Klinická Onkologie

âipové technologie v onkologickém klinická v˘zkumu a praxi onkologie Microarray technologies in oncologic research and clinical practice Supplement 2006 ROâNÍK 19

REDAKâNù ZPRACOVAL: SVOBODA Marek, HAJDÚCH Marián Prosinec 2006

VYDÁVÁ âASOPIS âESKÉ ONKOLOGICKÉ SPOLEâNOSTI âESKÁ LÉKA¤SKÁ A SLOVENSKEJ ONKOLOGICKEJ SPOLOâNOSTI SPOLEâNOST J. E. PURKYNù IâO 444359 THE JOURNAL OF THE CZECH AND SLOVAK ONCOLOGICAL SOCIETIES V NAKLADATELSTVÍ ApS BRNO, spol. s r. o. VEDOUCÍ REDAKTOR: REJTHAR ALE· IâO 543535 ZÁSTUPCE VEDOUCÍHO REDAKCE: REDAKTORA: KOZA IVAN MasarykÛv onkologick˘ ústav Brno V¯KONN¯ REDAKTOR: FAIT VUK Îlut˘ kopec ã. 7 656 53 Brno

Sekretáfi redakce: REDAKTO¤I: ing. Zdenûk Bou‰a âOUPEK PETR VALÍK DALIBOR tel., fax: 543 134 226 HÁJEK ROMAN VORLÍâEK JI¤Í Pfiijetí pfiíspûvkÛ: KOCÁK IVO ÎALOUDÍK JAN e-mail: [email protected] e-mail: [email protected]

Tiskne Moravská typografie, a. s. Brno, Moravské námûstí 13 IâO 15549763 REDAKâNÍ RADA: ADAM ZDENùK, Brno KOVA¤ÍK JAN, Brno Vychází 6krát roãnû BABU·ÍKOVÁ OLGA, Bratislava KOZA IVAN, Bratislava Roãní pfiedplatné 180 Kã BEDNA¤ÍK OTAKAR, Brno MAYER JI¤Í, Brno pro studenty LF 90 Kã BILDER JOSEF, Brno MECHL ZDENùK, Brno âOUPEK PETR, Brno NùMEC JAROSLAV, Brno Expedici na základû roãní objednávky DRBAL JOSEF, Brno ONDRU· DALIBOR, Bratislava vyfiizuje redakce ECKHARDT SANDOR, Budape‰È PAâOVSK¯ ZDENùK, Brno FAIT VUK, Brno PLE·KO IVAN, Bratislava Ministerstvo kultury âR HÁJEK ROMAN, Brno PETRUÎELKA LUBO·, Praha MK âR 5158 JURGA LUDOVIT, Trnava REJTHAR ALE·, Brno ISSN 0862-495 X KALLAY JOZEF, Bratislava SPURN¯ VLADIMÍR, Brno KAU·ITZ JURAJ, Bratislava UJHÁZY VILIAM, Bratislava INTERNET – vstupní adresa: KLASTERSK¯ JAN, Brusel VORLÍâEK JI¤Í, Brno http://www.linkos.cz KLENER PAVEL, Praha VYZULA ROSTISLAV, Brno KOCÁK IVO, Brno WAGNEROVÁ MÁRIA, Ko‰ice INDEXED IN EXCERPTA MEDICA KOUTECK¯ JOSEF, Praha ÎALOUDÍK JAN, Brno â I P O V É T E C H N O L O G I E V O N K O L O G I C K É M V ¯ Z K U M U A P R A X I O B S A H 2 0 0 6 Úvodní slovo ...... 330 V‰eobecn˘ pfiehled 1.Brdiãka R., Bruchová H. Vznik a rozmach ãipov˘ch technologií ...... 331 2.Merkerová M., Kráãmarová A., Bruchová H., Brdiãka R. VyuÏití bioãipov˘ch technologií v onkologii ...... 333 3.Koutná I., Krontorád P., Svoboda Z., Kozubek M. Vybrané aplikace technologie cDNA microarrays v onkologickém v˘zkumu ...... 338 4.Jaro‰ová M., Pospí‰ilová H., Plach˘ R., Papajík T., Koptíková J., Indrák K. Urãování nebalancovan˘ch genov˘ch zmûn metodou array komparativní genomové hybridizace (array CGH) u nádorÛ ...... 342 5.Malãíková J., Tich˘ B., Kota‰ková J., Mayer J., Pospí‰ilová ·. Od genomu k proteomu - vyuÏití proteinov˘ch ãipÛ v onkologii ...... 346 6.Tich˘ B., Svoboda M., Mayer J. a Pospí‰ilová ·. Odbûr a zpracování vzorkÛ pro expresní DNA ãipy ...... 350 7.Dziechciarková M., Berkovcová J., Trojanec R., Srovnal P., Bouchalová K. Hajdúch M. VyuÏití laserové mikrodisekce pro pfiípravu komplexních vzorkÛ z nádorové tkánû pro úãely mikrogenomick˘ch anal˘z ...... 355 8.Bouchal J., Turashvili G., Koláfi Z. Mikroãipová anal˘za genové exprese v mikrodisekovan˘ch vzorcích ...... 360 9.Pavlík T., Jarkovsk˘ J. Statistické metody v anal˘ze dat z DNA mikroãipÛ ...... 365 10.Budinská E., Jarkovsk˘ J. Metody detekce alterovan˘ch oblastí DNA z dat CGH arrays ...... 368

Klinick˘ pﬁehled 11. Svoboda M., Grell P., Fabián P., Palácová M., Petráková K., Nenutil R., Hajdúch M., Vyzula R. Molekulární taxonomie a prediktivní systémy karcinomu prsu definované na základû profilÛ genové exprese ...... 373 12. Slab˘ O., Garajová I., Svoboda M., Kocáková I., Vyzula R. Studium patogeneze kolorektálních karcinomÛ pomocí profilÛ genové exprese a moÏnosti jejich vyuÏití v diagnostické a prediktivní onkologii ...... 382 13. Svoboda M., Vá‰ová I., Kota‰ková J., Malãíková J., Fabián P., Tich˘ B., Berkovcová J., Klabusay M., Rejthar A. Aplikace DNA ãipÛ u lymfoidních malignit ...... 389 14. Dudová S., Bártová E., Pour L., Krejãí J., Hájek R. Profilování genové exprese u mnohoãetného myelomu ...... 397

PÛvodní práce 15. Slab˘ O., Garajová I., Svoboda M., Fabián P., Svoboda M., Srovnal J., ·merdová T., Kocáková I., ·efr R., Jech Z., Hoch J., Vyzula R. Pilotní studie identifikace prognostick˘ch markerÛ pacientÛ s kolorektálním karcinomem anal˘zou profilÛ genové exprese ...... 402 16. Michalová E., Hrstka R., ·tûrba J., Mendelová D., Valík D., Babãanová S., Kﬁivánková K., Vojtû‰ek B. Studium vlivu methotrexátu na expresi genÛ p53-signální dráhy v leukemick˘ch buÀkách pomocí cDNA array . . . . .407 17. Pospí‰ilová H., Morzuch L., Jaro‰ová M., Vandenberge P., Wlodarska I. Array comparative genomic hybridisation as a tool for a rapid mapping of breakpoints in unbalanced translocations in leukemia ...... 411 18 Bruchová H., Kráãmarová A., Klamová H., Brdiãka R. Detekce expresních profilÛ u pacientÛ s CML pomocí Atlas Plastic 8K Microarrays ...... 415 19. Obrazová ãást ...... 419 C O N T E N T S Introduction ...... 330 General reviews 1. Brdiãka R., Bruchová H. The rise and expansion of biochip technologies ...... 331

2. Merkerová M., Kráãmarová A., Bruchová H., Brdiãka R. Microarray technology application in oncology ...... 333

3. Koutná I., Krontorád P., Svoboda Z., Kozubek M. Selected applications of cDNA microarrays technology in oncological research ...... 338

4. Jaro‰ová M., Pospí‰ilová H., Plach˘ R., Papajík T., Koptíková J., Indrák K. Determination of genomic imbalances using array comparativeg enomic hybridization (aray CGH) in cancer genom ...... 342

5. Malãíková J., Tich˘ B., Kota‰ková J., Mayer J., Pospí‰ilová ·. From genome to proteome - using of protein microarrays in oncology ...... 346

6. Tich˘ B., Svoboda M., Mayer J. a Pospí‰ilová ·. Sample taking and processing for expression DNA microarrays ...... 350

7. Dziechciarková M., Berkovcová J., Trojanec R., Srovnal P., Bouchalová K. Hajdúch M. The utilization of laser capture microdissection for construction of specific samples from cancer tissue in order to microgenomic analyses ...... 355

8. Bouchal J., Turashvili G., Koláﬁ Z. Microarray analysis of gene expression in microdissected samples ...... 360

9. Pavlík T., Jarkovsk˘ J. Statistical methods for analysing gene expression microarray data ...... 365

10. Budinská E., Jarkovsk˘ J. Statistical approaches for identification of areas of DNA alteration analyzed by CGH arrays ...... 368 Clinical review 11. Svoboda M., Grell P., Fabián P., Palácová M., Petráková K., Nenutil R., Hajdúch M., Vyzula R. Breast cancer molecular taxonomy and predictive systems based on gene expression profiling ...... 373

12. Slab˘ O., Garajová I., Svoboda M., Kocáková I., Vyzula R. Studies on colorectal cancer pathogenesis by gene expression profiles and possibilities of their application to diagnostic and predictive oncology ...... 382

13. Svoboda M., Vá‰ová I., Kota‰ková J., Malãíková J., Fabián P., Tich˘ B., Berkovcová J., Klabusay M., Rejthar A. DNA microarrays in lymphoid malignancies ...... 389

14. Dudová S., Bártová E., Pour L., Krejãí J., Hájek R. Gene expression profiling in multiple myeloma ...... 397

Original publications 15. Slab˘ O., Garajová I., Svoboda M., Fabián P., Svoboda M., Srovnal J., ·merdová T., Kocáková I., ·efr R., Jech Z., Hoch J., Vyzula R. Identification of colorectal cancer prognostic markers by gene expression profiles analysis: pilot study ...... 402

16. Michalová E., Hrstka R., ·tûrba J., Mendelová D., Valík D., Babãanová S., Kﬁivánková K.,Vojtû‰ek B. cDNA array analysis of p53-signalling pathway genes in leukemic cells treated with methotrexate ...... 407

17. Pospí‰ilová H., Morzuch L., Jaro‰ová M., Vandenberge P., Wlodarska I. Array comparative genomic hybridisation as a tool for a rapid mapping of breakpoints in unbalanced translocations in leukaemia ...... 411

18. Bruchová H., Kráãmarová A., Klamová H., Brdiãka R. Gene expression profiling in CML patients using Atlas Plastic 8K Microarrays ...... 415

19. Supplementary pictures ...... 419 ÚVODNÍ SLOVO

Klinická onkologie a onkohematologie ãelí v posledních nûkolika letech stoupajícímu poãtu v˘sledkÛ plynoucích z molekulárního v˘zkumu patogeneze maligních onemocnû- ní. Tyto informace jsou implementovány jak v oblasti diagnostické, tak terapeutické. Objevují se nová protinádorová léãiva principiálnû odli‰ného charakteru neÏ klasická cytostatika. Jejich mechanismus úãinku je pfiísnû specifick˘ pro urãité typy nádorÛ. Para- lelnû se zavádûním nov˘ch léãiv na trh se do popfiedí zájmu dostávají biomarkery úãin- nosti definující s pfiijatelnou pravdûpodobností skupinu pacientÛ, ktefií budou z této spe- cifické léãby profitovat, dochází k individualizaci terapie. Tato individualizace se nevztahuje jenom na daného pacienta, ale mÛÏe b˘t specifická pro dan˘ nádor v daném ãase a postihuje tak biologickou podstatu zhoubného bujení, která je zejména u solidních nádorÛ zaloÏena na mimofiádné heterogenitû, pfiizpÛsobivosti a genetické nestabilitû nádo- rov˘ch populací.

Individualizovaná cílená terapie, zaloÏená na komplexním poznání biologick˘ch charakteristik nádoru i jeho nositele, pfiedstavuje nov˘ pfiístup, kter˘ byl umoÏnûn rozvojem moderních vy‰etfiovacích metod, zvlá‰tû cytogenetick˘ch a molekulárnû - biologick˘ch. Na principu cílené léãby se rozvíjí prediktivní onkologie, která se zab˘vá hledáním pre- diktivních znakÛ, pfiedpovídajících úãinnost urãitého léãebného postupu (chemoterapie, imunoterapie, radioterapie).

Komplexní zmûny v nádorovém genomu je moÏné jen s obtíÏemi studovat s pouÏitím tradiãních metod, které jsou vhodné k anal˘ze jednoho nebo nûkolika málo genÛ. Velké nadûje se právû proto vkládají do DNA ãipÛ a dosavadní publikované práce dokazují, Ïe molekulární taxonomie a prediktivní systémy zaloÏené na profilech genové exprese pﬁed- stavují správnou cestu k pﬁesnûj‰ímu poznání biologick˘ch vlastností nádoru v daném ãase a k dosaÏení lep‰ích léãebn˘ch v˘sledkÛ.

Toto zvlá‰tní ãíslo Klinické onkologie si klade za cíl podat pfiehled o pracovi‰tích zab˘- vajících se touto problematikou v âeské republice a seznámit ãtenáfie s nejv˘znamnûj- ‰ími poznatky, kter˘ch bylo ve studiu biologick˘ch vlastností nádorÛ dosaÏeno pomocí technologie DNA ãipÛ. Pfii skládání obsahu jsme se snaÏili pokr˘t celou oblast této nové technologie poãínaje od pfiípravy vzorkÛ, technického provedení, datové anal˘zy a zejmé- na poukázat na v˘sledky o kter˘ch jsme pfiesvûdãení, Ïe mají nebo v dohledné dobû budou mít zásadní dopad pro klinickou praxi. Je na Vás, ãtenáfiích, abyste posoudili do jaké míry se nám to podafiilo. Na závûr nezb˘vá, neÏ podûkovat v‰em participujícím autorÛm.

18. ﬁíjna 2006 Brno/Olomouc MUDr. Marián Hajdúch, PhD. MUDr. Marek Svoboda

330 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 v‰eobecn˘ pﬁehled

VZNIK A ROZMACH âIPOV¯CH TECHNOLOGIÍ THE RISE AND EXPANSION OF BIOCHIP TECHNOLOGIES BRDIâKA R., BRUCHOVÁ H.:

ÚSTAV HEMATOLOGIE A KREVNÍ TRANSFUZE, PRAHA

Souhrn Bioãipové technologie se zaãaly rozvíjet zhruba pfied 10 lety a jejich pouÏití stálé vzrÛstá a roz‰ifiuje se mnoÏství jejich aplikací. Od základní aplikace na problematiku molekulárnû genetickou, kdy analyzovanou substancí byly nukleové kyseliny, se postupnû jejich pouÏívání roz‰ífiilo i na bílkoviny, cukry a alespoÀ co se t˘ká pouÏívaného oznaãení i na buÀky a tkánû. V˘voj se ubíral v zásadû dvûma smûry, smûrem k neustálému zvût‰ování poãtu sou- ãasnû provádûn˘ch detekcí a smûrem k ãipÛm specializovan˘m na fie‰ení urãit˘ch specifick˘ch otázek.

Klíãová slova: Nové technologie v molekulární diagnostice, aktivní a pasivní DNA ãipy, mikroarraye a makro- arraye, genomové nanoprocesory.

Abstract Biochip technologies have arisen and expanded during the last decade and the scope of them is now very broad. At the very beginning the analyzed substance was nucleic acid, but also proteins and carbohydrates (sugars) became the targets and the same term covers also cells and tissues now. The technology evolved by increasing the number of detections made simultaneously on one chip and reached the possibility to test all human genes at once, the other way led to specific sets with limited number of probes e.g. all known mutations of one gene, or genes participating in one pathway or function.

Keywords: New technologies in molecular diagnostics, active and passive DNA chips, microarrays and macro- arrays, genomic nanoprocessors.

Od pÛvodních zaãátkÛ konstrukce bioãipÛ, kter˘m dominova- né. Druhou firmou, která se úspû‰nû uplatÀuje na trhu je firma ly otázky technické, které byly a jsou neustále fie‰eny pfiede- Nanogen. Její ãip je typick˘m zástupcem tzv. aktivních ãipÛ, v‰ím díky rÛzn˘m patentov˘m ochranám (http://www.bio- u nichÏ je moÏné ovlivÀovat pracovní podmínky kaÏdého senso- chipnet.com/patents), nabyly na dÛleÏitosti otázky vyhodnocení ru individuálnû. Rozdíl obou technick˘ch fie‰ení je mnohostran- a interpretace. n˘, zatímco pasivní ãipy, k nimÏ mÛÏeme pfiifiadit i membránové Budume-li se pokládat za pozorovatele a do jisté míry i za ‰iky (arraye), nebo arraye mikroteãek (mikrospotÛ) naná‰en˘ch úãastníky rozvoje této technologické revoluce od samého její- na mikroskopická podloÏní sklíãka, jsou schopny roz‰ífiit poãet ho zaãátku, pfiisvojíme si i právo kritického pohledu a odha- sensorÛ jednoho ãipu do deseti- aÏ statisícÛ, aktivní ãipy od sv˘ch du jejího dal‰ího smûfiování. Prehistorické zaãátky jsou kla- poãátkÛ obsahovaly jen desítky sensorÛ a dnes se propracovaly deny do rÛznû vzdálené minulosti a záleÏí na tom, zda budeme ke stovkám. PÛvodní prototyp komerãnû vyrábûn˘ firmou Nano- brát v úvahu spí‰e stránku technickou – pak patrnû se zmíní- gen, jehoÏ obrázek by byl jistû vhodn˘ jako vzor na dámské ‰aty me o reversním dot blotingu pouÏívaném napfi. firmou Innoli- (obr.1) obsahoval jen 25 pracovních plo‰ek, které byly vodivû pa k pÛvodnû velice skromnému urãování alel systému HLA. spojeny s periferií ãipu tak, aby na nich mohlo b˘t upravováno Nebo k mnohoãetné imunologické reakci, která mohla zna- napûtí a polarita. Vedle tûchto vlajkono‰Û obou smûrÛ existuje menat jakousi ideologickou pfiípravu (1). Spokojíme-li se v‰ak celá fiada dal‰ích firem a v˘robcÛ a stále vznikají nové a nové. se vzpomínkou na skuteãné „prototypy“ dne‰ních „bioãipÛ“, Nûkteré firmy pfiiná‰ejí i nová technická fie‰ení. Na jejich pfiehled nebudeme se muset vracet do pfiíli‰ vzdálené minulosti a bude- jen odkáÏeme - ( http://www.biochipnet.com/companies), pro- me nám na to staãit prakticky jen jedno desetiletí. Bûhem toho- toÏe se jejich poãet, zpÛvodních cca 10 vpolovinû minulého dese- to návratu zjistíme, Ïe nûkteré realizaãní pfiístupy jsou pouÏí- tiletí, nûkolikanásobnû rozrostl. Geograficky je vznik a rozmach vány stále. bioãipov˘ch technologií spojen s Kalifornií. Z pÛvodních cca 10 Není bez zajímavosti, Ïe nûkteré principy se ukázaly jako dlou- firem prakticky v‰echny vznikly právû tam. Dnes jsou sice roz- hodobû nosné a jsou pouÏívány dodnes. Na prvním místû je tfie- trou‰eny po celém svûtû – dokonce i u nás vzniklo na akademic- ba jmenovat firmu Affymetrix a její technologii v˘roby mikroãi- ké pÛdû pracovi‰tû vyrábûjící sklíãkové arraye (www.geneage- pÛ pomocí fotolitografické metody, pfii níÏ jsou reagující tech.com) a lze oãekávat, Ïe do prostoru v˘robcÛ se v‰emi oligonukleotidy syntetizovány pfiímo na místû (in situ). Její pfií- dÛsledky vstoupí i âína. Dlouho se nedafiilo ukojit zvûdavou tou- stup charakterizuje tzv. pasivní ãipy tj. takové, kde pracovní pod- hu najít nûjaké vysvûtlení existence kalifornského inkubátoru bio- mínky pro v‰echny „sensory“ – pracovní plo‰ky ãipu jsou stej- ãipov˘ch firem, aÏ jeden americk˘ kolega nabídl celkem plausi-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 331 bilní vysvûtlení. Ponecháme stranou fakt, Ïe v Kalifornii je pfií- PouÏívají se tedy k identifikaci urãit˘ch struktur a to vãet- jemné podnebí, mnoho pfiírodních krás a snad i vhodné ekono- nû urãování sekvence. Jsou také velice uÏiteãné i pfii sledo- mické prostfiedí. Podle jeho vysvûtlení do‰lo ke koincidenci nûko- vání aktivity genÛ jak za fyziologick˘ch podmínek, tak pfii lika pfiízniv˘ch faktorÛ. Jednak v dobû vzniku spoleãností nemoci, nebo pod vlivem léãby (4). Vsuneme-li na toto mís- zab˘vajících se v˘vojem a v˘robou bioãipÛ do‰lo k uvolnûní to vlastní zku‰enosti, pak pouÏití bioãipÛ ukázalo, Ïe inter- mnoha vysoce kvalifikovan˘ch pracovníkÛ fiady v˘zkumn˘ch indivividuální variabilita genové aktivity je znaãná a to jak vojensk˘ch zafiízení, v Kalifornii byl v té dobû jiÏ také k dispozi- ve zdraví tak v nemoci (5). Existují znaãné ontogenetické ci znaãn˘ potenciál specialistÛ z oblasti v˘roby poãítaãÛ a dosta- rozdíly - a zdá se, Ïe existují rozdíly nejen mezi tkánûmi, tek odborníkÛ pracujících na universitách v oblasti molekulární coÏ nepfiekvapuje, ale patrnû i mezi buÀkami. K anal˘ze genetiky. Co jiného je nezbytnou podmínkou pro rozvinutí tako- genové aktivity na jednobunûãné úrovni zatím na‰e moÏ- vé v˘roby neÏ vysoce kvalifikovan˘ personál disponující potfieb- nosti bioãipov˘ch technik nestaãí, ale i tímto smûrem se nové n˘mi znalostmi. Nesmíme také zapomenout na skuteãnost, Ïe technologie rozvíjejí. v USA je, na rozdíl od nás, zcela bûÏné propojení universitního Nálezy získané bioãipov˘mi technikami b˘vají podrobovány v˘zkumu s v˘robou. kritice z hlediska jejich vûrohodnosti a ãasto je vyÏadováno jejich ovûfiení jinou metodou. U kvantifikace genové aktivity pak pfiedev‰ím RT-PCR a ukazuje se, Ïe nûkdy dávají oba postupy v˘sledky shodné, jindy protichÛdné ãi spí‰e nesou- hlasné. Je nepochybné, Ïe citlivost RT-PCR je mnohem vût‰í, nicménû kaÏdá z metod zkoumá genovou aktivitu trochu jin˘m zpÛsobem a za jin˘ch podmínek.

Dnes je valná vût‰ina ãipÛ vyrábûna komerãnû a ani by to jinak nebylo ekonomické, s pfiedem dan˘m souborem sond, ale exi- stují i tzv. zákaznické ãipy, kdy si zákazník mÛÏe vybrat jak˘- mi sondami má b˘t ãip osazen. Dokonce existují firmy, které Obrázek 1: PÛvodní typ aktivního ãipu vyrábû- ãipové anal˘zy provádûjí jako sluÏbu s tím, Ïe zákazník pou- ného firmou Nanogen ze dodá vzorek a je mu pfiedán v˘sledek na úrovni datového s 25 sensory zpracování a statistického vyhodnocení. Kupodivu je cena takové sluÏby jen asi dvojnásobná ve srovnání s cenou ãipu. Co je principem „nástroje“, kter˘ bioãipová technika nabízí – nûkdy se také mluví o laboratofii na dlani. Pfiedev‰ím je to moÏ- JestliÏe obecnû vzrÛstá mnoÏství informací exponencionálnû nost provádût mnoho anal˘z jednoho vzorku souãasnû – sou- a v podstatû pfiekraãuje na‰i kapacitu je zpracovávat, natoÏ vyu- ãasné ãipy firmy Affymetrix mají na plo‰e zhruba 1.25 x 1.25 Ïít, platí to v je‰tû vût‰í mífie o rozvoji technologií v na‰em pfií- cm cca 500 000 sensorÛ a jsou tedy schopny bez problémÛ padû „bioãipov˘ch“. Jako vÏdy produkce informací je nejdfií- obsáhnout v‰echny geny, kter˘mi lidsk˘ genom disponuje. ve pfiedstavována abstrakty pfiedná‰ek (jejich sborníky) pak Tomu se blíÏí i sklíãkové nebo membránové arraye s dnes bûÏ- ãasopiseck˘mi ãlánky a teprve pozdûji monografiemi. I tûch n˘mi 10 000 - 30 000 teãek. Z hlediska pouÏití se nejvíce hodí je v‰ak dnes jiÏ pomûrnû bohatá nabídka, a proto se omezíme pro situaci, kdy nevíme co hledáme. Vedle tûchto v‰eobsahu- na úzk˘ v˘bûr tûch, které známe (6,7,8,9,10). jících „universálních“ ãipÛ pak existují ãipy s omezenou, ale Za pouÏití grantov˘ch prostfiedkÛ VZ 0002373601 a IGA MZ specializovanou v˘bavou sond. åR NR /7989-3 Jsou pouÏívány pro fie‰ení jiÏ konkrétnûj‰ích otázek a pokr˘- vají napfi. alely (mutace) urãitého genu napfi. P53, CYP450, Zájemce o podrobnûj‰í informace odkazujeme na text, kter˘ geny související s nûjakou funkcí – apoptóza, nebo onemoc- provází kurz J.Jonáka pro postgraduální studenty: Bruchová nûním. Zmûny probíhající v somatick˘ch buÀkách napfi. bûhem H, Brdiãka R: âipové technologie v molekulární biologii. onkogenézy jsou jedním z nejãastûji zkouman˘ch otázek (2,3). V „Molekulární biologie a genetika XI: sborník pfiedná‰ek“ Kromû zmûn, které odli‰ují nádorovou tkáÀ od zdravé, ale Praha : ÚMG AV âR, 2004 s. 7-20 pfiípadnû na absolvování i zmûny v tkáních, v nichÏ neprobíhá nádorové bujení jsou t˘denního praktického semináfie: http://www.uhkt.cz/vyu- pfiedmûtem mnoha v˘zkumn˘ch prací. ka_seminare/seminare/kurz_dnadiag

Literatura 5. Bruchová H, Brdiãka R: Inter-individuální variabilita geneové exprese sle- 1. Ekins RP, Chu FW: Multianalyte microspot immunoassay—microana- dovaná pomocí bioãipÛ. âas.lék.ães., 2004 142(12) :s.847-849 lytical „compact disk“ of the future. Clin Chem. 1991 37(11), s.1955- 6. Knudsen S: A Biologist_s Guide to Analysis of DNA Microparray Data. 1967 J.Wiley&Sons, New York 2002 2. Golub TR, et al.: Molecular classification of cancer: Class discovery and 7. Baxevanis AD, Oullette BFF: Bioinformatics. A practical quide to the ana- class prediction by gene expression monitoring. Sciece 1999, s.527-531 lysis of genes and proteins. J.Wiley&Sons, New York 1998 3. Minn AJ et al.: Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Natu- 8. Schena M: DNA microarrays. A practical Approach. Oxford Univ.Press 1999 re 2005,436, s.518-524 9. Schena M: Microarray Biochip Technology. Eaton Publ. Natick 2000 4. Bruchova H, Borovanova T, Klamova H, Brdicka R: Gene expression pro- 10. Warrington JA, Todd R, Wong D :Microarrays and cancer research. Eaton filing in chronic myeloid leukemia patients treated with hydroxyurea. Leu- Publ. Westborough 2002 (Chen j, Kricka LJ. Biochip technology. Taylor kemia and Lymphoma 2002, 43: s.1289-1295 and Francis, New York 2003)

332 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 VYUÎITÍ BIOâIPOV¯CH TECHNOLOGIÍ V ONKOLOGII MICROARRAY TECHNOLOGY APPLICATION IN ONCOLOGY MERKEROVÁ M., KRÁâMAROVÁ A., BRUCHOVÁ H., BRDIâKA R.

ODDùLENÍ MOLEKULÁRNÍ GENETIKY, ÚSTAV HEMATOLOGIE A KREVNÍ TRANSFUZE, PRAHA

Souhrn Prudk˘ rozvoj ãipov˘ch technologií v posledních letech umoÏnil sériové anal˘zy exprese nûkolika tisíc genÛ záro- veÀ v jediném experimentu a tím urychlil na‰e porozumûní komplexnosti bunûãn˘ch procesÛ. Pomocí mikroãipo- vého v˘zkumu lidského transkriptomu byly odhaleny nové, dfiíve nerozeznatelné subtypy tumorÛ, nové diagnostic- ké a prognostické markery nebo potenciální cílové molekuly pro terapii. Aplikace „high-throughput“ technologií v klinické onkologii slibuje do budoucna posun ke kaÏdodenním rutinním ãipov˘m anal˘zám nádorÛ a na jejich základû individualizaci léãebného programu. Pfied zavedením mikroãipÛ do klinické praxe jev‰ak je‰tû potfieba vyfie- ‰it nûkolik sporn˘ch otázek t˘kajících se anal˘zy dat, reprodukovatelnosti a validace v˘sledkÛ, mezilaboratorního srovnávání a v neposlední fiadû také problém stále pomûrnû vysok˘ch pofiizovacích i provozních nákladÛ.

Klíãová slova: mikroãipy, expresní anal˘zy, cDNA, molekulární diagnostika

Summary During recent few years, rapid progress in microarray technology has facilitated gene expression analyses of thousands of genes performed simultaneously in one experiment. It has revolutionized our understanding of the cellular processes complexity. Previously subtypes of tumors, new diagnostic and prognostic markers, or potential targets for therapy has been identified by microarray-based research of human transcriptom. In clinical oncology, high-throughput technologies implementation promises their routine application in tumor analyses and individualization of treatment. However, several issues relating to data analysis, reproducibility, cross-comparability, validation, and high pur- chase and operating costs need to be resolved before the technology can be adopted broadly in the clinical practices.

Key words: microarray, gene expression analysis, cDNA, molecular diagnostic

Onkologická onemocnûní vznikají v dÛsledku akumulace Princip ãipové technologie genetick˘ch, ale také fiady epigenetick˘ch zmûn. Druhou velmi DNA ãipové technologie jsou zaloÏeny na hybridizaci nukleo- podstatnou roli v progresi rakoviny hraje interakce nádorov˘ch v˘ch kyselin, tj. interakci mezi DNA sondami imobilizovan˘mi bunûk s okolními stromálními, imunitními a zánûtliv˘mi buÀka- na pevn˘ povrch ãipu, které reprezentují zkouman˘ gen, a mezi mi. Právû tato komplexnost vzniku nádoru, genetická heteroge- znaãen˘mi, voln˘mi molekulami nukleov˘ch kyselin odvozen˘- nita maligních bunûk, ale také variabilita mezi pacienty vedou mi z analyzovaného vzorku (Obr. 1). Pro expresní mikroãipy jsou k identifikaci mnoha nádorov˘ch subtypÛ (dosud bylo rozli‰eno v˘chozím materiálem molekuly RNA (celkové ãi mRNA) izolo- více jak 200 rÛzn˘ch typÛ nádorÛ) (1). Diagnostické a prognos- vané ze vzorku, které jsou pfiepsány na cDNA pomocí reverzní tické klasifikace nádorov˘ch onemocnûní se v souãasné dobû opí- transkripce azároveÀ fluorescenãnû ãi radioaktivnû znaãeny. Tak- rají zejména o klinické a histopatologické nálezy, celou ‰ífii kli- to pfiipravená cDNA je hybridizována na komplementární sondy nické heterogenity neodráÏejí v‰ak zcela dostateãnû. Nedávné imobilizované na povrchu ãipu. Signál generovan˘ na kaÏdé son- pokroky ve v˘zkumu lidského genomu (2,3) a tzv. „high-through- dû pak odráÏí hladinu exprese mRNA daného genu v analyzova- put“ technologie jiÏ umoÏÀují prostudovat molekulární kom- ném vzorku. Po detekci, kvantifikaci a normalizaci intenzit sig- plexnost maligních tumorÛ a díky tomu zvolit co nejvhodnûj‰í nálÛ pomocí specializovaného softwaru je vytvofien tzv. „gene léãebnou strategii pro kaÏdého pacienta. Pro ucelenou charakte- expression profile“ analyzovaného vzorku, kter˘ pak lze srovná- rizaci nádorÛ na molekulární úrovni se otevírají moÏnosti v podo- vat s expresními profily dal‰ích vzorkÛ. Existuje nûkolik verzí bû anal˘z nukleov˘ch kyselin (RNA, DNA), proteinÛ a metabo- uspofiádání, v závislosti na typu povrchu ãipu (nylonové mem- litÛ. Velmi cenná data jsou získávána díky ãipov˘m technologiím, brány, plastikové, nebo sklenûné ãipy) nebo na typu znaãení vzor- mezi kter˘mi získaly ústfiední postavení expresní mikroãipy. Ty ku (radioaktivnû, chemiluminiscenãnû, fluorescenãnû). Oblíbe- dovolují souãasnû monitorovat aktivitu nûkolika tisíc genÛ vdané n˘m pfiístupem je semikvantitativní anal˘za genové exprese tkáni/bunûãném typu (tzv. gene expression profilling, napfi. fir- pomocí tzv. duálního znaãení, pfii kterém jsou na jeden ãip hyb- my Agilent, Affymetrix). Bioãipové tehnologie jsou v souãasné ridizovány dva odli‰nû znaãené vzorky, napfiíklad vzorek z nádo- dobû v onkologii nejvíce vyuÏívány pro tyto úãely: rové tkánû a vzorek z kontrolní, zdravé tkánû. Fluorescenãnû zna- 1. nalezení molekulární podstaty onemocnûní ãené cDNA (nejãastûji se vyuÏívá Cy3 a Cy5 ãi Alexa barev) obou 2. identifikace nov˘ch diagnostick˘ch markerÛ nádorového srovnávan˘ch vzorkÛ jsou ve stejné koncentraci smíchány a hyb- procesu ridizovány na jeden mikroãip. Barva spotu vzniklá interferencí 3. klasifikace/definice jednotliv˘ch nov˘ch subtypÛ daného signálÛ obou znaãek potom vypovídá o kvantitativním rozdílu onemocnûní na molekulární úrovni, tzv. molekulární dia- v expresi daného genu mezi obûma vzorky. gnostika 4. identifikace odpovûdi pacienta na terapii Technologie v˘roby mikroãipÛ 5. zlep‰ení terapeutick˘ch postupÛ, zavedení léãby zacílené Pro v˘robu ãipÛ jsou nejãastûji pouÏívány nylonové membrá- na pfiíãinu onemocnûní ny, plastikové nebo sklenûné materiály. Plastikové a nylono-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 333 vé ãipy pfiedstavují tzv. makroãipy, neboÈ mají vût‰í rozmûry n˘ch oblastí téhoÏ genu, ãímÏ je zaji‰tûno nûkolikanásobné a men‰í hustotu nanesen˘ch spotÛ (napfiíklad nylonov˘ ãip mûfiení exprese daného genu v rámci jednoho mikroãipu bûhem Atlas Human cDNA Expression Array of firmy Clontech sle- jedné anal˘zy. KaÏdá z jedenácti sond je navíc doplnûna o son- duje expresi 588 genÛ na membránû o rozmûru 8 x 12 cm). du s jednou chybnû párující bází umístûnou uprostfied sondy (tzv. NejbûÏnûj‰ím povrchem je pravdûpodobnû mikroskopické mismatch), coÏ umoÏÀuje uÏivateli ovûfiit specifiãnost hybridi- sklíãko o velikosti 7,5 x 2,5 cm s povrchem upraven˘m pomo- zace. Plo‰ka mikroãipu (1,25 cm) je rozdûlenado ãtvercÛ o veli- cí hydrofobních polymerÛ (poly-L-lysin, modifikovan˘ silan kosti 11x11 μm, z nichÏ na kaÏdém jsou vázány kopie pouze pro - aminosilan, epoxysilan apod.) poskytujících reakãní skupi- jedin˘ typ sondy. Nejnovûj‰í mikroãip firmy Affymetrix, kter˘ ny jako jsou -NH2, -OH, =O pro navázání oligonukleotidÛ. umoÏÀuje detekovat hladiny aÏ 47000 rÛzn˘ch RNA, nese tûch- Naná‰ení sond na povrch ãipu lze provádût nûkolika zpÛsoby. to jedineãn˘ch ãtvercÛ celkem 1,3 miliony (4). První moÏností je mechanické spotování jiÏ presyntetizova- n˘ch sond a to buì cDNA klonÛ ãi jejich PCR produktÛ, ane- Pfiíprava vzorku pro expresní anal˘zy bo chemicky pfiipraven˘ch oligonukleotidÛ - v˘hody a nev˘- Solidní nádory pfiedstavují z histologického hlediska heterogen- hody obou typÛ sond jsou shrnuty v Tabulce 1. Jednotlivé ní smûs rÛzn˘ch bunûãn˘ch typÛ: maligní buÀky v rÛzném stup- sondy jsou naná‰eny na ãip tenk˘mi ostr˘mi jehlami (ink-jet ni diferenciace, krevní buÀky, buÀky zánûtlivé odpovûdi atd. printing) v objemu cca 1nl a nati‰tûné spoty pak mají 100- Díky variabilitû v bunûãném sloÏení nádorové tkánû je nutné 150μm v prÛmûru. Dal‰í moÏností v˘roby mikroãipÛ je syn- vûnovat zvlá‰tní pozornost v˘bûru vzorku. Obvykle je maximální téza sondy ve formû oligonukleotidÛ in situ na povrchu ãipu snaha soustfiedûna na získání pouze maligních bunûk. K tomuto (fotolitografie). úãelu jsou pouÏívány rÛzné mikrodisekãní techniky (napfi. Laser Capture Microdissection - LCM). Aãkoli je dnes moÏné získat expresní profil pouze pro maligní sloÏku nádorové tkánû, nelze opomenout vliv dal‰ích bunûãn˘ch komponent nádoru (endote- liální, buÀky imunitního systému) na jeho progresi. V˘chozím materiálem pro anal˘zu expresních profilÛ je obvykle vysoce kvalitní celková RNA, v mnoÏství 10-40μg, coÏ pfii- bliÏnû odpovídá 100mm3 tkánû (5). Dal‰í moÏnost pak pfiedstavuje pfiímá izolace mRNA. Pokud není vzorek nádorové tkánû ihned zpracován a o‰etfien inhibitory RNáz, je nutné tkáÀ bez- prostfiednû po resekci (maximálnû do 30 minut) zamrazit vteku- tém dusíku a skladovat alespoÀ pfii -80°C, ãímÏ je zamezeno degradaci RNA. DÛraz je dále kladen zejména na ãistotu RNA (tj. RNA bez pfiímûsi DNA) a její integritu, kterou je moÏné jednodu‰e ovûfiit pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Na rozdíl od ãerstv˘ch ãi zamrazen˘ch tkáÀov˘ch vzorkÛ, kte- ré je nutné co nejdfiíve zpracovat, mohou b˘t parafinové tká- Àové bloãky fixované pomocí formaldehydu (tzv. FFPE vzorky) dlouhodobû skladovány. V˘hodou takto uchovávan˘ch preparátÛ je jejich dobrá klinická dokumentace: prÛbûh one- mocnûní, odpovûì pacienta na léãbu a její v˘sledek. Nicmé- nû z FFPE vzorkÛ bylo je‰tû nedávno velmi problematické zís- kat dostateãné mnoÏství kvalitní, nedegradované RNA. Nyní jsou v‰ak na trhu k dispozici speciálnû pfiipravené kity pro izolaci RNA z tûchto tkáÀov˘ch preparátÛ (Arcturus, kit Paradi- se Reagent System; QIAGEN, Launches RNasy FFPE kit) a také speciálnû upravené mikroãipy se sondami, které jsou odvozené od 3’koncÛ mRNA (Affymetrix, mikroãip Gene- Chip Human X3P Array). Pokud jsou v˘chozím materiálem málobunûãné vzorky (napfií- klad po separaci bunûk na jednotlivé subtypy, po tkáÀové biopsii ãi LCM), je moÏné získanou mRNA amplifikovat. Dostup- né amplifikaãní kity jsou zpravidla limitovány 10ng mnoÏstvím celkové RNA, nicménû i 1ng v˘chozího materiálu mÛÏe b˘t postaãující (napfi. NuGEN Technologies, Ribo-SPIA technology). Základní schéma amplifikace mRNA má 3 kroky: podle mRNA je nejprve syntetizován pomocí reverzní transkrip- tázy komplementární fietûzec cDNA, následnû je vlákno mRNA odbouráno a nahrazeno 2. fietûzcem cDNA, ãímÏ vzni- Obrázek 1: Princip technologie expresních mikroãipÛ. Na obrázku je ãip Atlas Human cDNA Expression Array od firmy Clontech s celkovou RNA ká dvoufietûzcová cDNA, která je amplifikována. Poslední fází z linie K562, z experimentÛ provádûn˘ch v na‰í laboratofii. je pfiíprava znaãeného fietûzce antisense cRNA, kter˘ je syn- tetizován podle kódujícího (+) cDNA a má tudíÏ sekvenci kom- Metodou fotolitografie, kterou vyvinula firma Affymetrix, jsou plementární k pÛvodní bunûãné mRNA (Obr. 2). oligonukleotidové sondy syntetizovány pfiímo na povrchu sklenûného ãipu. Fotolitografická maska fiídí spolu se svûteln˘m Variabilita a její zdroje paprskem syntézu tak, Ïe vazebná místa oligonukleotidÛ jsou Pfii porovnávání v˘sledkÛ experimentÛ vycházejících svûtlem aktivována a reagují s nov˘m nukleotidem. Opaková- z bioãipov˘ch anal˘z je nutno mít na vûdomí nejen pfiirozenou ním cyklÛ spolu se stfiídáním masek dochází k prodluÏování variabilitu, která vychází z charakteru bunûãného materiálu fietûzcÛ sond vÏdy o jeden nukleotid aÏ do celkové uniformní nebo odli‰ného bunûãného sloÏení nádorové tkánû, ale také délky 25 nukleotidÛ. Tento zpÛsob konstrukce zvy‰uje vyuÏi- variabilitu technologického procesu. Zdroje této procesní vari- telnost plochy ãipu o 1-2 fiády. KaÏd˘ gen na ãipu od firmy Affy- ability mají pÛvod napfiíklad v povaze a zpracování biologic- metrix je reprezentován jedenácti 25-merními sondami z rÛz- kého materiálu (zpÛsob pfiípravy vzorku, extrakce RNA).

334 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Pokud je po izolaci RNA kvÛli malému mnoÏství v˘chozího základní pfiístupy k anal˘ze mikroãipov˘ch dat. Prvním je tak- materiálu zafiazen navíc amplifikaãní krok, mÛÏe pfiedstavo- zvaná „unsupervised analysis“ vyuÏívající informace poskytova- vat dal‰í pfiíãinu nárÛstu variability v dÛsledku rÛzné senziti- né v‰emi geny, které jsou v dané tkáni exprimované. Do spoleã- vity a aktivity enzymÛ pouÏívan˘ch v amplifikaãních kitech né kategorie tak lze seskupovat napfiíklad vzorky, které vykazují nebo rozdílné efektivity znaãení. Dále mÛÏe variabilita získa- v˘raznou podobnost ve sv˘ch expresních profilech, nebo je moÏ- n˘ch dat vycházet z nespecifické cross-hybridizace ãi z odli‰- né vyhledávat geny ve vzorku, které sevyznaãují shodnou expres- ností mezi jednotliv˘mi bioãipy (hybridizace, zpÛsob znaãe- ní hladinou (zv˘‰enou/sníÏenou transkripãní aktivitou v porov- ní testovaného vzorku, v˘bûr a délka sond pro konkrétní gen nání se zdravou kontrolou). Druh˘ pfiístup zvan˘ „supervised pfii konstrukci bioãipu). learning“ sleduje pouze pfiedem vybranou skupinu genÛ - cha- rakteristické markery definované pro jednotlivé diagnózy, a tím zafiazuje neznám˘ vzorek do dfiíve definované podskupiny one- mocnûní (7). Obû tyto metody mohou b˘t aplikovány na stejn˘ soubor dat za rÛzn˘m úãelem. První typ je ménû ovlivniteln˘ a je vhodnûj‰í pro odhalování dosud neznám˘ch, morfologicky podobn˘ch subtypÛ tumorÛ pouze na základû podobností v expresních profilech. „Supervised“ metoda je naopak vhod- nûj‰í k diagnostice tumorÛ, které patfií do jiÏ definovan˘ch klinicky v˘znamn˘ch podskupin. Existuje nûkolik matematick˘ch nástrojÛ pro testování a znázorÀování vztahÛ mezi expresními profily, mimo jiné tzv. klastrování a„multidimensional scaling“. Klastrovací metoda poskytuje dendrogramy podobné evoluãním stromÛm, ve kter˘ch koncové vûtve zobrazují podobné vzorky/geny. V˘sledkem druhé z metod jsou tfiídimensionální tzv. „scatter plots“, ve kter˘ch se podobné vzorky (znázornûné body) seskupují v prostoru. Jedním z nejpopulárnûj‰ích klastrovacích nástrojÛ je „hierarchical clustering“ (8), jiné metody vyuÏívají „K-means clustering“ a „self-organizing maps“.

Aplikace expresních ãipÛ v klinické onkologii Nabídka specificky zamûfien˘ch expresních mikroãipÛ je v souãasné dobû velmi pestrá. Vedle celogenomov˘ch mikroãi- pÛ (Affymetrix, Agilent) jsou k dispozici bioãipy, které umoÏ- Àují detekovat expresní hladiny pouze vybran˘ch skupin genÛ, jejichÏ proteinové produkty vykazují jistou podobnost z hlediska funkce, bunûãné lokalizace, interakcí, apod. Napfiíklad firmy Obrázek 2: Obecn˘ princip dvoustupÀové amplifikace mRNA Clontech ãi SupperArray nabízí bioãipy se sondami pro sledo- vání aktivity genÛ, u nichÏ se pfiedpokládá, Ïe participují na malig- Deregulované geny, identifikované pomocí ãipov˘ch techno- ní transformaci buÀky. Hlavními funkãními kategoriemi (klast- logií, které by mohly b˘t vyuÏity jako diagnostické ãi pro- ry) jsou geny úãastnící se regulace bunûãného cyklu, apoptózy, gnostické markery a nebo jako potenciální cíle pro dal‰í diferenciace, bunûãné signalizaci dále pak geny, jejichÏ produk- v˘zkum, musí b˘t nezávisle validovány jinou standardní meto- ty se uplatÀují jako transkripãní faktory, adhezivní molekuly ãi dou jako je napfi. kvantitativní RT-PCR ãi northern blot. povrchové receptory. V souvislosti s hledáním molekulární podstaty vzniku a rozvoje nádorov˘ch onemocnûní se nabízí moÏ- Anal˘za dat nost konstruovat mikroãipy, které by dovolily monitorovat expre- Hledání odli‰nû exprimovan˘ch genÛ mezi testovan˘mi sou- si genÛ zapojen˘ch do konkrétní signální dráhy. bory vzorkÛ b˘vá jedním z hlavních cílÛ bioãipov˘ch anal˘z. Expresní bioãipy jsou v klinické onkologii vyuÏívány pro Pokud chceme porovnávat intenzity signálÛ mezi dvûma ana- diagnostiku, zji‰tûní rizika progrese onemocnûní nebo pro sta- lyzovan˘mi vzorky, je nutno zahrnout do anal˘zy normaliza- novení pfiedpokládané odpovûdi na léãbu. ci dat, protoÏe jednotlivé vzorky se mohou navzájem li‰it napfi. Diagnostika v koncentraci mRNA, relativní vazebné afinitû ãi koncentraci Zájem o vyuÏití expresních bioãipÛ k onkologické diagnostice vázané znaãky. Mezi nejãastûji pouÏívané pfiístupy patfií cel- byl vyvolán prací kolektivu Khan et al. (9), podle které expresní ková normalizace intenzit, linearní regrese nebo log centering, profily rakovinn˘ch bunûãn˘ch linií odpovídaly jejich orgánu pfiiãemÏ normalizace mÛÏe b˘t pouÏita globálnû, tedy na cel- pÛvodu. Mezi prvními klinick˘mi studiemi vyuÏívajícími mik- kov˘ soubor získan˘ch dat, anebo lokálnû, ãili na vybranou roãipy k diagnostice byly práce zab˘vající se akutními leukemi- sadu dat (6). Zpravidla vycházíme z nulové hypotézy, která emi, u nichÏ je pfiístup k ãisté populaci nádorov˘ch bunûk rela- fiíká, Ïe pro sledovan˘ gen je mezi porovnávan˘mi vzorky tivnû jednoduch˘. Golub et al. (10) se zab˘val otázkou, zda je pozorována shodná expresní hladina. Alternativní hypotéza moÏné vyuÏít expresní ãipy pro diagnostické rozli‰ení akutní naopak tvrdí, Ïe testované vzorky nemají v pfiíslu‰ném genu myeloidní leukemie (AML) od akutní lymfoidní leukemie (ALL). stejnou úroveÀ exprese. Pro stanovení pravdûpodobnosti Pomocí „unsupervised learning“, pouze na základû genové expre- obou hypotéz je potfieba pouÏít napfi. parametrick˘ t-test, nebo se, dokázal správnû zafiadit 36 z 38 vzorkÛ kostní dfienû pacien- neparametrick˘ Mann-Whitney test (6). tÛ s AML nebo ALL, pfiiãemÏ pouze 2 zÛstaly nejasné. Tím doká- ProtoÏe DNA ãipy poskytují aÏ nûkolik tisíc v˘sledn˘ch hodnot zal, Ïe akutní leukemie lze klasifikovat pomocí microarrays bez z jediného experimentu, jsou anal˘za, interpretace a uloÏení tak- jak˘chkoliv pfiedchozích klinick˘ch znalostí. Dále zaznamenal to velkého mnoÏství dat nároãn˘m problémem. PfiestoÏe mÛÏe- rozdílnost expresních profilÛ T-ALL a B-ALL, na základû kte- me pomocí mikroãipÛ nalézt geny, které vykazují v˘razn˘ roz- ré je moÏné tyto dva subtypy akutní lymfatické leukemie odli‰it. díl v expresi a které lze dále vyuÏít pro následné specifické S vyuÏitím genov˘ch expresních profilÛ byly identifikovány anal˘zy, spoãívá nejvût‰í v˘znam bioãipov˘ch „high-through- a charakterizovány nové subtypy tumorÛ. Alizadeh et al. (11) put“ anal˘z v odhalování komplexnosti genetick˘ch zmûn. Tato identifikoval dva typy difuzního velkobunûãného B lymfomu komplexnost je urãována pomocí matematick˘ch soustav podob- odvozené z rÛzn˘ch stádií zrání B-lymfocytÛ. Armstrong et al. nû exprimovan˘ch genÛ v celém mnoÏství dat. Existují dva (12) potvrdil, Ïe ALL s chromozomální translokací

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 335 t(4;11)(q21;q23), jejíÏ souãástí je gen MLL (mixed-lineage leu- bu docetaxelem, pfiiãemÏ tyto geny, pokud je jiÏ známa jejich kemia), mají charakteristick˘ expresní profil odli‰n˘ od ALL funkce, se úãastní pfieváÏenû procesÛ fiízení bunûãného cyklu, i AML, kter˘ odpovídá ran˘m hematopoetick˘m progenitoro- RNA transkripce a translace. U pacientek, které odpovídaly na v˘m buÀkám. Klastrovací algoritmy tak mohou odli‰it ALL léãbu docetaxelem, bylo identifikováno 78 genÛ se zv˘‰enou s MLL translokací od bûÏné akutní leukemie, coÏ naznaãuje, expresí. Z nich nejvíce náleÏelo do kategorií genÛ úãastnících Ïe MLL pfiedstavuje odli‰né onemocnûní. Z Armstron- se apoptózy, stresov˘ch reakcích,adheze, transportu proteinÛ, govy ãipové anal˘zy vyplynulo, Ïe nejvíce odli‰ná je exprese signální transdukce nebo sestfiihu a transportu RNA. genu FLT3 a na jejím základû lze oddûlit MLL od ostatních typÛ leukemií. Aberace FLT3 byla zaznamenána jiÏ dfiíve v nûkte- cDNA mikroãipy oligounukleotidové mikroãipy r˘ch pfiípadech AML a mohla by b˘t leukemogenní (13,14,15). V˘hody FLT3, tyrosin kinázov˘ receptor, by tedy mohl pfiedstavovat ● není nutná promární znalost ● uniformní délka (do 80 b) atraktivní cílovou molekulu pro v˘voj nov˘ch specifick˘ch cDNA sekvence léãiv. Dal‰ím pfiíkladem je publikace Sorlie et al. (16), která ● moÏnost vlastního naná‰ení ● automatizace, kontrola kvality definuje na podkladû mikroãipov˘ch expresních anal˘z 5 pod- spotÛ v laboratofii bûhem syntézy ● nárÛst intenzity signálu ● vy‰‰í specifita, niÏ‰í pravdûpodobnost tfiíd karcinomu prsu, vãetnû nového myeloepitheliálního a dále pozitivnû korelujes délkou sondy cross-hybridizace luminálního epitheliálního typu. Bittner et al. (17) identifiko- ● del‰í sonda (=stabilnûj‰í hybridní val dvû podtfiídy koÏního maligního melanomu vykazující odli‰- molekula) umoÏÀuje nastavit více nou agresivitu. stringentní podmínky, tím se sníÏí Prognostické studie signál pozadí Mikroãipy byly vyuÏity mimo jiné pro predikci prÛbûhu rako- ● cenovû v˘hodnûj‰í viny prsu (18,19), lymfomÛ (11,20), rakoviny plic (21) nebo Nev˘hody adenokarcinomu ledvin (22,23). V pfiípadû predikce pfieÏití ● moÏnost cross-hybridizace u pacientek s rakovinou prsu se ukázalo, Ïe vyuÏití mikroãi- ● moÏnost kontaminace cDNA pové technologie pfiedãí stávající metody zaloÏené na klinic- klonÛ/PCR produktÛ k˘ch a histologick˘ch kritériích (19). Tabulka 1: Srovnání typÛ sond - klony cDNA/PCR produkty versus U renálního karcinomu byl pomocí expresních ãipÛ a validace oligonukleotidy jejich v˘sledkÛ kvantitativním RT-PCR identifikován set bio- markerÛ pro predikci jeho agresivity. Na základû 34 genÛ, které Pfiísliby do budoucna nejv˘raznûji vykazovaly rozdíly v expresi, bylo pomocí hierar- Potenciál expresních mikroãipÛ pro zlep‰ování diagnostické- chického klastrování správnû zafiazeno 88% (23 z 26) vzorkÛ do ho a prognostického testování nejen v onkologii je stále více skupiny agresivních a metastazujících karcinomÛ, 100% do sku- zfiejm˘. Z dat poskytovan˘ch ãipov˘mi technologiemi lze piny neagresivních nádorÛ a 100% do skupiny non-neoplastic- vybrat malé mnoÏství markerÛ, jejichÏ genovou expresi je moÏ- k˘ch vzorkÛ. Autofiinavíc poukázali na fakt, Ïe na základû expre- né dále sledovat konvenãními, ‰iroce roz‰ífien˘mi technikami se jednoho z kandidátních markerÛ (survivinu) lze predikovat jako jsou imunohistochemie, in situ hybridizace ãi PCR. KvÛ- pfieÏití pacientÛ s renálním karcinomem (23). li genetické komplexnosti onkologick˘ch onemocnûní by ale Expresní ãipy mohou b˘t také vyuÏity pro diagnostikování mûla b˘t daleko pfiesnûj‰í kombinace molekulárních markerÛ metastáz a identifikaci tkánû, ze které pÛvodnû pocházejí. I kdyÏ získaná obsáhlou anal˘zou neÏ pouÏití jediného markeru. jsou tumory ãasto histologicky identické, urãení jejich povahy Z toho vypl˘vá dal‰í vyuÏití ãipov˘ch technologí: komplexní apÛvodu je dÛleÏité pro správnou volbu léãebného postupu. Potfie- testování exprese v nádorové tkáni (pomocí mikroãipu vyro- ba nalezení lep‰ích molekulárních markerÛ, které by odhalily beného pfiímo na míru danému onemocnûní) a vyuÏití expres- primární zdroj metastázy, vedla k vyuÏití mikroãipÛ pfii klasifi- ních profilÛ jako klinick˘ch testÛ. kaci nádorÛ podle jejich pÛvodu (24-27). Napfiíklad Su et al. (26) Je zde v‰ak stále je‰tû nûkolik nevyfie‰en˘ch otázek, na které pouÏil „supervised learning“ metodu kidentifikování skupin genÛ, bude tfieba nalézt odpovûì pfied zavedením mikroãipÛ do kaÏ- jejíÏ hladina exprese je charakteristická pro rÛzné druhy nádorÛ. dodenní klinické praxe. Nûkteré se t˘kají samotné technolo- Tyto soubory zahrnovaly geny, jejichÏ exprese je typická pro gie, jiné klinické vyuÏitelnosti ãipÛ. DÛleÏit˘m problémem je danou zdravou tkáÀ, stejnû jako ty, jejichÏ hladina je zv˘‰ena standardizace metodiky. V souãasné dobû existuje velké mnoÏ- v dÛsledku onemocnûní. Pomocí vytvofieného klasifikaãního ství rÛzn˘ch ãipov˘ch platforem, které vyuÏívají rozdílné sady schématu pak správnû urãily 90% míst pÛvodu nádorÛ, vãetnû 9 genÛ, hybridizaãní podmínky ãi detekãní metody. Na nûkte- z 12 metastáz. Bhattacharjee et al. (27) dokázal, Ïe expresní mik- r˘ch mikroãipech jsou spotovány cDNA sondy rozliãn˘ch roãipy jsou schopné rozli‰it primární plicní adenokarcinom od délek, na jin˘ch jsou syntetické délkovû uniformní oligonuk- metastáz extra-pulmonálního pÛvodu. Tyto studie prokázaly, Ïe leotidy; sonda pro tent˘Ï gen mÛÏe b˘t reprezentována na rÛz- metastázy si obecnû zachovávají expresní profil tkánû, ze které pochá- n˘ch ãipech rÛzn˘mi sekvencemi. Bylo pozorováno, Ïe délka zejí, ãímÏ naznaãily potenciál ãipové technologie pro identifikaci sondy, stejnû jako její poloha v rámci hybridizujícího tran- tkáÀového pÛvodu u karcinomÛ vznikl˘ch z neznámého zdroje. skriptu hraje roli v intenzitû detekovaného signálu . Sondy krat- Pfiedpovûì odpovûdi na léãbu ‰í neÏ 400 nukleotidÛ poskytují aÏ o polovinu niÏ‰í intenzity Jedním z prvních úspûchÛ vyuÏití mikroãipÛ pro odhad reakce signálÛ neÏ sondy o délce 600 - 2000 nukleotidÛ. Obdobnû pacienta na léãebn˘ program byla identifikace 95 genÛ, jejichÏ sondy odvozené od 3’-konce mRNA se jeví z hlediska signá- expresní profil u pacientÛ s ALL podává informaci o citlivosti lu jako v˘hodnûj‰í (6). KaÏdá laboratofi také mÛÏe mít jin˘ pfií- bunûk k STI571 (glivec, imatinib) (28). Pro leukemické buÀky stup k získávání vzorkÛ z nádorové tkánû, pouÏívat jiné kon- rezistentní vÛãi pÛsobení STI571 bylo charakteristické zv˘‰ení trolní vzorky, ãi sady pouÏívan˘ch markerÛ - to v‰e mÛÏe vést exprese v genech pro Bruton’s tyrosin kinázu a dvou ATP syn- k rozdílÛm v intenzitû signálÛ. Rutinnímu vyuÏití této techno- tetáz (ATP5A1 a ATP5C1). Na druhou stranu vykazovaly sig- logie brání v neposlední fiadû i fakt, Ïe komerãnû dostupné nifikatní pokles v aktivitû proapoptotického genu BAK1 a genu mikroãipy a pfiístrojové stanice jsou stále pfiíli‰ drahé. kontrolujícího prÛbûh bunûãného cyklu p15INK4b. Technologická revoluce v posledních letech zpÛsobená prudk˘m Obdobnû byly prokázány odli‰né expresní profily u skupin rozvojem „high-throughput“ technologií sk˘tá nové moÏnosti pacientek s rakovinou prsu pozitivnû, respektive negativnû pro v˘zkum na poli molekulární medicíny a otevírá prostor pro reagujících na pfiedoperativní podávání docetaxelu (29). Cel- celistvûj‰í pochopení svûta biomolekul. Z onkologického hle- kem bylo definováno 92 genÛ, které vykazují odli‰nou aktivi- diska DNA ãipy umoÏÀují zcela nov˘ pohled do komplexity tu u chemosenzitivních/rezistentních pacientek. Z toho 14 genÛ nádorÛ a pfiedstavují do budoucna velik˘ potenciál pro zlep‰ení vykazovalo zv˘‰enou expresi u pacientek rezistentních na léã- lékafiské péãe o pacienta.

336 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Literatura carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc 1. Wadlow R, Ramaswamy S. DNA Microarrays in clinical cancer research. Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(19):10869-74. Current Molecular Medicine 2005, 5:111-120. 17. Bittner M, Meltzer P, Chen Y et al. Molecular classification of cutaneous 2. Lander ES, Linton LM, Birren B et al. Initial sequencing and analysis of malignant melanoma by gene expression profiling. Nature. 2000, the human genome. Nature 2001, 409(6822):860-921. 406(6795):536-40. 3. Venter JC, Adams MD, Myers EW et al. The sequence of the human geno- 18. van ‘t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ et al. Gene expression profiling me. Science 2001, 291(5507):1304-51. predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 2002, 415(6871):530-6. 4. www.affymetrix.com 19. van de Vijver MJ, He YD, van’t Veer LJ et al. A gene-expression signatu- 5. Ramaswamy S, Golub TR. DNA microarrays in clinical oncology. J Clin re as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002, Oncol 2002, 20(7):1932-41. 347(25):1999-2009. 6. Brentani RR, Carraro DM, Verjovski-Almeida S et al. Gene expression 20. Rosenwald A, Wright G, Chan WC et al.The use of molecular profiling to arrays in cancer research: methods and applications. Crit Rev Oncol Hema- predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. tol. 2005, 54(2):95-105. N Engl J Med 2002, 346(25):1937-47. 7. Raychaudhuri S, Sutphin PD, Chang JT, Altman RB. Basic microarray ana- 21. Beer DG, Kardia SL, Huang CC et al. Gene-expression profiles predict sur- lysis: grouping and feature reduction. Trends Biotechnol 2001, 19(5): vival of patients with lung adenocarcinoma. Nat Med 2002, 8(8):816-24. 189-93. 22. Takahashi M, Rhodes DR, Furge KA et al. Gene expression profiling of 8. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. analysis and display of clear cell renal cell carcinoma: gene identification and prognostic classifi- genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, cation. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(17):9754-9. 95(25):14863-8. 23. Kosari F, Parker AS, Kube DM et al. Clear cell renal cell carcinoma: gene 9. Khan J, Simon R, Bittner M et al. Gene expression profiling of alveolar expression analyses identify a potential signature for tumor aggressiveness. rhabdomyosarcoma with cDNA microarrays. Cancer Res 1998, Clin Cancer Res 2005, 11(14):5128-39. 58(22):5009-13. 24. Giordano TJ, Shedden KA, Schwartz DR et al. Organ-specific molecular 10. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P et al. Molecular classification of cancer: classification of primary lung, colon, and ovarian adenocarcinomas using class discovery and class prediction by gene expression monitoring. gene expression profiles. Am J Pathol 2001, 159(4):1231-8. Science 1999, 286(5439):531-7. 25. Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R et al. Multiclass cancer diagnosis using 11. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Distinct types of diffuse large B- tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 2000, 98(26):15149-54. 403(6769):503-11. 26. Su AI, Welsh JB, Sapinoso LM et al. Molecular classification of human 12. Armstrong SA, Staunton JE, Silverman LB et al. MLL translocations spe- carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Res 2001, cify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. 61(20):7388-93. Nat Genet 2002, 30(1):41-7. 27. Bhattacharjee A, Richards WG, Staunton J et al. Classification of human 13. Nakao M, Yokota S, Iwai T et al. Internal tandem duplication of the flt3 lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocar- gene found in acute myeloid leukemia. Leukemia 1996, 10(12):1911-8. cinoma subclasses. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98(24):13790-5. 14. Tse KF, Mukherjee G, Small D. Constitutive activation of FLT3 stimula- 28. Hofmann WK, de Vos S, Elashoff D et al. Relation between resistance of tes multiple intracellular signal transducers and results in transformation. Philadelphia-chromosome-positive acute lymphoblastic leukaemia to the Leukemia 2000, 14(10):1766-76. tyrosine kinase inhibitor STI571 and gene-expression profiles: a gene- 15. Zhao M, Kiyoi H, Yamamoto Y et al. In vivo treatment of mutant FLT3- expression study. Lancet 2002, 359(9305):481-6. transformed murine leukemia with a tyrosine kinase inhibitor. Leukemia 29. Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A et al. Patterns of resistance and incom- 2000, 14(3):374-8. plete response to docetaxel by gene expression profiling in breast cancer 16. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R et al. Gene expression patterns of breast patients. J Clin Oncol 2005, 23(6):1169-77.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 337 VYBRANÉ APLIKACE TECHNOLOGIE cDNA MICROARRAYS V ONKOLOGICKÉM V¯ZKUMU SELECTED APPLICATIONS OF cDNA MICROARRAYS TECHNOLOGY IN ONCOLOGICAL RESEARCH KOUTNÁ I., KRONTORÁD P., SVOBODA Z., KOZUBEK M.

CENTRUM ANAL¯ZY BIOMEDICÍNSKÉHO OBRAZU, FAKULTA INFORMATIKY MU, BRNO

Souhrn V této publikaci pfiiná‰íme pfiehled vûdeck˘ch prací, ve kter˘ch nám technologie cDNA microarrays umoÏnila nové náhledy do procesÛ maligní transformace. Díky této technologii dnes mÛÏeme sledovat v jeden okamÏik expresní aktivitu tisícÛ genÛ. S pomocí vhodn˘ch nástrojÛ mÛÏeme namûfiené hodnoty dávat do souvislostí, kte- ré byly je‰tû nedávno prakticky nemyslitelné. V na‰í laboratofii jsme vyvinuli nové nástroje a postupy pro anal˘- zu microarrays a pro zpracování v˘sledkÛ do podoby pouÏitelné v onkologickém v˘zkumu. Pro sledování nûkte- r˘ch charakteristik je nutné pouÏít vizualizaãní nástroje. Napfiíklad pro sledování aktivity urãit˘ch oblastí chromosomÛ jsou velmi vhodné transkripãní mapy (dále TM). Implementovali jsme vlastní software pro gene- rování TM a díky kombinaci jeho v˘stupÛ s dosavadními znalostmi jsme formulovali závûry na‰ich experimen- tÛ. Intuitivním roz‰ífiením TM jsme dosáhli mnoha dal‰ích vizualizací napfi. hustoty aktivních genÛ, kumulativní exprese oblastí atp. Tyto nástroje by mûly v budoucnosti pomáhat klinikÛm pfii diagnostice zhoubn˘ch malignit a urãování následné léãby.

Klíãová slova: microarrays, leukémie, karcinom tlustého stﬁeva, ex vivo diferenciace

Summary In this paper we bring a scientific review of studies in which cDNA microarrays technology allowed us to create new insights into malignant transformation processes. We can monitor parallel expression activity of thousands of genes using this technology. Using appropriate tools we can evaluate biological correlations that were practi- cally impossible few years ago. We have developed new tools and techniques transforming the data into form sui- table for oncological research. Special visualizations are necessary for some types of studies. E.g. transcription maps (TMs) are a proper tool for studying activity of chromosomal regions. We have implemented our own software for generating TMs. On the basis of combination of its outputs and knowledge gained so far we have for- mulated our conclusions. Using intuitive TM extensions we have obtained many useful visualizations, e.g. density of active genes, cumulative expression etc. These tools are supposed to help clinicians while forming diagnoses of malignant diseases and while treatment planning.

Keywords: microarrays, leukemia, colorectal carcinoma, ex vivo differentiation

Materiál a metody Obraz pofiízen˘ skenováním sklíãek analyzujeme pomocí Na základû zku‰eností s rÛzn˘mi druhy microarrays jsme se vlastního software, kter˘ jsme v rámci v˘zkumu orientovaném pro na‰e experimenty rozhodli pouÏívat skla SS-H19K (Cli- na anal˘zu obrazu vyvinuli tak, aby co nejlépe vyhovoval nical Genomic Centre GCC, Toronto, Ontario, Canada). Tato na‰im potfiebám. MfiíÏku nastavujeme poloautomaticky a pro- skla nesou celkem 19008 EST. Takto vysok˘ poãet EST nám vádíme velmi peãlivou kontrolu adresace (obr.1). Dal‰í kroky umoÏÀuje sledovat aktivitu témûfi celého genomu v ‰irokém jsou jiÏ plnû automatické, volíme pouze pouÏité metody. Ná‰ spektru typÛ vzorkÛ: vzorky odebrané z leukemick˘ch paci- software obsahuje velmi moderní segmentaãní a QC algorit- entÛ, nádory tlustého stfieva atp. Ná‰ v˘zkum se primárnû my kopírující v˘voj v této oblasti [5]. Na v˘stup pro kaÏd˘ spot orientuje na sledování zmûn genové exprese bûhem malig- zapisujeme prÛmûrnou intenzitu popfiedí, odhad intenzity ních transformací a diferenciací [1 – 4]. Pracujeme s rÛzn˘- lokálního pozadí a mûfiení kvality obrazového vzorku. Nume- mi druhy stabilizovan˘ch bunûãn˘ch linií a se vzorky ode- rické hodnoty získané pomocí na‰eho software dále normali- bran˘mi z pacientÛ. Odebíráme napfi. nádorovou tkáÀ zujeme opût ve vlastním programu. Implementovali jsme tlustého stfieva, kostní dfieÀ a krev leukemick˘ch pacientÛ. mnoÏství moderních normalizaãních algoritmÛ a pfiehledné Experimenty vyuÏívající cDNA microarrays sestávají nástroje vizualizace tak, abychom mohli s ohledem na design z následujících krokÛ: experimentu co nejlépe transformovat vstupní data. Ná‰ soft- • izolace a purifikace RNA, amplifikace ware obsahuje within-slide i between-slide normalizaãní meto- • reverzní transkripce dy (obr. 2) a umoÏÀuje cel˘ normalizaãní proces zapouzdfiit • hybridizace do velmi pfiehledného a kompaktního prostfiedí. Pokud porov- • skenování náváme hodnoty pouze jednotliv˘ch skel, pouÏíváme nejãas- • obrazová anal˘za, normalizace a statistické vyhodnocení. tûji LOWESS [6] within-slide normalizaci mezi jednotliv˘mi

338 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 subgridy, která velmi kvalitnû vyrovnává rozdíly v intenzitách zpÛsobené pfiedev‰ím rÛzn˘m zabudováváním pouÏívan˘ch fluorescenãních barviv. Nûkteré experimenty vyÏadují porov- návání hodnot z nûkolika skel mezi sebou. V tûchto pfiípadech volíme nejãastûji dvoufázovou normalizaci. Nejprve jednotli- vá skla normalizujeme pomocí vhodné within-slide normalizace a poté aplikujeme between-slide normalizaci, nejãasteji metodu Quantile [7]. Normalizované hodnoty dále podrobu- jeme statistické anal˘ze pro odhalení v˘znaãn˘ch genÛ nebo oblastí. Pro specifické aplikace dále implementujeme vizuali- zaãní nástroje, které nám pfiehlednû zobrazují pozorované charakteristiky.

Obrázek 3.: Charakteristické ãasové prÛbûhy genové exprese nalezené shlukovou anal˘zou namûfien˘ch hodnot pro v‰echny 3 typy diferenciací. • rychlá up-regulace • pomalá up-regulace • up-regulace následovaná down-regulací • pomalá down-regulace • rychlá down-regulace Poãty genÛ v GRG se pohybovaly okolo 100. Za úãelem porov- nání tûchto skupin mezi rÛzn˘mi druhy diferenciace jsme vypo- ãítali jejich prÛniky a zanesli je do tabulek. V nich mÛÏeme pozorovat jist˘ fiád poukazující na nenáhodné rozloÏení genÛ ve skupinách. Pro vût‰í pfiehlednost jsme kaÏdé políãko obar- vili tím ãervenûji ãím více genÛ patfií do pfiíslu‰ného prÛniku. V‰imneme si ãerven˘ch „ostrÛvkÛ“ znamenajících velk˘ prÛ- Obrázek 1.: Ukázka na‰eho software pro anal˘zu obrazu JABS.I. Na nik vzhledem k podobnému ãasovému prÛbûhu. Diagonální obrázku je vidût prostfiedí s definovanou mfiíÏkou. Pro dal‰í informace políãka nám potvrzují existenci oblastí aktivních bûhem v‰ech o tomto software nás mÛÏete kontaktovat. druhÛ diferenciace (tab.1).

Obrázek 2.: Pfiíklad definice normalizaãního v˘poãtu v na‰em software Tabulka 1.: Tabulka prÛnikÛ jednotliv˘ch shlukÛ (1-10 GRG) pro mega- JABS.N. UÏivatel definuje v˘poãet graficky, pomocí schématu. V˘poãet karyocytární a monocytární diferenciace. Takovéto tabulky byly vygene- je tak velmi pfiehlednû znázornûn. rovány pro v‰echny kombinace diferenciaãních studií. Intenzita ãervené barvy napomáhá k lep‰í pfiehlednosti tabulky. V˘zkum v oblasti leukemick˘ch onemocnûní Rádi bychom demonstrovali vhodnost pouÏití technologie Na druhou stranu ãervené ostrÛvky leÏící mimo diagonálu jsou cDNA microarrays pro sledování ãasovû závisl˘ch procesÛ, dokladem existence oblastí, které jsou sice aktivní bûhem rÛz- transkripãní aktivity, diferenciaãních a jin˘ch transformací. n˘ch diferenciací ale jejich aktivita se v ãase pro rÛzné diferen- Za tímto úãelem popí‰eme na‰e experimenty spojené s ana- ciace li‰í. Implementovali jsme vizualizaãní nástroj, kter˘ zobra- l˘zou diferenciaãních procesÛ. Studujeme kinetiku a rozdí- zuje v˘poãet relativní hustoty exprese (weighted area regulation, ly mezi vybran˘mi diferenciacemi. V oblasti stabilizovan˘ch WAR) vzhledem k pozici na chromosomu (obr. 4) a nástroj bunûãn˘ch linií provádíme intenzivní v˘zkum diferenciaã- barevnû odli‰ující geny jednotliv˘ch deseti skupin. Díky nûmu ních procesÛ u HL-60 a K562 bunûk a také na buÀkách jsme mûli moÏnost sledovat shlukování regulovan˘ch genÛ CD34+ [8, 9]. uvnitfi RIDGE (regions of increased gene expression) oblastí a periodické zmûny kinetiky genové regulace. Získali jsme tak Kinetické studie zcela nov˘ pohled na dynamiku genové regulace azmûnu struk- Pro hledání rozdílÛ v ãasovém prÛbûhu exprese jednotliv˘ch tury chromatinu. Pokud se zamûfiíme na oblasti hustû obsazené genÛ pouÏíváme v˘‰e zmínûná vysokohustotní microarrays regulovan˘mi geny, mÛÏeme pozorovat ãast˘ jev periodického skla. Pro sledování zmûn genové exprese nám slouÏily 3 mode- opakování genÛ z oblastí 1-10 na chromosomech (postupn˘ lové diferenciace: monocytární a granulocytární diferenciace nástup). Detailní zpracování hodnot a grafÛ WAR potvrdilo, Ïe HL-60 a megakaryocytární diferenciace bunûk K562 [10 – 13]. regulované geny se na chromosomech nevyskytují náhodnû. Na základû získan˘ch microarrays dat jsme rozdûlili geny do Napfiíklad shluky genÛ regulovan˘ch v granulocytech a mono- 10 skupin (GRG) pro kaÏd˘ druh diferenciace. Kriteriem byla cytÛ nacházíme na prvních 10Mbp chromosomu 7. Oproti tomu ãasová kinetika zmûn genové exprese. Tyto skupiny jsme sefia- v této oblasti není Ïádn˘ shluk u megakaryocytÛ. V oblasti oko- dili od 1 do 10 podle charakteristického prÛbûhu podle násle- lo 90Mbp mÛÏeme na chromosomu 8 vidût 35% genÛ regulo- dujícího klíãe (obr. 3) van˘ch v megakaryocytech oproti 10% v granulocytech. Hus-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 339 tota v˘skytu regulovan˘ch genÛ obecnû nekoreluje s hustotou regiony, které se mezi pacienty li‰ily [22]. Tento pfiístup umoÏ- genÛ danou obsazením sklíãka. Napfiíklad pouze 5 genÛ ze 60 Àuje relativnû detailní anal˘zu tkánû nádoru tlustého stfieva. je regulovan˘ch u monocytÛ v oblasti okolo 30Mbp chromoso- Na jejím základû je moÏné od sebe odli‰ovat pacienty s rÛz- mu 20. V˘skyt regulovan˘ch genÛ v rÛzn˘ch RIDGE [14, 15] n˘mi stádii Duke podle spoleãn˘ch a individuálních regionÛ oblastech není rovnomûrn˘ a jednotlivé diferenciaãní procesy ve srovnávacích mapách. V˘sledky microarrays anal˘z pfie- mají své individuální aktivní podoblasti uvnitfi RIDGE. nesené do podoby TM jsme studovali s cílem vyjasnit poziã- ní vztahy mezi regulovan˘mi geny. Tyto vztahy mohou objas- nit vliv remodelace chromatinu na genovou expresi. Uvedené v˘sledky mohou doplÀovat souãasnou diagnostiku a pomoci pfii plánování léãby [23] (obr. 6).

Obrázek 4.: Hustota rozloÏení regulovan˘ch genÛ pro rÛzné druhy dife- renciací. Díky této vizualizaci mÛÏeme sledovat oblasti relativnû (vzhledem k celkovému poãtu genÛ v oblasti) bohaté na regulované geny a sou- ãasnû i s vysok˘m poãtem (absolutnû) genÛ. V prvním aÏ tfietím sloupci jsou data spojená s diferenciaãními procesy, ãtvrt˘ sloupec vyjadfiuje hodnoty pro celé sklíãko (poãty zkouman˘ch genÛ v dan˘ch oblastech). Na‰e v˘sledky potvrdily [16], Ïe nejsou pouze oblasti se striktnû zv˘‰enou nebo sníÏenou hladinou exprese, ale Ïe na nûkte- Obrázek 5.: Ukázka MA grafu pro porovnávání dvou bunûãn˘ch popu- r˘ch polohách chromosomÛ existují oblasti specifické pro lací (v tomto pfiípadû populace bunûk získan˘ch pomocí CD34+ a Lin- urãité bunûãné procesy. V˘sledky poukazující na poziãní shlu- selekce na zaãátku ex vivo diferenciace) . Modré teãky reprezentují geny kování genÛ bûhem rÛzn˘ch druhÛ diferenciaãního procesu s velmi mal˘m rozdílem v expresi, ãervené teãky naopak geny s v˘znam- pfiedstavují velk˘ potenciál pro budoucí techniky diagnosti- nou odchylkou. Shoda pro tento graf ãiní 98,3%. kování onkologick˘ch onemocnûní.

Hledání reziduálních rozdílÛ v bunûãn˘ch populacích Velmi zajímavé z hlediska uplatnûní microarrays v klinické diagnostice se také jeví studie hledající minimální resp. maxi- mální shody dvou zkouman˘ch vzorkÛ. V práci vûnované tomuto problému [9] jsme porovnávali expresní profily CD34+ pozitivních bunûk, selektovan˘ch z periferní krve stimulova- n˘ch pacientÛ s non-Hodgkinov˘m lymfomem, dvûma zpÛ- soby selekce (CD34+ a Lin-). BuÀky jsme porovnávali bûhem ex vivo [17] diferenciace do granulocytÛ. Na‰ím cílem bylo nalezení stupnû shody dvou odli‰nû získan˘ch vzorkÛ. Proká- zali jsme, Ïe obû dvû selekãní metody poskytují srovnatelné bunûãné populace, které nemûní svÛj expresní status ani bûhem Obrázek 6.: Transkripãní mapy jako diagnostick˘ nástroj aplikovan˘ na dvout˘denní ex vivo diferenciace do granulocytÛ. data pacientÛ. V prvním sloupci je namûfiená genová exprese pacientÛ bez Pro tuto studii jsme vyvinuli vlastní microarrays metodiku porov- metastáz, ve druhém sloupci jsou data pacientÛ s metastázami. Tfietí slou- návání vzorkÛ. Jednoduché porovnávání hodnot je pfiíli‰ zatíÏe- pec reprezentuje rozdíl mezi prvním a druh˘m sloupcem. né systematickou chybou, pfiedev‰ím v oblasti niÏ‰ích intenzit (variance se více projeví). Metoda vyuÏívající z-score [18, 19] je Závûr navrÏena tak, aby v˘sledek nebyl tímto faktem pfiíli‰ ovlivnûn. Technologie cDNA microarrays se nám osvûdãila jako velmi Námi navrÏená metodika se sestává nejprve z within-slide nor- siln˘ nástroj pfii v˘zkumu v oblasti onkologick˘ch onemocnû- malizace na kaÏdém sklíãku. Hodnoty ze vzájemnû porovnáva- ní a to pfiedev‰ím na hledání nov˘ch vztahÛ ve zmûnû vyjádfie- n˘ch sklíãek dále normalizujeme between-slide normalizací. Poté ní genÛ, ãi rodin genÛ v prÛbûhu maligní transformace. Díky je moÏné jejich hodnoty porovnávat. Z-score metodou nalezne- velkému poãtu souãasnû zkouman˘ch genÛ jsou studie prová- me rozdílné hodnoty a na v˘stup vracíme procento zastoupení dûné za pomoci této technologie velmi robustní a málo zatíÏe- rozdíln˘ch hodnot, kter˘ reprezentuje rozdílnost (resp. shodu) né v˘bûrovou chybou. Za pomoci stejn˘ch druhÛ skel je moÏ- vzorkÛ aplikovan˘ch na porovnávan˘ch sklech (obr. 5). né sledovat ‰iroké spektrum jevÛ. V této publikaci jsme napfi. zmínili studie zab˘vající se leukemick˘mi buÀkami a buÀka- V˘zkum v oblasti nádoru tlustého stfieva mi tkánû tlustého stfieva. Díky interdisciplinární povaze na‰í Experimenty zab˘vající se nádory tlustého stfieva vedeme skupiny jsme vyvinuli nástroje, které nám transformovaly data pomocí porovnávání zdravé a nádorové tkánû [20]. Detekuje- do pfiehledné formy. Pfiíkladem jsou transkripãní mapy, které me geny s v˘znamn˘m rozdílem v expresi bûhem rÛzn˘ch stá- dávají do souvislosti genovou expresi s pozicí genu na chro- dií onemocnûní. Na‰e cíle jsou jak v identifikaci dÛleÏit˘ch mosomu. Také nástroje funkãní anal˘zy microarrays dat posky- genÛ, tak ve vyvíjení moderního diagnostického pfiístupu vyu- tují ãím dál sofistikovanûj‰í v˘sledky umoÏÀující propojit zmû- Ïívajícího srovnávací TM. Identifikovali jsme 195 dÛleÏit˘ch ny v expresním statusu s jednotliv˘mi metabolick˘mi dráhami genÛ s v˘znamn˘m rozdílem (164 down a 31 up-regulova- [24]. Podobné nástroje je moÏné vytváfiet i pro dal‰í studie a tím n˘ch) v expresi mezi zdravou a nádorovou tkání. Pacienty jsme je‰tû více roz‰ífiit uÏiteãnost cDNA microarrays. na základû na‰ich studií rozdûlili do dvou skupin podle v˘skytu metastáz v regionálních uzlinách. Provedli jsme funkãní Podûkování anal˘zu [21] identifikovan˘ch genÛ. Ta rozdûlila geny do kate- Tato práce byla podpofiena grantem Grantové agentury âeské gorií dle jejich funkce a v˘znamu. Srovnávací TM nám uká- Republiky GAâR (301/04/P136) a grantem interní grantové zaly nûkteré spoleãné regiony u rÛzn˘ch pacientÛ a také agentury ministerstva zdravotnictví IGA MZ (1A/8241-3).

340 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Literatura 13. Depraetere, S., Vanhaesebroeck, B., Fiers, W., Willems, J., Joniau, M..1995. 1. Cremer, T., Cremer, C. 2001. Chromosome territories, nuclear architectu- Polar agents with differentiation inducing capacity potentiate tumor nec- re and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet. 2: 292-301. rosis factor-mediated cytotoxicity in human myeloid cell lines. J Leukoc 2. Kozubek, S., Luká‰ová, E., Jirsová, P., Koutná, I., Kozubek, M., Ganová, Biol. Jan;57(1):141-51. A., Bártová, E., Falk, M., Paseková, R.2002. 3D Structure of the human 14. Caron, H., Schaik, van B., Mee, van der M., Baas, F., Riggins, G., Sluis, genome: order in randomness Chromosoma. Volume 111, Issue 5, Dec van P., Hermus, M.C., Asperen, van R., Boon, K., Voute, P.A., Heister- 2002:321 – 331. kamp, S., Kampen, van A., Versteeg, R. 2001. The human transcriptome 3. Luká‰ova, E., Kozubek, S., Kozubek, M., Falk, M., Amrichova, J. 2002. map: clustering of highly expressed genes in chromosomal domains. The 3D structure of human chromosomes in cell nuclei.Chromosome Res. Science. 291:1289-1292. 10(7):535-48. 15. Versteeg, R., Schik, B.D.C, Batenburg, M.F., Roos, M., Monajemi, R., 4. E. Bártová, P. Jirsová, M. Fojtová, K. Souãek, S. Kozubek. 2003. Chro- Caron, H., Bussemaker, H.J., Kampen, A.H.C. van (2003) The human tran- mosomal territory segmentation in apoptotic cells. Cellular and Molecu- scriptome map reveals extremes in gene density, intron length, GC content, lar Life Science, Volume 60, Number 5, pages: 979 – 990. and repeat pattern for domains of highly and weakly expressed genes. Geno- 5. MacAulay, C., Palcic, B.1988. A comparison of some quick and simple me Res 13: 1998-2004 . threshold selection methods for stained cells. Analyt. Quant. Cytol. Histol. 16. Koutná, I. , Krontorád, P., Svoboda, Z., Bartová E., Kozubek, M., Kozu- 10:134-138. bek, S. 2006. New insights into gene positional clustering and its properti- 6. Yang, Y.H. and Thorne, N. 2003. Normalization for Two-color cDNA Mic- es supported by large-scale analysis of various differentiation pathways. roarray Data. Science and Statistics. A Festschrift for Terry Speed, D. Gold- Genomics (2006), doi:10.1016/j.ygeno.2006.07.013. stein (eds.), IMS Lecture Notes, Monograph Series, Vol 40, pp. 403-418. 17. Sato N, Sawada K, Koizumi K, et al. In Vitro Expansion of Human Perip- 7. Bolstad, B.M., Irizarry, R.A, _strand, M. and Speed, T.P. 2003. A compa- heral Blood CD34+ Cells. Blood 1993;82(12): 3600-3609. rison of normalization methods for high density oligonucleotide array data 18. Quackenbush J. Microarray data normalization and transformation. Nat. based on variance and bias. Bioinformatics. Jan 22;19(2):185-93. Genet. Suppl. 2002;32: 496-501. 8. Van Epps DE, Bender J, Lee W, et al. Harvesting, Characterization, and 19. Cheadle C, Vawater MP, Freed WJ,Becker KG. Analysis of microarray Culture of CD34+ Cells from Human Bone Marrow, Peripheral Blood, and data using Z score transformation. J. Mol. Diagn. 2003;5(2): 73-81. Cord Blood. Blood Cells 1994;20: 411- 423. 20. Cotran RS, Kumar V, Collins T. Robbins Pathologic Basis of Disease. Phi- 9. Koutná I. and Klabusay M., Kohutova V., Krontorád P., Svoboda Z., Kozu- ladelphia: W.B. Saunders Company, 1999. bek M., Mayer J. Evaluation of CD34+ and Lin- selected cells from perip- 21. Abiko Y, Hiratsuka K, Kiyama-Kishikawa M, Tsushima K, Ohta M, Sasa- heral blood stem cell grafts of patients with lymphoma during differentia- hara H. Profiling of differentially expressed genes in human gingival epit- tion in culture ex vivo using a DNA microarray technique. Experimental helial cells and fibroblasts by DNA microarray. J Oral Sci, 2004: Hematology. 2006 Jul;34(7):832-40. 46: 19–24. 10. Lee, K.H., Chang, M.Y., Ahn, J.I., Yu, D.H., Jung, S.S., Choi, J.H., Noh, 22. E Jansová, I Koutná, P Krontorád, Z Svoboda, S Kﬁivánková, J Îalou- Y.H., Lee, Y.S., Ahn, M.J. 2002. Differential gene expression in retinoic dík, M Kozubek and S Kozubek. Comparative transcriptome maps: acid-induced differentiation of acute promyelocytic leukemia cells, NB4 a new approach to the diagnosis of colorectal carcinoma patients using and HL-60 cells. Biochem Biophys Res Commun. Sep; 296(5):1125-33. cDNA microarrays. Clinical Genetics, 2006, Volume 69, page 11. Bartova E, Kozubek S, Jirsova P, Kozubek M, Gajova H, Lukasova E, Skal- 218 – 227. nikova M, Ganova A, Koutna I, Hausmann M (2002) Nuclear topography 23. Liefers GJ, Tollenaar RAEM. Cancer genetics and thein application to indi- and gene activity in human differentiated cells. J Struct Biol 139:76–89. vidual medicine. Eur J Cancor, 2002: 38:872–879. 12. Depraetere, S., Joniau, M. 1994. Polar agents with differentiation-inducing 24. Mlecnik B, Scheideler M, Hackl, Hartler J, Sanchez-Cabo F , Trajanoski capacity prime myelomonocytic cell lines to lipopolysaccharide-induced Z. PathwayExplorer: web service for visualizing high-throughput expres- cytolysis: the role of endogenous tumor necrosis factor. Leukemia. sion data on biological pathways. Nucleic Acids Res. 2005, 33: W633- Nov;8(11):1951-9. W637.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 341 URâOVÁNÍ NEBALANCOVAN¯CH GENOV¯CH ZMùN METODOU ARRAY KOMPARATIVNÍ GENOMOVÉ HYBRIDIZACE (ARRAY CGH) U NÁDORÒ.

DETERMINATION OF GENOMIC IMBALANCES USING ARRAY COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (ARRAY CGH) IN CANCER GENOM. JARO·OVÁ M1., POSPÍ·ILOVÁ H1., PLACH¯ R.1, PAPAJÍK T.1, KOPTÍKOVÁ J2., INDRÁK K.2

1 HEMATO-ONKOLOGICKÁ KLINIKA LF A FN OLOMOUC 2 CENTRUM BIOSTATISTIKY A ANAL¯Z, P¤F A LF MU BRNO

Souhrn Nádory jsou onemocnûní charakterizovaná genomovou instabilitou. Zmûny v poãtu kopií DNA jsou jednou z mnoha abnormit, kter˘mi mÛÏe b˘t ovlivnûna exprese a funkce genÛ. Proto urãení nebalancovan˘ch zmûn, které pfied- stavují pfiedev‰ím amplifikace a delece chromosomov˘ch oblastí a genÛ v nich lokalizovan˘ch, dovoluje urãit kri- tické geny a signální dráhy zahrnuté do vzniku a v˘voje onemocnûní. Urãení takov˘ch nebalancovan˘ch zmûn dovoluje molekulárnû cytogenetická metoda komparativní genomová hybridizace (CGH). CGH se stala zákla- dem nedávno vyvinuté technologie, metody array komparativní genomové hybridizace (array CGH), která dovoluje detailní anal˘zu chromosomov˘ch oblastí, ve kter˘ch do‰lo ke zmûnû poãtu kopií sekvencí DNA. V souãas- nosti mÛÏeme vyuÏít fiady array CGH technologií, které v˘znamn˘m zpÛsobem zvy‰ují rozli‰ovací schopnost metody CGH a umoÏÀují definovat v genomu oblasti, které mají vztah ke vzniku nádoru a dovolují rychle odhalit geny leÏící v tûchto oblastech. Tato práce informuje o principu, v˘znamu a vyuÏití metody array CGH pfii urãování nebalancovan˘ch zmûn v nádorovém genomu.

Klíãová slova: CGH, DNA ãip, array CGH, nádorov˘ genom, onkogen, tumor supresorov˘ gen

Summary Cancer is a disease characterized by genomic instability. One of the mechanisms that changes gene expression and gene function is DNA copy number changes. These changes mostly include gains and losses of chromosomal regions, which can be detected by molecular cytogenetic method: comparative genomic hybridization (CGH). On the basis of CGH a new method has been recently developed called array comparative genomic hybridization (array CGH). Array CGH improves the resolution of CGH and enables detailed analysis of chromosomal regions, detecting DNA sequence copy number changes. Modern array CGH technologies posses increased sensitivity and are able to define genomic regions related to cancer, and to identify genes lying within these regions. Such genes may be involved in critical signaling pathways and may play role in cancer development and progression. This work informs about the principle, significance and usage of array CGH method in detection of imba- lanced aberrations of cancer genome.

Key words: CGH, DNA chip, array CGH, tumor genom, oncogene, tumor suppressor gene

Úvod jako referenãní, takÏe pomûr pfiímo mapuje zmûny poãtu kopií Molekulárnû cytogenetické metody pfiedstavují revoluãní v testovaném genomu. Je dÛleÏité si uvûdomit, Ïe CGH samot- a dnes jiÏ potvrzen˘ zpÛsob urãování chromosomov˘ch zmûn. ná urãuje pouze zmûny poãtu kopií, ale ne absolutní poãet kopií. Jednou z takov˘ch technologií, která byla vyvinuta pfiedev‰ím Pfiesnû tetraploidní bunûãná populace bude tedy dávat kon- pro vy‰etfiování nádorov˘ch bunûk, je metoda komparativní stantní pomûr v genomu a bude nerozli‰itelná od v˘sledku zís- genomové hybridizace (CGH). CGH (obr. ã. 1) byla vyvinuta kaného z diploidní testované populace. pro mûfiení zmûn poãtu kopií sekvencí DNA v celém genomu Metoda CGH má své omezené rozli‰ovací schopnosti a dovo- v jednom vy‰etfiení (1, 2). Principem metody je komparativní luje urãit nebalancované zmûny na chromosomech, které se neboli pomûrná hybridizace dvou odli‰nû znaãen˘ch geno- pohybují od 3 megabází (Mb) pro ztráty genetického materi- mov˘ch DNA s normálními metafázov˘mi chromosomy. álu a 7–10 Mb pro urãení pfiítomnosti nadbyteãného genetic- Genomové DNA jsou izolovány ze dvou bunûãn˘ch popula- kého materiálu (3). Zv˘‰it citlivost metody, která v jediné hyb- cí, normální a nádorové, a jsou znaãené rozdíln˘mi fluoro- ridizaãní reakci dovoluje analyzovat cel˘ nádorov˘ genom, se chromy, obvykle ãerven˘m a zelen˘m. Po skonãení hybridi- podafiilo zavedením metody array komparativní genomové zace jsou mûfieny intenzity obou fluorescencí podél kaÏdého hybridizace (array CGH). Cíl hybridizace, metafázové chro- chromosomu a pomûr intenzit ãervené a zelené fluorescence mosomy metody CGH, byly nahrazeny fragmenty klonované pak urãuje relativní pomûr poãtu kopií ve vy‰etfiovaném geno- DNA rÛzn˘ch genÛ. Tyto fragmenty byly speciální technikou mu. Jedna z genomov˘ch DNA je vÏdy normální, oznaãená umístûny – ti‰tûny na povrch skla, kde k nim referenãní

342 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 a zkoumaná DNA hybridizují. KaÏd˘ fragment klonované ãeny rozdíln˘mi fluorochromy a takto rozdílnû znaãené DNA genomové DNA zaujímá své pfiesnû urãené místo na povrchu hybridizují s ãipem obsahujícím fragmenty genomové DNA skla. Takto pfiipravené speciální sklo bylo oznaãeno microar- vybran˘ch genÛ. V˘sledek hybridizace je hodnocen pomocí ray neboli ãip (obr. 1). speciálního pfiístroje, umoÏÀující mûfiení intenzity fluorescence hybridizované normální a nádorové DNA. Rozdíl v pomû- ru intenzity ãervené a zelené fluorescence urãuje nebalanco- vané zmûny v nádorovém genomu. Pro vyhodnocení v˘sledkÛ hybridizace se pouÏívají speciální programy zabudované pfií- mo v ãtecím zafiízení a statistické vyhodnocení je provádûno pomocí dal‰ích samostatn˘ch softwarov˘ch nástrojÛ. Array CGH slouÏí ke zv˘‰ení pfiesnosti, rozli‰ení a rozsahu zmûn ve srovnání s klasickou metodou CGH a mûfiení mÛÏe b˘t porovnáno pfiímo k pozici na genomové sekvenci (5). âip pro array CGH je pfiipraven z mapovan˘ch BAC (Bacteri- al Artificial Chromosomes) a dal‰ích genomov˘ch klonÛ nebo jsou na hybridizaãním skle umístûny fragmenty komplemen- tární DNA genÛ (cDNA) a nebo oligonukleotidy. V pfiípadû pouÏití BAC array, vyÏaduje hybridizaãní reakce nûkolik stovek nanogramÛ genomové DNA, ale více jak jeden mikrogram DNA je potfiebn˘ pro cDNA array a nûkteré specifické BAC ãipy (6, 7). Jednotlivé typy ãipÛ mají své pfiednosti, ale i svá omezení. Napfiíklad, vy‰‰í rozli‰ení je dosaÏeno pouÏitím oligonukleotidov˘ch ãipÛ, které jsou pfiipraveny technikou spo- tování na sklo (8) nebo pfiímou syntézou na sklo nebo siliko- nové substráty (9), které obsahují více jak 500 000 elementÛ. âipy pro urãení nukleotidového polymorfismu (Single nuc- Obrázek ã. 1.: A. Komparativní genomová hybridizace (CGH). Princip leotide polymorfism array-SNP) jsou vysoce citlivé ãipy dovo- metody CGH je zaloÏen na hybridizaci dvou rozdílnû znaãen˘ch geno- lující urãit i ztrátu heterozygozity jednotliv˘ch nukleotidÛ mov˘ch DNA, které hybridizují s normálními chromosomy. Pomûr fluo- rescenãních intenzit urãuje oblasti na chromosomu, ve kter˘ch do‰lo ke i zmûny poãtu kopií (10). SNP ãipové sondy jsou sestavené ztrátám nebo zmnoÏení genetického materiálu. B. Stejná hybridizace dvou z 25-merov˘ch oligonukleotidÛ a kaÏd˘ SNP má jak sense tak rozdílnû znaãen˘ch genomov˘ch DNA s DNA ãipem. Poãty kopií klonÛ antisense fietûzec. Intenzita sondy tak odpovídá dvûma alelám na ãipu jsou urãeny pomûrem namûfien˘ch intenzit fluorescence a jejich a umoÏÀuje tak urãit celkem tfii genotypy – AA, BB nebo AB. urãení závisí také na velikosti klonÛ a jejich lokalizaci na chromosomu. Na rozdíl od BAC ãipu hybridizuje k SNP ãipu pouze jedna genomová DNA a zmûny poãtu kopií jsou urãeny na základû Princip metody array CGH srovnání s nezávislou pfiedchozí kontrolní hybridizací. Pomo- Technologie array CGH, také oznaãována jako matrix CGH, cí tohoto pfiístupu napfiíklad Raghavan a spol. (10) urãili vel- byla zpoãátku pouÏita pro urãení segmentálních zmûn – tj. kou oblast vykazující uniparentální disomii u nemocn˘ch s leu- zmûn, které se t˘kaly chromosomov˘ch oblastí o velikosti kémií, ktefií mûli normální karyotyp. Tento nález mûl velk˘ nûkolika megabází, (Mb), a které byly lokalizované ve speci- vliv na pochopení genov˘ch zmûn u leukémií a ukázal, Ïe SNP fick˘ch chromosomov˘ch oblastech spojen˘ch s urãit˘m one- ãipy budou mít v˘znamné místo také pfii urãování zmûn v nádo- mocnûním. Salinos-Toldo a spolupracovníci (4) pouÏili mic- rovém genomu. roarray technologii k urãení nebalancovan˘ch chromo- Dal‰í moÏností je pouÏití tzv. long oligonucleotide array. somov˘ch zmûn. V metodû CGH nahradili cíl hybridizace, Metoda, která je oznaãena jako ROMA – representational metafázové chromosomy, microarray neboli ãipem, kter˘ oligonucleotide microarray analysis, pfiedstavuje pfiístup, obsahoval klony s velk˘mi inzerty (large insert clones – LIC) ve kterém je genomová DNA roz‰tûpena pomocí restrikã- pokr˘vajícími chromosom 13q14 a dal‰í oblasti. Anal˘za fiady ního enzymu, nejãastûji BglII, kter˘ je následován linker- bunûãn˘ch linií a nádorového genomu v práci tûchto autorÛ mediated polymerázovou fietûzovou reakcí, a v˘sledkem ukázala, Ïe tento pfiístup dovoluje zv˘‰it citlivost metody CGH jsou fragmenty o délce men‰í jak 1,2 kilobáze (kb). Tento z 10 megabází (Mb) na 75–130 kilobází (kb). pfiístup dovoluje urãení zmûn, které jsou men‰í jak jedna megabáze (8).

Tiling array Pfiesto, Ïe je moÏné konstruovat ãipy s rÛzn˘m poãtem klonovan˘ch DNA v jednotliv˘ch chromosomov˘ch oblastech, je v˘bûr ãetnosti klonÛ velmi individuální. MÛÏe totiÏ vést k tomu, Ïe nûkteré oblasti zÛstanou nepokryté. Pro úplné porozumûní v˘znamu nebalancovan˘ch zmûn v nádorovém genomu potfiebujeme takové ãipy, které skuteãnû pokr˘vají cel˘ genom. Ishkanian a spol. (11) dosud jako jediní, sestavili ãip pro array CGH pokr˘vající skuteãnû cel˘ genom (Obr. 3). Toto tzv. sub- megabázové rozli‰ení, sestavené ze sady pfiekr˘vajících se klo- nÛ, bylo oznaãeno „SMRT“ (Submegabase resolution tiling set). Tento ãip je tvofien celkem 32 433 pfiekr˘vajícími se BAC Obrázek ã. 2.: Schematické znázornûní principu array komparativní geno- klony, které jsou naspotovány v triplikátech na celkem dvû mové hybridizace (detailní popis v textu). hybridizaãní skla. V˘znamem tûchto citliv˘ch konstrukcí tkví v tom, Ïe takov˘m ãipem mohou b˘t detekovány mikrozmû- Základním principem metody array CGH je hybridizace (Obr. ny, které pfii pouÏití jin˘ch ãipÛ zÛstanou neodhaleny. Av‰ak ã. 2). Vzorky normální a nádorové genomové DNA jsou pomo- takové vysoké rozli‰ení má svá úskalí. Tento ãip, na rozdíl od cí molekulárnû genetické metody random priming PCR ozna- jin˘ch s men‰ím rozli‰ením, obsahuje i klony, které hybridi-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 343 zují s vysoce homologními sekvencemi v genomu, a proto je vyÏaduje v praxi velmi dobrou znalost jejich principu. Nezna- vyhodnocení takov˘ch ãipÛ velmi nároãné a vyÏaduje znaãné lost by mohla vést k nesprávnému pouÏití a interpretaci v˘sled- znalosti a zku‰enosti. kÛ. Pfiíkladem volnû dostupn˘ch programÛ, které jsou schop- né hodnotit jednotlivé experimenty, jsou napfi. ArrayCyCHt A (genomics.catholic.ac.kr/arrayCGH), Caryoscope (caryoscope.stanford.edu/ a nebo SeeGH (www.ArrayCGH.ca) (15). Sofistikovanûj‰í programy, které dovolují vyhodnotit více expe- rimentÛ, jsou napfi. CGHPro (http://www.molgen.mpg.de/~abt rop/molecular cytogenetics/ArrayCGH/CGHPRO) Nebo CGHAnalyser (http:/guanine.genomics.upenn.edu/peo- ple/faculty/weberb/ douwnloads.htm cgh/html/). Pro vlastní vyhodnocení v˘sledku hybridizace je nutné znát také aktuální informace o polymorfismech v lidském genomu a tyto informace vyuÏít pfii hodnocení v˘sledkÛ (15).

Urãování zmûn v nádorovém genomu metodou array CGH V posledních 5 letech byla publikována fiada studií vyuÏívají- B cí metody array CGH pro urãování zmûn poãtu kopií zamûfie- n˘ch na specifické oblasti, o kter˘ch bylo známo, Ïe jsou ãas- Obrázek ã. 3.: Znázornûní moÏností volby klonÛ pro konstrukci ãipu. A – to zahrnuté do nebalancovan˘ch aberací. Napfiíklad byl Rozli‰ení ãipu je dáno poãtem a vzdáleností jednotliv˘ch vybran˘ch klo- zkonstruován ãip pro chromosom 3p tvofien˘ 535 BAC klony nÛ v dan˘ch oblastech. B – Pfiíklad volby klonÛ pro konstrukci tzv. tiling array, ve kterém se jednotlivé klony vzájemnû pfiekr˘vají. a byl pouÏit pro definování ãasto deletovan˘ch a amplifikovan˘ch oblastí u nádorÛ dutiny ústní (16) a nádorÛ plic (17) PoÏadavky na kvalitu a kvantitu DNA nebo 5p ãip s 491 BAC klony pokr˘vajícími 50 Mb na chro- Pro získání kvalitních a validních v˘sledkÛ je pfii pouÏití meto- mosomu 5p (18) a ãip pro chromosom 1p s celkem 642 BAC dy array CGH zapotfiebí dodrÏet dnes jiÏ pfiesnû stanovené pod- klony pokr˘vající 120 Mb, zase pomohl pfii objevu genÛ podí- mínky kaÏdé hybridizace. V˘znamn˘m faktorem, ovlivÀují- lejících se na tumorogenezi plic (19). cím jiÏ na poãátku v˘sledek hybridizace, je kvalita a kvantita V˘znam pouÏití ãipÛ s vysok˘m rozli‰ením byl potvrzen na vy‰etfiované DNA. Problémy se získáním potfiebného mnoÏ- studiích proveden˘ch u lymfomu plá‰Èové zóny (MCL), kte- ství DNA se mohou objevit pfiedev‰ím u materiálu získaného r˘ je charakterizován translokací t(11;14)(q13;q32). Tato z mal˘ch biopsií, zatímco problém s kvalitou se mÛÏe objevit zmûna je pfiíãinou zv˘‰ené exprese cyklinu D1. Pro malig- u formalinem fixovan˘ch tkání nebo u parafínov˘ch fiezÛ. Dnes ní transformaci jsou nutné pfiídatné genetické zmûny. Tyto jiÏ víme, Ïe tzv. „large insert“, klony s velikostí kolem 150 kb, zmûny a jejich frekvence byly studovány metodou array jsou pomûrnû citlivé a hybridizace je úspû‰ná i pfii pouÏití ménû CGH s rÛzn˘mi typy ãipÛ. Kohlhammer a spol. (20) pouÏi- kvalitní DNA. To v‰ak neplatí pro oligonukleotidové ãipy li ãip s rozli‰ením 15 Mb a detekovali prÛmûrnû 6,7 zmûn a ãipy tvofiené mal˘mi PCR fragmenty. Vût‰ina BAC ãipÛ na jeden vy‰etfien˘ pfiípad MCL. Urãili tak o 50 % více zmûn, vyÏaduje pro hybridizaci 200–400 ng DNA, zatím co oligo- neÏ bylo urãeno klasickou metodou CGH. V této práci bylo nukleotidové a cDNA ãipy vyÏadují aÏ 1 mikrogram vysoce urãeno celkem 6 oblastí s kandidátními geny, které jsou kvalitní DNA. cílem dal‰ích v˘zkumÛ. Ve studii Schraderse a spol. (21) byl Dal‰í limitací pro array CGH je heterogenita tkánû (12). Nená- u MCL pouÏit ãip s rozli‰ením 800 kb a bylo urãeno 15,4 dorové buÀky v nádorovém vzorku vedou k posunu v pomûru zmûn na jeden pfiípad a celkem 15 oblastí s kandidátními signálÛ spojen˘ch s genetick˘mi zmûnami v nádorov˘ch buÀ- geny. Dal‰í v˘znamná data byla získána ze studie de Leeuw kách. Garnis a spol. (13) napodobili tento fenomén experi- a spol. (22). Anal˘za bunûãné linie MCL s pouÏitím SMRT mentálnû a potvrdili, stejnû jako Davies a spol (14), Ïe prav- ãipu dovolila urãit v prÛmûru 35 zmûn v genomu se stejn˘m dûpodobnost urãení zmûn urãité velikosti není závislá jen na mnoÏstvím jak ztrát genetického materiálu, tak zmnoÏení, poãtu klonÛ pfiítomn˘ch na ãipu, ale také na jejich velikosti. a potvrdila opakující se zmûny men‰í jak 130 kb (22). Aãko- Vût‰í klony jsou identifikovány s vût‰í pravdûpodobností neÏ liv byla tato studie provedena na bunûãné linii, kde nûkteré klony malé. zmûny mohou souviset s kultivaãními artefakty, detekci cel- DÛleÏit˘ je také vhodn˘ v˘bûr referenãní DNA. PouÏívá se kem 35 zmûn je moÏné povaÏovat za velmi v˘znamnou. DNA jak od jedince opaãného pohlaví, tak stejného pohlaví. Navíc byly nûkteré zmûny submegabázové velikosti a zahr- Referenãní DNA je smûsí DNA rÛzn˘ch jedincÛ nebo jde novaly pouze 1–2 kandidátní geny. PouÏitím tohoto velmi o DNA pouze jednoho jedince. V˘bûr závisí také na zku‰e- citlivého ãipu se ukázalo, Ïe delece na chromosomu 8p21, nosti laboratofie. u které urãili Kohlhmmer a spol. (20) velikost 2,4 Mb, je ve skuteãnosti delece o velikosti 730 kb a zahrnuje tfii kandi- Anal˘zy dat získan˘ch metodou array CGH dátní tumor supresorové geny, jako napfi. TNFRSF10B – gen Rychl˘ rozvoj metody array CGH vedl k vyvinutí fiady softwa- tumor necrosis factor. rov˘ch systémÛ pro statistické hodnocení a vizualizaci dat. Prv- PouÏití metody array CGH s ãipy s vysok˘m rozli‰ením ním krokem vizualizace je konverse obrazov˘ch dat získan˘ch pfiiná‰í v˘znamné informace o kandidátních genech, které z pfiíslu‰ného ãtecího zafiízení do ãíselného vyjádfiení lokus-spe- jsou zahrnuty do patogeneze onemocnûní. Právû pouÏití cifického pomûru poãtu kopií. Program, kter˘ to umoÏÀuje, je citliv˘ch ãipÛ dává moÏnost odhalit a následnû analyzovat souãástí softwarového vybavení fiady skenerÛ. Druh˘m krokem malé oblasti v genomu. Pfiíkladem je trisomie chromoso- je pfiifiazení elementÛ naspotovan˘ch na ãipu k jejich pozici mu 12 u MCL. Ve studii de Leeuw a spol. (22) se ukázalo, v genomu. Speciální program dokáÏe na základû informace Ïe nejde o kompletní trisomii chromosomu 12, ale bylo o sekvenci jednotliv˘ch BAC klonÛ urãit jejich vztah k lidské- objeveno 6 oblastí na chromosomu 12, které byly dupliko- mu genomu. KaÏd˘ klon zastoupen˘ na ãipu je pak pfiesnû gra- vané na krátkém i dlouhém rameni chromosomu 12, pfii- ficky lokalizován na své genomové místo (obr. 2). ãemÏ jedna duplikace z nich byla men‰í jak 370 kb a obsa- Urãení nebalancovan˘ch zmûn vyÏaduje statistické vyhodno- hovala pouze 2 geny. To je dÛkaz, Ïe se vzrÛstající cení získan˘ch dat. Programy vhodné k tomuto úãelu jsou jak rozli‰ovací schopností array CGH technologií vzrÛstá také volnû dostupné, tak je moÏné je zakoupit od specializovan˘ch pravdûpodobnost snadnûj‰ího odhalení dosud neznám˘ch softwarov˘ch firem. Av‰ak pouÏití softwarov˘ch programÛ nádorov˘ch genÛ.

344 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Genetické zmûny spojené s progresí nádorÛ ximálnû vzhledem ke zlomu znaãené jednou barvou, zatímco PouÏití array CGH technologií pfiispûlo také k porozumûní sekvence, které jsou distálnû ke zlomu, jsou znaãeny jinou bar- nûkter˘m zmûnám, které pozorujeme v dobû progrese one- vou (Obr. 4). Kombinací metod array CGH a array painting je mocnûní. Martinez-Climent a spol. (23) pouÏili ãip s 2400 klo- moÏné stanovit jak zmûny poãtu kopií DNA, tak balancované ny s rozli‰ením 1,4 Mb pro studium zmûn bunûãné linie foli- translokace. kulárního lymfomu (FL) a nûkolika pacientÛ s transformací FL do velkobunûãného B lymfomu (DLBCL). Genomov˘ profil byl porovnán s jejich expresním profilem a bylo potvrzeno, Ïe transformace je provázena vznikem dal‰ích genomov˘ch zmûn a zmûna exprese fiady genÛ odpovídala jejich genomo- v˘m zmûnám. Jiná studie byla zamûfiena na urãení genetick˘ch zmûn v souvislosti s progresí premaligního stádia nádoru do plnû malig- ní formy. Weiss a spol. (24) studovali metodou array CGH hyperplastické polypy Ïaludku a Ïaludeãní adenomy a v˘sledkem srovnání bylo zji‰tûní, Ïe existují pravdûpodobnû dvû roz- dílné patogenetické cesty vzniku nádorÛ Ïaludku. V˘sledky práce Nyante a spol. (25) u nádorÛ prsu ukázaly, Ïe na základû nebalancovan˘ch zmûn mÛÏeme odli‰it podtypy nádorÛ prsních s odli‰n˘m klinick˘m prÛbûhem. V‰echny tyto studie ukázaly, Ïe pozdûj‰í nádorová stádia jsou charakterizována vy‰‰ím v˘skytem zmûn ve srovnání s jejich pfiedchozími stádii. Pfiedpokládá se, Ïe právû tyto pfiídatné zmû- ny jsou odpovûdné za progresi onemocnûní. Tyto nálezy mohou také pfiinést dÛleÏité prognostické informace o budou- cím klinickém chování onemocnûní. Napfiíklad, korelace array CGH v˘sledkÛ s klinick˘m prÛbûhem onemocnûní u lymfomu plá‰Èové zóny (MCL) ukázala, Ïe delece na chromosomech 8p a 13q14 je vÏdy spojena se ‰patnou prognózou onemocnû- ní (20). Obrázek ã. 4.: Schematické znázornûní principu metody paintig array âipová technologie pro urãení translokací (detailní popis v textu). Metoda array CGH dovoluje urãit zmûny poãtu kopií sekven- cí DNA. Nedovoluje urãit chromosomové zmûny typu inver- Závûr se a balancované translokace, ve kter˘ch nedochází ke zmûnû V této práci jsme se zamûfiili na molekulárnû cytogenetickou poãtu kopií. Pro urãení balancovan˘ch zmûn byla vyvinuta metodu array CGH dovolující urãení zmûn poãtu kopií sekven- modifikace metody array CGH a byla oznaãena array painting cí DNA, na její princip a v˘znam u nádorÛ. Zmûny poãtu kopií (26). Array painting vyuÏívá prÛtokové cytometrie k sortová- DNA jsou jedním z mnoha mechanismÛ, které se mohou podí- ní a separaci abnormálních chromosomÛ, které jsou v˘sled- let na zmûnû exprese genÛ, která vede ke vzniku nádoru. Vyu- kem translokace nebo inverse, pomocí zmûny velikosti a pomû- Ïití této technologie pro studium zmûn nádorového genomu je ru párÛ bází. Následuje izolace DNA z tûchto abnormálních pfiíslibem v˘znamného pokroku v urãení nádorov˘ch genÛ. chromosomÛ. DNA obou aberantních chromosomÛ jsou ozna- Jejich následné anal˘za pfiinese nové informace o jejich roli ãeny rozdíln˘mi fluorochromy a hybridizují s ãipem . V pfií- a podílu na vzniku a v˘voji nádorÛ a jejich moÏné cílené léãbû. padû balancované translokace rozdílnû znaãené DNA dvou derivovan˘ch chromosomÛ ukazují sekvence, které jsou pro- Práce je podporována grantem M·M 6198959205.

Literatura: 9. Zhou X., Cheng Li J., Paez G., et al.: An integrated view of copy number 1. Kallioniemi A., Kallioniemi OP., Sidar D. et al.: Comparative genomic and allelic alterations in the cancer genome using single nucleotide poly- hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science morphism array. Cancer Res 64, 2004, 3060-3071. 258, 1992, 818-821. 10. Raghavan M., Lillington DM., Skoulakis S. et al: Genome-wide single nuc- 2. Du Manoir S., Speicher MR., Joos S. et al.: Detection of complete and par- leotide polymorphism analysis reveals frequent partial uniparental disomy tial chromosome gains and losses by comparative genomic hybridization. due to somatic recombination in acute myeloid leukemias. Cancer Res 65, Human Genet 90, 1993, 590-610. 2005, 375-378. 3. Lichter P., Joos S., Bentz M. et al.: Comparative genomic hybridization: 11. Ishkaniana. S., Malloff CA., Watson SK. et al.: A tiling resolution DNA uses and limitations. Semin Hematol 37, 2000, 348-357. microarray with complete coverage of human genome. Nat Genet 36, 2004, 4. Solinas-Toldo S., Lampel S., Stilgenbauer S. et al.: Matrix-based compa- 299-303. rative genomic hybridization biochips to screen for genomic imbalances. 12. Pettus JA., Cowley BC., Maxwell T. et al.: Multiple abnormalities detec- Genes Chromosomes Cancer 20, 1997, 399-407. ted by dye reversal genomic microarrays in prostate cancer: a much grea- 5. Pinkel D, Segraves R., Sudar D. et al.: High resolution analysis of DNA ter sensitivity than conventional cytogenetics. Cancer Genet Cytogenet 154, copy number variation using comparative genomic hybridization to mic- 2004, 110-118. roarrays. Nat Genet 20, 1998, 207-2011. 13. Garnis C., Rosin MP., Zhang L., Lam WL.: Comparing canonical non-small 6. Pollack JR., Perou CM., Elizadeh AA. et al.: Genome-wide analysis of DNA cell lung squamous and adenocarcinoma model genomes. Int J Cancer copy number changes using cDNA microarrays. Nat Genet 23, 1999, 41-46. 116(5), 2005, 813-819. 7. Carvalho B., Ouwerkert E., Meijer GA., Ylstra B.: High resolution micro- 14. Davies JJ., Wilson IM., Lam WL.: Array CGH technologies and their appli- array comparative genomic hybridization analysis using spotted oligonuc- cations to cancer genom. Chromosome Research, 13, 2005, 237-248. leotides. J Clin Pathol 57, 2004, 644-646. 15. Lockwood WW., Chari R., Chi B., Lam WL.: Recent advances in array 8. Lucito R., Healy J., Alexander J. et a.l: Representational oligonucleotide comparative genomic hybridization technologies and their applications in microarray analysis: a high-resolution method to detect genome copy num- human genetics. E J Human Genetics, 14, 2005, 139-148. ber variation. Genome Res 13, 2003, 2291-2305. 16. Garnis C., Baldwin C., Zhang L. et al.: Use of complete coverage array

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 345 comparative genomic hybridization to define copy number alteration on based comparative genomic hybridization. Blood, 105, 2004, 686- chromosome 3p in oral squamous cell carcinoma. Cancer Res, 63, 2003, 1693. 8582-8585. 22. de Leeuw RJ., Davies JJ., Rosenwald A. et al.: Comprehensive whole geno- 17. Garnis C., Campbell J., Davies JJ. et al.: Involvement of multiple deve- me array CGH profiling of mantle cell lymphoma model genomes. Hum lopmental genes on chromosome 1p in lung tumourigenesis. Hum Mol Mol Genet 13, 2004, 1827-1837. Genet, 14, 2005, 475-482. 23. Martinez-ClimentJA., Alizadeh AA., Segraves R. et al.: Transformation of 18. Coe BP., Henderson LJ., Garnis C. et al.: High-resolution chromosome arm follicular lymphoma to diffuse large cell lymphoma is associated with 5p array CGH analysis of small cell lung carcinoma cell lines. Genes Chro- a heterogeneous set of DNA copy number and gene expression alterations. mosomes Cancer 42, 2005, 308-313. Blood 101, 2003, 3109-3117. 19. Henderson LJ, Coe BP., Lee EH. et al.: Genomic and gene expression pro- 24. Weiss MM., Kuipers EJ., Postma C. et al.: Genome wide comparative geno- filing of minute alteration of chromosome arm 1p in small cell lung carci- mic hybridization analysis of premalignant lesions of the stomach. Mol Pat- noma cell. Br J Cancer 92, 2005, 1553-1560. hol 56, 2003, 293-298. 20. Kohlhammer H., Schaenen C., Wessendorf S. et al.: Genomic DNA-chip 25. Nyante SJ., Devries S., Chen YY. et al.: Array-based comparative geno- hybridization in t(11;14)-positive mantle cell lymphomas shows a high fre- mic hybridization of ductal carcinoma in situ and synchronous invasive quency of aberrations and allows a refined characterization of consensus lobular cancer. Hum Pathol. 35, 2004, 759-763. regions. Blood, 104, 2004, 795-801. 26. Fiegler H, Gribble SM., Burford DC. et al.: Array painting: a method for 21. Schraders M., Pfund R., Straatman HM. et al.: Novel chromosomal a rapid analysis of aberrant chromosomes using DNA microarrays. J Med imbalances in mantle cell lymphoma detected by genome-wide array- Genet 40, 2003, 664-670.

OD GENOMU K PROTEOMU – VYUÎITÍ PROTEINOV¯CH âIPÒ V ONKOLOGII FROM GENOME TO PROTEOME – USING OF PROTEIN MICROARRAYS IN ONCOLOGY MALâÍKOVÁ J., TICH¯ B., KOTA·KOVÁ J., MAYER J., POSPÍ·ILOVÁ ·.

CENTRUM MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE A GENOVÉ TERAPIE, INTERNÍ HEMATOONKOLOGICKÁ KLINIKA, FN BRNO

Souhrn Rychl˘ rozvoj genomick˘ch technologií v posledních letech napomohl k lep‰ímu pochopení zmûn, které pro- bíhají v rakovinné buÀce na úrovni genomu. Skuteãn˘mi vykonavateli bunûãn˘ch funkcí jsou v‰ak proteiny kódované genomem. Pfiímá anal˘za souboru proteinÛ buÀky - proteomu - má proto velk˘ v˘znam pro pocho- pení procesu karcinogeneze a také v diagnostice. Celkov˘ bunûãn˘ proteom v klinick˘ch vzorcích studuje klinická proteomika, jejímÏ cílem je identifikovat a charakterizovat proteiny zapojené do vzniku a v˘voje onemocnûní. V onkologii se tato nová disciplína zamûfiuje na identifikaci proteinÛ, které by mohly slouÏit jako biomarkery onemocnûní pro vãasnou diagnosu, a také na studium vlivu terapeutik a nalezení nov˘ch terapeutick˘ch cílÛ. Rakovina je znaãnû heterogenní a promûnlivé onemocnûní a pro její v˘zkum i diagnostiku je zapotfiebí zavedení vysokokapacitních proteomick˘ch pfiístupÛ. Proteinové ãipy tyto poÏadavky splÀu- jí, neboÈ umoÏÀují paralelní stanovení mnoha parametrÛ v minimálním mnoÏství vzorku v rámci jediného experimentu. Tato technologie je vyuÏitelná nejen pro identifikaci a kvantifikaci proteinÛ, ale i pro jejich funkãní anal˘zu.

Klíãová slova: proteinové ãipy, proteomika, biomarkery, rakovina

Summary Rapid development of genomic technologies allowed better understanding of changes in cancer cell genome. However, proteins coded by genes execute biological functions predominantly. Hence, direct analysis of col- lections of proteins i.e. proteome, is of great importance to understanding of carcinogenesis and also for diagnostics. The entire proteome in biological samples is analysed by clinical proteomics that aims to identify and characterise the disease related proteins. The purpose of this novel discipline in oncology is to identify new molecular biomarkers useful in early diagnosis and drug discovery. As cancer being a heterogeneous and dynamic disease, new high-throughput and large-scale technologies are required. Therefore protein microarrays represent a powerful tool in cancer research and diagnosis allowing simultaneous determination of a large number of parameters from a minute amount of sample within a single experiment. Assay systems based on this technology are used for identification and quantification of proteins as well as for the study of protein functions.

Keywords: protein microarrays, proteomics, biomarkers, cancer

346 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Úvod konci 80. let (8). Prokázal, Ïe anal˘za na principu vazby pro- Primární pfiíãinou vzniku nádorÛ jsou ve vût‰inû pfiípadÛ zmû- tilátka-antigen, miniaturizovaná ve formû mikrospotÛ protilá- ny v genomu – genové mutace a chromozómové a genomové tek na pevném povrchu, mÛÏe dosáhnout vysoké citlivosti. aberace. Genom, jakoÏto soubor v‰ech genÛ buÀky, je v‰ak Systém, kter˘ vyuÏívá malého mnoÏství vázané protilátky pouze matricí, podle níÏ se syntetizují proteiny. Soubor v‰ech a malého objemu vzorku je citlivûj‰í neÏ systém se stonásob- proteinÛ v daném biologickém systému v konkrétním oka- nû vût‰ím objemem materiálu, neboÈ pfiesto, Ïe mnoÏství navá- mÏiku se naz˘vá proteom. Právû proteiny realizují vût‰inu zané molekuly je velmi nízké, v rámci mikrospotu lze dosáh- bunûãn˘ch funkcí. Modifikace v proteomu pozmûÀují signál- nout vysoké hustoty. Pfii stanovení analytÛ jako napfiíklad ní dráhy a mohou vést k naru‰ení klíãov˘ch bunûãn˘ch pro- thyroidní stimulující hormon (TSH) nebo HBsAg dosáhl Ekins cesÛ jako jsou proliferace, diferenciace, pfieÏívání, apoptóza, se sv˘mi spolupracovníky citlivosti fiádovû ve femtomolech metabolické a imunitní procesy (1). V pfiípadû, Ïe zmûny v sig- (odpovídá 106 molekulám na ml). ZároveÀ je moÏné stanove- nálních drahách poskytují buÀce selektivní rÛstovou v˘hodu, ní mnoÏství analytu ve vzorku, neboÈ mnoÏství vázaného ana- jsou pak vlastní pfiíãinou nádorového bujení (2). Proto identi- lytu pfiímo odráÏí jeho koncentraci. fikace genetick˘ch událostí vedoucích k onemocnûní vyÏadu- je také následné pochopení zmûn v proteomu. Navíc v protei- Typy proteinov˘ch ãipÛ novém sloÏení se dynamicky odráÏí momentální zmûny stavu Z hlediska pouÏití lze proteinové ãipy rozdûlit na expresní (ana- bunûk, proto monitorování proteomu v ãase umoÏÀuje urãit lytické) a funkãní. Expresní ãipy jsou pouÏívány pro stanove- prÛbûh onemocnûní a také reakci na léãbu. ní pfiítomnosti a koncentrace proteinÛ v komplexních vzorcích Moderní genomické pfiístupy v ãele s DNA ãipy umoÏÀují a mají velk˘ potenciál pro tzv. proteinové profilování, tj. moni- v jediném experimentu analyzovat cel˘ transkriptom, tj. geno- torování proteinové exprese ve velkém mûfiítku (large-scale vou expresi na úrovni mRNA. Mohou tak urãit vztah mezi akti- pfiístup). Pomocí funkãních proteinov˘ch ãipÛ detekujeme vitou genu a maligním onemocnûním. Je v‰ak je známo, Ïe interakce proteinÛ s jin˘mi proteiny, peptidy, nízkomoleku- korelace mezi mRNA expresí a hladinou odpovídajícího pro- lárními látkami, oligosacharidy ãi DNA. teinu není absolutní (3, 4), a to z dÛvodu rozdílné kontroly V pfiípadû expresních proteinov˘ch ãipÛ existují dva základ- rychlosti syntézy proteinÛ a také odli‰né rychlosti degradace ní formáty, které se li‰í zpÛsobem aplikace vzorku: pfiím˘ jak mRNA, tak proteinÛ. Genomické techniky také neumoÏ- (FPA – forward phase arrays) - na povrchu ãipu jsou imobi- Àují monitorovat, zda je exprimovan˘ protein funkãní. Funk- lizovány sondy, kaÏd˘ spot obsahuje jeden typ sondy. âip je ci proteinÛ ovlivÀují interakce s jin˘mi proteiny, ãi dal‰ími inkubován se vzorkem a proteiny jsou ze vzorku sondami molekulami a také fiada posttranslaãních modifikací: napfiíklad vyvazovány. U zpûtného formátu (RPA – reverse phase proces pfienosu signálu v buÀce je pfiednostnû fiízen fosforyla- arrays) jsou stovky rÛzn˘ch vzorkÛ imobilizovány na povr- cí proteinÛ. Proto v souãasnosti vzniká potfieba zavádûní chu ãipu ve formû spotÛ. âip je potom inkubován se znaãe- nov˘ch pfiístupÛ zamûfien˘ch pfiímo na detekci patologick˘ch n˘mi sondami (6). Nejãastûj‰ím typem sond jsou protilátky, zmûn v proteinovém spektru. pokud jsou imobilizovány na ãipu, hovofiíme o protilátko- Studium bunûãného proteomu je komplikováno právû jeho v˘ch ãipech. V pfiípadû zpûtného formátu, kdy jsou imobili- znaãnou komplexitou. Pokud uvaÏujeme, Ïe na‰e genetická zovány vzorky obsahující proteinové antigeny, jedná se informace obsahuje 40 000 genÛ, pak díky posttranskripã- o antigen ãipy. (Obr. 1) ním a posttranslaãním modifikacím mÛÏe buÀka obsahovat aÏ milion i více proteinÛ a mnoho z nich mÛÏe hrát roli ve v˘voji onemocnûní. Pro anal˘zu celkov˘ch zmûn v protei- nové expresi je tedy tfieba zavedení moderních vysokokapa- citních metod. ¤e‰ení mohou poskytnout proteinové ãipy (protein arrays), které umoÏÀují paralelní sledování ‰iroké- ho spektra proteinÛ souãasnû. V souãasné dobû jsou jiÏ vyu- Ïívány nejen pro identifikaci a kvantifikaci proteinÛ v mini- málním mnoÏství vzorku, ale také pro studium funkãnosti proteinÛ na základû jejich interakcí s partnersk˘mi molekulami (5).

Princip technologie Zjednodu‰enû fieãeno jsou proteinové ãipy stovky aÏ tisíce proteinÛ imobilizovan˘ch ve formû mikrospotÛ na pevném povrchu. Povrchem mohou b˘t membrány (polystyrenové, PVDF - polyvinyliden fluorid, nitrocelulosové), ov‰em v sou- ãasné dobû se stále více vyuÏívá standardních mikroskopic- k˘ch sklíãek – sklenûn˘ch s chemicky modifikovan˘m povrchem (poly-lysin, aldehydické skupiny) nebo potaÏen˘ch membránou. Nejãastûj‰í detekãní metodou je fluorescence, Obrázek 1.: Typy proteinov˘ch ãipÛ A – expresní ãipy. a – FPA (For- ward Phase Arrays) u protilátkov˘ch ãipÛ jsou na pevn˘ povrch vázány ale mÛÏe b˘t vyuÏito i chemiluminiscence nebo radioaktivi- protilátky a ty jsou inkubovány se vzorkem. Proteiny mohou b˘t znaãené ty (6). Alternativou k tûmto planárním ãipÛm jsou systémy pfiímo, nebo se provádí detekce pomocí sekundární znaãené protilátky – zaloÏené na mikrosférách pro mûfiení men‰ího mnoÏství ana- sendviãová technologie. b – RPA (Reverse Phase Arrays) analyzované lytÛ. Mikrosféry jsou kulovité ãástice pfiibliÏnû o velikosti proteiny jsou naspotovány na ãip a jsou detekovány pomocí znaãen˘ch μ protilátek. B - funkãní ãipy – na ãipu jsou vázány proteiny ve funkãní lymfocytu (prÛmûr ~ 10 m) vyrobené napfi. z polystyrenu konformaci a je tak umoÏnûno studium jejich interakcí s DNA, jin˘mi pro- nebo latexu. Tyto ãástice jsou „kódovány“ rozdíln˘mi barva- teiny ãi dal‰ími molekulami a také studium enzymové aktivity. mi nebo velikostmi a na nich jsou navázány sondy specifické pro stanovované proteiny. S pouÏitím napfi. flow cytometrie Expresní ãipy jsou rozdílnû kódované mikrosféry rozpoznávány a proteiny Protilátkové ãipy (FPA) ve vzorku jsou takto identifikovány a kvantifikovány. MnoÏ- NejbûÏnûj‰ím typem pfiím˘ch analytick˘ch ãipÛ jsou protilát- ství stanovovan˘ch proteinÛ je ov‰em limitováno poãtem dru- kové ãipy, kdy je na pevném povrchu vázáno velké mnoÏství hÛ mikrosfér (7). protilátek a tyto jsou potom inkubovány se vzorkem. Proteiny Základy pro v˘voj proteinov˘ch ãipÛ poloÏil Roger Ekins na ve vzorku mohou b˘t znaãeny pfiímo nebo se pro detekci pou-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 347 Ïívá tzv. sendviãová metoda – detekce pomocí znaãené sekun- studované vzorky (bunûãné nebo tkáÀové lyzáty). Pfiítomnost dární protilátky. PouÏití sekundární protilátky znaãnû zvy‰u- jednotliv˘ch proteinÛ (antigenÛ) je stanovována pomocí spe- je citlivost a specifitu anal˘zy, ov‰em vyÏaduje dvû specific- cifick˘ch znaãen˘ch protilátek. Takto byly napfiíklad srovná- ké protilátky pro dan˘ protein. vány hladiny proteinÛ u 60 lidsk˘ch nádorov˘ch linií. Lyzáty Pfiímé znaãení proteinÛ ve vzorku sice umoÏÀuje niÏ‰í citlivost z bunûãn˘ch linií byly spotovány vÏdy 10krát v rÛzn˘ch fiedû- detekce – fiádovû ng/ml, ale jeho v˘hodou je moÏnost dvouba- ních a proteiny byly detekovány pomocí 52 my‰ích monoklo- revného znaãení (9). Podobnû jako u DNA ãipÛ porovnáváme nálních protilátek. Byly takto nalezeny dva potenciální mar- expresi mRNA ve dvou vzorcích, mÛÏeme pomocí protilátko- kery odli‰ující nádory tlustého stfieva od nádorÛ vajeãníku, vách ãipÛ srovnávat hladiny proteinÛ v rÛzn˘ch tkáních (napfi. které jsou v nûkter˘ch pfiípadech histologicky ‰patnû rozli‰i- zdravá vs. nádorová tkáÀ). Proteiny ze dvou rÛzn˘ch zdrojÛ jsou telné (21). Tato skupina také srovnávala v˘sledky z proteino- barveny dvûma rÛzn˘mi fluorescenãními barvami, smíchány ve vého profilování s v˘sledky DNA ãipÛ a prokázala pomûrnû stejném pomûru a inkubovány na ãipu. âip je poté skenován flu- vysokou korelaci mezi hladinou mRNA a bunûãn˘mi struk- orescenãním readrem na dvou rÛzn˘ch kanálech se specifickou turními proteiny, ov‰em v pfiípadû nestrukturních proteinÛ Ïád- vlnovou délku pro dan˘ fluorofor. Pomûr fluorescence dvou flu- ná korelace prokázána nebyla (22). Pro studium karcinogene- oroforÛ potom odpovídá relativní koncentraci proteinu ve srov- ze je velmi vhodná kombinace RPA s laserovou mikrodisekcí návan˘ch vzorcích (Obr. 2). Poprvé s touto technikou vystou- (LCM – laser capture microdisection), protoÏe umoÏÀuje sle- pil Haab se sv˘mi spolupracovníky v roce 2001 (9). Spotovali dovat promûnliv˘ stav bunûãného proteomu ve vybran˘ch 115 komerãnû dostupn˘ch protilátek a testovali jejich reaktivi- bunûãn˘ch subpopulacích v mikroprostfiedí nádoru a vysledo- tu s pfiíslu‰n˘mi znaãen˘mi antigeny pfiipraven˘mi v rÛzn˘ch vat takto zmûny v signálních drahách vedoucí ke vzniku a pro- pomûrech koncentrací. Pfii interpretaci v˘sledkÛ je v‰ak tfieba gresi nádoru. Tuto technologii pouÏil Grubb se sv˘mi spolu- brát v úvahu, Ïe siln˘ signál mÛÏe vzniknout nejen v dÛsledku pracovníky (23) pro studium zmûn pfii progresi karcinomu vysoké koncentrace stanovovaného proteinu ve vzorku, ale také prostaty. Srovnávali fosforylaãní status klíãov˘ch regulátorÛ mÛÏe b˘t dÛsledkem vazby multiproteinového komplexu, kte- bunûãné signalizace v ran˘ch epiteliálních lézích, prostatic- r˘ vzniká pouze v jednom z porovnávan˘ch vzorkÛ. Získané kém stromatu a extracelulární matrix. Popsali zmûny v akti- v˘sledky by proto mûly b˘t ovûfieny nezávislou metodou. Pfie- vaci drah pfii progresi normálního epitelu do invazivního kar- sto do dne‰ka jiÏ mnoho v˘zkumn˘ch skupin prokázalo obec- cinomu a také rozdíly mezi pacienty. nou vyuÏitelnost tohoto pfiístupu a proteinové ãipy byly pouÏi- Nev˘hodou RPA pfiístupu je pomûrnû nízká koncentrace stu- ty i v mnoha pracích zamûfien˘ch na onkologick˘ v˘zkum. dovan˘ch proteinÛ (napfi. kináz nebo jin˘ch signálních mole- Sreekumar se sv˘mi spolupracovníky (10) pouÏili ãipy se 146 kul) v mikrospotu. ¤e‰ením pro zv˘‰ení citlivosti detekce je rÛzn˘mi protilátkami ke sledování zmûn proteinov˘ch hladin pre-frakcionace. Toho bylo vyuÏito pfii studiu autoreaktivity u bunûk karcinomu tlustého stfieva po léãbû ionizujícím záfie- protilátek v séru pacientÛ proti nádorov˘m proteinÛm. Lyzáty ním a potvrdili radiací indukované zv˘‰ení exprese u nûkolika bunûãn˘ch linií adenokarcinomu tlustého stfieva byly rozdûle- regulátorÛ apoptózy. Pro srovnání exprese proteinÛ u maligní ny pomocí dvourozmûrné kapalinové chromatografie a teprve a sousedící normální tkánû u pacientek s primárním nádorem jednotlivé frakce byly spotovány. âipy byly inkubovány se prsu bylo pouÏito protilátkového ãipu s 378 protilátkami a bylo sérem novû diagnostikovan˘ch pacientÛ s karcinomem tlusté- nalezeno nûkolik proteinÛ, jejichÏ zmûnûná exprese obû tkánû ho stfieva, plic a zdrav˘ch kontrol. Mezi tûmito skupinami byly odli‰ovala (11). Podobnû byly studovány sérové proteiny u paci- prokázány rozdíly v autoreaktivitû (24). V˘hodou této metodi- entÛ s nádory moãového mûch˘fie a zdrav˘ch kontrol (12). Pro- ky je moÏnost dal‰í anal˘zy a pfiípadné identifikace reaktivních tilátkové ãipy byly také vyuÏity pro anal˘zu exprese CD anti- autoantigenÛ s vyuÏitím hmotnostní spektrometrie. genÛ u rÛzn˘ch leukemick˘ch bunûk. âip s naspotovan˘mi anti-CD protilátkami byl inkubován pfiímo s bunûãnou suspen- Dal‰í formáty expresních proteinov˘ch ãipÛ zí a byly takto odli‰eny normální leukocyty periferní krve abuÀ- ky rÛzn˘ch leukémií: chronická lymfatická leukémie, vlasato- SELDI bunûãná leukémie, akutní myeloidní leukémie, T-bunûãná Alternativním pfiístupem zaloÏen˘m na nespecifick˘ch inter- akutní lymfoblastická leukémie a lymfom bunûk plá‰Èové zóny. akcích je technologie SELDI (surface enhanced laser desorp- V˘hodou tohoto pfiístupu je, Ïe nevyÏaduje barvení, navázané tion and ionisation). Spoãívá v inkubaci bunûãn˘ch extraktÛ buÀky jsou detekovány mikroskopicky a navíc mohou b˘t dále na makrospotech adsorpãního povrchu s rÛznou povrchovou charakterizovány rÛzn˘mi fluorescenãnû znaãen˘mi protilát- úpravou (hydrofobní, hydrofilní, kation/anion v˘mûnné a dal- kami (13,14,15). Tento typ ãipÛ, kdy se pouÏívají pfiímo Ïivé ‰í). Nespecificky navázané proteiny jsou potom analyzovány buÀky se nûkdy oznaãuje také jako bunûãné ãipy (viz níÏe). pomocí hmotnostní spektrometrie (25). Tato metodika má sice Pro zv˘‰ení citlivosti detekce se pouÏívá sendviãové techno- niÏ‰í citlivost, ale je velmi vhodná pro rychlé vyhledávání logie. Tento pfiístup byl napfiíklad vyuÏit pro kvantifikaci 150 neznám˘ch proteinov˘ch biomarkerÛ. rÛzn˘ch cytokinÛ a ostatních sloÏek séra a u více neÏ poloviny takto analyzovan˘ch proteinÛ se podafiilo dosáhnout citli- Bunûãné ãipy vosti fiádovû v pg/ml (16). Huang a spolupracovníci zase dete- V souãasné dobû byly ãipové technologie roz‰ífieny i na celé kovali zmûny v expresi cytokinÛ v lidsk˘ch glioblastomov˘ch buÀky. Bunûãné ãipy mohou b˘t také ve formátu pfiímém nebo buÀkách po léãbû tumor nekrotick˘m faktorem alfa (TNFα) zpûtném. Pfiíkladem pfiímého pfiístupu je napfi. ãip pro detekci (17). K detekci men‰ího poãtu komponent, napfi. v séru paci- CD antigenÛ na Ïiv˘ch buÀkách - viz v˘‰e (13, 14, 15). Pfii zpût- entÛ, je vhodné vyuÏití sendviãové technologie v kombinaci ném pfiístupu se napfi. vyuÏívá rÛstu bunûk pfiímo na povrchu s mikrosférami. Byly jiÏ vyuÏity pro detekci cytokinÛ, proti- ãipu s naspotovan˘mi rÛzn˘mi cDNA, buÀky jsou schopny látek, metabolick˘ch markerÛ, kináz, ale i ‰irokého spektra bûhem rÛstu pfiijmout tuto DNA a dostaneme potom ãip se spo- patogenÛ vãetnû virÛ, toxinÛ a bakteriálních spor (7, 18, 19, ty bunûk exprimujících rÛzné cizorodé proteiny, jejichÏ vlast- 20). V souãasné dobû jsou jiÏ komerãnû dostupné sady aÏ sta nosti mohou b˘t studovány pfiímo v bunûãném kontextu (26). rozdílnû barevnû znaãen˘ch mikrosfér a pfii jejich pouÏití se dosahuje podobné spolehlivosti, citlivosti a pfiesnosti jako pfii TkáÀové ãipy vyuÏití standardní ELISA techniky. Na ãipu mohou b˘t také imobilizovány pfiímo vzorky tkání, napfi. bioptick˘ch. V˘hodou je moÏnost paralelního screenin- Antigen ãipy (RPA) gu velkého mnoÏství tkáÀov˘ch vzorkÛ standardními analy- Jin˘m typem proteinov˘ch ãipÛ jsou tzv. reverse-phase arrays tick˘mi metodami jako imunohistochemie nebo fluorescenã- (RPA), ãili antigen ãipy, kdy jsou na ãip imobilizovány pfiímo ní in situ hybridizace souãasnû (27).

348 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 soru p53. Protein p53 je mutován asi u poloviny maligních onemocnûní a rÛzné mutace mohou mít na nádorové buÀky rÛzn˘ vliv. JelikoÏ je p53 transkripãní faktor, je tento ãip vhodn˘ zejména pro studium vlivu mutací na vazbu k DNA, ale také k jin˘m proteinÛm, které ovlivÀují jeho aktivitu (30). K pochopení protein-proteinov˘ch interakcí v signalizaã- ních procesech pfiispívají data získaná pomocí doménov˘ch ãipÛ s naspotovan˘mi rÛzn˘mi proteinov˘mi doménami (31, 32). Pomocí ãipÛ lze také stanovovat enzymatickou aktivitu proteinÛ. Klíãov˘mi molekulami v bunûãn˘ch procesech jsou kinázy, které fosforylují proteiny signálních drah a ovlivÀují tak jejich funkci. Zmûny v jejich aktivitû jsou tedy ãasto pfiíãinou nádorového bujení. Pro urãení fosfory- laãní aktivity rÛzn˘ch kináz a také stanovení vlivu jejich inhibitorÛ bylo vyuÏito peptidov˘ch ãipÛ (33). âipy s naspotovan˘mi mal˘mi molekulami byly navrÏeny pro identifikaci inhibitorÛ kaspáz, které hrají zásadní úlohu v procesech spou‰tûní apoptózy (34, 35). Takovéto ãipy s mal˘mi organick˘mi molekulami („chemické knihovny“) jsou vhodné pro sledování interakcí ligand-receptor, coÏ má pfiínos pro vyhledávání vhodn˘ch lékÛ interagujících se specifick˘mi proteiny. V souãasnosti je terapie vût‰inou zamûfiena na jed- notlivé molekuly, ov‰em vysokokapacitní proteomické techniky umoÏÀují nalezení nov˘ch terapeutick˘ch cílÛ. A tak v budoucnosti bude moÏné zamûfiit terapii proti více cílÛm naru‰ené signální dráhy souãasnû. Pomocí takovéto kombi- nované terapie lze potenciálnû dosáhnout vy‰‰í úãinnosti za souãasného sníÏení toxicity léãby (36). Obr. 2 Expresní protilátkové ãipy - princip dvoubarevného znaãení proteinÛ - Ze studovaného vzorku a pfiíslu‰né kontroly jsou vyizolovány Závûry a budoucnost proteinov˘ch ãipÛ proteiny, ty jsou nabarveny dvûma rozdíln˘mi barviãkami (flourofory), Hlavní v˘hody proteinov˘ch ãipÛ spoãívají v moÏnosti testo- smíchány ve stejném pomûru a inkubovány na jednom ãipu. Pomocí dvou- barevné detekce jsou identifikovány pfiímo rozdíly v proteinové expresi vání tisícÛ proteinÛ souãasnû a také v nenároãnosti na mnoÏ- mezi vzorkem a kontrolou. ství materiálu, coÏ má v˘znam zejména tam, kde je k dispozici jen mal˘ objem vzorku, napfi. pfii vyhledávání více âipy pro funkãní studie nádorov˘ch markerÛ v minimálním mnoÏství bioptického Proteinové ãipy jsou v poslední dobû vyuÏívány také pro stu- materiálu. Navíc kromû identifikace a kvantifikace studova- dium funkce proteinÛ, a to prostfiednictvím jejich interakce n˘ch proteinÛ umoÏÀuje i jejich funkãní anal˘zu. Proto tato s jin˘mi molekulami. Funkãní ãipy jiÏ byly pouÏity pro stu- technologie najde v budoucnosti vyuÏití nejen v základním dium interakcí s jin˘mi proteiny, DNA, RNA, oligosachari- v˘zkumu, ale i v klinické proteomice. Nové proteomické pfií- dy, nízkomolekulárními látkami vãetnû terapeutik a také ke stupy se uplatní v individuální péãi o pacienta na nûkolika úrov- studiu enzymatické aktivity. Pro tyto aplikace je nezbytné ních: vãasná detekce choroby pomocí expresních proteinov˘ch uchovat proteiny ve funkãním stavu, ãili ve správné kon- profilÛ, diagnóza s vyuÏitím proteinov˘ch markerÛ jako doplÀ- formaci. V souãasné dobû jsou jiÏ dostupné technologie pro ku ke standardním vy‰etfiovacím metodám, individualizova- imobilizaci funkãních proteinÛ. Jedna z prvních ãipov˘ch n˘ v˘bûr léãby na míru jednotliv˘m pacientÛm, sledování úãin- funkãních anal˘z byla navrÏena pro studium kvasinkov˘ch nosti a toxicity léãby v ãase a eventuální zmûny v léãbû na proteinÛ, a to pro urãení substrátové specifity kvasinkov˘ch základû detekovan˘ch zmûn v proteinovém profilu konkrétní- kináz (28). Stejná v˘zkumná skupina také vytvofiila funkãní ho pacienta. V neposlední fiadû informace o proteinech zapo- ãip, obsahující témûfi cel˘ proteom kvasinky (5800 protei- jen˘ch do patogeneze nemoci poskytnou potenciál k nalezení nÛ) a testovala na nûm interakce s kalmodulinem a také s fos- nov˘ch terapeutick˘ch cílÛ. folipidy (29). Funkãní ãipy byly také jiÏ vyuÏity pfii studiu fiady lidsk˘ch proteinÛ. Boutell a spolupracovníci pfiedsta- Podûkování: Tato práce je podporována granty IGA MZâR vili ãip s naspotovan˘mi 50 variantami nádorového supre- 8448-3/2005, M·MT 1K04017, NF Elpida Nukleus

Literatura 6. Poetz O, Schwenk JM, Kramer S, et al. Protein microarrays: catching the 1. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell. 2000 proteome. Mech Ageing Dev.2005 Jan;126(1):161-70. Jan;100(1):57-70. 7. Bellisario R, Colinas RJ, Pass KA. Simultaneous measurement of antibo- 2. Liotta LA, Kohn EC. The microenvironment of the tumour-host interface. dies to three HIV-1 antigens in newborn dried blood-spot specimens using Nature. 2001 May 17;411(6835):375-9. a multiplexed microsphere-based immunoassay. Early Hum Dev. 2001 3. Anderson L, Seilhamer J. A comparison of selected mRNA and prote- Aug;64(1):21-5. in abundances in human liver. Electrophoresis. 1997 Mar-Apr;18 8. Ekins RP. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. (3-4):533-7. 1989;7(2):155-68. 4. Le Naour F, Hohenkirk L, Grolleau A, et al. 2001. Profiling changes in gene 9. Haab BB, Dunham MJ, Brown PO. Protein microarrays for highly paral- expression during differentiation and maturation of monocyte-derived dend- lel detection and quantitation of specific proteins and antibodies in com- ritic cells using both oligonucleotide microarrays and proteomics. J. Biol. plex solutions. Genome Biol. 2001;2(2):RESEARCH0004. Chem. 276:17920-17931. 10. Sreekumar A, Nyati MK, Varambally S, et al. Profiling of cancer cells using 5. Zhu H, Snyder M. Protein chip technology.Curr Opin Chem Biol. 2003 protein microarrays: discovery of novel radiation-regulated proteins Can- Feb;7(1):55-63. cer Res. 2001 Oct 15;61(20):7585-93

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 349 11. Hudelist G, Pacher-Zavisin M, Singer CF, et al. Use of high-throughput 23. Grubb RL, Calvert VS, Wulkuhle JD, et al. Signal pathway profiling of protein array for profiling of differentially expressed proteins in normal and prostate cancer using reverse phase protein arrays. Proteomics. 2003 malignant breast tissue. Breast Cancer Res Treat. 2004 Aug;86(3):281-91. Nov;3(11):2142-6. 12. Sanchez-Carbayo M, Socci ND, Lozano JJ, Haab BB, Cordon-Cardo C.Pro- 24. Nam MJ, Madoz-Gurpide J, Wang H, et al. Molecular profiling of the immu- filing bladder cancer using targeted antibody arrays. Am J Pathol. 2006 ne response in colon cancer using protein microarrays: occurrence of auto- Jan;168(1):93-103. antibodies to ubiquitin C-terminal hydrolase L3. Proteomics. 2003 13. Belov L, de la Vega O, dos Remedios CG, et al. Immunophenotyping of Nov;3(11):2108-15. leukemias using a cluster of differentiation antibody microarray. Cancer 25. Davies H, Lomas L, Austen B. Profiling of amyloid beta peptide variants Res. 2001 Jun 1;61(11):4483-9. using SELDI Protein Chip arrays. Biotechniques. 1999 Dec;27(6):1258-61. 14. Belov L, Huang P, Barber N, et al. Identification of repertoires of surface 26. Ziauddin J, Sabatini DM. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 2003 Nature. 2001 May 3;411(6833):107-10. Nov;3(11):2147-54 27. Kallioniemi OP, Wagner U, Kononen J, Sauter G. Tissue microarray tech- 15. Belov L, Huang P, Chrisp JS, et al. Screening microarrays of novel monoc- nology for high-throughput molecular profiling of cancer. Hum Mol Genet. lonal antibodies for binding to T-, B- and myeloid leukaemia cells. J Immu- 2001 Apr;10(7):657-62. nol Methods. 2005 Oct 20;305(1):10-9. 28. Zhu H, Klemic JF, Chang S, et al. Analysis of yeast protein kinases using 16. Shao W, Zhou Z, Laroche I, et al. Optimization of Rolling-Circle Ampli- protein chips. Nat Genet. 2000 Nov;26(3):283-9. fied Protein Microarrays for Multiplexed Protein Profiling.J Biomed Bio- 29. Zhu H, Bilgin M, Bangham R, et al. Global analysis of protein activities technol. 2003 (5):299-307 using proteome chips. Science 2001 293(5537):2101-5 17. Huang RP, Huang R, Fan Y, Lin Y. Simultaneous detection of multiple 30. Boutell JM, Hart DJ, Godber BL, et al. Functional protein microarrays for cytokines from conditioned media and patient’s sera by an antibody-based parallel characterisation of p53 mutants. Proteomics. 2004 4(7):1950-8. protein array system. Anal Biochem. 2001 Jul 1;294(1):55-62. 31. Liu MY, Cai S, Espejo A, et al. 14-3-3 interacts with the tumor suppressor 18. Chen R, Lowe L, Wilson JD, et al. Simultaneous Quantification of Six tuberin at Akt phosphorylation site(s). Cancer Res. 2002 Nov 15;62 Human Cytokines in a Single Sample Using Microparticle-based Flow (22):6475-80. Cytometric Technology. Clin Chem. 1999 Sep;45(9):1693-1694. 32. Newman JR, Keating AE. Comprehensive identification of human bZIP inter- 19. McBride MT, Gammon S, Pitesky M, et al. Multiplexed liquid arrays for actions with coiled-coil arrays. Science. 2003 Jun 27;300(5628):2097-101. simultaneous detection of simulants of biological warfare agents. Anal 33. Houseman BT, Huh JH, Kron SJ, Mrksich M. Peptide chips for the quan- Chem. 2003 Apr 15;75(8):1924-30. titative evaluation of protein kinase activity. Nat Biotechnol. 2002 20. McBride MT, Masquelier D, Hindson BJ, et al., Autonomous detection of 20(3):270-4. aerosolized Bacillus anthracis and Yersinia pestis. Anal Chem. 2003 Oct 34. Gosalia DN, Diamond SL. Printing chemical libraries on microarrays for 15;75(20):5293-9. fluid phase nanoliter reactions. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jul 21. Nishizuka S, Chen ST, Gwadry FG, et al. Diagnostic markers that distin- 22;100(15):8721-6. guish colon and ovarian adenocarcinomas: identification by genomic, 35. Winssinger N, Ficarro S, Schultz PG, Harris JL. Profiling protein function proteomic, and tissue array profiling. Cancer Res. 2003 Sep 1;63 with small molecule microarrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug (17):5243-50. 20;99(17):11139-44. 22. Nishizuka S, Charboneau L, Young L, et al. Proteomic profiling of the NCI- 36. Normanno N, Campiglio M, De LA, et al. Cooperative inhibitory effect of 60 cancer cell lines using new high-density reverse-phase lysate microar- ZD1839 (Iressa) in combination with trastuzumab (Herceptin) on human rays. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Nov 25;100(24):14229-34. breast cancer cell growth. Ann Oncol. 2002 Jan;13(1):65-72.

ODBùR A ZPRACOVÁNÍ VZORKÒ PRO EXPRESNÍ DNA âIPY SAMPLE TAKING AND PROCESSING FOR EXPRESSION DNA MICROARRAYS TICH¯ B.1, SVOBODA M.2, MAYER J.1 A POSPÍ·ILOVÁ ·.1

1 CENTRUM MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE A GENOVÉ TERAPIE, INTERNÍ HEMATOONKOLOGICKÁ KLINIKA, FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO 2 LABORATO¤ PREDIKTIVNÍ ONKOLOGIE, ODD. KLINICKÉ A EXPERIMENTÁLNÍ PATOLOGIE, MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV V BRNù

Souhrn Moderní metodiky studia genové exprese na úrovni RNA vyuÏívající DNA ãipy (DNA microarrays) pﬁedstavují úãinn˘ nástroj nejen pro v˘zkum onkologick˘ch onemocnûní, ale mají i velk˘ potenciál stát se základem nov˘ch diagnostick˘ch postupÛ. Jejich úspû‰ná aplikace v‰ak vyÏaduje zvládnutí problematick˘ch postupÛ jako jsou odbûr vzorku, izolace RNA nebo znaãení nukleov˘ch kyselin. S ohledem na mnoÏství rÛzn˘ch DNA ãipov˘ch platforem, neexistuje jeden univerzální návod, kter˘ by mohl b˘t pouÏit ve v‰ech laboratoﬁích. Protokoly zpracování DNA ãipÛ se proto, nûkdy velmi v˘raznû li‰í, coÏ má negativní dopad i na moÏnost jejich diagnostického vyuÏití.

Klíãová slova: RNA, DNA ãip, biopsie, genová exprese

Summary Gene expression profiling using DNA microarrays represents not only a powerfull tool for oncological research but have also a big potential to become a standard diagnostic technique. However, successfull microarray application needs to overcome some pitfalls such as sample collection, RNA isolation or nucleic acid labeling. Due to the number of microarray platforms there is no universal guide that can be used by all laboratories. The number of sometimes very different protocols for DNA microarray processing has a negative impact on their diagnostic utilization.

Keywords: RNA, microarray, biopsy, gene expression

350 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Úvod Ïívají se napfi. pfii vy‰etfiování rektálních nádorÛ. Uvedené Rychl˘ rozvoj molekulárnû-biologick˘ch technik v posledních mnoÏství tkánû vût‰inou umoÏní pfiípravu 5 – 50 μg celko- letech s sebou pfiiná‰í zcela nové poÏadavky i na klinické léka- vé RNA, coÏ je dostateãné pro aplikace DNA ãipÛ. fie, chirurgy a patology. Odebíran˘ biologick˘ materiál by mûl 3. Operaãní excize. Lze jimi odebrat vût‰inou dostateãné b˘t pouÏiteln˘ i pro ta nejnároãnûj‰í vy‰etfiení, mezi nûÏ patfií mnoÏství nádorové tkánû pro DNA ãipy. i sledování genové exprese pomocí DNA ãipÛ. Pro tyto anal˘zy 4. Tenkojehelné aspiraãní biopsie. Ty pfiedstavují nejmen‰í je nutné získat co nejvût‰í mnoÏství velmi kvalitní RNA, tzn. co zátûÏ pro pacienta, mnoÏství takto získané tkánû a tedy nejvût‰í, ale zároveÀ reprezentativní vzorek nádorové tkánû, krve i RNA je ale velmi malé, zároveÀ mÛÏe b˘t negativnû ovliv- nebo kostní dfienû. Asi nejvût‰ími problémy, na kter˘ch mÛÏe nûna reprezentativnost vzorku . cel˘ ãipov˘ experiment ztroskotat, jsou nutnost rychlého odbû- Ve v‰ech pfiípadech probíhají odbûry za informovaného sou- ru a „kontaminace“ vzorku „normálními“ buÀkami. Ani úspû‰- hlasu pacienta a jsou indikovány o‰etfiujícími onkology aÏ po né zvládnutí procesu odbûru vzorku a izolace RNA nevede auto- konkrétní domluvû s patologem, tak aby odbûrem nebyla dotãe- maticky ke zdaru celého experimentu. Vzorek RNA je‰tû pfied na moÏnost patologického zhodnocení nádoru. Nûkdy není hybridizací prochází sérií úprav, pfii kter˘ch je naznaãen (napfi. moÏné z dÛvodÛ priority patologického vy‰etfiení provést nativ- fluorescenãní barvou) pfiípadnû i amplifikován. Tyto kroky stej- ní biopsii pro experimentální úãely. V takovém pfiípadû je moÏ- nû jako hybridizace vût‰inou vyÏadují ãasovû i finanãnû nároã- né pouÏít patologem jiÏ zhodnocené parafinové fiezy tkání. To nou optimalizaci protokolÛ a jakákoli, byÈ na první pohled nepa- ov‰em znamená nejenom mal˘ v˘tûÏek RNA a obvyklou nut- trná zmûna postupu, mÛÏe v˘znamnû ovlivnit jejich v˘sledek. nost amplifikace RNA, ale i rozpad RNA na men‰í fragmenty a nutnost pouÏít speciální metody jak pfii izolaci RNA, tak Odbûr vzorkÛ pfii následném zpracování materiálu. ProtoÏe tkáÀ je v parafi- Jde o jedno z kritick˘ch míst, které vût‰inou vyÏaduje tûsnou nov˘ch fiezech obvykle fixována formaldehydem, kter˘ mety- spolupráci nûkolika pracovi‰È (laboratofi, chirurgie, ambulan- luje DNA, nejsou rutinní parafinové fiezy vhodné ke sledová- ce, patologie ad.). Technická nároãnost je závislá na druhu ode- ní metylaãního statusu DNA. Existují v‰ak i speciální bíraného vzorku. histologická fixativa, která nemetylují DNA. S tûmito fixati- vy lze parafinové fiezy pouÏít i pro sledování metylaãních pro- a) Odbûry krve a kostní dfienû. filÛ DNA. Pro úãely sledování profilÛ genové exprese staãí obvykle 2- 10ml nesráÏlivé citrátové nebo K3EDTA krve nebo 1-5ml Stabilita RNA obdobnû o‰etfiené kostní dfienû. V nemocnicích jsou bûÏnû Odbûr materiálu pro izolaci RNA je vzhledem k degradabili- dostupné odbûrové nádobky pÛvodnû urãené pro stanovení tû RNA pomûrnû nároãn˘. Samotná RNA je stabilní, ale je vel- krevního obrazu. Nesmûjí se v‰ak pouÏít zkumavky s hepari- mi rychle degradována v‰udypfiítomn˘mi enzymy ribonukle- nem, kter˘ interferuje s PCR. BuÀky si zachovávají Ïivotnost ázami (RNAsami). Ty pochází jak z bunûk, ze kter˘ch je RNA dlouhou dobu po odbûru a k zaznamenatelné degradaci nedo- izolována, tak i z prostfiedí tj. z kontaminujících mikroorga- chází ani nûkolik hodin po aspiraci pfii ponechání vzorkÛ pfii nismÛ - bakterií. Pomineme – li bakteriální kontaminaci, ved- pokojové teplotû. Otázkou je zmûna exprese genÛ v buÀkách le RNA je fyziologickou souãástí buÀky celá fiada rÛzn˘ch ribo- ponechan˘ch del‰í dobu mimo organismus. V˘hodou krve jako nukleáz, které RNA degradují. Tyto ribonukleázy jsou souãástí zdrojového materiálu je i celkem snadná separace hlavních sloÏit˘ch bunûãn˘ch regulaãních mechanismÛ. Nane‰tûstí jsou typÛ jadern˘ch bunûk – granulocytÛ a mononukleárÛ na den- jednotlivé RNA degradovány nestejnû rychle díky pfiítomnos- zitních gradientech. Takto oddûlené bunûãné populace mohou ti AU- sekvencí v nûkter˘ch genech [1]. Je známo, Ïe RNA b˘t pouÏity jako v˘chozí materiál pro získání raritních subpo- pro nûkteré geny (cykliny) mají poloãas rozpadu v rozmezí pulací jako jsou napfi. leukemické (v prÛbûhu léãby) nebo minut, zatímco nûkteré housekeepingové geny mají poloãas hematopoetické prekurzorové buÀky pomocí fluorescence acti- nûkolik hodin. Po vyjmutí bunûk z tûla se rovnováÏné hladiny vated (FACS) nebo magnetic cell sortingu (MACS). Mimo to jednotliv˘ch RNA poru‰í a „rovnováÏn˘ expresní profil“ dané jsou komerãnû dostupné sady pro odbûr krve na izolaci RNA tkánû se zaãíná mûnit v jak˘si arteficielní produkt, kter˘ se tím pouÏívající princip chemické stabilizace. Jejich zásadní nev˘- více li‰í od pÛvodního stavu, ãím déle trvá, neÏ se degradace hodou je nemoÏnost následné separace krevních bunûk a samo- RNA zastaví. Vliv na genovou expresi mají i dal‰í faktory, zfiejmû vy‰‰í cena. napfi. hypoxie zapfiíãinûná podvázáním cév zásobujících rese- kovan˘ tumor, která mÛÏe vést ke zmûnû exprese celé fiady b) Odbûry bronchoalveolární laváÏe (BAL). genÛ [2]. ProtoÏe v klinické praxi je témûfi nemoÏné zajistit BAL se vyznaãují pomûrnû mal˘m v˘tûÏkem RNA (cca do uplynutí stejné doby od okamÏiku odbûru vzorku po jeho zpra- 1μg) vzhledem k omezenému poãtu bunûk. Navíc první 2 frak- cování, promítají se rozdílné doby odbûru do expresních pro- ce obsahují vedle bunûk leukocytární fiady pomûrnû hodnû epi- filÛ DNA ãipÛ a jsou zfiejmû jednou z pfiíãin známé variabili- telov˘ch bunûk (aÏ desítky procent). BuÀky leukocytární fiady ty experimentálních v˘sledkÛ DNA ãipÛ pocházejících od jsou v‰ak zajímavé z hlediska exprese NOS a markerÛ spoje- rÛzn˘ch v˘zkumn˘ch skupin [3]. n˘ch s alergick˘mi reakcemi. Pro tyto úãely se proto odebírá Pfiedpokladem úspû‰ného odbûru je tedy kromû sterility i co aÏ tfietí frakce, která obsahuje pfieváÏnû leukocytární fiadu. nejrychlej‰í stabilizace vzorku - inhibice ribonukleáz. Jednou c) Odbûry biopsií solidních nádorÛ. z moÏností je pouÏití chladu, kdy je vzorek tkánû velmi rych- Existuje nûkolik bûÏn˘ch typÛ biopsií: le zmraÏen - vhodn˘m zpÛsobem je ponofiení do tekutého dusí- 1. Jehlové biopsie. Jejich v˘hodou je malá zátûÏ pacienta. ku. Druhou moÏností je chemická inaktivace RNAs [4]. Pro K tomuto úãelu se pouÏívají speciální tzv. tru-cut jehly, kte- tento úãel jsou urãeny speciální stabilizaãní roztoky (napfi. ré z cílové tkánû vyfiíznou váleãek tlou‰Èky do 1mm a dél- RNAlater®). Ty pfiiná‰ejí nesporné v˘hody zjednodu‰ením ky cca do 10 - 15mm. PouÏívají se napfi. pfii vy‰etfiování manipulace s materiálem, kdy zpÛsob odbûru se pfiíli‰ neli‰í metastáz nádorÛ v játrech. Toto mnoÏství nemusí nûkdy sta- od odbûru napfi. pro histologické vy‰etfiení, jsou v‰ak podstat- ãit pro pfiípravu dostateãného mnoÏství celkové RNA a je nû finaãnû nákladnûj‰í a pro správn˘ prÛbûh fixace je nutné pak nutno pouÏívat amplifikaci RNA. pouÏít vzorek takové velikosti, aby mohl b˘t roztokem dosta- 2. Malé excize pomocí speciálních bioptick˘ch kle‰tí a fibro- teãnû rychle prosycen. Obû metody tedy vyÏadují co nejrych- skopÛ. Lze jimi odebrat aÏ nûkolik mm cílové tkánû. Pou- lej‰í zpracování tkánû po vyjmutí z organismu, nejlépe pfiímo

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 351 v odbûrové místnosti nebo na operaãním sále. Za pfiijatelnou v˘ch linií je to kolonková metoda, pfii izolaci z pevn˘ch tkání dobu mezi odbûrem vzorku a jeho stabilizací se povaÏuje max. dosahujeme v na‰ich podmínkách lep‰ích v˘sledkÛ kombina- 15 minut, vût‰ina studií pouÏívá 10 min. interval [5]. Nutnost cí obou v˘‰e popsan˘ch metod - po úvodní l˘ze vzorku v Tri- rychlé stabilizace komplikuje kontrolu vhodnosti vzorku, pro- zolu® a separaci fází pokraãujeme kolonkovou metodou, kte- toÏe vyÏaduje pfiítomnost kvalifikované osoby (patologa) pro rá zahrnuje i o‰etfiení vzorku DNAsou. iniciální makroskopické posouzení bioptátu a jeho rozdûlení Pfii izolací z pevn˘ch tkání je nutné pouÏít mechanickou homo- na velikostnû vhodné ãásti. Na na‰em pracovi‰ti (Centrum genizaci tkánû. Jednou z moÏn˘ch metod je rozdrcení hlubo- molekulární biologie a genové terapie, Interní hemato-onko- ce zmrazené tkánû v tekutém dusíku a následná l˘za. V labo- logická klinika, FN Brno – CMBGT) se osvûdãil zpÛsob odbû- ratofii CMBGT dáváme pfiednost rotor-stator homogenizátoru, ru, pfii kterém je vzorek ihned po resekci zchlazen a transpor- kdy je tkáÀ souãasnû homogenizována i lyzována v Trizolu. tován na ledu k patologovi, kter˘ jej rozdûlí na ãásti pro Tyto homogenizaãní techniky s sebou nesou riziko kfiíÏové histologické a molekulárnû-biologické vy‰etfiení. Potom je kontaminace vzorkÛ, je tedy nutné dÛkladnû oãistit v‰echny zmraÏen v tekutém dusíku a dále skladován pfii -80°C. Takto opakovanû pouÏíváné nástroje. uskladnûn˘ vzorek je pouÏit aÏ po histologickém vy‰etfiení ãás- V˘‰e uvedené metody pfiedstavují ty nejãastûji pouÏívané, je ti oddûlené patologem, pokud vyhoví poÏadovan˘m kriteriím dostupná fiada dal‰ích jak pro izolaci totální, tak i mediátorové zastoupení patologick˘ch bunûk. Pfii tomto zpÛsobu nedochá- RNA ve variantách pro manuální i plnû automatizované zpraco- zí k v˘raznûj‰í degradaci RNA (posuzováno na pfiístroji Bio- vání. Stále vût‰í roz‰ífiení získávají metody magnetické separa- Analyzer 2100, obr. 1) a odpadá manipulace s tekut˘m dusí- ce, kdy je RNA navázána na povrch magnetick˘ch ãástic, které kem na operaãním sále. Je tak moÏno odebírat i vût‰í vzorky jsou pfii prom˘vání ve zkumavce fixovány magnetem. Samo- tkánû, které nemohou b˘t vzhledem k jejich velikost stabili- zfiejmostí je pouÏití „RNAse Free“ jednorázového plastiku zovány chemicky. a dekontaminace pracovního prostoru pfii ve‰keré práci s RNA.

Kontrola kvality RNA Základní podmínkou úspû‰ného ãipového experimentu je, kro- mû vhodného designu, kvalita vstupního materiálu. Vzhledem k tomu, Ïe vût‰ina technik pracuje s reverzní transkripcí inicio- vanou z polyA(3’) konce mRNA je nutné zachovat co nejvût‰í procento transkriptÛ v jejich plné délce. Existují a dále jsou inten- zivnû rozvíjeny metody, které pouÏívají k iniciaci transkripce náhodné krátké nukleotidy (hexamery, oktamery). Ty nacháze- jí své uplatnûní pfiedev‰ím v aplikacích vyuÏívajících degrado- vanou RNA získanou napfi. izolací z parafinov˘ch bloãkÛ (FFPE - Formalin Fixed Parafin Embeded). Problém stability RNA si dobfie uvûdomují i v˘robci oligonukleotidov˘ch DNA ãipÛ, kte- fií se snaÏí sníÏit ovlivnûní v˘sledkÛ DNA ãipÛ pfiizpÛsobením algoritmÛ pro návrh sond tak, Ïe jsou preferovány sondy leÏící v sekvenci mRNA blízko k polyA(3’) konci – obvykle do vzdá- lenosti 1000 bazí. Pfies toto ulehãení je v‰ak kvalita vstupní RNA jedním z nejkritiãtûj‰ích bodÛ celého procesu pfiípravy DNA ãipÛ. Kontrola kvality RNA by tedy mûla b˘t nepostradatelnou sou- Obrázek 1.: Porovnání vlivu odbûru na stabilitu RNA. a) RNA izolova- ãástí v‰ech protokolÛ. Posouzení kvality RNA v‰ak není jedno- ná z bunûãné linie (1,8/10,0); b) RNA izolovaná z bunûãné linie (1,8/9,9); c) RNA izolovaná ze solidní tkánû uloÏené po odbûru 10min na ledu duché a neexistuje pro nûj spolehlivá metoda. Nejzákladnûj‰í (2,1/9,9); d) RNA izolovaná ze solidní tkánû uloÏené po odbûru 20min na a nejménû informativní je spektrofotometrické stanovení kon- ledu (2,2/9,7); e) RNA izolovaná ze solidní tkánû uloÏené po odbûru 10min centrace a ãistoty. Základními hodnotami jsou v tomto pfiípadû pfii pokojové teplotû (1,3/7,2); f) RNA izolovaná ze solidní tkánû uloÏené absorbance vzorku pfii 260 nm a pfii 280 nm. Vlnové délce 260 po odbûru 20min pfii pokojové teplotû (1,0/6,9); g) Degradovaná RNA (- nm odpovídá absorbanãní maximum nukleov˘ch kyselin, pomûr /2,6); h) Degradovaná RNA (-/2,4); v závorce: 28S:18S rRNA/RIN („RNA integrity number“) Gel-like v˘stup pfiístroje BioAnalyzer 2100 absorbancí pfii 260 a 280 nm vypovídá o kontaminaci RNA, pfiedev‰ím proteiny. Obecnû doporuãovan˘m rozmezím A260/A280 Izolace RNA je 1,9 – 2,1. Spektrofotometrické mûfiení ale není schopno vypo- V praxi je pouÏíváno nûkolik rozdíln˘ch technologií pro izola- vûdût nic o integritû vzorku, i naprosto degradovaná RNA mÛÏe ci RNA. Nejrychlej‰í je izolace na kolonkách (pevné fázi), kdy mít vysokou koncentraci a pomûr A260/A280 vy‰‰í neÏ 2 (obr. po uvolnûní z bunûk je RNA navázána na povrch filtru, neÏá- 2). Integrita je nejãastûji posuzována pomocí vzájemného pomû- doucí komponenty jsou vymyty a ãistá RNA je následnû z filtru prouÏkÛ 28S rRNA a 18S rRNA získan˘ch pfii denaturující ru eluována. Tato metoda dosahuje velmi dobr˘ch parametrÛ gelové elektroforéze. 28S a 18S rRNA jsou zvlá‰tními typy RNA, ãistoty a oproti následující vyniká jednoduchostí a rychlostí. které nekódují informaci o primární struktufie proteinÛ, ale jsou Dal‰í ãasto pouÏívanou metodou je izolace zaloÏená na pouÏi- stavební souãástí ribosomÛ. Pfii bûÏné izolaci RNA pfiedstavují tí smûsí fenolu a chaotropních solí [6]. Vzorek je nejprve lyzo- tyto dvû frakce vût‰inu získané celkové RNA (asi 85 %), kdeÏ- ván ve smûsi guanidinium thiokyanátu a fenolu (Trizol® ad.), to mRNA kódující proteiny, v závislosti na typu bunûk, 2-10 %. po pfiidání chloroformu nebo bromchloropropanolu a centrifu- Tyto dva druhy RNA jsou stejnû citlivé k degradaci jako mRNA, gaci dochází k rozdûlení do nûkolika fází. V horní vodné fázi ãehoÏ se vyuÏívá pro odhad její integrity. V pfiípadû intaktní RNA je zachycena RNA, v mezivrstvû DNA a v dolní organické fázi b˘vá podíl 28S rRNA : 18S rRNA vût‰í neÏ 2 a postupující degra- proteiny. Celková (totální) RNA je z vodné fáze precipitována dací se sniÏuje. Tuto metodu lze pouÏít i pro rychlé posouzení isopropanolem. Postup je technicky i ãasovû podstatnû nároã- kvality vizuálním odhadem síly prouÏkÛ, pfiesnûj‰í je samozfiej- nûj‰í, není pfiíli‰ vhodn˘ pro izolaci z velmi mal˘ch vzorkÛ. mû vyuÏití specializovaného software urãeného pro anal˘zu gelÛ, Velkou v˘hodou je moÏnost souãasné izolace RNA, DNA ipro- kter˘ je schopen vyhodnotit pomûry obou prouÏkÛ objektivnûji. teinÛ a zachycení krat‰ích fragmentÛ RNA (men‰ích neÏ 200 Gelová elektroforeza dovoluje i posouzení kontaminace geno- bazí). Obû metody by mûly b˘t schopny odstranit genomovou movou DNA, která se v nedenaturujícím agarosovém gelu obje- DNA, pfiesto je vhodné RNA o‰etfiit enzymem DNAsou. Námi ví jako velmi pomalu migrující prouÏek (obr. 3). Kontaminace pouÏívaná metoda závisí na druhu biologického materiálu, ze DNA nejen zkresluje spektrofotometrické stanovení koncentra- kterého má b˘t RNA izolována. V pfiípadû leukocytÛ a tkáÀo- ce RNA, ale mÛÏe vést i k zavádûjícím v˘sledkÛm ãipové ana-

352 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 l˘zy, pokud dojde k pfiepisu a obarvení genomové DNA. Alter- [7]. Proto se nyní vûnuje velká pozornost v˘voji metodik, nativou gelové elektroforézy je pouÏití pfiístroje BioAnalyzer, které umoÏÀují ze získaného biologického materiálu separo- kter˘ kromû pomûru 28S a 18S rRNA pouÏívá pro hodnocení vat Ïádanou populaci bunûk. Minimem by mûla b˘t histolo- integrity i dal‰í regiony gelu. V˘sledkem anal˘zy je tak kromû gická/cytologická/flow-cytometrická kontrola vstupního pomûru 28S/18S i tzv. RIN (RNA Integrity Number), dávající vzorku. Pokud zastoupení cílové subpopulace dosahuje urãi- pfiesnûj‰í odhad intaktnosti vzorku. Posouzení kontaminace geno- tou mez, je moÏno postupovat dále bez pouÏití dal‰ích puri- movou DNA je v‰ak na tomto pfiístroji obtíÏné, vzhledem k vel- fikaãních technik. Není-li tato podmínka splnûna, mûl by b˘t mi krátkému ãasu, po kter˘ jsou jednotlivé vzorky analyzovány. cel˘ experiment pfiizpÛsoben a do jeho protokolu zahrnuta Dal‰í moÏností je zku‰ební PCR amplifikace vzorku. PouÏívá se purifikace vzorku. V pfiípadû vzorku krve/kostní dfienû se dá metodika RT-PCR (reverzní transkripce a následná PCR) s pou- s úspûchem pouÏít technik MACS nebo FACS, pfiípadnû Ïitím oligo-dT primeru pro reverzní transkripci. Pomocí PCR jejich kombinace. Nev˘hodou je samozfiejmû prodlouÏená jsou souãasnû amplifikovány dva úseky genu, jeden v blízkosti doba zpracování, vy‰‰í finanãní nároãnost a ztráta, nûkdy vel- 3’(polyA) konce, druh˘ v 5’ oblasti. Pomûr tûchto dvou ampli- mi podstatné ãásti vzorku. Pro pevné tkánû je moÏné vyuÏít konÛ je u intaktní RNA blízk˘ 1, s postupující degradací klesá FACS/MACS metody po pfiedchozím rozvolnûní bunûk zastoupení fragmentu z 5’ konce genu. Nûkteré oligonukleoti- (napfi. trypsinací nebo mechanickou homogenizací tkánû) dové ãipy mohou obsahovat podobnou kontrolu, kdy jsou na nich nebo mikrodisekãní metody. Perspektivní je vyuÏití LCM sondy navrÏené pro oba konce transkriptu az pomûru jejich inten- (Laser Capture Microdissection) v kombinaci s metodami pro zit lze zpûtnû odhadnout míru degradace vstupní RNA. zpracování FFPE vzorkÛ. To umoÏÀuje nejen histologické posouzení odebíraného vzorku a v˘bûr cílové subpopulace, ale zároveÀ pfiedstavuje metodick˘ postup pouÏiteln˘ pro ana- l˘zu vzorkÛ uloÏen˘ch v patologick˘ch archívech. VyuÏití separovan˘ch raritních populací bunûk nebo LCM vyÏaduje následné pouÏití amplifikaãních technik, protoÏe získané mnoÏství RNA je velmi malé a pro DNA ãipy nedo- stateãné. Typické poÏadované mnoÏství v pfiípadû stan- dardních metodik pouÏívajících pro hybridizaci znaãenou cDNA je 10 a více mikrogramÛ celkové RNA. Tato mnoÏ- ství jsou pfii izolaci z malého poãtu bunûk napfi. po LCM naprosto nereálná, úspûchem je získání stovek nanogramÛ. Amplifikaãních technik bylo a je vyvíjeno znaãné mnoÏství [8-12], nejpouÏívanûj‰í se stala „Eberwinova“ [8] a její vari- ace. Metoda spoãívá v reverzní transkripci s inkorporací promotoru pro RNA polymerázu, syntéze druhého fietûzce cDNA a in vitro transkripci dvoufietûzcové DNA do kom- plementární RNA. Mimo technik amplifikujících vzorek jsou dostupné metody pro amplifikaci signálu, napfi. 3DNA Obrázek 2.: Spektrofotometrická kfiivka a elektroforéza degradované RNA PfiestoÏe má vzorek velmi dobré parametry pfii spektrofotemetric- systém [13], kdy je cDNA oznaãena speciální sekvencí, na kém mûfiení, mÛÏe b˘t integrita RNA nízká, a) Graf závislost absorbance kterou se poté váÏí speciální fluorescenãnû znaãené struk- vzorku RNA na vlnové délce, data získána pfiístrojem Nanodrop ND-1000; tury (dendrimery). ProtoÏe dendrimery mohou nést aÏ nûko- b) Stejn˘ vzorek RNA, gel-like v˘stup pfiístroje BioAnalyzer 2100 lik stovek molekul fluorescenãních barev, je moÏné dosáh- nout dostateãné intenzity signálu i pfii pouÏití ménû neÏ 1 mikrogramu totální RNA. Jinou moÏností je chemiluminis- cenãní systém detekce, kter˘ je nûkolikanásobnû citlivûj‰í neÏ fluorescenãní. Existují jiÏ komerãní vysokohustotní DNA ãipy s chemiluminiscenãní detekcí. Ve spojení s komerãnû dostupn˘m kitem na preamplifikaci RNA lze pouÏít jen 50ng v˘chozí RNA. V extrémních pfiípadech lze získat expresní profily z jedné jediné buÀky. Tyto profily jsou v‰ak poznamenány velkou variabilitou v˘sledkÛ.

Znaãení a hybridizace Zatímco základní postupy, jako je izolace RNA, jsou vícemé- nû univerzální, metodiky znaãení a hybridizace vzorkÛ se velmi li‰í. KaÏdá laboratofi si vytváfií vlastní protokoly, které nej- lépe vyhovují jejich poÏadavkÛm a zohledÀují typ a velikost vzorkÛ i druh pouÏit˘ch ãipÛ. V laboratofii CMBGT pouÏíváme lineární amplifikaci RNA s nepfiím˘m znaãením fluorescenãními barvami. Pfii tomto postupu je RNA nejdfiíve enzymaticky pfiepsána do dvou- Obrázek 3.: Kontaminace RNA genomovou DNA (gDNA), a) Konta- vláknové DNA, bûhem této reakce je zainkorporován pro- minovaná RNA; b) Genomová DNA – pozitivní kontrola; 1% nedenatu- rující TBE/agarosov˘ gel, barvení ethidiumbromidem; motor pro enzym T7 polymerázu. V dal‰ím kroku je dvou- vláknová DNA transkribována T7 polymerázou (RNA „âistota“ vzorku polymeráza) do komplementární amplifikované RNA Pfiedev‰ím v onkologii je nutno brát v potaz i „ãistotu“ vzor- (cRNA). V tomto kroku je do cRNA zabudován aminoallyl- ku, tj. míru zastoupení neÏádoucích populací bunûk. Vût‰i- UTP. Na závûr je cRNA pfieãi‰tûna a zakoncentrována. na experimentÛ je zamûfiena na sledování genové exprese cRNA je poté fluorescenãnû naznaãena barvami, které jsou v nádorov˘ch buÀkách. Klinické vzorky v‰ak nikdy nemÛ- reakcí s amino skupinou aminoallyl-UTP kovalentnû navá- Ïou dosáhnout stoprocentního zastoupení nádorové subpo- zány na fietûzce RNA. Po odstranûní nenavázan˘ch barev je pulace, pfiitom i relativnû malá pfiímûs „kontaminujících“ vzorek pfiipraven k hybridizaci. bunûk mÛÏe v˘raznû ovlivnit zji‰tûnou míru exprese genÛ âipy mají formát mikroskopického sklíãka, na kterém jsou

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 353 imobilizovány oligonukleotidové sondy délky 40-70 bazí. nebo biotinyl-16-UTP. Znaãení je spfiaÏeno samplifikací cDNA PouÏíváme dvoubarevnou metodiku DNA ãipÛ, tj. na ãip nebo lineární amplifikací cRNA . Po hybridizaci sond se zna- jsou souãasnû hybridizovány dva vzorky (napfi. referenãní ãenou cDNA nebo cRNA a po vymytí pfiebyteãné cDNA nebo a vy‰etfiovan˘) znaãené rÛzn˘mi fluorescenãními barvami. cRNA je tfieba membrány inkubovat s konjugátem streptavi- Pfii hybridizaci jsou dvû rÛznû znaãené cRNA smíchány din-alkalická fosfatáza. Konjugát se naváÏe na biotinové zbyt- s hybridizaãním pufrem a naneseny na ãip, kde jsou pone- ky znaãené cDNA nebo RNA na membránû. Obraz je nutno chány pfii optimální teplotû 16-17 hodin. Nakonec je nena- „vyvolávat“ inkubací s chemiluminiscenãním substrátem (napfi. vázaná cRNA odmyta a ãip je moÏno naskenovat fluores- CDPStar), kter˘ alkalická fosfatáza pfiemûÀuje za vzniku v˘raz- cenãním skenerem. né chemiluminiscence. Díky tomu je dosaÏeno 5x aÏ 10x vy‰- ‰í citlivosti metody oproti fluorescenãním metodám. Lze pro- to pouÏít pro vy‰etfiení ménû v˘chozí RNA (standardnû 500 ng aÏ 6 μg). Na obr. 4a) je vidût chemiluminiscenãní obraz stfied- nûhustotního DNA ãipu (512 bodÛ) pro detekci exprese onko- genÛ a tumorov˘ch supresorÛ u nádoru rekta (kle‰Èová biopsie, zpracováno cca 3x3x3mm tkánû). Intenzita signálu kaÏdého bodu pfiedstavuje „intenzitu“ exprese jednoho genu nebo „intenzitu“ exprese kontrolních markerÛ. V souãasné dobû pouÏívá- me v MOU DNA ãipy pfii v˘zkumu prediktivních faktorÛ rezistence na cytostatika (viz obr. 4b, 288 bodÛ) a pfii v˘zkumu nádorov˘ch prognostick˘ch faktorÛ.

Závûr Zaji‰tûní technické stránky odbûru biologického materiálu pro DNA ãipové experimenty vyÏaduje tûsnou a bezchybnû fungu- jící kooperaci klinick˘ch a laboratorních pracovi‰È. Pfii plánová- ní takového projektu je nutné promyslet v‰echny moÏné kom- plikace a fie‰it je je‰tû pfied jeho zahájením, zmûna parametrÛ v prÛbûhu experimentu mÛÏe zcela znehodnotit získaná data. Pfie- dev‰ím je zapotfiebí se seznámit se v‰emi technikami, které budou Obrázek 4a): Pfiíklad stfiednûhus- Obrázek 4b): Pfiíklad nízkohus- pouÏity a zhodnotit nutnost dal‰í purifikace materiálu a jejího totního membránového DNA ãipu, totního membránového DNA ãipu, moÏného vlivu na v˘bûr vhodn˘ch metodik (izolace RNA, ampli- chemiluminiscenãní detekce chemiluminiscenãní detekce fikace RNA). Nutností je vypracování systému kontroly kvality V Laboratofii prediktivní onkologie a v Laboratofii experimen- od fáze odbûru vzorku aÏ po znaãení a hybridizaci RNA. tální bunûãné biologie Masarykova onkologického ústavu DNA ãipy jsou stále pomûrnû novou metodou, ale jejich ‰ir‰í (MOU) z finanãních dÛvodÛ pouÏíváme tzv. nízkohustotní roz‰ífiení jako diagnostick˘ nástroj v onkologii je pravdûpo- DNA ãipy (desítky aÏ stovky sond na jednom ãipu). KvÛli vy‰- dobné v nejbliÏ‰ích letech. Klinická i laboratorní pracovi‰tû ‰í citlivosti a z dÛvodÛ úspory biologického materiálu a kvÛli by proto mûla b˘t pfiipravena na uplatnûní této technologie. nenároãnosti na technické vybavení pouÏíváme membránové ãipy s chemiluminiscenãní detekcí. Tyto DNA ãipy obsahují Podûkování: buì cDNA sondy jako klasické cDNA ãipy nebo oligonukleo- Práce byla podporována grantem IGA MZ âR NR8448- tidové sondy. cDNA nebo RNA znaãíme biotinyl-16-dUTP 3/2005, a NR 9076-4.

Literatura: 7. de Ridder D, van der Linden CE, Schonewille T et al. Purity for clarity: the 1. Barreau C, Paillard L, Osborne HB. AU-rich elements and associated need for purification of tumor cells in DNA microarray studies. Leukemia. factors: are there unifying principles? Nucleic Acids Res. 2006 Jan 2005 Apr;19(4):618-27. 3;33(22):7138-50. 8. Van Gelder RN, von Zastrow ME, Yool A et al. Amplified RNA synthesi- 2. Atkin G, Daley FM , Bourne S et al. The effect of surgically induced ischa- zed from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci emia on gene expression in a colorectal cancer xenograft model. Br J Can- U S A. 1990 Mar;87(5):1663-7. cer. 2006 Jan 16;94(1):121-7. 9. Shearstone JR, Allaire NE, Campos-Rivera J et al. Accurate and precise 3. Sotiriou C, Khanna C, Jazaeri AA, Petersen D, Liu ET. Core biopsies can transcriptional profiles from 50 pg of total RNA or 100 flow-sorted pri- be used to distinguish differences in expression profiling by cDNA micro- mary lymphocytes. Genomics. 2006 Apr 17. arrays. J Mol Diagn. 2002 Feb;4(1):30-6. 10. Kurn N, Chen P, Heath JD et al. Novel isothermal, linear nucleic acid ampli- 4. Grotzer MA, Patti R, Geoerger B et al. Biological stability of RNA isola- fication systems for highly multiplexed applications. Clin Chem. 2005 ted from RNAlater-treated brain tumor and neuroblastoma xenografts. Med Oct;51(10):1973-81. Pediatr Oncol. 2000 Jun;34(6):438-42. 11. Ohtsuka S, Iwase K, Kato M et al. An mRNA amplification procedure with 5. Chu TY, Hwang KS, Yu MH, Lee HS, Lai HC, Liu JY. A research-based directional cDNA cloning and strand-specific cRNA synthesis for com- tumor tissue bank of gynecologic oncology: characteristics of nucleic acids prehensive gene expression analysis. Genomics. 2004 Oct;84(4):715-29. extracted from normal and tumor tissues from different sites. Int J Gyne- 12. Marko NF, Frank B, Quackenbush J, Lee NH. A robust method for the ampli- col Cancer. 2002 Mar-Apr;12(2):171-6. fication of RNA in the sense orientation. BMC Genomics. 2005 Mar 1;6(1):27. 6. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid 13. Stears RL, Getts RC, Gullans SR. A novel, sensitive detection system for guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. high-density microarrays using dendrimer technology. Physiol Genomics. 1987 Apr;162(1):156-9. 2000 Aug 9;3(2):93-9.

354 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 VYUÎITÍ LASEROVÉ MIKRODISEKCE PRO P¤ÍPRAVU KOMPLEXNÍCH VZORKÒ Z NÁDOROVÉ TKÁNù PRO ÚâELY MIKROGENOMICK¯CH ANAL¯Z

THE UTILIZATION OF LASER CAPTURE MICRODISSECTION FOR CONSTRUCTION OF SPECIFIC SAMPLES FROM CANCER TISSUE, IN ORDER TO MICROGENOMIC ANALYSES DZIECHCIARKOVÁ M.1, BERKOVCOVÁ J.1, TROJANEC R.1, SROVNAL P.1, BOUCHALOVÁ K.1, HAJDÚCH M.1,2

1 LABORATO¤ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY P¤I DùTSKÉ KLINICE LÉKA¤SKÉ FAKULTY UNIVERZITY PALACKÉHO A FAKULTNÍ NEMOCNICE V OLOMOUCI 2 ONKOLOGICKÁ KLINIKA LÉKA¤SKÉ FAKULTY UNIVERZITY PALACKÉHO A FAKULTNÍ NEMOCNICE V OLOMOUCI

Souhrn Laserová záchytná mikrodisekce (Laser capture microdissection, LCM) je rychlá a spolehlivá metoda, kte- rá umoÏÀuje izolaci cílov˘ch bunûk ze specifického komplexu tkánû pro jejich následnou molekulární nebo proteinovou anal˘zu. Základem LCM je inverzní mikroskop se zabudovan˘m nízkov˘konnostním infraãer- ven˘m laserem. Nafiezané tkánû jsou upevnûny na standardní podloÏní sklo a termoplastická membrána (TM) je umístûna nad dehydratovan˘ preparát. V ohnisku laserového mikroskopu je umístnûna TM, kterou laser roztaví v poÏadovaném místû a naváÏe tak cílovou buÀku ãi strukturu k membránû. V souãasné dobû máme k dispozici nûkolik laserov˘ch mikrodisekãních systémÛ, které se li‰í zpÛsobem zachycení disekovan˘ch bunûk, v konfiguraci systému i v jednotliv˘ch aplikacích. Laserovou mikrodisekci lze pouÏít pro izolaci bunûk u fiady typÛ bunûãn˘ch i tkáÀov˘ch preparátÛ, vãetnû zamraÏen˘ch vzorkÛ, formalínem fixovan˘ch parafinizovan˘ch tkání ãi cytologick˘ch preparátÛ. V závislosti na pouÏitém materiálu je moÏno z mikrodisekovan˘ch bunûk extrahovat DNA, RNA ãi proteiny v dobré kvalitû. Kombinací s dal‰ími technikami, jako je napfiíklad cDNA microarray, LCM pomáhá identifikovat nové diagnostické a prognostické znaky vedou- cí ke zlep‰ení diagnosticko terapeutick˘ch metod v léãbû onkologick˘ch onemocnûní. Na na‰em pracovi‰ti jsme laserovou mikrodisekcí izolovali buÀky z cytologick˘ch preparátÛ adenokarcinomu plic získan˘ch punkãní cytologií zmraÏen˘ch ãi parafinizovan˘ch nádorÛ a také bunûãné linie, napfi. myeloidní leukemii K562. V této práci popisujeme na‰e zku‰enosti se zavedením LCM s následnou mikroizolací DNA/RNA a lineární amplifikací DNA/RNA pro úãely dal‰ích genetick˘ch anal˘z jako je napfi. komparativní genomická hybridizace, expresní studie, ãi pfiímé sekvenování vy‰etfiovan˘ch genÛ z biologického materiálu s mini- málním obsahem nádorov˘ch bunûk, ãi pro studium nádorové heterogenity na jednobunûãné úrovni.

Klíãová slova: EGFR1, komparativní genomická hybridizace, laserová mikrodisekce, lineární amplifikace DNA/RNA, isolace DNA/RNA, K-ras

Summary Laser capture microdissection (LCM) is a rapid, reliable method to obtain pure populations of targeted cells from specific microscopic regions of tissue sections for subsequent analysis. LCM is based on the adherence of visually selected cells to a thermoplastic membrane, which overlies the dehydrated tissue section and is focal- ly melted by triggering of a low energy infrared laser pulse. Tissue sections are mounted on standard glass slides, and transparent thermoplastic membrane is then placed over the dry section. The laser provides enough energy to transiently melt this thermoplastic film in to the target cells. Several systems are available for LCM, and vary in cell-capture method, system configuration and applications. LCM was applied to a wide range of cell and tissue preparations including frozen samples, formalin-fixed paraffin-embedded tissues or cytology smears. Depending on the starting material, DNA, good quality mRNA, and proteins can by extracted successfully from captured tissue fragments, down to the single cell level. In combination with another techniques like expression library construction and cDNA array hybridisation, LCM will allow the establishment of new diagnostic and prognostic markers, in order to indicate therapy individually tailored to the molecular profile of a given tumour. In this paper we refer our experiences with the LCM isolation of single cells from cytology smears of lung carcinomas, frozen and paraffin embedded tumour tissues as well as cell line cytospin preparation. Our ultimate goal was to introduce LCM technology in combination with DNA/RNA isolation and linear amplification for subsequent genomic analyses such as comparative genomic hybridisation, RNA expression studies and specific amplifications of investigated genes from tissue specimens with minority of tumour cells and/or for tumour heterogeneity studies based on one the single cell level. Key words: EGFR1, comparative genomic hybridization, laser capture microdissection, linear amplification of DNA/RNA, RNA/DNA isolation, K-ras

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 355 Úvod: Rozdílné LCM technologie V souãasné dobû molekulárnû biologické vy‰etfiení bunûk LCM umoÏÀuje disekci nejen jednotliv˘ch bunûk ãi bunûã- a tkání na úrovni DNA, RNA a proteinÛ pfiedstavuje revo- n˘ch kolonií z komplexu tkánû uchycené na podloÏním sklíã- luãní obrat v diagnostice a charakterizaci biologick˘ch vlast- ku, ale také vyfiezání jednotliv˘ch chromozómÛ a v nûkter˘ch ností nádorov˘ch onemocnûní. Nicménû, problém proteo- pfiípadech i disekci Ïiv˘ch bunûk pfiímo z kultivaãní misky. mick˘ch a genomick˘ch studií v pfiípadû anal˘zy V souãasné dobû máme k dispozici nûkolik mikrodisekãních komplexních nádorov˘ch vzorkÛ spoãívá v pfiípravû homo- systémÛ, které se li‰í v metodû odchytávání bunûk, v konfi- genní bunûãné populace. PrÛtoková cytometrie byla dlou- guraci systému i v aplikacích (tab.1) (7). Nûkteré systémy hou dobu pouÏívána jako v˘hradní technologie k získání jed- umoÏÀují bezdotykové katapultování oznaãen˘ch bunûk pfií- notliv˘ch bunûãn˘ch typÛ do suspenze, av‰ak moÏnost mo do sbûrn˘ch zkumavek, nebo vyzvednutí vyfiezan˘ch získání ãist˘ch bunûk ze vzorkÛ solidní tkánû, jako je biop- bunûk pfiímo víãkem mikrocentrifugaãní zkumavky. LCM sie, je ãasovû zdlouhavá. Dal‰í nev˘hodou prÛtokové cyto- systémy mohou mít zabudovan˘ infraãerven˘, nízko v˘kon- metrie je, Ïe vyÏaduje specifick˘ selekãní marker (1). Pro nostní infraãerven˘, ultrafialov˘ laser, nebo i jejich kombina- zlep‰ení metody izolace jednotliv˘ch bunûk nebo samostat- ce. V‰echny mikrodisekãní systémy mají laser zabudovan˘ do n˘ch bunûãn˘ch populací byla proto vyvinuta technika lase- standardního mikroskopu. rové mikrodisekce (LCM) (2, 3, 4). Laserová mikrodisekce byla pouÏita pro izolaci bunûk u fiady typÛ bunûãn˘ch i tká- Technologie zachytávání bunûk: Àov˘ch preparátÛ, vãetnû zamraÏen˘ch vzorkÛ, formalínem Membránové (fúzní) technologie fixovan˘ch a parafinizovan˘ch tkání ãi cytologick˘ch pre- Jedna z moÏností, jak zachytávat vyfiezané buÀky, je tzv. fúz- parátÛ. V závislosti na pouÏitém materiálu je moÏno z mik- ní technologie. Fúzní technologie zachytávání bunûk je zalo- rodisekovan˘ch bunûk extrahovat DNA, RNA ãi proteiny Ïena na selektivní pfiilnavosti cílov˘ch bunûk a fragmentÛ tká- v dobré kvalitû. Kombinací s dal‰ími technikami, jako napfií- ní k termoplastické membránû, která je upevnûna na prÛsvitné klad cDNA microarrays, pak LCM pomáhá identifikovat víãko mikrozkumavky (CapSureTM) (viz. www.arctur.com). nové diagnostické, prediktivní a prognostické markery, Termoplastická membrána je aktivována nízkov˘konnostním vedoucí ke zlep‰ení diagnosticko-terapeutick˘ch metod infraãerven˘m laserov˘m pulsem. Nafiezané tkánû jsou upev- v léãbû onkologick˘ch onemocnûní. nûny na standardní podloÏní sklíãko a termoplastická mem- brána je umístûna nad dehydratovan˘ preparát. V ohnisku lase- Princip a v˘voj laserové mikrodisekce rového mikroskopu se aktivuje termoplastická membrána, Laserová mikrodisekce je rychlá a spolehlivá metoda, která která je navázána k identifikované cílové buÀce v mikrosko- umoÏÀuje izolaci cílov˘ch bunûk ze specifického komplexu pované ãásti preparátu. Laser roztaví termoplastickou fólii tkánû pro jejich následnou molekulární nebo proteinovou ana- v místû vybrané cílové buÀky (1,5,8). ProtoÏe termoplastická l˘zu (5). folie absorbuje vût‰inu tepelné energie a laserov˘ puls trvá jen Poãátek laserové mikrodisekce se datuje do roku 1970, kdy zlomek sekundy, po‰kození biologick˘ch makromolekul je byl poprvé poÏit laser pro zachycení a manipulaci s bunûãn˘- minimální nebo nedetekovatelné. Po disekci pfiíslu‰n˘ch mi populacemi. V polovinû 90. let minulého století byl vyvi- bunûk, je termoplastická fólie s adherovan˘mi buÀkami odstra- nut první prototyp laserového mikrodisekãního systému ve nûna a zbytek nepouÏité tkánû zÛstává na podloÏním sklíãku. spolupráci nûkolika ústavÛ z National Institutes of Health Tuto technologii vyuÏívá PixCell II laserov˘ mikrosektor fir- (NIH). Pozdûji ze spolupráce NIH a firmy Arcturus (www.arc- my Arcturus. Novûj‰í verze laserového mikrodisektoru (Veri- tur.com) vznikl první komerãní mikrodisekãní systém (6). Ten- tas) této spoleãnosti má zabudovan˘ jak nízkov˘konnostní to systém vyfiezává buÀky pomocí laserov˘ch pulsÛ cílen˘ch infraãerven˘ laser, tak UV laser. Pro disekci pomocí UV lase- na okrsky tkánû, které jsou pfiekryty speciální membránou, tzv. ru jsou tkáÀové preparáty upevnûny na tenkou polyetylenovou fúzováním tkánû a membrány. Po disekci pfiíslu‰n˘ch bunûk fólií. Polyetylenová fólie s dehydratovan˘m preparátem je pfie- je termoplastická fólie s adherovan˘mi buÀkami odstranûna vrstvena víãkem s termoplastickou membránou (CapSureTM). a zbytek tkánû, která nebyla vybrána k disekci, zÛstává na pod- Cílové buÀky jsou mikrodisekovány prostfiednictvím ultrafia- loÏním sklíãku. BuÀky na membránû pak mohou b˘t podro- lového laseru, kter˘ pfiesnû obkrouÏí fieznou dráhu podél obvo- beny pfiíslu‰n˘m extrakãním podmínkám pro jejich následnou du disekovan˘ch bunûk. Mikrodisekované ãásti tkánû tak mikrogenomickou anal˘zu. zÛstávají pfiichyceny na spodní ãásti víãka.

Tabulka 1.: Srovnání rÛzn˘ch komerãnû dostupn˘ch mikrodisekãních systémÛ.

356 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Cell Robotics (www.cellrobotics.com) vyuÏívá tzv. techniku systém zahrnuje ultrazvukov˘ piezo-mikroskalpel s velmi ten- „Pick-Up Sticks“, která umoÏÀuje zachycení disekovan˘ch kou kovovou ‰piãkou, kter˘ je napojen na standardní mikro- bunûk. Tento mikrodisekãní systém je zaloÏen na UV laseru. skop propojen˘ s poãítaãem. Disekce je provádûna v kapce Mikroskalpel produkuje fototermální reakci v ohniskovém vody, xylenu ãi jiného média a to tak, Ïe na preparát je nane- bodu ãoãky mikroskopu, kde laserov˘ paprsek protíná cílov˘ sena kapka daného média, a mikroskalpel kmitav˘mi pohyby vzorek. TkáÀové preparáty jsou uchyceny na skla pokrytá ten- se‰krabává potfiebn˘ úsek tkánû do této kapky. Kapka s izolo- kou polyetylenovou fólií, vyfiezávané buÀky ãi okrsky tkánû van˘mi buÀkami ãi okrsky tkánû je aspirována speciální pipe- jsou laserem obkrouÏeny. Fototermální reakce v ohniskovém tou a vnesena do sbûrné mikrozkumavky. bodu laseru vypafií nebo odstraní velmi malou ãást cílov˘ch bunûk ãi tkánû. Disekované okrsky tkánû jsou smûfiovány elek- Aplikace LCM v diagnostice a prognózování nádorov˘ch trostatickou sílou smûrem k filmu a film s buÀkami je pak vlo- onemocnûní Ïen do mikrocentrifugaãní zkumavky a zpracován. Na na‰em pracovi‰ti pouÏíváme laserov˘ mikrodisektor Veri- Podobn˘ systém vyfiezávání bunûk má i mikrodisektor mmi- tas (Arcturus) (obr.1). Vypracovali jsme rutinní postupy pro CellCut firmy MMI Molecular Machines & Industries AG laserovou mikrodisekcí z cytologick˘ch preparátÛ karcinomÛ (www.molecular-machines.com), tento systém se v‰ak li‰í od plic získan˘ch punkãní cytologií barven˘ch metodou Giem- Cell Robotics ve zpÛsobu zachytávání bunûk po disekci. BuÀ- sa-Romanovski, zamraÏen˘ch ãi parafinizovan˘ch nádorov˘ch ky jsou vyfiezávány automaticky pomocí velmi pfiesného UV tkání (barveno hematoxylinem) a také cytospinov˘ch prepa- laseru. Vzorky jsou uchyceny na speciální membrány upev- rátÛ z nejrÛznûj‰ích bunûãn˘ch linií (barveno neutrální ãerve- nûné v rámeãku. Takto pfiipravené vzorky jsou pfiekryty skle- ní) (obr.2). Metodick˘m cílem bylo zavést kombinaci LCM nûn˘m podloÏním sklíãkem. Toto pfiikrytí efektivnû ochrání s lineární amplifikací DNA i RNA pro úãely dal‰ích mikroge- vzorek pfied neãistotami z okolí a je rozhodující pro v‰echny nomick˘ch anal˘z z biologického materiálu s minimálním aplikace, u kter˘ch je klíãové zabránit zevní kontaminaci. obsahem nádorov˘ch bunûk, ãi pro studium nádorové hetero- Vyfiezané okrsky tkánû jsou zachyceny víãky, která jsou pokry- genity na jednobunûãné úrovni. V dal‰í ãásti tohoto sdûlení ta adhesivní vrstvou. referujeme na‰e odzkou‰ené metodické postupy, které snad Systém Bio-Rad Colonis (viz. www.microscopy.bio-rad.com) usnadní práci dal‰ím zájemcÛm o pfiípravu genetického mate- pouÏívá rovnûÏ film pro zachycení bunûk, ale jinou cestou. riálu technikou LCM spojenou s amplifikací DNA ãi RNA Tento systém umoÏÀuje i aplikace s Ïiv˘mi buÀkami. Film je a následn˘mi genetick˘mi anal˘zami. umístûn do kultivaãní misky a Ïivé buÀky jsou na nûm pfiímo kultivovány. Po vypûstování kolonií je moÏno fiezat buÀky pfií- mo v kultufie. Vyfiezan˘ film je z kultury odloupnut a poÏado- vané buÀky zÛstanou na nûm uchyceny. Je také moÏno provést ablaci neÏádoucích kolonií bunûk. Ty jsou následnû odmyty a zbylé buÀky mohou b˘t dále kultivovány (7). Paprskové technologie Zachytávání bunûk pomocí speciálního filmu není jedinou cestou jak izolavat disekovan˘ materiál (7). PALM MicroBe- am’s (www.palm-microlaser.com) vyuÏívá tzv. technologii laserovû tlakového katapultování (Laser Pressure Catapulting, LPC). Pulzní UV-A laser je zabudovan˘ do standardního mikroskopu. Laser je zaostfien pfies objektiv ãoãky do bodu o velikosti 1μm. Uvnitfi úzkého bodu laserového ohniska je vytvo- fiená síla pro ablaci materiálu, zatímco okolní tkáÀ zÛstává zcela Obr. 1: Laserov˘ mikrodisektor Veritas firmy Arcturus. neporu‰ena. PouÏitím tohoto laserového systému mohou b˘t separované buÀky nebo vybrané oblasti tkánû vyzvednuty a zachyceny do sbûrného zafiízení. Toto je zcela bezkontaktní proces zachytávání bunûk, kdy pro transport selektovan˘ch oblastí do sbûrn˘ch systémÛ je pouÏito jenom zaostfiené svût- lo. Vzorek je pfiemístûn nûkolik milimetrÛ proti gravitaci. Stej- n˘ systém je také aplikován pro získávání Ïiv˘ch bunûk z bunûãn˘ch kolonií (9, 10, 11). Katapultovan˘ materiál mÛÏe b˘t dále centrifugován a pouÏit pro následnou molekulární ana- l˘zu, nebo dal‰í experimenty jako je rekultivace selektovan˘ch vitálních bunûk. Dal‰í ‰iroce pouÏívanou technikou je laserov˘ mikropaprsko- v˘ mikrodisekãní systém (12) (viz. www.leica-microsys- tems.com). Tento systém pouÏívá pulzní ultrafialov˘ laser s mal˘m paprskem pro vyfiezávání cílov˘ch bunûk prostfied- Obrázek 2.: Laserová záchytná mikrodisekce nádorov˘ch bunûk z cyto- nictvím fotoablace sousední tkánû. TkáÀové preparáty jsou logického preparátu karcinomu plic získaného punkãní cytologií (barve- uchyceny na tenkou polyetylenovou fólií. Cílové buÀky jsou no metodou Giemsa-Romanowski), zamraÏen˘ch ãi parafinizovan˘ch mikrodisekovány prostfiednictvím UV laseru, kter˘ pfiesnû nádorov˘ch tkání (barveno hematoxylinem) a stabilní bunûãné linie K562 obkrouÏí fiezanou dráhu podél obvodu disekovan˘ch selekto- (barveno neutrální ãervení): Na obrázku jsou A) oznaãeny nádorové buÀ- ky cytologického preparátu karcinomu plic; B) disekované buÀky karci- van˘ch bunûk. Touto „studenou“ ablací není materiál vysta- nomu plic; C) oznaãené nádorové buÀky z fiezu formalinem fixované ven pfiímému laserovému záfiení. Mikrodisekované ãásti tká- a parafinizované nádorové tkánû; D) vyfiezané buÀky z tohoto tkáÀového nû jsou sbírány do víãka nanozkumavky bezkontaktnû, tzn. fiezu; E) cytospin bunûãné nádorové linie K562; F) disekovaná buÀka buÀky padají do víãka zkumavky na základû gravitace, nádorové bunûãné linie K562. a mohou b˘t následnû pouÏity pro molekulární anal˘zu. Mechanické technologie Izolace a lineární amplifikace DNA Dal‰í moÏností zachytávaní bunûk nabízí napfi. spoleãnost Technika lineární amplifikace DNA byla modifikovaná pod- Eppendorf (www. eppendorf.com) prostfiednictvím tzv. „Pie- le dfiíve publikovan˘ch prací (13-16). BuÀky získané pomocí zo power for microdissection“ (PPMD) technologie. Tento LCM (1-1000 bunûk) byly v mikropodmínkách lyzovány pro-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 357 teinázou K. K mikrodisekovan˘m buÀkám bylo pfiidáno 5μlPK Komparativní genomická hybridizace (CGH) jako jedna pufru [50mM Tris-HCl (Sigma, USA) pH=8.1, 1 mg/ml pro- z moÏností pouÏití lineárnû amplifikované DNA získané teinázy K (New England Biolabs, USA), 1 mM EDTA (Serva, z bunûk izolovan˘ch LCM. Nûmecko)] a 5 μl minerálního oleje (Sigma, USA). V‰e bylo Principem komparativní genomické hybridizace (CGH; obr.4) inkubováno pfies noc pfii 40°C. Druh˘ den byly zkumavky je porovnání referenãní a vy‰etfiované DNA. KaÏdá z obou s natráven˘mi buÀkami krátce centrifugovány a inkubovány DNA je oznaãena jinou fluorescenãní barvou. Na na‰em pra- 10 min. pfii teplotû 95°C. Pfii této teplotû dochází k inaktivaci covi‰ti konsenzuálnû znaãíme referenãní DNA ãervenû avy‰et- proteinázy K. Poté byla dvou‰roubovice DNA roz‰tûpena fiovanou DNA zelenû. Obû DNA jsou smíchány v pomûru 1:1 restrikãním enzymem MseI (New England Biolabs, USA). a hybridizovány na normální lidské metafázní chromozómy. K5μl lyzátu bylo pfiidáno 0,2 μl One-Phor-All-Buffer–Plus Interpretace v˘sledkÛ je zaloÏena na zmûnû pomûru intenzity (Amersham Biosciences, USA), 1 μl MseI (10 jednotek) a 0.8 zelené a ãervené fluorescence u chromozómÛ, na nichÏ obû μ lH2O. Smûs byla inkubována 3 hodiny pfii 37°C. Po restrik- DNA byly hybridizovány (17,18,19). Delece (loss) ve vy‰et- ci byly na roz‰tûpené konce navázány adaptéry se specifick˘- fiované DNA zpÛsobí barevn˘ posun smûrem do ãervena, mi amplifikaãními sekvencemi. Pro annealing primerÛ byly amplifikace (gain) posun do zelena. Nev˘hodou CGH je fakt, pouÏity primery MseLig – 21 merov˘ (5’-AGT GGG ATT Ïe dokáÏe zachytit pouze nebalancované cytogenetické zmû- CCG CAT GCT AGT-3) a MseLig -12 merov˘ (5’-TAA CTA ny, které jsou pfiítomny alespoÀ u 50% jader, z nichÏ byla izo- GCA TGC-3μ) (Generi Bitech, âeská republika), 0.5μl One- lována DNA. V pfiípadû nádorov˘ch preparátÛ je vzorek více μ Phor-All-Buffer-Plus a 1.5 lH2O. Annealing byl zahájen inak- ãi ménû „kontaminován“ i nenádorov˘mi populacemi bunûk, tivací restrikãních enzymÛ pfii 65°C, pak se teplota sniÏovala které mohou v˘sledky CGH ovlivnit nafiedûním cytogenetic- po 1°C/min aÏ na 15°C. Pfii 15°C bylo k reakãní smûsi pfiidá- k˘ch alterací pod detekãní limit CGH. Laserová mikrodisek- no 1 μl T4 DNA ligázy a 1 μl T4 DNA ligázového pufru (New ce proto umoÏÀuje citlivûj‰í zachycení cytogenetick˘ch zmûn, England Biolabs, USA), obsahujícího 10mM ATP. Ligace pro- v˘bûrem poÏadovan˘ch nádorov˘ch populací ãi pouze jediné bíhala pfies noc pfii 15°C. Pomocí v˘‰e zmiÀovan˘ch sekven- (ne)nádorové buÀky. cí primerÛ byla DNA následnû amplifikována v PCR reakci. Pro primární amplifikaci bylo k 12 μl ligovaného produktu pfii- dáno 40 μl primární PCR smûsi, která obsahovala 3 μl Expand Long Template, buffer 1 (Expand Long Templa- te PCR Systém, Roche, ·v˘carsko), 2 μl dNTPs (10mM deo- xynukleotidy, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Sigma, USA), 35 μ lH2O. Primární amplifikace byla zapoãata 4 min. denatura- cí pfii 68°C. V tomto kroku jsou odstranûny pfiebyteãné oligonukleotidy z vazby na DNA fietûzec. Po denaturaci bylo do reakãní smûsi pfiidáno 0.7 μl (3.5 jednotek) DNA polymerá- zové smûsi Taq a Pwo polymerázy (Expand Long Template PCR Systém, Roche, ·v˘carsko). V termocykléru byly nasta- veny tyto amplifikaãní podmínky: 14 cyklÛ – 94°C (40s), 57°C (30s), 68°C (1min. 15s); 34 cyklÛ – 94°C (40s), 57°C (30s), 68°C (1min. 45s) a 1 cyklus – 94°C (40s), 57°C, 68°C (5min.). Pro kontrolu kvality a senzitivity DNA amplifikace byla pouÏita specifická PCR amplifikace exonu 2 genu Obrazek 4.: Schématick˘ princip komparativní genomické hybridizace pro lidsk˘ mamaglobin B1 (Obr. 3). Na‰e v˘sledky ukazují, (CGH) Ïe lineární amplifikací lze reprodukovatelnû namnoÏit DNA z jediné disekované buÀky do mnoÏství postaãujícího pro bûÏ- Pfiíkladem tohoto tvrzení je jeden z na‰ich experimentÛ, ve kte- né genetické anal˘zy zaloÏené na PCR. rém jsme technikou u laserové mikrodisekce izolovali jedno- tlivé buÀky z linie myeloidní leukémie K562. Technikou line- ární amplifikace byla DNA namnoÏena a produkt primární amplifikace byl pouÏit pro CGH. Pomocí CGH jsme porov- návali DNA získanou izolací klasick˘m zpÛsobem ze smûsné kultury bunûk a DNA po LCM jediné buÀky s následnou line- ární amplifikací. Na obrázku 5 jsou zobrazeny v˘sledky této CGH studie, vãetnû idiogramÛ po LCM a lineární amplifikaci DNA z jediné buÀky v porovnání se smûsn˘m vzorkem mye- loidní leukemické linie K562. Z v˘sledn˘ch idiogramÛ je patr- né, Ïe se nálezy ãásteãnû li‰í díky nádorové heterogenitû bunûk v tkáÀové kultufie. U myeloblastu podrobeného LCM je napfi. patrná nová amplifikace v oblasti chromozómu 15. Z anal˘zy také vypl˘vá, Ïe pfii vy‰etfiení DNA získané ze smûsné populace bylo detekováno men‰í mnoÏství cytogenetick˘ch zmûn, neÏ v pfiípadû DNA izolované z jedné buÀky. U smûsného vzorku tedy nebyly zachyceny aberace ménû frekventní, nedosa- hující zastoupení alespoÀ u 50% bunûk v celkové populaci.

Specifická amplifikace vy‰etfiovan˘ch genÛ pro úãely mutaã- ních studií Obr. 3: V˘sledek genovû specifické PCR amplifikace exonu 2 genu pro V souãasné dobû pouÏíváme techniku laserové mikrodisekce lidsk˘ mamaglobin B1 z mikrodisekovan˘ch bunûk, jejichÏ DNA byla zejména pfii anal˘ze mutací genÛ EGFR1 a k-ras u pacientÛ lineárnû amplifikována. Produkt selektivní amplifikace exonu 2 genu pro s nemalobunûãn˘m plicním karcinomem (20). Oddûlením lidsk˘ mamaglobin B1 se nacházel v oblasti 133bp. Zleva: 1) DNA lad- der, 2) templát pfiipraven˘ lineární amplifikací DNA z 1 buÀky, 3) tem- nádorové populace od nenádorov˘ch bunûk si totiÏ v˘znam- plát pfiipraven˘ lineární amplifikací DNA z 10 bunûk, 4)templátem byla nû zvy‰ujeme sensitivitu DNA sekvenace. DNA získaná z 300- kontrolní DNA. 500 mikrodisekovan˘ch bunûk je amplifikována ve dvouko-

358 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 lové nested PCR. Dvoukolová nested PCR je zaloÏena na 30 s následn˘m pfieãi‰tûním dvou‰roubovice cDNA. In vitro tran- cyklech amplifikace s externím párem genovû specifick˘ch skripce cDNA na antisense RNA byla provedena pomocí T7 primerÛ. Vznikl˘ PCR produkt je vyuÏit jako templát pro dru- RNA polymerázy. Amplifikace RNA byla ukonãena isolací hé kolo amplifikace ve 30 cyklech s interním párem primerÛ. a pfieãi‰tûním získané antisense RNA. Takto pfiipravenou RNA V˘sledn˘ amplikon je pak podroben klasické sekvenaãní lze pouÏít pro úãely vût‰iny expresních anal˘z. anal˘ze.

Obr. 6: Anal˘za kvality RNA získané z nádorové tkánû karcinomu rekta po mikrodisekci IR nebo UV laserem na bioanalyzátoru Agilent 2100 kitem RNA 6000 Pico: 1) RNA získaná po disekci celé tkánû pomocí IR Obrázek 5.: V˘sledek komparativní genomické hybridizace: A) V˘sled- laseru. 2) RNA získaná po disekci izolovan˘ch nádorov˘ch bunûk pomo- n˘ preparát (mitóza) pfii vy‰etfiení cytogenetick˘ch zmûn DNA získané ze cí IR laseru. 3) RNA získaná po disekci celé tkánû pomocí UV laseru. 4) smûsného vzorku kultury myeloidní leukemické linie K562. B) V˘sledn˘ Degradovaná RNA získaná po disekci izolovan˘ch nádorov˘ch bunûk preparát (mitóza) pfii vy‰etfiení DNA po LCM a lineární amplifikaci zís- pomocí UV laseru. L) Specifick˘ selekãní marker kontroly kvality arepro- kané z jedné buÀky myeloidní leukemické linie K562. C) Idiogram zís- dukovatelnosti elektroforetické separace. kan˘ stanovením cytogenetick˘ch zmûn u DNA získané ze smûsného vzorku kultury myeloidní leukemické linie K562. Cytogenetick˘ nález: REV Závûr: ISH ENH (3q29qter; 5p12-13.3; 5p15.2pter; 6p25.1pter; 12p11.1pter; V souãasnosti existuje celá fiada mikrodisekãních systémÛ, kte- 16p11.2-12; 18q21.3qter) REV ISH DIM (9q34.1qter; 12q21.1-21.3; 13q11.1qter; 16q12.1-13; 17p11.1-11.2; 18q11.2-12.1; 19p13.3pter). D) ré se li‰í nejen metodou zachytávání bunûk, (tzv. membráno- Idiogram cytogenetick˘ch zmûn DNA po LCM a lineární amplifikaci zís- vé nebo-li fúzní technologie, paprskové technologie ãi mecha- kané z jedné buÀky myeloidní leukemické linie K562. Cytogenetick˘ nické technologie), ale také konfiguraci systému a v následn˘ch nález: REV ISH ENH (1p36.2pter; 3q26.3qter; 4p11.1pter; 4q35qter; aplikacích. Pomocí v‰ech tûchto systémÛ lze vy‰etfiovanou tkáÀ 6p11.1-12.1; 9q13-21; 12p11pter; 15q11.2-24.1; 16p11.2.-12; prohlédnout pod mikroskopem pfied a po mikrodisekci. Tím je 17p12.1pter; 17q22qter; 18q22qter) REV ISH DIM (5q11.2-15; 5q34.0- 35.1; 7q11.2-21.1; 9p12-21; 9q21.3qter; 10q22.1-22.3; 10q26.1qter; zkontrolována homogenita studovaného materiálu a zachová- 12q21.1-21.3; 13q11.1qter; 16q12.1.-22; 19p13.3pter) ní morfologie disekované ãásti tkánû na víãku. Tyto systémy také umoÏÀují obrazovou dokumentaci po kaÏdé disekci, coÏ Izolace, lineární amplifikace a hodnocení kvality mikroizolo- poskytuje pfiíleÏitost ke korelaci histopatologick˘ch nálezÛ vané RNA po LCM s pouÏitím IR nebo UV laserÛ s v˘sledky molekulární anal˘zy. Laserovou mikrodisekcí byly izolovány buÀky kryoprezervo- Na na‰em pracovi‰ti je k dispozici laserov˘ mikrodisekãní vané nádorové tkánû karcinomÛ rekta. Pro srovnání byly buÀ- systém Veritas firmy Arcturus, kter˘ má zabudovan˘ jak IR ky disekovány IR laserem nebo UV laserem a to jednak jako 1) tak UV laser, coÏ nám umoÏnilo provedení rÛzn˘ch aplikací. rozsáhlej‰í úseky tkánû ãítající >1000 bunûk a také jako 2) jed- Laserovou mikrodisekcí byly isolovány buÀky z cytologic- notlivé shluky 1-3 nádorov˘ch bunûk. RNA byla izolovaná k˘ch preparátÛ karcinomÛ plic, zamraÏen˘ch ãi parafinizova- pomocí PicoPureTM RNA Isolation kitu (Arcturus, USA), kte- n˘ch nádorov˘ch tkání, i ze stabilních bunûãn˘ch linií. Za úãe- r˘ umoÏÀuje purifikaci pfies centrifugaãní kolonky. Kontrola lem získání dostateãného mnoÏství DNA/RNA jsme zavedli degradace získané RNA byla provedena pomocí RNA 6000 techniku lineární amplifikace DNA/RNA. V souãasné dobû Pico Kitu na bioanalyzéru Agilent 2100. Na obrázku 6 je zná- pouÏíváme techniku laserové mikrodisekce zejména pfii ana- zornûn v˘sledek získané RNA po mikrodisekci IR versus UV l˘ze mutací genu EGFR1 ak-ras, pro techniku komparativní laserem. Vidíme, Ïe pfii disekci mal˘ch okrskÛ tkánû (napfi. jed- genomické hybridizace (CGH) a pro izolaci RNA za úãelem notlivé infiltrující ãi metastatické buÀky) je vhodnûj‰í pouÏít dal‰ích expresních anal˘z. Z na‰ich zku‰eností jednoznaãnû IR laser, protoÏe bûhem disekce mal˘ch úsekÛ tkánû pomocí vypl˘vá nutnost pouÏití LCM pro pfiesnou diagnostiku, pre- UV laseru dochází ke znaãné tepelné degradaci RNA. dikci terapeutické odpovûdi a prognózování solidních nádorÛ RiboAmp RNA amplifikaãní kit (Arcturus, USA) byl pouÏit vyznaãujících se vysokou tkáÀovou i bunûãnou heterogenitou. pro amplifikaci vyizolované RNA. Tento kit umoÏÀuje amplifikaci jiÏ nanogramového mnoÏství celkové RNA na mikro- Podûkováni: gramové. Lineární amplifikace RNA byla zapoãata pfiepisem Práce na tomto projektu byla podpofiena v˘zkumn˘m zámû- jednovláknové molekuly RNA na cDNA reverzní transkriptá- rem M·M 6198959216, granty Interní Grantové Agentury zou se souãasnou inkorporací T7 promotoru. Druhé vlákno Ministerstva zdravotnictví âR NR/9076 a Ministerstvem prÛ- cDNA bylo dosyntetizováno pomocí exogenních primerÛ myslu a obchodu âR 1H-PK/45.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 359 Literatura: 12. Chimenti C., Pieroni M., Russo A., Sale P. et al.: Laser microdissection in 1. Curran S., McKeay J.A., McLeod H.L., Murray G.I.: Laser capture mic- clinical cardiovascular research. American College of Chest Physicians, roscopy. J Clin Pathol, 2000; 53:64-68. 2005; 128: 2876-2881. 2. Simone N.L., Bonner R.F., Gillespie J.W. et al.: Laser-capture microdis- 13. Klein Ch.A., Schmidt-Kittler O., Schardt J.A. et al.: Comparative genomic section: opening the microscopic frontier to molecular analysis. Trends hybridization, loss of heterozgosity, and DNA sequence analysis of single Genet., 1998; 14(7):272-276. cells. Proc Natl Acad Sci, 1999; 96: 4494-4499. 3. Banks R.E., Dunn M.J., Forbes M.A. et al.: The potential use of laser cap- 14. Stoecklein N.H., Erbersdobler A., Schmidt-Kittler O. et al.: SCOMP is ture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for superior to degenerated oligonucleotide primed-polymerase Chin reaction proteomic analysis—preliminary findings. Electrophoresis, 1999; 20(4- for global amplification of minute amounts of DNA from microdissected 5):689-700. archival tissue samples. American Journal of Pathology, 2002; 161: 43-51. 4. Emmert-Buck M.R., Bonner R.F., Chuaqui R.F. et al.: Laser capture mic- 15. Serth J., Kuczyk M.A., Paeslack U. et al.: Quantitation of DNA extracted rodissection. Science, 1996;274(5289):998-1001. after micropreparation of cells from frozen and formalin-fixed tissue sec- 5. Bonner R.F., Emmert-Buck M., Cole K., Pohida T. et al.: Laser capture tions. Am J Pathol, 2000; 156:1189-1196. microdissection: Molecular analysis of tissue. Science, 1997; 278: 1481- 16. Kuukasjarvi T., Tanner M., Pennanen S. et al.: Optimizing DOP-PCR for 1483. universal amplification of small DNA samples in comparative genomic 6. Brignole E.: Laser-capture microdissection. Modern Drug Discovery, 2000; hybridization. Genes Chromosom Cancer, 1997; 18:94-101. 3:69-70, 73. 17. Kallioniemi A., Kallioniemi O.P., Sudar D. et al.: Comparative genomic 7. Willingham E.: Laser Microdissection Systems. The Scientist, 2002; 16(10): hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science, 42. 1992; 258(5083):818-21. 8. Fend F., Raffeld M.: Laser capture microdissection in patology. J Clin Pat- 18. Kallioniemi O.P., Kallioniemi A., Piper J. et al.: Optimizing comparative hol, 2000; 53: 666-672. genomic hybridization for analysis of DNA sequence copy number chan- 9. Burgemeister R., Stich M.: Laser mediated live cell handling: Detection ges in solid tumors. Genes Chromosomes Cancer, 1994 10(4): 231-43. and collection of single live cells by laser microdissection and pressure 19. Speicher M.R., du Manoir S., Schrock E. et al.: Molecular cytogenetic ana- catapulting (LMPC). Zellbiologie, 2004; 23-24. lysis of formalin-fixed, paraffin-embedded solid tumors by comparative 10. Gjerdrum L.M., Lielpetere I., Rasmussen L.M. et al.: Laser-assisted mic- genomic hybridization after universal DANN-amplification. Hum Mol rodissection of membránû-mounted parafin section. J Mol Diagn, 2001; Genet, 1993; 2:1907-1014. 3:105-110. 20. Berkovcová J., Hajdúch M, Dziechciarková M, Trojanec R, Jano‰Èáková 11. Zhang L., Yang N., Conejo-Garcia J.R. et al.: Expression of endocrine A, Wiecek S, Grygárková I, Kolek V, Vorlíãek J.: Predikce úãinnosti tyro- gland-derived vascular endothelial growth factor in ovaria carcinoma. Clin zinkinázov˘ch inhibitorÛ Egfr1 v léãbû nemalobunûãn˘ch plicních karci- Cancor Res, 2003; 9:264-272. nomÛ. Klin Onkol, 2006 (v tisku).

MIKROâIPOVÁ ANAL¯ZA GENOVÉ EXPRESE V MIKRODISEKOVAN¯CH VZORCÍCH MICROARRAY ANALYSIS OF GENE EXPRESSIONM IN MICRODISSECTED SAMPLES BOUCHAL J., TURASHVILI G., KOLÁ¤ Z. LABORATO¤ MOLEKULÁRNÍ PATOLOGIE, LF UP, OLOMOUC Souhrn V poslední dobû se v experimentální praxi stále ve vût‰í mífie uplatÀují metody vyuÏívající mikroãipové expresní anal˘- zy. Vût‰ina expresních anal˘z v medicínském v˘zkumu vychází z bioptick˘ch vzorkÛ, které obsahují fiadu rÛzn˘ch typÛ bunûk. Majoritní populace bunûk je urãující pro celkovou informaci o genové expresi a znemoÏÀuje tak rozli‰ení speci- fické genové exprese jednotliv˘ch typÛ bunûk. Mezi metody, které umoÏÀují selekci pfiesnû definovan˘ch populací bunûk patfií laserová a mechanická mikrodisekce. Souãasné ãipy vyÏadují mikrogramová mnoÏství znaãené nukleové kyseliny, pfiiãemÏ vstupní mnoÏství RNA ze selektovan˘ch bunûk se mÛÏe pohybovat pouze v nanogramovém aÏ pikogra- movém fiádu. Tento problém je moÏno fie‰it rÛzn˘mi zpÛsoby amplifikace RNA, mezi které patfií dvojitá lineární amplifikace RNA nebo metody vyuÏívající kombinovanou PCR s linearní amplifikací. V tomto krátkém pfiehledu poskytujeme jednak informace, se kter˘mi jsme se setkali jednak bûhem na‰í souãasné anal˘zy genové exprese v mikrodisekovan˘ch buÀkách mléãné Ïlázy, a také ná‰ optimalizovan˘ postup. Cel˘ projekt sestával z ãasovû nároãného sbûru ãerstvû zmra- Ïené tkánû, optimalizace pfiípravy kryofiezÛ pro mikrodisekci, izolace a amplifikace RNA, hybridizace na mikroãipy, ana- l˘zy dat a koneãnû verifikace vybran˘ch v˘sledkÛ pomocí imunohistochemie. V souãasné dobû je vlastní práce v opo- nentním fiízení v zahraniãním ãasopise, a nemÛÏeme proto poskytnou detailnûj‰í informace o získan˘ch v˘sledcích. Klíãová slova: fixace, mikrodisekce, RNA, amplifikace, mikroãipy Abstract: The DNA microarray is a powerful, high throughput technique for assessing gene expression on a system- wide genomic scale. Most expression profiling studies of solid tumors have used biopsy samples containing large num- bers of contaminating stromal and other cell types, thereby complicating any precise delineation of gene expression in nontumor versus tumor cell types. Combining microdissection, RNA amplification protocols, microarray technologies and our knowledge of the human genome sequence, it is possible to isolate pure populations of cells or even a single cell and interrogate the expression of thousands of sequences for the purpose of more precisely defining the biology of the tumor cell. In this short overview, we provide informations on selected problems which we had to sol- ve during our microarray analysis of microdissected normal and tumour cells of mammary gland. We provide our opti- mized procedure as well. The whole project consisted of the long-term collection of snap-frozen tissues, optimaliza- tion of staining of cryosections for laser capture microdissection, isolation and amplification of RNA, hybridization onto chips, data analysis and finally verification of the results by immunohistochemistry. Our work is currently revie- wed by an international journal and we can’t provide detailed information on particular achievements yet. Keywords: fixation, microdissection, RNA, amplification, microarray

360 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 V literatufie existuje velké mnoÏství informací t˘kající se mik- kojivé v˘sledky po mikrodisekci imunobarven˘ch fiezÛ získa- roãipové anal˘zy, mikrodisekce i amplifikace RNA. V tomto li Uneyama a spolupracovníci (10). Tito autofii doporuãují spí- krátkém pfiehledu poskytujeme informace, se kter˘mi jsme se ‰e barvení cresylovou violetí, pfiípadnû hematoxylin-eosinem. setkali jednak bûhem na‰í souãasné anal˘zy genové exprese PouÏití hematoxylinu-eosinu pro laserovou mikrodisekci v mikrodisekovan˘ch buÀkách mléãné Ïlázy, a také v jiÏ ukon- a mikroãipovou anal˘zu doporuãují také Michel a spolupra- ãeném experimentu s nádorov˘mi liniemi odvozen˘mi od kar- covníci. (11). Ginsberg a Che testovali mikrodisekci a mikro- cinomu prostaty (1). Vût‰ina expresních anal˘z v medicínském ãipovou anal˘zu pfii pouÏití nejen hematoxylinu-eosinu a cre- v˘zkumu vychází z bioptick˘ch vzorkÛ, které obsahují fiadu sylové violeti, ale také po barvení thioninem, akridinovou rÛzn˘ch typÛ bunûk. Majoritní populace bunûk je pfiitom urãu- oranÏí a stfiíbrem (12). Nûktefií autofii s úspûchem pouÏili pro jící pro celkovou informaci o genové expresi a znemoÏÀuje tak stabilizaci RNA v analyzovan˘ch vzorcích RNAlater (13). rozli‰ení specifické genové exprese jednotliv˘ch typÛ bunûk Chaotropní soli RNAlateru v‰ak interferují s mikrodisekcí, (2). Mezi metody, které umoÏÀují selekci pfiesnû definovan˘ch a tak museli autofii sníÏit jejich koncentraci promytím v 70% populací bunûk patfií laserová a mechanická mikrodisekce. ethanolu a následnou dehydratací a vysu‰ením pomocí abso- V na‰í práci jsme testovali obû metody, ale mechanická mik- lutního ethanolu a xylenu. V na‰í práci se vyskytl také problém rodisekce pomocí systému Eppendorf se ukázala b˘t vhodná související s vysok˘m obsahem tukÛ v prsní tkáni, které zne- spí‰e pro izolaci vût‰ích tkáÀov˘ch okrskÛ. Vzhledem k poÏa- snadÀují pfiípravu kryofiezÛ. Po pfiídavku RNAlateru nebylo jiÏ davku izolace nejen nádorové tkánû, ale i normálních duktál- moÏné pfiipravit kvalitní kryofiezy ani pfii vychlazení tkání pfii ních a lobulárních luminálních bunûk mléãné Ïlázy, jsme pou- -80°C, a proto jsme byli nuceni pouÏívat pouze klasické Ïili systém laserové mikrodisekce od firmy Arcturus. Cel˘ kryofiezy. projekt sestával z ãasovû nároãného sbûru ãerstvû zmraÏené Obdobnû jako u dostateãnû koncentrovan˘ch vzorkÛ je tkánû, optimalizace pfiípravy kryofiezÛ pro mikrodisekci, izo- optimální kontrolou kvality RNA sledování pomûru lace a amplifikace RNA, hybridizace na mikroãipy, anal˘zy 28S/18S rRNA. Vzhledem celkovému objemu vzorkÛ v fiádu dat a koneãnû verifikace vybran˘ch v˘sledkÛ pomocí imuno- mikrolitrÛ je tato kontrola umoÏnûna v podstatû pouze pomo- histochemie. Zkrácen˘ optimalizovan˘ postup poskytujeme cí kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescen- níÏe. V souãasné dobû je na‰e práce v oponentním fiízení cí (14). Standardem se v této oblasti stal pfiístroj Agilent 2100 v zahraniãním ãasopise, a nemÛÏeme proto poskytnou detail- Bioanalyzer, kter˘ umoÏnuje na speciálních ãipech anal˘zu nûj‰í informace o získan˘ch v˘sledcích. jednoho mikrolitru celkové RNA a poskytuje nejen informaci o kvalitû RNA, ale zároveÀ i o koncentraci. Pokud není uve- Vliv fixace a barvení na mikrodisekci a kvalitu nukleov˘ch dená technologie k dispozici, je nutné barvení fiezÛ, mikrodi- kyselin sekci bunûk i izolaci RNA ovûfiit alespoÀ na testovacích Optimální fixace tkání musí poskytovat pfiijatelnou morfolo- vzorcích a cel˘ v˘tûÏek obûtovat pro kontrolu pomocí klasic- gii, umoÏnit samotnou mikrodisekci a stabilizovat mRNA. k˘ch metod jako je agarozová elektroforéza a RT-PCR. Po Goldsworhty a spolupracovníci testovali úãinky cross-linku- optimalizaci celé procedury je následnû nutné striktnû dodr- jících i precipitujících fixativ na zmraÏenou i do parafinu zali- Ïovat cel˘ postup u analyzovan˘ch vzorkÛ. PrÛmûrn˘ v˘tûÏek tou tkáÀ (3). Precipitující fixativa jako ethanol a aceton zaji‰- z 1000 mikrodisekovan˘ch bunûk je asi 50 ng celkové RNA, Èovaly více RT-PCR produktÛ neÏ formalin. Autofii také pfiiãemÏ v na‰ich laboratofiích jsme pozorovali pro agarozo- pozorovali vût‰í v˘tûÏnost RT-PCR z kryofiezÛ neÏ z fiezÛ para- vou elektroforézu a barvení Sybr-Gold detekãní limit 10 ng pfii finov˘ch. Kim a spolupracovníci oznaãují jako optimální fixa- vizualizaci pomocí chlazené CCD kamery (Diana II, Raytest, tivum pro stabilizaci RNA v tkáních zalit˘ch do parafinu met- Nûmecko). Pro ovûfiení kvality pomocí RT-PCR jsme testo- hacarn (kombinaci methanolu, chloroformu a kyseliny octové) vali primery pro beta-actin (15), které poskytují jednak rela- (4). Takto fixované tkánû úspû‰nû pouÏívali pro mikrodisekci tivnû dlouh˘ amplikon 626 bp a kontaminace genomickou a následnû RNA pro anal˘zu genové exprese taktéÏ pomocí DNA se projeví odli‰n˘m fragmentem o velikosti 1966 bp. Pfii RT-PCR. Dal‰í práce srovnávala ethanolovou fixaci a ãerstvû pouÏití Titan One Tube RT-PCR kitu (Roche) jsme v‰ak nedo- mraÏenou tkáÀ pomocí Affymetrix mikroãipÛ, av‰ak bez mik- cílili sníÏení detekãního limitu a vzhledem k finanãní nároã- rodisekování jednotliv˘ch bunûk (5). Autofii detegovali 26% nosti jsme od RT-PCR testování upustili. V dobû fie‰ení na‰e- prób (pfiesnûji probe sets, viz níÏe) u mraÏen˘ch tkání, oproti ho projektu nebyl k dispozici zmiÀovan˘ systém 2100 pouh˘m 4,5% z tkání fixovan˘ch ethanolem a zalit˘ch do para- Bioanalyzer a pro kvantifikaci RNA jsme pouÏívali spektro- finu. Pfies v˘razn˘ pokles poãtu detegovan˘ch transkriptÛ tato fotometr Nanodrop, kter˘ umoÏÀuje anal˘zu taktéÏ jediného data ukazují, Ïe pokud není k dispozici ãerstvû zmraÏená tkáÀ, mikrolitru vzorku. Po optimalizaci postupu byl pfiipraven nej- lze získat omezenou informaci o genové expresi i z tkání zali- prve jeden vzorek pouze pro testovací ãip Test3 Array (viz t˘ch do parafinu. TaktéÏ dal‰í autofii zjistili, Ïe fixace tkání níÏe) a následnû byla provedena kompletní anal˘za v‰ech tfií 70% etanolem zvy‰uje v˘tûÏnost RNA, DNA i proteinÛ opro- bunûãn˘ch populací od jedné pacientky. Po získání kvalitních ti formalinové fixaci a poskytuje srovnatelnou histologickou v˘sledkÛ jsme pfiistoupili k dokonãení anal˘zy v‰ech tfiiceti kvalitu fiezÛ (6-8). Pfiesto existuje poptávka po anal˘ze geno- vzorkÛ. Cel˘ proces amplifikace a znaãení (viz níÏe) byl navíc vé exprese z tkání fixovan˘ch formalinem a zalit˘ch do para- monitorován pomocí GeneChip® Eukaryotic Poly-A RNA finu. Firmy Arcturus a Affymetrix proto vyvinuly speciální Control Kit (Affymetrix), jehoÏ definovanû fiedûné kontroly ãipy (GeneChip® X3P Arrays), které obsahují hybridizaãní byly pfiidány do v‰ech vzorkÛ pfied syntézou cDNA a finálnû próby pouze v blízkosti 3’konce a jsou tak schopné detegovat byly detegovány na cílov˘ch ãipech Human Genome U133 více fragmentovan˘ch transkriptÛ (vysvûtlení viz níÏe). Plus 2.0 Arrays (Affymetrix). Laserová mikrodisekce a izolace RNA pro anal˘zu genové exprese je moÏná i z imunohistochemicky barven˘ch parafi- MoÏnosti amplifikace mRNA pro mikroãipovou anal˘zu nov˘ch fiezÛ (9). Autofii pouÏívali kvalitnû imunobarvené fiezy Eberwine a spolupracovníci vyvinuli dnes jiÏ klasickou, tzv. z tkání fixovan˘ch v acetonu, methanolu nebo ve smûsi etha- lineární amplifikaci RNA (16). Jedná se o pfiepis mRNA do nolu a acetonu. Specificita i rychlost mikrodisekce byla v˘raz- cDNA pomocí oligo-dT-T7 primeru, pfiiãemÏ inkorporovan˘ nû zv˘‰ena právû díky snaz‰í identifikaci Ïádan˘ch, popfiípa- T7-promotor umoÏÀuje následnou amplifikaci in vitro tran- dû nechtûn˘ch bunûãn˘ch populací. Pfiitom samotné barvení skripcí pomocí T7- polymerázy. K dosaÏení mikrogramov˘ch preparátÛ trvalo pouze 12-25 minut. Naproti tomu ménû uspo- mnoÏství RNA pro samotnou mikroãipovou anal˘zu je nûkdy

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 361 tento postup tfieba zopakovat. Jenson a spolupracovníci pozo- vání poãtu PCR cyklÛ pro kaÏdou cDNA tak, aby amplifika- rovali pouze malé zmûny v expresním profilu vzorkÛ amplifi- ce byla ukonãena v exponenciální fázi PCR. V systému firmy kovan˘ch dvojitou lineární amplifikací oproti nefiedûné RNA Roche, kter˘ jsme pouÏili i v na‰í práci, se PCR amplifikace (17). Nejlep‰í v˘sledky byly získány pfii amplifikaci 500 a více provádí dvakrát, pfiiãemÏ bûhem první reakce se odebírají ali- nanogramÛ celkové RNA, pfiiãemÏ jako kritické faktory se uká- kvoty z cyklÛ 21, 24, 27, 30 a 33 (Obr. 1). Ty jsou poté analy- zaly kvalita vstupní RNA a koncentrace oligo-dT-T7 prime- zovány agarozovou elektroforézou a podle intenzity amplifi- ru. Pro zmiÀovanou dvojitou lineární amplifikaci je dostupná kovan˘ch produktÛ je vybrán poãet cyklÛ pro druhou PCR. celá fiada komerãních kitÛ (Ambion, Arcturus, Epicentre a dal- Získané PCR produkty jsou pouÏity pro in vitro trankripci, ‰í). Detailní informace o problémech syntézy cDNA a in vit- bûhem které dochází k dal‰í amplifikaci a také ke znaãení pro ro transkripce poskytuje práce Baugh a spolupracovníkÛ (18). detekci na mikroãipech. Z jejich zku‰eností vychází i dal‰í kit od firmy Artus-biotech, jehoÏ hlavní odli‰ností je vyuÏití speciálních trinukleotidov˘ch Limitace mikroãipov˘ch anal˘z primerÛ (sekvence neuvedena) pro syntézu druhého fietûzce Po naskenování ãipÛ následuje obtíÏná fáze anal˘zy dat. V na‰í cDNA. práci jsme vyuÏili zku‰eností pracovi‰tû v anglickém Bir- Jak jiÏ bylo zmínûno v˘‰e jedním ze základních pfiedpokladÛ minghamu a kromû postupu uvedeného níÏe zde zmíníme pou- úspe‰né mikroãipové anal˘zy je kvalita RNA. Existují v‰ak ze nûkolik detailÛ t˘kajících se Affymetrix ãipÛ. Izzary a spo- pfiístupy, které umoÏÀují získat informaci také z degradované lupracovníci modifikovali zpÛsob hodnocení fluorescenãních RNA. Vût‰ina pfiístupÛ pro amplifikaci RNA pouÏívá oligo- signálÛ jednotliv˘ch prób na Affymetrix ãipech a srovnali jejich dT-T7 primer, kter˘ umoÏÀuje jednak pfiepis do cDNA (oligo- postup s algoritmy programÛ dChip (www.biostat.harvard.edu/ dT primer) a také in vitro transkripci pomocí T7-polymerázy complab/dchip) a komerãního programu Affymetrix (23). âipy (T7-promotor). Pfiepis do cDNA je tedy moÏn˘ pouze pro frag- Affymetrix jsou tvofieny oligonukleotidy o délce 25nt, které menty RNA obsahující poly-A signál. Xiang a spolupracov- jsou organizovány do tzv. probe sets pro jednotlivé geny (pro níci vyvinuli modifikovanou lineární amplifikaci pfii pouÏití vût‰inu genÛ je dostupn˘ vût‰í poãet probe sets). Tyto probe alternativního oligo-N9-T3 primeru (19). Náhodn˘ devíti-mer sets sestávají z 11 aÏ 20 párÛ tzv. perfect match (PM) a mis- (N9) umoÏÀuje pfiepis jakéhokoli fragmentu RNA do cDNA match (MM) oligonukleotidÛ, pfiiãemÏ uprostfied MM próby a k in vitro transkripci slouÏí promotor pro T3-polymerázu. (v pozici 13) je inkorporovan˘ chybn˘ nukleotid. Cílem toho- Tento postup vykazoval v degradovan˘ch vzorcích asi o tfieti- to pfiístupu je moÏnost lep‰í kontroly nespecifické hybridizace nu lep‰í záchyt rozdílnû exprimovan˘ch genÛ neÏ klasická oli- a hybridizaãní signály z tûchto prób jsou pfii klasické anal˘ze go-dT-T7 amplifikace. obvykle zohledÀovány. Izzary a spolupracovníci v‰ak ukazu- jí, Ïe matematická korekce probe sets pomocí tûchto MM prób pravdûpodobnû neodpovídá jejímu zam˘‰lenému biologické- mu v˘znamu a v jejich algoritmu hodnoty MM prób ignorují. Vedle konzistentnûj‰ích hodnot tzv. fold change, jejich pouÏi- tí RMA (Robust Multiarray Analysis) vykazovalo oproti Affy- metrix i dChip algoritmÛm více neÏ pûti-násobné sníÏení variance mezi replikáty. Tento aspekt je dÛleÏit˘ pro plánování experimentÛ a vzhledem k niÏ‰ímu poÏadavku na poãet repli- kátÛ má v˘znamn˘ ekonomick˘ dopad. V na‰í pfiedchozí práci jsme analyzovali telomerázovou aktivitu v prostatick˘ch bunûãn˘ch liniích po pÛsobení antiand- rogenu bicalutamidu (1). Pfies vysokou telomerázovou aktivitou v buÀkách LNCaP i DU145 nebyl transkript pro TERT (proteinová podjednotka telomezázy) pomocí mikroãipÛ dete- gován. Transkripty TERT pravdûpodobnû podléhají postran- skripãní úpravû, pfii které dochází ke ztrátû poly-A konce, kte- r˘ je nutn˘ pro reverzní transkripci. Expresi TERT v obou liniích jsme následnû potvrdili pomocí kvantitativní PCR v reálném ãase, která pro reverzní transkripci vyuÏívá speci- fické primery. Stabilita mRNA i jejího poly-A konce má pfii mikroãipové anal˘ze zásadní v˘znam a mechanismy její regulace jsou v literatufie diskutovány (24). Z na‰eho souãasného projektu upozorÀujeme na v˘znam ovûfiení mRNA signálÛ na jednotliv˘ch mikroãipech (Obr. 2). V rámci genÛ, hodnoce- n˘ch jako statisticky signifikantnû rozdílnû exprimované, mohou b˘t zahrnuty taktéÏ geny s velmi heterogenní nebo níz- kou expresí a jejich pouÏití pro interpretaci studovaného pro- blému mÛÏe b˘t zavádûjící. Na zásadní problém anal˘zy dat upozorÀují Michiels a spolu- pracovníci, ktefií znovu analyzovali mikroãipová data ze sedmi velk˘ch studií, které sestávaly alespoÀ ze 60 pacientÛ a poukazovaly na v˘znam anal˘zy genové exprese pro prognózu nádo- Obrázek 1.: Amplifikace RNA pomocí PCR. Detailní vysvûtlení této rového onemocnûní (25). Vzhledem k neadekvátní validaci metody je k dispozici v textu. Z v˘sledku agarozové elektroforézy vypl˘- v˘sledkÛ se publikované závûry ukázaly jako pfiíli‰ optimistic- vají optimální poãty cyklÛ pro druhou PCR (24 cyklÛ pro vzorek A a 27 ké, kdy pût ze sedmi studií neklasifikovaly pacienty lépe neÏ cyklÛ pro dal‰í dva vzorky). V˘sledné produkty jsou pouÏity pro in vitro transkripci, která je umoÏnûna inkorporací T7-promotoru. náhoda. Problém mikroãipov˘ch anal˘z pfiedstavuje také pou- Ïití rozdíln˘ch platforem. Van’t Veer a spolupracovníci defi- In vitro transkripci je moÏné kombinovat také s PCR amplifi- novali 70 genÛ, jejichÏ exprese by mohla diferencovat pacient- kací (20-22). Oligo-dT-T7 promotor je navíc spojen sPCR pri- ky s dobrou a ‰patnou prognózou karcinomu prsu (26). Obdobn˘ merem, kter˘ je inkorporován i pfii syntéze druhého fietûzce profil 76 genÛ definovali Wang a spolupracovníci (27). Pouze cDNA (Obr. 1). Nev˘hodou tohoto postupu je nutnost defino- tfii geny jsou v‰ak obûma profilÛm spoleãné, coÏ se vysvûtluje

362 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 pouÏitím odli‰n˘ch mikroãipÛ a matematick˘ch algoritmÛ pro maci o postranslaãních úpravách proteinÛ, které do znaãné míry anal˘zu dat (28). V této souvislosti Rogojina a spolupracovníci rozhodují o jejich biologické aktivitû. Dal‰ím problémem inter- analyzovali stejné vzorky pomocí dvou rozdíln˘ch mikroãipo- pretace v˘sledkÛ je doposud omezená nebo zcela chybûjící v˘ch platforem, Clontech a Affymetrix, a jako nezávislé ovûfie- informace o biologické funkci fiady genÛ. Pfies tyto obtíÏe je mik- ní pouÏili q-RT-PCR a ãásteãnû i western blot anal˘zu (29). roãipová anal˘za ve spojení s dal‰ími metodami, které verifi- Pokud byly vzorky hodnoceny opakovanû pomocí stejn˘ch ãipÛ, kují její v˘sledky, velmi v˘konn˘m a nadále slibn˘m pfiístupem obû platformy vykazovaly vysokou míru konzistence. Av‰ak pro studium nejen humánních chorob, ale biologie jako celku. pokud byly v˘sledky získané pomocí ãipÛ Clontech Atlas Glass 3.8 a Affymetrix U95A/U133A srovnány mezi sebou, ukázala Metodika optimalizovaná v na‰ich a spolupracujících labo- se velmi malá shoda. V˘sledky q-RT-PCR lépe korelovaly ratofiích s Affymetrix (85%) neÏ s Clontech (33%) a taktéÏ western blot Pfiíprava kryofiezÛ, laserová mikrodisekce a izolace RNA. anal˘za se shodovala spí‰e s Affymetrix platformou. Nádorová i normální tkáÀ byly zhodnoceny erudovan˘m pato- 2a) Gen CDH1 vykazuje vysoké a homogenní hodnoty. logem ihned po operaci, zmraÏeny v kapalném dusíku a skla- dovány pfii -80°C. Kryofiezy 7-8 μm byly pfiipraveny v kryos- tatu (Leica CM1850), jehoÏ pracovní plochy byly oãi‰tûny pomocí RNaseZap (Sigma, USA). ¤ezy byly ihned fixovány v acetonu, obarveny hematoxylinem a dehydratovány v alko- holu a xylenu. Pfied samotnou mikrodisekcí byly nabarvené fiezy krátkodobû skladovány v uzavfien˘ch zkumavkách se sili- cagelem (Sigma). Bûhem celého postupu byly pouÏívány nástroje zbavené RNáz a v‰echny roztoky byly pfiipraveny v DEPC-vodû. PfiibliÏnû 1500 bunûk studovan˘ch bunûãn˘ch populací bylo mikrodisekováno pomocí VeritasTM Laser Cap- ture Microdissection System (Arcturus Bioscience, USA; Laboratofi Experimentální Medicíny, Olomouc) podle stan- dardního protokolu. Mikrodisekované buÀky na speciálních discích byly ihned lyzovány v pufru RNesy Micro kitu (Qia- gen, Nûmecko). Úplná l˘ze bunûk byla provedena inkubací pfii 2b) Statistické hodnocení diferenciální exprese genu CPB1 je ovlivnûno jeho 42°C po dobu 30 minut a následovala izolace RNA pomocí velmi vysokou expresí ve vzorcích 8T a 13T. zmínûného kitu nebo skladování pfii -80°C. Pro kvantifikaci RNA byl pouÏit spektrofotometr Nanodrop (Nanodrop Tech- nologies, USA; Biofyzikalní Ústav AV âR, Brno). Amplifikace RNA, znaãení a hybridizace. Padesát nanogramÛ celkové RNA bylo pfievedeno do cDNA a následnû amplifiko- váno pomocí Microarray Target Amplification Kit (Roche Dia- gnostics, Svycarsko). Pfiesnûji, pro pfiepis do cDNA byl pouÏit modifikovan˘ oligo-dT primer (TAS-T7 Oligo (dT)24). Speci- ální sekvence TAS (Target Amplification Sequence), která nevy- kazuje homologii k Ïádn˘m znám˘m sekvencím a umoÏÀuje následnou amplifikaci pomocí PCR, je inkorporována i pfii syn- téze druhého fietûzce cDNA pomocí TAS-(dN)10 primeru (Obr. 1). Po purifikaci cDNA pomocí Microarray Target Purification Kit (Roche) byla provedena PCR s TAS primery opût pomocí Microarray Target Amplification Kit. Aby nedo‰lo ke zkreslení 2c) Exprese transkriptu LOC63920 je relativnû homogenní, ale celkovû níz- informace o genové expresi bûhem pozdních fází PCR, byl opti- ká exprese nadhodnocuje v˘znam tzv. násobné zmûny. mální poãet cyklÛ urãen v pfiedbûÏné PCR a kontrolou produk- tÛ z cyklÛ 21, 24, 27, 30 a 33 pomocí agarozové elektroforézy. PCR produkty z druhé, optimalizované PCR byly pfieãi‰tûny pomocí Microarray Target Purification Kit a pouÏity pro in vitro transkripci. Pomocí Microarray RNA Target Synthesis Kit T7 (Roche) byly do finální cRNA inkorporovány biotin-14-CTP (Invitrogen, USA) a biotin-16-UTP (Roche). Znaãená cRNA byla purifikována pomocí Microarray Target Purification Kit, spektrofotometricky kvantifikována a zkontrolována pomocí agarozové elektroferézy. Monitorování celého procesu amplifikace a znaãení umoÏnil GeneChip® Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit (Affymetrix, USA). Jeho definovanû fiedûné exo- genní pozitivní kontroly byly pfiidány do v‰ech vzorkÛ pfied syn- tézou cDNA a byly detegovány na cílov˘ch ãipech Human Geno- me U133 Plus 2.0 Arrays (Affymetrix). Pfied samotnou hybridizací bylo vÏdy 25 μg biotinylované cRNA fragmentová- Obrázek 2.: V˘znam kontroly dat z jednotliv˘ch ãipÛ pro geny hodno- no a pouÏito pro pfiípravu hybridizaãní smûsi. Proces fragmen- cené jako rozdílnû exprimované. Barevnû jsou odli‰eny ãtyfii bunûãné popu- tace, kter˘ umoÏÀuje efektivní hybridizaci koligonukleotidov˘m lace, pfiiãemÏ jsou komentovány tfii geny, které byly statisticky hodnocené jako rozdílnû exprimované mezi dvûmi populacemi vpravo. probám, byl zkontrolován pomocí agarozové elektroforézy. Hyb- ridizaãní smûs standardnû obsahuje biotinylované hybridizaãní PouÏití mikroãipÛ umoÏÀuje analyzovat genovou expresi celé- kontroly z GeneChipTM Eukaryotic Hybridization Control Kit ho genomu, ale pot˘ká se pfiitom nejen s jiÏ uveden˘mi problé- (Affymetrix). Syntetick˘ oligonukleotid B2 hybridizuje ke spe- my. Pfiedev‰ím poskytuje informaci na úrovni mRNA, která cifick˘m místÛm na ãipu a umoÏÀuje programu GCOS (Gene nemusí odpovídat expresi proteinÛ, které jsou zodpovûdné za Chip Operating Software, Affymetrix) správnû umístit mfiíÏku samotnou biologickou funkci. NemÛÏe také poskytnout infor- oddûlující jednotlivé signály po naskenování celého ãipu (Obr.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 363 3). Dal‰í neeukaryotické hybridizaãní kontroly (geny syntetické deseti pacientek pomocí programÛ Microsoft Excel a Access. dráhy E. coli pro biotin a gen pro rekombinázu bakteriofága P1) Rank Products anal˘za byla provedena pomocí modulu Rank- umoÏÀují kontrolu hybridizaãního kroku ikvality vlastního ãipu. Prod v programu Bioconductor http://www.bioconductor.org/), Vzhledem k vysoké cenû ãipÛ Human Genome U133 Plus 2.0 pfiiãemÏ mezní procento fale‰n˘ch pozitivit bylo stanoveno na Arrays byla provedena nejdfiíve hybridizace, barvení i skenová- 10%. Diferenciálnû exprimované geny mezi jednotliv˘mi ní na ãipech Test3 Array za úãelem ovûfiení kvality celého pro- bunûãn˘mi populacemi byly dále analyzovány pomocí online cesu pfiípravy znaãené cRNA. Hybridizaãní smûs byla pfiitom databáze DAVID (Database for Annotation, Visualization and pfiipravena jiÏ pro oba ãipy najednou. Hybridizace probíhala 16 Integrated Discovery, http://david.abcc.ncifcrf.gov). Vzhledem hodin pfii 45°C a 60 rpm v hybridizaãní peci. Prom˘vání, barve- ke komplikovanému systému Gene Ontology, kter˘ je stra- ní streptavidin-phycoerythrinem i skenování byly fiízeny pro- tifikován do tfií skupin (biologick˘ proces, molekulární gramem GCOS v prom˘vacím automatu a skeneru. funkce a bunûãná lokalizace) a pûti úrovní, jsme profunkãní anotaci genÛ pouÏili tzv. Functional Categories (SP_PIR_Key- words), které umoÏnily snaz‰í orientaci v získan˘ch v˘sled- cích. Detailnûj‰í informace o jednotliv˘ch genech byly získá- ny z dal‰ích volnû dostupn˘ch databází, pfiedev‰ím z Gene Cards (www.genecards.org) a NETAFFX Analysis Center (www.affymetrix.com/analysis).

Obr. 3. Affymetrix Test3 Array. Hybridizaãní kontroly vytváfií rám a definované rohy ãipu a umoÏÀují tak správné poãítaãové pfiiloÏení mfiíÏ- ky, která oddûluje signály pro jednotlivé próby. Anal˘za dat. Naskenované ãipy byly analyzovány pomocí GCOS se základním nastavením, s vyjímkou cílového signálu definovaného na hodnotu 100. Relativní expresní hladiny Obrázek 4.: Anal˘za podobnosti genov˘ch profilÛ. Vzájemná podob- mRNA byly definovány normalizovan˘mi hodnotami signálu. nost kompletních expresních profilÛ tfiiceti vzorkÛ byla hodnocena pomo- Vzájemná podobnost kompletních expresních profilÛ v‰ech cí Pearsonov˘ch korelaãních koeficientÛ a zobrazena jako tzv. sample cor- vzorkÛ byla hodnocena pomocí Pearsonov˘ch korelaãních koe- relation heatmap. Na ose x i y jsou jednotlivé vzorky (jejich ãíslování ficientÛ. Jejich korelaãní matrix byla graficky zobrazena jako neuvádíme) a jednotlivé barevné body odpovídají korelaãním koeficien- tzv. Heatmap (Obr. 4) pomocí pfiíslu‰né funkce v programova- tÛm pro srování kaÏdého vzorku s kaÏd˘m. âím vy‰‰í korelace, tím je barva více ãervená a naopak níÏ‰í korelace odpovídá odstínÛm modré barvy. cím prostfiedí R (http://www.r-project.org/). Podobnost kom- Uhlopfiíãka reprezentuje absolutní korelaci stejn˘ch vzorkÛ. pletních expresních profilÛ byla hodnocena také metodou PCA (Principal components analysis) pomocí PLS_Toolbox (Ver- Podûkování sion 3.5, Eigenvector Research, USA) v programu Matlab (Ver- Srdeãnû dûkujeme v‰em sv˘m spolupracovníkÛm za spolu- sion 7.1, The MathWorks, USA). Rozdílnû exprimované geny práci pfii laserové mikrodisekci (Marta Dziechciarková, Mari- mezi jednotliv˘mi bunûãn˘mi typy byly identifikovány jednak an Hajdúch), pfii zpracování mikroãipÛ a anal˘ze dat (Karl pomocí analyzaãního algoritmu v GCOS a také pomocí tzv. Baumforth, Wenbin Wei) a za ve‰kerou dal‰í technickou Rank Products a RMA (Robust Multiarray analysis) (23, 30). pomoc a odborné diskuze (Jifiina Zatloukalová, Jana Bûláko- V rámci GCOS anal˘zy bylo provedeno nejprve srovnání vá, Irena Koutná, Katefiina Bouchalová, David Friedeck˘, bunûãn˘ch populací v rámci jednotliv˘ch pacientek a násled- Jifií Drábek, Jifií Klein). Tato práce byla podpofiena granty nû byly filtrovány geny s nejvy‰‰ím poãtem zmûn v rámci v‰ech NR 7844-3 a MSM 6198959216.

Literatura 5. Perlmutter MA, Best CJ, Gillespie JW, et al. Comparison of snap freezing 1. Bouchal J, Baumforth KR, Svachova M, et al. Microarray analysis of bica- versus ethanol fixation for gene expression profiling of tissue specimens. lutamide action on telomerase activity, p53 pathway and viability of pro- J Mol Diagn 2004;6:371-7. state carcinoma cell lines. J Pharm Pharmacol 2005;57:83-92. 6. Gillespie JW, Gannot G, Tangrea MA, et al. Molecular profiling of cancer. 2. Taylor TB, Nambiar PR, Raja R, et al. Microgenomics: Identification of Toxicol Pathol 2004;32 Suppl 1:67-71. new expression profiles via small and single-cell sample analyses. Cyto- 7. Kabbarah O, Pinto K, Mutch DG, Goodfellow PJ. Expression profiling of metry A 2004;59:254-61. mouse endometrial cancers microdissected from ethanol-fixed, paraffin- 3. Goldsworthy SM, Stockton PS, Trempus CS, et al. Effects of fixation on embedded tissues. Am J Pathol 2003;162:755-62. RNA extraction and amplification from laser capture microdissected 8. Qin Y, Heine VM, Karst H, et al. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: tissue. Mol Carcinog 1999;25:86-91. comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Methods 2003;131:205-11. 4. Kim JO, Kim HN, Hwang MH, et al. Differential gene expression analy- 9. Fend F, Emmert-Buck MR, Chuaqui R, et al. Immuno-LCM: laser captu- sis using paraffin-embedded tissues after laser microdissection. J Cell Bio- re microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. chem 2003;90:998-1006. Am J Pathol 1999;154:61-6.

364 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 10. Uneyama C, Shibutani M, Masutomi N, et al. Methacarn fixation for geno- ated global mRNA amplification and its integration into microarray ana- mic DNA analysis in microdissected, paraffin-embedded tissue specimens. lysis on laser-captured cells. Biochem Biophys Res Commun J Histochem Cytochem 2002;50:1237-45. 2003;300:915-20. 11. Michel C, Desdouets C, Sacre-Salem B, et al. Liver gene expression pro- 21. Klur S, Toy K, Williams MP, Certa U. Evaluation of procedures for ampli- files of rats treated with clofibric acid: comparison of whole liver and laser fication of small-size samples for hybridization on microarrays. Genomics capture microdissected liver. Am J Pathol 2003;163:2191-9. 2004;83:508-17. 12. Ginsberg SD, Che S. Combined histochemical staining, RNA amplificati- 22. Ji W, Zhou W, Gregg K, et al. A method for gene expression analysis by on, regional, and single cell cDNA analysis within the hippocampus. Lab oligonucleotide arrays from minute biological materials. Anal Biochem Invest 2004;84:952-62. 2004;331:329-39. 13. Thelen P, Burfeind P, Grzmil M, et al. cDNA microarray analysis with 23. Irizarry RA, Bolstad BM, Collin F, et al. Summaries of Affymetrix Gene- amplified RNA after isolation of intact cellular RNA from neoplastic and Chip probe level data. Nucleic Acids Res 2003;31:e15. non-neoplastic prostate tissue separated by laser microdissections. Int 24. Ross J. mRNA stability in mammalian cells. Microbiol Rev J Oncol 2004;24:1085-92. 1995;59:425-50. 14. Zabzdyr JL, Lillard SJ. UV- and visible-excited fluorescence of nucleic 25. Michiels S, Koscielny S, Hill C. Prediction of cancer outcome with micro- acids separated by capillary electrophoresis. J Chromatogr arrays: a multiple random validation strategy. Lancet 2005; 365: 488-92. A 2001;911:269-76. 26. van ‘t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al. Gene expression pro- 15. Raff T, van der Giet M, Endemann D, et al. Design and testing of beta-actin filing predicts clinical outcome of breast cancer. Nature primers for RT-PCR that do not co-amplify processed pseudogenes. Bio- 2002;415:530-6. techniques 1997;23:456-60. 27. Wang Y, Klijn JG, Zhang Y, et al. Gene-expression profiles to predict distant 16. Eberwine J, Yeh H, Miyashiro K, et al. Analysis of gene expression in sing- metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer. Lancet le live neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 1992;89:3010-4. 2005;365:671-9. 17. Jenson SD, Robetorye RS, Bohling SD, et al. Validation of cDNA micro- 28. Weigelt B, Peterse JL, van ‘t Veer LJ. Breast cancer metastasis: markers array gene expression data obtained from linearly amplified RNA. Mol Pat- and models. Nat Rev Cancer 2005;5:591-602. hol 2003;56:307-12. 29. Rogojina AT, Orr WE, Song BK, Geisert EE Jr. Comparing the use of Affy- 18. Baugh LR, Hill AA, Brown EL, Hunter CP. Quantitative analysis of mRNA metrix to spotted oligonucleotide microarrays using two retinal pigment amplification by in vitro transcription. Nucleic Acids Res 2001;29:E29. epithelium cell lines. Mol Vis 2003;9:482-96. 19. Xiang CC, Chen M, Ma L, et al. A new strategy to amplify degraded RNA 30. Breitling R, Armengaud P, Amtmann A, Herzyk P. Rank products: from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res a simple, yet powerful, new method to detect differentially regula- 2003;31:e53. ted genes in replicated microarray experiments. FEBS Lett 2004; 20. Aoyagi K, Tatsuta T, Nishigaki M, et al. A faithful method for PCR-medi- 573: 83-92.

STATISTICKÉ METODY V ANAL¯ZE DAT Z DNA MIKROâIPÒ STATISTICAL METHODS FOR ANALYSING GENE EXPRESSION MICROARRAY DATA PAVLÍK T.1,2,*, JARKOVSK¯ J.1 1 INSTITUT BIOSTATISTIKY A ANAL¯Z, P¤ÍRODOVùDECKÁ A LÉKA¤SKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITYBRNO 2 KATEDRA APLIKOVANÉ MATEMATIKY, P¤ÍRODOVùDECKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY, BRNO Souhrn Mohutn˘ rozvoj molekulárnû biologick˘ch metod v posledních deseti letech je charakterizován produkcí velké- ho mnoÏství dat. Nejinak je tomu i v pfiípadû technologie DNA mikroãipÛ, která umoÏÀuje v jednom experimentu sledovat expresi desítek tisíc genÛ najednou. Kvantum získan˘ch experimentálních dat je v‰ak pro relevantní medicínské závûry nutné vhodnû analyzovat a interpretovat. Tento ãlánek je vûnován statistick˘m metodám, které lze pro hodnocení dat získan˘ch z DNA mikroãipÛ pouÏít. Tyto metody lze rozdûlit do tfií velk˘ch skupin: shlukovací metody, metody pro identifikaci rozdílnû exprimova- n˘ch genÛ a klasifikaãní metody. Shlukovací metody slouÏí k nalezení homogenních skupin pacientÛ s podob- n˘m expresním profilem nebo skupin genÛ s podobn˘m chováním, metody pro identifikaci rozdílnû exprimova- n˘ch genÛ hledají geny specifické svojí aktivitou pro urãitou biologickou tkáÀ, zatímco klasifikaãní metody slouÏí k nalezení diskriminaãního pravidla pro pfiesnou diagnostiku nov˘ch pacientÛ do jedné z definovan˘ch skupin. Klíãová slova: DNA mikroãipy, statistická anal˘za, shlukování, testování rozdílné exprese, klasifikaãní metody

Summary Last decade led to massive progress in the molecular biology methods which was accompanied by the producti- on of large amount of data. This is also the case of the gene expression microarray technology that makes it fea- sible to study thousands of genes simultaneously. However, for relevant medical inference there is the need for appropriate evaluation and interpretation of this large quantity of experimental data. This paper is dedicated to statistical methods that can be used for the evaluation of gene expression data. These methods can be split into three main categories: clustering methods, methods for identification of differentially expressed genes and classification techniques. Clustering methods can be used for finding of homogenous groups of patients or genes with similar expression profile, methods for identification of differentially expressed genes find genes specific for activity of certain biological tissue while classification techniques are used for setting up a discrimination rule for precise diagnostics of newly diagnosed patients to one of the previously defined classes. Keywords: DNA microarrays, statistical analysis, clustering, testing for differential expression, classification techniques

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 365 Úvod rimentu podobné chování, nebo skupin pacientÛ s podobn˘m Mohutn˘ rozvoj molekulárnû biologick˘ch metod v posled- expresním profilem. Ke shlukování se pouÏívají jak klasické ních deseti letech je charakterizován produkcí velkého mnoÏ- metody (metoda k-prÛmûrÛ [2], hierarchické metody [4]), tak ství dat. Nejinak je tomu i v pfiípadû technologie DNA mik- metody pouÏívané zejména v informaãních technologiích roãipÛ [1], která umoÏÀuje v jednom experimentu sledovat (self-organizing maps [5]). Do druhé skupiny patfií metody, expresi desítek tisíc genÛ najednou, coÏ ji fiadí mezi nejpou- jejichÏ úkolem je vytipovat podezfielé geny mezi v‰emi zkou- Ïívanûj‰í biologické metody dne‰ka. Kvantum získan˘ch man˘mi, tedy geny, které by mohly b˘t zodpovûdné za rÛzné experimentálních dat je v‰ak pro relevantní medicínské závû- vlastnosti biologick˘ch vzorkÛ. Jedná se zejména o metody ry nutné vhodnû analyzovat a interpretovat [2]. K tomu slou- násobného testování hypotéz zaloÏené na t-statistice a jejích Ïí biostatistické metody a postupy, mnohdy neobvyklé a zce- modifikacích. Úkolem klasifikaãních metod je na základû la pfiizpÛsobené charakteru dat z DNA mikroãipÛ. Pomocí v˘sledku experimentu, tedy získan˘ch intenzit genové expre- tûchto metod lze dosáhnout takov˘ch cílÛ jako je napfiíklad se, zafiadit zkouman˘ vzorek do nûkteré z definovan˘ch tfiíd. identifikace genÛ specifick˘ch svojí aktivitou pro urãitou bio- Metod pouÏívan˘ch k hodnocení dat z DNA mikroãipÛ je vel- logickou tkáÀ nebo genÛ s rozdílnou expresí mezi dvûma sku- mi mnoho a jsou neustále vylep‰ovány, ale stejnû jako v jin˘ch pinami biologick˘ch vzorkÛ, nalezení homogenních skupin oblastech matematiky nelze fiíci, Ïe by nûjaká z tûchto metod pacientÛ s podobn˘m expresním profilem nebo skupin genÛ byla nejlep‰í a její v˘sledky ty nejsprávnûj‰í. s podobn˘m chováním ãi nalezení diskriminaãního pravidla pro pfiesnou diagnostiku nov˘ch pacientÛ do jedné z definovan˘ch skupin. Schematické znázornûní základních cílÛ expe- rimentÛ s pouÏitím DNA mikroãipÛ a statistické metody k jejich dosaÏení jsou uvedeny na obrázku 1. Statistická anal˘za navazuje na fáze anal˘zy obrazu a normalizace dat a je tak poslední ãástí microarray experimentu, její v˘sledky jsou v‰ak na tûchto i pfiedchozích biologic- k˘ch fázích experimentu zcela závislé ve smyslu jejich kvalitního provedení a tudíÏ kvalitních vstupních dat. Pro- to se statistické principy promítají nejen do fáze anal˘zy obrazu a normalizace dat, ale i do samotné pfiípravy experimentu ve formû experimentálního designu.

Problémy KvÛli podstatû DNA mikroãipÛ se statistická anal˘za tohoto typu dat pot˘ká s nejrÛznûj‰ími obtíÏemi, které nûkdy nelze pomocí stávajících metod uspokojivû vyfie‰it, coÏ následnû vede k v˘voji nov˘ch biostatistick˘ch postupÛ specializova- n˘ch pro anal˘zu expresních dat. Zásadní problémy jsou tyto: 1. Velk˘ poãet sledovan˘ch promûnn˘ch - genÛ. Nejvût‰í v˘hoda microarray experimentu je zároveÀ i jeho nejvût‰í slabinou, neboÈ velmi málo statistick˘ch metod se umí Obrázek 1.: Základní cíle v anal˘ze DNA mikroãipÛ a statistické meto- vypofiádat s desítkami tisíc promûnn˘ch najednou. dy k jejich dosaÏení. 2. Malá velikost experimentálního vzorku – pacientÛ. Stu- Shlukovací metody die jsou limitovány jak finanãní nároãností DNA ãipÛ tak Shluková anal˘za je jednou z nejpouÏívanûj‰ích vícerozmûr- omezen˘m poãtem dostupn˘ch pacientÛ. Vût‰ina publiko- n˘ch statistick˘ch metod, a to jak obecnû, tak i v pfiípadû van˘ch prací je postavena pouze na vzorku v fiádu desítek expresních dat. Jedná se o explorativní techniku, která se pou- pacientÛ. Ïívá zejména v pfiípadech, kdy nemáme Ïádné a priori znalosti 3. Chybûjící hodnoty. Chybûjící hodnoty vznikají na mís- o struktufie uvnitfi dat. Úkolem shlukovacích metod je tedy najít tech podezfiel˘ch spotÛ, které jsou buì manuálnû nebo auto- v datech skupiny prvkÛ (shluky) tak, Ïe prvky jednotliv˘ch maticky vylouãeny z dal‰í anal˘zy. Spoty mohou b˘t vylou- skupin budou v jistém smyslu více podobné neÏ prvky z rÛz- ãeny z více dÛvodÛ, napfi. kvÛli prachu a ‰krábancÛm na n˘ch skupin, tzn. nalezené skupiny prvkÛ budou co nejvíce mikroãipu, deformovanému obrazu nebo ‰patnému nati‰- homogenní. V pfiípadû DNA mikroãipÛ jsou shlukovány tûní. Nejjednodu‰‰í doplnûní chybûjících hodnot je meto- zejména geny a experimentální vzorky (pacienti). Jednodu‰e dou fiádkového prÛmûru, kdy je chybûjící hodnota nahra- fieãeno, snaÏíme se nalézt mezi zkouman˘mi geny (resp. bio- zena prÛmûrem ostatních expresních hodnot daného genu. logick˘mi vzorky) skupinky genÛ (resp. biologick˘ch vzor- Troyanskaya a kol. [3] navrhují pouÏít pro dopoãítání chy- kÛ), které vykazují v prÛbûhu experimentu, tedy za pÛsobení bûjící hodnoty metodu k nejbliÏ‰ích sousedÛ, kdy je chy- specifick˘ch podmínek, podobné chování. bûjící hodnota daného genu urãena jako prÛmûr odpovída- Mírou podobnosti dvou prvkÛ (aÈ jiÏ genÛ nebo pacientÛ) je v tom- jících hodnot u k nejpodobnûj‰ích genÛ. Tento pfiístup je to pfiípadû matematická metrika neboli vzdálenost, k nejvhod- vhodnûj‰í, neboÈ bere v úvahu funkãní vztahy mezi jedno- nûj‰ím patfií euklidovská vzdálenost, která odpovídá námi vní- tliv˘mi geny. mané vzdálenosti ve trojrozmûrném prostoru, a korelaãní vzdálenost, která odráÏí závislost expresních hodnot dvou prvkÛ. Statistické metody Volba pouÏité vzdálenosti vÏdy závisí na okolnostech daného Metody pouÏívané pro statistickou anal˘zu dat získan˘ch experimentu. Pfii pouÏití shlukovacích metod je v‰ak nutné mít na z DNA mikroãipÛ se dají rozdûlit do tfií velk˘ch skupin: shlu- pamûti, Ïe tyto metody jsou urãeny k hledání a nalezení shlukÛ kovací metody, metody pro identifikaci rozdílnû exprimova- v datech, a to i v pfiípadû, Ïe se v datech Ïádná vnitfiní struktura n˘ch genÛ a klasifikaãní metody. Cílem shlukovacích metod nenachází. Z toho plyne, Ïe v˘sledky shlukovací anal˘zy nelze mÛÏe b˘t nalezení skupin genÛ, které vykazují v prÛbûhu expe- brát jako dogma a je nutné je vÏdy konzultovat s expertem.

366 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Nûkteré metody (napfi. níÏe zmínûná metoda k-prÛmûrÛ) poÏa- • Anal˘za rozptylu. Nûktefií autofii povaÏují normalizaci dují jako vstupní informaci poãet shlukÛ, které má daná pro- expresních hodnot, která pfiedchází statistické anal˘ze, za cedura vytvofiit, proto je nutné poãet skupin v datech nûjak˘m zbyteãnou a pouÏívají pro identifikaci v˘znamn˘ch genÛ zpÛsobem pfiedem odhadnout. Tento odhad mÛÏeme buì zís- anal˘zu rozptylu [12], v níÏ pomocí parametrÛ modelují vliv kat od klinického experta nebo pouÏitím matematick˘ch algo- rÛzn˘ch sloÏek experimentu na expresní hodnoty. ritmÛ, jako napfi. procedury silhouette width [6]. Pfiíkladem shlukovacích metod vhodn˘ch pro expresní data Klasifikaãní metody jsou následující procedury: Principem klasifikaãních metod v anal˘ze dat z DNA mikro- • Metoda k-prÛmûrÛ. Podstatou této jednoduché, a proto ãipÛ je vytvofiení rozhodovacího pravidla, které by na základû oblíbené, procedury je rozdûlení prvkÛ do skupin tak, aby namûfien˘ch hodnot genové exprese umoÏÀovalo pfiifiazení byla minimalizována vnitroshluková variabilita a zároveÀ pacienta do jedné z pfiedem definovan˘ch tfiíd (napfiíklad zdra- maximalizována mezishluková variabilita . v˘, nemocn˘). Z toho je zfiejmé, Ïe by se „dobré“ rozhodova- • Hierarchické metody. Principem hierarchick˘ch metod je cí pravidlo zaloÏené na expresních datech mohlo zafiadit po postupná tvorba shlukÛ, kdy v kaÏdém kroku jsou spojeny dva bok stávajících diagnostick˘ch metod a v˘raznû tak pfiispût ke nejpodobnûj‰í geny nebo skupiny genÛ. Tento heuristick˘ pfií- zpfiesnûní diagnostiky závaÏn˘ch onemocnûní. stup zaji‰Èuje minimální vnitroshlukovou variabilitu. Klasifikaãní pravidlo je vytvofieno vtzv. trénovací fázi, kdy daná • Self-organizing maps. Jedná se o jeden z mnoha algoritmÛ metoda studuje dostupná data (tzv. trénovací data) a uãí se pfii- ze skupiny neuronov˘ch sítí. Shluky jsou reprezentovány fiazovat pacienty do jednotliv˘ch tfiíd dle jejich expresního pro- jako uzly dvourozmûrné mfiíÏky, které se iterativnû adaptu- filu. Trénovací data musí b˘t samozfiejmû pfiedem validovaná jí na data v prostoru. V˘hodou tohoto algoritmu je, Ïe sou- v tom smyslu, Ïe u kaÏdého pacienta musí b˘t jednoznaãnû urãe- sední uzly v mfiíÏce odpovídají podobn˘m shlukÛm, v˘sled- no, do které tfiídy patfií. Mûfiítkem kvality klasifikaãních metod né uspofiádání tudíÏ odráÏí nejen podobnost prvkÛ ve je tzv. pravdûpodobnost misklasifikace, coÏ je pravdûpodobnost shlucích, ale i podobnost mezi shluky. pfiifiazení pacienta do nesprávné kategorie, kterou lze získat pou- • Metody zaloÏené na matematickém modelu. Tyto meto- Ïitím klasifikaãního pravidla na tzv. validaãní data. dy [7] pfiedpokládají, Ïe expresní hodnoty prvkÛ kaÏdého Pro klasifikaci se vût‰inou pouÏívá pouze ãást z promûnn˘ch shluku lze popsat matematickou funkcí, která se mezi shlu- (genÛ) tvofiících expresní profil pacienta. Je to dáno tím, Ïe ky li‰í pouze v nûkolika parametrech. Cílem je tedy odhad mnoho genÛ nemá vzhledem ke sledovan˘m tfiídám dostateã- tûchto parametrÛ pro jednotlivé shluky a následné pfiifiazení nou diskriminaãní schopnost, buì proto, Ïe jsou neaktivní, genu ke shluku, do nûjÏ patfií s nejvût‰í pravdûpodobností. nebo proto, Ïe se u obou skupin pacientÛ chovají stejnû. Vlast- nímu pouÏití klasifikaãní procedury by tedy mûl pfiedcházet Metody pro identifikaci rozdílnû exprimovan˘ch genÛ v˘bûr k tomuto úãelu vhodn˘ch genÛ pomocí metod pro iden- âast˘m a velmi dÛleÏit˘m cílem microarray experimentÛ je tifikaci rozdílnû exprimovan˘ch genÛ. identifikace rozdílnû exprimovan˘ch genÛ, tedy genÛ, jejichÏ Z klasifikaãních metod pouÏívan˘ch pro hodnocení expres- hladina exprese se li‰í mezi dvûma (nebo více) biologick˘mi ních dat lze vybrat následující pfiíklady: vzorky. MÛÏeme napfiíklad zkoumat geny odpovûdné za funkci rÛzn˘ch druhÛ tkání, geny odpovûdné za pfiemûnu zdravé • Lineární diskriminaãní anal˘za a její modifikace. Dis- tkánû v nádorovou nebo geny jednoznaãnû determinující jed- kriminaãní metody [13] pfiedpokládají, Ïe data v jednotli- notlivé nádorové tkánû. Znalost rozdílnû exprimovan˘ch genÛ v˘ch tfiídách jsou normálnû rozdûlená. Úkolem tûchto metod je zajímavá nejen z hlediska pfiímé interpretace, ale také z hle- je pak odhadnout z trénovacích dat parametry pro sledova- diska pouÏití této znalosti ke zpfiesnûní klasifikaãních metod. né skupiny, coÏ následnû umoÏÀuje zafiadit nového pacien- Vzhledem k tomu, Ïe pfii hodnocení genové exprese pracujeme ta do tfiídy dle maximální pravdûpodobnosti. nûkdy i s desítkami tisíc genÛ zároveÀ, setkáváme se zde s tzv. pro- • Metoda k nejbliÏ‰ích sousedÛ (k-NN). Princip této jedno- blémem násobného testování hypotéz [8]. Ten spoãívá v tom, Ïe duché metody je takov˘, Ïe z trénovacích dat vybereme s narÛstajícím poãtem hodnocen˘ch genÛ nám enormnû roste také k pacientÛ, ktefií jsou sv˘mi expresními profily nejbliÏ‰í (ve pravdûpodobnost toho, Ïe se pfii na‰em testování genÛ zm˘líme smyslu matematické vzdálenosti) expresnímu profilu nové- aoznaãíme jako v˘znamn˘ gen, kter˘ ve skuteãnosti Ïádnou infor- ho pacienta, a následnû ho pfiifiadíme do té skupiny, která má maci o zkouman˘ch vzorcích neobsahuje. KaÏdá metoda se s tím- mezi tûmito k pacienty nejpoãetnûj‰í zastoupení [14]. to problémem vypofiádává po svém, ale v Ïádném pfiípadû nelze • Support Vector Machines (SVM). Tato pomûrnû nová kla- fiíci, Ïe by tento problém byl uspokojivû vyfie‰en. Zde jsou nûkte- sifikaãní metoda se snaÏí najít mezi uvaÏovan˘mi tfiídami ré pfiíklady metod pro identifikaci v˘znamn˘ch genÛ: rovinu, která by je co nejlépe vzájemnû oddûlovala. SVM [15] jsou proto zejména vhodné pro klasifikaci, kdy uvaÏu- • T-test a jeho modifikace. Principem této skupiny metod [9] jeme pouze dvû rozdílné tfiídy. je v˘poãet ãíselného skóre pro kaÏd˘ gen, které odráÏí roz- • Klasifikaãní stromy. Jsou zaloÏeny na postupném ‰tûpení díl v genové expresi mezi sledovan˘mi podmínkami, datového souboru dle jednotliv˘ch promûnn˘ch (genÛ) [16]. a následné urãení prahové hodnoty, nad níÏ lze skóre pova- Promûnné, podle nichÏ se soubor ‰tûpí, jsou vybrány tak, Ïovat za statisticky v˘znamné. Jako skóre se vût‰inou pou- aby mûly co nejlep‰í schopnost oddûlit uvaÏované tfiídy. Ïívá klasická t-statistika, nûktefií autofii v‰ak odvodili svá vlastní skóre, pfiiãemÏ ve vût‰inû pfiípadÛ se jedná o modi- Závûr fikace t-statistiky. V tomto ãlánku jsme se zamûfiili na statistické metody a postu- • Significance Analysis of Microarrays (SAM). Tato pro- py pouÏitelné pro hodnocení v˘sledkÛ DNA microarray expe- cedura [10] je také zaloÏena na skóre odvozeném od t-stati- rimentÛ. Je patrné, Ïe spektrum metod vhodn˘ch k dosaÏení stiky, ale vzhledem k její popularitû je vhodné ji uvést zvlá‰È. odpovûdí na otázky v oblasti v˘zkumu genové exprese je vel- Její v˘hodou je, Ïe pro urãení prahové hodnoty oddûlující mi ‰iroké. Otázky, a tedy i statistické metody, lze rozdûlit do v˘znamné a nev˘znamné geny pouÏívá SAM permutace, tfií hlavních kategorií. Na první skupinu nejzákladnûj‰ích otá- které umoÏÀují vyhnout se nûkter˘m pfiedpokladÛm ménû zek t˘kajících se vnitfiní struktury dat nám dávají odpovûì shlu- propracovan˘ch metod. kovací procedury, jejichÏ úkolem je nalezení co nejpodobnûj- • Optimal Discovery Procedure. Storey akol. [11] odvodili pro- ‰ích skupin prvkÛ, aÈ uÏ genÛ nebo pacientÛ. Druhou sadu ceduru, která pfii hodnocení exprese jednotliv˘ch genÛ bere do otázek zab˘vajících se rozdílnou aktivitou genÛ ve sledova- úvahy také hodnoty exprese ostatních genÛ, coÏ zlep‰uje její n˘ch biologick˘ch vzorcích nám mohou pomoci rozlu‰tit srovnávací schopnost v rámci celé skupiny zkouman˘ch genÛ. metody pro identifikaci rozdílnû exprimovan˘ch genÛ zaloÏe-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 367 né na statistickém testování hypotéz, kdy pro kaÏd˘ gen tes- vují nejvût‰í pfiekáÏky pro biostatistiky na celém svûtû. Nic- tujeme rozdíl mezi dvûma (ãi více) skupinami namûfien˘ch ménû, DNA mikroãipy jsou natolik perspektivní technolo- expresních hodnot. Tfietí skupina statistick˘ch procedur, kla- gií, Ïe se vloÏené úsilí nepochybnû v budoucnu odrazí jak sifikaãní metody, fie‰í problém predikce spjat˘ s diagnostikou ve v˘voji kvalitních matematick˘ch metod anal˘zy, tak nov˘ch pacientÛ na základû jejich profilu genové exprese. následnû v prohloubení znalostí o fungování bunûãn˘ch I kdyÏ se na v˘voji statistick˘ch metod pro anal˘zu dat pochodÛ i ve zlep‰ení diagnostiky a léãby tûch nejzávaÏ- z DNA mikroãipÛ pracuje jiÏ pfiibliÏnû 7 let, v Ïádném pfií- nûj‰ích onemocnûní. padû nelze fiíci, Ïe by ‰lo o ukonãen˘ proces. Zejména obrov- sk˘ poãet zkouman˘ch genÛ a vÛãi nûmu pomûrnû mal˘ Podûkování: poãet dostupn˘ch pacientÛ ãi biologick˘ch vzorkÛ pfiedsta- Tato práce byla podpofiena grantem IGA MZ âR NR/9076 - 4.

Literatura 9. Reiner, A., Yekutieli, D. and Benjamini, Y. (2003). Identifying differen- 1. Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. and Brown, P.O. (1995). Quantitati- tially expressed genes using false discovery rate controlling procedures. ve monitoring of gene expression patterns with complementary DNA mic- Bioinformatics Vol. 19 No. 3: 368-375. roarray. Science, Vol. 270: 467-470. 10.Tusher, V.G., Tibshirani, R. and Chu, G. (2001). Significance ana- 2. Speed, T. (2003). Statistical analysis of gene expression microarray data. lysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Pro- Chapman & Hall/CRC. ceedings of the National Academy of Sciences USA, 98: 5116- 3. Troyanskaya, O., Cantor, M., Sherlock, G. et al. (2001). Missing value estimati- 5121. on methods for DNA microarrays. Bioinformatics Vol. 17 No. 6 pp. 520-525. 11. Storey, J.D., Dai, J.Y. and Leek, J.T. (2005). The Optimal Discovery Pro- 4. Eisen, M.B., Spellman, P.T, Brown, P.O. and Botstein, D. (1998). Cluster cedure for large-scale significance testing, with applications to comparati- analysis and display of genome-wide expression patterns. Proceedings of ve microarray experiments. UW Biostatistics Working Paper Series, Uni- the National Academy of Sciences USA, 95: 14863-14868. versity of Washington. 5. Tamayo, P., Slonim, D., Mesirov, J. et al. (1999). Interpreting patterns of 12. Kerr, M.K. and Churchill, G.A. (2000). Statistical design and the analysis gene expression with self-organizing maps: Methods and application to of gene expression microarray data. Technical report, The Jackson Labo- hematopoietic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sci- ratory. ences USA, 96: 2907-2912. 13. Dudoit, S., Fridlyand, J. and Speed, T.P. (2002). Comparison of discrimi- 6. Fridlyand, Y.M. (2001). Resampling methods for variable selection and nation methods for the classification of tumors using gene expression data. classification: applications to genomics. PhD thesis, University of Cali- Journal of the American Statistical Association Vol.97 No 457: 77-87. fornia at Berkeley, Department of Statistics. 14. Wit, E. and McClure, J. (2004). Statistics for microarrays. Wiley, Chi- 7. De Smet, F., Mathys, J., Marchal, K. et al. (2002). Adaptive quality-based chester, GB. clustering of gene expression profiles. Bioinformatics Vol.18 No. 5 15. Vapnik, V. (1998). Statistical Learning Theory. Wiley, Chichester, pp.735-746. GB. 8. Ge, Y., Dudoit, S. and Speed, T.P. (2003). Resampling-based multiple tes- 16. Lee, J.W., Lee, J.B., Park, M. and Song, S.H. (2005). An extensive com- ting for microarray data analysis. Technical report, University of Califor- parison of recent classification tools applied to microarray data. Computa- nia at Berkeley, Department of Statistics. tional Statistics & Data Analysis, 48: 869 – 885.

METODY DETEKCE ALTEROVAN¯CH OBLASTÍ DNA Z DAT CGH ARRAYS STATISTICAL APPROACHES FOR IDENTIFICATION OF AREAS OF DNA ALTERATION ANALYZED BY CGH ARRAYS BUDINSKÁ E., JARKOVSK¯ J. INSTITUT BIOSTATISTIKY A ANAL¯Z, P¤F A LF, MU BRNO. Souhrn CGH arrays se v dne‰ní dobû staly v˘znamnou technikou v anal˘ze genomu. VyuÏívají se pro detekci zmûn v poãtu kopií genÛ nebo chromozomÛ, popfiípadû jin˘ch chromosomov˘ch pfiestaveb. Základní metodou je porov- návání DNA vzorku a zdravé kontroly pomocí komparativní genomové hybridizace (CGH). Anal˘za genetické nestability u nádoru a s ní spojené hledání nádorov˘ch markerÛ se dá vyuÏít jak v diagnostice nádorÛ (klasifikace nádorÛ do jiÏ existujících skupin, hledání nov˘ch podskupin), tak i v predikci jejich odpovûdi na léãbu. V˘hodou technologie CGH arrays je moÏnost anal˘zy celého genomu v jediném experimentu. To ov‰em znamená, Ïe metoda produkuje velké mnoÏství dat, které musí b˘t správnû matematicky vyhodnoceny a základním cílem ãlán- ku je tak pfiedstavení tûchto matematick˘ch metod a jejich softwarové implementace. Klíãová slova: CGH arrays, statistická anal˘za, body zlomu, anal˘za segmentÛ

Summary Nowadays, array CGH experiments became a powerful technique for analysing changes in DNA by comparing control DNA and DNA of interest. This is widely used for example in genome cancer studies. Analysis of the tumour genome instabilities and the search for tumour markers can be used for the tumour diagnostics (tumour classification, detection of the new clinical groups of tumours) or for the prediction of the response to therapy. The method produce huge amount of data and special statistic techniques for detecting of genomic changes are necessary. The purpose of this paper is to provide brief summary of existing statistical methods used in CGH array analysis and their software implementation. Keywords: array CGH, statistical analysis, breakpoints, segment analysis

368 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 I. Úvod (od otce a od matky), potom v pfiípadû Ïe v nádorové buÀce Anal˘za microarrays je relativnû nová a v dne‰ní dobû popu- nedo‰lo u daného genu k Ïádné zmûnû, dostáváme pomûr 2/2, lární technologie anal˘zy genomu a jeho exprese. Jde o meto- coÏ znamená Ïe CGH ratio se rovná nule (log2 2/2 = 0). CGH du schopnou analyzovat tisíce genÛ v jediném experimentu ratio men‰í neÏ -1 indikuje deleci nejménû jedné kopie genu s ‰irok˘m uplatnûním v onkologii. VyuÏívá se jí pro porovná- (log2 1/2 = -1) a vût‰í neÏ 0.58 (log2 3/2 = 0.58) naopak ampli- ní genomu nádorov˘ch bunûk s genomem bunûk zdrav˘ch téhoÏ fikaci klonu v testovacím vzorku. Zjednodu‰enû fieãeno, v‰ech- typu tkánû, coÏ umoÏÀuje vyhledávat nádorové markery a ty ny záporné hodnoty znamenají potenciální delece a v‰echny dále vyuÏít napfiíklad pro klasifikaci nádorÛ do jiÏ existujících kladné hodnoty potenciální amplifikace. skupin, identifikovat nové podskupiny, urãit odpovûì nemoc- Na základû v˘‰e uveden˘ch hodnot by bylo moÏno stanovit ného na terapii [1], nebo rozli‰it primární nádory od metastáz dvû dûlící hranice a ty vyuÏít pro detekci zmûn; co se t˘ãe dele- [2]. Microarray technologie mÛÏe b˘t vyuÏita ve v‰ech tfiech cí, oznaãili by jsme tak v‰echny klony s CGH ratio men‰í neÏ typech anal˘zy genomu. Tzv. CGH arrays se vyuÏívají pro -1 a za amplifikace by jsme pak povaÏovali v‰echny klony detekci alterovan˘ch úsekÛ v DNA, expresní microarrays se s CGH ratio vût‰í neÏ 0.58. Z praktického hlediska bohuÏel zab˘vají anal˘zou míry vyjádfiení (exprese) genu (ta je ekvi- není moÏné tento zpÛsob anal˘zy pouÏít a to z dÛvodu exi- valentní mnoÏství RNA), a nakonec proteinové microarrays stence technické i biologické variability. Vzorek nádoru pou- studují strukturu jiÏ vytvofien˘ch proteinÛ. CGH arrays jsou Ïit˘ pro anal˘zu obvykle nikdy neobsahuje sto procent nádo- metoda, kterou lze detekovat alterované úseky v DNA, tedy rov˘ch bunûk a nacházejí se v nûm i buÀky zdravé, ãímÏ se delece nebo amplifikace. ProtoÏe nûkteré CGH ãipy pokr˘va- jednotlivé hodnoty CGH ratio pro delece i amplifikace posou- jí cel˘ genom, jsou tyto microrarrays schopny podat relativnû vají smûrem k nule. âasto je tûÏké pouh˘m okem rozli‰it ten- detailní obraz o zmûnách podél v‰ech chromozomÛ. to „‰um“, kter˘ pfiedstavuje fale‰nou odchylku od skuteãn˘ch Základním principem CGH microarray technologie je hybri- zmûn. Pro fie‰ení tohoto problému byly vyvinuty speciální sta- dizace nukleov˘ch kyselin se sondami umístûn˘mi na pod- tistické metody, které jsou schopny s jistou pravdûpodobnos- loÏním skle (tzv. spoty). Zjednodu‰enû se na kaÏdém spotu tí tyto dva stavy odli‰it. Zdrojem „‰umu“ (coÏ je smûs náhod- nachází jeden klon. Zdrojem informace je DNA z jedné nebo n˘ch vlivÛ, které ovlivÀují skuteãné hodnoty zkoumané dvou tkání (pfiípadnû bunûãn˘ch linií). Hybridizované DNA promûnné a nelze je od ní uspokojivû oddûlit) se kromû pfií- jsou pfiitom obarveny rÛzn˘mi fluorescenãními barvivy (nej- tomnosti zdrav˘ch bunûk ve vy‰etfiovaném vzorku mohou ãastûji ãervená – tkáÀ, kterou zkoumáme, zelená - kontrola), potenciálnû stát také v‰echny ãásti zpracovávání microarray po jejichÏ excitaci laserem o pfiíslu‰né vlnové délce je získá- sklíãka. Namûfiené hodnoty tak mÛÏou b˘t ovlivnûny napfií- na intenzita svûtla. Tato intenzita je úmûrná mnoÏství DNA klad rÛzn˘mi inkorporaãními a excitaãními vlastnostmi jed- pfiichycené k sondû a tedy pfienesenû i poãtu kopií genu ve zdro- notliv˘ch fluorescenãních barviv nebo pfiirozená fluorescen- jové tkáni. Takto získan˘ obraz ãipu je dále analyzován pomo- ce pozadí apod. cí programÛ pro anal˘zu obrazu a jednotlivé intenzity fluorescence (ekvivalentní mnoÏství DNA pfiichycené na odpovídajících sondách) jsou pfievedeny do ãíselné podoby, která podstupuje dal‰í matematické a statistické zpracování vedoucí k závûrÛm a interpretacím. Podobnû jako u expresních microarrays se i u CGH arrays vyu- Ïívá nejãastûji takzvan˘ „referenãní“ design, kter˘ je zaloÏen na porovnávání fluorescenãních intenzit testované (nádorové) DNA a referenãní (kontrolní, zdravé) DNA. Jedná se vlastnû o komparativní geonomovou hybridizaci (CGH) na microarrays ãipech. Pro následnou statistickou anal˘zu jsou v pfiípadû tohoto designu zajímavé pomûry fluorescenãní intenzity nádorové a refe- renãní DNA pro kaÏd˘ klon na microarray sklíãku. Tyto po- mûry se naz˘vají „CGH ratio“, a obvykle se logaritmují loga- ritmem o bázi dva (log2ratio):

intenzita nádorové DNA CGH ratio=log 2 intenzita kontrolní DNA Obrázek 1: Graf reprezentující CGH ratio klonÛ proti jejich pozici na Takhle upraven˘ podíl se spí‰e fiídí pfiibliÏnû normálním roz- genomu v kb. Vertikální pfiímky oznaãují body zlomu ohraniãující dete- loÏením (vzhledem k schopnosti logaritmické transformace kovan˘ region lidského chromozomu 7. mûnit asymetrické rozloÏení na více ãi ménû symetrické) [3], Je známo, Ïe u nádorÛ jsou obvykle zmûnami zasaÏeny vût‰í coÏ je v˘hodné pro fiadu statistick˘ch technik. Tyto podíly jsou regiony DNA [4.], tedy lze oãekávat, Ïe tyto zmûny jsou na obvykle vyjadfiovány aÏ po úpravû dat (která zahrnuje napfií- grafu pozorovatelné v podobû segmentÛ amplifikací/delecí. klad odstranûní neÏádoucích spotÛ z anal˘zy) nebo pfiípadné Oblasti, které tyto segmenty oddûlují se naz˘vají „body zlo- normalizaci (pomáhá odstraÀovat pfiípadné systematické mu“, protoÏe se v nich graf „láme“ buì do záporn˘ch nebo do i náhodné chyby), coÏ je fáze spoleãná jak pro anal˘zu expres- kladn˘ch hodnot (Obr. 1). Vût‰ina statistick˘ch metod pouÏí- ních tak pro anal˘zu CGH arrays. Následujícím krokem v ana- van˘ch pro anal˘zu CGH arrays se snaÏí detekovat tyto body l˘ze dat CGH arrays je potom prÛmûrování hodnot CGH rati- zlomu a vymezit tím zmínûné úseky co nejpfiesnûji. Pfii hledá- os technick˘ch replikátÛ klonu (klon se mÛÏe na sklíãku ní segmentÛ se vychází z pfiedpokladu, Ïe geny jsou na geno- nacházet ve více kopiích) a vykreslení hodnot prÛmûrÛ CGH mu uspofiádány v urãitém pevném pofiadí a v pfiípadû, Ïe jsou ratios v‰ech klonÛ oproti jejich pozici na genomu (Obr. 1). deletovány napfiíklad geny s pofiadím 1, 2 a 4, je s nejvût‰í prav- Tenhle krok poskytuje prvotní informaci o potenciálních zmû- dûpodobností deletován i gen mezi nimi s pofiadov˘m ãíslem nách a uplatÀuje se zde dal‰í v˘hoda logaritmování podílÛ. 3. Tyto pfiedpoklady pomáhají redukovat ‰um a zv˘‰it stati- JestliÏe uvaÏujeme ve zdravé buÀce dvû kopie kaÏdého genu stickou prÛkaznost detekovan˘ch zmûn. Statistické metody

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 369 pro hledání alterovan˘ch úsekÛ DNA u CGH arrays se li‰í od Dal‰ím krokem anal˘zy je detekce bodÛ zlomu, která je vlast- metod pro hledání odli‰nû exprimovan˘ch genÛ u expresních nû ekvivalentní úloze najít zmûnûné úseky (segmenty), proto microarrays právû tûmito pfiedpoklady. se tato ãást anal˘zy naz˘vá také segmentací. Pro fie‰ení úlohy Hledání alterovan˘ch vût‰ích úsekÛ je pouze jedním z úkolÛ je vyuÏívána fiada odli‰n˘ch metod. Jednu podskupinu tvofií anal˘zy CGH arrays. Dal‰ími je napfiíklad detekce bodov˘ch segmentaãní metody, které pfiedpokládají, Ïe data pocházejí mutací, zmûn o velikosti jednoho nebo nûkolika málo genÛ z rozloÏení, jeÏ je smûsí tfií normálních rozloÏení (pro delece, a urãení poãtu amplifikovan˘ch nebo deletovan˘ch kopií genÛ, pro geny beze zmûny, pro amplifikace), které se li‰í pouze neboli míry zmûny. stfiední hodnotou (napfi. -1, 0, 0.58).

II. Metody pro statistickou anal˘zu CGH arrays II.1. Metodika V souãasnosti existuje fiada statistick˘ch metod vyvinut˘ch za úãelem hledání alterovan˘ch úsekÛ DNA. Jak jiÏ bylo zmínû- no, vût‰ina z nich vyuÏívá informaci o pofiadí genÛ na genomu a faktu, Ïe sousední geny mají vût‰inou obdobné CGH ratio (tedy patfií do stejné alterované nebo nezmûnûné oblasti). Kromû nich ov‰em existují i metody, které tyto pfiedpoklady nevyuÏívají, jako jsou napfiíklad metody pouÏívající dvû pev- né dûlící hranice, jednu pro deletované a druhou pro ampli- fikované regiony, li‰ící se ve zpÛsobu stanovení tûchto hranic. Z nich lze zmínit metodu [5], která navrhuje stanovení hranic na základû rozloÏení CGH ratio z CGH array experi- mentÛ kontrola vÛãi kontrole, nebo metodu [6] vyuÏívající regresní anal˘zu pofiadí CGH ratios. Tyto metody mají obec- nû nev˘hodu, Ïe neberou do úvahy v˘‰e uvedené pfiedpoklady a jsou tak mnohem náchylnûj‰í k fale‰nû pozitivním nebo fale‰nû negativním v˘sledkÛm. MÛÏe se napfiíklad stát, Ïe gen s pofiadím ãíslo 3 se nachází ve velkém alterovaném regi- onu DNA (dejme tomu o 20 genech), ale díky ‰umu jeho CGH ratio nemá dostateãnû vysokou hodnotu pro pfiesáhnutí dûlí- cí hranice a je tak oznaãen jako nealterovan˘, i kdyÏ ve sku- teãnosti alterovan˘ je. Kromû toho pouÏití kontrolních CGH Obrázek 2.: Schéma metodiky vyhledávání alterovan˘ch segmentÛ. arrays experimentÛ pro stanovení dûlící hranice mÛÏe b˘t zavádûjící, protoÏe takovéto hranice neberou do úvahy pfií- Tyto metody se pak snaÏí správnû odhadnout právû para- padné odchylky u reáln˘ch experimentÛ a v˘sledky tak nemu- metry tohoto rozloÏení (prÛmûr, smûrodatná odchylka) a tím sí úplnû odpovídat realitû. urãit správnou segmentaci. Metody se li‰í v optimalizaãním Ostatní metody se snaÏí CGH data matematicky modelovat kriteriu (míra kontroly správnosti modelu) a algoritmem, a na základû optimalizace rÛzn˘ch kritérií pomocí nejrÛz- kter˘m tuto optimalizaci provádûjí. Z optimalizaãních kri- nûj‰ích algoritmÛ najít nejlep‰í rozdûlení dat do segmentÛ. terií zmíníme vûrohodnostní (likelihood) kriterium [8, 9, 10, Obvykle vyuÏívají jeden nebo více z následujících krokÛ 16], kriterium nejmen‰ích ãtvercÛ [11], parciální sumy [12], (Obr. 2): edge detection filter [13]. Jako optimalizaãní algoritmy pou- Ïívají genetické algoritmy [8], dynamické programování [10, 1. vyhlazení dat (pouÏíváno pro odstranûní ‰umu) 11], cirkulární binární segmentaci [12], adaptive weights 2. detekce bodÛ zlomu (detekce zmûnûn˘ch úsekÛ) smoothing [9] nebo EM algoritmus [13, 16]. Dal‰í metody 3. odhad optimálního poãtu zmûnûn˘ch úsekÛ vyuÏívají skryté Markovovy fietûzce [14] nebo modifikova- 4. klasifikace regionÛ (zafiazení detekovan˘ch regionÛ do tfií nou metodu hierarchického shlukování - CLAC [15]. skupin – deletované, nezmûnûné, amplifikované) Kroky tfii a ãtyfii, odhad optimálního poãtu segmentÛ a kla- a li‰í se pouze statistick˘mi metodami, které pro tyto kroky sifikace regionÛ, pfiedstavují nezbytné zakonãení anal˘zy, pouÏívají. protoÏe v kroku druhém nacházíme pouze nejlep‰í rozdûle- ní dat do urãitého poãtu segmentÛ. V tûchto segmentech v‰ak První krok, takzvané vyhlazování dat, má za úãel redukovat mohou b˘t buì nûkteré zbyteãnû navíc (fale‰nû pozitivní), v datech ‰um zpÛsoben˘ technickou nebo neÏádoucí biologic- a je tfieba je sjednotit, nebo, jako v pfiípadû metody CLAC, kou variabilitou (Obr. 2. - 2). Pro vyhlazování se pouÏívají rÛz- musíme zpûtnû urãit poãet segmentÛ, které jsou ze v‰ech né metody zaloÏené nejãastûji na virtuálním pohyblivém oknû moÏností vybrány (pokud to není jiÏ souãástí kroku 2). Pro o urãité velikosti, které se posouvá po hodnotách zleva dopra- nalezení optimálního poãtu segmentÛ je pouÏíváno shluko- va. V tomto oknû, napfiíklad o velikosti 5 genÛ, se spoãítá jeho vání, jako napfiíklad metoda k prÛmûrÛ [11], nebo nejãastû- statistická sumarizace, napfiíklad medián (mediánové vyhlazo- ji rÛzná penalizaãní kriteria [10, 13, 15]. Je tfieba zdÛraznit, vání), kterou se pak nahradí napfiíklad prostfiední hodnota v oknû. Ïe nûkteré metody tyto kroky nepotfiebují, a kroky 2-4 se tak Jednotlivé metody se li‰í velikostí okna, hodnotou, která je nahra- mohou prolínat. zována a druhem poãítané statistické sumarizace. Vysvûtlování principu jednotliv˘ch metod by pfiesáhlo rozsah Ne v‰echny vyhlazovací metody jsou zaloÏeny na pohyblivém tohoto ãlánku, proto zájemce o podrobnûj‰í informace odka- oknû. Za v‰echny zmíníme metodu tzv. „kvantilové regrese“ zujeme na literaturu. [7], která byla speciálnû navrhnuta pro anal˘zu CGH arrays. Její v˘hodou je, Ïe na rozdíl od ostatních technik netvofií pfii II.2. Existující software pro anal˘zu dat CGH arrays vyhlazovaní dat obloukovité a málo v˘razné pfiechody mezi Softwarové implementace metod pro anal˘zu dat CGH arrays odli‰n˘mi segmenty. Problémem vyhlazování je, Ïe kromû jsou obvykle dobfie dostupné a volnû staÏitelné, pro nûkteré odstranûní ‰umu dochází nûkdy i ke ztrátû skuteãné informa- metody existuje i více implementací. Kromû samostatn˘ch pro- ce. V pfiípadû dat z CGH arrays tak mÛÏeme „vyhladit“ napfií- gramÛ nebo webov˘ch aplikací se metody ve vût‰inû pfiípadÛ klad bodové zmûny, nebo zmûny o nûkolika málo genech a pro- vyskytují v podobû funkcí znám˘ch matematick˘ch progra- to ne v‰echny metody tento krok vyuÏívají. mÛ, jako jsou R [16] nebo Matlab [17] a pro anal˘zu je tak nut-

370 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 ná znalost práce v tûchto programech. NíÏe jsou shrnuty pfií- nû tak redukovat ‰um v datech. V ãlánku jsou pfiedstaveny klady implementací: pouze nûkteré, z na‰eho pohledu nejlep‰í dostupné metody anal˘zy CGH arrays, a to prostfiednictvím sv˘ch základních R - balíky: principÛ. GLAD [9] Tabulka 1: Porovnání implementací vybran˘ch metod pro anal˘zu dat cgh_smooth_nakao [7] CGH arrays. „Komplexnost algoritmu“ znamená, Ïe v programu je pou- CLAC [14] Ïita matematická metoda pro vyhledávání zmûnûn˘ch segmentÛ (tedy ne snapCGH [23] pouze stanovení dûlící hranice). Matlab: GLAD [9] Program Implementace Pfiedzpracování Grafy Je algoritmus Hlavní nev˘hody Hlavní v˘hody M-CGH [18] dat komplexní CGH plotter [11] MCGH Matlab ANO ANO ANO Speciální vstupní Komplexnost CGH_segmentation [10] formát dat ChARM [13] (GenePix and QuantArray) Excel: CGH Matlab NE ANO ANO - Lze pouÏít i pro CGH miner for Excel [14] plotter expresní microarrays Samostatné programy nebo webové aplikace arrayCy web ANO ANO NE Nekomplexní Jednoduch˘, ArrayCyGHt – webová aplikace pro anal˘zu GHt propojení a vizualizaci dat CGH arrays [19] s databázemi CGH Explorer – komplexní java nástroj [20] GLAD R, Matlab NE ANO ANO Není „user Komplexnost VAMP – komplexní webová aplikace zahrnující friendly“ vizualizaci, anal˘zu i porovnávání a anal˘zu profilÛ VAMP web ANO ANO ANO - Komplexní více pacientÛ najednou [21] zpracování aCGHSmooth [22] CGH arrays dat, anal˘za více II. 3. V˘hody a nev˘hody jednotliv˘ch metod pacientÛ KaÏdá z v˘‰e uveden˘ch metod má v porovnání s ostatními cgh_smooth_ R NE ANO NE nekomplexní, není své v˘hody a nev˘hody. Pro nûkteré je nezbytné znát a mít nakao „user friendly“ - k dispozici speciální matematick˘ software (R, Matlab), nûkte- CGH- R, Excel NE ANO ANO VyÏaduje normal Implementace ré implementace zase vyÏadují specifick˘ typ formátu dat. To mÛÏe b˘t problémem, pokud máme data z jin˘ch zdrojÛ miner – normal arrays v Excelu a nejsme schopni je do daného programu naãíst (napfi. M-CGH Tyto metody, na rozdíl od metod pro expresní arrays, nejsou vyÏaduje Gene-pix nebo Quant array formát). Nûkteré z metod doposud natolik unifikovány. KaÏdá z nich má své v˘hody nejsou „komplexní“, a to ve smyslu chybûjící anal˘zy seg- i nev˘hody, mnohdy se musí uÏivatel rozhodovat mezi kvali- mentÛ (po vyhlazování vyuÏívají pouze dûlící hranici, kterou tou v˘sledku a jednoduchostí pouÏívání. Metody se obvykle urãuje sám uÏivatel – napfi. [7]). Na druhé stranû, komplexní volí podle preferencí uÏivatele, v praxi se v‰ak doporuãuje metody mohou vyÏadovat nastavení mnoÏství parametrÛ, coÏ zanalyzovat data vÏdy více zpÛsoby a v˘sledky pak porovnat. vyÏaduje dobrou znalost problematiky a metody samotné V kaÏdém pfiípadû je nutná alespoÀ základní znalost matema- (napfi. GLAD, MCGH). Metoda CLAC je komplexní metoda, tického pozadí metody vyuÏité pro anal˘zu. která se relativnû jednodu‰e pouÏívá, av‰ak vyÏaduje nûkolik Vzhledem k faktu, Ïe mnohé metody pro anal˘zu pouÏívají normal-normal arrays, coÏ u nûkter˘ch experimentÛ nemusí pouze informaci o pofiadí jednotliv˘ch klonÛ na genomu a ne b˘t z finanãních dÛvodÛ moÏné. Nûkteré implementace posky- jejich skuteãnou polohu, je dÛleÏité nalezené regiony pod- tují pfiedzpracování dat zahrnující kontrolu kvality a normali- robit následné kontrolní anal˘ze uÏivatelem s ohledem na zaci, spolu s grafick˘mi vizualizacemi a pfiípadn˘mi dal‰ími skuteãnou pozici. Zji‰tûné aberace je dále vhodné ovûfiit anal˘zami. V souãasnosti je z tohoto pohledu nejkomplexnûj- pomocí jin˘ch pfiesnûj‰ích molekulárnû biologick˘ch tech- ‰ím webov˘m nástrojem nástroj VAMP [21], vyuÏívající meto- nik (napfi. PCR). du GLAD, kter˘ poskytuje kromû komplexní metody anal˘zy Jako zatím nejkomplexnûj‰í nástroj pro anal˘zu CGH arrays zmûnûn˘ch regionÛ i v‰echny ostatní stupnû anal˘zy dat, vãet- se jeví b˘t webová aplikace VAMP, která ale bohuÏel imple- nû normalizace a následné anal˘zy dat více pacientÛ. Snad mentuje pouze jednu z metod a neumoÏÀuje tak porovnání. zatím jedin˘m nástrojem, kter˘ spojuje více rÛzn˘ch metod Z tohoto hlediska jsme zatím zjistili pouze jedinou aplikaci, pro anal˘zu a umoÏÀuje srovnání jejich v˘sledkÛ je balík která poskytuje porovnání tfií metod najednou a to balík snapCGH [23], implementovan˘ v programu R. snapCGH, implementovan˘ v programu R. V této oblasti Tabulka ã. 1 sumarizuje v˘hody a nev˘hody vybran˘ch metod doposud chybí nástroj, kter˘ by propojoval metody v‰ech ãás- a jejich implementací tak jak je vidí autofii. Matematické porov- tí anal˘zy CGH arrays a poskytoval ‰ir‰í porovnání v˘sledkÛ. nání vût‰iny metod najdeme také v referenci ã. 24. Z tohoto dÛvodu zÛstáváme pfii jejich pouÏívání doposud odká- záni na znalost práce s rÛzn˘mi software a detailní znalost III. Závûr matematického pozadí vyuÏívan˘ch metod. ZároveÀ jde CGH arrays se v dne‰ní dobû staly v˘znamnou technikou o oblast s dosud neukonãen˘m matematick˘m v˘vojem, kde pro anal˘zu genomu a v jednom experimentu umoÏÀují ana- je moÏno oãekávat rozvoj jak dosavadních, tak v˘voj zcela l˘zu tisícÛ genÛ. ProtoÏe poruchy na úrovni genomu obvy- nov˘ch metod anal˘zy dat. kle zasahují ‰ir‰í chromozomální regiony (coÏ je informace kterou u expresních microarrays tolik nevyuÏijeme), je Podûkování uÏiteãné pfii jejich hledání tuto informaci pouÏít a v˘znam- Tato práce byla podpofiena grantem IGA MZ âR NR/9076 – 4.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 371 Literatura: 13. Myers, C.L., Dunham, M.J., Kung, S.Y., Troyanskaya, O.G. (2004) Accu- 1. Natrajan R, Williams RD, Hing SN et al. (2006). Array CGH profiling of rate detection of aneuploidies in array CGH and gene expression microar- favourable histology Wilms tumours reveals novel gains and losses asso- ray data. Bioinformatics 20(18):3533-3543. ciated with relapse. J Pathol, DOI: 10.1002/path.2021. 14. Fridlyand, J., Snijders, A.M., Pinkel, D., Albertson et al. (2004). Hidden 2. Wa CV, DeVries S, Chen YY et al. (2005). Clinical application of array- Markov models approach to the analysis of array CGH data. J. Multivari- based comparative genomic hybridization to define the relationship bet- ate Anal. 90, 132–153. ween multiple synchronous tumors. Modern Pathology 18:591-597. 15. Wang P, Kim Y, Pollack J et al.(2005). A method for calling gains and los- 3. Zar H. Jerrold (1999). Biostatistical Analysis. Prentice Hall, Upper Sadd- ses in array CGH data. Biostatistics 6(1):45-58. le River NJ, USA, 4. ed.: 275. 16. R Development Core Team (2006). R: A language and environment for sta- 4. Loeb LA, Christians FC (1996). Multiple mutations in human cancers. tistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Aus- Mutat Res;350:279-86. tria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org. 5. Pollack, J., Sorlie, T., Perou, C. et al. (2002). Microarray analysis reveals 17. Mathworks (2006).MATLAB: The Language of Technical Computing, a major direct role of DNA copy number alteration in the transcriptional Massachussetts: The MathWorks, Inc. program of human breast tumours. Proceedings of the National Academy 18. Wang, J., Meza-Zepeda, L.A., Kresse, S.H., Myklebost, O. (2004). of Sciences, USA 99, 12963–12968. MCGH: analysing microarray based CGH experiments. BMC Bioinfor- 6. Cheng, C., Kimmel, R., Neiman, P. and Zhao, L. P. (2003). Array rank matics 5, 74. order detection of gene copy-number changes in human cancer. Genomics 19. Kim, S.Y., Nam, S.W., Lee, S.H. et al. (2005). ArrayCyGHt: a web appli- 82, 122–129. cation for analysis and visualization of array-CGH data. Bioinformatics 7. Eilers, P. H. C. and de Menezes, R. X. (2005): Quantile smoothing of array 21(10): 2554-5. CGH data. Bioinformatics, 21: 1146–1153. 20. Lingjarde, O.Ch., Baumbusch, L.O., Liestol, K. et al. (2005). CGH-Explo- 8. Jong,K., Marchiori,E., van der Vaart,A., Ylstra,B., Meijer,G. And Weiss,M. rer: a program for analysis of array-CGH data. Bioinformatics 21(6):821- (2003) Chromosomal breakpoint detection in human cancer. In LNCS, vol. 822. 2611, Springer. 21. La Rosa P, Viara E, Hupe P, Pierron G (2006). VAMP: visualization and 9. Hupé, P., Stransky, N., Thiery, J.-P. et al. (2004). Analysis of array CGH analysis of array-CGH, transcriptome and other molecular profiles. Bioin- data: from signal ratio to gain and loss of DNA regions. Bioinformatics 20, formatics. July 4. 3413–3422. 22. Jong, K., Marchiori, E., Meijer, G. et al. (2004). Breakpoint identification 10. Picard, F., Robin, S., Lavielle, M. et al. (2005). A statistical approach for and smoothing of array comparative genomic hybridization data. Bioin- CGH microarray data analysis. BMC Bioinformatics; 6:27. formatics 1, 1–2. 11. Autio, R., Hautaniemi, S., Kauraniemi, P. et al. (2003). Cgh-plotter, Mat- 23. Smith, ML. (2006). Sample of aCGH analysis. www.bioconductor.org/pac- lab toolbox for CGH data analysis. Bioinformatics 19, 1714–1715. kages/1.8/ bioc/vignettes/snapCGH/inst/doc/snapCGHguide.pdf . 12. Olshen, A. B., Venkatraman, E. S., Lucito, R. and Wigler, M. (2004) Cir- 24. W.R. Lai, M.D. Johnson, R. Kucherlapati, and Peter J. Park (2005). Com- cular binary segmentation for the analysis of array-based DNA copy num- parative analysis of algorithms for identifying amplifications and deletions ber data. Biostatistics, 5, 557–572. in array CGH data, Bioinformatics 21(19):3763-3770.

372 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 klinick˘ pﬁehled

MOLEKULÁRNÍ TAXONOMIE A PREDIKTIVNÍ SYSTÉMY KARCINOMU PRSU DEFINOVANÉ NA ZÁKLADù PROFILÒ GENOVÉ EXPRESE BREAST CANCER MOLECULAR TAXONOMY AND PREDICTIVE SYSTEMS BASED ON GENE EXPRESSION PROFILING SVOBODA M.1,2, GRELL P.1,2, FABIÁN P.1, PALÁCOVÁ M. 1, PETRÁKOVÁ, K. 1, NENUTIL R.1, HAJDÚCH M.3, VYZULA R.1,2

1 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV BRNO 2 LÉKA¤SKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY BRNO 3 LABORATO¤ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY P¤I DùTSKÉ KLINICE LF UP A FN OLOMOUC Souhrn Karcinomy prsu jsou nejãastûj‰ím maligním onemocnûním u Ïen. Jejich vysoká incidence a mortalita zpÛsobují, Ïe se jedná nejenom o medicínsk˘, ale i o závaÏn˘ spoleãensk˘ problém. I pfies znaãn˘ pokrok, kter˘ za posledních 25 let nastal v diagnostice a v léãbû karcinomu prsu, dochází pouze k pozvolnému poklesu mortality. Pacientky sdílející stejná diagnostická a prognostická kritéria stále vykazují znaãné rozdíly ve v˘voji onemocnûní, a to i pfies jednotnou protinádorovou léãbu. Pfiíãina tûchto diskrepancí mÛÏe b˘t ve stávající histopatologické klasifikaci a v prognostic- k˘ch systémech pouÏívan˘ch v klinické praxi. V obou pfiípadech jsou do stejn˘ch skupin zafiazovány karcinomy s odli‰n˘m molekulárním profilem a biologick˘m chováním, neboÈ histopatologická taxonomie je zaloÏena v˘hrad- nû na morfologick˘ch parametrech a prognostické systémy zohledÀují pouze velmi limitovan˘ poãet molekulárních prediktivních markerÛ. Platí-li základní dogma biologick˘ch systémÛ, potom lze diverzitu fenotypu nádorov˘ch bunûk sledovat na úrovni jejich genomu. Komplexnost tûchto zmûn v‰ak pfiedpokládá anal˘zu stovek aÏ tisícÛ genÛ. Velké nadûje byly proto vloÏeny do DNA ãipÛ a dosavadní publikované práce a existence první klinické studie vyu- Ïívající DNA ãipy u karcinomu prsu dokazují, Ïe molekulární taxonomie a prediktivní systémy zaloÏené na profilech genové exprese pfiedstavují správnou cestu k dosaÏení lep‰ích léãebn˘ch v˘sledkÛ tohoto onemocnûní. Klíãová slova: karcinom prsu, DNA ãipy, taxonomie, predikce a prognóza, cílená léãba Summary Breast cancer is the most common malignant disease in women . Because of its high incidence and mortality, breast cancer is also important community problem. Despite the biologic and clinical advances that have been made in breast cancer diagnostic and treatment during the last 25 years, there is no corresponding reduction of mortality. Breast cancer patients with the same stage of disease can have markedly different treatment responses and overall outcome. It is believed that these discrepances in clinical behavior are due to molecular differences between histologically similar tumors. DNA microarray technology is capable to reveal such molecular differences. Looking back to DNA microarray studies, that results have been published until now, we can state that all our expectations put in this technology, were filled up. Mainly, the breast cancer molecular taxonomy and predictive systems based on gene expression profiling are the most promising results with the direct impact on the clinical practice. Key words: breast cancer, microarrays, taxonomy, prediction and prognosis, target therapy

1. Úvod kulárních inhibitorÛ receptorÛ rÛstov˘ch faktorÛ. O to víc je Vysoká incidence a mortalita karcinomÛ prsu pfiedstavuje v‰ak patrná klinická heterogenita prÛbûhu onemocnûní, kdy závaÏn˘ medicínsk˘ a spoleãensk˘ problém (1). Uplynul˘ch pacientky sdílející stejná diagnostická a prognostická kritéria 25 let pfiineslo znaãn˘ pokrok ve v˘zkumu karcinomu prsu, a/nebo jednotnou léãbu, vykazují znaãné rozdíly v léãebn˘ch jehoÏ v˘sledky se promítly na v‰ech stupních diagnostického v˘sledcích. Pfiíãina tûchto diskrepancí mÛÏe b˘t ve stávající i léãebného procesu tohoto onemocnûní. Pro Ïeny existuje efek- histopatologické klasifikaci a v prognostick˘ch systémech pou- tivní program preventivních prohlídek. V diagnostice lze vyu- Ïívan˘ch v klinické praxi. V obou pfiípadech jsou do stejn˘ch Ïít digitální mammografie, sonografick˘ch pfiístrojÛ nov˘ch skupin zafiazovány karcinomy s odli‰n˘m molekulárním pro- generací a magnetické rezonance. Chirurgové jsou schopni profilem a biologick˘m chováním, neboÈ histopatologická taxo- vádût záchovné operace prsu a peroperaãnû detekovat sentine- nomie je stále zaloÏena v˘hradnû na morfologick˘ch paramet- lovou uzlinu. Patologové mají bûÏnû k dispozici imunohisto- rech a prognostické systémy zohledÀují pouze velmi limitovan˘ chemické a FISH metody k vy‰etfiování molekulárních markerÛ. poãet molekulárních markerÛ. V dÛsledku toho dochází pouze Kliniãtí onkologové mohou pouÏít moderních cytostatik a cíle- k pomalému poklesu mortality, a naopak je patrné, Ïe fiada paci- nou léãbu na bázi hormonoterapie, imunoterapie a nízkomole- entek diagnostikovan˘ch v ãasn˘ch klinick˘ch stádiích v rám-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 373 ci screeningu je zbyteãnû po‰kozována adjuvantní chemotera- tumorÛ zreprodukovala dosavadní v˘sledky a zavedla defini- pií. Klinická heterogenita karcinomÛ prsu se odvíjí od genomu tivní oznaãení skupin: „luminal-like A“, „luminal-like B“ nádorov˘ch bunûk a patologické exprese jeho genÛ. Jedná se (pÛvodní „luminal-like B+C“), „basal-like“, „Her-2+“ o komplexní zmûny, které je moÏné jen s obtíÏemi studovat a poslední skupina „normal breast-like“. Profil genové expre- s pouÏitím tradiãních metod, vhodn˘ch spí‰e k anal˘ze jedno- se na jehoÏ základû bylo uvedené ãlenûní dosaÏeno sestával ho nebo nûkolika málo genÛ. Velké nadûje byly proto vloÏeny z 534 genÛ (4). do DNA ãipÛ. Dosavadní publikované práce a vznik první kli- Aãkoliv finální podoba molekulární taxonomie karcinomÛ prsu nické studie vyuÏívající DNA ãipy u karcinomu prsu dokazu- vze‰la z anal˘z pomûrnû rozsáhlého souboru 115 primárních jí, Ïe molekulární taxonomie a prediktivní systémy zaloÏené na tumorÛ, jednalo se vÏdy o práce jednoho autorského t˘mu, kte- profilech genové exprese pfiedstavují správnou cestu k dosaÏe- r˘ pouÏíval DNA ãipy vlastní produkce. Tohoto „hendikepu“ ní lep‰ích léãebn˘ch v˘sledkÛ tohoto onemocnûní. Ná‰ pfie- si byli autofii vûdomi, a proto se rozhodli validovat vlastní hledov˘ ãlánek si klade za cíl seznámit svého ãtenáfie s nejv˘- v˘sledky na nezávislém souboru, kter˘m se stala práce skupi- znamnûj‰ími poznatky, kter˘ch bylo pfii studiu biologick˘ch ny nizozemsk˘ch autorÛ pod vedením Laury van’t Veer . Nizo- vlastností karcinomÛ prsu dosaÏeno pomocí technologie DNA zemská skupina analyzovala profil genové exprese u 117 ãipÛ a o kter˘ch jsme pfiesvûdãení, Ïe mají zásadní dopad pro karcinomÛ prsu pomocí oligonukleotidov˘ch DNA ãipÛ pro- klinickou praxi. dukovan˘ch spoleãností Agillent (5). Stanfordská skupina auto- rÛ se rozhodla vyuÏít tûchto vefiejnû dostupn˘ch dat a vyzkou- 2. Molekulární taxonomie karcinomÛ prsu zaloÏená na ‰et, zda na základû exprese 534 genÛ jejich klasifikaãního profilu genové exprese profilu dosáhnou stejn˘ch v˘sledkÛ i na nezávislém souboru Therese Sο/ rlie, Charles Perou a kolektiv jejich spolupracov- pacientÛ, jejichÏ karcinomy byly navíc analyzovány odli‰nou níkÛ (dále jen stanfordská skupina) v roce 2000 analyzovali platformou DNA ãipÛ. I pfiesto, Ïe hodnotiteln˘ch bylo 461 pomocí DNA ãipÛ vlastní produkce expresi 8102 genÛ u 65 z pÛvodních 534 genÛ, rozdûlení nizozemského souboru bylo vzorkÛ karcinomÛ prsu získan˘ch od 42 pacientek. Spoleãnû stejné, opût do pûti skupin: „luminal-like A“, „luminal-like B“ s tûmito primárními tumory zkoumali i tkáÀ ze zdravé prsní „basal-like“, „Her-2+“ a skupina „normal breast-like“. Pfii popi- Ïlázy a nádorové bunûãné linie, jenÏ byly ustaveny z odli‰n˘ch sované anal˘ze vy‰la najevo zajímavá skuteãnost. V‰ech 18 bunûãn˘ch komponent tumoru (z bunûk bazálního a luminál- karcinomÛ nesoucích mutaci BRCA1 genu bylo na základû pro- ního epitelu, z mezenchymu a endotelu). V první fázi zpraco- filu genové exprese zafiazeno do skupiny „basal-like“ karcino- vání v˘sledkÛ autofii vybrali 496 genÛ, jejichÏ exprese se mÛ, a to i pfiesto, Ïe dva z nich exprimovaly estrogenové recep- v˘znamnû li‰ila minimálnû u tfií z analyzovan˘ch vzorkÛ. tory. Karcinomy, u kter˘ch byla detekována mutace BRCA2 V dal‰ím kroku provedli shlukovou anal˘zu, která na základû genu (2 pfiípady) byly obsaÏeny ve skupinû „luminal-like A“. podobnosti exprese tûchto genÛ rozdûlila karcinomy do ãtyfi V tabulce uvádíme distribuci karcinomÛ do jednotliv˘ch mole- skupin. První skupina byla charakteristická pfiítomností expre- kulárnû definovan˘ch skupin ve stanfordském a nizozemském se estrogenového receptoru-α (ER+) a cytokeratinÛ bunûk souboru (tabulka ãíslo 1). luminální epitelu (cytokeratin 8 a 18), a proto byla pojmeno- vána „luminal-like“. Druhá skupina byla pro vysokou expresi genu receptoru Her-2/neu (cErbB2) (dále jen Her-2) ozna- ãena „Her-2+“. Tfietí skupina vykazovala negativní expresi jak estrogenového receptoru-α (ER-), tak i progesteronového a Her-2 receptoru, naopak mûla zv˘‰enou hladinu cytokerati- nÛ a receptorÛ adheze typick˘ch pro buÀky bazálního epitelu (cytokeratin 5, 6 a 17, integrin α4). Tato skupina byla oznaãen- a „basal-like“. âtvrtá a poslední skupina mamárních karcino- mÛ byla oznaãena „normal breast-like“, neboÈ sdílela podob- n˘ profil genové exprese jako vzorky z normální prsní Ïlázy, v nichÏ pfievládaly adipocyty (2). O rok pozdûji, v roce 2001, publikovala stanfordská skupina dal‰í práci, ve které autofii potvrdili své pfiedchozí v˘sledky na dvojnásobném souboru primárních tumorÛ. Zfiejmû vy‰‰í poãet analyzovan˘ch vzorkÛ 2.1. „Basal-like“ karcinomy prsu umoÏnil shlukové anal˘ze „rozeznat“ ve skupinû karcinomÛ Otázkou zÛstává, proã mají mezi novû definovan˘mi skupi- „luminal-like“ tfii podskupiny, které autofii oznaãili jako „lumi- nami „basal-like“ karcinomy nejhor‰í prognózu? Jsou pfiíãi- nal-like A“, „luminal-like B“ a „luminal-like C“. Podskupina nou této skuteãnosti agresivní vlohy „basal-like“ karcinomÛ „luminal-like A“ pfiedstavovala 67% v‰ech tumorÛ klasifiko- nebo svÛj podíl nese i dosavadní léãebn˘ pfiístup, kter˘ nezo- van˘ch do skupiny „luminal-like“ a vyznaãovala se nejvy‰‰í hledÀuje jejich existenci? koncentrací ER v nádorové tkáni (v prÛmûru 111 fmol/mg) Biologické vlastnosti „basal-like“ karcinomÛ dávají skuteã- a expresí genÛ souvisejících s jeho signální dráhou. Na rozdíl nû pfiedpoklad k jejich agresivnímu chování. Jak jiÏ bylo uve- od podskupiny „luminal-like A“, prÛmûrná koncentrace ER deno, na úrovni profilu genové exprese sdílí v˘znamnou byla v podskupinách „luminal-like B“ a „luminal-like C“ men- podobnost s karcinomy nesoucími mutaci supresorového ‰í (60 fmol/mg). Karcinomy podskupiny „luminal-like C“ byly BRCA1 genu. Nejedná se v‰ak pouze o mutaci, která ve svém velmi heterogenní, exprimovaly ER i nûkteré geny charakte- dÛsledku znamená nedostatek funkãního BRCA1 proteinu. ristické pro „basal-like“ a „Her-2+“ karcinomy (obrázek ã 1/I). Jak dokazuje fiada prací, ke stejnému stavu dochází i v pfiípa- Ve své druhé práci autofii pokroãili mnohem dále. Na základû dû hypermetylace promotoru nemutovaného BRCA1 genu korelace s údaji o celkovém pfieÏití (OS) a ãasu do relapsu cho- (35). Alterace na úrovni BRCA1 genu nebo proteinu v‰ak roby (RFS) prokázali v˘znamnou klinickou odli‰nost u pûti nejsou jediné mechanismy vedoucí k moÏnému agresivnímu z ‰esti molekulárnû definovan˘ch skupin karcinomÛ (p<0,01). chování. Za podrobnûj‰í zmínku stojí vy‰‰í v˘skyt mutací Rozdíl nebyl nalezen pouze mezi karcinomy „luminal-like B“ v genu pro protein p53, které byly u „basal-like“ karcinomÛ a „luminal-like C“, a proto byly slouãeny do jedné skupiny zji‰tûny ve 45-82% pfiípadÛ, ve srovnání se 43-71% u „Her- „luminal B+C“ (3). Podrobnûji budeme o prognostickém v˘zna- 2+“ a s 13-15% u „luminal-like A“ karcinomÛ (3). ¤ada stu- mu molekulární taxonomie psát v dal‰í kapitole. Finální podo- dií pfiitom jednoznaãnû prokázala, Ïe pfiítomnost mutace genu bu molekulární toxonomie karcinomÛ prsu publikovala stan- pro p53 je negativním prognostick˘m faktorem a je asocio- fordská skupina v roce 2003, kdy na souboru jiÏ 115 primárních vána s hor‰í odpovûdí na systémovou léãbu (6,7). Podobné

374 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Obrázek ã. 1.: (I.) Dendrogram shlukové anal˘zy, na kterém je patrné rozdûlení 85 karcinomÛ prsu (sloupce) do pûti skupin definovan˘ch na základû podobnosti exprese vybran˘ch genÛ (fiádky): „basal-like“, „HER- 2+“, „normal breast-like“, „luminal-like C“, „luminal-like B“ (L.L.“B“) , „luminal- like A“. RovnûÏ geny jsou uskupeny do pûti funkãních skupin „A“ aÏ „E“. Obrázek je pouze ilustrativní a nezobrazuje v‰ech 476 genÛ pÛvodního geno- vé profilu. Exprese genÛ je v dendrogramu kódována barevnû. Zelená barva znaãí nízkou, ãervená barva vysokou a ãerná barva prÛmûrnou expresi daného genu v daném karcinomu. ·edá barva oznaãuje gen, jehoÏ exprese nebyla vyhodnocena. V levé ãásti obrázku se nachází grafy prezentující Kaplan-Meierovy kfiivky pravdûpodobnosti celkového pfieÏití - OS (II.) nebo ãasu do vzdálenostního relapsu choroby - RFS (III., IV.) pro v˘‰e uve- dené skupiny karcinomÛ prsu . Dendrogram a grafy II. a III. byly pfievzaty a upraveny z reference ã. 3., graf IV. zobrazuje v˘sledky ze studie van’t Veer L, a kol . (ref. ã. 5), a byl pfievzat a upraven z reference ã. 4. v˘sledky publikoval i Korsching a kol., kter˘ navíc zjistil, meme-li v úvahu molekulární alterace zastoupené u „basal- Ïe kromû mutovaného proteinu p53 mají „basal-like“ karci- like“ karcinomÛ (nadmûrná exprese Her-1 receptoru, sníÏená nomy i vy‰‰í expresi Her-1 receptoru (EGFR) a proliferaãní- exprese nebo nefunkãní mutace BRCA1 proteinu) je vysoce ho markeru Ki-67 (8). pravdûpodobné, Ïe brzy dojde k vyuÏití terapie interferující Skupina „basal-like“ karcinomÛ pfiedstavuje pfiibliÏnû 6-20% s tûmito zmûnami. V souãasné dobû probíhá klinická studie II. v‰ech karcinomÛ prsu. V jeho incidenci jsou v‰ak patrné raso- fáze, ve které jsou pacientky s „triple-negative“ fenotypem vé rozdíly, kdy zejména v populaci americk˘ch ãernochÛ pfie- léãené neoadjuvantní chemoterapií s cisplatinou. Studie vychá- sahuje v˘skyt 20 % (2,3,9). Zpohledu klinického onkologa jsou zí z poznatku o vysoké úãinnosti interkalaãních cytostatik na „basal-like“ karcinomy souãástí skupiny karcinomÛ prsu, pro bázi platinov˘ch derivátÛ u karcinomÛ s BRCA1 mutací kterou je charakteristická negativní exprese jak estrogenového, (10,31,32). Kromû tûchto pfiístupÛ se nabízí i léãba cílenû zamû- tak i progesteronového a Her-2 receptoru, tzv. „triple-negative“ fiená na signální dráhu Her-1 receptoru, kterou pfiedstavuje apli- (trojitû negativní) fenotyp, (3, 9). Stratifikace pacientÛ na zákla- kace monoklonálních protilátek (napfi. cetuximab) nebo níz- dû bûÏnû pouÏívan˘ch prognostick˘ch indexÛ (St. Gallen, Nati- komolekulárních inhibitorÛ kinázové aktivity Her-1 receptoru onal Cancer Institute, Nottingham) vÛbec nezohledÀuje v˘‰e (napfi. erlotinib a gefitinib). Poslední skupina léãiv by mohla uveden˘ fenotyp. Navíc mÛÏe b˘t negativní exprese Her-2 b˘t za úãelem stabilizace onemocnûní podávána i dlouhodo- receptoru vnímána i jako prognosticky pfiízniv˘ nález. Pfii uplat- bû, podobnû jako je tomu s tamoxifen u ER+ karcinomu prsu. nûní uveden˘ch prognostick˘ch indexÛ je zfiejmé Ïe, za urãit˘ch Základním pfiedpokladem pro uplatnûní individuálního pfií- okolností pacientky s „basal- like“ karcinomem nemusí b˘t stupu k „basal-like“ karcinomÛm v bûÏné klinické praxi je sta- vÛbec indikovány k adjuvantní chemoterapii, coÏ mÛÏe nega- novení panelÛ monoklonálních protilátek, které by je dokáza- tivnû ovlivnit v˘sledky parametrÛ pfieÏití (OS, RFS). ly s dostateãnou specificitou a senzitivitou identifikovat. Po pfieãtení v˘‰e uvedeného textu si mÛÏeme souhrnû odpo- Nûkolik prací na toto téma jiÏ bylo publikováno, pfiiãemÏ nej- vûdût na otázku v úvodu této kapitoly. Na nepfiíznivé prognó- ãastûji je urãení „basal-like“ karcinomu zaloÏeno na v˘sledku ze „basal-like“ karcinomÛ prsu se podílí nejenom jejich agre- detekce cytokeratinu 5, 6, 17, 19, moesinu, fascinu a c-Kit., sivní vlohy, ale rovnûÏ i dosavadní léãebn˘ pfiístup, kter˘ Her-1, Her-2, ER, PR a p53 (4,9,33,34). nezohledÀuje existenci ani nenabízí cílenou léãbu tûchto kar- cinomÛ. Proto je reáln˘ pfiedpoklad, Ïe v pfiípadû uplatnûní 3. Prediktivní a prognostické profily genové exprese u kar- individuálního postupu, mÛÏe nastat zlep‰ení léãebn˘ch cinomÛ prsu v˘sledkÛ „basal-like“ karcinomÛ. JiÏ v souãasnosti je moÏné Indikace adjuvantní léãby u ãasn˘ch stádií karcinomu prsu se vÛãi pacientkám s triple-negativním fenotypem uplatÀovat v praxi klinického onkologa opírá zejména o existenci nûko- pfiedpoklad agresivního chování choroby a indikovat adju- lika prognostick˘ch systémÛ. Mezi nejroz‰ífienûj‰í bezespo- vantní léãbu chemoterapií i v pfiípadû I. klinického stádia. ru patfií prognostické skórovací systémy vze‰lé z kritérií dopo- U pacientek ve vûku, kter˘ sám o sobû není indikací k vy‰et- ruãen˘ch skupinou expertÛ NIH (11) a ze závûrÛ konference fiení klinick˘m genetikem, je vhodné tuto moÏnost nabídnout v St. Gallen (12). V podobû internetové aplikace je dostupn˘ a testování na pfiítomnost mutace BRCA1 genu provést. Vez- systém „Adjuvant on-line“ (13). Uvedené systémy jsou pra-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 375 videlnû evaluovány, a proto v souãasnosti zahrnují nejenom 3.2.1. Indikace adjuvantní chemoterapie klinické ukazatele (napfi. vûk pacientky, velikost primárního I pfiesto, Ïe na molekulární úrovní definovaná klasifikace kar- tumoru), ale i histopatologické charakteristiky nádoru (gra- cinomÛ prsu obsahuje i prognostické informace, fiada v˘zkum- ding, exprese estrogenov˘ch a progesteronov˘ch receptorÛ), n˘ch t˘mÛ se snaÏila identifikovat prognostické profily geno- na základû kter˘ch rozdûlují pacientky do dvou hlavních pro- vé exprese nezávisle na taxonomick˘ch jednotkách. Z dosud gnostick˘ch skupin ve vztahu k riziku ãasného relapsu cho- proveden˘ch anal˘z vypl˘vá, Ïe v pfiípadû karcinomu prsu je roby. Na stranû druhé tyto systémy ãasto selhávají a pro pre- moÏné prognózu v˘voje onemocnûní stanovit z profilu geno- dikci léãebné odpovûdi jsou nepouÏitelné. Na jejich základû vé exprese primárního tumoru jiÏ v dobû diagnózy choroby je v‰ak indikována adjuvantní chemoterapie u 80% pacien- (5). tek, i kdyÏ víme, Ïe pouze polovina z nich bude postiÏena Laura van’t Veer, Marc J. van de Vijver a Yixin Wang publi- relapsem choroby a následnû podlehne metastatickému one- kovali velmi nadûjné studie, jejichÏ v˘sledkem byly profily mocnûní (14). Nejist˘ efekt chemoterapie a riziko akutních genové exprese, které dokázaly stratifikovat pacientky s kar- i dlouhodob˘ch neÏádoucích úãinkÛ této léãby, pfiedstavují cinomem prsu lokalizovan˘m pouze na oblast mammy, bez stál˘ a intenzivní stimul ke hledání prediktivní a prognostik˘ch prokázaného postiÏení regionálních lymfatick˘ch uzlin a vzdá- faktorÛ. len˘ch metastáz (dále jen pT≤2pN0M0), do skupiny s nízk˘m, nebo s vysok˘m rizikem vzdáleného relapsu (M1) choroby 3.1. Prognostick˘ v˘znam molekulární taxonomie v prÛbûhu pûti let od zahájení léãby (dále jen „ãasn˘ relaps“. Stanfordsk˘ t˘m prokázal, Ïe mezi jednotliv˘mi skupinami Nizozemská skupina autorÛ, pod vedením Laury van’t Veer, karcinomÛ prsu definovan˘mi na podkladû pfiíslu‰nosti k urãi- provedla v roce 2001 DNA ãipovou anal˘zu 117 karcinomÛ tému profilu genové exprese, existují statisticky v˘znamné prsu, ve které identifikovala profil genové exprese mající sil- rozdíly v parametrech RFS a OS. Tyto rozdíly byly reprodu- n˘ vztah k predikci ãasného relapsu choroby. Aby bylo moÏ- kovatelné i na nezávislém souboru pacientek nizozemsk˘ch né validovat v˘sledky pfii omezeném poãtu karcinomÛ, roz- autorÛ. Nejhor‰í prognózu vykazovala skupina „basal-like“ dûlili autofii soubor na cviãnou (training-set) a kontrolní karcinomÛ, následovaná „Her-2+“ karcinomy. V obou pfiípa- (test-set) skupinu. Pomocí specifick˘ch biostatistick˘ch anal˘- dech více neÏ 60% pacientek nedosáhlo RFS 48 mûsícÛ. Nao- z identifikovali ve cviãeném souboru profil 70 genÛ, jejichÏ pak nejlep‰ích v˘sledkÛ vykazovala skupina karcinomÛ hodnoty exprese se li‰ily mezi karcinomy pocházejícími od „luminal-like A“, kde osmiletého OS a RFS dosáhlo pfiibliÏ- pacientek s ãasn˘m nebo pozdním relapsem choroby nû 90% a 70% pacientek. Pacientky s karcinomy „luminal- (p=0,0018). Tento profil následnû testovali na kontrolní sku- like B“, nebo „normal breast-like“ dosahovaly tûchto para- pinû karcinomÛ. Senzitivita a specificita profilu pro rozdûlení metrÛ mezi 40 - 60 % (3,4,5), (obrázek ã. 1/II.-1/IV.). pacientek do v˘‰e uveden˘ch rizikov˘ch skupin dosáhla 91% Rouzier a kol. si poloÏili otázku: Souvisí odli‰ná prognóza a 73% a vícerozmûrné anal˘zy prokázaly jeho nezávislost na jednotliv˘ch molekulárních variant karcinomu prsu více dosud pouÏívan˘ch klinicko-patologick˘ch parametrech (veli- s jejich chemosenzitivitou, nebo se jedná spí‰e o odraz jejich kost tumoru, postiÏení lymfatick˘ch uzlin, stav hormonálních metastatického potenciálu? Autofii vybrali 82 pacientek receptorÛ, angioinvaze, grading) (p<0,001). Identifikace sku- s karcinomem prsu I. aÏ III. klinického stádia, kter˘m byla piny genÛ, jejichÏ profil exprese je zfietelnû asociován s ãas- podávána neoadjuvantní chemoterapie zaloÏená na sekvenã- n˘m relapsem choroby dokazuje, Ïe tyto karcinomy mûly jiÏ ním reÏimu Paklitaxel+FAC. Pfied zahájením léãby byla od poãátku svého vzniku metastatick˘ fenotyp a samotn˘ roz- pacientkám provedena tenkojehlová aspirace nádorov˘ch sev maligních bunûk nemusí probíhat pouze lymfatickou ces- bunûk z tumoru pro úãel mikroãipové anal˘zy, na jejímÏ tou (5). základû byl soubor rozdûlen na jednotlivé molekulárnû defi- O dva roky pozdûji publikoval nizozemsk˘ t˘m dal‰í práci, ve nované taxonomické jednotky. Karcinomy typu „luminal- které autofii testovali „svÛj“ 70-genov˘ prognostick˘ profil na like“ byly zastoupeny v 37%, „normal breast-like“ ve 12%, rozsáhlém souboru 295 pacientek, jehoÏ charakteristika je „basal-like“ ve 27% a „Her-2+“ ve 24%. Patologická kom- podrobnû rozvedena v tabulce ã. 2 (Vijver a kol.). Souhrnû pletní remise tumoru (pCR) nastala nejãastûji ve skupinû mÛÏeme fiíci, Ïe se opût jednalo o pacientky s karcinomem prsu „basal-like“ a „Her-2+“. V obou pfiípadech dosáhlo pCR lokalizovan˘m na oblast mammy, v tomto pfiípadû v‰ak zcela 45% pacientek. Naopak v pfiípadû „luminal- like“ karcino- zámûrnû pfiibliÏnû polovina mûla prokázané postiÏení regio- mÛ byla pCR detekována pouze v 6% pfiípadÛ a u „normal nálních lymfatick˘ch uzlin (pN1). Více neÏ dvû tfietiny karci- breast-like“ karcinomÛ nebyla zji‰tûna vÛbec. Autofii násled- nomÛ exprimovalo estrogenov˘ receptor. Pacientky byly léãe- nû identifikovali profil genové exprese, kter˘ predikoval né chirurgicky, a pokud byla indikovaná, následovala pCR v souvislosti s danou léãbou. Multivariabilní anal˘za zaji‰Èovací radioterapie . Adjuvantní chemoterapii obdrÏelo v‰ak neprokázala jeho nezávislost, neboÈ stejného rozdûle- 37% pacientek. V retrospektivní anal˘ze dokázal 70-genov˘ ní bylo dosaÏeno i pfii kombinovaném pouÏití klinicko-pato- profil spolehlivû urãit riziko relapsu pacientek, a to nezávisle logick˘ch parametrÛ: vûku a exprese estrogenového recep- na stavu postiÏení lymfatick˘ch uzlin a fiady dal‰ích klinick˘ch toru. Tento v˘sledek byl bezesporu ovlivnûn netypick˘m parametrÛ (p<0,001, obrázek ã. 2A-2D). Ve skupinû 151 paci- zastoupením jednotliv˘ch skupin karcinomÛ v pomûrnû entek s karcinomem lokalizovan˘m pouze na oblast prsu malém souboru, kdy karcinomy typu „basal-like“ a „Her- (pT≤2pN0M0) provedli autofii velmi zajímavé srovnání mezi 2+“ tvofiily více neÏ jeho polovinu. Pouze pro skupinu údaji o prognóze pacientek dosaÏen˘mi na základû profilu geno- „basal-like“ karcinomÛ bylo moÏné identifikovat specifick˘ vé exprese, nebo kritérií doporuãen˘ch skupinou expertÛ NIH, profil genové exprese, kter˘ byl nezávisl˘m prediktorem ãi ze závûrÛ konference v St. Gallen. V˘sledky tohoto srovná- pCR (15). ní jsou shrnuty v tabulce ã. 3 a 4. Mezitím co oba klinicko-pato- logické prognostické systémy identifikovaly v dané skupinû 3.2. Prognostické profily nezávislé na molekulární taxo- pouze 7-15% pacientek s nízk˘m rizikem relapsu, na podkla- nomii dû profilu genové exprese tvofiila tato skupina 39%. O pro- V úvodu k dal‰ím kapitolám musíme poznamenat, Ïe jsme mûli gnostické síle genového profilu vypovídá nejlépe skuteãnost, snahu zachovat pro termíny „predikce“ a „prognóza“ vyme- Ïe pouze 13,2% pacientek s predikovan˘m nízk˘m rizikem zení ve smyslu predikce odpovûdi na léãbu a prognóza pro pfie- bûhem 10 let zrelabovalo (16). Tyto v˘sledky podnítily nizo- Ïití nebo událost spojenou s relapsem/progresí choroby. ¤ada zemské autory k realizaci první klinické studie, která do jed- publikací, ze kter˘ch jsme ãerpali, v‰ak takovéto vymezení notliv˘ch ramen „randomizuje“ pacientky na základû v˘‰e u- nemûla, a proto jsou i v na‰em textu oba pojmy ãasto zastupi- vedeného profilu genové exprese. Jedná se o prospektivní telné. multicentrickou studii tfietí fáze organizovanou pod zá‰titou

376 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 EORTC (protokol 10041-BIG-3-04), která byla zahájena v roce zahrnovala 115 pacientek a slouÏila k identifikaci prognostic- 2006 a poãítá s náborem 6000 pacientek s ãasn˘m karcinomem kého profilu genové exprese. Druhá ãást, kontrolní soubor prsu, omezen˘m pouze na oblast mammy (pT≤3pN0M0). Jak („test set“), slouÏila k nezávislému ovûfiení v˘sledkÛ získa- název klinické studie „Microarray In Node negative Disease n˘ch z anal˘zy cviãného souboru. Oba soubory obsahovaly ve may Avoid ChemoTherapy“ (zkratka „MINDACT“) napoví- stejném pomûru pacientky s pozitivní a s negativní expresí dá, jejím primárním cílem je srovnat, zda je ve v˘bûru pacien- estrogenového receptoru. Mikroãipová anal˘za cviãného sou- tek pro adjuvantní chemoterapii efektivnûj‰í 70-genov˘ pro- boru identifikovala u ER+ pacientek 60 genÛ a u ER- pacien- gnostick˘ profil, nebo stávající klinicko-patologická kritéria. tek 16 genÛ, které dohromady vytvofiily profil genové expre- Schéma studie pfiedstavuje obrázek ã. 3. Na zaãátku studie je se schopn˘ rozdûlit pacientky do skupiny s nízk˘m, nebo u kaÏdé pacientky stanoveno riziko ãasného relapsu nemoci na s vysok˘m rizikem ãasného vzdálenostního relapsu (obrázek základû 70-genového profilu exprese a klinicko-patologick˘ch ã. 2E a 2F). Stejnû jako v pfiedchozí práci, i zde autofii provedli kritérií (Adjuvant on-line). PakliÏe oba prognostické systémy srovnání s klinicko-patologick˘mi prognostick˘mi systémy zafiadí pacientku do skupiny s nízk˘m rizikem ãasného relapsu, a dospûli k podobn˘m v˘sledkÛm, které jsou shrnuty v tabul- není indikována adjuvantní chemoterapie. V opaãené situaci ce ã. 3 a 4 (10). ano. Pfiedpokládá se, Ïe ve vût‰inû pfiípadÛ dojde k neshodû v˘sledkÛ obou prognostick˘ch systémÛ, kdy jeden nebo druh˘ zafiadí pacientku do nízkého nebo vysokého rizika ãasného relapsu. Za tûchto okolností budou pacientky randomizovány do dvou skupin. V první bude o indikaci chemoterapi rozhod- nuto na základû v˘sledku klinicko-patologického prognostic- kého systému, ve druhé na základû v˘sledku 70-genového prognostického systému. U pacientek, které budou indikovány k aplikaci adjuvantní chemoterapie dojde k dal‰í radnomizaci, která je rozdûlí do ramene s chemoterapií zaloÏenou na antra- cyklinu, nebo na kapecitabinu a docetaxelu. Pacientky s tumorem exprimujícím estrogenové receptory budou dále randomi- zovány do ramene s dvoulet˘m podáváním tamoxifenu následovan˘m pûtiletou léãbou letrozolem, nebo do ramene se samotn˘m letrozolem aplikovan˘m po dobu sedmi let. Posled- ní dvû randomizace vycházejí z druhotn˘ch cílÛ studie, ve kte- ré chtûjí pofiadatelé srovnat efektivitu a bezpeãnost obou ramen s chemoterapií a hormonoterapií. Na nezávislém souboru ãítajícím 286 pacientek a za pouÏití jiné mikroãipové technologie publikovali o nûkolik let pozdû- ji podobnou práci i Wang a kol. Podrobnou charakteristiku jejich souboru udává tabulka ã. 2. Struãnû lze fiíci, Ïe se jednalo v˘hradnû o pacientky s karcinomem prsu lokalizovan˘m na oblast mammy (pT≤4M0), bez prokázaného postiÏení regi- onálních lymfatick˘ch uzlin (pN0) a více neÏ dvû tfietiny kar- Z obou prací vypl˘vá, Ïe na základû profilu genové expre- cinomÛ exprimovalo estrogenov˘ receptor. Tumory o velikosti se primárního tumoru lze predikovat v˘voj nádorového one- pT3 a pT4 tvofiily pouze 3% celého souboru. mocnûní mnohem pfiesnûji, neÏ pomocí dosavadních klinicko-patologick˘ch prognostick˘ch systémÛ . Vezmeme-li v úvahu, Ïe u pacientek s negativním postiÏením region- álních lymfatick˘ch uzlin, které nejsou zaji‰tûny adjuvant- ní chemoterapií nastává relaps pfiibliÏnû v 30-40% pfiípadÛ (10), tak distribuce pacientÛ do skupiny s nízk˘m rizikem je v pfiípadû klinicko-patologick˘ch prognostick˘ch systé- mÛ jednoznaãnû poddimenzována (7-15%). Stanovení rizika relapsu na základû profilu genové exprese pfiiná‰í rozdû- lení blíÏící se více pfiirozenému prÛbûhu choroby. Tomu odpovídá jak rozdûlení pacientÛ do obou prognostick˘ch skupin (nízké riziko stanoveno v 35-39%), tak i poãty paci- entÛ dosahujících pûti a desetiletého pfieÏití bez vzniku vzdálen˘ch metastáz (viz. tabulky ã. 3 a 4). I pfiesto, Ïe vûro- hodnost dosaÏen˘ch v˘sledkÛ mikroãipov˘ch anal˘z je pod- loÏena klinick˘m v˘vojem onemocnûní u relativnû vyso- kého poãtu pacientek (s ohledem na finanãní náklady spojené s pouÏitím DNA ãipové technologie), je nutné zmí- nit i nûkolik nejasností, které nám utkvûly v pamûti pfii pro- ãítání uveden˘ch prací. Pfiekvapující je, Ïe ani jeden z pro- filÛ neobsahuje geny, jejichÏ prognostick˘ v˘znam byl u karcinomu prsu jiÏ popsán. Jedná se napfiíklad o Her- 2/neu, cyklin D1, ER-alfa, p53, UPA, PAI-1, c-myc a dal- ‰í. Vysvûtlení se nabízí nûkolik. Vyzvednout chceme sku- teãnost, Ïe v˘‰e uvedené prediktory jsou studovány pfiedev‰ím na úrovni proteinÛ, jejichÏ regulace je Pacientky byly léãené chirurgicky, a pokud byla indikovaná, ovlivÀována posttranslaãními a posttranskripãními mecha- následovala zaji‰Èovací radioterapie. Adjuvantní chemotera- nismy. Profily pfiitom mohou obsahovat geny hrající dÛle- pie nebyla podávána. Pacientky byly rozdûleny na dvû ãásti. Ïitou roli právû v tûchto mechanismech, pfiiãemÏ tato jejich První ãást, oznaãená jako „cviãn˘ soubor“ („training set“), funkce nemusela b˘t dosud odhalena.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 377 Dal‰ím pfiekvapením je, Ïe oba prognostické profily jsou aÏ na bliÏnû u 40% pacientek v‰ak tato léãba na podkladû primární tfii vyjímky tvofieny úplnû jin˘mi geny, a to i pfiesto, Ïe pÛvod- nebo sekundární rezistence selhává a dochází k relapsu cho- nû vznikly anal˘zou karcinomÛ s velmi podobnou histopato- roby. Hormonální léãba se uplatÀuje rovnûÏ v terapii logickou charakteristikou. RovnûÏ klinické parametry soubo- metastatického karcinomu prsu. I v tûchto pfiípadech dfiíve ãi rÛ jsou si velmi podobné. V˘raznûj‰í odli‰nosti jsme nalezli pozdûji dochází k jejímu selhání. pouze ve vûkovém rozloÏení pacientek a v zastoupení jedno- JiÏ jsme uvedli, Ïe molekulární taxonomie rozli‰uje ER+ kar- tliv˘ch stupÀÛ gradingu, kdy ve Wangovû práci je vût‰í zastou- cinomy prsu na dvû skupiny „luminal-like A“ a „luminal-like pení pacientek star‰ích 55 let a men‰í zastoupení dobfie dife- B“, které mají i pfies jednotnou léãbu v˘raznû odli‰nou pro- rencovan˘ch karcinomÛ „G1“ (31% karcinomÛ ve Wangovû gnózou (4). V pfiípadû nalezení vhodn˘ch imunohistoche- souboru ale nemá stanoven grading). Pfiitom stupeÀ gradingu micky vy‰etfiiteln˘ch markerÛ, jenÏ by obû skupiny spolehli- je v fiadû klinick˘ch studií nezávisl˘m prognostick˘m fakto- vû odli‰ily, bylo by moÏné zahájit klinické studie vedoucí rem, a tedy odráÏí biologické vlastnosti tumoru mající základ k optimalizaci léãby rizikov˘ch „luminal-like B“ karcinomÛ. v genovém profilu. Pomineme-li tyto skuteãnosti, odpovûd- RovnûÏ podrobnûj‰í studium jejich molekulární podstaty mÛÏe nost za tak zásadní odli‰nost obou prognostick˘ch genov˘ch pfiinést vysvûtlení pfiíãin selhání antiestrogenové léãby a pfií- profilÛ je moÏné „svést“ rovnûÏ na rozdílné mikroãipové te- padnû odhalit nové terapeutické cíle. chnologie pouÏité v obou studiích. Na tento argument se pfii- Identifikací profilu genové exprese, na jehoÏ podkladû by tom odvolává autorsk˘ t˘m Wangovy práce. Mikroãipové plat- bylo moÏné spolehlivû urãit pacientky, které budou mít nej- formy Affymetrix a Agilent sice detekují genovou expresi více vût‰í benefit z adjuvantní léãby tamoxifenem, nebo naopak neÏ dvou desítek tisíc genÛ, mezi nimi v‰ak existuje variabili- budou ohroÏeny jejím selháním, si vzala za cíl skupina auto- ta hybridizaãních sekvencí a datové anal˘zy (37). rÛ z University of Pittsburgh. V roce 2004 v NEJM publikovali práci, ve které pfiedstavili profil sloÏen˘ z 21 genÛ, jenÏ rozdûlil pacientky do tfií skupin podle rizika relapsu choroby. Tyto geny byly pÛvodnû vybrány ze skupiny 250 kandi- dátních genÛ, o nichÏ existovaly informace, vãetnû v˘sledkÛ DNA ãipov˘ch studií, dokladující jejich prediktivní v˘znam u karcinomu prsu. Analyzovan˘ soubor tvofiilo 668 pacientek s ER+ karcinomem prsu omezen˘m pouze na oblast mammy (pT≤4pN0M0). V‰echny uvedené pacientky byly v rámci protokolu klinické studie NSABP B-14 adjuvantnû léãené tamoxifenem po dobu pûti let a medián jejich sledo- vání pfiesáhl 14 let. K anal˘ze byla pouÏita RNA izolovaná z karcinomÛ fixovan˘ch formalínem a archivovan˘ch v para- Zajímav˘ komentáfi ke studiím Wanga a van’t Veerové se obje- finov˘ch bloãcích a pomocí multiplexové kvantitativní Real- vil v ãasopisu Lancet. Z pohledu biologick˘ch vlastností karci- Time PCR reakce byla stanovena hodnota exprese 21 nomÛ prsu zde byla uãinûna zásadní námitka, která upozornila vybran˘ch genÛ, které se staly základem pro v˘poãet indexu na rozdíl v metodikách práce obou autorsk˘ch t˘mÛ. Mezitím co rizika relapsu „RS-skóre“ (recurrence score). Na základû RS- Y. Wang vyhodnocoval v˘sledky mikroãipov˘ch anal˘z oddû- skóre byly pacientky rozdûleny do tfií skupin: 1. s nízk˘m lenû u karcinomÛ s pozitivní a s negativní expresí estrogenov˘ch (<10%), 2. se stfiedním (10-30%) a 3. s vysok˘m (>30%) rizi- receptorÛ, pfiiãemÏ dva takto detekované prognostické profily ve kem vzdáleného relapsu choroby do 10 let od zahájení adju- finále slouãil dohromady, L. van’t Veerová analyzovala karci- vantní léãby tamoxifenem. Mezitím co v celém souboru nomy neseparovanû. Signální dráha estrogenového receptoru je dosáhlo uveden˘ch 10 let 85% pacientek, ve skupinû s níz- pro nádorovou buÀku mimofiádnû v˘znamná a pfiímo i nepfiímo k˘m, stfiedním a vysok˘m rizikem tomu bylo u 93%, 85% ovlivÀuje expresi mnoha dal‰ích genÛ. Identifikace prognostic- a 31% pacientek (p<0,001). Podrobnû viz. tabulka ã. 5. I pfie- kého profilu je záleÏitost biostatistického zpracování hodnot stoÏe pacientky mlad‰í 50 let (v dobû zahájení léãby) vyka- genové exprese ve vztahu k v˘voji choroby. Vzhledem k mate- zovaly ãastûj‰í v˘skyt relapsÛ, v multivariabilní anal˘ze pfii matick˘m algorytmÛm, které tento vztah definují, v˘bûr prvních pouÏití RS-skóre nebyl vûk signifikantním prognostick˘m nûkolika „nejsignifikantnûji asociovan˘ch“ genÛ mÛÏe mít faktorem. Z ostatních testovan˘ch parametrÛ (velikost tumo- v˘znamn˘ vliv na selekci tûch zb˘vajících, pakliÏe jsou v sil- ru, Her-2 amplifikace, hladina estrogenového receptoru né funkãní biologické vazbû (18). Lze tedy pfiedpokládat, Ïe geny v cytozolu bunûk, grading tumoru) nabyl prognostického mající vztah k signální dráze estrogenového receptoru mohly zí- v˘znamu pouze údaj o gradingu. BohuÏel, i pfies zavedení skat v˘znamnûj‰í zastoupení v profilu L. van’t Veerové. Doká- jednotn˘ch hodnotících kritérií, stanovení gradingu tumoru zat takovou hypotézu, jak jsme jiÏ uvedli, je v‰ak obtíÏné, neboÈ vykazuje do znaãné míry variabilitu závislou na subjektivním u fiady z nich nemusí b˘t tento vztah dosud objeven. úsudku patologa. Autofii proto nechali grading vyhodnotit ne- Obecn˘m problémem vût‰iny mikroãipov˘ch studií je mal˘ závisle tfiemi patology, pfiiãemÏ pouze u ‰patnû diferencova- poãet pacientÛ ve cviãn˘ch souborech, na kter˘ch jsou pro- n˘ch tumorÛ bylo dosaÏeno interpersonální shody. Pfiekva- gnostické profily generovány. Limity poãtu pacientÛ vychá- piv˘m nálezem bylo, Ïe více neÏ tfietina pacientÛ s primárním zejí z finanãní nároãnosti DNA ãipov˘ch anal˘z. I pfii relativ- tumorem nepfiesahujícím 1cm byla ve stfiedním nebo vyso- nû vysokém poãtu pacientek ve cviãn˘ch souborech obou kém riziku s 15-20% v˘skytem relapsu ve sledovaném obdo- anal˘z (78 a 115), je pfii detekci více neÏ 20 000 genÛ v kaÏ- bí (23). dém karcinomu vysoce pravdûpodobné, Ïe i na vysoké hladi- Autofii si poloÏili otázku, zda prognostick˘ v˘znam jejich nû statistické v˘znamnosti (napfi. p < 0,001) bude vybrána 21-genového profilu bude zachován i v pfiípadech, kdy adju- desítka genÛ se silnou, nicménû fale‰nû pozitivní prediktivní vantní hormonoterapii pfiedchází aplikace chemoterapie. hodnotou (18). Pfiedmûtem jejich zájmu se proto staly pacientky zafiazené do klinické studie NSABP B-20. Jednalo se o soubor 651 paci- 3.2.2. Predikce léãebné odpovûdi na tamoxifen entek s ãasn˘m stádiem ER+ karcinomu prsu (pT≤4pN0M0), Tamoxifen je nejãastûji pouÏívany antiestrogen k léãbû karci- které byly léãené adjuvantní hormonoterapií tamoxifenem po nomÛ prsu exprimujících estrogenové receptory. V adjuvant- dobu pûti let (227 pacientek), a nebo adjuvantní chemotera- ní terapii ãasn˘ch stádií pfiedstavuje podávání tamoxifenu pií zaloÏenou na reÏimu MF a CMF s následující hormono- vysoce úãinnou léãbu, která sníÏuje kumulativní riziko relap- terapií tamoxifenem po dobu 5 let (424 pacientek). Medián su choroby o 40 aÏ 50% pro kaÏd˘ rok jejího podávání. Pfii- jejich sledování pfiesáhl 10 let. Obdobnû i zde byly pacient-

378 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 ky rozdûleny na základû RS-skóre do 3 prognostick˘ch sku- hypotéz, které lze z nadhledu na jejich základní podstatu roz- pin (nízké, stfiední a vysoké riziko relapsu). Pacientky s níz- dûlit do dvou smûrÛ. První tvrdí, Ïe nabytí metastatického k˘m RS-skóre dosahovaly nejlep‰ích léãebn˘ch v˘sledkÛ potenciálu vyÏaduje fiadu postupn˘ch specifick˘ch genetic- v prÛbûhu desetiletého sledování. Potvrdil se tak prognos- k˘ch zmûn, které pod vysok˘m selekãním tlakem mohou tick˘ v˘znam RS-skóre, a to nezávisle na skuteãnosti, zda vzniknout pouze v urãité subpopulaci bunûk primárního pacientky absolvují adjuvantní chemoterapii. Podrobnûj‰í tumoru. Druh˘ smûr tvrdí, Ïe získání genové v˘bavy zodpo- údaje viz. tabulka ã.5 (24). PouÏitá metoda byla následnû vûdné za metastázování je stochastick˘ jev, kter˘ mÛÏe patentovaná spoleãností Oncotype (25). postihnout kteroukoliv buÀku primárního tumoru na samot- ném poãátku jejího vzniku. Jednotlivé hypotézy pak jiÏ více 3.2.3. Predikce patologické kompletní remise po neoadju- nebo ménû pfiipou‰tí, Ïe metastatick˘ proces mÛÏe b˘t ovliv- vantní chemoterapii Àován bunûãnou i extracelulární sloÏkou mikroprostfiedí, ve Profil genové exprese byl rovnûÏ pouÏit k predikci patolo- kterém se nádorová buÀka nachází (14,20,21). gické kompletní remise (pCR) u pacientek s karcinomem prsu léãen˘m neoadjuvantní chemoterapií. Retrospektivní anal˘- zy fiady klinick˘ch studií prokázaly, Ïe dosaÏení pCR po neo- adjuvantní léãbû je spojeno s del‰ím bezpfiíznakov˘m a celkov˘m pfieÏitím pacientek (26,27). Pravdûpodobnost dosaÏení pCR je pfii aplikaci souãasn˘ch chemoterapeutick˘ch reÏimÛ pfiibliÏnû 25-30% (24,28). Pokud by byl objeven prediktivní test, kter˘ by dosáhl minimálnû 60% pozitivní prediktivní hodnoty, takto vybrané pacientky by mûly dvojnásobnû vy‰‰í pravdûpodobnost dosaÏení pCR. Ayers a kol. publikovali prá- ci, ve které podrobili mikroãipové anal˘ze 42 primárních kar- cinomÛ prsu od pacientek, jenÏ podstoupily neoadjuvantní chemoterapii reÏimem s paklitaxelem, fluorouracilem, doxorubicinem a cyklofosfamidem (T-FAC). Tfiináct pacientek (31%) dosáhlo pCR. Autofii z 19813 zkouman˘ch genÛ identifikovali 74 genÛ, které byly signifikantnû spojeny s v˘skytem pCR. I pfiestoÏe v kontrolním souboru dosáhl ten- to 74 genov˘ profil 100% specificity, jeho senzitivita byl- a nízká - 43% (28). Podobnou Rouzierovu práci jsme pfiedstavili v kapitole 2.1. (15). Mohlo by se zdát, Ïe k hledání prediktivních markerÛ je model neoadjuvantních chemoterapií více neÏ ideální, neboÈ léãebnou odpovûì lze stanovit v relativnû krátké dobû a úãi- nek chemoterapie není ovlivnûn sekundární rezistencí vznik- lou na podkladû pfiedchozí aplikace cytostatik. K pfiekvapi- vému závûru proto dospûla skupina Hannemannové a kol ., která nedokázala identifikovat Ïádn˘ genov˘ profil, kter˘ by pfiedpovûdûl pCR u pacientek léãen˘ch neoadjuvantní chemoterapií zaloÏenou na reÏimu AC (doxorubicin, cyklo- fosfamid) a AD (doxorubicin, docetaxel) (29). Jen tûÏko vûfií- me vysvûtlení autorÛ, Ïe v daném pfiípadû zfiejmû neexistu- V˘sledky DNA ãipov˘ch anal˘z jednoznaãnû dokazují, Ïe je skupina genÛ, která by dokázala vytvofiit siln˘ prediktivní genovou v˘bavu realizující metastatick˘ potenciál mohou mít profil ve ztahu k pCR u uveden˘ch chemoterapeutick˘ch nádorové buÀky aktivovanou jiÏ od poãátku svého vzniku. reÏimÛ. Negativní stanovisko musíme zaujmout k práci Svûdãí o tom dvû skuteãnosti. Ta první spoãívá ve zji‰tûní, Ïe Changa a kol. publikované v Journal of Clinical Oncology jiÏ u ãasn˘ch karcinomÛ prsu (pT≤2pN0M0) lze v dobû sta- v roce 2005, která prezentovala profil genové exprese pre- novení diagnózy identifikovat profil genové exprese spjat˘ dikujicí rezistenci nebo minimální odpovûì pro karcinomy s ãasn˘m vzdálenostním relapsem choroby (5,16,17). Druhá prsu neoadjuvantnû léãené docetaxelem. Ponûkud zvlá‰tní skuteãnost potvrzuje pfiedchozí. Práce publikované kolektivy se jeví mezní rozdûlení pacientek na docetaxel senzitivní autorek Laury van’t Veer a Britty Weigeltové dokazují, Ïe a rezistentní kritériem dosaÏení 75% procentní redukce nádo- genová exprese primárního tumoru a jeho metastázy je rové masy, pakliÏe 96% pacientek mûlo primární tumor kla- sobû vzájemnû podobná mnohem více, neÏ genová exprese sifikován˘ jako T3 a u 39% z tûchto tumorÛ pfiesáhl jeden mezi jednotliv˘mi primárními tumory nebo mezi metastatic- z rozmûrÛ 10 cm. Samotn˘ profil genové exprese byl stano- k˘mi loÏisky. Dosud necitovaná práce B. Weigeltové analy- ven pouze na vzorku ãítajícím 7 „senzitivních“ a 6 „rezi- zovala expresi 18336 genÛ u osmi párov˘ch vzorkÛ primár- stentních“ tumorÛ (30). ních tumorÛ a jejich vzdálen˘ch metastáz, které vznikly v intervalu 2 aÏ 15 let od diagnózy primárního tumoru. Stej- 4. Pfiíspûvek DNA ãipÛ k v˘voji nového modelu metasta- nou expresi v primárním tumoru a v jeho metastáze vykazo- zování karcinomu prsu valo 17748 aÏ 18271 genÛ (96,7-99,6%), coÏ potvrdilo Metastázování je povaÏováno za poslední a fatální stupeÀ domnûnku, Ïe za metastatick˘ potenciál je zodpovûdná poãet- v relativnû zdlouhavém procesu kancerogeneze solidních nû malá skupina genÛ (5,20). tumorÛ. Metastatick˘ potenciál obná‰í schopnost nádorové Karcinom prsu má svá predilekãní místa metastatického roz- buÀky migrovat extracelulární sloÏkou tumoru, intravazovat sevu. Dal‰í otázkou zÛstává, zda stejné geny, které pfiedurãu- do lymfatického a krevního obûhu, pfieÏít v tomto nepfiízni- jí metastatick˘ potenciál zodpovídají i za orgánov˘ tropismus, vém prostfiedí, pfiestoupit z nûj do jiného orgánu a zde reali- nebo se v tomto pfiípadû jedná o selekãní tlak na genovou v˘ba- zovat svÛj maligní potenciál. Pfiitom pouze ménû neÏ 0,1% vu tumoru vycházející z mikroprostfiedí, ve kterém se nádoro- nádorov˘ch bunûk, které se dostanou do cirkulace, je schop- vé buÀky vyskytují (sloÏení extracelulární mátrix, makrofágy, no zaloÏit Ïivotaschopné metastázy (19). Dosavadní znalos- dendritické buÀky, endotelie, pfiítomnost tumor infiltrujících ti o procesu metastazování slouÏily k podloÏení nûkolika lymfocytÛ)?

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 379 pak sníÏení exprese uveden˘ch genÛ v buÀkách, které pÛvod- nû metastazovaly pouze do plic, zpÛsobilo aÏ desetinásobné sniÏení poãtu plícních metastáz. Objeven˘ genov˘ profil predikující metastatické postiÏení plic autofii následnû ovûfiovali na souboru primárních karcinomÛ prsu získan˘ch od 82 pacientek. Na jeho základû rozdûlili pacientky na skupinu s nízk˘m a s vysok˘m rizikem vzniku metastatického postiÏení plic. Desetiletého období bez vzniku plícních metastáz dosáhlo ve skupinû s nízk˘m rizikem 89% pacientek, mezitím co ve skupinû s vysok˘m rizikem pouze 56% (p<0,0018). Autofii vyslovili hypotézu, Ïe primární tumory, které mají metastatick˘ potenciál, obsahují subpopulace bunûk s orgánovû specifick˘m genov˘ profilem pfiedurãujícím místo jejich metastatického rozsevu (22). Na základû nejnovûj‰ích poznatkÛ, které zahrnují v˘sledky mikroãipov˘ch anal˘z a objev nádorov˘ch kmenov˘ch bunûk, vznikl nov˘ model metastazování karcinomu prsu. Na jeho poãátku stojí fyziologická kmenová buÀka mléãné Ïlázy, kte- rá po dobu své existence akumuluje genové mutace do chví- Obrázek ã. 2.: ·est dílãích grafÛ zobrazuje Kaplan-Meierovy kfiivky prav- le, kdy nabydou transformujícího potenciálu. V tomto oka- dûpodobnosti celkového pfieÏití (OS), nebo pravdûpodobnosti pfieÏití bez mÏiku vzniká nádorová kmenová buÀka, která je pfii v˘skytu vzdáleného relapsu choroby (RFS) v pfiíslu‰né skupinû pacientek neomezeném mnoÏství bunûãného dûlení schopna sebeobno- s nízk˘m (pfiízniv˘ profil exprese), nebo s vysok˘m (nepfiízniv˘ profil vy a diferenciace do stádií jednotliv˘ch maligních progenito- exprese) rizikem ãasného vzdáleného relapsu choroby. Riziko bylo urãe- rÛ. Mezitím co z progenitorÛ vzniká majoritní bunûãná popu- no na základû profilu genové exprese. Grafy „A“ aÏ „D“ byly pfievzaty a upraveny z reference ã. 16 a grafy „E“ a „F“ z reference ã. 17. V obou lace primárního nádoru, která v‰ak nemá potenciál k zaloÏení studiích (ref. ã. 16 a ã. 17) byl pouÏit˘ nezávisl˘ prognostick˘ profil geno- vzdálen˘ch metastáz, samotná kmenová buÀka migruje do vé exprese. Pozor: barevné znaãení kfiívek není v obou studiích totoÏné. krevního obûhu a následnû do jednotliv˘ch orgánÛ, kde mÛÏe i po letech stráven˘ch ve stádiu dormance úspû‰nû zaloÏit Z tohoto pohledu pfiiná‰í zajímavé v˘sledky práce publikova- metastatická loÏiska. Genov˘ program pro specifick˘ orgá- ná Minne a kol. v Nature v roce 2005. Autofii pouÏili bunûã- nov˘ tropismus získává kmenová buÀka interakcí se sv˘m nou linii karcinomu prsu, která byla pÛvodnû izolována z ple- mikroprostfiedím. Tak mohou vzniknout kmenové buÀky urálního v˘potku pacientky v odstupu fiady let od operace schopné zaloÏit metastázy napfiíklad pouze v plících nebo ve primárního tumoru. Tyto buÀky oznaãili za matefiské a pomo- skeletu (14). cí níÏe popsané metodiky mezi matefisk˘mi buÀkami identifikovali ty, jenÏ preferenãnû metastazovaly do plic. BuÀ- 5. Závûr ky matefiské linie vstfiíkli do ocasní Ïíly my‰i. Po prÛkazu Technologie DNA ãipÛ se stala základním nástrojem v˘zkumu plícních metastáz my‰i usmrtili a z plícních loÏisek vyizolo- biologické podstaty a chování karcinomÛ prsu a její v˘sledky vali jednotlivé nádorové buÀky, které po pomnoÏení opût mûní ná‰ pohled na toto onemocnûní. Vznikla molekulární taxo- vstfiíkli do ocasní Ïíly dal‰ích my‰í. Tento proces dvakrát zopa- nomie, která definuje pût skupin karcinomÛ prsu: „luminal-like kovali a v jeho závûru získaly populaci nádorov˘ch bunûk, kte- A“, „luminal-like B“ „basal-like“, „Her-2+“ a skupinu „nor- rá velmi agresivnû zakládala pouze plícní metastázy. Mikro- mal breast-like“, které se v˘raznû li‰í sv˘m klinick˘m prÛbû- ãipovou anal˘zou následnû detekovali profil sloÏen˘ z 54 genÛ, hem. V pfiípadû „luminal-like B“ a „basal-like“ karcinomÛ exi- jejichÏ exprese odli‰ovala nádorové buÀky metastazující do stuje navíc pfiedpoklad, Ïe individualizace terapeutického plic od bunûk pÛvodní matefiské linie. S ohledem na proces pfiístupu mÛÏe vést ke zlep‰ení jejich léãebn˘ch v˘sledkÛ. Nové metastazování obsahoval profil dvû skupiny genÛ. První sku- poznatky pfiinesly DNA ãipové anal˘zy rovnûÏ do procesu pinu tvofiily geny, jejichÏ biologická funkce je obecnû spjatá metastázování, kde dokazují, Ïe genovou v˘bavu realizující s agresivitou a metastázováním nádorÛ. Druhou skupinu pfied- metastatick˘ potenciál mohou mít nádorové buÀky aktivova- stavovaly geny, jejichÏ exprese je v primárním tumoru nízká, nou jiÏ od poãátku svého vzniku. To mÛÏe vysvûtlovat skuteã- ale v˘znamnû se zv˘‰í v okamÏiku, kdy se nádorová buÀka nost, proã stávající klinicko-patologické prognostické systémy, ocitne v místû vhodném pro zaloÏení metastázy. Ze druhé sku- na jejichÏ podkladû je v souãasnosti indikována adjuvantní che- piny uvedeme nûkolik pfiíkladÛ: epiregulin (ligand receptorÛ moterapie, tak ãasto selhávají. Z tohoto dÛvodu byly dal‰í DNA ErbB rodiny), CXCL1 (chemokin), IL13RA2 (receptor pro ãipové anal˘zy zamûfieny na identifikaci prediktivních interleukin 13), ID1 (inhibitor transkripce), MMP1 a 2 (mat- a prognostick˘ch profilÛ genové exprese, které by daleko pfies- rixmetaloproteinázy), SPARC (adhezní molekula), COX2 nûji stanovovaly riziko ãasného relapsu choroby, nebo odpo- a VCAM1 (receptor adheze). Dokonalost jejich práce tkvûla vûì na podanou léãbu. V˘sledkem jsou první klinické studie, pfiedev‰ím ve validaci získan˘ch v˘sledkÛ. Autofii prokázali které za tímto úãelem DNA ãipy pouÏívají. nejenom, Ïe zmûny exprese uveden˘ch devíti genÛ se odráÏe- jí i na proteinové úrovni, ale pfiedev‰ím jednoznaãnou souvis- Podûkování: lost tûchto genÛ se vznikem plícních metastáz. Pokud v matefi- Práce byla podpofiena grantov˘mi projekty: IGA MZâR sk˘ch buÀkách docílili zv˘‰ení jejich exprese, tyto buÀky NR/8335-3, IGA MZâR NR/8270-3, M·MT 6198959216 zakládaly signifikantnû vût‰í mnoÏství plícních metastáz. Nao- a MPO 1H-PK45.

380 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 LITERATURA: 20. Weigelt B, Glas AM, Wessels LF, et al. Gene expression profiles of pri- 1. Novotvary 2003 âR, ÚZIS âR Praha, 2006, str. 31-69. mary breast tumors maintained in distant metastases. Proc Natl Acad Sci. 2. Perou CM, Sorlie T, Eisen MB, et al. Molecular portraits of human breast 2003;100(14):15901-15905. tumours. Nature 2000;406(6797):747-52. 21. Fidler IJ, Kripke ML. Metastasis results from preexisting variant cells wit- 3. Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, et al. Gene expression patte rns of bre- hin a malignant tumor. Science. 1977;197(4306):893-5 . ast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinic al implications. 22. Minn AJ, Gupta GP, Siegel PM, et al. Genes that mediate breast cancer Proc Natl Acad Sci 2001;98(19):10869-74. metastasis to lung. Nature 2005;436(7050):518-524. 4. Sorlie T, Tibshirani R, Parker J., et al. Repeated observatio n of breast tumor subtypes 23. Paik S, Shak S, Tang G, et al. A multigene assay to predict re currence of in independent gene expression data se ts. Proc Natl Acad Sci. 2003;100(14):8418-23. Tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. N Eng l J Med 5. van ‘t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al. Gene expressio n profiling 2004;351(27):2817-26. predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 2002;415(6871):530-6. 24. Paik S, Tang G, Shak S, et al. Gene expression and benefit of chemothera- 6. Aas T, Borresen AL, Geisler S, et al. Specific P53 mutations are associa- py in women with node-negative, estrogen receptor positive breast cancer. ted with de novo resistance to doxorubicin in breast cancer patients. Nat J Clin Oncol 2006;24:3726-3734. Med. 1996;2(7):811-4. 25. www.oncotypedx.com 7. Bergh J, Norberg T, Sjogren S, et al. Complete sequencing of the p53 gene 26. Fisher B, Bryant J, Wolmark N, et al.Effect of preoperative chemotherapy provides prognostic information in breast cancer patients, particularly in on the outcome of women with operable breast cancer. J Clin Oncol relation to adjuvant systemic therapy and radiotherapy. Nat Med. 1998;16:2672-2685. 1995;1(10):1029-34. 27. Kuerer HM, Newman LA, Smith TL, et al. Clinical course of breast can- 8. Korsching E, Packeisen J, Agelopoulos K, et al. Cytogenetic a lterations cer patients with complete pathologic primary tumor and axillary lymph and cytokeratin expression patterns in breast cancer: integrating a new node response to doxorubicin-based neoadjuvant chemot herapy. J Clin model of breast differentiation into cytogenetic pathways of breast carci- Oncol 1999;17:460-469. nogenesis. Lab Invest. 2002;82(11):1525- 33. 28. Ayers M, Symmans WF, Stec J, et al. Gene expression profiles predict com- 9. Nielsen T, Hsu F, Jensen K., et al. Immunohistochemical and c linical cha- plete pathologic response to neoadjuvant paclitaxel and fluorouracil, doxo- racterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma. : Clin rubicin, and cyclophosphamide chemotherapy in b reast cancer. J Clin Oncol Cancer Res. 2004;10(16):5367-74. 2004;22:2284-2293. 10. Majdak EJ, Debniak J, Milczek T, et al. Prognostic impact of B RCA1 pat- 29. Hannemann J, Oosterkamp HM, Bosch CA, et al. Changes in gene e xpres- hogenic and BRCA1/BRCA2 unclassified variant mutations in patients sion associated with response to neoadjuvant chemotherapy in breast can- with ovarian carcinoma. Cancer. 2005;104(5):1004-12. cer. J Clin Oncol 2005;23:3331-3341. 11. Eifel P, Axelson JA, Costa J, et al. National Institutes of He alth Consensus 30. Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A, et al. Patterns of resistanc eand incom- Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer, plete response to docetaxel by gene expression profiling in breast cancer November 1-3,2000. J Natl Cancer Inst 2001;93: 979-89. patients. J Clin Oncol 2005;23:1169-1177. 12. Goldhirsch A, Glick JH, Gelber RD, et al. International Consen sus Panel 31. Foulkes WD. BRCA1 and BRCA2: Chemosensitivity, Treatment Outco on the Treatment of Primary Breast Cancer: Seventh Inte rnational Confe- mes and Prognosis. Fam Cancer 2006;5(2):135-42. rence on Adjuvant Therapy of Primary Breast Cancer. J Clin Oncol 32. Dana-Farber Clinical Trial No.: DFCI 04-183. Preoperative Cisplatin in 2001;19:3817-27. Early Stage Breast Cancer, II Phase Study. www.dfci.harvard.edu 13. www.adjuvantonline.org, Adjuvant Inc., USA. 33.Rodriguez-Pinilla SM, Sarrio D, Honrado E, et al. Prognostic sig- 14. Weigelt B, Peterse J, van’t Veer L, et al. Breast Cancer Metas tasis: Mar- nificance of basal-like phenotype and fascin expression in node- kers and Models. Nature Rev Cancer 2005;5:591-602. negative invasive breast cancer. Clin Cancer Res 2006;12(5):1533- 15. Rouzier R, Perou CM, Symmans WF, et al. Breast Cancer Molecular Sub- 1539. types Respond Differently to Preoperative Chemotherapy. Clin Cancer Res 34. Charafe-Jauffret EA, Monville F, Finetti P, et al. Definition of basal-like 2005;11(16):5678-5685. breast tumors: Validation of new protein markers. Proc Amer Assoc Can- 16. van de Vijver MJ, He YD, van’t Veer LJ, et al.: A gene-expression signature as cer Res 2006;47:3602. a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002;347(25):1999-2009. 35. Matros E, Wang ZC, Lodeiro G, et al. BRCA1 promoter methylation in 17. Wang Y, Klijn JGM, Zhang Y, et al. Gene-expression profiles to predict sporadic breast tumors: realtionship to gene expression profiles. Breast Can distant metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer. Lancet Res Treatment 2005;91:179-186. 2005;365:671-679. 36. West M, Blanchette C, Dressman H, et al. Predicting the clinic al status of 18. Jenssen TK, Hoving E. Gene-expression profiling in breast cancer. Lancet human breast cancer by using gene expression profile s. Proc Natl Acad 2005;365:634-635. Sci 2001;98(20):11462-7. 19. Fidler IJ. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumour 37. Cheadle C, Becker KG, Cho-Chung YS, et al. A rapid method for micro- embolilabeled with 125-I-5-iodo-2-deoxyuridine. J Natl Cancer Inst. array cross platform comparisons using gene expression signa tures. Mol 1970;45:773-782. Cell Probes 2006. In press.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 381 STUDIUM PATOGENEZE KOLOREKTÁLNÍCH KARCINOMÒ POMOCÍ PROFILÒ GENOVÉ EXPRESE A MOÎNOSTI JEJICH VYUÎITÍ V DIAGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ ONKOLOGII STUDIES ON COLORECTAL CANCER PATHOGENESIS BY GENE EXPRESSION PROFILES AND POSSIBILITIES OF THEIR APPLICATION TO DIAGNOSTIC AND PREDICTIVE ONCOLOGY SLAB¯ O.1, GARAJOVÁ I.2, SVOBODA M.2, KOCÁKOVÁ I.2, VYZULA R.2

1 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV, ODDùLENÍ KLINICKÉ A EXPERIMENTÁLNÍ PATOLOGIE, BRNO 2 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV, KLINIKA KOMPLEXNÍ ONKOLOGICKÉ PÉâE, BRNO

Souhrn Technologie DNA ãipÛ je v souãasné dobû nejúãinnûj‰í a nejroz‰ífienûj‰í metodou studia genové exprese. Poãet pra- cí vyuÏívajících tuto technologii v posledních letech exponenciálnû narÛstá a moÏnosti jejího vyuÏití se v˘raznû posu- nuly z oblasti experimentální do oblasti klinické. Ve v˘zkumu kolorektálních karcinomÛ bylo za posledních pût let vyuÏito DNA ãipÛ ve více neÏ ‰edesáti studiích. Tyto práce popisovaly schopnost ãipÛ odli‰it nádorovou tkáÀ od zdravé stfievní sliznice, rozdûlit nádory podle histopatologického stádia, anatomické lokalizace, mikrosatelitní nestability, determinovat znaky regionálních a vzdálen˘ch metastáz v primárních nádorech, predikovat léãebnou odpo- vûì a identifikovat prognostické skupiny pacientÛ. Srovnatelnost areprodukovatelnost v˘sledkÛ DNA ãipov˘ch stu- dií bohuÏel v˘raznû ovlivÀuje jejich technologická rozmanitost. Pfiesto jsme nalezli nûkolik desítek genÛ, potenciálních markerÛ kolorektální karcinogeneze, jejichÏ pozmûnûná exprese v nádorové tkáni byla pozorována ve dvou a více nezávisl˘ch studiích. Slibné v˘sledky pfiinesly práce zamûfiené na vyuÏití profilÛ genové exprese ke stanovení pro- gnózy. PrÛmûrná senzitivita predikce relapsu nádorového onemocnûni, vzdálenostní progrese adélky celkového pfie- Ïití pomocí profilÛ genové exprese byla pro v‰echny tfii parametry pfiibliÏnû 80%. Dobré analytické vlastnosti pro- kázaly DNA ãipy také v predikci léãebné odpovûdi. Klinické vyuÏití profilÛ genové exprese bude znamenat zásadní krok vedoucí smûrem k individualizaci léãby a dispenzarizace pacientÛ s kolorektálními karcinomy.

Klíãová slova: kolorektální karcinom, DNA ãipová technologie, genová exprese, patogeneze, prognóza, predikce léãebné odpovûdi

Summary DNA microarray technology is currently the most effective and widespread technique used for gene expression studies. Over the last years the number of reports related to this technology exponentially increases and possibilities of DNA microarrays usage markedly drifted from basic to clinical research. DNA microarrays were used in more than sixty studies focused on colorectal cancer during last five years. This reports show efficiency of this technology to distinguish tumor from normal colonic tissue and classify tumors in order to their pathological grade, anatomic localization and microsatellite status. Subsequent papers demonstrate abilities of gene expression profiles to determina- te molecular signature of metastatic disease in primary tumors and predict therapy response and disease prognosis. However, comparability and reproducibility of studies based on DNA microarrays are notably affected by their tech- nological diversity. Anyway, we found several genes (potential markers of colorectal carcinogenesis) with altered expression in tumors identified by two or more independent studies. Promising resultswere reached by gene expression profiles in prediction of colorectal cancer prognosis. DNA microarrays showed good analytical ability also in therapy response prediction. Clinical application of gene expression profiles will be the important advance leading to individualized therapy and dispensarization of patients with colorectal cancer.

Key words: colorectal cancer, DNA microarray technology, gene expression, pathogenesis, prognosis, prediction of therapy response

1. Úvod onemocnûní pfii zahájení léãby. Klinick˘ v˘zkum se proto Kolorektální karcinomy (KRK) patfií v âeské republice v souãasné dobû zamûfiuje na prevenci, vãasnou detekci, opti- k nejãetnûj‰ím nádorov˘m onemocnûním. Poslední publiko- mální selekci pacientÛ pro adjuvantní chemoterapii a indivi- vaná data udávají jejich roãní incidenci 78 pfiípadÛ a mortali- duální chemoterapeutick˘ plán zaloÏen˘ na biologick˘ch vlast- tu 41 pfiípadÛ na 100.000 obyvatel. To na‰i zemi fiadí na prv- nostech konkrétního nádoru. ní místo v Evropû a jedno z pfiedních míst ve svûtû. V léãbû Technologie DNA ãipÛ umoÏÀuje ve velmi krátkém ãase para- tohoto onemocnûní i pfies vzrÛstající náklady není dosahová- lelnû monitorovat expresi tisícÛ genÛ, pfiípadnû cel˘ lidsk˘ no uspokojiv˘ch v˘sledkÛ. Prognóza pacientÛ závisí nejen na genom na úrovni RNA (tedy transkriptom) [1,2]. Díky v˘raz- pouÏit˘ch léãebn˘ch modalitách, ale i na stavu pokroãilosti n˘m alteracím v expresních profilech „zbláznûné“ nádorové

382 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 buÀky je ideální aplikací pro tuto technologii právû onkolo- variabilitû v˘sledkÛ dal‰í faktory jako nehomogenní soubory gick˘ v˘zkum [3]. Posun z oblasti základního v˘zkumu ke kli- pacientÛ, rozdílná kriteria pro kvalitu vstupního materiálu, vali- nickému vyuÏití DNA ãipÛ znamenala práce T. R. Goluba dace v˘sledkÛ alternativní metodikou, variabilita statistick˘ch a kol. (1999) publikována v Science. Pomocí profilÛ genové metod, rÛzná kriteria statistické v˘znamnosti nebo tzv. ische- exprese dokázal odli‰it pacienty s akutní myeloidní a akutní mické zdrÏení (ãas od podvázání cév do zamraÏení vzorku) T- a B-lymfoblastickou leukémií [4]. Klíãovou práci z hledis- [25-27]. Díky v˘‰e uveden˘m faktorÛm mÛÏeme z velkého ka onkologické prognostiky provedla van’t Veerová a kol. mnoÏství doposud identifikovan˘ch genÛ pouze malé mnoÏ- (2002), která analyzovala profily genové exprese primárních ství povaÏovat za kandidátní geny nádorové transformace. nádorÛ pacientek s karcinomem prsu a pomocí 70 genÛ byla Vybrané studie srovnávající profily genové exprese u nádoro- schopná predikovat metastázování nov˘ch pacientek s 89% vé tkánû a normálního stfievního epitelu jsou shrnuty pfiesností [5]. Tato sada genÛ je v souãasnosti ovûfiována mul- a charakterizovány v tabulce ã.1. I pfies rozmanitost ãipov˘ch ticentrickou klinickou studií a ãeká na svoje uplatnûní v ru- platforem a nekonzistentnost metodick˘ch postupÛ se nám tinní klinické praxi. podafiilo nalézt nûkolik desítek genÛ s pozmûnûnou expresí Technologie DNA ãipÛ byla bûhem poledních sedmi let opa- identifikovanou ve dvou a více nezávisl˘ch studiích [28]. Tyto kovanû vyuÏívána rovnûÏ ve v˘zkumu kolorektálních karci- geny jsou shrnuty s konkrétními citacemi a rozãlenûny podle nomÛ. Cílem tohoto pfiehledu je shrnout nejen nové poznatky biologické funkce v tabulce ã. 2. U vût‰iny z nalezen˘ch genÛ o karcinogenním procesu, kter˘ch bylo pomocí DNA ãipové byla jiÏ dfiíve pozorována pozmûnûná exprese buì pfiímo technologie dosaÏeno, ale také v˘sledky klinick˘ch studií u KRK nebo u jin˘ch typÛ nádorov˘ch onemocnûní. zamûfien˘ch na prognózu a predikci léãebné odpovûdi KRK Velkou skupinu z tûchto genÛ tvofií regulátory bunûãného cyk- a zhodnotit moÏnosti vyuÏití profilÛ genové exprese k indivi- lu a apoptózy, onkogeny a nádorové supresory. Typick˘m dualizaci léãby a dispenzarizace pacientÛ s kolorektálními kar- regulátorem bunûãného cyklu je CDC25B, ãlen CDC25 fos- cinomy [6]. fatázové rodiny, kter˘ aktivuje cyklin-dependentní kinázu CDC2 a je proto klíãov˘ pro indukci M-fáze bunûãného cyk- 2. Srovnání expresních profilÛ nádorové tkánû a normál- lu, s ãímÏ souvisí jeho onkogenní vlastnosti. Zv˘‰ené hladiny ní stfievní sliznice chemokinu a rÛstového onkogenu GRO-1 strukturnû podob- Doposud nejvût‰í mnoÏství DNA ãipov˘ch studií bylo zamû- ného interleukinu 8, byly jiÏ asociovány se ztrátou kontroly fieno na srovnávání expresních profilÛ nádorové tkánû a k ní bunûãného cyklu a angiogenezí u melanomu [29] a karcino- pfiiléhající normální stfievní sliznice [7-23, 35]. V˘stupem mu prostaty [30]. Zv˘‰ená exprese onkogenu MYC, kter˘ má z tûchto studií byla vÏdy sada genÛ s pozmûnûnou expresí, na klíãovou úlohou v kontrole bunûãné proliferace a diferenciace, základû které bylo moÏné s urãitou citlivostí rozli‰it nádoro- byla pozorována ve více neÏ 70% KRK [31]. NárÛst hladin vou tkáÀ od normálního stfievního epitelu. Byly takto identifi- onkogenu MYC byl opakovanû potvrzen pomocí DNA ãipÛ. kovány stovky nov˘ch genÛ, potenciálních markerÛ nádorové Onkogen MYC je jedním z cílov˘ch genÛ regulovan˘ch β- transformace, ale bohuÏel pfii minimálním prÛniku nalezen˘ch kateninov˘m komplexem. β-katenin je ve zdravé tkáni inhi- genov˘ch sad mezi jednotliv˘mi studiemi. bován produktem APC (adenomatous polyposis coli) genu, KdyÏ opomeneme základní parametry ovlivÀující váhu studie jehoÏ alterace se vyskytují u vût‰iny KRK. Mutované formy jako je napfiíklad poãet zkouman˘ch vzorkÛ [24], podílí se na APC genu ztrácí schopnost vázat se na β-katenin, kter˘ mÛÏe

Tabulka ã. 1: Vybrané ãipové studie zamûfiené na molekulární charakterizaci kolorektálních karcinomÛ Reference Rok âipová platforma N sond N genÛ +/- Poãet vzorkÛ Validace Srovnání nádorové tkánû a normální stfievní sliznice Notterman a kol. (10) * 2001 Affymetrix GeneChip 6600 19/47 22 NSE, 4 AD, 18 KRK RT-PCR Takemasa a kol. (13) 2001 cDNA microarray 4608 23/36 16 NSE, 16 KRK Agrawal a kol. (35) 2002 Affymetrix GeneChip 12000 339 10 NSE, 60 KRK NB, TMA Birkenkamp-Demtroder a kol. (15) 2002 Affymetrix GeneChip 6800 88/70 6 NSE 21 LKRK RT-PCR Lin a kol. (16) * 2002 cDNA microarray (LCM) 23040 50 20 NSE, 11 KRK, 9 AD Williams a kol. (19) 2003 cDNA microarray 9592 574/2058 20 NSE, 20 KRK RT-PCR Bertucci a kol. (20) 2004 cDNA microarray 8074 130/115 23 NSE, 22 KRK TMA Birkenkamp-Demtroder a kol. (22) 2005 Affymetrix GeneChip 7129 80 20 NSE, 25 KRK RT-PCR Croner a kol. (7) 2005 Affymetrix GeneChip 22284 168/283 10 NSE, 10 KRK Jansová a kol. (8) 2006 cDNA microarray 19008 31/164 18 NSE, 18 KRK RT-PCR Kolorektální karcinomy rÛzné anatomické lokalizace Bertucci a kol. (20) 2004 cDNA microarray 8074 46 10 LKRK, 9 PKRK TMA Birkenkamp-Demtroder a kol. (22) 2005 Affymetrix GeneChip 7129 30 15 LKRK, 10 PKRK RT-PCR Srovnání kolorektálních karcinomÛ vzhledem k mikrosatelitní nestabilitû Mori a kol. (38) 2003 cDNA microarray 8064 20 12 MSIK, 29 MSSK RT-PCR Banerjea a kol. (39) 2004 Affymetrix GeneChip 22284 542 29 MSIK, 104 MSSK RT-PCR Primární nádory ve vztahu k rozvoji regionální a vzdálenostní progrese Yanagawa a kol. (42) 2001 cDNA microarray (LCM) 9121 40/7 10 KRK, 10 HMKRK RT-PCR Bertucci a kol. (22) 2004 cDNA microarray 8074 46 6 KRKN0, 13KRKNX TMA Croner a kol. (40) 2005 Affymetrix GeneChip 22284 neuvedeno 41 KRKN0, 25KRKNX * bylo provedeno také srovnání expresních profilÛ adenomu a adenokarcinomu N sond - odpovídá poãtu genÛ detekovateln˘ch dan˘m ãipem; N genÛ +/- - poãet nalezen˘ch up/down regulovan˘ch genÛ; LCM - laserová mikrodisekce; NB - Nothern Blot; TMA - tká- Àové microarrays; RT-PCR - reverznû transkriptázová PCR; IHC - imunohistochemické metody; NSE - normální stfievní epitel; KRK - kolorektální karcinom; AD - adenom; LKRK - levostrann˘ KRK; PKRK - pravostrann˘ KRK; MSIK - KRK s mikrosatelitní nestabilitou; MSSK - KRK bez mikrosatelitní nestability; HMKRK - jaterní metastáze KRK; KRKMH – pri- mární KRK metastazující do jater; KRKNX – primární KRK metasazující do uzlin; KRKNO – primární KRK bez postiÏení uzlin

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 383 Tabulka ã. 2: Geny s rozdílnou expresí v nádorové tkáni identifikované minimálnû dvûmi nezávisl˘mi ãipov˘mi studiemi

GeneBank Symbol Gene Name ❏ Reference Bunûãn˘ cyklus, onkogeny, nádorové supresory, apoptóza S78187 CDC25B cell division cycle 25B + 7, 9, 10, 15, 19 X54489 CXCL1 chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (MGSA, GRO-1) + 7, 9, 10, 18, 19, 23 K02276 MYC v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog (avian) + 7, 10, 19, 23, 35 H74208 BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 (Bcl-2) + 19, 20 AI800528 BIRC5 baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin) + 7, 19 U33286 CSE1L CSE1 chromosome segregation 1-like (yeast) (CAS) + 10, 15 U37518 TNFSF10 tumor necrosis factor (ligand) superfamily, member 10 (TRAIL) - 9, 19 U60519 CASP10 caspase 10, apoptosis-related cysteine peptidase - 9, 12 Transkripãní faktory U14134 GTF3A general transcription factor IIIA + 10, 15 RÛstové faktory, cytokiny M38449 TGFB1 transforming growth factor, beta 1 (Camurati-Engelmann disease) + 7, 9, 15, 22 M77349 TGFBI transforming growth factor, beta-induced, 68kDa (BIGH3) + 9, 10, 14, 15, 35 U88323 GDF15 growth differentiation factor 15 (PLAB, PDF, PTGFB) + 18, 19 Bunûãná signalizace AF487339 NME1 non-metastatic cells 1, protein (nm23A) + 10, 11, 20, 23 M97496 GUCA2A guanylate cyclase activator 2A (guanylin) - 10, 15, 17 Z70295 GUCA2B guanylate cyclase activator 2B (uroguanylin) - 15, 35 Metabolické enzymy a transportní proteiny M61832 AHCY S-adenosylhomocysteine hydrolase + 7, 10, 15 Z26491 COMT catechol-O-methyltransferase - 10, 15, 17 M10050 FABP1 fatty acid binding protein 1, liver - 7, 13, 15 M33987 CA1 carbonic anhydrase I - 7, 19, 22 J03037 CA2 carbonic anhydrase II - 7, 8, 9, 13, 19, 35 M83670 CA4 carbonic anhydrase IV - 7, 10, 15, 20, 22, 35 X04350 ADH1C alcohol dehydrogenase 1C (class I), gamma polypeptide (ADH3) - 7, 9, 10, 35 K01383 MT1A metallothionein 1A (functional) - 7, 11, 15, 19, 21, 35 U29091 SELENBP1 selenium binding protein 1 - 7, 13, 15 U14528 SLC26A2 solute carrier family 26, member 2 - 13, 35 L02785 SLC26A3 solute carrier family 26, member 3; colon mucosa-associated (DRA) - 10, 15, 35 Proteiny extracelulární matrix, adhezivní molekuly, angiogeneze BC054498 COL1A2 collagen, type I, alpha 2 + 7, 8, 13, 17, 20, 35 J03040 SPARC secreted protein, acidic, cysteine-rich (osteonectin) + 7, 10, 19, 20, 35 J04765 SPP1 secreted phosphoprotein 1 (osteopontin) + 10, 22, 35 M32977 VEGF vascular endothelial growth factor + 13, 13, 40 AJ002550 MMP1 matrix metallopeptidase 1 (interstitial collagenase) + 7, 14, 20, 22 AL542407 MMP2 matrix metallopeptidase 2 (gelatinase A, 72kDa gelatinase) + 20, 22 AI628953 MMP3 matrix metallopeptidase 3 (stromelysin 1, progelatinase) + 7, 20, 22 BC003635 MMP7 matrix metallopeptidase 7 (matrilysin, uterine) + 7, 20, 22, 40 AK075448 MMP11 matrix metallopeptidase 11 (stromelysin 3) + 7, 20 AA411757 CEACAM1 carcinoembryogenic antigen-related molecule I (biliary glycoprotein) - 10 15, 19

❏ - exprese genu (+ up-regulovan˘, - down-regulovan˘) v nádorové tkáni ve srovnání s normálním stfievním epitelem tvofiit komplexy s jin˘mi proteiny, napfiíklad TCF (T-cell fac- kem relapsu onemocnûní [32]. Na skupinû genÛ spojen˘ch tor). TCF/β-kateninov˘ komplex je spojen s trvalou aktivací s bunûãn˘m cyklem a apoptózou byl pozorován nárÛst expre- Wnt signální dráhy a následnû zv˘‰enou expresí onkogenu se pfiedev‰ím u genÛ s antiapoptick˘m úãinkem, naproti tomu MYC [31]. Dal‰ím z genÛ aktivovan˘ch signální drahou sníÏenou expresi vykazovaly geny proapoptotické. TCF/β-katenin je regulátor apoptózy a bunûãné proliferace V‰echny tfií nalezené geny související s rÛstov˘mi faktory BIRC5 (survivin). Survivin je ãlenem rodiny IAP (inhibitor of (TGFB1, TGFBI, GDF15) patfií do proteinové rodiny TGF-β. apoptosis protein) a jeho antiapoptotick˘ úãinek je spojen pfie- Alterace v TGF-β signální dráze byly u KRK dfiíve pozorová- dev‰ím s vazbou na rÛzné druhy kaspáz a jejich inhibicí [31]. ny pfiedev‰ím na úrovni TGF-β receptorÛ. Mutace v genu pro Zv˘‰ená hladina antiapoptotického proteinu Bcl-2 zvy‰uje TGF-β receptor II se nacházejí u vût‰iny KRK s mikrosatelit- u nádorov˘ch bunûk schopnost pfieÏívání a jejich rezistenci ní nestabilitou a asi v polovinû v‰ech ostatních. Navíc zv˘‰e- vÛãi proapototick˘m stimulÛm, jako je odstranûní rÛstov˘ch ná hladina proteinu SMAD4, kter˘ je jedním z intracelulárních faktorÛ a glukózy, hypoxie, antionkogen p53 a chemoterape- transduktorÛ signálu TGF-β receptorÛ, byla asociována se sig- utická léãba (je jedním z MDR „multi drug resistance“ prote- nifikantnû lep‰í prognózou KRK, a jeho deficience s neschop- inÛ) [31]. SníÏená exprese byla pozorována u genÛ proapo- ností TGF-β signální dráhy inhibovat proliferaci v G1-fázi ptotick˘ch faktorÛ jako je TNFSF10 (TRAIL) a kaspáza 10 bunûãného cyklu, jiÏ dfiíve popsanou u transformovan˘ch (CASP10). TRAIL funguje jako induktor apoptózy specific- bunûk [31]. ky v nádorov˘ch buÀkách agonizací receptorÛ TRAIL-R1 Gen pro NME1 (nm23), kódující nukleotid difosfát kinázu, a TRAIL-R2. Jeho sníÏená exprese v nádorové tkáni je spojena svÛj název získal díky sníÏené expresi ve vysoce metastatic- s niÏ‰í apoptotickou aktivitou. U kolorektálních karcinom- k˘ch nádorov˘ch liniích. Tato inverzní asociace byla potvr- Û byla zv˘‰ená exprese receptoru TRAIL-R1 pozitivnû asoci- zena také v klinické studii s KRK nemetastazujícími a meta- ována s lep‰ím disease free survival (DFS) a sníÏen˘m rizi- stazujícími do jater [32].

384 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Tabulka ã. 3: âipové studie zamûﬁené na stanovení prognózy a predikci léãebné odpovûdi kolorektálních karcinomÛ

Reference Rok âipová platforma N sond N genÛ +/- Poãet vzorkÛ Validace VyuÏití mikroãipÛ ke stanovení prognózy Wang a kol. (45) 2004 Affymetrix GeneChip 22284 23 31 KRKDP, 43 KRKSP Eschrich a kol. (46) 2005 cDNA microarray 31872 43 30 KRKDP, 45 KRKSP GeneChip Barrier a kol. (43) 2005 Affymetrix GeneChip 22284 30 9 KRKDP, 9 KRKSP Arango a kol. (47) 2005 Affymetrix GeneChip 22284 218 15 KRKDP, 10 KRKSP RT-PCR VyuÏití mikroãipÛ k predikci léãebné odpovûdi a její charakterizaci na molekulární úrovni Mariadason a kol. (48) 2003 cDNA microarray 9216 50 30 KRK bunûãn˘ch linií RT-PCR Inoue a kol. (44) 2004 Affymetrix GeneChip 12000 neuvedeno 12 KRK Arango a kol. (49) 2004 cDNA microarray 9216 neuvedeno 30 KRK bunûãn˘ch linií RT-PCR Ghadimi a kol. (51) 2005 cDNA microarray 9984 54 30 KRK RT-PCR Souza a kol. (50) 2005 Affymetrix GeneChip 22284 152/40 bunûãná linie SW-620 RT-PCR N sond - odpovídá poãtu genÛ detekovateln˘ch dan˘m ãipem; N genÛ +/- - poãet nalezen˘ch up/down regulovan˘ch genÛ; RT-PCR - reverznû tran- skriptázová PCR; KRKDP - kolorektální karcinomy s dobrou prognózou; KRKSP - kolorektální karcinomy se ‰patnou prognózou

Dal‰í velkou skupinu tvofií geny pro metabolické enzymy v souladu s jejich biologickou funkcí [32]. âastokrát popiso- a transportní proteiny. Zmûny v metabolick˘ch drahách mast- van˘ nárÛst v expresi kolagenu typu I. (COL1A2), jehoÏ exprese n˘ch kyselin a jejich v˘znam v karcinogenezi KRK byly více- je omezena pouze na fibroblasty, potvrzuje pfiedchozí pozoro- krát popsány [30,33]. U nalezeného genu pro FABP1 byla sní- vání epitelo-mezenchymálních interakci u karcinomÛ prostaty, Ïená exprese jiÏ pozorována a pfiedpokládá se, Ïe bude mít kde mûly zásadní vliv na chování nádorov˘ch bunûk, pfiedev- funkci v diferenciaci enterocytÛ [13]. Ve vût‰inû DNA ãipo- ‰ím jejich vlastnosti spojené s progresí a invazivitou [36]. v˘ch studií byla pozorována sníÏená exprese alespoÀ jednoho DNA ãipové studie prokázaly schopnost odli‰it nádorovou tkáÀ metalothioneinu, nejãastûji MT1A. Metalothioneiny (MT) jsou od normálního stfievního epitelu na základû rozdíln˘ch profi- ubikvitární nízkomolekulárni proteiny s vysokou afinitou lÛ genové exprese. V˘sledky tûchto studií korelují se souãas- k dvouvazn˘m kovÛ. Imunohistochemické studie na KRK pro- n˘mi znalostmi molekulárnû biologické podstaty kolorektál- kázaly v souladu s v˘sledky ãipov˘ch anal˘z signifikantnû sní- ních karcinomÛ a obohacují je o nové poznatky. Ïenou expresi MT, negativnû korelující s klinick˘m stádiem onemocnûní a postiÏením lymfatick˘ch uzlin [21]. âasto dis- 3. Kolorektální karcinomy rÛzné anatomické lokalizace kutovan˘mi markery kolorektální karcinogeneze jsou karbonát Mnoho epidemiologick˘ch, morfologick˘ch a molekulárnû anhydrázy CA2 a CA4. Karbonát anhydrázy reverzibilnû hy- biologick˘ch pozorování svûdãí pro odli‰nosti v karcinogene- dratují CO2 a jejich sníÏené hladiny v primární nádorové tkáni zi sporadick˘ch KRK v závislosti na jejich anatomické loka- souvisí s mírou aniogeneze, invazivitou KRK (i jin˘ch typÛ lizaci. Karcinomy levého a pravého colon mohou tvofiit roz- nádorov˘ch onemocnûní) a rozvojem vzdálen˘ch metastáz [34]. dílné skupiny nádorÛ díky svému rozli‰nému embryonálnímu Patogeneze nádorové rÛstu je spojena s pfiestavbou extracelulár- pÛvodu a díky tomu, Ïe jsou vystaveny rÛznému stfievnímu ní matrix (ECM), redistribucí adhezivních molekul a aktivací obsahu. Pravostranné kolorektální karcinomy (PKRK) se ãas- angiogeneze. Pomocí DNA ãipové technologie byly nalezeny tûji vyskytují u Ïen, zatímco levostranné (LKRK) jsou bûÏ- pfiípadnû potvrzeny geny, které s tûmito procesy souvisí. Agra- nûj‰í u muÏÛ. PKRK a LKRK se také rozdílnû klinicky mani- wal a kol. (2002) identifikoval na souboru pacientÛ, ktefií byli festují a mají rozdílnou prognózu [37]. PfiestoÏe mají PKRK rozdûleni do skupin podle jednotliv˘ch klinick˘ch stádií one- vût‰í prÛmûr a jsou hÛfie diferencované, vyznaãují se pfiízni- mocnûní jako hlavní marker progrese kolorektálních karcino- vûj‰í prognózou a jsou spojeny se signifikantnû lep‰í léãebnou mÛ SSP1 (osteopontin). Osteopontin je glykoprotein vázající odpovûdí na 5-fluorouracil [15]. integriny, indukující antiapoptotické signální dráhy. Pomûr hla- Studií zamûfienou pouze na porovnání LKRK a PKRK vãetnû din osteopontinu v normálním stfievním epitelu (NSE) a KRK pfiilehlého stfievního epitelu (NSE) provedla Birkenkamp- je 1:15, mezi NSE a jaterními metastázami KRK je 1:30 [35]. Demtroderová a kol. (2005). Alterace v genové expresi nalez- K nárÛstu hladin osteopontinu pravdûpodobnû dochází stimula u 186 genÛ v levostrann˘ch a 118 genÛ v pravostrann˘ch lací Wnt signální dráhy jako u invazivních mamárních karci- KRK. Levostranné KRK vykazovaly vÛãi pravostrann˘m sig- nomÛ, ov‰em u KRK zpÛsobené zv˘‰enou hladinou TCF/β- nifikantnû niÏ‰í expresi cytokeratinÛ 8, 19 a 20, vy‰‰í exprese kateninu následkem mutací v APC genu [32] . Mezi nejãastûji byla pozorována u cyklooxygenázy 2 (COX2), caldesmonu 1 prokázané stimulátory nádorové angiogeneze patfií VEGF, coÏ a transgelinu 11 [22]. potvrzují i v˘sledky nûkter˘ch DNA ãipov˘ch studií. Jeho zv˘- Je zfiejmé, Ïe rozdíly v genové expresi mezi levostrann˘mi a pr- ‰ené hladiny v primárním nádoru a v krevním séru byly opa- avostrann˘mi KRK existují, a pravdûpodobnû budou mít kovanû pozitivnû korelovány s hor‰í prognózou nádorov˘ch souvislost s jejich rozdíln˘m v˘vojem a prognózou onemoc- onemocnûní vãetnû KRK. VEGF hraje dÛleÏitou roli pfii tvor- nûní. Nalézt mechanizmus odpovûdn˘ za lep‰í léãebnou odpo- bû jaterních metastáz, ve kter˘ch uÏ ov‰em k jeho zv˘‰ené vûì PKRK na 5-fluorouracil a pfiesnûji charakterizovat LKRK expresi nedochází. Vysvûtluje se to hypoxickou indukcí expre- a PKRK a jejich rozdíly na molekulární úrovni souãasn˘ stav se VEGF v rostoucím primárním nádoru, která v dostateãnû znalostí bohuÏel neumoÏÀuje. Lokalizace KRK by se v budouc- prokrveném jaterním parenchymu není pfiítomna [32]. Matrix nosti mohla stát dÛleÏit˘m prognostick˘m a prediktivním fak- metaloproteinázy (MMP-1,-2,-3,-7,-11) mají komplexní úlohu torem pfii navrhování individuálního terapeutického plánu. v procesu nádorového rÛstu a metastazování, jejich zv˘‰ené hladiny byly ãastokrát nalezeny v souvislosti s invazivitou 4. Srovnání kolorektálních karcinomÛ vzhledem k mikro- a metastatick˘m potenciálem rÛzn˘ch typÛ nádorÛ vãetnû KRK. satelitní nestabilitû Degradací bazálních membrán kompartmentov˘ch systémÛ PfiibliÏnû 90% hereditárních nepolypózních kolorektálních ovlivÀují nejen invazi nádoru do bezprostfiedního okolí nebo karcinomÛ (HNPCC) a 20% sporadick˘ch KRK vykazuje tzv. intra- a extravazaci nádorov˘ch bunûk, ale také migraci bunûk mikrosatelitní nestabilitu (MSI). âetné alterace mikrosatelitÛ v místû tvorby vzdálen˘ch metastáz. Hrají v˘znamnou úlohu krátk˘ch repetitivních sekvencí DNA v prÛbûhu celého geno- v procesu angiogeneze, a to vytváfiením prostoru pro novû vzni- mu jsou zpÛsobeny replikaãními chybami DNA polymerázy, kající cévy, podporou mobility endotelií a invazí bunûk nádo- které vznikají bûhem v˘voje tumoru a nebyly adekvátním zpÛ- rÛ do cév. Zv˘‰ené hladiny matrix metaloproteináz u KRK jsou sobem opraveny. Nádory vykazující mikrosatelitní nestabili-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 385 tu vût‰inou nejsou spojeny s mutacemi onkogenu RAS a nádo- ku. BohuÏel citlivost standardních zobrazovacích metod (CT, rového supresoru p53, mají lep‰í prognózu a léãebnou odpo- PET) se pohybuje pouze mezi 50 a 60%. Bertucci a kol. (2004) vûì a jejich expresní profily jsou odli‰né od nádorÛ MSI-. identifikoval sadu 46 genÛ se statisticky v˘znamnû rozdílnou Mori a kol. (2003) zji‰Èoval vliv mikrosatelitní nestability expresí v primárních nádorech spojen˘ch smetastatick˘m posti- na profily genové exprese a srovnával jeho v˘znamnost s jin˘- Ïením regionálních uzlin. Tato sada genÛ souvisela také srelap- mi molekulárními (status p53, mutace k-RAS, MLH1, MSH2) sem nádorového onemocnûní [20]. Na klinické vyuÏití ãipové a klinick˘mi charakteristikami (lokalizace, grade, vûk, pohla- technologie v diagnostice postiÏení regionálních uzlin se zamû- ví, klinické stádium) pomocí vícerozmûrné statistické anal˘- fiil Croner a kol. (2005) . Srovnával schopnost pfiedoperaãní pre- zy PCA (anal˘za hlavních komponent). Z nalezen˘ch kom- dikce regionálních metastáz pomocí expresních profilÛ a kon- ponent korelujících s molekulárními a klinick˘mi vlastnostmi venãních zobrazovacích metod. Po doplnûní v˘sledkÛ ãipové mûla nejvût‰í vliv na variabilitu expresních profilÛ kompo- studie ke standardním diagnostick˘m algoritmÛm se jejich sen- nenta schopná signifikantnû odli‰it fenotyp MSI+ od MSI- (p < zitivita zv˘‰ila pfiibliÏnû o 12% [40]. Pfiítomnost molekulární- 0,0001). Pomocí této komponenty bylo moÏné statisticky ho profilu spojeného s rozvojem jaterních metastáz v primár- v˘znamnû rozli‰it také anatomickou lokalizaci nádoru a histo- ních KRK ovûfioval Li a kol. (2004). Identifikoval soubor 429 lopatologick˘ grade, které byly jiÏ dfiíve se stavem MSI aso- genÛ se signifikantnû rozdílnou expresí mezi nádory nemeta- ciovány. Nádory s fenotypem MSI+ byly ménû diferencova- stazujícími a metastazujícími do jater [41]. né a byly lokalizovány napravo. Nûkolik genÛ tvofiících tuto U studií s pokroãil˘mi kolorektálními karcinomy bohuÏel není komponentu bylo jiÏ dfiíve v souvislosti s MSI zkoumáno nebo moÏné rozli‰it jestli k alteracím v jejich expresních profilech potvrzeno. Napfiíklad sníÏená exprese genu MLH1, kter˘ je do‰lo v ãasn˘ch nebo pozdních stádiích karcinogeneze. Proto souãástí systému zodpovûdného za opravy chybného párová- jejich klinické vyuÏití pro prognózu a predikci diseminace je di- ní bází, proapoptotického genu BAX nebo zv˘‰ená exprese skutabilní. K relevantním v˘sledkÛm by bylo moÏné dospût pou- genÛ pro glykoproteiny mucin 1 a mucin 5 [38]. Dal‰í speci- ze pomocí velkého soubor prospektivnû sledovan˘ch pacientÛ. fickou vlastností MSI+ nádorÛ je ãastá infiltrace lymfocyty. Lymfocyty infiltrující nádorov˘ epitel (IELs) jsou pfieváÏnû 6. VyuÏití mikroãipÛ ke stanovení prognózy cytotoxické, aktivované a uvolÀují mediátory bunûãné smrti. Prognosticky odli‰né skupiny pacientÛ s kolorektálními Fenotyp apoptotick˘ch MSI+ je spojen se zv˘‰enou apoptic- karcinomy se v souãasnosti vymezují na základû histologické kou aktivitou, ale souvislost mezi IELs a apoptózou zatím klasifikace, gradingu, klinického rozsahu a ojedinûl˘ch mole- nebyla prokázána. Nûktefií se domnívají, Ïe IELs je pouze kulárních markerÛ. Tyto faktory jsou pro chirurgicky vyléãe- sekundární jev bez jakékoliv biologické relevance. DNA ãipo- né pacienty rozhodující z hlediska indikace adjuvantní che- vá studie provedená Banerjeem a kol. (2004) spí‰e potvrzuje moterapie. Jejich prediktivní síla ov‰em není dostateãná imunogenní vlastnosti KRK s mikrosatelitní nestabilitou. Zv˘- a 25-30% pacientÛ v klinickém stádiu (dále jen stádiu) Dukes ‰ená exprese velkého mnoÏství genÛ prozánûtliv˘ch faktorÛ B umírá do pûti let na relaps nádorového onemocnûní. Racio- (interleukin 8 a 18, granulysin, HSP70, HSP110) a apoptotic- nální pfiistup k indikaci adjuvantní léãby nabízí molekulární k˘ch genÛ (TNF induced protein, TRAIL), svûdãí pro spojení charakterizace této vysoce rizikové podskupiny pomocí tech- IELs s aktivní imunitní odpovûdí [39]. Folow-up anal˘zy nologie DNA ãipÛ. potvrdily lep‰í celkové pfieÏití u pacientÛ s tímto typem nádo- Nadûjné v˘sledky pfiinesla studie zamûfiená na hledání nov˘ch ru. Dal‰í moÏné vysvûtlení lep‰í prognózy pacientÛ s KRK prognostick˘ch markerÛ relapsu onemocnûní vyuÏitím fenotypu MSI+ a jejich zv˘‰ené apoptotické aktivity vychází oligonukleotidov˘ch mikroãipÛ Affymetrix U133a. Na sou- z koncepce tzv. „oslabené malignity“, která je zaloÏena na pfied- boru 74 pacientÛ ve stádiu Dukes B byla identifikována sada pokladu, Ïe akumulace chyb zpÛsoben˘ch ‰patn˘m párová- 23 genÛ, která na nezávislém validaãním souboru 36 pacien- ním bází mÛÏe pfiekonat svÛj karcinogenní potenciál a v dÛsled- tÛ predikovala relaps s pfiesností 78% [45]. ku oslabit Ïivotaschopnost nádorov˘ch bunûk [39]. Zv˘‰ená DNA mikroãipy byly pouÏity k vytvofiení molekulárního sta- apoptotická aktivita nádorÛ s MSI+ fenotypem bude ov‰em gingu KRK, kter˘ mûl v˘raznû vy‰‰í prognostick˘ potenciál ovlivnûna spí‰e obûma v˘‰e uveden˘mi mechanizmy neÏ neÏ standardní Dukesova klasifikace [46]. Pro 78 vzorkÛ kolo- v˘hradnû jedním z nich . rektálních karcinomÛ byly získány expresní profily, z nichÏ se pomocí klastrové anal˘zy podafiilo identifikovat sadu 43 genÛ, 5. Primární nádory ve vztahu k rozvoji regionální která umoÏÀovala nezávisle na klinické klasifikaci rozdûlit a vzdálenostní progrese pacienty na dvû prognostické skupiny ve vztahu k celkovému V souãasné dobû se pfiedpokládá, Ïe schopnost metastázování pfieÏití. Pfii cross-validaci byla tato sada genÛ, obsahující mimo získává pouze malá subpopulace bunûk primárního nádoru jiné také geny pro osteopontin a neuregulin, schopná pfiedpo- somatick˘mi mutacemi bûhem nádorového rÛstu, odhadem vûdût 36 mûsíãní pfieÏití s pfiesností 90% (p<0,001). Na zákla- ménû neÏ jedna na 10 miliónÛ nádorov˘ch bunûk. Tuto pfied- dû molekulární klasifikace byla navíc ze skupiny pacientÛ ve stavu o ojedinûl˘ch metastatick˘ch buÀkách v mase primární- stádiu Dukes B vyãlenûna podskupina, která mûla hor‰í pro- ho nádoru zpochybnila zásadní práce Ramaswamy a kol. (2002). gnózu neÏ ãást pacientÛ ve stádiu Dukes C. Prognostická síla Identifikovala skupinu 128 genÛ asociovan˘ch s metastatickou této skupiny genÛ byla validována na nezávislé skupinû 95 tkání, které ji odli‰ovaly od tkánû primárního nádoru. Tento pacientÛ z jiné neÏ testovací populace s vyuÏitím rozdílné ãipo- metastatick˘ genov˘ profil byl ov‰em pfiítomen také v nûkte- vé platformy. Konverze mezi jednotliv˘mi technologiemi zna- r˘ch testovacích primárních nádorech, které byly chybnû iden- menala redukci genové sady z 43 na 26 genÛ a její schopnost tifikovány jako metastatické loÏisko. Na dal‰ích 279 primárních predikce 36 mûsíãního pfieÏití byla 78% [46]. Pro dobrou repro- adenokarcinomech rÛzného pÛvodu byl metastatick˘ genov˘ dukovatelnost a vysok˘ prognostick˘ potenciál tohoto soubo- profil signifikantnû asociován s nádory, u kter˘ch do‰lo k roz- ru genÛ svûdãí nejen zachování vysoké predikãní síly pfii vali- voji metastáz a mûly hor‰í prognózu. Ramaswamy formulova- daci na velkém souboru jiné populace pfii pouÏití jiné ãipové la hypotézu, Ïe program genové exprese metastatického one- technologie, ale také v˘skyt genÛ jiÏ dfiíve asociovan˘ch s pro- mocnûní mÛÏe b˘t pfiítomen jiÏ v molekulární v˘bavû primárního gresí onemocnûní v tomto souboru. nádoru, a proto identifikovateln˘ v dobû diagnózy [36]. Retrospektivní studii zamûfienou na predikci relapsu onemoc- PostiÏení regionálních lymfatick˘ch uzlin je jedním z nejdÛle- nûní provedl na souboru 25 pacientÛ klinického stádia Dukes Ïitûj‰ích prognostick˘ch faktorÛ KRK a klíãov˘m kriteriem C, u kter˘ch byl jedinou léãebnou modalitou radikální chirur- klinick˘ch klasifikaãních systémÛ. Jejich pfiedoperaãní dia- gick˘ zákrok Arango a kol. (2005). Je to jediná práce, ve kte- gnostika má v˘znam pro indikaci neoadjuvantní chemoradio- ré byla vstupním materiálem RNA izolovaná z tkání fixova- terapie u rektálních karcinomÛ a radikalitu chirurgického zákro- n˘ch ve formalinu a uloÏen˘ch v parafinov˘ch bloãcích

386 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 (FFPE). Podmínkou studií zaloÏen˘ch na FFPE je dÛkladná a pravé ãásti tlustého stfieva a v˘znam anatomické lokalizace kontrola kvality vstupního materiálu (u této studie znamenala nádoru pro prognózu onemocnûní a predikci léãebné odpovû- redukci z 91 na 25 vzorkÛ). Získan˘ klasifikátor tvofien˘ 17 di. KRK byly molekulárnû charakterizovány z hlediska mik- geny byl schopn˘ pfii cross-validaci správnû zafiadit 88% paci- rosatelitní nestability. V karcinogenním procesu nádorÛ MSI- entÛ a rozdûlit je z hlediska dlouhodobého DFS na hladinû a MSI+ byly identifikovány rozdíly, které korelují s anato- pravdûpodobnosti (p < 0,0001) [47]. Tato práce dokazuje, Ïe mickou lokalizací nádoru. Nádory MSI+ jsou pfieváÏnû pra- je moÏné provádût retrospektivní ãipové studie zaloÏené na vostranné a mají lep‰í prognózou. V primárních nádorech se formalinem fixovan˘ch tkáních, ale musí b˘t dodrÏená pfiísná podafiilo identifikovat znaky regionálních a vzdálen˘ch kriteria pro kontrolu kvality vstupního materiálu. metastáz. PrÛmûrná senzitivita predikce relapsu nádorového onemocnûní a délky celkového pfieÏití byla u obou parametrÛ 7. VyuÏití mikroãipÛ k predikci léãebné odpovûdi a její pfiibliÏnû 80%. V˘zkum predikce léãebné odpovûdi byl dopo- molekulární charakterizaci sud provádûn pfiedev‰ím na bunûãn˘ch liniích a DNA ãipy zde Souãasná klinická onkologie staví na v˘sledcích prokázaly velice dobré analytické vlastnosti. randomizovan˘ch klinick˘ch studií a za léãebn˘ standard je pfiijímán statisticky nejlep‰í léãebn˘ postup. Pfiitom se nebere Obrázek 1.: Návrh doplnûného diagnostického schématu pacientÛ s kolo- ohled na skuteãnost, Ïe i chemoterapie dosahující statisticky rektálním karcinomem hor‰ího v˘sledku mÛÏe b˘t individuálnû úãinnûj‰í. Souãasné moÏnosti prediktivní onkologie bohuÏel nenabízejí dostateã- nû senzitivní testy schopné predikovat léãebnou odpovûì Makroskopická diagnostika v rutinní klinické praxi. Doposud provádûné testování ojedi- Endoskopie, USG, CT, Biopsie nádorové tkánû nûl˘ch napfi. metabolick˘ch markerÛ cytostatik jako je tymi- MRI, PET dylát syntáza (TS), tymidin fosforyláza (TP) a dihydropyri- midin dehydrogenáza (DPD), se ukázalo jako nedostateãnû úãinné. Hned první DNA ãipové studie na bunûãn˘ch liniích kolorektálních karcinomÛ potvrdily, Ïe mechanizmus nád- orové rezistence je znaãnû komplexnûj‰í problém, kdyÏ rÛzná Sérum Molekulární staging Patologick˘ staging cytostatika indukovala expresi fiádovû aÏ stovek genÛ [48, 49]. pTNM, grade, IHC Nejãastûji zkouman˘m cytostatikem je 5-fluorouracil (5-FU), kter˘ pfiestoÏe je spoleãnû s leukovorinem léãbou prvé volby pfii adjuvantní chemoterapii kolorektálních karcinomÛ, má léãebn˘ efekt pouze u pfiibliÏnû 20% pacientÛ. Mariadason a kol. (2003) identifikoval 50 genÛ korelujících s apoptózou indukovanou úãinkem 5-FU na 30 bunûãn˘ch liniích KRK. Nádorové Proteomické Metodika PCR Tento soubor genÛ byl schopn˘ pfiedikovat léãebnou odpovûì markery metody Mikrosatelitní nestabili- signifikantnû úãinnûji neÏ pouÏívané prediktory jako jsou TS, CEA, CA19-9 (SELDI ta APC, DCC, TP, DPD, status p53 nebo mikrosatelitní nestabilita [48]. protein Chip) k-RAS, p53 Inhibitor topoizomerázy I, irinotekan se indikuje samostatnû u 5-FU rezistentních pacientÛ nebo v kombinaci s 5-FU a leukovorinem (reÏim FOLFIRI) pfii léãbû pokroãilého KRK. Nové mechanizmy úãinku irinotekanu (jeho aktivního derivá- tu SN-38) byly studovány na bunûãné linii SW-620. Indukce Molekulární charakterizace více neÏ dvojnásobné zmûny exprese byla pozorována u 192 nádoru KRK mikroãipem genÛ [50]. Dal‰ím lékem pouÏívan˘m v kombinaci s 5-FU a leukovorinem je oxaliplatina (reÏim FOLFOX). Vystavení nádorov˘ch bunûk úãinku oxaliplatiny vede k zablokování G2/M pfiechodu bunûãného cyklu a indukci apoptózy. Na 30 KRK bunûã- n˘ch liniích nalezl Arango a kol. (2004) soubor genÛ, mj. obsa- hující geny zapojené do apoptózy a oprav DNA, schopn˘ INDIVIDUALIZACE LÉâBY predikovat léãebnou odpovûì na oxaliplatinu s vy‰‰í senziti- A DISPENZARIZACE PACIENTA vitou neÏ mutaãní status p53. Schopnost predikce pfii cross- validaci byla statisticky v˘znamná na hladinû pravdûpodob- nosti p=0,002 [49]. V˘sledky DNA ãipov˘ch studií spoleãnû se souãasn˘mi poznat- Doposud jedinou klinickou studii zamûfienou na predikci léãeb- ky o molekulární biologii nádorÛ by v budoucnu mohly slouÏit né odpovûdi na neoadjuvantní chemoradioterapii pomocí DNA k navrÏení specifického KRK nízkohustotního DNA ãipu, schop- ãipÛ provedl Ghadimi a kol. (2005) na souboru 30 pacientÛ ného molekulárnû charakterizovat dan˘ nádor a to pfiedev‰ím s lokálnû pokroãil˘mi karcinomy rekta. Nalezl 54 genov˘ pre- z hlediska jeho invazivních vlastností, metastatického potenciá- diktor léãebné odpovûdi, kter˘ ovûfiil na validaãní skupinû paci- lu a rezistence na bûÏnû pouÏívaná cytostatika. Získan˘ expres- entÛ s citlivostí 78% a specifitou 86% [51]. V˘sledky této stu- ní profil by zapojením do standardního diagnostického schéma- die naznaãují vysok˘ potenciál technologie DNA ãipÛ tu (viz obr. ã . 1) umoÏÀoval spoleãnû s proteomick˘mi metodami v predikci léãebné odpovûdi u kolorektálních karcinomÛ do a ostatními pouÏívan˘mi diagnostick˘mi kriterii pfiesnûj‰í staging budoucna. více korelující s klinick˘m stavem pacienta a biologií nádoru, 8. Souhrn - klinické vyuÏití mikroãipové technologie odhad pravdûpodobnosti relapsu onemocnûní a parametru celko- u pacientÛ s kolorektálními karcinomy vého pfieÏití a citlivosti nádorov˘ch bunûk k rÛzn˘m chemotera- DNA ãipové studie prokázaly schopnost odli‰it nádorovou tkáÀ peutick˘m reÏimÛm.Klinické vyuÏití profilÛ genové exprese bude od normálního stfievního epitelu na základû rozdíln˘ch profi- znamenat zásadní krok vedoucí smûrem k individualizaci léãby lÛ genové exprese, a v˘sledky tûchto studií korelují se sou- a dispenzarizace pacientÛ s kolorektálními karcinomy. ãasn˘mi znalostmi molekulárnû biologické podstaty KRK a obohacují je o nové poznatky. Profily genové exprese pod- Podûkování pofiily hypotézu o rozdílném mechanizmu karcinogeneze v levé Práce byla podpofiena grantem IGA MZ âR NR/9076 - 4.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 387 Literatura 26. Kim BS, Kim I, Lee S, et al: Statistical methods of translating microarray 1. Svoboda M, Michálek J: Úvod do technologie DNA ãipÛ. Lék. a Techn. data into clinically relevant diagnostic information in colorectal cancer. 35:67-75, 2004 Bioinformatics 21:517-28, 2005 2. Pospí‰ilová, Mayer J: DNA ãipy - moderní metodika anal˘zy diferenciální 27. Draghici S, Khatri P, Eklund AC, et al: Reliability and reproducibility genové exprese a její v˘znam pro diagnostiku a léãbu nádorov˘ch one- issues in DNA microarray measurements. Trends Genet 22:101-9, mocnûní. Cas Lek ces 144:11-17, 2005 2006 3. Gabriele L, Moretti F, Pierotti MA, et al: The use of microarray technolo- 28. Moreau Y, Aerts S, De Moor B, et al: Comparison and meta-analysis of gies in clinical oncology. J Transl Med 4:8, 2006 microarray data: from the bench to the computer desk. Trends Genet 19:570- 4. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al: Molecular classification of can- 7, 2003 cer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. 29. Wang D, Yang W, Du J, et al: MGSA/GRO-mediated melanocyte trans- Science 286:531-7, 1999 formation involves induction of Ras expression. Oncogene 19:4647-59, 5. van ‘t Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, et al: Gene expression profiling 2000 predicts clinical outcome of breast cancer. Nature 415:530-6, 2002 30. Galamb O, Sipos F, Fischer K, et al: The results of the expression array stu- 6. Liefers GJ, Tollenaar RA: Cancer genetics and their application to indivi- dies correlate and enhance the known genetic basis of gastric and colorec- dualised medicine. Eur J Cancer 38:872-9, 2002 tal cancer. Cytometry B Clin Cytom 68:1-17, 2005 7. Croner RS, Foertsch T, Brueckl WM, et al: Common denominator genes 31. Watson AJ: An overview of apoptosis and the prevention of colorectal can- that distinguish colorectal carcinoma from normal mucosa. Int J Colorec- cer. Crit Rev Oncol Hematol 57:107-21, 2006 tal Dis 20:353-62, 2005 32. Bird NC, Mangnall D, Majeed AW: Biology of colorectal liver metastases: 8. Jansová E, Koutna I, Krontorad P, et al: Comparative transcriptome maps: A review. J Surg Oncol 94:68-80, 2006 a new approach to the diagnosis of colorectal carcinoma patients using 33. Yeh CS, Wang JY, Cheng TL, et al: Fatty acid metabolism pathway play cDNA microarrays. Clin Genet 69:218-27, 2006 an important role in carcinogenesis of human colorectal cancers by Mic- 9. Kitahara O, Furukawa Y, Tanaka T, et al: Alterations of gene expression roarray-Bioinformatics analysis. Cancer Lett, 2005 during colorectal carcinogenesis revealed by cDNA microarrays after laser- 34. Bekku S, Mochizuki H, Yamamoto T, et al: Expression of carbonic anhyd- capture microdissection of tumor tissues and normal epithelia. Cancer Res rase I or II and correlation to clinical aspects of colorectal cancer. Hepato- 61:3544-9, 2001 gastroenterology 47:998-1001, 2000 10. Notterman DA, Alon U, Sierk AJ, et al: Transcriptional gene expression 35. Agrawal D, Chen T, Irby R, et al: Osteopontin identified as lead marker of profiles of colorectal adenoma, adenocarcinoma, and normal tissue exa- colon cancer progression, using pooled sample expression profiling. J Natl mined by oligonucleotide arrays. Cancer Res 61:3124-30, 2001 Cancer Inst 94:513-21, 2002 11. Okuno K, Yasutomi M, Nishimura N, et al: Gene expression analysis in 36. Ramaswamy S, Ross KN, Lander ES, et al: A molecular signature of meta- colorectal cancer using practical DNA array filter. Dis Colon Rectum stasis in primary solid tumors. Nat Genet 33:49-54, 2003 44:295-9, 2001 37. Iacopetta B: Are there two sides to colorectal cancer? Int J Cancer 101:403- 12. Pinheiro NA, Caballero OL, Soares F, et al: Significant overexpression of 8, 2002 oligophrenin-1 in colorectal tumors detected by cDNA microarray analy- 38. Mori Y, Selaru FM, Sato F, et al: The impact of microsatellite instability sis. Cancer Lett 172:67-73, 2001 on the molecular phenotype of colorectal tumors. Cancer Res 63:4577-82, 13. Takemasa I, Higuchi H, Yamamoto H, et al: Construction of preferential cDNA 2003 microarray specialized for human colorectal carcinoma: molecular sketch of 39. Banerjea A, Ahmed S, Hands RE, et al: Colorectal cancers with microsa- colorectal cancer. Biochem Biophys Res Commun 285:1244-9, 2001 tellite instability display mRNA expression signatures characteristic of inc- 14. Tsunoda T, Nakamura T, Ishimoto K, et al: Upregulated expression of angi- reased immunogenicity. Mol Cancer 3:21, 2004 ogenesis genes and down regulation of cell cycle genes in human colorec- 40. Croner RS, Peters A, Brueckl WM, et al: Microarray versus conventional tal cancer tissue determined by cDNA macroarray. Anticancer Res 21:137- prediction of lymph node metastasis in colorectal carcinoma. Cancer 43, 2001 104:395-404, 2005 15. Birkenkamp-Demtroder K, Christensen LL, Olesen SH, et al: Gene expres- 41. Li M, Lin YM, Hasegawa S, et al: Genes associated with liver metastasis sion in colorectal cancer. Cancer Res 62:4352-63, 2002 of colon cancer, identified by genome-wide cDNA microarray. Int J Oncol 16. Lin YM, Furukawa Y, Tsunoda T, et al: Molecular diagnosis of colorectal 24:305-12, 2004 tumors by expression profiles of 50 genes expressed differentially in ade- 42. Yanagawa R, Furukawa Y, Tsunoda T, et al: Genome-wide screening of nomas and carcinomas. Oncogene 21:4120-8, 2002 genes showing altered expression in liver metastases of human colorectal 17. Saito A, Fujii G, Sato Y, et al: Detection of genes expressed in primary cancers by cDNA microarray. Neoplasia 3:395-401, 2001 colon cancers by in situ hybridisation: overexpression of RACK 1. Mol 43. Barrier A, Lemoine A, Boelle PY, et al: Colon cancer prognosis predicti- Pathol 55:34-9, 2002 on by gene expression profiling. Oncogene 24:6155- 64, 2005 18. Zou TT, Selaru FM, Xu Y, et al: Application of cDNA microarrays to gene- 44. Inoue Y, Shirane M, Miki C, et al: Gene expression profiles of colorectal rate a molecular taxonomy capable of distinguishing between colon can- carcinoma in response to neo-adjuvant chemotherapy. Int J Oncol 25:1641- cer and normal colon. Oncogene 21:4855-62, 2002 9, 2004 19. Williams NS, Gaynor RB, Scoggin S, et al: Identification and validation of 45. Wang Y, Jatkoe T, Zhang Y, et al: Gene expression profiles and molecu- genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer using cDNA mic- lar markers to predict recurrence of Dukes’ B colon cancer. J Clin Oncol roarrays and RNA interference. Clin Cancer Res 9:931-46, 2003 22:1564-71, 2004 20. Bertucci F, Salas S, Eysteries S, et al: Gene expression profiling of colon 46. Eschrich S, Yang I, Bloom G, et al: Molecular staging for survival predic- cancer by DNA microarrays and correlation with histoclinical parameters. tion of colorectal cancer patients. J Clin Oncol 23:3526-35, 2005 Oncogene 23:1377-91, 2004 47. Arango D, Laiho P, Kokko A, et al: Gene-expression profiling predicts 21. Jansová E, Krontorad P, Svoboda Z, et al: Nové moÏnosti v diagnostice recurrence in Dukes’ C colorectal cancer. Gastroenterology 129:874-84, kolorektálního karcinomu s vyuÏitím technologie DNA mikroãipÛ. Kli- 2005 nická onkologie 17:203-207, 2004 48. Mariadason JM, Arango D, Shi Q, et al: Gene expression profiling-based 22. Birkenkamp-Demtroder K, Olesen SH, Sorensen FB, et al: Differential prediction of response of colon carcinoma cells to 5-fluorouracil and camp- gene expression in colon cancer of the caecum versus the sigmoid and rec- tothecin. Cancer Res 63:8791-812, 2003 tosigmoid. Gut 54:374-84, 2005 49. Arango D, Wilson AJ, Shi Q, et al: Molecular mechanisms of action and 23. Chiu ST, Hsieh FJ, Chen SW, et al: Clinicopathologic correlation of up- prediction of response to oxaliplatin in colorectal cancer cells. Br J Cancer regulated genes identified using cDNA microarray and real-time reverse 91:1931-46, 2004 transcription-PCR in human colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomar- 50. Souza V, Dong YB, Zhou HS, et al: SW-620 cells treated wit- kers Prev 14:437-43, 2005 h topoisomerase I inhibitor SN-38: gene expression profiling. J Transl Med 24. Tibshirani R: A simple method for assessing sample sizes in microarray 3:44, 2005 experiments. BMC Bioinformatics 7:106, 2006 51. Ghadimi BM, Grade M, Difilippantonio MJ, et al: Effectiveness of gene 25. Shih W, Chetty R, Tsao MS: Expression profiling by microarrays in colo- expression profiling for response prediction of rectal adenocarcinomas to rectal cancer (Review). Oncol Rep 13:517-24, 2005 preoperative chemoradiotherapy. J Clin Oncol 23:1826-38, 2005

388 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 APLIKACE DNA âIPÒ U LYMFOIDNÍCH MALIGNIT DNA MICROARRAYS IN LYMPHOID MALIGNANCIES SVOBODA M.1,2, VÁ·OVÁ I.2,3, KOTA·KOVÁ J.1, MALâÍKOVÁ J.3, FABIÁN P.1, TICH¯ B.3, BERKOVCOVÁ J.4, KLABUSAY M.2,3, REJTHAR A.5

1 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV BRNO 2 LÉKA¤SKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERZITY BRNO 3 INTERNÍ HEMATOONKOLOGICKÁ KLINIKA FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO 4 LABORATO¤ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY P¤I DùTSKÉ KLINICE LF UP A FN OLOMOUC 5 PATOLOGICKO ANATOMICK¯ ÚSTAV, FN U SV. ANNY, BRNO

Souhrn Diagnostika hematologick˘ch malignit je v souãasnosti zaloÏena na morfologick˘ch kritériích, doplnûn˘ch o ana- l˘zy nûkolika molekulárních markerÛ. Uvnitfi fiady takto definovan˘ch jednotek v‰ak pacienti vykazují hetero- genní odpovûì na aplikovanou léãbu a odli‰n˘ klinick˘ v˘voj onemocnûní. Vyvstává tedy otázka, co je pfiíãinou tohoto stavu? Selhávají stávající diagnostické metody nebo klasifikaãní systémy hematologick˘ch malignit? Zhoubné novotvary obecnû pfiedstavují chorobu genomu. Z tohoto dÛvodu je nadûje vkládána do DNA ãipÛ (DNA microarrays), neboÈ se jedná o zafiízení schopné ve velmi krátkém ãase paralelnû detekovat a kvantifikovat expresi aÏ desítky tisíc genÛ. DNA ãipové anal˘zy nám umoÏÀují globální pohled na genovou expresi nádoru a identifikaci molekulárních markerÛ dÛleÏit˘ch pro diagnostiku, klasifikaci a predikci nádorového onemocnûní, zejmé- na se zfietelem na v˘voj a efektivní pouÏití cílené terapie. V pfiípadû lymfoidních malignit DNA ãipy jiÏ pfiinesly nûkolik v˘znamn˘ch objevÛ s jednoznaãn˘m klinick˘m dopadem. Jejich souhrn pfiiná‰íme v na‰em pfiehledovém ãlánku.

Klíãová slova: lymfom, leukémie, DNA ãipy, predikce a prognóza, cílená léãba.

Summary The diagnosis of hematologic malignancies is currently based on morphology and analysis of a few of molecular markers of cancer cells. Responses to treatment and clinical outcomes of patients within these diagnostic categories are heterogenous. What is the reason of this situation? The inadequacy of existing diagnostic methods or diagnostic categories? Cancer is, in essence, a genetic disease. DNA microarrays represents a tool capable of both detecting and quantifying expression of tens of thousands genes (expression profiling) in a very short period of time. On this account DNA micrarrays are used to identify new molecular markers important for diagnostic and clasification of cancer and prediction of treatment outcome. The aim of this review article is to introduce to some fundamental discoveries provided by microarray technology in lymphoid malignancies.

Key words: lymphoma, leukemia, microarrays, prediction and prognosis, target therapy.

Diagnostika hematologick˘ch malignit je v souãasnosti identifikovat variabilitu genetického kódu. DNA ãipové zaloÏena na morfologick˘ch kritériích, doplnûn˘ch o ana- anal˘zy nám umoÏÀují globální pohled na genovou expre- l˘zy nûkolika molekulárních markerÛ. Uvnitfi fiady takto si nádoru a identifikaci molekulárních markerÛ dÛleÏit˘ch definovan˘ch jednotek pacienti vykazují heterogenní odpo- pro diagnostiku, klasifikaci a predikci nádorového one- vûì na aplikovanou léãbu a odli‰n˘ klinick˘ v˘voj one- mocnûní, zejména se zfietelem na v˘voj a efektivní pouÏi- mocnûní. Vyvstává tedy otázka, co je pfiíãinou tohoto sta- tí cílené terapie (1). V pfiípadû lymfoidních malignit DNA vu? Selhávají stávající diagnostické metody nebo ãipy jiÏ pfiinesly fiadu v˘znamn˘ch objevÛ s jednoznaãn˘m klasifikaãní systémy hematologick˘ch malignit? Obecnû klinick˘m dopadem. Jejich souhrn pfiiná‰íme v na‰em pfie- lze konstatovat, Ïe zhoubné novotvary pfiedstavují choro- hledovém ãlánku. bu genomu, jehoÏ patologické alterace (chromozomální aberace nebo genové mutace) vedou k maligní transfor- 1. DIFÚZNÍ VELKOBUNùâN¯ LYMFOM Z B-LYM- maci buÀky a kumulace tûchto zmûn ovlivÀuje v˘voj nádo- FOCYTÒ (DLBCL) rového onemocnûní. Relativnû vysok˘ poãet genÛ s pri- DLBCL má nejvy‰‰í incidenci z celé skupiny nehodgkinsk˘ch márnû (onkogeny a supresorové geny), ale zejména se lymfomÛ (NHL). Jedná se o agresivní onemocnûní, jehoÏ sekundárnû pozmûnûnou expresí je moÏnou pfiíãinou sta- potenciální kurabilita souvisí zejména se zavedením kombi- vu, kdy na základû anal˘zy jednoho nebo nûkolika z nich nované chemoterapie zaloÏené na antracyklinech, která vede nelze vÏdy dosáhnout optimální diagnostické diskrimi- k vyléãení pfiibliÏnû 40% pacientÛ. Modifikace reÏimÛ che- nanty nebo prediktivního faktoru daného onemocnûní. moterapie, aÈ uÏ v podobû intenzifikace nebo poãtu cytostatik, Z tohoto dÛvodu je nadûje vkládána do DNA ãipÛ (DNA nepfiinesly pfiesvûdãivé zmûny v léãebn˘ch v˘sledcích. Urãi- microarrays), které pfiedstavují zafiízení schopné ve velmi tá nadûje spoãívá v biologické terapii monoklonálními proti- krátkém ãase paralelnû detekovat a kvantifikovat expresi látkami (2). Klinická heterogenita onemocnûní proto vede ke aÏ desítky tisíc genÛ (stanovit profil genové exprese) a nebo snaze o identifikaci prognostick˘ch markerÛ. Jak se ukázalo

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 389 na zaãátku osmdesát˘ch let, morfologická kritéria (definující MUM1/IRF4 (multiple myeloma-1/interferon regulatory fac- napfi. imunoblastickou, centroblastickou, anaplastickou vari- tor-4) a povrchového antigenu CD138 (10). I na‰e vlastní, antu DLBCL) nedosahovala pfiesvûdãivého prognostického dosud nepublikované, v˘sledky získané z hodnocení soubo- v˘znamu (3). S postupn˘m rozvojem imunohistochemick˘ch ru 48 pacientÛ s DLBCL ukazují, Ïe obû v˘‰e uvedené vari- a pozdûji zejména molekulárnû genetick˘ch metod, bylo moÏ- anty DLBCL jsou identifikovatelné pomocí IHC a mají roz- né studovat expresi jednotliv˘ch markerÛ na proteinové nebo dílnou prognózu (obrázek ã.2). genové úrovni. Ani s touto pomocí v‰ak nedo‰lo k nalezení sil- n˘ch prediktorÛ, neboÈ u fiady z nich existovaly rozporuplné v˘sledky (napfi. CD10, CD44, BCL-6) (4,5,6). Tyto rozpaky se staly mnohem znatelnûj‰ími ve svûtle pozitivních v˘sledkÛ mezinárodního projektu „International Non-Hodgkin’s Lymp- homa Prognostic Factors Project“, zaloÏeného v‰ak na anal˘- ze bûÏnû dostupn˘ch klinick˘ch parametrÛ a laboratorních vy‰etfiení. Jeho závûry byly publikovány v roce 1993, a to v podobû prognostického indexu „IPI“ (International Pro- gnostic Index) (7). Index IPI dosahoval mnohem vy‰‰í pro- gnostické síly neÏ tradiãnû pouÏívaná klinická stádia, na druhou stranu nebylo moÏné pfiehlédnout, Ïe mezi pacienty uvnitfi jednotliv˘ch prognostick˘ch skupin stále existovaly v˘znam- né rozdíly ve v˘voji choroby. S ohledem na podstatu nádoro- vého onemocnûní jsou v souãasnosti nadûje vkládány zejmé- na do komplexních anal˘z genové exprese pomocí technologie DNA ãipÛ (1).

1.1. Molekulární taxonomie DLBCL Jak jiÏ bylo uvedeno, subklasifikace DLBCL na základû morfologick˘ch kritérií nemûla v klinickém v˘voji onemocnûní Obrázek ã. 1.: (A) Dendrogram shlukové anal˘zy, na kterém je patrné odpovídající korelát. AÏ pouÏití DNA ãipÛ vedlo k odhalení rozdûlení DLBCL (sloupce) do tfií skupin definovan˘ch na základû podob- nov˘ch variant DLBCL, které se v˘raznû li‰í sv˘m biolo- nosti exprese vybrané skupiny genÛ (fiádky): 1. Germinal Center B-cell gick˘m chováním. První práci na toto téma publikoval A. like DLBCL; 2. Type-3 DLBCL; 3. Activated B-cell like DLBCL. Expre- se genÛ je v dendrogramu kódována barevnû. Zelená barva znaãí nízkou, Alizadeh s kolektivem sv˘ch stanfordsk˘ch spolupracovní- ãervená barva vysokou a ãerná barva prÛmûrnou expresi daného genu kÛ. Autofii pro tento úãel pouÏili DNA ãipy vlastní produk- v daném DLBCL. ·edá barva oznaãuje gen, jehoÏ exprese nebyla vyhod- ce, tzv. lymfoãipy, nesoucí na svém povrchu sondy pro více nocena. Na pravé stranû dendrogramu jsou uvedeny geny s nejvy‰‰í dis- neÏ 17 000 genÛ exprimovan˘ch zejména v lymfocytech krimaãní hodnotou. Pfievzato a upraveno z ref. ã. 9, podrobnû viz. text. (B a C) Kaplan-Meierovy kfiivky pravdûpodobnosti celkového pfieÏití a v lymfatické tkáni. Získané hodnoty genové exprese byly u pacientÛ s jednotliv˘mi variantami DLBCL, ktefií byli léãení kombino- podrobeny shlukové anal˘ze, která na základû jejich podob- vanou chemoterapií zaloÏenou na antracyklinech. Hodnoty na ose „x“ jsou nosti identifikovala dvû dosud nerozpoznané varianty DLB- uvedeny v letech. (B) pfievzato a upraveno z reference ã. 9, podrobnû viz. CL, oznaãené jako: „Germinal Center B-cell like DLBCL“ text. (C) pfievzato a upraveno z reference ã. 8, podrobnû viz. text. Jak uka- zují kfiivky Type-3 DLBCL a Activated B-cell like DLBCL mají hor‰í pro- (GCBC-like DLBCL; B-lymfocytÛm zárodeãného centra gnózu, neÏ Germinal Center B-cell like DLBCL. RovnûÏ profil genové podobn˘ DLBCL) a „Activated B- cell like DLBCL“ (ABC- exprese vykazuje vût‰í podobnost mezi Type-3 DLBCL a Activated B- like DLBCL; aktivovan˘m B-lymfocytÛm podobn˘ cell like DLBCL. DLBCL). Názvy byly odvozeny z podobnosti profilÛ geno- vé exprese obou variant s profily B-lymfocytÛ vycházejících DNA ãipové anal˘zy pfiispûly rovnûÏ k molekulární charakte- buì ze zárodeãného centra (GC-germinal center) lymfatic- ristice dal‰í varianty DLBCL, a to primárnû mediastinálního B- kého folikulu, nebo z antigenem aktivovan˘ch a mitoticky lymfocytárního lymfomu (mediastinal large B-cell lymphoma, aktivních B-lymfocytÛ periferní krve. Zajímavé zji‰tûní MLBCL). MLBCL není histopatologick˘mi metodami jedno- nastalo po korelaci uvedené molekulární klasifikace DLBCL znaãnû odli‰iteln˘ (11) a jeho diagnostika se proto opírá o kore- s klinick˘mi údaji. Pacienti s GCBC-like DLBCL (21 pfiípa- laci klinick˘ch údajÛ s diagnózou DLBCL. Incidence MLBCL dÛ) mûli signifikantnû lep‰í v˘sledky 5ti-letého pfieÏití, neÏ pfievaÏuje u mlad‰ích pacientÛ, ãastûji jsou to Ïeny (1,8:1), pacienti s ABC-like DLBLC (22 pfiípadÛ) (76% vs 16% paci- medián vûku se nachází v rozmezí 30-35 let. Onemocnûní typic- entÛ, p<0,01; obrázek ã. 1C). Multivariabilní anal˘za potvr- ky postihuje zejména mediastinum, ale mÛÏe i „metastazovat“, dila, Ïe tato klasifikace je nezávisl˘m prognostick˘m fakto- nejãastûji do ledvin, CNS a jater (11,12). MLBCL je agresivní rem, schopn˘m stratifikovat i pacienty se stejnou hodnotou onemocnûní, na druhou stranu relativnû dobfie odpovídá na pri- indexu IPI (8). Stanfordská skupina ve svém v˘zkumu pokra- mární léãbu. Nûkteré studie prokázaly dosaÏení lep‰ích léãeb- ãovala a o dva roky pozdûji publikovala práci, která obsaho- n˘ch v˘sledkÛ neÏ u klasického DLBCL, pakliÏe byla chemo- vala v˘sledky anal˘zy souboru 240 pacientÛ s DLBLC. Zfiej- terapie kombinována s radioterapií (3-leté pfieÏití v 82% mû vy‰‰í poãet lymfomÛ zpÛsobil, Ïe mezi pÛvodnû dvûma pfiípadÛ) (13). Jak jsme jiÏ uvedli, z morfologického pohledu zfietelnû odli‰n˘mi variantami byla nalezena varianta tfietí, není MLBCL od DLBCL jednoznaãnû odli‰iteln˘. Obû vari- oznaãená jednodu‰e „Type-3 DLBCL“ (tfietí typ DLBCL). anty vykazují difúzní proliferaci velk˘ch B-lymfocytÛ s bledou V‰echny tfii varianty DLBLC se li‰ily profilem genové expre- cytoplasmou a ani na úrovni jednotliv˘ch molekulárních zna- se (obrázek ã. 1A), i kdyÏ v parametrech pfieÏití pfietrvaly kÛ není patrná v˘razná diference. Jejich imunofenotyp sdílí pfií- jednoznaãné rozdíly jen mezi ABC-like a GCBC-like tomnost povrchov˘ch antigenÛ typick˘ch pro B-lymfocytární DLBCL (5-leté pfieÏití ve skupinû GCBC-like DLBCL 60% linii (CD19, CD20, CD22 a CD79a), ale na rozdíl od DLBCL, pacientÛ, ABC-like DLBCL 35%, Type-3 DLBCL 39%, MLBCL postrádají imunoglobulinovou komponentu BCR obrázek ã. 1B) (9). Uvedená molekulární klasifikace byla po- receptoru a pouze vyjímeãnû nesou translokaci BCL-2 nebo zdûji transformována na proteinovou úroveÀ, kde je zaloÏe- BCL-6 genu. Naopak nadmûrnou sklerotizaci potvrzuje zv˘- na na imunohistochemické detekci (IHC) nûkolika antigenÛ. ‰ená exprese genÛ extracelulární mátrix ve vzorcích MLBCL, GCBC-like DLBCL jsou od ABC-like DLBCL odli‰eny nej- zejména fibronectinu a kolagenu typ III a IV (11,12). O bunûã- ãastûji na základû pozitivní exprese povrchového antigenu ném pÛvodu MLBCL nebyl dosud uãinûn definitivní závûr. CD10 a/nebo proteinu BCL-6 a negativní exprese proteinu V˘sledky CGH (comparative genomic hybridization) a DNA

390 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 ãipov˘ch anal˘z odhalily na úrovni genomu podobnost mezi 1.2. Prognostické profily genové exprese DLBCL MLBCL a klasick˘m Hodgkinov˘m lymfomem typu nodulár- Vedle vzniku molekulární taxonomie DLBCL, paralelnû pro- ní sklerózy (HL-NS). MLBCL a HL-NS sdílejí nûkteré chro- bíhá i snaha o identifikaci profilÛ genové exprese, které by mosomální a genové abnormality, napfiíklad amplifikaci krát- slouÏily pouze k prognostick˘m nebo k prediktivním úãelÛm. kého raménka chromosomu 9 (75% MLBCL) a 2 ( 20% V roce 2002 publikovala M. Shipp s kolektivem bostonsk˘ch MLBCL), které zpÛsobují zv˘‰enou expresi genÛ JAK2, PDL2, spolupracovníkÛ práci, ve které analyzovali genovou expresi PDL1 (9p24) a REL (2p16). Tyto zmûny jsou u DLBCL dete- 58 DLBCL, pocházejících od pacientÛ léãen˘ch chemoterapií kovány jen velmi zfiídka, stejnû jako zv˘‰ená exprese proteinÛ na bázi CHOP reÏimu. V tomto souboru dosáhlo kompletní CD30, MAL, STAT1, TRAF1, IL-13Rá, CD58 a TARC. remise a minimálnû pûtiletého pfieÏití bez relapsu onemocnû- (11,12). Podobnost na molekulární úrovni zãásti potvrzují ní (RFS) 32 pacientÛ. Zb˘vajících 23 pacientÛ zemfielo i kazuistiky z klinické praxe popisující pacienty s HL-NS, u kte- v dÛsledku progrese choroby a 3 pacienti mûli opakovan˘ r˘ch dochází do jednoho roku od ukonãení léãby k relapsu cho- relaps onemocnûní, i kdyÏ zÛstávali na Ïivu. Autofii identifi- roby, která nese jednoznaãné histopatologické charakteristiky kovali profil sloÏen˘ ze 13 genÛ, jejichÏ expresí se li‰ily lym- DLBCL (14). Byly ale zaznamenány i opaãné pfiípady (12). fomy vyléãen˘ch pacientÛ („cured“) od pacientÛ, ktefií neús- Zajímavou práci na toto téma publikoval A. Rosenwald, kter˘ pû‰nû bojovali s chorobou („fatal/refractory“). V prvním se sv˘mi spolupracovníky z NCI (National Cancer Institute, pfiípadû dosáhlo pûtiletého pfieÏití 72% pacientÛ, ve druhém USA) analyzoval rozsáhlou skupinu 274 pacientÛ s DLBCL. pfiípadû 12% (p<0,0001) (16). K sedmi genÛm spjat˘ch se ‰pat- Autofii identifikovali 46 genÛ, jejichÏ exprese byla statisticky nou prognózou patfiily geny kódující PKCβII a PDE4B, jejichÏ signifikantnû odli‰ná (p<0.001) mezi MLBCL (46 pacientÛ) negativní prognostick˘ v˘znam byl pozdûji ovûfien i na prote- a DLBLC (obrázek ã. 3). Iniciálnû byla diagnóza MLBCL sta- inové úrovni (17,18). novena na základû klinick˘ch charakteristik, pfiiãemÏ 76% tûch- to lymfomÛ mûlo profil genové exprese charakterizující MLBCL (35 pacientÛ), 15% (7 pacientÛ) vykazovalo profil odpovídající GCBC-like DLBCL a 9% (4 pacienti) profil ABC- like DLBCL. Pacienti v poslední skupinû mûli znaãnû nepfiíz- niv˘ v˘voj choroby, zemfieli do 2 let od stanovení diagnózy. Pokud byli hodnoceni pouze pacienti s MLBCL definovan˘m na základû profilu genové exprese, pûtiletého pfieÏití dosáhlo 64% pacientÛ, ve srovnání se 46% DLBCL (11). Z klinického hlediska má dosud nejvût‰í v˘znam aberace chromosomu 2 vedoucí ke zv˘‰ené expresi genu c-REL a k následné aktivaci signální dráhy NF-κB, která je v pfiípadû MLBCL vhodn˘m terãem k v˘voji cílené terapie (15). V pfiedcházející ãásti textu jsme ãerpali rovnûÏ z v˘sledkÛ práce Savage K. a kol. ktefií studovali profil genové exprese na souboru 176 pacientÛ s DLBLC a 34 pacientÛ s MLBCL (12).

Obrázek ã. 3.: DNA ãipové anal˘zy pfiispûly rovnûÏ k molekulární cha- rakteristice primárnû mediastinálního B-lymfocytárního lymfomu (mediastinal large B-cell lymphoma, MLBCL). Diagnostick˘ profil MLBCL tvofií 46 genÛ, jejichÏ exprese je v dendrogramu kódována barevnû. Zele- ná barva znaãí nízkou, ãervená barva vysokou a ãerná barva prÛmûrnou expresi daného genu v daném DLBCL. ·edá barva oznaãuje gen, jehoÏ exprese nebyla vyhodnocena. Na základû podobnosti genové exprese uveden˘ch 46 genÛ (fiádky) je tedy moÏné odli‰it MLBCL od jin˘ch variant DLBCL (sloupce). Pfievzato a upraveno z reference ã. 11. Podrobnû viz. text.

Ve stejném roce publikoval A. Rosenwald 17ti-genov˘ prognostick˘ profil, kter˘ vznikl z anal˘zy DLBCL 240 pacientÛ Obrázek ã. 2.: Na podkladû profilu genové exprese je moÏné DLBCL léãen˘ch kombinovanou chemoterapií zaloÏenou na aplikaci rozdûlit na dvû základní varianty: Germinal Center B-cell like DLBCL“ antracyklinÛ (nejãastûji reÏim CHOP). Uveden˘ch 17 genÛ (GCBC-like DLBCL; B-lymfocytÛm zárodeãného centra podobn˘ bylo s ohledem na svou biologickou funkci rozdûleno do 5 DLBCL) a „Activated B-cell like DLBCL“ (ABC-like DLBCL; aktivovan˘m B-lymfocytÛm podobn˘ DLBCL). Pro obû varianty DLBCL kategorií. Zv˘‰ená exprese genÛ v prvních tfiech kategoriích byl definován charakteristick˘ fenotyp, kter˘ je identifikovateln˘ byla spjata s dobrou prognózou onemocnûní, naopak zv˘‰ená pomocí imunohistochemického vy‰etfiení. Pro lymfocyty zárodeãné- exprese genÛ ãtvrté a páté kategorie s prognózou nepfiíznivou. ho centra je charakteristická pozitivní exprese CD10 a/nebo Bcl-6, První kategorii tvofiily geny charakteristické pro B-lymfocyty a naopak negativní exprese MUM1 a CD138, jenÏ je typická pro anti- zárodeãného centra (napfi. BCL-6), druhou kategorii geny mají- genem stimulované mitoticky aktivní plasmatické lymfocyty. Jak uka- α zuje Kaplan-Meierova kfiivka GCBC-like DLBCL má pfiíznivûj‰í pro- cí vztah k MHC komplexu II. tfiídy (napfi. HLA-DP ), tfietí gnózu. Podrobnû viz. text. kategorii geny kódující proteiny extracelulární mátrix (napfi.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 391 kolagen a fibronectin) nebo spjaté s jejich syntézou (napfi. regulátory metabolismu (FRSB, RARS, LDHA); d) zástupci CTGF). âtvrtou kategorii pfiedstavovaly geny regulující bunûã- dal‰ích signálních cest (PIK4CA a MAPK1) a e) geny jedn- nou proliferaci (napfi. c-myc). Do Ïádné z uveden˘ch funkã- oznaãnû související s tumor infiltrujícími T-lymfocyty a mak- ních kategorií nebyl zafiaditeln˘ gen kódující BMP6 protein, rofágy (CD3D, CXCL12 a TM4SFA2). Kromû poslední kate- kter˘ jako jedin˘ utvofiil pátou kategorii (9). Pro jednotlivé pfií- gorie, byly ostatní geny zv˘‰enû exprimovány v agresivní fázi pady DLBCL bylo na základû údajÛ o expresi uveden˘ch 17 FL (21). genÛ vypoãteno skóre, které stratifikovalo pacienty do ãtyfi prognostick˘ch skupin. Mezitím co v první a ve druhé skupi- nû dosahovalo 5ti-letého pfieÏití 73% a 71% pacientÛ, ve zb˘- vajících dvou skupinách 34% a 15% pacientÛ (p<0,001). Dal- ‰í prognostick˘ genov˘ profil, tentokrát sloÏen˘ ze 6 genÛ, byl publikován I. Lossosem v roce 2004. Opût se jednalo o stanfordsk˘ t˘m autorÛ, ktefií nikoliv DNA ãipy, ale tentokrát pomocí multiplexové kvantitativní Real-Time PCR reakce validovali expresi 36 genÛ, jenÏ byly souãástí jiÏ dfiíve publikovan˘ch prognostick˘ch profilÛ nebo se z hlediska prognó- zy a predikce zkoumaly samostatnû (8,9,16). Na základû korelace údajÛ o genové expresi a parametrÛ pfieÏití bylo uveden˘ch 36 genÛ sefiazeno podle jejich prediktivní síly a ze získaného pofiadí byly vybrány tfii geny s nejvy‰‰í dosaÏenou kladnou (LMO2, BCL-6, fibronectin) a zápornou hodnotou (cyklin D2, SCYA3, BCL-2). Vznikla sestava ‰esti genÛ, kte- rá se stala základem pro v˘poãet MP-skóre (mortality-predictor score), jehoÏ hodnota rozdûlila pacienty s DLBCL do tfií prognostick˘ch skupin. Pacienti ve skupinû s nízk˘m rizikem (20 pacientÛ) dosáhli pûtiletého pfieÏití v 65% pfiípadÛ, ve sku- pinû se stfiední mírou rizika (18 pacientÛ) ve 49% a v posled- ní, vysoce rizikové skupinû (20 pacientÛ), pouze v 15% pfií- padÛ (p<0,004). V multivariabilní anal˘ze prokázali autofii Obrázek ã. 4.: (A) Dendrogram shlukové anal˘zy pfiehlednû znázorÀuje nezávislost MP-skóre na ostatních bûÏnû uÏívan˘ch klinicko- rozdíl v genové expresi dvou základních skupin B-CLL, které se li‰í mutaã- patologick˘ch parametrech, vãetnû indexu IPI (19). SvÛj pro- ní stavem IgVH. Nejvy‰‰í diskriminaãní hodnotu dosáhl gen pro protein ZAP-70 (1. fiádek). Exprese genÛ (fiádky) je v dendrogramu kódována gnostick˘ model navíc úspû‰nû verifikovali na dvou nezávis- barevnû. Zelená barva znaãí nízkou, ãervená barva vysokou a ãerná bar- l˘ch souborech DLBCL, a to na souboru 58 lymfomÛ M. Shipp va prÛmûrnou expresi daného genu v dané B-CLL (sloupce). Kaplan-Mei- a 240 lymfomÛ A. Rosenwalda. Obû práce jiÏ byly popsány erovy kfiivky znázorÀují ãasy do progrese choroby (PFS) u pacientÛ s B- v˘‰e (9,16). CLL v závislosti na pfiítomnosti: (B) exprese genu ZAP-70 (poãet molekul mRNA), nebo (C) mutace IgVH (gen pro IgVH byl v daném pfiípadû pova- Ïován za mutovan˘ tehdy, sdílel-li se zárodeãnou bunûãnou linií v nuk- 2. FOLIKULÁRNÍ LYMFOM (FL) leotidové sekvenci ménû neÏ 98% homologii). (D) Imunohistochemick˘ Folikulární lymfom se v incidenci NHL fiadí na druhé místo. prÛkaz proteinu ZAP-70 ve skupinû B-CLL s mutovan˘m, nebo nemuto- I pfiestoÏe je obecnû povaÏován za indolentní onemocnûní, kli- van˘m IgVH. (A-D) pfievzato a upraveno z reference ã. 42. (E) prÛkaz pozi- nick˘ prÛbûh jednotliv˘ch pfiípadÛ je variabilní a mÛÏe dochá- tivní exprese proteinu ZAP-70 pomocí flowcytometrické anal˘zy s fluo- rescenãnû znaãenou monoklonální protilátkou u pacienta s B-CLL zet k transformacím do agresivních lymfomÛ (2). s nemutovan˘m IgV . Pfievzato a upraveno z reference ã. 44. Velmi zajímavou preklinickou práci zab˘vající se v˘hradnû H folikulárním lymfomem publikoval Hervé Husson. Pomocí Vliv mikroprostfiedí na biologické chování nádoru studovali DNA ãipÛ analyzoval a následnû porovnal profil genové expre- Dave S. a kol. na souboru 191 pacientÛ s FL. V˘sledkem byly se fyziologick˘ch B-lymfocytÛ vycházejících ze zárodeãného dva genové profily („Profil imunitní odpovûdi 1“ a „Profil imu- centra a lymfocytÛ folikulárního lymfomu. V˘sledkem anal˘- nitní odpovûdi 2“) zámûrnû sloÏené z genÛ exprimovan˘ch zy byla identifikace 28 genÛ s nízkou a 37 genÛ s vysokou pouze v tumor infiltrujících buÀkách (T-lymfocyty, makrofá- expresí v lymfocytech FL ve srovnání s fyziologick˘m gy a dendritické buÀky). „Profil imunitní odpovûdi 1“ byl aso- protûj‰kem. Nezávislá metoda (kvantitativní Real-Time PCR) ciovan˘ s dobrou prognózou a obsahoval zejména geny cha- potvrdila v˘sledek DNA ãipÛ ve 32 pfiípadech z v˘‰e uvede- rakteristické pro T-lymfocyty (CD7, CD8B1, ITK, LEF1) ného poãtu genÛ. Mezi 24 geny s vysokou expresí byly i dva a makrofágy (ACTN1 a TNFSF13B), naopak „profil imunit- geny, jejichÏ proteiny patfií k v˘znamn˘m negativním regulá- ní odpovûdi 2“ obsahoval pfieváÏnû geny zv˘‰enû exprimova- torÛm bunûãného cyklu: p21CIP1 a p16INK4a. Tento nález kores- né v dendritick˘ch buÀkách a/nebo v makrofázích (TLR5, ponduje s pfiirozen˘m, indolentním, v˘vojem onemocnûní. FCGR1A, SEPT10, LGMN a C3AR1) a korespondoval se ‰pa- K nadmûrnû exprimovan˘m genÛm patfiily ty, jejichÏ protei- tnou prognózou v˘voje FL (22). O prognostickém v˘znamu ny se úãastní procesÛ mezibunûãn˘ch interakcí (TNF, IL2RG tumor infiltrujících makrofágÛ (TIM) u pacientÛ s FL hovofií a IL4RA) nebo slouÏí jako transkripãní faktory (PAX5 a ID- i Farinhova práce, ve které byly TIM detekovány imunohisto- 2). Naopak nízkou expresi u FL vykazovaly geny MRP8 chemicky na základû pfiítomnosti CD68 antigenu. Pacienti a MRP14. Jejich proteiny hrají v˘znamnou roli v bunûãné s vysok˘m poãtem TIM dosahovali del‰ího celkového pfieÏití adhezi (20). neÏ v opaãném pfiípadû (<15 TIM/high-power zorné pole) . Prognostick˘ profil genové exprese publikovalo nûkolik auto- Multivariabilní anal˘za prokázala nezávislost tohoto parametru rsk˘ch t˘mÛ. Glass AM a kol. analyzovali párové vzorky FL na indexu IPI (23). Z obecného pohledu není prognostick˘ získané v prÛbûhu indolentní a agresivní fáze onemocnûní v˘znam TIM jednoznaãn˘. V pfiípadû solidních tumorÛ exis- u jednotliv˘ch pacientÛ. Pomocí DNA ãipÛ identifikovali pro- tují práce, které naopak potvrzují negativní prognostick˘ fil genové exprese sloÏen˘ z 81 genÛ, kter˘ v kontrolním sou- v˘znam TIM. Z tohoto rozporu je evidentní, Ïe izolovaná boru s 94% pfiesností odli‰il vzorky pocházející z indolentní, detekce TIM nemusí mít jasnou v˘povûdní hodnotu. Není totiÏ nebo z agresivní fáze choroby. Geny tohoto profilu bylo moÏ- vylouãeno, Ïe existují jednotlivé subpopulace makrofágÛ, kte- né rozdûlit do nûkolika funkãních kategorií: a) regulátory bu- ré se li‰í svou biologickou funkcí (podobnû jako v pfiípadû T- nûãného cyklu (CCNE2, CCNA2, CDK2, CHEK1); b) regu- lymfocytÛ). Na druhé stranû mÛÏe b˘t biologická diverzita TIM látory DNA syntézy (TOP2A, PLOD3A, POLE2); c) indukovaná sekundárnû, napfiíklad T-lymfocyty nebo samot-

392 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 n˘mi nádorov˘mi buÀkami, tzv. „parakrinní smyãka“ (24). (32). Klinicky je B-CLL charakterizována jako lymfoprolife- Za zmínku stojí i práce, která se zab˘vala profilem genové rativní onemocnûní relativnû nízké malignity, nicménû s vel- exprese pacientÛ s FL s rozdílnou odpovûdí na terapii mono- mi variabilním prÛbûhem. Mezitím co u vût‰í ãásti pacientÛ se klonální protilátkou proti CD20 receptoru (rituximab). Dosud jedná o indolentní onemocnûní, se kter˘m se mohou pot˘kat bez podrobnûj‰í interpretace stojí zji‰tûní autorÛ, Ïe FL s nedo- i po desetiletí, ve druhé skupinû dochází k rychlé progresi cho- stateãnou léãebnou odpovûdí na rituximab mûly profil geno- roby, které mohu podlehnout bûhem nûkolika mûsícÛ. Klinic- vé exprese podobn˘ více buÀkám pocházejícím z fyziologické ké klasifikace B-CLL navrÏené Raiem nebo Binetem mají jen lymfatické tkánû krãních uzlin a sleziny, neÏ skupinû FL, kte- omezen˘ prognostick˘ v˘znam, a to zejména u ãasn˘ch stádií rá velmi dobfie reagovala na cílenou imunoterapii (25). nemoci (Binet A, Rai 1 a 2), ve kter˘ch je v‰ak diagnostiko- vána vût‰ina pacientÛ (34,35). Proto nastala potfieba identifi- 3. LYMFOM PLÁ·ËOVÉ ZÓNY / MANTLE CELL kace molekulárních prognostick˘ch markerÛ. Zpoãátku byl LYMPHOMA (MCL) v˘zkum zamûfien pfiedev‰ím na hledání chromosomálních abe- I v pfiípadû MCL je moÏné sledovat klinickou heterogenitu one- rací. BohuÏel, konvenãní cytogenetické techniky u pomalu pro- mocnûní. Aãkoliv medián celkového pfieÏití dosahuje 3 aÏ 4 gredujících bunûãn˘ch populací selhávaly, v dÛsledku ãehoÏ let, existují mezi jednotliv˘mi pacienty v˘razné rozdíly. Na byly chromosomální aberace detekovány pouze u 40-50% pfií- stranû jedné stojí ti, ktefií podlehnou progresi MCL do jedno- padÛ B-CLL. V˘razn˘ posun pfiineslo aÏ zavedení metody ho roku od stanovení diagnózy, na druhé stranû jsou pacienti FISH, která prokázala nejenom vy‰‰í frekvenci (aÏ 85% pfií- pfieÏívající více neÏ 10 let. Pro MCL je obecnû charakteristic- padÛ), ale i vût‰í spektrum chromosomálních zmûn u B-CLL. ká chromozomální aberace t(11;14)(q13;q32), jenÏ vede K prognosticky v˘znamn˘m patfií delece 17p13 a 11q22-q23, k nadmûrné expresi cyklinu D1. Rozdíly v jeho kvantitû v‰ak které jsou spjaty se ‰patnou prognózou (medián pfieÏití 32 a 79 nevysvûtlují odli‰nosti v klinickém prÛbûhu jednotliv˘ch pfií- mûsícÛ) a s vy‰‰í pokroãilostí choroby v dobû diagnózy, nao- padÛ MCL, i kdyÏ existují ojedinûlé práce, které prokazují pak trisomie 12q, normální karyotyp a delece 13q14 byly ãas- negativní prognostick˘ v˘znam vysoké hladiny cyklinu D1 tûji detekovány u pacientÛ s del‰ím pfieÏitím (medián 114,111 (26). Anal˘zou genové exprese MCL pomocí DNA ãipÛ se a 133 mûsícÛ) (35). Autofii Haslinger a kol. porovnávali expres- mezi prvními zab˘vala Rosenwaldova práce. Soubor obsaho- ní profily B-lymfocytÛ 11 zdrav˘ch dárcÛ a 100 B-CLL paci- val 92 pacientÛ s MCL, jehoÏ diagnóza byla stanovena na entÛ nesoucí nûkterou z tûchto aberací. Lokalizace rozdílnû základû morfologick˘ch kritérií a pfiítomnosti vysoké hladiny exprimovan˘ch genÛ u jednotliv˘ch skupin pomûrnû dobfie cyklinu D1 (CCND1+). V úvodní fázi anal˘zy bylo identifi- korelovala s lokalizací relevantních aberací, je tedy pravdû- kováno více neÏ 1000 genÛ, jejichÏ expresí se MCL li‰ily od podobné, Ïe chromozomální aberace hrají roli v patogenezi ostatních NHL. Diagnostick˘ profil MCL nakonec utvofiilo 42 B-CLL a jsou jednou z pfiíãin klinické heterogenity onemoc- genÛ, pfiiãemÏ gen pro CCND1 byl zámûrnû vyfiazen. Autofii nûní B-CLL (36). testovali uveden˘ profil na kontrolním souboru NHL, kde dosá- Dal‰í studie prokázaly, Ïe rovnûÏ v˘skyt somatick˘ch mutací hl správné identifikace MCL v 98% pfiípadÛ (27). v genech kódujících variabilní ãásti tûÏkého (VH) fietûzce imu- Zajímav˘m zji‰tûním bylo, Ïe sedm pfiípadÛ NHL s negativní noglobulinÛ (Ig) má vztah k predikci klinického v˘voje one- expresí cyklinu D1 (CCND1-) bylo na podkladû uvedeného mocnûní (obrázek ã. 4C). Na základû v˘skytu nebo absence profilu klasifikováno jako CCND1+ MCL. U tûchto lymfomÛ tûchto mutací je moÏné B-CLL ãlenit do dvou skupin. B-CLL byla následnû nalezena nadmûrná exprese cyklinu D2 nebo D3 vycházející z „pamûÈov˘ch“ B-lymfocytÛ, které jiÏ pro‰ly záro- (27). Existenci CCND1- MCL s prokázánou expresí cyklinu deãn˘m centrem a jsou nositely IgVH mutací (M-B-CLL, muta- D2 nebo D3 potvrdily i dal‰í práce, coÏ naznaãuje ted B-CLL), a B-CLL z „naivních“ B-lymfocytÛ (pre-GC B- urãitou „funkãní zastupitelnost“ jednotliv˘ch cyklinÛ D v pfií- lymfocyty), které do zárodeãného centra dosud nevstoupily, padû patogeneze MCL (28). Rosenwaldova práce vedla rov- nebo se v nûm nesetkaly s antigenem, a proto nenesou Ïádnou nûÏ k identifikaci prognostického genového profilu MCL, kte- somatickou mutaci genÛ IgVH (UM-B-CLL, unmutated B- r˘ obsahoval 48 genÛ ve v˘znamné vazbû k dobû celkového CLL) (37,38). Medián celkového pfieÏití (OS) pacientÛ ve sku- pfieÏití (p<0,001) (27). pinû UM-B-CLL se pohybuje v rozmezí 79-119 mûsícÛ, mezi- Studiem prognosticky nepfiíznivé blastoidní varianty MCL tím co ve skupinû M-B-CLL je nûkolikanásobnû del‰í a u fiady (BV-BCL) se zab˘vala publikace de Vose a kol. Autofii iden- tûchto pacientÛ onemocnûní vÛbec nevyÏaduje léãbu. Mutaã- tifikovali 118 genÛ, jejichÏ expresí se MCL a BV-MCL vzá- ní status IgVH je nezávisl˘m prognostick˘m faktorem, kter˘ jemnû odli‰ovaly. Ke skupinû genÛ s vy‰‰í expresí u BV-MCL pacienty stratifikuje bez ohledu na klinické stádium B-CLL. patfiily napfiíklad: cyklin-dependentní kinása 4 (CDK4); onko- Tak napfiíklad u pacientÛ klinického stádia „Binet A“ byl ve geny: c-myb, c-pim1 a c-pim2; inhibitory apoptózy: DAD1 skupinû UM-B-CLL medián OS 95 mûsícÛ a ve skupinû MB- a RSK1; a transkripãní faktory: YY1 a CDC25B. V pfiípadû CLL 293 mûsícÛ (P =0.0008) (37-39). CDK4 a CDC25B pfiitom existuje pfiímá spojitost s CCND1. Vzhledem k tomu, Ïe pfiítomnost nebo absence somatické Vazba CDK4 a CDC25B na CCND1 umoÏÀuje iniciaci pfie- mutace genÛ pro IgVH je vázána na odli‰né maturaãní stádi- chodu pfies kontrolní body bunûãného cyklu G1/S a G2/M. Oba um B-lymfocytÛ, bylo pfiekvapením, Ïe první mikroãipové ana- poslednû jmenované geny byly autory oznaãeny za potenciální l˘zy genové exprese B-CLL nevedly pfii pouÏití nezávisl˘ch kandidáty k cílené terapii, která by u BV-MCL mohla dosáhno- (unsupervised) shlukov˘ch anal˘z k identifikaci profilu geno- ut lep‰ího terapeutického úspûchu, neÏ stávající cytostatická vé exprese, kter˘ by obû skupiny B-CLL odli‰il. Tato skuteã- léãba (27,29). nost naopak podporuje hypotézu, Ïe B-CLL sdílejí spoleãn˘ bunûãn˘ pÛvod, ve kterém procházejí stejn˘m mechanismem 4. CHRONICKÁ LYMFATICKÁ LEUKÉMIE maligní transformace (40). Problematickou interpretaci vyvo- Z B-LYMFOCYTÒ (B-CLL) lávají v˘sledky dal‰í studie, ve které autofii na souboru 100 Dal‰í hematologickou malignitou, pfii jejímÏ studiu jsou pacientÛ vyselektovali genov˘ profil, na jehoÏ základû bylo s úspûchem vyuÏívány DNA ãipy, je B-CLL. Onemocnûní moÏné odli‰it M-B-CLL od UM-B-CLL. Kuriózní v‰ak bylo, postihuje zejména jedince nad 50 let vûku a s incidencí Ïe pouze u muÏÛ. Autofii pfiitom analyzovali zpoãátku cel˘ sou- 3:100 000 patfií k nejroz‰ífienûj‰ímu typu leukémie (pozn. bor, následnû zvlá‰È muÏskou a Ïenskou populaci. Jak u muÏÛ WHO klasifikace fiadí B-CLL k hematologick˘m malignitám (62 pacientÛ), tak i u Ïen (38 pacientek) pfiedstavovala skupi- vycházejících ze zral˘ch forem B-lymfocytÛ, tedy do stejné na M-CLL pfiibliÏnû 55% pfiípadÛ (36). Je snad pfiíslu‰nost skupiny, jako NHL) (30,31). V histopatologickém obraze je k pohlaví determinantou genové exprese leukemick˘ch bunûk? pro B-CLL charakteristická akumulace zral˘ch monomorfních My‰lenka to není tak úplnû zavrÏení hodná, uvûdomíme-li si, monoklonálních B-lymfocytÛ s typick˘m imunofenotypem Ïe incidence B-CLL je u muÏÛ pfiibliÏnû 2x vy‰‰í neÏ u Ïen,

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 393 a Ïe v nûkolika studiích byla prokázána jednoznaãná souvis- enty spolehlivû neodhalí ani pouÏití stávajících klinick˘ch, lost mezi v˘skytem UM-B-CLL a muÏsk˘m pohlavím. Nap- cytogenetick˘ch a molekulárních markerÛ (46). DNA ãipy se fiíklad v Damleovû práci byl pomûr muÏÛ a Ïen ve skupinû UM- proto nabízí jako vhodná metoda ke hledání nov˘ch predik- B-CLL 11:1 a 1,1:1 ve skupinû M-B-CLL (p<0,003), tivních a prognostick˘ch ukazatelÛ. Jedny z prvních mikroãi- v Oscierovû souboru 2,4:1 u UM-B-CLL a 1:1,1 u M-B-CLL pov˘ch anal˘z, které byly na souborech primárních lidsk˘ch (p=0,003) a v Hamblinovû souboru 2:1 u UM- B-CLL a 1,1:1 tumorÛ vÛbec provedeny, se t˘kaly právû pacientÛ s akutními u M-B-CLL (p>0,05) (37-39). Oscier navíc prokázal pfií- leukémiemi. V roce 1999 publikovala skupina T. Goluba slu‰nost k muÏskému pohlaví jako negativní prognostick˘ fak- v ãasopisu Science práci, ve které autofii na základû profilu tor, neboÈ po 10 letech v jeho souboru pfieÏívalo 64% muÏÛ genové exprese dokázali odli‰it obû hlavní skupiny akutních a 87% Ïen (p=0,01) (39). Vzhledem k tomu, Ïe incidence hema- leukémií (ALL a AML) (47). Optimismus autorÛ tehdy spo- tologick˘ch malignit je obecnû vy‰‰í u muÏÛ neÏ u Ïen, pfii- ãíval zejména v budoucnosti DNA ãipÛ, které povaÏovali za ãemÏ v ojedinûl˘ch pfiípadech se mÛÏe jednat o v˘razné roz- hlavní nástroj rozvíjející se prediktivní diagnostiky. Pfiedsta- díly (napfi. HCL 5:1, BurkitÛv lymfom sporadická forma 2-3:1, vovali si, Ïe pro kaÏdou skupinu nádorov˘ch onemocnûní endemická forma 2:1, MCL 2:1), stojí souvislost pohlaví budou existovat specifické DNA ãipy, nesoucí na svém povr- a hematologick˘ch malignit za bliÏ‰í prozkoumání (30,31). chu sondy pouze pro omezen˘ poãet relevantních genÛ, ajejich Po „selhání“ nezávisl˘ch shlukov˘ch anal˘z byl k identifika- pomocí bude moÏné stanovit pfiesnou diagnózu choroby, urãit ci genov˘ch profilÛ specifick˘ch pro M-B-CLL a UM-B-CLL nejvhodnûj‰í moÏnou léãbu a pfiedpovûdût prognózu pacien- pouÏit˘ jin˘ biostatistick˘ pfiístup, pracující jiÏ od poãátku ta. Je pfiíjemné sledovat, jak se jejich vize postupnû naplÀují. s informací, kter˘ ze vzorkÛ je, a nebo není nositelem mutace O tfii roky pozdûji publikovali Armstrong a kol. práci, ve kte- IgVH. Tímto zpÛsobem byl na pilotním souboru 28 pacientÛ ré identifikovali profil genové exprese specifick˘ pro skupinu identifikován první genov˘ profil ãítající 175 genÛ, jejichÏ leukémií s chromosomální aberací postihující mixed-lineage exprese se mezi vzorky UM-B-CLL a M-B-CLL v˘raznû li‰i- leukemia (MLL) gen. Tato skupina ALL má z hlediska svého la. Ke tfiem genÛm s nejvy‰‰í diskriminaãní hodnotou patfiil biologického chování nepfiíznivou prognózu a právû odli‰n˘ i ZAP-70, kódující stejnojmennou proteinkinázu. Gen ZAP- klinick˘ prÛbûh a pfiítomnost patognomické chromosomální 70 byl exprimován ve v‰ech pfiípadech UM-B-CLL, a naopak aberace vedly k jejímu vyãlenûní a oznaãení MLL (mixed- v Ïádném vzorku M-B-CLL (41). O dva roky pozdûji publi- lineage leukemia; nebo Re-MLL-ALL, Rearrangements-MLL- kovali stejní autofii práci, ve které podrobili DNA ãipové ana- ALL). Armstrogova práce byla realizována na souboru 37 l˘ze celkem 107 pacientÛ s B-CLL, pfiiãemÏ v 74% se jedna- pacientÛ a profil genové exprese dokázal jednoznaãnû od sebe lo o M-B-CLL (obrázek ã. 4A). I v tomto pfiípadû byla exprese odli‰it ALL, MLL a AML. Pfii podrobnûj‰í anal˘ze autofii zji- ZAP-70 v˘raznû vy‰‰í u UM-B-CLL neÏ u M-B-CLL stili, Ïe profil MLL se nápadnû podobá profilu genové expre- (p<0,001) a ze v‰ech 240 genÛ v profilu ZAP-70 dosahoval se hematopoetick˘ch progenitorÛ stojících ve v˘vojové fiadû nejvy‰‰ího diskriminaãního potenciálu k odli‰ení obou skupin na rozcestí myeloidních a lymfoidních linií. Tím potvrdili v˘- B-CLL (správnû klasifikoval 93% vzorkÛ, p<0,001) (42). sledky jin˘ch prací, které poukazovaly na rozporupln˘ feno- Podobné v˘sledky pfiinesla i dal‰í práce (43). typ tûchto nádorov˘ch bunûk (exprese lymfoidních znakÛ Objevení ZAP-70 patfií dosud k nejv˘znamnûj‰ím pfiíspûvkÛm CD79B, CD44 a CD19, naopak ztráta exprese lymfocytární- DNA ãipÛ do klinické praxe v oblasti prediktivní diagnostiky ho antigenu CD10, nebo koexprese myeloidních antigenÛ lymfoidních malignit. Jeho exprese je siln˘m a nezávisl˘m CD15 a CD65). Z mikroãipové anal˘zy dále vyplynulo, Ïe molekulárním prediktorem nepfiíznivé prognózy (obrázek ã. MLL, ve srovnání s ALL a AML, ve zv˘‰ené mífie exprimují 4B) (42,44). Jako názorn˘ pfiíklad uvádíme v˘sledky práce geny HOXA9, HOXA5 a HOXA4, které se podílejí na regu- Orchardové a kol., jenÏ studovali expresi ZAP-70 v souboru laci diferenciace pluripotentní hematopoetické buÀky a jejich 167 pacientÛ s B-CLL. Jednoznaãná mutace IgVH byla progenitorÛ, a dále FLT3 gen, kódující stejnojmenn˘ receptor detekována u 65% pacientÛ. Medián celkového pfieÏití ve sku- rÛstového faktoru, jenÏ se vyskytuje v˘hradnû u hematopoie- pinû s negativní expresí ZAP-70 pfiesahoval 24 let, zatímco ve tick˘ch kmenov˘ch bunûk (CD34+). Pfiítomnost interní tan- skupinû s pozitivní expresí byl 9,3 roku (p<0,0001) (44). Pro demové mutace FLT3 genu je detekována pfiibliÏnû u 20-30% klinickou praxi je zásadní i skuteãnost, Ïe genové expresi ZAP- procent pfiípadÛ AML a je jednoznaãn˘m nepfiízniv˘m pre- 70 odpovídá v˘skyt proteinu, kter˘ lze velmi jednodu‰e sta- diktivním a prognostick˘m faktorem (48). Podrobnûj‰ím stu- novit pomocí flowcytometrie (obrázek ã. 4E) nebo imunohis- diem expresního profilu MLL se zab˘val i Tsutsumi a kol. (49). tochemie (obrázek ã. 4D), pfiiãemÏ senzitivita a specificita Proteiny v˘‰e popisovan˘ch genÛ mohou b˘t vhodn˘mi kan- tûchto metod se pohybuje nad 95%. Z hlediska technické didáty pro cílenou léãbu. Z tohoto pohledu si nelze pfiát nic variability, ale rovnûÏ s ohledem na korelaci s proteinovou jiného, neÏ aby i v pfiípadû MLL byl objeven dal‰í „Gleevec“, expresí ZAP-70 a s údaji o klinickém prÛbûhu choroby, je gen jako v pfiípadû CML s fúzním BCR/ABL genem. V této sou- pro IgVH povaÏován za mutovan˘ tehdy, sdílí-li se zárodeã- vislosti se v souãasnosti vkládájí nemalé nadûje do inhibitorÛ nou bunûãnou linií v nukleotidové sekvenci ménû neÏ 97% tyrozin-kinázové aktivity FLT3 receptoru (50). homologii (40,44). Dal‰í rozsáhlá práce byla provedena na souboru 360 vzorkÛ Jako poslední pfiíklad vyuÏití DNA ãipÛ u B-CLL uvedeme ALL pocházejících od dûtsk˘ch pacientÛ. Autofii na základû identifikaci profilu genové exprese predikujícího odpovûì na profilu genové exprese sloÏeného z 271 genÛ rozdûlili ALL do fludarabin. Rosenwald a kol. tak uãinili na souboru 7 pacien- sedmi skupin: 1. BCR-ABL, 2 . E2A-PBX1, 3. TEL-AML1, 4. tÛ. Vût‰ina genÛ z tohoto profilu mûla funkãní vztah k signál- MLL, 5. hyperploidní karyotyp, 6. T-ALL a sedmá skupina ní dráze proteinu p53, coÏ odpovídá situaci v in-vitro systé- s dosud nejasn˘m v˘znamem. Profil genové exprese kla- mech, kde kultivace maligních lymfocytÛ s fludarabinem sifikoval v‰echny analyzované vzorky ALL s mnohem vût‰í vyvolává odpovûì závislou na stavu signální dráhy p53 a vede pfiesností, neÏ by se stalo pouze s ohledem na v˘skyt specific- k pozitivní selekci bunûk s mutovan˘m proteinem. Tímto k˘ch genov˘ch alterací. Tak napfiíklad ãtyfii pfiípady ALL byly mechanismem dochází k indukci sekundární rezistence zafiazené do skupiny TEL-AML1 i pfiesto, Ïe u nich nebyla RT- a k selhání protinádorové léãby (45). PCR reakcí nalezena Ïádná známá chimerická pfiestavba. Sekvenaãní anal˘za TEL v‰ak prokázala jeho mutaci (51). O rok 5. AKUTNÍ LYMFOBLASTICKÁ LEUKÉMIE (ALL) pozdûji publikoval stejn˘ autorsk˘ t˘m práci potvrzujíc- ALL je jedním z nejãastûj‰ích nádorov˘ch onemocnûní v dût- í existenci uveden˘ch 7 molekulárnû definovan˘ch skupin ALL, ském vûku. I pfiestoÏe v posledních desetiletích bylo dosaÏe- pfiiãemÏ tentokrát s pouÏitím jiné DNA ãipové platformy (52). no vynikajících léãebn˘ch v˘sledkÛ, stále existuje skupina Zajímavé práce byly publikovány se specifick˘m zamûfiením pacientÛ, která tomuto onemocnûní podlehne. Rizikové paci- na akutní lymfatické leukémie vycházející z T-lymfocytární

394 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 fiady (T-ALL). Z jejich v˘sledkÛ vypl˘vá, Ïe na základû profi- v˘ch faktorÛ nebo pfii kultivaci s doxorubicinem). V˘sledkem lu genové exprese je moÏné T- ALL rozdûlit do tfií skupin, pro jejich práce byla identifikace nûkolika signálních drah rea- které je charakteristická nadmûrná exprese jednoho ze tfií tran- lizujích antiapoptotick˘ úãinek integrinov˘ch receptorÛ (napfi. skripãních faktorÛ: LYL1, HOX11, nebo TAL1. Genov˘ pro- signální dráha PI3K-Akt a XIAP/Survivin-Caspasa-3/7) fil T-ALL s nadmûrnou expresí LYL1 a genÛ podléhajících jeho (57,58). O v˘znamu receptorÛ adheze svûdãí existence fiady regulaci byl podobn˘ profilu genové exprese pro-T-lymfocy- klinick˘ch studií s monoklonálními protilátkami proti integri- tÛ, a podobnû v pfiípadû T-ALL s nadmûrnou expresí HOX11, nov˘m receptorÛm nebo s inhibitory jednotliv˘ch kináz inte- nebo TAL1, byla pozorována shoda s profilem ãasn˘ch, nebo grinov˘ch signálních drah (obrázek ã. 5). pozdních kortikálních T- lymfocytÛ. Na rozdíl od molekulární klasifikace DLBCL, rozdûlení T-ALL na základû podobnosti Závûr: k jednotliv˘m v˘vojov˘m stádiím T-lymfocytÛ jenom potvr- Komplexní anal˘zy genové exprese pomocí DNA ãipÛ umoÏ- dilo stávající imunologické dûlení T-ALL (53,54). Àují realizovat nov˘ pohled na genom nádorov˘ch bunûk. Mechanismy chemorezistence a predikce vnímavosti na vybra- V pfiípadû lymfoidních malignit uvedené anal˘zy jiÏ pfiinesly ná cytostatika a kortikoidy se staly pfiedmûtem nûkolika pra- první v˘sledky pouÏitelné v klinické praxi pro diagnostiku, cí. Holeman a kol. sledovali zmûny genové exprese v lym- klasifikaci a predikci v˘voje nádorového onemocnûní. foblastech pacientÛ s ALL, které byly v in-vitro podmínkách kultivovány s prednisolonem, vinkristinem, cytosinarabinosi- dem a daunorubicinem. Pomocí DNA ãipÛ autofii identifikovali genové profily predikující chemosenzitivitu k aplikovan˘m lá- tkám a potvrdili známou skuteãnost, Ïe in-vitro detekovaná chemorezistence jednoznaãnû koreluje s vysok˘m rizikem relapsu choroby (55). PouÏití DNA ãipÛ vedlo rovnûÏ k urãe- ní genÛ, jejichÏ exprese se v˘znamnû li‰ila mezi ALL s níz- kou, nebo s vysokou kumulací metotrexátpolyglutamátÛ - metabolity metotrexátu. Toto zji‰tûní by mohlo v budoucnosti vést k individualizaci terapeutick˘ch protokolÛ pacientÛ s ALL ve smyslu intenzity dávky metotrexátu nebo jeho úpl- né zámûny za jiné cytostatikum (56). Cytoprotektivní úãinek mikroprostfiedí, ve kterém se lymfoblasty nacházejí, mÛÏe b˘t dal‰í pfiíãinou relapsÛ leukémií po indukãní terapii. Za nor- málních okolností jsou hematopoetické buÀky v mikropro- stfiedí kostní dfienû v kontaktu se stromálními buÀkam- i a s okolními sloÏkami extracelulární mátrix (ECM). Kromû fiady esenciálních rÛstov˘ch faktorÛ, které produkují stromál- ní buÀky, je pro pfieÏívání hematopoietick˘ch bunûk dÛleÏit˘ jiÏ prost˘ kontakt s tûmito buÀkami a s vláknit˘mi sloÏkami ECM (napfi. fibronectin, vimentin, laminin, kolagen) zpro- stfiedkovan˘ pomocí receptorÛ adheze (napfi. integrinové receptory, VCAM-1). A právû stimulace receptorÛ adheze mimo jiné spou‰tí signální dráhy vedoucí k inhibici apoptózy. Uve- den˘ cytoprotektivní úãinek se stává v˘znamn˘m zejména za nepfiízniv˘ch podmínek, napfiíklad v pfiítomnosti cytostatika. Astier a Svoboda jako první publikovali profil genové exprese B-lymfoblastÛ, které po stimulaci integrinov˘ch receptorÛ Podûkování: pfieÏívaly i ve stresov˘ch podmínkách (bez pfiítomnosti rÛsto- Práce byla podpofiena grantem MZ âR: NR 8231/3

Literatura: cular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistoche- 1. Svoboda M, Michálek J. Úvod do technologie DNA ãipÛ. Lékaﬁ a t echni- mistry using a tissue microarray. Blood 2004;103(1): 275-82. ka 2004;35:67-75. 11. Rosenwald A., Wright G., Leroy K., et al. Molecular diagnosis of primary 2. Freedman AS, Nadler LM. Non-Hodgkin’s lymphoma. In: Holland, Frei mediastinal B cell lymphoma identifies a clinically favorable subgroup of et al. Cancer medicine, 5th ed., B.C. Decker Inc. 2000; pp. 2 034-2059. diffuse large B cell lymphoma related to Hodgkin lymphoma. J Exp Med 3. Nathawani B, Dixon D, Jones S, et al. The clinical significanc e of the mor- 2003;198(6):851-62. fological subdivision of diffuse „histiocytic“ lympho ma: A study of 162 12. Savage K.J., Monti S., Kutok J.L., et al. The molecular signature of medi- patients treated by the Southwest Oncology Gro up. Blood 1982;60:1068. astinal large B-cell lymphoma differs from that of other diffuse large B- 4. Colomo L., Lopez-Guillermo A., Perales M., et al. Clinical impact of the cell lymphomas and shares features with classical Hodgkin lymphoma. differentiation profile assessed by immunophenotyping in patients with dif- Blood 2003;102(12):3871-9. fuse large B-cell lymphoma. Blood 2003;101(1) :78-84. 13. Zinzani PL, Martelli M, Magagnoli E, et al. Treatment and clin ical mana- 5. Jalkanen S, Joensuu H, Soderstrom KO, et al. Lymphocyte homing and clini- gement of primary mediastinal large B-cell lymphoma with sclerosis: cal behavior of non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Invest 19 91;87:1835-1841. MACOP-B regimen and mediastinal radiotherapy monitored by (67)Gal- 6. Muris J.J., Meijer C.J., Vos W., et al. Immunohistochemical pr ofiling based lium scan in 50 patients. Blood 1999;94:3289-3293. on Bcl-2, CD10 and MUM1 expression improves risk st ratification in pati- 14. Zarate-Osorno A, Medeiros LJ, Longo DL, et al. Non-hodgkin’slymphomas ari- ents with primary nodal diffuse large B cell lymphoma. J Pathol sing in patients successfully treated for Hodgkin’sdisease. A clinical, histologic, 2006;208(5):714-23. and immunophenotypic study of 14 cases. Am J Surg Pathol 1992;16:885-895. 7. A predictive model for aggressive Non-Hodgkin’s lymphoma. N Engl J Med 15. Staudt LM, Dave S. The biology of human lymphoid malignancies revea- 1993; 329(14):987-94. led by gene expression profiling. Adv Immunol 2005;87:163-208. 8. Alizadeh A.A., Eisen M.B., Davis R.E., et al. Distinct types of diffuse lar- 16. Shipp MA, Ross KN, Tamayo P, et al. et al. Diffuse large B-cell lympho- ge B-cell lymphoma identified by gene expression pro filing. Nature ma outcome predicti on by gene-expression profiling and supervised machi- 2000;403:503-11 ne learning. 2002;8(1):68-74. 9. Rosenwald A., Wright G., Chan W.C., et al. The use of molecular profiling 17. Hans C.P., Weisenburger D.D., Greiner T.C., et al. Expression of PKC- to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma. beta or cyclin D2 predicts for inferior survival in diffuse large B-cell lymp- N Engl J Med 2002;346(25):1937-47. homa. Mod Pathol 2005;18(10):1377-84. 10. Hans CP, Weisenburger DD, Greiner TC, et al. Confirmation of the mole- 18. Espinosa I., Briones J., Bordes R., et al. Membrane PKC-beta 2 protein expres-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 395 sion predicts for poor response to chemotherapy and survival in patients with gnostic factors in CLL: clinical stage, IGVH gene mutational status, and diffuse large B-cell lymphoma. Ann Hema tol 2006;85(9):597-603. loss or mutation of the p53 gene are independent prognostic factors. Blo- 19. Lossos I.S., Czerwinski D.K., Alizadeh A.A., et al. Prediction of survival od 2002;100(4):1177-84. in diffuse large-B-cell lymphoma based on the express ion of six genes. 40. Weistner A, Staudt LM. Towards molecular diagnosis and targete d thera- N Engl J Med 2004;350(18):1828-37. py of lymphoid malignances. Semin Hematol 2003;40:296-307. 20. Husson H, Carideo EG, Neuberg D, et al. Gene expression profiling in fol- 41. Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G, et al. Relation of gene expression licular lymphoma and normal germinal center B cells using cDNA arrays. phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymp- Blood 2002;99:282-289. hocytic leukemia. J Exp Med 2001; 194: 1639 - 1647. 21. Glass AM, Kersten J, Delahaye LJMJ, et al. Gene expression pro filing in 42. Wiestner A., Rosenwald A., Barry T.S., et al. ZAP-70 expression identifi- follicular lymphoma to assess clinical aggressivness and to guide the cho- es a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutate d immunoglo- ice of treatment. Blood 2005;105:301-307. bulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profi- 22. Dave SS, Wright G, Tan B, et al. Prediction of survival in fol licular lymp- le. Blood 2003;101(12):4944-51. homa based on molecular featuresof tumor-infiltrating immune cells. N Engl 43. Ferrer A, Ollila J, Tobin G, et al. Different gene expression in immunog- J Med 2004;351:2159-2169. lobulin-mutated and immunoglobulin-unmutated forms of chronic lymp- 23. Farinha P, Masoudi H, Skinnider BF, et al. Analysis of multiple biomar- hocytic leukemia. Cancer Genetic and Cytogenetic 2004; 153: 69 - 72. kers shows that lymphoma-associated macrophage (LAM) content is an 44. Orchard J.A., Ibbotson R.E., Davis Z., et al. ZAP-70 expression and independent predictor of survival in folicular lymphoma. Blood 2005; 106: prognosis in chronic lymphocytic leukaemia. Lancet 2004;363 2169-2174. (9403):105-11. 24. Wyckoff J, Wang W, Lin EY, et al. A paracrine loop between tumor cells 45. Rosenwald A, Chuang EY, Davis RE, et al. Fludarabine treatment of pati- and macrophages is required for tumor cell migration in mammary tumors. ents with chronic lymphocytic leukaemia induces a p53-dependent gene Cancer Res 2004;64(19):7022-9. expression response. Blood 2004;104:1428-1434. 25. Bohen SP, Troyanskaya OG, Alter O, et al. Variation in gene ex pression 46. Einsiedel HG, von Stackelberg A, Hartmann R et al. Long-term outcome patterns in follicular lymphoma and the response to rituximab. Proc Natl in children with relapsed ALL by risk-stratified salvage therapy: results of Acad Sci 2003;100:1926-1930. trial acute lymphoblastic leukemia-relapse study of the Berlin-Frankfurt- 26. Meusers P, Hense J, Brittinger G. Mantle cell lymphoma: diagnostic cri- Munster Group 87. J Clin Oncol 2005;2 3(31):7942-50. teria, clinical aspects and therapeutic problems. Leukemia 1997;Suppl 2: 47. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. Molecular classification of can- S60-4. cer: class discovery and class prediction by gene express ion monitoring. 27. Rosenwald A, Wright G, Wiestner A, et al. The proliferation gene expres- Science 1999;286(5439):531-7. sion signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts 48. Armstrong SA, Staunton JE, Silverman LB, et al. et al. MLL translocati- survival in mantle cell lymphoma. Cancer Cel l 2003;3:185-197. ons specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique 28. Chuang SS, Huang WT, Hsieh PP, et al. Mantle cell lymphoma in Taiwan: leukemia. 2002; 30(1) :41-7. clinicopathological and molecular study of 21 cases inclu ding one cyclin 49. Tsutsumi S, Taketani T, Nishimura K et al. Two distinct gene expression D1-negative tumor expressing cyclin D2. Pathol In t 2006;56(8):440-8. signatures in pediatric acute lymphoblastic leukemia wi th MLL rearran- 29. De Vos S, Krug U, Hofmann WK, et al. Cell cycle alterations in the blas- gements. Cancer Res 2003 ;63(16):4882-7. toid variant of mantle cell lymphoma (BV-MCL) as detected by gene 50. Brown P, Levis M, McIntyre E, et al. Combinations of the FLT3 inhibitor expression profiling of mantle cell lymphoma (MCL) and BV- MCL. Dia- CEP-701 and chemotherapy synergistically kill infant and childhood MLL- gn Mol Pathol 2003;12:35-43. rearranged ALL cells in a sequence-dependent manner. Leukemia 30. Novotvary 2003 âR, ÚZIS âR Praha, 2006, str. 31-69. 2006;20(8):1368-1376. 31. National Cancer Institute, SEER Incidence and US Death Rates 1 975-2003, 51. Yeoh EJ, Ross ME, Shurtleff SA et al. Classification, subtype discovery, Bethesda, USA, www.nci.gov; www.cancer.gov. and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by 32. Garand R and Robillard N. Immunophenotypic characterization of acute gene expression profiling. Cancer Cell 2002;1(2) :133-43. leukemias and chronic lymphoproliferative disorders: practical recom- 52. Ross ME, Zhou X, Song G et al. 1-40 Classification of pediatric acute lymp- mendations and classifications. Hematol. Cell Ther 1996; 38: 471 - 486. hoblastic leukemia by gene expression profiling. Blood 2003;102(8): 33. Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, et al. Clinical staging of chronic lymp- 2951-9. hocytic leukemia. Blood 1975;46:219-234. 53. Ferrando AA, Look AT. Gene expression profiling in T-cell acute lymp- 34. Binet JL, Auquier A, Dighiero G, et al. A new prognostic class ification of hoblastic leukémia. Semin Hematol 2003;40:274-280. chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analy- 54. Ferrando AA, Neuberg DS, Dodge RK, et al. Prognostic importance of sis. Cancer 1981;48:198-206. TLX1 (HOX11) oncogene expression in adults with T- cell acute lymp- 35. Dohner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al. Genomic aberrations and survi- hoblastic leukémia. Lancet 2004;363:535-6. val in chronic lymphocytic leukemia. New Engl JMed 2000; 343:1910-1916. 55. Holleman A, Cheok MH, den Boer Mlet al. Gene-expression patterns in 36. Haslinger C, Schweifer N, Stilgenbauer S, et al. Microarray gene expres- drug-resistant acute lymphoblastic leukemia cells and response to treat- sion profilig of B-cell chronic lymphocytic leukemia subgroups defined by ment. N Engl J Med 2004 ;351(6):533-42. genomic aberrations and VH mutation status. J C lin Oncol 2004; 22(19): 56. Kager L, Cheok M, Yang W et al. Folate pathway gene expression differs 3937 - 3949. in subtypes of acute lymphoblastic leukemia and influences methotrexate 37. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, et al. Unmutated IgVH genes are asso- pharmacodynamics. J Clin Invest 2005; 115(1):110-7. ciated with more aggressive form of chronic lymphocytic le ukemia. Blo- 57. Astier AL, Ronghui X, Svoboda M, et al. Temporal gene expression profile od 1999; 94: 1848 - 1854. of human precursor B leukemia cells induced by adhesion receptor: identifi- 38. Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. IgV gene mutation status an d CD38 cation of pathways regulating B-cell survival. Blood 2003;101(3):1118-1127. expression as a novel prognostic indikators in chronic lymphocytic leuke- 58. Astier AL, Svoboda M, Hinds E, et al. Integrins regulate survival of pre- mia. Blood 2000; 95: 2455 - 2457. B-ALL cells through differential IAP and caspase- 7 ubiquitination and 39. Oscier D.G., Gardiner A.C., Mould S.J., et al. Multivariate an alysis of pro- degradation. Leukemia 2004;18:873-875.

396 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 PROFILOVÁNÍ GENOVÉ EXPRESU U MNOHOâETNÉHO MYELOMU. GENE EXPRESSION PROFILING IN MULTIPLE MYELOMA. DUDOVÁ S.1,2, BÁRTOVÁ E.3, POUR L.1,2,4, KREJâÍ J.2, HÁJEK R. 1,2,4

1 LEHABI (LABORATORY OF EXPERIMENTAL HEMATOLOGY AND IMMUNOTHERAPY) ODDùLENÍ KLINICKÉ HEMATOLOGIE FN BRNO 2 LÉKA¤SKÁ FAKULTA MU BRNO 3 BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AKADEMIE VùD âESKÉ REPUBLIKY 4 INTERNÍ HEMATOONKOLOGICKÁ KLINIKA FN BRNO

Souhrn V na‰em sdûlení chceme informovat o pouÏití dvou metodik ke studiu molekulárnû genetické problematiky mno- hoãetného myelomu (MM). Prvnû zmíníme vyuÏití DNA ãipÛ (microarrays) a ve druhé ãásti se zamûfiíme na chro- matinovou imunoprecipitaci v anal˘zách epigenetick˘ch zmûn genÛ. Obû metodiky ná‰ v˘zkumn˘ t˘m pouÏívá, a proto pfiedstavíme i první v˘stupy. VyuÏití obou metodik je u MM stejné jako u v‰ech ostatních nádorÛ. Pfied- stavují moÏnost studia patogeneze maligních onemocnûní na molekulární úrovni, klasifikaci jinak neodli‰iteln˘ch prognostick˘ch skupin choroby, predikci léãebné odpovûdi na dan˘ terapeutick˘ zásah a identifikaci moÏn˘ch molekulárních cílÛ protinádorové terapie.

Klíãová slova: DNA ãipy, profil genové exprese, chromatinové imunoprecipitace, mnohoãetn˘ myelom.

Summary This review informs about utilization of two methods used in molecular examination in multiple myeloma on genomic level: DNA microarrays and chromatin immunoprecipitation. The profit of both methods is very similar in myeloma as well as in other cancers. They allow to study disease pathogenesis, generate new disease classification, and try to predict effect of therapy. Also, they are used to find the new potential target of therapy in multiple myeloma.

Key words: DNA microarray, gene expression profile, chromatin imunoprecipitation, multiple myeloma.

DNA ãipy u mnohoãetného myelomu. zmûny probíhající v prÛbûhu transformace FPB na buÀku Profilování genové exprese fyziologické a maligní MGUS a MM (2-5). Sekvenování variabilní oblasti genÛ pro plasmatické buÀky. imunoglobuliny prokázalo, Ïe plazmatické buÀky od jednot- Genová exprese je urãována nejenom faktory prostfiedí, ale liv˘ch pacientÛ s MGUS vykazují intraklonální variabilitu, rovnûÏ genetick˘m pozadím. Proto byla metoda DNA ãipÛ která ov‰em není pozorována u myelomov˘ch bunûk (6). Tato pouÏita pfii srovnání profilÛ genové exprese (PGE) CD138+ data jsou v souladu se zji‰tûním, Ïe plazmatické buÀky MGUS bunûk získan˘ch z kostní dfienû pacienta s MM a CD138+ plaz- kontinuálnû podléhají somatick˘m hypermutacím, zatímco matick˘ch bunûk geneticky identického dvojãete. V CD138+ u MM je jeden klon plazmatick˘ch bunûk dominantní a expan- buÀkách MM byla zji‰tûna zv˘‰ená exprese u 296 genÛ, nao- duje v kostní dfieni. pak sníÏená hladina transkriptÛ byla detekována u 103 genÛ, Dal‰í studie prokázala celkem 156 genÛ se zv˘‰enou expresí ve srovnání s fyziologick˘mi plazmatick˘mi buÀkami (FPB) v souvislosti s v˘skytem translokací t(4;14)(p16;q32), nebo dvojãete (1). t(11;14)(q13;q32). Získaná data umoÏÀují rozdûlit MM do ãtyfi Davies a kolektiv vyuÏili DNA ãipovou anal˘zu k identifika- odli‰n˘ch podskupin: MM1, MM2, MM3 a MM4. Skupina ci procesÛ úãastnících se pfii transformaci FPB na buÀky MM4 má molekulární znaky jako buÀky rychle proliferujících monoklonální gamapatie nejasného v˘znamu (MGUS) a mno- bunûãn˘ch linií MM. Skupina MM1 nese znaky MGUS. Nej- hoãetnému myelomu. Sledováním genÛ, které vykazovaly vel- v˘znamnûj‰í rozdíly v expresi mezi MM1 a MM4 byly nale- kou variabilitu mezi vzorky byly definovány dvû skupiny paci- zeny u genÛ, jejichÏ produkty se podílí na bunûãném cyklu entÛ: kontrolní a MGUS/MM. Anal˘za prokázala 263 genÛ a metabolizmu DNA. Jejich vysoká exprese byla detekována odli‰nû exprimovan˘ch mezi buÀkami MGUS a FPB, a 380 právû ve skupinû MM4, u které je ãastûji detekován abnor- genÛ s odli‰nou expresí mezi buÀkami MM a FPB, ze kter˘ch mální karyotyp a zv˘‰ená hladina sérového _2-microglobuli- bylo 197 genÛ spoleãn˘ch s první skupinou. Pouze u 74 genÛ nu. Tyto parametry jsou v klinické praxi spojovány se ‰patnou byla zji‰tûna odli‰ná míra transkripce mezi buÀkami MGUS prognózou (7). a MM. Tato zji‰tûní naznaãují, Ïe mezi MGUS a MM jsou men- ‰í rozdíly neÏ mezi fyziologick˘m protûj‰kem a MM nebo Molekulární klasifikace MM na základû profilování MGUS. Mezi geny s rozdílnou expresí pfievládaly: onkogeny, genové exprese. tumor supresorové geny, geny podílející se na signální trans- Plazmatické buÀky byly donedávna povaÏovány za homogenní dukci, geny kódující vazebné proteiny a transkripãní faktory populaci terminálních stadií B-lymfocytÛ. Nûktefií autofii sou- DNA a geny podílející se na diferenciaci buÀky (2). Profilo- dí, Ïe MM buÀky pfiedstavují terminálnû diferenciované vání genové exprese tak nám pomáhá odhalovat genetické potomstvo transformovaného B-lymfocytu. Poslední fenoty-

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 397 pové anal˘zy a profily genové exprese prokázaly, Ïe plazma- ‰ená exprese jednozo ze ãtyfi partnerÛ IGH translokace. Tato tické buÀky izolované z urãit˘ch orgánÛ mohou patfiit k odli‰- procenta v‰ak naznaãují, Ïe musí existovat i jiné vysvûtlení pro n˘m stádiím svého v˘voje (8,9). Mnohoãetn˘ myelom by tak sledované jevy, napfiíklad pfiítomnost bialelické 14q32 trans- pfiedstavoval spektrum onemocnûní s molekulárními otisky, lokace uvnitfi jedné buÀky, ãi biklonální nádor, nebo moÏnost, které ukazují na jejich pÛvod v odli‰n˘ch stadiích v˘voje pozd- Ïe zmûna hladiny zmínûn˘ch genÛ vznikla mechanizmem ního B-lymfocytu. Alizadeh a kolektiv prokázali podobnou nesouvisejícím s translokací. Mnohoãetn˘ myelom podtypu situaci u difuzního velkobunûãného B-lymfocytárního lymfo- MM3 úplnû postrádá translokace zahrnující v˘‰e uvedené mu (DLBCL), kter˘ v histopatologickém obraze pfiedstavuje geny. Autofii rovnû zmiÀují paralelní expresi FGFR3 a MMSET jednu diagnostickou jednotku, pfiiãemÏ na molekulární úrov- u podtypÛ MM1 a MM2. MMSET exprese bez pfiítomnosti ni mÛÏe b˘t rozdûlen na dva základní podtypy: DLBCL vychá- FGFR3 byla zji‰tûna pouze u podtypu MM4. Ve více neÏ 90% zející z B-lymfocytÛ zárodeãného centra (Germinal-centre B- pfiípadÛ klonotypick˘ch plazmatick˘ch bunûk do‰lo ke ztrátû cell like DLBCL) a z antigenem aktivovan˘ch mitoticky FGFR3, coÏ naznaãuje, Ïe tak muselo dojít v ãasné fázi v˘vo- aktivních B-lymfocytÛ je onemocnûní. Aktivace MMSET mÛÏe b˘t rozhodující udá- Activated B-cell like DLBCL) (10). Profilování genové expre- lostí pfii vzniku t(4;14)(p16;q32). Její pfiítomnost vede k chase bylo pouÏito rovnûÏ pro odli‰ení pozdních stadií diferenci- rakteristické expresi 21 genÛ vãetnû 4 znám˘ch translokaãních ace B-lymfocytÛ, kdy byly identifikovány geny regulující ãas- partnerÛ, z nichÏ nûkteré mohou pfiedstavovat moÏné partne- nou fázi bunûãné diferenciace (early-stage differentiation ry u 14q32 translokace (17). genes, EDG), kdy dochází k pfiechodu nezral˘ch B-lymfocy- Monosomie chromosomu 13 je detekována u 50-60% pacien- tÛ do tzv. „tonsillar B-cells“, a geny pozdní fáze diferenciace tÛ s MM s deleãním místem v oblasti 13q14. Pro stanovení, jest- (late-stage differentiation genes, LDG), které charekterizují li zmûny v genové expresi ganÛ lokalizovan˘ch v dané oblasti pfiemûnu „tonsillar B-cells“ na plazmatické buÀky kostní dfie- chromosomu predikují jeho deleci, byla pouÏita fluorescenãní nû (11, 12). BuÀky MM vykazovaly variabilní expresi fiady hybridizace (FISH) a profilování genové exprese (18, 19). Ze EDG a LDG genÛ. Na základû variability exprese EDG a LDG souboru vzorkÛ s prokázanou delecí chromosomu 13 (FISH13- genÛ bylo stanoveno, Ïe jiÏ dfiíve definované podtypy MM1 ) a vzorkÛ bez delece (FISH13+) bylo identifikováno 36 kan- aÏ MM4 mohou b˘t pfiifiazeny k nûkteré z „v˘vojov˘ch“ fiad didátních genÛ. Pûtatfiicet genÛ, z nichÏ 32 leÏelo na chromo- plasmatické buÀky. Podtyp MM4 je z bunûk podobn˘ch „ton- somu 13, vãetnû genÛ v oblasti 13q14 (GTF2F2, TSC22 a RB1), sillar B-cells“. Podtyp MM3 je rovnûÏ spojen s „tonsillar B- mûlo sníÏenou hladinu exprese. Pouze 1 gen, IGF1R (receptor cells“, ale naopak MM2 sdílí podobnost s plazmatick˘mi buÀ- pro inzulinu podobn˘ rÛstov˘ faktor 1) vykazoval vy‰‰í hladi- kami kostní dfienû. Tato data potvrzují hypotézu, Ïe MM mÛÏe nu transkripce. Deset genÛ, vãetnû genu retinoblastomu 1 (RB1), b˘t odvozen z bunûk malignû transformovan˘ch v rÛzn˘ch sta- bylo pouÏito s 85% úspû‰ností ke stanovení delece u pacientÛ diích v˘voje. Funkãní spektrum genÛ ze skupiny EDG bylo s MM bez známého stavu genu urãeného pomocí metody FISH. ‰ir‰í, neÏ v pfiípadû LDG, a zahrnovalo geny, jejichÏ proteiny Data z této studie naznaãují, Ïe moÏn˘ dÛsledek delece chro- se úãastní v procesech adheze, transkripce, vnitrobunûãné sig- mosomu 13 je vznik haploinsuficience tumor supresorového nální transdukce a metabolizmu. Pouze nûkolik málo genÛ bylo genu RB1, a právû sníÏení hladiny jeho transkriptÛ se mÛÏe spojeno s bunûãnou proliferací. podílet na vzniku nádoru. Normální plazmatické buÀky kostní dfienû i myelomové buÀky exprimují IGF1, zatímco u ostatních Vliv chromosomálních aberací na genovou expresi typÛ vyzrál˘ch B-lymfocytÛ nebyla jeho exprese nalezena (8). V souvislosti s tzv. „genomov˘m chaosem“ myelomové buÀ- Autofii naznaãují, Ïe aktivace IGF1R u pacientÛ s delecí chro- ky Shaughnessy a kolektiv sledovali ploiditu u MM bunûk mosomu 13 mÛÏe vytváfiet autokrinní rÛstov˘ signál, coÏ potvr- s abnormálními karyotypy (11). U 10% pacientÛ byla naleze- zují studie, ve kter˘ch jsou hladiny sérového IGF1R spojeny na trizomie chromosomÛ 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 a 21, zatímco s pfieÏíváním pacientÛ s MM (20). monozomie a delece pfieváÏnû q raménka postihovaly pfied- Statistickou anal˘zou profilÛ genové exprese ze vzorkÛ MM nostnû chromosom 6 (6%), 13 (13%), 16 (10%) a 22 (6%). Aby bez pfiítomnosti delece chromosomu 13 a bez dal‰ích karyo- autofii urãili, zda existuje souvislost mezi profilem genové typov˘ch abnormalit (CA) a vzorkÛ s delecí chromosomu 13 exprese a chromosomálními aberacemi, pomocí DNA ãipÛ a s pfiítomností CA, bylo nalezeno 157 genÛ se zmûnûnou srovnávali profily genové exprese plazmatick˘ch bunûk zís- expresí RNA. Vût‰ina genÛ (91%) mûla vy‰‰í expresi ve sku- kan˘ch od pacientÛ s MM a od zdrav˘ch dárcÛ. Pro analyzo- pinû s chromosomálními aberacemi, pouze 14 genÛ (8 z nich vané geny byla stanovena chromozomální pozice a dále poãty na chromosomu 13) mûlo v dané skupinû expresi men‰í. Nej- abnormálnû exprimovan˘ch genÛ na jednotliv˘ch chromoso- více genÛ kódovalo proteiny, které se podílí na proliferaci, mech. Autofii zjistili pozitivní korelaci mezi chromosomální regulaci pfiechodu mezi G1/S fází bunûãného cyklu, segrega- aberací a genovou expresí. Vût‰ina genÛ leÏících na chromo- ci chromosomÛ a na replikaci DNA (18, 21). somech 3, 5, 7, 9, 15 a 19 mûla zv˘‰enou expresi, zatímco geny Dal‰í otázka byla, zda hladiny exprese sledovan˘ch genÛ na chromosomech 10, 13, 14, 16 a 22 mûly sníÏenou expresi, mohou rozdûlit MM na ãtyfii cytogenetické skupiny pfiiãemÏ nejmarkantnûj‰í rozdíl byl u chromosomu 13. Poãet (FISH13+/CA-, FISH13+/CA+, FISH13-/CA-, a FISH13- kopií chromosomÛ se tak promítá do úrovnû transkripce. /CA+). Za tímto úãelem bylo sledováno tfiicet genÛ: dvacet Podobnû jako dal‰í nádory z B-lymfocytÛ, i MM vykazuje pfií- rozdílnû exprimovan˘ch mezi FISH13-/CA+ a FISH13+/CA- tomnost alterací v oblasti 14q32, kde se nachází geny tûÏkého a deset genÛ odli‰ujících FISH13- od FISH13+ (22). Autofii fietûzce imunoglobulinu (IGH). DNA ãipy byly proto pouÏity analyzovali 45 pacientÛ s MM FISH13-/CA-, u kter˘ch zjisti- ke sledování expresních hladin postiÏen˘ch genÛ, s cílem sta- li nízkou expresi genÛ regulujících bunûãn˘ cyklus a genÛ na novení moÏn˘ch translokaãních partnerÛ. Autofii se zamûfiili chromosomu 13. Naopak 30 pacientÛ ve skupinû FISH13+ na geny, které nejsou exprimovány normálními plazmatick˘- /CA+ mûlo relativnû zv˘‰enou expresi tûchto genÛ. Tfietí sku- mi buÀkami, ale ve vy‰‰ích hladinách jsou detekovány u paci- pina, 37 pacientÛ FISH13+/CA-, exprimovala geny na chro- entÛ s MM. Zv˘‰ená exprese receptoru-3 fibroblastového mosomu 13 souãasnû se sníÏenou expresí genÛ regulujících rÛstového faktoru (FGFR3), cyklinu D1 a D3 (CCND1, bunûãn˘ cyklus. U 34 pacientÛ s MM FISH13-/CA+ byly geny CCND3) byla ve shodû s pfiítomností t(4;14)(p16;q32), bunûãného cyklu byly vysoce exprimované (více neÏ u MM t(11;14)(q13;q32) nebo t(6;14)(p21;q32) (7, 13-16). Pfii ana- FISH13+/CA+), naopak geny lokalizované na chromosomu l˘ze novû diagnostikovan˘ch pfiípadÛ MM byla zji‰tûna pfií- 13 mûly nízkou expresi (ménû neÏ u skupiny FISH13-/CA-). tomnost CCND1 a FGFR3 exprese u 13%, homolog muscu- Stanovením ploidie na základû profilu genové exprese hypo- loaponeurotického fibrosarkomového onkogenu (c-MAF) diploidních a hyperdiploidních vzorkÛ, Shaughnessy a kolek- u 7,5% a CCND3 u 4,1%. U 34% myelomÛ byla nalezena zv˘- tiv identifikovali 14 genÛ, jejichÏ odli‰ná exprese mÛÏe pre-

398 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 dikovat ploidii s více neÏ 95% pfiesností u vzorkÛ se znám˘m nální molekuly. Mimo jiné tím poskytují cytoprotektivní úãi- karyotypem a s více neÏ 83% pfiesností u neinformativních pfií- nek nádorov˘m buÀkám, vãetnû ochrany pfied úãinky chemo- padÛ (18, 22). terapie (35). Zmûny v expresních profilech stromálních sloÏek mikroprostfiedí kostní dfienû mohou b˘t i v pfiípadû MM spo- Prediktivní a prognostické profily genové exprese jeny s predikcí progrese onemocnûní. Jedna ze studií genové u mnohoãetného myelomu exprese z biopsií kostní dfienû pacientÛ s MGUS, MM a zdra- V pfiípadû MM jiÏ byly identifikovány profily genové expre- v˘ch dárcÛ odhalila 146 genÛ se sníÏenou a 86 genÛ se zv˘‰e- se charakterizující klinick˘ prÛbûh onemocnûní, s rozdíly v pfie- nou expresí u MM. Srovnání profilÛ genové exprese mezi vzor- Ïití od 2 po více neÏ 80 mûsícÛ od stanovení diagnózy. Podob- ky z biopsií MM a purifikovan˘mi plazmatick˘mi buÀkami nû byly stanoveny i prediktivní profily genové exprese, a to téhoÏ pacienta prokázalo 75 genÛ s rozdílnou expresí. Tyto v souvislosti s úãinností léãby zaloÏené na thalidomidu a vyso- geny byly funkãnû spjaty s mikroprostfiedím MM (microenvi- kodávkované chemoterapii. RovnûÏ byly objeveny profily pre- ronment-associated genes, MAG). Celkem 54 MAG mûlo sní- dikující odpovûì na kombinovanou protinádorovou léãbu reÏi- Ïenou a 21 MAG zv˘‰enou expresi, pfiiãemÏ dva z pûti genÛ mem VAD (vinkristin, adriamycin, dexamethazon), kde byli s nejvy‰‰í odchylkou exprese, UMAG1 a UMAG2, kódují pacienti rozdûleni na dvû skupiny podle hladiny exprese 11 adhezní proteiny, které se podílejí na vzájemn˘ch interakcích genÛ regulujících bunûãn˘ cyklus. Sedmdesát procent paci- myelomov˘ch a stromálních bunûk. Oba geny byly exprimo- entÛ s vy‰‰í expresí minimálnû 8 z 11 genÛ, dospûlo po apli- vány více neÏ desetinásobnû u MM biopsií s vysok˘m pro- kaci v˘‰e uvedené chemoterapie do ãásteãné, nebo kompletní centem plazmatick˘ch bunûk (80%) v porovnání se vzorky remise. Naopak, pouze u 30% pacientÛ s expresí men‰í neÏ s nízk˘m procentem (20%), nebo biopsiemi od zdrav˘ch dár- medián u 8 z 11 tûchto genÛ, byla zji‰tûna odpovûì na léãbu. cÛ. Jejich exprese pfiitom nebyla zv˘‰ena ani ve vzorcíh MGUS Podobnû, i v pfiípadû inhibitoru proteazomu PS-341 bylo nale- (11). U obou genÛ byla prokázána v˘znamná role v nádoro- zeno 44 genÛ, jejichÏ exprese predikvoala odpovûì na uvede- vém rÛst a rezistenci na léky (27, 28). Dal‰í MAG, UMAG3, nou látku. Tyto studie naznaãují moÏnosti vyuÏití profilování je ãlen rodiny matrixov˘ch metalloproteináz (MMP). Vzorky genové exprese k identifikaci rizikov˘ch pacientÛ a k predik- MGUS biopsií vykazovaly variabilní expresi tohoto genu, ci odpovûdi na cílenou léãbu (23,25,26). v purifikovan˘ch plazmatick˘ch buÀkách nebyl detekovatel- Souãasné chemoterapeutické postupy vyuÏívají kombinace nûko- n˘. Zv˘‰ená exprese UMAG3 naznaãuje pÛsobení MMP lika léãiv, které interferují s vícero molekulárními mechanismy v odli‰n˘ch oblastech patologie MM vãetnû angiogeneze nebo nezbytn˘mi pro Ïivotaschopnost nádorové buÀky. Pomocí DNA resorpce kostí (29, 30). ãipÛ lze identifikovat geny, jejichÏ exprese je cílenû regulována nádorovou buÀkou právû po specifickém terapeutickém zásahu. VyuÏití chromatinové imunoprecipitace pfii studiu Napfiíklad po o‰etfiení bunûk MM dexamethazonem vykazoval epigenetick˘ch zmûn genÛ v˘znamn˘ch pro diagnostiku gen pro adhezní molekulu destiãek/endotheliálních bunûk mnohoãetného myelomu (PECAM1) sníÏenou expresi u 20 z 20 sledovan˘ch pfiípadÛ Chromatinová imunoprecipitace, kombinovaná s polymerázo- a pfiedstavoval nejvût‰í odchylku v genové expresi vÛbec. Témûfi vou fietûzovou reakcí (ChIP-PCR), pfiedstavuje v˘znamnou u v‰ech pacientÛ léãen˘ch dexamethazonem byla zji‰tûna sníÏe- molekulárnû-biologickou metodu, která slouÏí ke studiu epige- ná exprese proangiogenního genu vaskulárního endoteliálního netick˘ch modifikací chromatinu. Touto metodou je moÏné veli- faktoru (VEGF) a sekvence 1 genu leukémie myeloidních bunûk ce detailnû analyzovat vazbu transkripãních faktorÛ na vybrané (MCL1), kter˘ má antiapoptotickou funkcí. úseky DNA a nebo studovat zmûny v acetylacích, methylacích, PS-341 (bortezomib) vyvolával zmûny v expresi pouze 9 genÛ fosforylacích a ubikvitinacích histonÛ. Histony H2A, H2B, H3 (2 se zv˘‰enou a 7 se sníÏenou expresí). SníÏená exprese genu a H4, pfiestavující hlavní sloÏku chromatinu, jsou souãástí takz- Cockaynova syndromu 1 (CKN1) pfiedstavovala nejvût‰í zmû- van˘ch nukleosomÛ, které tvofií dva základní typy chromatinu, nu. CKN1 kóduje protein, kter˘ reaguje mimo jiné s podjednot- tj. euchromatin (transkripãnû aktivní DNA) a heterochromatin kou transkripãního faktoru IIH RNA polymerázy II a jeho muta- (kondenzované, transkripãnû neaktivní chromosomální oblas- ce jsou spojeny s defektní opravou transkripãnû aktivních genÛ ti). Ty se od sebe odli‰ují nejenom mnoÏstvím GC párÛ bazí, (24). SníÏená transkripce CKN1 úãinkem PS-341 mÛÏe mít nega- mírou kondenzace, ale právû i specifick˘mi modifikacemi his- tivní vliv na transkripci RNA polymerázou II a vysvûtluje nízk˘ tonÛ. Typick˘m markerem heterochromatinu je napfiíklad dea- poãet genÛ se zmûnûnou expresí v porovnání s úãinky dexamet- cetylace a nebo methylace histonu H3 v pozici lysinu 9, která je hazonu, thalidomidu a IMiD. IMiD a CC-5013 thalidomidov˘ u lidsk˘ch bunûk zprostfiedkována enzymem zvan˘m histon met- analog vyvolávaly zmûny v expresi u 98 genÛ (41 genÛ se zv˘- hyl transferáza Suv39H1 (31). Na druhou stranu, pro euchro- ‰enou a 57 genÛ se sníÏenou hladinou), zatímco thalidomid zpÛ- matin je velmi typická acetylace a také methylace histonu H3 sobil zmûny u 57 genÛ (29 zv˘‰ená a 28 sníÏená hladina). ·est v pozici lysinu 4. Za v‰echny tyto modifikace N-terminálních genÛ bylo ovlivnûno souãasnû IMiD i thalidomidem (25). koncÛ histonÛ jsou opût zodpovûdné pfiíslu‰né enzymy jako jsou Metodu DNA ãipÛ lze vyuÏít rovnûÏ pro identifikaci nov˘ch tera- napfiíklad histon acetylázy adeacetylázy (HATs, HDACs) anovû peutick˘ch cílÛ jiÏ existujících léãiv aroz‰ífiit tak spektrum jejich objeven˘ demethylující enzym LSD1 (32). indikace. Po aplikaci léãiv mÛÏeme identifikovat pfiítomnost spe- Epigenetick˘ stav pfiíslu‰né kódující oblasti a hlavnû promo- cifick˘ch transkriptÛ azjistit spoleãné rysy profilÛ genové expre- toru, jako místa iniciace transkripce, je zásadní právû pro regu- se u nádorov˘ch bunûk v souvislosti s odli‰nou odpovûdí na podá- laci transkripãní aktivity genÛ. To v‰e, spoleãnû s transkripã- ní urãité látky. Napfiíklad v maligních plazmatick˘ch buÀkách ními faktory, rozhoduje o optimální expresi genÛ. Je obecnû byla zji‰tûna vysoká transkripce farnezyltransferázy (FNTA) známo, Ïe nádorové buÀky jsou charakteristické mnoha gene- a onkogenu krysího sarkomu (RAS) (7). FNTA posttranskripã- tick˘mi abnormalitami, vãetnû genov˘ch amplifikací, delecí nû modifikuje RAS tak, aby se RAS protein mohl vázat na plaz- nebo translokací chromosomÛ. Tyto genetické pfiestavby vedou matickou membránu, kde je schopen vykonávat svou funkci. Pro- k nekontrolované expresi nûkter˘ch genÛ a tudíÏ jsou dopro- to mohou mít inhibitory FNTA velk˘ v˘znam u pacientÛ s MM vázeny rozsáhl˘mi zmûnami v epigenetick˘ch profilech chro- s vysokou expresí RAS a/nebo FNT (26). matinu (33, 34). Z tohoto dÛvodu se studium epigenetické regulace exprese genÛ zdá b˘t velmi zásadní z hlediska pochopení Profily genové exprese charakteristické pro maligní transformace bunûk. Chromatinová imunoprecipita- mikroprostfiedí u MGUS a MM ce, kombinovaná s PCR metodologií, pfiedstavuje slibn˘ krok RÛst MM a stejnû tak i jin˘ch nádorov˘ch bunûk je ãásteãnû v tûchto studiích. S vyuÏitím ChIP-PCR metody je moÏné pfies- závisl˘ na svém mikroprostfiedí, a to zejména na stromálních nû stanovit míru methylace a acetylace promotoru nebo kódu- buÀkách v okolí, které produkují rÛstové faktory a rÛzné sig- jící sekvence prognosticky v˘znamn˘ch genÛ.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 399 ChIP-PCR metodologie zahrnuje nûkolik krokÛ vedoucích zaci metody pro vzorky získané po magnetické separaci CD138- k optimálnímu stanovení epigenetick˘ch zmûn ve vybran˘ch a CD138+ bunûk mnohoãetného myelomu. Provedli jsme jiÏ lokusech. Prvním krokem je vytvofiení vazby mezi DNA nûkolik pilotních studií, které budou dále rozpracovány. Rov- a histony, takzvan˘ „cross link“, pomocí fixace bunûk ve nûÏ se zamûfiujeme na studium zmûn v epigenetick˘ch stavech formaldehydu. Po lyzaci bunûk je tfieba DNA vázanou na myelomov˘ch bunûãn˘ch linií ovlivnûn˘ch látkami, jako je histony fragmentovat na men‰ích úseky, zhruba o velikosti napfiíklad dexamethason, melfalan nebo Velcade, které mají do 200-1000 párÛ bazí. K tomuto úãelu se pouÏívá pfiístroj nezastupiteln˘ v˘znam pfii léãbû mnohoãetného myelomu. zvan˘ sonikátor. Jako dal‰í krok následuje imunoprecipitace DNA-proteinového komplexu s pfiíslu‰nou protilátkou, Závûr: která má schopnost rozpoznat studovanou modifikaci histo- I pfies pokroky v léãbû mnohoãetného myelomu, vãetnû vyso- nÛ. Po odmytí pfiebyteãné protilátky je pfii teplotû 65oC pfie- kodávkované chemoterapie, autologní transplantace a zave- ru‰ena vazba mezi DNA a histony a pomocí DNA izolaã- dením nov˘ch lékÛ do léãby relapsu onemocnûní, toto one- ních a purifikaãních technik je získáno optimální mnoÏství mocnûní zÛstává stále nevyléãitelné. V˘‰e uvedené metody DNA. Ta je dále pouÏita v klasické PCR reakci navrÏené umoÏÀují sledovat zmûny v celkové expresi genÛ i zmûny v epi- k detekci vybran˘ch genov˘ch lokusÛ, které jsou zásadní genetickém uspofiádání chromatinu s cílem identifikovat mole- v maligní transformaci studovan˘ch nádorov˘ch bunûk. Vel- kulární profily spojené se vznikem a v˘vojem maligního one- mi slibnou metodou se v souãasné dobû jeví i kombinace mocnûní. Uplatnûní pfiístupu anal˘zy vícekrokové patogeneze ChIP metody s DNA mikroãipy, tak zvaná „ChIP-on-chip“ myelomu umoÏní lépe pochopit jak se mûní exprese genÛ a epi- technologie, která slouÏí ke stanovení epigenetick˘ch zmûn genetické uspofiádání chromatinu bûhem rÛzn˘ch stadií one- napfiíklad v promotorov˘ch oblastech nûkolika stovek genÛ mocnûní a popsat terapeutické cíle na molekulární úrovni u jed- (GeneChips, Affymetrix). V tomto pfiípadû metoda pfiiná‰í notliv˘ch pacientÛ. Charakterizace genetick˘ch jevÛ a jejich velké mnoÏství dat o zmûnách v epigenetick˘ch profilech dÛsledkÛ dÛleÏit˘ch v rÛstu a pfieÏití myelomov˘ch bunûk spo- nádorov˘ch bunûk. To v‰e poskytuje cenné informace o cel- lu s porozumûním mechanizmu citlivosti a rezistence na aplikov˘ch rozdílech mezi normální a malignû transformova- kovanou léãbu, mÛÏe pomoci odhalit pacienty, ktefií budou nou buÀkou. odpovídat na danou léãbu a stanovit dal‰í cíle nov˘ch terape- V na‰í laboratofii jsme se zamûfiili na studium zmûn v methy- utick˘ch postupÛ. lacích a acetylací histonu H3 v pozici lysinu 9 u genÛ c-myc a CCND1, které hrají dÛleÏitou úlohu v patogenezi mnohoãet- Podûkování: ného myelomu. V souãasné dobû se zamûfiujeme na optimali- Práce byla podpofiena : VC M·MT âR LC06027

Literatura 11. Anderson KC, Shaughnessy JD Jr, Barlogie B, Harousseau JL, Roodman 1. Munshi N. C., Hideshima T., Carrasco D., Shammas M., Auclair D., Davi- GD. Multiple myeloma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. es F., Mitsiades N., Mitsiades C., Kim R. S., Li C., Rajkumar S. V., Fon- 2002;1:214-40 seca R., Bergsagel L., Chauhan D., Anderson K. C. Identification of genes 12. Tarte K., Zhan F., De Vos J., Klein B., Shaughnessy J. Jr. Gene expressi- modulated in multiple myeloma using genetically identical twin samples. on profiling of plasma cells and plasmablasts: toward a better understa- Blood. 2004;103(5):1799-806 nding of the late stages of B-cell differentiation. Blood. 2003 Jul 2. Davies F. E., Dring A. M., Li C., Rawstron A. C., Shammas M. A., O’Con- 15;102(2):592-600 nor S. M., Fenton J. A., Hideshima T., Chauhan D., Tai I. T., Robinson E., 13. Shaughnessy J., Gabrea A., Ying Q., Brents, L., Zhan F., Tian E., Sawyer Auclair D., Rees K., Gonzalez D., Ashcroft A. J., Dasgupta R., Mitsiades J., Barlogie B., Bergsagel P. L., Kuehl M. Cyclin D3 at 6p21 is dysregula- C., Mitsiades N., Chen L. B., Wong W. H., Munshi N. C., Morgan G. J., ted by recurrent Ig translocations in multiple myeloma. Blood. Anderson K. C. Insights into the multistep transformation of MGUS to mye- 2001;98(1):217-223 loma using microarray expression analysis. Blood. 2003;102(13):4504-11 14. Largo C., Alvarez S., Saez B., Blesa D., Martin-Subero J. I., Gonzalez- 3. Hardin J., Waddell M., Page C. D., Zhan F., Barlogie B., Shaughnessy J., Garcia I., Brieva J. A., Dopazo J., Siebert R., Calasanz M. J., Cigudosa Crowley J. J. Evaluation of multiple models to distinguish closely related J. C. Identification of overexpressed genes in frequently gained/amplifi- forms of disease using DNA microarray data: an application to multiple ed chromosome regions in multiple myeloma. Haematologica. myeloma. Stat Appl Genet Mol Biol. 2004;3(1):Article10 2006;91(2):184-91 4. Claudio J. O., Masih-Khan E., Tang H., Goncalves J., Voralia M., Li Z. H., 15. Stewart J. P., Thompson A., Santra M., Barlogie B., Lappin T. R., Shaugh- Nadeem V., Cukerman E., Francisco-Pabalan O., Liew C. C., Woodgett J. nessy J. Jr. Correlation of TACC3, FGFR3, MMSET and p21 expression R., Stewart A. K. A molecular compendium of genes expressed in multi- with the t(4;14)(p16.3;q32) in multiple myeloma. Br J Haematol. 2004 ple myeloma. Blood. 2002;100(6):2175-86 Jul;126(1):72-6 5. Shaughnessy J. D. Jr. Global gene expression profiling in the study of mul- 16. Shaughnessy J., Tian E., Sawyer J., Mccoy J., Tricot G., Jacobson J., Ana- tiple myeloma. Int J Hematol. 2003;77(3):213-25a issie E., Badros A., Zangari A., Fassas A., Morris C., Muwalla F., Barlo- 6. Stevenson F. K., Sahota S. S. B cell maturation in relation to multiple mye- gie B. Prognostic Impact Of Cytogenetic And Interphase FISH Defined loma. Pathol Biol. 1999;47: 89-97 Chromosome 13 Deletion In Multiple Myeloma: Early Results Of Total 7. Zhan F., Hardin J., Kordsmeier B., Bumm K., Zheng M., Tian E., Sander- Therapy II. Br J Haematol. 2003;120:44-52b son R., Yang Y., Wilson C., Zangari M., Anaissie E., Morris C., Muwalla 17. Santra M., Zhan F., Tian E., Barlogie B., Shaughnessy J. Jr. A subset of F., van Rhee F., Fassas A., Crowley J., Tricot G., Barlogie B., Shaughnes- multiple myeloma harboring the t(4;14)(p16;q32) translocation lacks sy J. Jr. Global gene expression profiling of multiple myeloma, monoclo- FGFR3 expression but maintains an IGH/MMSET fusion transcript. Blo- nal gammopathy of undetermined significance, and normal bone marrow od. 2003;101:2374-2376 plasma cells. Blood. 2002;99(5):1745-57 18. Shaughnessy J., Jacobson J., Sawyer J., McCoy J., Fassas A., Zhan F., Bumm 8. Zhan F., Tian E., Buml K., Smith R., Barlogie B., Shaughnessy J. Jr. Gene K., Epstein J., Anaissie E., Jagannath S., Vesole D., Siegel D., Desikan R., expression profiling of human plasma cell differentiation and classificati- Munshi N., Badros A., Tian E., Zangari M., Tricot G., Crowley J., Barlogie on of multiple myeloma based on similarities to distinct stages of late-sta- B. Continuous absence of metaphase-defined cytogenetic abnormalities, ge B-cell development. Blood. 2003;101:1128-1140 especially of chromosome 13 and hypodiploidy, ensures long-term survival 9. Medina F., Segundo C., Campos-Caro A., Gonzales-Garcia I., Brieva J. The in multiple myeloma treated with Total Therapy I: interpretation in the con- heterogenity shown by human plasma cells from tonsil, blood, and bone text of global gene expression. Blood. 2003;101(10):3849-56c marrow reveals graded stages of increasing maturity, but local profiles of 19. Shaughnessy J., Tian E., Sawyer J., Bumm K., Landes R., Badros A., Mor- adhesion molecule expression. Blood. 2002;99:2154-2161 ris C., Tricot G., Epstein J. Barlogie B. High Incidence of Chromosome 13 10. Alizadeh A. A., Eisen M. B., Davis R. E., Ma C., Lossos I. S., Rosenwald Deletion In Multiple Myeloma Detected by Multi-Probe Interphase FISH. A., Boldrick J. C., Sabet H., Tran T., Yu X., Powell J. I., Yang L., Marti G. Blood. 2000;96:1505-1511 E., Moore T., Hudson J. Jr., Lu L., Lewis D. B., Tibshirani R., Sherlock G., 20. Standal T., Borset M., Lenhoff S., Wisloff F., Stordal B., Sundan A., Waa- Chan W. C., Greiner T. C., Weisenburger D. D., Armitage J. O., Warnke ge A., Seidel C. Serum insulinlike growth factor is not elevated in patients R., Levy R., Wilson W., Grever M. R., Byrd J. C., Botstein D., Brown P. with multiple myeloma but is still a prognostic factor. Blood. O., Staudt L. M. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identifi- 2002;100(12):3925-9 ed by gene expression profiling. Nature. 2000;403(6769):503-11 21. Barlogie B. Jr., Shaughnessy J. D. Early results of total therapy II in mul-

400 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 tiple myeloma: implications of cytogenetics and FISH. Int J Hematol. as a determinant of cancer cell survival: a possible mechanism for de novo 2002;76 Suppl 1:337-9a drug resistance. Curr Opin Oncol.2000;12:557-563 22. Shaughnessy J. Jr. Primer on medical genomics. Part IX: scientific and cli- 29. Vacca A., Ribatti D., Presta M., Minischetti M., Iurlaro M., Ria R., Albini nical applications of DNA microarrays-multiple myeloma as a disease A., Bussolino F., Dammacco F. Bone marrow neovascularization, plasma model. Mayo Clin Proc. 2003;78(9):1098-109d cell angiogenic potential, and matrix metalloproteinase-2 secretion paral- 23. Barlogie B., Shaughnessy J., Zangari M., Tricot G. High-dose therapy and lel progression of human multiple myeloma. Blood. 1999;93(9):3064-73 immunomodulatory drugs in multiple myeloma. Semin Oncol. 2002;29(6 30. Wahlgren J., Maisi P., Sorsa T., Sutinen M., Tervahartiala T., Pirila E., Suppl 17):26-33b Teronen O., Hietanen J., Tjaderhane L., Salo T. Expression and induction 24. Henning K. A., Li L., Iyer N., McDaniel L. D., Reagan M. S., Legerski R., of collagenases (MMP-8 and -13) in plasma cells associated with bone- Schultz R. A., Stefanini M., Lehmann A. R., Mayne L. V., Friedberg E. C. destructive lesions. J Pathol. 2001;194(2):217-24 The Cockayne syndrome group A gene encodes a WD repeat protein that 31. Rice J. C., Allis C. D. Histone methylation versus histone acetylation: interacts with CSB protein and a subunit of RNA polymerase II TFIIH. new insights into epigenetic regulation. Curr. Opin. Cell Biol. Cell. 1995;82(4):555-64 2001;(3):263-273 25. Shaughnessy J. Jr., Zhan F., Barlogie B., Stewart A. K. Gene expression 32. Shi Y., Lan F., Matson C., Mulligan P., Whetstine J. R., Cole P. A., Case- profiling and multiple myeloma. Best Pract Res Clin Haematol. ro R. A., Shi Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxi- 2005;18(4):537-52 dase homolog LSD1. Cell 2004;119(7):941-953 26. Barlogie B, Shaughnessy J, Zangari M, Tricot G. High-dose therapy and 33. Nguyen C. T., Gonzales F. A., Jones P. A. Altered chromatin structure asso- immunomodulatory drugs in multiple myeloma. Semin Oncol. 2002 ciated with methylation-induced gene silencing in cancer cells: correlati- Dec;29(6 Suppl 17):26-33 on of accessibility, methylation, MeCP2 binding and acetylation. Nucleic 27. Damiano J. S., Cress A. E., Hazlehurst L. A., Shtil A. A., Dalton W. S. Cell Acids Res. 2001;29(22):4598-4606 adhesion mediated drug resistance (CAM-DR): role of integrins and resi- 34. Bártová E., Harniãarová A., Pacherník J., Kozubek S. Nuclear topography stance to apoptosis in human myeloma cell lines. Blood. 1999;93:1658- and expression of the BCR/ABL fusion gene and its protein level influ- 1667 enced by cell differentiation and RNA interference. Leuk. Res. 28. Shain K. H., Landowski T. H., Dalton W. S. The tumor microenvironment 2005;8:901-913

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 401 pÛvodní práce

PILOTNÍ STUDIE IDENTIFIKACE PROGNOSTICK¯CH MARKERÒ U PACIENTÒ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM ANAL¯ZOU PROFILÒ GENOVÉ EXPRESE IDENTIFICATION OF COLORECTAL CANCER PROGNOSTIC MARKERS BY GENE EXPRESSION PROFILES ANALYSIS: PILOT STUDY SLAB¯ O.1, GARAJOVÁ I.2, SVOBODA M.2, FABIAN P. 1, SVOBODA M. 1, SROVNAL J. 3, ·MER- DOVÁ T. 1, KOCÁKOVÁ I.2., ·EFR R.2, JECH Z. 4, HOCH J. 4, a VYZULA R.2

1 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV, ODDùLENÍ KLINICKÉ A EXPERIMENTÁLNÍ PATOLOGIE, BRNO 2 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV, KLINIKA KOMPLEXNÍ ONKOLOGICKÉ PÉâE LF MU, BRNO 3 FAKULTNÍ NEMOCNICE OLOMOUC, DùTSKÁ KLINIKA, LABORATO¤ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY, OLOMOUC 4 FAKULTNÍ NEMOCNICE V MOTOLE, CHIRURGICKÁ KLINIKA 2. LÉKA¤SKÉ FAKULTY UK, PRAHA

Souhrn Kolorektální karcinom je jedním z nejãastûji se vyskytujících nádorov˘ch onemocnûní. BohuÏel, v˘znam- ná ãást pacientÛ v klinick˘ch stádiích II a III umírá do pûti let po radikálním chirurgickém zákroku násled- kem progrese onemocnûní. Racionální pfiistup k indikaci adjuvantní léãby pro tyto pacienty nabízí mole- kulární charakterizace jejich rizika napfiíã obûma klinick˘mi stádii pomocí technologie DNA ãipÛ. Do studie byly zafiazeny bioptické vzorky dvanácti pacientÛ s histologicky potvrzen˘m kolorektálním karcinomem (KRK) v klinickém stádiu II a III tvofiené minimálnû ze 70% maligními buÀkami. ·est pacientÛ mûlo dobrou prognózu s délkou bezpfiíznakového pfieÏití (DFS) del‰í neÏ 36 mûsícÛ, ‰est mûlo ‰patnou prognózu s DFS krat‰ím neÏ 36 mûsícÛ. Pomocí nízkohustotních oligonukleotidov˘ch makroãipÛ spoleãnosti Supe- rArray urãen˘ch k relativní kvantifikaci exprese 128 genÛ potenciálnû zapojen˘ch do procesu metastazo- vání, byly identifikovány profily genové exprese primárních KRK v‰ech 12 pacientÛ. Anal˘zou expresních profilÛ pomocí t-testu (á = 0,01) a metody SAM jsme identifikovali 10 genÛ rozdílnû exprimovan˘ch (9 up- regulovan˘ch, 1 down-regulovan˘) v primárních nádorech pacientÛ se ‰patnou prognózou. Na‰e v˘sledky nasvûdãují, Ïe technologie nízkohustotních oligonukleotidov˘ch makroãipÛ je uÏiteãnou pomÛckou pro lep- ‰í pochopení molekulární podstaty progrese nádorového onemocnûní a zlep‰ení predikce metastatického potenciálu primárních nádorÛ u pacientÛ s lokoregionálnû pokroãil˘m kolorektálním karcinomem.

Klíãová slova: kolorektální karcinom, DNA ãipová technologie, profily genové exprese, prognóza

Summary Colorectal cancer (CRC) is one of the most common malignancies. Unfortunately, a significant proportion of surgically cured patients in the early stage of the disease develop progression and die from the disease. Twelve patients who had histologically confirmed left-sided colon adenocarcinoma with a volume fraction showing at least 70% of malignant tumor cells were included. Only stage II-III patients according to IUCC with no prior chemotherapy or radiotherapy were eligible for the study. Six patients were poor prognosis cases with disease free survival (DFS) lower then 36 month and six were good prognosis cases with DFS>36 month. Relative gene expression levels of 128 genes potentially involved in cancer progression and disse- mination were obtained by low-density oligonucleotide microarrays (SuperArray Bioscience Corp., Bet- hesda, MD) from 12 primary colon cancer samples. Gene expression data analysis based on the SAM and t- test (á = 0, 01) methods identified 10 genes with significantly different expression in primary tumors of patients with poor prognosis. Our preliminary data suggest that oligonucleotide microarray technology should contribute to a better understanding of the progression of colorectal cancer, and facilitate prediction of their metastatic potential.

Key words: colorectal cancer, DNA microarray technology, gene expression profiles, pathogenesis, prognosis

402 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Úvod a ãasn˘ch stádií karcinomÛ pomocí nízkohustotního cDNA Kolorektální karcinomy (KRK) patfií v âeské republice makroãipu [6]. Pro na‰i studii jsme se proto rozhodli pouÏít k nejãetnûj‰ím nádorov˘m onemocnûním. Poslední publikova- nizkohustotní oligonukleotidové makroãipy spoleãnosti Supe- ná data udávají jejich roãní incidenci 78 pfiípadÛ a mortalitu 41 rArray urãené k relativní kvantifikaci exprese 128 genÛ poten- pfiípadÛ na 100.000 obyvatel. To na‰i zemi fiadí na první místo ciálnû zapojen˘ch do procesu metastazování. v Evropû a jedno z pfiedních míst ve svûtû. V léãbû tohoto one- Cílem studie je získání expresních profilÛ prognosticky mocnûní i pfies vzrÛstající náklady není dosahováno uspokoji- odli‰n˘ch skupin pacientÛ s kolorektálním karcinomem v kli- v˘ch v˘sledkÛ. Jedním z dÛvodÛ je skuteãnost, Ïe pacienty v kli- nickém stádiu II a III pomocí oligonukleotidov˘ch makroãi- nickém stádiu II (pT3-pT4, pN0) a III (pT2-pT4, pN+) po pÛ, jejich porovnání a identifikace genÛ se signifikantnû roz- radikálním chirurgickém zákroku není moÏnû s dostateãnou sen- dílnou expresí mezi skupinami pacientÛ s rÛznou prognózou. zitivitou rozdûlit na skupinu s vysok˘m a nízk˘m rizikem relap- Tento pfiístup je zaloÏen na pfiedpokladu, Ïe pozdûj‰í vysoce su onemocnûní a následnû pro nû vytvofiit individuální léãebn˘ invazivní a metastatick˘ fenotyp kolorektálních karcinomÛ je plán. PfiibliÏnû 20-30% pacientÛ v klinickém stádiu II umírá do detekovateln˘ jiÏ v primárních karcinomech pacientÛ s loko- pûti let na progresi onemocnûní, protoÏe nebyli na základû sou- regionálním postiÏením tj. v klinickém stádiu II a III [7]. Detek- ãasnû pouÏívan˘ch diagnostick˘ch kriterii (histologická klasi- ce tohoto specifického molekulárního profilu by v budoucnu fikace, grade, klinick˘ rozsah, ojedinûlé molekulární markery) mohla slouÏit k individualizaci terapie u pacientÛ s kolorek- vyhodnoceni jako rizikoví z hlediska progrese onemocnûní tálním karcinomem [8]. a nedostali potfiebnou adjuvantní chemoterapii. U pacientÛ v kli- nickém stádiu III (k progresi dochází pfiibliÏnû u 50%) je situa- Materiál a metody ce opaãná. Naprostá vût‰ina pacientÛ po chirurgickém zákroku Soubor pacientÛ absolvuje adjuvantní chemoterapii, pfiestoÏe celkové pfieÏití Do studie bylo zafiazeno 12 pacientÛ ve vûku 52-76 let v dobû di- v˘znamnû zlep‰uje pouze u 10-20% tûchto pacientÛ a ostatní agnózy s histologicky potvrzen˘m sporadick˘m kolorektálním prochází zatûÏující chemoterapeutickou léãbou bez zfietelného adenokarcinomem v klinickém stádiu II a III dle IUCC (pT3- benefitu. Tyto skuteãnosti mají samozfiejmû v˘znam také z hle- pT4, pN0 nebo pT2-pT4, pN+), ktefií podstoupili chirurgick˘ diska farmakoekonomiky. Je tedy zfiejmé, Ïe souãasná kriteria zákrok v Masarykovû onkologickém ústavu v letech 2001 aÏ pro stanovení prognózy u pacientÛ v klinickém stádiu II a III ne- 2005 (viz. tabulka ã. 1). Pacienti byli rozdûleni do dvou skupin mají z hlediska predikce relapsu a celkového pfieÏití dostateã- z hlediska prognózy na základû parametru disease free survival nou informativní hodnotu. Racionální pfiistup k indikaci adju- (DFS). ·est pacientÛ mûlo dobrou prognózu (DFS>36 mûsícÛ, vantní léãby nabízí molekulární charakterizace vysoce rizikové medián 43), ‰est pacientÛ ‰patnou prognózu (DFS<36 mûsícÛ, podskupiny napfiíã pacienty v obou klinick˘ch stádiích pomocí medián 13). technologie DNA ãipÛ [1]. Nadûjné v˘sledky pfiinesla studie zamûfiená na hledání nov˘ch Izolace a kontrola kvality RNA prognostick˘ch markerÛ relapsu onemocnûní s vyuÏitím Bioptick˘ materiál byl ihned po chirurgickém vyjmutí zamra- oligonukleotidov˘ch mikroãipÛ Affymetrix U133a. Na sou- zen a uskladnûn pfii -80oC do dal‰ího zpracování. Celková RNA boru 74 pacientÛ ve stádiu Dukes B (stádium II) byla identifi- byla izolována pomocí TriReagentu (MRC, Research, USA) kována sada 23 genÛ, která na nezávislém validaãním soubo- dle doporuãení v˘robce, v nûkter˘ch pfiípadech pfieãi‰tûna na ru 36 pacientÛ predikovala relaps s pfiesností 78% (p = 0,0001) kolonkách uÏitím kitu ArrayGradeá (SuperArray Bioscience [2]. DNA mikroãipy byly pouÏity také k vytvofiení moleku- Corp.). âistota byla ovûfiena spektrofotometricky a nekonta- lárního stagingu kolorektálních karcinomÛ. Pro 78 vzorkÛ minovaná RNA (A260/A280 > 2; A260/A230 > 1,7) byla dále kolorektálních karcinomÛ byly získány expresní profily pomo- zpracována. Intergrita RNA byla kontrolována metodou kapi- cí 32,000 cDNA mikroãipÛ (TIGR), z nichÏ se pomocí klast- lární gelové elektroforézy pfiístorojem Agilent 2100 Bioana- rové anal˘zy podafiilo identifikovat sadu 43 genÛ, která um- lyzer (Agilent Technologies). Pouze nefragmentovaná RNA oÏÀovala nezávisle na klinické klasifikaci rozdûlit pacienty na charakterizovaná hodnotou RIN (RNA Integrity Number) vy- dvû prognostické skupiny ve vztahu k celkovému pfieÏití. Pfii ‰‰í neÏ 7 byla pouÏita pro dal‰í anal˘zy [9]. cross-validaci byla tato sada genÛ, obsahující mimo jiné také geny pro osteopontin a neuregulin, schopná pfiedpovûdût 36 Zpracování oligonukleotidov˘ch makroãipÛ (Oligo GEArrays) mûsíãní pfieÏití s pfiesností 90% (p<0,001) [3]. Retrospektivní K získaní expresních profilÛ jsme pouÏili nízkohustotní studii zamûfienou na predikci relapsu onemocnûní provedl na oligonukleotidové makroãipy spoleãnosti SuperArray Tumor souboru 25 pacientÛ klinického stádia Dukes C (stádium III), Metastasis Oligo GEArray (OHS-028) urãené k relativní kvan- u kter˘ch byl jedinou léãebnou modalitou radikální chirurgic- tifikaci exprese celkem 128 genÛ potenciálnû zapojen˘ch do k˘ zákrok Arango a kol. (2005). Získan˘ klasifikátor tvofien˘ procesu nádorové invazivity a metastazování (geny souvisejí- 17 geny byl schopn˘ pfii cross-validaci správnû zafiadit 88% cí s bunûãnou adhezí, extracelulární matrix, angiogenezí, regu- pacientÛ a rozdûlit je z hlediska dlouhodobého DFS na hladi- lací bunûãného cyklu, apoptózou). K lineární amplifikaci ~3 nû pravdûpodobnosti (p < 0,0001) [4]. μg intaktní RNA kaÏdého vzorku a jejímu znaãení biotinem- Studie zaloÏené na technologii vysokohustotních oligo- 16-UTP (Enzo Life Sciences) jsme pouÏili kit TrueLabeling- nukleotidov˘ch nebo DNA mikroãipÛ prokázaly velice dobré AMPTM 2.0 (SuperArray Bioscience Corp.). Získaná cRNA analytické vlastnosti, bohuÏel s minimálním prÛnikem mezi byla pfieãi‰tûna pomocí kolonkového kitu ArrayGradeTM nalezen˘mi genov˘mi sadami. Srovnatelnost a reprodukova- cRNA Cleanup Kit (SuperArray Bioscience Corp.). cRNA son- telnost tûchto studií je nane‰tûstí v˘znamnû ovlivnûna jejich dy byly následnû denaturovány a hybridizovány 20 hodin na technologickou rozmanitostí a v˘sledky, kter˘ch bylo pomo- nylonovou membránu makroãipu nesoucího oligonukleotido- cí nich dosaÏeno nelze povaÏovat za konkluzivní [5]. Pfiedpo- vé sondy specifické pro jednotlivé geny. Hybridizovaná cRNA kládáme, Ïe pro na‰e úãely bude vhodnûj‰í zamûfiit se na byla detekována po vazbû biotinu na avidin-fosfatázov˘ kon- sledování konkrétních biologick˘ch procesÛ spojen˘ch s inva- jugát chemiluminiscenãní reakcí s ãinidlem CDPstar (Tropix, zivitou a diseminací charakterizovan˘ch pomocí sady genÛ jiÏ Inc., Bedford, MA). V‰echny postupy byly provedeny dle dfiíve popsan˘ch u jin˘ch typÛ nádorÛ. Na stejném pfiedpo- doporuãení v˘robce. Chemiluminiscenãní obraz byl snímán kladu je zaloÏena napfiíklad práce Nosha a kol. (2005) zamû- 12bitovou chlazenou CCD kamerou (Synoptics Ltd .) po dobu fiená na porovnání expresních profilÛ kolorektálních adenomÛ 17 minut.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 403 Anal˘za obrazu a zpracování dat V˘sledky Anal˘za obrazu, odeãtení pozadí (spot s nejniÏ‰í intenzitou) Unifikace zkoumaného souboru, eliminace faktorÛ ovlivÀují- a normalizace dat byla provedena pomocí webové aplikace cích ãipové anal˘zy GEArray Expression Analysis Suite (SuperArray Bioscience Vzhledem k popsan˘m v˘razn˘m rozdílÛm v expresních pro- Corp.). Intenzita signálu jednotliv˘ch spotÛ byla normalizo- filech nádorÛ vykazujících mikrosatelitní nestabilitu byla pro- vána pomocí sady housekeepingov˘ch genÛ GAPDH, ACTB, vedena imunohistochemická anal˘za reparaãních proteinÛ HSPCB a B2M (viz obr. 1 - A16- F16). Statistická anal˘za MSH2, MLH1 a PMS2 [12] a do studie byly zafiazeny pouze a vizualizace normalizovan˘ch dat byly provedeny pomocí nádory s nepravdûpodobnou mikrosatelitní nestabilitou. Za softwaru TIGR MultiExperiment Viewer version 3.1 (The úãelem eliminace vlivu anatomické lokalizace na rozdíly Institute for Genomic Research, 2003, ) [10]. K identifikaci v expresních profilech rÛzn˘ch prognostick˘ch skupin byly genÛ rozdílnû exprimovan˘ch mezi dvûma skupinami pacien- nádory rozdûleny také z hlediska jejich lokalizace vzhledem tÛ jsme pouÏili dvouv˘bûrov˘ t-test (α = 0,01) a metodu SAM ke splenické flexufie (proximálnû a distálnû, 5 vs . 7) a analy- (Significance Analysis of Microarrays) [11], podmínkou byl zovány samostatnû. K vylouãení v˘znamné kontaminace jin˘- minimálnû dvojnásobn˘ rozdíl v expresi nalezen˘ch genÛ mezi mi bunûãn˘mi populacemi (lymfocyty, fibroblasty) byly v‰e- skupinami. Metoda SAM byla pouÏita pro studii typu „two chny vzorky ovûfieny patologem z hlediska zastoupení class unpaired data“ s poãtem permutací 1000, pro minimální nádorov˘ch bunûk. Vzorky tvofieny z více neÏ 70% nádoro- hodnotu odhadu FDR (false discovery rate) byla stanovena v˘mi buÀkami byly dále zpracovány [13]. Pouze nekontami- hranice ࣼ = 1,5. Nejv˘znamnûj‰í geny získané pomocí obou novaná a nefragmentovaná RNA (RIN > 7) byla pouÏita k ãipo- metod byly pouÏity pro shlukování pacientÛ s dobrou prognó- v˘m anal˘zám [9]. V˘‰e uvedená kriteria splÀovalo 12 zou a pacientÛ se ‰patnou prognózou pomocí metody hierar- (z testovan˘ch 20) vzorkÛ následnû pouÏit˘ch ve studii. chického shlukování (HCL) (viz obr. 2). Analogicky byly ana- Vyhodnoceno bylo rovnûÏ rutinnû provádûné stanovení hla- lyzovány rovnûÏ expresní profily kolorektálních karcinomÛ din nádorového markeru CEA (karcinoembryonální antigen) dle anatomické lokalizace. v krevním séru. Podle oãekávání byla skupina pacientÛ se ‰patnou prognózou spojena s vy‰‰í pooperaãní sérovou hladinou CEA neÏ skupina s dobrou prognózou (medián 7,1 vs. 1,9 μg/l).

Anal˘za expresních profilÛ prognosticky rozdíln˘ch pacientÛ Pro monitorování relativní exprese 128 genÛ potenciálnû zapojen˘ch do progrese a diseminace nádorového onemocnû- ní bylo pouÏito nizkohustotních oligonukleotidov˘ch makro- ãipÛ spoleãnosti SuperArrray (OHS-028). Panel relativní exprese tûchto genÛ byl získán pro 12 bioptick˘ch vzorkÛ pri- márních kolorektálních karcinomÛ nepfiedléãen˘ch pacientÛ, klinicky charakterizovan˘ch v tabulce 1 . Pfiíklady dvou níz- kohustotních oligonukleotidov˘ch makroãipÛ jsou ukázány na obrázku 1. Geny s expresí niÏ‰í neÏ 5% mediánu byly pova- Ïovány za neexprimované. Ve v‰ech 12 pfiípadech byla po- zorována detekovatelná genová exprese u více neÏ 40% (rozsah 41- 75%) spotÛ pfiítomn˘ch na makroãipu. Pomocí t-testu (α = 0,01) a metody SAM bylo identifikováno 10 genÛ (9 up- regulovan˘ch, 1 down-regulovan˘) se signifikantním více neÏ dvojnásobn˘m rozdílem v expresi mezi dvûma prognostick˘- mi skupinami pacientÛ (viz tabulka 2). Tato sada genÛ násled- nû umoÏnila v klastrové anal˘ze rozdûlit pacienty do skupin Obrázek 1.: Ukázka nizkohustotních oligonuklotidov˘ch makroãipÛ dvou analyzovan˘ch vzorkÛ dle prognózy (viz obr. 2). Z hlediska biologické funkce jsou mezi up-regulovan˘mi geny zastoupeny pfiedev‰ím onkogeny (MYC, MYB, KRAS, SRC) dále hepatální rÛstov˘ faktor HGF, transkripãní faktor ETV4, regulátor bunûãného cyklu PTEN a molekuly extracelulární matrix a bunûãné adheze (CD82, HPSE). SníÏenou expresi vykazoval ve skupinû pacientÛ se ‰patnou prognózou pouze antiangiogenní inhibitor metalop- roteinázy 2 (TIMP2).

Profily genové exprese proximálnû a distálnû lokalizovan˘ch kolorektálních karcinomÛ Rozdíly v profilech genové exprese mezi levostrann˘mi (leÏí- cí distálnû od splenické flexury) a pravostrann˘mi (leÏící proximálnû od splenické flexury) kolorektálními karcinomy byly opakovanû popsány [14]. Abychom vylouãili potenciál- ní interferenci rozdílÛ v profilech genové exprese souvisejí- cích s prognózou onemocnûní a anatomickou lokalizací, roz- dûlili jsme zkouman˘ soubor z hlediska anatomické lokalizace (pravostranné vs. levostranné, 5 vs. 7) a provedli anal˘zu expresních profilÛ analogick˘m postupem jako v pfiípadû pro- gnózy. Pomocí t-testu (α = 0,01) a metody SAM (ࣼ = 0,5) byly identifikovány 4 geny se signifikantní více neÏ dvojnásobnou expresí v proximálnû leÏících kolorektálních karcinomech. Obrázek 2.: Ukázka klastrogramu vytvofieného na základû 10 genÛ se sig- Tato malá skupina genÛ je tvofiena dvûma transkripãními fak- nifikantnû rozdílnou expresí mezi skupinami pacientÛ s rozdílnou pro- tory (ETV6, EWSR1), regulátorem bunûãného cyklu NF2 a ad- gnózou hezivní molekulou FAT (viz. tabulka ã. 3).

404 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Tabulka ã. 1.: Charakteristika zkoumaného souboru pacientÛ

Pacient Vûk Pohlaví Klinické stádium Lokalizace pTNM Grade CEA [μg/l] Stav pﬁi kontrole DFS dp1 73 Ïena III.B C184 (P) pT3N1M0 G2 3,4 remise 58 dp2 73 muÏ II.A C185 (D) pT3N0M0 G2 2,1 remise 54 dp3 61 Ïena II.A C182 (P) pT3N0M0 G1 1,9 remise 41 dp4 56 Ïena II.A C187 (D) pT3N0M0 G2 0,5 remise 44 dp5 62 Ïena III.A C190 (D) pT2N1M0 G2 0,7 remise 36 dp6 61 muÏ III.B C186 (D) pT3N1M0 G2 1,9 remise 36 sp1 52 muÏ II.A C190 (D) pT3N0M0 G2 9,4 met. v mezenteriu 20 sp2 72 muÏ II.A C183 (P) pT3N0M0 G2 4,8 jaterní metastázy 6 sp3 60 Ïena III.C C180 (P) pT4N2M0 G3 1,4 jaterní metastázy 13 sp4 73 muÏ II.A C182 (P) pT3N0M0 G1 1,7 kostní metastázy 7 sp5 52 muÏ II.A C190 (D) pT3N0M0 G1 41 lokální recidiva 18 sp6 76 muÏ III.B C190 (D) pT3N1M0 G1 22,6 lokální recidiva 12 (P) – proximálnû lokalizované nádory, (D) – distálnû lokalizované nádory, DFS – disease free survival, CEA –karcinoembryonální antigen (referenãní mez CEA < 4,6 μg/l)

Tabulka ã. 2.: Skupina genÛ s více neÏ dvojnásobnû rozdílnou expresí u pacientÛ s nepﬁíznivou prognózou (p<0,01)

GeneBank Symbol Název ࣼ Pozice p-value NM_005417 SRC V-src sarcoma viral oncogene homolog + H12 0,004 NM_000314 PTEN Phosphatase and tensin homolog + C11 0,001 NM_006665 HPSE Heparanase + D6 0,004 NM_000601 HGF Hepatocyte growth factor (hepapoietin A; scatter factor) + E6 0,003 NM_005375 MYB V-myb myeloblastosis viral oncogene homolog + H9 0,001 NM_004985 KRAS V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog + G7 0,002 NM_002231 CD82 CD82 antigen (KAI1) + E7 <0,001 NM_001986 ETV4 Ets variant gene 4 (E1A enhancer binding protein, E1AF) + E4 0,002 NM_002467 MYC V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog + A11 <0,001 NM_003255 TIMP2 TIMP metallopeptidase inhibitor 2 - G13 <0,001

Tabulka ã. 3.: Skupina genÛ s více neÏ dvojnásobnou expresí v proximálnû leÏících kolorektálních karcinomech (p<0,01)

GeneBank Symbol Název ࣼ Pozice p-value NM_001987 ETV6 Ets variant gene 6 (TEL oncogene) + F4 0,001 NM_005243 EWSR1 Ewing sarcoma breakpoint region 1 + G4 <0,001 NM_006665 FAT FAT tumor suppressor homolog 1 (Drosophila) + H4 0,004 NM_000268 NF2 Neurofibromin 2 (bilateral acoustic neuroma) + C10 0,003

Diskuze apoptotick˘m genem Bcl-X na proteinové úrovni. Exprese Cílem této studie bylo ovûfiit, zda vysoce invazivní a metasta- obou genÛ byla na souboru 91 KRK asociována se zv˘‰en˘m tick˘ fenotyp kolorektálních karcinomÛ (KRK) je detekova- rizikem progrese nádorového onemocnûní a niÏ‰ím celkov˘m teln˘ jiÏ v primárních karcinomech pacientÛ s lokoregionál- pfieÏitím [19]. Námi pozorována up-regulace onkogenÛ MYB ním postiÏením a zda by tento specifick˘ molekulární profil a MYC je v souladu se souãasn˘mi poznatky o jejích úloze mohl slouÏit ke stanovení jejich prognózy. Zkouman˘ soubor v kolorektální kancerogenezi. Mutace onkogenu KRAS se byl proto rozdûlen do dvou prognostick˘ch skupin na základû vyskytují pfiibliÏnû v 50% kolorektálních karcinomÛ a adeno- délky bezpfiíznakové pfieÏití (DFS). Abychom zjistili zmûny mÛ vût‰ích neÏ 1 cm. K mutacím onkogenu KRAS (pfiedev‰ím v expresi genÛ spojen˘ch s invazivitou a diseminací nádoro- v kodonech 12 a 13) dochází nejãastûji pfii pfiechodu ze stádia vého postiÏení analyzovali jsme profily genové exprese pri- ãasného adenomu k pokroãilému adenomu. Tyto mutace byly márních kolorektálních karcinomÛ tûchto dvou skupin opakovanû asociovány s nepfiíznivou prognózou [20]. RovnûÏ pacientÛ. zv˘‰ené hladiny proteinu RAS byly spojeny s hor‰ím celko- Anal˘zou exprese 128 genÛ získan˘ch pomocí oligonukleoti- v˘m pfieÏitím nezávisle na stádiu onemocnûní [21, 22]. Onko- dového makroãipu se nám t-testem a metodou SAM podafiilo gen SRC patfií do rodiny genÛ kódujících tyrozinkinázy se identifikovat 10 genÛ (9 up-regulovan˘ch, 1 down-regulova- zásadní rolí v transdukci rozliãn˘ch bunûãn˘ch signálÛ zod- n˘) s minimálnû dvojnásobn˘m rozdílem v expresi u skupiny povûdn˘ch za regulaci procesÛ jako je bunûãné dûlení, moti- pacientÛ s nepfiíznivou prognózou. Nûkteré z tûchto genÛ byly lita, bunûãná adheze, angiogeneze a bunûãné pfieÏívání. Jeh- v souvislosti s invazivitou a metastazováním kolorektálních o zv˘‰ené hladiny jsou ãasté ve vût‰inû epiteliálních nádorÛ karcinomÛ jiÏ popsány. (vãetnû kolorektálního) a jsou spojeny s vy‰‰í nádorovou Onkogen MYC má zásadní v˘znam v regulaci bunûãné proli- invazivitou a metastatick˘m potenciálem [16, 23, 24]. PTEN ferace a diferenciace. Je jedním z cílov˘ch genÛ regulovan˘ch je negativní regulátor Akt-kinázové signální dráhy, která má β-kateninov˘m komplexem, jehoÏ inhibice produktem APC zásadní úlohou v pfieÏívání bunûk, a je proto povaÏován za genu je u KRK znemoÏnûna jeho ãast˘mi mutacemi [15, 16]. nádorov˘ supresor. Mutace PTENu byly pozorovány v pfii- Zv˘‰ená hladina mRNA onkogenu MYC byla u kolorektál- bliÏnû 19% sporadick˘ch kolorektálních karcinomÛ [25], nic- ních karcinomÛ asociována rovnûÏ s vy‰‰í frekvencí relapsÛ ménû jeho sníÏené hladiny na úrovni RNA a proteinu nebyly onemocnûní a niÏ‰ím celkov˘m pfieÏitím [17]. Up-regulace pozorovány a pfiesn˘ mechanizmus jeho zapojení do kolorek- onkogenu MYC spoleãnû s onkogenem MYB byla inverznû tální kancerogeneze není znám [26]. Hepatální rÛstov˘ faktor korelována s mírou apoptózy v nádorové tkáni [18]. Pro tuto HGF je znám˘m pro-angiogenním faktorem zvy‰ujícím expre- asociaci svûdãí také popsaná ko-exprese onkogenu MYB santi- si receptoru pro urokinázov˘ aktivátor plazminogenu (uPAR)

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 405 pfies Erk signální dráhu. Jeho zv˘‰ené hladiny jsou spojeny se kované rozdíly mezi rÛznû lokalizovan˘mi KRK byly zpÛso- zv˘‰enou mírou angiogeneze a tedy i nádorovou invazivitou beny pfiedev‰ím v˘znamn˘m zastoupením MSI+ nádorÛ v pro- [24]. Jeho up- regulace byla pozorována u kolorektálních kar- ximální oblasti tlustého stfieva [14]. cinomÛ nevykazujících mikrosatelitní nestabilitu [27]. ETV4 (E1AF) je ãlenem rodiny transkripãních faktorÛ ets a v˘znam- Závûrem lze fiíci, Ïe pomocí anal˘zy profilÛ genové exprese se n˘m induktorem matrix metaloproteináz (pfiedev‰ím matrily- nám podafiilo identifikovat 10 genÛ, jejichÏ rozdílná exprese zinu MMP7) a podílí se tak na nádorové invazivitû a disemi- umoÏnila rozdûlit sledované pacienty do dvou skupin z hlediska naci [28]. Jeho zv˘‰ená exprese byla identifikována v ãasn˘ch prognózy. Vût‰ina z tûchto genÛ byla jiÏ dfiíve v souvislosti s pro- stádiích KRK rovnûÏ ve studii zaloÏené na nízkohustotních gnózou kolorektálního karcinomu studována. Na‰e v˘sledky DNA makroãipech [6]. Enzym heparanáza (HPSE) naru‰uje potvrzují pfiedchozí pozorování ajsou vsouladu biologickou pod- ochrannou vrstvu proteoglykanÛ (zejména heparan sulfátu) n- statou nádorové invazivity a metastázování. Alterace v expresi a cévním povrchu a pfiímo se tak mÛÏe podílet na hematogen- genÛ prohepatální rÛstov˘ faktor HGF atranskripãní faktor ETV4 ním metastazování. U kolorektálních karcinomÛ byla její up- byly u kolorektálního karcinomu s nepfiíznivou prognózou regulace asociována se signifikantnû niÏ‰ím pûtilet˘m pfieÏitím identifikovány poprvé. Po roz‰ífiení zkoumaného souboru paci- [29]. Inhibitor metaloproteinázy 2 (gelatinázy) TIMP2 je anti- entÛ a ovûfiení v˘sledkÛ metodou qRT-PCR nebo imunohisto- angiogenním faktorem a ztráta jeho exprese je spojena se zv˘- chemicky na proteinové úrovni by nalezená sada genÛ mohla b˘t ‰enou aktivitou galatináz a tedy i zv˘‰enou nádorovou invazi- jedním z krokÛ vedoucích smûrem k individualizaci terapie paci- vitou. Námi pozorována sníÏená exprese TIMP2 byla jiÏ dfiíve entÛ s lokoregionálnû pokroãil˘m kolorektálním karcinomem. pozitivnû korelována s niÏ‰ím celkov˘m pfieÏitím u pacientÛ s kolorektálními karcinomy [30]. Podûkování Îádn˘ z genÛ nalezen˘ch v souvislosti s rozdílnou prognózou Autofii dûkují MUDr. Michalu Jurajdovi, PhD z Patofyziolo- není rozdílnû exprimován mezi skupinami nádorÛ rÛzné ana- gického ústavu Lékafiské fakulty Masarykovy univerzity tomické lokalizace. Malé rozdíly v expresních profilech levo- v Brnû za technickou asistenci pfii snímání GEArrays CCD strann˘ch a pravostrann˘ch KRK (4 geny) pozorované v na‰í kamerou. studii jsou pravdûpodobnû zpÛsobeny vylouãením nádorÛ Práce byla podpofiena granty IGA MZ âR NR/9076 - 4 s mikrosatelitní nestabilitou (MSI+) z anal˘z. Dfiíve identifi- a MSM 6198959216.

Literatura 16. Bird NC, Mangnall D, Majeed AW: Biology of colorectal liver metasta- 1, Churchill GA: Fundamentals of experimental design for cDNA microarrays. ses: A review. J Surg Oncol 94:68-80, 2006 Nat Genet 32 Suppl:490-5, 2002 17. Kakisako K, Miyahara M, Uchino S, et al: Prognostic significance of c- 2. Wang Y, Jatkoe T, Zhang Y, et al: Gene expression profiles and molecu- myc mRNA expression assessed by semi-quantitative RT- PCR in patients lar markers to predict recurrence of Dukes’ B colon cancer. J Clin Oncol with colorectal cancer. Oncol Rep 5:441-5, 1998 22:1564-71, 2004 18. Greco C, Alvino S, Buglioni S, et al: Activation of c-MYC and c-MYB pro- 3. Eschrich S, Yang I, Bloom G, et al: Molecular staging for survival predic- to-oncogenes is associated with decreased apoptosis in tumor colon pro- tion of colorectal cancer patients. J Clin Oncol 23:3526-35, 2005 gression. Anticancer Res 21:3185-92, 2001 4. Arango D, Laiho P, Kokko A, et al: Gene-expression profiling predicts 19. Biroccio A, Benassi B, D’Agnano I, et al: c-Myb and Bcl-x overexpression recurrence in Dukes’ C colorectal cancer. Gastroenterology 129:874-84, predicts poor prognosis in colorectal cancer: clinical and experimental fin- 2005 dings. Am J Pathol 158:1289-99, 2001 5. Draghici S, Khatri P, Eklund AC, et al: Reliability and reproducibility issu- 20. Anwar S, Frayling IM, Scott NA, et al: Systematic review of genetic influ- es in DNA microarray measurements. Trends Genet 22:101-9, 2006 ences on the prognosis of colorectal cancer. Br J Surg 91:1275-91, 2004 6. Nosho K, Yamamoto H, Adachi Y, et al: Gene expression profiling of colo- 21. Sun XF, Ekberg H, Zhang H, et al: Overexpression of ras is an indepen- rectal adenomas and early invasive carcinomas by cDNA array analysis. dent prognostic factor in colorectal adenocarcinoma. Apmis 106:657-64, Br J Cancer 92:1193-200, 2005 1998 7. Ramaswamy S, Ross KN, Lander ES, et al: A molecular signature of meta- 22. Petrowsky H, Sturm I, Graubitz O, et al: Relevance of Ki-67 antigen expres- stasis in primary solid tumors. Nat Genet 33:49-54, 2003 sion and K-ras mutation in colorectal liver metastases. Eur J Surg Oncol 8. Liefers GJ, Tollenaar RA: Cancer genetics and their application to indivi- 27:80-7, 2001 dualised medicine. Eur J Cancer 38:872-9, 2002 23. Summy JM, Gallick GE: Src family kinases in tumor progression and meta- 9. Schroeder A, Mueller O, Stocker S, et al: The RIN: an RNA integrity num- stasis. Cancer Metastasis Rev 22:337-58, 2003 ber for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol 24. Rudmik LR, Magliocco AM: Molecular mechanisms of hepatic metastasis 7:3, 2006 in colorectal cancer. J Surg Oncol 92:347-59, 2005 10. Dudoit S, Gentleman RC, Quackenbush J: Open source software for the 25. Nassif NT, Lobo GP, Wu X, et al: PTEN mutations are common in spora- analysis of microarray data. Biotechniques Suppl:45-51, 2003 dic microsatellite stable colorectal cancer. Oncogene 23:617-28, 2004 11. Kooperberg C, Sipione S, LeBlanc M, et al: Evaluating test statistics to 26. Taniyama K, Goodison S, Ito R, et al: PTEN expression is maintained in select interesting genes in microarray experiments. Hum Mol Genet sporadic colorectal tumours. J Pathol 194:341-8, 2001 11:2223-32, 2002 27. Inoue Y, Miki C, Watanabe H, et al: Genomic instability and tissue expres- 12. Plevova P, Krepelova A, Papezova M, et al: Immunohistochemical sion of angiogenic growth factors in sporadic colorectal cancer. Surgery detection of the hMLH1 and hMSH2 proteins in hereditary non- poly- 139:305-11, 2006 posis colon cancer and sporadic colon cancer. Neoplasma 51:275-84, 28. Horiuchi S, Yamamoto H, Min Y, et al: Association of ets-related transc- 2004 riptional factor E1AF expression with tumour progression and overex- 13. de Ridder D, van der Linden CE, Schonewille T, et al: Purity for clarity: pression of MMP-1 and matrilysin in human colorectal cancer. J Pathol the need for purification of tumor cells in DNA microarray studies. Leu- 200:568-76, 2003 kemia 19:618-27, 2005 29. Sato T, Yamaguchi A, Goi T, et al: Heparanase expression in human colo- 14. Birkenkamp-Demtroder K, Olesen SH, Sorensen FB, et al: Differential rectal cancer and its relationship to tumor angiogenesis, hematogenous gene expression in colon cancer of the caecum versus the sigmoid and rec- metastasis, and prognosis. J Surg Oncol 87:174-81, 2004 tosigmoid. Gut 54:374-84, 2005 30. Curran S, Dundas SR, Buxton J, et al: Matrix metalloproteinase/tissue inhi- 15. Watson AJ: An overview of apoptosis and the prevention of colorectal can- bitors of matrix metalloproteinase phenotype identifies poor prognosis colo- cer. Crit Rev Oncol Hematol 57:107-21, 2006 rectal cancers. Clin Cancer Res 10:8229-34, 2004

406 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 STUDIUM VLIVU METHOTREXÁTU NA EXPRESI GENÒ P53-SIGNÁLNÍ DRÁHY V LEUKEMICK¯CH BU≈KÁCH POMOCÍ cDNA ARRAY. cDNA ARRAY ANALYSIS OF P53-SIGNALLING PATHWAY GENES IN LEUKEMIC CELLS TREATED WITH METHOTREXATE. MICHALOVÁ E.1, HRSTKA R.1, ·TùRBA J.1,3, MENDELOVÁ D.3, VALÍK D.2, BABâANOVÁ S.1, K¤IVÁNKOVÁ K.1, VOJTù·EK B.1

1 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV, ODDùLENÍ PATOLOGIE, ÎLUT¯ KOPEC 7, BRNO 2 MASARYKÒV ONKOLOGICK¯ ÚSTAV, ODDùLENÍ LABORATORNÍ MEDICÍNY, ÎLUT¯ KOPEC 7, BRNO 3 FAKULTNÍ NEMOCNICE BRNO, KLINIKA DùTSKÉ ONKOLOGIE, âERNOPOLNÍ 9, BRNO

Souhrn V˘chodiska: Akutní lymfoblastická leukémie je nejãastûji diagnostikovanou malignitou dûtsk˘ch pacientÛ v âes- ké republice. V posledních desetiletích byl uãinûn neb˘val˘ pokrok v její léãbû, k nûmuÏ bezesporu napomohla i fiada poznatkÛ t˘kající se molekulárních charakteristik onemocnûní. Anal˘za expresních profilÛ pomocí „Arrays“ (ãipÛ) se stala jednou z v˘znamn˘ch metod pfii identifikaci potenciálních markerÛ onemocnûní, které by umoÏnily bliÏ‰í charakterizaci nádorov˘ch bunûk a pfiispûly k porozumûní procesu vzniku leukémie i stratifikace léãby. Metody a v˘sledky: V rámci studie byl sledován vliv methotrexátu na expresi genÛ p53-signální dráhy u maligních blastÛ izolovan˘ch z kostní dfienû dûtsk˘ch pacientÛ s akutní leukémií. Zmûny exprese genÛ byly detekovány pomo- cí „GEArray Q series Human p53 Signalling Pathway Gene Array“. Porovnáním získan˘ch expresních profilÛ jednotliv˘ch pacientÛ byly pozorovány odli‰né hladiny exprese sledovan˘ch genÛ u kontrolních bunûk, taktéÏ zmûny transkripãní aktivity vlivem methotrexátu byly rÛznorodé. Kromû jin˘ch do‰lo vlivem methotrexátu k v˘razn˘m zmûnám transkripce genÛ uplatÀující se pfii apoptóze ãi regulaci bunûãného cyklu. Zmûny exprese nûkter˘ch genÛ byly nalezeny u více pacientÛ, fiada ostatních se v‰ak projevila individuálnû, nezávisle na typu onemocnûní. Závûry: Byly detekovány zmûny v expresi fiady genÛ p53-signální dráhy u maligních blastÛ kultivovan˘ch ex vivo s methotrexátem. Odli‰né hladiny exprese genÛ potvrzují znaãnou heterogenitu dûtsk˘ch leukémií, projevující se v na‰em souboru v expresních profilech a ve zpÛsobu bunûãné odpovûdi na pfiítomnost methotrexátu, jejichÏ dÛsled- kem mÛÏe b˘t rÛzná míra citlivosti k aplikovaná látce a také rÛzná odpovûì pacienta na terapii.

Klíãová slova: cDNA array, leukémie, p53, methotrexát

Summary Backgrounds: Acute lymphoblastic leukemia is the most frequent malignancy diagnosed in children in the Czech Republic. During last few decades, considerable progress in the treatment had been made and it was similarly con- tributed by many findings on the molecular basis of the disease. Expression profiling analysis using Macro or Mic- ro Arrays has become an important technique to identify potential markers of the disorder, which might characterise malignant cells and help in the understanding of development of leukaemia and treatment stratification. Methods and Results: In the present study, the effect of methotrexate on the expression of p53-signalling pathway genes was investigated in malignant blasts isolated from the bone marrow of patients with acute leukemia. Expression variations were detected using „GEArray Q series Human p53 Signalling Pathway Gene Array“. Having drawn a comparison between expression profiles, variable gene expression levels in the control cells; like- wise various transcription activity alterations were observed. Significant changes in the transcription were found among genes involved in the of apoptosis or cell cycle regulation. Regarding some genes, changes in expression were observed in more that one patient. However, the expression levels of most other genes varied individually, independently on the subtype of the disease. Conclusions: Changes in the expression of p53-signalling pathway genes were detected in the malignant blasts cultivated ex vivo with methotrexate. Different levels of the transcription in our series confirm heterogeneity of childhood leukemias, where patients with the same diagnosis do not need to share identical gene expression profiles even the manner of cellular response on the presence of methotrexate, resulting in the various level of perceptiveness to the medication and in the final response to the therapy.

Keywords: cDNAarray, leukemia, p53, methotrexate

Úvod ní lymfoblastická leukémie (ALL) (1). Jedná se o nádorové Leukémie je nejãastûj‰ím nádorov˘m onemocnûním dûtí onemocnûní krvetvorné tkánû, které vzniká maligní transfor- v âeské republice a tvofií asi 30-35 % v‰ech zhoubn˘ch nádo- mací kmenové buÀky lymfatické fiady. Vedle kostní dfienû rÛ. Leukémií v na‰í republice onemocní kaÏd˘ rok asi 80 - 90 a krve v‰ak mohou leukemické buÀky pronikat do dal‰ích tká- dûtí, pfiiãemÏ u pfieváÏné ãásti z nich je diagnostikována akut- ní a orgánÛ jako jsou mízní uzliny, slezina, játra, ledviny, CNS.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 407 Podle fenotypu je ALL rozli‰ována na leukémii z B-prekur- Materiál a metody zorÛ, která tvofií asi 85 % v‰ech pfiípadÛ a leukémii z T-pre- Od pacientÛ léãen˘ch na Klinice dûtské onkologie FN Brno kurzorÛ (15 % pfiípadÛ) (2). s diagnózou akutní lymfoblastické leukémie (ALL) a akutní Stejnû jako u solidních nádorÛ je i pro vznik leukémie nezbyt- myeloidní leukémie (AML) byly získány vzorky kostní dfie- n˘ vût‰í poãet genetick˘ch zmûn, které jako dÛsledek nestabi- nû, ze kter˘ch byly izolovány maligní blasty pomocí systému lity genomu buÀce propÛjãují odli‰né „v˘jimeãné“ neÏádoucí Lymphoprep (Axis-Shield). Blasty byly pfievedeny do RPMI vlastnosti, vymykající se bûÏnému Ïivotu buÀky. Zde je moÏ- média (Sigma) s obsahem 5- methyltetrahydrofolátu o v˘sled- no jmenovat aberantní exprese protoonkogenÛ, chromozo- né koncentraci 25 nM a následnû kultivovány se 40 μM met- mální translokace dávající vznik fúzním genÛm, hyperploidie. hotrexátem ãi s DMSO jako kontrola po dobu 24 hod. BuÀky Jejich dÛsledkem jsou pozmûnûné vlastnosti kmenov˘ch bunûk byly sklizeny a pelety uchovány pfii -80 °C. Z blastÛ byla izo- vedoucí k jejich abnormální proliferaci, blokované diferenci- lována celková RNA pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen) nebo aci a necitlivost k proapoptick˘m signálÛm (3). V léãbû akut- TriReagent (MRC). ní lymfoblastické leukémie byl za posledních nûkolik deseti- Exprese p53-signálních genÛ byla sledována pomocí GEAr- letí uãinûn neb˘val˘ pokrok a ve vyspûl˘ch centrech dûtské ray Q series Human p53 Signalling Pathway Gene Array onkologie je dnes dosahováno dlouhodob˘ch remisí u více neÏ (SuperArray Bioscience Corporation). Produkt je navrÏen pro 80 % dûtí s ALL (4, 5). K pokroku v léãbû nepochybnû pfii- studium panelu 96 genÛ spojen˘ch se signální dráhou protei- spûlo také intenzivní studium molekulárních charakteristik leu- nu p53, podle vztahu k p53 jsou geny rozdûleny do nûkolika kemick˘ch bunûk prohlubující celkové znalosti o daném one- funkãních skupin (Tabulka 1). Izolovaná celková RNA byla mocnûní. naznaãena biotinem v procesu reverzní transkripce pomocí Biologické chování buÀky je do jisté míry dáno profilem MMLV-reverzní transkriptázy (Promega) a získaná cDNA exprimovan˘ch genÛ. Studium buÀky na úrovni RNA umoÏ- následnû pouÏita jako hybridizaãní sonda. Pfii hybridizaci se Àuje sledovat její aktuální stav, kter˘ je v˘razem nesãetn˘ch sonda specificky váÏe na komplementární sekvence jednotli- bunûãn˘ch signálÛ vedoucích právû k expresi vybran˘ch genÛ. v˘ch genÛ, ukotvené v pfiesnû definovan˘ch pozicích na Technologie zaloÏené na principu ãipÛ umoÏÀují anal˘zu komerãnû dodávané membránû. Pozitivní signály na mem- exprese a transkripãní aktivity stovek (makroãipy) aÏ nûkoli- bránû jsou detekovány na principu chemiluminiscence. Míra ka tisícÛ (mikroãipy) genÛ najednou (6, 7). S jejich pomocí lze exprese jednotliv˘ch genÛ byla hodnocena jako intenzita sig- sledovat transkripãní aktivitu skupiny genÛ v nejrÛznûj‰ích nálÛ pomocí programu TotalLab 2003 (Nonlinear USA Inc) biologick˘ch systémech a za rÛznû definovan˘ch podmínek. a normalizována vzhledem k expresi genu GAPDH kódující- âipové technologie jsou vyuÏívány i pfii studiu maligních trans- ho glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu. Princip metody formací a fie‰ení problematiky nádorov˘ch onemocnûní, leu- znázorÀuje Obrázek 1. Získaná data byla statisticky analyzo- kémie nevyjímaje. Anal˘za transkripãní aktivity ‰irokého vána v programu Statistica Cz7 (StatSoft) za pouÏití Wilco- spektra genÛ a srovnávání expresních profilÛ je v˘chozí pfii xonova testu s hladinou v˘znamnosti p < 0,05. odhalování jednotliv˘ch genÛ a jimi kódovan˘ch proteinÛ jako Celkovû byla exprese p53-signálních genÛ byla hodnocena potenciálních markerÛ diagnózy ãi následné prognózy one- u 12 pacientÛ trpících ALL, z toho u 10 pfiípadÛ ALL B-fiady mocnûní (8, 9). Expresní anal˘za umoÏÀuje odli‰it akutní mye- (B1 aÏ 10) a 2 pfiípadÛ T-ALL (T1, 2), a u 2 pacientÛ trpících loblastickou leukémii od akutní lymfoblastické leukémie (10) AML (AML1, 2). ãi blíÏe klasifikovat akutní lymfoblastickou leukémii u dûtí (11). Odli‰né genetické abnormality maligních bunûk v kombi- Tabulka 1.: Geny analyzované z hlediska jejich exprese pomocí naci s typem leukémie a fiadou dal‰ích sledovan˘ch znakÛ GEArray Q series Human p53 Signalling Pathway Gene Array mohou b˘t spojeny s rÛznou mírou citlivosti bunûk k apliko- vané léãbû (12). Na základû identifikace klíãov˘ch genÛ je p53 rodina: TP53, TP63, TP73 moÏno dále sledovat v˘voj onemocnûní (13), studovat pfií- Geny ovlivÀující p53: slu‰né signální dráhy vybran˘ch genÛ, a to v‰e s cílem pfiispût Exprese a stabilita p53: BZRP (pBR), CREBBP (CBP), D5S346 (DP1), k porozumûní procesu vniku leukémie, k v˘voji nov˘ch pre- E2F1 (E2F), EP300 (p300), MDM2, MTBP, NFKB1, parátu a tím k efektivnûj‰í léãbû onemocnûní. NUMB V rámci studie byl pomocí cDNA GEArray sledován vliv Modifikace p53: ATM, ATR, CCNH (cyclin H), CDK7 (CAK), CHEK1 methotrexátu na transkripãní aktivitu genÛ p53-signální dráhy (Chk1), CHEK2 (Chk2), CREBBP (CBP), CSNK1A1 u maligních blastÛ dûtsk˘ch pacientÛ trpících akutní leukémií. (CK1), CSNK2A1, CSNK2A2, CSNK2B, EP300 (p300), Methotrexát je jiÏ po nûkolik desetiletí nejãastûji pouÏívan˘m HIPK2, KIP2, KIP3, MAP2K4, MAP2K7, MAPK8IP2, antifolátem pfii léãbû pacientÛ trpících akutní leukémií (14, 15). PCAF, PML, PRKCA, PRKCB1, PRKCG, PRKCQ, PÛsobí jako siln˘ inhibitor enzymu dihydrofolátreduktázy PRKDC (DNA-PK), SIRT1 a naru‰uje tak bunûãn˘ metabolismus folátÛ, metabolity Interakce s p53: APEX (Ref-1), BAP1, BRAP, BRCA1, CDKN2A methotrexátu pak pfiímo blokují aktivitu dal‰ích enzymÛ podí- (p14ARF), E1B-AP5 (E1B55K), E2F1, MDM2, MYC, lejících se na syntéze purinÛ a pyrimidinÛ (16). Koneãn˘m RASA1 (Ras), RB1 (pRB), TEAD1 (SV40), WRN, WT1 dÛsledkem je celkov˘ útlum syntézy DNA v buÀce (17). Pfii Geny ovlivnûné p53: léãbû akutní lymfoblastické leukémie je methotrexát apliko- Bunûãn˘ cyklus: ABCB1 (MDR1), ACTA1 (actin), AD022, APR-3, 2 ván v dávkách 12 aÏ 36000 mg/m , pfiesné mnoÏství a interval CDC2, CDKN1A (P21Waf1), DAXX, ESR1, FADD, dávkování jak methotrexátu, tak leukovorinu je definováno FAF1, GADD45A, GTSE1 (B99), HIF1A, HSPA4 (Hsp70), specifick˘mi léãebn˘mi protokoly jednotliv˘ch kooperativ- LRDD, MAP4, NDRG (RTP), PIG8 (E124), PMP22, ních skupin (18). Chemoterapie zahrnující methotrexát vyka- RELA, REPRIMO, SFN (14-3-3), SP1, STAT5A, TBP, zuje vy‰‰í efektivitu pfiedev‰ím u pacientÛ trpících akutní lym- THRA, TNFAIP1, TNFSF6, TP53TGI, TRAF1, TRAF4, foblastickou leukémií typu B (19). BuÀky B- ALL prokazují vy‰‰í citlivost k methotrexátu neÏ T-ALL buÀky (20, 21). Roz- TRAF5, WIG1 díly mezi nimi byly nalezeny v intenzitû transportu methotre- Apoptóza: APAF1, BAX, BBC3 (PUMA), BCL2, CASP9 (Caspase-9), xátu do bunûk, v aktivitû metabolizujících enzymÛ ãi v afini- CTSD (Cathepsin D), LRDD (PIDD), P53AIP1, PMAIP1 tû metabolitÛ methotrexátu k cílov˘m molekulám (21). (NOXA), PMP22 (GAS-3), TNF, TNFRSF10B Mechanismus odpovûdi leukemick˘ch bunûk na terapii (Killer5/DR5), TNFSF6 (Fas), TP53BP2 (ASPP2) methotrexátem není doposud zcela objasnûn, pfiispívá k tomu Reparace DNA: GADD45A, RRM2B (p53R2) i mnoÏství a variabilita genetick˘ch zmûn podílejících se na Angiogeneze a tvorba metastáz: BAI1, SERPINB5 (Maspin), THBS1 vzniku leukémie. (TSP1)

408 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Tabulka 2.: Exprese vybran˘ch genÛ p53-signální dráhy u jednotliv˘ch pacientÛ vyjádﬁená procentuálnû vzhledem k expresi genu GAPDH. K: kon- trolní blasty kultivované bez methotrexátu, ME: blasty kultivované s methotrexátem.

Obrázek 1.: Princip metody cDNA GEArray. pÛsobícího jako inhibitor apoptózy (23), byla taktéÏ nízká, pfií- padnû poklesla vlivem methotrexátu. Dále byly zaznamenány individuální zmûny v expresi proapoptick˘ch genÛ PIDD, NOXA, APAF- 1, ASPP2 a genÛ FADD, FAF1 a HIF1A uplat- Àujících se kromû apoptózy i pfii regulaci bunûãného cyklu. Byla pozorována pouze bazální transkripãní aktivita TP53 a vlivem methotrexátu se v˘raznû nemûnila. U nûkter˘ch pacientÛ v‰ak do‰lo ke zmûnám exprese v genu kódujícího protein MDM2, kter˘ je negativním regulátorem endogenní hladiny proteinu p53 (24). Methotrexát taktéÏ ovlivnil transkripãní aktivitu genÛ, jejichÏ produkty se uplatÀují pfii regulaci bunûãného cyklu. U blastÛ kultivovan˘ch s methotrexátem rostla u nûkter˘ch paci- entÛ exprese p21Waf1/Cip1, kódujícího inhibitor cyklin-depen- dentních kináz (25, 26) a ARF (p14), jehoÏ produkt se váÏe na MDM2 a podporuje jeho degradaci (27). U pacienta B1 byl zaznamenán v˘razn˘ vzestup exprese MTBP, jehoÏ produkt mÛÏe navodit zástavu bunûãného cyklu v G1 fázi nezávisle na p53 (28). Celkové zv˘‰ení exprese skupiny genÛ pfiispívající k zástavû bunûãného cyklu bylo pozorováno upacientÛ B1, B2, B6, B7 a AML1, útlum exprese naopak u pacientÛ B4, B5, a B9. Vysoké hladiny exprese a individuální zmûny byly prokázány u genÛ kódujících produkty spojené s modifikací p53: JNKK2, V˘sledky a diskuse CSNK1A1, SIRT1 nebo HIPK2, kódující kinázu, která stabi- Pfii porovnání expresních profilÛ byly zji‰tûny rozdílné hladi- lizací p53 ãi negativní regulací MDM2 pfiispívá k indukci apo- ny exprese jednotliv˘ch genÛ v kontrolních buÀkách, taktéÏ ptózy ãi zástavû bunûãného cyklu (29). Individuální zmûny míra odpovûdi bunûk na pÛsobení methotrexátu se mezi paci- exprese po vystavení bunûk methotrexátu byly detekovány enty li‰ila. U v‰ech pacientÛ bylo moÏné sledovat zmûny i u fiady transkripãních faktorÛ ãi vazebn˘ch proteinÛ (SP1, v expresi genÛ uplatÀujících se v procesu apoptózy. Pacienti EP300). V˘sledky expresní anal˘zy vybran˘ch p53-signálních B1, B2, B6, B8 a AML1 se vyznaãovali statisticky v˘znam- genÛ u jednotliv˘ch pacientÛ uvádí Tabulka 2. n˘m nárÛstem exprese proapoptick˘ch genÛ. Opaãn˘ úãinek V rámci vy‰etfiovaném souboru byly nalezeni pacienti (B1, B2, methotrexátu u dané skupiny genÛ byl zji‰tûn u pacientÛ B5 B6), u nichÏ methotrexát navodil zv˘‰enou expresi genÛ a B9. Silná transkripãní aktivita v kontrole i po podání methot- indukujících apoptózu a zástavu bunûãného cyklu. Naopak rexátu byla zaznamenána u genu BBC3, kódující protein u pacientÛ B5 a B9 byl zaznamená opaãn˘ efekt vedoucí k cel- PUMA, kter˘ vazbou na BCL2 indukuje uvolnûní cytochro- kovému poklesu transkripãní aktivity sledovan˘ch genÛ. Kli- mu c z mitochondrií a následnû apoptózu (22). V˘razn˘ nárÛst nické údaje t˘kající se prÛbûhu léãby v souãasnosti nebyly exprese BCL2 vazebného proteinu BAX byl pozorován u pac- dostupné u v‰ech sledovan˘ch pacientÛ a celkové hodnocení ienta B1, u ostatních se hladina exprese po methotrexátu zv˘‰i- získan˘ch v˘sledkÛ v souvislosti s úspû‰ností léãby bude vyÏa- la jen mírnû a zÛstávala celkovû nízká. Hladina exprese BCL2, dovat del‰í ãasov˘ odstup.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 409 Cílem studie bylo zjistit, zda methotrexát navozuje zmûny si genÛ p53-signální dráhy bude dále moÏno studovat pomocí exprese signálních genÛ p53 a popfiípadû vytipovat geny, kte- OligoGEAray, zaloÏeného na obdobném principu. ré by pfiispûly k charakterizaci onemocnûní ãi sledování jeho prÛbûhu a odpovûdi pacienta na léãbu. Na základû anal˘zy Závûr vzorkÛ 15 pacientÛ v‰ak nebyl nalezen gen, jehoÏ transkripã- Z v˘sledkÛ studie vypl˘vá, Ïe u maligních blastÛ kultivova- ní aktivita by byla obdobná u v‰ech pacientÛ. ¤ada genÛ byla n˘ch s methotrexátem skuteãnû dochází ke zmûnám exprese exprimována s vysokou intenzitou, taktéÏ zmûny exprese vli- nûkter˘ch genÛ p53-signální dráhy. Heterogenní expresní pro- vem methotrexátu byly v nûkter˘ch pfiípadech velmi v˘razné. fily kontrolních bunûk a bunûk kultivovan˘ch ex vivo s met- Jednotliví pacienti se v‰ak mezi sebou li‰ili jak ve spektru sil- hoterxátem odráÏejí odli‰ná genetická pozadí kaÏdého paci- nû exprimovan˘ch genÛ, tak i ve spektru zmûn exprese a jejich enta a odli‰n˘ zpÛsob odpovûdi jednotlivcÛ na pfiítomnost intenzitû. Tato variabilita je potenciálním dÛsledkem odli‰né- antifolátu. Tato skuteãnost je plnû v souladu se souãasn˘m ho genetického pozadí kaÏdého pacienta, které ovlivÀuje trendem biomedicínského v˘zkumu, kter˘ smûfiuje k vytvofie- i bunûãnou odpovûì na pfiítomnost cytostatika. ní personalizované medicíny, kde medikamentózní léãba bude Technologie cDNA Array pouÏitá v rámci studie je varianta cílena na fyziologické a genetické pozadí pacienta. expresní anal˘zy finanãnû ménû nároãná, která taktéÏ nevy- Byla pozorována indukce exprese genÛ, jejichÏ produkty se Ïaduje speciální a nákladné pfiístrojové vybavení. Je koncipo- úãastní regulace apoptózy a bunûãného cyklu a které by tak vána pro studium uÏ‰í skupiny genÛ (96 genÛ), pfiesnûji genÛ mohly hrát v˘znamnou roli pfii eliminaci maligní bunûãné vybrané signální dráhy a v˘bûr produktu je moÏno jednodu- populace. Pro zhodnocení vztahu vytipovan˘ch genÛ k met- ‰eji orientovat v závislosti na sledovaném problému ãi studo- hotrexátu by v‰ak bylo potfieba je‰tû více roz‰ífiit soubor ana- vaném systému. StûÏejním krokem je izolace celkové RNA lyzovan˘ch vzorkÛ a studovat tyto geny také z hlediska jimi jako v˘chozího materiálu pro syntézu znaãené cDNA sondy. kódovan˘ch proteinÛ a jejich interakcí. Poznatky o pÛsobe- Úspû‰nost izolace v tomto pfiípadû závisela pfiedev‰ím na obje- ní methotrexátu by dále mohly b˘t roz‰ífieny o anal˘zu zmûn mu sedimentu kultivovan˘ch blastÛ, jejich mnoÏství izolova- exprese genÛ jin˘ch signálních drah, pro které v˘robce dodá- ná ze vzorku kostní dfienû v‰ak nebyla vÏdy dostaãující, coÏ vá taktéÏ komerãnû pfiipravené membrány typu „GEArray bylo jedením z faktorÛ limitující poãet doposud vy‰etfien˘ch Q series Array“ nebo „Oligo GEArray Microarray“. Budou- pacientÛ. S koncem roku 2005 firma SuperArray Bioscience cí v˘sledky získané expresní anal˘zou dal‰ích pacientÛ by Corporation ukonãila v˘robu doposud pouÏívaného produktu tak mohly pfiispût k hodnocení citlivosti a individuální míry „GEArray Q series Human p53 Signalling Pathway Gene Ar- odpovûdi pacientÛ na terapii methotrexátem. ray“ a nahradila jej distribucí produktu „Oligo GEArray Human p53 Signalling Pathway Microarray“. Poãet analyzo- Podûkování van˘ch vzorkÛ, roz‰ifiující stávající v˘sledky (30), byl ome- Práce byla podpofiena z finanãních zdrojÛ IGA MZ âR No. zen poãtem dostupn˘ch membrán pÛvodního produktu. Expre- NR8338- 3/2005 a MZO 000209805.

Literatura 17. Olsen EA. The pharmacology of methotrexate. J Am Acad De rmatol 1991; 1. Mali‰ J, Klener P. Nádorová onemocnûní dûtského vûku. In : Klener P, ed. 25:306-318. Klinická onkologie. Galén, 2002:607-630. 18. Minnaur NJ, Kounali D, Vedi S et al. Methotrexate in the treatment of rhe- 2. Star˘ J. Moderní léãba dûtské leukémie je pﬁedev‰ím ambulantní. Vox Pedi- umatoid arthritid. II. In vivo effects on bone mineral density. Rheumato- atriae 2003; 3:16-20. logy 2002; 41:741-749. 3. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 20 00; 100:57- 19. Evans WE, Relling MV, Rodman JH et al. Conventional compared with 70. individualized chemotherapy for childhood acute lymphoblastic leukemia. 4. Pui CH, Relling MV, Campana D, ·vand WE. Childhood acute lymphob- N Engl J Med 1998; 8:499-505. lastic leukemia. Rev Clin Hematol 2002; 6:161-180. 20. Galpin AJ, Schuetz JD, Masson E et al. Differences in fo lylpolyglutama- 5. Star˘ J. Historie a souãasnost léãby akutní lymfoblastické leukémie u dûtí. te synthetase and dihydrofolate reductase expr ession in human B-lineage Trans Hemat dnes 2005; 11:170-175. versus T-lineage leucemic lymphoblasts: mechanism for lineage differen- 6. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of ces in methotrexate polyglutamylation and cytotoxicity. Mol Pharmacol gene expression patterns with complementary DNA m icroarray. Science 1997; 52:155-1 63. 1995; 270: 467-470. 21. Rots MG, Pieters R, Peters GJ et al. Role of folylpolyglutamate syntheta- 7. Diehn M, Alizadeh AA, Brown PO. Examining the living genome in health se and folylpolyglutamate hydrolase in methotrexate accumulation and and disease with DNA microarrays. JAMA 2000; 2 83:2298-2299. polyglutamylation an childhood leukemia. Blood 1999; 93:1677-1683. 8. Nasedkina TV, Zharinov VS, Isaeva EA et al. Clinical screening of gene 22. Yu J, Zhang L, Hwang PM et al. PUMA induces the rapid apoptosis of colo- rearrangements in childhood leukemia by using a multiplex polymerase rectal cancer cells. Molec Cell 2001; 7:673-6 82. chain reaction-microarray approach. Clin Cancer Res 2003; 9:5620-5629. 23. Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with 9. Bruchova H, Kalinova M, Brdicka R. Array-based analysis of gene expres- a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell sion in childhood acute lymphoblastic leukemia . Leuk Res 2004; 28:1-7. 1993; 74:609-619. 10. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P et al. Molecular classific ation of can- 24. Kubbutat MH, Jones SN, Vousden KH. Regulation of p53 stability by cer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Mdm2. Nature 1997; 387:299-303. Science 1999; 286:531-537. 25. el-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE et al. WAF1, a potential mediator 11. Yeoh EJ, Ross ME, Shurtleff SA et al. Classification, subtype discovery, of p53 tumor suppression. Cell 1993; 75:817-8 25. and prediction of outcome in pediatric acut e lymphoblastic leukemia by 26. Harper JW, Adami GR, Wei N et al. The p21 Cdk-interactin g protein Cip1 gene expression profiling. Cance r Cell. 2002; 1:133-143. is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell 1993; 75:805- 12. Belkov VM, Krynetski EY, Schuetz JD et al. Reduced folat e carrier expres- 816. sion in acute lymphoblastic leukemia: a mech anism for ploidy but not line- 27. Zhang Y, Xiong Y, Yarbrough WG. ARF promotes MDM2 degrad ation age differences in methotrexate accumulation. Blood 1999; 93:1643-1650. and stabilizes p53: ARF-INK4a locus deletion impairs both the Rb and p53 13. Chen JS, Coustan-Smith E, Suzuki T et al. Identification of novel markers tumor suppression pathways. Cell 1998; 92 :725-734. for monitoring minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. 28. Boyd MT, Vlatkovic N, Haines DS. A novel cellular protei n (MTBP) binds Blood 2001; 97:2115-2120. to MDM2 and induces a G1 arrest that is suppressed by MDM2. J Biol 14. Farber S, Diamond LK, Mercer RD et al. Temporary remission on acute Chem 2000; 275:31883-31890. leukemia in children produced by folic acid antagonists, 54-aminoptero- 29. Di Stefano V, Mattiussi M, Sacchi A, D’Orazi G. HIPK2 inhibits both ylglutamic acid (aminopterin). N Eng J Med 1948; 238:778-793. MDM2 gene and protein by, respectively, p53-dependent and independent 15. Bertino JR. Karnofsky memorial lecture. Ode to methotrexate. J Clin Onkol regulations. FEBS Lett 2005; 579:5473- 80. 1993; 11:5-14. 30. Hrstka R, Muller P, Vojtû‰ek B et al. Anal˘za zmûn exprese p53-signál- 16. Miller GP, Benkovic SJ. Stretching exercises—flexibility in dihydrofola- ních genÛ v buÀkách akutní lymfoblastické leukémie v závislosti na pÛso- te reductase catalysis. Chem Biol 1998; 5: R1 05-R113. bení methotrexátu. Klinická onkologie 2005; 18:64-68.

410 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 ARRAY COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDISATION AS A TOOL FOR A RAPID MAPPING OF BREAKPOINTS IN UNBALANCED TRANSLOCATIONS IN LEUKEMIA

ARRAY KOMPARATIVNÍ GENOMICKÁ HYBRIDIZACE JAKO NÁSTROJ PRO RYCHLÉ MAPOVÁNÍ ZLOMOV¯CH MÍST NEBALANCOVAN¯CH TRANSLOKACÍ U LEUKÉMIÍ

POSPÍ·ILOVÁ H.1,2, MORZUCH L.1, JARO·OVÁ M.2, VANDENBERGE P.1, WLODARSKA I.1

1DEPARTMENT OF HUMAN GENETICS, CATHOLIC UNIVERSITY OF LEUVEN, LEUVEN, BELGIUM 2DEPARTMENT OF HEMATO-ONCOLOGY, PALACK¯ UNIVERSITY, OLOMOUC, CZECH REPUBLIC

Summary Background: Chromosomal translocations involving immunoglobulin loci (14q32/IGH, 2p11/IGK and 22q11/IGL) play an important role in pathogenesis of B cell leukemia and lymphoma. These aberrations lead to deregulated transcription of targeted oncogenes by their juxtaposition with the IGH transcriptional enhancer(s). Fluorescent in situ hybridization (FISH) showed to be a potential tool for identification of cancer-related genes located in breakpoint regions of chromosomal translocations. However, the commonly used „probe-mapping“ FISH strategy requires numerous experiments with consecutively selected probes from the narrowed down region and uses a significant amount of cytogenetic material. One of the alternative approaches, array comparative genomic hybridisation (aCGH), is a rapid technique that operates on DNA level and uses only a small amount of tumor material. In contrast to FISH, however, it analyzes only unbalanced aberrations. The aim of this study was to evaluate array comparative genomic hybridisation (aCGH) as a potential tool for a rapid mapping of breakpoint of non- reciprocal IGH-associated translocation in B cell leukemia and lymphoma. Material and methods. For this study, we selected one case of B cell chroniclymphocytic leukemia (CLL) with a complex karyotype including unbalanced der(14)t(1;14)(q25;q32) involving IGH. Genomic profiling of this case was performed using 1 megabase (Mb) aCGH. Validation of aCGH results was done by metaphase FISH with Bacterial Artificial Chro- mosome (BAC) clones and chromosome painting probes. Results and conclusions. In one single aCGH experiment eight regions of genomic imbalances (4 gains and 4 losses) were identified. As expected, these imbalances included also duplication of 1q due to the der(14)t(1;14). Two consecutive BAC clones flanking the proximal breakpoint at 1q21.3 have been identified. These clones were further applied for metaphase FISH analysis that confirmed aCGH findings. Despi- te of 1 Mb resolution of the applied platform, these particular clones are separated by approximately 3 Mb. Given that this region is gene-rich, further BAC-mapping is required to identify the candidate gene located in the breakpoint region. Moreover, aCGH data helped us to correct original cytogenetic findings and precisely define karyotypic changes in this case. Our data provide additional evidence that aCGH is a powerful technique for molecular karyotyping of tumors and allows a rapid mapping of genomic imbalances, including breakpoints of non-reciprocal translocations. As shown in this study, the latter can be detected with high accuracy and sensitivity during a single experiment.

Keywords: array comparative genomic hybridisation, aCGH, unbalanced translocation, oncogene, IGH, chronic lymphocytic leukemia

Souhrn V˘chodiska: Chromosomální translokace zahrnující imunoglobulinové lokusy (14q32/IGH, 2p11/IGK a 22q11/IGL) hrají dÛleÏitou roli v patogenezi B-bunûãn˘ch leukémií a lymfomÛ. Jejich v˘sledkem je dere- gulace transkripce onkogenÛ zahrnut˘ch do tûchto translokací, která je zpÛsobená jejich juxtapozicí s IGH transkripãními enhancery. Pro identifikaci nádorov˘ch genÛ lokalizovan˘ch v blízkosti zlomov˘ch míst chromosomov˘ch translokací lze pouÏít fluorescenãní in situ hybridizaci (FISH). Nicménû bûÏnû uÏívaná mapo- vací strategie metodou FISH vyÏaduje velk˘ poãet experimentÛ se sondami vybran˘mi ze zkoumané oblasti a spotfiebuje znaãné mnoÏství cytogeneticky zpracovaného nádorového materiálu. Jedním z alternativních pfiístupÛ je array komparativní genomická hybridizace (aCGH), rychlá technika na úrovni DNA, která pou- Ïívá jen malé mnoÏství nádorového materiálu. Narozdíl od metody FISH v‰ak dovoluje urãit pouze neba- lancované zmûny. Cílem této práce bylo ukázat, Ïe aCGH je efektivní nástroj k rychlému mapování zlomo- v˘ch míst nereciprok˘ch IGH translokací u B-bunûãn˘ch leukémií a lymfomÛ. Materiál a metody. Pro tuto studii jsme vybrali jednoho pacienta s B-bunûãnou chronickou lymfocytární leu- kémií (CLL) s komplexním karyotypem a nebalancovanou translokací der(14)t(1; 14)(q25;q32) zahrnující IGH. Ke genomickému profilování tohoto pfiípadu jsme pouÏili metodu aCGH s rozli‰ením 1 megabáze (Mb). Validace v˘sledkÛ aCGH byla provedena pomocí metafázové FISH s BAC klony a celochromosomov˘mi malovacími sondami. V˘sledky a závûry. Bûhem jednoho aCGH experimentu bylo identifikováno osm abe- rantních oblastí (4 zmnoÏení a 4 ztráty genetického materiálu). Podle na‰eho oãekávání tyto abnormality

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 411 zahrnovaly také duplikaci 1q zahrnuté do tranlokace der(14)t(1;14). Byly identifikovány dva po sobû násle- dující BAC klony ohraniãující zlomové místo v oblasti 1q21.3. Tyto klony byly posléze pouÏity pro meta- fázovou FISH, která potvrdila aCGH nález. Navzdory 1 Mb rozli‰ení pouÏitého chipu, byly od sebe tyto dva konkrétní klony oddûleny oblastí pfiibliÏnû 3 Mb velkou. Vzhledem k tomu, Ïe v této oblasti se vyskytuje velké mnoÏství genÛ, je k identifikaci kandidátního genu leÏícího v oblasti zlomu nezbytné dal‰í mapování za pomocí BAC klonÛ. aCGH v˘sledky nám navíc pomohly opravit pÛvodní cytogenetick˘ nález a pfiesnû urãit zmûny karyotypu u tohoto pacienta. Na‰e data poskytují dal‰í dÛkaz toho, Ïe aCGH je efektivní technika pro molekulární karyotypování nádorÛ a umoÏÀuje rychlé mapování genomick˘ch zmûn, vãetnû zlomov˘ch míst nereciprok˘ch translokací. Ty mohou b˘t detekovány s vysokou pfiesností a citlivostí bûhem jediného experimentu, jak ukazuje na‰e práce.

Klíãová slova: array komparativní genomická hybridizace, aCGH, nebalancované translokace, onkogen, IGH, chronická lymfocytární leukémie

INTRODUCTION Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB, Leuven, Molecular cytogenetic techniques including FISH and aCGH Belgium). Genomic DNA was extracted according to stan- are potential tools used to unravel tumor-associated chro- dard procedures. Test and reference gDNA were labeled by mosomal aberrations. They offer precise molecular karyoty- a random prime labeling system (BioPrimeR Array CGH ping with a much higher resolution that conventional ban- Genomic Labeling Module, Invitrogen, Carlsbad, CA) with ding analysis. Among others, FISH has been succesfully Cy3-/Cy5-labeled dCTPs (Amersham Biosciences, Pisca- applied for mapping of translocation breakpoints and identi- taway, NJ). Probe preparation, preblocking of the slide, hyb- fication of targeted genes. This strategy, however, requires ridization and posthybridisation washes were performed selection of numerous DNA probes from the presumably with small modifications as described previously (3, 4). Sli- involved region and several rounds of experiments before the des were scanned using GenePix 4000B scanner (Axon breakpoint region will be narrowed down to <1 Mb. Usual- Instruments, Foster City, CA), image and data analysis was ly this procedure is labourious and time- and material-con- done using GenePix Pro 6.0 (Axon Instruments) and Excel suming. Array comparative genomic hybridisation (aCGH) (Microsoft Inc., Diegem, Belgium). Data were normalized enables rapid and efficient mapping of genomic imbalances by dividing the fluorescent intensity ratio of each spot by (including unbalanced translocations) in one reaction at a the mean of the ratios of the autosomes. The normalized resolution given only by the size and density of clones on the ratio values of the duplicates were averaged and a log2 value array (1). By principle, this technique does not operate in was calculated. For detection of copy number alterations cases with balanced rearrangements. we determined our thresholds as 0.3 for gains and -0.3 for The aim of this study was to evaluate aCGH as a tool to iden- losses. tify putative oncogenes located in the breakpoint regions of non-reciprocal IGH/14q32-associated translocations in B cell Interphase/metaphase FISH leukemia and lymphoma. It is well known that these, usually BAC/PAC clones, RP4-790G17 (148,42-148,56 Mb) and reciprocal, translocations result in deregulated transcription of RP11-216N14 (151,95-152,11 Mb), were labeled in Spectrum affected oncogenes by bringing them in the vicinity of regula- Green and Spectrum Orange, respectively and used for FISH. tory sequences of IGH. Thus, hypothetically, each gene affec- We selected them from the 1Mb Clone Set (Welcome Trust ted by 14q32/IGH translocation can be consider as a putative Sanger Institute, UK) used for arrays. Other applied probes oncogene. included LSI IGH, WCP 2 (Vysis Inc, IL, USA), WCP7 and To evaluate potential of aCGH in a rapid mapping of break- WCP 8 (Cambio Ltd, Cambridge, UK) and break- apart IG points of IGH-associated translocations, we selected one case kappa assay (5). BAC DNA was labeled by a random prime of B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) with unba- reaction (RadPrime DNA labeling system, Invitrogen) with lanced der(14)t(1;14)(q25;q32) and other complex chromoso- Spectrum Orange/Green d-UTPs (Vysis Inc.) according to mal changes. Results of our studies are shown and discussed manufacturers protocols. below. FISH experiments were evaluated using the Axioplan 2 fluorescence microscope equipped with the charge-coupled devi- MATERIAL AND METHODS ce Axiophot 2 camera (Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germa- Patient ny) and the MetaSystems Isis imaging system (MetaSystems, Patient, 66-year-old male with clinically and immunopheno- Altlussheim, Germany). Three to 6 abnormal metaphases were typically unambiguous B-CLL, was recently diagnosed in our evaluated in each FISH experiment. center. Peripheral blood was taken at the time of diagnosis after informed consent. RESULTS AND DISCUSSION Cytogenetic analysis of peripheral blood cells from the repor- Cytogenetic analysis ted patient revealed presence of two related abnormal clones Peripheral blood cells were cultured 72 hour in presence of tet- presented in Table 1. The second subclone showed structural radecanoyl phorbol acetate (TPA). Chromosome preparations, aberrations of both 14q32 described as der(14)t(1;14) R- banding and karyotyping were performed using conventi- (q25;q32) and add(14)(q32). onal methods. Chromosomal aberrations were described The applied aCGH analysis identified 8 regions of genomic according to ISCN (2005)(2). imbalances. These imbalances include loss of 10q26.3qter, 11q22.3q23.2, 13q14.2q14.3 and 14q32.33qter and duplicati- Array CGH on of 1q21.3qter, 2p14pter, 7q11.2qter and 8q21.3qter (Fig. Arrays were constructed using a 1Mb Clone Set (Welcome 1A). The size of unbalanced regions varied from 2 to 97 Mb. Trust Sanger Institute, UK) containing a total of 3527 The identified duplicated 1q region covered 94 Mb; RP4- BAC/PAC clones (3), in MicroArray Facility (Flanders 790G17 mapped at 148,42-148,56 Mb is the first proximal

412 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Table 1.: Summary of cytogenetic and aCGH/FISH results *aCGH results described according to ISCN (2005)

Karyotype aCGH results* Karyotype corrected after aCGH and FISH 1. arr cgh 1. 46,XY,add(5)(q35),add(10) 1q21.3qter(RP4790G17→CTB-160H23)x3, 46,XY,add(5)(q35), der(10)t(8;10)(q21.3;q26.3), (q26),del(11)(q21q23), 2p14pter(GS1-68F18→RP11-568N6)x3, del(11)(q22.3q23.2),del(13) del(13)(q13q21) [3]/ 7q11.2qter(RP5-905H7→RP4-764O12)x3, (q14.2q14.3) [3]/ 8q21.3qter(RP11-3J21→CTC-489D14)x3, 2. 10q26.3qter(RP11-168C9→CTB-137E24)x1, 2. 46,XY,del(2)(p12),t(3;13 11q22.3q23.2(RP11-563P16→RP11-212D19)x1, 46,XY,t(2;14)(p12;q32),t(3;13) (q27;q31),add(7)(q35), 13q14.2q14.3(RP11-305D15→RP11-431O22)x1, (q27;q31),dup(7)(q11.21qter), add(8)(p12),add(10)(q26), 14q32.33qter(RP11-417P24→CTC-820M16)x1 der(10)t(8;10)(q21.3;q26.3), del(11)(q21q23),del(13) del(11)(q22.3q23.2),del(13) (q13q21),der(14)t(1;14)(q25;q (q14.2;q14.3),der(14)t(1;14) 32),add(14)(q32),add(15) (q21.3;q32.33),der(15)t(2;15) (q26) [5] (p14;q26.3) [5]

BAC clone found to be duplicated and CTB-160H23 at 247,03- worth to note that none of the 4 previously described genes 247,17 Mb is the most terminal duplicated clone. These results associated with lymphomas: BCL9 (6), FCGR2B (7), MUC1 indicated gain of the 1q21.3qter region (B). According to cyto- (8) and IRTA2 (9), is located in the breakpoint region. This sug- genetics, this region was translocated to the der(14). To gests that t(1;14) ( q21.3;q32.33) involves a new oncogene that validate this aCGH finding, we performed metaphase warrants identification and characterization. Further FISH stu- FISH analysis with SpectrumGreen-labeled RP4-790G17 dies with BAC and fosmid clones selected from the narrowed (148,42-148,56 Mb) and SpectrumOrange-labeled RP11- down 3 Mb breakpoint region will follow. 216N14 (151,95-152,11 Mb); the latter clone represents the adjacent proximal region flanking the 1q21.3 breakpoint. Inde- ed, the der(14)t(1;14) was marked by a single green signal while both normal chromosomes 1 carried co-localized green/red signals (Figure 2.A). The aberrant 2F1R signal pattern was found in 36 % of interphase cells. Further FISH with LSI IGH applied on the previously analyzed metaphases showed two red signals (3’end of IGH) on der(14) and add(14) and one green signal (IGHV) on chromosome resembled del(2)(p12) (Fig. 2.B). Loss of the second green IGH signal was in line with the 14q32.33-qter loss found by aCGH illustrating the non- reci- procal t(1;14). The postulated reciprocal t(2;14)(p14; q32.33) was demonstrated by chromosome painting with WCP2 that hybridized to the add(14)(q32), del(2)(p12), normal chromosome 2 and unexpectedly, to add(15)(q26). The 2p12 breakpoint of t(2;14) was further mapped distally to IGK that retai- ned on the der(2). The remaining 7q11.2qter and 8q21.3qter gains were also validated by metaphase FISH using respective chromosome paintings. WCP7 hybridized with a normal chromosome 7 and add(7)(q35) indicating dup(7)( q11qter). WCP8 marked two normal chromosomes 8 and add(10)(q26) that Figure 1.: showed to be der(10)t(8;10) (q21.3;q26.3). The latter non- A. aCGH genomic profile The x-axis represents the clones ordered from reciprocal translocation was confirmed by loss the the chromosome 1 to 22, X and Y. The Y-axis shows the log2 ratios of 10q26.3-qterm region found by aCGH. Losses of 11q22.3- Cy5/Cy3 fluorescent intensity. The bold line indicates the thresholds for q23.2 and 13q14.2-q14.3 remained in line with the res- gains (0.3) and losses (-0.3). Arrows mark duplications of 1q21.3qter, 2p14pter, 7q11.2qter, 8q21.3qter and losses of 10q26.3qter, 11q22.3q23.2, pective del(11q) and del(13q) observed by cytogenetics. 13q14.2q14.3 and 14q32.33qter, from the left side to the right. Results of cytogenetic, aCGH and FISH analysis are sum- B. Partial genomic profile of chromosome 1 showing the 1q21.3qter dupli- marized in Table 1. cation The x-axis represents the clones ordered from 1p telomere to the Altogether, aCGH complemented by FISH studies allowed us 1q telomere. The Y-axis shows the log2 ratios of Cy5/Cy3 fluorescent intensity. The bold line indicates the thresholds for gains (0.3) and losses to correct karyotype of the reported case as follows: 46,XY,t(2; (-0.3). Lower log2 ratios of duplicated region reflect subclonal appearan- 14) (p12;q32), t(3;13) (q27;q31), dup(7) (q11.21qter), der(10) ce of this aberration found by interphase FISH. t(8;10) (q21.3;q26.3), del (11) ( q22.3q23.2), del (13) C. Partial genomic profile of chromosome 2 showing the 2p14pter dupli- (q14.2q14.3), der(14) t(1;14) (q21.3; q32.33), der(15)t (2;15) cation. The x-axis represents the clones ordered from 1p telomere to the (p14;q26.3) 1q telomere. The Y-axis shows the log2 ratios of Cy5/Cy3 fluorescent intensity. The bold line indicates the thresholds for gains (0.3) and los- Particularly important, we were able to rapidly map the bre- ses (-0.3). akpoint of non-reciprocal IGH-mediated t(1;14)(q21;q32) expecting to affect gene involved in pathogenesis of CLL. The In addition to der(14)t(1;14), we were able to map breakpoints breakpoint was narrowed down to the 1q21.3 region flanked of two other non-reciprocal translocations, t(2;15) and t(8;10) by two consecutive BAC clones spaced by approximately 3 and to determine duplicated region of 7q. Deletions of 11q and Mb. Unfortunately, this chromosome region is not covered 13q were mapped with a resolution of approximately 1 Mb. As with a resolution of 1 Mb, as could be expected. We searched expected, the 11q and 13q lost regions harbor respectively, for potential candidate genes with the Ensembl Cytoview geno- ATM and miR15/miR16, the candidated tumor suppressor genes me browser (www.ensembl.com). This region, however, con- involved in pathogenesis of CLL (10, 11). tains dozens of genes, mostly with unknown functions. It is Finally, using FISH, we identified t(2;14)(p12;q32), the second

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 413 IGH-associated translocation present in this case of CLL. pectively, hallmark rapid disease progression and poor survi- Given that this translocation is reciprocal, the 2p12 breakpo- val, while del(13) (q14.3) as a single aberration is associated int could not be rapidly mapped by aCGH; FISH identificati- with a good prognosis (13, 14). Chromosomal translocations on of the involved partner gene requires more labourious BAC- involving 14q32/ IGH are relatively rare in CLL; they occur mapping strategy. The known 2p genes involved in in about 4 % of cases studied by FISH and usually affect the IGH-associated translocations in B-NHL include REL (2p16) BCL2/18q21 and BCL3/19q13 genes (13, 14, 15). Particular- and BCL11A (2p16) (12). ly interesting is finding of two 14q32/IGH translocations in the present case. Given that der(14)t(1;14) and t(2;14) were found in a subclone with a more complex karyotype, we beli- eve that both these translocations represent secondary chromosomal aberrations acquired during evolution of the del(11q)/del(13q)-positive karyotype. In conclusion, using isolated CLL case, we demonstrated potential of aCGH as a tool for a rapid molecular mapping of non-reciprocal translocation. Resolution of this analysis ref- lects resolution of the applied aCGH platform. In the present case, the 1q21 breakpoint possibly harboring a novel CLL- associated oncogene, was narrowed down to the approximately 3 Mb region during one aCGH experiment. This approach Figure 2. is significantly less time- and material-consuming when com- A. FISH with RP4-790G17 (SpectrumGreen) (148,42-148,56 Mb) and pare to a standard probe-walking strategy. In most cases, the RP11-216N14 (SpectrumOrange) (151,95-152,11 Mb) confirming the definitive mapping of breakpoint may require complementa- aCGH results. The arrow shows the der(14)t(1;14)(q21.3;q32.33) with the only RP4-790G17 signal. Other two red/green signals are localized on ry FISH analysis. Although application of aCGH is limited to both chromosomes 1. unbalanced translocations, it can be succesfully used in rare B. FISH with LSI IGH (Vysis Inc.) probe on the same rehybridized metap- non- reciprocal translocations involving IGH/14q32 likely tar- hase. The red signals confirm the presence of 3’ end of IGH on der(14) geting lymphoma-associated oncogenes. and add(14). The arrow is showing one green signal (IGHV) localized at der(2)t(2;14)(p12;q32.33). Loss of second green signal remains in line with the 14q32.33qter loss found by aCGH. Note the aberrant signal pat- ACKNOWLEDGEMENTS tern also in interphase nuclei. This work was supported by KULeuven Research Foundation (BIL05/59). We would like to thank the Welcome Trust Sanger B-CLL is one of the most common leukemias in the Western Institute for clone supply, Paul Van Hummelen (MicroArray world showing variable clinical course. The most frequent Facility, Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, genomic aberrations identified in CLL include del(13q), VIB, Leuven, Belgium) for generating aCGH slides and Joris del(11q), trisomy 12, del(17p) and del(6q) found in up to 80 R. Vermeesch (Center for Human Genetics, University Hos- % of cases analyzed by FISH. Importantly, del(11)(q22q23) pital Gasthuisberg, Leuven. Belgium) for important technical and del(17)(p) likely targeting the ATM and p53 genes, res- guidance.

REFERENCES 8. Teruya-Feldstein J., Donnelly GB., Goy A. et al.: MUC-1 Mucin Protein 1. Fiegler H., Gribble SM., Burford DC. et al.: Array painting: a method for Expression in B-cell Lymphomas. Appl Immunohistochem Mol Morphol the rapid analysis of aberrant chromosomes using DNA microarrays. J Med 11(1), 2003, 28-32. antibodies. Clin Cancer Res 11(1), 2005, 87-96. Genet 40, 2003, 664-670. 9. Ise T., Maeda H., Santora K. et al.: Immunoglobulin superfamily receptor 2. ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenc- translocation associated 2 protein on lymphoma cell lines and hairy cell lature, Shaffer LG., Tommerup N. (eds); Karger S., Basel 2005 leukemia cells detected by novel monoclonal, 3413-20. 3. Fiegler H., Carr P., Douglas EJ. et al.: DNA microarrays for comparative 10. Schaffner C., Stilgenbauer S., Rappold GA. et al.: Somatic ATM mutati- genomic hybridization based on DOP-PCR amplification of BAC and PAC ons indicate a pathogenic role of ATM in B-cell chronic lymphocytic leu- clones. Genes Chromosomes Cancer 36, 2003, 361-374. kemia. Blood 94(2), 1999, 748-53. 4. Vermeesch JR., Melotte C., Froyen G. et al.: Molecular Karyotyping: Array 11. Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M. et al.: Frequent deletions and down- CGH Quality Criteria for Constitutional Genetic Diagnosis. J Histochem regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic Cytochem 53(3), 2005, 413-422. lymphocytic leukaemia. PNAS 99(24), 2002, 15524-15529. 5. Martín-Subero JI., Harder L., Gesk S. et al.: Interphase FISH assays for the 12. Satterwhite E., Sonoki T., Willis TG. et al.: The BCL11 gene family: detection of translocations with breakpoints in immunoglobulin light cha- involvement of BCL11A in lymphoid malignancies. Blood 98(12), in loci. Int J Cancer 98(3), 2002, 470-474. 20018. 6. Willis TG., Zalcberg IR., Coignet LJ. et al.: Molecular cloning of translo- 13. Mossafa H., Huret JL: Chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Atlas Genet cation t(1;14)(q21;q32) defines a novel gene (BCL9) at chromosome 1q21. Cytogenet Oncol Haematol., August 1997. Blood 91(6), 1998, 1873-81. 14. Reddy KS: Chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Atlas Genet Cytoge- 7. Callanan MB., Le Baccon P., Mossuz P. et al.: The IgG Fc receptor, Fc net Oncol Haematol, May 2005. RIIB, is a target for deregulation by chromosomal translocation in malig- 15. Dyer MJ.: The pathogenetic role of oncogenes deregulated by chromosomal nant lymphoma. PNAS 97(1), 2000, 309-314. translocation in B-cell malignancies. Int J Hematol 77(4), 2003, 315-20.

414 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 DETEKCE EXPRESNÍCH PROFILÒ U PACIENTÒ S CML POMOCÍ ATLAS PLASTIC 8K MICROARRAYS

GENE EXPRESSION PROFILING IN CML PATIENTS USING ATLAS PLASTIC 8K MICROARRAYS BRUCHOVÁ H., KRÁâMAROVÁ A., KLAMOVÁ H., BRDIâKA R .

ODDùLENÍ MOLEKULÁRNÍ GENETIKY, ÚSTAV HEMATOLOGIE A KREVNÍ TRANSFUZE, PRAHA

Souhrn V˘chodisko: Expresní microarrays pfiedstavují vhodnou technologi i pro studium patologick˘ch procesÛ na geno- mické úrovni. Pro identifikace odli‰nû exprimovan˘ch genÛ u pacientÛ s CML jsme pouÏili plastikové microarrays, které kombinují hlavní pfiednosti nylonov˘ch membrán a sklenûn˘ch microarrays. Pacienti a Metody. Leukocyty byly izolovány z periferní krve 6 pacientÛ s chronickou myeloidní leukemií v dobû stanovení diagnózy. U v‰ech pacientÛ byl detekován BCR/ABL fúzní gen. Pro detekci expresních profilÛ byly pouÏity Atlas Human Plastic 8K Microarrays (Clontech) s 8 327 genov˘mi sondami. mRNA byla izolována z 45μg celkové RNA pomocí magnetick˘ch ãástic. V˘sledky. Vût‰ina genÛ u pacientÛ vykazovala stejnou expresi jako kontrolní vzorek. U nûkter˘ch genÛ bylo moÏné detekovat podobné zmûny v expresi u v‰ech (ãi vût‰iny) pacientÛ napfi. zv˘‰ená exprese: lactotransferrin, proteoglycan 2, elastase 2, MMP 9, defensin alpha 1,3,4, peptidoglycan recognition protein, cathepsin G, myeloperoxidase, proteinase 3; sníÏená exprese: CD68 antigen, cathepsin B, H factor, integrin-alpha X, interleukin 8, preB cell colony enhancing factor. Závûr. Na‰e studie odhalila variabilitu v expresi mnoha genÛ, ale i pfiesto jsme identifikovali skupinu genÛ s podob- n˘mi zmûnami v aktivitû. Tyto geny by mohly b˘t asociovány s rozvojem onemocnûní a budou podrobnûji studovány.

Klíãová slova: genová exprese, CML, plastikové microarrays

Summary Background: Expression microarrays provide a powerful technology for studying disease processes on a genomic scale. We used plastic microarrays for identification of differentially expressed genes in chronic myeloid leukemia patients. Plastic arrays combine the best properties of glass and nylon arrays.Patients and Methods: Leukocytes were isolated from peripheral blood of 6 CML patients at diagnosis. All patients were BCR/ABL fusion gene positive. For gene expression profiling we used Atlas Human Plastic 8K Microarrays (Clontech) with 8 327 gene probes. mRNA was isolated from 45μg of total RNA using magnetic bead method. Results: Majority of the patient genes showed the same transcription activity as in the control sample. In a few genes it was possible to observe similar significant changes of gene expression in all (most) patients e.g.up-regulation: lactotransferrin, proteoglycan 2, elastase 2, MMP9, defensin alpha 1,3,4, peptidoglycan recognition protein, cathepsin G, myeloperoxidase, proteinase 3; down-regulation: CD68 antigen, cathepsin B, H factor, integrin-alpha X, interleukin 8, preB cell colony enhancing factor. Conclusions: Alt- hough the study revealed variability of gene expression in many genes, we identified a number of genes with the similar expression regulation. The genes may be associated with the disease process and will be analysed in detail.

Key words: gene expression, CML, plastic microarrays

Úvod detekovat relativnû mal˘ poãet genÛ (600 aÏ 1200), ale âipové technologie pfiedstavují velmi pfiínosnou metodiku pro nevyÏadují speciální vybavení laboratofie. Pro sledování studium komplexního pozadí rÛzn˘ch onemocnûní. Právû sle- exprese vût‰ího poãtu genÛ jsme zaãali pouÏívat plastikové dování transkripãní aktivity genÛ v dobû rozvoje onemocnûní microarrays. Firma Clontech vyvinula plastikovou micro- ãi v prÛbûhu léãby pomocí tûchto metod mÛÏe vést k odhale- array Atlas Plastic 8K Microarray s 8327 sondami, u které se ní kandidátních genÛ, které se podílejí na vzniku onemocnûní pokusila zkombinovat hlavní pfiednosti nylonov˘ch mem- a zároveÀ mohou pfiedstavovat dal‰í potenciální diagnostické brán a sklenûn˘ch microarrays (12). Tyto plastikové microar- ãi terapeutické cíle. U leukemií byly cDNA microarrays jiÏ rays lze stejnû jako nylonové membrány opakovanû pouÏít vyuÏity pro charakterizaci jejich molekulárního (genetického) minimálnû 3krát (dle na‰ich praktick˘ch zku‰eností to je pozadí (1,2), jejich klasifikaci (3,4,5,6,7,8), identifikaci mole- i maximální poãet recyklací), coÏ je ãiní finanãnû dostupné. kulárních zmûn pfii progresi onemocnûní (9) ãi pro studium ZároveÀ pouÏit˘ materiál má pfiednosti „sklíãek“ tzn. uni- pÛsobení lékÛ pouÏívan˘ch pro chemoterapii (10,11). formní neporézní povrch, kter˘ umoÏÀuje efektivní naná‰e- Také cílem této studie byla charakterizace expresních profi- ní sond po stránce kvantitativní i kvalitativní. Neporézní lÛ u pacientÛ s chronickou myeloidní leukemií (CML) v dobû povrch samozfiejmû minimalizuje pozadí a zjednodu‰uje stanovení diagnózy pomocí microarrays a identifikace genÛ metodiku z hlediska prehybridizace a odm˘vání. Navíc pev- s odli‰nou expresí. Doposud jsme pro expresní anal˘zy v na‰í né materiály jsou pohodlné na manipulaci a je zde i moÏnost laboratofii vyuÏívali nylonové membrány, které v‰ak umoÏÀují automatizace.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 415 Materiál a metody (profil smûsného vzorku zdrav˘ch osob). Do v˘sledkové tabul- V rámci studie bylo vy‰etfieno 6 pacientÛ s CML ve vûku od ky byly zahrnuty geny (na základû standardnû nastaven˘ch 39 do 76 let (medián 49)(Tab.1). Diagnóza byla stanovena pod- podmínek v softwaru), jejichÏ exprese se li‰ila nejménû dvoj- le standardních kritérií. Vzorky periferní krve byly odebrány násobnû a rozdíl v intenzitách pfiedstavoval nejménû dvojná- v dobû stanovení diagnózy s informovan˘m souhlasem paci- sobek prÛmûrné hodnoty pozadí. Názvy genÛ/proteinÛ v tabul- entÛ na základû schválení etickou komisí. Do souboru byli kách a v textu byly zachovány dle Clontech databáze. zafiazeni pacienti v chronické fázi s relativnû vysok˘m poãtem leukocytÛ, pfiiãemÏ u pacientÛ ã.3,4 onemocnûní jiÏ pfie‰lo Zmûny genové exprese vykazující dvojnásobné v akcelerovanou fázi. U v‰ech pacientÛ byl detekován V˘sledky a diskuse BCR/ABL fúzní gen. Na Atlas Plastic Human 8K Microarray je naneseno 8 327 geno- Tabulka 1: Charakteristika testovan˘ch pacientÛ v˘ch sond, pfiiãemÏ pozitivní signál (nad úrovní pozadí) byl detekován prÛmûrnû u 16% genÛ. Podíl genÛ vykazujících signi- pacient ã. pohlaví vûk diagnóza BCR/ABL leukocyty (109/l) fikantní zmûny exprese pfii srovnání s kontrolním vzorkem se 1 Î 49 CML b3 a2 350,7 pohyboval v rozmezí 10-20% (z exprimovan˘ch genÛ) v závis- 2 Î 49 CML b3 a2 236,5 losti na jednotliv˘ch pacientech. Zb˘vající geny pacientÛ se 3 Î 60 CML (akce. fáze) b3 a2 189,0 v expresi neli‰ily od kontrolního vzorku. U nûkter˘ch genÛ bylo 4 Î 76 CML (akce. fáze) b3 a2 380,0 moÏné detekovat podobné zmûny vexpresi uv‰ech pacientÛ napfi. 5 M 39 CML b2 a2 590,0 zv˘‰ená exprese - lactotransferrin (LTF), proteoglycan 2 (PRG2), 6 Î 49 CML b2 a2 354,6 elastase 2 (ELA2), metalloproteinase 9 (MMP9), defensin alpha 1/3/4(DEFA1, DEFA3, DEFA4), peptidoglycan recognition pro- Celková RNA z leukocytÛ periferní krve byla izolována pomo- tein (PGLYRP), cathepsin G (CTSG), myeloperoxidase (MPO), cí kyselé guanidium thiokyanat/fenol:chloroformové metody proteinase 3 (PRTN3), secretory leukocyte protease inhibitor (13) a následnû byla inkubována s DNasou I (0.2U/μg, Sigma) (SLPI); sníÏená exprese - CD68 antigen (CD68), cathepsin 30min pfii 37°C. Ze 45mg total-RNA byla izolována mRNA B (CTSB), H factor (CFH), integrin-alpha X (ITGAX), interfe- kitem Atlas Pure Total RNA Labeling System (Clontech), kte- ron induced transmembrane protein (IFITM), interleukin 8 (IL8), r˘ je zaloÏen˘ na magnetické separaci (12). Pro detekci expres- preB cell colony enhancing factor (IL6), neurogranin (NRGN) ních profilÛ byly vyuÏity Atlas Plastic Human 8K Microarrays (Obr.2). ¤ada genÛ dále vykazovala signifikantní zmûny expre- (Clontech) s 8 327 genov˘mi sondami o délce 80b (Obr. 1). se pouze unûkter˘ch pacientÛ jako napfi. reticulon 3 (RTN3), T cell receptor beta locus (TCRB), hemoglobin alpha 1 (HBA1), Obrázek 1.: Atlas Plastic Human 8K Microarray (Clontech) s 8 327 geno- v˘mi sondami, které jsou v duplikátech uspofiádány do 384 blokÛ. cDNA hemoglobin alpha 2 (HBA2), arrestin (SAG), polymerase RNA fragmenty o délce 80b jsou na plastikovém nosiãi imobilizovány UV záfie- II polypeptide E (POLR2E), small inducible cytokine A5 (CCL5), ním. âervenû jsou ohraniãeny kontrolní bloky obsahující pozitivní a nega- tumor protein (HLA-A) atd. tivní kontroly (12). Na obrázku je expresní profil pacienta ã.1. Obrázek 2.: Signifikantní zmûny genové exprese (normalizovaná data) detekované u vût‰iny CML pacientÛ v dobû diagnózy pomocí Atlas Plas- tic Human 8K Microarrays (Clontech). Zmûny exprese jsou vyjádfieny barevnou ‰kálou, kdy ãervené barvy pfiedstavují zv˘‰ení a modré barvy sníÏení genové exprese u pacienta. Zelená barva vyjadfiuje stejnou expresi genu jako u standardu (bílá barva –nedetekovatelná exprese/pod úrov- ní pozadí).

Pro pfiepis mRNA na cDNA neboli reverzní transkripci (RT) byl pouÏit Atlas cDNA Expression Arrays kit (Clontech) dle instrukcí v manuálu (12), pfiiãemÏ reakãní smûs obsahovala jako primery náhodné hexanukleotidy, MMLV reverzní tran- skriptasu a pro radioaktivní znaãení cDNA bylo pouÏito α33P [dATP] (50mCi/vzorek, Amersham Pharmacia Biotech). RT probíhala 30min pfii 42°C. Pro oddûlení oznaãené cDNA od neinkorporovan˘ch nukleotidÛ byla pouÏita silikagelová kolonová chromatografie (Atlas NucleoSpin Extraction Kit, Clontech). Vzorky byly hybridizovány pfies noc pfii 60°C za stálého míchání (6 ot/min). Pfii posthybridizaãním odm˘vání byly microarrays 2-krát opláchnuty (20s) roztokem 0.1x SSC, 0.1%SDS pokojové teploty a následnû inkubovány v 50ml stej- ného roztoku 10min pfii 60°C. Po ukonãení inkubace byly microarrays opláchnuty destilovanou vodou a dÛkladnû usu‰eny. Radioaktivita byla detekována pomocí pfiístroje Phosphori- mager FLA-2000 (Fuji)(doba expozice-24hod). Komparativní anal˘zy expresních profilÛ byly provedeny pomocí programu AtlasImage 2.7 (Clontech). Expresní profily u CML pacientÛ byly porovnány se standardním profilem

416 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Obrázek 3.: Exprese genu defensin alpha 3 detekovaná plastikov˘mi mik- fikantní pokles exprese byl dále detekován u genu H factor roãipy u CML pacientÛ a standardu. (CFH) , coÏ je pozitivní regulaãní kofaktor komplementové kaskády (23). Nízkou transkripãní aktivitu vykazovaly také geny kódující proteasy cathepsin B (CTSB) a ADAM . CTSB je lysosomální cystein-proteasa úãastnící se maturace amylo- idních prekurzorÛ (24). Protein a disintegrin and metallopr- otease domain 15 (ADAM) je ãlenem ADAM proteasové rodiny podílející se na regulaci buÀka-buÀka a buÀka-matrix interakcí. ADAM proteiny jsou také schopny interakce s integriny ãi Scr kinasami (25). Aãkoliv integriny u CML pacien- tÛ vykazovaly vût‰inou vy‰‰í expresi, v pfiípadû integrin alp- V˘raznû silnou expresi u v‰ech pacientÛ vykazovaly geny ha X (ITGAX) tomu tak nebylo . Gen ITGAX je souãástí defensin alpha 1,3 a 4 (DEFA1, DEFA3, DEFA4) (Obr.3). integrin alpha, coÏ je adhezivní receptor na povrchu krevních Defensiny kódují skupinu peptidÛ s protibakteriálními a cyto- bunûk, kter˘ zprostfiedkovává adhezi k vaskulárnímu endot- toxick˘mi úãinky, které zaji‰Èují obranyschopnost hostitele helu, migraci, chemotaxi atd. (26). a jsou produkovány pfiedev‰ím neutrofily. Vysoká exprese PreB-cell colony-enhancing factor (IL6) je cytokin zvy‰ující defensinÛ u myeloidních leukemick˘ch bunûk byla jiÏ proká- aktivitu MGF (stem cell factor) a interleukinu 7 (27). Exprese zána v nûkolika studiích (14,15) a stejnû jako myeloperoxida- tohoto genu byla pod hranicí detekovatelnosti. Dal‰ím cyto- se (MPO) mohou defensiny slouÏit jako marker myeloidní dife- kinov˘m genem s velmi nízkou expresní aktivitou byl interle- renciace (16). Právû také gen MPO byl u v‰ech pacientÛ ukin 8 (IL8) . IL8 je cytokin hrající dÛleÏitou roli pfiedev‰ím exprimován na zv˘‰ené hladinû. Protein MPO je syntetizován v chemotaxi a aktivaci neutrofilÛ (28). bûhem diferenciace myeloidních bunûk, a je proto vyuÏíván V˘razné expresní zmûny byly pozorovány pfiedev‰ím u genÛ pro urãování subtypÛ AML (17). V jádfie se MPO mÛÏe vázat podílejících se na regulaci imunitních procesÛ, coÏ naznaãuje, na DNA a chránit ji pfied po‰kozením kyslíkov˘mi radikály, Ïe u pacientÛ byly zfiejmû aktivovány obranné mechanismy. které vznikají pfii maturaci myeloidních bunûk. MPO byla nalezena v jádfie a cytoplazmû normálních i myeloidních leuke- Závûr mick˘ch bunûk (18) . Dal‰í gen se zv˘‰enou transkripãní akti- Leukemie se vyznaãují velkou variabilitou jak na klinické, tak vitou u v‰ech pacientÛ byl secretory leukocyte proteinase i na molekulární úrovni. Proto variabilita v genové expresi inhibitor (antileukoproteinase, SLPI ), jehoÏ produkt chrání u pacientÛ s CML zji‰tûná v této studii není nijak pfiekvapují- epitelové tkánû pfied proteasami jako je cathepsin G a neu- cí. Pfiíãinou této variability mohou b˘t inter-individuální roz- trophil elasatase. Geny kódující obû zmínûné proteasy vyka- díly mezi pacienty ve vûku, pohlaví, stádiu choroby atd. Ale zovaly u testovan˘ch pacientÛ zv˘‰enou expresi. Elastase 2 i pfies tuto variabilitu bylo moÏné vysledovat stejné zmûny (ELA2) je proteasa produkována krevními neutrofily a podílí exprese nûkter˘ch genÛ u v‰ech ãi vût‰iny pacientÛ v soubo- se na ‰tûpení proteinÛ v pojivov˘ch tkáních (19). Cathepsin ru, které mohou b˘t asociovány s rozvojem onemocnûní ãi G (CTSG) je proteasa produkovaná také neutrofily, která se „udrÏováním“ maligního klonu. Kromû genÛ, jejichÏ úãast uplatÀuje v imunitních procesech (20). Vy‰‰í exprese námi u leukemií je z hlediska funkce jasná, odhalilo na‰e testování detekovan˘ch genÛ MPO, DEFA1, DEFA3, DEFA4 a CTSG i zmûny exprese genÛ, o jejichÏ v˘znamu u CML není zatím byla zji‰tûna i u pacientÛ s akutní promyelocytární leukemií nic známo, a které tak pfiedstavují cíle dal‰ího v˘zkumu. (15). Zv˘‰ená expresní aktivita genÛ kódujících proteasy vneu- Atlas Plastic Microarrays pfiedstavují novou zajímavou plat- trofilech u pacientÛ s CML poukazuje zfiejmû na vy‰‰í aktivi- formu pro testování genové exprese, neboÈ co do objemu zís- tu tûchto myeloidních bunûk ãi na jejich zv˘‰ené poãetní kan˘ch v˘sledkÛ jsou srovnatelné s dal‰ími typy microarrays, zastoupení. Právû expanze terminálnû diferenciovan˘ch neu- ale po finanãní stránce pfiedstavují mnohem levnûj‰í alternati- trofilÛ je charakteristická pro chronickou fázi CML (21). Dále vu díky moÏnosti opakovaného pouÏití. Microarray technolo- u testovan˘ch pacientÛ byl silnûji exprimován gen lactotran- gie díky své v˘konnosti zcela jistû najdou své uplatnûní sferrin (LFT), jehoÏ produkt zaji‰Èuje transport Ïeleza v extra- v na‰ich laboratofiích nejen pfii fie‰ení v˘zkumn˘ch projektÛ, celulárních tekutinách a uplatÀuje se i v imunitní obranû. ale i v rutinní diagnostice. U nûkolika genÛ byla sledována sníÏená ãi Ïádná (resp. nedetekovatelná) exprese pfii porovnání se standardním profi- Podûkování lem. Mezi takovéto geny s nízkou expresí u v‰ech pacientÛ pat- Autofii dûkuji Mgr. J Polákovi (Oddûlení molekulární geneti- fiil gen CD68 antigen (CD68). CD68 je transmembránov˘ gly- ky, ÚHKT) za poskytnutí molekulárních dat t˘kajících se koprotein neznámé funkce, kter˘ je vysoce exprimován BCR/ABL fúzního genu. Studie byla podpofiena VZ v lidsk˘ch monocytech a tkáÀov˘ch makrofágách (22). Signi- 000237601 MZ âR.

Literatura a odkazy 5. Cho JH, Lee D, Park JH, et al. Optimal approach for class ification of acu- 1. Armstrong SA, Staunton JE, Silverman LB, et al. MLL trans location spe- te leukemia subtypes based on gene expression data. Biotechnol Prog 2002, cify a distinct gene expression profile that dist inguishes a unique leuke- 18(4):847-54 mia. Nat Genet 2002,30:41-7 6. Yeoh EJ, Ross ME, Shurtleff SA, et al. Classification, su btype discovery, 2. Niini T, Vettenranta K, Hollmen J, et al. Expression of myeloid-specific and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by genes in childhood acute lymphoblastic leuke mia - a cDNA array stu- gene expression profiling. Cancer C ell 2002,1(2):133-43 dy.Leukemia 2002, 16(11):2213-21 7. Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, et al. Molecular classific ation of can- 3. Cohen N, Rozenfeld-Granot G, Hardan I, et al. Subgroup of patients with cer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Philadelphia-positive chronic myelogenous leuke mia characterized by a Science 1999,286:531-7 deletion of 9q proximal to ABL gene: e xpression profiling, resistance to 8. Schoch C, Kohlmann A, Schnittger S, et al. Acute myeloid leukemias with interferon therapy, and po or prognosis. Cancer Genet Cytogenet reciprocal rearrangements can be distinguished by specific gene expressi- 2001,128:114-9 on profiles. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99(15):10008-13 4. Moos PJ, Raetz EA, Carlson MA, et al. Identification of g ene expression 9. Ohmine K, Ota J, Ueda M, et al. Characterization of stage progression on profiles that segregate patients with childhoo d leukemia. Clin Cancer Res chronic myeloid leukemia by DNA microarays wit h purified hematopoi- 2002,8(10):3118-30 etic stem cells. Oncogene 2001,20:8249-57

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 417 10. Hofmann WK, de Vos S, Elashoff D, et al. Relation between resistance of mosomal localization of the human cathepsin G gen e. J Biol Chem Philadelphia-chromosome-positive acute lymphobl astic leukemia to the 1989,264(23):13412-9 tyrosine kinase inhibitor STI571 and ge ne-expression profiles: a gene- 21. Gorre ME, Mohammed M, Ellwood K, et al. Clinical resistan ce to STI- expression study. Lancet 2002, 359 (9305):481-6 571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. 11. Bruchova H, Borovanova T, Klamova H, Brdicka R. Gene expr ession pro- Science 2001,293(5531):876-880 filing in chronic myeloid leukemia patients treated with hydroxyurea. Leu- 22. Holness CL, Simmons DL. Molecular cloning of CD68, a huma n mac- kemia and Lymphoma 2002,43(6):1289-1295 rophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood 1993,81(6):1607- 12. www.clontech.com 13 13. Chomczynsky P, Sacchi N. Single step method of RNA isolat ion by acid 23. Perkins SJ, Goodship TH. Molecular modelling of the C-ter minal doma- quanidin-isothiocyanate-phenol-chloroform extract ion. Anal Biochem ins of factor H of human complement: a correlation between haemolytic 1987, 162:156-159 uraemic syndrome and a predicted heparin b inding site. J Mol Biol 14. Valore EV, Ganz T. Posttranslational processing of defens ins in immatu- 2002,15;316(2):217-24 re human myeloid cells. Blood 1992,79(6):1538-44 24. Chan SJ, San Segundo B, McCormick MB, Steiner DF. Nucleot ide and 15. Hirata RK, Chen ST, Weil SC. Expression of granule prote in mRNAs in predicted amino acid sequences of cloned human and mo use preprocat- acute promyelocytic leukemia. Hematol Pathol 1993, 7(4):225-38 hepsin B cDNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 1986,83 (20):7721-5 16. Tsuruta T, Tani K, Shimane M, et al. Effects of myeloid cell growth factors 25. Poghosyan Z, Robbins SM, Houslay MD, Webster A, Murphy G, Edwards on alkaline phosphatase, myeloperoxidase, defensin and granulocyte colo- DR. Phosphorylation-dependent interactions between AD AM15 cyto- ny-stimulating factor receptor m RNA expression in haemopoietic cells of plasmic domain and Src family protein-tyrosine kinas es. J Biol Chem normal individuals an d myeloid disorders. Br J Haematol 1996,92(1):9-22 2002,277(7):4999-5007 17. Adam Z, Vorlíãek J a kol. Hematologie II: Pﬁehled maligní ch hematolo- 26. Shelley CS, Teodoridis JM, Park H, et al. During differen tiation of the gick˘ch nemocí. Grada Publishing 2001, Praha monocytic cell line U937, Pur alpha mediates i nduction of the CD11c beta 18. Murao S, Stevens FJ, Ito A, Huberman E. Myeloperoxidase: a myeloid cell 2 integrin gene promoter. J Immun ol 2002,168(8):3887-93 nuclear antigen with DNA-binding properties. P roc Natl Acad Sci U S A 27. Samal B, Sun Y, Stearns G, et al Cloning and characteriza tion of the cDNA 1988,85(4):1232-6 encoding a novel human pre-B-cell colony-enh ancing factor. Mol Cell Biol 19. Takahashi H, Nukiwa T, Yoshimura K et al. Structure of th e human neu- 1994,14(2):1431-7 trophil elastase gene. J Biol Chem 1988,263(29):14 739-47 28. Holmes WE, Lee J, Kuang WJ, et al. Structure and function al expression 20. Hohn PA, Popescu NC, Hanson RD, et al. Genomic organizat ion and chro- of a human interleukin-8 receptor. Science 1991, 253(5025):1278-80

418 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 obrazová ãást

„Hvûzdná obloha“ Marek Svoboda a GeneChip® 17. ãervna 2002 Obrázek pﬁedstavuje plochu DNA ãipu Gene- Chip®U95Av2, která byla skenována po ukon- ãení hybridizace. Na plo‰e ãipu se nachází více neÏ 400 000 hybridizaãních jednotek (viditelné jako svítící body). KaÏdá hybridizaãní jednotka nese více neÏ 1 000 000 kopií oligonukleotido- v˘ch prób pro detekci 12 600 lidsk˘ch genÛ.

Obrázek ã. 1.: Obrázek vysvûtluje strukturu DNA ãipu GeneChip®U133A. Samotn˘ ãip o velikosti plochy 1,28cm x 1,28cm je pro snadnûj‰í manipulaci zabudován do plastové kazety (vlevo). Na plo‰e ãipu (uprostﬁed) se nachází více neÏ 500 000 hybridizaãních jednotek (viditelné jako svítící body). KaÏdá hybridizaãní jednotka (vpravo) nese více neÏ 1 000 000 kopií oligonukleotidov˘ch prób pro detekci cca 17 000 lidsk˘ch genÛ. Spoleãnost Affy- metrix® vyrábí i ãip GeneChip®U133B. U133A a U133B jsou schopny dohromady detekovat cca 33 000 lidsk˘ch genÛ. DNA ãipy GeneChip® jsou vyrábûny pomocí litografické technologie. Podrobnû viz.: Svoboda M, Michálek J. Úvod do technologie DNA ãipÛ. Lékaﬁ a technika 2004;35:67-75.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 419 Obrázek ã. 2.: V˘roba DNA ãipu pomocí ãipovacího (spotovacího) stroje. Kontaktní naná‰ecí tûlesa stroje pfiená‰í pfiipraven˘ genetick˘ materiál (oligonukleotidy nebo cDNA) ze zásobníku na pfiesnû urãená místa sklenûné podkladové desky ãipu. Podrobnû viz.: Svoboda M, Michálek J. Úvod do technologie DNA ãipÛ. Lékafi a technika 2004;35:67-75.

Obrázek ã. 3.: Struktura DNA ãipu vyrobeného pomocí ãipovacího stroje. Podrobnû viz.: Svoboda M, Michálek J. Úvod do technologie DNA ãipÛ. Lékaﬁ a technika 2004;35:67-75.

420 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 Obrázek ã. 4.: Pﬁíprava sond (A.C) a testovaného genetického materiálu (B,D) pro DNA ãipy. Postup je odli‰n˘ u DNA ãipÛ nesoucích na svém povrchu sondy v podobû cDNA (tzv. cDNA ãipy), nebo oligonukleotidÛ (tzv. oDNA ãipy). Podrobnû viz.: Svoboda M, Michálek J. Úvod do technologie DNA ãipÛ. Lékaﬁ a technika 2004;35:67-75.

KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006 421 Obrázek ã. 5.: Po ukonãení hybridizace následuje dal‰í fáze zpracování DNA ãipu, tzv. „obrazová anal˘za“. Plocha DNA ãipu nesoucí fluorochrome- moznaãené molekuly testované DNA je excitována laserem, nebo filtrovan˘m svûtlem xenonové v˘bojky. Intenzita svûtla emitovaného fluorochromy je snímána „skenována“ skenery, jenÏ pracují na principu CCD kamery, nebo vyuÏívají PMT fotonásobiãÛ. Intenzita detekovaného záﬁení je vyhodnocena a následnû pseudobarevnû znázornûna. Podrobnû viz.: Svoboda M, Michálek J. Úvod do technologie DNA ãipÛ. Lékaﬁ a technika 2004;35:67-75.

Obrázek. ã. 6.: (A) Dendrogram shlukové anal˘zy, na kterém je patrné rozdûlení DLBCL (sloupce) do tfií skupin definovan˘ch na základû podobnosti exprese vybrané skupiny genÛ (fiádky): 1. Germinal Center B-cell like DLBCL; 2 . Type-3 DLBCL; 3. Activated B-cell like DLBCL. Exprese genÛ je v dendrogramu kódována barevnû. Zelená barva znaãí nízkou, ãervená barva vysokou a ãerná barva prÛmûrnou expresi daného genu v daném DLBCL. ·edá barva oznaãuje gen, jehoÏ exprese nebyla vyhodnocena. Na pravé stranû dendrogramu jsou uvedeny geny s nejvy‰‰í diskrimaãní hodnotou. (B a C) Kaplan-Meierovy kfiivky pravdûpodobnosti celkového pfieÏití u pacientÛ s jednotliv˘mi variantami DLBCL. Podrobn˘ popis obrázku a odkazy na literaturu naleznete v ãlánku: Svoboda M., a kol. Aplikace DNA ãipÛ u lymfoidních malignit.

422 KLINICKÁ ONKOLOGIE 19 SUPPLEMENT 2006