Bakteriofágy V Nanotechnologiích

PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Bakteriofágy v nanotechnologiích

Bakalářská práce

MARTIN STAROSTKA

Vedoucí práce: Mgr. Ivana Mašlaňová, Ph.D.

Ústav experimentální biologie obor Speciální biologie

Brno 2020

BAKTERIOFÁGY V NANOTECHNOLOGIÍCH

Bibliografický záznam

Autor: Martin Starostka Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Bakteriofágy v nanotechnologiích Studijní program: Experimentální biologie Studijní obor: Speciální biologie Vedoucí práce: Mgr. Ivana Mašlaňová, Ph.D. Rok: 2020 Počet stran: 82 Klíčová slova: nanotechnologie, nanomedicína, bakteriofágy, fágový displej, biosenzory, nanovlákna, fágové vakcíny, nanopóry

BAKTERIOFÁGY V NANOTECHNOLOGIÍCH

Bibliographic record

Author: Martin Starostka Faculty of Science Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Bacteriophages in nanotechnology Degree Programme: Experimental Biology Field of Study: Special Biology Supervisor: Mgr. Ivana Mašlaňová, Ph.D. Year: 2020 Number of Pages: 82 Keywords: nanotechnology, nanomedicine, bacteriophage, phage display, biosensors, nanowires, phage vaccines, nanopores

BAKTERIOFÁGY V NANOTECHNOLOGIÍCH

Abstrakt

Bakteriofágy jsou nejvíce abundantní entitou na této planetě. Široké spektrum jejich vlastností a morfologie spolu s jednoduchými možnostmi genetické modifikace poskytuje účinný nástroj pro celou řadu aplikací napříč průmyslem. Tato práce je zaměřena na využití fágů v relativně novém, rychle se rozvíjejícím vědním oboru, nanotechnologii. Selekční nástroj genového inženýrství, metoda fágového displeje, poskytuje jednoduchou možnost modifikace fágového povrchu. Identifikace a selekce peptidů s afinitou k organickým i anorganickým substrátům umožňuje vznik materiálů na bázi proteinů. Fágová schopnost samosestavení propůjčená těmto materiálům z nich činí ideální nástroj pro nanotechnologickou aplikaci, zejména pak v nanomedicíně.

BAKTERIOFÁGY V NANOTECHNOLOGIÍCH

Abstract

Bacteriophages are the most abundant entity on this planet. The wide spectrum of their properties and morphology together with the ease of their genetic manipulation makes them an excellent tool for application throughout the industry. This thesis takes a closer look at the use of phages at the relatively new, rapidly developing field of nanotechnology. The selection instrument of genetic engineering, the phage display method, provides a simple way to modify the phage surface. Identification and selection of peptides with the affinity to organic and inorganic substrates allows the development of protein-based materials. The self-assembly property of phages makes these materials even more interesting for the application in nanotechnology, especially in nanomedicine.

BAKTERIOFÁGY V NANOTECHNOLOGIÍCH

Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením vedoucího práce s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

V Brně 13. března 2020 ...... Martin Starostka

BAKTERIOFÁGY V NANOTECHNOLOGIÍCH

Poděkování

Na tomto místě bych rád poděkoval své školitelce Mgr. Ivaně Mašlaňové, Ph.D. a svému konzultantovi doc. Ing. Romanu Grögerovi, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady, připomínky a trpělivost při vypracování této práce.

OBSAH

Obsah

Seznam obrázků 15

Seznam pojmů a zkratek 16

1 Úvod 19

2 Nanotechnologie 21 2.1 Historie a vývoj ...... 21 2.2 Nanomedicína...... 22 2.3 Nanotechnologie pro separaci mikročástic ...... 27

3 Bakteriální viry 29 3.1 Charakteristika ...... 29 3.2 Morfologie ...... 29 3.3 Životní cyklus...... 34 3.4 Terapeutické využití bakteriofágů ...... 36

4 Fágová nanotechnologie 41 4.1 Biosenzory ...... 42 4.2 Vláknité fágy jako základ nanovláken a jiných nanomateriálů ...... 47 4.3 Fágy pro přenos genů a vakcín ...... 55 4.4 Nanopóry ...... 62

5 Závěr 65

Použité zdroje 66

SEZNAM OBRÁZKŮ

Seznam obrázků

Obr. 1: Schématické zobrazení kvantových teček ...... 23 Obr. 2: Grafické znázornění modelového bakteriofága T4 ...... 30 Obr. 3: Rekonstrukce snímku z kryoelektronové mikroskopie ...... 31 Obr. 4: Životní cyklus bakteriofága ...... 36 Obr. 5: Schématické zobrazení metody fágového displeje ...... 41 Obr. 6: Upevnění bakteriofága T4 ke zlatému povrchu ...... 45 Obr. 7: Různé typy nanostruktur vzniklých po fágové modifikaci ...... 49 Obr. 8: Fágem řízená syntéza nanovlákna ...... 50 Obr. 9: Schématické zobrazení modifikovaného fága cíleného na denaturovaný kolagen ...... 60

SEZNAM POJMŮ A ZKRATEK

Seznam pojmů a zkratek

AgNPs – Silver nanoparticles; stříbrné nanočástice ASCs – Adult stem cells; kmenové buňky ATP – Adenosine triphosphage; adenosintrifosfát AuNPs – Golden nanoparticles; zlaté nanočástice BIND – Bactrial ice nucleation diagnostic; bakteriální diagnostika ledovou nukleací BREX – Bacteriophage exclusion; bakteriofágové vyloučení Cas – CRISPR-associated protein; proteiny asociované s CRISPR systémem CRISPR – Clustered regularly interspaced short palindromic repeats; krátké palindromové repetice přerušované mezerníky DISARM – Defence island system associated with restriction-modification; obranný systém asociovaný s restrikčně-modifikačním systémem EGFR – Epidermal growth factor receptor; receptor epidermálního růstového faktoru ELISA – Enzyme-linked imunosorbent assay G- – Gram-negative bacteria; gram-negativní bakterie G+ – Gram-positive bacteria; gram-pozitivní bakterie GC IONPs – Iron oxide nanoparticles coated with glycol-chitosan; nanočástice oxidu železa kryté glykol-chitosanem GC – Glycol-chitosan; glykol-chitosan Hoc – Higly immunogenic outer capsid protein; vysoce imunogenní vnější kapsidový protein IONPs – Iron oxide nanoparticles; nanočástice oxidu železa Li-ion – Lithium-ion battery; lithium-iontová baterie

16 SEZNAM POJMŮ A ZKRATEK

MALDI TOF MS – Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spektrometry; hmotnostní spektrometrie za použití ionizace laserem v přítomnosti matrice s detektorem doby letu PA – protective antigen; protektivní antigen PCR – Polymerase chain reaction; polymerázová řetězová reakce PEDOT – poly (3,4-ethylendioxythiofen) QCM – Quartz crystal microbalance; křemen-krystalová mikrobalance QD – Quantum dots; kvantové tečky SEPTIC – Sensing of phage-triggered ion sensing; snímání fágem indukované iontové kaskády Soc – Small outer capsid protein; malý vnější kapsidový protein SPR – Surface plasmon resonance; povrchová plasmonová rezonance VLP – Virus-like particle; viru podobná částice

ÚVOD

1 Úvod

Nanotechnologie je technický obor studující vlastnosti hmoty na úrovni nanometrů. Tato dimenze poskytuje materiálům naprosto odlišné vlastnosti od těch, které denně pozorujeme v makrosvětě. Vlastnosti nanomateriálů jsou ovlivňovány převážně kvantově-mechanickými jevy. Cílem odvětví je aplikace těchto poznatků pro vývoj nástrojů schopných posunout hranice našich technologických možností stejně jako usnadnit náš každodenní život. K velkému rozvoji nanotechnologie pomohl Richard Faynmen, který v roce 1959 přednesl svou přednášku na téma: „There is plenty of room at the bottom: an invitation to enter a new field of physics“ na sjezdu Americké fyzikální společnosti. Zlatá doba nastala v 80. letech minulého století s objevem fullerenů a uhlíkových nanotrubek. Od té doby hrají nanotechnologie důležitou roli ve vědě každého státu, např. v USA roku 2003 byl pokrok v nanotechnologiích uzákoněn jakožto národní priorita. V současné době jsou nanotechnologie využívány nejvíce v elektronice, strojírenství a chemickém průmyslu. Pro tuto práci je však klíčovou oblastí nanomedicína. Nanomedicína je rychle se rozvíjející obor medicíny, který se snaží aplikovat poznatky a technologické postupy nanotechnologií k léčbě a diagnostice nemocí, se kterými si současné postupy neumí poradit. Tato práce je zaměřena na teoretické využití bakteriofágů, virů infikujících bakterie, ve spojení s postupy nanotechnologického odvětví. Fágy lze aplikovat nejen samostatně, ale také v kombinaci s organickými a anorganickými materiály, hlavně pak s nanomateriály. Možné uplatnění fágové nanotechnologie lze nalézt právě v nanomedicíně. Již od dob svého prvního objevu hrály bakteriofágy významnou roli ve vědeckém pokroku na poli biologie. Pomohly k objasnění základní virové biologie a potvrdily tezi, že DNA je dědičným materiálem života. Bakteriální viry jsou velmi rozmanitou skupinou organismů, ať již svou morfologií nebo stavbou či spektrem hostitelů. Současná taxonomická znalost bakteriálních virů je však pouhou špičkou ledovce znalostí, neboť velká většina jich nebyla dosud popsána. Předpokládá se, že pro každý bakteriální druh existuje minimálně jeden druh fága, ne-li více. Díky svým vlastnostem, zejména pak jejich

19 ÚVOD specifitě vůči jednotlivým bakteriálním druhům, mají bakteriofágy široké spektrum užití, nejvíce pak v oblasti medicíny. V současnosti, kdy je na vzestupu bakteriální rezistence vůči antibiotikům, se vědci vrací zpět k původní myšlence fágové terapie neboli léčbě bakteriálních infekcí bakteriofágy.

20 NANOTECHNOLOGIE

2 Nanotechnologie

Nanotechnologie se zabývá tvorbou a aplikací technologie jejichž velikost se pohybuje přibližně mezi 1 a 100 nm. V této dimenzi hmota nabývá jedinečných, na velikosti závislých vlastností (Leon a kol., 2020). Závislost vlastností na velikosti částic je dána velkým poměrem povrchu k objemu na nanoúrovni, kdy dominantní roli hrají povrchové vazby. Jako příklad lze uvést v makrosvětě neprůhlednou měď, která je v nanoměřítku transparentní. Nebo křemík, běžně izolující, lze ve formě nanočástic použít jako vodič (Ochekpe a kol., 2009). Nanotechnologie má širokou škálu využití v mnoha odvětvích průmyslu včetně aplikace ve zdravotnictví, zemědělství, potravinářství nebo v různých konstrukcích (Chen a kol., 2013). Nanočástice jsou charakterizovány na základě velikosti, tvaru, povrchu, povrchové reaktivity, náboje, chemického složení a agregačního stavu (Thangavel, 2014).

2.1 Historie a vývoj

V přírodě se lze s nanomateriály setkat např. u magnetotaktických bakterií využívajících nanočástice oxidů železa k orientaci v magnetickém poli nebo u výjimečného zbarvení některých motýlů díky interakcím světla s komplexními nanočásticemi na jejich křídlech. Jako důkaz užití nanotechnologie v lidské historii může posloužit Lykurgův pohár. Tento pohár má neobvyklé optické vlastnosti vycházející z kovových nanočástic, které pohár zbarvují do zelené v přímém světle a červené ve světle transmitovaném (Leon a kol., 2020). Koncept „nanometru“ byl prvně publikován Richardem Zsigmondym, laureátem Nobelovy ceny za chemii v roce 1925. Formuloval termín nanometru ve smyslu charakterizace velikosti částic a jako první byl schopen změřit velikost částic koloidního zlata pomocí mikroskopu (Hulla a kol., 2015). Následný rozvoj nanotechnologií velmi ovlivnil většinu průmyslových oblastí a znamenal i vznik nových vědních odvětví, například nanomedicíny.

21 NANOTECHNOLOGIE

2.2 Nanomedicína

Nanomedicína je rychle se rozvíjející vědní obor využívající poznatky z oblasti nanotechnologií v boji proti dnes těžce léčitelným chorobám. Zmínit lze rakovinu, cukrovku, neurodegenerativní poruchy nebo kardiovaskulární onemocnění. Jednou z možností, jak by nanotechnologie mohly pomoci, např. v boji s rakovinou, je jejich využití jako nosiče léků a vakcín. Tyto nosiče by mohly mnohem přesněji a efektivněji cílit na nádorové buňky za současné redukce nežádoucího působení na zdravé tkáně. Další možností pro boj nejen s rakovinou je vývoj nanosond a nanosensorů pro časnou detekci a diagnostiku, neboť většina onemocnění je v ranných stádiích asymptomatická (Thangavel, 2014). Nanomedicína zahrnuje celkem tři podoblasti technologií, které kombinovaně využívá: i) nanobiotechnologie ii) nanotechnologie iii) nanobiomimetika. Nanobiotechnologii lze definovat jako využití nanobiologických objektů pro účely medicíny. Jedním z prvních případů této technologie je čtyřicet let starý objev monoklonálních protilátek. Nanotechnologie je navzdory využívání nebiologických částic s nanomedicínou spojovaná nejčastěji. Příkladem je právě využívání nanočástic, jako jsou nanorozměrové tyčinky, trubičky, kuličky atd., které jsou naprosto cizí fyziologickým systémům jako je lidské tělo. Poslední možností je nanobiomimetika, obor zkoumající struktury a mechanismy biologických systémů za účelem uplatnění těchto znalostí při návrhu a syntéze nanomateriálů (Bates, 2014).

2.2.1 Nanočástice využívané v medicíně Kvantové tečky (QD – quantum dots) jsou luminiscentní polovodičové nanočástice tvořené sty až tisíci atomy (Yadav & Raizaday, 2016). Toto je tak činí vhodným nástrojem ke studiu intracelulárních procesů pomocí elektronového nebo konfokálního mikroskopu. Tento postup se označuje jako in vivo pozorování tkání při diagnostické analýze (Larson a kol., 2003). Jednou z důležitých vlastností jsou optické. Se zvyšující se velikostí se jejich emisní maximum přesouvá do vyšších vlnových délek (Obr. 1). S velikostí naopak nesouvisí jejich excitační spektrum, které je relativně široké. Emisní spektrum je poměrně úzké, což umožňuje simultánní detekci vícebarevných QD při ozáření světlem 22 NANOTECHNOLOGIE o jediné vlnové délce. Jejich rezistence k vysvícení navíc umožňuje delší vizualizaci cíleného místa (Dahan a kol., 2003).

Obr. 1: Schématické zobrazení kvantových teček. QD obsahují polovodičové jádro, obal může být překryt hydrofilními, hydrofobními nebo amfifilními ligandy, které mohou být dále modifikovány dalšími složkami (proteiny, protilátky, léky). Emisní spektrum se liší v závislosti na velikosti částic; Zdroj: (Maysinger a kol., 2015); upraveno.

Zlaté nanočástice (AuNPs), jsou malé částice zlata s průměrem od jednoho do sta nanometrů. Při rozpuštění ve vodě jsou často označovány jako koloidní zlato. Důležitou vlastností zlatých nanočástic je, že jejich povrch lze snadno modifikovat pomocí ligandů s různými funkčními skupinami vykazujícími vysokou afinitu k jejich povrchu jako jsou např. thioly, fosfany a aminy. Takto konjugované částice by mohly dobře sloužit k ukotvení dalších funkčních skupin, jako jsou např. oligonukleotidy, proteiny nebo protilátky (Daniel & Astruc, 2004). Vazba těchto ligandů ovlivňuje fyzikálně-chemické vlastnosti částic jako je např. vodivost nebo redoxní potenciál. Toho lze využít jako detekčního signálu v různých zařízeních, kde by AuNPs sloužily jako základní platforma pro biologické ligandy. Zmínit lze např. biosenzory a bioelektronická zařízení (Haick, 2007).

Superparamagnetické nanočástice oxidu železa jsou malé syntetické částice Fe3O4 s velikostí jádra do 10 nm a s organickým nebo anorganickým obalem. Velkou výhodou 23 NANOTECHNOLOGIE těchto nanočástic je jejich biokompatibilita a netoxičnost (Thangavel, 2014). Nanočástice oxidu železa (IONPs – iron oxide nanoparticles) jsou vyvíjeny obzvláště jako kontrastní látka pro magnetickou rezonanci a jako terapeutické agens pro magnetickou hypertermii. Pro oba účely jsou velmi důležité jejich magnetické vlastnosti a vhodný obal. Nanočástice oxidů železa jsou často voleny jako nosiče léků, přičemž jedním z možných provedení je uzavření léčiva a IONPs do polymerního nebo anorganického obalu. Je však důležité, aby co nejvyšší nosnost částic neovlivnila vlastnosti umožňujících jejich in vivo užití. Velkou výhodou IONPs jako vakcínových nosičů je pak vyšší účinnost léčiva v rámci postižené tkáně než v případě podání léčiva samostatně (Cotin a kol., 2018). IONPs vykazují také skvělé baktericidní účinky, v některých případech lepší než některá komerčně dostupná antibiotika. Magneticky řízenou cestou lze superparamagnetické IONPs dopravit na přesné místo určení. Inbaraj a kol. (2012) porovnal dvě varianty IONPs s komerčně dostupnými antibiotiky linezolidem a cefaclorem. První variantou IONPs byly holé, nijak upravené nanočástice oxidu železa a druhou variantou byly IONPs překryté glykol-chitosanem neboli GC (ve vodě rozpustný polymer). Baktericidní účinek byl testován na G– i G+ bakteriích: Escherichia coli (proteobacteria), Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica subs. enterica serovar enteritidis (proteobacteria), Staphylococcus aureus (firmicutes), patřících k nejčastějším potravinovým patogenům. V porovnání s antibiotiky se jako účinnější vůči E. coli a S. enteritidis projevily obě varianty IONPs. Opačný výsledek však byl pozorován u druhu S. aureus a serovaru E. coli O157:H7. Při porovnání obou variant nanočástic se jevily jako účinnější GC IONPs. Pokrytí IONPs pomocí glykol-chitosanu zvyšuje rozpustnost ve vodě. Hydrofilní povaha GC IONPs signifikantně přispívá k antibakteriálnímu účinku, neboť hydrofobní interakce mezi mikroorganismy a substrátem usnadňuje mikrobiální adhezi a proliferaci. Bakteriální adheze je výrazně zvýšena v případě hydrofobní povahy obou povrchů, substrátového i bakteriálního. Adheze je naopak omezena, pokud jsou oba povrchy hydrofilní povahy. Tento účinek nanočástic je v tomto případě považován za antibakteriální. Rozdíl v antibakteriálním účinku GC IONPs na oba zástupce E. coli byl pravděpodobně způsoben rozdílným

24 NANOTECHNOLOGIE stupněm hydrofilie. E. coli O157:H7 navíc produkuje extracelulární polysacharid zvyšující adhezní schopnost buněk, což může maskovat jejich hydrofilní vlastnosti.

Tab. 1: Minimální inhibiční koncentrace baktericidních prostředků na jednotlivé druhy patogenních bakterií; Zdroj: (Inbaraj a kol., 2012); upraveno.

Vzorek Minimální inhibiční koncentrace (µg · ml-1) E. coli E. coli S. enteritidis S. aureus O157:H7 GC 4 <0,5 <0,5 32 IONPs 256 <0,5 <0,5 256 GC IONPs 128 <0,5 8 64 Linezolid 32 16 32 4 Cefaclor 16 8 16 2

Jak již bylo zmíněno dříve, nanočástice oxidů železa lze využít pro léčbu rakoviny, konkrétně pomocí metody zvané magnetická hypertermie. Při vystavení střídavému magnetickému poli o vhodné amplitudě a frekvenci dojde k lokálnímu uvolnění tepla v místě koncentrace těchto částic, které snižuje viabilitu nádorových buněk. Bylo již prokázáno, že magnetická hypertermie zvyšuje citlivost rakovinných buněk k chemoterapiím nebo radioterapiím. Navíc působí na buněčné membrány a je schopná spustit termálně indukované uvolnění léčiv. Bohužel velkým nedostatkem této metody je nedostatečná tepelná energie nanočástic, které splňují podmínky biotolerability. Tento problém je v současné době obcházen lokální injekcí velkého množství částic. Z klinického hlediska je zde proto nutnost optimalizace těchto nanočástic pro efektivní magnetickou hypertermii (Cotin a kol., 2018). Stříbrné nanočástice (AgNPs), běžně používaný nanomateriál v klinickém výzkumu, vykazují několik zajímavých vlastností. K první vlastnosti stříbrných nanočástic se řadí výrazné antibakteriální účinky. Další vlastností je změna barvy v závislosti na velikosti. AgNPs menší než 10 nm vykazují žlutou barvu, zatímco se zvyšující se velikostí se jejich barva mění do červené až černé. Nad určitou koncentraci, AgNPs vykazují také schopnost zmenšovat velikost zasažených bakterií. AgNPs mají

25 NANOTECHNOLOGIE velký potenciál ke zvýšení baktericidní aktivity mnoha antibiotik, např. penicilin G, amoxicillin, erythromycin, clindamycin nebo vankomycin (Thangavel, 2014). Liposomy jsou uzavřené lipidické váčky obsahující jádro na vodní bázi. Jsou považovány za jednu z nejlepších variant organických nanočástic pro boj s nemocemi. Jako nosiče vakcín mají několik výhod. Enormní množství biokompatibilních lipidů je snadno dostupné pro tvorbu liposomů s přesně definovanými chemickými, biologickými i mechanickými vlastnostmi. Liposomy mají schopnost vytvořit uzavřenou strukturu s možností přenosu vhodného agens. Ve svém vodném jádru hydrofilní agens a ve své lipidické dvouvrstvě hydrofobní agens. Tato vlastnost zajišťuje ochranu léčiv před vnitřním prostředím těla po celou dobu přenosu k určenému místu. Stabilizace liposomové dvojvrsty pomocí specifických lipidů (např. cholesterol) navíc zvyšuje bezpečnost přenosu (Caracciolo, 2015). Liposomy jsou vhodnou alternativou ke klasickým chemoterapeutickým metodám při léčbě některých typů rakoviny. Liposomy vykazují vyšší bezpečnost pro pacienta u všech typů karcinomů. Bohužel však pouze u určitých typů rakoviny je prokázána i vyšší efektivita. Jako příklad lze uvést Kaposiho sarkom nebo akutní myeloidní leukémii. Ve vývoji jsou i liposomy s potenciálním využitím pro antibiotickou nebo antimykotickou léčbu (Crommelin a kol., 2020).

2.2.2 Současné hranice nanomedicíny Přestože nanočástice mají velké množství výhod a využití napříč medicínou, nelze tuto technologii označit jako bezchybnou. Velkým nedostatkem nanočástic je to, že kromě definované velikosti nemají žádné jiné společné vlastnosti. Proto musí být každý typ nanočástic definován a studován individuálně. Mimoto změny ve velikosti nebo tvaru často vedou ke změně fyzikálních a chemických vlastností. Netoxická částice o velikosti 100 nm může změnit svou povahu na toxickou při velikosti 1 nm a naopak. Změna velikosti může nastat i samovolně podle působení okolního prostředí, shlukování nebo rozpad částic pak může vést ke změně vlastností. Nepředvídatelné reakce také mohou nastat v rámci prostředí lidského těla, např. nežádoucí vstup do kapilár, translokace z místa injekce do jiných tělních částí, včetně prostupu hematoencefalickou bariérou. Nadto mohou tyto částice mít účinek běžně nečekaný u klasických terapií. Zmínit lze

26 NANOTECHNOLOGIE vstup do buněčných organel jako je jádro nebo mitochondrie vedoucí k nežádoucím změnám a poškozením nebo iniciaci hemokoagulace. Současná nanomedicína navíc není schopna predikovat průběh exkrece nebiodegradovatelných nanočástic (Shubhika, 2013). Další vývoj v této oblasti je nezbytný, neboť zmíněná technologie není pro lidské tělo ještě zdaleka tak bezpečná a prozkoumaná, jak by se na první pohled mohlo zdát. Do budoucna je zde také nutnost zamyslet se i nad etickou, sociologickou a ekonomickou stránkou věci. Je však potřeba podotknout, že výhody spolu s potenciálními možnostmi aplikace by mohly přinést revoluci do současného medicínského prostředí, která je v současné době tak nezbytná.

2.3 Nanotechnologie pro separaci mikročástic

Jednou z možných využití nanotechnologie je separace mikroorganismů či virů. Bakteriofágy jako amfoterní částice lze separovat pomocí různých kapilárních elektroforetických metod jako je například běžná kapilární elektroforéza nebo kapilární isoelektrická fokusace. Velkým problémem při separaci mikroorganismů je zvolení vhodných podmínek zabraňujících agregaci a adsorpci částic na povrch kapilár. Na druhou stranu povrchové vrásnění v jednotkách nanometrů je velmi důležité pro adhezi buněk k substrátům. Správně zvolené povrchové vrásnění křemičitých kapilár proto může být vhodným nástrojem pro separaci jednotlivých bakteriofágů. Ve studii Horká a kol. (2020) využili superkritickou vodu (voda přesahující teplotu 374 °C a tlak 22,1 MPa) k vytvoření nanometrového vrásnění na povrchu křemičitých kapilár. Modifikované kapiláry byly použity pro kapilární elektroforézu za účelem separace a zkoncentrování fágových vzorků. Identifikace fágů byla provedena pomocí MALDI TOF (matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight) hmotnostní spektrometrie.

BAKTERIÁLNÍ VIRY

3 Bakteriální viry

3.1 Charakteristika

Bakteriofágy neboli fágy jsou bakteriální viry, které byly objeveny nezávisle na sobě Frederickem Twortem a Felixem d’Herellem na počátku 20. století (Carter & Saunders, 2013). Tento objev byl učiněn v souvislosti s jejich schopností bakteriální lyze (Knipe & Howley, 2013). Jsou to jednoduché formy života prosté jakékoli metabolické aktivity. Fágy jsou závislé na hostitelském organismu, konkrétně na jeho genetickém materiálu a replikačním aparátu. Proto je lze označit za obligátní vnitrobuněčné parazity bakterií (Harada a kol., 2018). Bakteriofágy jsou nejvíce abundantní entitou na Zemi, kde se počet bičíkatých bakteriofágů odhaduje na 1031

(Knipe & Howley, 2013). Podle nosiče genetické informace lze fágy rozdělit na DNA, či RNA. Podle počtu vláken se rozlišují na jednořetězcové nebo dvouřetězcové. Jednokopiový genom může být lineární nebo cirkulární. Morfologicky jsou fágy považované za velmi rozmanitou skupinu, od jednoduchých ikosahedrálních a vláknitých fágů až ke komplexnějším bičíkatým s ikosahedrální hlavičkou. Většina fágů má kontraktilní nebo nekontraktilní bičík. (Carter & Saunders, 2013).

3.2 Morfologie

Průměrná velikost fágového virionu neboli virové částice je 50–200 nm, nicméně ty největší fágy mohou mít velikost až 400 nm. Většina všech známých bakteriofágů (více než 95 %) patří do řádu Caudovirales s typickou strukturou: dsDNA uložena v ikosahedrálním kapsidu, který je připojen k bičíku s příchytnými vlákny. Délka a vlastnosti bičíku jsou dány čeledí, do které daný virion patří (např. dlouhý a kontraktilní – Myoviridae, dlouhý a nekontraktilní – Siphoviridae, krátký a nekontraktilní – Podoviridae) (Richter a kol., 2018). Jako modelový organismus pro popis morfologie je v této práci zvolen bakteriofág enterobakterií T4 z čeledi Myoviridae. Tento fág má dsDNA genom uložený v kapsidu (hlavička), který je přichycený k bičíku.

29 BAKTERIÁLNÍ VIRY

Bičík slouží k transportu DNA při penetraci buněčné stěny hostitelské bakterie. Na spodní straně bičíku se nachází hexagonálně tvarovaná basální destička. Ta má za úkol koordinovat pohyby šesti dlouhých příchytných vláken bičíku (mj. jsou zodpovědné i za zachycení přítomnosti dané bakterie), krátkých hrotů basální destičky (zodpovídají za pevné přichycení k povrchu bakterie) a obalu, který obklopuje v tomto případě kontraktilní bičík pro penetraci bakterie a vnášení DNA do buňky (Obr. 2) (Rossmann a kol., 2005).

Obr. 2: Grafické znázornění modelového bakteriofága T4. Zdroj: (Rossmann a kol., 2005); upraveno.

3.2.1 ssRNA fágy Mezi jednořetězcové RNA bakteriofágy patří čeleď Leviviridae. Čeleď se dělí do dvou rodů: Allolevivirus a Levivirus (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)). Zástupci této čeledi se řadí mezi nejmenší fágy cílící na G– bakterie jako jsou např. Escherischia coli, Pseudomonas spp. (proteobacteria) nebo Caulobacter spp. (proteobacteria) (Carter & Saunders, 2013).

30 BAKTERIÁLNÍ VIRY

3.2.2 dsRNA fágy Do této skupiny patří jediná čeleď bakteriofágů Cystoviridae s jediným rodem Cystovirus. Zástupci této čeledi jsou obalení. Genom je tvořen 3 segmenty dvouřetězcové molekuly RNA. Každý ze segmentů kóduje určité strukturní či nestrukturní proteiny zajišťující kompletní sestavení fágové částice a její funkčnost. Významným zástupcem této čeledi je bakteriofág φ6 (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV); Mindich, 2001).

3.2.3 ssDNA fágy Mezi jednořetězcové DNA fágy řadíme vláknité bakteriofágy z čeledi Inoviridae a ikosahedrální z čeledi Microviridae (Carter & Saunders, 2013). Zástupci z čeledi Microviridae mají neobalený kapsid a cirkulární genom. Podle dvojí morfologie, genomové uspořádanosti, homologních sekvencí a typu hostitele se čeleď rozděluje na 2 podčeledě, Bullavirinae a Gokushovirinae. Typickým zástupcem této čeledi je virus E. coli φX174 z podčeledi Bullavirinae. Zástupci podčeledi Gokushoviridae napadají obligátní intracelulární parazitické bakterie jako je Bdellovibrio (proteobacteria), Chlamydia (chlamydiae) nebo bakteriální třídu Mollicutes (zástupcem je např. Spiroplasma (tenericutes)). Tato skupina sdílí obecné vlastnosti s bakteriofágem φX174, ale liší se v organizaci virionové morfologie (Obr. 3) a obsahu genů (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV); King a kol., 2012; Knipe & Howley, 2013).

A B

Obr. 3: Rekonstrukce snímku z kryoelektronové mikroskopie. 2 různé morfologie v rámci čeledi Microviridae; A. bakteriofág enterobakterie φX174; B. bakteriofág spiroplasmy SpV4; Zdroj: (King a kol., 2012); upraveno.

31 BAKTERIÁLNÍ VIRY

Zástupci z čeledi Inoviridae mají cirkulární genom helikálně stočený s tisíci kopiemi hlavního kapsidového proteinu (anglicky major capsid protein). Nejvýznamnějším rodem je Inovirus, jehož zástupci mají v průměru okolo 7 nm a napadají jak G+ tak G– bakterie. (King a kol., 2012). Do inovirů se řadí nejprostudovanější fág z této čeledi, kterým je virus E. coli M13. Virus M13 napadá pouze bakterie obsahující konjugativní F plasmid. K adsorpci k hostiteli využívá F pilus E. coli. Takovéto fágy označujeme jako F specifické fágy a mezi další významné patří bakteriofágy enterobakterií f1 nebo fd. Tato skupina fágů se od ostatních DNA fágů odlišuje tím, že nedochází k přenosu DNA do hostitelské buňky. Místo toho je fág celý pohlcen buňkou. Další odlišností je kontinuální produkce potomstva namísto usmrcení a lyze buňky (Carter & Saunders, 2013). Genom fága M13 je uložen v proteinovém obalu složeného asi z dvou tisíců sedmi set kopií hlavního kapsidového proteinu pVIII (tvoří asi 98 % všech proteinů). Na každém konci se pak nachází určitý počet menších obalových proteinů. Na konci, na kterém končí proces sestavení virionu se nachází proteiny pIII a pVI (spolu dohromady tvoří adsorpční komplex pro rozpoznání F pilu). Druhý konec, kde začíná sestavení virionu, je složen z proteinů pVII a pIX. Obalové proteiny jsou velmi důležitou složkou pro metodu fágového displeje a další aplikace v nanotechnologiích (Carter & Saunders, 2013; Wang a kol., 2019).

3.2.4 dsDNA fágy Do této kategorie patří naprostá většina bakteriálních virů, a také největší řád bičíkatých fágů Caudovirales s 5 čeleděmi: • Ackermannviridae • Herelleviridae • Myoviridae • Podoviridae • Siphoviridae Čeleď Ackermannviridae je čeleď pojmenovaná po významném vědci na poli klasifikace bakteriofágů, Dr. Hansi-Wolfgangu Ackermanovi (Adriaenssens a kol., 2018).

32 BAKTERIÁLNÍ VIRY

Zástupci infikují převážně enterobakterie jako je E. coli, Salmonella nebo Shigella (proteobacteria). Čeleď Herelleviridae cílí na bakterie kmene Firmicutes a jsou obligátně lytické. Viriony jsou sestaveny z ikosahedrální hlavičky, ke které je připojen dlouhý kontraktilní bičík (International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV)). Čeleď Myoviridae se vyznačuje dlouhými kontraktilními bičíky a v porovnání s ostatními bičíkatými fágy má často také větší hlavičku a vyšší obsah DNA. Tato čeleď je také více náchylná k zamrazování a rozmrzání a osmotickým šokům (Rohwer, 2014). Mezi nejprostudovanější fágy z této čeledi patří Escherichia virus T4. Virion se skládá z ikosahedrální hlavičky a krčku spojujícího tuto hlavičku s kontraktilním bičíkem. Hlavička je složena z velkého množství různých proteinů, včetně 2 doplňujících, vysoce imunogenní vnější kapsidový protein (Hoc – highly immunogenic outer capsid protein) a malý vnější kapsidový protein (Soc – small outer capsid protein) (Carter & Saunders, 2013). Hoc protein se nachází ve středu každé hexamerní kapsomery (stavební jednotka kapsidu) a šest kopií Soc proteinu obklopuje každou kapsomeru. Soc protein mimo jiné zvyšuje stabilitu kapsidu. Tyto dva proteiny jsou nicméně postradatelné, a proto se jeví jako jedinečná platforma pro vystavení antigenů a jiných proteinů na povrchu, třeba pro účely nanotechnologie (Knipe & Howley, 2013). Viriony čeledi Podoviridae mají krátký nekontraktilní bičík připojený k ikosahedrální hlavičce. Tyto viry jsou specifické vůči enterobakteriím a jím příbuzným bakteriím. Nejvýznamnějším zástupcem z této čeledi je Escherichia virus T7. T7 fág je striktně lytickým zástupcem (Knipe & Howley, 2013). Čeleď Siphoviridae je nejpočetnější z celého řádu Caudovirales. Viriony mají dlouhý tenký a nekontraktilní bičík připojený k ikosahedrální hlavě. Fágy jsou často temperované a specifické vůči enterobakteriím. Z výběru všech zástupců stojí za zmínku především Escherichia virus λ. Genom je lineární a má kohezní konce umožňující mu se v průběhu infekce kružnicově uzavřít. Následně se může replikovat nebo integrovat do hostitelského genomu (Knipe & Howley, 2013). Bakteriofág λ a jemu příbuzné fágy mohou nést gen pro verocytotoxin, kterým mohou konvertovat jejich hostitele na

33 BAKTERIÁLNÍ VIRY patogenní po dobu lyzogenizace (bakteriofág je ve fázi profága) (Carter & Saunders, 2013).

3.3 Životní cyklus

Za vhodných podmínek je jeden virion schopen vyprodukovat více než sto infekčních potomků za méně než hodinu. Úkolem virionu je přenos fágového genomu mezi hostiteli. Z toho důvodu musí být často odolný vůči podmínkám vnějšího prostředí (nukleázy nebo UV záření). Životní cyklus začíná rozpoznáním specifických receptorů na povrchu hostitelské buňky iniciující ireverzibilní adsorpci a vpravení genomu do buňky (Rohwer, 2014). Ireverzibilní adsorpce je následovaná narušením buněčné stěny, cytoplasmatické membrány buňky a přenosem genetické informace. Tento proces je realizován bičíkem fága, přičemž mechanismus je pro každý druh specifický. Všeobecně platí, že koncová část bičíku obsahuje enzymatický mechanismus pro penetraci vrstvy peptidoglykanu buněčné stěny bakterie i vnitřní membrány. Genetická informace je následně skrze bičík přenesena do hostitele. Samotný mechanismus přenosu však u většiny druhů fágů nebyl zatím dobře prostudován (Kutter & Sulakvelidze, 2005). V tomto bodě již může mít pokračování cyklu dvě podoby, které označujeme jako cyklus lytický a cyklus lyzogenní (Obr. 4). Mnoho bakteriofágů má schopnost tyto dva cykly spolu kombinovat.

3.3.1 Lytický cyklus Prvním krokem lytického cyklu je transkripce jednotlivých genů bakteriofága s následným převzetím kontroly nad celým hostitelským replikačním mechanismem. V průběhu procesu dochází k pomnožení fágového genomu, tvorbě jednotlivých komponent a sestavování jednotlivých proteinových obalů, prokapsidů. Jakmile je proces sestavení virionů ukončen nastává poslední fáze cyklu, lyze hostitelské buňky (Kutter & Sulakvelidze, 2005). Dvouvláknové DNA fágy vyvinuly lytický systém založený na oslabení buněčné stěny vedoucí ke kompletní lyzi. K tomuto účelu využívají enzymy – lysiny 34 BAKTERIÁLNÍ VIRY a protein – holin. Lysiny rozrušují jednu ze čtyř hlavních vazeb peptidoglykanu. Mezi lysiny patří lysozym oslabující glykosidové vazby, endopeptidáza cílící na peptidové vazby nebo amidáza hydrolyzující amidové vazby. Lysiny většinou postrádají signální sekvenci. Proto nemohou být translokovány přes membránu k jejich substrátům v peptidoglykanu. Tuto funkci zajišťují proteiny holiny narušující cytoplasmatickou membránu, čímž se zpřístupní peptidoglykanová vrstva pro lysiny. Na rozdíl od velkých DNA fágů, malé RNA i DNA fágy využívají odlišný postup buněčné lyze. Jejich genom kóduje proteiny ovlivňující bakteriální enzymy odpovědné za biosyntézu peptidoglykanu. Výsledkem je špatné sestavení buněčné stěny a lyze buňky (Fischetti, 2005).

3.3.2 Lyzogenní cyklus Fágy využívající druhou životní strategii, lyzogenní cyklus, se označují jako temperované. Jde o dočasnou symbiózu s hostitelskou buňkou, kdy fág odloží svou vlastní replikaci a produkci potomků, výměnou za prozatimní začlenění do hostitelského genomu zahrnující buněčnou replikaci. Začleněný fágový genom označujeme jako profág, bakterii s profágem označujeme jako lyzogen a proces nazýváme lyzogenizace (Rohwer, 2014). Lyzogen má často vyšší fitness díky novým fenotypovým vlastnostem, jež mu profág poskytuje. Tento děj se označuje jako lyzogenní konverze. Lyzogenní konverze může být pozitivní nebo negativní (Fortier & Sekulovic, 2013). Mezi nejběžnější výhody patří ochrana před napadením ostatními fágy, kterou nazýváme superinfekční imunita nebo získání nových faktorů virulence (Brussow a kol., 2004). Příkladem takového faktoru virulence je např. gen pro cholerový toxin u Vibrio cholerae (proteobacteria) (Petty a kol., 2007). Pro začlenění fágového genomu do genomu hostitelského produkuje bakteriofág vlastní integrázu (Rohwer, 2014). Integráza je enzym zprostředkující jednosměrnou místně specifickou rekombinaci mezi dvěma rozpoznávacími sekvencemi na DNA fága a hostitele (Groth & Calos, 2004).

35 BAKTERIÁLNÍ VIRY

Profág zůstává v buňce v „klidovém“ stádiu, ale přesto dochází k transkripci některých jeho genů, které ovlivňují hostitelskou buňku (Brussow a kol., 2004). Zhoršení podmínek ohrožující život hostitele, a tím i samotnou existenci profága, indukuje ukončení lyzogenního cyklu. Lyzogenní cyklus se změní na cyklus lytický s cílem vyprodukovat velké množství potomků a zahubit svého hostitele. Fágy si často s sebou kromě svého původního genomu odnáší i část genomu hostitele, který následně předají dalšímu hostiteli. Tato horizontální výměna genetické informace se označuje jako transdukce (Kutter & Sulakvelidze, 2005).

Obr. 4: Životní cyklus bakteriofága. Šipka vlevo zobrazuje lytický cyklus, šipka vpravo zobrazuje lyzogenní cyklus; Zdroj: (Bielke a kol., 2012); upraveno.

3.4 Terapeutické využití bakteriofágů

Pro svou schopnost cílit na specifické bakteriální kmeny, a naopak neschopnost interagovat s eukaryotickými buňkami, byly bakteriofágy považovány za možné terapeutické agens již od dob svého objevu. Z důvodu neuspokojivých výsledků v průvodních experimentech, které byly zapříčiněny převážně nedostatečnou technologií, a také kvůli objevu penicilinu bylo od této myšlenky na dlouhou dobu upuštěno s výjimkou některých států východní Evropy (Polsko, Gruzie, Rusko) (Lin a kol., 2017). Nadužívání antibiotik, a zvláště pak těch širokospektrálních, má však za následek 36 BAKTERIÁLNÍ VIRY současnou globální krizi bakteriální rezistence. Vzrůstající počet bakteriálních kmenů rezistentních k antibiotikům proto přináší šanci pro fágovou terapii uplatnit se v klinické sféře tam, kde známá antibiotika selhávají (Kakasis & Panitsa, 2019). Experimenty navazující na předchozí zkušenosti ukazují, že vysoce purifikované fágové preparáty s vysokým stupněm obsahu virionů v kombinaci s optimalizovanými metodami aplikace jsou nezbytné pro úspěšnou fágovou terapii (Petty a kol., 2007). Antagonistická koevoluce bakteriálních hostitelů a jejich bakteriofágů je považována za důležitý faktor pro řízení ekologických a evolučních procesů v mikrobiální sféře. Evoluce umožnila vznik bakteriálních kmenů rezistentních k antibiotikům, ale i k fágům. Při experimentech se bakterie rezistentní k fágům objevují poměrně rychle, avšak cenou za tuto rezistenci je většinou ztráta určité důležité funkce. Často jde například o sníženou schopnost růstu v absenci fága. U fágů, jako biologické entity podstupující evoluci také, však došlo k vývoji několika strategií určených k překonání bakteriálních antivirových mechanismů. Mezi známé antivirové mechanismy bakterií se řadí např. CRISPR/Cas, BREX nebo DISARM (Rohde a kol., 2018). Systém CRISPR/Cas je v současné době velice využívanou technologií pro editaci genomů. Ochranný mechanismus bakterií před bakteriofágy má velký potenciál ke genetické modifikaci těchto virů jako terapeutických agens. Fágy mohou být modifikovány k lepší účinnosti infekce a širšímu spektru hostitelů. Modifikované fágy by mohly být mimo jiné atraktivnější pro investory díky možnosti patentování, která je v případě přirozených bakteriofágů limitovaná (Sybesma a kol., 2018). Navíc, použití bakteriofágů s širokým spektrem hostitelů schopných cílit na vysoce konzervativní struktury na bakteriálním povrchu by umožnilo vývoj fágového koktejlu odolného vůči vzniku rezistence. Podmínkou uchování této odolnosti je nutnost pravidelné modifikace s cílem působit na nově vyselektované rezistentní bakterie (Rohde a kol., 2018). Je potvrzeno, že kombinace bakteriofágů s antibiotiky je více efektivní než jednotlivé metody samostatně. Zvláště pak, je-li použit fágový koktejl obsahující fágové kmeny s různým mechanismem infekce. To je způsobeno v důsledku rozdílných mechanismů účinku vedoucích k nepravděpodobnému vyvinutí si rezistence zároveň k antibiotikům i fágům. V konečném důsledku, kombinace fágových koktejlů a antibiotik

37 BAKTERIÁLNÍ VIRY by mohla směřovat ke snížení účinné dávky antibiotik vedoucí k redukci šance vzniku bakteriální rezistence. Tento fakt by mohl zapříčinit i opětovné využívání již vyřazených antibiotik (Green a kol., 2018). Jako příklad komerčně dostupného produktu lze zmínit např. PhagoBioDerm z Gruzie. Jedná se o biodegradovatelný kompozit polymerů impregnovaný kombinací ciprofloxacinu a fágového koktejlu (Petty a kol., 2007). Krom a kol. (2015) ve své práci poukazuje na rizika spojená s fágovou terapií, neboť účinek lytických fágů je založen na ruptuře buňky. Bakteriální lyze vede k uvolnění bakteriálních proteinů, včetně endotoxinů do svého okolí. Tato kontaminace má často za následek neblahé vedlejší účinky projevující se od průjmů až po sepsi, jež často končí smrtí. Alternativní metodou je použití modulárního fagemidového systému, jež exprimuje různou škálu nelytických antimikrobiálních peptidů a toxických proteinů. Principem je tedy inhibice intracelulárních mechanismů vedoucích k nelytické buněčné smrti. Fagemidový systém využívající proteiny bakteriofágů kódované v syntetickém plazmidu má oproti běžné fágové terapii mnoho výhod. Tento systém limituje závažné vedlejší účinky spojené s bakteriální lyzí. Navíc vede k přímému přenosu specifických vysoko-kopiových plazmidů v průběhu jediné infekce, zaručujících tak konstantní expresi a dlouhodobou stabilitu. Ve zmíněné studii je systém založen na expresi dvou plazmidů. První nese geny kódující fágové signály pro sbalování kapsidu a vhodné antibakteriální látky, zatímco druhý obsahuje takzvaný fagemidový pomocný systém. Pomocný systém generuje fágové proteiny potřebné k sestavení fágových částic, nicméně není sbalován do kapsidu spolu s prvním plazmidem. Vzniká tak stabilní počátek replikace produkující fágové částice, jež selektivně sbalují do svých kapsidů první syntetický plazmid. Tento přístup mimo jiné snižuje riziko vzniku rezistence díky absenci fágové replikace a možnosti superinfekce (adsorpce dalšího fága). Mezi další způsoby využití fágů v boji proti bakteriálním infekcím patří např. doručování léčiv nebo využití fágových lysinů (Bao a kol., 2019). Vláknité fágy mohou být modifikovány takovým způsobem, aby na svém povrchu mohly nést terapeutické geny nebo molekuly. Cílem je působit na antigeny nebo receptory na povrchu živočišných buněk s následnou transdukcí těchto genů pomocí receptorem vyvolané endocytózy. Zmíněná metoda zahrnuje technologii fágového displeje, která bude více

38 BAKTERIÁLNÍ VIRY rozvedena v následujících kapitolách. Naopak lysiny mohou být využity k tvorbě atenuovaných vakcín k imunizaci vůči bakteriálním patogenům (Petty a kol., 2007). V současné době ještě není možné zavedení fágové terapie do běžné klinické praxe. Důvody jsou tyto: 1. Kvalita a kvantita zpracovaných studií. 2. Produkce, složení a aplikace fágových koktejlů tak, aby metody odpovídaly současné legislativě. 3. Nedostatečné povědomí u medicínsky zaměřené i laické veřejnosti. 4. Nedostatečná právní ochrana v rámci duševního vlastnictví (Sybesma a kol., 2018). Vzhledem k povaze této technologie bude pravděpodobně nezbytná úprava legislativy, stejně jako nutnost rozsáhlejšího výzkumu. Navazující výzkum by měl být schopen zajistit dostatečnou odpověď na možné otázky a pochybnosti jak medicínských pracovníků, tak i široké veřejnosti. Současně zde bude nutnost i sociologického výzkumu zajišťujícího uvědomění laické veřejnosti. Stejně jako jakákoli jiná metoda, ani fágová terapie není bezchybná, či 100% účinná. Nicméně potenciál nejen fágové terapie, ale i fágů samotných je natolik velký, než aby zůstal nevyužitý.

FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

4 Fágová nanotechnologie

Základní metodou využívanou ve fágové nanotechnologii je metoda fágového displeje, která byla poprvé popsána v roce 1985 laureátem Nobelovy ceny Georgem Smithem. Metoda fágového displeje je technologie využívající vláknitých fágů M13 (a jemu příbuzných vláknitých fágů) ke studiu interakcí mezi proteiny, peptidy a DNA. Princip metody je založen na začlenění sekvence kódující určitý peptid či protein do klonovacího místa uvnitř genu zodpovídajícího za jeden z obalových proteinů bakteriofága. Zpravidla se jedná o pIII receptor vázající protein nebo pVIII hlavní kapsidový protein. Takto se modifikuje velký počet fágových virionů různými sekvencemi. Výsledkem je mikrozkumavka obsahující fágovou knihovnu peptidů, kterou lze použít k testování afinity s cíleným proteinem. Zkoumaný protein je imobilizován na povrchu reakční nádoby. Fágy exprimující peptid se schopností interagovat se substrátem se na něj navážou, ostatní zůstanou volně v roztoku. Volné fágy jsou odstraněny vylitím roztoku a promytím. Navázané fágy jsou uvolněny vymývacím roztokem. Takto získané fágy obsahují požadovanou DNA a lze je použít k vytvoření nových dílčích knihoven. Proces se označuje jako „biopanning“ (Obr. 5). Nejčastěji je potřeba tří až pěti kol biopanningu k identifikaci malého počtu peptid vázajících sekvencí z původní obsáhlé knihovny (Hyman, 2012; Pande a kol., 2010).

Obr. 5: Schématické zobrazení metody fágového displeje. Zdroj: (Phage Display Techniques); upraveno.

41 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

4.1 Biosenzory

Biosenzor lze definovat jako analytické zařízení schopné transformovat biologickou odpověď interakce biorozpoznávací složky (např. protilátky, nukleové kyseliny, bakteriofágy) s detekovaným biologickým materiálem (např. buněčné receptory, organely, tkáně a mikroorganismy) do měřitelného fyzikálního signálu (elektrický, optický, hmotnostní) (Weetall, 1996). Obecně se biosenzor skládá ze tří hlavních částí: rozpoznávací složky, transduktoru a ovládací elektrické jednotky zahrnující vstupní/výstupní rozhraní (Lima & Vianello, 2013). Mezi tradiční způsoby detekce patogenů řadíme mikrobiální a biochemické testy. Ty jsou jak časově, tak technicky náročné. Na druhou stranu využívání protilátek a metod založených na zkoumání a zpracování DNA vyžaduje náročnou přípravu vzorku a jeho purifikaci (Ahmed a kol., 2014). Biosenzory, jako detekční metoda, mají mnoho výhod díky jejich jednoduché ovladatelnosti, vysoké sensitivitě a schopnosti měření v reálném čase. Není vyžadována žádná charakterizace vzorku činící celý proces časově i cenově nenáročný (Ertürk a kol., 2015, 2016). V biosenzorech jsou běžně využívány protilátky s vysokou vazebnou afinitou a specifitou. Hlavními výhodami využívání protilátek je vysoká afinita vůči cílenému patogenu a snadná integrace do přenosných senzorů. Nevýhodou je poměrně vysoká cena a nízká stabilita za odlišných podmínek (kyselé/zásadité prostředí, organická rozpouštědla), které mohou nastat v různých biosenzorických zařízeních (např. těhotenské testy) (Altintas a kol., 2015). Díky tomu mají omezenou možnost opětovného použití (Ertürk & Lood, 2018). Využití fágových částic k detekci patogenních bakterií má řadu výhod v porovnání s protilátkami. Fágy jsou chemicky i termálně velmi stabilní, specifické vůči jednotlivým bakteriálním rodům, mohou být imobilizovány na transdukčním povrchu pro různé senzorické platformy, jsou levné a schopné rozpoznat živou a neživou buňku (Altintas a kol., 2015; Olofsson a kol., 2001). Detekce pouze živých bakterií redukuje počet falešně pozitivních výsledků, které se jinak běžně vyskytují u detekčních metod jako je PCR (Petty a kol., 2007).

42 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

Vysoká specifita je dána jejich schopností rozpoznávat specifické molekulární motivy exprimované na povrchu bakteriální buňky (Kutter & Sulakvelidze, 2005). Tato vlastnost představuje nástroj pro rychlou a přesnou detekci patogenů, která je tak důležitá v souvislosti se zdravotními středisky, nemocnicemi a potravinářským odvětvím (Henry & Debarbieux, 2012; Kutter & Sulakvelidze, 2005). Současný výzkum se zaměřuje na 4 způsoby využití bakteriofágů v biosenzorech: 1. Nelytické fágy (M13, fd) exprimující na svém povrchu cílově specifické molekuly (peptid nebo protein) s následnou funkcí jako rozpoznávací sonda namísto protilátek. 2. Pomocí metody fágového displeje jsou identifikovány vhodné peptidy, proteiny nebo protilátky. Ty jsou následně chemicky nebo geneticky syntetizovány a samostatně využívány jako sondy. 3. Lytické fágy (T4 nebo T7) jako rozpoznávající sondy s odlišným způsobem detekce. Detekce je založena na využití vnitrobuněčných komponent dostávajících se do okolí při bakteriální lyzi na konci fágového cyklu, které se označují jako biomarkery. Mezi ně lze zařadit např. ATP, bakteriální β-D-galaktosidázu nebo α- a β-glukosidázu. 4. Fágová nanovlákna mohou být spřažena s dalšími organickými molekulami a/nebo s dalšími nanomateriály za vzniku kompozitního zařízení reagujícího na vnější stimuly (Mao a kol., 2009; Schmelcher & Loessner, 2014). Biosenzory využívající bakteriofágy mají dvě vývojové oblasti, které doposud nebyly dostatečně objasněny. Jedná se o způsob uchycení fágů na povrch biosenzoru tak, aby toto spojení nijak neovlivňovalo afinitu fága k bakteriím. A dále o způsob signalizace reagující na interakci fága s bakterií v reálném čase.

4.1.1 Možnosti uchycení fágů k povrchu Existuje několik strategií, jak uchytit bakteriofágy k povrchu biosenzoru. Běžné metody využívají fyzikální adsorpci (tzv. fyzisorpce) (Mejri a kol., 2010), kovalentní

43 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE vazbu chemickými metodami (Zhu a kol., 2008) nebo genetickou modifikaci rozpoznávací složky (Gervais a kol., 2007). Metody fyzikální adsorpce zahrnují jednoduché vysušení suspenze obsahující rozpoznávací prvky na povrchu sensoru. Fyzisorpce se bohužel přes svou jednoduchost jeví jako nejméně přijatelná metoda z důvodů možného poškození organických komponent a slabé vazby. Slabá vazba vede k nerovnoměrnému rozložení rozpoznávacích prvků na povrchu sensoru (Harada a kol., 2018). Jiným přístupem upevnění bakteriofágů je metoda chemicky indukované kovalentní vazby. Výběr této metody vyžaduje modifikaci povrchu sensoru pomocí chemikálií, např. glutaraldehyd, silany nebo thioestery. Ty reagují s postranními řetězci aminokyselin na povrchu kapsidu viru. Chemické i fyzikální metody mají obrovskou nevýhodu v náhodné orientaci fága při vazbě díky interakci jakéhokoliv vhodného kapsidového proteinu s modifikovaným povrchem biosenzoru. Nenáhodná orientace je žádaná z důvodu ponechání volných vazebných domén pro interakci s cílovými patogeny (Hyman, 2012). Pro zvýšení efektivity fyzisorpce lze využít modifikovaných křemičitých materiálů. Modifikace křemičitého povrchu má za cíl změnit povrchový náboj z vysoce aniontového na vysoce kationtový. Díky opačnému rozložení náboje na fágovém povrchu (v případě fága T7 se jedná o záporně nabitou hlavičku a kladně nabitá příchytná vlákna) dojde ke zlepšení vazby a orientace fágů k povrhu skrze elektrostatické interakce (Cademartiri a kol., 2010). Genetická modifikace fágů vede k vytvoření funkčních ligandů na kapsidu tak, aby se zabránilo nenáhodné vazbě k povrchu sensoru. Například Gervais a kol. (2007) využil biotin exprimující fágy T4, které se navázaly na zlatý povrch přes streptavidin jako spojovač (Obr. 6). V literatuře byla také popsána možnost vazby biotinylovaného fága ke kuličkám mikrokrystalické celulózy nebo ke streptavidinem překrytým magnetickým kuličkám (Tolba a kol., 2010). Bohužel velkou slabinou metody je její časová a ekonomická náročnost (Cademartiri a kol., 2010). Ani jedna z metod se v současné době nejeví jako výrazně lepší než ty zbývající, což jen zdůrazňuje nezbytnost dalšího výzkumu v této oblasti zajišťující nejoptimálnější povrchovou imobilizaci bakteriofágů.

44 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

Obr. 6: Upevnění bakteriofága T4 ke zlatému povrchu. Bílé šipky zobrazují jednotlivé fágy; Zdroj: (Zourob & Ripp, 2010); upraveno.

4.1.2 Analytické metody pro biosenzory využívající fágy Mezi běžné analytické metody se řadí mikroskopie (elektronová i fluorescenční) a ELISA (z angličtiny enzyme-linked immunosorbent assay). Tyto metody však neumožňují detekci v reálném čase. Křemen-krystalová mikrobalance (QCM – quartz crystal microbalance) je schopná reagovat na změny v hmotnosti v jednotkách nanogramů. QCM sensor se skládá z piezoelektrického křemenového krystalu ve tvaru disku, který je vložen mezi dvě kovové elektrody (nejčastěji zlaté). Při adsorpci malého množství hmoty na povrchu elektrody dojde k poklesu v rezonanční frekvenci krystalu proporcionálně k adsorbované hmotnosti. Povrch krystalu lze modifikovat imobilizací detekční sondy reagující s příslušným analytem. Nevýhodou běžného QCM sensoru je nedostatečná selektivita. Použitím cílově specifického fága nebo proteinu identifikovaného pomocí metody fágového displeje lze selektivitu zvýšit (Mao a kol., 2009). Povrchová plasmonová rezonance (SPR – surface plasmon resonance) je další možná metoda pro bakteriální detekci užívanou v biosenzorech. Metoda je významná z důvodu vysoké citlivosti a schopnosti detekce v téměř reálném čase bez nutnosti charakterizace detekovaných agens (Zhou a kol., 2019). Ve studii Balasubramanian a kol. (2007) využili lytických bakteriofágů k detekci bakterií rodu Staphylococcus aureus. Fágy byly imobilizovány na zlatém povrchu biosenzoru

45 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE fyzisorpcí. Výsledkem experimentu byla dostatečně citlivá detekce bakterií bez nutnosti charakterizace patogenních agens nebo amplifikačních kroků usnadňující celý proces. V roztoku bakterií byla přítomna také bakterie Salmonella typhimurium jako důkaz selektivity fágů. Budoucnost těchto biosenzorů spočívá v jejich velikosti, neboť velikost takového biosenzoru lze přirovnat ke kreditní kartě. Edgar a kol. (2006) vyvinul bakteriální detekci kombinující biotinem značené bakteriofágy a streptavidinem kryté kvantové tečky. Metoda je výhodná pro detekci pomalu rostoucích bakteriálních kmenů, jejichž detekce je jinak běžně zdlouhavá díky nutnosti amplifikace. Amplifikace je v tomto případě zredukovaná na poměrně krátkou dobu (20–45 minut od infekce k lyzi) díky produkci velkého množství fágů z jediné infikované bakterie. Každého fága lze detekovat pomoci modifikovaných kvantových teček. Modifikované kvantové tečky byly zvoleny díky jejich schopnosti redukovat 2 hlavní nevýhody běžných fluoroforů (např. luciferáza nebo zelený fluorescenční protein). Jedná se hlavně o nízkou fotostabilitu a nedostatečný poměr signálu k šumu. Bakteriální diagnostika ledové nukleace (BIND – bacterial ice nucleation diagnostic) je poněkud neobvyklá metoda využívající reportérových fágů s vloženým inaW genem pro ledovou nukleaci. Reportérové bakteriofágy jsou geneticky upravené fágy, kterým byl do genomu vložen reportérový gen pro snadnou vizualizaci signálu. Vizualizace signálu koreluje s interakcí fága s bakterií nebo s infekčními událostmi. V tomto případě se jedná o gen, jehož produktem je protein integrující se uvnitř vnější bakteriální membrány, kde působí jako katalyzátor tvorby ledových krystalů při teplotách od - 2 °C do - 10 °C. K vizualizaci ledové krystalizace se využívá barevného indikátoru. Při zamrznutí indikátor změní barvu na oranžovou, zelená fluorescentní barva se projeví u negativní reakce. Výsledky lze zaznamenat pouhým okem nebo jednoduchým optickým scannerem (Wolber & Green, 1990). Jako další příklad detekce pomocí reportérových fágů může posloužit gen luxAB poskytující bioluminiscenci. Replikace virového genomu vede v produkci mnoha kopií tohoto genu a následná exprese směřuje k vyvolání bioluminiscence, která je snadno detekovatelná (Petty a kol., 2007). Snímání fágem indukované iontové kaskády (SEPTIC – sensing of phage-triggered ion sensing) je postup navržený pro rychlou detekci a identifikaci bakterií

46 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE pomocí elektrického pole. Elektrické pole vzniká náhodnou emisí iontů během fágové infekce. Únik iontů je masivní, přechodný a projevuje se během přenosu fágového genomu do hostitelské buňky. Tok iontů je možný pouze u fyziologicky živých buněk, projevuje se v řádech sekund po smíchání bakteriální suspenze s optimální koncentrací bakteriofágů. Tento tok se projevuje jako kolísání elektrického pole a je detekovatelný mikrometrovým kondenzátorem s titanovými elektrodami. Výhodou této metody je rychlá detekce (v řádu desítek minut) bez nutnosti imobilizace, podmínkou je však přítomnost živých buněk (Zourob & Ripp, 2010). Existuje mnoho dalších metod pro detekci patogenních bakterií. Arter a kol. (2010) vytvořil biosenzor kombinující bakteriofágy M13 s PEDOT nanovlákny (poly (3,4-ethylendioxythiofen)). Detekční systém byl založen na elektrochemických signálech zajišťujících detekci v reálném čase bez nutnosti použití drahých chemikálií. Mertens a kol. (2019) naopak vytvořil biosenzor detekující interakce mezi bakteriofágem T7 a E. coli. Zařízení bylo schopno určit viabilitu malého počtu bakterií uchycených na biosenzoru a zároveň detekovat interakce mezi fágem a bakterií. Systém tak nevyžaduje proteinové značení a je možné provést detekci v rámci jediné reakce bez dalších reagencií. Obě práce však zdůrazňují nutnost detailnějších studií před zavedením do skutečné praxe.

4.2 Vláknité fágy jako základ nanovláken a jiných nanomateriálů

Nanovlákna lze definovat jako struktury mající velikost v průměru omezenou na desítky nanometrů, zatímco podélná velikost je neomezená. Nanovlákna jsou sestavena z opakujících se molekulárních organických nebo anorganických jednotek (Assunção-Silva a kol., 2019). Existuje mnoho různých variant včetně kovových (Ni, Pt,

Au, Ag), polovodičových (InP, Si, GaN) nebo izolujících (SiO2, TiO2) (Kang a kol., 2010). Nanovlákna jsou velmi důležitou součásti nanotechnologie s potenciální aplikací v mikroobvodech, optoelektronice a mnoha dalších oblastech. Syntéza je však velmi složitá, nákladná a často doprovázená vznikem toxických vedlejších produktů. Monodisperzní struktura vláknitých fágů poskytuje ideální templát pro sestavení nanostruktur za pokojové teploty ve vodném roztoku (Petty a kol., 2007). Pro biosyntézu 47 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE nanovláken a jiných nanomateriálů jsou nejčastěji využívané vláknité fágy jako je bakteriofág M13 a jemu příbuzné fágy. Důležitá je metoda fágového displeje (Hyman, 2012). Touto metodou mohou fágy na svém povrchu exprimovat peptidy se specifickou afinitou k jiným organickým či anorganickým částicím za vzniku biointeraktivního motivu. Výsledkem může být nanomateriál se schopností samosestavení (Lee a kol., 2002).

4.2.1 Syntéza nanovláken Biosystémy jsou vysoce uspořádanou strukturou sestavenou z molekulárních stavebních bloků, jako jsou např. nukleové kyseliny či proteiny. Biomolekuly si udržují vlastnost vzájemného rozpoznávání s vysokou přesností a specifitou. V kombinaci s genetickým inženýrstvím se tato vlastnost může stát nástrojem racionální kontroly nad nukleací anorganických částic nebo formováním jednotlivých molekulárních vzorů. Integrace jedinečných vlastností makromolekul do procesu tvorby nových materiálů nabízí mnoho příležitostí včetně geneticky řízeného racionálního molekulárního designu, prostorové kontroly na úrovni nanometrů a hierarchického sestavení komplexních 2D a 3D struktur. Vhodným biologických nástrojem je vláknitý bakteriofág M13 díky jeho vysoce organizované struktuře a možnosti jednoduché genetické manipulace vedoucí k potřebným modifikacím plášťových proteinů. Programovatelnost proteinových funkcí pak zajišťuje vhodnou flexibilitu při sestavování heterokomplexních nanostruktur. Pro tento účel je vhodná modifikace jak pVIII tak pIII kapsidových proteinů fága. Vhodným příkladem je studie Huang a kol. (2005) ve které vytvořili heterokomplexní nanostrukturu zlata a selenidu kadmia (CdSe). Zlaté nanočástice a CdSe kvantové tečky překryté streptavididem s vazbou na pIII protein a zlaté nanočástice s vazbou na pVIII protein skrze anti-zlatý motiv. Navíc se zjistilo, že více než jeden fág je schopen vazby na stejnou streptavidinem krytou nanočástici, čímž vznikne více komplexní struktura jako je např. tvar písmene Y nebo lineární konstrukt vlákno-částice-vlákno (Obr. 7).

48 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

Obr. 7: Různé typy nanostruktur vzniklých po fágové modifikaci. Upravená fotografie z transmisního elektronového mikroskopu zachycující jednotlivé nanostruktury tvořené bakteriofágy po vazbě na streptavidinem krytou nanočástici, žlutou barvou jsou vyobrazené nanočástice zlata, zelenou barvou je vyobrazena CdSe kvantová tečka (oddíl C); Zdroj: (Huang a kol., 2005); upraveno.

Organizovaná struktura bakteriofága M13 byla také použita jako biologická matrice pro nukleaci a orientaci polovodičových nanovláken. K vytvoření této matrice byla metoda fágového displeje cílena na selekci peptidů se schopností nukleace nanokrystalů ze sulfidu zinečnatého (ZnS) a sulfidu kademnatého (CdS). Identifikované peptidy byly následně exprimovány na kapsidovém obalu v rámci pVIII kapsidového proteinu. Vystavení modifikovaných virionů polovodičovým prekurzorovým roztokům způsobilo tvorbu nanokrystalů po celé délce virionu za vzniku polovodičových nanovláken. Detekce vzniku nanokrystalů byla provedena vysokorozlišovací elektronovou mikroskopií. ZnS nanokrystaly vykrystalizovaly ve struktuře hexagonálního wurtzitu nebo v krychlovité struktuře sfaleritu, v závislosti na peptidu exprimovaném na virovém kapsidu. Podobné struktury byly pozorovány také s nanokrystaly CdS (Mao a kol., 2003). Postupně došlo k identifikaci více druhů peptidů schopných takovéto nukleace nanokrytalů. Z materiálů lze zmínit např. arsenid gallitý (GaAs), silikon, fosfid india (InP), kobalt-platinové částice (CoPt) nebo železo-platinové částice (FePt). Další postupnou modifikací fágového genomu, konkrétně oblastí kódujících obalové proteiny 49 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE jako jsou pVII nebo pIX, lze získat až trifunkční matrici schopnou posunout hranice dosavadních systémů vedoucích k sestavení ještě více komplexních struktur. Pro vytvoření jednokrystalových nanovláken je potřeba odstranění organické matrice, bakteriofága. Vhodným postupem je žíhání. Žíhání mineralizovaných fágů při teplotě 350 °C, která je nižší než teplota tání ZnS a CdS (400–500 °C), umožní sestavení polykrystalické struktury do jednokrystalového nanovlákna. Žíhání nicméně nevede pouze k odstranění organické komponenty, nýbrž i ke zkrácení a rozšíření vlákna ve srovnání s velikostí vláknitého fága (Mao a kol., 2004).

Obr. 8: Fágem řízená syntéza nanovlákna. A. schéma struktury běžného vláknitého fága a geneticky modifikovaného fága exprimujícího na svém povrchu RGD motiv; B. nanovlákno z MnO; C. snímky z elektronového mikroskopu zobrazující silikonové nanovlákna; Zdroj: (Ping a kol., 2017); upraveno.

50 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

4.2.2 Fágová nanovlákna jako možnost vylepšení baterií

Oxid kobaltnato-kobaltitý (Co3O4) vykazuje skvělé elektrochemické vlastnosti vhodné pro vylepšení elektrod lithium-iontových baterií (Li-ion). Ve studii

Nam a kol. (2006) využili vláknitých fágů M13 k biosyntéze Co3O4 nanovláken za pokojové teploty. Inkorporací peptidů schopných vázat zlaté atomy do kapsidového proteinu lze navíc vytvořit nanovlákna hybridního oxidu zlata a kobaltu zvyšující kapacitu baterie. Rosant a kol. (2012) využil geneticky modifikovaných vláknitých fágů k biosyntéze nanočástic z Co3O4. V práci však poukazuje na to, že modifikace jediné aminokyseliny v proteinové sekvenci virového kapsidu má za následek změnu nukleačních a elektrochemických vlastností těchto částic. Alternativním přístupem je využití samostatných peptidů a jejich samosestavovacích schopností. Navíc využití samotných peptidových elektrod by mohlo vést ke zvýšení výkonu baterie. Tento efekt je způsoben absencí inertní hmotnosti fágových virionů, která mnohdy tvoří až 40 % inaktivní hmoty baterie.

4.2.3 Regenerace tkání Mnoho výzkumných skupin se zabývá aplikací geneticky upravených vláknitých fágů pro účely tkáňové regenerace. Existují celkem čtyři různé způsoby využití geneticky modifikovaných vláknitých fágů: 1. Fágy s exprimovanými funkčními peptidy mohou sloužit jako alternativní růstový faktor pro tkáňovou regeneraci. 2. Modifikované fágy mohou regulovat kmenové buňky (ASCs – adult stem cells), tvorbou chemických a fyzikálních podnětů. 3. Peptidy, vyselektované z náhodné knihovny fágového displeje, vázající kmenové buňky lze využít jako cílené molekuly k přesnému doručení ASCs genů/léčiv s cílem kontinuální exprese růstových faktorů transfekovaných buněk po dlouhou dobu po vložení. 4. Funkční peptidy identifikované fágovým displejem lze konjugovat s biomateriály pro tvorbu lešení k tkáňové regeneraci (Cao a kol., 2019).

51 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

Růstové faktory jsou malé signální proteiny schopné stimulace a regulace buněčné proliferace, diferenciace, migrace, adheze a genové exprese. Navíc hrají důležitou roli v prvotních fázích reparačních procesů (Growth Factors and Other Cellular Regulators). Ve většině studií zabývajících se tkáňovou regenerací jsou růstové faktory inkorporovány do žebříčkovitého lešení (z angličtiny scaffolds) a postupně uvolňovány v průběhu regeneračního procesu. Užívané růstové faktory jsou uměle produkovány rekombinantními technologiemi v E. coli, ale proces produkce a purifikace je poměrně ekonomicky nákladný a poločas rozpadu krátký (Babensee a kol., 2000). Několik výzkumných skupin využilo metodu fágového displeje k expresi funkčních peptidů na fágovém proteinovém obalu. Cílem bylo vytvořit fágová nanovlákna a demonstrovat jejich schopnost regulace ASC proliferace, diferenciace, migrace, adheze a genové exprese. Zároveň došlo ke zjištění, že funkční peptidy na povrchu fága si dokáží uchovat svou biologickou funkci buněčné adheze (Yoo a kol., 2011; Zhu a kol., 2011). Výhody využití fágových funkčních peptidů jako růstových faktorů: 1. Fágová nanovlákna lze snadno a masově produkovat za ekonomicky výhodných podmínek 2. Vyšší regenerační efektivnosti lze dosáhnout kolektivní funkčností různých peptidů fágového nanovlákna. Exprese více než jednoho peptidu na povrchu nanovlákna lze dosáhnout použitím dvojité nebo trojité metody fágového displeje. 3. Společnou expresí jak funkčních peptidů, tak peptidů schopných vázat materiál žebříčkovitého lešení na povrchu fága lze docílit jednoduchého zavedení nanovláken do tohoto žebříčkovitého lešení bez jakékoliv chemické reakce. Potenciální problémy při použití fágových nanovláken jako růstových faktorů: 1. Vláknité fágy mohou aktivovat řadu imunitních reakcí (je potřeba dodat, že ve většině prací zavedení fágů do organismu nezpůsobilo závažné vedlejší problémy). 2. Bakteriofágy mohou být brzo eliminovány B lymfocyty (Cao a kol., 2019).

52 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

Žebříčkovité lešení hraje velmi důležitou roli v tkáňové regeneraci. Ideální lešení by mělo být dostatečně dobře biokompatibilní pro správnou podporu a kontrolu proliferace a diferenciace kmenových buněk. Lešení by také mělo mít unikátní strukturu schopnou nést růstové faktory ještě před implantací a uvolnit je během regenerace. Mezi další důležité vlastnosti pro správnou funkci patří porozita lešení zajišťující adhezi buněk a tkání s vnitřní částí obsahující růstové faktory, smáčivost pro dobré přichycení a dostatečná biodegradovatelnost po ukončení regenerace. Mezi běžné materiály, které jsou využívány patří keramika, syntetické polymery a přírodní makromolekuly (kolagenová vlákna) (O’Brien, 2011). V procesu tvorby jsou tato lešení obohacena o bioaktivní molekuly (např. růstové faktory) pomocí jednoduché difuze nebo chemických reakcí (Babensee a kol., 2000). Fágová nanovlákna s funkčními peptidy mají nejenom schopnost samosestavení do funkčního žebříčkovitého lešení za současné podpory proliferace a diferenciace kmenových buněk, ale také mohou obohatit předem vytvořená lešení o bioaktivní molekuly ke tkáňové regeneraci (Cao a kol., 2019). Regenerace tvrdých tkání (např. kostí) pomocí bakteriofágů se zdá být poněkud složitá z důvodu jejich morfologie. K reparaci kostní tkáně je v současnosti hojně využívaná syntetická forma kostního minerálu hydroxylapatitu. Doposud se většina prací zabývala využitím různých polyglutamátových domén, které vykazují selektivní vazbu k hydroxylapatitu, ke spojení bioaktivních peptidů s materiálem nesoucí hydroxylapatit. Studie Culpepper a kol. (2013) se zabývá modifikací této metody využitím fágových nanoklecí. Glutamátové zbytky byly začleněny do specifických regionů obalových proteinů bakteriofága P22 místně specifickou mutagenezí. Glutamát se v průběhu sestavování bakteriofága shlukoval v lokálních doménách podél kapsidu. Vysoko-hustotní oblasti glutamátu umožnily vazbu většího počtu nanoklecí na povrch hydroxylapatitu. Tato skutečnost poukazuje na to, že polyglutamátem modifikované nanoklece mají zvýšenou kapacitu k lokálnímu doručení osteoinduktivních molekul. Nicméně polyglutamátem modifikované fágové nanoklece mohou nalézt i další uplatnění, např. jako zobrazovací metoda v případě vazby kovových iontů. Fágy mají mnoho výhod při tkáňové regeneraci. Mezi tyto výhody se řadí např. možnost nahrazení klasických bioaktivních molekul, jako jsou ekonomicky

53 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE nákladné růstové faktory, peptidy fágového displeje bez nutnosti chemické konjugace. Nebo možnost studovat fyzikální a chemické podněty, které kolektivně ovlivňují chování kmenových buněk v takto sestavených fágových nanovláknech (Cao a kol., 2019). V neposlední řadě se fágy zdají být odolnější vůči lidským proteázám zaručujících tak bezpečné doručení bioaktivních molekul do cílového místa (Culpepper a kol., 2013). Velmi zajímavou oblastí se zdá být možnost regenerace nervové tkáně, přičemž se dlouhou dobu tato možnost zavrhovala. Jednou z aplikací fágových nanočástic pro nervovou regeneraci je vývoj biomimetických lešení pro tkáňovou manipulaci. Hlavním cílem nervového inženýrství je vytvoření bioaktivní konstrukce se schopností opravit a nahradit poškozenou nervovou tkáň s úplnou obnovou komplexních funkcí přirozené tkáně. Nanovlákna bakteriofága M13 vykazují několik zajímavých vlastností, které z nich činí vhodné stavební jednotky pro tento účel, např. jednoduchá genetická manipulace vedoucí k expresi více signálních peptidů na fágovém povrchu, jednoduchá amplifikace vhodných fágů pomocí pomnožení na bakteriálním hostiteli nebo bezpečnost vůči lidskému organismu díky přirozené neschopnosti interagovat s eukaryotickými buňkami. Navíc schopnost samosestavení bakteriofágů M13 do předem určených nanofilamentárních struktur poskytuje vhodný prostředek pro vyladění fyzikálně-chemických podnětů k řízenému růstu nervových buněk. Lešení upravené k regeneraci poškozené tkáně poskytuje umělé mikroprostředí schopné vyvolat růst a proliferaci neuronů a kontrolovat jejich vývoj a funkce. Jako příklad lze uvést sekreci indukčních faktorů, které jsou zásadní pro prodlužování axonů (Bakhshinejad & Sadeghizadeh, 2014). Mnoho výzkumných skupin využilo biopanningu k identifikaci několika funkčních peptidů schopných podnítit neurogenezi a/nebo nervovou diferenciaci. Merzlyak a kol. (2009) upravil kapsid fága M13 tak, aby na svém hlavním kapsidovém proteinu exprimoval příslušné signální motivy. Řízeným sestavením vytvořil 3D matrici z nanovláken pro tkáňovou regeneraci. Signálními motivy byly peptidy IKVAV a RGD. RGD peptid je zodpovědný za buněčnou adhezi k extracelulární matrix. IKVAV neboli laminin zodpovídá za adhezi nervových buněk a prodlužování axonů. Pro ověření biokompatibility a aktivity tohoto nanomateriálu byly zvoleny neurální progenitorové buňky hipokampu izolovány z dospělých krys. Progenitorové buňky byly

54 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE zvoleny záměrně z důvodu možných výhod v případě užití těchto matric při léčbě tak komplikovaných postižení jako je např. poraněná mícha. Geneticky modifikovaná fágová nanovlákna umožňují řízené sestavení a přesné rozmístění funkčních peptidů na fágovém povrchu. Řízené sestavení je důležité pro všechny tkáně vyžadující orientaci a polarizaci pro potřeby své správné biologické funkce (např. šlacha, rohovky, endoteliální buňky, meziobratlové ploténky nebo nervové buňky). Fágová nanovlákna ve formě nanomateriálu pro tkáňovou regeneraci poskytují určité výhody oproti konvenčním metodám. Více druhů signálních motivů mohou být exprimovány na povrchu fágů v rámci povrchových proteinů pIII, PVIII nebo pIX pomocí cílené genetické modifikace. Stejné stavební jednotky mohou být získány ve velkém množství jednoduchou cestou pomnožení na bakteriálních hostitelích. Nicméně další vývoj v této oblasti je nezbytný, obzvláště je nutno prohloubit znalost imunogenní odpovědi na tuto tělu cizí hmotu.

4.3 Fágy pro přenos genů a vakcín

Vakcinace neboli očkování je proces záměrného vystavení organismu mikrobiálním patogenům nebo jeho fragmentů za účelem posílení imunitního systému. Očkovací vakcína obsahuje mikroorganismus v oslabené (atenuované) nebo usmrcené formě, jeho toxiny, antigeny nebo uměle připravené protilátky. V poslední době je výzkum často zaměřován na vývoj nových typů vakcín, tzv. DNA vakcín, vakcín založených na metodě fágového displeje nebo vakcín virům podobných částic (VLP – virus-like particle). Vakcinaci metodou fágového displeje řadíme mezi nadějné vakcinační technologie. Tento typ očkování je založen na vakcíně obsahující suspenzi fágů s antigenními peptidy nebo proteiny exprimovanými na povrchu bakteriofága. Pro tuto metodu existují dva přístupy vystavení antigenu. Prvním je genetický postup přímé exprese antigenů pomocí transkripční fúze s obalovým proteinem. Druhým je chemická cesta nepřímé exprese antigenů skrze vazbu na předem exprimovaný peptid schopný vázat antigen. Genetický přístup poskytuje velmi efektivní a ekonomicky výhodnou produkci vakcín jednoduchou fágovou infekcí. Lze se však domnívat, že tento proces může omezit diverzitu a optimální funkční konformaci exprimovaného antigenu. Nepřímý postup chemickou cestou může diverzifikaci zvyšovat. Výrobní proces je ale poněkud náročnější, 55 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE obzvláště v případě opakované vazby antigenů k povrchu. Z toho důvodu je upřednostňovaná přímá metoda genetické cesty. Využívá se zejména vláknitých fágů, T4, T7 a λ fágů (Bao a kol., 2019). Velmi podobným postupem vakcinace je tzv. VLP vakcína. VLP jsou nanometrové multiproteinové částice mající obdobně složené strukturní proteiny virů bez přítomnosti virového genomu. Tím je zajištěna absence virulence (Roldão a kol., 2010). Nanočástice simulující strukturu a organizaci reálných virů, včetně přítomnosti antigenů, jsou schopny napodobovat virovou infekci a stimulovat odpovídající imunitní odpověď (Jain a kol., 2015). Tento přístup byl mj. použit při vývoji vakcín proti lidskému papillomaviru nebo hepatitidě B (Roldão a kol., 2010). Nicméně je potřeba dalšího vývoje v této oblasti, neboť zatím neexistuje žádná univerzální VLP platforma schopna nést jakýkoli antigen nebo dokonce větší množství antigenů zároveň. Univerzální typ platformy by urychlil vývoj jednotlivých typů vakcín vůči mnoha patogenům. Navíc by došlo k redukci nákladů na licencování a výrobu, činícím tyto vakcíny dostupné v globálním měřítku (Frietze a kol., 2016). Slibným řešením tohoto problému se zdá být použití bakteriofágů a vakcinace fágovým displejem. Důvodů pro toto smýšlení je několik, hlavně pak jejich levná a snadná produkce, velikost, povrchová struktura, zdravotní nezávadnost, stabilita v prostředí a biodegradovatelnost (Prisco & De Berardinis, 2012). Vhodným kandidátem je bičíkatý fág T4, jež byl využit při vývoji VLP vakcín vůči řadě patogenních bakterií a virů. Za zmínku stojí např. Bacillus anthracis (firmicutes), Yersinia pestis (proteobacteria), HIV-1, virus slintavky a kulhavky nebo virus infekční burzitidy drůbeže. Pro vývoj T4 VLP vakcíny pro boj s antraxem bylo využito protektivního antigenu (PA) antraxu, klíčové komponenty antraxového toxinu (Tao a kol., 2019). Protektivní antigen antraxu zprostředkovává prostup enzymatických součástí edémového faktoru a letálního faktoru do hostitelské buňky tvorbou membránových pórů (Bann, 2012). Vakcína byla testována na živočišném modelu Macaca mulatta. Výsledkem vakcinace byl ohromný nárůst v počtu PA specifického imunoglobulinu G a navíc 100% ochrana v případě vystavení makaka aerosolu obsahujícího spory Bacillus anthracis bez zjevných vedlejších účinků (Rao a kol., 2011). Kromě T4 bakteriofága lze v literatuře dohledat i využití jiných bakteriofágů, včetně bakteriofága T7, λ nebo vláknitých fágů podobných bakteriofágu M13 (Tao a kol., 2019).

56 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

I přesto, že vakcinace technikou fágového displeje je velmi slibná, v některých případech je poněkud problematické zachovat primární aktivní konformaci epitopů vystavených na fágovém povrchu. To často vede k neefektivní imunitní odpovědi na některé choroby. Jako alternativní metodu lze použít tzv. DNA vakcínu, schopnou zajistit správnou prezentaci konformačně aktivních epitopů pomocí intracelulární exprese proteinů (Bao a kol., 2019). Přístup DNA vakcinace zahrnuje přímé doručení DNA do cílené buňky nebo tkáně nejčastěji pomocí bakteriálního plazmidu. Vložený úsek DNA kóduje antigen, proti němuž je imunitní reakce cílena. Výhoda DNA vakcín spočívá v in-situ produkci antigenů, stimulaci imunitní odpovědi B i T lymfocytů, absenci jakýchkoliv infekčních agens, relativní jednoduchosti výrobního procesu a zvýšené stabilitě vakcín (WHO; DNA vaccines). Existuje mnoho efektivních metod, jak zajistit správné doručení nepoškozeného plazmidu do buněk, např. genové dělo, elektroporace nebo nano/mikročástice jako jsou liposomy. Všechny tyto metody jsou však nevýhodné, neboť navyšují nejenom náklady, ale také náročnost výroby (Bao a kol., 2019). Namdee a kol. (2018) ve své práci využil vláknitých bakteriofágů jako nosičů DNA vakcíny orální cestou. Vláknité fágy byly geneticky modifikovány vložením savčí DNA kazety, kódující požadovaný protein nebo antigen, do vlastního genomu. Následně byl upraven úsek DNA kódující hlavní obalový protein pVIII tak, aby na N- konci proteinu došlo k expresi tripeptidového RGD motivu (arginin glycin kyselina asparagová) umožňujícího vazbu fágů na patřičné buňky gastrointestinálního traktu. Práce zároveň upozorňuje na nutnost úpravy orálně přijímané vakcíny obsahující bakteriofágy tak, aby fágy přežily cestu skrze nepříznivé podmínky trávicího traktu (např. nízké pH, hydrolytické a jiné enzymy). Jednou z možností, jak toho docílit, je použití syntetických nanočástic. Fágový displej může nalézt uplatnění nejen při vakcinaci, ale také jako terapeutický prostředek např. při léčbě sexuálně přenosných nemocí způsobovaných patogeny jako je Chlamydia trachomatis či Neisseria gonorrhea (proteobacteria). Vůči těmto patogenům je v současnosti jen málo efektivních prostředků pro jejich eradikaci, a zvláště pak antibiotika se stávají méně afektivními z důvodu vzniku rezistence. Ve studii Bhattarai a kol. (2012) využili RGD peptidový motiv zprostředkovaný na

57 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE pVIII kapsidovém proteinu pro vyvolání endocytózy bakteriofága. Na plášťovém pIII proteinu byl exprimován PmpD peptid, který byl zvolen z důvodu jeho pravděpodobného vlivu na vývoj chlamydií z retikulárních na infekční elementární tělíska. Vzniklý konstrukt byl schopen snížit chlamydiální infekci, pravděpodobně díky neschopnosti příjmu živin retikulárními tělísky. Je však důležité zaměřit se na detailnější studium mechanismu infekce, které by mohlo přispět k objevu dalších peptidů s využitím pro jejich eliminaci. Modifikované fágy by tak jednou mohly nahradit antibiotika, vůči kterým tyto patogeny získávají v průběhu času rezistenci. Výzkum v oblasti nanotechnologie se také zabývá prevencí a léčbou nádorových onemocnění. Pro rakovinou imunoterapii je fágový displej využívám především 3 způsoby: 1. Identifikace mimotopů (peptidy napodobující nádorové antigeny) fágovým displejem. 2. Prezentace nádorových antigenů na fágovém povrchu pro aplikaci ve formě profylaktických a/nebo terapeutických vakcín. 3. Identifikace peptidů sloužících jako modulátory funkcí imunitních buněk (Goracci a kol., 2020). Mnoho terapií se zaměřilo na receptor epidermálního růstového faktoru (EGFR – epidermal growth factor receptor). EGFR je členem rodiny lidských epidermálních faktorů tyrosin kináz. EGFR hraje důležitou roli v buněčné proliferaci, diferenciaci a migraci. Jejich onkogenní potenciál byl prokázán také faktem, že jejich přehnaná exprese se vyznačuje nádorovou progresivitou, invazivitou a angiogenezí. Nadměrně exprimovaná forma epidermálních růstových faktorů byla mimo jiné prokázaná v mnoha lidských malignitách, včetně různých forem karcinomů, a dokonce i glioblastomů. Metody využívající EGFR většinou zahrnují aplikaci malých molekul inhibitorů tyrosin kináz nebo monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky již byly mnohokrát použity při léčbě rakoviny, nicméně jejich aplikace vyžaduje vícenásobné podání léčiva. Navíc jejich cena je často dělá nepřístupnými pro většinu pacientů. Zajímavým přístupem při léčbě rakoviny namísto užívání protilátek je aktivní imunizace proti určitým typům nádorových antigenů. Tyto metody jsou teoreticky schopné vymýtit

58 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE existující nádory a předejít jejich rekurenci po zbytek pacientova života. Rekombinantní fág M13 exprimující EGFR na svém povrchu byl použit proti Lewisovu karcinomu plic. Ukázalo se, že rekombinantní fágová vakcína by mohla do značné míry navodit imunitní odpověď a vyvolat tvorbu protilátek specifických na konkrétní nádorové buňky (Asadi-Ghalehni a kol., 2015). Kolagen, jedna z nejdůležitějších extracelulárních matrix, bývá často u postižené osoby rozrušován v důsledku výskytu rakoviny. Takto narušený kolagen má vysoce větvenou degradovanou a denaturovanou strukturu způsobenou nadměrnou expresí enzymu kolagenázy. Ve studii Jin a kol. (2014) se zaměřili na porušenou kolagenovou strukturu k detekci a léčbě rakoviny. Vláknitého fága M13 modifikovali 2 funkčními peptidy (Obr. 9). Konkrétně pVIII hlavní kapsidový protein byl modifikován peptidem vázající streptavidin (umožňuje následnou detekci díky vazbě s fluorescenčním barvivem) a pIII receptor vázající protein byl modifikován peptidem mimikující kolagen (vykazuje silnou afinitu k narušeným částem kolagenu). Fág dokázal selektivně rozpoznat několik typů kolagenu pomocí mimikujícího peptidu a detekce byla provedena fluorescenční mikroskopií. Tato modifikace tak umožňuje detekci a pozorování patologických stavů spojených s abnormalitami v kolagenu. Ve studii zdůrazňují možnost dodatečné modifikace fága, aby byl schopen také vázat terapeutická léčiva k okamžitému zahájení léčby postiženého místa.

59 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE

Obr. 9: Schématické zobrazení modifikovaného fága cíleného na denaturovaný kolagen. A. genetická modifikace fágových povrchových proteinů pVIII a pIII funkčními peptidy; B. detekce narušeného místa kolagenové struktury upraveným bakteriofágem; Zdroj: (Jin a kol., 2014); upraveno.

Velký důraz je také kladen na objev nových farmakologických látek schopných usnadnit diagnostiku a léčbu nádorových onemocnění. K takovým látkám řadíme peptidy, proteiny, protilátky nebo nukleové kyseliny. Monoklonální protilátky se v současných klinických aplikacích zdály být nejvíce účinnými, avšak často vyvolávají u pacientů nepříznivé vedlejší účinky (infuzního nebo hematologického původu). Navíc nejsou schopné správné lokalizace nádorového bujení, což vede k neefektivnímu pročištění těla od těchto defektních buněk. Následkem může být poškození jater či ledvin. Metodu fágového displeje lze v tomto ohledu považovat za jednu z možných strategií pro objev nových biomolekul s afinitou k nádorovým buňkám. Tato metoda se již mnohokrát prokázala jako efektivní nástroj pro hledání, amplifikaci a syntézu molekul s žádanou vazebnou afinitou (Landon a kol., 2004). Böttger a kol. (1996) využil peptidovou knihovnu fágového displeje k nalezení vysoce afinitních ligandů pro onkogen hdm2. Onkogen mdm2 a jeho lidský homolog hdm2 se vážou na tumor supresorový protein 53, což vede k inaktivaci jeho funkce jakožto transkripčního faktoru. Inaktivace funkce p53 je považovaná za možný mechanismus vzniku některých typů rakoviny, např. lidského sarkomu. Interakce mezi p53 a mdm2 je proto velmi častým cílem při vývoji

60 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE protirakovinných léků. V rámci jejich studie došlo k objevu série peptidů schopných silné interakce s hdm2. Tato vazba uchovává proteinu 53 jeho fyziologickou funkci transkripčního faktoru zabraňující vzniku tumorů. Molekulární zobrazovací metody umožňují lékařům vizualizaci nádorové progrese a lokalizace. Poskytnuté informace jsou důležité pro vhodnou diagnostiku a následnou léčbu. Díky optickým, elektrickým a magnetickým vlastnostem jsou pro zobrazení dynamických molekulárních a intracelulárních procesů vhodnou volbou nanočástice. Doposud byly nanočástice připojovány k zaměřovacím ligandům jako jsou protilátky či peptidy s cílem zvýšení substrátové specifity a tím nádorového záchytu. Nedostatkem však je skutečnost, že nadměrné zatížení ligandu vede ke snížení schopnosti cílit na nádorové buňky, čímž se zredukuje možnost vazby nanočástice na cílové receptory buňky. Vhodným nástrojem zobrazovacích metod se tak může stát fágový displej. Bakteriofág M13 může být modifikován tak, aby sloužil jako vektor inkorporující peptidy cílící na nádorové buňky a peptidové motivy pro sestavení magnetických železitých nanočástic sloužících jako kontrastní látka při magnetické rezonanci. Modifikovaný fág M13 byl použit k detekci rakoviny prostaty a jako rozpoznávací motiv nádorových buněk byl zvolen SPARC glykoprotein, který je nadměrně exprimován u více druhů rakoviny. Fágový povrch lze modifikovat tak, aby na pIII proteinu byly exprimovány cílové ligandy, zatímco na pVIII proteinu došlo k vazbě magnetických nanočástic. Jednoduchá modifikace umožňuje upevnit na povrch jakoukoli jinou vhodnou detekční látku, popř. i různé kombinace umožňující tak multimodální zobrazování. Navíc následná modifikace pIX proteinu by mohla zajistit přenos chemoterapeutik, čímž by vznikl komplexní systém se schopností detekce, vizualizace i terapie (Ghosh a kol., 2012). Vláknité fágy vykazují mimo jiné zajímavou schopnost proniknout skrze hematoencefalickou bariéru, což z nich činí vhodný nástroj pro léčbu Alzheimerovy a Parkinsonovy choroby (Ksendzovsky a kol., 2012). V minulosti byla metoda fágového displeje použita k identifikaci protilátek afinitních k epitopu lidského amyloidu beta. Tento amyloid vytváří amyloidní plaky zodpovědné za devastující mentální úpadek pacientů postižených Alzheimerovou chorobou. Zablokování epitopu lidského amyloidu beta ovlivňuje dynamiku celé molekuly, která zabraňuje agregaci amyloidních peptidů

61 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE zodpovědných za amyloidní plaky. Zablokování epitopů vede mimo jiné k rozvolnění již složených agregátů těchto plaků. Syntéza protilátek dává potenciální možnost vzniku vakcíny k léčbě a prevenci neurodegenerativních chorob jako je právě Alzheimerova choroba (Frenkel a kol., 2000).

4.4 Nanopóry

V literatuře existuje možnost modifikace lipidických dvojvrstev biomembrán inkorporací nanokanálů do jejich struktur, ve kterých hrají roli běžných membránových kanálů. Takovouto nanotechnologii lze aplikovat např. pro detekci biomarkerů souvisejících s onemocněními, detekci proteinů či peptidů a charakterizaci nukleových kyselin. Princip je založen na interakci biomolekulárního analytu se specifickou sondou uvnitř kanálu či průchodu analytu skrze kanál. Jednotlivé kanály vykazují rozdílné chování v průběhu transportu biomolekul kanálem z různých směrů lumen buňky. To je zapříčiněno převážně asymetrií ve struktuře a povrchovém náboji. Stanovení a kontrola orientace proteinového kanálu v liposomech či membránách je esenciální pro biotechnologické uplatnění. Ve studii Zhou a kol. (2016) studovali orientaci vložení proteinu bakteriofágů SPP1 a phi29, zodpovídajícího za sbalování DNA do prokapsidu, do lipidických membrán. Výsledkem studie bylo zjištění, že úprava hydrofilních a hydrofobních vlastností N- a C- konců proteinového kanálu způsobí změnu v orientaci vnoření kanálu do membrány. Bylo navrženo, že specifita orientace motorických kanálů je výsledkem hydrofilních/hydrofobních interakcí na rozhraní voda/vzduch během inkorporace proteinových kanálů do lipidických membrán. Výsledky studie lze reflektovat při tvorbě liposomů s vysoce definovanou orientací proteinových kanálů v jejich membránách, které lze uplatnit jako nosiče vakcín, bioreaktory či biomolekulární detekční systém. Technologie nanopóru, která je v současnosti nejvíce využívána pro sekvenaci a charakterizaci nukleových kyselin, je založena na principu odporového impulzu, kdy v průběhu průchodu nukleové kyseliny pórem dochází ke změnám v elektrickém proudu. Tyto změny jsou zaznamenávány s následným odvozením jednotlivých sekvencí. Možnost detekce, diferenciace, charakterizace a sekvenace proteinů na úrovni jediné 62 FÁGOVÁ NANOTECHNOLOGIE molekuly je v současnosti poněkud složitá. Důvodem je převážně obrovská diverzita proteinů týkající se jejich tvaru, struktury, rozdělení náboje nebo samotného složení 20 proteinogenních aminokyselin. Několik studií poukázalo na potenciál využití nanopóru ke studiu proteinové velikosti nebo konformačního stavu. Studie Ji a kol. (2018) je zaměřena na aplikaci proteinu bakteriofága T7 (motorický protein zodpovídající za sbalování nukleové kyseliny do prokapsidu) pro diferenciaci peptidů lišících se o jedinou aminokyselinu. Gen pro daný protein byl vložen do genomu E. coli. Exprese genu se projevila zabudováním póru do lipidické dvojvrstvy s funkcí biosenzoru. Doba zdržení a rozdíly v hodnotách elektrického proudu při průchodu nanopórem byly použity k odlišení jednotlivých peptidů. Mapování peptidů, které bylo provedeno pomocí štěpení trypsinem, poukazuje na potenciál využití metody k detekci abnormalit v sérových proteázách při diagnostice onemocnění.

ZÁVĚR

5 Závěr

Nanotechnologie patří k oborům rozvíjející se velkou rychlostí a jsou aplikovatelné téměř ve všech odvětvích průmyslu. V současné době je velká pozornost věnována vývoji nanomedicíny, oboru, který si klade za cíl zlepšit a usnadnit současnou léčbu běžných i těžce léčitelných nemocí a chorob. Nanomedicína aktuálně využívá především syntetické nanočástice netoxické pro živý organismus. Mezi nadějné a efektivní materiály patří zlaté nanočástice, nanočástice oxidu železa či kvantové tečky. Již dlouho využívané nanočástice jsou liposomy, pro tělo naprosto přirozené částice vhodné převážně pro cílený transport léčiv. Díky své povaze jsou schopné nést jak hydrofilní, tak hydrofobní látky beze ztrát. Nanočástice nemají kromě definované velikosti žádné společné vlastnosti. Navíc je většina vlastností závislá na dané velikosti. Díky mnoha neznámým vlastnostem a schopnostem nepředvídatelně interagovat v lidském těle se z nanočástic, s původním účelem pomoci, mohou stát organismu nebezpečné látky. Proto je zde nutnost dalšího a intenzivního vývoje na poli nanomedicíny před klinickou aplikací v praxi. Zajímavým přístupem je využití fágové nanotechnologie. Je to technologie využívající bakteriální viry pro tvorbu peptidických nanomateriálů. Základní metodou aplikovanou v těchto technologiích je fágový displej. Metoda fágového displeje umožňuje studovat afinitu proteinů k jednotlivým substrátům díky jejich expresi na fágových obalových proteinech. Tuto technologii lze využít k identifikaci peptidů a protilátek schopných interagovat s organickými i anorganickými substráty za vzniku nanovláken, které lze využít např. jako elektrody v bateriích nebo matrici pro tkáňovou regeneraci. Geneticky modifikované fágy lze také využít jako sondy pro rychlou detekci patogenních bakterií v biosenzorech. Analýza a diagnostika patogenů v reálném čase je velmi důležitá v medicínském a potravinářském odvětví, kde tyto bakterie působí největší škody. Jednou z možných aplikací fágů je jejich využití jako nosiče vakcín do postižených tkání. I přesto, že fágy poskytují mnoho výhod, neboť jsou levné, snadno modifikovatelné a bezpečné pro eukaryotní buňky, další výzkum fágové nanotechnologie je nezbytný.

65 POUŽITÉ ZDROJE

Použité zdroje

1) Adriaenssens, E. M., Wittmann, J., Kuhn, J. H., Turner, D., Sullivan, M. B., Dutilh, B. E., Jang, H. B., van Zyl, L. J., Klumpp, J., Lobocka, M., Moreno Switt, A. I., Rumnieks, J., Edwards, R. A., Uchiyama, J., Alfenas-Zerbini, P., Petty, N. K., Kropinski, A. M., Barylski, J., Gillis, A., … Rodney Brister, J. (2018). Taxonomy

of prokaryotic viruses: 2017 update from the ICTV Bacterial and Archaeal Viruses Subcommittee. Archives of Virology, 163(4), 1125–1129. https://doi.org/10.1007/s00705-018-3723-z 2) Ahmed, A., Rushworth, J. V., Hirst, N. A., & Millner, P. A. (2014). Biosensors for Whole-Cell Bacterial Detection. Clinical Microbiology Reviews, 27(3), 631–646. https://doi.org/10.1128/CMR.00120-13 3) Altintas, Z., Pocock, J., Thompson, K.-A., & Tothill, I. E. (2015). Comparative

investigations for adenovirus recognition and quantification: Plastic or natural antibodies? Biosensors and Bioelectronics, 74, 996–1004. https://doi.org/10.1016/j.bios.2015.07.076 4) Arter, J. A., Taggart, D. K., McIntire, T. M., Penner, R. M., & Weiss, G. A. (2010). Virus-PEDOT Nanowires for Biosensing. Nano Letters, 10(12), 4858–4862. https://doi.org/10.1021/nl1025826 5) Asadi-Ghalehni, M., Ghaemmaghami, M., Klimka, A., Javanmardi, M., Navari,

M., & Rasaee, M. J. (2015). Cancer immunotherapy by a recombinant phage vaccine displaying EGFR mimotope: An in vivo study. Immunopharmacology and Immunotoxicology, 37(3), 274–279. https://doi.org/10.3109/08923973.2015.1027917 6) Assunção-Silva, R. C., Gomes, E. D., Silva, N. A., & Salgado, A. J. (2019). Nanoengineered biomaterials for spinal cord regeneration. In Nanoengineered

66 POUŽITÉ ZDROJE

Biomaterials for Regenerative Medicine (s. 167–185). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813355-2.00008-9 7) Babensee, J. E., McIntire, L. V., & Mikos, A. G. (2000). [No title found]. Pharmaceutical Research, 17(5), 497–504. https://doi.org/10.1023/A:1007502828372

8) Bakhshinejad, B., & Sadeghizadeh, M. (2014). Bacteriophages and development of nanomaterials for neural regeneration. Neural Regeneration Research, 9(22), 0. https://doi.org/10.4103/1673-5374.145371 9) Balasubramanian, S., Sorokulova, I. B., Vodyanoy, V. J., & Simonian, A. L. (2007). Lytic phage as a specific and selective probe for detection of Staphylococcus aureus—A surface plasmon resonance spectroscopic study. Biosensors and Bioelectronics, 22(6), 948–955. https://doi.org/10.1016/j.bios.2006.04.003

10) Bann, J. G. (2012). Anthrax toxin protective antigen-Insights into molecular switching from prepore to pore: Anthrax Toxin Protective Antigen Review. Protein Science, 21(1), 1–12. https://doi.org/10.1002/pro.752 11) Bao, Q., Li, X., Han, G., Zhu, Y., Mao, C., & Yang, M. (2019). Phage-based vaccines. Advanced Drug Delivery Reviews, 145, 40–56. https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.12.013 12) Bates, F. (2014). Nanomedicine: Revolutionary Interdiscipline. In Y. Ge, S. Li, S.

Wang, & R. Moore (Ed.), Nanomedicine (s. 1–13). Springer New York. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-2140-5_1 13) Bhattarai, S. R., Yoo, S. Y., Lee, S.-W., & Dean, D. (2012). Engineered phage- based therapeutic materials inhibit Chlamydia trachomatis intracellular infection. Biomaterials, 33(20), 5166–5174. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.03.054

67 POUŽITÉ ZDROJE

14) Bielke, L. R., Tellez, G., & Hargis, B. M. (2012). Successes and Failures of Bacteriophage Treatment of Enterobacteriaceae Infections in the Gastrointestinal Tract of Domestic Animals. In pek Kurtbke (Ed.), Bacteriophages. InTech. https://doi.org/10.5772/33407 15) Böttger, V., Böttger, A., Howard, S. F., Picksley, S. M., Chène, P., Garcia-

Echeverria, C., Hochkeppel, H. K., & Lane, D. P. (1996). Identification of novel mdm2 binding peptides by phage display. Oncogene, 13(10), 2141–2147. 16) Brussow, H., Canchaya, C., & Hardt, W.-D. (2004). Phages and the Evolution of Bacterial Pathogens: From Genomic Rearrangements to Lysogenic Conversion. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68(3), 560–602. https://doi.org/10.1128/MMBR.68.3.560-602.2004 17) Cademartiri, R., Anany, H., Gross, I., Bhayani, R., Griffiths, M., & Brook, M. A. (2010). Immobilization of bacteriophages on modified silica particles.

Biomaterials, 31(7), 1904–1910. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.11.029 18) Cao, B., Li, Y., Yang, T., Bao, Q., Yang, M., & Mao, C. (2019). Bacteriophage-based biomaterials for tissue regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews, 145, 73–95. https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.11.004 19) Caracciolo, G. (2015). Liposome–protein corona in a physiological environment: Challenges and opportunities for targeted delivery of nanomedicines.

Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 11(3), 543–557. https://doi.org/10.1016/j.nano.2014.11.003 20) Carter, J. B., & Saunders, V. A. (2013). Virology: Principles and applications (2nd ed). John Wiley & Sons. 21) Cotin, G., Piant, S., Mertz, D., Felder-Flesch, D., & Begin-Colin, S. (2018). Iron Oxide Nanoparticles for Biomedical Applications: Synthesis, Functionalization,

68 POUŽITÉ ZDROJE

and Application. In Iron Oxide Nanoparticles for Biomedical Applications (s. 43– 88). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-101925-2.00002-4 22) Crommelin, D. J. A., van Hoogevest, P., & Storm, G. (2020). The role of liposomes in clinical nanomedicine development. What now? Now what? Journal of Controlled Release, 318, 256–263. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2019.12.023

23) Culpepper, B. K., Morris, D. S., Prevelige, P. E., & Bellis, S. L. (2013). Engineering nanocages with polyglutamate domains for coupling to hydroxyapatite biomaterials and allograft bone. Biomaterials, 34(10), 2455–2462. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2012.12.026 24) Dahan, M., Sabine Lévi, Camilla Luccardini, Philippe Rostaing, Béatrice Riveau, & Antoine Triller. (2003). Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science, 302(5644), 442–445. https://doi.org/10.1126/science.1088525

25) Daniel, M.-C., & Astruc, D. (2004). Gold nanoparticles: Assembly, supramolecular chemistry, quantum-size-related properties, and applications toward biology, catalysis, and nanotechnology. Chemical Reviews, 104(1), 293– 346. https://doi.org/10.1021/cr030698+ 26) Edgar, R., McKinstry, M., Hwang, J., Oppenheim, A. B., Fekete, R. A., Giulian, G., Merril, C., Nagashima, K., & Adhya, S. (2006). High-sensitivity bacterial detection using biotin-tagged phage and quantum-dot nanocomplexes.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(13), 4841–4845. https://doi.org/10.1073/pnas.0601211103 27) Ertürk, G., Hedström, M., Tümer, M. A., Denizli, A., & Mattiasson, B. (2015). Real-time prostate-specific antigen detection with prostate-specific antigen imprinted capacitive biosensors. Analytica Chimica Acta, 891, 120–129. https://doi.org/10.1016/j.aca.2015.07.055

69 POUŽITÉ ZDROJE

28) Ertürk, G., & Lood, R. (2018). Bacteriophages as biorecognition elements in capacitive biosensors: Phage and host bacteria detection. Sensors and Actuators B: Chemical, 258, 535–543. https://doi.org/10.1016/j.snb.2017.11.117 29) Ertürk, G., Özen, H., Tümer, M. A., Mattiasson, B., & Denizli, A. (2016). Microcontact imprinting based surface plasmon resonance (SPR) biosensor for

real-time and ultrasensitive detection of prostate specific antigen (PSA) from clinical samples. Sensors and Actuators B: Chemical, 224, 823–832. https://doi.org/10.1016/j.snb.2015.10.093 30) Fischetti, V. A. (2005). Bacteriophage lytic enzymes: Novel anti-infectives. Trends in Microbiology, 13(10), 491–496. https://doi.org/10.1016/j.tim.2005.08.007 31) Fortier, L.-C., & Sekulovic, O. (2013). Importance of prophages to evolution and virulence of bacterial pathogens. Virulence, 4(5), 354–365.

https://doi.org/10.4161/viru.24498 32) Frenkel, D., Katz, O., & Solomon, B. (2000). Immunization against Alzheimer’s beta -amyloid plaques via EFRH phage administration. Proceedings of the National Academy of Sciences, 97(21), 11455–11459. https://doi.org/10.1073/pnas.97.21.11455 33) Frietze, K. M., Peabody, D. S., & Chackerian, B. (2016). Engineering virus-like particles as vaccine platforms. Current Opinion in Virology, 18, 44–49.

https://doi.org/10.1016/j.coviro.2016.03.001 34) Gervais, L., Gel, M., Allain, B., Tolba, M., Brovko, L., Zourob, M., Mandeville, R., Griffiths, M., & Evoy, S. (2007). Immobilization of biotinylated bacteriophages on biosensor surfaces. Sensors and Actuators B: Chemical, 125(2), 615–621. https://doi.org/10.1016/j.snb.2007.03.007

70 POUŽITÉ ZDROJE

35) Ghosh, D., Lee, Y., Thomas, S., Kohli, A. G., Yun, D. S., Belcher, A. M., & Kelly, K. A. (2012). M13-templated magnetic nanoparticles for targeted in vivo imaging of prostate cancer. Nature Nanotechnology, 7(10), 677–682. https://doi.org/10.1038/nnano.2012.146 36) Goracci, M., Pignochino, Y., & Marchiò, S. (2020). Phage Display-Based

Nanotechnology Applications in Cancer Immunotherapy. Molecules, 25(4), 843. https://doi.org/10.3390/molecules25040843 37) Green, S., Ma, L., & Maresso, A. (2018). Phage Therapy. In Reference Module in Biomedical Sciences (s. B9780128012383662000). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801238-3.66117-2 38) Groth, A. C., & Calos, M. P. (2004). Phage Integrases: Biology and Applications. Journal of Molecular Biology, 335(3), 667–678. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2003.09.082

39) Growth Factors and Other Cellular Regulators. Získáno 8. březen 2020, z https://themedicalbiochemistrypage.org/growth-factors.php 40) Haick, H. (2007). Chemical sensors based on molecularly modified metallic nanoparticles. Journal of Physics D: Applied Physics, 40(23), 7173–7186. https://doi.org/10.1088/0022-3727/40/23/S01 41) Harada, L. K., Silva, E. C., Campos, W. F., Del Fiol, F. S., Vila, M., Dąbrowska, K., Krylov, V. N., & Balcão, V. M. (2018). Biotechnological applications of

bacteriophages: State of the art. Microbiological Research, 212–213, 38–58. https://doi.org/10.1016/j.micres.2018.04.007 42) Henry, M., & Debarbieux, L. (2012). Tools from viruses: Bacteriophage successes and beyond. Virology, 434(2), 151–161. https://doi.org/10.1016/j.virol.2012.09.017

71 POUŽITÉ ZDROJE

43) Horká, M., Karásek, P., Šalplachta, J., Růžička, F., Štveráková, D., Pantůček, R., & Roth, M. (2020). Nano-etched fused-silica capillary used for on-line preconcentration and electrophoretic separation of bacteriophages from large blood sample volumes with off-line MALDI-TOF mass spectrometry identification. Microchimica Acta, 187(3), 177. https://doi.org/10.1007/s00604-

020-4154-6 44) Huang, Y., Chiang, C.-Y., Lee, S. K., Gao, Y., Hu, E. L., Yoreo, J. D., & Belcher, A. M. (2005). Programmable Assembly of Nanoarchitectures Using Genetically Engineered Viruses. Nano Letters, 5(7), 1429–1434. https://doi.org/10.1021/nl050795d 45) Hulla, J., Sahu, S., & Hayes, A. (2015). Nanotechnology: History and future. Human & Experimental Toxicology, 34(12), 1318–1321. https://doi.org/10.1177/0960327115603588

46) Hyman, P. (2012). Bacteriophages and Nanostructured Materials. In Advances in Applied Microbiology (Roč. 78, s. 55–73). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978- 0-12-394805-2.00003-8 47) Chen, H., Roco, M. C., Son, J., Jiang, S., Larson, C. A., & Gao, Q. (2013). Global nanotechnology development from 1991 to 2012: Patents, scientific publications, and effect of NSF funding. Journal of Nanoparticle Research, 15(9), 1951. https://doi.org/10.1007/s11051-013-1951-4

48) Inbaraj, B. S., Tsai, T.-Y., & Chen, B.-H. (2012). Synthesis, characterization and antibacterial activity of superparamagnetic nanoparticles modified with glycol chitosan. Science and Technology of Advanced Materials, 13(1), 015002. https://doi.org/10.1088/1468-6996/13/1/015002 49) International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Získáno 31. říjen 2019, z https://talk.ictvonline.org/taxonomy/

72 POUŽITÉ ZDROJE

50) Jain, N. K., Sahni, N., Kumru, O. S., Joshi, S. B., Volkin, D. B., & Russell Middaugh, C. (2015). Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Advanced Drug Delivery Reviews, 93, 42–55. https://doi.org/10.1016/j.addr.2014.10.023 51) Ji, Z., Kang, X., Wang, S., & Guo, P. (2018). Nano-channel of viral DNA

packaging motor as single pore to differentiate peptides with single amino acid difference. Biomaterials, 182, 227–233. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2018.08.005 52) Jin, H.-E., Farr, R., & Lee, S.-W. (2014). Collagen mimetic peptide engineered M13 bacteriophage for collagen targeting and imaging in cancer. Biomaterials, 35(33), 9236–9245. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2014.07.044 53) Kakasis, A., & Panitsa, G. (2019). Bacteriophage therapy as an alternative treatment for human infections. A comprehensive review. International Journal of

Antimicrobial Agents, 53(1), 16–21. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2018.09.004 54) Kang, Y. R., Park, E. J., Kim, J. H., Min, N. K., & Kim, S. W. (2010). Development of bio-nanowire networks using phage-enabled assembly for biological sensor application. Talanta, 81(4–5), 1425–1430. https://doi.org/10.1016/j.talanta.2010.02.047 55) King, A. M. Q., Adams, M. J., Carstens, E. B., & Lefkowitz, E. J. (Ed.). (2012).

Virus taxonomy: Classification and nomenclature of viruses: ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press. 56) Knipe, D. M., & Howley, P. M. (Ed.). (2013). Fields virology (6th ed). Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health.

73 POUŽITÉ ZDROJE

57) Krom, R. J., Bhargava, P., Lobritz, M. A., & Collins, J. J. (2015). Engineered Phagemids for Nonlytic, Targeted Antibacterial Therapies. Nano Letters, 15(7), 4808–4813. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.5b01943 58) Ksendzovsky, A., Walbridge, S., Saunders, R. C., Asthagiri, A. R., Heiss, J. D., & Lonser, R. R. (2012). Convection-enhanced delivery of M13 bacteriophage to the

brain. Journal of Neurosurgery, 117(2), 197–203. https://doi.org/10.3171/2012.4.JNS111528 59) Kutter, E., & Sulakvelidze, A. (2005). Bacteriophages: Biology and applications. CRC Press. http://www.crcnetbase.com/isbn/9780849313363 60) Landon, L., Zou, J., & Deutscher, S. (2004). Is Phage Display Technology on Target for Developing Peptide-Based Cancer Drugs? Current Drug Discovery Technologies, 1(2), 113–132. https://doi.org/10.2174/1570163043335108 61) Larson, D. R., Warren R. Zipfel, Rebecca M. Williams, Stephen W. Clark, Marcel

P. Bruchez, Frank W. Wise, & Watt W. Webb. (2003). Water-Soluble Quantum Dots for Multiphoton Fluorescence Imaging in Vivo. Science, 300(5624), 1434– 1436. https://doi.org/10.1126/science.1083780 62) Lee, S.-W., Chuanbin Mao, Christine E. Flynn, & Angela M. Belcher. (2002). Ordering of Quantum Dots Using Genetically Engineered Viruses. Science, 296(5569), 892–895. https://doi.org/10.1126/science.1068054 63) Leon, L., Chung, E. J., & Rinaldi, C. (2020). A brief history of nanotechnology

and introduction to nanoparticles for biomedical applications. In Nanoparticles for Biomedical Applications (s. 1–4). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12- 816662-8.00001-1 64) Lima, G. P. P., & Vianello, F. (Ed.). (2013). Food Quality, Safety and Technology. Springer Vienna. https://doi.org/10.1007/978-3-7091-1640-1

74 POUŽITÉ ZDROJE

65) Lin, D. M., Koskella, B., & Lin, H. C. (2017). Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics, 8(3), 162. https://doi.org/10.4292/wjgpt.v8.i3.162 66) Mao, C., Flynn, C. E., Hayhurst, A., Sweeney, R., Qi, J., Georgiou, G., Iverson,

B., & Belcher, A. M. (2003). Viral assembly of oriented quantum dot nanowires. Proceedings of the National Academy of Sciences, 100(12), 6946–6951. https://doi.org/10.1073/pnas.0832310100 67) Mao, Chuanbin, Daniel J. Solis, Brian D. Reiss, Stephen T. Kottmann, Rozamond Y. Sweeney, Andrew Hayhurst, George Georgiou, Brent Iverson, & Angela M. Belcher. (2004). Virus-Based Toolkit for the Directed Synthesis of Magnetic and Semiconducting Nanowires. Science, 303(5655), 213–217. https://doi.org/10.1126/science.1092740

68) Mao, Chuanbin, Liu, A., & Cao, B. (2009). Virus-Based Chemical and Biological Sensing. Angewandte Chemie International Edition, 48(37), 6790–6810. https://doi.org/10.1002/anie.200900231 69) Maysinger, D., Ji, J., Hutter, E., & Cooper, E. (2015). Nanoparticle-Based and Bioengineered Probes and Sensors to Detect Physiological and Pathological Biomarkers in Neural Cells. Frontiers in Neuroscience, 9. https://doi.org/10.3389/fnins.2015.00480

70) Mejri, M. B., Baccar, H., Baldrich, E., Del Campo, F. J., Helali, S., Ktari, T., Simonian, A., Aouni, M., & Abdelghani, A. (2010). Impedance biosensing using phages for bacteria detection: Generation of dual signals as the clue for in-chip assay confirmation. Biosensors and Bioelectronics, 26(4), 1261–1267. https://doi.org/10.1016/j.bios.2010.06.054

75 POUŽITÉ ZDROJE

71) Mertens, J., Cuervo, A., & Carrascosa, J. L. (2019). Nanomechanical detection of Escherichia coli infection by bacteriophage T7 using cantilever sensors. Nanoscale, 11(38), 17689–17698. https://doi.org/10.1039/C9NR05240B 72) Merzlyak, A., Indrakanti, S., & Lee, S.-W. (2009). Genetically Engineered Nanofiber-Like Viruses For Tissue Regenerating Materials. Nano Letters, 9(2),

846–852. https://doi.org/10.1021/nl8036728 73) Mindich, L. (2001). RNA Phages. In Encyclopedia of Genetics (s. 1744–1746). Elsevier. https://doi.org/10.1006/rwgn.2001.1134 74) Nam, K. T., Dong-Wan Kim, Pil J. Yoo, Chung-Yi Chiang, Nonglak Meethong, Paula T. Hammond, Yet-Ming Chiang, & Angela M. Belcher. (2006). Virus- Enabled Synthesis and Assembly of Nanowires for Lithium Ion Battery Electrodes. Science, 312(5775), 885–888. https://doi.org/10.1126/science.1122716

75) Namdee, K., Khongkow, M., Boonrungsiman, S., Nittayasut, N., Asavarut, P., Temisak, S., Saengkrit, N., Puttipipatkhachorn, S., Hajitou, A., Ruxrungtham, K., & Yata, T. (2018). Thermoresponsive Bacteriophage Nanocarrier as a Gene Delivery Vector Targeted to the Gastrointestinal Tract. Molecular Therapy - Nucleic Acids, 12, 33–44. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2018.04.012 76) O’Brien, F. J. (2011). Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today, 14(3), 88–95. https://doi.org/10.1016/S1369-7021(11)70058-X

77) Ochekpe, N., Olorunfemi, P., & Ngwuluka, N. (2009). Nanotechnology and Drug Delivery Part 1: Background and Applications. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8(3). https://doi.org/10.4314/tjpr.v8i3.44546 78) Olofsson, L., Ankarloo, J., Andersson, P. O., & Nicholls, I. A. (2001). Filamentous bacteriophage stability in non-aqueous media. Chemistry & Biology, 8(7), 661– 671. https://doi.org/10.1016/S1074-5521(01)00041-2

76 POUŽITÉ ZDROJE

79) Pande, J., Szewczyk, M. M., & Grover, A. K. (2010). Phage display: Concept, innovations, applications and future. Biotechnology Advances, 28(6), 849–858. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2010.07.004 80) Petty, N. K., Evans, T. J., Fineran, P. C., & Salmond, G. P. C. (2007). Biotechnological exploitation of bacteriophage research. Trends in Biotechnology,

25(1), 7–15. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2006.11.003 81) Phage Display Techniques. Získáno 22. březen 2020, z https://www.biocat.com/proteomics/phage-display-techniques 82) Ping, H., Xie, H., & Fu, Z. (2017). Novel synthesis approaches for new structures in confined space inspired by natural structure-forming processes. Journal of Materiomics, 3(2), 83–95. https://doi.org/10.1016/j.jmat.2017.03.001 83) Prisco, A., & De Berardinis, P. (2012). Filamentous Bacteriophage Fd as an Antigen Delivery System in Vaccination. International Journal of Molecular

Sciences, 13(4), 5179–5194. https://doi.org/10.3390/ijms13045179 84) Rao, M., Peachman, K. K., Li, Q., Matyas, G. R., Shivachandra, S. B., Borschel, R., Morthole, V. I., Fernandez-Prada, C., Alving, C. R., & Rao, V. B. (2011). Highly effective generic adjuvant systems for orphan or poverty-related vaccines. Vaccine, 29(5), 873–877. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2010.11.049 85) Richter, Ł., Janczuk-Richter, M., Niedziółka-Jönsson, J., Paczesny, J., & Hołyst, R. (2018). Recent advances in bacteriophage-based methods for bacteria detection.

Drug Discovery Today, 23(2), 448–455. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2017.11.007 86) Rohde, C., Resch, G., Pirnay, J.-P., Blasdel, B., Debarbieux, L., Gelman, D., Górski, A., Hazan, R., Huys, I., Kakabadze, E., Łobocka, M., Maestri, A., Almeida, G., Makalatia, K., Malik, D., Mašlaňová, I., Merabishvili, M., Pantucek, R., Rose, T., … Chanishvili, N. (2018). Expert Opinion on Three Phage Therapy

77 POUŽITÉ ZDROJE

Related Topics: Bacterial Phage Resistance, Phage Training and Prophages in Bacterial Production Strains. Viruses, 10(4), 178. https://doi.org/10.3390/v10040178 87) Rohwer, F. L. (2014). Life in our phage world: A centennial field guide to the earth’s most diverse inhabitants (1st edition). Wholon.

88) Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J., & Alves, P. M. (2010). Virus-like particles in vaccine development. Expert Review of Vaccines, 9(10), 1149–1176. https://doi.org/10.1586/erv.10.115 89) Rosant, C., Avalle, B., Larcher, D., Dupont, L., Friboulet, A., & Tarascon, J.-M. (2012). Biosynthesis of Co3O4 electrode materials by peptide and phage engineering: Comprehension and future. Energy & Environmental Science, 5(12), 9936. https://doi.org/10.1039/c2ee22234e 90) Rossmann, M. G., Morais, M. C., Leiman, P. G., & Zhang, W. (2005). Combining

X-Ray Crystallography and Electron Microscopy. Structure, 13(3), 355–362. https://doi.org/10.1016/j.str.2005.01.005 91) Shubhika, K. (2013). Nanotechnology and medicine—The upside and the downside. International Journal of Drug Development and Research, 5(1). https://www.ijddr.in/abstract/nanotechnology-and-medicine--the-upside-and-the- downside-5003.html 92) Schmelcher, M., & Loessner, M. J. (2014). Application of bacteriophages for

detection of foodborne pathogens. Bacteriophage, 4(2), e28137. https://doi.org/10.4161/bact.28137 93) Sybesma, W., Rohde, C., Bardy, P., Pirnay, J.-P., Cooper, I., Caplin, J., Chanishvili, N., Coffey, A., De Vos, D., Scholz, A., McCallin, S., Püschner, H., Pantucek, R., Aminov, R., Doškař, J., & Kurtbӧke, D. (2018). Silk Route to the

78 POUŽITÉ ZDROJE

Acceptance and Re-Implementation of Bacteriophage Therapy—Part II. Antibiotics, 7(2), 35. https://doi.org/10.3390/antibiotics7020035 94) Tao, P., Zhu, J., Mahalingam, M., Batra, H., & Rao, V. B. (2019). Bacteriophage T4 nanoparticles for vaccine delivery against infectious diseases. Advanced Drug Delivery Reviews, 145, 57–72. https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.06.025

95) Thangavel, H. (2014). Nanobiology in Medicine. In Y. Ge, S. Li, S. Wang, & R. Moore (Ed.), Nanomedicine (s. 15–31). Springer New York. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-2140-5_2 96) Tolba, M., Minikh, O., Brovko, L. Y., Evoy, S., & Griffiths, M. W. (2010). Oriented Immobilization of Bacteriophages for Biosensor Applications. Applied and Environmental Microbiology, 76(2), 528–535. https://doi.org/10.1128/AEM.02294-09 97) Wang, T., Nguyen, A., Zhang, L., & Turko, I. V. (2019). Mass spectrometry

enumeration of filamentous M13 bacteriophage. Analytical Biochemistry, 582, 113354. https://doi.org/10.1016/j.ab.2019.113354 98) Weetall, H. H. (1996). Biosensor technology What? Where? When? and Why? Biosensors and Bioelectronics, 11(1–2), i–iv. https://doi.org/10.1016/0956- 5663(96)83729-8 99) WHO; DNA vaccines. WHO. Získáno 13. únor 2020, z https://www.who.int/biologicals/areas/vaccines/dna/en/

100) Wolber, P., & Green, R. (1990). Detection of bacteria by transduction of ice nucleation genes. Trends in Biotechnology, 8, 276–279. https://doi.org/10.1016/0167-7799(90)90195-4 101) Yadav, H. K. S., & Raizaday, A. (2016). Inorganic nanobiomaterials for medical imaging. In Nanobiomaterials in Medical Imaging (s. 365–401). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-323-41736-5.00012-1

79 POUŽITÉ ZDROJE

102) Yoo, S. Y., Kobayashi, M., Lee, P. P., & Lee, S.-W. (2011). Early Osteogenic Differentiation of Mouse Preosteoblasts Induced by Collagen-Derived DGEA-Peptide on Nanofibrous Phage Tissue Matrices. Biomacromolecules, 12(4), 987–996. https://doi.org/10.1021/bm1013475 103) Zhou, J., Qi, Q., Wang, C., Qian, Y., Liu, G., Wang, Y., & Fu, L. (2019).

Surface plasmon resonance (SPR) biosensors for food allergen detection in food matrices. Biosensors and Bioelectronics, 142, 111449. https://doi.org/10.1016/j.bios.2019.111449 104) Zhou, Z., Ji, Z., Wang, S., Haque, F., & Guo, P. (2016). Oriented single directional insertion of nanochannel of bacteriophage SPP1 DNA packaging motor into lipid bilayer via polar hydrophobicity. Biomaterials, 105, 222–227. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2016.08.002 105) Zhu, Haibao, Cao, B., Zhen, Z., Laxmi, A. A., Li, D., Liu, S., & Mao, C.

(2011). Controlled growth and differentiation of MSCs on grooved films assembled from monodisperse biological nanofibers with genetically tunable surface chemistries. Biomaterials, 32(21), 4744–4752. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2011.03.030 106) Zhu, Hongying, White, I. M., Suter, J. D., & Fan, X. (2008). Phage-based label-free biomolecule detection in an opto-fluidic ring resonator. Biosensors and Bioelectronics, 24(3), 461–466. https://doi.org/10.1016/j.bios.2008.04.028

107) Zourob, M., & Ripp, S. (2010). Bacteriophage-Based Biosensors. In M. Zourob (Ed.), Recognition Receptors in Biosensors (s. 415–448). Springer New York. https://doi.org/10.1007/978-1-4419-0919-0_11