Tierärztliche Hochschule Hannover Untersuchung modifizierter Implantatoberflächen für den orthopädischen Einsatz zur Reduzierung implantatassoziierter Infektionen im Rattenmodell INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae - (Dr. med. vet.) vorgelegt von Marie-Luise Schröder aus Neustrelitz Hannover 2018 Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. Janin Reifenrath, Klinik für Kleintiere, Tierärztliche Hochschule Hannover Orthopädische Klinik mit Sitz im NIFE, Medizinische Hochschule Hannover 1. Gutachterin/Gutachter: PD Dr. med. vet. Janin Reifenrath 2. Gutachterin/Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Peter Stadler Tag der mündlichen Prüfung: 30.10.2018 Diese Dissertation wurde im Rahmen des Verbundprojektes Biofabrication for NIFE angefertigt und durch die Volkswagenstiftung und das Niedersächsische Ministerium für Wissenschaft und Kultur gefördert. Für meine Mutter, die immer hinter mir steht. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 3.1. Einteilung und Diagnose von orthopädischen Implantatinfektionen ........... 6 3.2. Epidemiologie von Implantatinfektionen .................................................... 8 3.3. Erregerspektrum ...................................................................................... 10 3.4. Entstehung einer Implantatinfektion ......................................................... 12 3.4.1. Die Bildung von Biofilm auf der Implantatoberfläche ............................... 12 3.4.2. Resistenzmechanismen planktonischer und sessiler Bakterien............... 15 3.5. Histopathologische Reaktion des Gewebes auf eine Infektion ................ 17 3.5.1. Immun- und Fremdkörperreaktion auf ein steriles Implantat .................... 17 3.5.2. Immunantwort bei einer bakteriellen Infektion.......................................... 18 3.6. Therapiestrategien von Implantatinfektionen ........................................... 20 3.7. Innovative Oberflächenmodifikationen für die Reduktion von implantatassoziierten Infektionen ............................................................. 21 3.7.1. Antibakterielle Oberflächenmodifikationen ............................................... 21 3.7.2. Multifunktionale und „smarte“ Beschichtungen ........................................ 23 3.7.3. Antiadhäsive Oberflächenmodifikationen ................................................. 23 3.8. Tiermodelle für die Evaluation neuer Strategien zur Prophylaxe und Therapie von Implantatinfektionen ........................................................... 27 3.8.1. Bestimmung der Infektionslast im Tiermodel ........................................... 31 3.9. Ziel der Arbeit .......................................................................................... 33 4.1. Überblick über den Versuchsaufbau ........................................................ 34 4.2. Geräte, Programme, Medikamente und Verbrauchsmaterialien .............. 35 4.3. In vitro Versuche ...................................................................................... 40 4.3.1. Herstellung und Charakterisierung der Implantate ................................... 40 4.3.2. Infektionserreger ...................................................................................... 42 4.3.3. Ansatz der Bakteriensuspension ............................................................. 43 4.3.4. Vorbesiedlung der Implantate .................................................................. 44 4.4. In vivo Versuche ...................................................................................... 45 4.4.1. Versuchstiere ........................................................................................... 45 4.4.2. Gruppenaufteilung der Pilot- und Hauptstudie ......................................... 45 4.4.3. Durchführung der Operation .................................................................... 46 4.4.4. Postoperativer Verlauf ............................................................................. 48 I Inhaltsverzeichnis 4.4.5. Euthanasie und Probenentnahme ........................................................... 50 4.4.6. Nachweis des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein ........................ 52 4.4.7. Mikrocomputertomographische Aufnahmen der Tibiae ........................... 53 4.4.8. Durchführung der konfokalmikroskopischen Aufnahmen ......................... 54 4.4.9. Durchführung der rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen ............ 54 4.4.10. Aufbereitung der Proben für die Histologie .............................................. 55 4.4.11. Herstellung und Färbung der histologischen Schnitte .............................. 55 4.4.12. Auswertung der Röntgenaufnahmen ....................................................... 57 4.4.13. Quantifizierung und morphologische Beurteilung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche ................................................................................. 58 4.4.14. Auswertung der histologischen Schnitte .................................................. 66 4.5. Statistik .................................................................................................... 68 5.1. Charakterisierung der verwendeten Implantate ....................................... 69 5.2. Pilotstudie ................................................................................................ 70 5.2.1. Konzentration der Injektionslösung und der Inkubationssuspension für die vorbesiedelten Implantate ........................................................................ 70 5.2.2. Tierverluste .............................................................................................. 72 5.2.3. Befunde der täglichen Beurteilung ........................................................... 72 5.2.4. Relatives tibiales Gewicht der Tibiae ....................................................... 75 5.2.5. Bestimmung der CRP-Konzentration im Serum ....................................... 75 5.2.6. Ergebnisse der mikrobiologischen Evaluation ......................................... 76 5.2.7. Ergebnisse der CLSM Evaluation ............................................................ 78 5.2.8. REM Aufnahmen der infizierten explantierten Implantate ........................ 83 5.2.9. Ergebnisse der radiologischen Beurteilung ............................................. 83 5.2.10. Microcomputertomographische Untersuchung der Tibiae ....................... 87 5.2.11. Ergebnisse der histopathologischen Auswertung .................................... 88 5.2.12. Zusammenfassung der Ergebnisse der Pilotstudie .................................. 93 5.3. Hauptstudie.............................................................................................. 94 5.3.1. Konzentration der Bakteriensuspension und Tierverluste ........................ 94 5.3.2. Befunde der täglichen Beurteilung ........................................................... 94 5.3.3. Relatives tibiales Gewicht ........................................................................ 97 5.3.4. Ergebnisse der mikrobiologischen Evaluation ......................................... 97 5.3.5. Quantifizierung und morphologische Beurteilung der Besiedlung auf der Implantatoberfläche ................................................................................. 98 5.3.6. Beurteilung der exemplarischen REM Aufnahmen ................................ 102 5.3.7. Ergebnisse der radiologischen Beurteilung ........................................... 104 5.3.8. Mikrocomputertomographischen Untersuchung der Tibiae ................... 106 II Inhaltsverzeichnis 5.3.9. Ergebnisse der histologischen Beurteilung ............................................ 107 5.3.10. Zusammenfassung der Ergebnisse der Hauptstudie ............................. 111 6.1. Etablierung eines Tiermodells zur Abbildung einer low-grade ähnlichen implantatassoziierten Infektion ............................................................... 112 6.1.1. Tiermodell und verwendete Infektionskonzentrationen .......................... 113 6.1.2. Beurteilung infektionsbedingter Veränderungen .................................... 117 6.2. Implementierung einer Quantifizierungsmethode für die bakterielle Besiedlung auf der Implantatoberfläche in vivo ..................................... 122 6.2.1. Bestimmung der vitalen bakteriellen Biomasse mit der Software Imaris® x64 ......................................................................................................... 123 6.2.2. Bakterielle Besiedlung der Implantatoberfläche in der Pilotstudie ......... 126 6.3. Untersuchung der laserstrukturierten Spikeoberfläche im low-grade ähnlichen Tiermodell .............................................................................. 129 6.3.1. Bakterielle und zelluläre Besiedlung der Implantatoberflächen.............. 130 6.3.2. Beurteilung infektionsbedingter Parameter ............................................ 132 12.1. Detaillierte Darstellung des Bewertungssystems für die radiologische Auswertung ............................................................................................ 184 12.2. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der Befunde der täglichen Kontrolle in der Pilotstudie .................................................................................... 188 12.3. Übersichtstabelle über die Ergebnisse der radiologischen Beurteilung der Pilotstudie .............................................................................................. 193 12.4. Übersichtstabelle über