhadas através do programa ClustalW (LARKIN et al., 2007), juntamente com outras diferentes sequências disponíveis no NCBI. O programa jModelTest foi utilizado para realizar a seleção estatística do melhor modelo de substituição nucleotídica aplicado na análise 42

filogenética (POSADA, 2008). Posteriormente foi empregada a metodologia de Máxima Verossimilhança por meio do programa RaxML ( Randomized Axelerated Maximum Likelihood ) utilizado para a construção da árvore filogenética (STAMATAKIS, 2014). Foi aplicado também, o teste de bootstrap conjuntamente ao método de MV fixando-se 1000 réplicas para proporcionar confiabilidade aos valores dos grupamentos (FELSENSTEIN, 1985).

Figura 10 – Etapa de tratamento e montagem dos dados. (A) Pré-processamento dos dados (B) Montagem de novo

5.5.4 FastViromeExplorer O dado bruto também passou por uma pré-análise de detecção rápida de vírus através do pepiline FastViromeExplorer (TITHI et al., 2018) realizada pelo Laboratório do Centro de Genômica e Biologia de Sistemas da Universidade Federal do Pará. Foi realizado ajustes em três parâmetros padrão do programa para a obtenção dos resultados: –cr (valor dos critérios de proporção: padrão 0,3 ), -co (valor dos critérios de cobertura: padrão 0,1 ) e –cn (valor de critérios de leituras: padrão 10 ), no qual foi utilizado o seguinte comando: “java -cp bin FastViromeExplorer -1 nelielma/BaseCalls/fastq_files2/Amostra_R1_001.fastq.gz -2 nelielma/BaseCalls/fastq_files2/Amostra_R2_001.fastq.gz -i ncbi-virus-kallisto-index- k31.idx -o figado_s9 -cr 0.1 -co 0.05 -cn 2 ”. O programa filtra os resultados do alinhamento com base em critérios mínimos de cobertura e relata tipos de vírus, abundancia e anotações taxonômicas. O programa se baseia em duas principais etapas: 1 – mapeamento de leituras para um banco de dados de referência e 2 – etapa de filtragem, em que os resultados do mapeamento são submetidos a três critérios principais (proporção, cobertura e valor do número de critérios de leituras) para assegurar a qualidade de detecção viral e para possibilitar a redução do número de resultados falso- positivos.

6 RESULTADOS Os resultados obtidos apresentam perfil de detecção e abundância de vírus em dez amostras (fígado, cérebro e pool de vísceras) de pequenos mamíferos (roedores e marsupiais) das ordens Rodentia e Marsupialia. Das referidas amostras, foram construídas bibliotecas genômicas (cDNA) para o processo de sequenciamento, do qual foram geradas em média um total de 31,821 milhões de leituras. Os dados individuais das amostras estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 – Dados individuais das amostras pós-sequenciamento DADO BRUTO ANIMAL ID AMOSTRA (Leituras) Marmosa murina MA7049 Fígado 23,083,368.00 Marmosa murina MA7050 Fígado 20,226,386.00 Metachirus sp. MA7053 Fígado 34,585,464.00 Metachirus sp. MA7053 Vísceras 38,751,852.00 Philander sp. MA7054 Fígado 25,807,166.00 Philander sp. MA7054 Vísceras 33,483,380.00 Proechimys sp. RO22799 Fígado 29,624,298.00 Proechimys sp. RO22799 Vísceras 38,632,322.00 Proechimys sp. RO22876 Cérebro 40,374,438.00 Proechimys sp. RO22878 Cérebro 33,642,686.00

6.1 PROCESSAMENTO DOS DADOS Os arquivos brutos (RawData) previamente convertidos em fastq, passaram individualmente pela etapa de tratamento para a obtenção de leituras com maior qualidade para pesquisa de sequencias virais. As informações da limpeza dos dados, bem como o percentual de remoção de leituras por amostra estão representados na Figura 11. Para remover o rRNA foi utilizado o programa SortMeRNA, com o qual observou-se redução significativa de leituras (91%). Em relação à etapa de remoção de sequências redundantes pelo CD-HIT, foi removido 53% dos dados e na passagem pelo TrimGalore para retirada de leituras curtas, adaptadores e bases indeterminadas a redução foi menor, cerca de 20%. Depois de tratado, foram obtidas em média 1,097 milhões de leituras, totalizando 10,973 milhões para a montagem de novo , na qual foram utilizados os programas MetaSPAdes e IDBA-UD. As informações do total de leituras tratadas e o percentual de remoção estão representados na Figura 12.

Figura 11 – Etapa de limpeza e percentual de remoção de leituras por amostra no tratamento dos arquivos brutos. (A) Valores absolutos de leituras removidas, (B) valores relativos de leituras removidas

Figura 12 – Etapa de limpeza e percentual de remoção total de leituras dos arquivos brutos. (A) Número total de arquivos tratados, (B) percentuais de remoção de leituras

350000000 A 318211360 300000000

250000000

200000000

150000000

Nº totalNº de leituras 100000000

50000000 28995595 13754381 10973560 0 RawData SortMeRNA CD-HIT TrimGalore

6.2 REPRESENTAÇÃO TAXONÔMICA DOS VIRUS DETECTADOS

6.2.1 Gêneros virais Os arquivos paired-end (R1 e R2) tratados passaram pela análise no Diamond (Blastx ), os quais foram confrontados com o banco de dados RefSeq para proteína viral, levando em consideração a similaridade de sequencias. Ao final do processo, os resultados foram então avaliados no Megan que gerou gráficos taxonômicos, apresentando diversos gêneros virais (ANEXO A), dos quais os mais abundantes estão representados no Tabela 3. Na etapa de montagem pela metodologia de novo , foram gerados através do programa MetaSPAdes um total de 442,149 mil contigs e 54,727 mil pelo IDBA-UD. O número de contigs gerados por montador para cada amostra está representado na Figura 13. A partir desse processo, os arquivos de saída dos montadores foram anotados e caracterizados pelo Blastx através do programa Diamond e posteriormente avaliados no Megan para classificação taxonômica dos vírus detectados. A ferramenta gerou gráficos, apresentando diversidades de gêneros virais (ANEXO B). No entanto, os montadores não obtiveram resultados para todas as amostras, mas em contrapartida, o programa MetaSPAdes apresentou o maior número de detecções. Os gêneros mais abundantes estão representados no Tabela 4.

Figura 13 – Número de contigs por amostra gerados na montagem de novo pelos programas MetaSPAdes e IDBA-UD

100000 90000 80000 70000 60000

contigs 50000 40000

Nº de Nº 30000 SPAdes 20000 10000 IDBA 0

Tabela 3 – Principais gêneros virais detectados pela análise dos dados brutos no Diamond ( Blastx ) ANIMAL AMOSTRA GÊNERO

Marmosa murina MA7049 (Fígado) Epsilonretrovirus Gammaretrovirus

Marmosa murina MA7050 (Fígado) Vírus de RNA não classificado Gammaretrovirus

Metachirus sp MA7053 (Fígado) Orthobunyavirus Gammaretrovirus

Metachirus sp MA7053 (Vísceras) Gammaretrovirus Betaretrovirus

Philander sp MA7054 (Fígado) Gammaretrovirus Epsilonretrovirus

Philander sp MA7054 (Vísceras) Gammaretrovirus Epsilonretrovirus

Proechimys sp RO22799 (Fígado) Hepacivirus Betaretrovirus

Proechimys sp RO22799 (Vísceras) Hepacivirus Betaretrovirus

Proechimys sp RO22876 (Cérebro) Betaretrovirus Gammaretrovirus

Proechimys sp RO22878 (Cérebro) Hepacivirus Betaretrovirus 49

Tabela 4 – Principais gêneros virais detectados pela montagem de novo através dos programas MetaSPAdes e IDBA-UD ANIMAL AMOSTRA MONTADORES GÊNERO MetaSPAdes - - Marmosa murina MA7049 (Fígado) IDBA-UD - - MetaSPAdes Gammaretrovirus - Marmosa murina MA7050 (Fígado) IDBA-UD - - MetaSPAdes Orthobunyavirus Gammaretrovirus Metachirus sp MA7053 (Fígado) IDBA-UD Orthobunyavirus Gammaretrovirus MetaSPAdes Gammaretrovirus Betaretrovirus Metachirus sp MA7053 (Vísceras) IDBA-UD Betaretrovirus - MetaSPAdes Gammaretrovirus Alpharetrovirus Philander sp MA7054 (Fígado) IDBA-UD - - MetaSPAdes Gammaretrovirus Atlantic salmon swim bladder sarcoma virus Philander sp MA7054 (Vísceras) IDBA-UD - - MetaSPAdes Hepacivirus Betaretrovirus Proechimys sp RO22799 (Fígado) IDBA-UD Hepacivirus - MetaSPAdes Betaretrovirus Hepacivirus Proechimys sp RO22799 (Vísceras) IDBA-UD Hepacivirus Betaretrovirus MetaSPAdes Gammaretrovirus Betaretrovirus Proechimys sp RO22876 (Cérebro) IDBA-UD Gammaretrovirus Betaretrovirus MetaSPAdes Hepacivirus Betaretrovirus Proechimys sp RO22878 (Cérebro) IDBA-UD Hepacivirus Gammaretrovirus

6.2.2 Espécies virais Do total de 442,14 mil contigs gerados pelo MetaSPAdes, 191,89 deles foram referentes as amostras MA7053 (Fígado), RO22799 (Fígado/Vísceras) e RO22878 (Cérebro), e desses, 33 contigs apresentaram identidade aminoacídica pelo Blastx através do programa Diamond para as seguintes espécies: Vírus Caraparu (1/33), Hepacivirus de roedor (RHV) (22/33) e Hepacivirus F (HFV) (10/33). Na montagem feita pelo programa IDBA foram gerados 54,72 mil contigs e desses 27,57 mil para as mesmas amostras e apenas 21 deles apresentaram similaridade aminoacídica para as espécies virais: Vírus Caraparu (1/21), Hepacivirus de roedor (10/21) e Hepacivirus F (10/21). As informações taxonômicas, o número e tamanho dos contigs gerados pelos montadores individualmente para as três amostras estão representados na Tabela 5. Tabela 5 – Vírus detectados nas amostras MA7053 (Fígado), RO22799 (Fígado/Vísceras) e RO22878 (Cérebro)

Nº Tamanho Nº Tamanho ID da Animal Vírus contigs médio pares contigs médio pares amostra SPAdes de base (pb) IDBA de base (pb) Metachirus MA7053 Caraparu 1 316 1 316 sp. (Fígado) virus Rodent 9 614 4 1339 RO22799 hepacivirus (Fígado) Proechimys Hepacivirus F 4 702 4 593 sp. Rodent 3 3117 2 3494 RO22799 hepacivirus (Vísceras) Hepacivirus F 2 1041 2 649 Rodent 10 544 4 850 Proechimys RO22878 hepacivirus sp. (Cérebro) Hepacivirus F 4 485 4 718

6.2.3 Análise filogenética dos hepacivírus detectados No processo da montagem pela metodologia de novo foram gerados contigs de tamanhos variados, apresentando identidade para Hepacivirus , os quais foram alinhados e ordenados para obtenção de um único contig referente ao genoma do Hepacivirus , foram adicionados “NNNNN’s” nas regiões que não tiveram cobertura e o genoma foi utilizado na análise filogenética. Na árvore filogenética estão representados dois clados (superior e inferior) geneticamente distintos, sendo o superior englobando roedores, primatas não humanos, bovinos e humanos, e no inferior estão humanos, cães, equinos, morcegos e roedores. Os hepacivírus detectados neste estudo apresentaram maior similaridade com RHV detectado em 51

roedor da espécie Proechimys simispinosus , sendo agrupados filogeneticamente no mesmo clado (superior) (FIGURA 14). A estrutura dos domínios da poliproteína referente ao RHV detectado na amostra RO22799 deste estudo é semelhante aos Hepacivirus , apresentando dois domínios estruturais (Core e Env), quatro não estruturais (NS2, NS4b, NS5a_1a e NS5a_1b), uma estrutura da peptidase (S29) e um domínio correspondente a família Flaviviriade (Flavi_DEAD) (FIGURA 15).

Figura 14 – Filogenia dos hepacivírus detectados nas amostras RO22799 e RO22878

Figura 15 – Estrutura dos domínios da poliproteína referente ao Hepacivirus detectado na amostra RO22799

6.2.4 Famílias virais detectadas pelo FastViromeExplorer Os arquivos brutos passaram individualmente por uma pré-análise taxonômica de detecção rápida de vírus pelo FastViromeExplorer, o qual detectou leituras de vírus de RNA condizentes a várias famílias virais, dentre elas: Peribunyaviridae, Retroviridae, Tospoviridae , Circoviridae , Reoviridae , Anelloviridae e Totiviridae , além de vírus não classificados ( Unclassified ) em nenhuma das famílias existentes (APÊNDICE A). Os quatro principais gêneros virais detectados estão representados no Tabela 6.

Tabela 6 – Principais famílias virais detectadas pelo FastViromeExplorer

Animal Amostra Família MA7049 Marmosa murina Peribunyaviridae Partitiviridae Totiviridae Virgaviridae (Fígado) MA7050 Marmosa murina Peribunyaviridae Partitiviridae Virgaviridae Retroviridae (Fígado) MA7053 Metachirus sp. Peribunyaviridae Partitiviridae Virgaviridae Polydnaviridae (Fígado) Saccharomyces MA7053 Polydnavirida Metachirus sp. Peribunyaviridae Partitiviridae cerevisiae killer virus (Vísceras) e não classificado MA7054 Philander sp. Peribunyaviridae Polydnaviridae Partitiviridae Totiviridae (Fígado) Saccharomyces MA7054 Philander sp. Peribunyaviridae Polydnaviridae Partitiviridae cerevisiae killer virus (Vísceras) não classificado Saccharomyces RO22799 Proechimys sp. Peribunyaviridae Partitiviridae Virgaviridae cerevisiae killer virus (Fígado) não classificado RO22799 Proechimys sp. Peribunyaviridae Polydnaviridae Partitiviridae Virgaviridae (Vísceras) RO22876 Proechimys sp. Peribunyaviridae Polydnaviridae Partitiviridae Bromoviridae (Cérebro) Saccharomyces RO22878 Proechimys sp. Peribunyaviridae Polydnaviridae Partitiviridae cerevisiae killer virus (Cérebro) não classificado 53

7 DISCUSSÃO Neste estudo, foi realizada a análise metagenômica para detectar genoma de arbovírus e outros vírus de RNA em amostras de pequenos mamíferos (roedores e marsupiais), a fim de determinar suas classificações taxonômicas e elucidar as espécies virais que estão relacionadas às infecções nos animais deste estudo e que podem representar riscos à saúde humana. Essa metodologia veio para acentuar as pesquisas a níveis consideráveis no ramo da biologia molecular, superando as limitações dos métodos tradicionais utilizados principalmente na detecção de agentes virais, trazendo consigo técnicas inovadoras, sensíveis e rápidas que podem fornecer informações cruciais desses agentes biológicos dos mais variados biomas (MOKILI; ROHWER; DUTILH, 2012; HALL et al., 2015). Além disso, essa abordagem metodológica conta com sistemas e programas computacionais avançados para garantir o processamento e análise das milhões de leituras, produzidas por equipamentos especializados em sequenciamento de nova geração para obtenção de genomas ou partes dele, como o NextSeq (Illumina) (LIU et al., 2012; BZHALAVA; DILLNER, 2013). A realização de limpeza dos dados brutos ocorreu para eliminar sequências indesejáveis e gerar arquivos com maior número possíveis de sequências virais e ajudar na minimização de tempo durante a análise computacional. Com isso, para classificar as leituras obtidas a partir das amostras dos roedores e marsupiais, utilizamos programas computacionais para análise algorítmica de forma distinta, com o intuito de aumentar a cobertura da montagem. Na análise inicial dos dados (R1 e R2) tratados foi utilizado o Blastx através do Diamond que buscou similaridade com sequencias virais já descritas. A partir dessa análise, o programa Megan gerou gráficos taxonômicos o qual revelou à presença de vários gêneros virais (ANEXO A), dentre eles: Ortobunyavirus, Hepacivirus , gêneros pertencentes a família Retroviridae (Gammaretrovirus, Betaretrovirus, Epsilonretrovirus e Alpharetrovirus ) e vírus de RNA não classificado em nenhuma dos gêneros conhecidos. No estudo conduzido por Braga, 2017, também realizou estudo metagenômico com amostras de fígado, vísceras e sangue de espécies de roedores e identificou sequências de alguns agentes virais pertencentes a família Retroviridae , como o Koala retrovirus e Feline leukemia virus membros do gênero Gammaretrovirus e Squirrel monkey retrovirus membro do gênero Betaretrovirus . Wu et al., 2018 analisaram amostras de swabs faríngeos e anais através da análise metagenômica e identificaram leituras virais atribuídas a diversas famílias a 54

partir de amostras de roedores, dentre elas: Flaviviridae, Retroviridae, Coronaviridae e Adenoviridae . Em relação às amostras MA7053 (Fígado), RO22799 (Fígado e Vísceras) e RO22878 (Cérebro), foi possível gerar através dos programas MetaSPAdes e IDBA-UD contigs para os vírus: CARV, RHV e FHV. Apesar de nem todas as amostras apresentarem resultados, os montadores também geraram contigs para vírus de gêneros da família Retroviridae (Gammaretrovirus, Betaretrovirus e Epsilonretrovirus ) (ANEXO B). Na análise realizada através do programa MetaSPAdes para a amostra MA7053 (Fígado) foi gerado para o CARV apenas um contig com 316 pares de base com 99% de identidade para o segmento L que codifica a polimerase viral. O mesmo foi observado pela montagem através do programa IDBA-UD. Devido ao baixo número de leituras (12 leituras) para o CARV, pode significar que o animal da amostra em questão possivelmente estava no final do processo virêmico ou o vírus não apresenta replicação em altas titulações nessa espécie, e consequentemente baixa carga viral que dificultaria a detecção do seu genoma completo. O CARV foi isolado pela primeira vez em 1956 de um macaco sentinela ( Sapajus apella ) na floresta de Utinga em Belém do Pará, Brasil. Posteriormente, foi registrado isolamento a partir de sangue humano (trabalhador florestal febril) e de artrópodes pertencentes à mesma região (CAUSEY et al., 1961). Ele faz parte da família Peribunyaviridae e apresenta característica comum a seus membros de infecção aguda de curto período virêmico nos hospedeiros vertebrados, principalmente roedores e marsupiais (NICHOL et al., 2005; SCHMALJONH; NICHOL, 2007). O CARV é um arbovírus que faz parte do grupo antigênico C do gênero Orthobunyavirus , e tem sido associado a infecções humanas com sintomatologia similar a dengue, em que ocorre febre, cefaleia, náuseas, mialgia e fraqueza como os principais sintomas. Estudos realizados na Amazônia brasileira apresentam informações sorológicas de maior prevalência de anticorpos para o CARV em animais silvestres como os roedores e marsupiais do que para outros vírus desse grupo (NUNES et al., 2005, AZEVEDO et al., 2007). Para as amostras RO22799 (Fígado) e RO22799 (Vísceras) o programa MetaSPAdes gerou 9 e 3 contigs para o RHV que apresentou em média 614 e 3117pb com 61,5% e 67% de identidade aminoacídica, respectivamente, além de 4 e 2 contigs das mesmas amostras para o HFV apresentando tamanho médio de 702 e 1041pb com 63 e 67% em média de identidade, respectivamente. Já pela análise do programa IDBA-UD, foram obtidos 4 (RO22799-Fígado) 55

e 2 (RO22799-Vísceras) contigs para o RHV de cada uma das amostras, apresentando em média 1339 e 3494pb com 55,5% e 60,5% de identidade aminoacídica e para o HFV foram gerados 4 e 2 contigs com tamanho médio de 593 e 649pb com 63% e 69%, respectivamente. Na análise da amostra RO22878 (Cérebro) o MetaSPAdes gerou 10 contigs com tamanho médio de 544pb e 61,4% de identidade média para o RHV e 4 contigs apresentando em média 485pb com 60,75% de identidade para o HFV. Em relação ao programa IDBA-UD, foram gerados 4 contigs para cada um dos vírus em questão (RHV e HFV), com tamanho médio de 850 e 718pb com 63% e 67,5% em média de identidade aminoacídica, respectivamente. O Vírus da hepatite C (HCV) é o membro mais bem caracterizado do gênero Hepacivirus e representa uma das principais causas de morbidade e mortalidade entre os humanos devido ocasionar hepatite, cirrose e até câncer hepático (SMITH et al., 2016). Nos últimos anos vários estudos identificaram novos vírus mais divergentes que apresentaram estruturas genômicas e sequencias conservadas semelhantes ao HCV, isolados a partir de grande variedade de animais hospedeiros, como cães, cavalos, morcegos, primatas e roedores (KAPOOR et al., 2011; BURBELO et al., 2012; QUAN et al., 2013; DREXLER et al., 2013; KAPOOR et al., 2013). Devido as semelhanças e diferenças genéticas entre o HCV e o RHV, foi proposta a inclusão do RHV dentro do gênero Hepacivirus como sendo uma nova espécie (DREXLER et al., 2013; KAPOOR et al., 2013). No ano de 2016, Smith et al., (2016), propuseram a inclusão no gênero Hepacivirus de 13 novas espécies detectadas nos últimos 10 anos, incluindo os RHV e devido a detecção de sequências em diferentes espécies de roedores do Novo e do Velho Mundo com variações genéticas entre si, foi proposto que os hepacivírus de roedores fossem separados em duas espécies Hepacivirus E e Hepacivirus F , recentemente aceito pelo Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) (ICTV, 2018). No estudo de Kapoor et al. (2013), identificaram cinco sequencias de RHV as quais sugeriram classificar como novas espécies, baseando-se nas análises filogenéticas a partir da sequência parcial da helicase e nas distâncias genéticas intraespecíficas do HCV. Também foi detectado três dessas espécies em um único hospedeiro o camundongo cervídeo (Peromyscus maniculatus ) e duas outras espécies de RHV em ratos de madeira do deserto (Neotoma lepida ) e ratos de bolso hispid (Chaetodipus hispidus ), sendo que uma dessas espécies revelou diversidade genética intraespécie. No estudo metagenômico realizado por Firth et al. (2014), também foram detectadas sequencias de dois novos hepacivírus em ratos da Noruega e sugeriram que devido a detecção 56

do RNA viral nas amostras de excrementos e saliva é possível que a transmissão entre os animais possa ocorrer através da inalação, mordida ou ingestão. Nosso estudo detectou pela primeira vez leituras do genoma de RHV em roedor do gênero Proechimys sp . de região da Amazônia brasileira, em amostras de tecido hepático e cérebro, podendo sugerir que o RHV também possa ser neurotrópico. A filogenia para o RHV detectado neste estudo apresentou similaridade com uma espécie de RHV isolado de roedor da espécie Proechimys simispinosus , agrupando-se no mesmo clado (superior) e os domínios da poliproteína apresentou semelhança com os Hepacivirus nas regiões que codificam proteínas estruturais (Core e Env), não estruturais (NS2, NS4b, NS5a_1a e NS5a_1b), além da apresentação de uma estrutura da peptidase (S29) responsável pela clivagem das proteínas estruturais e um domínio que corresponde a família Flaviviriade (Flavi_DEAD). Schmid et al. (2018), detectou e isolou o genoma completo desse vírus (RHV) a partir de amostra de sangue do roedor da espécie Proechimys simispinosus no Panamá, objetivando investigar os efeitos de mudanças ambientais nas comunidades de pequenos mamíferos e seu impacto sobre a prevalência de hepacivírus, concluindo então, que as mudanças ambientais influenciadas pela ação humana estabelecem probabilidades de transmissão, infecção e prevalência do vírus entre a comunidade desses pequenos mamíferos. Esses achados em roedores de diferentes espécies apresentam importância significativa para estudos de infecções por hepacivírus, principalmente com relevância nos estudos do HCV devido à falta de pequenos animais como modelos adequados de infecção e apesar de ser um dos mais estudados, ainda necessita de esclarecimentos em muitos aspectos, incluindo virulência, patogênese e resposta imune do hospedeiro (KAPOOR et al., 2013; FIRTH et al., 2014). A utilização do programa FastViromeExplorer ocorreu como uma espécie de pré- análise para uma busca rápida de taxonomias de possíveis agentes virais nos arquivos brutos (R1 e R2) deste estudo. No entanto, o programa não disponibiliza valores de identidade dos vírus encontrados, apenas apresenta sequências detectadas e as mais abundantes. Diante disso, foram detectadas várias famílias virais dentre elas: Peribunyaviridae, Retroviridae e Togaviridae , além de outras famílias virais que possuem vírus de plantas ( Partitiviridae ), vírus de insetos ( Polydnaviridae, Bromoviridae e Virgavirdae ) e agentes que não apresentam classificação em nenhuma das famílias existentes (APENDICE A). Alguns estudos metagenômicos também detectaram diversos agentes virais em espécies de roedores, incluindo descobertas de novos vírus, bem como, de espécies já 57

existentes (PHAN et al., 2011; WU et al., 2018). No estudo conduzido por Phan et al. (2011), foram detectados vírus pertencentes a diversas famílias virais que infectam pequenos mamíferos ( Astroviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Papilomaviridae, Picornaviridae , dentre outras), insetos ( Bromoviridae, Polydnaviridae, Virgaviridae, etc.) e plantas (Partitiviridae, Geminiviridae , dentre outras). Os autores concluíram que os vírus de plantas e insetos refletem a dieta dos roedores e que possivelmente os vírus de planta não apresentam risco a saúde humana por ainda não haver evidências do envolvimento desses agentes em patologias. Porém, alguns estudos relataram presença de RNA de vírus vegetal no trato respiratório de pessoas fumantes e no intestino, por conta de consumo de alimentos contaminados (COLSON et al., 2010; BALIQUE et al., 2012). Os resultados apresentados pela pré-análise do fastviromeexplorer, mostraram-se distintos as análises posteriores. Isso ocorreu provavelmente devido ao processo de tratamento dos dados brutos, a utilização de bancos de dados e algoritmos diferentes entre os programas, baixa abundância de leituras de vírus de RNA nas amostras, além de ajustes nos valores padrão de três parâmetros, –cr (valor dos critérios de proporção), –co (valor dos critérios de cobertura) e –cn (valor de número de critérios de leituras) para a obtenção dos resultados, levando em consideração instruções dos desenvolvedores do programa sobre a necessidade de adaptar esses parâmetros de acordo com os estudos de cada usuário. Com exceção do CARV, não foram encontradas sequencias de outros vírus de RNA nocivos à saúde humana, talvez por conta do curto período de infecção aguda, baixa replicação de algumas espécies ou também por muitas dessas espécies não apresentarem tropismo pelos tecidos estudados.

8 CONCLUSÃO

• Os achados deste estudo podem reforçar o conhecimento sobre as comunidades virais que circulam em pequenos animais (roedores e marsupiais) na região Amazônica, especialmente próximo de cidades como Viseu. • A análise metagenômica demonstrou a presença de diferentes tipos de vírus presentes nas amostras de roedores e marsupiais, por meio da detecção das sequencias de seus genomas e identificação através da bioinformática. • A análise filogenética para o RHV detectados neste estudo, apresentaram similaridade com o Rodent Hepacivirus isolado do roedor da espécie Proechimys simispinosus , agrupando-se no mesmo clado. • Neste estudo foi detectado pela primeira vez sequencias do RHV em roedor do gênero Proechimys sp , de região da Amazônia brasileira, além da detecção de sequências em amostra de cérebro, indicando o possível neurotropismo do RHV. • A detecção de um contig com elevada identidade aminoacídica de 99% para o CARV sugere que o animal pudesse estar ao final do processo virêmico, porém a detecção de mais segmentos ou até mesmo o vírus podem estar presentes em outras amostras do animal estudado e que a tentativa de isolamento poderia ser realizada para identificação da particular viral.

Apoio financeiro O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001

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APÊNDICE A – Gráficos de classificação taxonômica gerados pelo FastViromeExplorer das amostras MA7049-Fígado, MA7050-Fígado, MA7053-Fígado e Vísceras, MA7054-Fígado e Vísceras, RO22799-Fígado e Vísceras, RO22876-Cérebro e RO22878-Cérebro

ANEXO A – Gráficos gerados pelo Megan após análise pelo Diamond (Blastx) dos arquivos brutos (R1 e R2) das amostras MA7049-Fígado, MA7050-Fígado, MA7053-Fígado e Vísceras, MA7054-Fígado e Vísceras, RO22799-Fígado e Vísceras, RO22876-Cérebro e RO22878-Cérebro.

ANEXO B – Gráficos gerados pelo Megan pós-montagem de novo através dos programas SPAdes e IDBA-UD das amostras MA7053-Fígado e Vísceras, MA7054-Fígado e Vísceras, RO22799-Fígado e Vísceras, RO22876-Cérebro e RO22878-Cérebro.

ANEXO C – Certificado de aprovação do CEUA para manipulação de material biológico armazenado