Porównanie Statusu Antyoksydacyjnego U Krów Mlecznych Ras: Polskiej Czerwonej, Holsztyńsko-Fryzyjskiej I Krzyżówki Czerwone

Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Instytut Medycyny Weterynaryjnej

Lek. wet. Joanna Kołodziejska-Lesisz

Porównanie statusu antyoksydacyjnego u krów mlecznych ras: polskiej czerwonej, holsztyńsko-fryzyjskiej i krzyżówki czerwonej norweskiej z holsztyńsko-fryzyjską, w różnych okresach cyklu produkcyjnego

The comparison of antioxidant status of dairy cattle breeds: Polish Red, Holstein-Friesian and crossbred cows Norwegian Red and Holstein-Friesian at different time of the production cycle

Praca doktorska

Doctoral thesis

Praca wykonana pod kierunkiem

Promotora Prof. dr. hab. Włodzimierza Klucińskiego

Promotora pomocniczego Dr Marty Parzenieckiej-Jaworskiej

w Zakładzie Weterynaryjnej Diagnostyki Laboratoryjnej i Klinicznej

Katedry Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej

Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie

Warszawa, 2020 1

Pragnę złożyć serdeczne podziękowania mojemu Promotorowi Panu prof. dr. hab. Włodzimierzowi Klucińskiemu za nieocenioną pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania pracy doktorskiej, cierpliwość, wyrozumiałość i okazaną życzliwość oraz poświęcony czas przy realizacji niniejszej pracy.

Dr Marcie Parzenieckiej-Jaworskiej za wsparcie, cenne porady i sugestie dotyczące interpretacji wyników.

Pracownikom Zakładu Weterynaryjnej Diagnostyki Laboratoryjnej i Klinicznej, szczególnie dr. Markowi Kulce, lek. wet. Małgorzacie Cegiełkowskiej oraz mgr inż. Monice Orłowskiej za pomoc w wykonaniu pomiarów laboratoryjnych.

Dziękuję Panu prof. dr. hab. Michałowi Jankowi oraz dr Magdalenie Hulanickiej za wsparcie w dziedzinie transkryptogenomicznej.

Mojej Rodzinie za wiarę i wsparcie duchowe.

Praca wykonana w ramach Stacjonarnych Studiów Doktoranckich w dziedzinie weterynaryjne nauki kliniczne, w latach 2012-2018. Kierownik Studiów: prof. dr hab. Mirosław Kleczkowski.

Badania prowadzono w Zakładzie Weterynaryjnej Diagnostyki Laboratoryjnej i Klinicznej Katedry Patologii i Diagnostyki Weterynaryjnej, w ramach grantu o numerze NN 308562840, finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki. Kierownik grantu: prof. dr hab. Włodzimierz Kluciński

Oświadczenie promotora pracy

Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie stopnia naukowego.

Data………..…….. Podpis promotora pracy……………………………………….

Oświadczenie autora pracy

Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca doktorska została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z obowiązującymi przepisami.

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur związanych z uzyskaniem stopnia naukowego w wyższej uczelni.

Oświadczam ponadto, że prezentowana wersja pracy jest zgodna z załączoną wersją elektroniczną.

Data……………….. Podpis autora pracy…………………………………

Spis treści

Streszczenie ...... 9 Abstract ...... 10 I. Wykaz skrótów zastosowanych w pracy ...... 11 II. Przegląd literatury ...... 14 1. Wstęp ...... 14 2. Kierunki hodowli bydła mlecznego w Polsce ...... 15 3. Ocena zdrowotności wysokowydajnych krów mlecznych ...... 18 4. Wykorzystanie oznaczeń parametrów statusu antyoksydacyjnego w ocenie zdrowotności krów mlecznych ...... 21 4.1. Procesy prooksydacyjne ...... 23 4.2. Procesy antyoksydacyjne ...... 24 4.3. Monitorowanie statusu antyoksydacyjnego u bydła mlecznego poprzez oznaczanie wybranych parametrów laboratoryjnych ...... 27 4.4. Terapeutyczna modyfikacja statusu antyoksydacyjnego u bydła mlecznego ...... 29 4.5. Status antyoksydacyjny bydła mlecznego a cykl produkcyjny ...... 30 4.6. Status antyoksydacyjny bydła mlecznego, a wydajność mleczna ...... 31 III. Cel pracy ...... 33 IV. Materiały i Metody ...... 34 1. Materiał ...... 34 1.1 Zwierzęta ...... 34 1.2. Materiał badawczy ...... 35 2. Badanie kliniczne krów ...... 36 2.2. Ocena laktacji krów ...... 37 4. Metody analityczne ...... 37 4.1. Badanie hematologiczne ...... 37 4.2. Oznaczanie parametrów biochemicznych we krwi (stężenie kwasu β-hydroksymasłowego, białka całkowitego, cholesterolu całkowitego, lipoprotein i trójglicerydów w surowicy oraz związków TBA-reaktywnych w osoczu) ...... 37 4.3. Oznaczanie enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej (aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, całkowitej katalazy i reduktazy glutationowej w surowicy oraz aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizacie) ...... 39

4.4. Oznaczanie nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej (całkowitego potencjału antyoksydacyjnego, stężenia bilirubiny całkowitej, kwasu moczowego i albumin w surowicy oraz stężenia glutationu całkowitego w hemolizacie) ...... 40 5. Metody oceny profilu transkryptomicznego ...... 41 5.1. Izolacja RNA z komórek jądrzastych krwi ...... 41 5.2. Mikromacierze ...... 42 6. Metody statystyczne ...... 46 6.1. Analiza statystyczna wyników badań hematologicznych i biochemicznych ...... 46 6.2. Analiza statystyczna wyników mikromacierzowych ...... 47 6.3. Analiza ontologiczna list genów o zmiennej ekspresji ...... 47 V. Wyniki ...... 49 1. Wyniki badania klinicznego i oceny kondycji ciała (BCS) ...... 49 2. Wyniki oceny laktacji ...... 50 3. Wyniki wybranych parametrów hematologicznych oraz biochemicznych, w tym enzymatycznych i nieenzymatycznych, określających stan ochrony antyoksydacyjnej, u krów rasy polskiej czerwonej w okresie zasuszenia, poporodowym i w szczycie laktacji z dwóch cyklów produkcyjnych ...... 51 3.1. Wyniki parametrów hematologicznych ...... 51 3.2. Stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu ...... 52 3.3. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy ...... 52 3.4. Stężenie białka całkowitego w surowicy ...... 53 3.5. Stężenie cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL oraz trójglicerydów w surowicy ...... 54 3.6. Aktywność enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów ...... 55 3.7. Stężenie nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów ...... 56 4. Wyniki wybranych parametrów hematologicznych oraz biochemicznych, w tym enzymatycznych i nieenzymatycznych określających stan ochrony antyoksydacyjnej, u krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w okresie zasuszenia, poporodowym i w szczycie laktacji z dwóch cyklów produkcyjnych ...... 57 4.1. Wyniki parametrów hematologicznych ...... 57 4.2. Stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu ...... 58 4.3. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy ...... 58 4.4. Stężenie białka całkowitego w surowicy ...... 58

4.5. Stężenie cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL oraz trójglicerydów w surowicy ...... 59 4.6. Aktywność enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów ...... 60 4.7. Stężenie nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów ...... 62 5. Wyniki wybranych parametrów hematologicznych oraz biochemicznych, w tym enzymatycznych i nieenzymatycznych określających stan ochrony antyoksydacyjnej, u krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko- fryzyjskiej w okresie zasuszenia, poporodowym i w szczycie laktacji z dwóch cyklów produkcyjnych ...... 63 5.1. Wyniki parametrów hematologicznych ...... 63 5.2. Stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu ...... 63 5.3. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy ...... 64 5.4. Stężenie białka całkowitego w surowicy ...... 64 5.5. Stężenie cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL oraz trójglicerydów w surowicy ...... 64 5.6. Aktywność enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów ...... 65 5.7. Stężenie nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów ...... 66 6. Porównanie wartości wybranych enzymatycznych i nieenzymatycznych parametrów określających stan ochrony antyoksydacyjnej między krowami ras: polskiej czerwonej, holsztyńsko-fryzyjskiej i krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej z holsztyńsko- fryzyjską w różnych okresach cyklów produkcyjnych ...... 67 6.1. Okres zasuszenia ...... 67 6.2. Okres poporodowy ...... 69 6.3. Okres szczytu laktacji ...... 70 6.4. Podsumowanie wartości wybranych parametrów ochrony antyoksydacyjnej w kolejnych okresach cyklu produkcyjnego dla krów ras: polskiej czerwonej, holsztyńsko-fryzyjskiej i krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej z holsztyńsko- fryzyjską ...... 71 7. Wyniki korelacji ...... 74 7.1. Korelacje pomiędzy wskaźnikiem kondycji ciała a badanymi parametrami enzymatycznej i nieenzymatycznej ochrony antyoksydacyjnej ...... 74

7.2. Korelacje pomiędzy stężeniem związków TBA-reaktywnych i kwasu β- hydroksymasłowego a badanymi parametrami enzymatycznej i nieenzymatycznej ochrony antyoksydacyjnej ...... 74 8. Analiza profilu transkryptomicznego w badanych okresach produkcyjności u krów rasy polskiej czerwonej i holsztyńsko-fryzyjskiej ...... 77 VI. Dyskusja ...... 78 VII. Podsumowanie ...... 108 VIII. Wnioski ...... 110 IX. Literatura ...... 111 X. Załączniki ...... 146

Streszczenie

Porównanie statusu antyoksydacyjnego u krów mlecznych ras: polskiej czerwonej, holsztyńsko-fryzyjskiej i krzyżówki czerwonej norweskiej z holsztyńsko-fryzyjską w różnych okresach cyklu produkcyjnego

Podczas oddychania tlenowego, procesów katabolicznych i anabolicznych, we wszystkich komórkach organizmu wytwarzane są reaktywne formy tlenu (RFT). Nadmiar RFT może prowadzić do uszkodzeń oksydacyjnych istotnych biologicznie makrocząsteczek: DNA, białkek i lipidów. U krów mlecznych, zwłaszcza krów wysokowydajnych w chowie intensywnym, obserwuje się narażenie na stres oksydacyjny, który zwiększa podatności na rozwój zaburzeń metabolicznych oraz zmniejsza wydajność mleczną. Spadek wydajności mlecznej i obniżenie jakości produktów pochodzenia zwierzęcego prowadzi do strat ekonomicznych w gospodarstwach rolnych zaangażowanych w produkcję mleczną. Celem badania było porównanie wartości wybranych enzymatycznych i nieenzymatycznych przeciwutleniaczy we krwi obwodowej trzech ras bydła mlecznego, różniących się systemem hodowli, wydajnością mleczną i długością laktacji. Badania przeprowadzono na krowach rasy holsztyńsko-fryzyjskiej (HF), polskiej czerwonej (PR) i krzyżówce holsztyńsko-fryzyjskiej i norweskiej czerwonej (NRFxHF). Próbki krwi pobrano od 45 klinicznie zdrowych zwierząt w okresie zasuszenia, w pierwszym tygodniu po porodzie i w szczycie laktacji. Wykazano, że mechanizmy antyoksydacyjne u krów rasy PR są oparte na aktywności całkowitej katalazy (CAT) i erytrocytarnej dysmutazy ponadtlenkowej (SOD-1). Aktywność CAT i SOD-1 u krów rasy HF jest bardziej nasilona i utrzymuje się dłużej niż u krów PR w związku z wyższą wydajnością mleczną. U krów HRFxHF, w porównaniu do krów PR, obserwowano porównywalną aktywności CAT i utrzymującą się dłużej wyższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD-3) w surowicy ze względu na większe nasilenie procesów katabolicznych we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji. Utrzymanie równowagi oksydacyjnej wymaga u krów HF zaangażowania puli glutationu obecnej we krwi obwodowej, a u krów rasy NRFxHF kwasu moczowego i albumin. Opisany status antyoksydacyjny umożliwia zachowanie równowagi oksydacyjnej w okresie nasilonych przemian metabolicznych związanych z porodem i rozpoczęciem laktacji.

Słowa kluczowe: bydło mleczne, przeciwutleniacze, katalaza (CAT), dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), reaktywne formy tlenu (RFT), krew obwodowa

Abstract

The comparison of antioxidant status of dairy cattle breeds: Polish Red, Holstein- Friesian and crossbred cows Norwegian Red and Holstein-Friesian at different time of the production cycle In all cells during metabolism, for instance in aerobic respiration, catabolic and anabolic processes, the reactive oxygen species (ROS) are constantly produced. The excess of accumulated ROS leads to oxidative damage to biologically significant macromolecules: DNA, proteins and lipids. In dairy cows, especially high-yielding cows in intensive rearing, exposure to oxidative stress increases susceptibility to the development of metabolic disorders and decreased milk yield. A decreas in milk yield and the quality of animal products both lead to economic losses on farms involved in dairy production.

The study aimed to compare the values of selected enzymatic and nonenzymatic antioxidants in the peripheral blood of three breeds of dairy cattle, differing in the breeding system, milk yield and lactation duration. The research was carried out on Holstein-Friesian (HF), Polish Red (PR), and Holstein-Friesian and Norwegian Red (NRFxHF) cows. Blood samples were taken from 45 clinically healthy animals during the dry period, in the first week after delivery and at the peak of lactation.

Antioxidative mechanisms in PR cows are based on total catalase (CAT) and erythrocyte superoxide dismutase (SOD-1) activities. CAT and SOD-1 activity in HF cows are more intense and last longer than in PR cows due to higher milk yield. In HRFxHF cows, compared to PR cows, comparable CAT activity and longer-lasting higher plasma superoxide dismutase (SOD-3) activity were observed due to the increased intensity of catabolic processes in early and at the peak of lactation. Maintaining oxidative balance requires HF cows to have a pool of glutathione in peripheral blood circulation and uric acid and albumin in comparison to NRFxHF cows.

The described antioxidant status allows maintaining oxidative balance during periods of intense metabolic changes associated with the delivery and the start of lactation.

Key words: dairy cattle, antioxidants, catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), reactive oxygen species (ROS), peripheral blood

I. Wykaz skrótów zastosowanych w pracy

ArO• - rodnik aryloksylowy

ArOO• - rodnik arylonadtlenkowy

ATP - adenozynotrójfosforan

Bc - białko całkowite

BCS - ocena kondycji ciała

BHM - kwas β-hydroksymasłowy

BrO- - podbromin

CAT - całkowita katalaza cDNA - komplementarny kwas deoksyrybonukleinowy

ClO- - podchloryn cRNA - komplementarny kwas rybonukleinowy

DNA - kwas deoksyrybonukleinowy

EDTA-K2 - sól dipotasowa kwasu wersenowego

GR - reduktaza glutationowa

GRA - liczba granulocytów (neutrofili, eozynofili i bazofili)

GPX - peroksydaza glutationowa

H2O2 - nadtlenek wodoru

HCT - wskaźnik hematokrytowy

HDL - frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości

HGB - hemoglobina

HF - krowy rasy holsztyńsko-fryzyjskiej

•− HO2 - rodnik wodoronatlenkowy

HOBr - kwas podbromawy

HOCl - kwas podchlorawy

HOI - kwas podjodawy

IL-2 - interleukina 2

IO- - podjodyn

LDL - frakcja lipoprotein o niskiej gęstości

LPO - nadtlenki lipidów

LYM - liczba limfocytów

MCH - średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej

MCHC - średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej

MCV - średnia objętość krwinki czerwonej

MDA - aldehyd dimalonowy

MID - liczba monocytów

MPV - średnia objętość płytki n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych

NADH - dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy

NEFA - niezestryfikowane kwasy tłuszczowe

NO• - tlenek azotu

NO2• - ditlenek azotu

NRFxHF - krowy pochodzące z krzyżówki ras: holsztyńsko-fryzyjskiej i norweskiej czerwonej

1 O2 - tlen singletowy

•− O2 - anionorodnik ponadtlenkowy

O3 - ozon

•OH - rodnik hydroksylowy p - istotność statystyczna

PON-1 - paraoksonaza 1

PC - pochodne karbonylowe

PLT - liczba płytek krwi

PR – krowy rasy polskiej czerwonej 12

r - współczynnik korelacji

RBC - liczba krwinek czerwonych

RFT - reaktywne formy tlenu

RIN - kontrolny parametr jakości RNA

RNA - kwas rybonukleinowy

RO• - rodnik alkoksylowy

ROO• - rodnik nadtlenkowy

SD - odchylenie standardowe

SOD - dysmutaza ponadtlenkowa

SOD-1 - izoenzym dysmutazy ponadtlenkowej, oznaczany w hemolizacie

SOD-2 - izoenzym dysmutazy ponadtlenkowej, stwierdzany w macierzy mitochondrialnej

SOD-3 - izoenzym dysmutazy ponadtlenkowej, oznaczany w surowicy

TAC - całkowita zdolność antyoksydacyjna

TAS - całkowity status antyoksydacyjny

TBA - kwas 2-tiobarbiturowy

TBARS - związki reagujące z kwasem tiobarbiturowym

TCA - kwas trójchlorooctowy

TMR - całkowicie wymieszana dawka - system pełnoporcjowego żywienia krów mlecznych

WBC - liczba krwinek białych

II. Przegląd literatury

1. Wstęp

Pierwsze doniesienia na temat toksyczności tlenu, sformułowane w oparciu o kliniczne doświadczenia na zwierzętach laboratoryjnych, pochodzą z końca XIX wieku (Smith, 1899; Binger i wsp., 1927). Kolejne prowadzone w tej dziedzinie prace ujawniły, że szkodliwe działanie tlenu może być powiązane z obecnością jego reaktywnych form (Gerschman i wsp., 1954; Harman, 1956). Momentem przełomowym był rok 1956, w którym po raz pierwszy została przedstawiona w czasopiśmie pt. „Journal of Gerontology” wolnorodnikowa teoria starzenia się organizmu. Jej autor - Denham Harman zaprezentował pogląd, iż na proces starzenia mają wpływ nie tylko stężenie i aktywność wolnych rodników generowanych podczas fizjologicznych oraz patologicznych procesów zachodzących w organizmie, ale także sprawność mechanizmów antyoksydacyjnych, zarówno enzymatycznych, jak i nieenzymatycznych. Od tego czasu zagadnienia dotyczące reaktywnych form tlenu oraz mechanizmów ochrony antyoksydacyjnej wzbudzają duże zainteresowanie badaczy z różnych dziedzin naukowych, przede wszystkim z zakresu nauk ścisłych, przyrodniczych, nauk medycznych i nauk o zdrowiu oraz nauk rolniczych, w tym w szczególności w dyscyplinie weterynarii.

Stres oksydacyjny, rozumiany jako zaburzenie równowagi pomiędzy ilością reaktywnych form tlenu i aktywnością przeciwutleniaczy, bierze się pod uwagę w patogenezie wielu chorób przebiegających z uszkodzeniem oksydacyjnym istotnych biologicznie makrocząsteczek (Kizil i wsp., 2007; Valko i wsp., 2007). U ludzi potwierdzono udział stresu oksydacyjnego w przebiegu cukrzycy, miażdżycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, obturacyjnego bezdechu sennego i zmian neurodegeneracyjnych (Schultz i wsp., 2000; Maier i Chan, 2002; Aruoma i wsp., 2007; Gelderman i wsp., 2007). Wykazano również jego udział w rozwoju transformacji nowotworowej oraz reakcji zapalnej (Visconti i Grieco, 2009; Reuter i wsp., 2010). U zwierząt stres oksydacyjny jest uznawany za jeden z głównych czynników doprowadzających do zmniejszenia potencjału obronnego organizmu. Stan ten skutkuje zwiększeniem ryzyka rozwoju chorób, zarówno w formie klinicznej, jak i podklinicznej, doprowadzając do strat ekonomicznych, zmniejszenia opłacalności hodowli i obniżenia jakości produktów pochodzenia zwierzęcego (Lykkesfeldt i Svendsen, 2007). W hodowli wielkotowarowej bydła mlecznego, zmniejszenie efektywności produkcji wynika przede wszystkim z pogorszenia zdrowotności krów mlecznych co skutkuje nadmiernym ich 14

brakowaniem i skróceniem użytkowania najlepszych, wysokowydajnych osobników (Oltenacu i Broom, 2010). Obniżenie wskaźników zdrowotności krów mlecznych w chowie intensywnym wynika najczęściej z trudności w pokryciu potrzeb pokarmowych najbardziej wydajnych krów mlecznych, w szczególności zapotrzebowania na energię i białko. Dochodzi do zaburzenia statusu energetycznego i nasilenia występowania chorób metabolicznych takich jak ketoza, kwasica żwacza, przemieszczenie trawieńca, zatrzymanie łożyska, hipokalcemia czy zapalenie macicy (Heidarpour i wsp., 1996; Blum i wsp., 2000; Nowak i wsp., 2006; Kankofer i wsp. 2010). Gwałtowne obniżenie kondycji ciała i statusu energetycznego predysponuje do wzrostu stężenia w osoczu reaktywnych form tlenu, dlatego pomiar parametrów równowagi oksydacyjnej jest kluczowy dla holistycznej oceny zdrowotności krów mlecznych szczególnie w okresie predysponującym do występowania chorób metabolicznych (Edmonson i wsp., 1989; Bernabucci i wsp., 2005). Z tego względu określenie wartości parametrów statusu antyoksydacyjnego jest istotnym elementem monitorowania zdrowotności krów mlecznych w różnych okresach cyklu produkcyjnego. Obok wysokowydajnych krów holsztyńsko-fryzyjskich, na szczególną uwagę zasługują krowy ras krzyżówki czerwonej norweskiej z holsztyńsko-fryzyjską oraz polskiej czerwonej, ze względu na wzrastające zainteresowanie hodowlą krzyżówek międzyrasowych oraz ras rodzimych.

2. Kierunki hodowli bydła mlecznego w Polsce

W minionym 25-leciu w Polsce zaszły istotne zmiany w hodowli bydła mlecznego, uwarunkowane głównie przyczynami ekonomicznymi. Zmiany te obejmowały znaczną intensyfikację hodowli bydła mlecznego. Hodowla została ukierunkowana na utrzymanie wysokowydajnych krów mlecznych w dużych stadach bydła mlecznego. Doszło tym samym do zmniejszena liczby gospodarstw o profilu mlecznym (głównie eliminacji małych gospodarstw) i wzrostu średniej liczby krów mlecznych utrzymywanych w gospodarstwie. Ograniczono pogłowie krów o niskiej i średniej wydajności mlecznej na rzecz krów wysokowydajnych, co przyczyniło się do ogólnego spadku pogłowia bydła mlecznego, ogólnego wzrostu wydajności mlecznej oraz wzrostu ogólnej produkcji mlecznej w Polsce. Intensyfikacja hodowli bydła mlecznego wymusiła zmianę struktury rasowej utrzymywanych zwierząt, preferując rasy wysokowydajne. W hodowli wielkostadnej rasy rodzime, takie jak rasa polska czerwona, zostały zastąpione wysokowydajnymi krowami rasy holsztyńsko- fryzyjskiej. Rasa holsztyńsko-fryzyjska (HF) stanowi aktualnie ponad 90% pogłowia bydła

mlecznego utrzymywanego w Polsce. O sukcesie hodowlanym rasy HF zdecydował szybko następujący, stale utrzymujący się wzrost wydajności mlecznej, możliwy dzięki intensywnym pracom hodowlanym opartym na selekcji genetycznej oraz poprawie jakości żywienia i warunków utrzymania zwierząt. Według oceny wartości użytkowej krów mlecznych oraz analiz przeprowadzonych przez Polską Federację Hodowców Bydła i Producentów Mleka przeciętna wydajność mleczna krowy wzrosła z 3 668 kg w 1985 r. do 8 298 kg w 2018 r.

Wraz ze wzrostem wydajności mlecznej obserwowano znaczne pogorszenie zdrowotności oraz skrócenie czasu użytkowania mlecznego krów rasy HF (Freyer i wsp., 2008). Jak podaje Oltenacu i Broom (2010), intensywna selekcja hodowlana prowadzona w celu zwiększenia wydajności mlecznej wpłynęła negatywnie na kondycję zwierząt. Wykazano odwrotnie proporcjonalną zależność pomiędzy parametrami wydajności mlecznej, a wskaźnikami zdrowia, płodności i długowieczności. Hagen i Fürll (2010) oraz Ingvartsen i wsp. (2003) wykazali u krów wysokowydajnych zwiększoną zapadalność na choroby metaboliczne, choroby układu rozrodczego, zapalenie wymienia oraz choroby racic. Z tego względu, jednym z kierunków nowoczesnej hodowli bydła mlecznego jest dążenie do poprawy stanu zdrowia krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej, przy równoczesnym zachowaniu stosunkowo wysokiej wydajności mlecznej. Efekt ten można uzyskać poprzez krzyżowanie międzyrasowe (Ferris i wsp., 2014; Gołębiewski i wsp., 2015; Ibrahim i wsp., 2016) z rasami charakteryzującymi się dobrą zdrowotnością. Dlatego podejmuje się próby wprowadzenia do hodowli bydła mlecznego w Polsce nowej rasy, będącej wynikiem krzyżówki rasy norweskiej czerwonej (NRF) z rasą holsztyńsko-fryzyjską (HF). Krowy rasy NRF charakteryzują się wyższą płodnością, małą podatnością na choroby, wysokim wskaźnikiem zacieleń, łatwych porodów i odchowu cieląt. U krów rasy NRF stwierdzono prawie 4 - krotnie niższy wskaźnik martwo urodzonych cieląt oraz niższą liczbę komórek somatycznych w mleku, w porównaniu do krów rasy HF (Begley i wsp., 2009). Krowy rasy NRFxHF mogą osiągać wydajność mleczną nieznacznie niższą niż krowy HF, ze względu na silne uwarunkowania genetyczne. Wykazano również, że wydajność mleczna krów NRFxHF zależy w dużej mierze od warunków utrzymania, organizacji pracy w stadzie oraz optymalnej opieki lekarsko- weterynaryjnej (Begley i wsp., 2009). Rosnące zainteresowanie użytkowaniem krów rasy NRFxHF sprawia, że staje się ona jednym z nowych kierunków hodowli bydła mlecznego, alternatywnym do jednostronnej hodowli krów wysokowydajnych rasy HF.

Drugim alternatywnym kierunkiem hodowli krów mlecznych jest hodowla zachowawcza ras rodzimych, będąca w opozycji do postępującej globalizacji i intensyfikacji produkcji mlecznej. Intensyfikacja hodowli podyktowana czynnikami ekonomicznymi, promuje hodowlę ras wysokowydajnych ze względu na największą efektywność i dochodowość użytkowania (Litwińczuk, 2011; Chabuz, 2013), podczas gdy hodowla zachowawcza obejmuje użytkowanie ekstensywne ras lokalnych. Przykładem rasy rodzimej utrzymywanej w chowie ekstensywnym jest bydło polskie czerwone (PR, Polish Red) stanowiące mniej niż 1,2 % ogólnego pogłowia bydła mlecznego w Polsce. Ze względu na małą liczebność pogłowia i zagrożenie wyginięciem, rasa PR została objęta w 1999 roku programem ochrony zasobów genetycznych, który jest prowadzony do dnia dzisiejszego przez Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy w Krakowie*. Rasę polską czerwoną uznaje się za jedną z najstarszych rodzimych ras bydła utrzymywanych na terenie Europy (Oltenacu i Algers, 2005; Adamczyk i wsp., 2008).

Wydajność mleczna krów rasy polskiej czerwonej jest niska i przeważnie nie przekracza 4 tyś. kg mleka w czasie całej laktacji. Czas trwania laktacji może znacząco różnić się między osobnikami ze względu na typowe dla tej rasy zjawisko spontanicznego zasuszenia oraz odwracalnego zmniejszenie produkcji mlecznej w okresach ograniczonego żywienia (Szarek i wsp., 2004; Stefanon i wsp., 2005). Krowy rasy PR wykazują również inne przystosowania do trudnych warunków środowiskowych, dlatego są utrzymywane głównie w warunkach ekstensywnych, w oparciu o wypas pastwiskowy (Adamczyk i wsp., 2008). Krzywa laktacji krów PR, w porównaniu z krowami HF, jest mniej stroma i przebiega bardziej płasko. Jednak krowy rasy PR odznaczają się dużą odpornością na choroby, żywotnością oraz doskonałą płodnością. Porody i odchów cieląt przebiegają zazwyczaj bez komplikacji (Szarek i wsp., 2004).

Pomimo niskiej wydajności mlecznej krów rasy PR, należy zwrócić uwagę na wysoką wartość biologiczną ich mleka. Duża zawartość białka, szczególnie frakcji kazein oraz kwasów tłuszczowych, sprawia, że mleko krów rasy polskiej czerwonej jest pożądanym surowcem w przemyśle mleczarskim (Felenczak i wsp., 2002; Litwińczuk i wsp., 2015).

* Źródło danych: załącznik nr 2 do zarządzenia Dyrektora Instytutu Zootechniki PIB nr 21/19 z dnia 18 marca 2019 r. pt. „Program ochrony zasobów genetycznych bydła rasy polskiej czerwonej (dostęp on-line http://bydlo.bioroznorodnosc.izoo.krakow.pl/).

Dodatkowo obecność rzadko spotykanej frakcji kappa-kazein oraz α-laktoglobulin, potwierdza możliwość wykorzystania mleka krów PR jako surowca o właściwościach prozdrowotnych (Litwińczuk i wsp., 2015). Rasa polska czerwona, podobnie jak inne rasy rodzime, odgrywa ważna rolę w zachowaniu różnorodności genetycznej hodowanego bydła mlecznego. Wykazano również, że hodowla bydła rasy polskiej czerwonej oddziaływuje pozytywnie na obszary związane ze środowiskiem, kulturą i społeczeństwem (Litwińczuk i wsp., 2012; Chabuz i wsp., 2012 i 2013), dlatego polską czerwoną rasę bydła należy postrzegać jako unikatową.

3. Ocena zdrowotności wysokowydajnych krów mlecznych

Hodowla wielkotowarowa bydła mlecznego, prowadzona w sposób intensywny, jest zależna od czynników genetycznych i środowiskowych, które mogą prowadzić do obniżenia wskaźników zdrowotności krów mlecznych. Pogorszenie zdrowotności skutkuje nadmiernym brakowaniem i skróceniem użytkowania najlepszych wysokowydajnych krów mlecznych, a co za tym idzie zmniejszenia efektywności produkcji (Ingvartsen i wsp. 2003; Freyer i wsp., 2008; Oltenacu i Broom 2010). Wiele problemów zdrowotnych u krów wysokowydajnych wynika z trudności w pokryciu potrzeb pokarmowych najbardziej wydajnych krów mlecznych, w szczególności zapotrzebowania na energię i białko. W konsekwencji, dochodzi do pogłębienia ujemnego bilansu energii w okresie okołoporodowym, a co za tym idzie nasilenia występowania chorób metabolicznych, takich jak ketoza, kwasica żwacza, przemieszczenie trawieńca, zatrzymanie łożyska, hipokalcemia czy zapalenie macicy (Nowak i wsp., 2006; Illek i wsp., 2015). Okres okołoporodowy jest więc okresem predylekcyjnym do występowania chorób metabolicznych, których ryzyko występowania może być określane na podstawie oceny statusu energetycznego (Rodriguez-Jimenez i wsp., 2018).

Wstępną ocenę statusu energetycznego krów wysokowydajnych przeprowadza się w oparciu o ocenę kondycji ciała, określaną przy użyciu 5-stopniowej skali (ang. BCS – body condition score) (Edmonson i wsp., 1989) rutynowo w całym cyklu produkcyjnym (Kluciński i wsp., 2012; Wieliczko, 2013). Punktowy wskaźnik kondycji ciała ściśle koreluje z ilością tłuszczu w tkance podskórnej u krów wysokowydajnych, który stanowi ważną rezerwę energetyczną organizmu (Nogalski i wsp., 2009). Według Bernabucci i wsp. (2005) najsilniejszy spadek kondycji ciała u krów mlecznych ma miejsce w ciągu pierwszych 2 tygodni po porodzie i ma on związek z nasilonymi przemianami energetycznymi w okresie

okołoporodowym i wczesnej laktacji, charakterystycznymi dla krów wysokowydajnych (Coffey i wsp., 2002). Nasilone przemiany energetyczne w okresie okołoporodowym mają na celu zaspokojenie bytowych potrzeb energetycznych oraz pokrycie wydatku energetycznego, związanego z intensywną produkcją mleka (Sakha i wsp., 2006; Wathes i wsp., 2009). Wymagania energetyczne i mineralne krów mlecznych, zwłaszcza wysokowydajnych, podczas laktacji są znacznie większe niż u innych gatunków zwierząt (Lohrenz i wsp., 2010). Jeżeli nie zostają one pokryte, poprzez zbilansowane żywienie, dochodzi do rozwoju negatywnego bilansu energetycznego, co skutkuje nasileniem procesów katabolicznych (Barej, 1990; Eicher i wsp., 1998). W efekcie nasilenia procesów katabolicznych dochodzi do mobilizacji tkanki tłuszczowej i obniżenia kondycji ciała (Bell, 1995; Gross i wsp., 2013; Kessel i wsp., 2008). Zatem ocena zmiany kondycji ciała na przestrzeni cyklu produkcyjnego stanowi stosunkowo czuły wskaźnik stanu energetycznego bydła mlecznego (Smith i wsp., 1997a). Metoda ta, ze względu na łatwość jej wykonania i bardzo niskie koszty, jest rekomendowana do ewaluacji prawidłowości zarządzania stadem bydła mlecznego w kontekście żywienia (Gillund i wsp., 2001). Oprócz powyżej wymienionych czynników na kondycję ciała mają wpływ również czynniki genetyczne (Roche i wsp., 2006), wiek krowy oraz liczba laktacji (Pryce i Harris, 2006) i sezon wycielenia (Pryce i wsp., 2001). U krów ras rodzimych charakteryzujących się niską produkcją mleczną, zmiany BCS w cyklu produkcyjnym są nieistotne, a parametr ten nie jest oceniany (Szarek i wsp., 2004).

Według González i wsp. (2009) oraz McArt i wsp. (2013b) monitorowanie parametrów krwi krów wysokowydajnych jest bardziej skutecznym narzędziem w rozpoznawaniu i ocenie zaawansowania zaburzeń metabolicznych od oceny kondycji ciała. W tym celu przeprowadza się szczegółową ocenę statusu energetycznego krów mlecznych w oparciu o pomiar stężenia pośrednich metabolitów tłuszczy, takich jak stężenie cholesterolu, frakcji lipoprotein o wysokiej i niskiej gęstości, trójglicerydów oraz ciał ketonowych (kwasu ß-hydroksymasłowego, kwasu acetooctowego i acetonu) we krwi badanych krów. U przeżuwaczy dominującym związkiem ketonowym jest kwas β-hydroksymasłowy (BHM), którego stężenie stanowi główny wskaźnik nasilonych przemian energetycznych (Wittwer, 1995; Cincović i wsp., 2012; Rodriguez-Jimenez i wsp., 2018). Krowy podlegające intensywnym procesom katabolicznym w okresie okołoporodowym charakteryzują się wyższym stężeniem BHM w surowicy, co wiarygodnie odzwierciedla intensywność mobilizacji lipidów, szczególnie po porodzie i podczas laktacji (Busato i wsp.,

2002). Wzrost stężenia kwasu β-hydroksymasłowego ogranicza również spożycie paszy i upośledza funkcje przysadki i tarczycy, narządów dokrewnych związanych z kontrolą homeostazy, co dodatkowo pogłębia ujemny bilans energii i zwiększa występowanie chorób metabolicznych (Laeger i wsp., 2010). Z tego względu pomiar stężenia BHM jest uznawany za „złoty standard” w diagnostyce laboratoryjnej zaburzeń okresu okołoporodowego krów wysokowydajnych (Wittwer, 1995; Cincović i wsp., 2012; Rodriguez-Jimenez i wsp., 2018). Stężenie BHM w surowicy, ze względu na ścisłe powiązanie z bilansem energetycznym, jest wykorzystywane m.in. w diagnostyce podklinicznej ketozy, a monitorowanie stężenia BHM w surowicy w okresie zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji pozwala na ocenę ryzyka wystąpienia zaburzeń metabolicznych (Andersson i Lundström, 1984; Andersson, 1988; Oetzel, 2004; Karimi i wsp., 2016). Stężenie BHM w surowicy jest uznawane za najczulszy i zarazem niezawodny wskaźnik zarówno klinicznej, jak i podklinicznej ketozy u wysokowydajnych krów mlecznych (Duffield, 2000; González i wsp., 2009; McArt i wsp., 2013b). Jak podał Duffield ze wsp. (1997) oraz Meikle i wsp. (2004) podkliniczna ketoza u krów mlecznych jest zjawiskiem niekorzystnym i niepożądanym przez hodowców, ze względu na obniżenie wydajności mlecznej oraz niekorzystny wpływa na zdolności rozrodcze i status układu immunologicznego. Toksyczne i subtoksyczne stężenia BHM oraz acetooctanu hamują u bydła proliferację limfocytów oraz zaburzają aktywność fogocytarną polimorfojądrowych leukocytów obojętnochłonnych, co pośrednio zwiększa podatność krów na inne choroby, szczególnie infekcyjne, i pogarszając bilans ekonomiczny hodowli bydła wysokomlecznego (Huszenica i wsp., 2006; Kluciński i wsp., 1988; Targowski i wsp., 1985; Targowski i Kluciński, 1983). Wczesne diagnozowanie podklinicznej ketozy, w oparciu o stężenie BHM we krwi, pozwala na ograniczenie strat ekonomicznym i poprawę zdrowotności i wydajności bydła mlecznego (Cincnović i wsp., 2012).

Bernabucci i wsp. (2005) wykazali ponadto, że status energetyczny krów wysokowydajnych jest powiązany ze statusem oksydacyjnym. Również Edmonson i wsp. (1989) wykazali zależność pomiędzy BCS, a rozwojem stresu oksydacyjnego u krów mlecznych. Większa utrata kondycji ciała oraz gwałtowne obniżenie statusu energetycznego krów mlecznych w okresie poporodowym predysponuje do wzrostu stężenia w osoczu reaktywnych metabolitów tlenowych, grup tiolowych, związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym oraz obniżenia w erytrocytach aktywności dysmutazy ponadtlenkowej

(Glass i wsp., 1981; Bernabucci i wsp., 2005). Z tego względu pomiar parametrów równowagi oksydacyjnej organizmu może dostarczyć interesujących danych pozwalających na efektywne monitorowanie zdrowotności krów mlecznych szczególnie w okresie predysponującym do występowania chorób metabolicznych.

4. Wykorzystanie oznaczeń parametrów statusu antyoksydacyjnego w ocenie zdrowotności krów mlecznych

Status antyoksydacyjny jest miarą równowagi pomiędzy reakcjami o charakterze pro- i antyoksydacyjnymi zachodzącymi w żywym organizmie (Kovacic i Jacintho, 2001). W wyniku reakcji prooksydacyjnych powstają reaktywne formy tlenu (RFT), które charakteryzuje dwoista natura - w umiarkowanej ilości pełnią funkcje fizjologiczne, natomiast w nadmiarze mogą prowadzić do uszkodzeń oksydacyjnych istotnych biologicznie makrocząsteczek, a w konsekwencji do rozwoju zaburzeń lokalnych i ogólnoustrojowych (Valko i wsp., 2006; Ďuračkova, 2010). Uszkodzenia oksydacyjne istotnych biologicznie tłuszczy, białek, węglowodanów oraz kwasów nukleinowych skutkują bowiem hamowaniem fizjologicznych funkcji pełnionych przez dane składniki biologiczne obecne w przestrzeni wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowej (Halliwell i Gutteridge, 2007; Valko i wsp., 2007). Do głównych konsekwencji uszkodzeń oksydacyjnych na poziomie komórkowym zalicza się: uszkodzenie błony mitochondrialnej, zmniejszenie stężenia ATP, uszkodzenie materiału genetycznego, wzrost stężenia produktów peroksydacji lipidów oraz jonów Ca2+ w cytoplazmie, zwiększenie przepuszczalności błony komórkowej, zmniejszenie stężenia całkowitego glutationu w komórce, uszkodzenia cytoszkieletu oraz zmiany morfologii komórek (Halliwell, 1987; Grover i Samson, 1988; Nakaya i wsp., 1992; Bartosz, 1998 i 2003;).

Zaburzona równowaga pomiędzy ilością RFT i przeciwutleniaczy określona jest mianem stresu oksydacyjnego. Stres oksydacyjny rozwija się w wyniku bezwzględnego lub względnego nadmiaru RFT, a więc w wyniku zwiększonej produkcji RFT, zmniejszonej biodostępności przeciwutleniaczy lub gdy oba zjawiska występują równocześnie (Miller i wsp., 1993; Kizil i wsp., 2007). Efekty stresu oksydacyjnego uzależnione są zarówno od czasu utrzymywania się jak i wielkości zaburzeń równowagi prooksydacyjno- antyoksydacyjnej (Valko i wsp., 2007). Potwierdzono, że u ludzi, utrzymujący się przez dłuższy czas brak równowagi pomiędzy stężeniem RFT a wydolnością mechanizmów antyoksydacyjnych może doprowadzić do zaburzeń płodności (Sikka, 2001; Agarwal i wsp., 21

2003; Sharma i Agarwal, 2004). Wykazano również udział stresu oksydacyjnego w patogenezie m.in. cukrzycy (Jain, 1999; Beisswenger i wsp., 2001; Aruoma i wsp., 2007), miażdżycy (Halliwell, 1989; White i wsp., 1994; Beckman i Koppenol, 1996), reumatoidalnego zapalenia stawów (Flugge i wsp., 1999; Darlington i Stone, 2001; Gelderman i wsp., 2007), obturacyjnego bezdechu sennego (Schultz i wsp., 2000), oraz zmian neurodegeneracyjnych takich jak stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne (Liu, 1996), choroba Alzheimera (Hensley i wsp., 1996; Multhaup i wsp., 1997), choroba Huntingtona (Maier i Chan, 2002) i choroba Parkinsona (Adams i wsp., 2001). Przedstawiono także liczne dowody udziału RFT w transformacji nowotworowej (Cerutti, 1991; Knight, 1998; Visconti i Grieco, 2009), reakcji zapalnej oraz procesach starzenia się organizmu (Fang i wsp., 2009; Reuter i wsp., 2010).

Pomimo dużego zainteresowania zagadnieniami związanymi ze stresem oksydacyjnym w weterynarii, badania nad wpływem równowagi pomiędzy stężeniem RFT, a wydolnością mechanizmów antyoksydacyjnych na zdrowotność krów mlecznych są nieliczne, a ich wyniki niejednokrotnie pozostają ze sobą w sprzeczności. (Lykkesfeldt i Svendsen, 2007) udowodnili, że zwierzęta utrzymywane w warunkach fermowych, w szczególności przeżuwacze, mogą być narażone na stres oksydacyjny sporadycznie lub w sposób ciągły. Jednakże w obu przypadkach uznaje się stres oksydacyjny za główny czynnik doprowadzający do zmniejszenia potencjału obronnego organizmu. Stan ten skutkuje zwiększeniem ryzyka rozwoju chorób, zarówno w formie klinicznej, jak i podklinicznej, doprowadzając do strat ekonomicznych i obniżenia jakości produktów pochodzenia zwierzęcego (Jacob i wsp., 2017). Na uwagę zasługują prace opisujące zmiany w równowadze prooksydacyjno-antyoksydacyjnej bydła, zachodzące w warunkach patologicznych lub pod wpływem czynników stresogennych. Podczas klinicznej postaci anaplazmozy, babesiozy, fascjolozy, hypodermozy i teileriozy stwierdzono także objawy stresu oksydacyjnego. Wykazano względny nadmiaru RFT we krwi w oparciu o wzrost wskaźników uszkodzenia oksydacyjnego (stężenia aldehydu dimalonowego oraz tlenku azotu) przy równoczesnym obniżeniu wartości parametrów enzymatycznej i nieenzymatycznej obrony antyoksydacyjnej (całkowitego statusu antyoksydacyjnego w surowicy, aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy, reduktazy glutationowej w surowicy oraz stężenia kwasu askorbinowego w surowicy) (El-Moghazy, 2011; Guzel i wsp., 2008; Nazifi i wsp., 2009; Ozkurt-Borazan i wsp., 2011). Analogiczne zależności

ujawniono w czasie transportu zwierząt (Chirase i wsp., 2004; Sordillo i Aitken, 2009). Również utrzymywanie krów mlecznych w warunkach stresu cieplnego powodowało wzrost uszkodzeń oksydacyjnych, a w szczególności nasiloną peroksydację lipidów (Chandra i Aggarwal, 2009; Aengwanich i wsp. 2011). Nie ulega wątpliwości, że znaczny wzrost stężenia RFT i/lub niewydolność mechanizmów antyoksydacyjnych należy brać pod uwagę w patogenezie wielu chorób bydła mlecznego. Jednak badania przeprowadzone na klinicznie zdrowych krowach mlecznych wykazały, że status oksydacyjny i antyoksydacyjny ulegają pewnym zmianom w warunkach fizjologicznych. Takie wahania w cyklu produkcyjnym mogą wynikać jedynie z przejściowych zmian metabolicznych, w granicach nie przekraczających możliwości kompensacyjnych organizmu, a co za tym idzie nie muszą prowadzić do zaburzenia homeostazy redoks i rozwoju stresu oksydacyjnego (Castillo i wsp., 2003 oraz 2005; Pintea i wsp., 2006; Cigliano i wsp., 2014; Konvičná i wsp., 2015). Ponieważ zależności pomiędzy statusem antyoksydacyjnym, a cyklem produkcyjnym i wydajnością mleczną krów wymagają szerszego komentarza, zostaną szerzej omówione w kolejnych podrozdziałach.

4.1. Procesy prooksydacyjne

Podstawowym źródłem reaktywnych form tlenu (RFT) jest łańcuch oddechowy, zlokalizowany w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (Boveris, 1984; Cadenas i Davies, 2000). Szacuje się, że od 1 do 4% tlenu zaangażowanego w tym procesie ulega ubocznej i niecałkowitej, bo jednoelektronowej redukcji, która odbywa się przy udziale flawoproteiny- dehydrogenazy NADH oraz ubichinonu (Beyer, 1992; Nohl, 1994). Wytwarzany w ten •− sposób anionorodnik ponadtlenkowy (O2 ) może wywołać istotne zaburzenia funkcji mitochondrium, które w dalszej konsekwencji skutkują spadkiem wytwarzania ATP przy jednoczesnym wzmożonym wytwarzaniu RFT (Rego i Oliveira, 2003; Genova i wsp., 2004; Li i wsp., 2004). RFT w znaczących ilościach powstają również w wyniku reakcji Fentona, z udziałem oksydoreduktaz oraz podczas metabolizmu nukleotydów purynowych i mikrosomalnego cyklu hydroksylacyjnego przy udziale cytochromu P-450 (Fenton, 1984; Granger, 1988; Miller i wsp., 1990; Dupuy i wsp., 1991; Fitzpatrick i wsp., 2009). RFT formują się także w wyniku działania czynników fizycznych, takich jak: promieniowanie jonizujące, promieniowanie nadfioletowe, fale ultradźwiękowe oraz kontakt z fotosensybilizatorami. Powstające w ten sposób reaktywne formy tlenu są więc ubocznymi, ale i nieuniknionymi produktami metabolizmu w organizmach tlenowych (Fridovich, 1978;

Poyton i wsp., 2009; Wiedemann i wsp., 2013), sklasyfikowanymi jako najbardziej liczna klasa wolnych rodników (Miller i wsp., 1990; Boveris, 1998).

Głównym przedstawicielem reaktywnych form tlenu jest anionorodnik ponadtlenkowy •− (O2 ), który może dalej ulegać przekształceniu i przyczyniać się do powstania wtórnych RFT (Valko i wsp., 2005). Do istotnych biologicznie RFT, będących wolnymi rodnikami, zalicza się również wysoce reaktywny rodnik hydroksylowy (•OH), rodnik wodoronatlenkowy •− (HO2 ), rodnik nadtlenkowy (ROO•), rodnik alkoksylowy (RO•), tlenek azotu (NO•), ditlenek azotu (NO2•), rodnik aryloksylowy (ArO•) i rodnik arylonadtlenkowy (ArOO•) (Boveris, 1998; Puzanowska-Tarasiewicz i wsp., 2008 i 2010). Wśród pochodnych tlenu, 1 nieposiadających wolnych elektronów, wyróżnić można m.in.: tlen singletowy ( O2), ozon - (O3), nadtlenek wodoru (H2O2), kwas podchlorawy (HOCl), podchloryn (ClO ), kwas podbromawy (HOBr), podbromin (BrO-), kwas podjodawy (HOI) oraz podjodyn (IO-) (Dröge, 2002; Hansen, 2010).

W warunkach fizjologicznych RFT są stale generowane w każdej żywej komórce, natomiast w czasie procesów patologicznych ich ilość znacząco może wzrosnąć (Halliwell, 1991). Produkcja RFT może odbywać się w sposób kontrolowany, czego przykładem jest mechanizm odporności wrodzonej - wybuch tlenowy, zachodzący w aktywowanych makrofagach i neutrofilach, chroniący organizm przed inwazją mikroorganizmów (Keisari i wsp., 1983; Hampton i wsp., 1998; Coussens i Werb, 2002; Dröge, 2002; Hansen, 2010). Ponadto RFT mogą pełnić rolę cząsteczek sygnalizacyjnych (Finkel, 1998; Los i wsp., 1995), uczestniczących w ekspresji genów (Allen i Tresini, 2000) oraz regulacji kluczowych procesów komórkowych: proliferacji, migracji, różnicowania i kontrolowanej śmierci komórek (Jabs, 1999; Nakamura i wsp., 1997; Simon i wsp., 2000; Yoshida i wsp., 2004;Valko i wsp., 2007; Covarrubias i wsp., 2008; Gałecka i wsp., 2008).

4.2. Procesy antyoksydacyjne

Stałe fizjologiczne generowanie reaktywnych form tlenu w komórkach wykazujących metabolizm tlenowy, doprowadziło do wykształcenia na drodze ewolucji różnorodnych mechanizmów regulacyjnych, celem utrzymania stanu równowagi oksydacyjnej (Cadenas, 1997; Dröge, 2002). Zabezpieczają one zarówno wnętrze komórek, jak i środowisko przestrzeni zewnątrzkomórkowej (Hulbert i wsp., 2007), przed znaczącym wzrostem RFT, które mogłoby doprowadzić do uszkodzeń oksydacyjnych i rozwoju procesów patologicznych 24

(Halliwell, 1991). Odpowiedź organizmu na stres oksydacyjny, podobnie jak na większość czynników stresogennych, zachodzi w trzech etapach: alarmowym, adaptacyjnym i wyczerpania (Onasanya i wsp., 2015; Scope i wsp., 2002). W etapie alarmowym dochodzi do wzrostu aktywności bądź stężenia antyoksydantów. Utrzymujący się wzrost aktywności enzymów ochronnych oraz zwiększenie stężenia antyoksydantów niskocząsteczkowych sugeruje wystąpienie stanu zwiększonego narażenia na RFT i etap adaptacyjny odpowiedzi antyoksydacyjnej. Po ustąpieniu czynnika stresogennego, dochodzi do powrotu aktywności bądź stężeń antyoksydantów do wartości fizjologicznych, charakterystycznych dla niezaburzonej homeostazy redoks. Jednak nagłe obniżenie aktywności enzymów ochronnych lub stężeń antyoksydantów niskocząsteczkowych, poniżej wartości fizjologicznych, sugeruje stan wyczerpania organizmu, czyli przełamania jego możliwości obronnych. W związku z powyższym istotne jest monitorowanie w czasie zmian stężenia i aktywności antyoksydantów, a porównanie statusu antyoksydacyjnego w warunkach fizjologicznych oraz okresach predylekcyjnych do wystąpienia zaburzeń równowagi redoks, dostarcza najpełniejszych danych o możliwościach obronnych organizmu (Hulbert i wsp., 2007; Onasanya i wsp., 2015).

Głównymi komponentami mechanizmów regulacyjnych, uczestniczących w utrzymaniu równowagi redoks, są związki o budowie enzymatycznej i nieenzymatycznej, które ze względu na pełnioną rolę są określane wspólnym terminem antyoksydantów. Antyoksydanty enzymatyczne i nieenzymatyczne różnią się pod względem mechanizmów działania antyoksydacyjnego oraz efektywności inaktywacji reaktywnych form tlenu (Di Mascio i wsp., 1991; Sies, 1997).

Obrona enzymatyczna oparta jest głównie na aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPX), całkowitej katalazy (CAT), reduktazy glutationowej (GR) i paraoksonazy-1 (PON-1) (Roels i Geerts, 1982; Burk, 1990; Brigelius- Flohé, 1999; Ray i Husain, 2002; Landis i Tower, 2005; Konvicna i wsp., 2014; Kulka i wsp., 2016). Enzymy te uznawane są za pierwszą linię obrony przeciwko reaktywnym formom tlenu (Michiels i wsp., 1994; Abd Ellah, 2016). Inne enzymy, takie jak peroksyredoksyny, hydrolazy epoksydów, S-transferazy glutationowe, metalotioneiny, ceruloplazmina i peroksysomalne błonowe białko 20 (PMP 20), pełnią drugoplanową, pomocniczą rolę w obronie przed RFT (Burk, 1990; Hayes i McLellan, 1999). Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD) i całkowita katalaza (CAT) uczestniczą w reakcji dysproporcjowania odpowiednio 25

anionorodnika ponadtlenkowego oraz nadtlenku wodoru. Mechanizm ten zabezpiecza przed powstaniem bardziej reaktywnego rodnika hydroksylowego. Największą aktywność antyoksydantów enzymatycznych stwierdza się w środowisku wewnątrzkomórkowym. U ssaków, w tym również u bydła, wyróżnia się trzy izoformy dysmutzy ponadtlenkowej, oznaczane w skrócie: SOD-1, SOD-2 oraz SOD-3 (Zelko i wsp., 2002; Covarrubias i wsp., 2008). SOD-1, któremu przypisuje się najważniejszą rolę biologiczną, powszechnie występuje w erytrocytach, hepatocytach i spermatogoniach, SOD-2 w macierzy mitochondrialnej, a SOD-3 odkryto w osoczu krwi, limfie, płynie maziowym, mózgowo- rdzeniowym oraz śródmiąższowym tkanek (Marklund i wsp., 1982; Crapo i wsp., 1992). Z kolei reduktaza glutationowa (GR), utrzymuje całkowitą pulę glutationu w stanie zredukowanym, czyli w formie charakteryzującej się właściwościami ochronnymi przed RFT (Jefferies, 2003; Józefczak i wsp., 2012).

Obrona nieenzymatyczna oparta jest głównie na obecności niskocząsteczkowych związków o właściwościach antyoksydacyjnych nazywanych zmiataczami wolnych rodników. Zmiatacze wolnych rodników stanowią główny mechanizm obronny przed RFT płynów zewnątrzkomórkowych oraz osocza krwi. Ich obecność, w szczególności glutationu, stwierdza się również w przestrzeni wewnątrzkomórkowej. Glutation jest najważniejszym zmiataczem wolnych rodników. Wykazuje silną zdolność do wiązania RFT oraz warunkuje skuteczne działanie innych antyoksydantów, takich jak witamina C, witamina E czy selen (Machado i wsp., 2014; Maurya i wsp., 2014). U ssaków, uwzględniając również bydło, do najważniejszych endogennych antyoksydantów nieenzymatycznych poza glutationem zalicza się kwas moczowy, albuminy, bilirubinę, kwas askorbinowy, biliwerdynę, kwas liponowy, karnozynę, anserynę, kreatyninę, zredukowany koenzym Q oraz pochodne estronu i estradiolu (Salvemini i wsp., 1999; Chawla i Kaur, 2004; Masella i wsp., 2005; Tanritanir i wsp., 2009). Antyoksydanty niskocząsteczkowe łącząc się z RFT, szczególnie rodnikiem hydroksylowym, ulegają uszkodzeniu, co stanowi mechanizm zabezpieczający makrocząsteczki istotne biologicznie przed uszkodzeniem oksydacyjnym. Nieenzymatyczne niskocząsteczkowe antyoksydanty stanowią drugą linię obrony przed reaktywnymi formami tlenu, ponieważ reakcje w których uczestniczą są mniej specyficzne w porównaniu do reakcji katalizowanych przez antyoksydanty enzymatyczne (Uriu-Adams i Keen, 2005; McEligot i wsp., 2005; Kleczkowski i wsp., 2006).

4.3. Monitorowanie statusu antyoksydacyjnego u bydła mlecznego poprzez oznaczanie wybranych parametrów laboratoryjnych

Stan stresu oksydacyjnego nie jest klasyczną chorobą i nie towarzyszą mu specyficzne objawy kliniczne, pomimo, że może doprowadzać do zaburzeń zdrowotnych bydła mlecznego. Dlatego też monitorowanie statusu antyoksydacyjnego wymaga szczególnego podejścia i użycia specjalistycznych metod (Hermans i wsp., 2007; Sharma i wsp., 2011). Wykorzystanie oceny statusu pro- i antyoksydacyjnego w diagnostyce klinicznej stwarza możliwość oceny ryzyka wystąpienia stresu oksydacyjnego, a tym samym ryzyka wystąpienia chorób z nim związanych (Cherubini i wsp., 2005; Abuelo i wsp., 2013). Jednak pomimo licznych badań (Turk i wsp., 2004, 2008 i 2013; Castillo i wsp., 2006; Albera i Kankofer, 2010 i 2011; Antončić-Svetina i wsp., 2011; Sharma i wsp., 2011) nie określono dotychczas norm fizjologicznych dla danych parametrów antyoksydacyjnych jednoznacznie wskazujących na wystąpienie stresu oksydacyjnego u krów mlecznych. Trudność metodyczna wynika ze złożoności układów chroniących organizm przed negatywnym wpływem RFT. Istotne znaczenie ma również dostępność metod badawczych i laboratoryjnych wykorzystywanych w ocenie stanu pro- i antyoksydacyjnego (Hermes-Lima i wsp., 1998; Abuelo i wsp., 2013). W prezentowanej pracy metody badawcze zostały wybrane w oparciu o trójstopniowy system obrony antyoksydacyjnej opisywany w organizmie ssaków, w tym również bydła, wykorzystujący oznaczenia aktywności antyoksydantów enzymatycznych oraz stężenia antyoksydantów nieenzymatycznych (McEligot i wsp., 2005; Landis i Tower, 2005). Celem pierwszej linii obrony jest niedopuszczeniu do powstawania RFT oraz ich reakcji z istotnymi biologicznie makrocząsteczkami. Istotną rolę pełnią w tym procesie antyoksydanty enzymatyczne oraz białka wiążące jony pierwiastków przejściowych (Eckersall i Conner, 1988). W monitorowaniu wydolności pierwszej linii obrony antyoksydacyjnej wykorzystuje się oznaczenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) (izoenzymu pozakomórkowego SOD-3 w surowicy krwi oraz izoenzymu cytoplazmatycznego SOD-1 w hemolizacie), aktywności całkowitej katalazy (CAT) w surowicy oraz aktywności reduktazy glutationowej (GR) w surowicy (Goldberg i Spooner, 1983; Wheeler i wsp., 1990; Covarrubias i wsp., 2008). Drugą linię obrony stanowią niskocząsteczkowe związki o właściwościach antyoksydacyjnych, które kosztem uszkodzenia własnych cząsteczek wyłapują pozostałe RFT, głównie w środowisku wodnym płynu pozakomórkowego. Monitorowanie efektywności drugiej linii obrony opiera się na pomiarze stężenia glutationu całkowitego w hemolizacie oraz w surowicy stężenia bilirubiny całkowitej, kwasu 27

moczowego oraz albumin (Ehrlich, 1883; Klackar’a, 1947; Bartholomew i Delany, 1964; Eyer i wsp., 1986). Trzecia linia obrony antyoksydacyjnej odpowiada za usuwanie skutków reakcji RFT z makrocząsteczkami i polega na odtwarzaniu prawidłowej struktury uszkodzonych cząsteczek. W pierwszej kolejności opiera się ona na aktywności enzymów naprawiających uszkodzone kwasy nukleinowe. Wydajność trzeciej linii obrony nie jest monitorowana poprzez parametry statusu antyoksydacyjnego, ze względu na niską specyficzność oznaczeń (Dröge, 2002; Hulbert i wsp., 2007). Podsumowaniem oceny sprawności nieenzymatycznych mechanizmów antyoksydacyjnych jest określenie całościowo statusu antyoksydacyjnego organizmu w oparciu o pomiar całkowitego potencjału antyoksydacyjnego w surowicy (TAS, ang. Total Antioxidant Status) (Cao i Prior, 1998; Ghisellii wsp., 2000). Wartość TAS odzwierciedla łączną aktywność antyoksydacyjną antyoksydantów nieenzymatycznych, które różnią się między sobą cechami wynikającymi z budowy chemicznej i odmiennym mechanizmem działania (Miller i wsp., 1993; Young, 2001). Jednym z wyznaczników statusu oksydacyjnego wysokowydajnych krów mlecznych może okazać się oznaczenie stężenia związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym, określanych jako związki TBA-reaktywne (TBARS, ang. Thiobarbituric acid reactive substances). W tej pośredniej metodzie pomiarowej wskaźnikiem statusu oksydacyjnego, a pośrednio antyoksydacyjnego, jest stężenie końcowych produktów peroksydacji lipidów (Maseki, 1981; Ledwożywa i wsp., 1986; Aoki i wsp., 2008; Celi, 2011). Według Armstronga i Brownego (1994) oraz Ayala i wsp. (2014) pomiar stężenia związków TBA-reaktywnych można uznać za dobry ogólny wskaźnik nasilenia stresu oksydacyjnego, bowiem uwzględnia wiele produktów końcowych peroksydacji lipidów, włączając dominujący pod względem ilościowym aldehyd malonowy (MDA). Metoda ta jest powszechnie wykorzystywana w badaniach naukowych do oceny nasilenia uszkodzeń oksydacyjnych (Pavlović i wsp., 2019; Gunawardena i wsp., 2019; Kapusta i wsp., 2018; Kumar i wsp., 2019). Oznaczenie TBARS stanowi wspólny wskaźnik pozwalający na ocenę statusu prooksydacyjno- antyoksydacyjnego i statusu energetycznego, istotnego z punktu widzenia monitorowania zdrowotności wysokowydajnych krów mlecznych w okresie predylekcyjnym do wystąpienia chorób metabolicznych (Rodriguez-Jimenez i wsp., 2018).

Podsumowując możliwości monitorowania statusu antyoksydacyjnego bydła mlecznego należy stwierdzić, że miarodajna ocena potencjału obronnego organizmu wymaga zastosowania złożonego panelu parametrów laboratoryjnych. Wielokierunkowa koncepcja

oceny statusu antyoksydacyjnego zwiększa możliwość rzetelnego odwzorowania stanu żywego organizmu. Potrzebie wielokierunkowej oceny obronności organizmu krów mlecznych wychodzą na przeciw nowe techniki diagnostyczne oparte na metodach biologii molekularnej. Ich zastosowanie umożliwi ocenę mechanizmów antyoksydacyjnych na poziomie transkryptomicznym, poznanie regulacji genów kodujących przeciwutleniacze oraz białek regulujących ich ekspresję na etapie translacyjnym i potranslacyjnym. Ponadto zastosowanie techniki mikromacierzy pozwala na jednoczesne zbadanie ekspresji znacznej ilości genów, co może znaleźć zastosowanie w badaniach przesiewowych. Zastosowanie metod biologii molekularnej pozwoli na uzyskanie wysokiej czułości pomiarów z małej objętości materiału wyjściowego (van Hal i wsp., 2000).

4.4. Terapeutyczna modyfikacja statusu antyoksydacyjnego u bydła mlecznego

Zjawisko stresu oksydacyjnego u krów mlecznych jest niekorzystne pod względem ekonomicznym, dlatego jednym z kierunków badań jest poszukiwanie skutecznych i opłacalnych rozwiązań zmniejszających nasilenie stresu oksydacyjnego. Poprawę stanu oksydacyjnego uzyskano na drodze suplementacji nieenzymatycznymi antyoksydantami, stosowanymi doustnie lub parenteralnie. W okresie zasuszenia podanie domięśniowe witaminy E (680 mg) wraz z selenem (15 mg) zastosowanym w formie soli potasowej zmniejsza po porodzie częstotliwość występowania zatrzymania łożyska u krów mlecznych (Trinder i wsp., 1969; Pechová i wsp., 2002; Kleczkowski i wsp., 2003). Witamina E oraz selen zastosowane w monoterapii wykazały również ochronny wpływ na stan zdrowia krów (Eger i wsp., 1985; Erskine i wsp., 1997). Natomiast ich łączne podawanie przed wycieleniem może stanowić skuteczną profilaktykę przeciwko zapaleniom wymienia (Smith i wsp., 1997b; Stoldt i wsp., 2016). Badania eksperymentalne wykazały, że zastosowanie w późnej ciąży terapii z użyciem witamin A, E i D, ogranicza występowania klinicznego zapalenia wymienia w okresie poporodowym (Barnouin i Chassagne, 1998; Jin i wsp., 2014). Późniejsze prace ujawniły, że efekty terapii opartej na antyoksydantach zależą przede wszystkim od stanu odżywienia zwierząt (Kolver i Müller, 1998). Korzystny wpływ dowiedziono jedynie w przypadku krów ze stwierdzonymi uprzednio niedoborami witaminowymi bądź mineralnymi (LeBlanc, 2002; Weiss i Spears, 2006). Najnowsze badania sugerują możliwość zastosowanie antyoksydantów enzymatycznych w terapii specyficznej. Podawanie dożylne dysmutazy ponadtlenkowej bądź podawanie podskórne katalazy ma na celu wsparcia

organizmu w walce z nadmierną ilością RFT i może przynieść zadawalające rezultaty (Dröge, 2002; Suzuki i wsp., 2008; Giordano, 2015).

4.5. Status antyoksydacyjny bydła mlecznego a cykl produkcyjny

Największą podatność na stres oksydacyjny w całym cyklu produkcyjnym wykazują krowy mleczne będące aktualnie w fazie od ostatniego etapu zasuszenia do wczesnego okresu poporodowego (Drackley, 1999; Ronchi i wsp., 2000; Bernabucci i wsp., 2005; Sharma i wsp., 2011; Pilarczyk i wsp., 2012; Gong i Xiao, 2016). Szczególnie krytycznym okresem jest poród oraz początek laktacji. Na tym etapie produkcji dochodzi do znacznego, rozwijającego się dynamicznie i stosunkowo w krótkim czasie, wzrostu zapotrzebowania energetycznego (Abd Ellah, 2016). Metabolizm krów mlecznych ulega gwałtownym zmianom, aby sprostać wysokim wymaganiom energetycznym podczas produkcji siary, porodu oraz rozpoczęcia laktacji (Hardarson i Ingvartsen, 2005). Istotny wzrost zapotrzebowania krów na energię i białko niejednokrotnie nie może zostać pokryty pomimo właściwie zbilansowanej dawki żywieniowej, między innymi ze względu na ograniczony apetyt zwierząt. Dochodzi do zaburzenia statusu energetycznego i nasilenia występowania chorób metabolicznych (Nowak i wsp., 2006; Rodriguez-Jimenez i wsp., 2018). Gwałtowne zmiany statusu energetycznego i kondycji ciała prowadzą do zwiększenia wytwarzania RFT, rozwoju stresu oksydacyjnego i nasilenia uszkodzeń oksydacyjnych (Miller i wsp., 1993a). Bernabucci i wsp. (2005) oraz Gheise i wsp. (2017) wykazali związek pomiędzy kondycją ciała a podatnością na stres oksydacyjny u bydła mlecznego. Według Roche i wsp. (2009) wysoka kondycja ciała w okresie okołoporodowym oraz jej znaczna i dynamiczna zmiana w pierwszych tygodniach laktacji zaburza stan metaboliczny krów mlecznych. Stefańska i wsp. (2016) sugerują, że kondycja ciała oceniona powyżej 3,51 pkt w dniu porodu ma istotnie negatywny wpływ na stan metaboliczny krów mlecznych w okresie poporodowym. Tak nasilone tempo przemiany energii po porodzie zwiększa ilość wytwarzanych RFT, co może skutkować peroksydacją lipidów i nasileniem uszkodzeń oksydacyjnych (Tiwari i wsp., 2013; Ayala i wsp., 2014; Barrera i wsp., 2018). Zaburzona homeostaza redoks dodatkowo predysponuje wysokowydajne krowy mleczne do rozwoju zaburzeń okresu okołoporodowego (Ronchi, 2000; Castillo i wsp., 2001; Bernabucci i wsp., 2005; Castillo i wsp., 2005). Należy mieć na uwadze, że prawidłowy przebieg okresu okołoporodowego jest niezwykle ważny dla zdrowotności, przyszłej wydajności mlecznej i płodności krów (Shanks i wsp., 1981; Sharma

i wsp. 2011). Dlatego pogłębiające się zaburzenia w tym okresie cyklu produkcyjnego generują pośrednio straty ekonomiczne w hodowli krów mlecznych.

Większość badań dotyczących równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej u bydła mlecznego koncentruje się na krowach wysokowydajnych w okresie okołoporodowym, ponieważ w tym właśnie okresie najczęściej dochodzi do zaburzeń równowagi pro- i antyoksydacyjnej (Castillo i wsp., 2005; Pedernera i wsp., 2010). Goff (2006) sugeruje jednak, że w przypadku krów wysokowydajnych stres oksydacyjny może rozwinąć się również w późniejszych etapach produkcyjnych w szczególności w szczycie laktacji. Szczyt laktacji, z uwagi na znaczne nasilenie przemian metabolicznych związanych z najwyższą dobową wydajnością mleczną podczas całej laktacji, jest istotnym okresem w aspekcie nasilonej produkcji RFT. W dostępnej literaturze brakuje doniesień opisujących status antyoksydacyjny w różnych fazach cyklu produkcyjnego. Porównanie statusu antyoksydacyjnego w warunkach fizjologicznych oraz okresach predylekcyjnych do wystąpienia zaburzeń równowagi redoks, dostarcza najpełniejszych danych o możliwościach obronnych organizmu (Hulbert i wsp., 2007; Onasanya i wsp., 2015). Dlatego kompleksowa analiza statusu antyoksydacyjnego bydła mlecznego powinna uwzględniać również różne etapy cyklu produkcyjnego, w szczególności okres zasuszenia, okres poporodowy oraz szczyt laktacji.

4.6. Status antyoksydacyjny bydła mlecznego, a wydajność mleczna

Do najważniejszych chorób występujących u bydła mlecznego, mających potwierdzony związek ze stresem oksydacyjnym zalicza się: choroby gruczołu mlekowego, stany zapalne macicy, zaburzenia płodności, zatrzymanie łożyska, choroby układu oddechowego, moczowego, skóry i wątroby (Miller i wsp., 1993; Ronchi i wsp., 2000; Waller, 2000; Sordillo, 2005; Castillo i wsp., 2005; Erisir i wsp., 2006; Wilde, 2006; Kizil i wsp., 2007; Abd Ellah i wsp., 2007; Sordillo i Aitken, 2009; Pilarczyk i wsp., 2012). Występowanie wymienionych chorób wzrasta wraz z wydajnością mleczną krowy. Ziętara (2007) wykazał, że najbardziej narażone są krowy wysokowydajne, a więc o wydajności przekraczającej 9 000 kg mleka w czasie 305-dniowej laktacji. Goff (2006) sugeruje, że wzrost zachorowalności u krów wysokowydajnych jest związany z nasileniem aktywności metabolicznej, wynikającej z konieczności pokrycia energetycznego potrzeb bytowych oraz wymagań produkcyjnych, które u osobników wysokowydajnych są znaczne. Sordillo i wsp.

(2007) oraz Celi (2011) dowiedli, że zwiększona wydajność produkcyjna krów mlecznych nasila metabolizm oksydacyjny, co predysponuje do zwiększonego wytwarzania RFT. Stefańska (2014) uważa natomiast, że ilość produkowanych RFT należy wiązać z lokalnym nasileniem metabolizmu w gruczole mlekowym podczas laktacji. Autorka zwraca uwagę, że wyprodukowanie 1 kg mleka wymaga przepływu przez gruczoł mlekowy około 500 litrów krwi (Stefańska, 2014). Zdaniem Ganaie i wsp. (2013) wzrost wydajności mlecznej zwiększa również wrażliwość krów na stres cieplny. W okresie okołoporodowym, w erytrocytach krów mlecznych narażonych na stres cieplny stwierdzono wzrost aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i peroksydazy glutationowej oraz wzrost stężenia związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym (Bernabucci i wsp., 2002). Niezależnie od bezpośredniej przyczyny wzrostu produkcji RFT, krowy wysokowydajne są uważane za predysponowane do występowania stresu oksydacyjnego (Castillo i wsp., 2003; Löhrke i wsp., 2005; Celi i wsp., 2014; Celi i Gabai, 2015).

W dostępnej literaturze brakuje doniesień dotyczących równoczesnego porównania statusów antyoksydacyjnych bydła mlecznego różnych ras, o niskiej, średniej i wysokiej wydajności mlecznej. Niska wydajność mleczna jest cechą charakterystyczną ras rodzimych, takich jak rasa PR. Średnia wydajność mleczna charakteryzuje rasę czerwoną norweską i NRFxHF, z kolei wysoka wydajność mleczna jest cechą charakterystyczną rasy HF. W celu wypełnienia istniejącej luki zaprojektowano doświadczenie przeprowadzone na krowach reprezentujących odpowiednio rasę PR, NRFxHF oraz HF. Badane krowy pochodziły ze stad o różnym systemie utrzymania i żywienia - krowy ras PR i NRFxHF z hodowli w systemie ekstensywnym, na uwięzi, żywione tradycyjnie, podczas gdy krowy rasy HF z hodowli w systemie intensywnym, wolnostanowiskowym, żywione TMR. Prezentowane wyniki reprezentują tym samym wartości wybranych wskaźników statusu pro- i antyoksydacyjnego, odzwierciedlające indywidualne sytuacje badanych stad. W dalszej częsci pracy, dla zachowania przejrzystości prezentowania i omawiania wyników, zastosowano uogólnienie porównując krowy rasy PR, NRFxHF, HF, w miejsce porównania stad krów rasy PR, NRFxHF, HF. Zaproponowane badania porównujące status antyoksydacyjny bydła mlecznego o niskiej, średniej i wysokiej wydajności w typowych warunkach utrzymania i żywienia, biorą pod uwagę ewolucyjną genezę mechanizmów antyoksydacyjnych (Cadenas, 1997; Dröge, 2002), a ich wyniki mogą znacznie poszerzyć dotychczasową wiedzę o zależnościach pomiędzy mechanizmami antyoksydacyjnymi a wydajnością mleczną krów.

III. Cel pracy

Celem przeprowadzonych badań było:

1. oznaczenie wartości wybranych enzymatycznych i nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej krwi obwodowej krów rasy rodzimej - polskiej czerwonej, utrzymywanych w warunkach hodowli ekstensywnej, w trzech najważniejszych okresach cyklu produkcyjnego, tj. w zasuszeniu, w pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji; w odniesieniu do równoległej oceny natężenia procesów prooksydacyjnych lipidów oraz oceny gospodarki lipidowej.

2. przeprowadzenie analizy porównawczej wartości enzymatycznych i nieenzymatycznych składników ochrony antyoksydacyjnej krwi obwodowej krów rasy polskiej czerwonej z krowami rasy holsztyńsko-fryzyjskiej, jako przykład krów o wysokiej wydajności mlecznej, utrzymywanych w systemie hodowli wielkostadnej, w wybranych okresach cyklu produkcyjnego.

3. przeprowadzenie analizy porównawczej wartości enzymatycznych i nieenzymatycznych składników ochrony antyoksydacyjnej krwi obwodowej krów rasy polskiej czerwonej z krowami pochodzącymi z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej, jako przykład krów o umiarkowanej wydajności mlecznej, utrzymywanych w warunkach hodowli drobnotowarowej, w wybranych okresach cyklu produkcyjnego,

4. przeprowadzenie analizy porównawczej profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych krwi obwodowej pobranej od krów rasy polskiej czerwonej i krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w okresie zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji.

IV. Materiały i Metody

1. Materiał

1.1 Zwierzęta

Badania przeprowadzono na 17 krowach, wieloródkach (w czasie III lub IV laktacji) rasy polskiej czerwonej (PR), losowo wybranych ze stada liczącego 75 zwierząt, zlokalizowanego na terenie północno-wschodniej Polski. U wszystkich wybranych krów badania przeprowadzono w czasie 2 kolejnych cykli produkcyjnych. Średnia wydajność krów wynosiła 3 500 kg mleka w czasie poprzedzającej badania 251 - dniowej laktacji. Krowy hodowano w systemie ekstensywnym na uwięzi, na indywidualnych stanowiskach. Sposób utrzymania, jak i żywienie zwierząt oparte były na tradycyjnym systemie stosowanym w hodowli zwierząt ras rodzimych.

W celu wykonania analizy porównawczej do dalszych badań wybrano dwie inne rasy krów mlecznych, charakteryzujące się wyższą wydajnością mleczną oraz utrzymywane w odmiennych systemach niż krowy rasy polskiej czerwonej. Drugą grupę badawczą stanowiło 15 krów wieloródek w II lub III laktacji, rasy holsztyńsko-fryzyjskiej (HF), wybranych losowo ze stada zlokalizowanego w centralnej Polsce i następnie monitorowanych w czasie 2 kolejnych cykli produkcyjnych. Stado liczyło 340 krów mlecznych, hodowanych wolnostanowiskowo, o średniej wydajności 10 500 kg mleka w poprzedzającej badania 332 - dniowej laktacji. Sposób utrzymania zwierząt, jak i żywienie w systemie TMR (total mix rations) w czasie całego cyklu produkcyjnego było ujednolicone i dostosowane do poszczególnych etapów cyklu produkcyjnego oraz wydajności mlecznej.

Trzecią grupę stanowiło 13 krów wieloródek krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej (NRFxHF) w czasie II i III laktacji. Zostały one wybrane losowo spośród 70 krów pochodzących z 5 hodowli drobnotowarowych z rejonu centralnej Polski. Krowy utrzymywane były całorocznie w systemie uwięziowym i żywione metodą tradycyjną w oparciu o zbilansowane pasze wyprodukowane w poszczególnych gospodarstwach, wykorzystując przy tym głównie własne plony. Średnia wydajność mleczna zwierząt wybranych do doświadczenia wyniosła 6 500 kg mleka w ciągu poprzedzającej 335- dniowej laktacji. Również u krów rasy NRFxHF badanie objęło 2 następujące po sobie cykle produkcyjne.

Badanie profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych krwi obwodowej przeprowadzono na 8 wybranych losowo krowach, tj. 4 zwierzętach z badanej grupy 17 krów rasy PR oraz 4 z 15 krów rasy HF, spełniając tym samym minimalne wymogi w zakresie reprezentatywności prób dla badań genomicznych. Porównano profile transkryptomiczne krów rasy PR z profilami krów rasy HF. Profile transkryptomiczne komórek jądrzastych krwi obwodowej dla każdej z ras zostały określone w następujących okresach: I – w zasuszeniu, II – w pierwszym tygodniu po porodzie, III – w szczycie laktacji. Przeprowadzono również odrębną dla każdej rasy krów (PR oraz HF) analizę porównawczą profili pomiędzy okresem I a II, II a III oraz III a I.

1.2. Materiał badawczy

Krew obwodową do badań od wszystkich krów pozyskiwano trzykrotnie w czasie trwania każdego z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, co łącznie czyni sześć próbek krwi pozyskanych od każdej badanej krowy. Każdorazowo, w dwóch kolejnych cykli produkcyjnych badano te same krowy. Pierwsze pobranie krwi przeprowadzono w okresie zasuszenia, średnio 60-40 dni przed porodem. Następnie materiał pobierano w pierwszym tygodniu po porodzie (średnio 2-7 dni po porodzie). Trzecie pobranie materiału przeprowadzono w szczycie laktacji, który był notowany u krów polskich czerwonych pomiędzy 35 a 50 dniem laktacji, a u pozostałych dwóch ras w przedziale 40-60 dni laktacji. Każdorazowo krew pobierano w godzinach porannych, po doju, a przed zadaniem paszy. Próbki krwi od wszystkich badanych krów, niezależnie od rasy, pobierano w tym samym okresie (porze roku) odpowiednio dla okresu zasuszenia, okresu poporodowego i szczytu laktacji.

W całym okresie doświadczalnym, czyli podczas dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, pobrano od krów z żyły szyjnej zewnętrznej (vena jugularis externa) łącznie 270 prób krwi celem przeprowadzenia oznaczeń parametrów hematologicznych i biochemicznych. Dodatkowo pobrano 54 próby krwi do badań transkryptomicznych (uwzględniając 30 prób służących jako materiał do wspólnej referencji). Krew od każdego zwierzęcia pozyskiwano do dwóch probówek - do jednej zawierającej antykoagulant EDTA- K2 firmy F.L. Medical (Włochy) i do drugiej zawierającej aktywator wykrzepiania (cząsteczki krzemionki) w celu otrzymania surowicy, po skrzepnięciu pobranej krwi a następnie jej odwirowaniu (3 800 obrotów/min przez 15 minut).

Próbki krwi pobrane do probówek z antykoagulantem przeznaczone zostały do wykonania badań hematologicznych, otrzymania osocza, a także hemolizatu masy erytrocytarnej. Krew do otrzymania osocza i masy erytrocytarnej odwirowywano przy 2 400 obrotów/min przez 10 minut w 4°C. Pozyskane w ten sposób osocze przenoszono do probówek typu Eppendorf. Następnie z masy erytrocytarnej usuwano kożuszek leukocytarno- płytkowy. Pozostałe krwinki czerwone poddawano lizie z użyciem czterech objętości, w stosunku do objętości masy erytrocytarnej, wody destylowanej o temperaturze 2°C i odwirowano przy użyciu 4 500 obrotów/min przez 15 minut. Supernatant zbierano i przenoszono do jałowych probówek typu eppendorf.

Otrzymaną surowicę, osocze i hemolizat zamrażano w temperaturze -80°C w celu późniejszego oznaczania wybranych parametrów.

Materiał do badań profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych krwi obwodowej kolekcjonowano w tych samych okresach produkcyjnych, co w przypadku wykonywania badań wybranych enzymatycznych i nieenzymatycznych składników ochrony antyoksydacyjnej, tzn. w okresie zasuszenia, w pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji. Krew, z żyły szyjnej zewnętrznej, do analizy profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych pobierano do próbówek Rneasy Protect Animal Blood Tubes (Qiagen, USA), przeznaczonych do izolacji RNA.

2. Badanie kliniczne krów

Podczas całego doświadczenia, każdorazowo przed pobieraniem krwi, zwierzęta poddawane były badaniu klinicznemu, co umożliwiało przeprowadzenie oceny ogólnego stanu zdrowia krów na postawie temperatury ciała, liczby oddechów i tętna, prawidłowości węzłów chłonnych, błon śluzowych oraz gruczołu mlekowego. Ponadto oceniane były podstawowe wskaźniki produkcyjności mlecznej. W przypadku krów rasy holsztyńsko- fryzyjskiej oraz krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej oceniano również wskaźnik kondycyjności (BCS) wg skali Edmonsona i wsp. (1989). W grupie krów rasy PR nie oceniano kondycji krów albowiem wskaźnik ten jest dedykowany krowom wysokowydajnym. U krów charakteryzujących się niską wydajnością mleczną, w tym przypadku u bydła rasy PR, nie stwierdza się jego istotnych zmian w przebiegu cyklu produkcyjnego. Zatem punktowa ocena kondycji krów nie jest praktykowana u bydła mlecznego charakteryzującego się niską produkcyjnością. Do 36

dajszych badań biochemicznych oraz transkryptomicznych zakwalifikowano jedynie krowy spełniające kryteria zdrowia w całym okresie objętym badaniami, a więc krowy nie wykazujące objawów klinicznych choroby oraz nie demonstrujące wartości parametrów hematologicznych krwi wykraczających poza normy hematologiczne dla danej rasy.

2.2. Ocena laktacji krów

Na podstawie zebranych danych dotyczących przebiegu dwóch kolejnych cykli produkcyjnych tych samych osobników określono takie parametry jak: całkowita średnia wydajność mleczna w laktacji, średnia dobowa wydajność mleczna w szczycie laktacji, średnia długość laktacji oraz średni odsetek białka i tłuszczu w mleku w całym okresie laktacji.

4. Metody analityczne

4.1. Badanie hematologiczne

W celu przeprowadzenia ogólnej oceny stanu zdrowia zwierząt wykonano badanie hematologiczne. U wszystkich krów badanie liczby erytrocytów (RBC), stężenia hemoglobiny (HGB), wskaźnika hematokrytowego (HCT), średniej objętości erytrocytu (HCV), średniej masy hemoglobiny w erytrocycie (MCH), średniego stężenia hemoglobiny w erytrocycie (MCHC), liczby leukocytów (WBC), liczby limfocytów (LYM), monocytów (MID), granulocytów (GRA), liczby płytek (PLT) i średniej objętość płytki (MPV) wykonano przy użyciu analizatora hematologicznego Abacus Junior Vet (Diatron MI PLC, Węgry). Badania hematologiczne krwi przeprowadzano każdorazowo po pobraniu krwi przez cały okres objęty doświadczeniem.

4.2. Oznaczanie parametrów biochemicznych we krwi (stężenie kwasu β-hydroksymasłowego, białka całkowitego, cholesterolu całkowitego, lipoprotein i trójglicerydów w surowicy oraz związków TBA-reaktywnych w osoczu)

4.2.1. Oznaczanie stężenia kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy

Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego (BHM) w surowicy wykonano metodą enzymatyczno-kolorymetryczną (Williamson i wsp., 1962) za pomocą testu diagnostycznego firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy), przy długości fali 505 nm. Wyniki wyrażono w jednostce mmol/l surowicy.

4.2.2. Oznaczanie stężenia związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym w osoczu

W celu oceny stężenia produktów peroksydacji lipidów, jako wyznacznika stanu oksydacyjnego, wykonano w osoczu oznaczenie stężenia związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym (związków TBA-reaktywnych, TBARS) w oparciu o metodę opisaną przez Maseki (1981) w modyfikacji Ledwożywa i wsp. (1986). Badaną próbkę osocza o objętości 250 µl rozcieńczono w stosunku 1:1 z 0,9% roztworem soli fizjologicznej i dodano 2,5 ml 20 % kwasu trójchlorooctowego (TCA) w 0,6 M HCl. Po 10 minutach inkubacji dodano 1,5 ml 0,67% kwasu 2-tiobarbiturowego (TBA) firmy Sigma-Aldrich Inc. (Niemcy). Próbki inkubowano 20 minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie schłodzono je do temperatury pokojowej, dodano 4 ml 1-butanolu, poddano wytrząsaniu przez 3 minuty i wirowaniu 4 500 obrotów/min przez 10 minut. Zebrano supernatant oraz odczytano jego absorbancję przy długości fali 532 nm używając spektrofotometru mikropłytkowego Epoch (BioTek Instruments Inc., USA). Powyższą procedurę zastosowano zarówno w przypadku próbek osocza badanych zwierząt, jak i rozcieńczeń wzorcowego dwualdehydu malonowego (MDA), przygotowanych w celu wykonania krzywej standardowej. Krzywa standardowa posłużyła do odczytania stężenia związków TBA-reaktywnych w badanych próbach. Analizę każdej próbki osocza przeprowadzono w duplikatach, wynik ostateczny przedstawiono jako średnią arytmetyczną dwóch otrzymanych wyników i wyrażono w jednostce µmol/l z uwzględnieniem wartości odchylenia standardowego (SD).

4.2.3. Oznaczanie stężenia białka całkowitego w surowicy

Stężenie białka całkowitego w surowicy oznaczono metodą biuretową w modyfikacji Weichselbauma (1946) oraz Gornalla i wsp. (1949) przy użyciu odczynników firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy). Wyniki, odczytane przy długości fali 540 nm, wyrażono w jednostce g/l surowicy.

4.2.4. Oznaczanie stężenia cholesterolu całkowitego w surowicy

Stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy oznaczono metodą enzymatyczno- kolorymetryczną (Allain, 1974) przy użyciu zestawu odczynników firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy), przy długości fali 520 nm. Wyniki wyrażono w mmol/l surowicy. 38

4.2.5. Oznaczanie stężenia lipoprotein w surowicy

Stężenie lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL) w surowicy oznaczono wg metody strąceniowo-enzymatycznej (Burstein i wsp.,1970; Allain, 1974) przy wykorzystaniu odczynników firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy), przy długości fali 578 nm. Wyniki wyrażono w mmol/l surowicy.

Stężenie lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w surowicy oznaczono za pomocą metody strąceniowo-enzymatycznej przy użyciu zestawu odczynników firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy), przy długości fali 600 nm. Wyniki wyrażono w mmol/l surowicy.

4.2.6. Oznaczanie stężenia trójglicerydów w surowicy

Oznaczenie stężenia trójglicerydów w surowicy wykonano metodą enzymatyczno- kolorymetryczną wg Fossatiego i wsp. (1982), używając odczynniki firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatyczny analizator biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy), przy długości fali 540 nm. Wyniki wyrażono w mmol/l surowicy.

4.3. Oznaczanie enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej (aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, całkowitej katalazy i reduktazy glutationowej w surowicy oraz aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizacie)

4.3.1. Oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy i hemolizacie

W surowicy oznaczono aktywność izoenzymu pozakomórkowego dysmutazy ponadtlenkowej (SOD-3, nr katalogowy E.C. 1.15.1.1), natomiast w hemolizacie oznaczono aktywność izoenzymu cytoplazmatycznego (SOD-1, nr katalogowy E.C. 1.15.1.1). Aktywność izoenzymów SOD oznaczono metodą enzymatyczno-kolorymetryczną w oparciu o reakcję inhibicji przy użyciu komercyjnego testu diagnostycznego „Superoxide Dismutase” (Cayman Chemical Company, USA) oraz spektrofotometru mikropłytkowego Epoch (BioTek Instruments, Inc., USA), przy długości fali 450 nm. Wyniki wyrażono w jednostce U/ml. W przypadku hemolizatu aktywność SODu dodatkowo zaprezentowano w przeliczeniu na stężenie hemoglobiny (U/g HGB).

4.3.2. Oznaczanie aktywności całkowitej katalazy w surowicy

Aktywność całkowitej kalatazy (CAT, nr katalogowy E.C. 1.11.1.6) w surowicy oznaczono metodą kolorymetryczną (Johansson i wsp., 1988; Wheeler i wsp., 1990) przy użyciu testu diagnostycznego „Catalase” firmy Cayman Chemical Company (USA) oraz spektrofotometru mikropłytkowego Epoch (BioTek Instruments, Inc., USA), przy długości fali 540 nm. Wyniki wyrażono w U/ml surowicy.

4.3.3. Oznaczanie aktywności reduktazy glutationowej w surowicy

Aktywność reduktazy glutationowej (GR, nr katalogowy E.C. 1.6.4.2) w surowicy oznaczono metodą kinetyczno-spektrofotometryczną opisaną przez Goldberg’a i Spooner’a (1983), używając komercyjnego zestawu odczynników firmy Randox Laboratories Ltd. (Wielka Brytania). Wyniki, ostatecznie wyrażone w jednostce U/l surowicy, odczytywano przy długości fali 340 nm, posługując się bichromatycznym analizatorem chemicznym - Pointe 180 (Pointe Scientific, Inc., USA).

4.4.1. Oznaczanie całkowitego potencjału antyoksydacyjnego w surowicy

Całkowity potencjał antyoksydacyjny (TAS) w surowicy oznaczono metodą kolorymetryczną (Miller i wsp., 1993) przy wykorzystaniu odczynników firmy Randox Laboratories Ltd. (Wielka Brytania) oraz bichromatycznego analizatora chemicznego - Pointe 180 (Pointe Scientific, Inc., USA), przy długości fali 600 nm. Wyniki wyrażono w jednostce mmol/l surowicy.

4.4.2. Oznaczanie stężenia bilirubiny całkowitej w surowicy

Stężenie bilirubiny całkowitej w surowicy oznaczono wg metody kolorymetrycznej opisanej przez Ehrlicha (1883) za pomocą odczynników firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy), przy fali o długości 540 nm. Wyniki wyrażono w jednostce µmol/l surowicy.

4.4.3. Oznaczanie stężenia kwasu moczowego w surowicy

Stężenie kwasu moczowego w surowicy oznaczono w oparciu o enzymatyczną metodę opisaną przez Klackar’a (1947) przy wykorzystaniu odczynników firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy), przy długości fali 520 nm. Wyniki wyrażono w mmol/l surowicy.

4.4.4. Oznaczanie stężenia albumin w surowicy

Stężenie albumin w surowicy oznaczono metodą kolorymetryczną wg Bartholomew i Delany (1964) przy użyciu odczynników firmy Pointe Scientific Inc. (USA) oraz automatycznego analizatora biochemicznego Miura One (I.S.E. S.r.l., Włochy). Wyniki odczytywano przy długości fali 630 nm i przedstawiono w jednostce g/l surowicy.

4.4.5. Oznaczanie stężenia glutationu całkowitego w hemolizacie

Stężenie glutationu całkowitego w hemolizacie oznaczono metodą enzymatyczno- kolorymetryczną (Tietze, 1969; Eyer i wsp., 1986), wykorzystując komercyjny test diagnostyczny „Glutathione” firmy Cayman Chemical Company (USA) oraz spektrofotometr mikropłytkowy Epoch (BioTek Instruments, Inc., USA), przy długości fali 405 nm. Wyniki wyrażono w µmol/l hemolizatu.

5. Metody oceny profilu transkryptomicznego

5.1. Izolacja RNA z komórek jądrzastych krwi

Całkowite RNA z komórek jądrzastych krwi wyizolowano przy użyciu RNeasy Protect Animal Blood Kit (Qiagen, Niemcy) zgodnie z załączonym protokołem producenta. Wyizolowane RNA rozpuszczono następnie w 30 µl buforu REB Buffer znajdującego się w zestawie. Ilość wyizolowanego RNA zmierzono za pomocą urządzenia NanoDrop 2000 (NanoDrop Technologies, USA). Uzyskane próbki analizowano przy użyciu urządzenia BioAnalyzer (Agilent Technologies, USA) w celu określenia jakości i integralności RNA. Aby zapewnić optymalną jakość wyników, do analizy wykorzystano tylko próbki RNA z wartością kontrolnego parametru jakości RNA (RIN, ang. RNA Integrity Number) powyżej wartości 7,5. RIN jest oceniany w skali 1-10.

5.2. Mikromacierze

Analizę profili ekspresji genów wykonano przy użyciu mikromacierzy Bovine (V2) Gene Expression Microarray (Agilent Technologies, USA). Wykorzystano mikromacierze o parametrach 4 x 44K, co oznacza, że na każdym ze szkiełek znajdowały się po 4 mikromacierze zawierające po około 45 000 sond oligonukleotydowych bydła. Do amplifikacji i znakowania RNA w celu wytworzenia RNA komplementarnego (cRNA) do sond oligonukleotydowych mikromacierzy użyto zestawu Low Input Quick Amp Labeling Kit (Agilent, USA). W sumie wykonano analizę 24 mikromacierzy - 12 mikromacierzy u krów rasy PR oraz 12 mikromacierzy u krów rasy HF, co stanowiło odpowiednio po 4 mikromacierze dla każdej badanej rasy krów mlecznych w I, II oraz III okresie badawczym. Hybrydyzację mikromacierzy wykonano przy użyciu zestawu Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies, USA), zgodnie z protokołem producenta. W prowadzonych badaniach zastosowano wewnętrzny system kontroli jakości RNA Spike In Kit (Agilent Technologies, USA). Macierze odczytano każdorazowo po uzyskaniu dodatniego wyniku kontroli wewnętrznej intensywności i jakości fluorescencji (prawidłowy odczyt intensywności fluorescencji sond kontroli wewnętrznej RNA Spike). Po hybrydyzacji macierze zeskanowano przy pomocy skanera mikromacierzy firmy Agilent. Uzysnane wyniki kontroli wewnętrznej wskazują na wiarygodność uzyskanej intensywności ekspresji badanych genów.

Do oceny mikromacierzy użyto następujących zestawów odczynników:

− Low Input Quick Amp Labeling Kit, Two-Color (Agilent, USA) – zestaw umożliwiający wybarwienie i amplifikację cRNA z RNA. W metodzie tej użyto RNA polimerazę T-7, która jednocześnie amplifikuje materiał i wbudowuje oznakowany barwnikami Cyjanina 3-CTP i Cyjanina 5-CTP. Zestaw pozwala na wykonanie 100- krotnego powielenia materiału. − Two-color RNA Spike-in Kit (Agilent, USA) – zestaw zawierający dwa komplety mieszaniny transkryptów o zoptmalizowanej zdolności powielania, w pełni zgodnych z komplementarnymi próbami na mikromacierzy. Ich zlogarytmowane intensywności świecenia dla koloru czerwonego i zielonego (w zależności od typu Spike’a) umożliwiają analizę jakościową. − Gene Expression Hybridization Kit (Agilent, USA) – zatwierdzony do użytku z macierzami ekspresyjnymi firmy Agilent zestaw pozwalający na przeprowadzenie

kompletnej, najlepszej jakościowo hybrydyzacji. Bufor fragmentacyjny umożliwia rozbicie cRNA do optymalnej wielkości dla celów hybrydyzacji. Niespecyficzne wiązanie minimalizowane jest poprzez zastosowanie 10X Blocking Agent. − Gene Expression Wash Buffer 1 (Agilent, USA) – bufor płuczący − Gene Expression Wash Buffer 2 (Agilent, USA) – bufor płuczący − Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz (Qiagen, Niemcy) − Woda milli-Q water RNeasy Mini Kits (Qiagen, Niemcy) − 100% Etanol

W badaniach wykorzystano zestaw urządzeń niezbędnych do analizy ekspresji genów, w skład którego wchodzą: komora i piec hybrydyzacyjny SHO1 (Shel Lab, USA), skaner mikromacierzy G2565CA (Agilent, USA) oraz specjalistyczne oprogramowanie Agilent’s Scan Control, Agilent’s Feature Extraction, Gene Spring) pozwalające na przeprowadzenie poszczególnych etapów doświadczeń, począwszy od przygotowania macierzy, poprzez skanowanie, na analizie danych kończąc.

Procedura wykonania mikromacierzy składała się z następujących etapów: a) Przygotowanie próbek: − Przygotowanie miksów Spike A i Spike B − Synteza cDNA − Synteza i amplifikacja cRNA − Przygotowanie próbek do barwienia − Oczyszczanie wybarwionego / zamplifikowanego materiału − Oczyszczanie cRNA b) Hybrydyzacja: − Przygotowanie odczynnika 10X Blocking Agent − Przygotowanie próbek do hybrydyzacji − Złożenie układu hybrydyzacyjnego c) Płukanie: − Dodanie odczynnika Triton X-102 do buforów płuczących Gene Expression − Ogrzanie buforu płuczącego Gene Expression − Przygotowanie zestawu naczyń wraz z buforami do płukania mikromacierzy

− Płukanie mikromacierzy d) Skanowanie i zapis danych: − Skanowanie mikromacierzy przy użyciu Agilent’s Scan Control software, version A.8.5.1 − Zapisanie danych z użyciem Agilents Feature Extraction Software 10.10.1.1.

Eksperyment wykonano w układzie ze wspólną referencją (ang. common reference), którą stanowiło wymieszane RNA z komórek jądrzastych krwi obwodowej, pobranej od 30 krów pochodzących ze stad badanych, ale nie biorących udziału w eksperymencie (15 krów rasy PR i 15 krów rasy HF, w różnych okresach cyklu produkcyjnego). RNA, stanowiące wspólną referencję, wyizolowano metodą opisaną we wcześniejszej części pracy. Schemat procesu amplifikacji cRNA przedstawiono na ryc. 1. Do bezpośredniego znakowania materiału przeznaczonego do hybrydyzacji z płytką mikomacierzową zastosowano cyjaninowe znaczniki fluorescencyjne Cy-3 oraz Cy-5. Znakowanie materiału do hybrydyzacji z płytką mikromacierzową polegało na wprowadzeniu do badanego materiału w trakcie reakcji syntezy nukleotydów dUTP lub dCTP związanych ze znacznikiem fluorescencyjnym.

Ryc. 1. Schematyczne przedstawienie procedury amplifikacji cRNA (elementy graficzne z „Agilent Two-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis Protocol”, na podstawie wersji opracowania nr 6.6 z 2012 roku).

Efektywność znakowania określano przy użyciu pomiarów na urządzeniu NanoDrop. Następnie próbki mieszano razem w obrębie par (próba referencyjna z próbą kontrolą/badaną) i nakładano na płytki mikromacierzowe. Na każdej dwukolorowej mikromacierzy poddawano hybrydyzacji 300 ng cRNA od krów referencyjnych (oznaczanych przez Cy-3) i 300 ng cRNA od krów badanych (oznaczanych przez Cy-5). RNA Spike In Kit (Agilent Technologies, USA) użyto jako kontroli wewnętrznej.

Hybrydyzację mikromacierzy przeprowadzono przy użyciu zestawu Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies, USA) zgodnie z protokołem producenta. Po nałożeniu na płytkę uszczelki, umieszczeniu w kasetach hybrydyzacyjnych i zamknięciu w piecu hybrydyzacyjnym z kołyską, próby poddawano procesowi 17-godzinnej hybrydyzacji. Następnie mikromacierze płukano w buforach płuczących, co umożliwiło usunięcie niezwiązanego cRNA wraz z barwnikami. Dodatek Triton X-102 w znacznym stopniu ograniczył wystąpienie artefaktów na mikromacierzach. Po płukaniu macierze wirowano w wirówce Eppendorf 5804R (Eppendorf, Niemcy).

Skanowanie macierzy odbywało się na skanerze Agilent G2565CA Microarray Scanner pozwalającym na uzyskanie wysokiej jakości odczytów świecenia znaczników fluorescencyjnych. Skanowanie i odczyt sygnałów z dwóch fluorochromów odbywało się jednocześnie dzięki zastosowaniu odpowiedniego układu laserów i detektorów. Sczytanie sygnałów i analizę surowych danych umożliwił program do analizy obrazów Feature Extraction 10.10.1.1. Oprogramowanie automatycznie odnajduje i nakłada siatki mikromacierzy, oznacza i odrzuca spoty niewłaściwie wybarwione, dokładnie określa stopień wybarwienia spotów i oblicza istotność statystyczną. Odczyt każdej z mikromacierzy opierał się na określeniu siły świecenia obu barwników i porównaniu intensywności ich fluorescencji w obrębie każdej pary sond. Wygenerowany przez program raport podsumował uzyskany wynik i umożliwił określenie jakości wykonanego eksperymentu.

6. Metody statystyczne

6.1. Analiza statystyczna wyników badań hematologicznych i biochemicznych

Wyniki opracowano statystycznie przy pomocy programu GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software, Inc., USA). Normalność rozkładu zmiennych sprawdzono testem Kołomogorowa-Smirnowa. Wyniki przedstawiono jako średnią arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym. Ze względu na małą liczebność badanych grup (n<50) do 46

dalszej analizy wybrano testy nieparametryczne. Dla zmiennych powiązanych wykorzystano test Wilcoxona dla par obserwacji lub test Friedmana. Zmienne niepowiązane analizowano przy pomocy testu Manna-Whitneya, bądź testu Kruskala-Wallisa. Do określenia zależności pomiędzy poszczególnymi zmiennymi w danej grupie zwierząt zastosowano współczynnik korelacji rang Spearmana. We wszystkich analizach p<0,05 przyjęto za poziom istotności statystycznej.

6.2. Analiza statystyczna wyników mikromacierzowych

Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu Gene Spring 12 (Agilent, USA). Próbki poddano kontroli jakości, a wyniki wykazały, że każda próbka miała podobny profil metryczny. Następnym krokiem było przefiltrowanie zestawów sond w celu usunięcia sond o słabej jakości. Analizę hierarchiczną przeprowadzono za pomocą metody Ward’a. Istotność statystyczną różnic pomiędzy ekspresją genów oceniono przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (One-way ANOVA) oraz testu wielokrotnego rozstępu Tukey’a (wartość p≤ 0,05 uznano za istotną statystycznie). W analizie zastosowano także test Benjamini i Hochberg tzw. FDR (ang. False discover rate) = E (V/R) (0 gdy R=0) ustalony na poziomie 5%, gdzie V oznacza liczbę fałszywych odrzuceń, R liczbę wszystkich odrzuceń, zaś E wartość oczekiwaną. Test ten opiera się na badaniu stosunku liczby fałszywych odrzuceń do liczby wszystkich odrzuceń. Uzyskane w doświadczeniu dane mikromacierzowe zostały wprowadzone do jednej z głównych baz mikromacierzowych t.j. Gene Expression Omnibus (GEO) i udostępnione pod numerami GSE51657 i GSE55378.

6.3. Analiza ontologiczna list genów o zmiennej ekspresji

Analizę ontologiczną list genów o istotnie statystycznie zmienionej ekspresji przeprowadzono za pomocą programu Pathway Studio 6.0 (Ariadne Genomics). Program ten wykorzystujące bazę danych zawierającą miliony indywidualnie modelowanych powiązań pomiędzy białkami, genami, kompleksami, komórkami, tkankami, lekami i chorobami (Nikitin i wsp., 2003; Szymańska-Czerwińska i Bednarek, 2007). Listy genów zidentyfikowanych w doświadczeniu wprowadzono do powyższej bazy stosując symbole przypisane poszczególnym genom dla całego gatunku Bos taurus (bydło domowe), niezależnie od rasy. Analiza ontologiczna pozwoliła na przydzielenie genów o zmienionej ekspresji do procesów pełnionych w organizmie. Następnie uzyskane wyniki analizowano z zastosowaniem funkcji programu Pathway Studio, pozwalającej na stworzenie sieci

zależności pomiędzy zidentyfikowanymi genami oraz poznanie ich wzajemnych interakcji z innymi genami lub cząsteczkami aktywnymi biologicznie. W tym celu wykorzystano listy wszystkich genów o istotnie zmienionej ekspresji w poszczególnych grupach eksperymentalnych, aby uniknąć wykluczenia genów pełniących ważne funkcje biologiczne, mogących wykazywać nawet niewielkie zmiany ekspresji.

V. Wyniki

Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w wynikach badań hematologicznych i biochemicznych między dwoma kolejnymi cyklami produkcyjnymi. Z tego względu spulowano wyniki uzyskane w pierwszej i drugiej laktacji w jedną serię danych. Spulowane wyniki prezentowane w dalszej części pracy stanowią średną arytmetyczną wraz z odchyleniem standardowym z dwóch kolejnych laktacji, a ich szczegółowe porównanie przedstawiono w rozdziale X. Załączniki w tabelach 3-14. W rozdziale V. Wyniki omówiono jedynie różnice istotne statystycznie.

1. Wyniki badania klinicznego i oceny kondycji ciała (BCS)

W przeprowadzonych ogólnych badaniach klinicznych, poprzedzających pobieranie krwi w trzech grupach krów, wszystkie parametry życiowe (temperatura wewnętrzna mierzona w prostnicy, częstość tętna, oddechów) mieściły się w zakresie norm fizjologicznych i nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy badanymi okresami w cyklu produkcyjnym (p>0,05). Nie stwierdzono również nieprawidłowości podczas badania klinicznego błon śluzowych, węzłów chłonnych oraz gruczołu mlekowego.

Średnie wartości wskaźników kondycji ciała (BCS) w skali pięciopunktowej ocenione u krów rasy HF i NRFxHF w badanych okresach produkcyjnych zostały przedstawione w tabeli 1. W szczycie laktacji u obydwu ras krów stwierdzono istotnie niższą wartość średniego wskaźnika kondycji ciała w stosunku do średnich wartości otrzymywanych w okresie zasuszenia oraz okresie poporodowym (p<0,05).

Tabela 1. Średnie wartości wskaźników kondycji u krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej (HF) oraz krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej (NRFxHF) w badanych okresach cyklu produkcyjnego, przedstawione w skali pięciopunktowej wg Edmonsona i wsp. (1989).

Okresy produkcyjne Rasy krów zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

HF 3,25±0,3a 3,20±0,3a 2,80±0,2b

a a b NRFxHF 3,45±0,3 3,40±0,3 2,80±0,3 Wartości podano w średnich arytmetycznych z badanej grupy krów ± odchylenie standardowe. Różnice istotne statystycznie (p<0,05) w danym wierszu przedstawiono za pomocą liter a, b. Tą samą literą oznaczono wyniki nie różniące się w stopniu statystycznym.

2. Wyniki oceny laktacji

Oceniono dwie kolejne laktacje w pełnym cyklu produkcyjnym u badanych ras krów mlecznych. Wyniki zbiorcze, zaprezentowane jako średnie arytmetyczne z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych wraz z wartościami odchylenia standardowego, przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2. Ocena laktacji w pełnym cyklu produkcyjnym u krów rasy polskiej czerwonej (PR), holsztyńsko-fryzyjskiej (HF) oraz krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej (NRFxHF). Rasy krów Parametry rasa rasa rasa PR HF NRFxHF Całkowita średnia wydajność mleczna w laktacji 3500±100c 10500±300a 6700±400b (kg/krowa) Średnia dobowa wydajność mleczna w szczycie laktacji 16,00±2,50c 45,70±6,20a 32,00±7,00b (kg/krowa/dzień) Średnia długość laktacji 257±20b 338±12a 330±20a (dni) Średni odsetek białka w mleku w całym okresie laktacji 3,25±0,04 3,35±0,02 3,27±0,05 (%) Średni odsetek tłuszczu w mleku w całym okresie laktacji 4,39±0,05a 3,83±0,03c 4,00±0,05b (%) Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b, c. Tą samą literą oznaczono wyniki nie różniące się w stopniu statystycznym.

Krowy rasy PR charakteryzowały się 3-krotnie niższą całkowitą wydajnością mleczną w stosunku do krów rasy HF oraz prawie 2-krotnie niższą w stosunku do krów NRFxHF (tab. 2). Tendencja ta dotyczyła również średniej dobowej wydajności mlecznej w szczycie laktacji. Średni odsetek białka w mleku podczas całej laktacji była zbliżona we wszystkich badanych grupach (p>0,05). Natomiast istotne różnice odnotowano w odniesieniu do średniego odsetka tłuszczu w mleku (p<0,05). W grupie krów PR był on istotnie wyższy o 14,62% i 9,75% w porównaniu do krów HF i NRFxHF. Ponadto u krów rasy PR stwierdzono istotnie krótszy czas trwania laktacji w porównaniu z pozostałymi badanymi grupami.

3. Wyniki wybranych parametrów hematologicznych oraz biochemicznych, w tym enzymatycznych i nieenzymatycznych, określających stan ochrony antyoksydacyjnej, u krów rasy polskiej czerwonej w okresie zasuszenia, poporodowym i w szczycie laktacji z dwóch cyklów produkcyjnych

3.1. Wyniki parametrów hematologicznych

W badaniu hematologicznym przeprowadzonym u krów rasy PR stwierdzono w szczycie laktacji, tj. między 35 a 50 dniem laktacji, istotny spadek liczby czerwonych krwinek, stężenia hemoglobiny, wskaźnika hematokrytowego, średniej objętości krwinki

czerwonej w porównaniu do pozostałych badanych okresów produkcji p<0,05 (ryc. 2, tab. 3).

MCH (pg) MCH

Ryc. 2. Wartości wybranych parametrów hematologicznych krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD); RBC - liczba krwinek czerwonych, HGB - stężenie hemoglobiny, HCT - wskaźnik hematokrytowy, MCV - średnia objętość krwinki czerwonej, MCH - średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej. Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b. 51

Średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej wynosiła od 16,98 ± 1,25 do 17,79 ± 1,56 pg, przy czym istotny (p<0,05) spadek tej wartości wystąpił w szczycie laktacji, w porównaniu z pierwszym tygodniem po porodzie. Nie stwierdzono istotnych różnic w średniej masie hemoglobiny w krwinkach czerwonych pomiędzy zasuszeniem, a okresem poporodowym oraz pomiędzy zasuszeniem, a szczytem laktacji (p>0,05). Analizując średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, parametry układu białokrwinkowego oraz płytkowego w okresie zasuszenia, po porodzie i szczycie laktacji nie stwierdzono u tej rasy różnic istotnych statystycznie - p>0,05 (tab. 3).

3.2. Stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu

W pierwszym tygodniu po porodzie obserwowano istotny wzrost (p<0,05) stężenia związków TBA-reaktywnych w osoczu o około 21% w porównaniu z okresem zasuszenia (ryc. 3, tab. 3). Nie stwierdzono istotnych różnic w stężeniu związków TBA-reaktywnych w osoczu między okresem zasuszenia, a szczytem laktacji (p>0,05).

2.0 a ab b 1.5

1.0

0.5 TBARS (µmol/l) TBARS

0.0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne

Ryc. 3. Stężenie związków TBA-reaktywnych (TBARS) w osoczu krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

3.3. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy

Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy było istotnie niższe (p<0,05) w okresie zasuszenia w porównaniu ze stężeniem stwierdzonym w szczycie laktacji (ryc. 4, tab. 3). Nie stwierdzono różnic w stężeniu BHM w surowicy zarówno pomiędzy zasuszeniem, a okresem poporodowym, jak również pomiędzy szczytem laktacji, a okresem poporodowym (p>0,05). 52

2.5 ab 2.0 a

1.5 b

1.0 BHM (mmol/l) BHM 0.5

0.0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne

Ryc. 4. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego (BHM) w surowicy krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

3.4. Stężenie białka całkowitego w surowicy

W pierwszym tygodniu po porodzie stwierdzono istotny spadek (p<0,05) stężenia białka całkowitego w surowicy o około 8% w porównaniu z okresem zasuszenia (ryc. 5, tab. 3), oraz brak różnic pomiędzy okresem poporodowym, a szczytem laktacji (p>0,05). Nie stwierdzono również różnic w stężeniu białka całkowitego w surowicy pomiędzy zasuszeniem, a szczytem laktacji (p>0,05).

100 a b 80 ab

20 Białko całkowite (g/l) całkowite Białko 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne

Ryc. 5. Stężenie białka całkowitego w surowicy krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

3.5. Stężenie cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL oraz trójglicerydów w surowicy

W tabeli 4 przedstawiono średnie stężenia wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy krów rasy PR w badanych okresach produkcyjnych.

Najniższe stężenia cholesterolu, frakcji HDL i LDL stwierdzono w pierwszym tygodniu po porodzie. Uzyskane wartości były istotnie statystycznie niższe w porównaniu z okresem zasuszenia i szczytem laktacji (p<0,05).

W okresie zasuszenia stwierdzono w surowicy najwyższe stężenie trójglicerydów, w porównaniu ze stężeniami stwierdzonymi w pozostałych dwóch okresach i wyniosło ono średnio 0,22 ± 0,11 mmol/l. W pierwszym tygodniu po porodzie, jak i w szczycie laktacji średnie stężenie trójglicerydów w surowicy było istotnie niższe w porównaniu z okresem zasuszenia - p<0,05 i kształtowało się na średnim poziomie 0,09 mmoli/l (ryc. 6, tab. 4).

Ryc. 6. Stężenie wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD); HDL – frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości, LDL – frakcja lipoprotein o niskiej gęstości. Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b, c. 54

3.6. Aktywność enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów W tabeli 5 przedstawiono wyniki aktywności badanych enzymów ochrony antyoksydacyjnej we krwi w okresach zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie i w szczycie laktacji u krów rasy PR. Najwyższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy stwierdzono w okresie zasuszenia oraz w pierwszym tygodniu po porodzie w porównaniu ze szczytem laktacji - p<0,05 (ryc. 7, tab. 5). Aktywności te wynosiły odpowiednio 11,27 ± 3,80 U/ml i 12,31 ± 5,62 U/ml. Najwyższą aktywność całkowitej katalazy, wynoszącą 34,16 ± 16,10 U/ml, stwierdzono w surowicy w okresie poporodowym, w porównaniu z aktywnością stwierdzoną w okresie zasuszenia i szczycie laktacji - p<0,05 (ryc. 7, tab. 5). Aktywność reduktazy glutationowej w surowicy krów rasy polskiej czerwonej istotnie spadła w pierwszym tygodniu po porodzie, w porównaniu z okresem zasuszenia i szczytem laktacji (p<0,05). Średnia wartość aktywności reduktazy glutationowej w surowicy u krów w tym okresie wyniosła 111,97 ± 59,71 U/l (ryc. 7, tab. 5).

Ryc. 7. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), całkowitej katalazy (CAT) oraz reduktazy glutationowej w surowicy krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

Najwyższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizacie, otrzymanym z krwi krów rasy PR, podobnie jak w surowicy stwierdzono w pierwszym tygodniu po porodzie. Wartości tej aktywności były wyższe o 22,4% w porównaniu do średniej aktywności tego enzymu w hemolizacie otrzymanym z krwi krówz okresu zasuszenia i szczytu laktacji - p<0,05 (ryc. 8, tab. 5). Tendencja ta dotyczyła oznaczanej aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizacie w przeliczeniu zarówno na ml hemolizatu, jak i na gram hemoglobiny.

800 8000 a a b ab 600 b 6000 b

400 4000 SOD SOD (U/ml)

200 SOD (U/g Hb) 2000

0 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

Ryc. 8. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w hemolizacie krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

3.7. Stężenie nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów

Na podstawie przeprowadzonych badań nie stwierdzono istotnych różnic w wartościach stężeń całkowitego potencjału antyoksydacyjnego, bilirubiny całkowitej, kwasu moczowego i albumin w surowicy krwi krów między badanymi okresami produkcyjności, tj. okresem zasuszenia, pierwszym tygodniem po porodzie oraz w szczycie laktacji - p>0,05 (tab. 6). Nie stwierdzono także istotnych statystycznie różnic (p>0,05) w stężeniu glutationu całkowitego w hemolizacie między badanymi okresami produkcyjnymi u tej rasy krów (tab. 6).

4. Wyniki wybranych parametrów hematologicznych oraz biochemicznych, w tym enzymatycznych i nieenzymatycznych określających stan ochrony antyoksydacyjnej, u krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w okresie zasuszenia, poporodowym i w szczycie laktacji z dwóch cyklów produkcyjnych

4.1. Wyniki parametrów hematologicznych

U krów rasy HF stwierdzono istoty spadek o około 8% liczby erytrocytów w pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji, w stosunku do okresu zasuszenia - p<0,05 (ryc. 9, tab. 7). Wskaźnik hematokrytowy (HCT) w okresie zasuszenia jak i w pierwszym tygodniu po porodzie był istotnie wyższy niż w szczycie laktacji (p<0,05). Spośród wskaźników układu czerwonokrwinkowego u krów w pierwszym tygodniu po porodzie, w porównianiu z innymi okresami produkcyjnymi, stwierdzono najwyższą średnią objętość krwinki czerwonej (MCV) - p<0,05 (ryc. 9, tab. 7). W pozostałych parametrach układu czerwonokrwinkowego oraz parametrach białokrwinkowych i układu płytkowego nie stwierdzono istotnych różnic pomiędzy badanymi okresami produkcyjnymi (tab. 7).

Ryc. 9. Wartości wybranych parametrów hematologicznych krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD); RBC – liczba krwinek czerwonych, HCT – wskaźnik hematokrytowy, MCV – średnia objętość krwinki czerwonej. Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b. 57

4.2. Stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu

Nie stwierdzono istotnych statystycznie zmian w stężeniu związków TBA- reaktywnych w osoczu krów, pomiędzy okresem zasuszenia, w pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji (p>0,05). Średnie stężenie tych związków u badanych krów rasy HF wynosiło od 1,31 ± 0,48 do 1,39 ± 0,33 µmol/l (tab. 7).

4.3. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy

U krów rasy HF w pierwszym tygodniu po porodzie stwierdzono w surowicy istotny wzrost stężenia kwasu β-hydroksymasłowego o 78,4% w porównaniu z okresem zasuszenia (p<0,05). Istotnie wyższe stężenie BHM utrzymywało się także w szczycie laktacji w porównaniu z okresem zaszuszenia. Średnia wartość stężenia kwasu β-hydroksymasłowego w szczycie laktacji wynosiła 0,80 ± 0,31 mmol/l (ryc. 10, tab. 7).

1.5 a a 1.0 b

0.5

(mmol/l) BHM

0.0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne

Ryc. 10. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego (BHM) w surowicy krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

4.4. Stężenie białka całkowitego w surowicy

Średnie stężenie białka całkowitego w surowicy krów było istotnie niższe (p<0,05) w pierwszym tygodniu po porodzie w porównaniu do okresu zasuszenia i szczytu laktacji (ryc. 11, tab. 7).

100 a a 80 b 60

20 Białko całkowite (g/l) całkowite Białko 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne

Ryc. 11. Stężenie białka całkowitego w surowicy krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

4.5. Stężenie cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL oraz trójglicerydów w surowicy

Stężenie wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy zestawiono w tabeli 8.

Najniższe stężenie cholesterolu, frakcji HDL oraz LDL stwierdzono w pierwszym tygodniu po porodzie w porównaniu z okresem zasuszenia i szczytem laktacji (p<0,05). W szczycie laktacji stężenia cholesterolu całkowitego oraz frakcji HDL, oznaczanych w surowicy krów rasy HF, istotnie wzrosło nie tylko w stosunku do wartości otrzymanych w pierwszym tygodniu po porodzie, ale także przewyższyły stężenia z okresu zasuszenia (p<0,05).

Najwyższe stężenie trójglicerydów obserwowano w surowicy krów rasy HF w okresie zasuszenia (p<0,05). W pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji było ono istotnie niższe w porównaniu do okresu zasuszenia, i wynosiło odpowiednio 0,09 ± 0,05 mmol/l oraz 0,12 ± 0,09 mmol/l (ryc. 12, tab. 8).

8 a 6 a

b 6 b 4

4 c c 2

2 HDL (mmol/l) Cholesterol (mmol/l) Cholesterol 0 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

4 0.4 a a a 3 0.3 b 2 0.2 b b

LDL (mmol/l) LDL 1 0.1 trójglicerydy (mmol/l) trójglicerydy 0 0.0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

Ryc. 12. Stężenie wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy krów rasy holsztyńsko- fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD); HDL – frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości, LDL – frakcja lipoprotein o niskiej gęstości. Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b, c.

4.6. Aktywność enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów

W tabeli 9 zestawiono wyniki średniej aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy i hemolizacie oraz aktywności całkowitej katalazy i reduktazy glutationowej w surowicy krów rasy HF w okresie zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji. Stwierdzono istotnie wyższą średnią aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy w okresie zasuszenia w porównaniu do szczytu laktacji (p<0,05). Jednocześnie nie stwierdzono różnic w aktywności SOD pomiędzy okresem zasuszeni, a okresem poporodowym oraz pomiędzy okresem poporodowym, a szczytem laktacji (p>0,05).

Aktywność całkowitej katalazy w surowicy była istotnie wyższa w pierwszym tygodniu po porodzie w porównaniu z okresem zasuszenia, jak i szczytem laktacji (p<0,05). Wynosiła ona odpowiednio: 16,98 ± 5,13 U/ml, 24,21 ± 10,30 U/ml i 17,70 ± 6,40 U/ml w surowicy w okresie zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji (ryc. 13).

W aktywności reduktazy glutationowej w surowicy krów HF nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w okresie zasuszenia, po porodzie, jak i w szczycie laktacji (p>0,05).

15 a ab 40 b a 30 10 b b 20

5 CAT (U/ml) CAT SOD SOD (U/ml) 10

0 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

Ryc. 13. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i całkowitej katalazy (CAT) w surowicy krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

800 8000 a a ab ab 600 b 6000 b

400 4000 SOD SOD (U/ml)

200 SOD (U/g Hb) 2000

0 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

Ryc. 14. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w hemolizacie krów rasy holsztyńsko- fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD. Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono istotny wzrost aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizacie krów w pierwszym tygodniu po porodzie w porównaniu z okresem zasuszenia (p<0,05). Wzrost ten wyniósł odpowiednio 25,2% i 27,6% w przypadku przeliczenia aktywności dysmutazy ponadtlenkowej na ml hemolizatu oraz na gram hemoglobiny (ryc. 14, tab. 9).

4.7. Stężenie nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów

Spośród badanych nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej w surowicy tj. w stężeniu TAS, całkowitej bilirubiny, kwasu moczowego i albumin, nie stwierdzono różnic istotnie statystycznych między badanymi okresami produkcyjności - p>0,05 (tabela 10). W hemolizacie natomiast stwierdzono najniższe stężenie glutationu całkowitego w okresie zasuszenia, a najwyższe w szczycie laktacji (p<0,05), które wynosiło odpowiednio 192,56,98 ± 59,04 µmol/l w hemolizacie (ryc. 15, tab. 10).

300 ab a b 200

100

glutation całkowity (µmol/l) całkowity glutation 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne

Ryc. 15. Stężenie glutationu całkowitego w hemolizacie krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

5. Wyniki wybranych parametrów hematologicznych oraz biochemicznych, w tym enzymatycznych i nieenzymatycznych określających stan ochrony antyoksydacyjnej, u krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko- fryzyjskiej w okresie zasuszenia, poporodowym i w szczycie laktacji z dwóch cyklów produkcyjnych

5.1. Wyniki parametrów hematologicznych

U krów pochodzących z krzyżówki rasy NRF i HF wartości parametrów hematologicznych mieściły się w zakresie norm fizjologicznych przyjętych dla bydła i nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic pomiędzy okresem zasuszenia, poporodowym i szczytem laktacji - p>0,05 (tab. 11).

5.2. Stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu

Stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu w okresie zasuszenia wynosiło 1,50 ± 0,14 µmol/l. W pierwszym tygodniu po porodzie nastąpił istotny wzrost ich stężenia, o około 23%, w porównaniu do wartości otrzymanych w okresie zasuszenia jak i w szczycie laktacji (ryc. 16, tab. 11).

2.5 a ab 2.0 b 1.5

1.0

TBARS (µmol/l) TBARS 0.5

0.0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne

Ryc. 16. Stężenie związków TBA-reaktywnych (TBARS) w osoczu krów krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

5.3. Stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy

Analizując otrzymane wyniki stężenia kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między okresem poporodowym i szczytem laktacji w porównaniu do okresu zasuszenia - p>0,05 (tab.11).

5.4. Stężenie białka całkowitego w surowicy

U krów rasy NRFxHF nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w stężeniu białka całkowitego w surowicy pomiędzy okresem zasuszenia, pierwszym tygodniem po porodzie oraz szczytem laktacji - p>0,05 (tab.11).

5.5. Stężenie cholesterolu całkowitego, frakcji HDL, LDL oraz trójglicerydów w surowicy

W przeprowadzonych badaniach stwierdzono istotnie niższe stężenia cholesterolu, frakcji HDL i LDL w surowicy krów rasy NRFxHF w pierwszym tygodniu po porodzie, w porównaniu z wynikami otrzymanymi w okresie szczytu laktacji - p<0,05. Jednocześnie nie stwierdzono różnic w stężeniu omawianych parametrów biochemicznych pomiędzy okresem zasuszenia, a okresem poporodowym oraz okresem zasuszenia i szczytem laktacji - p>0,05 (ryc. 17, tab. 12).

Stężenie trójglicerydów w surowicy krów tej rasy było istotnie niższe w pierwszym tygodniu po porodzie, jak i w szczycie laktacji, w porównaniu z okresem zasuszenia - p<0,05. Nie stwierdzono różnic w stężeniu trójglicerydów między okresem poporodowym i szczytem laktacji - p>0,05 (ryc. 17, tab. 12).

8 5 a a 6 4 ab

ab 3 b 4 b 2

2 HDL (mmol/l)

1 Cholesterol (mmol/l) Cholesterol

0 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

3 a 0.4 ab a 0.3 2 b 0.2 b b 1

LDL (mmol/l) LDL 0.1 trójglicerydy (mmol/l) trójglicerydy 0 0.0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

Ryc. 17. Stężenie wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy krów krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD); HDL – frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości, LDL – frakcja lipoprotein o niskiej gęstości. Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

5.6. Aktywność enzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów

W pierwszym tygodniu po porodzie stwierdzono najwyższą średnią aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy w porównaniu z okresem zasuszenia i szczytem laktacji oraz najwyższą średnią aktywność całkowitej katalazy w surowicy w porównaniu z okresem zasuszenia - p<0,05 (ryc. 18, tab. 13). Najniższą średnią aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy krów NRFxHF obserwowano w szczycie laktacji, a całkowitej katalazy w okresie zasuszenia. Nie stwierdzono jednak różnic w aktywności SOD w surowicy między okresem zasuszenia, a szczytem laktacji - p>0,05. Podobnie nie stwierdzono różnic w aktywności CAT w surowicy pomiędy okresem zasuszenia, a szczytem laktacji oraz pomiędzy okresem poporodowym, a szczytem laktacji.

25 60 a a 20 b b 40 15 ab b 10

CAT (U/ml) CAT SOD SOD (U/ml) 5

0 0 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

Ryc. 18. Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i całkowitej katalazy (CAT) w surowicy krów krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

Nie stwierdzono istotnych zmian (p>0,05) w aktywności dysmutazy ponadtlenkowej oznaczanej w hemolizacie, a także w aktywności reduktazy glutationowej w surowicy między okresem zasuszenia, pierwszym tygodniem po porodzie oraz szczytem laktacji (tab. 13)

5.7. Stężenie nieenzymatycznych parametrów ochrony antyoksydacyjnej we krwi obwodowej krów

Nie stwierdzono istotnych różnic w stężeniu nieenzymatycznych wskaźników ochrony antyoksydacyjnej oznaczanych w surowicy, tj. TASu i bilirubiny całkowitej, między okresami zasuszenia, po porodzie oraz szczytem laktacji - p>0,05 (tab. 14).

Nie stwierdzono natomiast istotnych różnic (p>0,05) w stężeniu glutationu całkowitego, oznaczanego w hemolizacie, pomiędzy badanymi okresami produkcyjnymi (tab. 14).

Albuminy i kwas moczowy charakteryzowały się znacząco niskimi stężeniami w surowicy badanych krów w pierwszym tygodniu po porodzie. Istotny wzrost stężenia tych parametrów, średnio o 16,1% w przypadku albumin i o 60,0% w przypadku kwasu moczowego, nastąpił w szczycie laktacji w porównaniu z pierwszym tygodniem po porodzie - p<0,05. Nie stwierdzono różnic zarówno w stężeniu albumin jak i kwasu moczowego w surowicy między okresem zasuszenia, a okresem poporodowym oraz okresem zasuszenia i szczytem laktacji - p>0,05 (ryc. 19, tab. 14).

80 0.15

ab a 60 a b 0.10 ab b 40

0.05

Albuminy (g/l) Albuminy 20

0 (mmol/l) moczowy Kwas 0.00 zasuszenie poporodowy szczyt laktacji zasuszenie poporodowy szczyt laktacji

Okresy produkcyjne Okresy produkcyjne

Ryc. 19. Stężenie albumin i kwasu moczowego w surowicy krów krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

6. Porównanie wartości wybranych enzymatycznych i nieenzymatycznych parametrów określających stan ochrony antyoksydacyjnej między krowami ras: polskiej czerwonej, holsztyńsko-fryzyjskiej i krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej z holsztyńsko- fryzyjską w różnych okresach cyklów produkcyjnych

6.1. Okres zasuszenia

Stężenie związków TBA-reaktywnych w okresie zasuszenia było istotnie niższe w osoczu krów rasy PR od stężenia stwierdzonego u krów krzyżówki ras NRFxHF. Najniższe średnie stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy stwierdzono w tym okresie u krów rasy HF, a najwyższe u krzyżówki ras NRFxHF (ryc. 20).

Ryc. 20. Stężenie związków TBA-reaktywnych (TBARS) w osoczu oraz stężenie kwasu β-hydrokysmasłowego (BHM), białka całkowitego, albumin i aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w surowicy 3 ras krów mlecznych w okresie zasuszenia (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,01) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b, c.

Opisane różnice w stężeniu kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy były istotne statystycznie (p<0,05). U krów NRFxHF obserwowano najniższe stężenie białka całkowitego i najwyższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy w porównaniu z bydłem rasy PR i HF (p<0,01). U krów rasy PR średnie stężenie albumin w surowicy było istotnie statystycznie wyższe (p<0,05) w porównaniu ze stężeniem stwierdzonym u krzyżówki ras NRFxHF (ryc. 20).

W okresie zasuszenia nie stwierdzono istotnych zależności u badanych 3 ras krów mlecznych w zakresie stężenia w surowicy cholesterolu całkowitego i jego frakcji (HDL, LDL), trójglicerydów, kwasu moczowego, bilirubiny całkowitej, wartości TASu, aktywności całkowitej katalazy i reduktazy glutationowej w surowicy oraz aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i stężenia glutationu całkowitego w hemolizacie (p>0,05).

6.2. Okres poporodowy

U krów rasy NRFxHF w pierwszym tygodniu po porodzie stwierdzono najwyższe stężenie związków TBA-reaktywnych oraz najwyższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy, w porównaniu z pozostałymi rasami (p<0,05) (ryc. 21).

Ryc. 21. Stężenie związków TBA-reaktywnych (TBARS) w osoczu oraz stężenie albumin, aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i całkowitej katalazy (CAT) w surowicy 3 ras krów mlecznych w pierwszym tygodniu po porodzie (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

U krów rasy PR aktywność całkowitej katalazy w surowicy była istotnie wyższa od aktywności stwierdzonej u przedstawicieli rasy HF (p<0,05). We wczesnym okresie poporodowym średnie stężenie albumin w surowicy krów NRFxHF było istotnie niższe od średniego stężenia stwierdzonego u bydła rasy PR - p<0,05 (ryc. 21). W zakresie pozostałych parametrów, porównywanych u 3 badanych grup krów, nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie (p>0,05). 69

6.3. Okres szczytu laktacji

W szczycie laktacji najwyższe stężenie związków TBA-reaktywnych w osoczu i zarazem najwyższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej w surowicy stwierdzono u krów rasy NRFxHF, w porównaniu z krowami rasy PR i HF (p<0,05) (ryc. 22).

Ryc. 22. Stężenie związków TBA-reaktywnych (TBARS) w osoczu oraz stężenie kwasu β-hydroksymasłowego (BHM), białka całkowitego, HDL i aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w surowicy 3 ras krów mlecznych w szczycie laktacji (średnie arytmetyczne ± SD). Różnice istotne statystycznie (p<0,05) między grupami krów przedstawiono za pomocą liter a, b.

Istotnie statystycznie najniższe średnie stężenie kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy wystąpiło u badanych przedstawicieli krów rasy HF (p<0,05). W okresie szczytu laktacji średnie stężenie białka całkowitego oraz stężenie HDL w surowicy krów rasy HF były istotnie statystycznie wyższe od wyników obserwowanych w grupie krów rasy PR - p<0,05 (ryc. 22). W zakresie pozostałych badanych parametrów, porównywanych u 3 ras

(tj. krów rasy PR, HF oraz krzyżówki ras NRF i HF), nie stwierdzono różnic istotnych statystycznie (p>0,05).

6.4. Podsumowanie wartości wybranych parametrów ochrony antyoksydacyjnej w kolejnych okresach cyklu produkcyjnego dla krów ras: polskiej czerwonej, holsztyńsko-fryzyjskiej i krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej z holsztyńsko- fryzyjską

Omówione zmiany wartości wybranych enzymatycznych i nieenzymatycznych parametrów określających stan ochrony antyoksydacyjnej podsumowano dla kolejnych okresów cyklu produkcyjnego i zwizualizowano główne trendy odpowiednio dla krów rasy polskiej czerwonej (ryc. 23), krów pochodzących z krzyżowania bydła rasy czerwonej norweskiej (ryc. 24) oraz rasy holsztyńsko-fryzyjskiej (ryc. 25). Podsumowano różnice istotne statystycznie i przedstawiono je w odniesieniu do średniej dobowej wydajności mlecznej odpowiednio dla niskowydajnych krów rasy PR, średniowydajnych krów rasy NRFxHF oraz wysokowydajnych krów rasy HF.

U krów rasy PR stwierdzono wzrost aktywności SOD-1 w hemolizacie, również w przeliczeniu na stężenie hemoglobiny, oraz CAT w surowicy pomiędzy okresem zasuszenia i początkiem laktacji, a następnie spadek aktywności SOD-1 i CAT w szczycie laktacji do wartości porównywalnych z okresem zasuszenia. W szczycie laktacji aktywność SOD-1 w przeliczeniu na stężenie hemoglobiny była porównywalna zarówno z okresem zasuszenia jak i początkeim laktacji. U krów rasy PR spadek aktywności SOD-3 w surowicy stwierdzono pomiędzy początkiem i szczytem laktacji, a spadek aktywności GR pomiędzy zasuszeniem i początkiem laktacji. Aktywność GR w szczycie laktacji była porównywalna zarówno z okresem zasuszenia jak i początkiem laktacji. U krów rasy PR nie stwierdzono zmian w stężeniu antyoksydantów nieenzymatycznych pomiędzy badanymi okresami (ryc. 23).

U krów rasy NRFxHF stwierdzono wzrost aktywności SOD-3 w surowicy oraz CAT w surowicy pomiędzy okresem zasuszenia i początkiem laktacji, a następnie spadek aktywności SOD-3 w szczycie laktacji do wartości porównywalnych z okresem zasuszenia.

Ryc. 23. Schemat zmian parametrów obrony enzymatycznej i nieenzymatycznej u krów rasy polskiej czerwonej w trzech najważniejszych okresach cyklu produkcyjnego w odniesieniu do średniej dobowej wydajności mlecznej

Aktywności CAT w szczycie laktacji była porównywalna zarówno z okresem zasuszenia jak i początkiem laktacji. Nie stwierdzono zmian aktywności SOD-1 w hemoliczacie oraz GR w surowicy oraz zmian TAS i stężenia glutationu i bilirubiny w surowicy między kolenymi okresami produkcyjnymi. Stwierdzono natomiast wzrost stężenia kwasu mlekowego i albumin między początkiem, a szczytem laktacji (ryc. 24).

U krów rasy HF stwierdzono wzrost aktywności SOD-1 w hemolizacie i CAT w surowicy pomiędzy okresem zasuszenia i początkem laktacji, a nstępnie spadek aktywnosci CAT w szczycie laktacji. Aktywność SOD-1 w szczycie laktacji była porównywalna z okresem zasuszenia i początkiem laktacji. Nie stwierdzono zmian w aktywności GR między kolejnymi okresami produkcyjnymi, natomiast stwierdzono sukcesywny spadek aktywności SOD-3 w surowicy pomiędzy okresem zasuszenia a początkiem laktacji oraz pomiędzy początkiem i szczytem laktacji. Stwierdzono również sukcesywny wzrost stężenia glutationu między okresem zasuszenia a początkiem laktacji, a następnie między początkiem i szczytem laktacji. u krów rasy HF, nie stwierdzono zmian TAS oraz stężenia pozostałych badanych antyoksydantów nieenzymatycznych między kolejnymi okresami produkcyjnymi (ryc. 25). 72

Ryc. 24. Schemat zmian parametrów obrony enzymatycznej i nieenzymatycznej u krów pochodzących z krzyżowania bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w trzech najważniejszych okresach cyklu produkcyjnego w odniesieniu do średniej dobowej wydajności mlecznej

Ryc. 25. Schemat zmian parametrów obrony enzymatycznej i nieenzymatycznej u krów rasy holsztyńsko fryzyjskiej w trzech najważniejszych okresach cyklu produkcyjnego w odniesieniu do średniej dobowej wydajności mlecznej 73

7. Wyniki korelacji

7.1. Korelacje pomiędzy wskaźnikiem kondycji ciała a badanymi parametrami enzymatycznej i nieenzymatycznej ochrony antyoksydacyjnej

U krów rasy HF i NRFxHF nie stwierdzono korelacji pomiędzy wskaźnikiem kondycji ciała, a parametrami określającymi stan antyoksydacyjny w okresie zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji (p>0,05).

7.2. Korelacje pomiędzy stężeniem związków TBA-reaktywnych i kwasu β- hydroksymasłowego a badanymi parametrami enzymatycznej i nieenzymatycznej ochrony antyoksydacyjnej

U krów rasy PR analiza zależności pomiędzy stężeniem związków TBA-reaktywnych i kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy a parametrami ochrony antyoksydacyjnej (tj. aktywnością dysmutazy ponadtlenkowej, całkowitej katalazy, reduktazy glutationowej, TAS-em i stężeniem bilirubiny całkowitej, kwasu moczowego, albumin w surowicy oraz aktywnością dysmutazy ponadtlenkowej i stężeniem glutationu całkowitego w hemolizacie), metodą korelacji rang Spearmana, we wszystkich okresach produkcyjnych, wykazała dwie istotne statystycznie zależności, zaprezentowane na rycinie 26.

Szczyt laktacji Zasuszenie 500 600

400

400 300 r = 0,363 r = 0,442 p = 0,035 200 p = 0,009 200 100

0 (µmol/l) całkowity glutation 0 Reduktaza glutationowa (U/l) glutationowa Reduktaza 0.0 0.5 1.0 1.5 0 1 2 3 BHM (mmol/l) TBARS (mol/l)

Ryc. 26. Korelacje rang Spearmana w cyklu produkcyjnym u krów rasy polskiej czerwonej (p<0,05); BHM – kwas β-hydroksymasłowy, TBARS – związki TBA-reaktywne, r – współczynnik korelacji.

U krów rasy HF w całym cyklu produkcyjnym, tzn. w okresie zasuszenia, w pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji, nie stwierdzono istotnych statystycznie zależności pomiędzy stężeniem związków TBA-reaktywnych i kwasu β-hydroksymasłowego a badanymi parametrami enzymatycznej i nieenzymatycznej ochrony antyoksydacyjnej.

U krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej wykazano istotną zależność pomiędzy stężeniem związków TBA- reaktywnych w osoczu a stężeniem glutationu całkowietgo w hemolizacie w okresie zasuszenia (p=0,002, r=0,772). W grupie krów NRFxHF, badanej w pierwszym tygodniu po porodzie, stwierdzono ponadto zależność pomiędzy aktywnością dysmutazy ponadtlenkowej w hemolizacie a stężeniem kwasu β-hydroksymasłowego w surowicy (p<0,05). Współczynnik tej korelacji rang Spearmana wynosił odpowiednio -0,566 i -0,634 dla aktywności dysmutazy ponadtlenkowej wyrażonej w jednostce U/ml oraz w przeliczeniu na g hemoglobiny. U rasy NRFxHF stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy stężeniem kwasu β-hydroksymasłowego a stężeniem kwasu moczowego w okresie zasuszenia (p=0,042, r=0,571), w pierwszym tygodniu po porodzie (p=0,048, r=0,558) oraz w szczycie laktacji (p=0,029, r=0,604), co przedstawiono na rycinie 27. Dalsza analiza statystyczna nie wykazała innych istotnych zależności (p>0,05).

Zasuszenie Zasuszenie 250 0.15

200 0.10 150 r = 0,772 r = 0,571 p = 0,002 100 p = 0,042 0.05

50 Kwas moczowy (mmol/l) moczowy Kwas

Glutation całkowity (µmol/l) całkowity Glutation 0 0.00 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 TBARS (mol/l) BHM (mmol/l)

Po porodzie Po porodzie 10000 800

8000 600 r = -0,566 6000 r = -0,634 p = 0,044 p = 0,020 400 4000

2000 200

0 (U/ml) SOD w hemolizacie

SOD w hemolizacie (U/g Hb) SOD w hemolizacie 0 0 1 2 3 0 1 2 3 BHM (mmol/l) BHM (mmol/l)

Po porodzie Szczyt laktacji

0.10 0.15

0.08 0.10 0.06 r = 0,558 r = 0,604 p p = 0,029 0.04 = 0,048 0.05

0.02 Kwas moczowy (mmol/l) moczowy Kwas Kwas moczowy (mmol/l) moczowy Kwas 0.00 0.00 0 1 2 3 0 1 2 3 BHM (mmol/l) BHM (mmol/l)

Ryc. 27. Korelacje rang Spearmana w cyklu produkcyjnym u krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej (p<0,05); BHM – kwas β-hydroksymasłowy, TBARS – związki TBA-reaktywne, r – współczynnik korelacji.

8. Analiza profilu transkryptomicznego w badanych okresach produkcyjności u krów rasy polskiej czerwonej i holsztyńsko-fryzyjskiej

Analiza transkryptomiczna ekspresji genów w komórkach jądrzastych krwi obwodowej bydła rasy PR i bydła rasy HF w trzech różnych okresach cyklu produkcyjnego metodą analizy wariancji wykazała, że w tym układzie doświadczalnym istotnie ekspresją różni się w sumie 85 transkryptów (tab. 15 w załączniku), reprezentujących 84 znane lub prawdopodobne geny (tab. 16 w załączniku). Lista tych genów została poddana analizie ontologicznej w programie Pathway Studio. W jej efekcie zidentyfikowano istotnie regulowane szlaki sygnałowe różniące między sobą bydło rasy PR i HF. Przeprowadzone badania, u dwóch ras krów mlecznych w trzech różnych okresach cyklu produkcyjnego, ujawniły różnice w ekspresji 7 genów związanych ze szlakiem sygnalizacji adiponektyny oraz różnice w ekspresji pojedynczych genów związanych z procesami komórkowymi, szlakami nocyceptywnymi oraz sygnalizacją receptorową (tab. 17 w załączniku). Natomiast ekspresja genów związanych z utrzymaniem równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej organizmu u bydła rasy PR nie różniła się znacząco w porównaniu z wynikami otrzymanymi w grupie krów rasy HF, zarówno w okresie zasuszenia (I), jak i w pierwszym tygodniu po porodzie (II) oraz w szczycie laktacji (III). Ze względu na brak istotnych zmian w profilu transkryptomicznym w zakresie mechanizmów antyoksydacyjnych odstąpiono od dalszej analizy metodą RT-PCR. U krów rasy PR, poddając wspólnej analizie trzy różne okresy produkcji (I, II oraz III), również nie stwierdzono zmian w ekspresji tych genów. Podobne wyniki otrzymano w grupie bydła rasy HF.

VI. Dyskusja

Monitorowanie statusu pro- i antyoksydacyjnego na podstwaie wybranych parametrów laboratoryjnych umożliwia ocenę ryzyka wystąpienia stresu oksydacyjnego, a co za tym idzie ryzyka wystąpienia związanych z nim chorób (Abuelo i wsp., 2013 i 2015). Ponieważ u bydła mlecznego występowanie zaburzeń metabolicznych w okresie okołoporodowym wzrasta wraz z wydajnością mleczną (Nowak i wsp., 2006; Rodriguez-Jimenez i wsp., 2018), dlatego też krowy rasy PR można uznać za obarczone najmniejszym ryzykiem rozwoju stresu oksydacyjnego związanego z produkcją mleczną.

Porównanie wyników uzyskanych od krów rasy polskiej czerwonej o niskiej wydajności mlecznej i krów rasy holsztyńsko fryzyjskiej o wysokiej wydajności mlecznej pozwoli na określenie różnic w statusie antyoksydacyjnym potencjalnie związanych z wysoką wydajnością mleczną. Krowy rasy HF zakwalifikowane do badań pochodziły ze stada o wysokiej wydajności mlecznej (10 500 kg mleka/krowę/laktację), w którym żywienie w czasie całego cyklu produkcyjnego było oparte na systemie TMR. Grupa krów rasy HF objętych badaniem charakteryzowała się wysoką całkowitą średnią wydajnością mleczną w laktacji (10 500±300 kg mleka/krowę), wysoką średnią dobową wydajnością mleczną w szczycie laktacji (45,70±6,20 kg mleka/krowę/dzień) oraz długą średnią długością laktacji (338±12 dni).

Dotychczasowe badania opisujące status antyoksydacyjny u krów mlecznych dotyczą przede wszystkim krów wysokowydajnych rasy holsztyńsko-fryzyjskiej lub rasy fryzyjskiej. W dostępnej literaturze brakuje doniesień charakteryzujących status antyoksydacyjny bydła mlecznego o niskiej i średniej wydajności mlecznej. W prezentowanych badaniach własnych bydło o niskiej wydajności mlecznej reprezentuje rasa PR, podczas gdy bydło o średniej wydajności mlecznej rasa NRFxHF. Porównanie aktywności antyoksydantów enzymatycznych i stężenia aktyoksydantów nieenzymatycznych u bydła mlecznego o niskiej, średniej i wysokiej wydajności mlecznej pozwoli na określenie zależności pomiędzy mechanizmami antyoksydacyjnymi a wydajnością mleczną klinicznie zdrowych krów. Dotychczasowe badania przeprowadzone na klinicznie zdrowych krowach mlecznych wykazały zmiany statusu oksydacyjnego i antyoksydacyjnego w prawidłowym cyklu produkcyjnym. Uznano, że mogą one wynikać z przejściowych zmian metabolicznych zachodzących w granicach nie przekraczających możliwości kompensacyjnych organizmu

(Castillo i wsp., 2005; Castillo i wsp., 2006; Sharma i wsp., 2011; Cigliano i wsp., 2014; Konvičná i wsp., 2015).

Zmiany statusu oksydacyjnego i antyoksydacyjnego w prawidłowym cyklu produkcyjnym monitorowano dotąd z wykorzystaniem wielu parametrów enzymatycznych i nieenzymatycznych różniących się pod względem mechanizmów działania antyoksydacyjnego oraz efektywności inaktywacji RFT (Di Mascio i wsp., 1991; Sies, 1997). Castillo i wsp. (2005 i 2006) badali stężenie aldehydu malonowego (MDA) oraz całkowity potencjał antyoksydacyjny (TAS). Sharma i wsp. (2011) wykorzystali stężenie MDA i glutationu oraz aktywność peroksydazy glutationowej (GPX), całkowitej katalazy (CAT) i SODu w lizacie erytrocytarnym. Cigliano i wsp. (2014) brali pod uwagę stężenie pochodnych karbonylowych (PC), nadtlenków lipidów (LPO) i całkowitą zdolność antyoksydacyjną (TAC) oraz aktywność GPX i SOD w surowicy. Konvičná i wsp. (2015) skupili się na stężeniu MDA w surowicy oraz aktywności SOD i GPX w lizacie erytrocytów. Natomiast Paździor-Czapula i wsp. (2014), Konvicna i wsp. (2014) i Kulka i wsp. (2016) zwrócili uwagę, poza stężeniem MDA i aktywnością SOD i GPX, również na aktywność paraoksonazy-1 (PON-1). PON-1 jest enzymem biorącym udział w hydrolizie wiązań estrowych oraz w procesach antyoksydacyjnych, którego aktywność u zdrowych krów zmienia się w zależności od fazy cyklu produkcyjnym i może okazać się cennym wskaźnikiem statusu antyoksydacyjnego w przypadku zaburzeń metabolicznych w cyklu produkcyjnym. PON-1 zapobiega utlenieniu poszczególnych frakcji lipoprotein i może okazać się cennym wskaźnikiem statusu antyoksydacyjnego w przypadku zaburzeń metabolicznych w cyklu produkcyjnego. W kolejnych badaniach dotyczących statusu antyoksydacyjnego warto zwrócić uwagę na aktywność GPX, PON-1, stężenie PC i LPO oraz wartość TAC. Natomiast w dalszej części dyskusji będą omawiane te spośród wymienionych antyoksydantów, które wybrano do badań własnych prezentowanych w niniejszej pracy.

Castillo i wsp. (2005) badali krowy rasy fryzyjskiej o średniej dobowej wydajności mlecznej 35 kg mleka/ krowę /dzień, a więc wyższej niż krowy rasy NRFxHF i niższej niż krowy rasy HF w prezentowanych badaniach własnych. Autorzy badali dwa parametry statusu oksydacyjnego - stężenie MDA oraz TAS, w okresach odpowiadających zasuszenia i wczesnej laktacji. W badaniach Castillo i wsp. (2005) w zasuszeniu (42 dzień przed porodem) stężenia MDA i TAS wynosiły odpowiednio 36,60±6,07 μM/l i 0,112±0,001 mmol/l. Pomiędzy zasuszeniem a wczesną laktacją (7 dzień po porodzie) autorzy 79

obserwowali brak zmian w stężeniu MDA wynoszącym 68,99±33,64 μM/l oraz wzrost stężenia TAS do wartości 0,247±0,002 mmol/l.

W przeprowadzonych badaniach własnych stężenie MDA było uwzględnione jako składowa TBARS. Stwierdzone stężęnia były zbieżne z badaniami Castillo i wsp. (2005) w grupie krów rasy HF (brak różnic w stężeniu TBARS pomiędzy zasuszeniem, a wczesną laktacją) oraz odmienne w grupie krów rasy NRFxHF (wzrost stężenia TBARS pomiędzy zasuszeniem, a wczesną laktacją). Zarówno uzyskana zbieżność jak i różnice są uzasanione ponieważ Castillo i wsp. (2005) prowadził badania na grupie 39 zdrowych krów rasy Holsztyńskiej. Analogiczny wzrost stężenia TBARS obserwowano u krów rasy PR. W badaniach własnych nie stwierdzono również wzrostu TAS pomiędzy zasuszeniem a wczesną laktacją u wszystkich trzech badanych ras. W kolejnej pracy na podobnej grupie krów rasy fryzyjskiej, Castillo i wsp. (2006) kontynuowali badania stężenia MDA i TAS dla okresów odpowiadających wczesnej laktacji i szczytowi laktacji. Autorzy nie stwierdzili różnic pomiędzy wczesną laktacją (7 dzień po porodzie) i szczytem laktacji (42 i 56 dzień po porodzie) w wartościach obydwóch parametrów w trzech wskazanych pomiarach (68,99±33,64 μM/l, 33,01±4,25 μM/l i 28,87±5,33 μM/l dla MDA w osoczu oraz 0,247±0,002 mmol/l, 0,178±0,004 mmol/l i 0,154±0,002 mmol/l dla TAS w surowicy) (Castillo i wsp., 2006). Obserwacje Castillo i wsp. (2006) są zbieżne z wynikami badań własnych w grupie krów rasy HF i NRFxHF, a więc w grupie o porównywalnej wydajności mlecznej. Jedynie w grupie krów rasy PR, a więc krów o niższej wydajności mlecznej niż w badaniach Castillo i wsp. (2006) obserwowano spadek stężenia TBARS pomiędzy początkiem a szczytem laktacji.

Sharma i wsp. (2011) badali krowy pochodzące z krzyżowania bydła rasy Sahiwal i holsztyńskiej o średniej całkowitej wydajności mlecznej wynoszącej 2 752±113,79 kg mleka / krowę uzyskanej podczas 284±5,75 dniowej laktacji. Opisana wydajność mleczna była najbardziej zbliżona do wydajności krów rasy PR. Autorzy Ci badali stężenie MDA w osoczu i glutationu w surowicy oraz aktywność całkowitej katalazy (CAT) w surowicy i SOD w lizacie erytrocytarnym w odniesieniu do stężenia hemoglobiny, w zasuszeniu (4 tygodnie przed porodem) oraz w bliskości szczytu laktacji (4 tygodnie po porodzie). Autorzy wykazali pomiędzy zasuszeniem, a laktacją: wzrost stężenia MDA (7,59±0,72 nM/gHGB/h vs. 13,34±2,68 nM/gHGB/h), spadek stężenia glutationu (71,81±11.41 μg/ml vs. 28,99±6.58 μg/ml) oraz brak różnic w aktywności CAT (42,52±6,98 μmM /min/mg HGB vs. 48,33±6,55 80

μmM /min/mg HGB) i aktywności SOD (6,99±0,45 U/mg HGB vs. 6,37±0,72 U/mg HGB). Porównie wyników badań własnych z wynikami prezentowanymi przez Sharma i wsp. (2011) oraz Castillo i wsp. (2005 i 2006) jest utrudnione ze względu na inną metodę oznaczania stężenia produktów końcowych peroksydacji lipidów. Sharma i wsp. (2011) i Castillo i wsp. (2005 i 2006) badali jedynie dominujący pod względem ilościowym aldehyd malonowy (MDA), podczas gdy w badaniach właśnych brano pod uwagę stężenie związków TBA- reaktywnych, które według Ayala i wsp. (2014) jest lepszym ogólnym wskaźnikiem nasilenia stresu oksydacyjnego niż stężenie MDA, bowiem uwzględnia wiele produktów końcowych peroksydacji lipidów. W badaniach Castillo i wsp. (2006) w czwartym tygodniu laktacji stężenie MDA wynosiło 42,10±6,46 μM/l i nie różniło się od wartości określonej w późnej ciąży (34,57±2,40 μM/l). Również w prezentowanych badaniach własnych nie stwierdzono różnic w stężeniu TBARS pomiędzy zasuszeniem a szczytem laktacji, zarówno dla krów rasy PR, HF jak również NRFxHF. W badaniach własnych nie stwierdzono spadku stężenia glutationu opisanego przez Sharma i wsp. (2011). W badaniach własnych oznaczenie glutationu przeprowadzono w hemolizacjie, podczas gdy Sharma i wsp. (2011) badali stężenie glutationu w surowicy krwi. Omawiana rożbieżność wyników może podlegać wpływowi rodzaju badanego materiału biologicznego. W badaniach własnych, u krów ras PR i NRFxHF nie stwierdzono zmian stężenia glutationu w hemolizacie w kolejnych okresach cyklu produkcyjnego, podczas gdy u krów rasy HF stwierdzono istotny wzrost pomiędzy zasuszeniem, a szczytem laktacji. Wyniki uzyskane dla krów rasy HF trudno skonfrontować z uzyskanymi przez Sharma i wsp. (2011) dla krzyżówki krów holsztyńskich z rasą rodzimą również ze względu na znaczne rozbieżności w całkowitej produkcji mlecznej oraz długości laktacji. Wyniki Sharma i wsp. (2011) uzyskane dla aktywności dyzmutazy ponadtlenkowej w surowicy są zbliżone do wyników badań własnych otrzymanych w hemolizacie, w których nie stwierdzono różnicy w aktywności SOD-1 podanej w odniesieniu do stężenia hemoglobiny (U/g HGB) pomiędzy zasuszeniem i szczytem laktacji dla trzech badanych ras. Układ doświadczalny zaproponowany przez Sharma i wsp. (2011) nie obejmował okresu wczesnej laktacji - pierwszego tygodnia po porodzie, w którym w badaniach własnych obserwowano istotny wzrost aktywności SOD-1 w hemolizacie u krów rasy PR i NRFxHF, a więc ras najbardziej zbliżonych do krów badanych przez Sharma i wsp. (2011). Również aktywność całkowitej katalazy w badaniach Sharma i wsp. (2011) oraz badaniach własnych była porównywalna w zasuszeniu i szczycie laktacji. Jednak ponownie układ doświadczalny Sharma i wsp. (2011) nie dawał możliwości rejestracji istotnego statystycznie wzrostu, 81

a następnie istotnego statystycznie spadku aktywności CAT u krów rasy PR, HF i NRFxHF we wczesnej laktacji.

Cigliano i wsp. (2014) badali krowy rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w dwóch okresach, pomiędzy 35 a 60 dniem laktacji, co odpowiada okresowi szczytu laktacji, oraz pomiędzy 85 i 160 dniem laktacji, a więc w okresie nie objętym prezentowanymi badaniami. Średnia dobowa wydajności mlecznej w pierwszym badanym okresie wynosiła około 25 kg mleka/ krowę /dzień, a w drugim około 17 kg mleka/ krowę /dzień. Średnia dobowa wydajności mlecznej z całej laktacji była więc wyższa niż u krów rasy PR i niższa niż u krów rasy NRFxHF oraz HF w prezentowanych badaniach własnych. Przytaczani autorzy wykazali niższą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej SOD w surowicy (1,57±0,1 U/ml) (Cigliano i wsp. (2014)), niż wykazana w badaniach własnych aktywność SOD-3 w surowicy dla ras PR (9,00±2,9 U/ml), HF (9,20±3,0 U/ml) i NRFxHF (12,39±3,1 U/ml). Cigliano i wsp. (2014) nie przeprowadzili pomiarów w zasuszeniu oraz we wczesnej laktacji, z kolei w prezentowanych badaniach własnych nie prowadzono badań pomiędzy 85 a 160 dniem laktacji, co uniemożliwia porównanie uzyskanych tendencji do zmian profilu antyoksydantów enzymatycznych w kolejnych etapach produkcji.

Konvičná i wsp. (2015) badali krowy rodzimej rasy słowackiej o średniej całkowitej wydajności mlecznej wynoszącej 7 136,3 kg mleka / krowę, a więc wyższej niż krowy rasy NRFxHF i niższej niż krowy rasy HF w prezentowanych badaniach własnych. Autorzy badali stężenie MDA oraz aktywność erytrocytarnej SOD (obliczaną względem stężenia HGB) 3 tygodnie przed wycieleniem, tydzień po wycieleniu oraz sześć tygodni po wycieleniu, co odpowiadało odpowiednio okresowi zasuszenia, wczesnej laktacji i szczytu laktacji. Konvičná i wsp. (2015) wykazali wzrost stężenia MDA pomiędzy zasuszeniem (0,57±0,08 μmol/l) a wczesną laktacją (0,76±0,21 μmol/l), a następnie spadek stężenia MDA w szczycie laktacji do wartości niższej niż w zasuszeniu (0,40±0,24 μmol/l). Podobne wyniki obserwowano w badaniach własnych dla TBARS u krów ras PR i NRFxHF pomiędzy zasuszeniem i wczesną laktacją, podczas gdy spadek stężenia TBARS między okresem poporodowym a szczytem laktacji był mniejszy niż w badaniach Konvičná i wsp. (2015). Wyniki Konvičná i wsp. (2015) nie były więc zgodne z obserwacjami Castillo i wsp. (2005 i 2006), a obserwowany wzrost stężenia MDA miał miejsce wcześniej niż w badaniach Sharma i wsp. (2011). Konvičná i wsp. (2015) wykazali również wzrost aktywności SOD w surowicy pomiędzy zasuszeniem (57,03±6,78 μkat/gHGB) i wczesną laktacją (59,22±6,71 82

μkat/gHGB). Wysoka aktywność SOD w surowicy utrzymywała się również w szczycie laktacji, a prezentowany profil był najbardziej zbliżony do zmian stężenia SOD-3 względem stężenia HGB u krów rasy HF. Badania Konvičná i wsp. (2015) oraz Cigliano i wsp. (2014) przeprowadzono w innych przedziałach czasowych z zastosowaniem innych metod pomiaru aktywności SOD w surowicy, co uniemożliwia zarówno bezpośrednie porównanie uzyskanych wartości jak również ogólnych trendów zmian aktywności dysmutazy. Wyniki Konvičná i wsp. (2015) są również sprzeczne z wynikami Sharma i wsp. (2011), którzy nie stwierdzili różnic w aktywności SOD w surowicy pomiędzy zasuszeniem i 4 tygodniem laktacji.

Ze względu na przytoczone powyżej znaczne rozbieżności w wartościach parametrów enzymatycznej i nieenzymatycznej ochrony antyoksydacyjnej szczegółowa dyskusja wyników uzyskanych w badaniach własnych zostanie przeprowadzona pomiędzy badanymi okresami cyklu produkcyjnego dla kolejnych badanych ras, w odniesieniu do rasy PR, jako rasy o najniższej produkcyjności a co za tym idzie potencjalnie najmniej narażonej na nadmierną produkcję RFT. Trudność w klasycznym dyskutowaniu uzyskanych wyników na tle wartości dotychczas publikowanych wynika z bardzo dużej rozbieżności stosowanych modeli doświadczalnych w zakresie doboru zwierząt (pod względem rasy, wieku oraz ilości dotychczasowych wycieleń, etapu cyklu produkcyjnego, sposobu utrzymania i żywienia, liczebności grup badawczych), wydajności mlecznej, okresów dokonywanych pomiarów, metod pomiarowych, zastosowanych jednostek i kalkulacji względem m.in. stężenia HGB oraz doboru mierzonych parametrów statusu antyoksydacyjnego. W dostępnej literaturze brakuje prac opisujących w jednym modelu wszystkich wybranych w tej pracy parametrów biochemicznych krwi. Co więcej, brakuje również prac realizowanych w różnych okresach cyklu produkcyjnego u trzech ras krów mlecznych charakteryzujących się inną wydajnością mleczną.

Obserwowany u krów rasy polskiej czerwonej wzrost aktywności CAT i SOD-1 na początku laktacji w porównaniu do okresu zasuszenia wskazuje na rozwój stereotypowej odpowiedzi organizmu na stres towarzyszący rozpoczęciu laktacji (Onasanya i wsp., 2015). Rolą CAT i SOD-1 jest niedopuszczenie do powstawania RFT (Roels i Geerts, 1982; Burk, 1990; Ray i Husain, 2002; Landis i Tower, 2005; Olędzki i Harasym, 2017). Obserwowany wzrost jest charakterystyczny dla reakcji adaptacji (Covarrubias i wsp., 2008; Scope i wsp., 2002) i może sugerować znaczny udział stresu oksydacyjnego po porodzie (Piccione i wsp., 83

2011 i 2012). Można więc przypuszczać, że krowy rasy PR są we wczesnej laktacji bardziej narażone na działanie RFT niż w okresie zasuszenia oraz w szczycie laktacji (Sordillo i wsp., 2009; Gołębiowski, 2015). Z kolejnymi dniami laktacji, aż do szczytu laktacji, obserwowano stopniowy powrót aktywności CAT i SOD-1 do poziomu wyjściowego, mierzonego w okresie zasuszenia. Spadek aktywności antyoksydantów enzymatycznych sugeruje ustępowanie czynnika stresogennego (Onasanya i wsp., 2015). Można przypuszczać, że we wczesnej laktacji powstające w nadmiarze anionorodniki ponadtlenkowe i nadtlenek wodoru są poddawane intensywnej reakcji dysproporcjonowania z udziałem odpowiednio SOD i CAT (Zelko i wsp., 2002). Wydaje się więc, że krowy rasy PR są w tym czasie zabezpieczone przed powstaniem bardziej reaktywnego rodnika hydroksylowego (Covarrubias i wsp., 2008). Obserwowany w szczycie laktacji spadek aktywności SOD-3 może wskazywać na wyczerpanie możliwości dysproporcjonowania anionorodnika ponadtlenkowego w surowicy krwi, która mimo to jest efektywnie kontynuowana w erytrocytach z wykorzystaniem SOD-1, której przypisuje się najważniejszą rolę biologiczną (Marklund i wsp., 1982; Crapo i wsp., 1992). Interesujący jest również spadek aktywności GR we wczesnej laktacji, a następnie stopniowy powrót do wartości wyjściowej w szczycie laktacji. Obserwowane silne obniżenie tej aktywności sugeruje etap wyczerpania rezerw GR i możliwość przełamania mechanizmów obrony przeciw RFT (Covarrubias i wsp., 2008; Onasanya i wsp., 2015). Zagrożone może być tym samym utrzymanie całkowitej puli glutationu w stanie zredukowanym, a więc w formie o najsilniejszych właściwościami ochronnymi przed RFT (Pastore i wsp., 2003; Jozefczak i wsp., 2012).

Sugerowane zaburzenie równowagi pomiędzy zredukowaną a utlenioną formą glutationu powinno przekładać się również na zmianę ogólnego stężenia glutationu. Jednak w druga linia obrony, monitorowana za pomocą stężenia wybranych antyoksydantów nieenzymatycznych nie wykazuje zmian w kolejnych okresach cyklu produkcyjnego. Rolą antyoksydantów nieenzymatycznych jest wyłapywanie RFT, które nie zostały zneutralizowane przez antyoksydanty enzymatyczne, i inaktywacja ich kosztem uszkodzenia własnych cząsteczek (Eyer i wsp., 1986). Obserwowany w kolejnych okresach produkcyjnych brak różnic w stężeniu TAS, odzwierciedlającym łączną aktywność antyoksydantów enzymatycznych i nieenzymatycznych (Miller i wsp., 1993), oraz brak zmian stężenia antyoksydantów nieenzymatycznych potwierdza wykazaną wydajność CAT i SOD-1 jako

głównych składowych mechanizmów antyoksydacyjnych u bydła mlecznego o niskiej wydajności mlecznej.

U krów rasy HF, podobnie jak u krów PR, obserwowano wzrost aktywności CAT i SOD-1 na początku laktacji, w porównaniu do okresu zasuszenia. Obserwowana reakcja adaptacji na stres towarzyszący rozpoczęciu laktacji (Onasanya i wsp., 2015) utrzymuje się dłużej u krów rasy HF niż PR, o czym świadczy wolniejszy spadek aktywności SOD-1 w szczycie laktacji. Można przypuszczać, że stres oksydacyjnego w pierwszych dniach laktacji jest silniejszy u krów wysokowydajnych niż u krów o niskiej produkcyjności, co w pełni uzasadniają znaczne równice metaboliczne zależne od produkcyjności. U krów wysokowydajnych stwierdzono bowiem wyższe stężenia RFT, niż u krów o niższej wydajności mlecznej (Castillo i wsp., 2003; Löhrke i wsp., 2004). Według Bernabucci i wsp. (2005) oraz Castillo i wsp. (2005) wysoka wydajność mleczna predysponuje do rozwoju stanu stresu oksydacyjnego, który jest efektem zaburzenia równowagi prooksydacyjno- antyoksydacyjnej organizmu. Można również przypuszczać, że u krów wysokowydajnych we wczesnej laktacji przeważa produkcja anionorodników ponadtlenkowych (Crapo i wsp., 1992). Świadczy o tym szybsze niż u krów rasy PR wyczerpanie aktywności SOD-3 w surowicy i przedłużająca się wzmożona aktywność SOD-1 (Marklund i wsp., 1982; Crapo i wsp., 1992). Jednocześnie efektywność reakcji dysproporcjonowania nadtlenku wodoru jest porównywana u krów rasy HF i PR o czym świadczy podobna krzywa aktywności CAT (Zelko i wsp., 2002). Z kolejnymi dniami laktacji, aż do szczytu laktacji, obserwowano stopniowy spadek aktywności CAT co wskazuje na efektywne ograniczenie aktywności nadtlenku wodoru (Onasanya i wsp., 2015). Wydaje się więc, że krowy rasy HF są w szczycie laktacji w mniejszym stopniu zabezpieczone przed powstaniem reaktywnego rodnika hydroksylowego i są narażone na stres oksydacyjny (Covarrubias i wsp., 2008). Można przypuszczać, że krowy rasy HF są narażone na działanie wyższych stężeń RFT utrzymujących się dłużej niż u krów rasy PR. Nasilenie produkcji RFT wydaje się obejmować zarówno okres wczesnej laktacji jak i szczyt laktacji. Co ciekawe, u krów rasy HF aktywności GR utrzymuje się na stałym poziomie niezależnie od okresu produkcji. Może to świadczyć o efektywności mechanizmów antyoksydacyjnych opartych na puli aktywnego glutationu (Onasanya i wsp., 2015). Wobec intensywnej produkcji anionorodnika ponadtlenkowego i objawów ograniczonej wydajności dysmutazy ponadtlenkowej, szczególnie w surowicy, działanie antyoksydacyjne przejmują zmiatacze wolnych rodników w drugiej linii obrony.

Świadczy o tym wzrost stężenia glutationu we wczesnej laktacji, utrzymujące się i pogłębiające w szczycie laktacji. Glutation, jako główny antyoksydant nieenzymatyczny obecny w płynie zewnątrzkomórkowym i surowicy krwi wychwytuje i dezaktywuje RFT, które "przedostały się" przez mechanizmy ochrony enzymatycznej (Masella i wsp., 2005; Jozefczak i wsp., 2012). Można przypuszczać, że brak zmian w aktywności GR obserwowana u krów wysokowydajnych w porównaniu do krów o niskiej produkcji mlecznej może być cechą adaptacyjną utrwaloną na drodze selekcji w hodowli bydła rasy HF. Należy mieć na uwadze, że stałe generowanie wysokich stężeń reaktywnych form tlenu w komórkach wykazujących silnie przyspieszony metabolizm tlenowy związany z wysoką produkcyjnością, może doprowadzić do wykształcenia lub wzmocnienia poszczególnych mechanizmów regulacyjnych, w celu utrzymania homeostazy redoks (Dröge, 2002). W kolejnych okresach cyklu produkcyjnego nie obserwowano zmian stężeń pozostałych antyoksydantów nieenzymatycznych należących do drugiej linii obrony (Eyer i wsp., 1986). Brak różnic w stężeniu TAS oraz brak zmian stężenia bilirubiny, kwasu moczowego i albumin potwierdza wykazaną wydajność mechanizmów opartych na aktywności CAT, SOD-1 i GR oraz reaktywności glutationu jako głównych czynników antyoksydacyjnych u bydła mlecznego o wysokiej wydajności mlecznej.

U krów rasy NRFxHF, podobnie jak u krów PR i HF obserwowano wzrost aktywności CAT i SOD na początku laktacji, w porównaniu do okresu zasuszenia. Jednak w odróżnieniu od obydwóch ras obserwowana reakcja adaptacji dotyczyła SOD-3 w surowicy, a nie SOD-1 obecnej głównie w erytrocytach. U krów rasy NRFxHF nie obserwowano cech wyczerpania aktywności SOD-3 w surowicy i zwiększenia aktywność SOD-1. Aktywność SOD-1, podobnie jak aktywność GR, była porównywalna we wszystkich badanych okresach produkcyjnych. Można przypuszczać, że stres oksydacyjnego w pierwszych dniach laktacji jest u krów rasy NRFxHF efektywnie kompensowany głównie przy udziale CAT i SOD-3. Uzyskane wyniki wskazują, że u krów o średniej wydajności mlecznej we wczesnej laktacji powstaje więcej nadtlenku wodoru niż u krów o niskiej wydajności mlecznej. Świadczy o tym utrzymująca wzmożona aktywność CAT, która trwa dłużej u krów NRFxFR niż u krów PR. Reakcja dysproporcjonowania anionorodników ponadtlenkowych odbywa się głównie w surowicy krwi bez cech aktywacji wewnątrzkomórkowej dysmutazy ponadtlenkowej (Zelko i wsp., 2002). Obserwowany w zasuszeniu i we wczesnej laktacji brak zmian stężenia antyoksydantów nieenzymatycznych potwierdza wykazaną wydajność CAT i SOD-3. Jednak

w szczycie laktacji, dochodzi do spadku aktywności SOD-3 co może wskazywać na rozpoczynający się etap wyczerpania rezerw SOD-3 w surowicy i możliwość przełamania mechanizmów obrony przeciw RFT (Covarrubias i wsp., 2008; Onasanya i wsp., 2015). Działanie antyoksydacyjne przejmują zmiatacze wolnych rodników w drugiej linii obrony, w szczególności kwas moczowy i albuminy. Świadczy o tym wzrost ich stężenia w szczycie laktacji w stosunku do wczesnej laktacji. Można przypuszczać, że kwas moczowy i albuminy wychwytują RFT które "przedostały się" przez mechanizmy ochrony enzymatycznej i dezaktywują je kosztem uszkodzenia własnej struktury (Masella i wsp., 2005; Jozefczak i wsp., 2012). Wobec istotnych zmian metabolicznych zachodzących w organizmie krów wraz z rozwojem laktacji obserwowana zmienność wymaga dalszych badań. O efektywności nieenzymatycznych mechanizmów antyoksydacyjnych w drugiej linii obrony świadczy brak różnic w stężeniu glutationu, bilirubiny, a przede wszystkim TAS, który odzwierciedla łączną aktywność antyoksydantów enzymatycznych i nieenzymatycznych (Miller i wsp., 1993). Wydaje się więc, że krowy rasy NRFxFR we wczesnej laktacji są zabezpieczone przed powstaniem bardziej reaktywnego rodnika hydroksylowego (Covarrubias i wsp., 2008), natomiast w szczycie laktacji są bardziej podatne na uszkodzenia oksydacyjne związane z nasilonym metabolizmem.

Można przypuszczać, że utrzymująca się w szczycie laktacji podwyższona aktywność CAT i wzrost stężenia kwasu moczowego oraz albumin w stosunku do zasuszania oraz wyższa aktywność SOD-3 w porównaniu do aktywności stwierdzonej u krów o niskiej produkcji mlecznej może być cechą adaptacyjną utrwaloną na drodze selekcji w hodowli bydła rasy NRFxHF. Stałe generowanie wysokich stężeń reaktywnych form tlenu, zwłaszcza nadtlenku wodoru, w komórkach wykazujących przyspieszony metabolizm tlenowy związany ze wzrostem produkcyjności, może doprowadzić do wykształcenia lub wzmocnienia poszczególnych mechanizmów regulacyjnych (Dröge, 2002). Prezentowane wyniki wskazują na istotną rolę mechanizmów opartych na aktywności CAT i SOD-3 jako głównych czynników antyoksydacyjnych u bydła mlecznego o średniej wydajności mlecznej oraz mechanizmów opartych na stężeniu kwasu moczowego i albumin jako pomocniczych czynników antyoksydacyjnych wobec zwiększonej produkcji RFT.

W prezentowanych badaniach u wszystkich przedstawicieli trzech ras bydła mlecznego, na każdym etapie cyklu produkcyjnego, nie stwierdzono zaburzeń podczas ogólnego badania klinicznego. Temperatura wewnętrzna, częstość tętna oraz oddechów 87

mieściła się w przedziale norm fizjologicznych (Burfeind i wsp., 2012; Eigenberg i wsp., 2000; Thomas i Moore, 1951). Poddając klinicznej ocenie błony śluzowe, dostępne węzły chłonne oraz gruczoł mlekowy, również nie stwierdzono nieprawidłowości, w tym objawów choroby. Zgodnie z wytycznymi Radkowska i Herbut (2014) przeprowadzenie badania stanu ogólnego umożliwia monitorowanie zdrowia krów mlecznych. Na jego podstawie nie stwierdzono objawów klinicznych zaburzeń metabolicznych typowych dla okresu okołoporodowego krów wysokowydajnych (Nowak i wsp., 2006). We wszystkich okresach cyklu produkcyjnego badane krowy można uznać za klinicznie zdrowe. Uzyskane wyniki potwierdzają obserwacje Castillo i wsp. (2003; 2006), Cigliano i wsp. (2014) oraz Konvičná i wsp. (2015), którzy wykazali zmiany statusu oksydacyjnego i antyoksydacyjnego u klinicznie zdrowych krów. Obserwowane w cyklu produkcyjnym u krów ras PR, NRFxHF i HF różnice w wartościach parametrów statusu antyoksydacyjnego mogą wynikać z przejściowych zmian metabolicznych, które mieszczą się w granicach możliwości kompensacyjnych organizmu. Brak objawów klinicznych zaburzeń metabolicznych potwierdza wydajność mechanizmów antyoksydacyjnych opartych u bydła rasy PR na aktywności CAT i SOD-1, u bydła rasy HF na aktywności CAT i GR oraz reaktywności glutationu, a u bydła rasy NRFxHF na aktywności CAT i SOD-3 oraz reaktywności kwasu moczowego i albumin (Castillo i wsp., 2003 oraz 2006; Pintea i wsp., 2006; Cigliano i wsp., 2014; Konvičná i wsp., 2015).

W przeprowadzonych badaniach, podstawowe badanie ogólne poszerzono o badanie hematologiczne i biochemiczne krwi w celu pełnego monitorowania stanu zdrowia badanych krów (Brucka-Jastrzębska i wsp., 2007; Mordak i Nicpoń, 2006). Według Tracz i wsp. (2012) regularnie wykonywane badanie krwi umożliwia wykrycie zaburzeń na wczesnym etapie rozwoju. W hodowli krów wysokowydajnych, okresowo wykonywane badania laboratoryjne są elementem strategii prewencyjnej, stosowanej w celu minimalizacji strat związanych ze spadkiem wydajności mlecznej na skutek zaburzeń stanu zdrowia (Małecki, 2003). Należy jednak pamiętać, że wiele stanów fizjologicznych u bydła mlecznego, takich jak ciąża czy laktacja, może wpłynąć na przesunięcie punktu równowagi hematologicznej i biochemicznej krwi (Sattar i Mirza, 2009). Claxton i Ortiz (1996) zwrócili uwagę, że w warunkach fizjologicznych różnice w wartościach parametrów hematologicznych mogą występować również pomiędzy rasami danego gatunku. Z tego względu wyniki badań krwi powinny być rozpatrywane w odniesieniu do etapu cyklu produkcyjnego (Sattar i Mirza, 2009), statusu

fizjologicznego badanych osobników (Aengwanich, 2002), wieku, płci, kondycji (Roland i wsp., 2014), ale również rasy i genotypu (Etim i wsp. 2014; Onasanya i wsp. 2015).

W prezentowanych badaniach oceniono podstawowe parametry hematologiczne, do których zaliczono m.in.: RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT, WBC. U wszystkich badanych ras krów, na każdym etapie cyklu produkcyjnego, otrzymane wyniki były zgodne z wartościami referencyjnymi ustalonymi odpowiednio przez Wooda and Quiroz-Rocha (2010) dla krów we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji oraz przez George i wsp. (2010) dla krów po szczycie laktacji i w zasuszeniu, co wskazuje na utrzymanie homeostazy podczas całego doświadczenia. Nie stwierdzono różnic w wartościach parametrów hematologicznych krwi pomiędzy krowami rasy PR, HF oraz NRFxHF. Uzyskane wyniki są zgodne z obserwacjami Mirzadeh i wsp. (2010) według których w przypadku bydła mlecznego, rasa nie stanowi głównego, ani też istotnego czynnika wpływającego na zmienność parametrów hematologicznych. Radkowska i Herbut (2014) wskazali, że rozważany wpływ może mieć system utrzymania bydła. Autorzy wykazali wyższy WBC, HT i HGB u krów utrzymywanych na pastwisku bądź z zapewnionym do niego swobodnym dostępem niż u krów utrzymywanych w systemie zamkniętym. Z kolei Olayemi i wsp. (2000) opisali wyższe wartości WBC, RBC i PVC u krów utrzymywanych w systemie intensywnym, w porównaniu do chowu ekstensywnego. W prezentowanych badaniach własnych, rozważając parametry hematologiczne trzech ras krów odmiennie utrzymywanych i żywionych, nie stwierdzono podobnych zależności. Uzyskane wyniki są zgodne z obserwacjami Meglia i wsp. (2005), według których żywienie bydła nie wpływa na liczbę WBC oraz na fagocytozę neutrofili i wybuchy tlenowe.

Jednak według Belić i wsp. (2011) profil hematologiczny u krów mlecznych ulega zmianom zależnym od cyklu produkcyjnego, które są najsilniej wyrażone w okresie okołoporodowym. U krów rasy PR obserwowano spadek RBC, HT i HGB w szczycie laktacji oraz najwyższe średnie wartości MCV po porodzie. Podobnie u krów rasy HF obserwowano spadek RBC, HT i wzrost MCV po porodzie. Zarówno Jones i Allison (2007) jak i Sattara i Mirza (2009) obserwowali u części badanych krów spadek odpowiednio RBC, HT i HGB lub tylko RBC kilka godzin po porodzie. Również Nazifi i wsp. (2008) wykazali spadek HGB, RBC i HT związany z porodem, a Esievo i Moore (1979) wskazywali na spadek HGB we wczesnej laktacji. Z kolei Enemark i wsp. (2009) wykazali wzrost wartości parametrów czerwonokrwinkowych (RBC, HGB, HT) w pierwszych dniach laktacji, jako skutek 89

koncentracji krwi związanej z porodem. Również Steinhardt i wsp. (1994) wykazali wzrost HGB w okresie okołoporodowym i spadek HGB wraz z postępującą laktacją. Uzyskane wyniki badań własnych są zgodne z obserwacjami Esievo i Moore (1979), Jones i Allison (2007), Nazifi i wsp. (2008), Sattara i Mirza (2009) oraz Ambily i wsp. (2017) i mogą być związane z mechanizmem kompensacji, uruchomionym w wyniku utraty krwi podczas porodu i polegającym na zwiększonej produkcji erytrocytów. W warunkach fizjologicznych podczas porodu dochodzi do nieznacznej utraty pełnej krwi co prowadzi od odruchowego zwężenia naczyń krwionośnych. Kompensacyjna reakcja układu krążenia maskuje skutki utraty krwi, dlatego w badaniu hematologicznym przeprowadzonym tuż po porodzie zazwyczaj nie obserwuje się zmian (Abramowicz i wsp., 2019). Jednak już po około dwóch dniach rozpoczyna się u bydła regeneracja erytrocytów (Roland i wsp., 2014). W skutek nasilonej erytropoezy pojawiają się we krwi obwodowej młode, większe erytrocyty, które wpływają na zwiększenie wartości MCV (Chandra i wsp., 2012). Wzrost wartości MCV może być spowodowany również niedoborem żelaza, jednak ze względu na brak zmian MCH, MCHC oraz brak klinicznych i laboratoryjnych objawów anemii pośrednio wykluczono taką hipotezę (Mudron i wsp., 1999; Aengwanich i wsp., 2009; Mazzullo i wsp., 2014). Podobnych zmian nie obserwowano w krów rasy NRFxHF. Zarówno Górski i Saba (2012) jak i Tienken i wsp. (2015) badając krowy mleczne, również nie zaobserwowali zmian wartości parametrów czerwonokrwinkowych pomiędzy okresem zasuszenia a pierwszym miesiącem po porodzie.

Zarówno u rasy PR, HF jak i NRFxHF nie obserwowano również różnic w wartości parametrów układu płytkowego pomiędzy kolejnymi etapami cyklu produkcyjnego. We wszystkich badanych grupach wartości PLT i MPV mieściły się w zakresie norm fizjologicznych zaproponowanych przez Mirzadeh i wsp. (2010) oraz George i wsp. (2010).

Również u wszystkich badanych ras wartości WBC mieściły się w zakresie norm fizjologicznych zaproponowanych przez Sattara i Mirza (2009) oraz George i wsp. (2010). U krów mlecznych wszystkich badanych ras obserwowano nieznaczny wzrost WBC po porodzie w porównaniu do okresu zasuszenia. Obserwowane zmiany nie były istotne statystycznie co jest zgodne z wynikami przedstawionymi przez Quiroz-Rocha i wsp. (2009) oraz Gvozdić i wsp. (2014). Jednak w dostępnej literaturze doniesienia dotyczące liczby WBC w kolejnych etapach cyklu produkcyjnego są sprzeczne. Gilbert i wsp. (1993) oraz Nazifi i wsp. (2008) opisali spadek WBC po porodzie. Natomiast według Zerbe i wsp. (2000) 90

oraz Radkowska (2015) u krów w okresie przedporodowym występuje wzrost wartości WBC, ze względu na zwiększoną populację neutrofili, a następnie dochodzi do spadku leukocytów, który może być obserwowany już podczas pierwszego tygodnia po porodzie. Również Mirzadeh i wsp. (2010) wykazali wzrost WBC u krów w czasie czynnej laktacji w porównaniu do krów w zasuszeniu. Leukocytoza opisywana fizjologicznie u krów w późnej ciąży oraz we wczesnym okresie poporodowym jest związana z oddziaływaniem uwalnianych glikokortykosteroidów na szpik kostny oraz pulę marginalną leukocytów. Glikorortykosteroidy uwalniane z nadnerczy płodu inicjują akcję porodową ale również wpływają na podwyższenie liczby neutrofilii oraz w mniejszym stopniu liczby monocytów we krwi krowy (Lee i Kehrli, 1998; O’Loughlin i wsp., 2012). Równocześnie wykazano tendencje do zmniejszenia liczby limfocytów (Braun i wsp., 2018; Meglia i wsp., 2001). Podobnych zmian nie wykazano w późnym okresie poporodowym pokrywającym się z wczesną laktacją oraz w szczycie laktacji (Detilleux i wsp., 1995). Hachenberg ze wsp. (2007) i Cincović ze wsp. (2012) wykazali, że w okresie okołoporodowym u krów nadmiernie obciążonych katabolicznie dochodzi do spadku wartości WBC. Leukopenia rozwijająca się w przebiegu klinicznej ketozy jest efektem zwiększonego katabolizmu leukocytów (Marutsova i wsp., 2015) oraz negatywnego wpływu zwiększonego stężenia ciał ketonowych na proliferację komórek szpiku (Hoeben i wsp., 1999). Również Marutsova i wsp. (2015) wykazali u krów w okresie okołoporodowym leukocytozę wynikającą z limfocytozy, którą wiązali z wystąpieniem podklinicznej ketozy. Marutsova i wsp. (2015) poza spadkiem wartości WBC obserwowali również wzrost wartości HGB i HT. Z kolei Belić i wsp. (2011) wykazali spadek wartości RBC, HGB i WBC u krów w okresie przejściowym jako skutek rozwoju ujemnego bilansu energetycznego i bezpośredniego wpływu NEFA oraz BHM. Cincović i wsp. (2012) podał, że zmiany stężenia we krwi BHM, glukozy i niezestryfikowanych kwasów tłuszczowych (NEFA) determinują profil metaboliczny oraz hematologiczny krów mlecznych w okresie okołoporodowym. W prezentowanych badaniach własnych nie stwierdzono objawów klinicznych ketozy, a wskazujący na podkliniczną ketozę wzrost stężenia BHM w pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji pozostawał bez wpływu na ogólną liczbę WBC. Co ciekawe, u krów rasy HFxNRF, u których w okresie okołoporodowym stwierdzono najwyższe stężenie BHM, nie stwierdzono zmian wartości RBC, HGB, HT i WBC w całym cyklu produkcyjnym.

Rafia i wsp. (2011) wykazali dodatnie korelacje pomiędzy kondycją ciała a HCT, HGB, MCV, MCH u krów rasy holsztyńskiej w okresie okołoporodowym. Obserwowane korelacje były słabe (wartości współczynnika korelacji 0,18

Według Bernabucci i wsp. (2005), Nowak i wsp. (2006) Lykkesfeldt i Svendsen (2007) oraz Rodriguez-Jimenez i wsp. (2018) wysokowydajne krowy mleczne utrzymywane w warunkach fermowych są w bliskości porodu narażone na rozwój stresu oksydacyjnego i związanych z nim chorób okresu okołoporodowego przebiegających w formie klinicznej lub podklinicznej. W prezentowanej pracy nie stwierdzono objawów klinicznych chorób metabolicznych u krów ras PR, HF i NRFxHF we wszystkich badanych okresach cyklu produkcyjnego. Zwrócono więc szczególną uwagę na określenie zależności pomiędzy statusem antyoksydacyjnym a parametrami umożliwiającymi monitorowanie zaburzeń podklinicznych, takimi jak BHM oraz stężenie pośrednich metabolitów tłuszczów (HDL, LDL, trójglicerydów, cholesterolu) i TBARS.

Według Bernabucci i wsp. (2005) oraz Castillo i wsp. (2005) BCS powyżej 3,5 punktu predysponuje do rozwoju stresu oksydacyjnego, który jest efektem zaburzenia równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej organizmu. W badaniach własnych kondycja ciała krów ras HF i NRFxHF w zasuszeniu wynosiła odpowiednio 3,25 i 3,45 punktów i mieściła się w przedziale wartości fizjologicznych zaproponowanych przez Jaśkowskiego i Twardonia (2002) oraz Słoniewskiego (2003) dla bydła mlecznego w okresie zasuszenia. Badane krowy możne więc uznać za właściwie przygotowane kondycyjnie do porodu i laktacji. We wczesnej laktacji zanotowano spadek BCS aż do najniższych wartości w szczycie laktacji co jest zgodne z obserwacjami Adamski i Onyszko (2000) oraz Heinrichs i wsp. (2016). Największe zmiany BCS obserwowano pomiędzy porodem a szczytem laktacji, co jest zgodne z doniesieniami Bernabucci i wsp. (2005) oraz Nałęcz-Tarwackiej i wsp. (2015). Borkowska i wsp. (2015) wykazali, że kondycja krów oscylująca wokół wartości 3,5 punktu w okresie zasuszenia jest najbardziej korzystną w aspekcie późniejszej wydajności mlecznej. Według Roche i wsp. (2009) w dniu porodu optymalna pod względem metabolicznym kondycja krów 92

mlecznych powinna mieścić się w zakresie 3,0-3,25 punktu, przy czym BCS powyżej 3,5 punktu może predysponować do wystąpienia zaburzeń zdrowotnych. Natomiast Crowe (2008) podał, że zmiana kondycji ciała w warunkach fizjologicznych nie powinna przekraczać 0,5 punktu w okresie wczesnej laktacji. Dodatkowo Remppis ze wsp. (2011) stwierdzili, że dorosła krowa mleczna, podczas pierwszych 60 dni laktacji nie powinna tracić więcej niż 0,5-1 punktu w skali BCS. Zmiana BCS większa niż 1 punkt może być związana z zaburzeniami zdrowotnymi, najczęściej metabolicznymi, oraz zmniejszeniem produkcji mleka (Pedron i wsp., 1993; Gallo i wsp., 1996; Drackley, 1999). Badania przeprowadzone przez Busato i wsp. (2002) wykazały najlepszy stan metaboliczny u krów mlecznych, których kondycja ciała w zasuszeniu była wyższa niż 3,25 punktu i stopniowo obniżała się w dwóch pierwszych miesiącach laktacji, jednak nie więcej niż o 0,75 punktu.

Gheise i wsp. (2017) zaprezentowali pogląd, że krowy mleczne o kondycji ciała powyżej 4 punktów są bardziej podatne na stres oksydacyjny ze względu na niższą aktywność enzymów antyoksydacyjnych. W prezentowanych badaniach własnych nie stwierdzono korelacji pomiędzy aktywnością antyoksydantów enzymatycznych a BCS, jednak w żadnym z badanych okresów wartość BCS nie przekraczała średniej wartości 3,45 punktu, a najwyższa wartość skrajna wynosiła 3,75 punktu. Gheise i wsp. (2017) wykazali również tendencje do znacznego i gwałtownego obniżenia kondycji ciała w pierwszym miesiącu po porodzie, co istotnie predysponuje do rozwoju zaburzeń metabolicznych. W badaniach własnych spadek kondycji ciała nie był gwałtowny i nie przekraczał 0,75 punktu, co może uzasadniać brak wykazanych zależności pomiędzy parametrami statusu antyoksydacyjnego i BCS.

U krów rasy NRFxHF obserwowano bardziej intensywną lipolizę niż u krów rasy HF, o czym świadczy wyższy wskaźnik utraty kondycji ciała w okresie od porodu do szczytu laktacji. Również u krów rasy NRFxHF stwierdzono w okresie okołoporodowym najwyższe stężenie BHM wskazujące na podkliniczną ketozę. Analiza stężenia BHM w surowicy ujawniła podkliniczną ketozę u krów rasy NRFxHF we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji. Do oceny nadmiernego obciążenia katabolicznego zastosowano próg odcięcia zaproponowany przez Hachenberg'a i wsp. (2007), Kupczyńskiego i wsp. (2008), Seifi i wsp. (2011) oraz McArt'a i wsp. (2012) i (2013). Według cytowanych autorów krowy mleczne, u których w okresie okołoporodowym stężenie BHM w surowicy przekracza 1,20 mmol/l należy uznać za objęte stanem podklinicznej ketozy. Za stan podklinicznej ketozy uznano 93

wszystkie stężenia BHM równe lub wyższe niż 1,20 mmol/l, przy równoczesnym prawidłowym wyniku ogólnego badania klinicznego. Inni autorzy definiują podkliniczną ketozę przy stężeniu BHM we krwi powyżej wartości 1,40 mmol/l (Carrier i wsp., 2003; Chapinal i wsp., 2012; Duffield i wsp., 2009; Geishauser i wsp., 2000; Nielen i wsp., 1994). Przyjmując tę skalę, badane krowy rasy NRFxHF we wszystkich etapach cyklu produkcyjnego należy uznać za podklinicznie zdrowe. Z kolei Rollin i wsp. (2010) polecają jako punkt odcięcia stężenia BHM w surowicy dla rozpoznania stanu podklinicznej ketozy u krów mlecznych wartość zawierająca się w przedziale od 1,00 do 1,40 mmol/l (Rollin i wsp., 2010). Przyjmując tę skalę, również krowy rasy PR we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji należałoby uznać za nadmiernie obciążone metabolicznie. Markusfelda i wsp. (1997) zwrócili uwagę, że wysoka kondycja ciała krów mlecznych w okresie okołoporodowym, znacznie predysponowała do poporodowego wzrostu stężenia ciał ketonowych we krwi i rozwoju kwasicy ketonowej. Z kolei Hachenberg ze wsp. (2007) stwierdzili, że krowy z wysokimi wartościami stężenia BHM w surowicy wyraźnie tracą kondycję ciała w okresie poporodowym. Według Adamskiego (2010) kondycja krowy mlecznej po wycieleniu oraz tempo jej zmiany w dalszym etapie cyklu produkcyjnego zależy w dużym stopniu od ilości wcześniej zgromadzonych zapasów tłuszczowych. Bernabucci i wsp. (2005) oraz Lacetera i wsp. (2005) również zwrócili uwagę, że wyższa wyjściowa kondycja ciała na etapie zasuszenia, może predysponować do dynamiczniejszych jej zmian w trakcie cyklu produkcyjnego, a szczególnie do większej utraty BCS po porodzie i w fazie wczesnej laktacji. Opisane zależności obserwowano w badaniach własnych na przykładzie krów NRFxHF. U większości krów rasy NRFxHF, tj. blisko u 80% osobników, odnotowano wysokie wartości BHM, typowe dla podklinicznej ketozy, utrzymujące się również w szczycie laktacji. Stan ten wskazuje na znaczne rozpowszechnienie zaburzeń metabolicznych w stadzie, większe niż w dotychczas publikowanych badaniach. Według Duffielda i wsp. (1997) podkliniczna ketoza rozwija się zazwyczaj we wczesnej laktacji i dotyczy przeważnie od 40 do 60% osobników stada. Według Baird (1982) oraz Nielen i wsp. (1994) ryzyko wystąpienia podklinicznej ketozy u krów mlecznych jest największe w pierwszym miesiącu laktacji a jej występowanie nie przekracza 47% osobników w stadzie. Z kolei według Suthar'a i wsp. (2013) podkliniczna ketoza dotyczyła od 11 do 37% krów w stadzie w pierwszych dwóch tygodniach laktacji. Według Bernabucci i wsp. (2005) krowy o wysokim BCS i znacznej wydajności mlecznej, których przykładem w badaniach własnych są krowy rasy NRFxHF, mogą być bardziej wrażliwe na stres oksydacyjny. Stres oksydacyjny może wynikać ze znacznej ilości 94

generowanych RFT, wyczerpania mechanizmów obrony antyoksydacyjnej lub obu czynników jednocześnie (O’Boyle i wsp., 2006). W prezentowanych badaniach własnych stwierdzono objawy osłabienia aktywności SOD-3 i przedłużającej się wysokiej aktywności CAT w szczycie laktacji. W szczycie laktacji stwierdzono również wzrost stężenia kwasu moczowego oraz albumin w stosunku do wczesnej laktacji. Co ciekawe, właśnie u krów rasy NRFxHF, we wszystkich etapach cyklu produkcyjnego, stwierdzono średnie dodatnie korelacje pomiędzy stężeniem kwasu moczowego i BHM. Można więc przypuszczać, że u tej rasy krów mlecznych kwas moczowy może być zaangażowany w wychwytywanie i inaktywację wolnych rodników wytwarzanych w wyniku nasilonych procesów katabolicznych. Co więcej jedynie u krów rasy NRFxHF wykazano średnie ujemne korelacje pomiędzy aktywnością SOD-1 a stężeniem BHM co może uzasadniać ograniczony udział SOD-1 w reakcji antyoksydacyjnej we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji oraz istotną rolę SOD-3 w utrzymaniu wydajności reakcji dysproporcjonowaniu anionorodnika ponadtlenkowego, wykazaną w niniejszych badaniach. Na uwagę zasługuje również słaba dodatnia korelacja pomiędzy stężeniem BHM a aktywnością GR, wykazana w zasuszeniu u krów rasy PR, zwłaszcza wobec spadku aktywności GR we wczesnej laktacji obserwowanego jedynie u krów rasy PR. Jednak kontynuacja rozważań nad zależnością pomiędzy aktywnością SOD-1, stężeniem kwasu moczowego i BHM u krów rasy NRFxHF oraz aktywnością GR i stężeniem BHM u krów rasy PR wymaga dalszych badań w bardziej rozbudowanym układzie doświadczalnym.

U wszystkich badanych ras obserwowano poporodowy wzrost stężenia BHM we krwi, zgodny z wcześniej publikowanymi wynikami (Hachenberg i wsp., 2007; Van Dorland i wsp., 2009; Park i wsp., 2010; Gross i wsp., 2011; Cincović i wsp., 2012; Gheise i wsp., 2017). Nie stwierdzono również różnicy w stężeniu BHM pomiędzy laktacjami u wszystkich badanych ras. Uzyskane wyniki nie są zgodne z sugestią Quiroz-Rocha i wsp. (2009), zgodnie z którą u krów wieloródek w okresie poporodowym stężenie BHM w surowicy jest wyższe w trakcie trzeciej i kolejnej laktacji w porównaniu do drugiej laktacji. Jednak najbardziej interesujące wyniki analizy stężenia BHM uzyskano w grupie krów o najwyższej wydajności mlecznej, czyli dla rasy HF. Podobnie jak w badaniach Wathes’a i wsp. (2007), w całym cyklu produkcyjnym nie przekraczały one wartości granicznej przyjętej dla stwierdzenia podklinicznej ketozy. Zarówno w zasuszeniu, jak i w szczycie laktacji stężenie BHM było niższe u krów rasy HF niż u krów rasy PR i NRFxHF. U krów rasy HF w całym badanym

cyklu produkcyjnym stwierdzono też mniejszą zmianę BCS niż u krów rasy NRFxHF. Uzyskane wyniki są zgodne z obserwacjami Hachenberga i wsp. (2007), według których krowy mleczne z wyższymi wartościami stężeń BHM we krwi, są bardziej obciążone metabolicznie i wydatniej tracą kondycję ciała. Można uznać, że pomimo najwyższej wydajności, krowy HF charakteryzowały się względnie najmniejszym nasileniem procesów lipolizy i wykazywały najbardziej korzystny bilans energetyczny z punktu fizjologii okresu okołoporodowego. Uzyskane wyniki wskazują na właściwe pokrycie wymagań energetycznych i mineralnych krów wysokowydajnych (Lohrenz i wsp., 2010) poprzez prawidłowe zarządzanie stadem bydła mlecznego w kontekście żywienia (Gillund i wsp., 2001; Gatellier i wsp., 2004). Krowy HF karmiono w systemie TMR, wykorzystując specjalny program komputerowy do ustalenia składu dawki pokarmowej, co pozwoliło na elastyczne i zarazem precyzyjne dopasowanie żywienia do potrzeb wydajności mlecznej na każdym etapie produkcji mlecznej. Ponadto krowy rasy HF były regularnie poddawane ocenie pod kątem zapotrzebowania żywieniowego, co miało istotne znaczenie przy tworzeniu grup technologicznych i organizacji hodowli. Krowy rasy HF o zbliżonych wymaganiach żywieniowych były grupowane i razem utrzymywane w boksach. Natomiast krowy NRFxHF nie grupowano pod względem zapotrzebowania energetycznego, a żywiono jedynie w oparciu o tradycyjne metody, z wykorzystaniem plonów z własnych gospodarstw. Podobny system chowu, połączony z wypasem pastwiskowym, wykorzystywano u krów PR, co u większości osobników tej rasy w pełni zaspokajało potrzeby energetyczne, ze względu na stosunkowo niską wydajność mleczną. Jednakże nie było to możliwe w przypadku krów NRFxHF, które charakteryzowały się średnią wydajnością mleczną, dwukrotnie wyższą niż krowy rasy PR. Można więc stwierdzić, że średni poziom wydajności mlecznej (6 500 kg mleka w trakcie 330-dniowej laktacji) zwiększył znacznie wymogi energetyczne zwierząt, doprowadzając do sytuacji, w której trudno było je pokryć przy wykorzystaniu żywienia tradycyjnego. Rozwijający się deficyt energetyczny doprowadził do uruchomienia mechanizmów kompensacyjnych, w tym lipolizy. Jej konsekwencją było obniżenie kondycji ciała oraz wzrost stężenia we krwi BHM. Uzyskane wnioski są zgodne z poglądami Gillunda i wsp. (2001), którzy wskazują na istotne znaczenie żywienia, a szczególnie ograniczeń geograficznych w zakresie doboru pasz, w rozwoju ketozy u krów o wydajności mlecznej przekraczającej 6 000 kg mleka w trakcie 305-dniowej laktacji.

Intensywność procesów biologicznych zachodzących w organizmie krów mlecznych w okresie okołoporodowym należy oceniać nie tylko w odniesieniu do wskaźników zmiany kondycji ciała, ale również stanu odżywienia organizmu. W przeprowadzonych badaniach wykorzystano w tym celu oznaczenie stężenia białka całkowitego w surowicy. Według Klebaniuk i Rocki (2011) stężenie białka całkowitego we krwi krów mlecznych może ulec fizjologicznemu zmniejszeniu w okresach zwiększonego zapotrzebowania metabolicznego. Natomiast Kupczyński i Chudoba-Drozdowska (2002) wymienili wśród czynników wpływających na wartości tego parametru między innymi etap laktacji, wiek i żywienie krów, a także porę roku, która wpływa na jakość pasz. W badaniach własnych u krów ras PR oraz HF stwierdzono poporodowy spadek stężenia białka całkowitego w stosunku do zasuszenia. Uzyskane wyniki są zgodne z obserwacjami Górski i Saba (2012), Piccione i wsp. (2012) oraz Tόthova i wsp. (2016). Jak podali Kupczyński i Chudoba-Drozdowska (2002) we wczesnej laktacji dochodzi do dystrybucji osoczowych albumin i globulin do gruczołu mlekowego. Opisane zmiany można więc wiązać ze zwiększonym zapotrzebowaniem na białko, w związku z rozpoczęciem laktacji (Heck i wsp., 2009) oraz produkcją bogatej w immunoglobuliny siary (Roubies i wsp., 2006; Mohri i wsp., 2007). Siara zawiera bowiem prawie dwudziestokrotnie więcej albumin i globulin niż mleko (Żukowski, 2006). Podobnych zmian w stężeniu białka całkowitego w surowicy nie stwierdzono u krów rasy NRFxHF. U krów rasy NRFxHF stężenie białka całkowitego w zasuszeniu było niższe niż u krów rasy PR i HF, i przez cały okres doświadczenia utrzymywało się w przedziale referencyjnym zaproponowanym przez Alberghina i wsp. (2011) i Winnicką (2015). Obserwowane różnice we wskaźnikach stanie odżywienia można wiązać z nasilonymi procesami katabolicznymi obserwowanymi u krów rasy NRFxHF, a przejawiającymi się większym spadkiem BCS i wyższym stężeniem BHM u rasy NRFxHF niż u ras PR i FH. Cincović i wsp. (2012) wykazali bowiem, że krowy mleczne obciążone lipolizą oraz ketogenezą mają niższe stężenia białka całkowitego w surowicy w pierwszym tygodniu po porodzie, w porównaniu z krowami nieobciążonymi katabolizmem.

Biorąc pod uwagę stężenie pośrednich metabolitów tłuszczów, stężenie cholesterolu całkowitego, frakcji LDL i HDL oraz trójglicerydów w surowicy krów ras PR, HF i NRFxHF były zbliżone, co wskazuje na efektywność mechanizmów utrzymujących homeostazy tłuszczy. We wszystkich badanych grupach obserwowano poporodowe obniżenie stężenia cholesterolu całkowitego w surowicy, istotne statystycznie u krów ras PR i HF. Również

Castillo i wsp. (2005) opisali poporodowy spadek stężenia cholesterolu całkowitego i trójglicerydów w surowicy krów mlecznych w stosunku do zasuszenia. We wszystkich badanych grupach w zasuszeniu i po porodzie stężenie cholesterolu całkowitego było zgodne z doniesieniami innych autorów (Grummer, 1993; Pysera i Opałka, 2000; Castillo i wsp., 2005; Quiroz-Rocha i wsp., 2009). Według Kim i Suh (2003) to właśnie stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy stanowi miarodajny wskaźnik bilansu energetycznego, również w przypadku krów mlecznych. We wszystkich badanych grupach krów mlecznych, pomimo znacznego poporodowego spadku stężenia cholesterolu całkowitego we krwi, wynoszącego od 33 do 45% w stosunku do odpowiednich wartości z okresu zasuszenia, stężenia cholesterolu nie odbiegały od zakresów referencyjnych zaproponowanych przez Meyera i Harleya (1998) oraz Baumgartnera (2005). Poporodowy spadek całkowitego stężenia cholesterolu wynika ze zmian metaboliczno-endokrynologicznych, typowych dla okresu przejściowego, a w szczególności związanych z wytwarzaniem siary, zapoczątkowaniem i utrzymaniem laktacji (Van Dorland i wsp., 2009; Piccione i wsp., 2011). Na poporodowy spadek stężenia cholesterolu wpływa również zwiększona sekrecja glukagonu, doprowadzająca do efektu mobilizacji tkanki tłuszczowej (Cavestany i wsp., 2005). Stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy po osiągnięciu wartości minimalnych we wczesnym okresie poporodowym, ulegało następnie stopniowemu wzrostowi. Tendencja wzrostowa utrzymywała się do dziewiątego tygodnia laktacji (Guedon i wsp., 1999; Nath i wsp. (2005). Souza i Junior (2009) oraz Garcia i wsp. (2011), badając krowy mleczne rasy Holsztyńskiej, potwierdzili ciągły wzrost całkowitego stężenia cholesterolu w kolejnych dniach laktacji powiązany z postępującym wzrostem wydajności mlecznej. Zgodnie z doniesieniami Precht (2001) cholesterol jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania gruczołu mlekowego, a synteza 100 g tłuszczu mleka wymaga średnio 200-300 mg cholesterolu. Jednak dawka pokarmowa krów mlecznych charakteryzuje się niską zawartością cholesterolu. Według Pushpakumara i wsp. (2003) oraz Sepulveda-Varasa i wsp. (2015) stężenie cholesterolu całkowitego we krwi jest skorelowane ze spożyciem paszy przez krowy mleczne i powinno różnić się pomiędzy grupami produkcyjnymi oraz systemami żywienia. W badaniach własnych nie potwierdzono podobnych różnic zarówno w odniesieniu do systemu utrzymania i żywienia, jak również rasy i wydajności mlecznej. Wykazano natomiast najwyższe całkowite stężenie cholesterolu, porównywalne u wszystkich badanych ras, w szczycie laktacji. Z kolei według Murondoti i wsp. (2004) oraz Meglia i wsp. (2005) niższe stężenie lipidów w osoczu krów mlecznych może wynikać ze zmniejszonego pobierania suchej masy 98

w okresie okołoporodowym. Wyniki badań własnych uzyskane w cyklu produkcyjnym są zbieżne z obserwacjami Kesslera i wsp. (2014) oraz Arfuso i wsp. (2016). W bliskości porodu i we wczesnej laktacji, autorzy ujawnili u krów mlecznych tendencję do obniżenia się we krwi stężenia cholesterolu całkowitego, LDL, trójglicerydów, którą można powiązać z fizjologicznymi zmianami w szlakach metabolicznych, typowymi dla tego etapu cyklu produkcyjnego. Podobne wyniki uzyskali również inni autorzy (Guedon i wsp., 1999; Nath i wsp., 2005; Bertoni i wsp., 2008; Souza i Juniora, 2009; Cozzi i wsp., 2011; Garcia i wsp., 2011; Tracz i wsp. 2012). Można więc stwierdzić, że zależności pomiędzy całkowitym stężeniem cholesterolu, a rasą bydła mlecznego we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji, a więc w okresie o największym zróżnicowaniu badanych grup pod względem żywienia i dziennej produkcji mleka, wymaga dalszych badań.

Klebaniuk i Rocki (2011) zwrócili uwagę, że w organizmie krów mlecznych bardzo istotna jest proporcja pomiędzy frakcjami cholesterolu. Wskaźnikiem prawidłowego metabolizmu tłuszczy jest stosunek procentowy stężenia HDL do cholesterolu całkowitego wynoszący co najmniej 40%. W badaniach własnych, dla trzech badanych ras, omawiany stosunek HDL/cholesterol całkowity wynosił około 74%, 81% i 74% odpowiednio w zasuszeniu, wczesnej laktacji i w szczycie laktacji. Uzyskane wyniki potwierdzają prawidłowe działanie mechanizmów powiązanych z gospodarką lipidową u krów rasy PR, HF oraz NRFxHF.

Po porodzie, w stosunku do zasuszenia, obserwowano istotny spadek stężenia trójglicerydów w surowicy wszystkich grup krów mlecznych. Średnie wartości stężenia trójglicerydów w badaniach własnych charakteryzowały znaczne wartości odchylenia standardowego, świadczące o niezależnym od rasy dużym metabolicznym zróżnicowaniu osobników. Podobną dużą zmienność wyników pomiarów stężenia trójglicerydów w surowicy opisali Souza i Juniora (2009) w okresie okołoporodowym u krów mięsnych. Jednak w obydwu przypadkach uzyskane wyniki były zbieżne z obserwacjami innych autorów (Park i wsp., 2010; Mikuła i wsp., 2011; Piccione i wsp., 2012; Arfuso i wsp., 2016; Hristovska i wsp., 2017). Djoković i wsp. (2014) wykazali analogiczną tendencję zmian stężenia trójglicerydów w surowicy w przebiegu cyklu produkcyjnego u krów mlecznych, charakteryzujących się średnią wydajnością mleczną zbliżoną do rasy NRFxHF. Uruchomione w okresie okołoporodowym rezerwy tłuszczowe zapewniały pokrycie znacznych wymagań metabolicznych związanych z rozpoczynającą się laktacją (Nazifi i wsp., 99

2002; Roche i wsp., 2009). Jednak zgodnie z poglądami Van den Top i wsp. (2005) obserwowany spadek stężenia trójglicerydów we krwi krów mlecznych mógł wynikać ze wzrostu aktywności lipazy lipoproteinowej w gruczole mlekowym. Jak podali Park i wsp. (2010) w surowicy krów mlecznych dochodzi do spadku stężenia trójglicerydów po porodzie, które utrzymuje się na niskim poziomie w okresie pierwszych kilku tygodni laktacji, ze względu na wykorzystanie tróglicerydów do produkcji mleka.

Według Mutlu i Abdullaha (1998) również zbyt niskie stężenie trójglicerydów w surowicy, utrzymujące się poniżej 0,12 mmol/l, może świadczyć o zaburzeniach metabolicznych krów mlecznych. Djoković i wsp. (2005) zwrócili uwagę na zwiększone ryzyko kumulacji trójglicerydów w hepatocytach przy niskim stężeniu obwodowym. Veenhuizen i wsp. (1991) oraz Jorritsma i wsp. (2001) sugerują, że predyspozycje do akumulacji trójglicerydów w wątrobie krów zależą w dużym stopniu od cech osobniczych i mogą być różne w obrębie jednego stada, przy zachowaniu tych samych warunków utrzymania i żywienia. Ryzyko kumulacji trójglicerydów jest najwyższe po porodzie, kiedy fizjologicznie dochodzi do uruchomienia mechanizmów związanych z mobilizacją kwasów tłuszczowych, oraz w przebiegu ketozy (Djoković i wsp., 2007; Djoković i wsp., 2013b). Djoković i wsp. (2014) wykazali ujemną korelację pomiędzy stężeniem trójglicerydów a BHM w surowicy krów na różnych etapach laktacji. Autorzy zasugerowali, że wiarygodnym wskaźnikiem umożliwiającym monitorowanie przebiegu mobilizacji kwasów tłuszczowych u krów mlecznych jest wzajemna proporcja stężenia trójglicerydów i BHM (Djoković i wsp., 2013a). Współwystąpienie stężenia BHM w surowicy powyżej 1,2 mmol/l i stężenia trójglicerydów 0,12 mmol/l może stanowić wyznacznik stłuszczenia wątroby u krów mlecznych (González i wsp., 2011; Sevinc i wsp., 1998; Xu i wsp., 2008). W przeprowadzonych badaniach własnych, podobnie jak w badaniach Gonzáleza i wsp. (2011), część wyników mieściła się poniżej omawianego progu zarówno w pierwszym tygodniu po porodzie, jak i w szczycie laktacji. Średnie stężenie trójglicerydów niższe niż 0,12 mmol/l stwierdzono u krów ras PR i HF we wczesnej laktacji oraz u krów ras PR i NRFxHF w szczycie laktacji. Jednocześnie średnie stężenie BHM wyższe niż 1,2 mmol/l stwierdzono jedynie u krów rasy NRFxHF we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji. Można więc przypuszczać, że krowy rasy NRFxHF w szczycie laktacji mogą być narażone na wystąpienie stłuszczenia wątroby będące wynikiem nasilonych procesów mobilizacji kwasów tłuszczowych (Sevinc i wsp., 2003; Šamanc i wsp., 2011).

100

W przeprowadzonych badaniach u krów ras PR oraz NRFxHF stwierdzono wzrost stężenia związków TBA-reaktywnych w pierwszym tygodniu po porodzie w stosunku do okresu zasuszenia. Również Saleh i wsp. (2007) stwierdzili u krów w dniu porodu istotny wzrost stężenia TBARS we krwi, i tym samym najwyższe wartości w całym cyklu produkcyjnym. Podobne obserwacje przedstawili Bernabucci i wsp. (2005) u wysokowydajnych krów rasy Holsztyńskiej oraz Simonow i wsp. (2015) u krów rasy Ukraińskiej Czarno-Białej o średniej wydajności mlecznej. W badaniach własnych zarówno we wczesnej laktacji jak i w szczycie laktacji wykazano wyższe stężenie TBARS u krów rasy NRFxHF niż u krów ras PR i HF. W badaniach Saleha i wsp. (2007) nie stwierdzono różnic w stężeniu TBARS pomiędzy rasą rodzimą, a krzyżówką rasy rodzimej z rasą fryzyjską w okresie przedporodowym, w dniu porodu, we wczesnej laktacji oraz w środku laktacji. Można więc zgodzić się z poglądami Wullepita i wsp. (2009) według których wydajność mleczna krów ma niewielki wpływ na stężenie końcowych produktów peroksydacji lipidów. Pogląd ten jest w opozycji do obserwacji Sharma i wsp. (2011) według których krowy wysokowydajne są bardziej narażone na wpływ wolnych rodników, co doprowadza do nasilenia procesów peroksydacji i powstawania zwiększonej ilości produktów ubocznych, głównie aldehydu malonowego (MDA). Również Kapusta i wsp. (2018), badając rasę HF, wykazali najwyższe stężenia MDA u krów charakteryzujących się najwyższą dobową wydajnością mleczną. W badaniach własnych pomimo braku bezpośredniego związku pomiędzy wydajnością mleczną a stężeniem TBARS, w tym MDA, stwierdzono dużą zmienność osobniczą otrzymanych wyników, szczególnie we wczesny okresie poporodowym. O znacznej zmienności świadczyły wysokie odchylenia standardowe od średniej wartości stężenia TBARS uzyskane u krów wszystkich trzech ras. Podobne obserwacje opisali Castillo i wsp. (2005) badając stężenie MDA u krów wysokowydajnych. Autorzy przedstawili średnie stężenia MDA wraz z odchyleniem standardowy wynoszący blisko 50% wartości średniej. Opisane wysokie wartości odchyleń standardowych mogą być związane z różnicami w dobowej wydajności mlecznej pomiędzy poszczególnymi osobnikami lub odmienną wrażliwość osobniczą krów mlecznych na stres oksydacyjny związany z porodem oraz początkiem laktacji. Również Hernandez i wsp. (2006) oraz Konvična i wsp. (2015) zwrócili uwagę na predyspozycje osobnicze do wzrostu stężenia TBARS i uznali, że nasilenie peroksydacji lipidów w okresie okołoporodowym zależy nie tylko od etapu produkcyjnego, ale również od cech osobniczych (Gaál i wsp., 2006; Vlizlo i wsp., 2015). Jednak według Simonowa i wsp. (2015) to fazy cyklu produkcyjnego wpływają istotnie na intensywność 101

procesów prooksydacyjnych i peroksydację lipidów u krów mlecznych. Bernabucci i wsp. (2005) zaobserwowali wzrost stężenia związków TBA-reaktywnych już piątego dnia przed wycieleniem, podczas gdy Sharma i wsp. (2011) wskazali wczesny okres poporodowy oraz początek laktacji jako najbardziej krytyczny pod względem wytwarzania TBARS. Według autorów w pierwszych tygodniach po porodzie dochodzi najczęściej do zaburzenia równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej ze względu na zwiększoną podatność krów mlecznych na choroby związane z produkcją. Zgłaszane przez innych autorów wartości TBARS u bydła różnią się w zależności od etapu produkcyjnego oraz zastosowanej metody analitycznej (Bernabucci i wsp., 2002; Castillo i wsp., 2005; Castillo i wsp., 2006; Konvična i wsp., 2015; Rezaei i Dalir-Naghadeh, 2006; Saleh i wsp., 2007). Porównanie wyników uzyskanych w różnych badaniach jest utrudnione ze względu na brak normalizacji w zakresie analizy stężenia związków TBA-reaktywnych (Richard i wsp., 1992). Wong i wsp., (1987), Aoki i wsp. (2008) oraz Celi (2011) kwestionowali wykorzystanie stężenia osoczowych związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym w ocenie nasilenia procesów związanych z peroksydacją lipidów, zachodzących w warunkach in vivo. Za główny powód krytyki podawano małą specyficzność oznaczenia, związaną z wpływem na ostateczny wynik różnych aldehydów, nie tylko MDA. Stężenie MDA stanowi powszechnie uznany biomarker wolnorodnikowych uszkodzeń lipidów oraz stresu oksydacyjnego (Ayala i wsp., 2014; Barrera i wsp., 2018; Tiwari i wsp., 2013). Jednak pomimo opisywanych ograniczeń w wielu aktualnych badaniach to właśnie stężenie TBARS jest wykorzystywane do oszacowania stężenia MDA w osoczu i oceny uszkodzeń oksydacyjnych (Kapusta i wsp., 2018; Kumar i wsp., 2019; Gunawardena i wsp., 2019; Pavlović i wsp., 2019). Pomiar stężenia związków TBA-reaktywnych umożliwia bowiem przeprowadzanie wiarygodnej analizy porównawczej materiału zebranego w obrębie jednego układu doświadczalnego. Według Armstronga i Brownego (1994) oraz Ayala i wsp. (2014) stężenie TBARS można uznać za dobry ogólny wskaźnik nasilenia stresu oksydacyjnego, bowiem uwzględnia wiele produktów końcowych utleniania lipidów, włączając dominujący pod względem ilościowym MDA. Ponadto Wernicki i wsp. (2006) wykazali, dodatnią korelację pomiędzy stężeniem TBARS a koncentracją kortyzolu we krwi cieląt w sytuacji stresu związanego z transportem. W badaniach własnych wykazano dodatnią korelację pomiędzy stężeniem TBARS a stężeniem glutationu, średnią u rasy PR i silną u rasy NRFxHF. Jednak u obydwóch ras nie stwierdzono zmian stężenia glutationu w kolejnych okresach cyklu produkcyjnego, podczas gdy stopniowy wzrost stężenia glutationu w okresie poporodowym aż do szczytu laktacji 102

obserwowano u krów rasy HF. U krów rasy HF z kolei nie wykazano korelacji pomiędzy stężeniem TBARS a stężeniem glutationu. Obserwowane zależności pomiędzy stężeniem glutationu, stężeniem TBARS oraz aktywnością reduktazy glutationowej wydają się być istotne z punktu widzenia reakcji zmian statusu antyoksydacyjnego wysokowydajnych krów mlecznych. Badania własne, podobnie jak badania Zhao i wsp. (2019), wskazują, że u krów mlecznych wyższa kondycja ciała może wiązać się z wyższymi stężeniami we krwi związków TBA-reaktywnych i BHM oraz wyższą aktywnością SODu w surowicy. Jednak hipoteza ta wymaga dalszych badań przeprowadzonych w bardziej rozbudowanym układzie doświadczalnym.

Analizę porównawczą profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych krwi obwodowej pobranej od krów rasy polskiej czerwonej i krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej przeprowadzono w okresie zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji. W dostępnej literaturze brakuje doniesień opisujących identyfikację genów, których patologiczna ekspresja może prowadzić do zaburzeń regulacji gospodarki oksydacyjno- antyoksydacyjnej u bydła mlecznego, zwłaszcza w kontekście zmienności w kluczowych okresach cyklu produkcyjnego oraz wydajności mlecznej. Przeprowadzona analiza profilu transkryptomicznego stanowi nowatorskie rozszerzenie złożonego panelu parametrów laboratoryjnych, zgodne z wielokierunkową koncepcją oceny statusu antyoksydacyjnego bydła mlecznego (van Hal i wsp., 2000).

W prezentowanych badaniach nie stwierdzono różnic w profilu transkryptomicznym komórek jądrzastych krwi obwodowej pobranej od krów ras PR i HF dla ekspresji genów związanych z utrzymaniem równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej. Według Kuge i Jones (1994) oraz Aslund i wsp. (1999) stres oksydacyjny, zaburzający mechanizmy antyoksydacyjne oparty na układzie glutationu, doprowadza do aktywacji czynników transkrypcyjnych AP-1 i NF-ĸB, fosfatazy tyrozynowej białka, rodziny kinaz Src, JNK i p38, szlaków sygnałowych MAPK. Galter i wsp. (1994) podali, że silne zakłócenie równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej prowadzi do zmiany ekspresji genów typową dla stanów chorobowych. Brak podobnych różnic u zdrowych klinicznie krów mlecznych w kolejnych etapach cyklu produkcyjnego wskazuje na wydajność mechanizmów antyoksydacyjnych u obydwu badanych ras krów. Można również przypuszczać, że zarówno mechanizmy antyoksydacyjne na poziomie transkryptomicznym jak również regulacja genów kodujących przeciwutleniacze są zbliżone u obydwu ras: o niskiej i wysokiej wydajności mlecznej. 103

Uzyskane wyniki potwierdzają spostrzeżenia przeprowadzone podczas oceny aktywności antyoksydantów enzymatycznych i stężeń antyoksydantów nieenzymatycznych zgodnie z którymi obserwowane różnice w wartościach parametrów statusu antyoksydacyjnego mogą wynikać z przejściowych zmian metabolicznych, które mieszczą się w granicach możliwości kompensacyjnych organizmu. Dlatego nie można zgodzić się z poglądami Søndergaarda i wsp. (2002) zgodnie z którymi zwiększona produkcyjność u krów mlecznych prowadzi do rozwoju stresu metabolicznego co znajduje odzwierciedlenie w różnicach wartości parametrów wykorzystywanych podczas monitorowania statusu metabolicznego krów.

Podczas analizy porównawczej profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych krwi obwodowej obserwowano interesujące różnice międzyrasowe, niebędące celem pracy. Obserwowane różnice międzyrasowe w profilu transkryptomicznego mogą mieć związek z omawianymi wcześniej metabolicznymi różnicami międzyrasowymi. Uzyskane wyniki, w szczególności różnice w ekspresji 7 genów szlaku sygnalizacji adiponektyny: NR1H3, SLC25A20, CPT1A, SUCLA2, IL2RA, PDK4, MITF, sugerują odmienne szkaki uwrażliwiania komórek na działanie insuliny u bydła rasy PR i HF. Adiponektyna jest hormonem polipeptydowego wydzielanym przez tkankę tłuszczową, zaangażowanym w szereg procesów metabolicznych, szczególnie przemianę glukozy i kwasów tłuszczowych w wątrobie i mięśniach (Chilliard i wsp., 2001; Kadowaki i Yamauchi, 2005; Vincent i Taylo, 2006; Roche i wsp., 2008). U krów mlecznych adiponektyna może być istotnym czynnikiem koordynujących homeostazę energetyczną (Chilliard i wsp., 2001; Ailhaud, 2006) i wpływającym na dostępność składników odżywczych służących do syntezy mleka (Singh, 2014). Według Krumma i wsp. (2017) produkcja adiponektyny w okresie okołoporodowym, a tym samym jej stężenie w osoczu krów mlecznych, jest zależna od bilansu energetycznego i ulega wahaniom w cyklu produkcyjnym (Raddatz i wsp., 2008; Giesy i wsp., 2012; Ohtani i wsp., 2012). Jednocześnie wzrost stężenia adiponektyny w surowicy ponad poziom referencyjny ogranicza wydajność mleczną (Kalamaras, 2012). Kalamaras (2012) wykazał bowiem ujemną korelację pomiędzy stężeniem adiponektyny i hormonu wzrostu w surowicy krów wysokowydajnych, podczas gdy Nilsson i wsp. (2005) opisali hamujący wpływ hormonu wzrostu i prolaktyny na ekspresję genów adiponektyny i jej obwodowe stężenie. Można więc uznać, że hormon wzrostu i prolaktyna są inhibitorami syntezy adiponektyny, biorącymi pośredni udział w mobilizacji kwasów tłuszczowych w okresie okołoporodowym u krów mlecznych (Nilsson i wsp., 2005; Kalamaras, 2012;

104

Krumm i wsp., 2017). U krów wysokowydajnych wysokie stężenia hormonu wzrostu i prolaktyny są uwarunkowane genetycznie i wynikają z selekcji hodowlanej pod kątem wydajności mlecznej (Nebel i McGilliard, 1993; Wachter i wsp., 1999; Veerkamp i wsp., 2003; Sgorlon i wsp., 2015). Można więc przypuszczać, że obserwowane w badaniach własnych różnice w ekspresji genów szlaku sygnalizacji adiponektyny są związane z utrwaloną w procesie hodowlanym, wysoką wydajnością mleczną krów rasy HF. W prezentowanej pracy u krowy rasy HF stwierdzono dwukrotnie wyższą dobową wydajność mleczną podczas szczytu laktacji oraz trzykrotnie większą produkcję mleczną w czasie całej laktacji w porównaniu do krów rasy PR. U krów rasy HF stwierdzono również wyższą zawartość tłuszczu w mleku niż u krów rasy PR. Obserwowane różnice produkcyjne mogą być związane z odmiennym zaangażowaniem szlaków sygnalizacyjnych metabolizmu tłuszczy i gospodarki energetycznej organizmu (Lemor i wsp., 2009; Lee i Shao, 2012). Rola adiponektyny w regulacji gospodarki lipidowej u krów ras PR i HF w zasuszeniu oraz laktacji, zasygnalizowana w prezentowanej pracy, wymaga dalszych badań w ukierunkowanym modelu doświadczalnym.

Niezależnie od obserwacji dotyczących profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych krwi obwodowej, prowadzonych pod kątem ekspresji genów związanych z utrzymaniem równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej oraz regulacji metabolizmu tłuszczy, pomiędzy krowami ras PR i HF wykazano różnicę w ekspresji genów związanych z procesami komórkowymi (TPM4, MYO6) oraz sygnalizacją receptorową (IL2RA).

Genu IL2RA koduje podjednostkę α receptora IL-2, która jest niezbędna w reakcji wiązania IL-2 z komórkami efektorowymi (Maślanka i wsp., 2014). Wiązanie IL-2 jest zasadniczym etapem w inicjacji odpowiedzi immunologicznej. Ekspresja IL2RA na powierzchni komórki ma więc kluczowe znaczenie w aspekcie utrzymania funkcji odpornościowej oraz stanu homeostazy organizmu (Goudy i wsp., 2013). IL2RA bierze również udział, na drodze kontroli aktywności komórek T regulatorowych, w regulacji tolerancji immunologicznej. Według Zoldan i wsp. (2014) wzrost ekspresji IL2RA u krów mlecznych ma miejsce podczas nasilenia stanu zapalnego, ze względu na obecność IL2RA na granulocytach obojętnochłonnych. Wykazane w badaniach własnych różnice w ekspresji IL2RA pomiędzy bydłem rasy PR i HF mogą wskazywać na odmienną regulację mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono różnic w stanie zdrowia krów obydwu ras, zarówno w badaniu klinicznym jak 105

i hematologicznym we wszystkich badanych etapach cyklu produkcyjnego. Pomimo tego, w kolejnych badaniach warto zwrócić uwagę na sugerowany związek pomiędzy inicjacją odpowiedzi immunologicznej a wydajnością krów mlecznych.

Geny TPM4 i MYO6 kodują białka tropomiozynę 4 i miozynę 6 które są składnikami strukturalnymi mięśni gładkich i mięśni poprzecznie prążkowanych. Tropomiozyna 4 w komórkach mięśniowych wiąże aktynę i uczestniczy w skurczu mięśni (Mills i wsp., 2010; Kabbage i wsp., 2013), a w komórkach innych niż miocyty jest zaangażowana w procesy związane ze stabilizowaniem i remodelowaniem cytoszkieletu, które umożliwiają migrację komórek (Dunn i wsp., 2006; Hundt i wsp., 2016). Z kolei miozyna 6 warunkuje aktywność ruchową mikrotubul i uczestniczy w sygnalizacji komórkowej, endocytozie, regulacji sekrecji, transporcie wewnątrzkomórkowym, ukierunkowanej migracji komórek oraz autofagii (Masters i wsp., 2017; Tumbarello i wsp., 2012). W stanach patologicznych zaburzenia ekspresji TPM4 i MYO6 stwierdzono podczas badań nad inwazyjnością i rozwojem raka u ludzi. W dostępnej literaturze brakuje informacji dotyczących ekspresji oraz funkcji TPM4 i MYO6 u bydła mlecznego, zarówno podczas fizjologicznego cyklu produkcyjnego, jak również w stanach patologicznych, także tła nowotworowego. Wykazane różnice w ekspresji TPM4 i MYO6 pomiędzy bydłem rasy PR i HF są pierwszym doniesieniem o możliwym zróżnicowaniu międzyrasowym u bydła mlecznego. Obserwacje te mogą mieć związek z zapadalnością na choroby nowotworowe oraz długowiecznością obydwu ras. Krowy rasy PR charakteryzują się większą rezystencją na choroby oraz niesprzyjające warunki środowiskowe, w porównaniu do bydła wysokowydajnego (Adamczyk i wsp. 2008). Rasa PR uważana jest za długowieczną, unikalną pod względem długości przeżycia. Krowy rasy PR zachowujących dobry stan zdrowia oraz płodność w wieku powyżej 12 lat i są użytkowane mlecznie przeciętnie 5-7 laktacji. Z kolei krowy rasy HF są użytkowane około 3 laktacje i brakowane ze stada przeciętnie w wieku 5-6 lat (Whitaker i wsp., 2005; Litwińczuk i Barłowska, 2015). Porównanie ras PR i HF pod kątem zapadalności na choroby nowotworowe jest utrudnione, ze względu na brak wiarygodnych danych i wczesne brakowania krów w hodowli mlecznej. Z tego względu wykazane różnice w ekspresji genów TPM4 i MYO6 stanowią interesujący temat badawczy, który powinien zostać poruszony w kolejnych doświadczeniach.

Wykorzystanie mikromacierzy oligonukleotydowych umożliwiło jednoczesne zbadanie ekspresji znacznej ilości genów (Brown i Botstein, 1999; Kazula, 2009; Lipshutz 106

i wsp., 1999; Lockhart i Winzeler, 2000; Lomnytska i wsp., 2011) oraz wykazanie interesujących zmienności w obrębie genów związanych ze szlakiem sygnalizacji adiponektyny oraz pojedynczych genów związanych z procesami komórkowymi, szlakami nocyceptywnymi oraz sygnalizacją receptorową. W prezentowanym układzie doświadczalnym wykazano różnice w ekspresji genów w komórkach jądrzastych krwi obwodowej bydła pomiędzy rasami PR i HF dla 85 transkryptów reprezentujących 84 znane geny. Wobec znacznej ilości przebadanych genów w trakcie jednego eksperymentu obserwowana zmienność wydaje się niewielka. Analiza całego transkryptomu krwi obwodowej, przeprowadzona przez Weikarda i wsp. (2015), wykazała zmianę w 2235 loci w późnej ciąży i 208 loci po porodzie u krów mlecznych poddanych profilaktycznemu szczepieniu przeciw wirusowej biegunce bydła, w porównaniu do krów nieszczepionych. Cheng i wsp. (2015) obserwowali zmianę ekspresji 420 genów krów rasy Holsztyńskiej w wyniku zarażenia M. bovis. Z kolei Kolli i wsp. (2013) dowiedli, że stres cieplny doprowadza do zmiany ekspresji 460 transkryptów w komórkach jądrzastych krwi obwodowej bydła zebu. Można więc stwierdzić, że oddziaływanie czynników zewnętrznych, takich jak stres cieplny czy kontakt z antygenami patogenów bydlęcych, ma większy wpływ na profil transkryptomiczny bydła niż selekcja rasowa (Tanaka i wsp., 2011). Obserwowane różnice pomiędzy rasą PR i HF mogą wynikać z zastosowania odmiennych metod hodowlanych w procesie selekcji obydwu ras. U bydła rasy HF, w ostatnich czterech dekadach, postęp hodowlany przebiegał bardzo dynamicznie, podczas gdy u rasy PR był ograniczony do minimum ze względu na warunki hodowli zachowawczej. Omawiane różnice międzyrasowe w profilu transkryptomicznego komórek jądrzastych krwi obwodowej wymagają dalszych badań i walidacji metodą RT-PCR.

107

VII. Podsumowanie

W wyniku porównania statusu antyoksydacyjnego u krów mlecznych ras: polskiej czerwonej, holsztyńsko-fryzyjskiej i krzyżówki rasy czerwonej norweskiej z holsztyńsko- fryzyjską w różnych okresach cyklu produkcyjnego wykazano rozwój standardowej odpowiedzi organizmu na stres towarzyszący rozpoczęciu laktacji charakterystyczny dla reakcji adaptacji. Odpowiedź ta, obserwowana u wszystkich badanych ras, angażowała odmienne mechanizmy antyoksydacyjne. U krów rasy PR, reprezentujących bydło o niskiej wydajności mlecznej wykazano skuteczność CAT i SOD-1 jako głównych składowych mechanizmów antyoksydacyjnych. U wysokowydajnych krów rasy HF za główne mechanizmy antyoksydacyjne uznano aktywność CAT, SOD-1 i GR oraz reaktywność glutationu. Z kolei u krów rasy NRFxHF, o średniej wydajności mlecznej, uzyskane wyniki wskazują na istotną rolę mechanizmów opartych na aktywności CAT i SOD-3 jako głównych czynników antyoksydacyjnych oraz mechanizmów opartych na stężeniu kwasu moczowego i albumin jako pomocniczych czynników zabezpieczających istotne biologicznie makrocząsteczki przed uszkodzeniem oksydacyjnym w reakcji z RFT.

W tym samym okresie produkcyjnym, w warunkach fermowych, krowy mleczne są narażone na najbardziej dynamiczne zmiany metaboliczne i związane z nimi choroby okresu okołoporodowego. W prezentowanej pracy nie stwierdzono objawów klinicznych chorób metabolicznych u krów ras PR, HF i NRFxHF we wszystkich badanych okresach cyklu produkcyjnego. Również badane parametry hematologiczne przez cały okres doświadczenia mieściły się w przedziale wartości referencyjnych właściwych dla kolejnych okresów. We wczesnej laktacji u krów rasy NRFxHF obserwowano bardziej intensywną lipolizę niż u krów rasy HF, o czym świadczy wyższy wskaźnik utraty kondycji ciała. Również u krów rasy NRFxHF stwierdzono w okresie okołoporodowym najwyższe stężenie BHM wskazujące na podkliniczną ketozę. Obserwowane różnice we wskaźnikach stanu odżywienia, również stężenia białka całkowitego, można wiązać z nasilonymi procesami katabolicznymi obserwowanymi u krów rasy NRFxHF, a przejawiającymi się większym spadkiem BCS i wyższym stężeniem BHM u rasy NRFxHF niż u ras PR i HF. Z tego względu krowy rasy NRFxHF uznano za najbardziej podatne na rozwój stresu oksydacyjnego wynikającego ze znacznej ilości generowanych RFT i/lub wyczerpania mechanizmów obrony antyoksydacyjnej. U krowy rasy NRFxHF w szczycie laktacji stwierdzono objawów osłabienia aktywności SOD-3, przedłużającej się wysokiej aktywności CAT, wzrost stężenia 108

kwasu moczowego i albumin oraz dodatnie korelacje pomiędzy stężeniem kwasu moczowego i BHM jak również ujemne korelacje pomiędzy aktywnością SOD-1 a stężeniem BHM. Również procesy mobilizacji kwasów tłuszczowych, najbardziej nasilone w szczycie laktacji u krów rasy NRFxHF, nie prowadziły do zaburzeń homeostazy organizmu. Co więcej nie stwierdzono zależności pomiędzy wydajnością mleczną krów a stężeniem końcowych produktów peroksydacji lipidów mierzoną z wykorzystaniem związków TBA-reaktywnych. Dodatnie korelacje pomiędzy stężeniem TBARS i glutationu u ras PR i NRFxHF oraz zmiany stężenia glutationu obserwowane u rasy HF wskazuje na udział glutationu i reduktazy glutationowej w ochronie antyoksydacyjnej podczas mobilizacji tłuszczy (Pompella i wsp., 2003; Pizzoferrato i wsp., 2007). Uzyskane wyniki wskazują również na zależności pomiędzy wyższymi stężeniami we krwi związków TBA-reaktywnych i BHM oraz wyższą aktywnością SODu w surowicy.

Na podstawie oceny aktywności antyoksydantów enzymatycznych i stężeń antyoksydantów nieenzymatycznych oraz wskaźników klinicznych i podklinicznych zaburzeń metabolicznych u krów badanych ras należy stwierdzić, że obserwowane różnice w wartościach badanych parametrów mogą wynikać z przejściowych zmian metabolicznych, które mieszczą się w granicach możliwości kompensacyjnych organizmu (Sahoo i wsp., 2009). Również wyniki z zakresu transkryptogenomiki są zgodne z wynikami oceny statusu antyoksydacyjnego badanych ras krów mlecznych. Wielokierunkowa koncepcja oceny statusu antyoksydacyjnego bydła mlecznego umożliwiła wykazanie homeostazy prooksydacyjno- antyoksydacyjnej we wszystkich badanych okresach cyklu produkcyjnego, zarówno u rodzimej rasy PR, alternatywnej rasy NRFxHF jak i wysokowydajnych krów rasy HF. Uzyskane wyniki pozwalają stwierdzić, że w prawidłowym procesie produkcji mlecznej w okresie najsilniejszych zmian metabolicznych nie dochodzi do rozwoju stresu oksydacyjnego.

109

VIII. Wnioski

Na podstawie przeprowadzonych badań wyprowadzono następujące wnioski:

1. Mechanizmy antyoksydacyjne u krów rasy rodzimej - polskiej czerwonej, utrzymywanych w warunkach hodowli ekstensywnej, w dużej mierze zależą od aktywności CAT i SOD-1 i umożliwiają zachowanie homeostazy oksydacyjnej w okresie nasilonych przemian metabolicznych związanych z porodem i rozpoczęciem laktacji.

2. Mechanizmy antyoksydacyjne u krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej, będących przykładem krów wysokowydajnych, umożliwiają zachowanie homeostazy oksydacyjnej porównywalnej do rasy polskiej czerwonej, pomimo większej wydajności mlecznej i dłuższej laktacji. Reakcja adaptacji na stres oksydacyjny związany z początkiem laktacji jest bardziej nasilona i utrzymuje się dłużej u krów rasy HF niż PR i poza aktywnością CAT i SOD-1 angażuje również pulę glutationu we krwi obwodowej.

3. Procesy kataboliczne kwasów tłuszczowych u krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej, będących przykładem krów o umiarkowanej wydajności mlecznej utrzymywanych w warunkach hodowli drobnotowarowej, są we wczesnej laktacji i w szczycie laktacji bardziej nasilone niż u krów rasy polskiej czerwonej. Zachowanie homeostazy oksydacyjnej wymaga wyższej aktywności CAT i utrzymującej się dłużej wyższej aktywności SOD-3 oraz zaangażowania nieenzymatycznych mechanizmów antyoksydacyjnych opartych na zmianach stężenia kwasu moczowego i albumin.

4. Profil transkryptomiczny komórek jądrzastych krwi obwodowej jest zbliżony u krów rasy polskiej czerwonej i holsztyńsko-fryzyjskiej i nie wskazuje na obecność różnic w ekspresji genów związanych z utrzymaniem homeostazy oksydacyjnej w okresie zasuszenia, pierwszym tygodniu po porodzie oraz w szczycie laktacji. Obserwowane różnice w ekspresji genów szlaku sygnalizacji adiponektyny mogą wskazywać na odmienne szlaki uwrażliwiania komórek na działanie insuliny u obydwu ras.

110

IX. Literatura

Abd Ellah M.R. (2016) Oxidant and antioxidants during the transition period in dairy cows. J Adv Vet Res., 6:130-133.

Abd Ellah M.R., Okada K., Yasuda J. (2007) Oxidative stress and bovine liver diseases: role of glutathione peroxidase and glucose 6-phosphate dehydrogenase. Jpn J Vet Res., 54(4):163- 173.

Abramowicz B., Kurek Ł., Lutnicki K. (2019) Haematology in the early diagnosis of cattle diseases - a review. Vet. arhiv, 89:579-590.

Abuelo A., Hernandez J., Benedito J.L., Castillo C. (2013) Oxidative Stress index (OSi) as a new tool to assess redox status in dairy cattle during the transition period. Animal., 7(8): 1374-1378.

Abuelo A., Hernandez J., Benedito J.L., Castillo C. (2015) A pilot study to compare oxidative status between organically and conventionally managed dairy cattle during the transition period. Reproduction in Domestic Animals. Dostęp online: https://doi.org/10.1111/rda.12519.

Adamczyk K., Feleńczak A., Jamrozy J., Szarek J. (2008) Conservation of Polish Red Cattle. Slovak J of Am Sci., 41(2):72-76.

Adams J.D.J., Chang M.L., Klaidman L. (2001) Parkinson’s disease-redox mechanisms. Curr. Med. Chem., 8:809-814.

Adamski M. (2010) Kondycja krów w okresie okołoporodowym a poziom wybranych parametrów krwi i płodności. Wydawnictwo UPW, Wrocław.

Adamski M, Onyszko P (2000) Analiza współzależności kondycji ciała krów czerwono- białych z niektórymi parametrami mleczności i rozrodu. Zeszyty Naukowe Przeglądu Hodowlanego, 51:85-92.

Aengwanich W. (2002) Effect of age on hematological values and blood profile of Holstein Friesian crossbred in Northeastern Thailand. Suranaree J. Sci. Technol., 9:289-292.

Aengwanich W., Chantiratikul A., Pamok S. (2009) Effect of seasonal variations on hematological values and health monitor of crossbred beef cattle at slaughterhouse in northeastern part of Thailand. Am.-Eurasian J. Agric. Environ. Sci., 5:644-648.

Aengwanich W., Kongbuntad W., Boonsorn T. (2011) Effects of shade on physiological changes, oxidative stress, and total antioxidant power in Thai Brahman cattle. Int J Biometeorol., 55:741-748.

Agarwal A., Saleh R.A., Bedaiwy M.A. (2003) Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction. Fertil Steril., 79(4):829-843.

111

Ailhaud G. (2006) Adipose tissue as a secretory organ: from adipogenesis to the metabolic syndrome. C. R. Biol., 329(8):570-577.

Albera E., Kankofer M. (2010) The comparison of antioxidative/oxidative profile in colostrums, milk and blood of early post-partum cows during their first and second lactation. Reprod Domest Anim., 45(6):e417-425.

Albera E., Kankofer M. (2011) The comparison of antioxidative/oxidative profile in blood, colostrum and milk of early post-partrum cows and their newborns. Reprod Domest Anim., 46(5):763-769.

Alberghina D., Giannetto C., Vazzana I., Ferrantelli V., Piccione G. (2011) Reference intervals for total protein concentration, serum protein fractions, and albumin/globulin ratios in clinically healthy dairy cows. J Vet Diagn Invest., 23(1):111-114.

Allain C.C., Poon L.S., Chan C.S., Richmond W., Fu P.C. (1974) Enzymatic determination of total serum cholesterol. Clin Chem., 20(4):470-475.

Allen R.G., Tresini M. (2000) Oxidative stress and gene regulation. Free Radic Biol Med., 28:463-499.

Ambily T.R., Beena V., Karthiayini K., Uma R., Ramnath V., Sunanda C. (2017) Effect of antioxidant supplementation on haematological parameters of transition dairy cattle. International Journal of Science, Environment and Technology, 6(5):2785-2791.

Andersson L. (1988) Subclinical ketosis in dairy cows. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., 4:233-251.

Andersson L., Lundström K. (1984) Effect of energy balance on plasma glucose and ketone bodies in blood and milk and influence of hyperketonemia on milk production of post parturient dairy cows. Zentralbl. Veterinaermed., 31:539–547.

Antončić-Svetina M., Turk R., Svetina A., Gereš D., Rekić B., Juretić D. (2011) Lipid status, paraoxonase-1 activity and metabolic parameters in serum of heifers and lactating cows related to oxidative stress. Res Vet Sci., 90:298-300.

Aoki M., Oshita T., Sakaguchi M. (2008) The comparison of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) concentrations in plasma and serum from dairy cattle. J. Vet. Med. Sci., 70:107–110.

Arfuso F., Fazio F., Levanti M., Rizzo M., Di Pietro S., Giudice E., Piccione G. (2016) Lipid and lipoprotein profile changes in dairy cows in response to late pregnancy and the early postpartum period. Arch. Anim. Breed., 59:429-434.

Armstrong D., Browne R. (1994) The analysis of free radicals, lipid peroxides, antioxidant enzymes and compounds related to oxidative stress as applied to the clinical chemistry laboratory. Adv. Exp. Med. Biol., 366:43-58.

112

Aruoma O.I., Neergheen V.S., Bahorun T., Jen L.S. (2007) Free radicals, antioxidants and diabetes: embryopathy, retinopathy, neuropathy, nephropathy and cardiovascular complications. Neuroembryol Aging, 4:117-137.

Aslund F., Zheng M., Beckwith J., Storz G. (1999) Regulation of the OxyR transcription factor by hydrogen peroxide and the cellular thioldisulfide status. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:6161-6165.

Ayala A., Muñoz M.F., Argüelles S. (2014) Lipid Peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of Malondialdehyde and 4-Hydroxy-2-Nonenal. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 360438):31. Dostęp online: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4066722/.

Baird G.D. (1982) Primary ketosis in the high-producing dairy cow: clinical and subclinical disorders, treatment, prevention, and outlook. J. Dairy Sci., 65:1-10.

Barej W. (1990) Metabolizm energetyczny u wysokomlecznych krów. Prz. Hod., 9-10:12–15.

Barnouin J., Chassagne M. (1998) Factors associated with clinical mastitis incidence in French dairy herds during late gestation and early lactation. Vet Res., 29(2):159-171.

Barrera G., Pizzimenti S., Daga M., Dianzani C., Arcaro A., Cetrangolo G.P. (2018) Lipid Peroxidation-Derived Aldehydes, 4-Hydroxynonenal and Malondialdehyde in Aging-Related Disorders. Antioxidants, 7(8):102.

Bartholomew R.J., Delany A. (1964) Spectrophotometric studies and analytical applications of the protein error of same pH indicators. Proc. Aust. Assoc. Clin. Biochem.,1:64.

Bartosz G. (1998) Rola reaktywnych form tlenu w apoptozie. Postępy Bioch., 44:22-31.

Bartosz G. (2003) Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

Baumgartner W.: Klinische Propädeutic der inneren Krankheiten und Nantkrankheiten der Haus und Heintiere. Parey, Berlin 2005.

Beckman J.S., Koppenol W.H. (1996) Nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271: C1424-1437.

Begley N., Buckley F., Pierce K.M., Fahey A.G., Mallard B.A. (2009) Differences in udder health and immune response traits of Holstein-Friesians, Norwegian Reds, and their crosses in second lactation. J Dairy Sci., 92(2):749-757.

Beisswenger P.J., Szwergold B.S., Yeo K.T. (2001) Glycated proteins in diabetes. Clin. Lab. Med. 21:53-78.

113

Belić B., Cincović M.R., Krćmar L.J., Vidović B. (2011) Reference values and frequency distribution of hematological parameters in cows during lactation and in pregnancy. Contemporary agriculture, 60 (1-2):145-51.

Bell A.W. (1995) Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late pregnancy to early lactation. J. Anim. Sci., 73:2804-2819.

Bernabucci U., Ronchi B., Lacetera N., Nardone A. (2002) Markers of oxidative status in plasma and erythrocytes af transition dairy cows during hot season. J. Dairy Sci., 85:2173- 2179.

Bernabucci U., Ronchi B., Lacetera N., Nardone A. (2005) Influence of body condition score on relationships between metabolic status and oxidative stress in periparturient dairy cows. J Dairy Sci., 88:2017-2026.

Bertoni G., Trevisi E., Han X., Bionaz M. (2008) Effects of inflammatory conditions on liver activity in puerperium period and consequences for performance in dairy cows. J Dairy Sci., 91:3300-3310.

Beyer R.E. (1992) An analysis of the role of coenzyme Q in free radical generation and as an antioxidant. Biochem. Cell Biol., 70:390-403.

Binger C.A.L., Faulkner J.M., Moore R.L. (1927) Oxygen poisoning in mammals. J Exp Med., 45:849-864.

Blum J.W., Bruckmaier R.M., Vacher P.Y., Munger A., Jans F. (2000) Twenty-four-hour patterns of hormones and metabolites in week 9 and 19 of lactation in high-yielding dairy cows fed triglycerides and free fatty acids. Journal of Veterinary Medicine, 47:43-60.

Borkowska D., Januś E., Polski R. (2015) Changes in the body condition and dairy milk yield of cows during lactation depending on the level of fat reserves before calving. Acta Sci. Pol. Zootechnica, 14(1):41-50.

Boveris A. (1984) Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria. Methods Enzymol., 105:429-435.

Boveris A. (1998) Biochemistry of free radicals: from electron to tissues. Medicina, 58:350- 356.

Braun U., Warislohner S., Torgerson P., Nuss K., Gerspach C (2018) Clinical and laboratory findings in 503 cattle with traumatic reticuloperitonitis. BMC Vet. Res. 14:66. Dostęp on line: https://bmcvetres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-018-1394-3.

Brigelius-Flohé R. (1999) Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidase. Free Radic. Biol. Med., 27:951-965.

114

Brown P.O., Botstein D. (1999) Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics, 21:33-37.

Brucka-Jastrzębska E., Kawczuga D., Brzezińska M., Orowicz W., Lidwin-Kaźmierkiewicz M. (2007) Zależność parametrów hematologicznych bydła rasy simental od stanu fizjologicznego. Medycyna Weterynaryjna, 63:1583-1586.

Burfeind O., Suthar V.S., Heuwieser W. (2012) Effect of heat stress on body temperature in healthy early postpartum dairy cows. Theriogenology, 78(9):2031-8.

Burk R.F. (1990) Protection against free radical injury by selenoenzymes. Pharmacol. Therap., 45:383-385.

Burstein M., Scholnick H.R., Morfin R. (1970) Rapid method for the isolation of lipoproteins from human serum by precipitation with polyanions. J Lipid Res., 11:583-595.

Busato A., Faissle D., Küpfer U., Blum J.W. (2002) Body condition scores in dairy cows: associations with metabolic and endocrine changes in healthy dairy cows. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med., 49(9):455-60.

Cadenas E. (1997). Basic mechanisms of antioxidant activity. Biofactors, 6:391-397.

Cadenas E., Davies K. (2000) Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radic. Biol. Med., 29:222-230.

Cao G., Prior R.L. (1998) Comparison of different analytical methods for assessing total antioxidant capacity of human serum. Clinical Chemistry, 44:1309-1315.

Carrier J., Stewart S., Godden S., Fetrow J., Rapnicki P. (2003) Evaluation of three cow-side diagnostic tests for the detection of subclinical ketosis in fresh cows. J. Dairy Sci., 87:3725- 3735.

Castillo C., Benedito J.L., Lopez-Alonso M., Miranda M., Hernandez J. (2001) Importancia del estrés oxidativo en ganado vacuno: en relación con el estado fisiológico (preñez y parto) y la nutrición. Archivos de Medicina Veterinaria, 33:5-20.

Castillo C., Hernandez J., Bravo A., Lopez-Alonso M., Pereira V., Benedito J.L. (2005) Oxidative status during late pregnancy and early lactation in dairy cows. The Veterinary Journal. 169:286-292.

Castillo C., Hernandez J., Lopez-Alonso M., Miranda M., Benedito J.L. (2003) Values of plasma lipid hydroperoxides and total antioxidant status in healthy dairy cows: preliminary observations. Archiv für Tierzucht. 46:227-233.

Castillo C., Hernandez J., Valverde I., Pereira V., Sordillo J., Lopez Alonso M., Benedito J.L. (2006) Plasma malonaldehyde (MDA) and total antioxidant status (TAS) during lactation in dairy cows. research in Vererinary Science, 80(2):133-139.

115

Cavestany D., Blanc J.E., Kulcsar M., Uriarte G., Chilibroste P., Meikle A., Febel H., Ferraris A., Krall E. (2005) Studies of the Transition Cow Under a Pasture-based Milk Production System: Metabolic Profiles. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med., 52(1):1-7.

Celi P. (2011) Biomarkers of oxidative stress in ruminant medicine. Immunopharmacol. Immunotoxicol., 33:233-240.

Celi P., Chauhan S.S., Cottrell J.J., Dunshea F.R., Lean I.J., Leury B.J., Liu F. (2014) Oxidative stress in ruminants: enhancing productivity through antioxidant supplementation. Broadening Horizons, nr 11, dostęp online: http://www.feedipedia.org/.

Celi P., Gabai G. (2015) Oxidant/antioxidant balance in animal nutrition and health: the role of protein oxidation. Front Vet Sci., 2:48.

Cerutti P.A. (1991) Oxidant stress and carcinogenesis. Europ J Clin Invest., 21:1-5.

Chabuz W. (2013) Efektywność chowu bydła i produkcji mleka w gospodarstwach utrzymujących rasy lokalne i wysokoprodukcyjne z uwzględnieniem system utrzymania. Rocz. Nauk. PTZ, 2: 9-21.

Chabuz W., Grzywaczewski G., Rysiak A., Cios S., Podolak P., Litwińczuk Z. (2012) Wpływ wypasu lokalnych ras bydła na różnorodność biologiczną łąk i pastwisk Polesia Lubelskiego. Rocz. Nauk. PTZ, 8(2):81-90.

Chandra G., Aggarwal A. (2009) Effect of DL-α-Tocopherol acetate on calving induced oxidative stress in periparturient crossbred cows during summer and winter seasons. Indian Journal of Animal Nutrition., 26:204-210.

Chandra S., Tripathi A.K., Mishra S., Amzarul M., Vaish A.K. (2012) Physiological changes in hematological parameters during pregnancy. Indian J Hematol Blood Transfus., 28(3):144- 146.

Chapinal N., Carson M.E., LeBlanc S.J., Leslie K.E., Godden S., Capel M., Santos J.E., Overton M.W., Duffield T.F. (2012) The association of serum metabolites in the transition period with milk production and early-lactation reproductive performance. J. Dairy Sci., 95:1301-1309.

Chawla R., Kaur H. (2004) Plasma antioxidant vitamin status of periparturient cows supplemented with α-tocopherol and β-carotene. Animal Feed Science and Technology, 114(1):279-285.

Cheng Y., Chou C.H., Tsai H.J. (2015) In vitro gene expression profile of bovine peripheral blood mononuclear cells in early Mycobacterium bovis infection. Exp Ther Med., 10(6):2102- 2118.

Cherubini A., Ruggiero C., Polidori M.C., Mecocci P. (2005) Potential markers of oxidative stress in stroke. Free Radic Biol Med., 39(7):841-52.

116

Chilliard Y., Bonnet M., Delavaud C., Faulconnier Y., Leroux C., Djiane J., Bocquier F. (2001) Leptin in ruminants. Gene expression in adipose tissue and mammary gland, and regulation of plasma concentration. Domestic Animal Endocrinology, 21:271-295.

Chirase N., Greene L., Pudry C., Loan R., Auvermann B., Parker D., Walborg E., Stevenson D., Xu Y., Klauning J. (2004) Effect of transport stress on respiratory disease, serum antioxidant status, and serum concentrations of lipid peroxidation biomarkers in beef cattle. Am J Vet Res. 65:860-864.

Cigliano L., Strazzullo M., Rossetti C., Grazioli G., Auriemma G., Sarubbi F., Iannuzzi C., Iannuzzi L., Spagnuolo M.S. (2014) Characterization of blood redox status of early and mid- late lactating dairy cows. Czech J. Anim. Sci., 59(4):170-181.

Cincović R.M., Belić B., Radojčić B., Hristov S., Đoković R. (2012): Influence of lipolysis and ketogenesis to metabolic and hematological parameters in dairy cows during periparturient period. Acta Vet. Belgrade, 62:429-444.

Cincović M.R., Belić B., Vidović B., Krćmar L.J. (2011) Reference values and frequency distribution of metabolic parameters in cows during lactation and in pregnancy, Contemporary agriculture, 60(1-2):175-82.

Claxton J.R., Ortiz P. (1996) Haematological parametrs in brown swiss and Holstein cattle at high altitude. Trop. Anim. Health Prod., 28:1120116.

Coffey M.P., Simm G., Bortherstone S. (2002) Energy balance profiles for the first three lactations of dairy cows estimated using random regression. J. Dairy Sci., 85:2669-2678.

Coussens L.M., Werb Z. (2002) Inflammation and cancer. Nature, 420:860-867.

Covarrubias L., Hernandez-Garcia D., Schnabel D., Salas-Vidal E., Castro-Obregon S. (2008) Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active? Dev Biol., 320:1-11.

Cozzi G., Ravarotto L., Gottardo F., Stefani L., Contiero B., Moro L., Brscic M., Dalvit P. (2011) Short communication: reference values for blood parameters in Holstein dairy cows: effects of parity, stage of lactation, and season of production. J. Dairy Sci., 94:3895- 901.

Crapo J.D., Oury T., Rabouille C., Slot J.W., Chang L.Y. (1992) Copper,zinc superoxide dismutase is primarily a cytosolic protein in human cells. Proc Natl Acad Sci USA, 89:10405- 10409.

Crowe M.A. (2008) Resumption of ovarian cyclicity in post-partum beef and dairy cows. Reprod. Domest. Anim., 43:20-28.

Darlington L.G., Stone T.W. (2001) Antioxidants and fatty acids in the amelioration of rheumatoid arthritis and related disorders. Br. J. Nutr., 85:251-269.

117

Detilleux J.C., Kehrli M.E., Stabel J.R., Freeeman A.E., Kelley D.H. (1995) Study of immunological dysfunction in periparturient Holstein cattle selected for high and average milk production. Vet. Immunol. Immunopathol., 44:251-267.

Di Mascio P., Murphy M.E., Sies H. (1991) Antioxidant defense systems: the role of carotenoids, tocopherols, and tiols. Am J Clin Nutr., 53(1):194S-200S.

Djoković R., Kurćubić V., Cincović M., Fratrić N., Gvozdić D., Petrović M. (2014) Endocrine and metabolic status of the mid yielding dairy cows during transition period and mid lactation. Materiały z XIV Middle European Buiatrics Congress, 25-27.05.2014, Warszawa.

Djoković R., Kurćubić V., Ilić Z., Cincović M., Petrović M., Fratrić N., Jašović B. (2013a) Evaluation of metabolic status in Simmental dairy cows during late pregnancy and early lactation. Veterinarski Arhiv, 83(6):593-602.

Djoković R., Kurćubić V., Ilić Z., Cincović M., Fratrić N., Stanimirović Z., Petrović M.D., Petrović M.P. (2013b) Evaluation of the metabolic status of Simmental dairy cows in early and mid lactation. Animal Science Papers and Reports, 31(2):101-110.

Djoković R., Šamanc H., Bošković-Bogosavljević S., Radović V. (2005) Changes of characteristic blood parameters in ketotic cows. Veterinarski Glasnik, 59 (suppl. 1-2):221- 228.

Djoković R., Šamanc H., Jovanović M., Nikolić Z. (2007) Blood concentrations of thyroid hormones and lipids in the liver in dairy cows in transitional period. Acta Vet. Brno, 76:525- 532.

Drackley J.K. (1999) Biology of dairy cows during the transition period: the final frontier? J. Dairy Sci., 82(11):2259-2273.

Dröge W. (2002) Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev., 82(1):47-95.

Duffield T.F. (2000) Subclinical ketosis in lactating dairy cattle. Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract. 16:231-253.

Duffield T.F., Kelton D.F., Leslie K.E., Lissemor K.D., Lumsden J.H. (1997) Use of test day milk fat and milk protein to detect subclinical ketosis in dairy cattle in Ontario. Can. Vet. J., 38:713-718.

Duffield T.F., Lissemore K.D., McBride B.W., Leslie K.E. (2009) Impact of hyperketonemia in early lactation dairy cows on health and production. J. Dairy Sci., 92:571-580.

Dunn T.A., Chen S., Faith D.A., Hicks J.L., Platz E.A., Chen Y., Ewing C.M., Sauvageot J., Isaacs W.B., De Marzo A.M., Luo J. (2006) A novel role of myosin VI in human prostate cancer. Am. J. Pathol., 169:1843-1854.

118

Dupuy C., Virion A., Ohayon R., Kaniewski J., Dème D., Pommier J. (1991) Mechanism of hydrogen peroxide formation catalyzed by NADPH oxidase in thyroid plasma membrane. J Biol. Chem., 266:3739-3743.

Ďuračkova Z. (2010) Some current insights into oxidative stress. Physiol. Res., 59:459-469.

Eckersall P.D., Conner J.G. (1988) Bovine and canine acute phase proteins. Vet Res Commun., 12(2-3):169–78.

Edmonson A.J., Lean I.J., Weaver L.D., Farver T., Webster G. (1989) A Body Condition Scoring Chart for Holstein Dairy Cows. J Dairy Sci., 72:68-78.

Eger S., Drori D., Kadoori I., Miller N., Schindler H. (1985) Effects of selenium and vitamin E on incidence of retained placenta. J Dairy Sci., 68:2119-2122.

Ehrlich P. (1883) Sulfodiazobenzol, ein Reagens auf Bilirubin. Centr Klin Med, 4:721-723.

Eicher R., Liesegang A., Bouchard E., Tremblay A. (1998) Influence of concentrate feeding frequency and intrinsic factors on diurnal variations of blood metabolites in dairy cows. Proc. Proc Am Assoc Bov Pract, Rome, pp 198-202.

Eigenberg R.A., Hahn G.L., Nienaber J.A., Brown-Brandl T.M., Spiers D.E. (2000) Development of a new respiration rate monitor for cattle. Transactions of the ASAE, 43(3):723-728.

El-Moghazy F. (2011) Effect of parasitic infestation on oxidant/antioxidant status in buffaloes. Middle-East Journal of Scientific Research, 4:585-593.

Enemark J.M.D., Schmidt H.B., Jakobsen J., Enevoldsen C. (2009) Failure to improve energy balance or dehydration by drenching transition cows with water and electrolytes at calving. Vet Res Commun., 33(2):123-37.

Erisir M., Akar Y., Gurgoze S., Yuksel M. (2006) Changes in plasma malondialdehyde concentrarion and some erythrocyte antioxidant enzymes in cows with prolapsus uteri, caesaren section, and retained placenta. Revue Med. Vet., 157(2):80-83.

Erskine R.J., Bartlett P.C., Herdt T., Gaston P. (1997) Effects of parenteral administration of vitamin E on health of periparturient dairy cows. J Am Vet Med Assoc., 211:466-469.

Esievo K.A.N., Moore W.E. (1979) Effect of dietary protein and stage of lactation on the haematology and erythrocyte enzymes activities of high producing dairy cattle. Res. Vet. Sci., 26:53-58.

Etim N.N., Williams M.E., Akpabio U., Offiong E.E. (2014) Haematological Parameters and Factors Affect-ing Their Values. Agricultural Science, 2:37-47.

Eyer P., Podhradsky D. (1986) Evaluation of the micromethod for determination of glutathione using enzymatic cycling and Ellman’s reagent. Anal. Biochem., 153:57-66. 119

Fang J., Seki T., Maeda H. (2009) Therapeutic strategies by modulating oxygen stress in cancer and inflammation. Adv Drug Deliv Rev, 61:290-302.

Felenczak A., Gil Z., Fertig A., Gardzina E., Skrzyński G. (2002) Skład i właściwości mleka krów ras polskiej czerwonej i czerwono-białej z uwzględnieniem polimorfizmu białek. Zesz. Nauk. PTZ, Prz. Hod., 62:63-68.

Fenton H.J.H. (1984) Oxidation of tartaric acid in the presence of iron. J Chem Soc., 65:899- 910.

Ferris C.P., Heins B.J., Buckley F. (2014) Crossbreeding in dairy cattle: pros and cons. WCDS Advances in dairy Technology, 26:223-243.

Finkel T. (1998) Oxygen radicals and signaling. Curr Opin Cell Biol., 10:248-253.

Fitzpatrick A.M., Teague W.G., Holguin F,. Yeh M., Brown L.A. (2009) Severe Asthma Research Program. Airway glutathione homeostasis is altered in children with severe asthma: evidence for oxidant stress. J Allergy Clin Immunol., 123:146-152.

Flugge L.A., Miller-Deist L.A., Petillo P.A. (1999) Towards a molecular understanding of arthritis. Chem. Biol. Int., 6:R157-166.

Fossati P., Lorenzo P. (1982) Serum triglycerides determined colorimetrically with an enzyme that produces hydrogen peroxide. Clin Chem., 28:2077-2080.

Freyer G., König S., Fischer B., Bergfeld U., Cassell B.G. (2008) Invited review: crossbreeding in dairy cattle from a German perspective of the past and today. J Dairy Sci., 91(10):3725-3743.

Fridovich I. (1978) The biology of oxygen radicals. Science, 201:875-880.

Gaál T., Ribiczeyné-Szabó P., Stadler K., Jakus J., Reiczigel J., Kövér P., Mézes M., Sümeghy L. (2006) Free radicals, lipid peroxidation and the antioxidant system in the blood of cows and newborn calves around calving. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol., 143(4):391-6.

Gallo L., Carnier P., Cassandro M., Mantovani R., Bailoni L., Contiero B., Bittante G. (1996) Change in body condition score of holstein cows as affected by parity and mature equivalent milk yield. J. Dairy Sci., 79:1009-1015.

Galter D., Mihm S., Dröge W. (1994) Distinct effects of glutathione disulphide on the nuclear transcription factor kappa B and the activator protein-1. Eur. J. Biochem., 221:639-648.

Gałecka E., Mrowicka M., Malinowska K., Gałecki P. (2008) Wolne rodniki tlenu i azot w fizjologii. Pol. Merk. Lek., 143:446-448.

120

Ganaie A.H., Shanker G., Bumla N.A., Ghasura R.S., Mir N.A., Wani S.A., Dudhatra G.B. (2013) Biochemical and physiological changes during thermal stress in bovines. J. Vet. Sci. Technol., 4(126): 126-132.

García A.M.B., Cardoso F.C., Campos R., Thedy D.X., González F.H.D. (2011) Metabolic evaluation of dairy cows submitted to three different strategies to decrease the effects of negative energy balance in early postpartum. Pesq. Vet. Bras., 31(Supl.1):11-17.

Gatellier P., Mercier Y., Renerre M. (2004) Effect of diet finishing mode (pasture or mixed diet) on antioxidant status of Charolais bovine meat. Meat Sci., 67:385-394.

Geishauser T., Leslie K., Tenhag J., Bashiri A. (2000) Evaluation of eight cowside ketone tests in milk for detection of subclinical ketosis in dairy cows. J. Dairy Sci., 83:296-299.

Gelderman K.A., Hultqvist M., Olsson L.M., Bauer K., Pizzolla A., Olofsson P., Holmdahl R. (2007) Rheumatoid arthritis the role of reactive oxygen species in disease development and therapeutic strategies. Antioxid Redox Signal, 9:1541-1567.

Genova M.L., Pich M.M., Bernacchia A., Bianchi C., Biondi A., Bovina C., Falasca A.I., Formiggini G., Castelli G.P., Lenaz G. (2004) The mitochondrial production of reactive oxygen species in relation to aging and pathology. Ann. NY Acad. Sci., 1011: 86-100.

George J.W., Snipes J., Lane V.M. (2010) Comparison of bovine hematology reference intervals from 1957 to 2006. Vet Clin Pathol, 39:138-148.

Gerschman R., Gilbert D.L., Nye S.W., Dwyer P., Fenn W.O. (1954) Oxygen poisoning and x-irradiation—A mechanism in common. Science, 119:623-626.

Gheise N.J., Riasi A., Shahneh A.Z., Celi P., Ghoreishi S.M. (2017) Effect of pre-calving body condition score and previous lactation on BCS change, blood metabolites, oxidative stress and milk production in Holstein dairy cows. Italian Journal of Animal Science, 16(3):474-483.

Ghiselli A., Serafini M., Natella F., Scaccini C. (2000) Total antioxidant capacity as a tool to assess redox status: critical view and experimental data. Free Radical Biological Medicine, 29:1106-1114.

Giesy S.L., Yoon B., Currie W.B., Kim J.W., Boisclair Y.R. (2012) Adiponectin deficit during the precarious glucose economy of early lactation in dairy cows. Endocrinology, 153(12):5834-44.

Gilbert R.O., Gröhn Y.T., Miller P.M., Hoffman D.J. (1993) Effect of parity on periparturient neutrophil function in dairy cows. Vet Immunol Immunopathol, 36:75-82.

Gillund P., Reksen O., Gröhn Y.T., Karlberg K. (2001) Body Condition Related to Ketosis and Reproductive Performance in Norwegian Dairy Cows. J. Dairy Sci., 84:1390-1396.

121

Giordano C.R., Roberts R., Krentz K.A., Bissig D., Talreja D., Kumar A., Terlecky S.R., Berkowitz B.A. (2015) Catalase therapy corrects oxidative stress-induced pathophysiology in incipient diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci., 56(5):3095-102.

Glass G.A., Gershon D. (1981) Enzymatic changes in rat erythrocytes with increasing cell and donor age: loss superoxide dismutase activity associated with increases in catalytically defective forms. Biochem Biophys Res Commun., 103(4):1245-1253.

Goff J. (2006) Major advances in our understanding of nutritional influence on bovine health. J. Dairy Sci., 89(4):1292-1301.

Goldberg D.M., Spooner R.J. (1983) Glutatione reductase. W Methods of Enzymatic Analysis, wyd. Bergmayer H.U., Verlag-Chemie, 3:258-265.

Gołębiowski M. (2015) Żywienie krów mlecznych w laktacji. Farmer, 12:114-117.

Gołębiowski M., Kądrowska A., Wójcik A., Wnęk A., Slósarz J., Kunowska-Slósarz M., Nałęcz-Tarwacka T. (2015) Wykorzystanie krzyżowania międzyrasowego w doskonaleniu genetycznym bydła mlecznego. Przegląd hodowlany, 1:1-4.

Gong J., Xiao M. (2016) Selenium and antioxidant status in dairy cows at different stages of lactation. Biol Trace Elem Res., 171:89-93.

González F.D., Muiño R., Pereira V., Campos R., Benedito J.L. (2011) Relationship among blood indicators of lipomobilization and hepatic function during early lactation in high- yielding dairy cows. J Vet Sci., 12(3):251–255.

González F.D., Muiño R., Pereira V., Campos R., Castellote J.L.B. (2009) Indicadores sanguíneos de lipomobilização e função hepática no início da lactação em vacas leiteiras de alta produção. Ciênc. Anim. Bras., 1:64.

Gornall A.G., Bardawill C.J., David M.M. (1949) Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J. Biol. Chem., 177:751-766.

Goudy K., Aydin D., Barzaghi F., Gambineri E., Vignoli M., Ciullini Mannurita S., Doglioni C., Ponzoni M., Cicalese M.P., Assanelli A., Tommasini A., Brigida I., Dellepiane R.M., Martino S., Olek S., Aiuti A., Ciceri F., Roncarolo M.G., Bacchetta R. (2013) Human IL2RA null mutation mediates immunodeficiency with lymphoproliferation and autoimmunity. Clin Immunol., 146(3):248-61.

Górski K., Saba L. (2012) Changes in the level of selected haematological and biochemical parameters in the blood of dairy cows in central-eastern Poland. Acta Veterinaria (Beograd), 62(4):421-428.

Granger D.N. (1988) Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol., 255:H1269-H1275.

122

Greenfield R.B., Cecava M.J., Johnson T.R., Donkin S.S. (2000) Impact of dietary protein amount and rumen undegradability on intake, peripartum liver triglyceride, plasma metabolites and milk production in transition dairy cattle. J. Dairy Sci., 83:703-710.

Gross J.J., Schwarz F.J., Eder K., van Dorland H.A., Bruckmaier R.M. (2013) Liver fat content and lipid metabolism in dairy cows during early lactation and during a mid-lactation feed restriction. J. Dairy Sci., 96:5008-5017.

Gross J.J., van Dorland H.A., Bruckmaier R.M., Schwarz F.J. (2011) Performance and metabolic profile of dairy cows during a lactational and deliberately induced negative energy balance with subsequent realimentation. J. Dairy Sci., 94:1820-1830.

Grover A.K., Samson S.E. (1988) Effect of superoxide radical on Ca2+ pumps of coronary artery. Am J Physiol, 255:C297-C303.

Grummer R.R. (1993) Etiology of lipid-related metabolic disorders in periparturient dairy cows. J. Dairy Sci., 76:3882-3896.

Guédon L., Saumande J., Dupron F., Couquet C., Desbals B. (1999) Serum cholesterol and triglycerides in postpartum beef cows and their relationship to the resumption of ovulation. Theriogenology, 51(7):1405-15.

Gunawardena H.P., Silva K.D., Sivakanesan R., Katulanda P. (2019) Increased lipid preoxydation and erythrocyte glutathione peroxidase activity of patients with type 2 diabetes mellitus: Implications for obesity and central obesity. Obesity Medicine, 15:100118. Dostęp online: https://doi.org/10.1016/j.obmed.2019.100118.

Guzel M., Askar T.K., Kaya G., Atakisi E., Avci G.E. (2008) Serum sialic acids, total antioxidant capacity, and adenosine deaminase activity in cattle with theileriosis and anaplasmosis. Bull Vet Inst Pulawy, 52:227-230.

Gvozdić D., Ralević V., Ristanić M., Fratrić N. (2014) Hematology and serum chemistry parameters in transition dairy cows. Materiały z XIV Middle European Buiatrics Congress, 25-27.05.2014, Warszawa.

Hachenberg S., Weinkauf C., Hiss S., Sauerwein H. (2007) Evaluation of classification modes potentially suitable to identify metabolic stress in healthy dairy cows during the peripartal period, J Anim Sci, 85:1923-32.

Hagen J., Fürll M. (2010) The antioxidant metabolism in serum and mammary gland lymph from cows with mastitis in comparison to healthy control animals. Wiener tierärztliche Monatsschrift, 97(11-12):270-278.

Halliwell B. (1987) Oxidants and human disease: some new concepts. FASEB J., 1(5):358- 364.

123

Halliwell B. (1989) Free radicals, reactive oxygen species and human disease: a critical evaluation with special reference to atherosclerosis. Br J Exp Pathol. 70(6): 737-757.

Halliwell B. (1991) Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry, and role in human disease. Am J Med., 91:14S-22S.

Halliwell B., Gutteridge J.M.C. (2007) Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press, Oxford, UK.

Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. (1998) Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood, 92:3007-3017.

Hansen P.J. (2010) Supplemental antioxidants to enhance fertility in dairy cattle. 21 th Annu. FL Ruminant Nutr. Symp., Gainesville, Fl, str. 157-166.

Harðarson G., Ingvartsen K. (2005) Energy metabolism in the periparturient dairy cow. Frǣðaping landdbunaðarins, 94-102.

Harman D. (1956) Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J of Gerontol., 11(3):298-300.

Hayes J.D., McLellan L.I. (1999) Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a co-ordinately regulated defense against oxidative stress. Free Radic Res, 31:273-300.

Heck J.M.L., van Valenberg H.J.F., Djikstra J., van Hooijodonk A.C.M. (2009) Seasonal variation in the Dutch bovine raw milk composition. Journal of Dairy Science, 92:4745-4755.

Heidarpour M., Mohri M., Fallah-rad A.H., Dehghan Shahreza F., Mohammadi M. (1996) Oxidative stress and trace elements before and after treatment in dairy cows with clinical and subclinical endometritis. Revue. Méd. Vét., 163(12):628-633.

Heinrichs J., Jones C., Ishler V. (2016) Body Condition Scoring as a Tool for Dairy Herd Management. The Pennsylvania State University. Źródło: http://extension.psu.edu.

Hensley K., Butterfield D.A., Hall N., Cole P., Subramaniam R., Mark R., Mattson M.P., Markesbery W.R., Harris M.E., Aksenov M. (1996) Reactive oxygen species as causal agents in the neurotoxicity of the Alzheimer’s disease-associated amyloid beta peptide. Ann N Y Acad Sci, 786:120-134.

Hermans N., Cos P., Maes L., de Bruyne T., Vanden Berghe D., Vlietinck A.J., Pieters L. (2007) Challenges and pitfalls in antioxidant research. Curr. Med. Chem., 14:417-430.

Hermes-Lima M., Storey J.M., Storey K.B. (1998) Antioxidants defenses and metabolic depression. The hypothesis of preparation for oxidative stress in land snails. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol., 120:437-448.

124

Hernández J., Castillo C., Pereira V., Lόpez A.M., Vazquez P., Gutiérrez B., García- Vaquero M., Benedito J.L. (2006) Oxidative stress status in high-yielding dairy cows. Conference: XXIV World Buiatric Congress. Francja. Materiały konferencyjne.

Hoeben D., Burvenich C., Massart-Leen A.M., Lenjou M., Nijs G., Van Bockstaele D., Beckers J.F. (1999) In vitro effect of ketone bodies, glucocorticosteroids and bovine pregnancy-associated glycoprotein on cultures of bone marrow progenitor cells of cows and calves. Vet Immunol Immunopathol, 68:229-40.

Hristovska T., Cincović M., Stojanović D., Belić B., Kovačević Z., Jezdimirović M. (2017) Influence of Niacin Supplementation on the Metabolic Parameters and Lipolysis in Dairy Cows During Early Lactation. Kafkas Univ Vet Fak Derg, 23(5):773-778.

Hulbert A.J., Pamplona R., Buffenstein R., Buttemer W.A. (2007) Life and death: metabolic rate, membrane composition, and life span of animals. Physiol Rev., 87(4):1175-213.

Hundt N., Steffen W., Pathan-Chhatbar S., Taft M.H., Manstein D.J. (2016) Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Sci Rep., 6:20554.

Huszenicza G.Y., Kulcsar M., Korodi P., Bartyik J., Rudas P., Ribiczei-Szabo P. (2006) Adrenocortical and thyroid function, hormone and metabolite profiles and the onset of ovarian cyclicity in dairy cows suffering from various forms ketosis. Acta Veterinaria, 56(1):25-36.

Ibrahim H.M.M., El-seedy Y.Y., Gomaa N.A. (2016) Cytokine response and oxidative stress status in dairy cows with acute clinical mastitis. J Dairy Vet Anim Res., 3(1):9-13.

Illek J., Vlček M., Tulis F., Kumprechtova D., Kudrna V. (2015) Monitoring and managing of Energy metabolism in transition dairy cows. Magyar Állatorvosok Lapja, 137(Supp. I):291- 295.

Ingvartsen K.L., Dewhurst R.J., Friggens N.C. (2003) On the relationship between lactational performance and health: is it yield or metabolic imbalance that causes diseases in dairy cattle? A position paper. Livestock Prod. Sci., 83:277-308.

Jabs T. (1999) Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals. Biochem Pharmacol, 57:231-245.

Jacob T., Pakkiri M. (2017) Oxidative Stress and the Level of Antioxidants in the Condition of Sub-Clinical Ketosis Associated with the Increased Milk Somatic Cell Count. International Journal of Livestock Research, 7(5):228-233.

Jain S.K. (1999) Should high-dose vitamin E supplementation be recommended to diabetic patients? Diabetes Care, 22:1242-1244.

Jaśkowski J.M., Twardoń J. (2002) Kondycja a płodność krów. Med. Wet., 58(1):23-25.

125

Jefferies H., Coster J., Kahlil A., Bot J., McCauley R.D., Hall J.C. (2003) Glutathione. ANZ J. Surg., 73:517-522.

Jin L., Yan S.M., Shi B.L., Bao H., Gong J., Guo X., Li J. (2014) Effects of vitamin A on the milk performance, antioxidant functions and immune functions of dairy cows. Animal Feed Science and Technology.192:15-23.

Johansson L.H., Borg L.A. (1988) A spectrophotometric method for determination of catalase activity in small tissue samples. Anal Biochem., 174:331-336.

Jones M.L., Allison R.W. (2007) Evaluation of the ruminant complete blood cell count. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 23(3):377-402.

Jorritsma R., Jorritsma H., Schukken Y.H., Bartlett P.C., Wensing T., Wentink G.H. (2001) Prevalence and indicators of postpartum fatty infiltration of the liver in nine commercial dairy herds in the Netherlands. Livest. Product. Science, 68: 53-60.

Jozefczak M., Remans T., Vangronsveld J., Cuypers A. (2012) Glutathione is a key player in metal-induced oxidative stress defenses. Int J Mol Sci.,13(3):3145-75.

Kabbage M., Trimeche M., Ben Nasr H., Hammann P., Kuhn L., Hamrita B., Chahed K. (2013) Tropomyosin-4 correlates with higher SBR grades and tubular differentiation in infiltrating ductal breast carcinomas: an immunohistochemical and proteomics-based study. Tumour Biol., 34(6):3593-602.

Kadowaki T., Yamauchi T. (2005) Adiponectin and adiponectin receptors. Endocrine Reviews, 26(3):439-451.

Kalamaras K. (2012) The role of adiponectin in regulation of metabolism in dairy cows. PhD thesis, University of Nottingham.

Kankofer M., Albera E., Feldman M., Gundling N., Hoedemaker M. (2010) Comparison of antioxidative/oxidative profiles in blood plasma of cows with and without retained fetal placental membranes. Theriogenology, 74(8):1385-95.

Kapusta A., Kuczyńska B., Puppel K. (2018) Relationship between the degree of antioxidant protection and the level of malondialdehyde in high-performance Polish Holstein-Friesian cows in peak of lactation. PLoS ONE 13(3):e0193512. Dostęp online: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0193512.

Karimi N., Mohri M., Azizzadeh M., Seifi H. A., Heidarpour M (2016) Relationships between trace elements, oxidative stress and subclinical ketosis during transition period in dairy cows. Iranian Journal of Veterinary Science and Technology, 7(2):46-56.

Kazula A. (2009) Wykorzystanie mikromacierzy DNA w terapii i diagnostyce. Farmacja Polska 65(3):229-238.

126

Keisari Y., Braun L., Flescher E. (1983) The oxidative burst and related phenomena in mouse macrophages elicited by different sterile inflammatory stimuli. Immunobiology., 165:78-89.

Kessler E.C., Gross J.J., Bruckmaier R.M., Albrecht C. (2014) Cholesterol metabolism, transport, and hepatic regulation in dairy cows during transition and early lactation. J. Dairy Sci., 97:5481-5490.

Kessel S., Strohel M., Meyer H.H.D., Hiss S., Sauerwein H., Schwarz F.J., Bruckmeyer R.M. (2008) Individual variability in physiological adaptation to metabolic stress during early lactation in dairy cows kept under equal conditions. Journal of Animal Science, 86:2903- 2912.

Kim I.H., Suh G.H. (2003) Effect of the amount of body condition loss from the dry to near calving periods on the subsequent body condition change, occurrence of postpartum diseases, metabolic parameters and reproductive performance in Holstein dairy cows. Theriogenology, 60:1445-1456.

Kizil O., Akar Y., Saat N., Kizil M., Yuksel M. (2007) The plasma lipid peroxidation intensity (MDA) and chain-breaking antioxidant concentrations in the cows with clinic or subclinic mastitis. Revue Med. Vet., 158 (11):529-533.

Klackar H.M. (1947) Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes. J. Biol. Chem., 167:429-442.

Klebaniuk R., Rocki G. (2011) Wskaźniki hematologiczne i biochemiczne krwi przydatne do analizy żywienia i odżywienia krów mlecznych. Przegląd hodowlany, 1:4-7.

Kleczkowski M., Kluciński W., Bartosz G. (2006) Free radical basics of cattle diseases. Monografia. Wspólnota Polska Association Lomza Division, Łomża, Polska.

Kleczkowski M., Kluciński W., Sitarska E., Sikora J., Kasztelan R. (2003) Influence of mineral nutrition on superoxide dismutase activity in blood of cows. Bull. Vet. Inst. Pulawy, 47:547-554.

Kluciński W., Kleczkowski M., Fabisiak M., Kołodziejska J. (2012) Ocena kondycji – ważny element badania krów mlecznych. Lecznica dużych zwierząt, 2:134-139.

Kluciński W., Miernik-Degórska E., Degórski A., Targowski S., Winnicka A. (1988) Effect of ketone bodies on the mitogenic response of bovine milk lymphocytes. J Vet Med., 35:626- 639.

Knight J.A. (1998) Free radicals: their history and current status in aging and disease. Ann Clin Lab Sci., 28(6):331-346.

Kolli V., Upadhyay R.C., Singh D. (2013) Peripheral blood leukocytes transcriptomic signature highlights the altered metabolic pathways by heat stress in zebu cattle. Research in Veterinary Science, 96(1):102-110.

127

Kolver E.S., Müller L.D. (1998) Performance and Nutrient Intake of High Producing Holstein Cows Consuming Pasture or a Total Mixed Ration. J Dairy Sci, 81:1403-1411.

Kovacic P., Jacintho J.D. (2001) Mechanisms of carcinogenesis: Focus on oxidative stress and electron transfer. Curr. Med. Chem., 8:773-796.

Konvična J., Vargova M., Kadasi M., Kovač G., Kostecka Z. (2014) Antioxidant status in periparturient dairy cows. Materiały z XIV Middle European Buiatrics Congress, 25- 27.05.2014, Warszawa.

Konvična J., Vargova M., Paulikova I., Kovač G., Kostecka Z. (2015) Oxidative stress and antioxidant status in dairy cows during prepartal and postpartal periods. Acta Vet. Brno, 84:133-140.

Krumm C.S. Giesy S.L., Caixeta L.S., Butler W.R., Sauerwein H., Kim J.W., Boisclair Y. R. (2017) Effect of hormonal and energy-related factors on plasma adiponectin in transition dairy cows. J Dairy Sci., 100(11):9418-9427.

Kuge S., Jones N. (1994) YAP-1 dependent activation of TRX2 is essential for the response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress by hydroperoxides. EMBO J., 13:655-664.

Kulka M., Kołodziejska-Lesisz J., Kluciński W. (2016) Serum paraoxonase 1 (PON1) activity and lipid metabolism parameters changes in different production cycle periods of Holstein- Friesian, Polish Redand Norwegian breeds. Pol. J. Vet. Sci., 19(1):165-173.

Kumar S, Kumar A, Khan M.M. (2019) Estimation of Aldose Reductase Activity and Malondialdehyde Levels in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus. Biomed Pharmacol J, 12(2):1001-1007.

Kupczyński R., Adamski M., Pogoda-Sewerniak K., Kuczaj M., Zawadzki W. (2008) The comparison of the methods of an assessment of β-hydroxybutyrate acid and glucose in blood of cows. Zeszyty Naukowe Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, Biologia i Hodowla Zwierząt, LVI/566/2008:101-110.

Kupczyński R., Chudoba-Drozdowska B. (2002) Values of selected biochemical parameters of cows’ blood during their drying-off and the beginning of lactation. EJPAU, 5(1). Dostęp online: http://www.ejpau.media.pl/volume5/issue1/veterinary/art-01.html.

Lacetera N., Scalia D., Bernabucci U., Ronchi B., Pirazzi D., Nardone A. (2005) Lymphocyte functions in overconditioned cows around parturition. J Dairy Sci., 88(6):2010-6.

Laeger T., Metges C.C., Kuhla B. (2010) Role of b-hydroxybutyric acid in the central regulation of energy balance. Appetite, 54:450-455.

Landis G.N., Tower J. (2005) Superoxide dismutase evolution and life span regulation. Mech. Ageing Dev., 126:365-379.

128

LeBlanc S.J., Duffield T.F., Leslie K.E., Bateman K.G., TenHag J., Walton J.W., Johnson W.H. (2002) The effect of prepartum injection of vitamin E on health in transition dairy cows. J Dairy Sci., 85(6):1416-1426.

Ledwożyw A., Michalak J., Stępien A., Kadziołka A. (1986) The relationship between plasma triglycerides, cholesterol, total lipids and lipid peroxidation products during human atherosclerosis. Clin Chim Acta, 155:275-84.

Lee E.K., Kehrli M. (1998) Expression of adhesion molecules on neutrophils of periparturient cows and neonatal calves. Am J Vet Res., 59:37-43.

Lee B., Shao J. (2012) Adiponectin and lipid metabolism in skeletal muscle. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2(4):335-340.

Lemor A., Hosseini A., Sauerwein H., Mielenz M. (2009) Transition period-related changes in the abundance of the mRNAs of adiponectin and its receptors, of visfatin, and of fatty acid binding receptors in adipose tissue of high-yielding dairy cows. Domest Anim Endocrinol., 37(1):37-44.

Li J., Gao X., Qian M., Eaton J.W. (2004) Mitochondrial metabolism underlies hyperoxic cell damage. Free Radic. Biol. Med., 36:1460-1470.

Lipshutz R.J., Fodor S.P., Gingeras T.R., Lockhart D.J. (1999) High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet., 21(1):20-4.

Litwińczuk Z. (2011) Ochrona zasobów genetycznych zwierząt gospodarskich i dziko żyjących. PWRiL, Warszawa.

Litwińczuk Z., Barłowska J. (2015) Populacja bydła mlecznego w Polsce i jej przydatność dla mleczarstwa. Przegląd hodowlany, 4:3-10.

Litwińczuk Z., Barłowska J., Chabuz W., Brodziak A. (2012) Nutritional value and technological suitability of milk cows of three Polish breeds included in the genetic resources conservation programme. Annals of Animal Science, 12(3):423-432.

Litwińczuk Z., Matwijczuk A., Brodziak A. (2015) Wartość energetyczna, właściwości fizyczne i przydatność technologiczna mleka krów rasy polskiej czerwonej, białogrzbietej i simentalskiej utrzymanych w systemie niskonakładowym. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość., 6(103):106-117.

Liu D. (1996) The roles of free radicals in amyotropic Lateran sclerosis. J Mol Neurosci., 7(3):159-167.

Lockhart D.J., Winzeler E.A. (2000) Genomics, gene expression and DNA arrays. Nature, 405:827-836.

129

Lohrenz A.K., Duske K., Schneider F., Nurnberg K., Losand B., Seyfert H.M., Metges C.C., Hammon H.M. (2010) Milk performance and glucose metabolism in dairy cows fed rumen protected fat during midlactation. Journal of Dairy Science, 93:5867-5876.

Lomnytska M.I., Becker S., Bodin I., Olsson A., Hellman K., Hellström A.C., Mints M., Hellman U., Auer G., Andersson S. (2011) Differential expression of ANXA6, HSP27, PRDX2, NCF2, and TPM4 during uterine cervix carcinogenesis: diagnostic and prognostic value. Br J Cancer., 104(1):110-9.

Los M., Dröge W., Stricker K., Baeuerle P.A., Schulze-Osthoff K. (1995) Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions. Eur. J. Immunol., 25:159-165.

Löhrke B., Viergutz T.T., Kanitz W., Becker F., Göllnitz K., Hurtienne A., Schweigert F.J. (2005) Relationship between oxidant stress and milk productivity in dairy cows. Berl Munch Tierarztl Wochenschr., 118:265-269.

Löhrke B., Viergutz T.T., Kanitz W., Göllnitz K., Becker F., Hurtienne A., Schweigert F.J. (2004) High milk yield in dairy cows associated with oxidant stress. Online J Vet Res., 8:70-78.

Lykkesfeldt J., Svendsen O. (2007) Oxidant and antioxidants in diseases: Oxidative stress in farm animals. The Veterinary Journal, 173:502-511.

Machado V.S., Oikonomou G., Lima S.F., Bicalho M.L., Kacar C., Foditsch C., Felippe M.J., Gilbert R.O., Bicalho R.C. (2014) The effect of injectable trace minerals (selenium, copper, zinc, and manganese) on peripheral blood leukocyte activity and serum superoxide dismutase activity of lactating Holstein cows. Vet J., 200(2):299-304.

Maier C.M., Chan P.H. (2002) Role of superoxide dismutases in oxidative damage and neurodegenarive disorders. Neuroscientist., 8(4):323-334.

Małecki J. (2003) The influence of farm produced feeds on the metabolic profiles and daily milk yield of cows during first months of lactation. Acta Sci. Pol. Ser. Zoot., 2 (2): 65-76.

Marklund S.L., Holme E., Hellner L. (1982) Superoxide dismutase in extracellular fluids. Clin. Chim. Acta, 126:41-45.

Markusfeld O., Galon N., Ezra E. (1997) Body condition score, health, yield and fertility in dairy cows. Vet. Rec., 141:67–72.

Marutsova V., Binev R., Marutsov P. (2015) Comparative clinical and haematological investigations in lactating cows with subclinicall and clinical ketosis. Mac Vet Rev, 38(2):159-166.

Maseki M., Nishigaki I., Hagihara M., Tomoda Y., Yagi K. (1981) Lipid peroxide levels and lipids content of serum lipoprotein fractions of pregnant subjects without pre-eclampsia. Clin Chim Acta., 115:155-161.

130

Masella R., Di Benedetto R., Vari R., Filesi C., Giovannini C. (2005) Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: Involvement of glutathione and glutathione related enzymes. J. Nutr. Biochem., 16:577-586.

Masters T.A., Tumbarello D.A., Chibalina M.V., Buss F. (2017) MYO6 Regulates Spatial Organization of Signaling Endosomes Driving AKT Activation and Actin Dynamics. Cell Rep., 19(10):2088-2101.

Maślanka T., Spodniewska A., Barski D., Jasiecka A., Zuśka-Prot M., Ziółkowski H., Markiewicz W., Jaroszewski J.J. (2014) Prostaglandin E₂ down-regulates the expression of CD25 on bovine T cells, and this effect is mediated through the EP4 receptor. Vet Immunol Immunopathol., 160(3-4):192-200.

Maurya P.K., Aggarwal A., Singh S.V., Chandra G., Singh A.K., Chaudhari B.K. (2014) Effect of vitamin E and zinc on cellular antioxidant enzymes in karan fries cows during transition period.Indian J. Animal. Res, 48(2):109-119.

Mazzullo G., Rifici C., Cammarata F., Caccamo G., Rizzo M., Piccione G. (2014) Effect of different environmental conditions on some haematological parameters in cow. Ann. Anim. Sci., Vol. 14(4):947–954.

McArt J.A., Nydam D.V., Oetzel G.R. (2012) Epidemiology of subclinical ketosis in early lactation dairy cattle. J Dairy Sci., 95(9):5056-66.

McArt J.A., Nydam D.V., Oetzel G.R. (2013) Dry period and parturient predictors of early lactation hyperketonemia in dairy cattle. J. Dairy Sci., 96:198-209.

McArt J.A., Nydam D.V., Oetzel G.R., Overton T.R., Ospina P.A. (2013b) Elevated non- esterified fatty acids and beta-hydroxybutyrate and their association with transition dairy cow performance. Vet. J., 198:560-570.

McEligot A.J., Yang S., Meyskens F.L. (2005) Redox regulation by intrinsic species and extrinsic nutrients in normal and cancer cells. Ann. Rev. Nutr., 25:261-295.

Meglia G.E., Johannisson A., Agenas S., Holtenius K., Waller K.P. (2005) Effects of feeding intensity during the dry period on leukocyte and lymphocyte sub-populations, neutrophil function and health in periparturient dairy cows. Vet J 169:376–384.

Meglia G.E., Johannisson A., Peterson L., Persson Waller K.P. (2001) Changes in some blood micronutrients, leukocyte and neutrophil expression of adhesion molecules in periparturient dairy cows. Acta Vet Scand 42:139–150.

Meikle A., Kulcsar M., Chilliard Y., Febel H., Delavaud C., Cavestany D., Chilibroste P. (2004) Effects of parity and body condition at parturition on endocrine and reproductive parameters of the cow. Reproduction, 127:727-737.

131

Meyer D.J., Harley J.W.: Veterinary Laboratory Medicine (Interpretation and Diagnosis) W.B. Saunders Company, 1998.

Michiels C., Raes M., Toussaint O., Remacle J. (1994) Importance of Se-glutathione peroxidase, catalase, and Cu/Zn-SOD for cell survival against oxidative stress. Free Radical Biology and Medicine, 17:235-248.

Mikuła R., Nowak W., Jaśkowski J.M., Maćkowiak P., Oszmałek E.P. (2011) Effects of different starch sources on metabolic profile, production and fertility parameters dairy cows. Pol J Vet Sci., 14(1):55-64.

Miller J.K., Brzezińska-Ślebodzińska E., Madsen F.C. (1993a) Oxidative stress, antioxidants, and animals function. J Dairy Sci., 76:2812-2823.

Miller D.M., Buettner G.R., Aust S.D. (1990) Transition metals as catalysts of “autoxidation” reactions. Free Radic. Biol. Med., 8:95-108.

Miller N.J., Rice-Evans C., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A. (1993) A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin Sci (Lond)., 84:407-412.

Mills R.L., Carlos-Valdez L., Burciaga-Robles L.O., Stein D., Step D.L., Fulton R.W., DeSilva U., Krehbiel C.R. (2010) Muscle gene expression in an acute model of bovine respiratory disease. J. Anim. Sci., 88(E-Suppl. 2):738.

Mirzadeh K.H., Tabatabaei S., Bojarpour M., Mamoei M. (2010) Comparative study of hematological parameters according strain, age, sex, physiological status and season in Iranian cattle. Journal of Animal and Veterinary Advances, 9(16):2123-2127.

Mohri M., Sharifi K., Eidi S. (2007) Hematology and serum biochemistry of Holstein dairy calves: age related changes and comparison with blood composition in adults. Research in Veterinary Science, 83:30–39.

Moorby J.M., Dewhurst R.J., Tweed J.K.S., Dhanoa M.S., Beck N.F.G. (2000) Effects of altering the energy and protein supply to dairy cows during the dry period. 2. Metabolic and hormonal responses. J. Dairy Sci., 83:1795-1805.

Mordak R., Nicpoń J. (2006) Hematologiczne i metaboliczne parametry krwi u krów w czasie okołoporodowym i wzrastającej laktacji. Med. Wet., 62:1292-1294.

Mudron P., Kovac G., Konvična J. (1999) The ferric-reducing activity of plasma in dairy cows at different lactation stages. Folia. Vet., 43:29-31.

Multhaup G., Ruppert T., Schlicksupp A., Hesse L., Beher D., Masters C.L., Beyreuther K. (1997) Reactive oxygen species and Alzheimer’s disease. Biochem Pharmacol, 54:533- 539.

132

Murondoti A., Jorritsma R., Beynen A.C., Wensing T., Geelen M.J.H. (2004) Unrestricted feed intake during the dry period impairs the postpartum oxidation and synthesis of fatty acids in the liver of dairy cows. J. Dairy Sci., 87:672-679.

Mutlu S., Abdullah B. (1998) The clinical-chemical parameters, serum lipoproteins and fatty infiltration of the liver in ketotic cows. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, 22:443-447.

Nakamura H., Nakamura K., Yodoi J. (1997) Redox regulation of cellular activation. Ann. Rev. Immunol., 15:351-369.

Nakaya H., Takeda Y., Tohse N., Kanno M. (1992) Mechanism of the membrane depolarization induced by oxidative stress in guinea-pig ventricular cells. J Mol Cell Cardiol, 24:423-534.

Nałęcz-Tarwacka T., Kuczyńska B., Gołębiewski M., Puppel K. (2015) Ocena kondycji (BCS), jako narzędzie w zarządzaniu stadem bydła mlecznego. W pracy zbiorowej pod redakcją Bożeny Ginalskiej pt. „Wyniki badań naukowych w produkcji zwierzęcej i możliwości zastosowania w praktyce”, wyd. Centrum Doradztwa Rolniczego w Brwinowie Oddział w Radomiu, Radom, 5-8.

Nath H.C., Baruah K.K., Baruah A., Sarmah B. (2005) Serum cholesterol and protein in pre, peri and postpartum cows. The Indian veterinary journal, 82(5):519-521.

Nazifi S., Ahmadi M.R., Gheisari H.R. (2008) Hematological changes of dairy cows in postpartum period and early pregnancy. Comp. Clin. Pathol., 17:157–163.

Nazifi S., Razavi S., Hasanshahi F., Esmailnezhad Z. (2009) Effect of the severity of Theileria Annulata infection on some haematological parameters and antioxidant enzymes in naturally infected cattle. Bulgarian Journal of Veterinary Medicine, 1:63-71.

Nazifi S., Saeb M., Ghavami S.M. (2002) Serum lipid profile in Iranian fat tailed sheep in late pregnancy, at parturition and during the post parturition period. Journal Veterinary Medicine, 49:9-12

Nebel R.L., McGilliard M.L. (1993) Interactions of high milk yield and reproductive performance in dairy cows. J Dairy Sci., 76(10):3257-68.

Nielen M., Aarts M.G.A.., Jonkers A.G.M., Wensing T., Schukken Y.H. (1994) Evaluation of two cowside tests for the detection of subclinical ketosis in dairy cows. Can. Vet. J., 35:229- 232.

Nikitin A., Egorov S., Daraselia N., Mazo I. (2003) Pathway studio-the analysis and navigation of molecular networks. Bioinformatics, 19:2155-2157.

Nilsson L., Binart N., Bohlooly Y.M., Bramnert M., Egecioglu E., Kindblom J., Kelly P.A., Kopchick J.J., Ormandy C.J., Ling C., Billig H. (2005) Prolactin and growth hormone

133

regulate adiponectin secretion and receptor expression in adipose tissue. Biochem Biophys Res Commun, 331(4):1120-1126.

Nogalski Z., Łoniewska K., Ambroziak K., Jagłowska B. (2009) Szacowanie poziomu zapasów energetycznych u krów mlecznych na podstawie grubości tłuszczu podskórnego. Acta. Sci. Pol. Zootechnica 8(1-2):31-40.

Nohl H. (1994) Generation of superoxide radicals as byproduct of cellular respiration. Ann. Biol. Clin., 52:199-204.

Nowak W., Jaśkowski J., Wylegała S. (2006) Wpływ żywienia w okresie przejściowym na rozród krów mlecznych. Medycyna Wet. 62(6):632-636.

O’Boyle N., Corl C.M., Gandy J.C., Sordillo L.M. (2006) Relationship of body condition score and oxidant stress to tumor necrosis factor expression in dairy cattle. Vet. Immunol. Immunopathol, 113:297-304.

Oetzel G.R. (2004) Monitoring and testing dairy herds for metabolic disease. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract., 20:651-674.

Ohtani Y., Takahashi T., Sato K., Ardiyanti A., Song S.H., Sato R., Onda K., Wada Y., Obara Y., Suzuki K., Hagino A., Roh S.G., Katoh K. (2012) Changes in circulating adiponectin and metabolic hormone concentrations during periparturient and lactation periods in Holstein dairy cows. Anim Sci J., 83(12):788-95.

Olayemi F.O., Farotimi J.O., Fagbohun O.A. (2000) Haematology of the West African Dwarf Sheep under Two Different Management Systems in Nigeria. African Journal of Biomedical Research, 3(2):197-198.

Olędzki R., Harasym J. (2017) Zmiany aktywności dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy w zróżnicowanych wiekowo krwinkach czerwonych u osób starszych. Probl Hig Epidemiol., 98(1):89-98.

O’Loughlin A., Lynn D.J., McGee M., Doyle S., McCabe M., Earley B. (2012) Transcriptomic analysis of the stress response to weaning at housing in bovine leukocytes using RNA-seq technology. BMC Genomics., 13:250.

Oltenacu P.A., Algers B. (2005) Selection for increased production and the welfare of dairy cows: Are new breeding goals needed? Ambio., 34:311-315.

Oltenacu P.A., Broom D.M. (2010) The impact of selection for increased milk yield on the welfare of dairy cows. Anim. Welf., 19:39-49.

Onasanya G.O., Oke F.O., Sanni T.M., Muhammad A.I. (2015) Parameters Influencing Haematological, Serum and Bio-Chemical References in Livestock Animals under Different Management Systems, OJVM, 8(5):181-189. Dostęp online: http://file.scirp.org/Html/1- 2280209_59218.htm.

134

Ozkurt-Borazan G., Aktas S., Camkerten I., Gokcen A., Ipek H., Sahin T., Uren-Paksoy N. (2011) Erythrocyte superoxide dismutase, catalase activity and malondialdehit level in hypodermosis. J Anim Vet Adv., 10(1):84-86.

Park A.F., Shirley J.E., Titgemeyer E.C., Cochran R.C., Defrain J.M., Wickersham E.E., Johnson D.E. (2010) Characterization of plasma metabolites in holstein dairy cows during the periparturient period. Int. J. Dairy Sci., 5:253-263.

Pastore A., Federici G., Bertini E., Piemonte F. (2003) Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification. Clin Chim Acta, 333:19-39.

Pavlović M., Đurić A., Stevanović I., Begić A., Vujanović D., Ninković M., Đukić M. (2019) Disulfiram partially improves oxidative but not androgen status in rats exposed to cadmium. Arch Biol Sci. Dostęp online: https://doi.org/10.2298/ABS190814057P.

Paździor-Czapula K., Gesek M., Rotkiewicz T., Kluciński W., Kołodziejska J., Kleczkowski M., Fabisiak M. (2014) Immunohistochemical evaluation of superoxide dismutase (Cu/Zn SOD) concentrations in erythrocytes of dairy cattle and farm-raised deer by a computer- assisted analysis of microscopic images. Pol. J. Vet. Sci., 17(2):275-279.

Pechová A., Podhorský A., Lokajová E., Pavlata L., Illek J. (2002) Metabolic effects of chromium supplementation in dairy cows in the peripartal period. Acta Vet Brno, 71:9-18.

Pedernera M., Celi P., Garcia S.C., Salvin H.E., Barchia I., Fulkerson W.J. (2010) Effect of diet, energy balance and milk production on oxidative stres in early-lactating dairy cows grazing pasture. The Veterinary Journal, 186:352-357.

Pedron O., Federicia C.H., Senatore E., Baroli D., Rizzi R. (1993) Effect of body condition score at calving on performance, some blood parameters, and milk fatty acid composition in dairy cows. J. Dairy Sci., 76:2528-2535.

Piccione G., Messina V., Marafioti S., Casella S., Giannetto C., Fazio F. (2012) Changes of some haematochemical parameters in dairy cows during late gestation, post partum, lactation and dry periods. Veterinarija ir Zootechnika, 58(80):59-64.

Piccione G., Messina V., Schembari A., Casella S., Giannetto C., Alberghina D. (2011) Pattern of serum protein fractions in dairy cows during different stages of gestation and lactation. J. Dairy Res., 78:421-425.

Pilarczyk B., Jankowiak D., Tomza-Marciniak A., Pilarczyk R., Sablik P., Drozd R., Tylkowska A., Skolmowska M. (2012) Selenium concentration and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity in serum of cows at different stages of lactation. Biol Trace Elem Res., 147:91-96.

Pintea A., Zinveliu D., Pop R., Andrei S., Kiss E. (2006) Antioxidant status in dairy cows during lactation. Buletin USAMV-CN, 63:130-135.

135

Pizzoferrato L., Manzi P., Marconi S., Fedele V., Claps S., Rubino R. (2007) Degree of antioxidant protection: a parameter to trace the origin and quality of goat’s milk and cheese. J Dairy Sci., 90:4569-4574.

Pompella A., Visvikis A., Paolicchi A., De Tata V., Casini A.F. (2003) The changing faces of glutathione, a cellular protagonist. Biochem Pharmacol, 66:1499-1503.

Poyton R.O., Ball K.A., Castello P.R. (2009) Mitochondrial generation of free radicals and hypoxic signaling. Trends Endocrinol Metab, 20:332-340.

Precht D. (2001) Cholesterol content in European bovine milk fats. Nahrung, 45:2-8.

Pryce J.E., Coffey M.P., Simm G. (2001) The relationship between body condition score and reproductive performance. J. Dairy Sci., 84:1508-1515.

Pryce J.E., Harris B.L. (2006) Genetics of body condition score in New Zealand dairy cows. J. Dairy Sci., 89:4424-4432.

Pushpakumara P.G.A., Gardner N.H., Reynolds C.K., Beever D.E., Wathes D.C. (2003) Relationship between transition period diet, metabolic parameters and fertility in lactating dairy cows. Theriogenology, 60:1165-1185.

Puzanowska-Tarasiewicz H., Kuźmicka L., Tarasiewicz M. (2010) Antyoksydanty a reaktywne formy tlenu. Bromat. Chem. Toksykol., 43:9-14.

Puzanowska-Tarasiewicz H., Starczewska B., Kuźmicka L. (2008) Reaktywne formy tlenu. Bromat. Chem. Toksykol., 41:385-398.

Pysera B., Opałka A. (2000) The effect of gestation and lactation of dairy cows on lipid and lipoprotein patterns and composition in serum during winter and summer feeding. J. Anim. Feed Sci., 9:411-424.

Quiroz-Rocha G.F., LeBlanc S.J., Duffield T.F., Wood D., Leslie K.E., Jacobs R.M. (2009) Reference limits for biochemical and hematological analytes of dairy cows one week before and one week after parturition. Can Vet J., 50(4):383-8.

Raddatz J.R., Elias A.N., Whisnant C.S. (2008) Measurements of Adiponectin in lactating dairy cows. J Anim. Sci.: 86 (E-Suppl.2):60.

Radkowska I. (2015) Zmiany wskaźników hematologicznych i biochemicznych krwi u krów mlecznych w okresie okołoporodowym w zależności od systemu utrzymania. Rocz. Nauk. Zoot., 42(2):171-179.

Radkowska I., Herbut E. (2014) Hematological and biochemical blood parameters in dairy cows depending on the management system. Anim. Sci. Pap. Rep., 32(4):317-325.

136

Rafia S., Taghipour-Bazargani T., Khaki Z., Bokaee S., Sattari Tabrizi S. (2011) Effect of body condition score on dynamics of hemogram in periparturient Holstein cows. Comp. Clin. Pathol., 21(5):933-943.

Ray G., Husain S.A. (2002) Oxidants, antioxidants and carciongenesis. Indian J. Exp. Biol., 11:1213-1232.

Rego A.C., Oliveira C.R. (2003) Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem. Res., 28:1563-1574.

Remppis S., Steingass H., Gruber L., Schenke H. (2011) Effects of energy intake on performance, mobilization and retention of body tissue, and metabolic parameters in dairy cows with special regard to effects of pre-partum nutrition on lactation – A review. Asian– Aust. J. Anim. Sci., 24(4):540-572.

Reuter S., Gupta S.C., Chaturvedi M.M., Aggarwal B.B. (2010) Oxidative stress, inflammation, and cancer: how are they linked? Free Radic Biol Med., 49(11):1603-1616.

Rezaei S.A., Dalir-Naghadeh B. (2006) Evaluation of antioxidant status and oxidative stress in cattle naturally infected with Theileria annulata. Vet. Parasitol., 142:179-186.

Rezapour A., Roudbaneh M. (2011) Effects of food restriction on oxidative stress indices in ghezel ewes. Journal of animal and veterinary advances, 10:980-986.

Richard M.J., Portal B., Meo J., Coudray C., Hadjian A., Favier A. (1992) Malondialdehyde kit evaluated for determining plasma and lipoprotein fractions that react with thiobarbituric acid. Clinical Chemistry, 38(5):704-709.

Roche J.R., Berry D.P., Kolver E.S. (2006) Holstein-Friesian strain and feed effects on milk production, body weight, and body condition score profiles in grazing dairy cows. J. Dairy Sci., 89:3532-3543.

Roche J.R., Blache D., Kay J.K., Miller D.R., Sheahan A.J., Miller D.W. (2008) Neuroendocrine and physiological regulation of intake, with particular reference to domesticated ruminant animals. Nutr. Res. Rev., 21:207-234.

Roche J.R., Friggens N.C., Kay J.K., Fisher M.W., Stafford K.J., Berry D.P. (2009) Invited review: body condition score and its association with dairy cow productivity, health, and welfare. J Dairy Sci., 92:5769-5801.

Rodriguez-Jimenez S., Haerr K.J., Trevisi E., Loor J.J., Cardoso F.C., Osorio J.S. (2018) Prepartal standing behavior as a parameter for early detection of postpartal subclinical ketosis associated with inflammation and liver function biomarkers in peripartal dairy cows. J Dairy Sci., 101(9):8224-8235.

137

Roels F., Geerts A. (1982) Cytoplasmic catalase: cytochemistry and physiology. Ann. NY Acad. Sci., 386:534-536.

Roland L., Drillich M., Iwersen M. (2014) Hematology as a diagnostic tool in bovine medicine. J Vet Diagn Invest., 26(5):592-598.

Rollin E., Berghaus R.D., Rapnicki P., Godden S.M., Overton M.W. (2010) The effect of injectable butaphosphan and cyanocobalamin on postpartum serum beta-hydroxybutyrate, calcium and phosphorus concentrations in dairy cattle. J Dairy Sci., 93:978–987.

Ronchi B., Bernabucci U., Lacetera N., Nardone A. (2000) Oxidative and metabolic status of high yielding dairy cows in different nutritional conditions during the transition period. Proceedings of 51st Annual Mtg. E.A.A.P., Wiedeń, str. 125.

Roubies N., Panouis N., Fytianou A., Katsoulos PD., Giadinis H. (2006) Effects of age and reproductive stage on certain serum biochemical parameters of Chios sheep under Greek rearing conditions. J Vet Med A., 53:277-281.

Sahoo S.S., Patra R.C., Behera P.C., Swarup D. (2009) Oxidative stress indices in the erythrocytes from lactating cows after treatment for subclinical ketosis with antioxidant incorporated in the therapeutic regime. Vet Res Commun., 33(3):281-90.

Sakha M., Ameri M., Rohbkhsh A. (2006) Changes in blood β-hydroxybutyrate and glucose concentrations during dry and lactation periods in Iranian Holstein cows. Comparative Clincal Pathology, 15:221-226.

Saleh M., Salam A., Mileegy I.H.M. (2007) Oxidative antioxidant status during transition from late pregnancy to early lactation in native and cross bred cows in the Egyptian oasis. Assiut Vet Med J., 53:113.

Salvemini F., Franze A., Iervolino A., Filosa S., Salzano S., Ursini M.V. (1999) Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucose-6-phosphate dehydrogenase expression. J. Biol. Chem., 274:2750-2757.

Šamanc H., Kirovski D., Stojić V., Stojanović D., Vujanac I., Prodanović R. (2011) Application of the metabolic profile test in the prediction and diagnosis of fatty liver in Holstein cows. Acta Vet, 61:543-53.

Sattar A., Mirza R.H. (2009) Haematological parameters in exotic cows during gestation and lactation under subtropical conditions. Pak. Vet. J., 29:129-132.

Schulz R., Mahmoudi S., Hattar K., Sibelius U., Olschewski H., Mayer K., Seeger W., Grimminger F. (2000) Enhanced release of superoxide from polymorphonuclear neutrophils in obstructive apnea. Am J Respir Crit Care Med., 162:566-570.

138

Scope A., Filip A.T., Gabled C., Resch F. (2002) The Influence of Stress from Transport and Handling on Hematologic and Clinical Chemistry Blood Parameters of Racing Pigeons (Columba livia domestica). Avian Diseases, 46:224-229.

Seifi H.A., LeBlanc S.J., Leslie K.E., Duffield T.F. (2011) Metabolic predictors of postpartum disease and culling risk in dairy cattle. Vet. J., 188:216-220.

Sepúlveda-Varas P., Weary D.M., Noro M., von Keyserlingk M.A.G. (2015) Transition Diseases in Grazing Dairy Cows Are Related to Serum Cholesterol and Other Analytes. PLoS ONE 10(3):e0122317.

Sevinc M., Basoglu A., Guzelbektas H. (2003) Lipid and lipoprotein levels in dairy cows with fatty liver. Turk. J. Vet. Anim. Sci., 27:295-299.

Sevinc M., Basoglu A., Oztok I., Sandikci M., Birdane F. (1998) The clinical-chemical parameters, serum lipoproteins and fatty infi ltration of the liver in ketotic cows. Turk. J. Vet. Anim. Sci., 22:443-447.

Sgorlon S., Fanzago M., Sandri M., Gaspardo B., Stefanon B. (2015) Association of index of welfare and metabolism with the genetic merit of Holstein and Simmental cows after the peak of lactation. Ital J Anim Sci., 14(3):368-73.

Shanks R.D., Freeman A.E., Dickinson F.N. (1981) Postpartum distribution of costs and disorders of health. J Dairy Sci., 64(4):683-688.

Sharma R.K., Agarwal A. (2004) Role of reactive oxygen species in gynecologic diseases. Reproductive Med and Biol., 3:177-199.

Sharma N., Singh N.K., Singh O.P., Pandey V., Verma P.K. (2011) Oxidative stress and antioxidant status during transition period in dairy cows. Asian-Aust. J. Anim. Sci., 4:479- 484.

Sies H. (1997) Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology, 82(2):291-295.

Sikka S.C. (2001) Relative impact of oxidative stress on male reproduction function. Curr Med Chem., 8(7):851-862.

Simon H.U., Hai-Yehia A., Levi-Schaffer F. (2000) Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis., 5(5):415-418.

Simonov M., Petruh I., Vlizlo V. (2015) Processes of lipid peroxidation and antioxidant defense in dairy cows depending on lactation period and season. Rocz. Nauk. Zoot., 42(2):107-115.

139

Singh S.P. (2014) Characterization of adiponectin at different physiological states in cattle based on an in-house developed immunological assay for bovine adiponectin. Dysertacja doktorska, Uniwersytet w Bonn, Niemcy.

Słoniewski K. (2003) Zmienność fenotypowa i genetyczna cech opisujących kaliber i kondycję krowy w czasie laktacji. Prace i Mat. Zoot. IGHZ-PAN, Jastrzębiec, Mon. i Rozpr., zeszyt 8.

Smith J.L. (1899) Pathological effects due to increase of oxygen tension in air breathed. J Physiol., 24:19-35.

Smith T.R., Hippen A.R., Beitz D.C., Young J.W. (1997a) Metabolic characteristics of induced ketosis in normal and obese dairy cows. J. Dairy Sci., 80:1569-1581.

Smith K.L., Hogan J.S., Weiss W.P. (1997b) Dietary vitamin E and selenium affect mastitis and milk quality. J of Vet Sci., 75:1659-1665.

Søndergaard E., Sørensen M.K., Mao I.L., Jensen J. (2002) Genetic parameters of production, feed intake, body weight, body composition, and udder health in lactating dairy cows. Livest Prod Sci, 77(1):23-24.

Sordillo L.M. (2005) Factors affecting mammary gland immunity and mastitis susceptibility. Livest. Prod. Sci., 98:89-99.

Sordillo L.M., Aitken S.L. (2009) Impact of oxidative stress on the health and immune function of dairy cattle. Veterinary Immunology and Immunopathology, 128:104-109.

Sordillo L.M., Contreras G.A., Aitken S.L. (2009) Metabolic factors affecting the inflammatory response of periparturient dairy cows. Anim. Health Res. Rev., 10:53-63.

Sordillo L.M., O’Boyle N., Gandy J.C., Corl C.M., Hamilton E. (2007) Shifts in thioredoxin reductase activity and oxidant status in mononuclear cells obtained from transition dairy cattle. J. Dairy Sci., 90:1186-1192.

Souza R.M., Junior E.H.B. (2009) Influência do puerperio e da fase pós-puerperal no lipidograma de vacas da raça holandesa criadas no Estado de São Paulo. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci., 46:5-10.

Stefanon B., Sgorlon S., Gabai G., (2005) Usefulness of nutraceutics in controlling oxidative stress in dairy cows around parturition. Vet. Res. Commun., 29:387-390.

Stefańska B. (2014) Metody oceny statusu metabolicznego wysokowydajnych krów mlecznych. Wiadomości Zotechniczne, 2:50-56.

Stefańska B., Nowak W., Pruszyńska-Oszmałek E., Mikuła R., Stanisławski D., Kasprowicz- Potocka M., Frankiewicz A., Maćkowiak P. (2016) The effect of body condition score on the

140

biochemical blood indices and reproductive performance of dairy cows. Ann. Anim. Sci., 16(1):129-143.

Steinhardt M., Thielscher H.H., von Horn T., von Horn R., Ermgassen K., Ladewig J., Smidt D. (1994) The hemoglobin concentration in the blood of dairy cattle of different breeds and their offspring during the peripartum period. Tierarztl Prax., 22:129-135.

Stoldt A.K., Mielenz M., Nürnberg G., Sauerwein H., Esatbeyoglu T., Wagner A.E., Rimbach G., Starke A., Wolffram S., Metges C.C. (2016) Effects of a six-week intraduodenal supplementation with quercetin on liver lipid metabolism and oxidative stress in peripartal dairy cows. J Anim Sci., 94(5):1913-23.

Suthar V.S., Canelas-Raposo J., Deniz A., Heuwieser W. (2013) Prevalence of subclinical ketosis and relationships with postpartum diseases in European dairy cows. J Dairy Sci., 96:2925-2938.

Suzuki Y., Matsumoto T., Okamoto S., Hibi T. (2008) A lecithinized superoxide dismutase (PC-SOD) improves ulcerative colitis. Colorectal Dis., 10(9): 931-934.

Szarek J., Adamczyk K., Felenczak A. (2004) Polish Red Cattle breeding: past and present. AGRI, 35:21-35.

Szymańska-Czerwińska M., Bednarek D. (2007) Białka ostrej fazy i ich znaczenie w ocenie dobrostanu zwierząt. Życie Wet., 82:1002-1005.

Tanaka M., Kamiya Y., Suzuki T., Nakai Y. (2011) Changes in oxidative status in periparturient dairy cows in hot conditions. Animal Science Journal, 82:320-324.

Tanritanir P., Dede S., Ceylan E. (2009) Changes in some macro minerals and biochemical parameters in female healthy siirt hair goats before and after parturition. Journal of Animal and Veterinary Advances, 8:530-533.

Targowski S.P., Kluciński W. (1983) Reduction in mitogenic response of bovine lymphocytes by ketone bodies. Am J Vet Res., 44:828-830.

Targowski S.P., Kluciński W., Littledike E.T., Hoy D.A. (1985) Suppression of mitogenic response of bovine lymphocytes during experimental ketosis in calves. Am J Vet Res., 46(6):1378-1380.

Thomas J.W., Moore L.A. (1951) Variations in heart rate of dairy cows. J Dairy Sci., 34(4):321-328.

Tienken R., Kersten S., Frahm J., Hüther L., Meyer U., Huber K., Rehage J., Dänicke S. (2015) Effects of Prepartum Dietary Energy Level and Nicotinic Acid Supplementation on Immunological, Hematological and Biochemical Parameters of Periparturient Dairy Cows Differing in Parity. Animals (Basel), 5(3):910-933.

141

Tietze F. (1969) Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione: Applications to mammalian blood and other tissues. Anal. Biochem., 27:502-522.

Tiwari B.K., Pandey K.B., Abidi A.B., Rizvi S.I. (2013) Markers of Oxidative Stress during Diabetes Mellitus. Journal of Biomarkers, 378790:8.

Tóthová C., Nagy O., Nagyová V., Kováč G. (2016) Serum protein electrophoretic pattern in dairy cows during the periparturient period. Journal of Applied Animal Research, 46(1):33- 38.

Tracz E., Kupczyński R., Mordak R., Zawadzki M. (2012) Analiza wybranych wskaźników metabolicznych krów utrzymywanych w różnych systemach. Acta Sci. Pol., Medicina Veterinaria, 11(3):15-24.

Trinder N., Woodhouse C.D., Renton C.P. (1969) The effect of vitamin E and selenium on the incidence of retained placentae in dairy cows. Vet Rec., 85:550-553.

Tumbarello D.A., Waxse B.J., Arden S.D., Bright N.A., Kendrick-Jones J., Buss F. (2012) Autophagy receptors link myosin VI to autophagosomes to mediate Tom1-dependent autophagosome maturation and fusion with the lysosome. Nat. Cell Biol., 14:1024-1035.

Turk R., Juretic D., Geres D., Svetina A., Turk N., Flegar-Mestrić Z. (2008) Influence of oxidative stress and metabolic adaptation on PON1 activity and MDA level in transition dairy cows. Anim Reprod Sci., 108:98-106.

Turk R., Juretic D., Geres D., Turk N., Rekic B., Simeon-Rudolf V., Svetina A. (2004) Serum paraoxonase activity and lipid parameters in the early postpartum period of dairy cows. Res in Vet Sci., 76:57-61.

Turk R., Podpečan O., Mrkun J., Kosec M., Flegar-Meštrić Z., Perkov S., Starič .J, Robić M., Belić M., Zrimšek P. (2013) Lipid mobilisation and oxidative stress as metabolic adaptation processes in dairy heifers during transition period. Anim. Repr. Sci., 141:109-115.

Uriu-Adams J.Y., Keen C.L. (2005) Copper, oxidative stress, and human health. Mol. Aspect. Med., 26:268-298.

Valko M., Leiter D., Moncol J., Cronin M.T.D., Mazur M., Telser J. (2007) Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol., 39:44-84.

Valko M., Morris H., Cronin M.T.D. (2005) Metals, toxicity and oxidative stress. Curr. Med. Chem., 12:1161-1208.

Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M., Mazur M. (2006) Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chem. Biol. Interact., 160:1-40.

142

Van Dorland H.A., Richter S., Morel I., Doherr M.G., Castro N., Bruckmaier R.M. (2009) Variation in hepatic regulation of metabolism during the dry period and in early lactation in dairy cows. J. Dairy Sci., 92:1924-1940.

Van Hal N.L., Vorst O., van Houwelingen A.M., Kok E.J., Perijnenburg A., Aharoni A., van Tunen A.J., Keijer J. (2000) The application of DNA microarrays in gene expression analysis. J Biotechnol. 78(3):271-280.

Van den Top A.M., Van Tol A., Jansen H., Geelen M.J., Beynen A.C. (2005) Fatty liver in dairy cows post partum is associated with decreased concentration of plasma triacylglycerols and decreased activity of lipoprotein lipase in adipocytes. J. Dairy Res., 72:129-137.

Veenhuizen J.J., Drackley J.K., Richard M.J., Sanderson T.R., Miller L.D., Joung J.W. (1991) Metabolic changes in blood and liver during development and early treatment of experimental fatty liver and ketosis in cows. J. Dairy Sci. 74:4238-4253.

Veerkamp R.F., Beerda B., Van der Lende T. (2003) Effects of genetic selection for milk yield on energy balance, levels of hormones, and metabolites in lactating cattle, and possible links to reduced fertility. Livestock Production Science 83: 257-275.

Vincent H.K., Taylor A.G. (2006) Biomarkers and potential mechanisms of obesity-induced oxidant stress in humans. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord., 30:400-418.

Visconti R., Grieco D. (2009) New insights on oxidative stress in cancer. Curr Opin Drug Discov Devel, 12:240-245.

Vlizlo V., Petrukh I., Kotsyumbas I., Kosenko Y. (2015) Correlation between products of lipid peroxidation and level of enzymatic activity of antioxidant system in high-producing lactating cows. Magyar Állatorvosok Lapja, 137(suppl. I):335-338.

Wachter C.M., McDaniel B.T., Whitlow L.W., Pettyjohn S. (1999) Genetics of antioxidant activity in Holsteins and Jerseys: associations with various traits. J Dairy Sci., 82(1):31.

Waller K.P. (2000) Mammary gland immunology around parturition. Influence of stress, nutrition and genetics. Adv Exp Med Biol., 480:231-245.

Wathes D.C., Cheng Z., Bourne N., Taylor V.J., Coffey M.P., Brotherstone S. (2007) Differences between primiparous and multiparous dairy cows in the interrelationships between metabolic traits, milk yield and body condition score in the periparturient period. Domest. Anim. Endocrinol., 33(2):203–225.

Wathes D.C., Cheng Z., Chowdhury W., Fenwick M.A., Fitzpatrick R., Morris D.G., Patton J., Murphy J.J. (2009) Negative energy balance alters global gene expression and immune responses in the uterus of postpartum dairy cows. Physiol Genomics, 39:1-13.

Weichselbaum T.E. (1946) An accurate and rapid method for the determination of proteins in small amounts of blood serum and plasma. Am J Clin Pathol., 10:40-49.

143

Weikard R., Demasius W., Hadlich F., Kühn C. (2015) Different blood cell-derived transcriptome signatures in cows exposed to vaccination pre- or postpartum. PLOS One, dostęp online: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136927.

Weiss W.P., Spears J.W. (2006) Role of antioxidants and trace elements in health and immunity of transition dairy cows. Vet J., 176(1):70-76.

Wernicki A., Urban-Chmiel R., Kankofer M., Mikucki P., Puchalski A., Tokarzewski S. (2006) Evaluation of plasma cortisol and TBARS levels in calves after short-term transportation. Rev. Med. Vet., 157:30-34.

Wheeler C.R., Salzman J.A., Elsayed N.M., Omaye S.T., Korte D.W. (1990) Automated assays for superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, and glutathione reductase activity. Anal Biochem., 184:193-199.

Whitaker D.A., Macrae A.I., Burrough E. (2005) Nutrition, fertility and dairy herd productivity. Cattle Practice, 13:27–32.

White C.R., Brock T.A., Chang L-Y., Crapo J., Briscoe P. i wsp. (1994) Superoxide and peroxynitrite in atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 91:1044-1048.

Wiedemann S., Horstmann K., Piechotta M., Meyer U., Flachowsky G., Kaske M. (2013) Intraday variation of metabolic key indicators in serum of dairy cows between week 2 antepartum and week 12 postpartum. Czech J. Anim. Sci., 58(8):343–350.

Wieliczko A. (2013) Wpływ długości okresu zasuszenia krów rasy polskiej holsztyńsko- fryzyjskiej odmiany czerwono-białej różniących się wiekiem na ich stan zdrowia, wydajność mleczną, skład chemiczny siary oraz wyniki odchowu cieląt. Dysertacja doktorska, Wrocław.

Wilde D. (2006) Influence of macro and micro minerals in the periparturient period on fertility in dairy cattle. Anim. reprod. Sci., 96:240-249.

Williamson D.H., Mellanby J., Krebs H.A. (1962) Enzymatic determination of D(-)-β- hydroxybutyric acid and acetoacetic acid in blood. Biochemical J. 82:90-96.

Winnicka A.: Wartości referencyjne podstawowych badań laboratoryjnych w weterynarii. Wydawnictwo SGGW, Warszawa, 2015.

Wittwer F. (1995) Empleo de los perfiles metabólicos en el diagnóstico de desbalances metabólicos nutricionales en el ganado. Buiatría Bovinos, 2:16–20.

Wong S.H., Knight J.A., Hopfer S.M., Zaharia O., Leach C.N., Sunderman F.W. (1987) Lipoperoxides in plasma as measured by liquid-chromatographic separation of malondialdehyde-thiobarbituric acid adduct. Clin. Chem., 33(2):214–220.

Wood D., Quiroz-Rocha G.F. (2010) Normal hematology of cattle. Schalm’s veterinary hematology, 6 edycja, Wiley, Ames, 829-835.

144

Wullepit N., Raes K., Beerda B., Veerkamp R.F., Fremaut D., De Smet S. (2009) Influence of management and genetic merit for milk yield on the oxidative status of plasma in heifers. Livestock Science, 12(2-3):276-282.

Xu C., Wang Z., Liu G., Li X., Xie G., Xia C., Zhang H. (2008) Metabolic characteristic of the liver of dairy cows during ketosis based on comparative proteomics. Asian. Aust. J. Anim. Sci., 21:1003-1010.

Yoshida H., Cheng W., Hung J., Montell D., Geisbrecht E., Rosen D., Liu J., Naora H. (2004) Lessons from border cell migration in the Drosophila ovary: a role for myosin VI in dissemination of human ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci USA, 101:8144-8149.

Young I.S. (2001) Measurement of total antioxidant capacity. J. Clin. Path., 54:339.

Zelko I.N., Mariani T.J., Folz R.J. (2002) Superoxide dismutase multigene family: A comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution and expression. Free Radic Biol Med., 33(3):337–349.

Zerbe H., Schneider N., Leibold W., Wensing T., Kruip T.A., Schuberth H.J. (2000) Altered functional and immunophenotypical properties of neutrophilic granulocytes in postpartum cows associated with fatty liver. Theriogenology 54:771-786.

Zhao W, Chen X., Xiao J., Chen X.H., Liu Y.Z., Sun Z., Zhang F.X., Wang T., Zhen Y.G., Qin G.X. (2019) Prepartum body condition score affects milk yield, lipid metabolism, and oxidation status of Holstein cows. Asian-Australasian journal of animal sciences, 32(12):1889-1896.

Ziętara W. (2007) Ekonomiczne i organizacyjne problemy produkcji mleka przy wysokiej wydajności mlecznej krów. Roczniki Nauk Rolniczych, 93(2):27-36.

Zoldan K., Moellmer T., Schneider J., Fueldner C., Knauer J., Lehmann J. (2014) Increase of CD25 expression on bovine neutrophils correlates with disease severity in post-partum and early lactating dairy cows. Dev Comp Immunol., 7(2):254-63.

Żukowski K. (2006) Znaczenie siary w odchowie cieląt. Wiadomości zootechniczne, 44(1):57-58.

145

X. Załączniki

Tabela 3. Wartości parametrów hematologicznych oraz stężenie związków TBA – reaktywnych w osoczu, kwasu β-hydroksymasłowego i białka całkowitego w surowicy krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych. Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 34) poporodowy (n = 34) szczyt laktacji (n = 34) x  SD x  SD SD Pełna krew: - RBC (1012/l) 6,54  0,59a 6,36 0,44a 6,01 0,53b - HGB (g/l) 11,17 1,47a 11,31 1,19a 10,20 1,04b - HCT (l/l) 0,34 0,04a 0,35 0,04a 0,31 0,04b - MCV (fl) 52,09 5,10b 55,79 5,87a 52,47 4,61b - MCH (pg) 17,10 1,62ab 17,79 1,56a 16,98 1,25b - MCHC (g/dl) 32,79 1,15 31,96 1,97 32,45 1,81 - WBC (109/l) 6,82 1,43 7,22 2,39 6,45 1,87 - LYM (109/l) 3,61 1,04 3,31 0,87 3,29 0,92 - MID (109/l) 0,33 0,25 0,35 0,32 0,30 0,28 - GRA (109/l) 2,87 0,83 3,56 1,92 2,87 1,15 - PLT (109/l) 217,82 67,74 247,38 75,84 282,35 159,43 - MPV (fl) 6,59 0,49 6,67 0,59 6,50 0,61 Osocze: - związki TBA - reaktywne (µmol/l) 1,21 0,26b 1,47 0,35a 1,33 0,41ab Surowica: - BHM (mmol/l) 0,79 0,26b 1,18 0,77ab 1,18 0,54a - białko całkowite (g/l) 72,09 11,99a 66,03 10,09b 67,68 6,37ab Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, RBC - liczba krwinek czerwonych, HGB - stężenie hemoglobiny, HCT - wskaźnik hematokrytowy, MCV - średnia objętość krwinki czerwonej, MCH - średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC - średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, WBC - liczba krwinek białych, LYM - liczba limfocytów, MID - liczba monocytów, GRA - liczba granulocytów (neutrofili, eozynofili i bazofili), PLT - liczba płytek krwi, MPV - średnia objętość płytki, związki TBA - reaktywne - związki reagujące z kwasem tiobarbiturowym, BHM - kwas β-hydroksymasłowy, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

146

Tabela 4. Stężenie wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 34) poporodowy (n = 34) szczyt laktacji (n = 34) x  SD x  SD SD Cholesterol całkowity (mmol/l) 4,02  1,28a 2,68 0,93b 4,59 1,09a HDL (mmol/l) 3,10 0,94b 2,17 0,62c 3,66 0,84a LDL (mmol/l) 1,88 0,83a 1,11 0,68b 1,75 1,04a trójglicerydy (mmol/l) 0,22 0,11a 0,09 0,08b 0,09 0,06b Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, HDL - frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości, LDL - frakcja lipoprotein o niskiej gęstości, a,b,c - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

147

Tabela 5. Aktywność wybranych enzymów ochrony antyoksydacyjnej we krwi krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 34) poporodowy (n = 34) szczyt laktacji (n = 34) x  SD x  SD SD Surowica: - SOD (U/ml) 11,27  3,80a 12,31 5,62a 9,00 2,91b - CAT (U/ml) 21,85 11,41b 34,16 16,10a 19,57 8,21b - GR (U/l) 169,07 94,61a 111,97 59,71b 127,54 77,77ab Hemolizat: - SOD (U/ml) 460,33 95,59b 563,34 138,89a 494,05 123,87b - SOD (U/g Hb) 4127,33 1003,73b 5041,48 1470,31a 4833,97 1289,60ab Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, SOD - dysmutaza ponadtlenkowa, CAT - całkowita katalaza, GR - reduktaza glutationowa, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

148

Tabela 6. Stężenie wybranych parametrów nieenzymatycznych ochrony antyoksydacyjnej we krwi krów rasy polskiej czerwonej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 34) poporodowy (n = 34) szczyt laktacji (n = 34) x  SD x  SD SD Surowica: - TAS (mmol/l) 1,00  0,18 0,95 0,17 0,91 0,18 - bilirubina całkowita (µmol/l) 4,12 1,98 4,52 1,59 4,48 1,76 - kwas moczowy (mmol/l) 0,07 0,02 0,07 0,02 0,08 0,04 - albuminy (g/l) 41,76 9,28 40,02 5,23 39,82 2,67 Hemolizat: - glutation całkowity (µmol/l) 155,37 87,25 168,94 72,98 184,84 73,58 Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, TAS - całkowity status antyoksydacyjny, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

149

Tabela 7. Wartości parametrów hematologicznych oraz stężenie związków TBA – reaktywnych w osoczu, kwasu β-hydroksymasłowego i białka całkowitego w surowicy krów rasy Holsztyńsko-Fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 30) poporodowy (n = 30) szczyt laktacji (n = 30) x  SD x  SD SD Pełna krew: - RBC (1012/l) 6,61  0,51a 6,06 0,54b 6,13 0,66b - HGB (g/l) 10,77 0,99 10,29 1,04 10,60 0,97 - HCT (l/l) 0,32 0,03ab 0,32 0,03a 0,30 0,03b - MCV (fl) 48,53 4,02b 53,60 4,48a 49,07 4,76b - MCH (pg) 16,32 1,17 17,00 0,94 16,48 1,22 - MCHC (g/dl) 33,72 1,32 31,87 1,87 33,68 1,38 - WBC (109/l) 7,06 1,75 7,80 2,56 7,71 1,88 - LYM (109/l) 3,92 1,03 3,86 1,09 3,82 1,05 - MID (109/l) 0,22 0,22 0,17 0,17 0,23 0,23 - GRA (109/l) 2,91 1,18 3,66 2,00 3,66 1,32 - PLT (109/l) 246,03 97,93 302,33 176,07 292,43 86,15 - MPV (fl) 6,26 0,51 5,97 0,54 6,08 0,35 Osocze: - związki TBA - reaktywne (µmol/l) 1,31 0,48 1,39 0,33 1,35 0,40 Surowica: - BHM (mmol/l) 0,51 0,17b 0,91 0,26a 0,80 0,31a - białko całkowite (g/l) 74,53 10,61a 64,33 6,23b 74,67 7,82a Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, RBC - liczba krwinek czerwonych, HGB - stężenie hemoglobiny, HCT - wskaźnik hematokrytowy, MCV - średnia objętość krwinki czerwonej, MCH - średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC - średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, WBC - liczba krwinek białych, LYM - liczba limfocytów, MID - liczba monocytów, GRA - liczba granulocytów (neutrofili, eozynofili i bazofili), PLT - liczba płytek krwi, MPV - średnia objętość płytki, związki TBA - reaktywne - związki reagujące z kwasem tiobarbiturowym, BHM – kwas β-hydroksymasłowy, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

150

Tabela 8. Stężenie wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 30) poporodowy (n = 30) szczyt laktacji (n = 30) x  SD x  SD SD Cholesterol całkowity (mmol/l) 4,19  1,41b 2,30 0,50c 5,80 1,65a HDL (mmol/l) 3,09 0,82b 1,91 0,41c 4,32 1,11a LDL (mmol/l) 1,89 1,02a 0,76 0,29b 2,20 1,15a trójglicerydy (mmol/l) 0,24 0,12a 0,09 0,05b 0,12 0,09b Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, HDL - frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości, LDL - frakcja lipoprotein o niskiej gęstości, a,b,c - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

151

Tabela 9. Aktywność wybranych enzymów ochrony antyoksydacyjnej we krwi krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 30) poporodowy (n = 30) szczyt laktacji (n = 30) x  SD x  SD SD Surowica: - SOD (U/ml) 10,14  3,19a 10,45 3,60ab 9,20 3,00b - CAT (U/ml) 16,98 5,13b 24,21 10,30a 17,70 6,40b - GR (U/l) 109,62 64,42 89,73 58,46 126,36 73,87 Hemolizat: - SOD (U/ml) 439,27 94,40b 550,10 111,94a 479,62 111,59ab - SOD (U/g Hb) 4215,88 1146,31b 5379,82 1357,37a 4766,69 1093,61ab Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, SOD - dysmutaza ponadtlenkowa, CAT - całkowita katalaza, GR - reduktaza glutationowa, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

152

Tabela 10. Stężenie wybranych parametrów nieenzymatycznych ochrony antyoksydacyjnej we krwi krów rasy holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 30) poporodowy (n = 30) szczyt laktacji (n = 30) x  SD x  SD SD Surowica: - TAS (mmol/l) 0,83  0,19 0,92 0,20 0,91 0,22 - bilirubina całkowita (µmol/l) 4,59 1,63 5,63 2,85 4,52 2,21 - kwas moczowy (mmol/l) 0,07 0,02 0,07 0,02 0,08 0,03 - albuminy (g/l) 39,47 8,49 37,17 3,72 38,97 4,20 Hemolizat: - glutation całkowity (µmol/l) 143,44 63,03b 165,54 106,18ab 192,56 59,04a Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, TAS - całkowity status antyoksydacyjny, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

153

Tabela 11. Wartości parametrów hematologicznych oraz stężenie związków TBA – reaktywnych w osoczu, kwasu β-hydroksymasłowego i białka całkowitego w surowicy krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 26) poporodowy (n = 26) szczyt laktacji (n = 26) x  SD x  SD SD Pełna krew: - RBC (1012/l) 6,78  0,69 6,61 0,71 6,54 0,79 - HGB (g/l) 10,59 1,19 10,41 0,81 9,98 1,32 - HCT (l/l) 0,32 0,03 0,31 0,03 0,29 0,03 - MCV (fl) 47,25 4,03 47,67 4,68 43,83 4,80 - MCH (pg) 15,67 1,16 15,83 1,08 15,29 1,40 - MCHC (g/dl) 33,16 0,98 33,23 2,01 34,23 3,10 - WBC (109/l) 7,87 1,33 8,03 2,52 8,30 1,77 - LYM (109/l) 4,57 0,98 4,36 1,48 4,72 1,27 - MID (109/l) 0,28 0,19 0,27 0,26 0,40 0,34 - GRA (109/l) 3,01 1,10 3,40 1,84 3,19 1,08 - PLT (109/l) 223,33 53,21 318,17 148,04 270,33 81,99 - MPV (fl) 6,70 0,54 6,25 0,26 6,38 0,37 Osocze: - związki TBA - reaktywne (µmol/l) 1,50 0,14b 1,85 0,40a 1,67 0,42ab Surowica: - BHM (mmol/l) 1,16 0,36 1,33 0,62 1,40 0,62 - białko całkowite (g/l) 64,23 6,71 64,30 7,19 73,62 13,02 Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, RBC - liczba krwinek czerwonych, HGB - stężenie hemoglobiny, HCT - wskaźnik hematokrytowy, MCV - średnia objętość krwinki czerwonej, MCH - średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej, MCHC - średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej, WBC - liczba krwinek białych, LYM - liczba limfocytów, MID - liczba monocytów, GRA - liczba granulocytów (neutrofili, eozynofili i bazofili), PLT - liczba płytek krwi, MPV - średnia objętość płytki, związki TBA - reaktywne - związki reagujące z kwasem tiobarbiturowym, BHM - kwas β-hydroksymasłowy, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

154

Tabela 12. Stężenie wybranych parametrów gospodarki lipidowej w surowicy krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 26) poporodowy (n = 26) szczyt laktacji (n = 26) x  SD x  SD SD Cholesterol całkowity (mmol/l) 3,40  0,73ab 2,37 0,76b 4,71 1,06a HDL (mmol/l) 2,80 0,66ab 2,04 0,65b 3,82 0,79a LDL (mmol/l) 1,45 0,91ab 0,76 0,62b 2,05 0,71a trójglicerydy (mmol/l) 0,24 0,07a 0,12 0,07b 0,10 0,06b Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, HDL - frakcja lipoprotein o wysokiej gęstości, LDL - frakcja lipoprotein o niskiej gęstości, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

155

Tabela 13. Aktywność wybranych enzymów ochrony antyoksydacyjnej we krwi krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i Holsztyńsko-Fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 26) poporodowy (n = 26) szczyt laktacji (n = 26) x  SD x  SD SD Surowica: - SOD (U/ml) 15,33  1,67b 18,99 1,94a 12,79 3,09b - CAT (U/ml) 18,44 9,34b 32,61 15,20a 23,93 8,49ab - GR (U/l) 155,25 81,08 147,28 70,69 179,97 84,38 Hemolizat: - SOD (U/ml) 507,90 143,69 531,25 171,25 512,02 154,34 - SOD (U/g Hb) 4902,08 1418,66 5128,07 1720,36 5333,01 1613,26 Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, SOD - dysmutaza ponadtlenkowa, CAT - całkowita katalaza, GR - reduktaza glutationowa, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

156

Tabela 14. Stężenie wybranych parametrów nieenzymatycznych ochrony antyoksydacyjnej we krwi krów pochodzących z krzyżówki bydła rasy czerwonej norweskiej i holsztyńsko-fryzyjskiej w różnych okresach produkcyjnych.

Okresy produkcyjne Parametry zasuszenie (n = 26) poporodowy (n = 26) szczyt laktacji (n = 26) x  SD x  SD SD Surowica: - TAS (mmol/l) 0,88  0,23 0,95 0,30 1,06 0,27 - bilirubina całkowita (µmol/l) 4,04 1,07 6,29 2,71 4,05 1,09 - kwas moczowy (mmol/l) 0,07 0,02ab 0,05 0,02b 0,08 0,02a - albuminy (g/l) 36,46 1,71ab 33,46 3,95b 38,85 5,79a Hemolizat: - glutation całkowity (µmol/l) 171,43 29,62 181,43 21,72 193,18 50,56 Objaśnienia: n - liczba pomiarów w dwóch cyklach produkcyjnych, - średnia arytmetyczna z dwóch kolejnych cykli produkcyjnych, SD - odchylenie standardowe, TAS - całkowity status antyoksydacyjny, a,b - różnice istotne statystycznie (p<0,05) pomiędzy wartościami średnimi zawartymi w tym samym wierszu.

157

Tabela 15. Całkowita liczba genów o istotnie różnej ekspresji w komórkach jądrzastych krwi obwodowej bydła rasy czerwonej polskiej (PR) i bydła rasy holsztyńsko-fryzyjskiej (HF) w trzech różnych okresach cyklu produkcyjnego: I – okres zasuszenia; II – okres poporodowy; III – szczyt laktacji.

Nazwa grupy PR - I PR - II PR - III HF - I HF - II HF - III

PR - I 85 21 13 58 41 36

PR - II 85 6 71 12 39

PR - III 85 69 25 42

HF - I 85 62 28

HF - II 85 17

HF - III 85

158

Tabela 16. Lista genów o zmienionej istotne ekspresji w komórkach jądrzastych krwi obwodowej bydła rasy czerwonej polskiej (PR) i bydła rasy holsztyńsko-fryzyjskiej (HF) w trzech różnych okresach cyklu produkcyjnego.

Wartość p Symbol L. p. Nazwa genu (skorygownana) genu Bos taurus zinc finger protein 613 (ZNF613), mRNA 1 0,03445955 ZNF613 [NM_001103337] Rep: Helicase-like transcription factor (EC 3.6.1.-) (SWI/SNF- related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin subfamily A member 3) (Sucrose nonfermenting 2 0,040526688 protein 2-like 3) (DNA-binding protein/plasminogen activator inhibitor 1 regulator) (HIP - Canis familiaris, partial (44%) [TC415855] Bos taurus zinc finger protein 2 homolog (mouse) (ZFP2), 3 0,036439963 ZFP2 mRNA [NM_001098146] PREDICTED: Bos taurus KIAA0090 ortholog (KIAA0090), 4 0,039852872 EMC1 mRNA [XM_585215] Bos taurus helicase (DNA) B (HELB), mRNA 5 0,047432903 HELB [NM_001206182] Bos taurus THO complex 1 (THOC1), mRNA 6 0,048377734 THOC1 [NM_001205480] Bos taurus serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), 7 0,02615438 SERPINB2 member 2 (SERPINB2), mRNA [NM_001192079] Bos taurus mitochondrial ribosomal protein S31 (MRPS31), 8 0,038909424 MRPS31 mRNA [NM_001076015] Bos taurus C-type lectin domain family 4, member D 9 0,038909424 CLEC4D (CLEC4D), mRNA [NM_001193117] CR551896 Normalized and Subtracted bovine embryonic and 10 0,038909424 extraembryonic tissues (bcaz [CR551896] basic helix-loop-helix family, member e23 [Source:HGNC 11 0,04357645 BHLHE23 Symbol;Acc:16093] [ENSBTAT00000014445] Bos taurus polymerase (RNA) III (DNA directed) polypeptide 12 0,042898845 POLR3A A, 155kDa (POLR3A), mRNA [NM_001083750] syntaxin 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:3403] 13 0,02615438 STX2 [ENSBTAT00000061491] Bos taurus nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)- 14 0,032061465 NUDT16L1 type motif 16-like 1 (NUDT16L1), mRNA [NM_001034526] Bos taurus Fas (TNFRSF6) binding factor 1 (FBF1), mRNA 15 0,04190962 FBF1 [NM_001075642] centrosomal protein 192kDa [Source:HGNC 16 0,038909424 SEH1L Symbol;Acc:25515] [ENSBTAT00000017803] Bos taurus UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N- 17 0,04190962 B3GNT2 acetylglucosaminyltransferase 2 (B3GNT2), mRNA [NM_001102497] Bos taurus DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 38 18 0,038909424 DHX38 (DHX38), mRNA [NM_001075798] PREDICTED: Bos taurus uncharacterized LOC100139887 19 0,038909424 (LOC100139887), miscRNA [XR_139482]

159

PREDICTED: Bos taurus solute carrier family 39 (metal ion 20 0,038909424 transporter), member 11 (SLC39A11), transcript variant X1, mRNA [XM_005221267] Bos taurus microphthalmia-associated transcription factor 21 0,038909424 MITF (MITF), mRNA [NM_001001150] Bos taurus ATP/GTP binding protein-like 5 (AGBL5), mRNA 22 0,044858713 AGBL5 [NM_001024564] Bos taurus ATPase, Na+/K+ transporting, beta 3 polypeptide 23 0,039852872 ATP1B3 (ATP1B3), mRNA [NM_001035393] Bos taurus zinc finger and BTB domain containing 9 (ZBTB9), 24 0,04190962 ZBTB9 mRNA [NM_001191462] Bos taurus solute carrier family 25 (carnitine/acylcarnitine 25 0,04190962 SLC25A20 translocase), member 20 (SLC25A20), mRNA [NM_001077936] Bos taurus testis expressed 2 (TEX2), mRNA 26 0,039852872 TEX2 [NM_001101970] Bos taurus dishevelled, dsh homolog 1 (Drosophila) (DVL1), 27 0,044858713 DVL1 mRNA [NM_001206601] Bos taurus zinc finger protein 287 (ZNF287), mRNA 28 0,038909424 ZNF287 [NM_001205803] 29 0,038909424 ANXA4 Bos taurus annexin A4 (ANXA4), mRNA [NM_001001440] Bos taurus catechol-O-methyltransferase (COMT), mRNA 30 0,038909424 COMT [NM_001102317] 31 0,02615438 Bos taurus cDNA clone IMAGE:8120706. [BC104568] 32 0,04190962 MYO6 Bos taurus myosin VI (MYO6), mRNA [NM_001206072] Bos taurus nuclear receptor binding protein 2 (NRBP2), mRNA 33 0,039852872 NRBP2 [NM_001077848] 34 0,039031833 TPM4 Bos taurus tropomyosin 4 (TPM4), mRNA [NM_001101162] syntaxin 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:3403] 35 0,02615438 STX2 [ENSBTAT00000061491] Bos taurus chromosome X open reading frame, human 36 0,039031833 CXHXorf65 CXorf65 (CXHXorf65), mRNA [NM_001077032] ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 10 37 0,032061465 ABCC10 [Source:HGNC Symbol;Acc:52] [ENSBTAT00000007685] Uncharacterized protein 38 0,0475552 LOC529535 [Source:UniProtKB/TrEMBL;Acc:F1MWW2] [ENSBTAT00000045622] Bos taurus 5'-3' exoribonuclease 2 (XRN2), mRNA 39 0,038909424 XRN2 [NM_001192472] Bos taurus calcium binding protein 1, mRNA (cDNA clone 40 0,044858713 CABP1 IMAGE:8112400), complete cds. [BC133556] Bos taurus chromosome 9 open reading frame, human CXorf21 41 0,048262946 C9HXorf21 (C9HXorf21), mRNA [NM_001038537] 42 0,048027325 Bos taurus Fc fragment of IgG, receptor, transporter, alpha 43 0,04190962 FCGRT (FCGRT), mRNA [NM_176657] Bos taurus spastic paraplegia 20 (Troyer syndrome) (SPG20), 44 0,03445955 SPG20 mRNA [NM_001077996] Bos taurus capping protein (actin filament) muscle Z-line, beta 45 0,04190962 CAPZB (CAPZB), mRNA [NM_176648]

160

46 0,04190962 LOC781146 Bos taurus lysozyme (LOC781146), mRNA [NM_001080336] Bos taurus thioredoxin-like 1 (TXNL1), mRNA 47 0,045398597 TXNL1 [NM_001077886] Rep: Isoform EP3D of P34979 - Bos taurus (Bovine), partial 48 0,04190962 (5%) [TC423954] Bos taurus carboxymethylenebutenolidase homolog 49 0,044858713 CMBL (Pseudomonas) (CMBL), mRNA [NM_001192983] Bos taurus guanine deaminase (GDA), mRNA 50 0,038909424 GDA [NM_001192620] Bos taurus pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 (PDK4), 51 0,03445955 PDK4 mRNA [NM_001101883] Bos taurus diacylglycerol kinase, epsilon 64kDa (DGKE), 52 0,04190962 DGKE mRNA [NM_001192930] Bos taurus toll-like receptor 7 (TLR7), mRNA 53 0,038909424 TLR7 [NM_001033761] Rep: Ribonuclease H1 - Bos taurus (Bovine), complete 54 0,044858713 [TC396681] Bos taurus interleukin 2 receptor, alpha (IL2RA), mRNA 55 0,043053802 IL2RA [NM_174358] Bos taurus oxidized low density lipoprotein (lectin-like) 56 0,04190962 OLR1 receptor 1 (OLR1), mRNA [NM_174132] Bos taurus C-type lectin domain family 4, member D 57 0,02615438 CLEC4D (CLEC4D), mRNA [NM_001193117] Bos taurus nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3 58 0,038909424 NR1H3 (NR1H3), mRNA [NM_001014861] Rep: PREDICTED: A-kinase anchor protein 11 isoform 4 - Pan 59 0,032061465 troglodytes, partial (7%) [TC438620] Bos taurus CLK4-associating serine/arginine rich protein 60 0,03445955 CLASRP (CLASRP), mRNA [NM_001077887] Rep: Transcriptional regulator, GntR family - Fusobacterium 61 0,038909424 nucleatum subsp. nucleatum, partial (6%) [TC428907] Bos taurus nuclear receptor coactivator 4 (NCOA4), mRNA 62 0,04329574 NCOA4 [NM_001075868] SEC24 family member D [Source:HGNC Symbol;Acc:10706] 63 0,04190962 SEC24D [ENSBTAT00000004721] Bos taurus pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 (PDK4), 64 0,038909424 PDK4 mRNA [NM_001101883] Bos taurus NSA2 ribosome biogenesis homolog (S. cerevisiae) 65 0,04190962 NSA2 (NSA2), mRNA [NM_001034546] Bos taurus E2F transcription factor 6 (E2F6), mRNA 66 0,04190962 E2F6 [NM_001076848] Bos taurus heme binding protein 1 (HEBP1), mRNA 67 0,02615438 HEBP1 [NM_001075985] Bos taurus nuclear receptor subfamily 1, group H, member 3 68 0,038909424 NR1H3 (NR1H3), mRNA [NM_001014861] Bos taurus Fc fragment of IgG, receptor, transporter, alpha 69 0,038909424 FCGRT (FCGRT), mRNA [NM_176657] Bos taurus zinc finger protein, X-linked (ZFX), mRNA 70 0,038909424 ZFX [NM_177490] Rep: Protein transport protein Sec24D - Homo sapiens 71 0,04329574 (Human), partial (9%) [TC434506]

161

Bos taurus integrin, alpha 10 (ITGA10), mRNA 72 0,03445955 ITGA10 [NM_001205590] BovGen_04251 normal cattle brain Bos taurus cDNA clone 73 0,038909424 RZPDp1056B0252Q 5', mRNA sequence [CO875926] Bos taurus sentrin-specific protease 7-like (LOC507820), 74 0,04443533 LOC507820 mRNA [NM_001101888] Bos taurus SMAD family member 5 (SMAD5), mRNA 75 0,032061465 SMAD5 [NM_001077107] Bos taurus C-terminal binding protein 2 (CTBP2), mRNA 76 0,038909424 CTBP2 [NM_175712] Uncharacterized protein 77 0,038909424 CPT1A [Source:UniProtKB/TrEMBL;Acc:E1BKY3] [ENSBTAT00000029336] Bos taurus secretory carrier membrane protein 5 (SCAMP5), 78 0,038909424 SCAMP5 mRNA [NM_001166565] Bos taurus 2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa 79 0,038909424 OAS1Z (OAS1Z), mRNA [NM_001029846] Bos taurus eukaryotic translation initiation factor 2-alpha 80 0,045398597 EIF2AK3 kinase 3 (EIF2AK3), mRNA [NM_001098086] Bos taurus alkaline ceramidase 3 (ACER3), mRNA 81 0,04190962 ACER3 [NM_001102285] syntaxin 2 [Source:HGNC Symbol;Acc:3403] 82 0,039031833 STX2 [ENSBTAT00000061491] Bos taurus guanine nucleotide binding protein (G protein), beta 83 0,03445955 GNB4 polypeptide 4 (GNB4), mRNA [NM_001099033] Bos taurus succinate-CoA ligase, ADP-forming, beta subunit 84 0,04190962 SUCLA2 (SUCLA2), mRNA [NM_001075493]

162

Tabela 17. Istotnie zmienione szlaki sygnałowe, w które zaangażowane są geny o zmienionej istotne ekspresji w komórkach jądrzastych kriw obwodowej bydła rasy czerwonej polskiej (PR) i bydła rasy holsztyńsko-fryzyjskiej (HF) w trzech różnych okresach cyklu produkcyjnego.

Nazwa szlaku Rodzaj szlaku Geny istotnie zmienione wartość p Tworzenie Procesy TPM4 (tropomyosin 4); CAPZB (capping 0,015668 cytoszkieletu komórkowe protein (actin filament) muscle Z-line, beta) aktynowego Ruch oparty na Procesy TPM4 (tropomyosin 4); MYO6 (myosin 6) 0,025582 aktomiozynie komórkowe Sygnalizacja Sygnalizacja NR1H3 (nuclear receptor subfamily 1, group H, 0,035257 adiponektyny międzykomórkowa member 3 ); SLC25A20 (solute carrier family 25 (carnitine/acylcarnitine translocase), member 20); CPT1A (carnitine palmitoyltransferase 1A (liver)); SUCLA2 (succinate-CoA ligase, ADP- forming, beta subunit); IL2RA (interleukin 2 receptor, alpha); PDK4 (pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4); MITF (microphthalmia- associated transcription factor ) Leptyna -> Szlaki IL2RA (interleukin 2 receptor, alpha) 0,03731 produkcja nocyceptywne CD25/IL6/IL10 TGFBR -> Sygnalizacja SMAD5 (SMAD family member 5) 0,040591 sygnalizacja receptorowa SMAD1/5/9

163

Wyrażam zgodę na udostępnianie mojej pracy w czytelniach Biblioteki SGGW.

…………………………………… (czytelny podpis autora)

164