Untersuchung Modifizierter Implantatoberflächen Für Den Orthopädischen Einsatz Zur Reduzierung Implantatassoziierter Infektionen Im Rattenmodell

Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchung modifizierter Implantatoberflächen für den orthopädischen Einsatz zur Reduzierung implantatassoziierter Infektionen im Rattenmodell

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.)

vorgelegt von Marie-Luise Schröder aus Neustrelitz

Hannover 2018

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. Janin Reifenrath, Klinik für Kleintiere, Tierärztliche Hochschule Hannover Orthopädische Klinik mit Sitz im NIFE, Medizinische Hochschule Hannover

1. Gutachterin/Gutachter: PD Dr. med. vet. Janin Reifenrath

2. Gutachterin/Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Peter Stadler

Tag der mündlichen Prüfung: 30.10.2018

Diese Dissertation wurde im Rahmen des Verbundprojektes Biofabrication for NIFE angefertigt und durch die Volkswagenstiftung und das Niedersächsische Ministerium für Wissenschaft und Kultur gefördert.

Für meine Mutter, die immer hinter mir steht.

Inhaltsverzeichnis

3.1. Einteilung und Diagnose von orthopädischen Implantatinfektionen ...... 6 3.2. Epidemiologie von Implantatinfektionen ...... 8 3.3. Erregerspektrum ...... 10 3.4. Entstehung einer Implantatinfektion ...... 12 3.4.1. Die Bildung von Biofilm auf der Implantatoberfläche ...... 12 3.4.2. Resistenzmechanismen planktonischer und sessiler Bakterien...... 15 3.5. Histopathologische Reaktion des Gewebes auf eine Infektion ...... 17 3.5.1. Immun- und Fremdkörperreaktion auf ein steriles Implantat ...... 17 3.5.2. Immunantwort bei einer bakteriellen Infektion...... 18 3.6. Therapiestrategien von Implantatinfektionen ...... 20 3.7. Innovative Oberflächenmodifikationen für die Reduktion von implantatassoziierten Infektionen ...... 21 3.7.1. Antibakterielle Oberflächenmodifikationen ...... 21 3.7.2. Multifunktionale und „smarte“ Beschichtungen ...... 23 3.7.3. Antiadhäsive Oberflächenmodifikationen ...... 23 3.8. Tiermodelle für die Evaluation neuer Strategien zur Prophylaxe und Therapie von Implantatinfektionen ...... 27 3.8.1. Bestimmung der Infektionslast im Tiermodel ...... 31 3.9. Ziel der Arbeit ...... 33

4.1. Überblick über den Versuchsaufbau ...... 34 4.2. Geräte, Programme, Medikamente und Verbrauchsmaterialien ...... 35 4.3. In vitro Versuche ...... 40 4.3.1. Herstellung und Charakterisierung der Implantate ...... 40 4.3.2. Infektionserreger ...... 42 4.3.3. Ansatz der Bakteriensuspension ...... 43 4.3.4. Vorbesiedlung der Implantate ...... 44 4.4. In vivo Versuche ...... 45 4.4.1. Versuchstiere ...... 45 4.4.2. Gruppenaufteilung der Pilot- und Hauptstudie ...... 45 4.4.3. Durchführung der Operation ...... 46 4.4.4. Postoperativer Verlauf ...... 48

I Inhaltsverzeichnis

4.4.5. Euthanasie und Probenentnahme ...... 50 4.4.6. Nachweis des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein ...... 52 4.4.7. Mikrocomputertomographische Aufnahmen der Tibiae ...... 53 4.4.8. Durchführung der konfokalmikroskopischen Aufnahmen ...... 54 4.4.9. Durchführung der rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen ...... 54 4.4.10. Aufbereitung der Proben für die Histologie ...... 55 4.4.11. Herstellung und Färbung der histologischen Schnitte ...... 55 4.4.12. Auswertung der Röntgenaufnahmen ...... 57 4.4.13. Quantifizierung und morphologische Beurteilung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche ...... 58 4.4.14. Auswertung der histologischen Schnitte ...... 66 4.5. Statistik ...... 68

5.1. Charakterisierung der verwendeten Implantate ...... 69 5.2. Pilotstudie ...... 70 5.2.1. Konzentration der Injektionslösung und der Inkubationssuspension für die vorbesiedelten Implantate ...... 70 5.2.2. Tierverluste ...... 72 5.2.3. Befunde der täglichen Beurteilung ...... 72 5.2.4. Relatives tibiales Gewicht der Tibiae ...... 75 5.2.5. Bestimmung der CRP-Konzentration im Serum ...... 75 5.2.6. Ergebnisse der mikrobiologischen Evaluation ...... 76 5.2.7. Ergebnisse der CLSM Evaluation ...... 78 5.2.8. REM Aufnahmen der infizierten explantierten Implantate ...... 83 5.2.9. Ergebnisse der radiologischen Beurteilung ...... 83 5.2.10. Microcomputertomographische Untersuchung der Tibiae ...... 87 5.2.11. Ergebnisse der histopathologischen Auswertung ...... 88 5.2.12. Zusammenfassung der Ergebnisse der Pilotstudie ...... 93 5.3. Hauptstudie...... 94 5.3.1. Konzentration der Bakteriensuspension und Tierverluste ...... 94 5.3.2. Befunde der täglichen Beurteilung ...... 94 5.3.3. Relatives tibiales Gewicht ...... 97 5.3.4. Ergebnisse der mikrobiologischen Evaluation ...... 97 5.3.5. Quantifizierung und morphologische Beurteilung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche ...... 98 5.3.6. Beurteilung der exemplarischen REM Aufnahmen ...... 102 5.3.7. Ergebnisse der radiologischen Beurteilung ...... 104 5.3.8. Mikrocomputertomographischen Untersuchung der Tibiae ...... 106 II Inhaltsverzeichnis

5.3.9. Ergebnisse der histologischen Beurteilung ...... 107 5.3.10. Zusammenfassung der Ergebnisse der Hauptstudie ...... 111

6.1. Etablierung eines Tiermodells zur Abbildung einer low-grade ähnlichen implantatassoziierten Infektion ...... 112 6.1.1. Tiermodell und verwendete Infektionskonzentrationen ...... 113 6.1.2. Beurteilung infektionsbedingter Veränderungen ...... 117 6.2. Implementierung einer Quantifizierungsmethode für die bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche in vivo ...... 122 6.2.1. Bestimmung der vitalen bakteriellen Biomasse mit der Software Imaris® x64 ...... 123 6.2.2. Bakterielle Besiedlung der Implantatoberfläche in der Pilotstudie ...... 126 6.3. Untersuchung der laserstrukturierten Spikeoberfläche im low-grade ähnlichen Tiermodell ...... 129 6.3.1. Bakterielle und zelluläre Besiedlung der Implantatoberflächen...... 130 6.3.2. Beurteilung infektionsbedingter Parameter ...... 132

12.1. Detaillierte Darstellung des Bewertungssystems für die radiologische Auswertung ...... 184 12.2. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Pilotstudie ...... 188 12.3. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der radiologischen Beurteilung der Pilotstudie ...... 193 12.4. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der histologischen Beurteilung der Pilotstudie ...... 195 12.5. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Hauptstudie ...... 196 12.6. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der radiologischen Beurteilung der Hauptstudie...... 200 12.7. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der histologischen Beurteilung der Hauptstudie...... 201 12.8. Veröffentlichungen ...... 202

III 1. Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

% Prozent ° Grad °C Grad-Celsius µA Mikroampere µCT Mikrocomputertomographie µl Mikroliter µm2 Quadratmikrometer µm3 Kubikmikrometer A Fläche A. dest. Aqua destillata Abb. Abbildung AG Aktiengesellschaft AG und Co. Aktiengesellschaft und Compagnie Kommanditgesellschaft auf KGaA Aktien ANOVA Varianzanalyse (analysis of variance) bzw. beziehungsweise CFU Kolonie-bildende Einheiten (colony forming units) CLSM Konfokale Laserscanning Mikroskopie cm² Quadratzentimeter Co. KG Compagnie Kommanditgesellschaft CRP C-reaktives Protein DIN Deutsches Institut für Normung DNA Desoxyribonucleinsäure eDNA Extrazelluläre Desoxyribonucleinsäure EDTA Ethylendiamintetraacetat ELISA Enzym-linked Immunosorbent Assay EPS extrazelluläre Polymere Substanz G Gauge g Gramm GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung ISO Internationale Organisation für Normung J Joule Kat. Kategorie KBE Kolonie bildende Einheit KGW Körpergewicht kV Kilovolt l Liter M Molar mA Milliampere mbH Mit beschränkter Haftung mg Milligramm Min. Minute

IV 1. Abkürzungsverzeichnis

ml Milliliter mm Millimeter mM Millimolar NaCl Natrium Chlorid nm Nanometer OD Optische Dichte OP Operation p Signifikanzniveau PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PCR Polymerase Ketten Reaktion PMN Polymorhkerninge neutrophile Granulozyten Ra Mittelrauhwert REM Raster Elektronen Mikroskopie Rmax maximale Rauhtiefe RNA Ribonukleinsäure ROI Region of Interest ROS reaktive Sauerstoff Spezies rpm Drehung pro Minute Rz Rauhtiefe s Sekunde Sa mittlere arithmetische Höhe SD Standardabweichung Sz maximale Höhe Ti90/Al6/V4 Titan/Aluminium/Vanadium TPLO Tibia Plateau Leveling Osteotomie Tris HCl Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid TSB Tryptische Soja Boullion V Volt z.B. zum Beispiel

2. Einleitung 1

Einleitung

Sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin stellen implantatassoziierte Infektionen schwerwiegende Komplikationen in der orthopädischen Chirurgie dar (PARVIZI et al. 2012, BOZIC u. RIES 2005, TURK u. SINGH 2015, SOONTORNVIPART et al. 2003, BERGH u. PEIRONE 2012, YAP et al. 2015, RAHAL et al. 2003). In der Humanmedizin werden Implantate, wie Platten, Schrauben oder Nägel häufig zur Versorgung von Frakturen eingesetzt (AARON et al. 2013, SCHULTE et al. 2014, MITCHELL et al. 2014). Implantate, die dauerhaft im Körper verbleiben, dienen zum Großteil dem künstlichen Gelenkersatz. Hüft- und Knieendoprothesen spielen eine große Rolle, aber auch Schulter- und Ellenbogenendoprothesen gewinnen zunehmend an Bedeutung (GARCIA et al. 2016). Für den Patienten ist eine gute Mobilität bis ins hohe Alter wichtig, welche bei vielen Patienten nur durch den Einsatz eines künstlichen Gelenkes erhalten werden kann (GRAYSON u. DECKER 2012, MARICONDA et al. 2011, CASTRICINI et al. 2013). Im Hinblick auf den demographischen Wandel ist hier eine deutliche Steigerung der Primärimplantationen von Endoprothesen zu verzeichnen (GARCIA et al. 2016, STATISTISCHES BUNDESAMT 2018). In der Veterinärmedizin werden Implantate vor allem zur Therapie von Frakturen bei Klein- und Großtieren oder zur Therapie bei Kreuzbandrissen eingesetzt (SOONTORNVIPARAT et al. 2003, YAP et al. 2015, BERGH u. PEIRONE 2012, AUER u. WATKINS 1996, WITTE et al. 2004, HIRVINEN et al. 2009). Hüftendoprothesen werden auch bei Hunden oder Katzen implantiert (FORSTER et al. 2012, LISKA 2010, GUERRERO u. MONTAVON 2009). In der Veterinärmedizin werden im Vergleich zur Humanmedizin mehr Implantate verwendet, die nach der Erfüllung ihrer Funktion wieder explantiert werden können (AUER u. WATKINS 1996, WITTE et al. 2004). Der Anspruch an die Haltbarkeit und Funktionalität eines Implantates ist insbesondere für Dauerimplantate hoch. Für Endoprothesen gilt, dass diese im Idealfall bis zum Tod des Patienten im Körper verbleiben. Allerdings gibt es Gründe, die zu einer notwendigen Implantatrevision führen können. Neben der aseptischen Lockerung sind implantatassoziierte Infektionen eine Hauptursache für den frühzeitigen Austausch von Implantaten, wodurch deren durchschnittliche Lebensdauer deutlich verkürzt wird (BOZIC et al. 2009, BOZIC et al. 2010). Die Infektionen führen zum einen zu einer hohen Belastung des Gesundheitssystems, zum anderen zu einer Belastung für den Patienten durch Revisionsoperationen, langandauernde Krankenhausaufenthalte und antimikrobielle Therapien (PARVIZI et al. 2012, BOZIC u. RIES, 2005, KURTZ et al. 2005, AGGARWAL et al. 2013, ZIMMERLI et al. 2004). Im veterinärmedizinischen Bereich treten implantatassoziierte Infektionen häufiger bei temporären Implantaten auf, wie beispielsweise

2 2. Einleitung

nach der Therapie des Kreuzbandrisses (VERWILGHEN u. SINGH 2015, GATINEAU et al. 2011, PRATESI et al. 2015). Auf Grund vieler Antibiotikaresistenzen, die sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin zunehmend auftreten, ist die Therapie von Implantatinfektionen häufig erschwert (FURUSTRAND TAFIN et al. 2012, ZAJONZ et al. 2016a). Akute Infektionen treten meist wenige Tage nach dem operativen Eingriff auf und zeigen deutliche klinische Symptome wie Schmerzhaftigkeit und/oder Wundsekretion (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Problematischer in der Diagnostik sind die verzögerten oder so genannten low-grade Infektionen, die oft schlecht von einer aseptischen Lockerung zu unterscheiden sind (SCHMIDT et al. 2011, TRAMPUZ u. WIDMER 2006). Dadurch werden diese Infektionen oft spät erkannt und die Infektionserreger haben Zeit, sich am Implantat anzulagern und sich dort über die Ausbildung eines Biofilms und der Produktion von extrazellulärer Matrix zu schützen (FLEMMING u. WINGENDER 2010, DAVIES 2003). Diese Matrix dient als physikalische Schutzschicht vor der Abtötung durch das Immunsystem und vor antimikrobiellen Therapien (PENESYAN et al. 2015, DAVIES 2003). Außerdem zeigen Bakterien in einem Biofilm eine verringerte Wachstums- und Teilungsrate, was den Wirkmechanismus vieler antimikrobieller Substanzen umgehen kann (WOOD et al. 2013, MEISSNER et al. 2013, STERNBERG et al. 1999, DAVIES 2003). Der Biofilm bietet den Bakterien zusätzlich die Möglichkeit zum Gentransfer zwischen verschiedenen Stämmen oder Spezies, wodurch Resistenzgene gegen Antibiotika ausgetauscht werden können (SAVAGE et al. 2013).

Wegen der klinischen Ausgangslage in Bezug auf implantatassoziierte Infektionen der Human- als auch der Veterinärmedizin besteht ein großes Interesse an neuen, antibakteriell wirksamen orthopädischen Implantatmaterialien. Wichtige Aspekte sind die Wirksamkeit, Biokompatibilität, Haltbarkeit und Langlebigkeit dieser neuen Implantate (GALLO et al. 2014, CORVEC et al. 2012, ROMANO et al. 2015). Neue Werkstoffe oder Oberflächenmodifikationen sollten einerseits einen bakterienabweisenden Effekt haben, andererseits die Besiedlung mit körpereigenen Zellen zulassen oder sogar fördern und dadurch das Einwachsen in den Knochen begünstigen. Besonders Endoprothesen benötigen eine gute postoperative Stabilität und sollten schnell in die umgebende Knochenmatrix einheilen (GALLO et al. 2014). Optimalerweise sollten diese neuen Oberflächenmodifikationen schnell und großflächig herstellbar sein (JAGGESSAR et al. 2017). Ein Ansatz zur Prävention von Implantatinfektionen bereits vor deren Manifestation ist die spezifische Strukturierung von Implantatoberflächen. Das Ziel ist dabei, die initiale Anlagerung von Bakterien zu reduzieren (CHUNG et al. 2007, DOLL et al. 2016a, ZHU et al. 2014). Hier bietet die ultra-kurz gepulste Laserablation eine gute Methode auch großflächig eine Strukturierung auf sehr harten Materialien wie Titan aufzubringen (JAGGESSAR et al. 2017). Mit diesem Verfahren wurden in einer

2. Einleitung 3

vorangegangenen Studie Spikestrukturen in verschiedenen Größen (2 bis 20 µm) auf Silizium hergestellt und mit Titan besputtert. Diese Strukturen wurden in vitro im Hinblick auf die Anlagerung von humanen und murinen Fibroblasten und Osteoblasten getestet (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten). Dabei zeigten die Zellen eine verbesserte flächige Anlagerung mit abnehmender Spikegröße. In anderen Publikationen ließ sich durch eine Spikestruktur mit der Größe von circa 6 µm ein proliferierender Effekt auf Osteoblasten und ein osteogener Effekt auf die Stammzelldifferenzierung nachweisen (FADEEVA et al. 2009, SCHLIE et al. 2011). Die bakterielle Adhäsion verhielt sich dagegen tendenziell umgekehrt. Mit steigender Spikegröße wurde nach Adhäsion mit Staphylococcus aureus eine vermehrte Oberflächenbesiedlung bei den größeren Spikes durch Bakterien im Vergleich zu kleinen und mittelgroßen Spikes beobachtet (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten). Kleinere Spikestrukturen stellen daher eine vielversprechende Oberfläche dar, welche in in vitro Untersuchungen tendenziell einen bakterienabweisenden Effekt aufwiesen, gleichzeitig aber die günstigsten Eigenschaften für die zelluläre Besiedlung lieferten. Daraus ließ sich die Hypothese für die vorliegende Arbeit ableiten, dass eine laserstrukturierte Implantatoberfläche mit kleiner Spikestruktur durch ein „Race for the Surface“ von körpereigenen Zellen und Bakterien zugunsten der körpereigenen Zellen zu einer reduzierten Infektionslast an der Implantatoberfläche führen könnte (GRISTINA 1987).

Für die Überprüfung dieser Hypothese ist die Testung der Oberflächenstrukturierung in präklinischen Modellen notwendig. Für die in vivo Testung müssen geeignete Tiermodelle zur Verfügung stehen, die auf die jeweilige Anwendung und den eingesetzten Infektionskeim angepasst sind (OLSON et al. 2006, HOU et al. 2012). In vivo können im Gegensatz zu in vitro weitere Parameter untersucht werden, wie die klinischen Befunde und Wechselwirkungen mit dem umgebenden Gewebe. Neben der Wahl der geeigneten Tiermodelle ist die Wahl geeigneter und möglichst akkurater Quantifizierungsmethoden für die bakterielle Besiedlung sehr wichtig. Die bisher übliche Methode zur Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche ist die Auszählung von auf Agarplatten wachsenden Kolonie- bildenden Einheiten (KBE). Die KBE werden von Gewebehomogenisaten oder von mittels Ultraschall vom Implantat abgelösten Biofilm bestimmt (LUCKE et al. 2003a, HOENE et al. 2010, HAENLE et al. 2013, JØRGENSEN et al. 2014, HARRASSER et al. 2016). Die Ablösung der Bakterien stellt hierbei den kritischsten Schritt der Quantifizierung dar. DOLL et al. (2016b) hat in einer in vitro Untersuchung die Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche durch zwei Verfahren verglichen. Bei dem ersten Verfahren wurden die Bakterien mittels Ultraschall von der Implantatoberfläche abgelöst, das erhaltende Homogenisat nach Durchführung einer Verdünnungsreihe ausgestrichen und die KBE ausgezählt. Dieses Verfahren wurde mit der Quantifizierung über eine direkte Darstellung der

4 2. Einleitung

bakteriellen Besiedelung auf der Implantatoberfläche über konfokale Laserscanning Mikroskopie (CLSM) nach Lebend/Tot- Färbung der Bakterien verglichen. In dieser Studie wurde festgestellt, dass bei der Ablösung im Ultraschallbad Bakterien abgetötet werden und bei der Quantifizierung mittels Lebend/Tot- Färbung 10 bis 30-fach mehr lebende Bakterien auf der Oberfläche ermittelt wurden. Zusätzlich dazu muss beachtet werden, dass sich Bakterien in einem Biofilm in unterschiedlichen Wachstumszuständen befinden und viele Bakterien in ihrer sessilen und damit stoffwechselreduzierten Form vorliegen (DAVIES 2003). Diese Bakterien lassen sich schlecht bis gar nicht in vitro kultivieren, sind aber lebensfähig und stellen ein Infektionsrisiko dar (WOOD et al. 2013, LEWIS 2010). Die Auszählung der KBE hat weiterhin den Nachteil, dass die Bakterien nicht in ihrem ursprünglichen Siedlungsverband dargestellt werden können und somit eine Biofilmbildung auf der Oberfläche nicht detektiert werden kann. Um im Rahmen einer konfokalmikroskopischen Untersuchung die Morphologie der Bakterien auf der Implantatoberfläche zu beschreiben, wurde ein semiquantitativer Score von GLAGE et al. (2017) etabliert. In diesem neurochirurgischen Modell wurde eine Schraube in die Schädelkalotte der Ratte implantiert und mit Staphylococcus aureus infiziert. Nach Entnahme und Lebend/Tot- Färbung der Besiedlung auf der Oberfläche der Schraube wurde konfokalmikroskopisch die bakterielle Besiedlung über den semiquantitativen Score beschrieben. Er reicht von 0-5 und beschreibt vereinzelte Bakterien bis hin zur großflächigen Biofilmformation. Dieses Auswertungsmodell hat den Vorteil, die Morphologie der bakteriellen Besiedlung mit einzubeziehen, kann aber die Bakterienlast nicht quantitativ erfassen. Um die Wirksamkeit neuer Oberflächen eingehender zu evaluieren, wäre eine Quantifizierungsmethode optimal, die sowohl eine quantitative als auch eine morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung ermöglicht. Eine solche Methode ist jedoch bisher noch nicht für in vivo Modelle zur Anwendung gekommen.

Das erste Ziel dieser Arbeit war es, im Rahmen einer Pilotstudie eine low-grade ähnliche Implantatinfektion mit Staphylococcus aureus in der Ratte zu etablieren und dabei die geeignete Infektionsdosis und den Infektionsweg zu bestimmen. Die bakterielle Besiedlung der Implantatoberfläche, sowie die Entzündungsreaktion des Knochens auf das Implantat sollten mittels bildgebender und histologischer Verfahren charakterisiert werden. Das zweite Ziel der Arbeit war die Einführung einer Methodik für die Quantifizierung und morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung auf Implantat- oberflächen in dem etablierten in vivo Model, die auf der Analyse der Besiedlung mittels CLSM basiert. Basierend auf den Ergebnissen der Pilotstudie sollte im Rahmen der Hauptstudie die Hypothese überprüft werden, dass eine laserstrukturierte Implantatoberfläche mit

2. Einleitung 5

einer definierten Spikestruktur zu einer reduzierten Infektionslast an der Implantatoberfläche führt.

6 3. Literaturübersicht

Literaturübersicht 3.1. Einteilung und Diagnose von orthopädischen Implantatinfektionen

Eine implantassozierte Infektion bezeichnet die Entzündung des Gewebes, welches das Implantat umgibt (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Die Entzündungen vom Dauerimplantaten betrifft meist künstliche Gelenke und erstreckt sich sowohl auf das Gelenk als auch auf das Umgebungsgewebe, weshalb meistens von periprothetischen Gelenkinfektionen gesprochen wird (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Frakturstabilisierende Implantate, wie Schrauben oder Platten, können auch von einer Infektion betroffen sein (HULL et al. 2014, TRAMPUZ u. WIDMER 2006). Das klinische Bild einer Implantatinfektion variiert stark in Abhängigkeit der Infektionsroute, der Virulenz des Infektionserregers, der Immunantwort des Patienten und der Involution des umgebenden Gewebes (SENDI et al. 2011a, KUIPER et al. 2014). Symptome schließen Schmerzen, Fieber, Rötung, Wärme und möglicher- weise Funktionsverlust oder Gelenkschwellung ein (TANDE u. PATEL 2014, SCHMIDT et al. 2011). Postoperativ kann es auch zur Sekretion aus der Wunde oder vor allem bei chronischen Infektionen zur Bildung einer Fistel kommen (KUIPER et al. 2014, SCHMIDT et al. 2011, ACHERMANN et al. 2014). Implantatinfektionen können nach der Infektionsroute (perioperativ, hämatogen oder kontagiös) oder dem zeitlichen Beginn der Infektionssymptome postoperativ (frühe, verzögerte bzw. low-grade oder späte) klassifiziert werden (TRAMPUZ u. ZIMMERLI 2005). Die meisten Infektionen erfolgen perioperativ und sind damit exogenen Ursprungs (OCHSNER et al. 2014). Sie entstehen durch das Einwandern von Bakterien durch die offene oder geschädigte Hautbarriere (OCHSNER et al. 2014). Hochgradige Schäden des umgebenden Weichgewebes, oder eine extensive Devaskularisation des Gewebes führen zu einer verringerten Immunantwort am Implantatinterface und ermöglichen eine leichtere Kolonisierung des Implantates und des Gewebes mit Bakterien (OCHSNER et al. 2014). Akute Infektionen sind meistens auf intra- oder perioperativ erworbene Infektionen mit hochvirulenten Keimen zurückzuführen (TRAMPUZ u. ZIMMERLI 2005). Verzögerte oder so genannte low-grade Infektion sind zumeist auch intra- und perioperativ erworbene Infektionen, die sich aber auf Grund der niedrig virulenten Infektionskeime wie Koagulase-negative Staphylococcen erst verspätet manifestieren (TRAMPUZ u. ZIMMERLI 2005). Neben der Infektion exogenen Ursprungs kann das Implantat auch durch eine hämatogene Absiedlung von Erregern infiziert werden (SENDI et al. 2011b). Ursächlich für die Implantatinfektion sind Entzündungen in anderen Bereichen des Körpers, von denen sich die Bakterien absiedeln, hämatogen streuen und am Implantat ideale Bedingungen für eine Neuansiedlung finden. (BERBARI et al. 2010, GUPTA et al. 2014, SENDI et al. 2011b, OCHSNER et al. 2014). Infektionsursachen können Zahninfektionen, Hautinfektionen, aber auch Pneumonien

3. Literaturübersicht 7

oder Harnwegsinfektionen sein (BERBARI et al. 2010, SENDI et al. 2011b, GUPTA et al. 2014, OCHSNER et al. 2014). In der frühen postoperativen Phase bis circa ein Jahr post OP überwiegt der Anteil der perioperativ erworbenen Infektionen, während danach der Anteil der hämatogenen Infektionen an Bedeutung gewinnt (OCHSNER et al. 2014).

Die Diagnose von periprothetischen Infektionen ist sehr anspruchsvoll (SCHMIDT et al. 2011). Insbesondere low-grade Infektionen lassen sich auf Grund fehlender oder unspezifischer Symptome oft schwer von einer aseptischen Lockerung unterscheiden (TRAMPUZ u. ZIMMERLI 2008). Durch die Kombination von verschiedenen diagnostischen Verfahren wird die Wahrscheinlichkeit eines Infektionsnachweises erhöht (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Es handelt sich hierbei um eine Kombination aus mikrobiologischen, histopathologischen und bildgebenden Verfahren. Als Goldstandart gilt der mikrobielle Nachweis der Infektionserreger am Implantat durch Punktion des Gelenkes (BAUER et al. 2006). Problematisch sind Verunreinigungen der Probe oder antibiotische Vorbehandlung des Patienten, welche zu falsch positiven bzw. negativen Ergebnissen führen können (ESPOSITO et al. 2009, FROMMELT 2004). Wichtig ist hier die ausreichend lange Bebrütungszeit von 5-14 Tagen (PARVIZI u. DELLA VALLE 2010). Labordiagnostische Verfahren werden meistens in Kombination miteinander verwendet und schließen die Bestimmung der Leukozytenzahl, die Höhe des C-reaktiven Proteins (CRP) und Interleukin-6 oder die Blutsenkungsgeschwindigkeit ein (OSMON et al. 2013, PARVIZI u. DELLA VALLE 2010, ETTINGER et al. 2015). Allerdings können gerade low-grade Infektionen hier unauffällige Befunde aufweisen (TRAMPUZ u. ZIMMERLI 2008). Typische Befunde der radiologischen Diagnostik sind periimplantäre Osteolysen oder Lockerungs- säume, die aber bei low-grade Infektionen sehr gering ausgeprägt sein oder fehlen können (PARVIZI u. DELLA VALLE 2010, VASSO u. SCHIAVONE 2015, KALORE et al. 2011). Die Ultraschallbehandlung nach Entnahme des Implantates und anschließender mikrobieller Untersuchung kann dank der hohen Spezifität gut zum Erregernachweis dienen, besitzt aber eine geringere und in Abhängigkeit von der Studienlage wechselnde Sensitivität (VAN DIEK et al. 2017, TRAMPUZ et al. 2007). Auf Grund der häufig fehlenden Symptome der low-grade Infektion, wird diese vor der OP häufig nicht erkannt und kann dadurch in der Revisions-OP zu erheblichen Problemen führen (VASSO u. SCHIAVONE 2015).

8 3. Literaturübersicht

3.2. Epidemiologie von Implantatinfektionen

Der periprothetische Gelenkersatz, aber auch die Frakturversorgung sind ein häufiges Einsatzgebiet für Implantate in der humanmedizinischen orthopädischen Chirurgie (GARCIA et al. 2016, TRAMPUZ u. ZIMMERLI 2006, STATISTISCHES BUNDESAMT 2018). Die Primärimplantationsraten im Bereich des periprothetischen Gelenkersatzes steigen jährlich an (STATISTISCHES BUNDESAMT 2018). Beispielsweise betrug der Anstieg der Primärimplantationsrate von Knieendoprothesen im Zeitraum von 2005 (128.041 Implantationen pro Jahr) bis 2013 (142.704 Implantationen pro Jahr) circa 10 %. Die Implantationsrate von Schultertotalendoprothesen stieg im gleichen Zeitraum um 402 % (2005: 2321 und 2013: 11.649 Primärimplantationen pro Jahr). Gründe für die steigenden Primärimplantationsraten sind der demographische Wandel und der Anspruch auch im höheren Alter noch mit wenigen Einschränkungen mobil zu sein. Die Primärimplantationsrate von Endoprothesen ist bei älteren Patienten deutlich höher als bei jüngeren. Beispielsweise liegt die Primärimplantationsrate von Endoprothesen bei Patienten mit einem Alter über 65 Jahren bei circa 72 % (GARCIA et al. 2016). Für Deutschland ist keine Studie bekannt, die den Anstieg der Primärimplantationen für die nächsten Jahre schätzt, aber KURTZ et al. (2007) rechnet in den USA bis 2030 mit einem Anstieg der Primärimplantationen von Hüft- bzw. Knieendoprothesen auf 572.000 bzw. 3,48 Millionen, welches einem Anstieg von 174 % bzw. 673 % entspricht. Folglich wird auch die Anzahl der Implantatinfektionen ansteigen. Die Inzidenz von Implantatinfektionen in der Humanmedizin variiert stark. In Abhängigkeit von der Lokalisation wurden Infektionsinzidenzen bei periprothetischen Infektionen im Bereich von 0,5-7,5 % festgestellt (DALE et al. 2009, PHILLIPS et al. 2006, MORTAZAVI et al. 2010, SINGH et al. 2012, ACHERMANN et al. 2011, VOLOSHIN et al. 2011). Bei der Frakturversorgung wurde eine Inzidenz von 0,5-5 % ermittelt, die auf Grund des Kontaminationsrisikos bei offenen Frakturen bis zu 20 % erreichen kann (TRAMPUZ u. ZIMMERLI 2006, HULL et al. 2014). Neben der aseptischen Lockerung, z.B. durch Fremdkörperreaktionen, sind implantatassoziierte Infektionen mit circa 20 % Ursache einer notwendigen Revision und damit sowohl für den Patienten als auch für das Gesundheitssystem ein erhebliches Problem (KURTZ et al. 2005, BOZIC et al. 2009, BOZIC et al. 2010).

In der Veterinärmedizin werden Implantate in ähnlichen Funktionen verwendet wie im humanen Bereich. Die wichtigsten Einsatzgebiete sind im Gegensatz zur Humanmedizin nicht die Endoprothesen, sondern die Frakturversorgung, die Versorgung der Kreuzbandruptur durch z. B. durch eine Tibia Plateau Levelling Osteotomie (TPLO) oder Operationen an der Wirbelsäule (AUER u. WATKINS 1996, SMITH u. WRIGHT 2014, GOODRICH et al. 2014, ROSSIGNOL et al. 2016, ROUSH 2005, GATINEAU et al. 2011, PRATESI et al. 2015, AUGER et al. 2000). Es werden

3. Literaturübersicht 9

vor allem Platten und Schrauben, aber auch externe Fixateure und intramedulläre Nägel eingesetzt (AUER u. WATKINS 1996, SMITH u. WRIGHT 2014, RIJKENHUIZEN et al. 2012, GOODRICH et al. 2014). Hüftimplantate werden vor allem beim Hund aber auch bei der Katze implantiert (FORSTER et al. 2012, LISKA 2010). Auch wenn Endoprothesen nicht den ähnlichen Stellenwert haben wie in der Humanmedizin, werden sie dennoch verwendet. Studien zu implantatassoziierten Infektionen sind in der Veterinärmedizin nur in geringem Umfang vorhanden (GOODRICH 2006). Der Fokus der durchgeführten Studien zu chirurgischen Infektionen wird in der Veterinärmedizin vor allem auf die postoperativen Wundinfektionen gelegt (YAP et al. 2015, WEESE 2008, VERWILGHEN u. SINGH 2015, TURK et al. 2015, NELSON 2011). Zu den tiefen postoperativen Wundinfektionen zählen auch die Implantatinfektionen (VERWILGHEN u. SINGH 2015, TURK et al. 2015). Als Gesamtinfektionsrate in der orthopädischen Kleintierchirurgie konnte TURK et al. (2015) einen Wert von 5,2 % ermitteln. 50 % dieser Infektionen waren implantatassoziiert. Besonders hervorzuheben ist die chirurgische Versorgung des Kreuzbandrisses mittels TPLO, die in diesem Bereich sehr gut beschrieben ist. Die Inzidenz für eine Implantatinfektionen nach erfolgter TPLO lag je nach Studie zwischen 3,8 % und 13,3 % (GATINEAU et al. 2011, PRATESI et al. 2015) und trägt damit im Bereich der Kleintiermedizin ein erhebliches Infektionsrisiko.

Risikofaktoren für die Entstehung einer Wund- bzw. Implantatinfektion sind in der Human- und Veterinärmedizin ähnlich (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017, TURK et al. 2015, NELSON 2011). Sie lassen sich in Vorerkrankungen des Patienten, operationsbedingte Faktoren und Implantat-abhängige Faktoren einteilen (OTTO- LAMBERTZ et al. 2017). Vorerkrankungen, die das Infektionsrisiko des Patienten erhöhen, sind Diabetes, rheumatoide Arthritis und medikamentöse Therapien, wie beispielsweise eine Immunsuppression (KUNUTSOR et al. 2017, NELSON 2011, BERBARI et al. 2012, KUNUTSOR et al. 2017, NELSON 2011). Außerdem erhöhen Über- und Untergewicht, vorhandene Wundkontaminationen oder Infektionen an anderen Lokalisationen im Körper die Infektionsinzidenz (BERBARI et al. 2012, PULIDO et al. 2008, TANDE u. PATEL 2014, NELSON 2011, TURK et al. 2015, BERBARI et al. 2010, OCHSNER et al. 2014, PULIDO et al. 2008). Operationsbedingte Risikofaktoren sind beispielsweise eine verlängerte OP-Zeit, ein narkosebedingter Abfall des Blutdrucks oder eine Hypothermie während der OP (KUNUTSOR et al. 2017, NAMBA et al. 2013, NELSON 2011, TURK et al. 2015, NELSON 2011). Drainagen oder eine verzögerte Wundheilung können die Inzidenz von implantatassoziierten Infektionen erhöhen (BERBARI et al. 2012, OTTO- LAMBERTZ et al. 2017). Ein verlängerter postoperativer Klinikaufenthalt beeinflusste

10 3. Literaturübersicht

die Ausbildung einer postoperativen Wundinfektion zusätzlich negativ (NELSON 2011). Implantate stellen grundsätzlich einen Risikofaktor dar (NELSON 2011, LENTINO 2003). Außerdem steigt das Infektionsrisiko mit zunehmender Anzahl an Operationen. Die Infektionsinzidenzen nach Revisionsoperationen sind beispielsweise viel höher als die nach Primärimplantationen auf Grund von voraus- gegangenen Infektionen des Implantates (BERBARI et al. 2012, KUNUTSOR et al. 2017).

3.3. Erregerspektrum

Das Errgerspektrum von Implantatinfektionen im humanmedizinischen Bereich varriert in Abhänigkeit von der Studienlage, der Lokalisation des Implantates und der Menge der untersuchten Fälle (DAPUNT et al. 2016b, ARCIOLA et al. 2015, AGGARWAL et al. 2014, TANDE u. PATEL 2014) Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis sind die beiden häufigsten Erreger von Implantatinfektionen in der orthopädischen Chirurgie (DAPUNT et al. 2016b, ARCIOLA et al. 2015). Zusammen sind sie zu ähnlichen Anteilen verantwortlich für bis zu zwei Drittel der Implantatinfektionen von Hüft- und Knieendoprothesen (DAPUNT et al. 2016b, ARCIOLA et al. 2015). In einer anderen Studie wurde Staphylococcus aureus allein als Infektionserreger von Hüft- und Knieinfektionen in circa 40 % der Fälle diagnostiziert (ARCIOLA et al. 2015). Pseudomonas aeruginosa kann in bis zu in 15 % der Fälle ursächliches Pathogen sein und Streptococcen in circa 9 % der Implantatinfektionen (DAPUNT et al. 2016b). Polymikrobielle Infektionen können bis zu 15 % der Implantatinfektionen bedingen (ARCIOLA et al. 2015). Enterococcus spp. kann in bis zu 10 % der Implantat- infektionen detektiert werden (DAPUNT et al. 2016b). Vor allem bei Hüftendo- prothesen wird Escherichia coli in bis zu 10% der Infektionen diagnostiziert (ARCIOLA et al. 2015). Infektionen von Schulter- und Ellenbogenendoprothesen zeigten ein geringgradig unterschiedliches Keimspektrum. Staphylococcus aureus und Koalgluase-negative Staphylococcen waren auch hier die Hauptinfektionserreger (TANDE u. PATEL 2014). Cutibacterium acnes, ein anaerobes Bakterium, welches in den Talgdrüsen der Haarfollikel vor allem in der Achselhöhle lebt, war verantwortlich für bis zu 24 % der Schulterprotheseninfektionen (PERRY u. LAMBERT 2006, TANDE u. PATEL 2014). Hämatogene Infektionen haben ihren Ursprung in einem anderen Infektionsherd und entstehen durch Bakteriämien (OCHSNER et al. 2014). Infektionserreger waren in diesem Fall häufig Staphylococcus aureus durch beispielsweise Hautinfektion,

3. Literaturübersicht 11

Salmonellen aus dem Gastrointestinaltrakt oder Escherichia coli auf Grund von Harnwegsinfektionen (SENDI et al. 2011b, GUPTA et al. 2014, OCHSNER et al. 2014).

Für den veterinärmedizinischen Bereich analysierte TURK et al. (2015) das Vorkommen von postoperativen Wundinfektionen bei Hunden (n=846) bis zu einem Zeitraum von 45 Wochen postoperativ (siehe Abbildung 1). Dabei stellte er als Erreger in circa 58 % der Infektionen Staphylococcus pseudointermedius fest. Dieser zeigte in 47,4 % der untersuchten Fälle Methicillin-Resistenzen. Methicillin resistente Staphylococcus aureus waren zu 15,8 % Erreger einer Infektion. Enterococccus spp. wurden in circa 11 % der Wundinfektionen isoliert. Klebsiellen, Pasteurella spp. und Streptococcus spp. wurden zu jeweils 5 % als ursächliche Keime nachgewiesen (TURK et al. 2015). In einer anderen Studie wurde aus postoperativen Wundinfektionen Staphylococcus pseudointermdius mit einem Anteil von 46 % isoliert, beta-hämolysierende Streptococcen in 24 % und Staphylococcus aureus in 8 % der Infektionen isoliert. Escherichia coli wurde mit einem Anteil von 11 % und Pasteurella multocida mit einem Anteil von 3 % isoliert. Weniger häufige Erreger waren Proteus mirabilis mit 2 %, Pseudomonas aeruginosa mit 2 % und Staphylococcus schleiferi coagulans zu 4 % (WINDAHL et al. 2015).

Abbildung 1: Infektionserreger von postoperativen Wundinfektionen in der Veterinärmedizin. Diese Abbildung wurde nach den Angaben in TURK et al. (2015) erstellt.

Auch wenn gramnegative Erreger in ihrer Wichtigkeit nicht unterschätzt werden dürfen, nehmen Staphylococcen als am häufigsten isolierte Erreger von implantatassoziierten Infektionen den größten Stellenwert ein (ARCIOLA et al. 2015, DAPUNT et al. 2016b, TURK et al. 2015). Auf Grund ihres Biofilmbildungsvermögens und der häufig vorkommenden Antibiotikaresistenzen sind sie eine besondere Herausforderung für die Therapie von implantatassoziierten Infektionen (IZANO et al. 2008, MÜHLHOFER et al. 2017, SHEEHY et al. 2010).

12 3. Literaturübersicht

3.4. Entstehung einer Implantatinfektion

Eine Implantatinfektion entsteht dann, wenn Bakterien die Implantatoberfläche kolonisieren und dadurch im Körper eine Entzündungsreaktion auslösen (WAGNER u. HÄNSCH 2017). Die Menge an Bakterien, welche notwendig ist, um eine Infektion am Ort des Geschehens hervorzurufen, ist bei dem Vorhandensein eines Implantates deutlich geringer als ohne Implantat, wie eine Studie in einem Meerschwein-Infektionsmodell mit einem subkutanen Implantat zeigte (ZIMMERLI et al. 1982). Eine 100.000-fache geringere Infektionskonzentration war ausreichend, um in dieser Studie bei Vorhandensein eines Implantates eine Infektion mit Staphylococcus aureus hervorzurufen. GRISTINA (1987) postulierte die Theorie des „Race for the Surface“. Die Entscheidung, ob eine Infektion entsteht oder nicht, hängt nach dieser Theorie davon ab, ob körpereigene oder Bakterienzellen zuerst das Implantat besiedeln. Mit der Anhaftung und Kolonisierung der Oberfläche geben sie der anderen Zellspezies keine Möglichkeit für eine Anlagerung auf der Implantatoberfläche. In Abhängigkeit von der Zellspezies (eukaryotische Zellen oder Bakterien), welche die Implantatoberfläche als erstes kolonisiert, entsteht eine Implantatinfektion oder wird verhindert. Sie postuliert, dass eine Oberfläche, auf der sich eukaryotische Zellen optimal anlagern können, eine Möglichkeit sein kann, um die Entstehung einer Implantatinfektion zu verhindern. Dieses Modell bezieht die Biokompatibilität und Gewebeintegration von Implantaten in den Körper mit ein und kann als Theorie auf die Erforschung und Wirksamkeitsprüfung von bakterienabweisenden Oberflächen angewendet werden (GALLO et al. 2014). Ein anderer wesentlicher Aspekt ist die Möglichkeit von verschiedenen Bakterienspezies, nach der Anlagerung und Vermehrung einen Biofilm auf Implantatoberflächen zu bilden (DAVIES 2003). Bakterien können sich durch diesen Biofilm vor der Abtötung durch körpereigene und therapeutische Strategien schützen (DAVIES 2003, FUENTE-NUNEZ et al. 2013). Um zu verstehen, warum durch Biofilmbildung Probleme bei der Therapie vom implantatassoziierten Infektionen entstehen und welche Forschungsansätze vielversprechend für die Bekämpfung der Biofilmbildung sind, wird in den folgenden Abschnitten die Bildung von Biofilm erklärt und auf die Mechanismen eingegangen, die den Biofilm resistenter gegenüber einer antimikrobiellen Therapie machen.

3.4.1. Die Bildung von Biofilm auf der Implantatoberfläche

Als Biofilm wird eine Masse aus Bakterien und hydrierter extrazellulärer Matrix definiert, welche fest auf einer Grenzfläche zweier Aggregatzustände haften, was in

3. Literaturübersicht 13

vielen Fällen eine feste Oberfläche in einer flüssigen Umgebung ist (FLEMMING u. WINGENDER 2010). Mehr als 80 % der chronischen bakteriellen Infektionen entstehen durch Biofilmbildung (COSTERTON et al. 1999). Diese wird initialisiert als Antwort auf eine negative Änderung von Umweltfaktoren (JEFFERSON 2004) und kann beispielsweise durch die Exposition von subinhibitorischen antimikrobiellen Substanzen entstehen (KAPLAN 2011).

Die Bildung von Biofilm erfolgt in fünf Phasen (DAVIES 2003). Diese Phasen sind in Abbildung 2 graphisch dargestellt. In der ersten Phase kommt es zu einer reversiblen Anlagerung der Bakterien an die Implantatoberfläche (DAVIES 2003). Auf den Transport und die reversible Anlagerung von Bakterien an das Implantat haben physikalische Kräfte, wie Gravitations- und Scherkräfte des Mediums sowie van der Waals Kräfte einen Einfluss (KATSIKOGIANNI u. MISSIRLIS 2004, GOTTENBOS et al. 2000). Daneben sind auch chemische Bindungen, hydrophobe Interaktionen und Chemo- oder Haptotaxis von Bedeutung für die Anlagerung der Bakterien (MAYER et al. 1999, KIROV 2003). Die Anlagerungskapazität der Bakterien an das Implantat ist abhängig von den Eigenschaften der Oberfläche, aber auch vom pH-Wert, der Umgebungs- temperatur, der Expositionszeit und der Bakterienkonzentration, sowie dem (Nicht-) Vorhandensein von antimikrobiellen Substanzen (SONG et al. 2015, BUNT et al. 1993, KATSIKOGIANNI u. MISSIRLIS 2004, SCHIERHOLZ et al. 2000). In der zweiten Phase binden sich die Bakterien fest an die Implantatoberfläche (KATSIKOGIANNI u. MISSIRLIS 2004). Dieser Prozess kann auf zwei Wegen stattfinden: Durch die Anhaftung auf der Implantatoberfläche über Zellfortsätze und Adhäsine oder durch die spezifische Bindung von körpereigenen Proteinen auf der Implantatoberfläche (MCKENNEY et al. 1998, CRAMTON et al. 1999, VAN HOUDT u. MICHIELS 2005, ARCIOLA et al. 2004, FOWLER et al. 2000, HERRMANN et al. 1988). In der dritten Phase der Biofilmbildung kommt es zu einer deutlichen Vermehrung der Zellen auf der Implantatoberfläche und zu einer Bildung von multiplen Zelllayern (SPEZIALE et al. 2009). Dadurch erfolgt die Bildung einer stabilen Mikrokolonie, welche die Grundlage für die Biofilmreifung darstellt (VEERACHAMY et al. 2014, SRIRAMULU et al. 2005). Nach der Bildung von multiplen Zellschichten erfolgt in der vierten Phase eine weitere Vermehrung von Bakterien und die Reifung des Biofilms über die die Bildung von extrazellulärer Polymer-Substanz (EPS) (FLEMMING u. WINGENDER 2010). Bei der Reifung des Biofilms werden hunderte von Genen aktiviert (TAYLOR et al. 2014, WHITELEY et al. 2001). Dadurch verändern die Bakterien ihre Lebensweise von einer planktonischen, freischwimmenden in eine sessile Form (GARRETT et al. 2008). Diese sessile Form ist durch eine geringere metabolische Aktivität, sowie einer verringerten Teilungs- und Wachstumsrate gekennzeichnet (WOOD et al. 2013,

14 3. Literaturübersicht

MEISSNER et al. 2013). In der fünften Phase erfolgt die Abgabe von einzelnen, plankonischen Bakterien aus dem Biofilm in die Umgebung, was zu einer Absiedlung von Bakterien in einen anderen Körperteil und dadurch zu einer neuen Infektion führen kann (VEERACHAMY et al. 2014). Diese Ablösung ist eine Antwort auf Änderungen der Umwelt, wie einem Über- oder Unterangebot an Nährstoffen (SAUER et al. 2004).

In einem Biofilm bilden sich verschiedene Mikroökosysteme aus, welche durch speziell darauf angepasste Subpopulationen oder Stämme besiedelt werden (DAVIES 2003). Ein Einfluss auf das innere Milieu des Biofilms haben verschiedene Faktoren, wie die Nähe zu Wasserkanälen, die Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff oder der pH-Wert (MARTINELLI et al. 2002). Die Versorgungs- bedingungen haben also auch einen wichtigen Einfluss auf die Wachstums- und Teilungsraten der Subpopulationen in einem Biofilm. Viele Biofilme bestehen zu über 90 % aus EPS, welche zum größten Teil von den Mikroorgansimen selbst produziert wird. Sie besteht aus Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren und Lipiden (FLEMMING u. WINGENDER 2010). Diese sorgen für die mechanische Stabilität, die Adhäsion an die Oberfläche oder für die interzelluläre Adhäsion und bilden daher ein dreidimensionales Grundgerüst, welches die Zellen untereinander verbindet und immobilisiert (FLEMMING u. WINGENDER 2010, MCKENNY et al. 1998, CRAMTON et al. 1999, LASA u. PENADES 2006, OTZEN u. NIELSEN 2008). Die Zusammensetzung der EPS variiert in Abhängigkeit der Spezies sowie des Stammes und in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen (FLEMMING et al. 2007). Extrazelluläre DNA (eDNA) ist in Staphylococcus aureus Biofilmen eine wichtige Komponente (IZANO et al. 2008). Sie wird von den Bakterien selbst produziert oder entsteht durch Zelllyse (THOMAS et al. 2008, ALLESEN- HOLM et al. 2006). eDNA stabilisiert die EPS, ist aber auch für Genetransfermechanismen verantwortlich, wodurch Resistenzgene zwischen verschiedenen Bakterienstämmen oder -spezies übertragen werden können (SAVAGE et al. 2013).

3. Literaturübersicht 15

Abbildung 2: Die fünf Phasen der Biofilmbildung. Die Abbildung ist adaptiert nach DAVIES (2003).

3.4.2. Resistenzmechanismen planktonischer und sessiler Bakterien

Resistenzmechanismen sind ein häufiger Grund für das Versagen von antimikrobieller Therapie (DAVIES 2003). Sie werden unterteilt in eine zelluläre und eine Gemeinschaftsresistenz (PENESYAN et al. 2015). Des Weiteren können sie die Immunantwort des Wirtes beeinflussen (THURLOW et al. 2011, HANKE u. KIELIAN 2012, WATTERS et al. 2016). Die Gemeinschaftsresistenz ist ein adaptiver Resistenzmechanismus im Biofilm, welcher durch Umweltfaktoren oder Wachstumskonditionen entsteht (TAYLOR et al. 2014). Beispielsweise können Biofilmbakterien zusätzliche antimikrobielle Resistenz erlangen, die bis zu 1000-fach höher ist als die ihrer planktonischen Gegenstücke (FUENTE-NUNEZ et al. 2013). Vor allem die Zellen tief im Biofilm zeigen verringerte Wachstums- und Teilungsraten (WOOD et al. 2013, MEISSNER et al. 2013, DAVIES 2003, STERNBERG et al. 1999). Da viele antimikrobielle Substanzen genau diese bakteriellen Prozesse angreifen, haben sie auf Biofilme eine deutlich verringerte Wirkung. Die produzierte Biofilmmatrix dient als Diffusionsbarriere, wodurch Antibiotika schwerer den Biofilm durchdringen können (HUANG et al. 1995, CAMPANAC et al. 2002). Bakterien in einem Biofilm bilden verschiedene zusätzliche Schutzfaktoren, wie Multidrug Efflux Pumpen (PAULSEN 2003, SOTO 2013). Diese spielen eine Rolle in der erhöhten Resistenz gegenüber Antibiotika und antimikrobiellen Wirkstoffen (FUENTE-NUNEZ et al. 2013). Das Vorhandensein von Persister Bakterien ist ein weiterer Grund für antimikrobielle Resistenzen von Bakterien (WOOD et al. 2013). Bei der Vermehrung der Bakterien können sie bis zu 1 % der Gesamtpopulation ausmachen (LEWIS 2006). Diese Subpopulation des Inokulums ist metabolisch inaktiv und ruht. Dadurch können sie

16 3. Literaturübersicht

schlecht durch antimikrobielle Substanzen behandelt werden und bilden einen Herd für rekurrierende und chronische Infektionen (LEWIS 2010).

Zelluläre Resistenzen entstehen durch die Mutation oder den Transfer von Genen (TAYLOR et al. 2014, WRIGHT 2007). Über verschiedene Mechanismen werden die Bakterien resistent gegenüber antimikrobiellen Stoffen (PAULSEN 2003, SOTO 2013). Die Bildung von so genannten „Small Colony Variants“ ist eine phänotypische Änderung in der exponentiellen Wachstumsphase der Bakterien (EDWARDS 2012). Sie kommen bei verschiedenen Spezies vor, wie Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa oder Escherichia coli (KAHL 2014). Sie sind gekennzeichnet durch eine kleinere Koloniegröße auf normalen Agarplatten und der herabgesetzten Pigmentation sowie Hämolyse der Kolonien (PROCTOR et al. 2006). Das Auftreten von „Small Colony Variants“ wurde vor allem nach Exposition von selektiven Wachstumskonditionen, wie einer Antibiotikagabe beschrieben (OCHSNER et al. 2014). „Small Colony Variants“ sind häufig resistent gegenüber Antibiotika oder Desinfektionsmitteln (OCHSNER et al. 2014). Diese Eigenschaften führen zu einer erhöhten Erregerpersistenz, weshalb diese Keime schwer zu behandeln sind und mit chronischen und persistierenden Infektionen in Verbindung gebracht werden (PROCTOR et al. 2006). Oft ist bei dem Auftreten von „Small Colony Variants“ ein radikales Therapiemanagement mit mehreren Operationen und langen Antibiotikabehandlungen erforderlich (OCHSNER et al. 2014).

Bakterien im Biofilm können zudem die Immunantwort des betroffenen Patienten beeinflussen (THURLOW et al. 2011, HANKE u. KIELIAN 2012, WATTERS et al. 2016). Ein reifer Biofilm auf der Implantatoberfläche kann vom Immunsystem schlechter eliminiert werden als planktonische Bakterien (LEID et al. 2002). Das liegt unter anderem an verschiedenen Schutz- und Eversionsmechanismen, die den Biofilm vor der Elimination durch Immunzellen schützen (THURLOW et al. 2011, GÜNTHER at al 2009, WATTERS et al. 2016). Einige dieser Mechanismen sind im folgenden Abschnitt kurz erläutert. Der reife Biofilm beeinflusst die Phagozytosefähigkeit der Leukozyten. Immunzellen können schlechter in den Biofilm eindringen und deren Phagozytoseaktivität wird reduziert (THURLOW et al. 2011, GÜNTHER et al. 2009). Staphylococcus aureus Biofilme können die natürliche Immunantwort durch die Reduktion des proinflammatorischen Milieus absenken, weil sie die Produktion proinflammatorischer Zytokine modellieren (THURLOW et al. 2011). Diese Modulation führt zu einer Differenzierung von proinflammatorischen in antiinflammatorische Makrophagen und zu einer fibrösen Abkapselung des Biofilms (HANKE u. KIELIAN 2012). Diese Abkapselung verstärkt die Resistenzmechanismen

3. Literaturübersicht 17

des Biofilms noch und führt dazu, dass antimikrobielle Wirkstoffe oder Immunzellen diesen schlechter erreichen können (HANKE u. KIELIAN 2012). Exopolysaccharide der EPS können die Aktivität von Toll-like-Rezeptoren reduzieren, über welche Bakterien erkannt werden oder sie setzen die Aktivität der PMN herab (WATTERS et al. 2016). Andere Exopolysaccharide stimulieren wiederum die Immunantwort, was zu einer Gewebedestruktion führt und in postoperativen Wundinfektionen eine ideale Umgebung für das Wachstum und die Vermehrung der Bakterien schafft (WATTERS et al. 2016).

3.5. Histopathologische Reaktion des Gewebes auf eine Infektion

Die Immunantwort spielt bei der Integration und späteren Stabilität des Implantates eine wichtige Rolle. Daher ist es von großer Bedeutung die pathologischen Veränderungen zu verstehen, die durch die Infektion des Implantates und Biofilmbildung auf der Oberfläche entstehen. Daher wird im folgenden Abschnitt die Immunantwort auf ein steriles und infiziertes Implantat erklärt, sowie auf einige Eversionsmechanismen von Bakterien im Biofilm eingegangen.

3.5.1. Immun- und Fremdkörperreaktion auf ein steriles Implantat

Durch das Einbringen eines Implantates in einen knöchernen Bereich entsteht im betreffenden Bereich ein zellulärer Gewebeschaden. Blutungen und das Austreten von Gewebeflüssigkeit sind die Folge (YU et al. 2015). Das Implantat wird nach dem Einbringen sofort von Blut- und Gewebeflüssigkeit überzogen, dem so genannten „Conditioning Film“ (GOTTENBOS et al. 2002). Dieser enthält unter anderem Thrombin und Fibrin (HIGGINS et al. 2009). Nach Aggregation und Aktivierung bildet sich ein Fibrin-Thrombin-Netz aus (SCHMIDT et al. 2009). Diese proinflammatorische Oberfläche lockt Zellen des Immunsystems an die Implantatoberfläche. Die ersten Zellen sind neutrophile oder polymorphkernige Granulozyten (PMN), die die Phagozytose von Geweberesten übernehmen (YU et al. 2015, SHEIKH et al. 2015). PMN sezernieren proteolytische Enzyme und reaktive Sauerstoffspezies, um die eingedrungenen Fremdkörper, in diesem Fall das Implantat, abzutöten und anschließend zu phagozytieren (DAPUNT et al. 2016a, FRANZ et al. 2011). Dieser Prozess kann zu einer Gewebeschädigung führen (FRANZ et al. 2011). Die PMN sezernieren außerdem proinflammatorische Zytokine und Chemokine, welche weitere Immunzellen anlocken (ROCHFORD et al. 2016). Die dabei angelockten Monozyten spielen eine kritische Rolle in der Wundheilung und Geweberegeneration (FRANZ et al. 2011). Sie differenzieren sich in

18 3. Literaturübersicht

Makrophagen (SPILLER et al. 2014). Diese neuen Makrophagen phagozytieren die Gewebereste und produzieren Chemokine, wodurch weitere Immunzellen angelockt werden (FRANZ et al. 2011, BROUGHTON et al. 2006). Die angelockten Immunzellen sezernieren Interleukine, welche bewirken, dass die Makrophagen die Gewebeheilung einleiten. Dabei wird das proinflammatorische in ein antiinflammatorisches Milieu umgewandelt, welches die Wundheilung verbessert (STEIN et al. 1992). Makrophagen sezernieren Enzyme und Zytokine, die eine Reorganisation des Gewebes bewirken und Fibroblasten anlocken sowie deren Proliferation fördern (BROUGHTON et al. 2006). Fibroblasten produzieren Kollagen und extrazelluläre Matrix um das Implantat (DARBY et al. 2014). Im weiteren Heilungsverlauf wird dieses Gewebe vaskularisiert und Osteoblasten wandern ein, die neues Knochengewebe bilden (KUZYK u. SCHEMITSCH 2011). Die Entzündungsphasen sollten nicht als ein streng chronologischer Prozess betrachtet werden, weil sich die pathophysiologischen Vorgänge überschneiden und ineinander übergehen (SILVA 2011). Kommt es zu einer Fremdkörperreaktion auf das sterile Implantat, wird der Prozess der Remodellierung und der Wundheilung unterbrochen und die chronische Entzündung fortgesetzt (LICKORISH et al. 2004). Die vorhandenen Makrophagen versuchen weiterhin das Implantat durch Phagozytose, die Sekretion von Enzymen und der Produktion von reaktiven Spezies zu entfernen (BAKER et al. 2014). Die chronische Entzündungsreaktion persistiert (LICKORISH et al. 2004). Da es sich bei dem Implantat um einen Fremdkörper handelt, der durch die Makrophagen nicht entfernt werden kann, fusionieren die Makrophagen zu Fremdkörperriesenzellen (YU et al. 2015, YANG et al. 2014). Dieser Prozess wird auch „frustrierte Phagozytose“ genannt (KZHYSHKOWSKA et al. 2015). Fremdkörperriesenzellen fördern die Einwanderung von Fibroblasten zum Implantat, die Kollagen um das Implantat ausscheiden (BAKKER et al. 1988). Es kommt zur Bildung von Granulationsgewebe. Über einen längeren Zeitraum bildet sich eine Kapsel um das Implantat, welche als Hauptmerkmal der Fremdkörperreaktion angesehen wird. Durch die Bildung der Kapsel und die daraus resultierende mangelnde Einheilung in den Knochen, verliert auch das Implantat seine Funktion und es kommt zur aseptischen Lockerung (BAKKER et al. 1988).

3.5.2. Immunantwort bei einer bakteriellen Infektion

Die Bildung des „Conditioning Films“, also die Anlagerung von Blut- und Gewebe- proteinen auf der Implantatoberfläche bildet ideale Voraussetzungen für die Absiedlung von Bakterien in diesen Bereich (YU et al. 2015). Das gebildete Fibrin- Thrombin-Netz erleichtert die initiale Infektion (GOTTENBOS et al. 2002). Durch die

3. Literaturübersicht 19

Zerstörung der natürlichen Hautbarriere und der inerten Oberfläche des Implantates können Bakterien leichter einwandern und sich gut anlagern (WAGNER u. HÄNSCH 2017). Dadurch ist eine geringere initiale bakterielle Inokulationsdosis ist für das Auslösen einer Infektion bei Vorhandensein eines Implantates notwendig als ohne Implantat (ZIMMERLI et al. 1982). Ein starker Gewebeschaden oder eine ausgedehnte Nekrose fördern das Überleben der Bakterien in der Wunde (ROCHFORD et al. 2012, SCHLEGEL u. PERREN 2006, ARENS et al. 1999). Durch das Vorhandensein des Implantates, aber auch durch den infektiösen Stimulus der Bakterien, kommt es zu einem massiven Einwandern von Immunzellen an den Infektionsort. Die ersten Zellen sind PMN (WAGNER u. HÄNSCH 2017). Sie setzen proinflammatorische Zytokine und Chemokine frei, die das proinflammatorische Milieu begünstigen und PMN, Makrophagen, aber auch andere Immunzellen, wie T-Lymphozyten anlocken (ROCHFORD et al. 2016, DAPUNT et al. 2014, WAGNER et al. 2008). Die PMN erkennen Lipopolysaccharide, Pathogen- assoziierte und mikrobiell-assoziierte molekulare Muster der Bakterien über Toll-like- Rezeptoren und werden dadurch aktiviert (OZINSKY et al. 2000, MEDZHITOV u. JANEWAY 2002). Sollte es den PMN nicht möglich sein die Bakterien durch Phagozytose zu eliminieren, kommt es zur Freisetzung von proteolytischen Enzymen, um die Bakterien abzutöten (ARCIOLA 2010). Dadurch wird das proinflammatorische Milieu aufrechterhalten und das Gewebe um das Implantat wird zerstört (ARCIOLA 2010, DAPUNT et al. 2016a). Auch Osteoklasten zerstören den Knochen durch die Lyse der Knochensubstanz (WAGNER u. HÄNSCH 2017, GAIDA et al. 2012). Die Eliminierung des Biofilms ist nicht unbedingt von der Anzahl der PMN abhängig, sondern von der Stärke der Immunantwort durch die oxidative Aktivität der PMN (NGUYEN et al. 2013). Bakterien besitzen die Möglichkeit, die Antwort der Zellen auf die Infektion zu modellieren. Staphylococcus aureus konnte in vitro die Differenzierung in proinflammatorische Makrophagen fördern (TROUILLET-ASSANT et al. 2015). Diese Makrophagen förderten die Differenzierung und Resorptionskapazität von Osteoklasten in einem in vitro Infektionsmodell, wodurch der Knochen stärker abgebaut wird. Staphylococcus aureus konnte die Knochenresorptionskapazität der Osteoklasten auch durch eine Förderung der Zellfusion erhöhen (TROUILLET- ASSANT et al. 2015). In Biopsien von Osteomyelitis Patienten wurde eine Korrelation der Anzahl von PMN und Osteoklasten im Cortex festgestellt. (GAIDA et al. 2012). Eine Persistenz des proinflammatorischen Milieus, welches durch Immunzellen aufrechterhalten wird, fördert folglich die Lyse von Knochenmatrix durch Osteoklasten (DAPUNT et al. 2016a). Das lysierte Knochengewebe wird durch fibrotisches Material ersetzt, bis wieder neuer Knochen gebildet wird (CYTEVAL 2016, TRINDADE et al. 2016).

20 3. Literaturübersicht

3.6. Therapiestrategien von Implantatinfektionen

Bei der Entscheidung für ein Therapiekonzept ist die genaue Einordnung der Symptome wichtig, um festzustellen, ob es sich um eine akute oder chronische Infektion handelt (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Entscheidend ist auch, ob die Funktion des Implantates erhalten ist (OCHSNER et al. 2014, OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Bei humanmedizinischen Endoprothesen ist ein prothesenerhaltender Therapie- versuch gerechtfertigt, wenn eine akute Infektion vorliegt, das Implantat fest im Knochen sitzt, das Weichteilgewebe intakt ist und die Erreger gut therapierbar sind (OSMON et al. 2013, PARVIZI et al. 2013, PARVIZI u. DELLA VALLE 2010). In diesem Fall kann operativ ein umfassendes chirurgisches Debridement erfolgen und wenn möglich der Austausch von nicht fest im Knochen verankerten Prothesenteilen, um eine maximale Keimreduktion zu erreichen. Diese Operationstechnik kann mehrfach wiederholt werden (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Wichtig ist die zusätzliche Therapie mit einem knochengängigen und gut bioverfügbaren Antibiotikum, auf das der Keim sensibel reagiert (OCHSNER et al. 2014). Bei grampositiven Biofilm- bildenden Keimen kann zusätzlich Rifampicin gegeben werden (KÖNIG et al. 2001). Intravenös sollte die Therapie begonnen werden und bei gutem Ansprechen oral über zwei bis sechs Wochen, bei Bedarf sogar bis zu maximal drei Monate weitergeführt werden (OSMON et al. 2013). Bei chronischen Infektionen mit Symptomen ab drei bis vier Wochen nach der Implantation ist die Therapie mit Antibiotika, wie beispielsweise Rifampicin, sehr schwierig und nicht unbedingt erfolgversprechend (REITER et al. 2012). Deshalb sollte hier ein ein- oder zweizeitiger Prothesenwechsel erfolgen (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Es sollte immer eine gezielte antimikrobielle Therapie nach Resistenztest erfolgen, die ausreichend lange fortgesetzt wird (OCHSNER et al. 2014, OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Antibiotika sollten gut bioverfügbar, knochengängig und Biofilm- penetrierend sein (OTTO-LAMBERTZ et al. 2017). Die Biofilmpenetrationsfähigkeit ist dabei abhängig vom Erreger (DAROUICHE et al. 1994, JEFFERSON et al. 2005, RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 2007, SINGH et al. 2010). Gut biofilmgängige Antibiotika sind beispielsweise Cirpofloxacin, Levofloxacin, Fosfomycin bei Escherichia coli- Biofilmen und Vancomycin bei Staphylococcus epidermidis- Biofilmen (RODRIGUEZ-MARTINEZ et al. 2007, SINGH et al. 2010, JEFFERSON et al. 2005). Rifampicin kann Biofilme von Staphylococcus aureus gut penetrieren, allerdings gibt es schon erste Resistenzen gegen dieses Antibiotikum (GREIMEL et al. 2017, KÖNIG et al. 2001 und REITER et al. 2012). Im veterinärmedizinischen Bereich ist Rifampicin für die Behandlung von nicht- Lebensmittel liefernden Tieren zugelassen. Allerdings sind im Moment in Deutschland keine Tierarzneimittel zugelassen, die Rifampicin enthalten (VETIDATA 2018c). Für Levofloxacin,

3. Literaturübersicht 21

Vancomycin und Fosfomycin gilt die gleiche Situation und für den Einsatz dieser Antibiotika müssen daher humanmedizinische Arzneimittel umgewidmet werden (VETIDATA 2018a, 2018b, 2018d). Da die zunehmende Anzahl an Resistenzen ein großes Problem darstellt, muss zusätzlich nach alternativen Methoden zur Reduktion von Implantatinfektionen gesucht werden.

3.7. Innovative Oberflächenmodifikationen für die Reduktion von implantatassoziierten Infektionen

Die Modifikation von Implantatoberflächen kann eine Möglichkeit sein, um Infektionen präventiv zu bekämpfen (GALLO et al. 2014, ROMANO et al. 2015). Vor ihrer klinischen Anwendung muss die antiinfektive Wirkung in vitro und in vivo nachgewiesen sein (DIEFENBECK et al. 2016). Neue Oberflächenmodifikationen müssen neben der antiinfektiven Wirkung auch biokompatibel und ohne Nebenwirkungen sein (GALLO et al. 2014, ROMANO et al. 2015). Sie sollten eine hohe mechanische Stabilität besitzen, um den mechanischen Stress während und nach der Operation auszuhalten (GALLO et al. 2014). Vor allem in der Endoprothetik spielt die Dauerstabilität des Implantates postoperativ eine wichtige Rolle. Deshalb sollte für diese Implantate ein Ansatz gewählt werden, der Bakterien schadet oder deren Anhaftung verhindert, aber die Anlagerung von körpereigenen Zellen nicht hemmt, sondern diese im Idealfall sogar fördert (GALLO et al. 2014). Im Hinblick auf hämatogene Infektionen ist ein langanhaltender antiinfektiver Effekt wichtig (CORVEC et al. 2012). Bei der Wirkungsweise wird unterschieden zwischen antiadhäsiven bzw. antiadsorptiven Oberflächen, die die initiale Adhäsion von Bakterien hemmen, und antibakteriellen Oberflächen, die die Bakterien bei Kontakt abtöten. Des Weiteren kann zwischen mono- und multifunktionalen Oberflächen oder so genannten „smarten Coatings“, unterschieden werden (GALLO et al. 2014).

3.7.1. Antibakterielle Oberflächenmodifikationen

Oberflächenbeschichtungen, die darauf abzielen Bakterien abtöten, lassen sich in anorganische oder organische Oberflächenbeschichtungen einteilen (GALLO et al. 2014). Die Modifikation von Implantatoberflächen mit anorganische Materialien umfasst die Beschichtung mit Silber, Kupfer- und Zink-Ionen oder mit Magnesium (CHENG et al. 2014, FUNAO et al. 2016, BRAISSANT et al. 2015, CHAI et al. 2011, PETRINI et al. 2006, QIN et al. 2015, ZENG et al. 2013). Die Beschichtungen wirken über die

22 3. Literaturübersicht

Freisetzung von Kationen, die in die Zellatmung, Zellteilung oder Zellmembranformation eingreifen und dadurch die Zellen abtöten (LEMIRE et al. 2013). Bei der Beschichtung mit Metallionen muss bedacht werden, dass diese ab einer bestimmten Konzentration zytotoxisch auch auf eukaryotische Zellen wirken. Das gilt vor allem für Kupfer und Zink, aber auch für Silber (HODGKINSON u. PETRIS 2012, MIJNENDONCKX et al. 2013, PETRINI et al. 2006). Bakterien sind außerdem in der Lage, Resistenzen gegen Metallionen auszubilden (SILVER 2003). Einige Silberbeschichtungen sind bereits erhältlich und können bei Bedarf hergestellt werden (ROMANO et al. 2015). Magnesium hat in vitro ebenfalls eine antibakterielle Wirkung gezeigt, die in einigen in vivo Studien bestätigt wurde (QIN et al. 2015, ZENG et al. 2013). ZENG et al. (2013) implantierte Magnesiumgranula in die Kaninchentibia und QIN et al. (2015) untersuchte die Wirkung eines Magnesium- Neodym-Zink-Zirconium-Kirschner Drahtes im Rattenfemur mit artifizieller Staphylococcus aureus Infektion. In beiden Studien wurde eine Reduktion der KBE/Knochen in der Magnesiumgruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe festgestellt. Eine andere Studie zeigte allerdings keinen antibakteriellen Effekt durch Magnesium in einem in vivo Maus-Modell, in dem die Implantate subkutan eingebracht und mit Staphyloccocus aureus infiziert wurden (RAHIM et al. 2016). Neben Metallen werden auch organische Verbindungen für antibakterielle Oberflächenbeschichtungen eingesetzt. Organisch gekoppelte Substanzen können antimikrobielle Peptide oder Antibiotika sein. Diese Substanzen werden entweder durch ein Linkermolekül, wie beispielsweise Poly-DL-Lactid oder Polyetherether- ketone, kovalent an die Oberfläche gebunden oder direkt auf die Oberfläche aufgesprüht (VESTER et al. 2010, DAROUICHE 2007, DIEFENBECK et al. 2016). Verschiedene Antibiotika können so an die Oberfläche gekoppelt werden (DIEFENBECK et al. 2016, DAROUICHE 2007, VESTER et al. 2010). Studien haben bereits die Wirksamkeit von mit Antibiotika beschichteten Implantaten bestätigt. Getestete Antibiotika waren beispielsweise Vancomycin, Rifampicin, Ciprofloxacin oder Gentamycin (ANTOCI et al. 2007, DAROUICHE 2007, CASTRO et al. 2003, DIEFENBECK et al. 2016). Die Anwendbarkeit dieser Formulierungen ist allerdings begrenzt, da sie nur gegen sensible Bakterien eingesetzt werden können. Auf Grund der Resistenzlage gegenüber Antibiotika muss vorher klar sein, wie lange die minimale Hemmkonzentration überschritten wird. Aus diesen Gründen eigene sie sich nur für die Kurzzeitbehandlung und weniger für die Prävention (GALLO et al. 2014). Antimikrobielle Peptide, wie beispielsweise Enoxacin oder Bacitracin (NIE et al. 2017a, 2017b) zeigten eine antibakterielle Wirkung in vivo und in vitro. Resistenzbildungen traten bei antimikrobiellen Peptiden weniger schnell auf als bei Antibiotika (DOBSON et al. 2013). Daher stellen sie eine alternative Behandlungsmethode zu Antibiotika dar.

3. Literaturübersicht 23

Substanzen wie Carolacton oder peptidische Nukleinsäuren konnten die Biofilmbildung auf der Oberfläche in vitro hemmen (HANSEN et al. 2016, RECK et al. 2011, STUMPP et al. 2015). Positiv geladene Polymere wie quartäre Ammoniumverbindungen oder Chitosan wurden allein oder in Kombination mit anderen mikrobiellen Substanzen getestet und zeigten einen antibakteriellen Effekt in vitro (ANTONUCCI et al. 2012, FU et al. 2005). Hydrogele, die direkt in der Operation mit Antibiotika beladen werden können, eignen sich ebenfalls nur für den Kurzzeiteinsatz, da sie nach kurzer Zeit abgebaut werden (OVERSTREET et al. 2015).

3.7.2. Multifunktionale und „smarte“ Beschichtungen

Multifunktionale Systeme wurden entwickelt, um den antibakteriellen Effekt und den Aspekt der Biokompatibilität zu verbinden (GALLO et al. 2014). Es sind Oberflächen- beschichtungen, die antiadhäsive Moleküle oder antimikrobielle Substanzen mit Substanzen verbinden, welche die Einheilung in das Gewebe fördern. Beispiele für dafür sind Kombinationen aus Heparin und Chitosan (FU et al. 2005) oder Arginin- Glycerin-Aspartat (MUSZANSKA et al. 2014). Allerdings besitzen diese Oberflächen- beschichtungen keine Langzeitstabilität und chronische Implantatinfektionen können immer noch auftreten. Daher werden so genannte smarte Beschichtungen entwickelt, welche multifunktional, selbst- antwortend und selbst- reparierend sind (GALLO et al. 2014). Sie besitzen Nanocontainer für z.B. antimikrobielle Wirkstoffe (SCHNEIDER u. DECHER 2008, ZHAO et al. 2013). Diese Nanocontainer besitzen Sensoren, die auf bestimmte Signale, wie beispielsweise einen pH-Wert Abfall, eine Temperaturveränderung oder mechanische, chemische oder elektrochemische Veränderungen reagieren und dadurch ihre Wirkstoffe freisetzen (SHCHUKIN u. MOHWALD 2013, SHCHUKIN u. MOHWALD 2007, YU et al. 2013). Antibakteriell wirksame multifunktionale Systeme wurden bereits erfolgreich in vitro getestet (YU et al. 2013, PARVIZI et al. 2007).

3.7.3. Antiadhäsive Oberflächenmodifikationen

Die Anlagerung von Bakterien an die Implantatoberfläche hängt neben den Eigenschaften der Umgebung von der Beschaffenheit der Oberfläche ab (SONG et al. 2015, KATSIKOGIANNI u. MISSIRLIS 2004, SCHIERHOLZ et al. 2000, BUNT et al. 1993). Die elektrische Ladung, Hydrophilie oder Hydrophobie und die Rauigkeit bzw. Topographie der Oberfläche sind weiterhin entscheidende Faktoren (HARRIS et al. 2004, DOLL et al. 2016a, ANTONUCCI et al. 2012, ZHU et al. 2014, SONG et al.

24 3. Literaturübersicht

2015, POORTINGA et al. 2001). Sie können die Anlagerungskapazität sowohl positiv, als auch negativ beeinflussen. Bakterien in wässrigen Lösungen sind im Allgemeinen negativ geladen (RIBEIRO et al. 2012). Allerdings variiert die Ladung in Abhängigkeit vom Medium, dem pH-Wert, dem Alter und der Oberflächenstruktur der Bakterien (AN et al. 1997, KATSIKOGIANNI u. MISSIRLIS 2004). Im Allgemeinen würde eine negativ geladene Oberfläche also abstoßend auf Bakterien wirken (SONG et al. 2015). Polyurethan, das mit Polyethylenglycol und negativ geladenen Molekülgruppen modifiziert wurde, konnte beispielsweise die Adhäsion von Escherichia coli und Staphylococcus epidermidis in vitro im Vergleich zur unbehandelten Polyurethanoberfläche reduzieren (PARK et al. 1998). Allerdings können tote Zellen oder eine Oxidschicht die Oberfläche maskieren und ihr bakterienabweisendes Potential reduzieren (SONG et al. 2015). Antiadhäsive Polymerbeschichtungen sind hydrophob und stoßen hydrophile Bakterien ab (ROMANO et al. 2015, ROJO et al. 2008). Allerdings können diese Materialien auch die zelluläre Antwort des Wirtes negativ beeinflussen und sollten daher nicht als einzige Beschichtung verwendet werden (ROMANO et al. 2015). Beschichtungen mit Proteinen, wie dem hydrophilen Heparin konnte eine Anlagerung von Staphylococcus aureus in vitro reduzieren (ARCIOLA et al. 1993). Vernetztes Albumin konnte in einer in vivo Studie im Kaninchen eine Reduktion der bakteriellen Adhäsion von Staphylococcus epidermidis bewirken (AN et al. 1997). Die Hydrophilie oder Hydrophobie von Bakterien variiert in Abhängigkeit von der Spezies, den Wachstumsbedingungen, dem Alter und der Oberflächenstruktur des Bakteriums (KREKELER et al. 1989, HOGT et al. 1985). Daher kann nur eine ausschließlich auf Hydrophile oder Hydrophobie basierende Oberflächenmodifikation die Anlagerung von Bakterien nicht komplett verhindern. Superhydrophobe Oberflächen haben einen Wasserkontaktwinkel größer als 120° (LAFUMA u. QUERE 2003). Diese Oberflächen findet man in der Natur beispielsweise auf Lotusblättern. Die Struktur besteht aus kugelförmigen Mikrostrukturen, die zusätzlich von einer unregelmäßigen Nanostruktur bedeckt sind (ZHU et al. 2014). Eine Nachbildung dieser Struktur in Titan zeigte in vitro einen reduzierenden Effekt auf die Anlagerung von Pseudomonas aeruginosa (FADEEVA et al. 2011). Ein abweisender Effekt gegenüber der Anlagerung von Staphylococcus aureus konnte hingegen nur innerhalb der ersten Stunde der Inkubation festgestellt werden (TRUONG et al. 2012). Der superhydrophobe Effekt von Lotusstrukturen beruht auf in kleinen Kavitäten der Oberfläche eingeschlossenen Luftblasen, welche den direkten Kontakt der Bakterien mit der Oberfläche verhindern. Bei längerer Inkubation in Flüssigkeit wird diese Luft mit der Zeit durch Medium ersetzt, wodurch ein direkter Kontakt und eine Anlagerung der Bakterien möglich werden. Ob die Anlagerung der Bakterien an die Lotusstruktur am Ende erfolgreich ist, ist nun wieder speziesabhängig (FADEEVA et al. 2011).

3. Literaturübersicht 25

Strukturen, die die verfügbare Oberfläche maximieren, führen meist zu einer verstärkten Anlagerung von Bakterien (KATSIKOGIANNI et al. 2006). Das ist in der Regel bei raueren Oberflächen der Fall (KATSIKOGIANNI u. MISSIRLIS 2004). Die Ausprägung der Anlagerung und das Anlagerungsverhalten variiert allerdings spezies- und stammspezifisch (OLSON et al. 2006, HOU et al. 2012). Oberflächen, die diese Anlagerungsfläche verringern, wirken also antiadhäsiv. Eine solche Strukturierung von Implantatoberflächen kann dazu beitragen, die Anlagerung von Bakterien zu reduzieren (CHUNG et al. 2007, DOLL et al. 2016a, GE et al. 2015, SKOOG et al. 2018, IVANOVA et al. 2012, JAGGESSAR et al. 2017). CHUNG et al. (2007) untersuchte die bakterienabweisende Wirkung von Sharklett AFTM-Strukturen in vitro auf Platin-katalysiertem Poly-(dimethyl)-Siloxan Elastomer mit dem Staphylococcus aureus Stamm ATCC 29213. Diese Struktur ist der Haihaut nachempfunden und besteht aus geometrisch angeordneten rautenförmigen Mikrostrukturen mit Dimensionen von ca. 2 µm. Eine Reduktion der Biofilmbildung von Staphylococcus aureus auf den Sharklett AFTM-Strukturen von 3 % nach zwei Tagen Inkubation bis hin zu 40 % nach 21 Tagen Inkubation wurde festgestellt. Die anhaftenden Bakterien waren hauptsächlich in den Vertiefungen der Struktur zu finden. DOLL et al. (2016a) testete die bakterielle Besiedlung von Staphylococcus aureus DSM 2569 auf Sharklett AFTM-ähnlich strukturierten Titanoberflächen, die mittels ultra-kurz gepulster Laserablation hergestellt wurden. Auf allen Strukturen wurde nach 24 Stunden eine Reduktion der bakteriellen Besiedlung von circa 15 % festgestellt. Titan-besputterte Spikes auf Silizium wurden durch ultra-kurz gepulste Laserablation in verschiedenen Größen (kleine: 2 µm, mittelgroße: 5-6 µm, große: 10-20 µm) für in vitro Versuche hergestellt (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten). Mit steigender Spikegröße wurde nach Inkubation mit Staphylococcus aureus eine vermehrte Oberflächenbesiedlung durch Bakterien bei den größeren Spikes im Vergleich zu kleinen und mittelgroßen Spikes beobachtet. Die Anlagerung von Staphylococcus aureus auf verschiedenen Säulenstrukturen auf Silizium (0,6 µm bis 20 µm) wurde von GE et al. (2014) in vitro untersucht. Staphylococcus aureus zeigte nach 12 Stunden Inkubation im Vergleich zur Kontrolle bereits eine verringerte Anlagerung bei 20 µm und 10 µm großen Säulen. Die bakterielle Anlagerung nahm mit sinkenden Abständen der Säulen zueinander weiter ab. Nach 24 Stunden Besiedlung der Säulen mit Staphylococcus aureus zeigte sich ein ähnliches Bild wie nach 12 Stunden Inkubation. Eine Oberflächenmodifikation auf Silizium, die Zirkadenflügeln nachempfunden ist und ebenfalls aus säulenartigen Erhebungen besteht, zeigte eine antibakterielle Wirkung gegen Pseudomonas aeruginosa in vitro (IVANOVA et al. 2012). Mit der gleichen Struktur auf Titan wurde bei der Inkubation mit Staphylococcus aureus eine verringerte Anlagerung im Vergleich zur unstrukturierten Titankontrolle festgestellt, aber eine stärkere Anlagerung als die von Pseudomonas aeruginosa (HASAN et al. 2017).

26 3. Literaturübersicht

Da davon auszugehen ist, dass eine Strukturierung der Implantatoberfläche auch eine Auswirkung auf die umgebenden eukaryotischen Zellen hat, sollte auch das in die Evaluation einer Oberflächenmodifikation mit einbezogen werden (SKOOG et al. 2018). Auf Grund der erwünschten schnellen und stabilen Einheilung ist besonders bei künstlichen Gelenken die Integration der Oberfläche durch Anlagerung von Zellen von großer Bedeutung. In diesem Fall sollte allerdings nicht nur die Anlagerungskapazität betrachtet werden, sondern auch wie aktiv die Zellen sind und wie viel extrazelluläre Matrix sie produzieren (SCHLIE et al. 2011, DEIWICK et al. 2014, FADEEVA et al. 2016). In vitro wurde die Wirkung der Zirkardenflügel- ähnlichen Oberfläche auf die Anlagerung und Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen untersucht (HASAN et al. 2017). Sie besiedelten auf der modifizierten Oberfläche eine deutlich geringere Fläche im Vergleich zur glatten Titanoberfläche. Allerdings zeigten sie ein höheres osteogenes Potential durch eine höhere Aktivität von Knochenmarkern. Die Anlagerungskapazität einer Fibroblasten- Zelllinie wurde auch auf der mit Staphylococcus aureus vorbesiedelten Zirkardenflügel-ähnlichen Siliziumoberfläche getestet (PHAM et al. 2016). Die Zellen wuchsen auf der vorbesiedelten Oberfläche und waren am Tag sieben konfluent. Sie verformten sich allerdings und bildeten weniger Ausläufer im Vergleich zur nicht strukturierten Siliziumoberfläche. DEIWICK et al. (2014) und FADEEVA et al. (2016) untersuchten die osteogene Wirkung von humanen Stammzellen aus dem Fettgewebe auf Lotusstrukturierten Titan-Oberflächen, die mittels ultra-kurz gepulster Laserablation hergestellt wurden. Obwohl weniger Zellen auf der strukturierten Oberfläche wuchsen und diese nicht so ausgebreitet waren, zeigten diese eine stärkere Adhäsion an die Oberfläche über verschiedene Ausläufer. Außerdem wurde eine Erhöhung von osteogenen Markern auf der Lotusstruktur festgestellt, was eine erhöhte Produktion von Knochenmatrix zur Folge hat. Spikestrukturen, die eine ähnliche Topographie hatten, aber im Vergleich zu den Lotusstrukturen kleiner waren, wurden auf ihr Anlagerungsvermögen für Fibroblasten und Osteoblasten getestet (SCHLIE et al. 2011, FADEEVA et al. 2009). Sie zeigten eine geringgradig reduzierte Anlagerung von Fibroblasten, aber einen proliferativen Effekt auf eine Osteoblasten-Zelllinie (SCHLIE et al. 2011). Auf Silizium wurden Titan-besputterte Spikes für in vitro Versuche durch ultra-kurz gepulste Laserablation in verschiedenen Größen (kleine: 2 µm, mittelgroße: 5-6 µm, große: 10-20 µm) hergestellt (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten). Es zeigte sich, dass sich humane und murine Fibroblasten und Osteoblasten besser auf kleinen Spikes anlagern als auf großen Spikes. Spätestens nach sieben Tagen waren Fibroblasten auf den kleinen und mittleren Spikes konfluent. Im Hinblick auf die geringere bakterielle Besiedlung auf kleineren Spikes, weisen die kleineren Spikes das Potential auf, selektiv die Anlagerung und Differenzierung von Zellen zu verbessern, ohne dabei die bakterielle Adhäsion zu

3. Literaturübersicht 27

begünstigen. In vivo könnte dieses Verhalten die Einheilung deutlich fördern und einen Anlagerungsvorteil im Vergleich zu den Bakterien bieten.

Die Testung von strukturierten Implantaten in vivo ist in Mausmodellen beschrieben. PHAM et al. (2016) untersuchte die Zirkadenflügel-ähnliche Oberfläche auf Silizium. Diese Implantate wurden subkutan zwischen die Schulterblätter implantiert. Eine Infektion wurde nicht ausgelöst. Eine minimale Infiltration mit Makrophagen wurde nach 15 Tagen beobachtet sowie eine geringere Fremdkörperreaktion im Vergleich zu nicht strukturierten Siliziumimplantaten. In einem murinen Infektionsmodell wurden lammellenartige Strukturen auf Polystyrol in die Bauchhöhle implantiert und mit Staphylococcus aureus Stamm 15981 zwei Tage postoperativ infiziert (VALLE et al. 2015). Sieben Tage postoperativ zeigten die großen, lamellenartig strukturierten Polystyrolimplantate eine geringere Menge an KBE/Implantat im Vergleich zu nicht strukturierten Polystyrolimplantaten.

Ein großer Nachteil vieler Strukturen auf Titan ist die aufwändige Fertigung, da auf Grund der Härte des Materials und der häufig geometrisch genau definierten Strukturen das Erstellen sehr langwierig und aufwändig ist (ELBOURNE et al. 2017). Für eine potentielle klinische Anwendung muss daher eine Struktur gefunden werden, die großflächig und schnell auf die Implantatoberfläche aufgebracht werden kann. Diese sollte möglichst bakterienabweisend sein, aber die Anlagerung von körpereigenen Zellen ermöglichen und im Idealfall sogar fördern. Für einen vereinfachten Zulassungsprozess sollte das Herstellungsverfahren die Oberfläche idealerweise nicht chemisch verändern und keine Rückstände hinterlassen, was durch die Anwendung von Ätzverfahren oder ähnlichen Methoden nicht ausgeschlossen werden kann (LI et al. 2012). Selbstorganisierende Strukturen, die mittels ultra-kurz gepulster Laserablation gefertigt werden, könnten dafür die Lösung sein (JAGGESSAR et al. 2017).

3.8. Tiermodelle für die Evaluation neuer Strategien zur Prophylaxe und Therapie von Implantatinfektionen

Geeignete Tiermodelle sind unabdingbar, um neue Implantate auf ihre Wirksamkeit zu testen, vor allem in Hinblick auf die Sicherheit des Patienten und die spätere Marktzulassung. Die Auswahl des Tiermodells ist vor allem abhängig von der Fragestellung. Im orthopädischen Bereich werden vor allem Ratte, Maus oder Kaninchen als Versuchstiere eingesetzt, da die Haltung größerer Versuchstiere aufwändiger und teurer ist (PERIC et al. 2015). Ratten sind mit 53 % die am häufigsten eingesetzte

28 3. Literaturübersicht

Spezies für Infektionsmodelle im orthopädischen Bereich. Sie eignen sich auf Grund ihrer Größe im Vergleich zur Maus gut für die Wirksamkeitsprüfung komplexerer Implantate. Die Haltung ist unkompliziert und kostengünstig (LOVATI et al. 2017). Des Weiteren ist die Existenz verschiedener gut charakterisierter Stämme von Vorteil bei der Untersuchung von Risikofaktoren wie beispielsweise Diabetes mellitus (KERN et al. 2010). Der histologische Knochenaufbau der Nager variiert allerdings im Vergleich zum Menschen. Unterschiede zu humanen Knochen sind einerseits das fehlende System von Haver`schen Kanälen und andererseits die permanent offenen Epiphysenfugen. Trotz dieser Unterschiede eignen sich Nager gut für die Wirksamkeitsprüfung neuer Therapiestrategien (PERIC et al. 2015).

Vor allem low-grade Infektionen stellen ein großes diagnostisches und therapeutisches Problem dar. Auf Grund ihrer unspezifischen Symptome sind sie schlecht von einer aseptischen Lockerung zu unterscheiden (SCHMIDT et al. 2011). Im Normalfall infizieren sich Patienten intraoperativ, aber die Symptome treten verzögert auf (TRAMPUZ u. WIDMER 2006). Die Zeit von der Infektion bis zum Auftreten der Symptome ist sehr kritisch, da den Infektionserregern genügend Zeit bleibt, einen reifen, schlecht zu therapierenden Biofilm auszubilden (PENESYAN et al. 2015). Aus diesem Grund ist es sinnvoll, ein Tiermodell zu wählen, welches die schwierigen diagnostischen und therapeutischen Anforderungen der low-grade Infektion wiederspiegelt. Es ist möglich, die Implantatinfektion auf unterschiedlichem Wege zu simulieren. Bei den meisten orthopädischen Modellen wird die Simulation einer perioperativen Infektion über die Injektion einer Bakteriensuspension gewählt (FUKUSHIMA et al. 2005, HAENLE et al. 2013, JØRGENSEN et al. 2014, LUCKE et al. 2003a, 2003b). Andere Autoren konnten mit der Methode der Vorbesiedlung im Vergleich zur Injektion eine quantitativ höhere Infektionsrate erzeugen (MONZÓN et al. 2001, 2002). Auch für die Simulation einer hämatogenen Absiedlung liegen Tiermodelle im Schwein oder der Maus vor (HORST et al. 2012, JOHANSEN et al. 2011, JOHANSEN et al. 2012). Staphylococcus aureus ist in bis zu 40 % der Fälle der verantwortliche Erreger für die Infektionen von Hüft- und Knieendoprothesen (ARCIOLA et al. 2015). Auf Grund häufig auftretender Antibiotikaresistenzen und seiner Biofilmbildungskapazität ist dieser Erreger ein wichtiges Pathogen, der in Tiermodellen eingesetzt wird (FURUSTRAND TAFIN et al. 2012, ZAJONZ et al. 2016b, AN u. FRIEDMAN 1998, REIZNER et al. 2014, AN et al. 2006, LOVATI et al. 2017). Die eingesetzten Staphylococcus aureus Stämme sind vielfältig. Es handelt sich aber in den meisten Fällen um klinische Isolate aus humanen entzündlichen Geweben, vorrangig von periprothetischen Infektionen, Infektionen von Osteosynthesematerialien, aber auch Septiditen (REIZNER et al. 2014). Die eingesetzten Konzentrationen variieren stark

3. Literaturübersicht 29

und liegen in den Bereichen von 102 bis 108 KBE (AN et al. 2006, REIZNER et al. 2014, LOVATI et al. 2017). Die Entzündungsreaktion im Tiermodell ist in Abhängigkeit von der eingesetzten Inokulationskonzentration des Erregers unterschiedlich stark ausgeprägt (LUCKE et al. 2003a, FUKUSHIMA et al. 2005). Bei sinkenden Infektionskonzentrationen sind die korrespondierenden Infektionssymptome in der Bildgebung und Histologie in den meisten Fällen geringer (LUCKE et al. 2003a, FUKUSHIMA et al. 2005, VOGELY et al. 2000). Mit sinkender Infektionskonzentration sinkt aber auch der Prozentsatz an infizierten Tieren. (LUCKE et al. 2003a, MONZÒN et al. 2002, METSEMAKERS et al. 2016). Low-grade ähnliche Infektionen werden in Tiermodellen vor allem durch Staphylococcus aureus in geringen Infektionskonzentrationen simuliert (LOVATI et al. 2017, FÖLSCH et al. 2015, HAENLE et al. 2013, SØE et al. 2013, LUCKE et al. 2003a, 2003b, DIEFENBECK et al. 2016, HARRASSER et al. 2016, FUKUSHIMA et al. 2005). Die eingesetzten Konzentrationen variieren, liegen aber zumeist im Bereich von 101 bis 104 KBE/Tier (LOVATI et al. 2017, LUCKE et al. 2003a, HARRASSER et al. 2016, HAENLE et al. 2013). Bei der Wahl des Infektionserregers sollte darauf geachtet werden, dass er in dem gewählten Versuchstier auch eine Reaktion auslöst. Das Immunsystem der Ratte ist sehr effektiv, was dazu führt, dass human pathogene Keime in human infektionsauslösenden Konzentrationen bei Ratten oft keine adäquate Infektion zeigen (OFLUOGLU et al. 2007). Somit ist der Einsatz von rattenpathogenen Infektionserregern von Vorteil, um die sofortige Eliminierung der Erreger durch das Immunsystem zu verhindern und so eine Situation zu simulieren, die das Krankheitsbild des Menschen besser abbildet (MEISSNER 1959). Nicht zu vergessen ist die stammspezifische Reaktion von Erregern in einem Tiermodell. In einem Mausmodell für subkutane Abszesse wurde beispielsweise gezeigt, dass ein Verlust der Stickoxid-Synthase die Virulenz und Abszessausbildung herabsetzt (VAN SORGE et al. 2013). Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass sich die Anlagerungs- und Biofilmkapazität bei unterschiedlichen Stämmen einer Bakterienspezies deutlich unterscheidet (OLSON et al. 2006, HOU et al. 2012). Daher sollte die Infektionskonzentration in jedem Modell vorher überprüft werden, um verlässlich die gewünschte Infektion und Ausprägung zu erzeugen.

Tiermodelle, die Endoprothesen oder –teile mit Gelenkbeteiligung als Implantat für das Infektionsmodell nutzen, sind in Nagern und im Kaninchen beschrieben (SØE et al. 2013, CARLI et al. 2017, SOUTHWOOD et al. 1985). Ein Infektionsmodell im Kaninchen mit Hüftendoprothese wurde von SOUTHWOOD et al. (1985) beschrieben. In dieser Studie wurde Staphylococcus aureus als Infektionserreger in einer Konzentration von 105 KBE/Tier genutzt. Infektionen von Knieendoprothesen und -teilen sind in der Ratte und in der Maus beschrieben (SØE et al. 201, CARLI et

30 3. Literaturübersicht

al. 2017). Der Infektionserreger war ebenfalls ein Staphylococcus aureus Stamm und die Infektionsdosen für eine nachweisbare Infektionsreaktion lagen bei 103 und 105 KBE/Tier. Kompliziertere Tiermodelle simulieren die Realität besser, als Tiermodelle, die einfachere Implantate ohne Gelenkbeteiligung verwenden, wie beispielsweise Kirschner Drähte (LUCKE et al. 2003a, FÖLSCH et al. 2015, DIEFENBECK et al. 2016). Allerdings sind vereinfachte Tiermodelle für eine standardisierte Untersuchung von Beschichtungen oder Oberflächenmodifikationen ebenfalls geeignet. Es kann außerdem davon ausgegangen werden, dass die Schmerzhaftigkeit bei dem Vorhandensein einer Gelenkinfektion deutlich höher ist, als ohne Gelenkbeteiligung (BUFALARI et al. 2016). Daher sollte bei der Wahl des Tiermodells auch die Belastung des Versuchstieres in Betracht gezogen werden, welche im Sinne des drei R-Prinzips so gering wie möglich gehalten werden sollte RUSSEL u. BURCH 1959). Die Charakterisierung der Implantatinfektion im Tiermodell wird im Normalfall durch den Nachweis und die Quantifizierung der Entzündungsreaktion im Umgebungsgewebe des Implantates durchgeführt. Für Verlaufsuntersuchungen der Knochenstruktur eigenen sich vor allem bildgebende Verfahren, wie Röntgen, mikrocomputertomographische (µCT) oder magnetresonanztomographische Aufnahmen (NISKA et al. 2012, STADELMANN et al. 2015, HORST et al. 2012). Anschließend können die erhobenen Daten qualitativ oder quantitativ ausgewertet werden. Bei der Auswertung von Röntgenaufnahmen werden vor allem semiquantitative Scores verwendet (AN u. FRIEDMAN 1998, LUCKE at al. 2003, FUKUSHIMA et al. 2005). µCT Aufnahmen und magnetresonanztomographische Aufnahmen können qualitativ, semiquantitativ über Scores oder quantitativ, z.B. durch die Messung von Knochenvolumen oder –dichte, ausgewertet werden (ALT et al. 2011, ODEKERKEN et al. 2013, HORST et al. 2012, NISAK et al. 2012). Post mortem können die betreffenden Areale histologisch aufgearbeitet werden und die Entzündungsreaktion über Standard- oder Spezialfärbungen nachgewiesen werden (ALT et al. 2011, SKINNER et al. 1992, STADELMANN et al. 2015, NISKA et al. 2012, JOHANSEN et al. 2012, JOHANSEN et al. 2011, AN u. FRIEDMAN 1998, HARRASSER et al. 2016, VOGELY et al. 2000). Für den Nachweis der Knochenveränderungen eignet sich beispielsweise die Toluidinblau-Färbung gut. Mit der Hämatoxylin-Eosin-Färbung können vor allem Zellen gut dargestellt werden (MULISCH et al. 2010). Die Färbung mittels tartratresistenter saurer Phosphatase eignet sich zum Nachweis von knochenabbauenden Osteoklasten, die bei einer bakteriellen Entzündung unter anderem für die Knochenlyse verantwortlich sind (PARK et al. 2013, TROUILLET-ASSANT et al. 2015). Die histologisch nachweisbaren Veränderungen können qualitativ oder semiquantitativ über Score Schema erfasst werden (STADELMANN et al. 2015, NISKA et al. 2012, JOHANSEN et al. 2012, JOHANSEN et al. 2011, AN u. FRIEDMAN 1998, HARRASSER et al. 2016, VOGELY et al. 2000, FUKUSHIMA et al. 2005).

3. Literaturübersicht 31

3.8.1. Bestimmung der Infektionslast im Tiermodel

Neben dem geeigneten Tiermodell ist auch die Wahl der Auswertungsmethode für den Nachweis der Bakterien und die Bestimmung der Infektionslast am Implantat entscheidend. Ein Problem stellt der Erregernachweis bzw. die Quantifizierung der Bakterien auf der Implantatoberfläche dar. Im Idealfall kann durch die Nachweismethode die Infektionslast quantifiziert werden, und die Erreger können in ihrem ursprünglichen Siedlungsverband dargestellt werden, um zu bestimmen, ob sie in einem Biofilm wachsen oder nicht. Zum Nachweis der Bakterien sind für die in vivo Versuche verschiedene Methoden etabliert: der Abklatsch von Implantaten auf Blutagar, die Gewebehomogenisierung oder die Ablösung der Bakterien vom Implantat mittels Ultraschall mit anschließender Bestimmung der KBE (LUCKE et al. 2003a, HAENLE et al.2013, JØRGENSEN et al. 2014, VIDLAK u. KIELIAN 2016). Im folgenden Abschnitt werden die Vor- und Nachteile dieser Methoden erläutert und es wird auf mögliche innovativere Nachweismethoden eingegangen. Der Abklatsch oder Abstrich vom Implantat kann lediglich zum qualitativen Nachweis der Bakterien dienen (LUCKE et al. 2003a, DIEFENBECK et al. 2016). Andere Methoden bestimmen quantitativ die Bakterienlast, indem umgebendes Gewebe homogenisiert, in Verdünnungsreihen auf Blutagar ausgestrichen wird und nach Bebrütung die KBE ausgezählt werden (VIDLAK u. KIELIAN 2016, HAENLE et al. 2013, FUKUSHIMA et al. 2005, JØRGENSEN et al. 2014). Diese Methode stellt eine Standardmethode bei der Evaluation von Implantatinfektionen in der Forschung dar. Trotzdem sind die Ergebnisse dieser Quantifizierung mit Bedacht zu betrachten. Gründe dafür sind, dass sich Bakterien in einem Biofilm in unterschiedlichen Wachstumszuständen befinden. Das heißt, viele Bakterien befinden sich in ihrer sessilen und damit stoffwechselreduzierten Form (DAVIES 2003). Diese Bakterien lassen sich schlecht bis gar nicht anzüchten, sind aber lebensfähig und stellen ein Infektionsrisiko dar (WOOD et al. 2013, LEWIS 2010). Einige Bakterien wachsen nur unter streng anaeroben Bedingungen oder besonders langsam (OCHSNER et al. 2014, TAVERNIER u. COENYE 2015). Das führt zu erschwerten Kultivierungs- bedingungen und reduziert die Sensitivität der Methode (LEWIS 2010). Außerdem ist bei der Probenentnahme aus dem Umgebungsgewebe der Ursprung der Bakterien nicht eindeutig zuzuordnen (KERSTENS et al. 2015). Ein Nachweis darüber, ob die Bakterien auf der Implantatoberfläche einen Biofilm gebildet haben, ist mit dieser Methode nicht möglich, da ein etwaiger Biofilm durch die Methode selbst zerstört wird. Auf Grund der Resistenz von Erregern in einem Biofilm und den daraus resultierenden therapeutischen Problemen, ist die Identifikation von möglichem Biofilm auf der Implantatoberfläche wünschenswert (FUENTE-NUNEZ et al. 2013). Außerdem muss bei der Ultraschall-basierten Methode beachtet werden, dass durch

32 3. Literaturübersicht

die Prozedur ein Teil der Bakterien abgetötet wird und auf Grund der oben genannten Gründe die quantitative Bestimmung der Infektionserreger nur mit Einschränkungen möglich ist (DOLL et al, 2016b, DAVIES 2003, LEWIS 2010). Eine Kombination aus den oben geschriebenen Verfahren eignet sich also gut für den qualitativen Nachweis der Bakterien in vivo. Bei der quantitativen Auswertung durch Auszählung der KBE dürfen die oben beschriebenen Nachteile nicht außer Acht gelassen werden.

Der Nachweis von Bakterien mittels PCR ist ebenfalls möglich (FREIRE et al. 2011, LI et al. 2008). Die eigentliche PCR ist aber qualitativer Natur und dient deshalb nur zum Nachweis der bakteriellen DNA (TAVERNIER u. COENYE 2015). Eine quantitative Aussage über die bakterielle Menge ist durch die Verwendung der quantitativen oder real-time PCR möglich (AMMANN et al. 2013). Mit Hilfe einer Fluoreszenzreaktion kann das PCR Produkt quantitativ bestimmt werden (AMMANN et al. 2013). Dennoch kann die PCR per se keine Aussagen über die Morphologie der Bakterien auf der Implantatoberfläche treffen.

Bildgebende Verfahren eigenen sich gut zum Nachweis von Bakterien in vitro und in vivo (DOLL et al. 2016a, 2016b, GLAGE et al. 2017, ALT et al. 2011, CARLI et al. 2017, JØRGENSEN et al. 2014). Oft wird die die konfokale Laserscanning Mikroskopie (CLSM) mit vorheriger Lebend/Tot- Fluoreszenzfärbung oder die Rasterelektronenmikroskopie (REM) verwendet (DOLL et al. 2016a, 2016b, GLAGE et al. 2017, CARLI et al. 2017). Beide Methoden haben den Vorteil, die Bakterien in ihrem ursprünglichen Siedlungsverbund darstellen zu können. Bei der Lebend/Tot- Färbung ist es zudem möglich, die Morphologie der Bakterien ohne vorherige Trocknung zu untersuchen und zusätzlich zwischen lebend und tot zu unterscheiden (CARLI et al. 2017, DOLL et al. 2016a, 2016b). Ein Score Schema, das die morphologischen Charakteristika der Biofilmbildung berücksichtigt, wurde von GLAGE et al. (2017) in einem neurochirurgischen Rattenmodell etabliert. Eine Schraube wurde in die Schädelkalotte implantiert, mit dem Staphylococcus aureus Stamm 36/07 infiziert, nach Entnahme Lebend/Tot gefärbt und anschließend mit dem CLSM mikroskopiert. Das Score Schema bewertet den Nachweis von Bakterien über die Vergabe von null (keine Bakterien) bis fünf (Biofilmbildung) Punkten und wertet so aufsteigend die bakterielle Besiedlung. Es handelt sich bei dieser Methode also um eine semiquantitative Evaluation für Besiedlungsunterschiede. In vitro bietet die Lebend/Tot- Färbung und anschließende Mikroskopie die Möglichkeit der quantitativen Auswertung durch Software-gesteuerte Berechnung des Biofilmvolumens (DOLL et al. 2016a, 2016b). In vivo ist die quantitative Auswertung allerdings schwieriger, da neben den Bakterien auch eukaryotische Zellen die Implantatoberfläche besiedeln. Diese Zellen sollten bei der Auswertung nicht vernachlässigt werden, da die Ergebnisse andernfalls eine zu große

3. Literaturübersicht 33

vermeintlich bakterielle Besiedlung ergeben. Zu diesem Zeitpunkt ist in der verfügbaren Literatur noch keine Methode bekannt, die für die Quantifizierung der bakteriellen Biomasse in vivo angewendet wurde. Daher wurde die bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche noch nicht gleichzeitig quantitativ und morphologisch erfasst. Diese Methodik soll in der vorliegenden Arbeit etabliert werden.

3.9. Ziel der Arbeit

Auf Grund diagnostischen und therapeutischen Probleme von Implantatinfektionen, war das erste Ziel dieser Arbeit die Etablierung einer low-grade ähnlichen Implantatinfektion mit Staphylococcus aureus in der Ratte im Rahmen einer Pilotstudie. Dabei mussten die geeignete Infektionsdosis und der geeignete Infektionsweg bestimmt werden. Die bakterielle Besiedlung der Implantatoberfläche, aber auch die Entzündungsreaktion des Knochens auf das Implantat sollten mittels bildgebender und histologischer Verfahren charakterisiert werden. Die Einführung einer CLSM-basierten Methodik für die Quantifizierung und morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung auf Implantatoberflächen in dem etablierten in vivo Model war das zweite Ziel der Arbeit. Basierend auf den Ergebnissen der Pilotstudie sollte im Rahmen der Hauptstudie die Hypothese überprüft werden, dass eine laserstrukturierte Implantatoberfläche mit einer definierten Spikestruktur zu einer reduzierten Implantatinfektion führt.

34 4. Material und Methoden

Material und Methoden

4.1. Überblick über den Versuchsaufbau

Die im Rahmen dieser Studie durchgeführten Arbeiten sind in eine Pilot- und eine Hauptstudie gegliedert. Das Ziel der Pilotstudie war es, eine low-grade ähnliche Implantatinfektion mit Staphylococcus aureus in der Ratte zu etablieren. Dafür mussten die Fragen beantwortet werden, welcher Infektionsweg und welche Infektionsdosis für die Erzeugung einer low-grade ähnlichen Implantatinfektion mit Staphylococcus aureus geeignet sind. Des Weiteren wurde eine Methode etabliert, mit der die Quantifizierung der vitalen bakteriellen Biomasse auf der Implantatoberfläche möglich ist. Basierend auf den Ergebnissen der Pilotstudie wurde in der Hauptstudie eine durch ultra-kurz gepulste Laserablation hergestellte spikestrukturierte Implantatoberfläche auf ihr Vermögen, die hervorgerufene Implantatinfektion zu reduzieren, getestet. Einen Überblick über den Versuchsablauf gibt die Abbildung 3.

Abbildung 3: Überblick über den Ablauf der Versuche.

4. Material und Methoden 35

4.2. Geräte, Programme, Medikamente und Verbrauchsmaterialien

Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Geräte und Programme. Produkt Beschreibung Hersteller µSurf Custom Konfokales Mikroskop Nanofocus, Oberhausen, Deutschland Aesculap Isis, Modell Tierschermaschine Aesculap Suhl GmbH, Suhl, GT415/420 Deutschland BD ED 100 Feinwaage Sartorius AG, Göttingen, Deutschland BioPhotometer Photometer Eppendorf, Hamburg, Deutschland Cleanwizard Clean Bench Kojair®, Vilppula, Finnland Colibri II Bohrmaschine Synthes, Umkirch, Deutschland Diamant Säge Säge Exakt, Helsinki, Finnland Digitales Röntgen digitales Röntgengerät WDT diagnstic X ray ULTRA 10040HF EMB 2200-0 Tierwaage Kern und Sohn GmbH, Balingen, Deutschland Femtopower Compact Femtosekundenlasersystem Femtolasers Produktions Pro GmbH, Österreich GFL 3005 Schüttler Omnilab GmbH und Co.KG, Bremen, Deutschland GraphPad Prism, Statistikprogramm Graphpad Software Inc., La Version 6.01 Jolla, USA Heraeus Multifuge 1S- Zentrifuge ThermoFisher Electron LED R GmbH, Osterode, Deutschland Image J, Version Grafikprogramm Wayne Rasband, National 1.4sV Institute of Health, USA Imaris x64, Version Grafik- und Bitplane AG, Zürich, Schweiz 8.4 Auswertungssoftware INE 200 Excellent Brutschrank Memmert GmbH und Co. KG, Schwabach, Deutschland Inveon µCT Micro-Computertomograph Siemens AG, München, Deutschland Keyenze BZ9000E Inverses Fluoreszenz- Keyence Deutschland Phasenkontrast-Mikroskop GmbH, Neu-Isenburg, Deutschland LAS AF Lite Grafikprogramm für die Leica Microsystems, Wetzlar, CLSM Aufnahmen Deutschland

36 4. Material und Methoden

Leica DM LFSA TCS Konfokales Mikroskop Leica Microsystems, Wetzlar, SP2 Deutschland Leica MZFLIII Stereomikroskop Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland Maxisafe 2020 Clean Bench ThermoFisher Scientific, Braunschweig, Deutschland MicroDicom Viewer, Programm zur Darstellung MicroDicom, Sofia, Bulgarien Version 2.0.0 der µCT Aufnahmen, Photoshop CS6, Grafikprogramm Adobe Systems, San José, Version 13.0 USA PowerPro 4000 Poliermaschine Buehler, Esslingen, Deutschland Quanta 400 F Rasterelektronenmikroskop Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA RCT basic Magnetrührer mit IKA Werke GmbH und integrierter Heizplatte Co.KG, Staufen, Deutschland RM 2155, 2255 Mikrotom Leica Biosystems, Nussloch, Deutschland Schnellschleifgerät Dremel mit Sägeaufsatz Brüder Mannesmann Werkzeuge GmbH, Remscheid, Deutschland Schüttelinkubator Typ Schüttelinkubator Gesellschaft für Labortechnik 3032 mbH, Burgwedel, Deutschland SPSS, Version 25 Statistikprogramm IBM, Armonk, USA Synergy 2 Microplate Reader BioTek, Bad Friedrichshall, Deutschland Thermometer Infrarotthermometer Medisana®, Neuss, Deutschland Tissue-Tek® TEC® 5 Paraffinausgießkonsole Sakura, Staufen, Deutschland Tissue-Tek® VIP 5 Einbettautomat Sakura, Staufen, Deutschland VetRay® Diagnostic Archivierungs- und VetRay® N e.K Workstation Bearbeitungsprogramm für Hettenshausen, Deutschland die Röntgenbilder Vortex Genie 2 Vortexmischer neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Deutschland Zeiss Axioskop, Auflichtmikroskop Carl Zeiss Microscopy Modell Scope A.1, GmbH, Jena, Deutschland Zeiss Crossbeam 540 Rasterelektronenmikrskop Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland

4. Material und Methoden 37

Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Medikamente. Produkt Beschreibung Hersteller Antisedan® Atipamezolhydrochlorid Zoetis Schweiz GmbH, Zürich, Schweiz Bepanthen® Augen- Dexpanthenol Bayer Health Care, und Nasensalbe Leverkusen, Deutschland Butorgesic Buthorphanol CP-Pharma, Burgdorf, Deutschland Dormicum® Midazolam Dormicum®, 1mg/kg KGW, Hameln Pharma Plus GmbH, Hameln, Deutschland Dormitor® Medetomidinhydrochlorid Pfizer Deutschland GmbH, Berlin, Deutschland Fentanyl-Janssen® Fentanylcitrat Janssen-Cilag GmbH, Neuss, Deutschland Flumazenil-hameln Flumazenil Hameln Pharma Plus GmbH, Hameln, Deutschland Isofluran CP® Isofluran CP-Pharma, Burgdorf, Deutschland Ketamin 10 % Ketaminhydrochlorid WDT, Garbsen, Deutschland Kochsalz-Spüllösung 0,9 %-ige Natrium-Chlorid- B. Braun, Melsungen, 0,9 % Lösung Deutschland Kodan® Hautdesinfektionsmittel Schülke und Mayr GmbH, Norderstedt, Deutschland Naloxon Inresa Naloxonhydrochlorid Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland ProntoVet® Wunddesinfektionslösung WDT, Garbsen, Deutschland Rimadyl® Caprofen Pfizer Deutschland GmbH, Berlin, Deutschland Silberspray Wundabdeckung Pharmamedico GmbH, Twistringen, Deutschland Sterofundin® HEG-5 Infusionslösung B. Braun, Melsungen, Deutschland Tramal Tramadolhydrochlorid Grünethal GmbH, Stolberg, Deutschland Xylavet® Xylazinhydrochlorid CP-Pharma, Burgdorf, Deutschland

Tabelle 3: Übersicht über die verwendeten Verbrauchsmaterialien. Produkt Beschreibung Hersteller 2,5 %-ige 2,5 %-ige Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Glutardialdehydlösung Glutardialdehydlösung in Deutschland PBS

38 4. Material und Methoden

20 G Kanüle Steril, Durchmesser 0,90x Sterican®, B Braun, 40 mm Melsungen, Deutschland 2-Isopropylalkohol Lösung für die De-/ Carl Roth GmbH und Co. Rehydrierung der Schnitte, KG, Karlsruhe, Deutschland 96 % in A. dest., 70 % in A. dest. 48-Well Platte Well-Platte für die Lagerung Greiner Bio-One GmbH, der Implantate Frickenhausen, Deutschland Altromin 1324 TPF Haltungsfutter Altromin Spezialfutter, Lage, Deutschland Blutagarplatten Mit 5 % Schafblut Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Deutschland Collagenase 4 mg/ml Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland CRP-EILSA Ratte- CRP ELISA Kit Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Deckgläser 24x 60 mm Omnilab GmbH und Co.KG, Bremen, Deutschland Dispase 2 mg/ml Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland EDTA Röhrchen Volumen 1,3 ml Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland Eosin 1 %-ige Lösung in A. dest. Merck Chemicals GmbH, Darmstadt, Deutschland Eppendorf Tubes Volumen 1,5 ml, Safe-Lock Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH, Wesseling-Berzdorf, Deutschland Falcon Volumen 15 und 50 ml Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland Formaldehyd Fixierlösung, Carl Roth GmbH und Co. 3,5-3,7 % phosphatgepuffert, pH 7,2 KG, Karlsruhe, Deutschland Glasplatte Hitzebeständig, 7x 7 cm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main, Deutschland Glycerin 1 ml 50 %-ige Lösung in Carl Roth GmbH, Karlsruhe, 0,5 ml TSB Deutschland Hämalaun Lösung nach Mayer Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Hartklebewachs Modellier- und Gusswachs SILADENT Dr. Böhme und Deiberit 500 Schöps GmbH, Goslar, Deutschland Hepes Puffer 150 mM Sigma-Alrich, Taufkirchen, Deutschland

4. Material und Methoden 39

Histosette Maße: 41x 27,5x 6 mm3 und Carl Roth GmbH, Karlsruhe, 41x 27,5x 12 mm3 Deutschland Impfschlinge Schlingenvolumen 10 µl Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland Kimtech Tissue Tech Labortücher KIMBERLY-CLARK GmbH, Koblenz, Deutschland Knochenwachs 12 Einheiten je 2,5 g Assut Europe S.p.A., Leipzig, Deutschland Kochsalz- Lösung 0,9 %-ige Natrium-Chlorid- B. Braun, Melsungen, 0,9 % Lösung Deutschland L- förmige Spatel Steril, 146x 38 mm2, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Durchmesser 4 mm Deutschland LIVE/DEAD™ Bacterial Viability Kit Thermo Fisher Scientific, BacLight™ (Lebend/Tot- Farbstoff) Schwerte, Deutschland MEA 2-Methoxyethylacetat Merck Chemicals GmbH, Darmstadt, Deutschland Menzel Gläser Objektträger Thermo Fisher Scientific, SUPERFROST® Schwerte, Deutschland Neuros Model 1701 Hamilton Spritze, Hamilton, Bonaduz, Schweiz RN Volumen: 10 µl OP-Lochfolie Sterile Abdeckfolie Mölnlycke®, Düsseldorf, Deutschland PBS Steril, ohne Calcium und Biochrom, Berlin, Magnesium Ddeutschland Permanent Marker Wasserfest Schneider Schreibgeräte GmbH, Schramberg, Deutschland Poly-L-Lysin Chemikalie für die Sigma-Alrich, Taufkirchen, Objektträgerbeschichtung Deutschland Ponal Express Chemikalie für die Conrad Electronic SE, Objektträgerbeschichtung Hirschau, Deutschland PURE™ Paraffin Polymerfrei Medite GmbH, Burgdorf, Deutschland Röhrchen Volumen 13 ml, zum Ansatz Sarstedt AG und Co., der Vorkultur Nümbrecht, Deutschland Roti®- Histokitt II Eindeckmedium Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland Rotilabo® mini- Tupfer, Kopfdurchmesser Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Wattestäbchen, 2 mm Deutschland Serum Röhrchen Volumen 300 µl und 1,3 ml Sarstedt AG und Co., Nümbrecht, Deutschland Snuggle Safe Heizkissen WDT, Garbsen, Deutschland Technovit® 9100 Neu Chemikalie für die Heraeus Kulzer GmbH, Technoviteinbettung Wehrheim, Deutschland

40 4. Material und Methoden

Titan/ Aluminium/ Ti90/Al6/V4, GoodFellow GmbH, Bad Vanadium-Folien 50x50x0,8 mm3 Nauheim, Deutschland Toluidinblaulösung 0,1 %-ige Lösung in A. dest. Merck Chemicals GmbH, Darmstadt, Deutschland Tris HCl 50 mM, pH 7,5, Tris- Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Hydrochlorid Deutschland Tryptische Soja 15 g Tryptische Soja Oxoid, Wesel, Deutschland Bouillon Boullion 1,5 g Hefeextrakt Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Ad 500 ml A. dest. Tryptische Soja 15 g Tryptische Soja Oxoid, Wesel, Deutschland Boullion mit 50 mM Boullion Glucose 1,5 g Hefeextrakt Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe, Deutschland 5,45 g Glucose Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe, Deutschland Ad 500 ml A. dest. USEDECALC® Entkalkungslösung Medite GmbH, Burgdorf, Deutschland Vicryl 4-0 Resorbierbares Ethicon, Norderstedt, Nahtmaterial Deutschland Xylol Entparaffinierungsmedium Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland

4.3. In vitro Versuche 4.3.1. Herstellung und Charakterisierung der Implantate

Die Implantate für die Pilot- und Hauptstudie wurden aus zwei 50x50x0,8 mm³ großen Titan/Aluminium/Vanadium-Folien (Ti90/Al6/V4) hergestellt (n=79 Implantate pro Platte). Im Institut für Werkstoffkunde der Leibniz Universität Hannover wurden die Ti90/Al6/V4-Folien mittels Wasserstrahlschneidverfahren auf eine Größe von 0,8x0,8x12 mm3 final zugeschnitten. Diese sind exemplarisch in Abbildung 4 dargestellt. Die Oberfläche der Implantate wurde angeraut, damit die Bakterien gute Bedingungen für eine Anlagerung auf der Oberfläche vorfinden (DOLL et al. 2016a, 2016b). Dafür wurden alle Implantate der Pilotstudie und Hauptstudie im Werkstoffprüflabor der Klinik für Zahnärztliche Prothetik und Biomedizinische Werkstoffkunde der Medizinischen Hochschule Hannover standardisiert poliert. Die Implantate wurden nebeneinander in zwei Reihen auf einer Glasplatte angeordnet. Hartklebewachs wurde auf einer Heizplatte bei 100 °C verflüssigt und die Implantate

4. Material und Methoden 41

damit umschlossen. Nach Ausrichtung der Implantate und Abkühlen des Wachses klebten die Implantate in den zwei Reihen fest auf der Glasplatte. Die obenliegende Implantatseite wurde mit einer 45 µm Scheibe auf einer Poliermaschine bei 250 rpm poliert. Nach Abschluss des Poliervorgangs wurde das Wachs auf der Heizplatte wieder verflüssigt und die Implantate wurden auf die angrenzende Seite gedreht und der Polierprozess wiederholt. Diese Wiederholung erfolgte im Anschluss auch für die Seiten drei und vier. Nach Abschluss des Poliervorgangs wurden alle Implantate in Aceton von Wachsresten befreit. Eine Analyse der Oberflächenrauigkeit der polierten Implantate (n=3 je Charge) erfolgte durch das Institut für Fertigungstechnik und Werkzeugmaschinen der Leibniz Universität Hannover. Sie wurde mit einem konfokalen Mikroskop unter Anwendung eines Gauß-Filters von 0,25 mm nach DIN ISO Norm 25178 und 4287 durchgeführt.

Abbildung 4: Darstellung der Maße der verwendeten Implantate. (A) veranschaulicht die Länge des Implantates in der Aufsicht und (B) stellt die Maße des Implantates schematisch dar.

Für die Gruppe mit laserstrukturierten Implantaten der Hauptstudie wurden 20 Implantate nach der Politur im Laserzentrum Hannover e.V. zusätzlich strukturiert. Durch den Einsatz eines Femtosekundenlasersystems unter Verwendung eines 60 mm Achromates und einer Fluenz der Laserstrahlung von 3,3 J/cm² mit circa 200 Laserpulsen wurde eine Spikestruktur auf der Implantatoberfläche generiert. Je eine Implantatoberfläche des Referenzimplantats und des laserstrukturierten Implantats wurden unter einem Stereomikroskop untersucht. Zur Charakterisierung wurde des Weiteren exemplarisch eine rasterelektronenmikroskopische Untersuchung der Implantatoberfläche durchgeführt. Die Aufnahmen mit dem Rasterelektronenmikroskop wurden von der Zentralen Einrichtung für Raster- elektronenmikroskopie der Medizinischen Hochschule Hannover und im Laserzentrum Hannover e.V. angefertigt (n=1 Implantat pro Gruppe). Die Proben wurden in Aceton gereinigt und mit Gold besputtert. Die Aufnahmen wurden mit 10kV und unter Verwendung eines Kammer-Sekundärelektronendetektors angefertigt.

42 4. Material und Methoden

4.3.2. Infektionserreger

Als Infektionserreger wurde der rattenpathogene Staphylococcus aureus Stamm 36/07 verwendet, welcher im Zentralen Tierlabor und Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover aus dem Schwein isoliert und für die Versuche zur Verfügung gestellt wurde (BARAKI et al. 2012). Dieser Erreger wurde bereits erfolgreich in einem neurochirurgischen Infektionsmodell in der Ratte eingesetzt und zeigte Biofilmbildung in diesem Modell (GLAGE et al. 2017). Die Bakterien wurden routinemäßig in aliquotierten Glycerolstocks zu je 10 µl bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert. Ein Antibiogramm des betreffenden Erregers wurde vom Institut für medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover mit dem VITEK® 2 System in der Version 07.01 erstellt und ist in der Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4: Antibiogramm des Versuchskeims Staphylococcus aureus 36/07. + bedeutet abgeleitete Antibiotika Antibiotikum Minimale Interpretation Hemmkonzentration (mg/l) Cefoxitin-Screen negativ - Benzylpenicillin ≥0,5 resistent + Ampicillin resistent + Amoxicillin/ Clavulansäure sensibel +Ampicillin/ Sulbacatam sensibel Oxacillin ≤0,25 sensibel + Cefaclor sensibel + Cefazolin sensibel + Cefuroxim sensibel + Ertapenem sensibel + Imipenem sensibel + Meropenem sensibel Gentamycin ≤0,5 sensibel + Tobramycin sensibel + Ciprofloxacin resistent Levofloxacin 4 resistent Erythromycin ≤0,25 sensibel Clindamycin 0,25 sensibel Linezolid 2 sensibel Daptomycin 0,25 sensibel Teicoplanin ≤0,5 sensibel Vancomycin ≤0,5 sensibel

4. Material und Methoden 43

+ Doxycyclin resistent Tetracyclin ≥16 resistent Tigecycline ≤0,12 sensibel Fosfomycin ≤8 sensibel Fusidinsäure ≤0,5 sensibel Mupirocin ≤2 sensibel Rifampicin ≤0,003 sensibel Trimethoprim/ Sulfamethoxazol ≤10 sensibel

4.3.3. Ansatz der Bakteriensuspension

Für den Ansatz der bakteriellen Injektionslösung für die in vivo Versuche wurde am Vortag eine Vorkultur aus dem Glycerolstock von Staphylococcus aureus 36/07 auf Blutagar angesetzt. Dafür wurden 5 µl der Stocklösung auf Blutagar ausgestrichen. Am OP Tag wurde eine Kolonie gepickt und die Bakteriensuspension steril in 0,9 %-iger NaCl-Lösung angesetzt. Die Konzentration wurde über die Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Photometer eingestellt. Dieses Verfahren misst die optische Dichte bzw. die Absorption bei 600 nm, um die Trübung der Lösung zu bestimmen. Diese Trübung korrespondiert mit einer definierten Zellzahl. Um die zur Konzentration korrespondierende OD600 einzustellen, wurden Kolonien von Staphylococcus aureus 36/07 in der sterilen NaCl-Lösung durch Vortexen gelöst. Anschließend wurde die OD600 gemessen. Bis zum Erreichen der Ziel-OD wurden weitere Kolonien in der NaCl-Lösung gelöst. Die Ziel-ODs und die korrespondierenden Injektionskonzentrationen sind in Tabelle 5 aufgeführt. Um die Konzentration der hergestellten Bakteriensuspension zu überprüfen, wurde eine 1:10 Verdünnungsreihe in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) vor und nach der Verwendung erstellt und 100 µl jeder Verdünnungsstufe auf Blutagar ausgestrichen. Nach 24 Stunden Bebrütungszeit bei 37 °C unter aeroben Bedingungen wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt und die KBE/ml ermittelt. Aus den Einzelwerten wurde der arithmetische Mittelwert gebildet. Von der Konzentration vor und nach der OP, sowie der Konzentration mehrerer Ansätze auf Grund mehrerer OP Tage wurde der arithmetische Mittelwert gebildet. Bis zur Verwendung wurde die Bakteriensuspension bei Raumtemperatur gelagert.

44 4. Material und Methoden

Tabelle 5: Ziel-OD600 und korrespondierende Bakterienkonzentrationen der Injektionssuspensionen. Bakterienkonzentration Ziel-OD600 106 KBE/10 µl 0,64 105 KBE/10 µl 0,064 104 KBE/10 µl 0,014 103 KBE/10 µl 0,003

4.3.4. Vorbesiedlung der Implantate

Für die Vorbesiedlung wurden die Implantate (n= 20) bei 121 °C für 20 Minuten autoklaviert und vor Versuchsbeginn 30 Minuten in 70 %-igem Ethanol desinfiziert und anschließend unter der Clean Bench getrocknet. Die Vorkultur für die Vorbesiedlung der Implantate wurde am Vortag in tryptonischer Soja Bouillon (TSB) mit 5 µl der Bakterienstocklösung des Staphylococcus aureus 36/07 angesetzt und über Nacht bei 37 °C aerob in einem Schüttelinkubator inkubiert. Nach Zentrifugation bei 5000 rpm für 15 Minuten und zweimaligem Waschen der Vorkultur mit TrisHCl wurde die Inkubationslösung in TrisHCl angesetzt. Die Zielkonzentration war 107 KBE/ml und erfolgte durch Einstellung einer OD600 von 0,77 nm mit einem Photometer. Die Kontrolle der Bakterienkonzentration erfolgte wie in Punkt 4.3.3. beschrieben über das Ausplattieren und Auszählen von Bakterienkolonien nach Durchführung einer Verdünnungsreihe. Die Implantate wurden in 48-Well Platten fünf Stunden, aerob bei 37 °C schüttelnd bei 400 rpm mit 1 ml der TrisHCl-Bakteriensuspension inkubiert. Anschließend wurde die TrisHCl-Bakteriensuspension abgezogen und durch 1 ml TSB mit 50 mM Glucose ersetzt. Die Implantate wurden stehend 12 Stunden bei 37 °C unter aeroben Konditionen inkubiert. Acht vorbesiedelte Implantate wurden in der Pilotstudie implantiert. Auf Grund von zwei Operationstagen wurden 12 Implantate für die Überprüfung der bakteriellen Besiedlung verwendet. Pro Operationstag wurden drei Implantate Lebend/Tot gefärbt (siehe Punkt 4.4.8.), um die Menge der bakteriellen Besiedlung mikroskopisch zu kontrollieren. Von je drei Implantaten pro Operationstag wurden die Bakterien abgelöst, um die Menge der KBE auf der Implantatoberfläche zu ermitteln. Um die Bakterien von der Implantatoberfläche zu lösen, wurden die Implantate in jeweils 500 µl einer Enzymsuspension aus 4 mg/ml Collagenase und 2 mg/ml Dispase in PBS inkubiert (DOLL et al. 2016b). Die Implantate wurde zuerst 30 s in der Enzymlösung gevortext und anschließend zwei Stunden bei 37 °C, aerob und schüttelnd bei 600 rpm inkubiert. Im Anschluss an die Inkubationszeit wurden die

4. Material und Methoden 45

Implantate ein weiteres Mal für zwei Minuten gevortext. Die entstandene Enzym- Bakteriensuspension wurde nach Erstellung einer 1:10 Verdünnungsreihe in PBS auf Blutagar ausgestrichen. Nach 24 Stunden Bebrütungszeit bei 37 °C unter aeroben Konditionen wurden die Kolonien ausgezählt und die KBE/ml ermittelt. Aus den Einzelwerten wurde der arithmetische Mittelwert gebildet. Bis zur Verwendung wurden die vorbesiedelten Implantate bei Raumtemperatur in PBS gelagert.

4.4. In vivo Versuche 4.4.1. Versuchstiere

Die Versuche wurden am Institut für Versuchstierkunde und Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Es wurden männliche Lewis Ratten mit dem Stammcode LEW/NHanZtm mit einem Alter von mindestens 12 Wochen und einem durchschnittlichen Gewicht von 377±36 g aus der Zucht des Zentralen Tierlabors verwendet. Die Tiere wurden in 2er Gruppen in Allentown-BCU Racks und Allentown-Typ III ähnlichen Käfigen mit einem Tag-/ Nachtrhythmus von 14/10 Stunden gehalten. Die Raumtemperatur betrug 22±2 °C und die Luftfeuchtigkeit betrug 55±10 %. Den Tieren stand Haltungsfutter und Wasser ad libitum zur Verfügung. Die Verteilung in die Gruppen der Hauptstudie erfolgte randomisiert nach Gewicht. Die Durchführung des Tierversuches wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit mit dem Aktenzeichen 33.12-42502-04-16/2186 genehmigt.

4.4.2. Gruppenaufteilung der Pilot- und Hauptstudie

Die vorliegende Studie war in eine Pilot- und eine Hauptstudie untergliedert. In der Pilotstudie wurde das Tiermodell etabliert und die beste Infektionsroute sowie Infektionskonzentration ermittelt, um ein low-grade ähnliche Implantatinfektion mit Staphylococcus aureus zu erzeugen. Dafür wurden in einer Gruppe (VB12) mit Bakterien vorbesiedelte Implantate eingesetzt. Die Bezeichnung „VB“ kürzt in diesem Fall das Wort Vorbesiedlung ab. In den anderen Gruppen (I106 bis I103) wurde eine Bakteriensuspension in unterschiedlichen Konzentrationen injiziert, um die Infektion auszulösen. Die Abkürzung „I“ repräsentiert in diesen Gruppen das Wort Injektion. Die Zuordnung der Tierzahlen zu den Versuchsgruppen ist in Tabelle 6 dargestellt.

46 4. Material und Methoden

Tabelle 6: Gruppenzusammensetzung in der Pilotstudie. Gruppen- Versuchsansatz Bakterienkonzentration/ Tieranzahl bezeichnung Vorbesiedlung Kontrolle Injektion von 0,9 %-iger 10 µl 0,9 %-ige 8 NaCl-Lösung NaCl- Lösung VB12 Vorbesiedlung in der 107 KBE/ml 8 Bakteriensuspension (12 Stunden) I106 Injektion der 106 KBE/10 µl 8 Bakteriensuspension I105 105 KBE/10 µl 8

I104 104 KBE/10 µl 8 I103 103 KBE/10 µl 8

In der Hauptstudie wurde die laserstrukturierte Oberfläche mit der Referenz- oberfläche aus der Pilotstudie verglichen. Alle Tiere der Hauptstudie wurden durch eine Injektion mit einer Bakteriensuspension der Konzentration von 103 KBE/10 µl in die Tibia infiziert. 17 Tiere erhielten ein Implantat mit der polierten Referenzstruktur aus der Pilotstudie und 17 Tiere ein Implantat mit der laserstrukturierten Oberfläche. Um die Gruppengröße von 17 Tieren zu erreichen, war es erlaubt, zwei Reservetiere pro Gruppe bei nicht infektionsbedingten Ausfällen nachträglich zu operieren. In der Tabelle 7 ist die Gruppenzusammensetzung der Hauptstudie zusammengefasst.

Tabelle 7: Gruppenzusammensetzung in der Hauptstudie. Gruppenbezeichnung Beschreibung des Implantates Tieranzahl Referenzstruktur Mit 45 µm Scheibe poliertes Ti90/Al6/V4 17 (+2) Implantat Laserstruktur Laserstrukturiertes Ti90/Al6/V4 Implantat 17 (+2)

4.4.3. Durchführung der Operation

Über den präoperativen Adaptationszeitraum wurden die Tiere regelmäßig gehandelt. Die Tiere wurden durch eine intramuskulär in die Glutäenmuskulatur applizierte Injektionsnarkose aus einer Kombination von Fentanyl (0,02 mg/kg KGW), Midazolam (1 mg/kg KGW) und Medetomidin (0,2 mg/kg KGW) anästhesiert. Nach dem Bewusstseinsverlust wurden die Tiere sofort auf ein Heizkissen verbracht, auf dem sie für die Dauer der OP verblieben. Alle Tiere erhielten eine subkutane Injektion des Analgetikums Carprofen (5 mg/kg KGW). Die linke Hintergliedmaße wurde geschoren. Die Konjunktiven wurden vor Austrocknung durch das Auftragen einer Augensalbe geschützt. Anschließend wurden die Tiere in eine Clean Bench

4. Material und Methoden 47

verbracht und die Haut wurde mit einem Hautdesinfektionsmittel desinfiziert. Eine sterile Lochfolie wurde verwendet, um das OP-Feld vor Kontamination zu schützen. Der Hautschnitt wurde 1-2 mm medial der Kniescheibe begonnen und bis zur Hälfte der Tibia gerade nach unten fortgesetzt. Die Haut wurde von der umgebenden Muskulatur gelöst. Anschließend erfolgte ein Längsschnitt durch die den Knochen bedeckende Muskulatur. Das Periost wurde mit einem Raspatorium im Bereich des Bohrloches vom Knochen gelöst und zur Seite geschoben. Das Bohrloch wurde mit einer Bohrmaschine und einem 1 mm Bohrkopf circa 1-2 mm oberhalb und lateral des Ansatzes des seitlichen Kniegelenkbandes bis zum Durchtritt in die Markhöhle gerade durch die Kortikalis und dann abgeschrägt mit Bohrrichtung nahezu parallel zum Verlauf der Tibia gebohrt, um das Einschieben des Implantates zu ermöglichen. Mit einer 20 G Kanüle wurde die Zugänglichkeit der Markhöhle überprüft. Nach Verifizierung der Zugänglichkeit wurden 10 µl der Lösung (0,9 %-ige NaCl-Lösung oder die Bakteriensuspension) mit einer 10 µl Hamilton Spritze in die Markhöhle injiziert. Anschließend wurde das Implantat eingeschoben. In der Gruppe mit den bakteriell vorbesiedelten Implantaten wurde auf die Injektion der Bakterienlösung verzichtet und nur das vorbesiedelte Implantat eingebracht. Das Bohrloch wurde mit sterilem Knochenwachs verschlossen. Die Wunde wurde mit 2-3 ml ProntoVet® und anschließend mit 0,9 %-iger NaCl-Lösung gespült. Das Periost wurde zusammen mit der Muskulatur mit 2-3 Sultan`schen Diagonalheften mit Vicryl 4-0 verschlossen. Die Haut wurde mit Vicryl 4-0 mittels einer fortlaufenden intrakutanen Naht vernäht. Um eine Dehydratation zu vermeiden, erhielt jedes Tier postoperativ eine subkutane Injektion von Sterofundin® HEG-5 (9 ml/kg KGW). Direkt postoperativ und noch in Narkose erfolgte eine radiologische Untersuchung. Es wurde je eine Aufnahme in anterior-posteriorer und medio-lateraler Projektion mit einem µCT (Fluoroskopie) oder einem digitalen Röntgengerät (in Abhängigkeit von der Verfügbarkeit) angefertigt. Die fluoroskopischen Aufnahmen wurden mit den Einstellungen von 50 kV, 500 µA, einem Binning von 2 sowie mit dem Modus der mittleren Systemvergrößerung angefertigt. Die Röntgenaufnahmen wurden mit den Einstellungen 1 mAs mit 50 kV für die anterior-posteriore Projektion und 1 mAs mit 45 kV für die medio-laterale Projektion angefertigt. Im Anschluss an die Röntgenuntersuchung wurde die Hautnaht mit Silberspray abgedeckt. Die Narkose wurde durch die subkutane Injektion von Atipamezol (0,05 mg/kg KGW), Flumazenil (0,2 mg/kg KGW) und Naloxon (0,12 mg/kg KGW) antagonisiert. Der Ablauf der OP mit endgültigem Implantatsitz ist in Abbildung 5 dargestellt.

48 4. Material und Methoden

Abbildung 5: Durchführung der Operation. (A) zeigt die Eröffnung der Tibia mit Hilfe eines Bohrers, (B) die Injektion der Bakteriensuspension und (C) die Insertion des Implantates. (D) ist eine schematische Darstellung des Implantatsitzes in der Tibia. Diese Abbildung ist modifiziert nach POPESKO et al. (2002).

4.4.4. Postoperativer Verlauf

Im Rahmen der postoperativen analgetischen Behandlung erhielten alle Tiere bis einschließlich Tag drei post OP eine tägliche, subkutane Injektion mit Carprofen. Die Tiere wurden täglich nach dem in Tabelle 8 aufgeführten Scoring Schema kontrolliert. Die Gewichtskontrolle erfolgte mit einer Tierwaage und die Temperaturkontrolle mittels Infrarotthermometer auf dem Bauch. Zur verbesserten Messung der Körperoberflächentemperatur wurde dieser in der Hauptstudie rasiert. Die Blutentnahme für die Basalwerte erfolgte präoperativ (maximal zwei Tage vorher) durch die Punktion der Schwanzvene. Am Tag sieben post OP wurde erneut Blut durch die Punktion der Schwanzvene gewonnen. Pro Entnahmezeitpunkt wurden 300 µl Blut für die Serumgewinnung entnommen. Das gefüllte Serumröhrchen wurde bei 13´000 rpm für 15 Minuten zentrifugiert. Der Serumüberstand wurde abgenommen und tiefgefroren bei -20 °C bis zur Analyse gelagert. Eine radiologische Kontrolle des Implantatsitzes und der Knochenveränderungen erfolgte 14 Tage und 21 Tage nach der Operation. Die Aufnahmen am Tag 14 erfolgten am anästhesierten Tier durch Applikation eines Gemisches aus 1,5-5 % Isofluran und 0,5-1 l/min Sauerstoff über eine Narkosekammer in der Narkoseeinleitung und über einer Maske bei der Aufrechterhaltung der Narkose. Die Aufnahme am Tag 21 post OP erfolgte nach der Euthanasie. Die zeitliche Abfolge von Blutentnahmen, Operation, Röntgenuntersuchungen und Euthanasiezeitpunkt ist in Abbildung 6 dargestellt.

4. Material und Methoden 49

Eine zusätzliche analgetische Versorgung mit Carprofen über das standardisierte Versuchsdesign hinaus wurde für den Fall festgelegt, dass die Tiere einen Gesamtscore von mindestens 4 Punkten oder in einem Bewertungskriterium einen Einzelscore von mindestens 2 Punkten erreichten. Weitere Kriterien für eine zusätzliche analgetische Behandlung waren eine reduzierte Futteraufnahme über drei Tage oder keine Futteraufnahme an einem Tag, außerdem eine Gewichtsreduktion von über 10 % des Ausgangsgewichtes. Für gleichbleibende Schmerzensanzeichen nach 24 Stunden und Applikation von Carprofen, das heißt einen gleichbleibend schlechten Score, wurde eine Applikation von Tramadol (2,5 mg/100 ml) über das Trinkwasser festgelegt. Als Kriterium für die zusätzliche subkutane Butorphanolapplikation (0,5-2 mg/kg KGW, dreimal täglich) in Kombination mit Carprofen (einmal täglich) wurde die unklare Aufnahme von Tramadol über das Trinkwasser und 24 Stunden ohne Besserung der Schmerzsymptomatik festgelegt. Als Abbruchkriterien des Versuches wurden eine Fraktur der Tibia oder Fibula, ein offener Abszess oder eine Sepsis festgelegt. Eine Gewichtsreduktion über 20 % des Ausgangsgewichtes und eine Reduktion des Spontanverhaltens über 75 % im Beobachtungszeitraum von 2 Minuten wurden als weitere Abbruchkriterien definiert.

Abbildung 6: Zeitlicher Verlauf eines Versuchsdurchganges.

Tabelle 8: Score Schema für die tägliche Kontrolle. Kategorie Veränderung Punktzahl Haltung und Normale Haltung; Haare glatt, glänzend und dem 0 äußere Körper dicht anliegend; Körperoberflächentemperatur Erscheinung, normal Temperatur Normale Haltung; struppige oder stumpfe Haare; 1 Körperoberflächentemperatur und/oder Körperinnen- temperatur normal Geringgradig aufgekrümmter Rücken; struppige, 2 stumpfe Haare; Körperinnentemperatur bis 40 °C (<24 Stunden) Stark aufgekrümmter Rücken; struppige, stumpfe, 3 verunreinigte Haare; Körperinnentemperatur >40 °C (maximal 24 Stunden)

50 4. Material und Methoden

Verhalten und Aufmerksam und neugierig 0 Aktivität Sehr ruhig: geringgradig reduzierte spontane 1 Bewegung; nicht reduzierte induzierte Bewegung Apathie: mittelgradig reduzierte spontane Bewegung; 2 geringgradig reduzierte induzierte Bewegung Stupor: keine spontane Bewegung; kaum induzierte 3 Bewegung Lahmheit Normaler Bewegungsablauf 0 Geringgradige Veränderung im Bewegungsablauf 1 (geringgradig verkürzter Schritt; verminderte Lastaufnahme) Mittelgradige Veränderung im Bewegungsablauf 2 (deutlich vermindertes Aufsetzen der Gliedmaße in der Bewegung; deutlich verkürzter Schritt) Hochgradige Veränderung im Bewegungsablauf 3 (vollständige Entlastung der Gliedmaße) Gewichts- Kein Gewichtsverlust 0 verlust Gewichtsverlust <10 % 1 Gewichtsverlust 10–20 % 2 Gewichtsverlust >20 % 3 Implantations- Keine Schwellung und Rötung 0 stelle Geringgradige Schwellung und Rötung 1 Mittelgradige Schwellung, Rötung und 2 Schmerzhaftigkeit Hochgradige Schwellung, Rötung und/oder 3 Abszedierung mit Schmerzhaftigkeit Gesamtpunkte 0–15

4.4.5. Euthanasie und Probenentnahme

Am Tag 21 post OP wurden alle Tiere durch eine intraperitoneale Injektion von Ketamin (60-80 mg/kg KGW) und Xylazin (7-12 mg/kg KGW) tief anästhesiert. Der Brustkorb wurde eröffnet und durch eine Herzpunktion wurden 1 ml Blut in einem EDTA-Röhrchen und 2 ml Blut in einem Serumröhrchen gewonnen. Anschließend wurden die Tiere durch Herzschnitt getötet. Das gewonnene Blut für die Serumgewinnung wurde wie in Punkt 4.4.4. beschrieben, zentrifugiert und bis zur Analyse gelagert. Das Röntgen der Gliedmaße erfolgte nach der Euthanasie. Allen Tieren wurde, soweit möglich, steriler Urin durch die Punktion der Blase entnommen. Die Entnahme der Tibia und des Implantates erfolgte unter einer Clean Bench. Die linke Hintergliedmaße wurde erneut geschoren und mit einem Hautdesinfektions-

4. Material und Methoden 51

mittel desinfiziert. Der Körper der Ratte wurde durch ein steriles OP Tuch abgedeckt, sodass nur noch das desinfizierte Bein zugänglich war. Die Haut des Beines wurde lateral mit einem Skalpell aufgeschnitten und anschließend von dort ausgehend bis zum Sprunggelenk und über das Knie abpräpariert. Die Tibia wurde im Sprunggelenk und im Kniegelenk abgesetzt. Die Entfernung der Muskulatur erfolgte unter Schonung der Fibula. Mit einem in PBS angefeuchteten Tupfer wurde ein Abstrich an der Implantationsstelle durchgeführt und zur weiteren mikrobiologischen Untersuchung auf Blutagar ausgestrichen. Mit einem sterilen Schnellschleifgerät mit Sägeaufsatz wurde die Tibia direkt über dem Sitz des Implantates abgesetzt und das Implantat wurde mit einer feinen Pinzette entnommen. Zur weiteren mikrobiologischen Untersuchung wurde mit einem in PBS angefeuchteten Tupfer ein Abstrich von einer Implantatseite vorgenommen und auf Blutagar ausgestrichen. Die abgestrichene Implantatseite wurde anschließend mit einem wasserfesten Stift gekennzeichnet, um spätere Verwechselungen der Seiten bei der mikroskopischen Auswertung auszuschließen. Im Anschluss wurde das Implantat in einer mit PBS gefüllten 48-Well Platte bis zur Lebend/Tot- Färbung (siehe Punkt 4.4.8.) zwischengelagert. Weiterhin erfolgte ein Knochenmarksabstrich auf Blutagar mit einem in PBS angefeuchteten Tupfer. Von auffälligen Befunden, wie bspw. Schwellungen, wurde ebenfalls ein Tupferabstrich genommen und auf Blutagar ausgestrichen. Die entnommenen Tibiae wurden in 3,5-3,7 %-igem Formalin bis zur histologischen Aufarbeitung fixiert. Zur Kontrolle des Vorliegens einer Sepsis wurden in der Pilotstudie 100 µl EDTA- Blut, sowie 100 µl des entnommenen Urins auf einer Blutagarplatte ausgestrichen. Alle angefertigten Ausstriche wurden 24 bzw. 48 Stunden, aerob und bei 37 °C bebrütet. Nach 24 Stunden Inkubationszeit wurde das Bakterienwachstum kontrolliert und die Morphologie beurteilt. Nach 48 Stunden Wachstum konnte das Auftreten von Hämolyse beurteilt werden. Das Gewicht der Tibiae wurde auf einer Feinwaage bestimmt. In der Tabelle 9 sind alle Untersuchungen und Probenentnahmen zusammengefasst.

52 4. Material und Methoden

Tabelle 9: Zusammenfassung der Probenentnahmen und Messparameter in der Pilot- und Hauptstudie. Maßnahme Zeitpunkt Anmerkung Kontrolle Täglich Haltung, äußere Erscheinung, Temperatur Verhalten und Aktivität Gang Gewicht Implantationsstelle Blutentnahme Vor der OP (Tag -2 bis 0) zusätzlich: EDTA-Blut für den (Serum) Tag 7 Ausstrich auf Blutagar Tag 21 Röntgen Tag 0 post OP jeweils anterior-posteriore und Tag 14 medio-laterale Projektion Tag 21 Mikrobiologie Post mortem Abstrich Implantationsstelle Abstrich Implantat Abstrich Knochenmark Ausstrich Blut Ausstrich Urin Auffällige Befunde Pathologie Post mortem Vermerk auffälliger Befunde CLSM Post mortem zwei Seiten, mindestens fünf Aufnahmen je Seite REM Post mortem Exemplarisch in Pilot- und Hauptstudie Knochengewicht Post mortem Tibia links µCT Post mortem Pilotstudie, exemplarisch in der Hauptstudie Histologie Post mortem Tibia links

4.4.6. Nachweis des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein

Die gewonnenen Serumproben der Gruppen K, I106 und I103 wurden auf die Konzentration des C-reaktiven Proteins (CRP) untersucht. Diese drei Gruppen wurden ausgewählt, um den größtmöglichen Unterschied in der Höhe der Konzentration zu ermitteln. Dadurch sollte evaluiert werden, ob sich die Serum CRP- Konzentration eignet, um die Ausprägungsstärke der Infektion zu bestimmen. Für die Bestimmung der CRP-Konzentration wurde ein Enzyme-linked-Immunosorbant- Assay (ELISA) Kit verwendet, welches spezielle Antikörper für das Ratten- CRP

4. Material und Methoden 53

verwendet. Die Funktionsweise des ELISAs basiert auf der Bindung des zu untersuchenden Substrates über spezifische Antikörper (ENGVALL et al. 1971). An den Antikörper ist ein Enzym gekoppelt, welches ein zugegebenes Substrat umsetzt und so eine Farbreaktion bewirkt, dessen Signalstärke mit Hilfe eines Microplate Readers gemessen werden kann (GOULD et al. 1985). Über die Stärke der Farbreaktion lässt sich die Konzentration des CRPs bestimmen. Die Serumproben wurden bis zur Verwendung auf Eis gelagert und 1:80´000 in der Assay-Verdünnungslösung verdünnt. Alle Inkubationsschritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Für die Standardkurve wurde der lyophilisierte Standard in der Assay-Verdünnungslösung nach Protokoll verdünnt. Je 100 µl der Proben und der Standards wurden pro Well pipettiert. Die Platte wurde abgedeckt und für 2,5 Stunden inkubiert. Anschließend wurde mit jeweils 300 µl Waschpuffer vier Mal gewaschen. 100 µl des Biotin-konjugierten Antikörpers wurden in jedes Well pipettiert und die Platte wurde abgedeckt für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde die Platte vier Mal mit 300 µl Waschpuffer gewaschen. Im nächsten Schritt wurden 100 µl des Streptavidin HRP-gekoppeltem Reagenz in jedes Well pipettiert und die Platte wurde abgedeckt für 45 Minuten inkubiert. Anschließend wurde die Platte wie oben beschrieben erneut gewaschen. Je 100 µl des 3,3´, 5,5´-Tetramethylbenzidin Substrates wurde in jedes Well pipettiert und die Platte wurde im Dunkeln 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden pro Well 50 µl der Stopp-Lösung hinzugefügt. Mit einem Microplate Reader wurde die Absorption bei 450 nm und bei 550 nm zur Hintergrundbestimmung gemessen. Zur Berechnung der Konzentration in µg/ml wurde zuerst der Absorptionswert bei 550 nm vom Absorptionswert bei 450 nm subtrahiert. Anschließend wurden die Werte des Standards in einem Diagramm logarithmisch aufgetragen. Eine logistische Regressionskurve mit 4 Parametern wurde aus den Punkten ermittelt. Mit Hilfe dieser Funktion wurden die Serum CRP-Werte bestimmt und mit dem Verdünnungsfaktor 80´000 korrigiert.

4.4.7. Mikrocomputertomographische Aufnahmen der Tibiae

Nach Euthanasie der Tiere und Entnahme des Implantates wurden die verbliebenden Tibiateilstücke mit einem µCT gescannt. In der Pilotstudie wurden alle Tibiae jeder Gruppe untersucht, während in der Hauptstudie exemplarisch nur je drei Tiere pro Gruppe gescannt wurden. Die Scans wurden vom Kleintierbildgebungszentrum des Instituts für Versuchstierkunde und Zentralem Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover durchgeführt. Die Knochen wurden bei 60 kV, 500 µA einem Binning von 1 angefertigt. Es wurde ein 360°- Scan mit 720 Projektionen durchgeführt.

54 4. Material und Methoden

4.4.8. Durchführung der konfokalmikroskopischen Aufnahmen

Nach Entnahme wurden die Implantate mit dem Lebend/Tot- Farbstoff Syto® 9 und Propidiumiodid gefärbt. Dafür wurden die Implantate zunächst vorsichtig mit steriler PBS-Lösung gewaschen, um nicht fest auf der Oberfläche haftende Gewebereste zu entfernen. Anschließend wurden die Implantate für 15 Minuten in einer 1:1000 Verdünnung des Lebend/Tot- Farbstoffes in PBS abgedunkelt bei Raumtemperatur inkubiert (MOLECULAR PROBES 2004). Nach Ablauf der Färbezeit wurden die Implantate ein weiteres Mal mit PBS gewaschen und in 2,5 %-iger Glutardialdehydlösung für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Implantate wurden nach Ablauf der Fixierzeit zwei Mal vorsichtig mit steriler PBS Lösung gewaschen. Bis zur Mikroskopie wurden die Implantate in PBS, lichtgeschützt und bei 4 °C gelagert. Zwei Implantatseiten wurden mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop untersucht. Pro Implantatseite wurden für die spätere Auswertung mindestens fünf Aufnahmen mit einer Größe von 190x 190 µm2 pro Aufnahme in einer 630-fachen Vergrößerung aufgenommen. Die Aufnahmen wurden gleichmäßig auf dem Implantat verteilt, um eine möglichst aussagekräftige Darstellung der gesamten Besiedlung darzustellen. Insgesamt wurden auf diese Weise mindestens 2 % der Gesamtoberfläche mit Hilfe der CLSM Aufnahmen abgebildet. Mit diesen Aufnahmen wurde die folgende deskriptive und quantitative Auswertung in Imaris® x64 durchgeführt.

4.4.9. Durchführung der rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen

Nach der Lebend/Tot- Färbung und Durchführung der Aufnahmen am CLSM wurden besiedelte Implantate exemplarisch rasterelektronmikroskopisch untersucht. Bis zur Untersuchung wurden die besiedelten Implantate in 2,5 %-iger Glutardialdehyd- lösung gelagert. Die REM Aufnahmen wurden von der Zentralen Einrichtung für Rasterelektronenmikroskopie der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt. Nach Fixierung in 150 mM Hepes, welches 1,5 % Formaldehyd und 1,5 % Glutardialdehyd enthielt und einen pH-Wert von 7,35 hatte, wurden die Proben in Aceton dehydriert, im „kritischer Punkt“-Verfahren getrocknet und mit Gold besputtert. Die Aufnahmen wurden mit 10 kV unter Verwendung eines Kammer- Sekundärelektronendetektors angefertigt.

4. Material und Methoden 55

4.4.10. Aufbereitung der Proben für die Histologie

Die Tibiae wurden zwei Tage in 3,5-3,7 %-igem Formaldehyd fixiert. Anschließend wurde der Tibiabereich der ursprünglichen Implantatlokalisation mit einer Säge in zwei gleich große, circa 6 mm lange Hälften geteilt. Die proximale Hälfte der Tibia wurde entkalkt und in Paraffin eingebettet, während die distale Hälfte in Technovit eingebettet wurde. Die Entkalkung erfolgte 18 Tage in einer Histosette schüttelnd bei 200 rpm und Raumtemperatur mit einer kommerziell erhältlichen Entkalkungslösung. Jeden zweiten Tag wurde die Entkalkungslösung gewechselt. Die Einbettung in Paraffin erfolgte mit dem Tissue-Tek® VIP 5 Einbettautomat und der Tissue-Tek® TEC 5 Paraffinausgießkonsole im Institut für Pathologie der Medizinischen Hochschule Hannover nach dem in Tabelle 10 beschriebenen Protokoll. Die Einbettung in Technovit® erfolgte mittels modifizierten Herstellerprotokolls von Heraeus Kulzer (WILLBOLD u. WITTE 2010).

Tabelle 10: Protokoll für die Einbettung in Paraffin. Lösung Konzentration der Lösung (%) Zeit (Min.) Temperatur (°C) Formalin 4 120 40 Alkohol 70 60 40 Alkohol 90 45 40 Alkohol 100 45 40 Alkohol 100 60 40 Alkohol 100 60 40 Alkohol 100 60 40 Xylol 100 45 40 Xylol 100 45 40 Xylol 100 60 40 Paraffin 100 30 62-66 Paraffin 100 30 62-66 Paraffin 100 30 62-66 Paraffin 100 60 62-66

4.4.11. Herstellung und Färbung der histologischen Schnitte

Um die Haftung der Schnitte an den Objektträger zu erhöhen, wurden alle Objektträger vor dem Gebrauch mit Poly-L-Lysine nach dem folgenden Protokoll beschichtet. In 150 ml A. dest. wurden 3 g Ponal Express gelöst. Anschließend wurden 7,5 ml der Poly-L-Lysine Stammlösung mit 75 ml A. dest. aufgefüllt. Die verdünnte Poly-L-Lysin Lösung wurde im Verhältnis 1:2 mit der Ponal-Lösung

56 4. Material und Methoden

gemischt. Die Objektträger wurden 10 Minuten in der Lösung inkubiert und anschließend bei 37 °C für 24 Stunden getrocknet. Die Technovit- und Paraffinblöcke wurden mit einem Mikrotom in Schnitte mit einer Dicke von 5 µm geschnitten und anschließend auf die beschichteten Objektträger aufgezogen. Nach dem Zuschnitt wurden die in Paraffin eingebetteten Knochenschnitte wie in Tabelle 11 beschrieben, Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die in Technovit® eingebetteten Proben wurden wie in Tabelle 12 beschrieben, Toluidinblau gefärbt.

Tabelle 11: Protokoll für die Hämatoxylin-Eosin Färbung. Durchführung Inkubationszeit Reagenzien Temperatur Entplasten 2x 10 Min. Xylol Raumtemperatur (Abzug) Rehydrieren Je 2 Min. 2x 100 % Isopropylalkohol Raumtemperatur 1x 96 % Isopropylalkohol 1x 70 % Isopropylalkohol 1x 50 % Isopropylalkohol 1x A. dest. Färben 10 Min. Hämalaun nach Mayer Raumtemperatur Bläuen 14 Min. Leitungswasser Raumtemperatur Gegenfärben 4 Min. 1 %-ige Eosinlösung Raumtemperatur Waschen Kurz eintauchen A. dest. Raumtemperatur Dehydrieren 2x 2 Min. 1x 50 % Isopropylalkohol Raumtemperatur 1x 70 % Isopropylalkohol (Abzug) 1x 96 % Isopropylalkohol 100 % Isopropylalkohol 5 Min. Xylol Eindeckeln Roti®-Histokitt II Raumtemperatur (Abzug)

4. Material und Methoden 57

Tabelle 12: Protokoll für die Toluidinblau Färbung. Durchführung Inkubationszeit Reagenzien Temperatur Entplasten 2x 10 Min. Xylol Raumtemperatur 10 Min. 1-Methoxy-2-propylacetat (Abzug) Rehydrieren je 2 Min. 2x 100 % Isopropylalkohol Raumtemperatur 1x 96 % Isopropylalkohol 1x 70 % Isopropylalkohol 1x A. dest. Färben 1 Min. 0,1 %-ige Raumtemperatur Toluidinblaulösung Waschen kurz eintauchen 2-3x A. dest. Raumtemperatur Dehydrieren je 1 Min. 1x 70 % Isopropylalkohol Raumtemperatur 1x 96 % Isopropylalkohol (Abzug) 1x 100 % Isopropylalkohol 2x 5 Min. Xylol Eindeckeln Roti®-Histokitt II Raumtemperatur (Abzug)

4.4.12. Auswertung der Röntgenaufnahmen

Die Röntgenaufnahmen wurden über ein semiquantitatives Score-System ausgewertet, welches in Anlehnung an AN u. FRIEDMAN (1998) und LUCKE et al. (2003a) modifiziert wurde. Einzelscores mit den Werten 0, 1, 2 und 3 wurden vergeben. Ein höherer Scorewert entsprach dabei einer stärkeren Knochenveränderung. Die Ausprägung der Osteolyse und der periostalen Reaktion wurde im Bohrlochbereich, im Implantatbereich und im Bereich distal des Implantates bewertet. Der subjektive Gesamteindruck des Knochens wurde auch mit einem Score von 0-3 bewertet. Frakturen oder Sequester wurden mit 0 oder 1 bewertet, wobei ein Scorewert von 1 für das Vorhandensein einer Fraktur oder eines Sequesters vergeben wurde. Die maximal erreichbare Punktzahl war 23. Je drei Personen haben die Aufnahmen verblindet ausgewertet. Aus den drei verblindeten Bewertungen wurde der Mittelwert gebildet, um etwaige Schwankungen in der Bewertung durch die einzelnen Personen auszugleichen. Die vergebenen Einzelpunkte wurden zu einem Gesamtscore addiert. Für jeden Zeitpunkt pro Gruppe wurde der Median gebildet. Das Scoring Schema ist in Tabelle 13 zusammengefasst und eine mit exemplarischen Bildern versehene Darstellung des Scores befindet sich im Anhang in der Tabelle 24 unter dem Punkt 12.1.

58 4. Material und Methoden

Tabelle 13: Score Schema für die Auswertung der radiologischen Aufnahmen. ROI Kriterium Grad der Veränderung keine geringgradig mittelgradig hochgradig Bohrloch Osteolyse 0 1 2 3 Periostale 0 1 2 3 Reaktion Implantatsitz Osteolyse 0 1 2 3 Periostale 0 1 2 3 Reaktion Bereich Osteolyse 0 1 2 3 distal des Periostale 0 1 2 3 Implantates Reaktion Gesamter Gesamt- 0 1 2 3 Knochen eindruck keine vorhanden Fraktur 0 1 Sequester 0 1

4.4.13. Quantifizierung und morphologische Beurteilung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche

Funktionsweise des Lebend/Tot- Farbstoffes

Der Lebend/Tot- Farbstoff besteht aus den Fluoreszenzfarbstoffen Syto® 9 und Propidiumiodid (BOULOS et al. 1999, VIRTA et al. 1998). Propidiumiodid bindet an Nukleinsäuren und wird häufig zur Identifikation von toten Zellen verwendet, da der Farbstoff nur in Zellen mit gestörter Zellmembranintegrität eindringen kann (STOCKS 2004). Propidiumiodid fluoresziert rot. Syto® 9 kann in lebende und tote Zellen eindringen, bindet Nukleinsäuren und fluoresziert grün. Da Propidiumiodid eine höhere Affinität für die Bindung von DNA hat, wird Syto® 9 in Zellen mit gestörter Zellmembranintegrität durch Propidiumiodid ersetzt (STOCKS 2004). Auf Grund einer begrenzten Inkubationszeit und dem Fakt, dass vor allem Zellkerne von eukaryotischen Zellen deutlich mehr Nukleinsäuren enthalten und dadurch mehr Bindungsstellen für die Farbstoffe an den Nukleinsäuren vorhanden sind, kann es zu einer Doppelfärbung von Syto® 9 und Propidiumiodid kommen. Dieser Zustand wird Colokalisation genannt und kommt sowohl bei eukaryotischen, als auch bei bakteriellen Zellen vor. Die so angefärbten Zellen haben damit eine anteilige Grünfärbung, müssen aber als tot gewertet werden. Auf Grund der Doppelfärbung fluoreszieren sie gelb bis orange. Eukaryotische Zellen haben auf Grund des hohen

4. Material und Methoden 59

Gehalts an Nukleinsäuren meistens eine höhere Fluoreszenzintensität als Bakterien. Als beispielhafte Darstellung kann hier die Abbildung 10 dienen, die den morphologischen Bewertungsscore für die bakterielle Besiedlung veranschaulicht. Im weiteren Verlauf der Arbeit werden die eukaryotischen Zellen zur Vereinfachung nur als Zellen bezeichnet.

Quantifizierung der gesamten Biomasse des Lebend-, Tot- und Colokalisationsanteils

Die Quantifizierung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche erfolgte durch das Programm Imaris® x64. Nach Laden der konfokalmikroskopischen Aufnahmen wurde durch die Software eine dreidimensionale Rekonstruktion der Bilder erstellt. Das geladene Bild wurde in unterschiedlichen Farbkanälen (grün und rot) dargestellt und ausgewertet (Darstellung des Grünkanals in Abbildung 7 A). Zuerst wurde der Lebendvolumenanteil der Gesamtbiomasse auf der Implantatoberfläche über den „Oberflächen Modus“ bestimmt. In diesem Modus wird eine Oberfläche über die zu bestimmende Biomasse gelegt (siehe Abbildung 7 B), aus der das Programm das Volumen berechnet (siehe Abbildung 7 C). Die Überlagerung des Ursprungsbildes mit der Volumenberechnung (siehe Abbildung 7 D) zeigt den Hintergrund, der nicht in weitere Berechnungen mit einbezogen wurde. Der Totvolumenanteil wurde im Rotkanal entsprechend dem Lebendvolumenanteil im Grünkanal bestimmt. Nach Bestimmung des Lebend- und Totvolumenanteils der Gesamtbiomasse wurde ein zusätzlicher Kanal für den Colokalisationsanteil gewählt, in dem die sich überlappende Grün- bzw. Rotfärbung dargestellt wurde. Das Gesamtvolumen des Colokalisationskanals wurde entsprechend dem Lebend- und Totanteil bestimmt. Alle Volumenanteile wurden angegeben in µm3/Fläche des Sichtfeldes (bezeichnet als A).

60 4. Material und Methoden

Abbildung 7: Quantifizierung des Gesamtlebendvolumens auf der Implantatoberfläche. (A) stellt den Grünkanal des CLSM- Bildes separat dar und zeigt damit den gefärbten Lebendanteil aus Zellen und Bakterien auf der Implantatoberfläche. (B) zeigt die Auswahl der vorhandenen Oberfläche der grün gefärbten Biomasse (in grau), welche in die Volumenberechnung des Gesamtlebendanteils mit einbezogen wird. In (C) ist das durch das Programm berechnete Volumen in blau dargestellt. (D) stellt die Überlappung des bestimmten Volumens in blau aus (C) und des Gesamtlebendanteils aus (A) in grün dar; reine Grünanteile stellen damit eine nicht weiter einbezogene Hintergrundfärbung dar. Der Maßstabsbalken entspricht 15 µm.

Quantifizierung der eukaryotischen Zellmasse und des bakteriellen Colokalisationsanteils

Die Gesamtbiomasse auf der Implantatoberfläche setzt sich aus dem Syto® 9 gefärbten Anteil (zur Vereinfachung als LebendGesamt bezeichnet) und dem mit Propidiumiodid gefärbten Totanteil zusammen. Zusätzlich dazu muss der Colokalisationsanteil bedacht werden, der die sich überlappende Syto® 9 und Propidiumiodidfärbung anzeigt. Auf der Implantatoberfläche befinden sich neben Bakterien auch eukaryotischen Zellen. Um die lebende bakterielle Biomasse zu bestimmen, wurde die Besiedlung

4. Material und Methoden 61

der Implantatoberfläche in einzelne Komponenten aufgeteilt. Der Lebend-, Tot- und Colokalisationsanteil wurde dementsprechend in einen bakteriellen und eukaryotischen zellulären Anteil (weiterhin als zellulärer Anteil oder Zellmasse bezeichnet) aufgeteilt. Zur Berechnung der lebenden bakteriellen Biomasse auf dem Implantat wurde vom Gesamtlebendvolumen das Volumen der zellulären Lebendmasse und das Volumen des bakteriellen Colokalisationsanteils subtrahiert. Zur Veranschaulichung sind in Abbildung 8 die bakteriellen und zellulären Volumenanteile bildlich und als Formel für die Berechnung der vitalen bakteriellen Biomasse dargestellt. Die berechneten Volumenanteile wurde in µm3/Fläche des Sichtfeldes (bezeichnet als A) angegeben.

Abbildung 8: Darstellung der Volumenanteile und der Formel für die Berechnung der vitalen bakteriellen Biomasse.

Die Bestimmung der lebenden Zellmasse und des bakteriellen Colokalisationsanteils erfolgte über zwei verschiedene Methoden (siehe Abbildung 9): die Volumen- und die Spot-Methode. Die Kriterien für die Bestimmung des zellulären Lebendanteils und des bakteriellen Colokalisationsanteils wurden anhand der Oberflächenbesiedlung von infizierten Tieren festgelegt. Der erste Ansatz modelliert die Zellstrukturen durch Nachbildung des Volumens (siehe Abbildung 9 A, B), während der zweite Ansatz die Zellkörper durch kugelförmige Spots (siehe Abbildung 9 C, D) nachbildet. Abbildung 9 E und F zeigen die Überlagerung beider Methoden ohne und mit dem gefärbten Gesamtlebendanteil. Für beide Ausschlussmethoden wurde eine höhere Fluoreszenzintensität der eukaryotischen Zellen im Vergleich zu den Bakterien zu Grunde gelegt. Dafür wurde die Höhe der mittleren Fluoreszenzintensität als Kriterium mit in beide Auswertungsmethoden aufgenommen. Bei der Volumen-Methode wurde für die Nachbildung der eukaryotischen Zellkörper der „Volumen Modus“ verwendet. Nach Einschluss der zu differenzierenden Biomasse erfolgte die Nachbildung des Volumens wie bei der Berechnung des Lebend-, Tot- und Colokalisationsanteils über

62 4. Material und Methoden

eine Oberfläche, welche auf die zu berechnenden Strukturen gelegt wurde. Mit Hilfe dieser Oberfläche berechnete das Programm das zu bestimmende Volumen. Neben der mittleren Fluoreszenzintensität wurde eine zelluläre Mindestgröße von 10 µm3 angenommen. Diese Größe war das kleinste bestimmbare Zellvolumen in allen Versuchen. Das Volumen der colokalisierten Bakterien wurde aus diesem Grund definiert mit größer als 1 µm3 und kleiner als 9 µm3. Bei der Modellierung der zellulären Strukturen durch kugelförmige Spots (Spot- Methode) wurde die Annahme getroffen, dass sich die meisten Zellen durch eine kugelige Form nachbilden lassen. Der Parameter der Fluoreszenzintensität wurde wie in der ersten Methode berücksichtigt. Um die kugelige Form zu erstellen, wurde eine Fläche von 5x6 µm2 definiert, aus der die kugelige Form erstellt wurde. Diese Abmessungen entsprachen den durchschnittlichen gefundenen Zellabmessungen. Als Voraussetzung für den bakteriellen Colokalisationsanteil wurde eine Bakteriengrundfläche von 1x1 µm2 pro Spot angenommen. Der Unterschied beider Auswertungsmethoden besteht erstens in der Form, durch welche die Zellen nachgebildet wurden (möglichst reale Darstellung oder Modellierung durch kugelige Strukturen) und zweitens in den Größenannahmen für beide Methoden. In der Volumen-Methode wurde das kleinste bestimmbare Zellvolumen angenommen, während bei der Spot-Methode die durchschnittlich bestimmbare Grundfläche der Zelle angenommen wurde. Auf Grund des erhöhten Messfehlers bei Aufnahmen mit sehr hoher Besiedlung wurden Aufnahmen ausgeschlossen, deren Gesamtlebendbesiedlung größer war als 1,5x105 µm3 pro Aufnahme.

In der Hauptstudie wurde zusätzlich zur Bakterienlebendmasse die über die Volumen-Methode bestimmte (eukaryotische) Zellmasse angegeben. Da der Hauptfokus bei der Auswertung auf der Bestimmung der bakteriellen Besiedlung lag, wurde ein Lebed/Tot- Färbekit für Bakterien verwendet. Dieses Färbekit und die eingesetzten Konzentrationen sind also speziell dafür ausgelegt, Bakterien zu färben. Für Zellen muss angenommen werden, dass auf Grund der größeren Menge an Nukleinsäuren in den meisten Fällen eine Colokalisation von Syto® 9 und Propidiumiodid vorlag. Da das Färbeprotokoll auf die Färbung von Bakterien ausgelegt war und nur der zelluläre Syto® 9- Anteil bestimmt wurde, kann nur eine Aussage über die zelluläre Besiedlung, nicht aber über deren Lebend- oder Totanteil getroffen werden.

4. Material und Methoden 63

Abbildung 9: Darstellung beider Ausschlussmethoden am Beispiel des Zellausschlusses. (A) und (B) zeigen die Bestimmung des (eukaryotischen) zellulären Anteils am Gesamtlebendvolumen mittels Volumen-Methode. Die nachgebildeten zellulären Strukturen sind in gelb in (A) dargestellt. In (B) sind die zellulären Strukturen aus (A) mit dem Gesamtlebendvolumen (in grün) überlagert. (C) und (D) zeigen die Bestimmung des (eukaryotischen) zellulären Anteils am Gesamtlebendvolumen mittels Spot-Methode. Die zellulären Strukturen sind als Spots in rot in (C) dargestellt und mit dem Gesamtlebendvolumen (grün) in (D) überlagert. (E) und (F) zeigt Unterschiede der Volumen-Methode (in gelb) und der Spot-Methode (in rot), welche durch die Grundannahmen beider Methoden entstehen. Insbesondere nicht runde Zellstrukturen sind hier ausschlaggebend. (F) zeigt die Überlagerung aus (E) mit der grün gefärbten Biomasse auf der Implantatoberfläche. Der Maßstabsbalken entspricht 15 µm.

64 4. Material und Methoden

Morphologische Evaluation der bakteriellen und zellulären Besiedlung auf der Implantatoberfläche

Um den morphologischen Ansprüchen der Oberflächenbesiedlung gerecht zu werden, wurde zusätzlich ein Scoresystem in Anlehnung an GLAGE et al. (2017) für die morphologische Beschreibung der bakteriellen Besiedlung entwickelt. Ein Score von 0 wurde vergeben, wenn keine Bakterien auf der Oberfläche detektiert wurden (siehe Abbildung 10 A). Ein Score von 1 wurde verteilt, wenn vereinzelt Bakterien auf der Oberfläche sichtbar waren (siehe Abbildung 10 B). Ein Scorewert von 2 wurde bei Mikrokoloniebildung vergeben (siehe Abbildung 10 C) und ein Score von 3 bei beginnender Biofilmbildung (siehe Abbildung 10 D). Ein Scorewert von 4 wurde bei Biofilmbildung vergeben (siehe Abbildung. 10 E, F). Tabelle 14 fasst den Score für die morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung auf der Implantat- oberfläche zusammen. Die eukaryotische zelluläre Besiedlung wurde nach dem Vorliegen von verschiedenen Zelltypen auf der Implantatoberfläche beurteilt und beschrieben. Die Kernmorphologie, die Bildung von zellulären Ausläufern und das Vorhandensein von Zellen mit mehreren Zellkernen wurden dabei beurteilt.

Tabelle 14: Score Schema für die morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung. Score Morphologie 0 Keine Bakterien auf der Implantatoberfläche 1 Vereinzelt Bakterien auf der Implantatoberfläche 2 Eine oder mehrere Mikrokolonien 3 Beginnende Biofilmbildung 4 Biofilmbildung

4. Material und Methoden 65

Abbildung 10: Darstellung des Score Schemas für die morphologische Bewertung der bakteriellen Besiedlung. (A) stellt den Score 0 dar, bei dem keine Bakterien sichtbar sind. (B) zeigt vereinzelt Bakterien (markiert mit Pfeilen) auf der Implantatoberfläche, was einem Score von 1 entspricht. (C) zeigt exemplarisch Mikrokoloniebildung (markiert durch einen Kreis, Score von 2) und (D) zeigt den Score von 3, der einer beginnenden Biofilmbildung (markiert mit einem Kreis) entspricht. Biofilmbildung (markiert durch Kreise, Score von 4) ist in (E) und (F) dargestellt.

66 4. Material und Methoden

4.4.14. Auswertung der histologischen Schnitte

Die Auswertung der histologischen Schnitte (Hämatoxylin-Eosin Färbung und Toluidinblau Färbung) erfolgte ebenfalls über ein semiquantitatives Score-System, welches in Anlehnung an VOGELY et al. (2000) modifiziert wurde. Pro Färbung wurden zwei Schnitte evaluiert, sodass insgesamt vier Schnitte pro Tier bewertet wurden. Über das Scoresystem wurden Knochenveränderungen mit den Einzelwerten 0, 2, 4 und 6 pro Kriterium bewertet. Ein höherer Score entsprach dabei einer stärkeren Knochenveränderung. Ein Score für den Gesamteindruck wurde in 50-facher Vergrößerung vergeben. Die Veränderungen im Knochenmark, im Cortex und am Periost wurden in 50-facher, 200-facher und 400-facher Vergrößerung bewertet. Im Knochenmark wurde die Infiltration mit polymorphnukleären neutrophilen Granulozyten (PMN), die Bildung von Mikroabszessen und die Ausbildung von Fibrose bewertet. Im Cortex wurden die destruktiven Veränderungen, die Infiltration mit PMN und Osteoklasten sowie der fibrotische Umbau bewertet. Die Quantität der periostalen Reaktion wurde ebenfalls bewertet. Die vergebenen Einzelwerte wurden zu einem Gesamtscore addiert. Der maximal erreichbare Gesamtscore war 54. Aus den ermittelten Gesamtscores pro Schnitt wurde ein Median pro Tier berechnet. Der Gruppenmedian wurde aus den Tiermedianen gebildet. Die Bewertungskriterien sind in der Tabelle 15 zusammengefasst und werden im folgenden Abschnitt näher beschrieben. Der Gesamteindruck wurde mit einem Score von 2 bewertet, wenn weniger als ein Drittel des gesamten Knochens verändert war. Bei Veränderungen, die mehr als ein Drittel, aber weniger als 50 % des gesamten Knochens betroffen haben, wurde ein Score von 4 vergeben und bei Veränderungen von mehr als 50 % ein Score von 6. Bei vereinzelt vorkommenden PMN im Knochenmark bis hin zu zwei lagiger PMN Infiltration am Interface wurde ein Score von 2 vergeben. Ein Score von 4 wurde vergeben, wenn mehr als zwei aber maximal fünf Lagen PMN am Interface oder im Knochenmark gefunden wurden. Bei starker Infiltration mit PMN von mehr als fünf Lagen am Interface oder im Knochenmark wurde ein Score von 6 vergeben. Bei einem fibrotischen Umbau des Knochenmarks bis zu einem Drittel im Vergleich zum gesamten Knochenmark wurde die Veränderung mit einem Score von 2 bewertet. Wenn das Knochenmark mehr als ein Drittel, aber maximal zwei Drittel fibrotisch umgebaut war, wurde ein Score von 4 vergeben. Ein Score von 6 wurde vergeben, wenn mehr als zwei Drittel des Knochenmarks fibrotisch umgebaut waren. Destruktive Veränderungen im Cortex wurden mit einem Score von 2 beurteilt, wenn vermehrte und deutlich erweiterte Gefäße vorlagen bis hin zu maximal zwei fibrotischen Arealen, der kleiner als 500 µm waren. Bei dem Vorliegen von mehr als zwei kleinen fibrotischen Arealen oder Fibrose, die bis zu einem Drittel des Knochens betrafen, wurde ein Score von 4 vergeben und bei Veränderungen, bei dem mehr als ein Drittel des Cortex zerstört war, wurde ein Score von 6 vergeben. Fibrotische

4. Material und Methoden 67

Veränderungen im Cortex wurden mit einem Score von 2 bewertet, wenn maximal zwei fibrotische Areale vorlagen, die kleiner waren als 500 µm. Ein Score von 4 wurde vergeben, wenn circa ein Drittel des Cortex fibrotisch umgebaut war. Bei fibrotischen Arealen, die mehr als ein Drittel des Cortex betrafen, wurde ein Score von 6 vergeben. Das Vorliegen von Entzündungszellen im Cortex wurde in den veränderten Arealen beurteilt. Ein Score von 2 wurde vergeben, wenn vereinzelt PMN im Gesichtsfeld identifiziert wurden und bis zu 5 Osteoklasten. Bei zwei bis drei Lagen von PMN und bis zu 10 Osteoklasten wurde ein Score von 4 vergeben. Ein Score von 6 wurde bei mehr als drei Lagen PMN und/oder mehr als 10 Osteoklasten pro Gesichtsfeld vergeben. PMN und Osteoklasten wurden bei der Auswertung zusammengefasst, da GAIDA et al. (2012) feststellte, dass bei der Ausbildung der Infektion das Vorhandensein von Osteoklasten mit der Infiltration von PMN korreliert. Mikroabszesse wurden dann als solche gewertet, wenn sie mindestens zu zwei Dritteln von gerichtetem Bindegewebe umschlossen waren. Bei einem bis zu drei Mikroabszessen, die kleiner waren als 300 µm, wurde ein Score von 2 vergeben. Bei bis zu fünf kleinen Mikroabszessen oder einem Mikroabszess, der größer als 300 µm war, wurde ein Score von 4 vergeben. Ein Score von 6 wurde vergeben, wenn mehr als fünf Mikroabszesse vorlagen oder mehr als ein Mikroabszess, der größer war als 300 µm. Periostale Neubildungen, die weniger als ein Drittel des Knochens betrafen und kleiner als 500 µm waren, wurden mit einem Score von 2 bewertet. Mit einem Score von 4 wurden periostale Reaktionen bewertet, die mehr als ein Drittel aber weniger als 50 % des Knochens betrafen. Ein Score von 6 wurde bei periostalen Reaktionen vergeben, die mehr als 50 % des Knochens betrafen und/oder größer als 500 µm waren.

Tabelle 15: Score Schema für die Bewertung der histopathologischen Veränderungen. ROI Kriterium Schweregrad der Veränderung keine geringgradig mittelgradig hochgradig Knochenmark PMN 0 2 4 6 Mikroabszesse 0 2 4 6 Fibrose 0 2 4 6 Kortex Destruktion 0 2 4 6 PMN und 0 2 4 6 Osteoklasten Mikroabszesse 0 2 4 6 Fibrose 0 2 4 6 Periostale Quantität 0 2 4 6 Reaktion Subjektiver Gesamteindruck 0 2 4 6

68 4. Material und Methoden

4.5. Statistik

Die Mittelwerte, Mediane und Standardabweichungen (SD) wurden mit der Software Microsoft® Excel 2010 erstellt. Die statistische Auswertung erfolgte mit der Software SPSS Version 25 und GraphPad Prism Version 6.01. Alle Daten wurden zuerst auf Normalverteilung und Varianzhomogenität getestet. Die Signifikanzanalyse parametrischer Daten erfolgte mit dem ANOVA Verfahren und anschließendem post hock Test nach Tukey. Die Signifikanzanalyse nicht normalverteilter Daten und Scores erfolgte mit nicht parametrischen Tests (Kruskal-Wallis Test und Man-Whitney-U Test bzw. Friedmann Test und Wilcoxon Test). Normalverteilte Daten sind beschrieben als Mittelwerte±SD. Nicht normalverteilte Daten und Scores sind als Mediane (Minimum/Maximum) beschrieben. Als Signifikanzniveau wurde p≤0,05 angenommen. Die signifikanten Unterschiede sind im Text beschrieben und mit einem Sternchen (*) in den Grafiken verzeichnet. In einigen Abbildungen werden Rauten (#) korrespondierend zu den Sternchen verwendet. Kreise in den Boxplots zeigen Ausreißer der Gruppe. Diese sind mindestens drei Mal so groß, wie die Höhe der Boxen.

5. Ergebnisse 69

Ergebnisse

5.1. Charakterisierung der verwendeten Implantate

Nach Herstellung und Politur der Referenzimplantate wurden diese auf ihre Rauhigkeit nach DIN ISO 4287 und ISO 25178 untersucht. Für die exemplarisch untersuchten Referenzimplantate wurde ein Mittelrauhwert (Ra) von 0,13±0,03 µm, eine Rauhtiefe (Rz) von 0,88±0,23 µm und eine maximale Rauhtiefe (Rmax) von 0,92±0,2 µm ermittelt. Die mittlere arithmetische Höhe (Sa) betrug 0,16±0,02 µm und die maximale Höhe (Sz) 3,73±0,58 µm. Abbildung 11 zeigt eine CLSM Aufnahme des Referenzimplantates, anhand der die Rauhigkeitsauswertung vorgenommen wurde. Exemplarisch wurden die polierten Referenzimplantate, sowie die strukturierten Implantate aus der Hauptstudie mittels REM untersucht. Auf der Oberfläche des Referenzimplantates in Abbildung 12 (A-D) ist sowohl in der stereomikroskopischen Aufnahme als auch in der rasterelektronenmikroskopischen Darstellung eine Mikrostrukturierung erkennbar, die vor allem aus Längsrillen besteht. Zum Teil können auch quer verlaufende Rillen beobachtet werden (siehe Abbildung 12 A). Die Aufnahmen der laserstrukturierten Oberfläche in Abbildung 12 (A) und (E-G) zeigen gleichmäßig angeordnete Spikestrukturen von circa 5 µm auf der gesamten Oberfläche. Diese Spikeoberfläche ist den mit Titan besputterten Siliziumspikes nachempfunden, die die geringste bakterielle Besiedlung in vitro gezeigt haben (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten).

Abbildung 11: Exemplarisch CLSM Aufnahme der Oberfläche des Referenzimplantates. Die Rauigkeit der Oberfläche des Implantates für die Pilotstudie und des Referenzimplantates für die Hauptstudie zeigt eine rillenartige Mikrostrukturierung mit vornehmlich vorhandenen Längstrillen, aber auch zum Teil quer verlaufenden Rillen. Die Farben verdeutlichen die Höhen und Tiefen der Rillen, die durch den Polierprozess erzeugt wurden.

70 5. Ergebnisse

Abbildung 12: Exemplarische Aufnahmen der Oberfläche des Referenzimplantates und des laserstrukturierten Implantates. (A, B, E) sind stereomikroskopische Aufnahmen des polierten Referenzimplantates in (A, B) und des laserstrukturierten Implantates (A, E). (C, D, F, G) zeigen REM Aufnahmen des Referenzimplantates mit den Längstrillen (C, D) und des laserstrukturierten Implantates mit der Spikestruktur (F, G).

5.2. Pilotstudie 5.2.1. Konzentration der Injektionslösung und der Inkubations- suspension für die vorbesiedelten Implantate

Die Konzentrationen der bakteriellen Injektionssuspensionen wurden vor und nach Verwendung der Suspension bestimmt und als Mittelwert angegeben. Die tatsächlichen Konzentrationen der bakteriellen Injektionslösung blieben in allen Gruppen im angestrebten Konzentrationsbereich (103, 104, 105 und 106 KBE/10 µl). Für die Gruppe I106 wurde eine mittlere Konzentration von 2,09±1,02x106 KBE/10 µl für die intraoperative Infektion verwendet und für die Gruppe I105 eine mittlere Konzentration von 4,85±0,632x105 KBE/10 µl. Die mittlere Konzentration der bakteriellen Inokulationslösung für die Gruppe I104 betrug 2,49±0,954x104 KBE/10 µl und für die der Gruppe I103 1±0,333x103 KBE/10 µl. Tabelle 16 gibt einen Überblick über die Ergebnisse der bakteriellen Inokulationskonzentrationen. Die Konzentration der Inkubationslösung (KBE/ml) für die vorbesiedelten Implantate wurde nach jedem Ansatz bestimmt. In dieser Gruppe (VB12) war die Inkubationssuspension mit einer mittleren Konzentration von 3,2±0,41x107 KBE/ml ebenfalls im angestrebten Bereich von 107 KBE/ml. Die durch eine Ablösung mittels Enzymlösung ermittelte Bakterienmenge (KBE/ml) auf der Implantatoberfläche betrug 9,19±7,58x107 KBE/ml (siehe Tabelle 16).

5. Ergebnisse 71

In der CLSM Analyse zeigten die im Well oben und unten liegenden Implantatseiten gleichmäßige, mehrschichtige Bakterienansammlungen mit Mikrokoloniebildung (siehe Abbildung 13 A). Auf den seitlich im Well positionierten Implantatseiten wurde die gleiche Besiedlung wie auf den oben und unten liegenden Seiten nur im Randbereich festgestellt. Nach der Ablösung mittels Enzymsuspension (siehe Abbildung 13 B) waren auf der Implantatoberfläche sehr selten vereinzelte Bakterien auffindbar.

Tabelle 16: Ergebnisse der KBE-Bestimmung in der Pilotstudie. Gruppe Versuchsansatz OD 600 KBE/10 µl KBE/ml (ml für VB12) (Ablösung) Kontrolle Injektion von steriler - 0,9 %-ige - NaCl-Lösung NaCl-Lösung VB12 Vorbesiedlung in der 0,0621±0,0041 3,2±0,58x107 9,19±7,58x107 Bakteriensuspension I106 Injektion der 0,636±0,0121 2,09±0,818x106 - Bakteriensuspension I105 0,0642±0,0003 4,85±0,537x105 - I104 0,0141±0,0004 2,49±0,804x104 - I103 0,0029±0,0016 1±0,333x103 -

Abbildung 13: Exemplarische CLSM Aufnahmen der vorbesiedelten Implantate vor und nach der Ablösung der Bakterien. (A) zeigt eine CLSM Aufnahme nach der Vorbesiedlung der Implantate mit Bakterien und Lebend/Tot- Färbung. (B) zeigt eine CLSM Aufnahme nach Ablösung der Bakterien für die KBE-Bestimmung und anschließender Lebend/Tot- Färbung der auf dem Implantat verbliebenen Bakterien.

72 5. Ergebnisse

5.2.2. Tierverluste

Insgesamt mussten sechs Tiere in der Pilotstudie für die Beurteilung ausgeschlossen werden. Zwei Tiere wurden auf Grund von nicht infektionsbedingten Problemen ausgeschlossen. Je ein Tier in der Gruppe VB12, I105 und I104 erlitt im Versuchsdurchlauf eine Fraktur der Tibia oder Fibula und wurden daher vorzeitig euthanasiert. Ein Tier verstarb drei Tage post OP aus einem nicht ersichtlichen Grund. Die Anzahl an operierten und ausgewerteten Tieren ist in Tabelle 17 zusammengefasst dargestellt. Vorzeitig ausgeschiedene Tiere wurden nicht ersetzt, da eine Mindestgruppengröße von 6 Tieren für die Auswertung bei der Versuchsplanung angenommen wurde.

Tabelle 17: Tabellarische Darstellung der operierten und ausgewerteten Tierzahlen in der Pilotstudie. Gruppe n (operiert) n (evaluiert) Kontrolle 8 8 VB12 8 6 I106 8 6 I105 7 6 I104 8 7 I103 8 8

5.2.3. Befunde der täglichen Beurteilung

Über den gesamten Versuchszeitraum wurden alle Tiere täglich nach dem Schema in Tabelle 8 im Punkt 4.4.4 kontrolliert. Fast alle Tiere verhielten sich über den gesamten Versuchszeitraum unauffällig und waren aktiv. Die Haltung und das äußere Erscheinungsbild waren ohne besonderen Befund und gepflegt. Über den gesamten Versuchszeitraum erhielten die Tiere in den Kategorien „Verhalten und Aktivität“ sowie „Haltung, äußere Erscheinung, Köpertemperatur“ einen Score von 0. Die Ausnahme bildete ein Tier aus der Gruppe I106, welches drei Tage post OP ohne ersichtlichen Grund verstarb. Dieses erhielt am zweiten Tag post OP einen Score von 1 und 2 in den Kategorien „Haltung, äußere Erscheinung, Köpertemperatur“ und „Verhalten und Aktivität“. Es zeigte ein leicht struppiges Fell, eine verminderte Aktivität und war sehr ruhig. Das Gewicht der Tiere sank bis zum zweiten Tag post OP in den Gruppen K, I106, I105, I104 und I103 und stieg anschließend wieder an (siehe Abbildung 14 A). Das Ausgangsgewicht erreichten die Tiere der Kontrolle im Median am Tag 11 post OP,

5. Ergebnisse 73

die Gruppe I105 am Tag sechs post OP, während die Tiere der Gruppe I104 und I103 das Ausgangsgewicht am Tag 14 und 12 post OP erreichten. Die Tiere der Gruppe VB12 erreichten über den gesamten Versuchszeitraum nicht das Ausgangsgewicht und die Gruppe I106 erreichte das Ausgangsgewicht nur an zwei Versuchstagen (Tag 14 und 21 post OP). Der maximale Gewichtsverlust lag in der Gruppe der Kontrolltiere bei 4 % und am Ende des Versuchsdurchlaufs erreichten die Tiere 106 % des Ausgangsgewichtes. Die Tiere der Gruppe I105 hatten einen maximalen Gewichtsverlust von 0,5 % und erreichten am Tag 21 110 % des Ausgangsgewichtes. Die Tiere der Gruppen I104 und I103 zeigten einen maximalen Gewichtsverlust von 3 % und erreichten am Tag der Euthanasie 102 % (Gruppe I104) bzw. 104 % (Gruppe I103) des Ausgangsgewichtes. Der prozentuale Gewichtsverlust erreichte maximal 4 %. Die Gruppe VB12 hatte einen maximalen Gewichtsverlust von 7 % am Tag neun post OP. Am Tag 21 post OP hatte die Gruppe VB12 einen prozentualen Gewichtsverlust von circa 6 %. Ein Gewichtsverlust nach der Anästhesie für das Röntgen am Tag 14 wurde in allen Gruppen außer der Gruppe I103 beobachtet. Die Körperaußentemperatur zeigte keine auffällige Erhöhung in einer Gruppe, schwankte allerdings stark (siehe Abbildung 14 B). Drei bis vier Tage post OP normalisierte sich das Gangbild in allen Gruppen (siehe Abbildung 14 C). In der Gruppe VB12 mussten drei Tiere, in der Gruppe I106 zwei Tiere und in der Gruppe I104 ein Tier auf Grund einer Lahmheit zusätzlich analgetisch mit Carprofen behandelt werden. Das Gangbild normalisierte sich bei fast allen Tieren nach analgetischer Behandlung wieder. Ein Tier der Gruppe I106 einwickelte eine bakterielle Kniegelenksinfektion (siehe Punkt 5.2.6.) und wurde daher über den restlichen Versuchszeitraum analgetisch mit Tramdol im Trinkwasser versorgt. Die Schwellung der Implantationsstelle war bei den meisten Tieren post OP gering- bis mittelgradig und nahm über den Versuchszeitraum hinweg bei allen Gruppen ab (siehe Abbildung 14 D). Die Tiere der Gruppe K, I106 und I105 erreichten am Tag 12 post OP einen medianen Score von 0, während die Tiere der Gruppe VB12 einen medianen Score von 0 am Tag 14 post OP erreichten. In dieser Gruppe nahm die Schwellung ab Tag 16 post OP wieder zu und zeigte bis zum Versuchsende eine geringgradige mediane Schwellung (Score von 1). Am Tag acht bzw. sieben post OP war die Schwellung der Implantationsstelle der Gruppe I104 und I103 auf einen medianen Score von 0 zurückgegangen. Die Implantationsstellen der Gruppen K, I106, I105, I104 und I103 schwollen nach Erreichen des 0 Wertes nicht wieder an. Eine detaillierte Darstellung der medianen, minimalen und maximalen Ausprägung der Parameter prozentuale Gewichtsveränderung, Temperatur, Lahmheit und Schwellung der Implantationsstelle befindet sich im Anhang in der Tabelle 25 im Punkt 12.2. Aus diesem Grund wurde in der Abbildung 14 zur besseren Übersicht nur der Median abgebildet.

74 5. Ergebnisse

Abbildung 14: Ergebnisse der täglichen Beurteilung der Gruppen der Pilotstudie. Die relative Gewichtsentwicklung im gesamten postoperativen Verlauf ist in (A) dargestellt. (B) zeigt den Verlauf der Körperoberflächentemperatur post OP. Die Beurteilung der Lahmheit und der Schwellung der Implantationsstelle sind in (C) bzw. (D) dargestellt. Abgebildet sind die Mediane der ermittelten Werte ohne Minima und Maxima.

5. Ergebnisse 75

5.2.4. Relatives tibiales Gewicht der Tibiae

Nach Entnahme der Tibiae wurden alle Knochenteilstücke mit einer Feinwaage gewogen. Die tibialen Gewichte sind relativ zum Körpergewicht am Euthanasietag in der Abbildung 15 dargestellt. Die Knochengewichte der Kontrollgruppe zeigten ein relatives mittleres Gewicht von 0,331±0,068 %. Eine Erhöhung des Gewichtes im Vergleich zur Kontrolle kann in fast allen infizierten Gruppen außer der Gruppe I103 festgestellt werden. Diese Erhöhung ist in der Gruppe VB12 (0,514±0,080 %) signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Gruppe I106 erreichte ein mittleres relatives tibiales Gewicht von 0,455±0,116 % (p= 0,058 im Vergleich zur Kontrollgruppe). Die Gruppe I105 hatte ein relatives mittleres Knochengewicht von 0,439±0,099 %, die Gruppe I104 ein Gewicht von 0,371±0,050 %. Die Gruppe I103 erreichte ein mittleres Gewicht von 0,320±0,038 %. Mit abnehmender Infektionskonzentration konnte eine Abnahme des mittleren relativen Knochengewichtes festgestellt werden. Dieser Unterschied war in der Gruppe VB12 im Vergleich zu den Gruppen I104 und I103 signifikant.

Abbildung 15: Relatives tibiales Gewicht der Gruppen der Pilotstudie. Das Gewicht der Tibia ist relativ zum Gewicht am Tag 21 post OP dargestellt. Sternchen (*) zeigen signifikante Unterschiede mit p≤0,05.

5.2.5. Bestimmung der CRP-Konzentration im Serum

Nach Blutentnahme zur Serumgewinnung vor der OP, am Tag 7 und 21 post OP wurde die Konzentration des C-reaktiven Proteins mit Hilfe eines ELISA Kits bestimmt. Bei der Untersuchung der Konzentration des CRPs im Blutserum der Tiergruppen K, I106 und I103 wurde zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter

76 5. Ergebnisse

Unterschied zwischen den Versuchsgruppen detektiert. In den Gruppen K und I103 wurde zwischen den unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten ebenfalls kein signifikanter Unterschied in der CRP-Konzentration festgestellt. Allerdings konnte sowohl in der Kontrollgruppe, als auch in der Gruppe I103 ein Trend beobachtet werden. Die Kotrollgruppe zeigte einen Anstieg der Konzentration am Tag 7 (329,4±354,5 µg/ml) und einen Abfall am Tag 21 (237,1±189,6 µg/ml) post OP im Vergleich zum Tag 0 (263,1±208,1 µg/ml). In der Gruppe I106 wurde ein Anstieg am Tag 7 (258,1± 100,1µg/ml) und 21 (353,6±73,1 µg/ml) post OP im Vergleich zum Tag 0 (107,2±63,2 µg/ml) ermittelt. Dieser Anstieg war signifikant am Tag 21 post OP im Vergleich zu Tag 0. Die Gruppe I103 zeigte einen nicht signifikanten Anstieg der CRP-Konzentration am Tag 7 (229,3±173,1 µg/ml) und 21 (337,0±274,7 µg/ml) im Vergleich zu Tag 0 (204,1±107,7 µg/ml). Die Abbildung 16 stellt die Ergebnisse der Serum CRP-Konzentration graphisch dar.

Abbildung 16: CRP-Konzentration im Serum der Gruppen K, I106 und I103. Sternchen (*) zeigen signifikante Unterschiede mit p≤0,05.

5.2.6. Ergebnisse der mikrobiologischen Evaluation

Nach der Euthanasie wurde bei jedem Tier ein Abstrich von der Implantationsstelle vor der Eröffnung des Knochens angefertigt. Außerdem wurde ein Abstrich vom Knochenmark und vom Implantat erstellt. Des Weiteren wurde ein Abstrich von auffälligen Befunden genommen. Je 100 µl Blut und Urin wurden auf Blutagarplatten ausgestrichen. Der Versuchskeim Staphylococcus aureus 36/07 bildet unter aeroben Bedingungen auf Blutagar gelbliche, glänzende, glattrandige und schleimige Kolonien, die nach 24 Stunden Wachstum unter aeroben Bedingungen eine partielle Hämolyse des Blutagars zeigen. Diese sind exemplarisch in Abbildung 17 A durch

5. Ergebnisse 77

den Ausstrich des Glycerolstocks dargestellt. In der Kontrollgruppe wurde auf allen Ausstrichen vom Implantat, Knochenmark und der Implantationsstelle kein Wachstum des Versuchskeimes Staphylococcus aureus 36/07 nachgewiesen. Auf den Abstrichen der Implantationsstelle wuchsen in vier von acht Kontrolltieren kleine, weiße, nicht hämolysierende Kolonien. Das Wachstum dieses Keimes ist exemplarisch in Abbildung 17 C dargestellt. Aus einer Schwellung in der Unterhaut medio-proximal der Naht unterhalb des Knies, die nicht in Verbindung mit der Implantationsstelle stand, wurde ebenfalls das Bakterium isoliert, welches kleine, weiße, nicht hämolysierende Kolonien bildete. Aus den Knochenmarks- und Implantatabstrichen aller infizierten Tiere wurde der Versuchskeim Staphylococcus aureus 36/07 isoliert, welcher exemplarisch als Implantatabstrich in Abbildung 17 B dargestellt ist. Bis auf drei Abstriche von jeweils einem Tier der Gruppe VB12, I105 und I103 waren alle Abstriche der Implantationsstelle positiv für den Versuchskeim. Bei vier Tieren konnte kein Blut auf Grund von geronnenem Blut und bei drei Tieren kein Urin auf Grund von fehlendem Urin in der Blase ausgestrichen werden. In insgesamt vier Urinausstrichen unterschiedlicher Gruppen (je ein Tier aus K, VB12, I106 und I104) wurde das Wachstum von weißen, nicht hämolysierenden, kleinen Kolonien beobachtet. Aus dem Ausstrich des angeschwollenen Kniegelenks des Tieres der Gruppe I106 wurde der Versuchskeim Staphylococcus aureus 36/07 nachgewiesen. Die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung sind in Tabelle 18 zusammengefasst.

Tabelle 18: Ergebnisse der mikrobiellen Untersuchung der Pilotstudie. Gruppe Ausstriche Implantations Implantat Knochenmark Blut Urin Auffälligkeiten -stelle Kontrolle 4/8* 0/8 0/8 0/8 1/8* Schwellung der Unterhaut: 1/6* VB12 5/6 6/6 6/6 0/6 1/4*, # I106 6/6 6/6 6/6 0/6 1/5*, # Schwellung des Knies: 1/6 I105 5/6 6/6 6/6 0/6 0/6 I104 7/7 7/7 7/7 0/4# 1/7* I103 7/8 8/8 8/8 0/8 0/8 * kleine weiße Kolonien ohne Hämolyse, # Probenentnahme war nicht möglich auf Grund von koaguliertem Blut oder fehlendem Urin in der Blase.

78 5. Ergebnisse

Abbildung 17: Exemplarische Darstellung der mikrobiologischen Befunde der Pilotstudie. (A) zeigt einen Ausstrich des Glycerolstocks von Staphylococcus aureus 36/07, (B) den Abstrich von einem Implantat der Gruppe I103 und (C) die Kontamination einer Implantationsstelle auf Blutagar.

5.2.7. Ergebnisse der CLSM Evaluation

Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche

Die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung der bakteriellen Lebendmasse auf den Implantatoberflächen durch die CLSM Untersuchung und nachfolgende Auswertung mittels der Imaris® x64 Software durch Volumen- und Spot-Methode sind tabellarisch als Median (Minimum/Maximum) in der Tabelle 19 und graphisch in der Abbildung 18 dargestellt. Die Spot- und die Volumen-Methode zum Ausschluss der Zellen und der colokalisierten Bakterien zeigten in den Gruppen VB12, I106, I105 und I104 ähnliche Ergebnisse, welche sich nicht signifikant voneinander unterschieden. In der Kontrollgruppe und in der Gruppe I103 wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Medianen beider Methoden gefunden. In beiden Gruppen war das Volumen mit der Spot-Methode größer im Vergleich zum Volumen, welches mit der Volumen- Methode bestimmt wurde. In den Gruppen VB12 und I106 wurde kein signifikanter Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt. Ein signifikanter Anstieg der vitalen bakteriellen Besiedlung wurde in den Gruppen I105, I104 und I103 im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. Dieser Anstieg war unabhängig von der Methode. Im Gruppenvergleich wurden keine signifikanten Unterschiede ermittelt. Allerdings zeigt sich ein Trend zur Zunahme der bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche mit sinkender Infektionskonzentration. Auch in der Kontrolle wird eine vermeintliche bakterielle Besiedlung über beide Methoden quantifiziert, bei der es sich um zellähnliche Strukturen handelt, die kleiner als 10 µm sind (siehe Punkt 5.2.7.2) und die als Hintergrund zu werten sind. Die

5. Ergebnisse 79

Quantifizierungsmethode kann also die Besiedlungsstärke bestimmen, allerdings keine Auskunft über das Vorhandensein einer Infektion geben.

Tabelle 19: Volumen der vitalen bakteriellen Biomasse auf der Implantatoberfläche nach Bestimmung mit der Volumen- und Spot-Methode. Gruppe Vitale bakterielle Biomasse (µm3/A) Volumen-Methode Spot-Methode Kontrolle 4,63x103 (1,17x103/ 1,65x104) 8,23x103 (1,59x103/ 1,41x104) VB12 1,24x104 (3,61x103/ 2,24x104) 1,31x104 (3,15x103/ 1,85x104) I106 9,17x103 (2,42x103/ 4,99x104) 8,72x103 (2,61x103/ 5,05x104) I105 2,54x104 (1,13x104/ 3,22x104) 2,48x104 (1,27x104/ 3,44x104) I104 3,12x104 (6,60x103/ 4,70x104) 3,08x104 (6,52x103/ 4,66x104) I103 2,41x104 (4,53x103/ 6,59x104) 2,48x104 (5,67x103/ 6,86x104) Die quantifizierten Volumina sind dargestellt als Median (Minimum/ Maximum).

Abbildung 18: Ergebnisse der Quantifizierung der vitalen bakteriellen Besiedlung in der Pilotstudie. Sternchen (*) zeigen einen signifikanten Unterschied mit p≤0,05 im Vergleich zur Kontrollgruppe, während Rauten (#) einen signifikanten Unterschied zwischen den Auswertungsmethoden mit p≤0,05 anzeigen.

Morphologische Beurteilung der bakteriellen und zellulären Besiedlung auf der Implantatoberfläche

Die Bakterien auf der Implantatoberfläche wurden zusätzlich zur Quantifizierung nach ihrem morphologischen Erscheinungsbild mit einem Score beurteilt. Bei der Beurteilung der Implantatoberfläche im Hinblick auf die Bakterienmorphologie zeigte sich, dass die generelle Besiedlung mit Bakterien und Zellen auf der Implantatoberfläche von Tier zu Tier variierte. Die Ergebnisse der Auswertung sind

80 5. Ergebnisse

graphisch in der Abbildung 19 dargestellt. Einen Überblick über das Aussehen der bakteriellen und zellulären Besiedlung gibt Abbildung 20. In der Kontrollgruppe wurden keine Bakterien auf der Zelloberfläche gefunden und die Gruppe erreichte einen Score von 0 (0/0), (Abbildung 19 und 20 A). Allerdings wurden auf der Implantatoberfläche gefärbte zellähnliche Strukturen beobachtet, die größer waren, als Bakterien, aber kleiner als 10 µm. Im Gegensatz dazu ließen sich auf der Implantatoberfläche aller Infektionsgruppen Bakterien nachweisen. Der Score war in allen Infektionsgruppen signifikant höher im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Gruppen VB12 und I106 erreichten einen medianen Score von 1 (1/1) bzw. 1 (1/3). Die Implantatoberfläche dieser Gruppen war insgesamt im Vergleich zu den Gruppen I105, I104 und I103 weniger stark mit bakterieller Biomasse besiedelt. Auf der Implantatoberfläche wurden vor allem vereinzelte Bakterien gefunden (siehe Abbildung 19 und 20 B, C). In der Gruppe VB12 wurde vereinzelt Mikrokolonie- bildung auf der Implantatoberfläche beobachtet und in der Gruppe I106 vereinzelt beginnende Biofilmbildung, aber auch flächigen Biofilm. Der mediane Score der Gruppe I105 betrug 1 (1/3) (siehe Abbildung 19 und 20 D). In der Mehrzahl waren vereinzelt Bakterien auf der Oberfläche zu erkennen. In vielen Aufnahmen wurde aber auch Mikrokoloniebildung bis hin zur flächigen Biofilmbildung beobachtet. In den Gruppen I104 und I103 wurde eine stärkere bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche (siehe Abbildung 19 und 20 E und F) beobachtet. Der mediane Score betrug 2 (1/4) in der Gruppe I104 und 2 (1/4) in der Gruppe I103. In diesen Gruppen wurden auch vereinzelte Bakterienansammlungen gefunden. In der Mehrzahl der Aufnahmen wurde Mikrokoloniebildung bis hin zur flächigen Biofilmbildung beobachtet. In der Gruppe I103 und vereinzelt in der Gruppe I104 wurde eine Bildung von Clustern in flächiger Biofilmformation beobachtet. Bei der Beurteilung der Zellmorphologie und Zellbesiedlung ließen sich in der Kontrollgruppe vor allem Zellen mit rundem Zellkern und Zellen mit Ausläufern nachweisen. Es wurden auch Zellen mit eingezogenem Zellkern beobachtet. Vereinzelt wurden Zellen mit mehreren Zellkernen identifiziert. In den Infektionsgruppen wurden deutlich mehr Zellen mit eingezogenem Zellkern gefunden. Vereinzelt wurden Zellen mit rundem Zellkern, mit mehreren Zellkernen oder mit Ausläufern identifiziert.

5. Ergebnisse 81

Abbildung 19: Ergebnisse der morphologischen Auswertung der bakteriellen Besiedlung in der Pilotstudie. Auf die Einzeichnung des signifikanten Unterschieds aller Infektionsgruppen im Vergleich zur Kontrolle wurde verzichtet. Sternchen (*) zeigen einen signifikanten Unterschied mit p≤0,05 zwischen den Infektionsgruppen.

82 5. Ergebnisse

Abbildung 20: Bakterielle Besiedlung auf Implantatoberflächen in der Pilotstudie. In der Kontrolle (A) wurden keine Bakterien nachgewiesen, während die Gruppen VB12 (B) und I106 (C) vereinzelte Bakterien (weiße Pfeile) auf der Implantatoberfläche zeigten. In der Gruppe I105 wurden vermehrt Bakterienansammlungen (eingekreist) gefunden, während die Gruppen I104 (E) und I103 (F) vermehrt Biofilmbildung (eingekreist) zeigten. Die roten Pfeile in (A) markieren Zellen, die Ausläufer bilden, während die roten Pfeilspitzen in (C) bis (F) Zellen mit eingezogenem Zellkern zeigen.

5. Ergebnisse 83

5.2.8. REM Aufnahmen der infizierten explantierten Implantate

Von der Gruppe I103 wurden exemplarisch REM Aufnahmen angefertigt, um die bakterielle und zelluläre Besiedlung auf der Implantatoberfläche zu beurteilen. Die exemplarischen REM Aufnahmen zeigten eine Besiedlung auf der Implantatoberfläche in der Übersichtsaufnahme (siehe Abbildung 21 A). Diese Strukturen auf der Oberfläche ließen sich in der Vergrößerung in eukaryotische, zelluläre Anteile und kugelförmige Bakterien unterteilen (siehe Abbildung 18 B, C). Sowohl die Zellen, als auch die Bakterien sind auf Grund des Trocknungsprozesses etwas kleiner als im hydrierten Zustand. Neben Zellen und Bakterien ließen sich auch fibrinös bis fädig wirkende extrazelluläre polymere Matrixbestandteile abbilden (siehe Abbildung 18 B, C).

Abbildung 21: Exemplarische REM Aufnahmen eines infizierten Tieres der Gruppe I103. (A) zeigt eine Übersichtsaufnahme des besiedelten Implantates. Die Besiedlung mit Zellen und Bakterien ist mit Pfeilen gekennzeichnet. (B) und (C) zeigen Nahaufnahmen der Implantatoberfläche mit eukaryotischer zellulärer (Pfeilkopf) und bakterieller Besiedlung (eingekreist). Die Bakterien haben fibrinös wirkenden EPS (Pfeile) gebildet.

5.2.9. Ergebnisse der radiologischen Beurteilung

Am Tag 0, 14 und 21 post OP wurden fluoroskopische bzw. radiologische Aufnahmen der operierten Tibiae angefertigt und die infektionsbedingten Knochenveränderungen über einen modifizierten semiquantitativen Score (siehe Punkt 4.4.12.) ausgewertet. Tabelle 20 zeigt die Ergebnisse der Auswertung als Median (Minimum/Maximum). Die radiologische Beurteilung direkt postoperativ zeigte keine Veränderungen der operierten Tibiae (Score 0) mit Ausnahme des artifiziellen Knochendefekts durch die Bohrung. Am Tag 14 post OP war der Gesamtscore in allen Gruppen signifikant im Vergleich zum Tag 0 erhöht. Außerdem wurde in allen Infektionsgruppen eine signifikante Erhöhung im Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt. Am Tag 21 post OP wurde ein signifikant erhöhter Gesamtscore in allen Gruppen im Vergleich zum Tag 0 und im Vergleich zum Tag 14 post OP in den Gruppen VB12, I106 und I103 festgestellt. Ein signifikanter Anstieg des Gesamtscores im Vergleich zur Kontrolle wurde in allen Infektionsgruppen

84 5. Ergebnisse

ermittelt. Am Tag 14 konnten signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Ein signifikant geringerer Gesamtscore wurde in der Gruppe I103 im Vergleich zu VB12 und I105 festgestellt, sowie in der Gruppe I106 im Vergleich zur Gruppe I105. Am Tag 21 post OP wurde ein signifikant erhöhter Gesamtscore in der Gruppe VB12 im Vergleich zu I105 und I103 ermittelt.

Tabelle 20: Gesamtscore der radiologischen Auswertung in der Pilotstudie. Tage post OP 0 14 21 Gruppe Kontrolle 0,0 (0,0/1,3) 0,7 (0,0/3,3) 0,3 (0,0/4,0) VB12 0,0 (0,0/1,3) 8,3 (6,3/13,0) 15,8 (10,3/20,7) I106 0,0 (0,0/0,0) 6,2 (4,3/10,0) 12,5 (7,3/18,7) I105 0,0 (0,0/0,3) 9,7 (6,0/11,0) 10,5 (6,7/12,0) I104 0,0 (0,0/0,3) 10,3 (4,3/13,7) 11,0 (6,7/19) I103 0,0 (0,0/0,3) 5,3 (3,0/8,0) 7,5 (3,3/15) Die ermittelten Scores sind dargestellt als Median (Minimum/Maximum).

Abbildung 22: Darstellung der Gesamtscores der radiologischen Auswertung in der Pilotstudie. Sternchen (*) zeigen signifikante Unterschiede mit p≤0,05. Auf das Einzeichnen der signifikanten Unterschiede der Infektionsgruppen zur Kontrollgruppe und den Untersuchungszeitpunkten innerhalb der Gruppe wurde zum Zwecke der Übersichtlichkeit verzichtet.

Die Mediane, Minima und Maxima der Einzelscores pro Gruppe sind im Anhang im Punkt 12.3. in der Tabelle 26 dargestellt. Die nachfolgende Beschreibung der Gruppenveränderungen bezieht sich auf diese Tabelle. Abbildung 23 zeigt exemplarische Aufnahmen aller Gruppen am Tag 21 post OP. In der Kontrollgruppe wurde am Tag 14 und 21 post OP eine geringgradige periostale Reaktionen auf das Implantat röntgenologisch nachgewiesen, die sich

5. Ergebnisse 85

auch durch die Bewertung auf den subjektiven Gesamteindruck auswirkte. In den Gruppen VB12, I106 und I103 wurde eine Verstärkung der infektionsbedingten Knochenveränderungen bis zum Tag 21 festgestellt. Am stärksten waren die infektionsbedingten Veränderungen der Knochenstruktur in den Gruppen VB12 und I106 im Vergleich zu den anderen Infektionsgruppen ausgeprägt. Im Bereich des Bohrloches wurden am Tag 14 in der Gruppe VB12 bereits gering- bis mittelgradige Osteolysen festgestellt, die stärker waren als die in der Gruppe I106. Am Tag 21 waren die periostalen Reaktionen und Osteolysen im Bohrlochbereich in der Gruppe VB12 mittel- bis hochgradig ausgeprägt und damit deutlich stärker als die der Gruppe I106. Im Bereich des Implantates und distal davon wurden am Tag 14 geringgradige periostale Reaktionen und Osteolysen in beiden Gruppen festgestellt. Diese verstärkten sich bis zum Tag 21 zu mittelgradigen periostalen Reaktionen und hochgradigen Osteolysen im Bereich des Implantates und waren geringgradig stärker ausgeprägt in der Gruppe VB12 im Vergleich zur Gruppe I106. Die infektionsbedingten Knochenveränderungen in der Gruppe I105 und I104 verstärkten sich nur geringgradig im zeitlichen Verlauf und beide Gruppen zeigten ähnlich starke infektionsbedingte Knochenveränderungen. Die Gruppe I105 zeigte im Bereich des Bohrloches und des Implantates am Tag 14 mittelgradige Osteolysen und periostale Reaktionen. Im Gegensatz zur Gruppe I105 zeigte die Gruppe I104 in diesen Bereichen im Median geringgradige Osteolysen, wies aber innerhalb der Gruppe größere tierindividuelle Unterschiede in der Ausprägung der infektionsbedingten Knochenveränderungen auf. Im Bereich des Bohrloches und des Implantates wurden am Tag 21 in der Gruppe I105 ähnlich starke infektionsbedingte periostale Reaktionen und Osteolysen festgestellt wie am Tag 14. In der Gruppe I104 verstärkten sich im Gegensatz zur Gruppe I105 die periostalen Reaktionen und Osteolysen im Bereich des Bohrlochs, sowie die Osteolysen um das Implantat geringgradig. Der Bereich distal des Implantates wies am Tag 14 und 21 in der Gruppe I105 mittelgradige Osteolysen auf, die in der Gruppe I104 nur geringgradig waren. Die Gruppe I103 zeigte in der radiologischen Auswertung die geringsten infektionsbedingten Veränderungen. Allerdings wurden in dieser Gruppe vor allem am Tag 21 große tierindividuelle Unterschiede in der Ausprägung der infektionsbedingten Knochenveränderungen festgestellt. Im Bereich des Bohrloches und des Implantates wurden am Tag 14 geringgradige periostale Reaktionen und Osteolysen festgestellt. Die Osteolysen in diesen Bereichen verstärkten sich am Tag 21 minimal, blieben aber im Median geringgradig. Die periostale Reaktion im Bereich des Bohrloches und des Implantates verstärkte sich bis zum Tag 21 und zeigte im Median eine mittelgradige Ausprägung im Implantatbereich. Im Bereich distal des Implantates wurden nur am Tag 21 im Median geringgradige Osteolysen beobachtet.

86 5. Ergebnisse

Abbildung 23: Exemplarische radiologische Aufnahmen der Gruppen der Pilotstudie am Tag 21 post OP. Zur besseren Vergleichbarkeit der Aufnahmen wurden die fluoroskopischen Aufnahmen (A-E) invertiert. Die Kontrollgruppe (A) zeigte radiologisch keine auffälligen Veränderungen. Die Gruppen VB12 (B) und I106 (C) zeigten die deutlichsten Veränderungen mit höchstgradigen Osteolysen (Pfeile) und periostalen Reaktionen (Pfeilspitzen). Die Gruppen I105 (D) und I104 (E) zeigten Veränderungen mit hochgradigen Osteolysen (Pfeile) und mittelgradigen periostalen Reaktionen (Pfeilspitzen), während in der Gruppe I103 (F) geringgradige Osteolysen (Pfeile) und mittelgradige periostale Reaktionen (Pfeilspitze) im Bereich des Implantates beobachtet wurden. Das Bohrloch ist in (A) mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet. Der Maßstabsbalken entspricht 5 mm.

5. Ergebnisse 87

5.2.10. Microcomputertomographische Untersuchung der Tibiae

Die Tibiateilstücke wurden nach Entnahme des Implantates im µCT untersucht. Mikrocomputertomographisch konnten in allen Gruppen morphologische Veränderungen beobachtet werden. In der Kontrollgruppe wurden im Gegensatz zu den Infektionsgruppen keine osteolytischen Veränderungen gefunden. Eine Knochenneubildung, die teilweise oder vollständig das Implantat umschloss, wurde in allen untersuchten Tibiae der Kontrollgruppe gefunden (siehe Abbildung 24 A). In den infizierten Gruppen wurde eine Knochenneubildung um das Implantat vermehrt bei den Tieren der Gruppen I105, I104 und I103 beobachtet, aber nicht in den Gruppen VB12 und I106. In der Gruppe VB12 und I106 wurden höchstgradige Osteolysen und periostale Reaktionen beobachtet (siehe Abbildung 24 B und C). Hochgradige Osteolysen und periostale Reaktionen waren in den Gruppen I105 und I104 zu beobachten (siehe Abbildung 24 D und E). Tiere der Gruppe I103 zeigten geringgradige Osteolysen und periostale Reaktionen. Vereinzelt traten auch mittelgradige osteolytische Reaktionen auf (siehe Abbildung 24 F). Hochgradigere Osteolysen mit fibrotischer Umsetzung und vermehrte periostale Reaktionen wurden mit steigender Infektionskonzentration beobachtet.

Abbildung 24: Exemplarische µCT Aufnahmen von Tibia-Querschnitten der Pilotstudie. Die Knochen der Kontrollgruppe (A) zeigten nur geringgradige morphologische Veränderungen mit Knochenneubildung (Pfeilspitze) um den ehemaligen Implantatbereich (*), während die Knochen der Gruppe VB12 (B) und I106 (C) höchstgradige Osteolysen (eingekreist) und periostale Reaktionen (Pfeile) aufwiesen. Die Tibiae der Gruppen I105 (D), sowie I104 (E) zeigten hochgradige osteolytische Veränderungen (eingekreist) und periostale Reaktionen (Pfeile). Als infektionsbedingte Veränderungen in der Gruppe I103 waren nur geringgradige Osteolysen (eingekreist) und

88 5. Ergebnisse

mittelgradige periostale Reaktionen (Pfeil) erkennbar. Der vorherige Implantatsitz ist in allen Abbildungen mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet. Der Maßstabsbalken entspricht 1 mm.

5.2.11. Ergebnisse der histopathologischen Auswertung

Bei der histologischen Bewertung über einen semiquantitativen Score mit den möglichen Punktzahlen von 0-6 in Abhängigkeit von der Schwere der Ausprägung und einem maximal erreichbaren Wert von 54, zeigte die Kontrollgruppe den geringsten Gesamtscore von 3 (0/6) und damit die geringsten histologischen Veränderungen. Alle Gesamtscores der infizierten Gruppen waren signifikant erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe. Der mediane Gesamtscore betrug in der Gruppe VB12 39,5 (32/44), in der Gruppe I106 40 (26/43), in der Gruppe I105 27,5 (10/33), in der Gruppe I104 28 (16/34) und in der Gruppe I103 19,5 (7/40). Ein signifikant erhöhter Gesamtscore wurde außerdem in der Gruppe VB12 im Vergleich zur Gruppe I105, I104 und I103 festgestellt. I106 zeigte einen signifikant erhöhten Gesamtscore im Vergleich zur Gruppe I105 und I103.

Abbildung 25: Darstellung des Gesamtscores nach Auswertung der histopathologischen Veränderungen der Gruppen in der Pilotstudie. Sternchen (*) zeigen signifikante Unterschiede zwischen den Infektionsgruppen mit p≤0,05. Auf das Einzeichnen des signifikanten Unterschiedes der Infektionsgruppen im Vergleich zur Kontrolle wurde zur besseren Übersicht verzichtet.

Die Mediane, Minima und Maxima der Einzelscores pro Gruppe sind im Anhang im Punkt 12.4. in der Tabelle 27 dargestellt. Die nachfolgende Beschreibung der Gruppenveränderungen bezieht sich auf diese Tabelle. Die Tibia-Querschnitte der Kontrolltiere zeigten histologisch alle eine Knochen- neubildung um das Implantat. In Einzelfällen konnten geringgradige Infiltration mit

5. Ergebnisse 89

PMN, fibrotische Veränderungen im Knochenmark, sowie periostale Reaktionen histologisch festgestellt werden. Die Tibia-Querschnitte der Gruppen VB12 und I106 zeigten histologisch ähnlich starke Veränderungen. Im Knochenmark wurde eine hochgradige Infiltration mit PMN und eine hochgradige fibrotische Umsetzung beobachtet. Auch der Cortex war in beiden Gruppen hochgradig zerstört und fibrotisch umgebaut und die periostalen Veränderungen ebenfalls mittel- bis hochgradig. Unterschiede zwischen den Gruppen zeigten sich dahingehend, dass vereinzelt Mikroabszesse im Knochenmark der Gruppe VB12 beobachtet wurden im Gegensatz zur Gruppe I106. Im Cortex war in der Gruppe VB12 eine mittelgradige Infiltration mit PMN und Osteoklasten und vielen Mikroabszessen festzustellen, wohingegen in der Gruppe I106 selten Mikroabszesse, aber eine hochgradige Infiltration mit PMN und Osteoklasten gefunden wurden. Außerdem waren zwischen den Tieren der Gruppe I106 stärkere tierindividuelle Schwankungen zu beobachten. Die Tibia-Querschnitte der Gruppe I105 zeigte eine ähnlich starke Reaktion auf die Infektion wie die der Gruppe I104. Geringgradige Infiltrationen mit PMN und mittelgradige fibrotische Umsetzung des Knochenmarks wurden in der Gruppe I105 beobachtet. Die Gruppe I104 zeigte im Vergleich zur Gruppe I105 eine stärkere Infiltration mit PMN und eine gleich starke fibrotische Umsetzung des Knochenmarks. Die Destruktion des Cortex, der fibrotische Umbau und die periostalen Reaktionen waren in beiden Gruppen sehr deutlich feststellbar, aber schwächer ausgeprägt als in den Gruppen VB12 und I106. Die geringsten histologischen Veränderungen waren in der Gruppe I103 zu finden. Es wurden keine Mikroabszesse gefunden. Der fibrotische Umbau des Knochenmarks und des Cortex war am wenigsten stark ausgeprägt mit einer geringgradigen Infiltration mit PMN und Osteoklasten. Allerdings zeigte die Gruppe I103 insgesamt hohe tierindividuelle Schwankungen in der Ausprägung der osteomyelitischen Veränderungen. Die Reaktion auf die Infektion variierte zwischen starken Reaktionen bis hin zu kaum feststellbaren Reaktionen, wie beispielsweise einer starken Gefäßinjektion. Die histologische Reaktion auf die Infektion ist mit exemplarischen Aufnahmen in den Abbildungen 26-28 dargestellt. Die Abbildung 26 zeigt exemplarisch Toluidinblau gefärbte Übersichtsaufnahmen der Tibiae aller Gruppen in 100-facher Vergrößerung. In Abbildung 27 ist die Reaktion des Knochenmarks exemplarisch in Hämatoxylin- Eosin gefärbten Schnitten in 400-facher Vergrößerung dargestellt. Abbildung 28 zeigt exemplarisch in 200-facher Vergrößerung an Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitten die Reaktion des Cortex auf die Infektion.

90 5. Ergebnisse

Abbildung 26: Exemplarische Übersichtsaufnahmen von Tibia-Querschnitten der Pilotstudie in Toluidinblau. (A) zeigt eine Aufnahme der Kontrolle, die keine Entzündungsreaktion aufweist, dafür aber Knochenneubildung (Pfeilspitzen) um den ehemaligen Sitz des Implantates (*). (KM) bezeichnet das unveränderte Knochenmark. Eine Übersichtsaufnahme der Gruppe VB12 ist in (B) und der Gruppe I106 in (C) dargestellt. Eine hochgradige zelluläre Infiltration (graue Pfeile) im fibrotisch umgebauten Knochenmark (Fi), höchstgradige Destruktion des Cortex mit fibrotischem Umbau (eingekreist) und hochgradige periostale Reaktionen (Pfeile) sind sichtbar. Eine Übersichtsaufnahme der Gruppe I105 ist in (D) und der Gruppe I104 in (E) dargestellt. Knochenneubildung (Pfeilspitzen) um den ehemaligen Implantatsitz (*) und eine geringere Destruktion bzw. ein geringerer fibrotischer Umbau des Cortex (eingekreist) im Vergleich zu den Gruppen VB12 und I106 sind erkennbar. Periostale Reaktionen sind in der Gruppe I104 sichtbar (Pfeile). (F) zeigt eine Aufnahme der Gruppe I103. Knochenneubildung (Pfeilspitzen) am Interface und eine deutlich geringere Destruktion des Cortex wurden beobachtet. Geringgradige periostale Reaktionen sind auch in dieser Gruppe sichtbar (Pfeil). Der ehemalige Implantatsitz ist in allen Abbildungen mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.

5. Ergebnisse 91

Abbildung 27: Exemplarische Aufnahmen des Implantatinterfaces von Tibia-Querschnitten der Pilotstudie in Hämatoxylin-Eosin. (A) zeigt eine Aufnahme der Kontrolle, in der deutliche Knochenneubildung (Pfeilspitzen) im unveränderten Knochenmark (KM) um den ehemaligen Implantatsitz (*) erkennbar sind. (B) zeigt eine exemplarische Aufnahme der Gruppe VB12 und (C) eine Aufnahme der Gruppe I106 mit hochgradiger PMN-Infiltration (graue Pfeile) und Fibrose (Fi) im Knochenmark. Eine Aufnahme des Knochenmarks der Gruppe I105 ist in (D) und der Gruppe I104 in (E) dargestellt. Eine Infiltration mit PMN (graue Pfeile) und ein deutlicher fibrotischer Umbau (Fi) des Knochenmarks (KM) sind sichtbar. (F) zeigt eine Aufnahme der Gruppe I103. Knochenneubildung (Pfeilspitzen) am Interface im Knochenmark (KM), eine geringgradige Fibrose (Fi) und eine geringgradige Infiltration mit PMN (graue Pfeile) sind zu erkennen. Der Implantatsitz ist mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.

92 5. Ergebnisse

Abbildung 28: Exemplarische Aufnahmen des Cortex der Pilotstudie in Hämatoxylin-Eosin. (A) zeigt eine Aufnahme der Kontrolle, die keine Entzündungsreaktion aufweist. Im linken Bereich ist bereits das unveränderte Knochenmark (KM) mit Knochenneubildung (Pfeilspitzen) um den ehemaligen Implantatsitz (*) abgebildet. (B) zeigt eine Aufnahme der Gruppe VB12 und (C) eine Aufnahme der Gruppe I106 mit höchstgradiger Destruktion des Cortex und höchstgradigem fibrotischen Umbau (Fi), einer Infiltration mit Osteoklasten (schwarze Pfeile) und PMN (graue Pfeile). Eine Aufnahme der Gruppe I105 ist in (D) und der Gruppe I104 in (E) dargestellt. Die Destruktion des Cortex und der fibrotische Umbau (eingekreist) sind in diesen Gruppen noch deutlich zu erkennen. (F) zeigt eine exemplarische Aufnahme der Gruppe I103 mit einer geringgradigen Reaktion des Cortex auf die Infektion. Eine deutliche Gefäßinjektion (#) und geringgradige fibrotische Umsetzung der osteolytischen Bereiche (eingekreist) sind festzustellen.

5. Ergebnisse 93

5.2.12. Zusammenfassung der Ergebnisse der Pilotstudie

Die Ergebnisse der Pilotstudie sind im folgenden Abschnitt zusammengefasst. Die Konzentrationen für die Infektionssuspensionen der Gruppen lagen in dem angestrebten Konzentrationsbereich. Bei der täglichen Beurteilung wurden eine vermehrte Schwellung der Implantationsstelle und eine vermehrte, aber analgetisch behandelbare Lahmheit in den Gruppen mit höherer bakterieller Inokulations- konzentration (VB12 und I106) festgestellt. Das relative Knochengewicht nach Explanation nahm mit sinkender Infektionskonzentration ab und erreichte in der Gruppe I103 das der Kontrollgruppe. Die Bestimmung der CRP-Konzentration im Serum zeigte im zeitlichen Verlauf tendenziell eine sinkende Konzentration in der Kontrolle und eine steigende Konzentration in den infizierten Gruppen I106 und I103. Bei der mikrobiologischen Untersuchung waren die Abstriche der Kontrollgruppe negativ für den eingesetzten Versuchskeim. Die Abstriche der infizierten Gruppen waren positiv für den eingesetzten Versuchskeim Staphylococcus aureus 36/07. Das über die Software Imaris x64 ermittelte bakterielle Volumen zeigte eine steigende Tendenz mit sinkender Infektionskonzentration. Die Ergebnisse der morphologischen Auswertung ergaben vergleichbar mit den CLSM Ergebnissen einen steigenden morphologischen Score mit sinkender Infektionskonzentration. Die Auswertung der radiologischen Aufnahmen ergab einen erhöhten Gesamtscore in allen infizierten Gruppen am Tag 14 und am Tag 21 post OP. Der Gesamtscore stieg mit steigender Infektionskonzentration. Die histologische Auswertung ergab ein ähnliches Ergebnis wie die Röntgenauswertung. Es wurde ein steigender Gesamtscore mit steigender Infektionskonzentration ermittelt. Sowohl die radiologische, als auch die histologische Auswertung des Gesamtscores zeigte stärkere infektionsbedingte Veränderungen im Knochen mit steigenden Infektionskonzentrationen.

94 5. Ergebnisse

5.3. Hauptstudie 5.3.1. Konzentration der Bakteriensuspension und Tierverluste

Die Konzentrationen der bakteriellen Inokulationskonzentrationen wurden vor und nach Verwendung der Suspension bestimmt und als Mittelwert angegeben. Die für die Hauptstudie angestrebte Zielkonzentration von 103 KBE/10 µl wurde mit 2,5x103±1,66x103 KBE/10 µl bei einer OD600 von 0,003±0,003 erreicht. Insgesamt drei Tiere wurden verloren, zwei davon sind in der Narkose verstorben und ein Tier am Tag 3 post OP ohne ersichtlichen Grund. Die Tiere wurden ersetzt, sodass in beiden Gruppen der Hauptstudie 17 Tiere ausgewertet werden konnten. In Tabelle 21 ist die Anzahl der operierten und ausgewerteten Tiere zusammengefasst.

Tabelle 21: Zusammenfassung der operierten und ausgewerteten Tiere in der Hauptstudie. Gruppe n (operiert) n (ausgewertet) Referenzstruktur 19 17 Laserstruktur 18 17

5.3.2. Befunde der täglichen Beurteilung

Über den gesamten Versuchszeitraum wurden alle Tiere täglich nach dem Schema in Tabelle 8 im Punkt 4.4.4. kontrolliert. Ab dem ersten Tag post OP verhielten sich alle Tiere unauffällig und waren aktiv. Das äußere Erscheinungsbild war gepflegt. Die Haltung war unauffällig. Alle Tiere bis auf eines verhielten sich über den gesamt Versuchszeitraum unauffällig, waren aktiv und erhielten deshalb über den gesamten Versuchszeitraum in den Kategorien „Verhalten und Aktivität“ sowie „Haltung, äußere Erscheinung, Köpertemperatur“ einen Score von 0. Ein Tier aus der Gruppe der laserstrukturierten Implantate, welches 3 Tage post OP ohne ersichtlichen Grund verstarb, bildete die Ausnahme. Dieses erhielt am zweiten Tag post OP einen Score von 1 bzw. 2 in den Kategorien „Haltung, äußere Erscheinung, Köpertemperatur“ bzw. „Verhalten und Aktivität“. Es zeigte ein leicht struppiges Fell, eine verminderte Aktivität und war sehr ruhig. Das Gewicht der Tiere sank bis zum zweiten Tag post OP in beiden Gruppen und stieg anschließend wieder bis zum Erreichen des Ausgangsgewichtes am Tag 14 in der Gruppe mit den Referenzimplantaten und am Tag 12 in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten (siehe Abbildung 29 A). Die maximale Gewichts- abnahme betrug in der Gruppe mit der Referenzstruktur 2,7 % des Ausgangs- gewichtes und in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten 2,2 % des Ausgangsgewichtes. Am Ende der Versuchsdauer erreichte die Gruppe mit den Referenzimplantaten ein Gewicht von 102 % des Ausgangsgewichtes, während die

5. Ergebnisse 95

Gruppe mit den lasterstrukturierten Implantaten 101 % des Ausgangsgewichtes erreichte. Ein minimaler Gewichtsverlust nach der Anästhesie für das Röntgen am Tag 14 wurde in beiden Gruppen beobachtet. Dieser betrug 0,2 % in der Gruppe mit der Referenzstruktur und 0,6 % in der Gruppe mit den lasterstrukturierten Implantaten. Die Körperoberflächentemperatur zeigte bei den Tieren eine leichte Schwankung. Es waren keine auffälligen Erhöhungen im Temperaturverlauf erkennbar (siehe Abbildung 29 B). Postoperativ zeigten alle Tiere eine Lahmheit, die in beiden Gruppen am Tag 2 post OP mit Ausnahme von einem Tier wieder verschwand. Dieses Tier der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten wurde analgetisch über 4 Tage behandelt. Anschließend traten keine weiteren Symptome auf. Ein weiteres Tier der Gruppe der laserstrukturierten Implantate wurde auf Grund einer starken Gewichtsabnahme analgetisch über 3 Tage behandelt. Die Schwellung der Implantationsstelle war im Median geringgradig (Score 1) und erreichte ab Tag 5 einen Score von 0 in beiden Gruppen. In der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten zeigten einige Tiere eine geringgradige wiederkehrende Schwellung, die am Tag neun einen maximalen medianen Score von 0,5 erreichte. In beiden Gruppen gab es einige Tiere, die geringgradige Schwellungen der Implantationsstelle auch nach dem Tag 5 zeigten. In der Gruppe mit der Referenzstruktur waren das sieben Tiere und in der Gruppe, die die laserstrukturierten Implantate erhielt, acht Tiere. Das Gewebe unter der Haut schimmerte leicht bläulich. In Abbildung 29 sind die Parameter prozentuale Gewichtsentwicklung, Körperoberflächentemperatur, Lahmheit und Schwellung der Implantationsstelle dargestellt. Zur besseren Übersichtlichkeit wurde in der Abbildung 29 nur der Median dargestellt. Eine detaillierte Darstellung der Mediane mit minimalen und maximalen Ausprägungen der in Abbildung 29 gezeigten Parameter befindet sich im Anhang unter Punkt 12.5 in der Tabelle 28.

96 5. Ergebnisse

Abbildung 29: Befunde der täglichen Beurteilung der Gruppen der Hauptstudie. Die relative Gewichtsentwicklung im gesamten postoperativen Verlauf ist in (A) dargestellt. (B) zeigt den Verlauf der Körperoberflächentemperatur post OP. Die Beurteilung der Lahmheit und der Schwellung der Implantationsstelle sind in (C) sowie in (D) dargestellt. Abgebildet sind die Mediane der ermittelten Werte ohne Minima und Maxima.

5. Ergebnisse 97

5.3.3. Relatives tibiales Gewicht

Das mediane relative Knochengewicht der operierten Tibia wurde am Tag 21 post OP gemessen und in Abhängigkeit vom Körpergewicht am Euthanasietag dargestellt. Das mediane relative tibiale Gewicht in der Gruppe, die die Referenzimplantate erhielt, betrug 0,303 % (0,259 %/0,459 %). Das relative mediane Knochengewicht der laserstrukturierten Gruppe betrug 0,296 % (0,260 %/0,399 %). Zwischen beiden Gruppen wurde kein signifikanter Unterschied ermittelt.

Abbildung 30: Relatives tibiales Knochengewicht der Gruppen der Hauptstudie.

5.3.4. Ergebnisse der mikrobiologischen Evaluation

Das Ergebnis der mikrobiologischen Untersuchung von Implantationsstelle, Knochenmark und Implantatabstrich zum Euthanasiezeitpunkt ist in Tabelle 22 zusammengefasst dargestellt. Nach 24 Stunden Bebrütungszeit wurden auf allen Knochenmarksabstrichen und allen Implantatabstrichen der laserstrukturierten Implantate Kolonien des Versuchskeims Staphylococcus aureus 36/07 nachgewiesen, der gelbliche, glänzende, glattrandige und schleimige Kolonien mit partieller Hämolyse bildet. Alle Knochenmarksabstriche und 13 der 17 Implantatabstriche der Gruppe mit dem Referenzimplantat wiesen einen positiven

98 5. Ergebnisse

Befund für Staphylococcus aureus 36/07 auf. Die Abstriche der Implantationsstelle zeigten in der Gruppe mit den Referenzimplantaten bei 13 Tieren und in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten bei 15 Tieren ein Wachstum mit gleicher Koloniemorphologie wie Staphylococcus aureus 36/07.

Tabelle 22: Ergebnisse der mikrobiologischen Abstriche in der Hauptstudie. Ausstriche Gruppe Implantationsstelle Implantat Knochenmark Referenzstruktur 13/17 14/17 17/17 Laserstruktur 15/17 17/17 17/17

5.3.5. Quantifizierung und morphologische Beurteilung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche

Die Implantate wurden nach der Eröffnung der Tibia mit einer Pinzette herausgezogen. 15 der 17 Implantate der laserstrukturierten Gruppe ließen sich sehr schwer aus dem Knochen herausziehen. Aus der Gruppe mit Referenzimplantat konnte jedes Implantat leicht entnommen werden. Nach Lebend/Tot- Färbung und konfokalmikroskopischer Analyse erfolgte die Quantifizierung der bakteriellen und zellulären Biomasse auf der Implantatoberfläche. Von den angefärbten und mittels CLSM dargestellten Gesamtoberflächen (170 Aufnahmen/Gruppe) mussten von den Referenzimplantaten insgesamt sechs Aufnahmen ausgeschlossen werden und von den laserstrukturierten Implantaten insgesamt 42 Aufnahmen ausgeschlossen werden, da die Gesamtlebendbesiedlung größer war als 1,5x105 µm3 pro Aufnahme.

Quantifizierung und morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung

Die vitale bakterielle Biomasse auf der Implantatoberfläche wurde mit der Volumen- Methode ermittelt. Sie betrug auf der Oberfläche der Referenzimplantate 1,62x104 (3,71x103/ 4,78x104) µm3/A. In der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten betrug die vitale bakterielle Biomasse 5,09x104 (2,18x104/ 8,0x104) µm3/A und war damit signifikant erhöht im Vergleich zur Gruppe, die die Referenzimplantate erhielt (siehe Abbildung 31 A). In der morphologischen Beurteilung durch den semiquantitativen Score mit Werten zwischen 0 und 4 je nach Vorhandensein von Bakterien und Biofilm wurden starke

5. Ergebnisse 99

Schwankungen zwischen den Tieren beider Gruppen festgestellt. Die Gruppe mit der Referenzstruktur zeigte einen medianen Score von 1 (1/4). Dieser war signifikant kleiner als der Score der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten, der im Median bei 3 (1/4) lag. Die morphologische Auswertung zeigte, dass sowohl auf Oberflächen der Referenzstruktur Mikrokoloniebildung, beginnende Biofilmbildung und Biofilmbildung zu beobachten war als auch in der laserstrukturierten Gruppe Implantatoberflächen zu finden waren, die nur vereinzelt Bakterien aufwiesen (siehe Abbildung 31 B).

Quantifizierung und morphologische Beurteilung der zellulären Besiedlung

Der Unterschied in der Oberflächenbesiedlung zeigte sich auch in der Besiedlung der Implantatoberfläche mit eukaryotischen Zellen. Die mediane zelluläre Besiedlung war in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten mit 4,41x104 (2,34x104/ 6,59x104) µm3/A signifikant höher im Vergleich zu der Gruppe mit der Referenzoberfläche mit 1,08x104 (3,06x103/ 3,45x104) µm3/A (siehe Abbildung 31 C). Morphologisch zeigten sich in sehr vielen Aufnahmen der Gruppe, die das laserstrukturierte Implantat erhielt, Zellen mit Ausläufern, die zumeist einen länglichen bis spindelförmigen Zellkörper besaßen (siehe Abbildung 32 C). Diese Ausläuferzellen wurden weniger häufig in der Gruppe mit den Referenzimplantaten gefunden (siehe Abbildung 32 A). Dafür wurden auf der Oberfläche der Referenzimplantate im Vergleich zu den laserstrukturierten Implantaten häufiger Zellen mit eingezogenem Kern gefunden. In der Gruppe mit dem laserstrukturierten Implantat wurden häufiger Zellen gefunden, die mehr als einen Zellkern hatten. Bei diesen Zellen wurden in der Regel drei bis vier Zellkerne gezählt. Zellen, die circa doppelt so groß waren, wie die Zellen mit einem eingezogenen Kern, wurden deutlich häufiger auf der Implantatoberfläche der laserstrukturierten Gruppe gefunden.

100 5. Ergebnisse

Abbildung 31: Ergebnisse der quantitativen und morphologischen Auswertung der bakteriellen und zellulären Besiedlung auf der Implantatoberfläche. Die Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung ist in (A) und die morphologische Beurteilung in (B) dargestellt. (C) zeigt die Quantifizierung der Zellmasse auf den Implantatoberflächen. Sternchen (*) zeigen signifikante Unterschiede mit p≤0,05.

5. Ergebnisse 101

Abbildung 32: Exemplarische Darstellung der bakteriellen Besiedlung auf den Implantatoberflächen in der Hauptstudie. Die Besiedlung auf der Implantatoberfläche nach Lebend/Tot- Färbung der Referenzstruktur ist in (A) und (B) dargestellt, während die Besiedlung der laserstrukturierten Oberfläche in (C) und (D) dargestellt ist. Um die genaue Lokalisation der bakteriellen Besiedlung zu zeigen, ist zusätzlich die Implantatoberfläche der Referenzstruktur in (B) und die Oberfläche der Laserstruktur in (D) dargestellt. Zur besseren Sichtbarkeit sind die Strukturen in den Abbildungen ohne Implantatoberfläche markiert (A, C). Auf der Implantatoberfläche der Referenzstruktur (A) sind vereinzelt Bakterien sichtbar (weiße Pfeile). Häufiger können Zellen mit eingezogenem Zellkern identifiziert werden (beispielsweise markiert mit einer roten Pfeilspitze). Auf der laserstrukturierten Oberfläche ist beginnende Biofilmbildung bzw. Biofilmbildung (eingekreist) auch zwischen den Spikestrukturen erkennbar. Deutlich mehr Zellen können auf der Implantatoberfläche nachgewiesen werden. Im Vergleich zur Referenzoberfläche sind weniger Zellen mit eingezogenem Zellkern (rote Pfeilspitzen) sichtbar. Außerdem sind spindelförmige Zellen mit Ausläufern (rote Pfeile) auf der Implantatoberfläche nachzuweisen.

102 5. Ergebnisse

5.3.6. Beurteilung der exemplarischen REM Aufnahmen

In der exemplarischen REM Untersuchung der Referenzoberflächen zeigten sich wie auch in der CLSM Untersuchung Unterschiede in der Besiedlungsstärke. Auf der Oberfläche sind sowohl Zellen, als auch Bakterien angelagert (Abbildung 33 A). Biofilmbildung ist erkennbar in Form von großen rundlichen Bakterienansammlungen in ihrer fibrinöse wirkenden extrazellulären Matrix (Abbildung 33 B und C). Die Aufnahmen der laserstrukturierten Oberfläche zeigen, dass die Spike-Struktur nach Explantation noch vorhanden ist. Ob diese im Vergleich zur ursprünglichen Struktur vor der Implantation unverändert ist, ist auf Grund der starken Besiedlung schwer zu identifizieren. Die Gesamtbesiedlung der strukturierten Oberfläche ist deutlich höher als die der Referenzoberfläche (siehe Abbildung 33 D-F). Auf der Übersichts- aufnahme (Abbildung 33 D) des laserstrukturierten Implantates ist eine flächige Zellmasse zu erkennen, die auf der Implantatoberfläche aufliegt. Spindelförmige Zellen, die Ausläufer und teilweise ein zusammenhängendes Netz bilden (Abbildung 33 D und E), sind auf der Implantatoberfläche in großer Anzahl neben eingezogenen Zellen vorhanden (Abbildung 33 E und F). Zellausläufer sind neben Bakterien- ansammlungen in ihrer fibrösen Matrix auf der Implantatoberfläche sichtbar (Abbildung 33 F).

5. Ergebnisse 103

Abbildung 33: Exemplarische REM Aufnahmen der Gruppen der Hauptstudie. In (A) und (D) sind Übersichtsaufnahmen der explantierten Implantate mit Referenzstruktur (A) und Laserstruktur (D) dargestellt. Die Besiedlung mit Bakterien und Zellen ist mit Pfeilen markiert. In (D) zeigen Pfeilspitzen auf die Besiedlung mit Osteoblasten, die ein flächiges Netz auf der Implantatoberfläche ausbilden. (B) und (E) zeigen eine nähere Aufnahme der Besiedlung auf der Referenzoberfläche (B) und der laserstrukturierten Oberfläche (E). Zellen in (B) und eine flächige Osteoblastenbesiedlung in (E) sind mit Pfeilspitzen markiert. In der Gruppe mit dem laserstrukturierten Implantat (E) wurden spindelförmige Zellen (Pfeile) auf der Implantatoberfläche gefunden, die Netze ausbilden. Bakterienansammlungen in (B) sind eingekreist. Eine Nahaufnahme der Besiedlung der Oberfläche von der Referenzstruktur ist in (C) und der Laserstruktur in (F) abgebildet. Biofilmbildung und Bakterien sind eingekreist, Pfeile zeigen auf die von den Bakterien produzierte fibrinös wirkende Matrix, während Zellen mit Pfeilspitzen markiert sind. Auf Grund des Dehydratationsprozesses sind die Zellen und Bakterien auf der Implantatoberfläche kleiner als im hydrierten Zustand.

104 5. Ergebnisse

5.3.7. Ergebnisse der radiologischen Beurteilung

In der radiologischen Untersuchung wurden die knöchernen Tibiaveränderungen über ein Scoresystem mit Werten von 0 bis maximal 3 pro Beurteilungskriterium und einem Maximalwert von 23 beurteilt. Direkt post OP wurden die Veränderungen in beiden Gruppen mit ein Gesamtscore von 0 bewertet. Am Tag 14 post OP zeigten sich schon geringgradige radiologische Veränderungen in beiden Gruppen. Sie waren signifikant erhöht im Vergleich zum Tag 0. Signifikant stärkere Veränderungen wurden in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten im Vergleich zur Gruppe mit den Referenzimplantaten ermittelt. Am Tag 21 hatten beide Gruppen einen signifikant erhöhten Gesamtscore im Vergleich zum Tag 0 und Tag 14. Zwischen beiden Gruppen wurde kein signifikanter Unterschied ermittelt. Die Gesamtsumme ist in Form des Medians (Minimum/Maximum) pro Gruppe als Übersicht in Tabelle 23 und graphisch in Abbildung 34 dargestellt.

Tabelle 23: Gesamtscore der radiologischen Auswertung in der Hauptstudie. Tage post 0 14 21 OP Gruppe Referenzstruktur 0,0 (0,0/0,3) 2,3 (0,3/6) 5,0 (1,7/14) Laserstruktur 0,0 (0,0/0,0) 3,3 (0,0/6) 6,3 (0,3/12)

Abbildung 34: Darstellung des Gesamtscores der radiologischen Auswertung der Hauptstudie. Sternchen (*) zeigen signifikante Unterschiede mit p≤0,05. Auf das Einzeichnen der signifikanten Unterschiede zwischen den Untersuchungstagen wurde zur besseren Übersicht verzichtet.

5. Ergebnisse 105

Die Mediane (Minima/Maxima) der Einzelscores pro Gruppe sind im Anhang im Punkt 12.6. in der Tabelle 29 dargestellt. Die nachfolgende Beschreibung der Gruppenveränderungen bezieht sich auf diese Tabelle. Am Tag 14 post OP zeigten die Tiere beider Gruppen im Bereich des Bohrlochs im Median eine geringgradige Osteolyse. Geringgradige Osteolysen konnten in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten im Gegensatz zur Gruppe mit den Referenzimplantaten im Median auch im Bereich des Implantates und distal davon beobachtet werden. Am Tag 21 post OP zeigten die Tiere beider Gruppen geringgradige periostale Reaktionen im Bereich des Implantatsitzes. Geringgradige Osteolysen wurden in beiden Gruppen im Bereich des Bohrloches, des Implantates und distal des Implantates festgestellt. Diese waren in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten im Median geringgradig stärker ausgeprägt als in der Gruppe, die die Referenzimplantate erhielt. In beiden Gruppen waren tierindividuelle Schwankungen am Tag 14 und 21 vorhanden. Diese schwankten von keinen radiologisch erkennbaren infektionsbedingten Veränderungen bis hin zu geringgradigen Veränderungen in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten und mittelgradigen Veränderungen im Bereich des Bohrloches und Implantatsitzes in der Gruppe mit den Referenzimplantaten. Am Tag 21 wurden in der Gruppe, welche die laserstrukturierten Implantate erhielt, maximal mittelgradige Veränderungen festgestellt. Im Vergleich dazu wurden in der Gruppe mit den Referenzimplantaten maximal mittelgradige Veränderungen im Bereich des Bohrloches und Implantatsitzes, sowie hochgradige Veränderungen im Bereich distal des Implantates festgestellt.

106 5. Ergebnisse

Abbildung 35: Exemplarische radiologische Aufnahmen der Hauptstudie am Tag 21 post OP. Eine Aufnahme der Tibia eines Tieres mit einem Referenzimplantat ist in (A) und eine Aufnahme der Tibia aus der Gruppe mit der Laserstruktur ist in (B) abgebildet. Im Bereich des Bohrloches zeigten beide Gruppen ähnlich starke osteolytische Veränderungen (Pfeil) als Reaktion auf die Infektion. Im Bereich des Implantates und distal des Implantates war die Osteolyse (Pfeile) in der laserstrukturierten Gruppe geringgradig stärker im Vergleich zur Gruppe mit Referenzimplantat. Der Maßstabsbalken entspricht 5 mm.

5.3.8. Mikrocomputertomographischen Untersuchung der Tibiae

Die exemplarische mikrocomputertomographische Untersuchung der Tibiateilstücke beider Untersuchungsgruppen zeigte geringgradige Veränderungen der Knochenstruktur in der Gruppe mit dem Referenzimplantat. Eine Knochenneubildung um den ehemaligen Sitz des Implantates wurde beobachtet. Es wurden nur geringgradige Osteolysen im Übergangsbereich des Knochenmarks zum Cortex festgestellt (siehe Abbildung 36 A). In der laserstrukturierten Gruppe wurden endostal geringgradige diffuse Knochenneubildungen beobachtet, die vom Cortex ausgingen (siehe Abbildung 36 B). Cortikale Osteolysen sind in der laserstrukturierten Gruppe zu erkennen. Diese sind etwas stärker ausgeprägt als die der nicht strukturierten Referenzgruppe. Periostale Reaktionen sind deutlich sichtbar in der Gruppe mit dem laserstrukturierten Implantat.

5. Ergebnisse 107

Abbildung 36: Exemplarische µCT Aufnahmen der Gruppen der Hauptstudie. Eine exemplarische Aufnahme der Gruppe, die das polierte Referenzimplantat erhielt, ist in (A) dargestellt und eine exemplarische Aufnahme der Gruppe, welches das laserstrukturierte Implantat erhielt, ist in (B) dargestellt. Knochenneubildung um den ehemaligen Implantatsitz (A) bzw. vom Endost ausgehend in (B) ist durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Osteolysen des Cortex in (A) und (B) sind eingekreist, während periostale Reaktionen in (B) durch einen Pfeil gekennzeichnet sind. Der Maßstabsbalken entspricht 1 mm.

5.3.9. Ergebnisse der histologischen Beurteilung

Die histologische Bewertung erfolgte über einen semiquantitativen Score mit den möglichen Punktzahlen von 0-6 in Abhängigkeit von der Schwere der Ausprägung. Der maximal erreichbare Score war 54. Drei Tiere aus der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten mussten von der histologischen Auswertung ausgeschlossen werden, da das Implantatinterface durch den Auszug aus dem Knochen zu stark zerstört worden war. In der Gruppe mit den Referenzimplantaten betrug der mediane Gesamtscore 14 (8/36) und war signifikant niedriger als in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten. Diese Gruppe erreichte einen Gesamtscore von 22 (12/40). Die Gesamtsumme ist in Form eines Boxplots graphisch in Abbildung 37 (A) dargestellt. Knochenneubildung um das Implantat wurde bei 16 von 17 Tieren in der Gruppe mit den polierten Referenzimplantaten beobachtet, während in der Gruppe mit den strukturierten Implantaten 11 der 14 auswertbaren Tibia-Querschnitte Knochen- neubildung zeigten. Diese war zum Teil implantatnah, aber auch diffus ausgehend vom Endost. Die Mediane, Minima und Maxima der Einzelscores pro Gruppe sind im Anhang im Punkt 12.7. in der Tabelle 30 dargestellt. Um die Lokalisation der Veränderungen genauer zu untersuchen, wurden die Einzelscores aus der Tabelle 30 auf ihre Unterschiede untersucht. Dabei wurden zwei Parameter identifiziert, die sich signifikant voneinander unterschieden: die Destruktion und die Fibrose im Cortex.

108 5. Ergebnisse

Die Destruktion und fibrotische Umsetzung des Cortex war in der Gruppe, die die Referenzimplantate erhielt (Destruktion: 2 (2/6) und Fibrose: 2 (0/6)), signifikant geringer als in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten (Destruktion: 3 (2/6) und Fibrose: 3 (2/6)). Die fibrotische Umsetzung des Knochenmarks war in der laserstrukturierten Gruppe mit einem medianen Score von 3,5 (0/5) im Vergleich zur Gruppe mit den Referenzimplantaten, welche einen medianen Score von 2 (0/4) hatte, nicht signifikant erhöht. Die signifikant veränderten Parameter sind in Abbildung 37 (B) und (C) graphisch dargestellt.

Die nachfolgende Beschreibung der Gruppenveränderungen bezieht sich auf die Tabelle 30 im Anhang unter Punkt 12.7. Im Knochenmark beider Gruppen wurde im Median eine geringgradige Infiltration mit PMN und ein geringgradiger fibrotischer Umbau festgestellt. Der fibrotische Umbau des Knochenmarks war in der Gruppe mit der Laserstruktur stärker ausgeprägt, als in der Gruppe mit den Referenzimplantaten. Die Infiltration des Cortex mit PMN und Osteoklasten war in beiden Gruppen geringgradig. Die Destruktion und die Fibrose des Cortex war in der Gruppe mit der Referenzstruktur weniger stark ausgeprägt als in der Gruppe mit der Laserstruktur. Die periostale Reaktion war in beiden Gruppen im Median geringgradig. Beide Gruppen zeigten große tierindividuelle Unterschiede in der Ausprägung der infektionsbedingten Knochenveränderungen, die zwischen keiner feststellbaren Reaktion bzw. einer geringgradigen bis hin zu einer hochgradigen Reaktion schwankten. Knochenneubildung wurde häufig in beiden Gruppen beobachtet. In der Gruppe, welche die polierten Referenzimplantate erhielt, wurde zumeist Knochenneubildung um den ehemaligen Implantatsitz festgestellt (siehe Abbildung 38 A). In der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten wurden sowohl implantatnahe Knochenneubildungen als auch geringgradige diffuse Knochenneubildungen oder Zubildungen beobachtet, die nicht implantatnah waren (siehe Abbildung 38 B). Die histologische Reaktion auf die Infektion ist mit exemplarischen Aufnahmen in der Abbildung 38 dargestellt. (A) und (B) zeigen Toluidinblau gefärbte Übersichtsaufnahmen der Tibiae beider Gruppen in 100-facher Vergrößerung. In (C) und (D) ist die Reaktion des Knochenmarks in Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitten in 400-facher Vergrößerung dargestellt. Die Sternchen (*) in (A-D) markieren jeweils den ehemaligen Sitz des Implantates. (E) und (F) zeigen in 200-facher Vergrößerung und Hämatoxylin-Eosin gefärbten Schnitten die Reaktion des Cortex auf die Infektion.

5. Ergebnisse 109

Abbildung 37: Darstellung der histopathologischen Veränderungen in der Hauptstudie. (A) stellt die Auswertung des Gesamtscores der Gruppe mit Referenzimplantat und Laserstruktur graphisch dar. (B) stellt die Auswertung der Destruktion des Cortex und (C) die Auswertung des fibrotischen Umbaus des Cortex graphisch dar. Sternchen (*) zeigen signifikante Unterschiede mit p≤0,05.

110 5. Ergebnisse

Abbildung 38: Exemplarische Aufnahmen der histopathologischen Veränderungen in der Hauptstudie in Toluidinblau und Hämatoxylin-Eosin gefärbten Tibia-Querschnitten. Eine Toluidinblau gefärbte Übersichtsaufnahme der Gruppe mit Referenzimplantat ist in (A) und eine Übersichtsaufnahme der Gruppe mit laserstrukturiertem Implantat ist in (B) dargestellt. (D-F) zeigen Hämatoxylin-Eosin gefärbte Aufnahmen des Knochenmarks (C, D) und des Cortex (E, F) der Gruppe mit Referenzimplantat (C, E) und der Gruppe mit laserstrukturiertem Implantat (D, F). Implantatnahe Knochenneubildung (Pfeilspitzen) in der Gruppe mit Referenzimplantat ist in (A) und implantatferne Knochenneubildung (Pfeilspitze) in der laserstrukturierten Gruppe ist in (B) ersichtlich. Eine stärkere Fibrose (Fi) im Knochenmark (KM) ist in der Gruppe mit der Laserstruktur (B, D) im Vergleich zur Referenzstruktur (A, C) zu erkennen. Wenig bis keine cortikale Destruktion (eingekreist) zeigt die Gruppe mit dem Referenzimplantat in (E). Am unteren Rand ist bereits das unveränderte Knochenmark (KM) zu erkennen, während die Gruppe mit dem laserstrukturierten Implantat (F) deutlichere Destruktionen (eingekreist) im Cortex mit geringgradiger Osteoklasteninfiltration (Pfeile) zeigt. Die Sternchen (*) markieren den ehemaligen Sitz des Implantates.

5. Ergebnisse 111

5.3.10. Zusammenfassung der Ergebnisse der Hauptstudie

Die Ergebnisse der Hauptstudie sind im folgenden Abschnitt kurz zusammengefasst. Die angestrebte Injektionskonzentration von 103 KBE/10 µl wurde erreicht. Bei der täglichen Untersuchung konnte kein Unterschied im Allgemeinzustand zwischen den Gruppen festgestellt werden. Das relative tibiale Gewicht war in der Gruppe, die das laserstrukturierte Implantat erhielt nicht signifikant höher als in der Gruppe mit dem Referenzimplantat. Die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung ergaben einen positiven Befund für Staphylococcus aureus in den Knochenmarksausstrichen aller Tiere aus beiden Gruppen. Der Implantatabstrich war bei allen Tieren, die laserstrukturierte Implantate erhielten und bei 14 Tieren aus der Gruppe mit dem Referenzimplantat positiv für Staphylococcus aureus. Die Bestimmung der lebenden bakteriellen Biomasse ergab eine höhere Besiedlung in der Gruppe, die das laserstrukturierte Implantat erhielt im Vergleich zur Gruppe mit dem Referenz- implantat. Auf der Oberfläche der Gruppe mit der Laserstruktur wurde eine signifikant höhere Zellmenge bestimmt im Vergleich zur Gruppe, die das Referenzimplantat erhielt. Bei der radiologischen Auswertung wurden infektionsbedingte Knochen- veränderung ab dem Tag 14 beobachtet, die sich bis zum Tag 21 verstärkten. Die Knochenveränderungen waren am Tag 14 post OP signifikant und am Tag 21 post OP tendenziell stärker in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten im Vergleich zu der Gruppe, die das Referenzimplantat erhielt. Für die histologische Auswertung mussten drei Tiere aus der Gruppe mit der Laserstruktur ausgeschlossen werden, da der ehemalige Implantatsitz durch die Entnahme des Implantates zerstört war. Bei der histologischen Auswertung wurde ein signifikant höherer Gesamtscore, also stärkere Knochenveränderungen in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten im Vergleich zur Gruppe mit den Referenzimplantaten festgestellt. Die Veränderungen, welche einen signifikanten Unterschied zeigten, waren im Cortex zu finden. Hier wurde eine stärkere Destruktion und fibrotische Umsetzung in der Gruppe mit der Laserstruktur festgestellt im Vergleich zur Gruppe, die das referenzstrukturierte Implantat erhielt.

112 6. Diskussion

Diskussion

6.1. Etablierung eines Tiermodells zur Abbildung einer low-grade ähnlichen implantatassoziierten Infektion

Das erste Ziel dieser Arbeit war es, in der Pilotstudie eine low-grade ähnliche Implantatinfektion mit Staphylococcus aureus in der Ratte zu etablieren, um anhand dieses Modells neue Prophylaxe- und Therapieansätze für diese schwerwiegende Komplikation in orthopädischen Chirurgie der Human- und Veterinärmedizin evaluieren zu können. Die Implantatinfektion im Tiermodell sollte dabei vorrangig mittels bildgebender und histologischer Verfahren charakterisiert werden, eine Quantifizierung der Biofilmbildung auf der Implantatoberfläche ermöglichen und die Beurteilung der Morphologie der bakteriellen Besiedlung zulassen. Da Staphylococcus aureus einer der wichtigsten Erreger für implantatassoziierte Infektionen ist, wurde ein Staphylococcus aureus Stamm als Versuchskeim in der vorliegenden Studie eingesetzt (ARCIOLA et al. 2015, TURK et al. 2015, AGGARWAL et al. 2014, SHEEHY et al. 2010, HOU et al. 2012, LOVATI et al. 2017).

Die Etablierung der low-grade ähnlichen Infektion im Rattenmodell konnte in der Pilotstudie erreicht werden. Die zur Charakterisierung des Tiermodells verwendeten Parameter tibiales Gewicht, sowie die radiologische und histologische Beurteilung der infektionsbedingten Knochenveränderungen zeigten ähnliche Ergebnisse. Die Infektion mit der geringen Inokulationsdosis von 103 KBE/10 µl modelliert eine low- grade Infektion am besten. Die Tiere, die mit der Inokulationsdosis von 103 KBE/10 µl infiziert wurden, zeigten im Median ein geringeres Knochengewicht, sowie weniger starke radiologische und histologische Veränderungen. Aus diesem Grund wurde die Infektionskonzentration von 103 KBE/10 µl für die Infektion in der Hauptstudie verwendet. Tiere, die mit einer hohen Inokulationsdosis infiziert wurden, zeigten radiologisch und histologisch deutliche schwere infektionsbedingte Veränderungen der Knochenstruktur. Die Konzentrationsbereiche VB12 und I106, sowie I105 und I104 zeigten bei der Auswertung ähnlich starke Ausprägung der Knochenveränderungen, während die Gruppe I103 die geringsten infektionsbedingten Symptome in allen Parametern zeigte. Die Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung ergab tendenziell ein steigendes Volumen der bakteriellen Biomasse mit sinkender Inokulationsdosis. Die morphologische Beurteilung der Bakterien auf der Implantatoberfläche zeigte korrespondierend zu den CLSM Ergebnissen vermehrt Biofilmbildung auf der Implantatoberfläche mit sinkender Inokulationskonzentration. Die Bestimmung des Knochengewichtes, sowie die Beurteilung der radiologisch und histologisch feststellbaren infektionsbedingten Knochenveränderungen stellten sich als geeignete Beurteilungsparameter für die Stärke der Infektion heraus. Die

6. Diskussion 113

Bestimmung der CRP-Konzentration eignete sich auf Grund der nicht signifikanten Unterschiede und hohen Standardabweichungen zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren nicht für die Bestimmung der Infektionsstärke. Eine Implantatinfektion konnte verlässlich hervorgerufen werden, unabhängig ob als Infektionsmethode bakteriell vorbesiedelte Implantate oder die Injektion der Bakteriensuspension verwendet wurde.

6.1.1. Tiermodell und verwendete Infektionskonzentrationen

In der vorliegenden Studie wurde ein Tiermodell gewählt, in dem das Implantat ohne Gelenkbeteiligung in die Tibia eingesetzt wird. Ein Modell mit Gelenkbezug würde das klinische Bild von infizierten Endoprothesen genauer wiederspiegeln, allerdings verkompliziert eine Gelenkbeteiligung das Infektionsgeschehen und stellt eine größere Belastung für die Versuchstiere dar, was sich auch in der vorliegenden Studie bei einem Tier der Gruppe I106 deutlich zeigte (BUFALARI et al. 2016, SØE et al. 2013). Dieses Tier entwickelte im Versuchszeitraum eine Kniegelenksinfektion mit dem Versuchskeim, die nach der Euthanasie mikrobiologisch nachgewiesen werden konnte. Vor der Verabreichung der Schmerzmittel zeigte das Tier eine hochgradige Lahmheit. Die Lahmheit reduzierte sich nach Schmerzmittelgabe, allerdings musste die analgetische Behandlung über den gesamten Versuchs- zeitraum fortgesetzt werden. Eine Gelenkbeteiligung ermöglicht zwar die gleichzeitige Untersuchung der Arthritis und auf Grund der Lokalisation die Untersuchung von infektionsbedingten Knochenveränderungen im epiphysären Bereich, aber die Gelenkbeteiligung ist bei der Entstehung der infektionsbedingten pathologischen Knochenveränderungen nicht der entscheidende Faktor. Da der Fokus in dieser Studie auf der bakteriellen Besiedlung der Implantatoberfläche lag, ist auch die Beteiligung des epiphysären Bereiches nicht unbedingt notwendig. Ein weiterer Anspruch an das Modell war die Anpassung an die Auswertung mittels CLSM. Aus diesem Grund wurden spezielle quaderförmige Implantate verwendet, die vor der Benutzung mit einer 45 µm Scheibe poliert wurden, um den Bakterien eine gute Struktur für die Anlagerung zu bieten (DOLL et al. 2016a, 2016b). Des Weiteren eignet sich die Geometrie des Implantates gut für die Modifizierung mittels laserbasierter Verfahren. Der Einsatz von Schrauben oder komplizierteren, zusammengesetzten Implantaten würde diese Auswertemethodik erschweren. LUCKE et al. (2003a) und DIEFENBECK et al. (2016) verwendeten beide ein Tiermodell in der Ratte, bei dem unter Schonung des Kniegelenks über ein Bohrloch in der Metaphyse die bakterielle Suspension von Staphylococcus aureus ATCC49230 und ein Kirschner Draht als Implantat eingeführt wurden. Die Evaluation der Ergebnisse erfolgte nach vier Wochen Standzeit der Tiere. ODEKERKEN et al

114 6. Diskussion

2013 verwendete ein Kaninchenmodell mit Gelenkbeteiligung, in dem er ein rundes Implantat in die Tibia über das Kniegelenk einsetzte und anschließend mit Staphylococcus aureus ATCC49230 infizierte. Die Standzeit war sechs Wochen. Er berichtet nicht von Komplikationen, die durch die Gelenkbeteiligung entstanden sind, aber auf Grund der Ergebnisse kann von einer erhöhten Belastung der Tiere in diesem Versuch ausgegangen werden. Um innovative Implantatoberflächen in einem Tiermodell zu untersuchen, ist daher auch im Sinne des drei R-Prinzips eine einfachere, tierschonendere Implantationsart zu bevorzugen (RUSSEL u. BURCH 1959, LUCKE et al. 2003a, DIEFENBECK et al. 2016).

Der Infektionsweg und die Infektionsdosis mussten bestimmt werden, die zum Erzeugen der low-grade Infektion geeignet sind. Es wurden zwei Infektionswege (Vorbesiedlung und Injektion einer Bakteriensuspension) untersucht. Die vorbesiedelten Implantate sollten beginnende Biofilmbildung auf der Implantat- oberfläche zeigen, um den Bakterien einen Vorteil gegenüber dem Immunsystem zu bieten. Unterschiedliche Inokulationskonzentrationen wurden durch die Injektion einer Bakteriensuspension getestet (103, 104, 105, 106 KBE/10 µl). Die Methode der Vorbesiedlung zeigte radiologisch und histologisch allerdings deutlich schwerere Knochenveränderungen und die bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche war in der Gruppe VB12 geringer als die der Infektionsgruppen, die eine Injektion mit einer Bakteriensuspension mit einer geringeren Konzentration erhielten. Daher stellte sich die Methode der Vorbesiedlung für die Modellierung einer low-grade ähnlichen implantatassoziierten Infektion als ungeeignet heraus. Zwei Studien stellten als minimale Infektionskonzentration ähnliche Konzentrationen (102 KBE/10 µl bzw. 6x102 KBE/5 µl) wie in dem in dieser Studie beschriebenen Modell fest. LUCKE et al. (2003a) verwendete ein Rattenmodell ohne Gelenkbeteiligung. In diesem wurde ein Kirschner Draht als Implantat in die Tibia eingesetzt und mit Staphylococcus aureus ATCC49230 in den Konzentrationen 106, 103 und 102 KBE/10 µl sowie 10 µl PBS als Kontrolle infiziert. Er ermittelte als minimale Infektionskonzentration 102 KBE/10 µl. FUKUSHIMA et al. (2005) erzeugte eine akute tibiale Osteomyelitis ohne Implantat in der Ratte durch die Infektion mit dem Staphylococcus aureus Stamm BB in den Konzentrationen 101 bis 105 KBE/5µl. Der Versuchszeitraum war eine Woche. Die minimale Infektionskonzentration lag in dieser Studie bei 6x102 KBE/5 µl. In der Studie von LUCKE et al. (2003a) entsprechen auch die Ergebnisse der radiologischen und histologischen Auswertung bei der geringen Infektionskonzentration denen einer low-grade ähnlichen Infektion mit geringeren Infektionssymptomen. Diese Befunde sind mit den Ergebnissen der Gruppe I103 vergleichbar. Es ist wichtig, dass der Erreger auch im eingesetzten Modellorganismus pathogen ist. Für den verwendeten Staphylococcus aureus Stamm 36/07 konnte die Biofilmbildungskapazität und Virulenz in vivo bereits in einem neurochirurgischen

6. Diskussion 115

Infektionsmodell in Sprague Dawley Ratten nachgewiesen werden (GLAGE et al. 2017). In dieser Studie wurde eine Schraube in die Schädelkalotte der Ratte implantiert, infiziert und nach zwei, zehn sowie 21 Tagen auf die bakterielle Adhäsion an der Schraube und die Infektionsreaktion des Knochens ausgewertet. Allerdings wurde in diesem Modell eine Infektionskonzentration von 107 KBE/Tier verwendet und damit liegt die eingesetzte Infektionskonzentration über der in dieser Studie eingesetzten bakteriellen Infektionskonzentrationen. Die Infektionskonzentration von 107 KBE/Tier entspricht einer Konzentration, die eine hochgradige, akute Infektion simuliert (LOVATI et al. 2017). Unterschiede zwischen diesem Modell und dem in dieser Studie vorliegenden Modell ist die Lokalisation des Implantates und das eingesetzte Implantat selbst. In der vorliegenden Studie wurde das Implantat in das Knochenmark der Tibia implantiert, während in der Studie von GLAGE et al. (2017) die Implantation in die Schädelkalotte erfolgte. Auf Grund der unterschiedlichen anatomischen Lokalisationen und physiologischen Begebenheiten (Knochenstruktur, Vorhandensein von Knochenmark bzw. Meningen und Gehirn) kann eine unterschiedliche Reaktion auf die Infektion vermutet werden. Das Implantat selbst war in der vorliegenden Studie ein Ti90/Al6/V4-Stab, der vor dem Einsatz mit einer 45 µm Scheibe poliert wurde. In der Studie von GLAGE et al. (2017) wurde eine Schraube aus Titan eingesetzt, die nicht näher beschrieben wurde. Daher fehlen Informationen zur genauen Materialzusammensetzung und Struktur der Schraube, was eine direkte Vergleichbarkeit erschwert. Da das Anlagerungsverhalten stammspezifisch variiert und abhängig von dem vorliegenden Material und der Oberflächenbeschaffenheit ist, sollte die Infektionskonzentration in jedem Modell vorher überprüft werden, um verlässlich die gewünschte Infektion zu erzeugen (VAN SORGE et al. 2013).

Um den Infektionskeim nachzuweisen und dadurch das Vorliegen einer Infektion zu bestätigen, wurden Abstriche von der Implantationsstelle vor Eröffnung des Knochens, vom Knochenmark und vom Implantat genommen. Die mikrobiologischen Ergebnisse der Pilotstudie zeigten einen positiven Befund für den Infektionskeim auf allen Blutagarplatten des Implantat- und Knochenmarkabstriches. Knochen- veränderungen waren bei allen infizierten Tieren radiologisch sichtbar. Beide Befunde unterstützen, dass alle Tiere der infizierten Gruppen auch infiziert waren. Unabhängig von dem Infektionsweg und der Dosis kann eine Implantatinfektion in diesem Modell ausgelöst werden. Die Vorbesiedlung hat sich als alternative Methode zur Injektion einer Bakteriensuspension für das Auslösen einer Infektion gezeigt. Die Ergebnisse der Pilotstudie unterstützen die Ergebnisse der Studie von MONZÒN et al. (2002), bei der 100 % der Ratten durch eine Vorbesiedelung des Implantates infiziert wurden. In dieser Studie wurden verschiedene Infektionsmethoden getestet und nach neun Wochen Standzeit evaluiert. Ein Implantat aus rostfreiem Stahl, welches aus einer Kanüle hergestellt wurde, wurde in die Tibia der Ratte implantiert

116 6. Diskussion

und mit dem Staphylococcus aureus Stamm 9213 SP infiziert. Als Infektions- methoden wurden eine bakterielle Suspension in den Konzentrationen 105 und 106 KBE/Tier verwendet, vorbesiedelte Implantate (12 Stunden in einer Bakterien- suspension mit einer Konzentration von 106 KBE/ml) und eine Kombination dieser vorbesiedelten Implantate mit der Injektion einer Bakteriensuspension in der Konzentration von 104 KBE/Tier. Dabei erzielte das vorbesiedelte Implantat die höchste Infektionsrate von 100 %, wohingegen die Kombination aus Injektion und Vorbesiedlung eine Infektionsrate von 62 % erreichte und die alleinige Injektion eine Infektionsrate von 12 % (105 KBE/Tier) bzw. 75 % (106 KBE/Tier) nach neun Wochen Standzeit post OP. Im Vergleich zur vorliegenden Studie konnte auch in der Studie von MONZÒN et al. (2002) eine 100 %-ige Infektionsrate bei Tieren festgestellt werden, die mit vorbesiedelten Implantaten infiziert wurden. Im Gegensatz zu unserer Studie wurde allerding eine geringere Infektionsrate bei den Infektionskonzentrationen von 105 und 106 KBE/Tier festgestellt. Diese Abweichung kann gegebenenfalls durch die unterschiedlichen Infektionskeime erklärt werden. Der Infektionskeim, welcher in der vorliegenden Studie eingesetzt wurde, scheint auf Grund der höheren Infektionsraten (106-103 KBE/Tier: 100 % Infektionsinzidenz) eine stärkere infektionsauslösende Wirkung zu haben. Die mikrobiologischen Befunde der vorliegenden Studie weichen deutlich von METSEMAKERS et al. 2016 ab, der den Einfluss von verschiedenen Rauigkeiten von Frakturversorgungsplatten aus nicht rostenden Stahl (Ra=0,18 µm und 3,86 µm) und Titan (Ra=0,44 µm und 0,2 µm) in einem Kaninchenmodell mit osteotomiertem Humerus untersucht. Als Versuchskeim diente Staphylococcus aureus Stamm JAR060131, welcher in den Konzentrationen von 2x103, 2x104 und 2x105 KBE/Tier injiziert wurde. Im Gegensatz zu den mikrobiologischen Ergebnissen der vorliegenden Studie stellte er bei einer Infektionskonzentration von 2x103 KBE/Tier eine deutlich geringere Infektionsinzidenz von circa 35 % (Ra=0,2 µm) und 50 % (Ra=0,18 µm) fest. Die polierten Flächen (Ra=0,18 µm und 0,2 µm) zeigten eine höhere Infektionsinzidenz bei der Infektionskonzentration von 2x103 KBE/Tier als die rauen Flächen (Ra=0,44 µm: 35% Infektionsinzidenz, Ra=3,86 µm: 20 % Infektions- inzidenz). Die festgestellte Infektionslast in KBE auf dem Implantat nach Explantation, die über Ausstriche der abgelösten Bakterien nach Ultraschall- behandlung bestimmt wurden, variierten nur geringgradig zwischen den Gruppen bei Vorliegen einer Infektion. In der vorliegenden Studie konnte bei einem Mittelrauwert des Implantates von 0,13±0,03 µm mit der Konzentration von 103 KBE/Tier verlässlich eine Infektion ausgelöst werden.

Neben der verlässlichen lokalen Infektion ist es wichtig, dass die Tiere keine Sepsis entwickeln. Um zu ermitteln, ob zum Zeitpunkt der Euthanasie eine Sepsis vorlag, wurden Ausstriche vom Blut und vom Urin der Tiere angefertigt. Im Blut konnte kein bakterielles Wachstum nachgewiesen werden. Somit kann davon ausgegangen

6. Diskussion 117

werden, dass keines der Tiere eine Sepsis zum Zeitpunkt der Euthanasie hatte (Vergleich mit der Tabelle 18 im Punkt 5.2.6.). Kleine, weiße, nicht hämolysierende Kolonien wuchsen auf vier Implantatabstrichen und einem Urinabstrich der Kontrollgruppe. Auch aus einer Schwellung im Unterhautgewebe, die keinen Kontakt zur Implantationsstelle hatte, wurde dieser Keim isoliert. Hier handelt es sich auf Grund der Koloniemorphologie vermutlich um eine Kontamination mit Stpahylocooccus epidermidis (OCHSNER et al. 2014). Diese Keime sind Kommensalen auf der Haut der Ratte (SUCKOW et al. 2006). Da der Abstrich von der Implantationsstelle vor Eröffnung der Tibia erfolgte und in der Kontrollgruppe alle anderen Abstriche alle negativ waren, können die Tiere der Kontrollgruppe als nicht infiziert angesehen werden. Auf drei Urinabstrichen der Infektionsgruppen sind ebenfalls kleine, weiße, nicht hämolysierende Kolonien gewachsen. Da alle Blutausstriche negativ waren und die Tiere ein ungestörtes Allgemeinbefinden gezeigt haben, kann hier ebenfalls von einer Kontamination ausgegangen werden.

6.1.2. Beurteilung infektionsbedingter Veränderungen

Um die Ausprägung der lokalen Infektion der Tibia zu beurteilen, wurden verschiedene Methoden verwendet. Neben der täglichen Kontrolle des Allgemeinbefindens wurde das Knochengewicht bestimmt und die radiologische Untersuchung sowie histologische Beurteilung von Knochen-Querschnitten dienten der quantitativen und semiquantitativen Evaluation der infektionsbedingten Veränderungen des Knochens. Alle drei Methoden zeigten ähnliche Ergebnisse und scheinen damit gut geeignet zu sein, die Infektionsausprägung zu beurteilen. Die Bestimmung der CRP-Konzentration im Blut lieferte im Gegensatz zu den anderen Parametern weniger verlässliche Ergebnisse für die Beurteilung der Stärke der Infektion.

Knochengewicht

Die Knochengewichte am Tag 21 post OP zeigten tendenziell eine Abnahme mit sinkender Infektionskonzentration. Der Gewichtsunterschied des relativen Knochen- gewichtes war nur signifikant zwischen der Gruppe VB12 und der Kontrollgruppe, sowie zwischen der Gruppe VB12 im Vergleich zu den Gruppen I103 und I104. Das Gewicht der Gruppe I103 näherte sich dem in der Kontrolle deutlich an. Diese Gewichtszunahme in den infizierten Gruppen kann durch den Knochenumbau auf Grund der Infektion und Infiltration mit PMN erklärt werden (SADONI 2007). Um den

118 6. Diskussion

Einfluss des Körpergewichtes auf das Ergebnis nicht zu werten, wurden prozentuale Werte zum Endgewicht ermittelt. Die in dieser Studie ermittelten Knochengewichte passen zu den Ergebnissen von LITTLEWOOD-EVANS et al. (1997) und LUCKE et al. (2003a), die ebenfalls ein hohes Knochengewicht bei einer hohen Infektionsdosis bzw. ein steigendes Knochengewicht bei ansteigender Infektionsdosis beschrieben haben. Allerdings sollten die ermittelten Knochengewichte von LITTLEWOOD- EVANS et al. (1997) und LUCKE et al. (2003a) im Vergleich zu den Knochengewichten aus der vorliegenden Studie etwas geringer sein, da in der vorliegenden Studie im Gegensatz zu den beiden anderen Studien die Tibia mit der Fibula zusammen gewogen werden musste. Die Fibula war wichtig für die Stabilität beim µCT-Scan und diente als Orientierung bei der Einbettung. LITTLEWOOD- EVANS et al. (1997) untersuchte die Expression des Tumor-Nekrose-Faktor-alpha in einem Osteomyelitismodell in der Tibia der Ratte. Er setzte als sklerotisierendes Agens Natriummorrhuat ein und infiziert mit dem Staphylocooccus aureus Stamm 1098 in einer Konzentration von 9x1010 KBE/Tier. Das tibiale Gewicht war 0,45 % nach 14 Tagen, 0,5 %, nach 39 Tagen, 0,4 % nach 49 Tagen und 0,5 % nach 63 Tagen post OP. Das Fehlen der Fibula beim Wiegen der Knochen von LITTLEWOOD-EVANS et al. (1997) muss zusätzlich in Betracht gezogen werden und damit sind die ermittelten tibialen Gewichte höher als in den Gruppen VB12 (0,514±0,080 %) und I106 (0,455±0,115 %) aus der vorliegenden Studie, was auf die die höhere initiale Inokulationsdosis zurückgeführt werden kann. LUCKE et al. (2003a) ermittelte nach 4 Wochen ein prozentuales Gewicht von 0,25 % in der Kontrollgruppe, 0,34 % in der Gruppe, die 106 KBE/Tier erhielt, 0,33 % in der Gruppe, die 103 KBE/Tier erhielt und 0,3 % in der Gruppe, die 102 KBE/Tier als initiale Inokulationsdosis erhielt. Im Vergleich dazu waren die ermittelten relativen tibialen Gewichte in der vorliegenden Studie in der Gruppe I106 0,455±0,115 % und in der Gruppe I103 0,320±0,038 %. Bei LUCKE et al. (2003a) und in der vorliegenden Studie konnte ein deutlicher Anstieg des relativen Knochengewichtes im Vergleich zur Kontrolle festgestellt werden. In den Gruppen, die eine Injektion mit 103 KBE/Tier erhielten, ist das relative tibiale Gewicht in der vorliegenden Studie (Fibula mitgewogen) etwas geringer als in der Studie von LUCKE et al. (2003a), welche ohne Fibula gewogen wurde. Dieses Ergebnis könnte auf geringere infektionsbedingte Umbauprozesse im Knochen in der vorliegenden Studie schließen, die eine geringere Gewichtszunahme nach einer Infektion zur Folge haben. Die Gründe dafür könnten die eingesetzten Infektionsstämme sein, die eine unterschiedlich starke Reaktion des Knochens auf eine geringe Infektionsdosis hervorrufen oder die etwas unterschiedlichen postoperativen Untersuchungs- zeitpunkte, welcher drei Wochen in der vorliegenden Studie und vier Woche bei LUCKE et al. (2003a) betrug.

6. Diskussion 119

Radiologische und histologische Beurteilung

Im Vergleich der Evaluationsmethoden zeigten die Ergebnisse der radiologischen und histologischen Beurteilung der Knochenveränderung ähnliche Ergebnisse in Bezug auf die Schwere der Knochenveränderungen. Beide Methoden zeigten eine geringe Reaktion der Kontrollgruppe auf das Implantat im Vergleich zu den infizierten Gruppen. Radiologische Veränderungen konnten vor allem im Bereich des Bohrloches gefunden werden. Diese Reaktionen können als physiologische Reaktion des Knochens auf den Implantationsprozess gewertet werden. Knochenwachs stellt einen Fremdkörper dar und wird in einigen Studien auch verwendet, um die Infektion des Knochens zu verstärken (NELSON et al. 1990, PATTERSON et al. 1993, WELLISZ et al. 2008). Auch ohne infektiöses Pathogen reagiert der Knochen auf den Fremdkörper, wodurch Veränderungen im Bohrlochbereich der Kontrolle zu erklären sind. Der Gesamtscore der radiologischen Auswertung war nicht signifikant höher in der Gruppe VB12 im Vergleich zur Gruppe I106. Der histologische Gesamtscore war dagegen in beiden Gruppen ähnlich. Ein Grund für die unterschiedlichen Gesamtscores in der radiologischen und histologischen Auswertung war vermutlich die Einbeziehung des Bohrloches bei der Bewertung der radiologischen Veränderungen, welches in der histologischen Auswertung durch eine etwas distalere Lokalisation der Schnittebenen nicht berücksichtigt wurde. Die Gruppe VB12 zeigte im Vergleich zur Gruppe I106 in diesem Bereich stärkere Veränderungen. Stärkere Veränderungen in Bereich des Bohrloches bei den Infektionsgruppen lassen sich durch das Vorhandensein des Knochenwachses als Fremdkörper erklären (NELSON et al. 1990, PATTERSON et al. 1993, WELLISZ et al. 2008). Eine Erklärung für die abweichenden Ergebnisse zwischen den Gruppen VB12 und I106 können die verschiedenen Infektionsmethoden sein. Die Bakteriensuspension wird weit unten im Knochen appliziert, während das vorbesiedelte Implantat in den Knochen geschoben wird. Bei diesem Vorgang ist es möglich, dass sich einige Bakterien lösen und dadurch wäre der Bereich des Bohrloches in der Gruppe VB12 stärker bakteriell kontaminiert als der der Gruppe I106. FUKUSHIMA et al. (2005) induzierte eine akute Osteomyelitis in der Tibia der Ratte ohne Implantat mit dem Staphylococcus aureus Stamm BB in den Konzentrationen 101 bis 105 KBE/5 µl. Der Versuchszeitraum war eine Woche. Trotz der kurzen Standzeit wurde auch hier ein steigender Gesamtscore mit steigender Infektions- dosis bei der radiologischen Bewertung beobachtet. Allerdings zeigten die histologischen Gesamtscores ähnliche Werte für die Konzentrationen 103, 104 und 105. Das von FUKUSHIMA et al. (2005) verwendete Score Schema für die radiologische Beurteilung unterscheidet nicht zwischen verschiedenen Lokalisationen und vergibt Score Punkte von 0 bis 4, schließt aber ähnliche Beurteilungsparameter wie in der vorliegenden Studie in die Bewertung ein. Die Beurteilungskriterien

120 6. Diskussion

schließen die Stärke der periostalen Reaktion, Deformation, Weitung des Knochenschaftes, Knochenneubildung und Deformation des Weichgewebes ein. Erklärungen für die unterschiedlichen Ergebnisse von FUKUSHIMA et al. und der vorliegenden Studie können der kürzere Untersuchungszeitraum von einer Woche im Vergleich zu drei Wochen in der vorliegenden Studie sein, unterschiedliche Ausprägung der histopathologischen Veränderungen durch den Einsatz eines anderen Stammes, das Fehlen eines Implantates oder Unterschiede in den Score Schemata für die Bewertung der infektionsbedingten Veränderungen.

In Bezug auf die histologische Auswertung zeigte GAIDA et al. (2012) eine Korrelation der Infiltration von PMN und Osteoklasten im Cortex bei implantatassoziierten Infektionen. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Studie die PMN und Osteoklasten im Cortex zusammen gewertet. Die starken Knochenveränderungen in den Gruppen mit der höheren Infektionsdosis (VB12 und I106) können durch eine verstärkte Immunantwort bedingt sein, die ein stärkeres proinflammatorisches Milieu bedingt (DAPUNT et al. 2016a, TROUILLET- ASSANT et al. 2015). Die Infektion mit Staphylococcus aureus und das proinflammatorische Milieu können in einer Stimulation der Osteoklasten resultieren (DAPUNT et al. 2016a, TROUILLET-ASSANT et al. 2015). Ein vermehrter Knochenabbau ist die Folge. Der unreife Biofilm und die dadurch bedingte höhere Aktivierung des Immunsystems können ebenfalls zum Knochenabbau beitragen (GÜNTHER at al 2009).

C-reaktives Protein als Entzündungsparameter

Die Messung der CRP-Konzentration im Serum sollte als möglicher Biomarker zur Beurteilung der Infektionslast dienen. Tendenziell wurde zwar ein Absinken der Serum CRP-Konzentration in der Kontrollgruppe und ein Anstieg in den infizierten Gruppen verzeichnet, allerdings ist dieser Anstieg nur signifikant in der Gruppe I106 bei dem Vergleich von Tag 0 und Tag 21. Insbesondere in der Kontrollgruppe wurden außerdem am Tag 0 starke tierindividuelle Schwankungen festgestellt. Damit konnte die Serum CRP-Konzentration in dieser Studie keinen zuverlässigen Hinweis auf das Vorliegen einer Implantatinfektion liefern. HAENLE et al. (2013) zeigte ein ähnliches Ergebnis bei der Bestimmung der CRP-Konzentration in Rattenseren. Er implantierte ein konisches Implantat in die Tibiametaphyse und infizierte durch die Applikation einer Bakteriensuspension mit dem Staphylococcus aureus Stamm ATCC 25923 in den Konzentrationen 103, 104, 105 und 106 KBE/Tier. Die CRP- Konzentrationen im Serum wurden sechs Wochen post OP bestimmt. Diese zeigten ebenfalls keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe und

6. Diskussion 121

zwischen den Infektionsgruppen. Aus den oben genannten Gründen wurde daher auf die Bestimmung der Serum CRP-Konzentration in der Hauptstudie verzichtet.

Allgemeinbefinden

Um das tägliche Allgemeinbefinden zu kontrollieren, wurden verschiedene Parameter erhoben und nach dem Schweregrad mit einem Score von 0 bis 3 bewertet. Dabei entsprach ein höherer Score einem stärkeren Schweregrad. Parameter, die Abweichungen zeigten, waren das Gewicht, die Körperoberflächentemperatur, die Schwere der Lahmheit und die Schwellung der Implantationsstelle. Die rektal gemessene physiologische Körperinnentemperatur liegt bei der Ratte bei 37,5-39 °C bzw. 36-40 °C in Abhängigkeit der Quelle (WEISS et al. 2014, WOLFENSOHN u. LLOYD 2003). Die Körperoberflächentemperatur liegt bei der Außentemperatur von 22±2 °C in der Regel 1-2 °C unter der Körperinnentemperatur (VON ENGELHARDT u. BREVES 2005). Isolierende Faktoren, wie das Fell, müssen beachtet werden, da sie die Körperoberflächentemperatur zusätzlich verändern können (VON ENGELHARDT u. BREVES 2005). An Hand dieser Daten kann darauf geschlossen werden, dass die Körperinnentemperatur trotz deutlicher Schwankungen bei der Messung der Körperaußentemperatur im physiologischen Bereich lag. Die Messung der rektalen Körperinnentemperatur ist für die Tiere mit großem Stress verbunden und variiert auch geringgradig in ihrem Messwert im Vergleich zu implantierbaren Thermosensoren (DALLMANN et al. 2006, MEYER et al. 2017). Daher kann bei der Messung der rektalen Körperinnentemperatur auch davon ausgegangen werden, dass Schwankungen auftreten. Aus diesem Grund ist die Messung der Körperoberflächentemperatur unter dem Gesichtspunkt des Tierschutzes ein probates Mittel, auch wenn sie nicht so aussagekräftig ist, wie die Messung der Körperinnentemperatur. Fast alle Tiere zeigten am Tag zwei post OP ein normales Verhalten und ein ungestörtes Allgemeinbefinden, was ein Hinweis für eine moderate Belastung durch die OP und die Infektion ist. Nur ein Tier, welches am Tag 3 post OP verstarb, zeigte ein deutlich vermindertes Allgemeinbefinden und ein deutlich reduziertes Interesse an der Futteraufnahme am Tag 2 post OP. Die Vermutung liegt nahe, dass sich dieses Tier nicht adäquat von der Narkose erholte und deshalb verstarb. Das initiale Gewicht zu Versuchsbeginn erreichte die Gruppe VB12 nicht und die Gruppe I106 erst am Tag 21 post OP. Im Vergleich zu den anderen Gruppen schienen beide Gruppen also eine höhere Belastung gehabt zu haben, da die Futteraufnahme und damit die Gewichtsentwicklung ein maßgeblicher Faktor für das Wohlbefinden ist (BRENNAN et al. 2009). FUKUSHIMA et al. (2005) zeigte ein ähnliches Ergebnis. Die Gruppe, die mit 6x105 KBE/5 µl infiziert wurde und die

122 6. Diskussion

höchste Infektionskonzentration erhalten hatte, zeigte den größten Gewichtsverlust im Vergleich zu den anderen Gruppen. Die anderen Versuchsgruppen aus der vorliegenden Studie (K, I105, I104 und I103) erreichten das Initialgewicht früher, spätestens am Tag 14 post OP. Diese Gewichtsentwicklung ist vergleichbar mit den Gruppen im Modell von LUCKE et al. (2003a) die das Ausgangsgewicht am 14. Tag erreichten. In diesem Rattenmodell ohne Gelenkbeteiligung wurde ein Kirschner Draht als Implantat in die Tibia eingesetzt und mit Staphylococcus aureus ATCC49230 in den Konzentrationen 106, 103 und 102 KBE/10 µl sowie 10 µl PBS als Kontrolle infiziert. Die Versuchstiere wurden am Tag der OP, am Tag drei post OP und anschließend wöchentlich gewogen bis zum Versuchsende vier Wochen post OP. Bei der täglichen Kontrolle konnte in der vorliegenden Studie eine Verbesserung der Lahmheit mit sinkender Infektionskonzentration festgestellt werden. Im Gegensatz zu den Gruppen mit den hohen Inokulationsdosen (VB12 und I106), in der mehrere Tiere lahmheitsbedingt behandelt werden mussten, musste kein Tier der Gruppe I103 lahmheitsbedingt behandelt werden. Des Weiteren wurde eine Verbesserung der Schwellung an der Implantationsstelle mit sinkender Infektionsdosis festgestellt. Somit wird auch bei diesen Parametern deutlich, dass die Gruppen, welche mit den hohen Infektionsdosen infiziert wurden, etwas stärker vom Versuch belastet waren, als die Gruppen, die mit einer geringeren Inokulationsdosis infiziert wurden.

6.2. Implementierung einer Quantifizierungsmethode für die bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche in vivo

Das zweite Ziel der Arbeit war die Einführung einer CLSM-basierten Methodik für die Quantifizierung und morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung und Biofilmbildung auf der Implantatoberfläche. Im Zuge der Pilotstudie konnte eine CLSM-basierte Quantifizierungsmethode für die Bestimmung der lebenden bakteriellen Biomasse auf der Implantatoberfläche etabliert werden. Kombiniert mit der morphologischen Bewertung eignet sich die neue Methode trotz ihrer Limitationen gut zur Bewertung der bakteriellen Besiedlung auf Implantatoberflächen. Um innovative bakterienabweisende Implantatoberflächen zu testen und dabei ein Gesamtbild der implantatassoziierte Infektion zu erzeugen, sollte die CLSM-basierte Beurteilung der Implantatoberfläche in jedem Fall durch die beschriebenen radiologischen und histologischen Untersuchungen des Umgebungsgewebes ergänzt werden.

6. Diskussion 123

6.2.1. Bestimmung der vitalen bakteriellen Biomasse mit der Software Imaris® x64

Zur Abbildung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche wurden von zwei Implantatseiten mindestens fünf Aufnahmen angefertigt. Der Anteil des Gesamtlebend-, Gesamttot- und des Gesamtcolokalisationsvolumens wurden über die Software Imaris x64 bestimmt, wie es bereits für die Auswertung von in vitro Versuchen beschrieben wurde (DOLL et al. 2016a, 2016b). Allerdings wurden in den in vitro Versuchen keine eukaryotischen Zellen verwendet, die aber auf der Implantatoberfläche der explantierten Implantate in der vorliegenden Studie vorhanden waren. Um die eukaryotischen Zellen und die colokalisierten Bakterien auszuschließen, muss die Biomasse der eukaryotischen Zellen und colokalisierten Bakterien bestimmt werden und von der Gesamtlebendmasse abgezogen werden. Für den Ausschluss der lebenden eukaryotischen Zellmasse und des bakteriellen Colokalisationsanteiles wurden zwei Imaris® x64-basierte Methoden vergleichend in der Pilotstudie untersucht. Die Volumen-Methode modelliert das eigentliche eukaryotische Zellvolumen so realistisch wie möglich, während die Spot-Methode die Zellkörper über eine kugelige Form nachbildet. Mit beiden Methoden wurde eine tendenzielle Zunahme der lebenden bakteriellen Biomasse auf der Implantatoberfläche mit abnehmender initialer Infektionsdosis festgestellt. Die Menge des quantifizierten Volumens unterschied sich in vier der sechs untersuchten Gruppen (VB12, I106, I105, I104) zwischen beiden Methoden nicht. In zwei Gruppen (Kontrolle, I103) wurde ein signifikant höheres Volumen mit der Spot-Methode im Vergleich zur Volumen-Methode festgestellt. Damit scheint der Anteil an in die Berechnungen mit eingebezogener Hintergrundbesiedlung in der Volumen-Methode deutlich geringer zu sein als in der Spot-Methode, was für die Verwendung der Volumen-Methode in weiteren Studien spricht.

Zwei Methoden wurden für den Ausschluss der lebenden, eukaryotischen, zellulären Biomasse von der lebenden Gesamtbiomasse verwendet: die Volumen- und die Spot-Methode. Das Ziel war eine möglichst exakte Erfassung des (eukaryotischen) zellulären Volumens. Beide Methoden nutzen die Fluoreszenzintensität als Auswertungskriterium, weil diese in den eukaryotischen Zellen höher ist als in Bakterien, da Zellen einen höheren Gehalt an Nukleinsäuren besitzen und daher mehr Bindungsstellen für den Farbstoff vorhanden sind. Deshalb wurde das Kriterium „Höhe der mittleren Fluoreszenz-Intensität“ mit in die Auswertung einbezogen. Der Unterschied zwischen beiden Methoden liegt in den Größenannahmen für den Ein- bzw. Ausschluss der eukaryotischen Zellen und colokalisierten Bakterien, sowie in der Art der Nachbildung. Die erste getestete Methode war die Rekonstruktion des Volumens mit der Volumen- Methode, die die Struktur der gefärbten Zellen bzw. Zellanteile möglichst genau

124 6. Diskussion

nachbildet. Die Nachbildung des Volumens erfolgte wie bei der Berechnung des Lebend-, Tot- und Colokalisationsanteils über eine Oberfläche, welche auf die zu berechnenden Strukturen gelegt wird und aus der das Volumen durch das Programm errechnet wurde. Als Grundannahmen wurden die Fluoreszenzintensität und das kleinste bestimmbare Zellvolumen von 10 µm3 verwendet. Der Vorteil dieser Methode ist die exaktere Bestimmung und Wiedergabe der zellulären Formen, da diese Methode alle Zellformen nachbildet, inklusive der Modellierung DNA-haltiger Zellausläufer. Im Gegensatz zur Volumen-Methode wurde bei der zweiten Methode, der Spot-Methode, eine kugelige Form zur Modellierung der Zellstrukturen verwendet, deren Mindestgrundfläche den durchschnittlichen Zellmaßen von 5x6 µm2 entsprach. Eine Wachstumsfunktion („Region growing“) wurde im Programm implementiert, sodass auch das Volumen größerer Zellkörper bestimmt werden konnte. Der Nachteil dieser Methode ist, dass sie nicht für die Modellierung von Zellfortsätzen oder generelle Abweichungen von der runden Form geeignet ist, da nicht von der Kugelform abgewichen werden kann. Auf Grund der besseren Modellierung der eukaryotischen Zellstrukturen durch den Einschluss von Fortsätzen und Ausläufern, wurde die Volumen-Methode als Auswertungsmethode der Spot- Methode vorgezogen und ist daher in der Hauptstudie angewendet worden. Aufnahmen, welche eine sehr hohe Besiedlung über 1,5x105 µm3/A hatten, mussten von der Auswertung ausgeschlossen werden. Der Grund war eine Signalüberlappung von eukaryotischen zellulären Strukturen und bakteriellen Strukturen. Eine Limitation der neuen Quantifizierungsmethode ist daher die Signalüberlappung von eukaryotischen Zellstrukturen und Bakterien, die bei einer sehr hohen Besiedlung auftritt. Der Abriss von Strukturen bei der Entnahme des Implantates aus dem Knochen ist ein methodisches Problem, welches allerdings sowohl bei der Bestimmung der KBE als auch bei der konfokalmikroskopischen Darstellung der Strukturen auftritt. In der Kontrollgruppe wurde eine gewisse Hintergrundbesiedlung ermittelt. Allerdings ist eine bakterielle Besiedlung auf Grund negativer mikrobiologischer Abstriche und fehlender mikrocomputertomographischer, radiologischer und histologischer Infektionsanzeichen sehr unwahrscheinlich. Die Ein- und Ausschlusskriterien, welche für die Bestimmung der Zellen und colokalisierten Bakterien erhoben wurden, wurden anhand von Aufnahmen von infizierten Implantaten festgelegt. Auf der Oberfläche der Kontrolle wurden zellähnliche Strukturen gefunden, die größer waren, als Bakterien, aber kleiner als 10 µm. Hierbei könnte es sich um Zellreste handeln. In den Aufnahmen der infizierten Tiere wurden die oben genannten Strukturen nicht gefunden. Es ist daher möglich, dass die festgelegten Ein- und Ausschlusskriterien zu einem Einschluss von diesen Zellstrukturen bzw. Zellresten geführt hat. Aus diesen Gründen kann die Quantifizierungsmethode für die vitale bakterielle Biomasse auf der Implantatoberfläche nicht für die Unterscheidung zwischen infiziert und nicht infiziert verwendet werden, gibt aber dennoch einen guten Überblick über

6. Diskussion 125

die semiquantitative bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche. Die morphologische Beurteilung der bakteriellen Biomasse auf der Implantatoberfläche ergab in der Kontrollgruppe einen Score von 0. Es wurden also keine Bakterien auf der Implantatoberfläche festgestellt und dadurch das Ergebnis der mikrobiologischen Abstriche bestätigt. Eine Verbesserung der Färbemethode für Bakterien, beispielsweise durch das Anfärben der Peptidoglykane in der Zellwand der Bakterien würde die Quantifizierung verbessern, ist aber mit einer deutlich aufwändigeren und zeitlich intensiveren Färbetechnik verbunden und kann auf Grund der begrenzten technischen Voraussetzungen am CLSM (zu wenig Aufnahmekanäle für alle Färbungen) nicht optimal mit einer Lebend/Tot- Färbung kombiniert werden.

Die am häufigsten verwendete Methode für die Quantifizierung der Bakterien auf der Implantatoberfläche ist die Auswertung der KBE nach der Ablösung der Bakterien im Ultraschallbad (LUCKE et al. 2003a, HAENLE et al. 2013, JØRGENSEN et al. 2014, FUKUSHIMA et al. 2005). Mit dieser Methode wird die Anzahl der abgelösten, kultivierbaren Bakterien bestimmt. Bei der Bestimmung des bakteriellen Volumens mittels CLSM Aufnahmen, können im Gegensatz zur Auszählung der KBE die morphologischen Besonderheiten der Biofilmbildung auf der Implantatoberfläche abgebildet werden. Auch kann bei der CLSM-basierten Auswertung mittels Lebend/Tot- Färbung zwischen lebenden und toten Bakterien unterschieden werden. Im Gegensatz zur Bestimmung der KBE werden bei der Lebend/Tot- Färbung mit anschließender Untersuchung im CLSM stoffwechselreduzierte oder inaktive Persister-Bakterien in der Auswertung mitberücksichtigt (STOCKS 2004). Diese Bakterien sind bei der Auszählung der KBE schwer bis nicht anzuzüchten (WOOD et al. 2013, MEISSNER et al. 2013). Des Weiteren hat eine Studie von DOLL et al. (2016b) gezeigt, dass bei der Ablösung im Ultraschallbad ein Teil der Bakterien abstirbt, wodurch sie bei der Quantifizierung entfallen. Deshalb ist wahrscheinlich der bakterielle Anteil auf der Implantatoberfläche höher als der durch die Auszählung der KBE bestimmte Anteil an Bakterien. Daher bietet die Methode der KBE Bestimmung keine idealen Bedingungen, um die Menge an Bakterien auf der Implantatoberfläche wiederzugeben. Für die vorliegende Studie wurde daher eine CLSM-basierte Auswertungsmethode verwendet, die sowohl quantitative Unterschiede abbildet als auch die Morphologie der bakteriellen Besiedlung berücksichtigt. Trotz größer tierindividueller Unterschiede lassen sich mit der CLSM-basierten Quantifizierung Unterschiede in der Besiedlungsstärke feststellen, die vermutlich vergleichbar mit der KBE Auszählung sind. In Kombination mit der morphologischen Beurteilung der bakteriellen Besiedlung, die eine Unterscheidung in infiziert und nicht infiziert ermöglicht, eignet sich die CLSM-basierte Quantifizierung der vitalen bakteriellen Biomasse, um die Infektionslast auf der Implantatoberfläche zu bestimmen. Ein Restrisiko, eine Infektion nicht zu erkennen, bleibt sowohl bei der

126 6. Diskussion

KBE-Auszählung als auch bei der hier verwendeten Methodik, ist aber für die Fragestellung, welche in dieser Studie untersucht werden sollte, nicht von Bedeutung.

6.2.2. Bakterielle Besiedlung der Implantatoberfläche in der Pilotstudie

Zum jetzigen Zeitpunkt ist keine Studie bekannt, die in vivo eine Volumen- bestimmung der vitalen bakteriellen Biomasse auf der Implantatoberfläche durchgeführt hat. Die meisten Studie messen die Infektionslast auf der Implantatoberfläche über die Bestimmung der KBE nach Ablösung der Bakterien vom Implantat oder nach Homogenisierung des Umgebungsgewebes (LUCKE et al. 2003a, HAENLE et al. 2013, JØRGENSEN et al. 2014, FUKUSHIMA et al. 2005). Bei dem Vergleich der Ergebnisse aus der vorliegenden Studie mit anderen Studien muss diese Situation beachtet werden. Allerdings können die allgemeinen Aussagen dieser Studien mit den Ergebnissen aus der vorliegenden Studie verglichen werden. In den Infektionsgruppen wurde eine Tendenz zu einer erhöhten bakteriellen Biomasse pro quantifizierte Fläche mit sinkender Infektionskonzentration festgestellt. Diese war allerdings nicht statistisch signifikant. Der wahrscheinlichste Grund dafür können individuelle Unterschiede in den Gruppen sein, die hohe Standard- abweichungen bedingen. Diese Unterschiede können das Ergebnis einer unterschiedlichen bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche sein oder auf Grund des Auszugsvorganges aus dem Knochen auftreten. Bei diesem Vorgang können z.B. Strukturen von der Oberfläche abreißen und im Knochen verbleiben. Auf Grund der protektiven Eigenschaften der EPS wurde eine vermehrte Biofilmbildung auf der Implantatoberfläche der Gruppe VB12 erwartet (PENESYAN et al. 2015). Im Gegensatz zu den erwarteten Ergebnissen zeigte die Implantatoberfläche dieser Gruppe eine verminderte bakterielle Lebendbiomasse im Vergleich zu den Gruppen I105, I104 und I103. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis könnte eine unzureichende Formation von EPS auf den vorbesiedelten Implantaten sein, oder ein teilweises Abreißen der angelagerten Bakterien bei der Implantation. Durch die unzureichende Formierung von EPS kann es möglicherweise zu einem geringeren Schutz vor dem Immunsystem und einer erhöhten Phagozytose durch PMN gekommen sein wie GÜNTHER at al (2009) in vitro zeigt. Eine vermehrte Biofilmbildung mit sinkender Inokulationskonzentration, wie in dieser Studie beobachtet wurde, kann auch das Ergebnis einer erhöhten Immunantwort auf die initial höher eingesetzte Bakterienkonzentration sein. Die verstärkte Immunantwort kann durch ein stärkeres proinflammatorisches Milieu hervorgerufen worden sein (DAPUNT et al. 2014, TROUILLET-ASSANT et al. 2015). DAPUNT et al. (2014) verglich in ihrer Studie den nicht-infektiösen mit dem infektiösen

6. Diskussion 127

Implantatverlust in humanen Patienten und analysierte die Aktivierung von T-Lymphozyten bei diesen Vorgängen in Blut- und Gewebeproben. Sie stellte eine erhöhte Aktivierung der T-Lymphozyten und besonders der zytotoxischen T-Lymphozyten in Patienten mit einem infektiösen Implantatverlust fest. TROUILLET- ASSANT et al. (2015) untersuchte in vitro den direkten Einfluss einer Staphylococcus aureus (Stämme 8325-4, DU5883 und 6850) Infektion auf die Neubildung und die Resorptionsaktivität von primären murinen Osteoklasten-Vorläuferzellen. Staphylococcus aureus Zellen wurden von infizierten Osteoklasten internalisiert. Eine Infektion der Osteoklasten-Vorläuferzellen bewirkte eine Differenzierung in Makrophagen, die proinflammatorische Zytokine sezernierten. Diese erhöhten die Resorptionskapazität des Knochens von nicht infizierten Osteoklasten. Die Infektion von reifen Osteoklasten durch Staphylococcus aureus erhöhte die Fusionskapazität der Zellen und erhöhte so die Resorptionskapazität der Osteoklasten. Diese Studien zeigen eine Aufrechterhaltung des proinflammatorischen Millieus, welche zu stärkeren Knochenveränderungen führen, aber die Menge an Bakterien und Biofilm auf der Implantatoberfläche reduzieren und liefern eine Erklärung für die Befunde der vorliegenden Studie. VIDLAK u. KIELIAN (2016) untersuchten die Immunantwort auf eine stamm- abhängige bakterielle periprothetische Gelenksinfektion in einem Mausmodell, in dem ein Kirschner Draht über das Kniegelenk in den distalen Femur eingebracht wurde. Für die Infektion wurden die Staphylococcus aureus Stämme LAC und UAMS-1 in den Konzentrationen 103 und 105 KBE/Tier verwendet. Nach sieben und 14 Tagen wurde die Infektionslast und die Immunantwort evaluiert. Die KBE wurden durch Homogenisierung des Umgebungsgewebes und Ausstrich auf Agarplatten nach Durchführung einer Verdünnungsreihe ermittelt. Sie fanden eine höhere Biofilmbildung in den Umgebungsgeweben (Gewebe, Gelenk) und im homogenisierten Knochen in der Gruppe, welche mit 105 KBE/Maus infiziert wurde im Vergleich zur Gruppe, die mit 103 KBE/Maus infiziert wurde. VOGELY et al. (2000) zeigte mit seiner Studie ein ähnliches Ergebnis wie VIDLAK u. KIELIAN (2016). Er implantierte Ti90/Al6/V4-Stäbe mit und ohne Hydroxylapatit-Beschichtung in die Tibia von Kaninchen und infizierte mit dem Staphylococcus aureus Stamm 10832 in den Konzentrationen von 102, 103, 104 und 105 CFU/Tier. Die Bestimmung der KBE/Knochen wurde nach Homogenisierung, Durchführung einer Verdünnungsreihe und Ausstrich auf Blutagar durchgeführt. Die KBE/Knochen stiegen mit steigender Infektionskonzentration nach Implantation des Ti90/Al6/V4-Stabes und Hydroxylapatit beschichteten Stabes. Histologisch wurden wenige Mikroabszesse im Knochenmark oder im Cortex gefunden. Wenn sie gefunden wurden, traten sie vermehrt bei der Infektion mit höheren Konzentrationen auf. Das Ergebnis der Studien von VIDLAK u. KIELIAN (2016) und VOGELY et al. (2000) geben einen Hinweis darauf, dass bei einer höheren Infektionskonzentration die Bakterien eher in das Umgebungsgewebe abwandern und sich dort als Mikroabszess abkapseln.

128 6. Diskussion

Diese Ergebnisse würden erklären, warum auf der Implantatoberfläche der Infektionsgruppen, die mit einer hohen initialen Bakteriendosis (Gruppen VB12 und I106) infiziert wurden, weniger Bakterien auf der Implantatoberfläche auffindbar waren. Auch die histologischen Befunde aus der vorliegenden Studie unterstreichen diese Theorie. In der Gruppe VB12 wurden gelegentlich Mikroabszesse gefunden. Trotz größerer tierindividueller Unterschiede in der histopathologischen Ausprägung der infektionsbedingten Knochen-veränderungen wurden auch in der Gruppe I106 bei wenigen Tieren die Ausbildung von Mikroabszessen festgestellt.

Bei dem Vergleich der Ergebnisse sollte der Einfluss der verwendeten Stämme auf das Ergebnis der ausgezählten Menge der KBE und die Schwere der histopathologischen Veränderungen des Knochens mit einbezogen werden Nachweislich zeigen verschiedene Stämmen unterschiedliche adhäsive Eigenschaften für die Anlagerung an die Implantatoberfläche, wie es für Staphylococcus epidermidis Stämme auf unterschiedlichen Materialien von OLSON et al. (2006) gezeigt wurde. VIDLAK u. KIELIAN (2016) stellten auch Unterschiede in der KBE Menge im Umgebungsgewebe und im Knochen in Abhängigkeit der eingesetzten Staphylococcus aureus Stämmen fest und geben somit einen Hinweis auf mögliche An- bzw. Absiedlungspräferenzen von verschiedenen Bakterien- stämmen. Allerdings spielt auch das Biofilmbildungsvermögen, welches mit der Bestimmung der KBE nicht erfasst werden kann, eine große Rolle. Die Biofilmbildung ist stammspezifisch unterschiedlich ausgeprägt und zum großen Teil verantwortlich für die Persistenz von Infektionen (VAN SORGE et al. 2013, OLSON et al. 2006, HOU et al. 2012). Daher ist die morphologische Beurteilung neben der quantitativen Erfassung von großer Bedeutung. Aus diesem Grund wurde die bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche mit einem Scoresystem in Anlehnung an GLAGE et al. (2017) entwickelt, welches die morphologischen Besonderheiten bei der Biofilmbildung beschreibt. Eine Tendenz zur steigenden Biofilmformation mit sinkender bakterieller Inokulationskonzentration wurde beobachtet korrespondierend zu den bestimmten Volumina pro Fläche. Die morphologische Beurteilung zeigte vor allem vereinzelte Bakterien auf der Implantatoberfläche in den Gruppen mit einer hohen Inokulationsdosis (VB12 und I106). Diese Ergebnisse stimmen mit denen von GLAGE et al. (2017) überein, die eine Schraube in die Schädelkalotte der Ratte implantierte und mit dem Staphylococcus aureus Stamm 36/07 in einer Konzentration von 107 KBE/10 µl infizierte. Nach 21 Tagen wurden die Schrauben explantiert, mit dem Lebend/Tot- Farbstoff gefärbt und die bakterielle Besiedlung auf der Oberfläche mittels CLSM und einem morphologischen Scoring Schema von 0 bis 5 untersucht. Vergleichbar zur vorliegenden Studie fand GLAGE et al. (2017) bei der hohen Infektionskonzentration vereinzelt Bakterien auf der Implantatoberfläche und nur selten Biofilmbildung. JØRGENSEN et al. (2014) beurteilte die Biofilmformation

6. Diskussion 129

auf der Implantatoberfläche nach einem Zeitraum von vier bis zu 15 Tagen mittels Epifloureszenzmikroskopie und CLSM Analyse nach Lebend/Tot- Färbung in einem Mausmodell für implantatassoziierte Osteomyelitis in der Tibia. Durch dieses Verfahren wurde nur das Vorhandensein von Biofilm auf der Implantatoberfläche bestätigt, aber keine Quantifizierung vorgenommen. Bei einem Teil der Tiere untersuchte er die bakterielle Besiedlung auf dem Implantat durch die Auswertung der auf Agar gewachsenen KBE nach Ultraschallbehandlung des Implantates. In verschiedenen Tiergruppen wurden die epifloureszierenden Staphylococcus aureus Stämme Xen29 und 31 in der Konzentration von 104 KBE/Tier verwendet. Korrespondierend zu unseren Ergebnissen war in dieser Studie die Verteilung von Biofilm in den Gruppen heterogen und es wurde Biofilmbildung bei einer Konzentration von 104 KBE festgestellt.

6.3. Untersuchung der laserstrukturierten Spikeoberfläche im low-grade ähnlichen Tiermodell

Das Hauptziel der Hauptstudie war die Überprüfung der Hypothese, dass die speziell gefertigten laserstrukturierten Oberflächen bei der Implantation in den Knochen gegenüber der Referenzstruktur zu einer reduzierten Infektionslast an der Implantatoberfläche führen. Dass Oberflächenmodifikationen in vivo einen hemmenden Effekt auf die bakterielle Besiedlung haben können, konnte für lammellenartige Strukturen auf Polystyrol gezeigt werden, die in die Bauchhöhle der Maus implantiert, zwei Tage post OP mit dem Staphylococcus aureus Stamm 15981 infiziert und nach sieben Tage untersucht wurden (VALLE et al. 2015). Überprüft wurde die angenommene Hypothese mittels der in der Pilotstudie evaluierten Methoden und einer Inokulationskonzentration von 103 KBE/10 µl, da diese am besten dem klinischen Bild der low-grade Infektion entsprach. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass sich diese Hypothese in der vorliegenden Studie für die verwendeten Implantatoberflächen nicht bestätigt hat. Bei der Quantifizierung der vitalen bakteriellen Besiedlung wurde eine erhöhte Besiedlung auf der strukturierten Implantatoberfläche im Vergleich zur Referenzoberfläche festgestellt, welche im Gegensatz zu den in vitro Ergebnissen stehen (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten). Auch die radiologische und histologische Auswertung ergab stärkere Knochenveränderungen in der Gruppe mit der Laserstruktur im Vergleich zur Referenzstruktur. Trotz stärkerer Knochen- veränderungen ließen sich die Implantate der Gruppe mit der Laserstruktur im Vergleich zur Referenzstruktur schwerer aus dem Knochen ausziehen. Auch war die eukaryotische zelluläre Besiedlung signifikant höher auf der laserstrukturierten Oberfläche im Vergleich zur Gruppe mit der Referenzstruktur. Somit konnte das

130 6. Diskussion

osteogene Potential und die guten zellulären Anlagerungseigenschaften, die auf Grund der in vitro Ergebnisse vermutet wurden, in vivo bestätigt werden. Das Ergebnis der vorliegenden Studie zeigt, dass eine in vitro tendenziell Bakterien reduzierend wirkende Oberfläche selbst bei guter Gewebeanlagerung diese Wirkung nicht automatisch in vivo beibehält. Das Ergebnis unterstreicht noch einmal die Wichtigkeit von in vivo Modellsystemen als Schnittstelle zwischen Material- entwicklungen im Labor und einer klinischen Anwendung. Auch wenn die in dieser Studie verwendete Spikestruktur bisher noch nicht die gewünschte Reduktion der Implantatinfektion gezeigt hat, ist sie dennoch auf Grund ihres guten Einheilungsverhaltens ein sehr guter Ausgangspunkt für weitere Modifikationen, die dann gezielt die antibakterielle Wirkung adressieren sollten.

6.3.1. Bakterielle und zelluläre Besiedlung der Implantatoberflächen

Die Implantate der laserstrukturierten Gruppe ließen sich schwerer aus dem Knochen herausziehen und korrespondierend zu diesem Befund zeigte die Gruppe mit der Laserstruktur eine stärkere Besiedlung mit eukaryotischen Zellen im Vergleich zur Gruppe mit der Referenzstruktur. Allerdings wurde auf der strukturierten Implantatoberfläche auch eine Erhöhung der vitalen bakteriellen Biomasse im Vergleich zur Referenzoberfläche festgestellt. Die Ergebnisse der bakteriellen Besiedlung stehen im Gegensatz zu den in vitro Ergebnissen, welche keine Erhöhung der bakteriellen Besiedlung gezeigt haben (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten). Er untersuchte mit Staphylococcus aureus besiedelte laserstrukturierte Oberflächen mit Spikestrukturen in den Größen von 2-20 µm und stellte eine verringerte Oberflächenbesiedlung mit Bakterien bei den kleinen und mittelgroßen Spikes im Vergleich zu größeren Spikes fest. Eine deutliche Diskrepanz zwischen in vitro und in vivo Ergebnissen konnte auch von HARRASSER et al. (2016) bei einer implantatassoziierten Infektion in einem Rattenmodell gezeigt werden. Er kombinierte Hydroxylapatit mit dem antibakteriellen Wirkstoff Silber, wodurch die Infektion reduziert werden sollte. In die Metaphyse der Tibia wurden konische Ti90/Al6/V4-Implantate eingebracht, die mit Hydroxylapatit oder mit Hydroxylapatit und Silber beschichtet waren. Der Staphylococcus aureus Stamm ATCC25923 in den Konzentrationen von 102 und 103 KBE/Tier wurde für die Infektion genutzt. Nach einem Untersuchungszeitraum von sechs Wochen wurde die KBE pro Implantat durch Ablösung der Bakterien im Ultraschallbad bestimmt und die KBE im Knochen durch Homogenisierung und Ausstrich des Homogenisats auf Blutagar. Die ausgezählten KBE der Proben waren in fast allen Gruppen für die Hydroxylapatit und Silber beschichteten Implantate erhöht mit Ausnahme der mit 103 KBE/Tier infizierten und mit Hydroxylapatit und Silber beschichteten Implantate.

6. Diskussion 131

In dieser Gruppe waren die bestimmten KBE der Hydroxylapatit beschichteten Implantate höher als die der mit Hydroxylapatit und Silber beschichteten Implantate. Ein gutes Einwachsen der nicht infizierten Implantate und ein schlechtes Einwachsen der infizierten Implantate in den Knochen wurde beobachtet. Die gleiche Kombination aus Hydroxylapatit und Silber zeigte zuvor in vitro im Vergleich zu Hydroxylapatit beschichteten Ti90/Al6/V4-Plättchen einen antibakteriellen Effekt gegenüber Staphylococcus epidermidis (BRAISSANT et al. 2015). Damit ließ sich auch in diesem Fall in vivo nicht das in vitro Ergebnis der antibakteriellen Wirksamkeit bestätigen. Eine mögliche Erklärung für die unterschiedlichen in vitro und in vivo Ergebnisse sind die unterschiedlichen Erreger, die untersucht wurden. Gegebenenfalls zeigt der eingesetzte Staphylococcus aureus Stamm von HARRASSER et al. (2016) eine stärkere Silbertoleranz als der eingesetzte Staphylococcus epidermidis Stamm von BRAISSANT et al. (2015). Ein Unterschied zwischen den in vitro Versuchen und den in vivo Versuchen der vorliegenden Studie und HARRASSER et al (2016) ist, dass das Implantat in vivo anders als in vitro nach dem Einbringen in den Knochen sofort von Blut- und Gewebeflüssigkeit überzogen wird, dem so genannten „Conditioning film“ (YU et al. 2015, GOTTENBOS et al. 2002). Dieser enthält unter anderem Thrombozyten und Gerinnungsfaktoren, wie Fibrin und Thrombin (HIGGINS et al. 2009). DING et al. (2013) stellte beispielsweise fest, dass sich Thrombozyten verbessert auf größeren säulenartigen Strukturen anlagern können. Daher besteht die Möglichkeit, dass sich auch auf dem geprüften laserstrukturierten Implantat Thrombozyten gut anlagern können und sich gegebenenfalls ein ausgedehnterer „Conditioning film“ auf der Oberfläche gebildet hat. Der „Conditioning film“ mit seinen genannten Inhaltsstoffen stellt für Bakterien eine gute Anlagerungsfläche dar, denn die Proteine auf der Oberfläche sind potentielle Bindungspartner für die von Bakterien produzierten Adhäsine (GOTTENBOS et al. 2002, CRAMTON et al. 1999, VAN HOUDT u. MICHIELS 2005, FOWLER et al. 2000). Die veränderte Anlagerungsoberfläche auf Grund eines ausgedehnten „Conditioning films“ könnte den Bakterien einen Anlagerungsvorteil geboten haben (GOTTENBOS et al. 2002). Eine andere Erklärung könnte auch eine mögliche Strukturschädigung der Oberfläche durch die knöcherne Implantation sein. Warum die bakterielle Besiedlung in vivo nicht gesenkt werden konnte, sondern sogar erhöht war, ist nicht abschließend zu klären. Insbesondere vor dem Hintergrund, dass die laserstrukturierten Implantate deutlich fester integriert waren und auch die zelluläre Besiedlung der laserstrukturierten Implantate durch die Tiere deutlich höher war als die auf den Referenzimplantaten. Denn wenn man die von GRISTINA (1987) postulierte „Race for the Surface“-Theorie betrachtet, nach welcher die Entstehung einer Infektion davon abhängt, welche Zellen (eukaryotisch gegen Bakterien) zuerst das Implantat besiedeln und sich an die Oberfläche anhaften, müsste die Bakterienlast eigentlich reduziert sein. Sie postulierte, dass

132 6. Diskussion

Bakterien keine Möglichkeit mehr haben die Implantatoberfläche zu besiedeln, wenn körpereigene Zellen sich schneller am Implantat anlagern. Können sich die Bakterien allerdings zuerst anlagern, kann eine Implantatinfektion die Folge sein. Nach dieser Theorie könnte durch Implantate, die eine gute Biokompatibilität besitzen und von den Zellen gut integriert werden, das „Race for the Surface“ gewonnen und dadurch eine Implantatinfektion verhindert werden. Welche Zellart sich schneller anlagern konnte, kann in der vorliegenden Studie aufgrund des Untersuchungsintervalls von 21 Tagen nicht exakt bestimmt werden. Dennoch kann auf Grund der Ergebnisse der vorliegenden Studie und der Literaturbeispiele darauf geschlossen werden, dass eine sehr gute Biokompatibilität bzw. eine ideale Anlagerungsfläche für eukaryotische Zellen für die Reduktion der Implantatinfektion allein nicht ausreichend zu sein scheint. Beim postulierten „Race for the Surface“ als Ansatz zur Reduktion von Implantatinfektionen müssen vermutlich deutlich mehr Faktoren beachten werden, als allein eine verbesserte Einheilung (GRISTINA 1986).

6.3.2. Beurteilung infektionsbedingter Parameter

Die erhöhte Infektionslast in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten stellte sich in fast allen Untersuchungsmethoden dar mit Ausnahme von Parametern der Allgemeinuntersuchung. Kein Unterschied wurde im Verhalten, im Allgemein- befinden, in der Körpertemperatur und der Schwellung der Implantationsstelle festgestellt. Die Gewichtsentwicklung war in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten sogar etwas besser im Vergleich zu der Gruppe, die die Referenzimplantate erhielt. Die Tiere der Gruppe mit laserstrukturierten Implantaten erreichten früher das Ausgangsgewicht und hatten einen niedrigeren maximalen Gewichtsverlust als die Gruppe mit den Referenzimplantaten. Allerdings erreichte die Gruppe mit den Referenzimplantaten ein höheres Endgewicht und hatte einen minimal geringeren, narkosebedingten Gewichtsverlust am Tag 14 post OP. Auf Grund dieser Befunde kann aus der Gewichtsentwicklung kein Hinweis auf einen veränderten Gesundheitsstatus festgestellt werden. Zwei Tiere der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten mussten aufgrund von Lahmheit bzw. Gewichtsverlust analgetisch behandelt werden. Diese Behandlung gibt einen Hinweis darauf, dass die Belastung durch den Versuch in der Gruppe, die die laserstrukturierten Implantate erhielt, geringgradig höher war als in der Gruppe mit den polierten Referenzimplantaten.

Die mikrobiologische Beurteilung ergab einen positiven Befund für den Inokulationskeim Staphylococcus aureus 36/07 in allen Knochenmarksausstrichen beider Gruppen, sowie auf allen Implantatabstrichen der Gruppe mit den

6. Diskussion 133

laserstrukturierten Implantaten, allerdings nur auf 14 von 17 Implantatabstrichen der Referenzimplantate. Sowohl bei der Quantifizierung, als auch bei der morphologischen Beurteilung der bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche mittels CLSM konnte hingegen auf allen Implantatoberflächen beider Gruppen eine Besiedlung mit Bakterien festgestellt werden. Da bei allen Tieren der Gruppe mit den polierten Referenzimplantaten der Knochenmarksausstrich aller Tiere positiv war, kann mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit von einem Durchführungsfehler beim Abstrich ausgegangen werden.

Vergleicht man die Ergebnisse der radiologischen und histologischen Auswertung, zeigte die Gruppe mit strukturierter Implantatoberfläche einen höheren Gesamtscore und damit stärkere infektionsbedingte Knochenveränderungen mit beiden Auswertungsverfahren, auch wenn dieser an Tag 21 bei der radiologischen Auswertung im Gegensatz zur histologischen Auswertung nicht signifikant erhöht war. Bei der histologischen Auswertung wurden die Destruktion und die Fibrose des Cortex als signifikant erhöhte Parameter in der Gruppe mit den laserstrukturierten Implantaten ermittelt. Neben den bereits im Punkt 6.1. diskutierten Ursachen für Unterschiede zwischen den Methoden kann in der ein weiterer Grund für die Diskrepanz zwischen den Ergebnissen beider Auswertungsmethoden durch die drei ausgeschlossenen Tiere in der laserstrukturierten Gruppe erklärt werden. Bei diesen Tieren ließ sich das Implantat besonders schwer aus dem Knochen entfernen. Beim Herausziehen der Implantate wurde das Interface komplett zerstört bzw. sehr stark beschädigt, sodass eine Auswertung nicht möglich war. Sie zeigten in der radiologischen Auswertung einen medianen Score, der dem der Gruppe mit den Referenzimplantaten entsprach oder sogar geringer war. Durch die stärkere bakterielle Oberflächenbesiedlung der Gruppe mit laserstrukturiertem Implantat im Vergleich zur Gruppe, die die polierten Referenzimplantate erhielt, kann es aber auch zu einer vermehrten Aktivierung des Immunsystems und vor allem der Osteoklasten gekommen sein (DAPUNT et al. 2014, 2016, TROUILLET-ASSANT et al. 2015). Diese Aktivierung könnte die signifikant erhöhte Destruktion des Cortex und die dadurch bedingte Fibrose der laserstrukturierten Gruppe im Vergleich zu Gruppe mit der Referenzstruktur erklären. Bei einer Infektion, welche vom Knochenmark ausgeht, würde man allerdings primär signifikante Veränderungen im Knochenmark erwarten. So wurde beispielsweise in der Pilotstudie eine Verstärkung der Fibrose und Infiltration mit PMN mit steigender Infektionskonzentration festgestellt (Vergleich mit Punkt 12.4., Tabelle 27). Außerdem ging in der Pilotstudie eine stärkere Destruktion des Knochens mit einer leichteren Entnahme der Implantate einher. Ausgehend von den Ergebnissen der Pilotstudie und der vom Knochenmark ausgehenden Infektion wären die zu erwartenden Ergebnisse in der Gruppe mit der Laserstruktur ein leichter Auszug des

134 6. Diskussion

Implantates aus dem Knochen, weniger Knochenneubildung um das Implantat, eine stärkere Infiltration mit PMN und Fibrose im Knochenmark. Allerdings konnten 14 der 17 Implantate aus der laserstrukturierten Gruppe schwerer aus dem Knochen entfernt werden als die der referenzstrukturierten Gruppe. Bei acht der 17 Tiere wurde außerdem implantatnahe Knochenneubildung festgestellt. Auf Grund des schweren Auszugs des Implantates aus dem Knochen, kann eventuelle Knochenneubildung um das Implantat beim Auszug auch mit aus dem Knochenmark entfernt worden sein. Besonders die REM Aufnahmen, aber auch die CLSM Aufnahmen unterstützen diese Vermutung, denn auf der Implantatoberfläche der REM Aufnahmen wurden flächige Zellansammlungen gefunden, die eine Art Teppich auf der Implantatoberfläche bildeten (siehe Punkt 5.3.6. Abbildung 33). Diese Morphologie ist von Osteoblasten bekannt, die neue Knochenmatrix produzieren (SCHAESKE et al. unveröffentlichte Daten, SCHLIE et al. 2011). Warum die histologischen Befunde von den erwarteten Befunden abweichen, kann nicht abschließend geklärt werden. Die Vermutung liegt aber nahe, dass die Laserstruktur auf der Oberfläche einen deutlichen Einfluss auf die Anlagerung von eukaryotischen Zellen in ihrer Nähe hat und die feste Anlagerung von Osteoblasten fördert und diese trotz des Infektionsstimulus durch die Bakterien zu einer Produktion von Knochensubstanz animiert. Beim Einbringen in den Knochen könnte es zu einer Beschädigung der ursprünglichen Laserstruktur gekommen sein. Nach Entnahme der Implantate war eine Struktur ähnlich der ursprünglichen Struktur in den CLSM und REM Aufnahmen auf der Oberfläche zu erkennen. Ob diese aber der eingebrachten Struktur entspricht, kann durch die CLSM und REM Aufnahmen nicht ausgeschlossen oder bestätigt werden, da die starke zelluläre Besiedlung auf der Oberfläche eine genauere Evaluation verhindert und die herkömmlichen Methoden für die Ablösung von Zellen und Bakterien die Strukturen beschädigen könnten.

7. Zusammenfassung 135

7. Zusammenfassung

Marie-Luise Schröder (2018): Untersuchung modifizierter Implantatoberflächen für den orthopädischen Einsatz zur Reduzierung implantatassoziierter Infektionen im Rattenmodell

Implantatassoziierte Infektionen sind in der orthopädischen Chirurgie eine der am schwierigsten zu behandelnden Komplikationen. Die Behandlung der Infektionen geht mit einer hohen Belastung für den Patienten und hohen Kosten für das Gesundheitssystem einher. Die Biofilmbildung der Infektionserreger und die steigenden antibiotischen Resistenzen sind zwei der wichtigsten Probleme bei der Behandlung von Implantatinfektionen. Deshalb gibt es einen hohen Forschungs- bedarf im Bereich der prophylaktischen und therapeutischen Strategien zur Bekämpfung von Implantatinfektionen. Die Funktionalisierung von Implantat- oberflächen stellt dabei ein großes Forschungsfeld dar. Eine Möglichkeit ist die Strukturierung der Oberfläche durch ultra-kurz gepulste Laserablation, durch die bakterienabweisende Strukturen generiert werden können. Mit diesem Verfahren hergestellte Spikestrukturen zeigten in vitro in Abhängigkeit von der Spikegröße Unterschiede in der bakteriellen und zellulären Besiedlung. Mit kleineren Spikes (5-6 µm) versehene Implantatoberflächen stellten einen vielversprechenden Ansatz für die Reduktion von Implantatinfektionen dar. Um die Hypothese der Infektionsreduktion durch Verwendung der speziellen Implantat- oberflächen zu überprüfen, sollten die Strukturen präklinisch in einem passenden in vivo Modell im Rahmen des Forschungsverbundes „Biofabrication for NIFE“ getestet werden. Für die Auswertung der in vivo Studien waren die richtigen Evaluationsmethoden essentiell. Nicht nur die Menge der bakteriellen Besiedlung auf der Implantatoberfläche sollte untersucht werden, sondern auch das morphologische Erscheinungsbild der Biomasse, um beispielsweise zwischen Biofilm und planktonischen Bakterien zu unterscheiden. Diese Kombination aus beiden Evaluationsmethoden wurde bisher noch nicht durchgeführt. Daher wurde zunächst in einer Pilotstudie ein Rattenmodell für einen rattenpathogenen Staphylococcus aureus Stamm erarbeitet. Es musste festgestellt werden, welcher Infektionsweg und welche Infektionskonzentration geeignet waren, um eine low-grade ähnliche implantatassoziierte Infektion zu modellieren. Des Weiteren wurde eine Methode für die CLSM-basierte Quantifizierung der bakteriellen Besiedlung in Kombination mit der morphologischen Beurteilung etabliert. Für das Auslösen der implantatassoziierten Infektion wurde ein quaderförmiger Ti90/Al6/V4-Stab in die Tibia der Ratte implantiert und mit dem Staphylococcus aureus Stamm 36/07 über die Injektion einer Bakteriensuspension in verschiedenen Konzentrationen (103, 104, 105 und 106 KBE/10 µl) intraoperativ infiziert. Als

136 7. Zusammenfassung

alternative Infektionsmethode wurden bakteriell vorbesiedelte Implantate verwendet. Score-basierte radiologische und histologische Auswertungsverfahren wurden für die semiquantitative Beurteilung von infektionsbedingten Knochen- und Gewebe- veränderungen nach einem Untersuchungszeitraum von drei Wochen verwendet. Die bakterielle Infektionslast wurde durch konfokalmikroskopische Aufnahmen der Implantatoberfläche nach Lebend/Tot- Färbung ermittelt. Die Quantifizierung der vitalen bakteriellen Biomasse wurde mit zwei verschiedenen Methoden (Volumen- Methode und Spot-Methode) durchgeführt und mit einem Scoresystem kombiniert, welches die morphologischen Besonderheiten der Biofilmbildung auf der Implantatoberfläche wiederspiegelt. In der Pilotstudie wurde mit sinkender Infektionskonzentration eine Tendenz zur zunehmenden Biofilmformation, sowohl quantitativ, als auch morphologisch festgestellt. Die radiologische und histologische Evaluation ergab stärkere Knochen- veränderungen mit steigender Infektionskonzentration. Damit entsprach die Injektion der Bakteriensuspension in der Konzentration von 103 KBE/10 µl am besten dem klinischen Bild der low-grade Infektion und eignete sich daher für den Einsatz in der Hauptstudie. Für die Beurteilung der bakteriellen Infektionslast auf der Implantatoberfläche stellte sich die Volumen-Methode als die am besten geeignete Methode heraus. In der Hauptstudie wurde mit den etablierten Methoden aus der Pilotstudie eine laserstrukturierte Oberfläche mit Spikestrukturen (circa 5 µm) im Hinblick auf die Hypothese geprüft, dass die Laserstrukturierung der Oberfläche möglicherweise die Infektionslast der Implantatoberfläche reduziert. Allerdings zeigte sich in den Untersuchungen ein gegenteiliger Effekt. Die Evaluation der explantierten laserstrukturierten Oberfläche am Ende des Untersuchungszeitraumes von 21 Tagen ergab zwar eine stärkere zelluläre Besiedlung mit eukaryotischen Zellen und damit eine verstärkte Integration in den Knochen im Vergleich zur polierten Referenzoberfläche, die bakterielle Besiedlung war aber, im Gegensatz zu den in vitro Studien, stärker als die der Referenzstruktur. Die radiologischen und histologischen Auswertungen ergaben stärkere infektionsbedingte Veränderungen des Knochens bei Verwendung der Spikestruktur im Vergleich zur Referenzstruktur aus der Pilotstudie. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie auf der einen Seite die Wichtigkeit von in vivo Modellen in der präklinischen Testung von neuen Implantatmaterialien und auf der anderen Seite, dass die geprüften laserstrukturierten Oberflächen derzeit nicht geeignet sind, die bakterielle Besiedlung zu reduzieren. Allerdings stellen sie durch ihr gutes Anlagerungsvermögen für eukaryotische Zellen und der daraus resultierenden starken Verankerung im Knochen einen Ausgangspunkt für weitere Modifikationen dar, welche gezielt die antibakterielle Wirkung adressieren könnten.

8. Summary 137

Summary

Marie-Luise Schröder (2018): Analysis of modified implant surfaces in a rat model for the reduction of implant associated infections for orthopedic applications

Implant associated infections are among the major problems in orthopaedic surgery, which can result in devastating complications for the patients and high costs for the health system. Biofilm formation and rising numbers of antibiotic resistance of the infection agents are two major threats for the therapy of implant associated infections. Therefore, prevention and therapeutic strategies are two research foci amongst others to reduce implant infections. Diminution of implant associated infections can be achieved by functionalization of implant surfaces, which reduce the adhesion of bacteria. One method to generate such surfaces is the femtosecond laser based modification of the implant surface. Spike structures, which were manufactured with this method, showed a better cellular adhesion and decreasing bacterial adhesion on smaller spikes structures (5-6 µm) compared to larger spike structures (10-20 µm) in vitro. Such structures are a promising approach for the reduction of implant associated infections. To verify this hypothesis, it was the aim of the study to test the modified surface in a suitable animal model within the research association “Biofabrication for NIFE”. For the analysis of in vivo studies, proper evaluation methods are essential to quantify the bacterial load on the implant surface and to assess the morphological organization of the bacteria to differentiate between biofilm and planktonic bacteria. Up to now the simultaneous assessment of quantity and morphology of the bacterial load on the implant surface in vivo has not been described. The establishment of an in vivo rat model with a similar appearance than a human low-grade infection was established in a pilot study. The suitable route of infection and the inoculation concentration had to be determined to model the low-grade like symptoms. A quantification method for the bacterial colonisation on the implant surface in combination with the evaluation of the bacterial morphology was implemented. In the main study, a laser structured implant surface was tested for its capacity to reduce the implant associated infection. To establish the implant associated infection, cubic Ti90/Al6/V4-rods were implanted in the tibia of rats and infected intraoperatively with a bacterial suspension (103, 104, 105, 106 CFU/10 µl) of the Staphylococcus aureus strain 36/07. Bacterial pre- cultivated implants were used as an alternative onset of the infection. Score-based radiological and histological evaluation methods were used for the semiquantitative assessment of infection-related bone and tissue alterations after an examination period of three weeks. The bacterial load was assessed with confocal microscopic images of the implant surface after LIVE/DEAD staining. The quantification of the

138 8. Summary

vital bacterial biomass on the implant surface was performed with the Imaris® x64 software package using two different methods (volume and spot method) and combined with a scoring system, which displays the morphological characteristics of biofilm formation on the implant surface. A tendency towards increasing biofilm formation with decreasing infection concentration was observed in the quantity of the bacterial load and the morphologic evaluation. Radiographic and histologic analysis revealed an increased score and therefore more severe alterations of the bone structure with increasing infection concentrations. The injection of a bacterial suspension in the concentration of 103 CFU/10 µl was defined as the most suitable route of application and concentration to mimic low-grade infection like symptoms. Therefore, this concentration was used in the main study. For the quantification of the bacterial burden on the implant surface, the volume method was determined to be the most suitable method. In the main study, a laser structured implant surface with spike structures (approximately 5 µm) was tested, which should reduce the infectious burden on the implant surface. After an examination period of three weeks, the laser structured surface displayed a better integration into the bone and a higher eukaryotic cellular colonization compared to the reference structure. In contrast to the in vitro results, the bacterial load on the laser structured implant surface showed a higher bacterial load compared to the group with the reference structure. The infection related bone and tissue alterations showed more severe alterations in the group with the laser structured implants compared to the group with the reference implants. The results of this study underline the importance of the use of animal models in preclinical testing. The current laser structures are not suitable to reduce the infectious load on the implant surface. Because of the high cellular colonization and the strong integration of the implant into the bone, the laser structure can be a basis for further modifications, which target the antibacterial effect specifically.

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180 10. Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Infektionserreger von postoperativen Wundinfektionen in der Veterinärmedizin...... 11 Abbildung 2: Die fünf Phasen der Biofilmbildung...... 15 Abbildung 3: Überblick über den Ablauf der Versuche...... 34 Abbildung 4: Darstellung der Maße der verwendeten Implantate...... 41 Abbildung 5: Durchführung der Operation...... 48 Abbildung 6: Zeitlicher Verlauf eines Versuchsdurchganges...... 49 Abbildung 7: Quantifizierung des Gesamtlebendvolumens auf der Implantatoberfläche...... 60 Abbildung 8: Darstellung der Volumenanteile und der Formel für die Berechnung der vitalen bakteriellen Biomasse...... 61 Abbildung 9: Darstellung beider Ausschlussmethoden am Beispiel des Zellausschlusses...... 63 Abbildung 10: Darstellung des Score Schemas für die morphologische Bewertung der bakteriellen Besiedlung...... 65 Abbildung 11: Exemplarisch CLSM Aufnahme der Oberfläche des Referenzimplantates...... 69 Abbildung 12: Exemplarische Aufnahmen der Oberfläche des Referenzimplantates und des laserstrukturierten Implantates...... 70 Abbildung 13: Exemplarische CLSM Aufnahmen der vorbesiedelten Implantate vor und nach der Ablösung der Bakterien...... 71 Abbildung 14: Ergebnisse der täglichen Beurteilung der Gruppen der Pilotstudie. ... 74 Abbildung 15: Relatives tibiales Gewicht der Gruppen der Pilotstudie...... 75 Abbildung 16: CRP-Konzentration im Serum der Gruppen K, I106 und I103...... 76 Abbildung 17: Exemplarische Darstellung der mikrobiologischen Befunde der Pilotstudie...... 78 Abbildung 18: Ergebnisse der Quantifizierung der vitalen bakteriellen Besiedlung in der Pilotstudie...... 79 Abbildung 19: Ergebnisse der morphologischen Auswertung der bakteriellen Besiedlung in der Pilotstudie...... 81 Abbildung 20: Bakterielle Besiedlung auf Implantatoberflächen in der Pilotstudie. ... 82 Abbildung 21: Exemplarische REM Aufnahmen eines infizierten Tieres der Gruppe I103...... 83 Abbildung 22: Darstellung der Gesamtscores der radiologischen Auswertung in der Pilotstudie...... 84 Abbildung 23: Exemplarische radiologische Aufnahmen der Gruppen der Pilotstudie am Tag 21 post OP...... 86 Abbildung 24: Exemplarische µCT Aufnahmen von Tibia-Querschnitten der Pilotstudie...... 87

10. Abbildungsverzeichnis 181

Abbildung 25: Darstellung des Gesamtscores nach Auswertung der histopathologischen Veränderungen der Gruppen in der Pilotstudie. 88 Abbildung 26: Exemplarische Übersichtsaufnahmen von Tibia-Querschnitten der Pilotstudie in Toluidinblau...... 90 Abbildung 27: Exemplarische Aufnahmen des Implantatinterfaces von Tibia- Querschnitten der Pilotstudie in Hämatoxylin-Eosin...... 91 Abbildung 28: Exemplarische Aufnahmen des Cortex der Pilotstudie in Hämatoxylin- Eosin...... 92 Abbildung 29: Befunde der täglichen Beurteilung der Gruppen der Hauptstudie...... 96 Abbildung 30: Relatives tibiales Knochengewicht der Gruppen der Hauptstudie. .... 97 Abbildung 31: Ergebnisse der quantitativen und morphologischen Auswertung der bakteriellen und zellulären Besiedlung auf der Implantatoberfläche. 100 Abbildung 32: Exemplarische Darstellung der bakteriellen Besiedlung auf den Implantatoberflächen in der Hauptstudie...... 101 Abbildung 33: Exemplarische REM Aufnahmen der Gruppen der Hauptstudie...... 103 Abbildung 34: Darstellung des Gesamtscores der radiologischen Auswertung der Hauptstudie...... 104 Abbildung 35: Exemplarische radiologische Aufnahmen der Hauptstudie am Tag 21 post OP...... 106 Abbildung 36: Exemplarische µCT Aufnahmen der Gruppen der Hauptstudie...... 107 Abbildung 37: Darstellung der histopathologischen Veränderungen in der Hauptstudie...... 109 Abbildung 38: Exemplarische Aufnahmen der histopathologischen Veränderungen in der Hauptstudie in Toluidinblau und Hämatoxylin-Eosin gefärbten Tibia-Querschnitten...... 110

182 11. Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Übersicht über die verwendeten Geräte und Programme...... 35 Tabelle 2: Übersicht über die verwendeten Medikamente...... 37 Tabelle 3: Übersicht über die verwendeten Verbrauchsmaterialien...... 37 Tabelle 4: Antibiogramm des Versuchskeims Staphylococcus aureus 36/07...... 42 Tabelle 5: Ziel-OD600 und korrespondierende Bakterienkonzentrationen der Injektionssuspensionen...... 44 Tabelle 6: Gruppenzusammensetzung in der Pilotstudie...... 46 Tabelle 7: Gruppenzusammensetzung in der Hauptstudie...... 46 Tabelle 8: Score Schema für die tägliche Kontrolle...... 49 Tabelle 9: Zusammenfassung der Probenentnahmen und Messparameter in der Pilot- und Hauptstudie...... 52 Tabelle 10: Protokoll für die Einbettung in Paraffin...... 55 Tabelle 11: Protokoll für die Hämatoxylin-Eosin Färbung...... 56 Tabelle 12: Protokoll für die Toluidinblau Färbung...... 57 Tabelle 13: Score Schema für die Auswertung der radiologischen Aufnahmen...... 58 Tabelle 14: Score Schema für die morphologische Beurteilung der bakteriellen Besiedlung...... 64 Tabelle 15: Score Schema für die Bewertung der histopathologischen Veränderungen...... 67 Tabelle 16: Ergebnisse der KBE-Bestimmung in der Pilotstudie...... 71 Tabelle 17: Tabellarische Darstellung der operierten und ausgewerteten Tierzahlen in der Pilotstudie...... 72 Tabelle 18: Ergebnisse der mikrobiellen Untersuchung der Pilotstudie...... 77 Tabelle 19: Volumen der vitalen bakteriellen Biomasse auf der Implantatoberfläche nach Bestimmung mit der Volumen- und Spot-Methode...... 79 Tabelle 20: Gesamtscore der radiologischen Auswertung in der Pilotstudie...... 84 Tabelle 21: Zusammenfassung der operierten und ausgewerteten Tiere in der Hauptstudie...... 94 Tabelle 22: Ergebnisse der mikrobiologischen Abstriche in der Hauptstudie...... 98 Tabelle 23: Gesamtscore der radiologischen Auswertung in der Hauptstudie...... 104 Tabelle 24: Detaillierte Darstellung des Scores für die radiologische Auswertung. 184 Tabelle 25: Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Pilotstudie...... 188 Tabelle 26: Einzelscores der Beurteilung der radiologischen Veränderungen in der Pilotstudie...... 193 Tabelle 27: Einzelscores der Beurteilung der histologischen Veränderungen in der Pilotstudie...... 195 Tabelle 28: Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Hauptstudie. ... 196

11. Tabellenverzeichnis 183

Tabelle 29: Einzelscores der Beurteilung der radiologischen Veränderungen in der Hauptstudie...... 200 Tabelle 30: Einzelscores der Beurteilung der histologischen Veränderungen in der Hauptstudie...... 201

184 12. Anhang

Anhang

12.1. Detaillierte Darstellung des Bewertungssystems für die radiologische Auswertung

Tabelle 24: Detaillierte Darstellung des Scores für die radiologische Auswertung.

12. Anhang 185

186 12. Anhang

12. Anhang 187

188 12. Anhang

12.2. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Pilotstudie

Tabelle 25: Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Pilotstudie. Die Einzelscores sind dargestellt als Median (Minimum/Maximum). Die Kategorien sind wie folgt abgekürzt: %KGW- prozentuales Körpergewicht, Temp.- Körperoberflächentemperatur, LH- Lahmheit,

SIS- Schwellung der Implantationsstelle.

ontrolle

Gruppe K VB12 I106 I105 I104 I103

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

(34,4/35,5)

(0/0)

0 (100/100) 100 35,1 (0/0) 0 (0/0) 0 (100/100) 100 (35,1/35,9) 35,3 (0/0) 0 (0/0) 0 (100/100) 100 (34,8/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 (100/100) 100 (34,5/35,5) 34,9 (0/0) 0 (0/0) 0 (100/100) 100 (35,2/35,7) 35,4 (0/0) 0 (0/0) 0 (100/100) 100 (34,9/35,5) 35,2 (0/0) 0 0

(34,8/36,1)

(0/1)

1 (95,2/99,7) 98,3 (35,2/35,6) 35,3 0 (1/2) 1,3 (96,3/105,4) 98,6 (35,1/35,8) 35,3 (0/2) 0 (0/2,5) 1 (97,2/102,8) 99,7 (34,4/35,6) 35,4 (0/1) 0 (0/1) 0 (95,9/101) 99,4 (34,6/35,5) 35,2 (0/0) 0 (1/2) 1 (96,3/100) 98,2 (35,3/35,9) 35,5 (0,5/1,5) 0,8 (1/1,5) 1 (95,9/101,1) 98,8 35,5 (0,5/1) 0,8 (1/2) 1,5

(92,6/99,8) (92,8/101,1)

2 96,3 (35/35,9) 35,4 (0/0,5) 0 (1/1,5) 1 (94,6/102,6) 96 (34,3/35,8) 35,5 (0/1) 0 (0/1,5) 1 (89,9/101,3) 97,3 (34,6/35,5) 35,2 (0/2) 0 (0/1) 0,5 (95,6/103) 99,1 (35/35,3) 35,2 (0/0) 0 (1/2) 1 (95,5/98,4) 97,1 (35,2/35,6) 35,5 (0,5/1) 0,5 (1/2) 1 97,3 (35,2/35,8) 35,6 (0/1) 0,3 (0,5/1) 1

3 (93,8/100,3) 97,1 (35,3/36) 35,5 (0/0,5) 0 (0/1) 1 (93,6/105,4) 95,5 (34,2/35,5) 34,7 (0/0,5) 0 (0/1) 1 (94/101,5) 98,6 (34,8/35,5) 35,3 (0/2,5) 0 (0,5/1) 0,5 (94,9/103,3) 99,7 (34,9/35,6) 35,3 (0/0) 0 (1/1,5) 1,5 (95,4/100) 97,5 (35,1/35,7) 35,4 (0/0,5) 0 (0,5/1) 1 (94,6/100,8) 97,2 (35,4/35,8) 35,5 (0/0,5) 0,3 (0,5/1) 0,8

(95,9/99,7)

4 (91,8/99,7) 98,4 (35,1/35,8) 35,2 (0/0,5) 0 (0,5/1) 1 (93,4/103,4) 94,1 (34/35,9) 35,1 (0/0,5) 0 (0,5/1) 1 (94/101,3) 98,1 (34,3/35,4) 35,2 (0/2,5) 0 (0/1) 0,8 (95,6/103,7) 98,7 (34,2/35,6) 35,2 (0/0) 0 (1/1,5) 1 97,5 (35,3/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0,5/2) 0,5 (94,2/100,5) 97,7 (35/35,9) 35,4 (0/0,5) 0 (0/0,5) 0,5

12. Anhang 189

ontrolle

Gruppe

K VB12 I106 I105 I104 I103

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

(34,5/35,7)

5 (93/100,9) 97,9 35,3 (0/0,5) 0 (0,5/1) 1 (92,4/103,2) 94,1 (34,3/35,4) 34,9 (0/0) 0 (0/1,5) 1 (91,7/101,3) 98,1 (34,6/35,4) 35 (0/2,5) 0 (0/1) 1 (97,9/101,7) 99,4 (34,2/35,6) 35,2 (0/0) 0 (0,5/2) 1 (96/99,7) 97,2 (35,5/35,7) 35,6 (0/0) 0 (0,5/2) 1 (94,4/101,4) 98,1 (35/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0/0,5) 0,3

(94,2/101,6)

1 (94,4/102,2) 1

6 97,7 (34,3/35,5) 35 (0/0) 0 (0/1) 1 (93,1/102,9) 94,6 (34,1/35,6) 34,9 (0/0) 0 (0/2) 1 (92,9/101,3) 97,6 (34,5/35,5) 35,3 (0/2,5) 0 (0/1) 1 101,3(98,1/104,3) (34,2/35,3) 35 (0/1) 0 (0,5/1) 1 (96/100,3) 97,4 (35,3/35,7) 35,6 (0/0) 0 (0/1,5) 0,8 98, (35,2/35,9) 35,6 (0/0) 0 (0/1) 0,3

(0/1)

7 (91,9/102,8) 98,7 (34,2/35,8) 35,3 (0/0) 0 (0/1) 1 (91,9/103,2) 94 (34,5/35,7) 35 (0/0) 0 (0/2) 1 (92,6/100,5) 98,5 (34,7/35,9) 35,4 (0/2,5) 0 (0/1) 1 (100,3/104,7) 101 (34,7/35,5) 35,1 (0/0) 0 (0,5/1) 1 (95,4/100) 97,9 (35,4/35,8) 35,4 (0/0) 0 0,8 (95/103,2) 98,3 (35/35,9) 35,8 (0/0) 0 (0/1) 0

(35,3/35,8)

8 (94,6/102,2) 98,5 (34,2/35,5) 35,1 (0/0) 0 (0/1) 0,5 (90,4/102,9) 92,3 (34,4/35,6) 34,9 (0/3) 0 (0/2) 1 (90,7/100,5) 97,7 (34,3/35,6) 34,9 (0/2,5) 0 (0,5/1) 1 100,9(95,6/105,3) (34,9/35,5) 35,3 (0/1,5) 0 (0,5/1) 1 (95,7/100,8) 98,6 35,6 (0/0) 0 (0/1) 0 (93,9/102,7) 99,7 (35,2/36,9) 35,6 (0/0) 0 (0/1) 0

(95,7/101,1)

9 (94,9/102,5) 99,8 (34,9/35,6) 35,4 (0/0) 0 (0/1) 0,5 (90,3/102,9) 90,8 (34,4/35,4) 34,6 (0/2) 0 (0/2) 1 (91/100,5) 97,8 (34,5/35,8) 34,9 (0/3) 0 (0,5/1) 0,8 101,3(95,9/104,7) (34,9/35,5) 35,3 (0/1,5) 0 (0,5/1) 0,5 99,3 (35,2/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0/0,5) 0 (94,1/104,1) 99 (35,1/35,9) 35,7 (0/0) 0 (0/2) 0

(0/1,5)

10 (95,7/105,1) 99,7 (34,9/35,6) 35,4 (0/0) 0 (0/1) 0,5 (91,1/102,9) 92,3 (34,6/35,6) 35,3 (0/2) 0 (0/2) 1,5 (90,7/100,5) 97,9 (34,4/35,5) 35,5 (0/2) 0 (0/0,5) 0,5 101,9(95,6/105,7) (35,1/35,6) 35,3 0 (0/1,5) 1 (96,6/100,8) 98,6 (35,4/35,7) 35,6 (0/0) 0 (0/0,5) 0 (94,4/103,5) 99,7 (35,2/35,7) 35,6 (0/0) 0 (0/2) 0,3

190 12. Anhang

ontrolle

Gruppe

K VB12 I106 I105 I104 I103

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

(35,1/35,8)

11 100,7(96,6/105,1) 35,4 (0/0) 0 (0/1) 0,3 (90,7/103,7) 92 (34,1/35,5) 35,2 (0/2) 0 (0/1,5) 1 (91,3/100,5) 97,8 (34,9/35,5) 35,4 (0/2) 0 (0/0,5) 0,3 103,2(96,2/104,8) (34,9/35,5) 35,4 (0/1) 0 (0/1) 0,5 (96,8/101) 99,4 (35,4/35,8) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 (95,3/104,1) 100 (35,1/35,9) 35,7 (0/0) 0 (0/2) 0

(96,8/106) (96,3/104,6)

12 101,3 (34,7/35,7) 35,4 (0/0) 0 (0/1) 0 (90,6/104) 93,1 (34,3/35,4) 35 (0/1) 0 (0/1,5) 1 (91,7/100,5) 97,4 (34,6/35,5) 35,4 (0/2) 0 (0/0) 0 103,9(97,2/108,3) (35,2/35,6) 35,4 (0/0,5) 0 (0/1) 0 (97,1/100,3) 99,2 (35,3/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 100,3 (35,5/35,9) 35,7 (0/0) 0 (0/2) 0

(0/0)

13 101,2(97/107,3) (35,4/35,7) 35,6 (0/0) 0 (0/1) 0 (89,5/104) 92,3 (34,2/35,5) 34,8 (0/1) 0 (0/1) 0,5 (92,6/100,8) 99 (34,5/35,6) 35,2 (0/1,5) 0 (0/0) 0 104,8(97,8/108,7) (34,6/35,5) 35,2 (0/1) 0 (0/1) 0 100,4(98/100,9) (35,4/35,7) 35,5 (0/0) 0 0 100,5(97/105,4) (35,2/35,8) 35,6 (0/0) 0 (0/1,5) 0

14 102,8(98,8/108,5) (35,1/35,7) 35,4 (0/0) 0 (0/1) 0 (90,8/103,7) 92,2 (34,1/35,8) 35,2 (0/3) 0 (0/3) 0 (92,9/101,1) 99,1 (34,3/35,5) 35,2 (0/1) 0 (0/0) 0 105,5(98,1/109,7) (34,7/35,8) 35,4 (0/1) 0 (0/1) 0 100,4(98,6/102) (35,3/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 100,5(97/105,1) (35/35,8) 35,6 (0/0) 0 (0/1) 0

(35,4/35,8)

15 101,6(97/107,3) (34,9/35,7) 35,4 (0/0) 0 (0/1) 0 (90,3/104,6) 92,1 (34,1/35,7) 34,4 (0/2,5) 0 (0/1) 0 (91,1/100,3) 97,4 (34,5/35,6) 35,2 (0/2) 0 (0/0) 0 104,2(100,3/108,7) (35/35,6) 35,2 (0/0) 0 (0/0) 0 (96,3/102,1) 99,7 35,6 (0/2) 0 (0/0) 0 100,7(96,8/105,4) (35,5/35,8) 35,7 (0/0) 0 (0/1) 0

12. Anhang 191

ontrolle

Gruppe

K VB12 I106 I105 I104 I103

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

(35/35,6)

16 102,1(98,1/108,5) 35,3 (0/0) 0 (0/,5) 0 (90,4/101,1) 92,3 (34,1/34,8) 34,4 (0/2,5) 0,3 (0/1,5) 0,5 (91,7/100) 98,1 (34/35,2) 34,8 (0/2) 0 (0/0) 0 105,7(102,9/109,3) (34,2/35,5) 34,9 (0/0) 0 (0/0) 0 (98,3/101,1) 99,7 (35,4/35,7) 35,6 (0/2) 0 (0/0) 0 101,4(97,3/105,7) (35,3/35,8) 35,6 (0/0) 0 (0/1) 0

(98,1/108,5)

17 102 (35,2/36,3) 35,5 (0/0) 0 (0/,5) 0 (90,2/100,9) 91,7 (34,1/35,4) 35 (0/2) 0 (0/1,5) 0,8 (91,7/100,3) 98 (34,5/35,3) 34,7 (0/2) 0 (0/0,5) 0 105,9(102,3/109,3) (35,3/35,7) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 100,3(97,9/101,6) (35,3/35,5) 35,5 (0/2) 0 (0/0) 0 101,3(97,2/105,9) (35,3/35,7) 35,5 (0/0) 0 (0/1) 0

(35,4/35,7)

18 102,9(97,6/110,8) (35,3/35,7) 35,5 (0/0) 0 (0/,5) 0 (89,9/101,7) 92,2 (34,6/35,6) 35,5 (0/2) 0,3 (0/1,5) 0,8 (92,3/101) 98,6 (34,3/35,7) 34,7 (0/1,5) 0 (0/0,5) 0 106,2(104,5/110) (35,3/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 101,7(98/102,8) 35,5 (0/1,5) 0 (0/0) 0 102,3(96,8/107,6) (35,1/35,8) 35,5 (0/0) 0 (0/0,5) 0

19 102,4(98,1/109,2) (35,1/35,6) 35,5 (0/0) 0 (0/,5) 0 (89,2/101,7) 92,6 (34,1/35,5) 35,3 (0/1,5) 0,3 (0/2) 1 (91,4/100,8) 98,1 (34,7/35,4) 35,1 (0/1,5) 0 (0/1) 0 107,9(103,9/111,7) (35,4/35,7) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 101,4(99/102,8) (35,4/35,7) 35,5 (0/1,5) 0 (0/0) 0 102,6(98/109,2) (35,1/35,8) 35,5 (0/0) 0 (0/0,5) 0

)

(0/0)

20 103,1(98,2/111,4) (34,9/35,8) 35,5 0 (0/,5) 0 (89,9/102) 94,3 (35,1/35,6) 35,4 (0/1,5) 0,3 (0/2) 1 (92,6/101,7) 98,2 (34,7/35,6) 35,3 (0/1,5) 0 (0/1) 0 (106,1/111,2) 109 (34,7/35,6) 35,4 (0/0) 0 (0/0) 0 101,7(99/103,4) (35,4/35,7) 35,6 (0/1) 0 (0/0) 0 102,1(99,5/109,2) (35,4/35,8 35,7 (0/0) 0 (0/0,5) 0

192 12. Anhang

ontrolle

Gruppe

K VB12 I106 I105 I104 I103

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

,2/108,4)

21 105,8(100,5/112,1) (34,9/35,6) 35,4 (0/0) 0 (0/,5) 0 (88,7/102,6) 94,3 (34,1/35,4) 34,9 (0/1,5) 0,3 (0,5/2) 1,5 100,7(95,8/120,6) (34,6/35,6) 35,4 (0/1,5) 0 (0/1) 0 (108/113,6) 109 (35/35,7) 35,5 (0/0) 0 (0/0) 0 100,6(99,7/104,3) (35,4/35,7) 35,6 (0/1) 0 (0/0) 0 103,6(100 (35,6/35,7) 35,7 (0/0) 0 (0/0) 0

12. Anhang 193

12.3. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der radiologischen Beurteilung der Pilotstudie

Tabelle 26: Einzelscores der Beurteilung der radiologischen Veränderungen in der Pilotstudie. Die Einzelscores sind dargestellt als Median (Minimum/Maximum). Tag 0 Tag 14 Tag 21 Gruppe ROI Periostale Periostale Periostale Osteolyse Osteolyse Osteolyse Reaktion Reaktion Reaktion Bohrloch 0 (0/0,3) 0 (0/0,3) 0 (0/0,3) 0 (0/0,7) 0 (0/1) 0 (0/0,7) Implantatsitz 0 (0/0,3) 0 (0/0) 0,2 (0/0,7) 0 (0/0,7) 0 (0/0,7) 0 (0/0,7) Bereich distales 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,7) 0 (0/0) 0 (0/0,7) Implantat Kontrolle subjektiver 0 (0/0,3) 0,2 (0/0,7) 0 (0/1) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0) Sequester 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0) 1,7 Bohrloch 0 (0/0) 0 (0/0) 1,3 (1/2,7) 2,2 (1,7/3) 2,7 (1,3/3) (1,3/2,7) 1,7 Implantatsitz 0 (0/0,3) 0 (0/0) 1,3 (1/2) 2,3 (1,3/3) 2,5 (1,7/3) (0,7/1,7) Bereich distales 1,7 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,7) 1 (0/1,3) 0,8 (0/3) VB12 Implantat (0,7/2,3) subjektiver 0 (0/0,3) 1,7 (1,3/3) 2 (1,7/3) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/1) 0,8 (0/1) Sequester 0 (0/0,7) 0 (0/0,7) 0 (0/0) 2,2 Bohrloch 0/0/0) 0/0/0) 1,2 (1/1,7) 1,2 (0,7/2) 1,8 (1,3/3) (1,3/2,7) 1,2 1,8 Implantatsitz 0/0/0) 0/0/0) 1 (0,7/1,7) 2 (1,7/3) (0,7/1,7) (1,7/2,7) Bereich distales 0,7 0/0/0) 0/0/0) 0 (0/0,3) 0,2 (0/2,3) 1,2 (0/2,7) I106 Implantat (0,3/1,3) subjektiver 0/0/0) 1 (0,7/2) 2,2 (1,3/3) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/1) Sequester 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,3) Bohrloch 0 (0/0) 0 (0/0) 1,7 (1,3/2) 1,7 (1,3/2) 1,8 (0,3/2) 1,7 (1/2) Implantatsitz 0 (0/0,3) 0 (0/0) 1,7 (1/1,7) 1,7 (0,7/2) 1,5 (1/2,3) 1,7 (1/2) Bereich distales 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,3) 1,7 (0/2) 0 (0/0,7) 1,7 (0/2) Implantat I105 subjektiver 0 (0/0) 2 (0,7/2) 1,8 (1,3/2) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/1) 0 (0/0,3) Sequester 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,3)

194 12. Anhang

Tag 0 Tag 14 Tag 21 Gruppe ROI Periostale Periostale Periostale Osteolyse Osteolyse Osteolyse Reaktion Reaktion Reaktion 1,5 Bohrloch 0 (0/0) 0 (0/0,3) 1,3 (1/2,3) 2 (1/2,7) 2 (1,3/2,7) (0,7/2,3) Implantatsitz 0 (0/0,3) 0 (0/0) 1,3 (0,7/2) 1,3 (0,3/2) 1,3 (1/2,7) 1,7 (1,3/3) Bereich distales 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,7) 1,2/0/2,3) 0 (0/2,3) 1,3 (0/3) I104 Implantat subjektiver 0 (0/0) 1,7 (1/2,3) 2 (1,7/3) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,3) Sequester 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0) 0,7 1,2 Bohrloch 0 (0/0) 0 (0/0,3) 1 (0,3/2) 1,3 (0,7/2) (0,3/1,7) (0,7/2,3) 0,8 0,7 Implantatsitz 0 (0/0) 0 (0/0) 1,7 (0,7/2) 1 (0,3/2) (0,3/1,3) (0,3/1,7) Bereich distales 0 (0/0) 0 (0/0,3) 0 (0/0,7) 0,7 (0/1,7) 0 (0/1,7) 1 (0/2,7) I103 Implantat subjektiver 0 (0/0) 0,8 (0,7/1,7) 1,3 (0,7/2,3) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0) Sequester 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,3)

12. Anhang 195

12.4. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der histologischen Beurteilung der Pilotstudie

Tabelle 27: Einzelscores der Beurteilung der histologischen Veränderungen in der Pilotstudie.

Die Einzelscores sind dargestellt als Median (Minimum/Maximum).

Gruppe

ontrolle

ROI K VB12 I106 I105 I104 I103

Gesamt eindruck (0/2) 0 (4/6) 6 (4/6) 6 (2/6) 4 (2/5) 4 (2/6) 3

PMN (0/2) 1 (4/6) 6 (3/6) 5 2,5 (0/4) (1/6) 4 (2/6) 2

Mikro abszesse (0/0) 0 (0/2) 0,5 (0/1) 0 (0/1) 0 (0/2) 0 (0/3) 0

Knochenmark Fibrose (0/2) 0 5(2/5) (4/6) 5 (2/5) 4 (2/5) 3 (0/6) 2,5

Destruktion (0/0) 0 (4/6) 6 (4/6) 6 (2/6) 4 (2/6) 4 (1/6) 3

PMN PMN und Osteoklasten (0/2) 0 (0/6) 3,5 (3/6) 6 (0/4) 4 (2/4) 3 (2/5) 2

(0/2)

Mikro abszesse (0/0) 0 (1/6) 4,5 (0/3) 0,5 (0/1) 0 (0/4) 2 0

Cortex Fibrose (0/0) 0 (4/6) 6 (4/6) 6 (0/5) 3 (2/6) 4 (0/6) 2

Periostale Reaktion (0/3) 1 (4/6) 5,5 (4/6) 4,5 (2/4) 4 (2/5) 4 (0/5) 3,5

196 12. Anhang

12.5. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Hauptstudie

Tabelle 28: Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Hauptstudie. Die Einzelscores sind dargestellt als Median (Minimum/Maximum). Die Kategorien sind wie folgt abgekürzt: %KGW- prozentuales Körpergewicht, Temp.- Körperoberflächentemperatur, LH- Lahmheit,

SIS- Schwellung der Implantationsstelle.

Gruppe Referenz struktur Laser struktur

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

0 (100/100) 100 (36,3/37,3) 36,7 (0/0) 0 (0/0) 0 (100/100) 100 (36,1/37,2) 36,5 (0/0) 0 (0/0) 0

1 (95,9/100,2) 98,1 (36,2/37,2) 36,6 (0/1) 0,5 (0/1,5) 1 (95,8/100,8) 98,4 (36/36,8) 36,5 (0/1) 0,5 (0/2) 1

2 (95,3/100) 97,1 (36,3/36,9) 36,5 (0/1) 0 (0/1) 0,5 (95,8/100) 97,8 (36/37,1) 36,5 (0/1) 0 (0/1,5) 1

(0/2)

3 (95,1/99,8) 97,9 (36/36,6) 36,5 (0/0) 0 0,5 (95,2/100,5) 98 (36,1/36,7) 36,4 (0/1) 0 (0/1) 0,5

4 (95,3/99,2) 97,5 (36,2/36,8) 36,5 (0/0) 0 (0/2) 0,5 (95/100) 98,5 (36,1/36,8) 36,5 (0/0,5) 0 (0/2) 0,5

12. Anhang 197

Gruppe Referenz struktur Laser struktur

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

5 (94,9/99,5) 98,2 (36,3/37) 36,5 (0/2) 0 (0/2) 0 (93,9/100,6) 98,7 (36,2/36,9) 36,3 (0/2) 0 (0/2) 0

6 (95,1/100) 98,3 (36/36,5) 36,3 (0/1) 0 (0/2) 0,5 (93,9/100,5) 98,7 (36/36,8) 36,4 (0/1) 0 (0/2) 0

(93,3/100,1)

7 (94,9/100,8) 98,1 (35,9/37) 36,3 (0/0) 0 (0/2) 0 98,7 (35,9/36,9) 36,3 (0/0) 0 (0/2,5) 0

8 (95,3/100,7) 97,8 (36/36,9) 36,4 (0/0) 0 (0/3) 0 (93,1/100,5) 98,3 (36/37) 36,4 (0/0) 0 (0/2) 0

9 (95,1/100,8) 98,6 (36/36,7) 36,3 (0/0) 0 (0/2) 0,5 (93,9/100,1) 99 (36/36,7) 36,3 (0/0) 0 (0/2) 0

10 (96/101,9) 98,6 (36/36,8) 36,3 (0/0) 0 (0/2) 0 (93,4/102,3) 99,2 (36/36,9) 36,2 (0/0) 0 (0/2) 0

198 12. Anhang

Gruppe Referenz struktur Laser struktur

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

11 (95,3/102,2) 98,7 (36/36,8) 36,4 (0/0) 0 (0/1) 0 (94,7/102,3) 99,2 (36/36,8) 36,2 (0/0) 0 (0/1,5) 0

12 (96/101,6) 98,7 (36/36,8) 36,2 (0/0) 0 (0/1) 0 (94,7/102,3) 100 (36,1/36,7) 36,2 (0/0) 0 (0/1,5) 0

13 (95,8/102,3) 99,7 (36/36,6) 36,3 (0/0) 0 (0/1) 0 100,5(94,7/102,8) (36/36,7) 36,4 (0/0) 0 (0/1,5) 0

(96,9/103,3)

14 100,5 (36/37) 36,4 (0/0) 0 (0/0,5) 0 100,3(94,2/103,4) (36/37) 36,5 (0/0) 0 (0/1) 0

15 (96,2/102,7) 99,7 (36/36,6) 36,3 (0/0) 0 (0/0,5) 0 100,3(94,4/102,8) (36/36,9) 36,5 (0/0) 0 (0/0,5) 0

(95,5/104,3)

16 (96/103,5) 100 (36/36,7) 36,3 (0/0) 0 (0/0,5) 0 100 (36/36,9) 36,3 (0/0) 0 (0/0,5) 0

12. Anhang 199

Gruppe Referenz struktur Laser struktur

Kat.

Tag %KGW Temp. LH SIS %KGW Temp. LH SIS

17 100,3(96,9/102,9) (36/36,8) 36,3 (0/0) 0 (0/0,5) 0 (95,2/104,5) 101 (35,8/37,1) 36,2 (0/0) 0 (0/0,5) 0

(96,9/102,7)

18 100,8 (36,2/36,7) 36,3 (0/0) 0 (0/0,5) 0 100,3(95,5/104,7) (36/36,7) 36,2 (0/0) 0 (0/0,5) 0

19 100,8(97,3/104,6) (35,9/36,7) 36,2 (0/0) 0 (0/1) 0 100,8(95,2/104,5) (36/36,6) 36,3 (0/0) 0 (0/0,5) 0

20 100,8(97,3/104,9) (35,9/36,8) 36,2 (0/0) 0 (0/1) 0 100,5(95,9/105,6) (35,9/36,8) 36,2 (0/0) 0 (0/0,5) 0

21 (97,8/105,7) 102 (36/36,9) 36,4 (0/0) 0 (0/0,5) 0 (94,9/105,8) 101 (35,9/37,1) 36,3 (0/0) 0 (0/0,5) 0

200 12. Anhang

12.6. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der radiologischen Beurteilung der Hauptstudie

Tabelle 29: Einzelscores der Beurteilung der radiologischen Veränderungen in der Hauptstudie. Die Einzelscores sind dargestellt als Median (Minimum/Maximum). Gruppe ROI Tag 0 Tag 14 Tag 21 Periostale Osteolyse Periostale Osteolyse Periostale Osteolyse Reaktion Reaktion Reaktion Referenz- Bohrloch 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,7) 0,7 (0/1,3) 0 (0/1) 1 (0,3/1,7) struktur Implantatsitz 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/1) 0,3 (0/1,7) 1 (0,3/2,3) 0,7 (0,3/2,3) Bereich distales 0 (0/0) 0 (0/0,3) 0 (0/1) 0,3 (0/1,7) 0 (0/2,3) 0,7 (0/2,7) Implantat subjektiver 0 (0/0) 0,3 (0/1) 1 (0,3/2,3) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,7) Sequester 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0) Laser- Bohrloch 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0,3) 0,7 (0/1) 0,7 (0/1) 0,7 (0/1,3) struktur Implantatsitz 0 (0/0) 0 (0/0) 0,3 (0/1) 0,7 (0/1,3) 1 (0/2,3) 1,3 (0/2) Bereich distales 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/1) 1 (0/1,3) 0 (0/2) 1 (0/2) Implantat subjektiver 0 (0/0) 1 (0/1,3) 1,3 (0/2) Gesamteindruck Fraktur 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/0) Sequester 0 (0/0) 0 (0/0) 0 (0/1)

12. Anhang 201

12.7. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der histologischen Beurteilung der Hauptstudie

Tabelle 30: Einzelscores der Beurteilung der histologischen Veränderungen in der Hauptstudie.

Die Einzelscores sind dargestellt als Median (Minimum/Maximum).

Gruppe

struktur

ROI Referenz struktur Laser

Gesamt eindruck (2/6) 2 (2/6) 3

PMN 2 (1/6) 2 (2/5)

Mikro abszesse (0/2) 0 (0/2) 0

Knochenmark Fibrose (0/4) 2 (0/5) 3,5

Destruktion (2/6) 2 (2/6) 3

PMN PMN und Osteoklasten (0/4) 1 (1/4) 2

Mikro abszesse (0/0) 0 (0/2) 0

Cortex Fibrose (0/6) 2 (2/6) 3

Periostale Reaktion (1/6) 2 (2/5) 2

202 12. Anhang

12.8. Veröffentlichungen

Teile der Ergebnisse aus dieser Arbeit wurden auf nationalen und internationalen Fachkongressen präsentiert:

• European Bone and Joint Infection Society (EBJIS), 2017 Annual Meeting 07.- 09.09.2017; Nantes, Vortrag „Establishment of an implant-associated osteomyelitis rat model to test micro-structured antibacterial implant surfaces” Schröder, M.-L., Windhagen, H., Calließ, T., Angrisani, N., Reifenrath, J.

• 2nd International Symposium of BIOFABRICATION for NIFE, 31.08- 01.09.2017, Hannover, Poster „An in vivo rat model for the evaluation of laser-structured antibacterial implant surfaces” Schröder, M.-L., Angrisani, N., Fadeeva, E., Hegermann, J., Calließ, T., Windhagen, H., Reifenrath, J.

• 55. Wissenschaftliche Tagung der Gesellschaft für Versuchstierkunde GV- Solas und 17. Fortbildungsveranstaltung der IGTP, 11.- 13.09.2017, Köln, Poster „Etablierung einer Auswertungsmethodik für die Beurteilung Implantat- assoziierter Infektionen im Rattenmodell“ Schröder, M.-L., Angrisani, N., Reifenrath, J.

13. Danksagung 203

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meiner Doktormutter PD Dr. Janin Reifenrath für die Möglichkeit dieses Projekt von Beginn an begleiten und so selbstständig bearbeiten zu dürfen. Ein herzliches Dankeschön geht auch an Dr. Nina Angrisani. Ich danke euch beiden für eure fortwährende Unterstützung im gesamten Zeitraum der Dissertation und für die vielen guten Anmerkungen, Vorschlägen und Korrekturvorschläge.

Des Weiteren möchte ich mich bei „Biofabrication for NIFE“ für die finanzielle Unterstützung bedanken.

Mein Dank geht außerdem an unsere technischen Assistenten Maike, Mattias und Diana. Vielen Dank für die Hilfe und Unterstützung bei der Durchführung und Färbung der Histologie, auch wenn ich weiß, dass ihr das ein oder andere heftig geflucht habt. Ich danke Mattias sehr für die Hilfe am CLSM. Diana danke ich besonders für die Arbeiten im S2-Bereich, für das fortwährend offene Ohr und die Bereitschaft immer etwas Neues lernen zu wollen. Vielen Dank, dass du immer da warst, wenn Not am Mann (oder der Frau) war!

Ich möchte mich außerdem bei allen Mitgliedern der Zahnärztlichen Prothetik und des Werkstoffprüflabors bedanken, die mir immer geholfen haben und meine Fragen stets geduldig beantwortet haben. Ich habe mich bei euch stets sehr gut aufgenommen gefühlt.

Ich danke Dr. Elena Faadeva vielmals für die schnelle Strukturierung der Implantate und die Bereitschaft, immer und schnell zu helfen, wenn es Fragen zu klären gab.

Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. Bleich des Institutes für Versuchstierkunde und Zentralem Tierlabor für die Überlassung des Staphylococcus aureus Stamm 36/07. Außerdem danke ich Nadine Held für die tolle Zusammenarbeit und das offene Ohr und das stetige Bemühen uns zu helfen und unsere Wünsche zu erfüllen. Mein Dank geht außerdem an das Kleintierbildgebungszentrum des ZTLs für das Anfertigen der fluroskopischen Aufnahmen und besonders an Dr. Stefan Lienenklaus, der trotz des nie eingehaltenen Zeitplanes immer entspannt blieb und in harten Zeiten auch Schokolade zur Verfügung stellte.

Ich danke weiterhin Dr. Jan Hegermann aus der „Zentrale Forschungseinrichtung Elektronenmikroskopie“ der MHH für das Anfertigen der schönen REM Aufnahmen.

204 13. Danksagung

Ein herzlicher Dank geht ebenfalls an Lena und Patrick, die mich bei der Betreuung meiner Tiere stets verlässlich unterstützt haben und mir dadurch ein paar freie Wochenenden ermöglicht haben. Vielen lieben Dank auch für die tolle Unterstützung bei den OPs und Euthanasien. Ohne euch wäre das sehr schwierig geworden! Danke Patrick, dass du immer wusstest, welche Musik gerade am besten passt! ☺

Vielen Dank Philip für deine Unterstützung, dein Verständnis für die vielen Wochenenddienste und die Hilfe bei der Korrektur der vielen Rechtschreibfehler und fehlenden Worte.

Mein herzliches Dankeschön gilt den anderen drei Mükenruskeln für das Aufheitern, die geteilte Schoki oder das Eis in harten Zeiten. Vielen Dank dafür, dass ihr immer ein offenes Ohr für mich hattet, egal um welches Thema es sich drehte! Ihr seid die Besten und ich bin sehr froh darüber, euch an meiner Seite gehabt zu haben. Etwas Besseres hätte mir kaum passieren können! Vielen Dank liebe Hilke, dass du stoisch mein „Computer-Tourette“ ertragen hast und mir immer helfend zur Seite gestanden hast, wenn Not an der Frau war. Ich finde unser Therapiekonzept ganz toll, auch wenn es nur langsam anzuschlagen scheint. ☺ Auch wenn die Musikwahl im OP nicht immer deinem Geschmack entsprach, konnten wir uns am Ende ja ganz gut arrangieren. Ich sag nur „Ein Schritt links,……“ ☺ Vielen Dank liebe Eva, dass auch du dir immer Zeit für mich genommen hast und mir immer versucht hast, meine vielen Fragen zu beantworten. Durch deine kritische Beurteilung und deine Einwände haben viele Sachen super funktioniert! Auch wenn es noch ein bisschen dauern wird und ich extra dafür nach Hannover kommen muss, verspreche ich dir, dass ich es auch mal zu „Benni´s Training“ schaffen werde (es sei denn, es regnet. Oder es ist kalt….). ☺ Liebe Katharina, ein herzliches Dankeschön (mit riesengroßem Herz) geht an dich. Vielen lieben Dank für dein immer währendes offenes Ohr für meine anfänglich und auch später sehr vielen Fragen, deine tollen Korrekturvorschläge und die Zeit die du dir immer genommen hast. Zum Ballett Training schaffe ich es auch nochmal!

Auch meinen Eltern und insbesondere meiner Mutter gilt mein herzlicher Dank für die immerwährende und nie abreißende Unterstützung und Geduld. Ohne dich und deine emanzipierte Erziehung, liebe Mutti, wäre ich heute die, die ich bin. Ich kann dir niemals genug dafür danken, dass du immer für mich da bist und mich immer ohne Einschränkungen unterstützt. Deine Unterstützung und Liebe hat mir viel Kraft und Motivation bei der Anfertigung dieser Arbeit geschenkt.