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Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Región Veracruz

Maestría en Ciencia Animal

EVALUACIÓN MOLECULAR DE Amblyomma mixtum COMO POTENCIAL VECTOR DE Anaplasma marginale, Rickettsia spp Y Ehrlichia sp DE BOVINOS DE ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ.

Tesis para obtener el grado de Maestra en Ciencia Animal

Presenta: MVZ. Carolina Cárdenas Amaya

Directora y Tutora: Dra. Dora Romero Salas

Director Externo: Dr. Adalberto A. Pérez de León

Asesora: Dra. Mariel Aguilar Domínguez

Junio de 2021

“Lis de Veracruz: Arte, Ciencia, Luz”

Pág. 2 Universidad Veracruzana Tesis Carolina Cárdenas Amaya

Universidad Veracruzana Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Región Veracruz

Maestría en Ciencia Animal

EVALUACIÓN MOLECULAR DE Amblyomma mixtum COMO POTENCIAL VECTOR DE Anaplasma marginale, Rickettsia spp Y Ehrlichia sp DE BOVINOS DE ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ.

Tesis para obtener el grado de Maestra en Ciencia Animal

Presenta: MVZ. Carolina Cárdenas Amaya

Directora y Tutora: Dra. Dora Romero Salas

Director Externo: Dr. Adalberto A. Pérez de León

Asesora: Dra. Mariel Aguilar Domínguez

Universidad Veracruzana Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Coordinación de Maestría en Ciencia Animal

H. Veracruz, Ver., a 28 de Junio de 2021

ASUNTO: Aprobación de Tesis De Maestría

MVZ. CAROLINA CÁRDENAS AMAYA P R E S E N T E

Por este conducto se le comunica que su tesis de Maestría en Ciencia Animal

intitulada: Miguel Ángel de Quevedo s/n esq. Yáñez “Evaluación molecular de Amblyomma mixtum como potencial Col. Unidad Veracruzana C.P. 91710 vector de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp de Veracruz Veracruz, México bovinos de zona centro del estado de Veracruz”

Teléfonos +52 229 934 2075 Fue aprobada en su totalidad en cuanto a formato y calidad del contenido a +52 229 934 4053 satisfacción del Jurado de examen, por lo que está Usted autorizado a EDITAR la +52 229 178 0044 presentación definitiva del trabajo. Ext. 24125 Fax 24104 Atentamente El H. Jurado www.uv.mx/veracruz/fmvz

Correo Electrónico: [email protected] Dr. Argel Flores Primo Dr. David Itzcóatl Martínez Herrera Coordinador de la Maestría en Presidente Ciencia Animal

Dra. Anabel Cruz Romero Secretaria

Dr. Miguel Ángel Alonso Díaz Vocal

Dra. Karla María López Hernández Suplente

c.c.p. MVZ Fabián Francisco Vanoye Lara.- Secretario de la Facultad - Archivo AFP/mac* I

Hoja de declaratoria de originalidad

“El presente trabajo no ha sido aceptado o empleado para el otorgamiento de título o grado diferente o adicional al actual. La tesis es resultado de las investigaciones del autor, excepto donde se indican las fuentes de información consultadas. El autor otorga su consentimiento a la Universidad Veracruzana para la reproducción del documento con el fin del intercambio bibliotecario siempre y cuando se indique la fuente”.

“El autor de esta tesis recibió durante el periodo agosto 2019 a julio 2021, el beneficio de la beca número 999006 otorgada por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT)”.

III

Hoja de reconocimientos institucionales

A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana.

Al Laboratorio de Parasitología, Rancho “Torreón del Molino”, de Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana.

Al Centro de Medicina Tropical, Unidad de Investigación en Medicina Experimental, Facultad de Medicina, de la Universidad Nacional Autónoma de México.

Al Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en Ganadería Tropical (CEIEGT) “El Clarín”, Universidad Nacional Autónoma de México.

A la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad Autónoma de Querétaro.

A San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service.

Dedicatoria

El presente trabajo está dedicado a:

MIS PADRES. Por su apoyo incondicional, esfuerzo, por inculcarme las ganas de querer seguir superándome; así también, por los sacrificios que hicieron para que lograra concluir una etapa más en mi vida, por lo cual les estaré eternamente agradecida.

A MIS HERMANAS. Por sus palabras de apoyo, aliento y ánimos que aún en la distancia se sienten cerca, gracias por todo, las amo.

A MI TÍA GUADALUPE AMAYA. Por abrirme las puertas de su casa y brindarme su apoyo incondicional, así como por ser una hermana mayor para mí. La quiero mucho.

A LA DRA. DORA ROMERO SALAS. Por apoyarme en todo momento, en la buenas y en las malas; así como alentarme en cada momento a seguir superándome, siempre estando ahí para apoyarme. Gracias por la confianza y fe depositada en mí.

Agradecimientos

AL DR. ADALBERTO A. PÉREZ DE LEÓN, LA DRA. MARIEL AGUILAR DOMÍNGUEZ, LA DRA. ANABEL CRUZ ROMERO Y AL DR. DAVID I. MARTÍNEZ HERRERA.

Por aceptar formar parte de este proyecto, por ayudarme a lo largo de estos dos años, así como por su asesoramiento, por las críticas constructivas; también por guiarme e introducirme por el camino de la investigación y hacer crecer en mí el deseo de continuar desarrollándome, les estoy muy agradecida.

A MIS AMIGOS Y COMPAÑEROS DE LABORATORIO.

Por siempre mostrar su apoyo incondicional, así como las incontables tardes de trabajo en el laboratorio destinadas a concluir nuestros trabajos, siempre procurando apoyarnos mutuamente.

AL DR. DANIEL SOKANI SANCHES MONTES Y AL DR. MIGUEL ALONSO DÍAZ.

Por abrirme las puertas de sus respectivas instituciones con la finalidad de apoyarme en la culminación de esta investigación, por las asesorías y dudas que salieron sobre la marcha.

AL DR. JOSÉ OCTAVIO MERINO CHARREZ Y AL DR. JUAN JOEL MOSQUEDA GUALITO.

Por el apoyo en cuanto a material biológico y las asesorías en temas de suma importancia para el desarrollo de esta investigación.

A los productores por su apoyo y accesibilidad apoyando en los muestreos.

Índice Hoja de declaratoria de originalidad ...... I Hoja de reconocimientos institucionales ...... III Dedicatoria...... IV Agradecimientos ...... V Índice ...... VI Índice de figuras ...... VIII Resumen ...... IX Abstract ...... X Introducción ...... 1 Antecedentes ...... 3 2.1. Garrapatas ...... 3 2.1.1. Clasificación taxonómica ...... 3 2.1.2. Alimentación ...... 4 2.1.3. Garrapatas en la ganadería a nivel mundial ...... 4 2.1.4. Garrapatas en la ganadería bovina en México ...... 5 2.2. Amblyomma mixtum ...... 6 2.2.1. Distribución geográfica ...... 6 2.2.2. Ciclo biológico de A. mixtum ...... 7 2.3. Garrapatas como vectores ...... 8 2.3.1. Relación Vector-Parásito-Hospedador: Transmisión transovárica...... 9 2.3.2. Relación Vector-Parásito-Hospedador: Transmisión transestadial ...... 9 2.4. Principales patógenos asociados a garrapatas en México ...... 9 2.4.1. Anaplasma marginale: Generalidades y Características ...... 10 2.4.2. Rickettsia spp: Generalidades y Características ...... 11 2.4.3. Ehrlichia sp: Generalidades y Características ...... 11 2.5. Estudios enfocados a la detección de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en garrapatas Amblyomma ...... 12

Hipótesis ...... 14 Objetivo general ...... 14 5.1. Objetivos específicos ...... 14

VII

ARTÍCULO I ...... 15 ARTÍCULO II ...... 34 Conclusiones ...... 49 Referencias ...... 50 Anexo I ...... 55 Anexo II...... 59

VIII

Índice de figuras

Figura 1. Clasificación taxonómica de las garrapatas ...... 4 Figura II. Ciclo biológico de A. mixtum...... 8

Resumen

Cárdenas Amaya, Carolina. MCA. Universidad Veracruzana. Junio 2021. Evaluación molecular de Amblyomma mixtum como potencial vector de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en bovinos de zona centro del estado de Veracruz. Directora y Tutora: Dra. Dora Romero Salas, Director externo: Dr. Adalberto A. Pérez de León, Asesora: Dra. Mariel Aguilar Domínguez.

Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp son bacterias distribuidas en regiones tropicales y subtropicales, consideradas endémicas en México, transmitidas principalmente por garrapatas de gran importancia como Rhipicephalus microplus. Sin embargo, debido a su amplia distribución y la gran variedad de hospederos dentro su ciclo biológico, Amblyomma mixtum no se descarta como un potencial vector de dichos patógenos. Por lo cual, el objetivo de esta investigación fue el evaluar molecularmente el rol de Amblyomma mixtum como potencial vector de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en bovinos de la zona centro del estado de Veracruz, México. Se obtuvieron 919 garrapatas de 207 bovinos pertenecientes a 14 unidades de producción bovina; 463 (50.4%) especímenes se identificaron como la especie Amblyomma mixtum. El 78% (78/100) de las muestras sanguíneas dieron positivo a la presencia de Anaplasma spp y/o Ehrlichia sp, así como el 66% (66/100) de las muestras de garrapatas. En cuanto a Rickettsia spp, el 2% (2/100) de las muestras sanguíneas dieron positivo y sólo el 1% (1/100) de las muestras de garrapata. Se encontró una alta prevalencia de Anaplasma spp/Ehrlichia sp en comparación a investigaciones anteriormente realizados con la misma especie de garrapata. El presente estudio demuestra la presencia de Anaplasma spp/Ehrichia sp en el 78% de las muestras sanguíneas, así como en el 66% en muestras de garrapatas identificadas como Amblyomma mixtum obtenidas de bovinos de la zona centro del estado de Veracruz. Así mismo, se determinó que existe asociación (vector/hospedero) en 24 muestras positivas a Anaplasma spp y/o Erhlichia sp obtenidas de bovinos de la zona centro del estado de Veracruz.

Palabras clave: Amblyomma mixtum, Patógeno, Vector

Abstract

Anaplasma marginale, Rickettsia spp and Ehrlichia sp are bacteria distributed in tropical and subtropical regions, considered endemic in Mexico, transmitted mainly by highly important ticks such as Rhipicephalus microplus. However, due to its wide distribution and the great variety of hosts within its biological cycle, Amblyomma mixtum is not ruled out as a potential vector for these pathogens. Therefore, the objective of this research was to molecularly evaluate the role of Amblyomma mixtum as a potential vector of Anaplasma marginale, Rickettsia spp and Ehrlichia sp in cattle from the central zone of the state of Veracruz, Mexico. 919 ticks were obtained from 207 bovines belonging to 14 bovine production units; 463 (50.4%) specimens were identified as the Amblyomma mixtum species. 78% (78/100) of the blood samples were positive for the presence of Anaplasma spp and / or Ehrlichia sp, as well as 66% (66/100) of the tick samples. As for Rickettsia spp, 2% (2/100) of the blood samples were positive for and only 1% (1/100) of the tick samples. A high prevalence of Anaplasma spp / Ehrlichia sp was found in comparison to previous studies carried out in the same tick species. The present study demonstrates the presence of Anaplasma spp / Ehrichia sp in 78% of the blood samples, as well as in 66% in samples of ticks identified as Amblyomma mixtum obtained from cattle from the central zone of the state of Veracruz. Likewise, it was determined that there is an association (vector / host) in 24 samples positive to Anaplasma spp and / or Erhlichia sp obtained from cattle from the central zone of the state of Veracruz.

Keywords: Amblyomma mixtum, Pathogen, vector

Introducción

Los ectoparásitos, en especial las garrapatas, imponen serias restricciones en la salud animal, tanto por su actividad como vector de enfermedades, como el efecto en la producción del sector ganadero; lo que ocasiona pérdidas económicas estimadas en más de $1.6 billones de dólares anualmente a nivel mundial (Polanco et al., 2016). También transfieren severos patógenos zoonóticos a los humanos (Shine et al., 2014). El impacto que tienen las garrapatas en el sector ganadero en México se debe principalmente a su amplia distribución en regiones tropicales y subtropicales, la adaptación que poseen a condiciones extremas, a los daños económicos (como la disminución en parámetros reproductivos); así como, al constante problema creciente de resistencia a ixodicidas (Rodríguez-Vivas et al., 2006). Produciendo pérdidas estimadas en $10.978 mil millones (Pérez de León, 2019). Sin embargo, el problema de mayor impacto que generan las garrapatas en los bovinos es el de transmitir patógenos como son las bacterias pertenecientes a los géneros Anaplasma (Anaplasma marginale), Rickettsia spp y Ehrlichia sp (Labruna & Manchado, 2006). Anaplasma marginale, considerada la de mayor patogenicidad; es una bacteria perteneciente al genogrupo II de las Ehrlichias causante de la Anaplasmosis bovina; la cuál alcanza hasta 26% de mortalidad, así como reservorios de por vida a los que sobreviven a la enfermedad (OIE, 2015). De Rickettsia spp se reportan tasas que van desde 23 a 85%, considerada también endémica de climas tropicales y subtropicales propios de las regiones costeras del país; así como una presentación de cuadros clínicos variados dependiendo la especie afectada (Parola et al., 2009). En cuanto a Ehrlichia sp, esta es una bacteria que provoca la enfermedad Ehrlichiosis; de la cual se presenta una mortalidad superior al 50% (Davies, 1993). La principal garrapata que predomina en la ganadería de México es Riphicephalus microplus, la cual afecta al 80% de la población bovina y a la que se le atribuye la mayor actividad como vector de patógenos

(Manzano et al., 2012). Sin embargo, existe otra especie que convive con ella y además es la segunda de mayor importancia, siendo esta Amblyomma mixtum (Aguilar et al., 2019); por ende, no se descarta que también posea esta actividad. A. mixtum es una especie descrita por Koch (1844) perteneciente al complejo Amblyomma cajennense (Nava, 2014), que produce daños tanto físicamente, tales como los desgarres en piel causado por sus piezas bucales tan desarrolladas; así como los fisiológicos al producir debilidad, fiebre y mortalidad (Soulsby, 1992). Sin embargo, no se cuenta con ninguna evidencia científica que indique el funcionamiento de A. mixtum como vector de patógenos de importancia en los animales y humanos; por lo que se requiere investigación adicional para lo descrito anteriormente (Almazán, et al., 2018). Debido a la escasa información sobre A. mixtum como vector de patógenos, es necesario determinar la presencia de los que alberga; así como, identificar si existe relación entre vector/hospedero y su prevalencia, lo que permitirá a los ganaderos establecer medidas de control y/o prevención acorde a cada Unidad de Producción Bovina (UPB). Por lo cual se tiene como objetivo evaluar molecularmente el rol de A. mixtum como potencial vector de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en bovinos de la zona centro del estado de Veracruz, México.

Antecedentes

2.1. Garrapatas

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados que afectan a mamíferos, aves y reptiles. Se tiene registro de al menos 900 especies de distribución cosmopolita, que significa que existe una gran diversidad de características estructurales, biológicas y fisiológicas. Han logrado la adaptación a la mayoría de los hábitats terrestres del planeta, porque se les puede ubicar desde el nivel del mar hasta los 2,600 msnm (Lima et al, 2000). En general las larvas de garrapatas trepan a las plantas de los pastizales para facilitar el acceso a los hospederos moviéndose de forma horizontal hasta 1.8 metros de su sitio original (Falco & Fish, 1991).

2.1.1. Clasificación taxonómica

Las garrapatas, junto con otros invertebrados como insectos, arañas, ácaros y crustáceos, pertenecen al Phylum Arthropoda, a la Clase Arachnida, que se agrupan al Orden Acarina y dentro de éste al suborden Ixodoidea; del cual deriva la familia Ixodidea; dividida en tres: Ixodidae, Argasidae y Nuttalliellidae (Figura I) (Ríos-Osorio, 2016). La Ixodidae (a la cual pertenece A. mixtum) mejor conocida como la de las garrapatas duras, poseen una lámina dorsal dura, comprenden el 80% del total de las garrapatas existentes a nivel mundial, le sigue la Argasidae, ésta por el contrario es conocida como la de las garrapatas blandas, porque carece de esa lámina, y por último una familia intermedia conocida como Nuttalliellidae, representada sólo por una especie africana Nuttalliella namaqua , misma que no tiene importancia en cuanto a vector de patógenos, puesto que hay evidencia científica que demuestra que no cuenta con esta función (Polanco et al., 2016)

Figura 1. Clasificación taxonómica de las garrapatas. Adaptada de: “Aspectos biológicos y ecológicos de las garrapatas duras” por Diana Nayibe Polanco-Echeverry y Leonardo Alberto Ríos-Osorio. 2016, Corpoica Cienc. Tecnol. Agropecuaria. 4(15).

2.1.2. Alimentación

Al ser hematófagos, su alimentación está basada en sangre de forma exclusiva. El proceso de alimentación comienza desde la unión de la garrapata al hospedero, por medio de un corte ocasionado por unas estructuras bucales llamadas quelíceros que usan el hipostoma para poder sostenerse en el tejido, ambas piezas localizadas en el capitulum. Es mediante este proceso donde ocurre también la transmisión de patógenos (Sonenshine et al., 2002).

Las hembras de la familia Ixodidae (en particular las del género Amblyomma) requieren de una gran cantidad de sangre, alimentándose en un periodo de 7 a 12 días; mientras que las larvas y ninfas lo hacen por un periodo más corto, de manera intermitente y sólo permaneciendo en el hospedero por unas semanas o meses (Polanco & Ríos-Osorio, 2016).

2.1.3. Garrapatas en la ganadería a nivel mundial

La importancia de las garrapatas radica en la capacidad de ser tanto parásitos obligados como vectores de enfermedades parasitarias, bacterianas y víricas. Algunas de esas enfermedades están consideradas como plagas de los animales domésticos y que provocan pérdidas económicas.

Muchas de ellas son zoonóticas; es decir, son procesos transmitidos de los animales (tanto domésticos como silvestres) a la especie humana. Algunas enfermedades víricas transmitidas por las garrapatas a los humanos pueden ser mortales. Las cifras de prevalencia, incidencia y mortalidad son variables, porque dependen del agente etiológico implicado, el vector y las condiciones sociales que pueden facilitar o impedir su transmisión (Estrada-Peña, 2015). Las garrapatas se consideran como uno de los factores zoosanitarios más importantes a nivel tropical, al afectar a la población bovina en un 80%. Producen pérdidas estimadas en más de 1.6 billones de dólares al año (Polanco y Ríos-Osorio, 2016). Estas pérdidas se deben a daños directos, como son la pérdida de sangre asociada a las cargas parasitarias, que a su vez causa anemia y estrés, inflamación de la piel y las respuestas tóxicas y alérgicas causadas por los antígenos y coagulantes presentes en la saliva de estos (Estrada-Peña & Venzal, 2007). En cuando a las pérdidas ocasionadas por la transmisión de patógenos se estima que alcanza cifras entre $13.9-18.7 billones de dólares anuales (Castro, 1997).

2.1.4. Garrapatas en la ganadería bovina en México

La ganadería bovina es una de las principales actividades realizadas en México, ocupa el séptimo lugar a nivel mundial en cuando a cabezas de ganado bovino donde se refiere, donde Veracruz es el principal estado con una producción anual de 4,302,814 (SIAP, 2017) de la que se estima que el 80% de la población ganadera se encuentra afectada por garrapatas. De las 100 especies de garrapatas, 68 pertenecen a la familia Ixodidae y de estas, dos se encuentran en México concentradas en cinco géneros: Ixodes, Riphicephalus, Amblyomma, Dermacentor y Haemaphysalis (Pérez et al., 2014). Donde Rhipicephalus microplus, Riphicephalus annulatus y Amblyomma mixtum son las principales garrapatas que afectan a la producción y economía pecuaria (Rodríguez-Vivas et al., 2017), y causan pérdidas estimadas en 11 mil millones de pesos al año (Rodríguez- Vivas et al., 2014 y 2017).

La garrapata R. microplus es considerada el ectoparásito de mayor importancia en la ganadería tropical y subtropical, se encuentra distribuida en el 50% del territorio mexicano (Almazán et al., 2018). A. mixtum ocupa el segundo lugar de importancia en las unidades de producción bovina (UPB), clasificada dentro del complejo Amblyomma cajennense junto A.

cajennense s. s., Amblyomma tonellidae, Amblyomma interandinum, Amblyomma patinoi y Amblyomma sculptum (Nava et al., 2014).

2.2. Amblyomma mixtum

A. mixtum fue descrita por Koch en 1844; sin embargo, tiempo después se consideró sinónimo de A. cajennense, para tener así la descripción de la especie presente en México, gracias a estudios realizados por Nava (2014) donde se compararon especímenes de manera morfológica, para indicar así que la especie presente desde el sur de Texas hasta el ecuador es A. mixtum, reubicándola y concluir que es una especie perteneciente al complejo A. cajennense (Estrada-Peña et al., 2004; Nava et al., 2014; Aguilar-Domínguez et al., 2019).

2.2.1. Distribución geográfica

La distribución geográfica de muchas especies de garrapatas está condicionada a factores ambientales tales como la temperatura, humedad, el tipo de vegetación, así como a la disponibilidad de hospederos (Castro & Wright, 2007; Aguilar-Domínguez et al., 2018). Las garrapatas, han logrado colonizar nuevos nichos ecológicos con un clima adecuado y hospederos apropiados, que significa que se tienen modos eficaces de dispersión (por ejemplo el comercio de ganado y los movimientos migratorio de animales silvestres que incluye mamíferos y aves) (Daniel & Dusbábek, 1994), este movimiento de poblaciones de garrapatas pueden significar un alto riesgo epidemiológico, porque estas pueden estar infectadas con patógenos e iniciar así el establecimiento del ciclo de transmisión local entre poblaciones locales de garrapatas y hospederos. A. mixtum posee una amplia zona de distribución que comprende desde el sureste de Texas, y que pasa por México, en especial en las áreas colindantes con el Golfo de México hasta el Ecuador (Almazán et al., 2018; Aguilar-Domínguez et al., 2019); tiene predisposición por áreas tropicales y subtropicales; pero ha logrado su adaptación a climas semi áridos, así como zonas con mayor altitud (Venzal, 2019).

Se localiza en temperaturas de 13 a 16°C; sin embargo, se conoce también su localización a más de 20°C, aún en los meses de invierno (Almazán, 2016), entonces es muy importante el papel que juega el cambio climático, porque si logra adaptarse a más de 7°C de lo que se conocía, con faclilidad podrá adaptarse al incremento anual previsto de 1.1°C y podrá ampliar su rango de distribución, llegar a lugares donde no se tenía registro de ella y a su vez de los posibles patógenos que lleve consigo, al ampliar las zonas endémicas de las enfermedades que causan los mismos (Romero & Soler 2012).

2.2.2. Ciclo biológico de A. mixtum

Es una garrapata que presenta cuatro estadios de desarrollo, los cuales son huevo, larva, ninfa y adulto (Figura II). En cada uno se alimenta una vez en su vida; siendo su principal característica el estar compuesto de tres hospederos; entre los cuáles incluye a mamíferos, aves y reptiles, para completar su ciclo entre 123 y 193 días (Almazán, 2016). Estas etapas están determinadas por factores bióticos, la disponibilidad de los hospederos y la resistencia que propicia el medio ambiente (Estrada-Peña, 2015). Las larvas suben al primer hospedero, se alimentan y completan su repleción en un período de 3 a 5 días, para después desprenderse y caer al suelo. Ya repletas mudan en el suelo en un período de 21 a 30 días al estadío de ninfa. Después, suben a un segundo hospedero y ahí se alimentan durante un periodo de 3 a 6 días. La ninfa repleta cae al suelo y realiza la muda en 20 a 28 días (Almazán, 2016). Las garrapatas adultas suben al tercer hospedero para alimentarse y realizar la cópula. La repleción completa de la hembra en esta etapa dura de 7 a 12 días. Las garrapatas hembra repletas se desprenden del hospedador y caen al suelo para llevar a cabo la ovoposición en un lapso de 25 a 29 días. La incubación de los huevos se lleva a cabo en el suelo durante 8 a 12 días para finalizar con la eclosión de larvas. En condiciones ambientales adecuadas y disponibilidad de hospederos, el ciclo biológico completo se desarrolla en un periodo de 133 a 193 días (Almazán, 2016).

Figura II. Ciclo biológico de A. mixtum. Adaptada de: “Aspectos biológicos de Amblyomma mixtum (Koch, 1844) en el noroeste de México” por Consuelo Almazán, Angélica Torres-Torres, Lorena Torres-Rodríguez, Noé Soberanes-Céspedes y Martín Ortiz-Estrada. 2016, Quehacer Científico en Chiapas. 3(10).

2.3. Garrapatas como vectores

Un vector se define como un organismo que tiene la capacidad de transmitir una enfermedad a hospederos (OMS, 2017). En salud pública existen diferentes tipos de vectores, se entienden como vectores mecánicos aquellos que sólo transportan al agente sin que este se modifique o se reproduzca; en general el vector contamina el aparato bucal o el tubo digestivo. Un ejemplo claro de este tipo de vectores son las moscas (Ellis et al., 2009), y los vectores biológicos que se diferencian de los mecánicos porque éstos forman parte del ciclo biológico de los patógenos, que asegura una transmisión efectiva y prolongada; asimismo, dan parte a que los vectores funcionen como reservorios, porque aquí el agente puede transmitirse de generación en generación por vía transovárica. Este grupo es muy amplio, comprende principalmente artrópodos como los mosquitos, pulgas, chinches, piojos y el de mayor relevancia en la Medicina Veterinaria, así como en Salud Pública, las garrapatas (Dantas-Torres & Camara, 2017).

2.3.1. Relación Vector-Parásito-Hospedador: Transmisión transovárica

Se refiere a cuando el vector se infecta con cierto patógeno y lo transmite a toda su progenie a través de los huevos. El parásito realiza su ciclo biológico en la garrapata y cuando esta llega al estado adulto produce esporozoitos infectivos ubicados en las glándulas salivales. Este tipo de transmisión le permite a la garrapata permanecer en un estado de infección por varias generaciones, sin necesidad de alimentarse de nuevo de un hospedero infectado (Young & Morzaria, 1986). Se conocen tres presentaciones, que dependen del número de hospederos que posea el vector. En una garrapata de un solo hospedero, se infectan las hembras adultas al momento de alimentarse de un hospedero infectado, con lo cual al momento de emerger los huevos serán infectivos para el hospedero del que se alimenten, desde su estado de larva hasta el de adulto. En una garrapata de dos hospederos, la diferencia radica en que sólo se transmitirá a su progenie en los estados de ninfa o adulto. Y en las garrapatas de tres hospederos, aquí igual ocurre la transmisión transovárica hacia toda la progenie, haciéndola infectiva a todos sus hospederos en todos los estadios (Polanco-Echeverry &Ríos-Osorio, 2016).

2.3.2. Relación Vector-Parásito-Hospedador: Transmisión transestadial

Esta sucede cuando la garrapata en su estado de larva o ninfa ingiere sangre de un hospedero infectado. Luego estos son transmitidos a los siguientes estados, ninfa y adulto respectivamente, donde las adultas son las transmisoras del patógeno hacia un nuevo hospedero por medio de los esporozoitos infectivos (Young & Morzaria, 1986).

2.4. Principales patógenos asociados a garrapatas en México

Los patógenos que utilizan a las garrapatas como vectores, se han consagrado como un problema de salud pública, sobre todo en regiones tropicales y subtropicales. Durante su alimentación pueden transmitir agentes patógenos, ubicándolos como vectores de varias enfermedades, además del desgarre que ocasionan al momento de prenderse a la piel; pueden

causar prurito, inflamación en la piel, estrés, alergias, así como anemia (Rodríguez-Vivas et al., 2016). La transmisión de patógenos es motivo de alerta y preocupación, porque una gran parte ocasionan enfermedades zoonóticas; esto por medio de mecanismos de coinfección. El proceso por el cual se da esta infección está mediado por factores ecológicos, climáticos y antropogénicos que afectan al ciclo enzoótico entre patógeno, garrapata y hospedero (Dantas- Torres et al., 2017).

2.4.1. Anaplasma marginale: Generalidades y Características

La Anaplasmosis es una enfermedad infectocontagiosa de amplia distribución, con mayor desarrollo en zonas tropicales y subtropicales, afecta a bovinos y pequeños rumiantes (Olguin et al., 2015). Las especies de Anaplasma se transmiten por medio de las garrapatas, donde A. marginale es la de mayor patogenicidad y por ello de las más importantes (OIE, 2015). Anaplasma marginale es una bacteria perteneciente al genogrupo II de las ehrlichias, es además un parásito en los eritrocitos maduros del ganado bovino (Corona y Martínez, 2011), y se encuentra ampliamente distribuida en climas tropicales y subtropicales (Risc, 1980). El cuadro clínico se caracteriza por una anemia hemolítica marcada, disminución de peso, aborto y en algunas ocasiones la muerte del animal (González et al., 2014), tiene una frecuencia que oscila hasta el 26% en el ganado bovino y aquellos que sobreviven a la enfermedad permanecen persistentemente infectados de por vida, sin que excluya que se expongan de nuevo a la Rickettsia, para servir así de reservorio para la misma (Corona et al., 2012). En cuanto a su transmisión por medio de las garrapatas en Latinoamérica, se tiene descrito a Rhipicephalus microplus y Amblyomma spp como los principales vectores, donde la segunda es de manera transestadial (de un estadío a otro) e intraestadial (dentro del mismo estadío), esta última realizada por los machos adultos de las garrapatas (Kocan et al., 2000). El diagnóstico se realiza por medio de pruebas como es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) que cuenta con una especificidad y sensibilidad cercanas al 100% (Reina- Bello, 2014).

2.4.2. Rickettsia spp: Generalidades y Características

Las bacterias pertenecientes al género Rickettsia son organismos intracelulares obligados y cuya presencia en su hospedero causa una infección conocida como rickettsiosis, que puede ser de tipo zoonótico. Los casos encontrados se asocian de forma directa con personas en constacto directo con animales domésticos; sin embargo, la práctica de la ganadería se considera un posible factor de riesgo (Peniche et al., 2014). Las Rickettsias se encuentran clasificadas de dos maneras, en la primera comprende cuatro grupos: grupo de las fiebres manchadas (R. rickettsii , R. conorii y R. parkeri entre otras), grupo del tifus (R. prowazekii y R. typhi ), grupo transicional (R. akari , R. australis y R. felis) y el grupo ancestral (R. bellii y R. canadensis) (Mansueto et al., 2012). El segundo comprende dos grupos con subgrupos: grupo de las fiebres manchadas (subgrupo R. rickettsii , subgrupo R. massiliae , subgrupo R. helvetica y subgrupo R. akari) y por último el grupo del tifus (subgrupo R. prowazekii) (Merhej y Raoult, 2011). En México se ha notificado R. rickettsi, considerada la más patógena del género, ya que se han reportado tasas de letalidad que van desde 23 a 85%; pero desciende hasta el 5% con un tratamiento adecuado; considerada endémica de climas tropicales y subtropicales propios de las regiones costeras del país (Parola et al., 2009). Su vector principal es R. sanguineus reportado desde los años 40 (Mariotte et al., 1944). Otro vector encontrado es la garrapata Amblyomma cajennense spp, clasificada en la actualidad como Amblyomma mixtum que se considera un riesgo en la salud pública debido a su variabilidad de hospederos durante todo su ciclo (Parola et al., 2005).

2.4.3. Ehrlichia sp: Generalidades y Características

Este grupo de bacterias intracelulares obligadas producen la enfermedad denominada ehrlichiosis, que afecta a numerosas especies como son bovinos, caballos, perros, así como también al ser humano (infección causada por Ehrlichia chaffensis), considerándose así enzoótica (Dawson et al., 1991).

Tiene distribución cosmopolita, pero muestra preferencia por regiones tropicales donde es transmitida por las garrapatas. En el caso de los bovinos, la enfermedad es denominada como Ehrlichiosis bovina y es una infección de tipo benigna provocada por Ehrlichia bovis; la cuál produce equimosis y numerosas petequias en la superficie de las mucosas y las superficies serosas; así como una fiebre alta, hipertrofia de los nódulos linfáticos y esplenomegalia. Se ha encontrado una mortalidad arriba del 50% en los bovinos infectados (Davies, 1993).

2.5. Estudios enfocados a la detección de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en garrapatas Amblyomma

En Etiopía (Teshale et al., 2014), por medio de PCR analizaron 384 garrapatas pertenecientes al género Amblyomma (203 Amblyomma variegatum y 181 Amblyomma lepidum), la mayoría provenientes de ganado bovino y el resto de ovinos. El 16.4% dio positivo a una o más de las especies de Ehrlichia y/o Anaplasma, aunque se observó un mayor porcentaje en las garrapatas recolectadas de ganado bovino que las provenientes de ovinos (20.6 ˂ 3%). En Madagascar, Pothmann et al. (2016) notificaron que el 52% de las garrapatas Amblyomma variegatum recolectadas de ganado bovino estaban infectadas con Anaplasma marginale, para arrojar una prevalencia entre el 52 y 70% para el ganado en general; sin embargo, no lograron establecer una relación entre las muestras positivas de las garrapatas y las muestras positivas de sangre, porque Amblyomma variegatum coexiste con Rhipicephalus microplus, que ya está establecida como un vector de Anaplasma marginale.

En lo que respecta a la misma especie de garrapata, Moumouni et al. (2016) realizaron la identificación del grupo rickettsial causante de la fiebre de las montañas rocosas, en ocho diferentes localidades pertenecientes a cuatro distritos de Benín, África. Recolectaron 910 garrapatas adultas (789 machos y 121 hembras), de las cuales 585 (499 machos y 86 hembras) fueron positivas a Rickettsia spp, obteniédose prevalencias desde 37.6 a 92.9%; así como la presencia de estos patógenos en todas las localidades muestreadas. En cuanto al porcentaje, hubo evidencia estadística significativa de que son diferentes, 52.1% para las hembras y el 25.8% para los machos.

En dos localidades de Tennessee, Estados Unidos de América, se recolectaron 396 garrapatas Amblyomma americanum incluidas ninfas y adultos, con la finalidad de identificar la presencia de Ehrlichia sp mediante pruebas de PCR y así poder estimar la posible prevalencia con los resultados. Las pruebas concluyeron que 33 garrapatas dieron positivas, sin encontrar diferencia estadística significativa por su estadio; así como el sexo. La prevalencia fue del 7.2% (Harmon et al., 2015). En cuanto a estudios realizados en México, Merino et al. (2020) comprobaron la presencia de Rickettsia spp en garrapatas Amblyomma mixtum provenientes de bovinos mediante pruebas de PCR; sin embargo, el punto más importante fue la coinfección que existió en dos garrapatas de diferentes especies (Amblyomma mixtum y Rhipicephalus microplus) obtenidas del mismo hospedero; además de obtener una secuenciación de Candidatus Ricketssia amblyommii, que fue obtenida de una garrapata Amblyomma mixtum proveniente de un bovino.

Hipótesis

Amblyomma mixtum es un potencial vector de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en bovinos de la zona centro del estado de Veracruz, México.

Objetivo general

Evaluar por técnicas moleculares el papel de Amblyomma mixtum como potencial vector de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en bovinos de la zona centro del estado de Veracruz, México.

5.1. Objetivos específicos

• Clasificar mediante claves morfológicas dicotómicas las garrapatas de bovinos de la zona centro del Estado de Veracruz para identificar género y especie. • Identificar la presencia de ADN de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en muestras de sangre de bovinos de la zona centro del Estado de Veracruz para determinar la prevalencia de estos patógenos en los bovinos. • Identificar la presencia de ADN de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en las garrapatas de bovinos de la zona centro del Estado de Veracruz para determinar la prevalencia de estos patógenos en las garrapatas de los bovinos.

ARTÍCULO I

FRECUENCIA DE ESPECIES DE GARRAPATAS EN BOVINOS DE UNIDADES DE PRODUCCIÓN BOVINA DE LA REGIÓN CENTRAL DEL ESTADO DE

VERACRUZ, MÉXICO

Revista: Veterinary Research Communications

Factor de Impacto: 1.293

FRECUENCIA DE ESPECIES DE GARRAPATAS EN BOVINOS DE UNIDADES

DE PRODUCCIÓN BOVINA DE LA REGIÓN CENTRAL DEL ESTADO DE

VERACRUZ, MÉXICO

FREQUENCY OF TICK SPECIES IN CATTLE FROM BOVINE PRODUCTION

UNITS IN THE CENTRAL REGION OF THE STATE OF VERACRUZ, MEXICO

Cárdenas-Amaya C1, Romero-Salas D1*, Aguilar-Domínguez M1, Cruz-Romero A1,

Alonso-Díaz MA2, Martínez-Herrera DI3, Pérez-Cogollo LC4, Pérez de León AA5

1Laboratorio de Parasitología, rancho “Torreón del Molino”, Facultad de Medicina

Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, México. Carr. Veracruz-

Xalapa, Km. 14.5, Col. Valente Díaz, Veracruz, México. CP. 91697

2CEIEGT. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Km. 5.5 Carr. Fed. Martínez de la Torre-Tlapacoyan, Veracruz, México. CP.

93650.

3Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz,

México. CP. 91710.

5Departamento de Ciencias Pecuarias, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,

Universidad de Córdoba, AA 354, Montería, Colombia.

6San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center United States Department of Agriculture -

Agricultural Research Service 9611 South Riverbend Avenue Parlier, CA 93648.

*Autor de correspondencia [email protected]

FREQUENCY OF CATTLE TICK SPECIES IN BOVINE PRODUCTION UNITS

IN THE CENTRAL REGION OF THE STATE OF VERACRUZ, MEXICO

Abstract

Ticks are ectoparasites that affect 80% of the bovine population and also produce direct and indirect losses, which sometimes leads to animal death. Veracruz state of Mexico has

4,302,814head of livestock inventory susceptible to infestations; however, there is lack information on tick species circulating in the state; for this reason, the objective of the study was to identify the presence and frequency of the main tick species affecting livestock in

Bovine Production Units (UPB) in the central region the of Veracruz state of Mexico. Ticks from 207 bovines at 15 UPB were collected located in 9 municipalities in the central region of Veracruz state, which were identified by dichotomic and taxonomic established keys.

From 919 ticks collected, 463 (50.4%) correspond to Amblyomma mixtum species and 456

(49.6%) to Rhipicephalus microplus. Only adult specimens were collected from the first; however, nynphas were also identified in R. microplus. Of the bovines sampled, 54.1% presented co-infections. The presence and frequency of the two main tick species reported in the cattle of the UPB of the central region of Veracruz state was checked, with A. mixtum being 80.2% and R. microplus with 73.9%.

Keywords: Ectoparasites, Bovines, Amblyomma mixtum, Rhipicephalus microplus.

FRECUENCIA DE ESPECIES DE GARRAPATAS EN BOVINOS DE UNIDADES

DE PRODUCCIÓN BOVINA DE LA REGIÓN CENTRAL DEL ESTADO DE

VERACRUZ, MÉXICO.

Resumen

Las garrapatas son ectoparásitos que afectan al 80% de la población bovina y además producen pérdidas directas e indirectas, que en ocasiones conlleva a la muerte del animal. El estado de Veracruz cuenta con un inventario de 4,302,814 cabezas de ganado susceptible a infestaciones; sin embargo, la información en cuanto a especies de garrapatas que circulan en el estado es limitada; por esta razón, el objetivo de este estudio fue identificar la presencia y frecuencia de las principales especies de garrapatas que afectan a la ganadería en Unidades de Producción Bovina (UPB) en la región central del estado de Veracruz, México. Se colectaron garrapatas de 207 bovinos provenientes de 15 UPB ubicadas en nueve municipios de la región central del estado de Veracruz, mismas que se identificaron mediante claves taxonómicas dicotómicas establecidas. De las 919 garrapatas colectadas 463 (50.4%) corresponden a la especie Amblyomma mixtum y 456 (49.6%) a Rhipicephalus microplus. De la primera se colectaron solo especímenes adultos; sin embargo, también se identificaron ninfas en R. microplus. De los bovinos muestreados, 54.1% presentaron coinfecciones. Se comprobó la presencia y frecuencia de las dos principales especies de garrapatas reportadas en los bovinos de las UPB de la región central del estado de Veracruz, fue A. mixtum en

80.2% y R. microplus con 73.9%.

Palabras clave: Ectoparásitos, Bovinos, Amblyomma mixtum, Rhipicephalus microplus.

INTRODUCCIÓN

La producción de ganado bovino en México es una actividad muy importante desde el punto de vista social y económico. Se realiza en alrededor de 1.2 millones de unidades de producción bovina que tienen una gran participación en términos de seguridad alimentaria, fuente de empleos e ingresos económicos para millones de familias. La mayoría de los sistemas de producción se basan en el pastoreo directo, donde una de sus principales amenazas son las garrapatas y los patógenos que transmiten a los bovinos.

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos obligados que infestan al 80% de la población bovina del mundo. Estos ectoparásitos también afectan diversas especies de mamíferos

(incluido el hombre), aves y reptiles. Se tiene registro de al menos 900 especies de garrapatas que poseen una gran diversidad de características estructurales, biológicas; así como también fisiológicas (Soneshine, 2014) que causan a la ganadería bovina pérdidas de $2.5 billones de dólares al año (Almazán et al., 2018).

Las pérdidas económicas se deben a daños directos como como son la disminución de los parámetros productivos, reproductivos, estrés, inflamación de la piel, respuestas tóxicas y alérgicas causadas por los antígenos y coagulantes presentes en la saliva de estos (Estrada-

Peña, 2004). Además, las garrapatas son el principal grupo de parásitos artrópodos que actúan como vectores de patógenos que afectan tanto a animales silvestres como domésticos (Pérez de León et al., 2020).

En México existen 82 especies de garrapatas que parasitan a los animales domésticos y silvestres (Almazán et al., 2018), donde las principales garrapatas que afectan a los bovinos son las pertenecientes a la familia Ixodidae, en particular Rhipicephalus microplus,

Rhipicephalus annulatus y Amblyomma mixtum que son las de mayor prevalencia en las UPB

(Higa et al., 2020). Sin embargo, existen otras como Dermacentor albipictus, Rhipicephalus

sanguineus, Anocentor nitens y Otobius megnini (esta última perteneciente a la familia

Argasidae) que tienen un impacto negativo en la ganadería bovina (Martínez et al., 2019).

El estado de Veracruz, México, cuenta con el mayor inventario de cabezas de bovinos con

4,302,814; que se ven afectadas en general por dos especies de garrapatas como son

Rhipicephalus microplus y Amblyomma mixtum (Higa et al., 2020; Rodríguez-Vivas et al.,

2014).

Existen factores que propician la introducción de nuevas especies de garrapatas como son la movilización de animales, porque el estado es una ruta de tránsito de cientos de miles de bovinos procedentes de otros estados y países de Latinoamérica; así también el cambio climático, del que se que se sabe que impacta de formas directa o indirecta sobre el hábitat y ciclo biológico de los ectoparásitos (Kutz et al., 2009; Cumming et al., 2006), que incluye a las garrapatas (Pérez de León et al., 2012), que pueden afectar la distribución de las especies de garrapatas en las UPB de Veracruz.

Lo anterior, ha permitido la ocurrencia de cambios en la dinámica de las infestaciones de garrapatas o el diagnóstico de enfermedades transmitidas por estos vectores (ej. recientemente se identificó la presencia de Rickettsias en A. Mixtum (Romero et al., 2021;

Ulloa-García et al., 2020). Los estudios sobre la frecuencia y distribución de las garrapatas en el estado de Veracruz son escasos y los que existen datan de hace más de 10 años; por lo que es necesario actualizar la información sobre las infestaciones de estos ectoparásitos en el ganado bovino por el riesgo económico, de salud animal y pública que representan. Por ello, el objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de las garrapatas que infestan a los bovinos en las UPB de la región central del estado de Veracruz, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó un muestreo simple por conveniencia durante un año (octubre de 2019 a octubre de 2020) en 15 UPB de nueve municipios del estado de Veracruz (Alvarado, Tlalixcoyan,

Manlio Fabio Altamirano, Soledad de Doblado, Camarón de Tejeda, Colipa, Juchique de

Ferrer, Yecuatla y Martínez de la Torre), donde se colectaron garrapatas de 207 bovinos. En cada UPB se realizaron encuestas de manera general e individual para obtener información complementaria acorde a la investigación.

Toma de muestras de garrapatas

La colección de las garrapatas se realizó a contrapelo de cabeza a cola para localizarlas, luego se tomaron con pinzas entomológicas haciendo un movimiento firme hacia arriba, con el fin de no desprender el aparato bucal durante la inspección física de los bovinos (Grammons y

Salam, 2002).

Los especímenes colectados se depositaron de manera individual en viales con etanol al 70% con su correspondiente identificación.

La identificación de las garrapatas se realizó con base en claves taxonómicas descritas por

Nava et al. (2014) para A. mixtum y por Nava et al. (2019) para R. microplus con la utilización de un estereoscopio Motic®. Se clasificaron de acuerdo con su especie, sexo y estadio.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se utilizó estadística descriptiva con el programa STATA Ver. 14.0. para determinar la frecuencia de las especies de garrapatas identificadas.

RESULTADOS

De las 919 garrapatas colectadas de los bovinos, se identificaron dos especies: A. mixtum y R. microplus (Figura 1 y 2).

A C

B D

Figura 1. Hembra de R. microplus: (A) Vista dorsal; (B) Vista ventral y Macho: (A) Vista dorsal; (B) Vista ventral.

A C

D B

Figura 2. Hembra de Amblyomma mixtum: (A) Vista dorsal; (B) Vista ventral y Macho: (C) Vista dorsal; (D) Vista ventral

En la Tabla 1 se muestra la frecuencia de las especies de garrapatas identificadas en las UPB.

El 50.4 % (463/919) de los especímenes se identificaron como A. mixtum y el 49.6 %

(456/919) se identificaron como R. microplus. Todos los especímenes de A. mixtum fueron adultos, donde el 52.9% (245) fueron machos y el 47.1% (218) hembras. En lo que respecta a la garrapata R. microplus, 86.0% (392) fueron hembras adultas, 13.2% (60) machos y 0.8%

(4) en estado de ninfas (0.8%).

Tabla 1. Especies de garrapatas identificadas en bovinos de los ranchos ganaderos, con relación a los municipios muestreados. A. R. (%) Municipio Bovinos (%) Garrapatas (%) (%) mixtum microplus Alvarado 17 8.2 42 4.6 41 8.9 1 0.2 Tlalixcoyan 40 19.3 122 13.3 85 18.3 37 8.1 Manlio 20 9.7 56 6.0 13 2.8 43 9.4 Fabio Altamirano Soledad de 20 9.7 125 13.6 37 8.0 88 19.3 Doblado Camarón 8 3.9 66 7.2 13 2.8 53 11.6 de Tejeda Colipa 54 26.0 241 26.2 129 27.8 112 24.6 Juchique de 12 5.8 64 7.0 36 7.8 28 6.1 Ferrer Yecuatla 26 12.6 133 14.5 73 15.8 60 13.2 Martínez 10 4.8 70 7.6 36 7.8 34 7.5 de la Torre Total 207 100 919 100 463 100 456 100

La Figura 3 muestra que, de los 207 bovinos muestreados en este estudio, 153 se encontraron infestados por la garrapata R. microplus (73.9%), considerada la garrapata del bovino; sin embargo, en 166 de los bovinos se observaron infestados con la garrapata A. mixtum (80.2%).

Figura 3. Clasificación de los bovinos muestreados de acuerdo con las especies de

garrapatas identificadas.

De acuerdo con la clasificación de los bovinos muestreados con base a las infestaciones observadas y al tomar en cuenta las coinfecciones de los 207 bovinos, 54 (26.1%) presentaron

A. mixtum y en 41 (19.8%) se observó la presencia de R. microplus (Figura 4). Sin embargo, en 115 (54.1%) de los bovinos muestreados presentaron la presencia de ambas especies de garrapatas; así como también se demostraron coinfecciones en el 86.6% de las UPB muestreadas.

Animalesmuestreados

Figura 4. Clasificación de los bovinos muestreados de acuerdo con las especies de

garrapatas identificadas y la coinfección de estas.

En cuanto a los productos que se usan con mayor frecuencia en las UPB muestreadas como método de control, dos utilizan organofosforados (13.3%), siete hacen uso de las amidinas

(46.6%), tres implementan lactonas macrocíclicas (20.0%), tres el uso de los piretroides

(13.3%); sin embargo, en dos UPB no tenían control alguno para estos ectoparásitos (13.3%); así también, en dos (13.3%) se comentó el uso de mezclas de los productos mencionados.

En cuanto a la frecuencia de su utilización, sólo en una UPB se baña cada semana, el 60% baña en promedio cada dos semanas, el 20% cada tres semanas y el 13.3% no emplea método de control alguno (Tabla 2).

Tabla 2. Métodos de control utilizados y frecuencia de baño en bovinos por UPB y municipios. UPB Número de Frecuencia bovinos Método de control de baño Municipio (semana) 1 17 Organofosforados 3 Alvarado 1 8 Amidinas 1 Camarón de Tejeda 1 30 Amidinas 2 Colipa 2 4 No aplica 0 Colipa 3 20 Amidinas 2 Colipa 1 5 No aplica 0 Juchique de Ferrer 2 7 Lactonas Macrocíclicas 2 Juchique de Ferrer 1 20 Amidinas 2 Manlio Fabio Altamirano 1 10 Lactonas Macrocíclicas 2 Soledad de Doblado 2 10 Amidinas 3 Soledad de Doblado 1 30 Piretroides/Amidinas 3 Tlalixcoyan

2 10 Amidinas 2 Tlalixcoyan 1 6 Amidinas 2 Yecuatla 2 20 Lactonas Macrocíclicas 2 Yecuatla 1 10 Piretroides/Organofosforados 2 Martínez de la Torre

Con relación a las especies de animales que conviven con los animales muestreados, se obtuvo que el 94.9% de los bovinos convive de forma directa con caballos, el 62.9% con perros, el 54.8% con gallinas, el 25.3% con pavorreales, así como el 14.2% con venados, el

12.9% con burros y el 10.1% con ovejas (Tabla 3).

Tabla 3. Especies de animales que conviven con el ganado en los ranchos muestreados Convivencia con otras especies No. de Bovinos (%) Caballos 187 94.9 Perros 124 62.9 Gallinas 108 54.8 Pavorreal 50 25.3 Venados 28 14.2 Burros 24 12.9 Ovejas 20 10.1

DISCUSIÓN

Los resultados en esta investigación demostraron la presencia de las dos garrapatas de mayor importancia en la ganadería del trópico en las UPB muestreados y corresponden a

Rhipicephalus microplus y Amblyoma mixtum, que ya han sido reportadas con antelación en el ganado bovino en México.

De acuerdo con la frecuencia obtenida para la garrapata A. mixtum, el resultado fue de 50.4%, que es superior al 14.3% encontrado por Düttmann et al. (2016) para esta misma especie de garrapata, incremento que puede corresponder al desplazamiento del nicho ecológico de R. 26

microplus, donde el cambio climático puede ser uno de los posibles factores. También podría indicar que sea posible encontrar problemas de resistencia o pudiera deberse a un mal manejo en los productos ixodicidas que emplean los productores ganaderos, porque se tienen antecedentes de resistencia para la garrapata R. microplus en los productos mencionados

(Fernández-Salas et al., 2012ab; Pérez-Cogollo et al., 2010). De acuerdo con las infestaciones en los bovinos, la especie R. microplus, se encontró con mayor frecuencia

(73.9%) con respecto al estudio de Reyes-Domínguez et al. (2013) que encontraron 65%; sin embargo, esto se pudo ver influenciado por las condiciones climáticas, entre ellas la humedad que fue de 80% para el periodo de muestreo; lo que propicia las condiciones adecuadas para que estas frecuencias se incrementen (Coronel-Benedett et al., 2018).

Con relación a las coinfecciones, se observó que 86.6% de los ranchos analizados presentaron ambas especies de garrapatas (A. mixtum y R. microplus), que concuerda con estudios previos realizados en el estado de Veracruz, donde también se demostró la coinfección de las mismas especies de garrapatas en un 86% (Alonso-Diaz et al., 2013). En cuanto a los métodos de control utilizados antes mencionados, se utiliza en el 60% de los ranchos productos a base de amidinas; que de acuerdo con Alonso-Díaz et al. (2013), son productos a los cuales las especies de garrapatas identificadas han generado resistencia, así como también a lo mencionan Higa et al. (2019), que señalan 100% de resistencia en garrapatas Amblyomma mixtum en cuanto al uso de las amidinas, que puede atribuirse a que se encuentre con mayor frecuencia en un hospedero que en general se encuentra infestado por Rhipicephalus microplus.

CONCLUSIONES

Se comprobó la presencia de las dos principales especies de garrapatas A. mixtum y R. microplus encontradas en los bovinos de las UPB de la región central del estado de Veracruz,

México; también se demostró que el 54.11% del ganado muestreado presentó coinfecciones a ambas especies, cifra que aumentó a 86.6% con relación a los ranchos que fueron muestreados.

Se obtuvo el estado actual del uso de productos garrapaticidas; sin embargo, existe información que demuestra la existencia de resistencia por parte de las garrapatas (en particular R. microplus) para el total de los productos empleados que podría interferir en la frecuencia de estas.

Agradecimientos

A los productores ganaderos que proporcionaron las facilidades para la colecta de muestras de los especímenes de garrapatas en los bovinos, de sus UPB, así como al personal del

Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la

Universidad Veracruzana por su apoyo para lograr este estudio.

Financiamiento

Los autores declaran no tener conflictos de intereses económicos o comerciales. Carolina-

Cárdenas Amaya fue apoyada con una beca de maestría de CONACyT y es estudiante de maestría del Programa de Maestría en Ciencia Animal, Universidad Veracruzana, UV.

Cumplimiento de estándares éticos

Este proyecto fue aprobado por la Comisión de Bioética y Bienestar Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Veracruzana

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARTÍCULO II

DETECCIÓN MOLECULAR DE Anaplasma marginale, Rickettsia spp Y Ehrlichia sp EN GARRAPATAS (Amblyomma mixtum) Y BOVINOS DE LA ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ, MÉXICO.

Revista: Ticks and Tick-borne Diseases

Factor de Impacto: 2.749

DETECCIÓN MOLECULAR DE Anaplasma marginale, Rickettsia spp Y Ehrlichia sp EN GARRAPATAS (Amblyomma mixtum) Y BOVINOS DE LA ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ, MÉXICO.

MOLECULAR DETECTION OF Anaplasma marginale, Rickettsia spp AND Ehrlichia sp IN TICKS (Amblyomma mixtum) AND BOVINE FROM THE CENTRAL ZONE OF THE STATE OF VERACRUZ, MEXICO.

Cárdenas-Amaya C1, Romero-Salas D1*, Aguilar-Domínguez M1, Cruz-Romero A1, Alonso-Díaz MA2, Sánchez-Montes S3, Martínez-Herrera DI4, Mosqueda-Gualito JJ5, Pérez de León AA6

1Laboratorio de Parasitología, rancho “Torreón del Molino”, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, México. Carretera Veracruz- Xalapa, Km. 14.5, Col. Valente Díaz, Veracruz, México. CP. 91697. 2CEIEGT. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México. Km. 5.5 Carr. Fed. Martínez de la Torre-Tlapacoyan, Veracruz, México. CP. 93650.

3Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias región Tuxpan, Universidad Veracruzana, Carr. Tuxpan-Tampico Km. 7.5, Veracruz, México. CP. 92870.

4Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, México. CP. 91710.

5Facultad de Ciencias Naturales. Universidad Autónoma de Querétaro Querétaro, México. CP. 76230 6San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center United States Department of Agriculture - Agricultural Research Service 9611 South Riverbend Avenue Parlier, CA 93648.

*Autor de correspondencia: [email protected]

ABSTRACT

Anaplasma marginale, Rickettsia spp and Ehrlichia sp are widely distributed bacteria in tropical and subtropical regions, being considered endemic in Mexico. The main vector described in cattle is Rhipicephalus microplus; However, due to its wide distribution, as well as the variety of hosts within the biological cycle, Amblyomma mixtum is not ruled out as a potential vector, which is considered of lower importance since this same variety represents a public health risk. Blood samples and ticks were collected from bovines from 9 municipalities in the central zone of the state of Veracruz, the blood samples were stored in aliquots and kept at -20 ° C while the ticks individually into 1.5 mL Eppendorf® vials containing ethanol at 70%. Subsequently, DNA extraction was performed using the Chelex 100 SIGMA® technique. The identification of Anaplasma marginale, Rickettsia spp and Ehrlichia sp was carried out by the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique using the 16SrRNA gene for Anaplasma spp and / or Ehrlichia sp and gltA for Rickettsia spp. The sequence of the data obtained through the Mega® program, the comparison of genes through the GenBank® database and finally the phylogenetic reconstruction through the Mr. Bayes3.2.7® program was carried out. The presence of Anaplasma spp / Ehrlichia sp was detected in 78% (78/100) of the selected blood samples; as well as in 66% (68/100) of the samples corresponding to Amblyomma mixtum tick species; also showing association of 24 blood samples with their perspective samples of the species A. mixtum; taking an approach of the potentiality of A. mixtum as a vector of pathogens.

Keywords: Amblyomma mixtum, Pathogens, Bovines, Vector, Ticks.

RESUMEN

Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp son bacterias intracelulares de amplia distribución en regiones tropicales y subtropicales, considerándose endémicas en México. Su principal vector descrito en bovinos es Rhipicephalus microplus; sin embargo, debido su amplia distribución que va desde el sur de Texas hasta el Ecuador, así como a la variedad de hospederos dentro de su ciclo biológico, Amblyomma mixtum no se descarta como un potencial vector, lo cual se considera de suma importancia porque esta misma variedad representa un riesgo en la salud pública. Se colectaron muestras sanguíneas y garrapatas de bovinos de 9 municipios de la zona centro del estado de Veracruz, las muestras sanguíneas fueron almacenadas en alícuotas y conservadas a -20°C, mientas que las garrapatas de manera individual en viales Eppendorf® de 1.5ml y etanol al 70%. Después, se realizó la extracción de ADN por medio de la técnica de Chelex 100 SIGMA®. La identificación de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp se realizó mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) donde se utilizó el gen 16SrRNA para Anaplasma spp y/o Ehrlichia sp y gltA para Rickettsia spp. Se realizó la secuencia de los datos obtenidos por medio del programa Mega®, la comparación de genes por medio de la base de datos del GenBank® y por último la reconstrucción filogenética por medio del programa Mr.Bayes3.2.7®. Se detectó la presencia de Anaplasma spp/Ehrlichia sp en el 78% (78/100) de las muestras sanguíneas seleccionadas; así como en el 66% (68/100) de las muestras correspondientes a la especie de garrapata Amblyomma mixtum; además se observó asociación de 24 muestras de sangre con sus respectivas muestras de la especie A. mixtum, para ello obtener un acercamiento de la potencialidad de A. mixtum como vector de patógenos.

Palabras clave: Amblyomma mixtum, Patógenos, Bovinos, Vector, Garrapatas.

INTRODUCCIÓN

Anaplasma marginale es una bacteria perteneciente al genogrupo II de las Ehrlichias, la cual afecta en particular a los eritrocitos maduros del ganado bovino (Kocan et al., 2000); produce la enfermedad denominada anaplasmosis bovina, que es infectocontagiosa de amplia distribución con mayor desarrollo en zonas tropicales y subtropicales (Ismail et al., 2017), que afecta en especial a bovinos y pequeños rumiantes (OIE, 2015). Los signos clínicos más notables en los bovinos son anemia, ictericia, fiebre y letargia; además de que en algunos casos causa la muerte del animal (Falco & Fish, 1991), se ha encontrado una mortalidad del 26% (Corona et al., 2012); sin embargo, los animales que sobreviven a la enfermedad desarrollan una infección persistente que se caracteriza por ciclos bajos de bacteriemia, que conlleva a una inmunidad de por vida con resistencia a los signos clínicos de la enfermedad (Corona et al., 2012); además de actuar como reservorio de este patógeno (Olguín & Bernal, 2015). Las bacterias del género Rickettsia, al igual que Anaplasma marginale, son organismos intracelulares obligados que causan en este caso, una infección conocida como Rickettsiosis (Lima et al., 2000), que puede ser de tipo zoonótico (de la Fuente et al., 2001). Este género está compuesto de 26 especies de las cuales cinco se han reconocido en México; incluida R. rickettsi considerada la más patógena del género (de Sousa et al., 2018), debido a que se han encontrado tasas de letalidad que van de 23 a 85% que se ve disminuida de forma notable a 5% con un tratamiento adecuado (Parola et al., 2009). En conjunto con las bacterias intracelulares se encuentra el género Ehrlichia, que cuenta con cinco especies reconocidas (Horak et al., 2002), afecta a varias especies como los bovinos, caballos, perros; así como al ser humano (infección causada por Ehrlichia chaffensis) (Dawson et al., 1991), considerándose zoonótica (Palmer et al., 2001). Se presenta en regiones tropicales y subtropicales y en especial en el caso de los bovinos produce una enfermedad denominada ehrlichiosis bovina (Teshale et al., 2014), que causa una mortalidad del 50% en los bovinos infectados (Reina-Bello, 2014). Las garrapatas juegan un papel muy importante, ya que son los principales vectores de estos patógenos (Barros-Battesti, 2006), registrando como vectores en México de Anaplasma marginale a las especies Rhipicephalus microplus y Amblyomma spp. (Polanco-Echeverry &

Ríos-Osorio, 2016); sin embargo, el segundo sin confirmarse. Al hablar de las rickettsias se menciona como vector principal a R. sanguineus y en la actualidad a Amblyomma mixtum (Almazán et al., 2016) y en cuanto a las Ehrlichias se registra a las garrapatas del género Ixodes (Bell-Sakyi, 2004). En lo que respecta a estudios similares, Teshale et al. (2014) en Etiopía analizaron 384 garrapatas pertenecientes al género Amblyomma: (203) Amblyomma variegatum y (181) Amblyomma lepidum, que en su mayoría provienen de ganado bovino y el resto de ovinos. El 16.4% dio positivo a una o más de las especies de Ehrlichia y/o Anaplasma, con mayor frecuencia en las garrapatas recolectadas de ganado bovino que las provenientes de ovinos (20.6 ˂ 3%).

De acuerdo con el estudio realizado en México por Merino et al. (2020), se comprobó la presencia de Rickettsia spp en garrapatas Amblyomma mixtum provenientes de bovinos mediante pruebas de PCR; encontraron que el punto más importante fue la coinfección que existió en dos garrapatas de diferentes especies (Amblyomma mixtum y Rhipicephalus microplus) correspondientes a un mismo hospedero; y el resultado de la secuenciación fue de Candidatus Rickettsia ambliommi, obtenida de una garrapata Amblyomma mixtum proveniente de un bovino; sin embargo no se demostró asociación vector-hospedero.

Con relación a lo mencionado con antelación, la evidencia científica que indique la actividad de Amblyomma mixtum como un potencial vector de patógenos es mínima (Almazán et al., 2016), por lo que se requiere información adicional. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar por técnicas moleculares el papel de Amblyomma mixtum como potencial vector de Anaplasma marginale, Rickettsia spp y Ehrlichia sp en bovinos de la zona centro del estado de Veracruz, México.

MATERIAL Y MÉTODOS

Lugar de estudio y muestreo El presente estudio se llevó a cabo en nueve municipios de la zona centro del Estado de Veracruz, donde se tiene como antecedente la presencia de Amblyomma mixtum (Aguilar et al., 2019) en los siguientes municipios: Alvarado (coordenadas: 18°46´17″N 95°45´43″O), Camarón de Tejeda (19°01´16″N 96°36´54″O), Colipa (19°55´00″N 96°42´00″O), Juchique de Ferrer (19°50´00″N 96°42´00″O), Manlio Fabio Altamirano (19°06´01″N 96°20´28″O),

Martínez de la Torre (20°04´00″N 97°03´00″O), Soledad de Doblado (19°02´41″N 96°25´24″O), Tlalixcoyan (18°48´11.27″N 96°03´39.67″O) y Yecuatla (19°52´00″N 96°45´00″O) (UTM Geo Map 2021). Durante el periodo de octubre 2019 a marzo de 2020 se colectaron garrapatas en cualquier estadío y muestras sanguíneas de 207 bovinos, se inspeccionaron los bovinos de cabeza a cola realizándose una inspección a contrapelo y se tomaron los especímenes con fórceps cuidando no desprender el hipostoma (Gammon y Salam, 2002) y se depositaron de manera individual en viales con Etanol al 70% con su correspondiente identificación. Para la muestra sanguínea se recolectó sangre completa de la base de la cola o yugular de los bovinos en tubos con EDTA. Obtenidas las muestras, se trasladaron al Laboratorio de Parasitología de la Unidad de Diagnóstico del Rancho Torreón del Molino de la Universidad Veracruzana para su identificación y almacenamiento, hasta su posterior análisis.

Identificación de las garrapatas

Se realizó con base en claves taxonómicas ya establecidas para cada especie de garrapata, Guzmán-Cornejo (2011) para el complejo Amblyomma cajennense y Nava (2014) para Amblyomma mixtum, con la utilización de un estereoscopio Motic®. Se clasificaron de acuerdo con su especie, sexo y estadio.

Extracción de ADN y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La extracción de ADN se realizó utilizando la técnica de resina quelante (Chelex® 100 SIGMA) con la técnica estandarizada de forma previa por Aguilar et al. (2019) para las garrapatas y la sangre total con EDTA. La identificación de Anaplasma spp. y/o Ehrlichia sp. y de Rickettsia spp. se realizó en el “Centro de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, UNAM” (CMTFM) y en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Veracruzana, mediante la amplificación del gen 16S rRNA por medio de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional (cPCR), con ayuda de los oligonucleótidos EHR01F 5’-GCC TAA CAC ATG CAA GTC GAA CG-3’ y EHR02R 5’ GCC CAA TAA TTC CGA ACA ACG-3’ para Anaplasma spp y/o Ehrlichia sp que amplifica 500 pb (Telford et al., 2011) y para Rickettsia spp R. rick-F 5′-TGT CTA TCA ATT CAC AAC TTG CC-3′ y R. rick-R 5′-GCT TAC AAA ATT CTA AAA ACC ATA TA-3′ que amplifican 800 pb (Merino et al., 2020).

La mezcla de reacción consistió en 12.5 μL de una solución 2X de GoTaq® Green Master Mix (Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU.), 1 μL de cada oligonucleótido (2 μM cada uno), 5.5 μL de agua libre de DNasa y 5 μL de ADN (200-300 ng) para hacer un volumen final de 25 μl (Espinosa-Martinez et al, 2015). Las condiciones para la PCR para Anaplasma spp. y/o Ehrlichia sp. (Murphy et al., 2017) fueron las siguientes; Desnaturalización inicial a 95°C durante 5 min, 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 60 segundos, alineamiento a 55°C durante 60 segundos y extensión a 72°C durante 60 segundos, seguida de una extensión final a 72°C durante 5 minutos. Para Rickettsia spp las condiciones fueron: Desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, alineamiento a 54°C durante 30 segundos y extensión a 72°C durante 30 segundos, seguida de una extensión final a 72°C durante 7 minutos. Para la visualización de los amplicones se implementó electroforesis en geles de agarosa al 2%, los cuales se corrieron en una solución de TAE corridas a 80 V durante 40 min. Se realizó la selección de ejemplares, así como muestras sanguíneas de los municipios en cuestión para obtener una muestra significativa, para continuar con la realización de la PCR convencional por medio de pools. 100 muestras sanguíneas y 100 muestras de garrapatas obteniéndose así 20 pools de 5 muestras cada uno.

Análisis estadístico Se realizó con el uso del programa STATA ® Versión 14 para la obtención de prevalencia cruda, así como las prevalencias específicas. Análisis genético La secuenciación de los datos obtenidos será realizada por medio del programa Mega®; después la comparación de los genes por medio de la base de datos del GenBank® y por último la reconstrucción filogenética por medio del programa Mr. Bayes 3.2.7®.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se colectaron 207 muestras de bovinos y 919 garrapatas pertenecientes a los nueve municipios seleccionados de la zona dentro del estado de Veracruz. Se realizó la identificación de los especímenes obteniéndose las especies de Amblyomma mixtum y Rhipicephalus microplus (Cuadro 1). Se identificaron por claves morfológicas 463 (50.4%) especímenes correspondientes a la especie Amblyomma mixtum, de los cuales 245 (52.9%)

fueron hembras y 218 (47.1%) machos y 456 (49.6%) a Rhipicephalus microplus. Teniendo 392 (86.0%) hembras, 60 (13.2%) machos y 4 (0.8%) en estado de ninfas. La garrapata de mayor importancia y con mayor frecuencia encontrada en la ganadería del trópico en México es Rhipicephalus microplus (Rodríguez-Vivas et al.,2005); sin embargo, de acuerdo con la frecuencia obtenida de Amblyomma mixtum cuyo resultado fue de 50.4%, que es similar al 67% encontrado por Noda et al. (2015), quienes indican que este incremento de la media puede corresponder al desplazamiento del nicho ecológico de Rhipicephalus microplus, debido a que sea posible que se encuentren ya problemas de resistencia o una consecuencia del mal manejo en los productos ixodicidas que emplean los productores ganaderos. R. microplus se considera la garrapata de mayor impacto en la ganadería, en gran parte debido a la transmisión de patógenos que generan pérdidas económicas en los ganaderos (Almazán et al., 2018). La especie Amblyomma mixtum (antes identificada como Amblyomma cajennense) se encuentra presente en 14 de los 32 estados que conforman la República Mexicana (Nava et al., 2014); sin embargo, se confirmó la presencia, así como su distribución en bovinos en el estado de Veracruz (Aguilar et al., 2019). Para la detección de Anaplasma spp y/o Ehrlichia sp se amplificó un fragmento de 500pb, que dio como resultado su presencia en 78 (78%) (Figura 1 y 2) de las muestras sanguíneas analizadas, resultado que se encuentra dentro del rango ya señalado por Maya-Delgado et al. (2020) para la identificación de estos patógenos en bovinos, y que endémicos de climas tropicales y subtropicales. El 66 (66%) (Cuadro 2 y 3) de las muestras recolectadas corresponden a la garrapata A. mixtum y es superior a lo encontrado por Cotes-Perdomo et al. (2020) de 17.1%. En cuanto a la asociación vector-hospedero, en este estudio se encontró evidencia molecular de la presencia de Anaplasma spp. y/o Ehrlichia sp. en 24 muestras de bovinos, así como de la especie de garrapata identificada como A. mixtum que es el primer reporte donde se indica una potencial actividad de esta garrapata como vector de patógenos; sin embargo, se necesitan estudios complementarios para poder confirmar su actividad como vector.

CONCLUSIÓN

Se identificó la presencia de las dos especies de garrapatas mas importantes en la ganadería del trópico, R. microplus y A. mixtum.

Mediante la utilización de pruebas moleculares se identificó la presencia de Anaplasma spp. y/o Ehrlichia sp. en muestras de 24 bovinos y la especie de garrapata A. mixtum colectadas de los mismos en la zona centro del estado de Veracruz, que indica una potencial actividad de esta como vector de patógenos, misma que no ha sido reportada con anterioridad para territorio mexicano. A. mixtum es una especie de garrapata que se conoce que actúa como vector de Ricketssia spp.; sin embargo; existen notificaciones donde se detecta la presencia de Anaplasma spp. y/o Ehrlichia sp. en países de Latinoamérica; además, es el primer estudio donde se asocia con las variables Vector-Hospedero, con lo cual se da una aproximación del funcionamiento de esta como vector de estos patógenos.

Estos hallazgos son de suma importancia, porque esta especie de garrapata se encuentra desatendida en territorio mexicano y las prevalencias encontradas de Anaplasma spp. y/o Ehrlichia sp. se le atribuyen a la especie R. microplus, que es el principal vector de estos patógenos. Es necesario continuar explorando la actividad vectorial de esta garrapata por el impacto que podría ocasionar en la medicina veterinaria, así como en la salud pública.

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ANEXOS.

Cuadro 1. Especies de garrapatas identificadas con la relación a los municipios muestreados y especímenes observados. A. R. Municipio Bovinos (%) Garrapatas (%) (%) (%) mixtum microplus Alvarado 17 8.2 42 4.6 41 8.9 1 0.2 Tlalixcoyan 40 19.3 122 13.3 85 18.3 37 8.1 Manlio Fabio Altamirano 20 9.7 56 6.0 13 2.8 43 9.4 Soledad de Doblado 20 9.7 125 13.6 37 8.0 88 19.3 Camarón de Tejeda 8 3.9 66 7.2 13 2.8 53 11.6 Colipa 54 26.0 241 26.2 129 27.8 112 24.6 Juchique de Ferrer 12 5.8 64 7.0 36 7.8 28 6.1 Yecuatla 26 12.6 133 14.5 73 15.8 60 13.2 Martínez de la Torre 10 4.8 70 7.6 36 7.8 34 7.5 Total 207 100 919 100 463 100 456 100

Cuadro 2. Animales y garrapatas positivos a Anaplasma spp y/o Ehrlichia sp.

Muestra ADN Muestras de Media/±ES (%) Binomial Exact pools (+/total) [95% Conf. Interval]

Sangre 78/100 .78 ±.0414246 78 .6860803 .8566964

Amblyomma mixtum 66/100 .66 ±.047370 66 .5584667 .7517765

Rhipicephalus microplus 52/100 .52 ±.04996 52 . 4177898 .6209945

Cuadro 3. Animales y garrapatas positivos a Rickettsia spp.

Muestra ADN Muestras Media/±ES % Binomial Exact de pools (+/total) [95% Conf. Interval]

Sangre 2/100 .02 ±.014 2 .0024313 .0703839

Amblyomma mixtum 1/100 .01 ±.0099499 1 .0002531 .0544594

Rhipicephalus microplus 0/100 0 0 0 .0362167*

Figura 1 y 2. Fragmentos de ADN amplificados de Anaplasma spp/Ehrlichia sp a partir de muestras de sangre y garrapatas de bovinos.

Conclusiones

Se demostró la presencia de las dos principales especies de garrapatas que afectan a la ganadería del trópico, identificadas como Rhipicephalus microplus y Amblyomma mixtum. Mediante el uso de pruebas moleculares se demostró la presencia de Anaplasma spp. / Ehrichia sp. en el 78% de las muestras sanguíneas, así como en el 66% en muestras de garrapatas identificadas como Amblyomma mixtum obtenidas de bovinos de la zona centro del estado de Veracruz. Asimismo, se determinó que existe asociación (vector/hospedero) en 24 muestras positivas a Anaplasma spp. y/o Erhlichia sp. obtenidas de bovinos de la zona centro del estado de Veracruz, con lo cual se obtiene información sobre la potencialidad de Amblyomma mixtum como vector de estos patógenos, misma que se desconoce.

En cuanto a Rickettsia spp, se encontró presente en muestras de bovinos y en la especie Amblyoma mixtum; sin embargo, estas muestras no se encontraban asociadas entre sí, no lográndose demostrar la asociación de variables en este estudio. Por otro lado, estudios recientes han demostrado que Amblyomma mixtum es un vector de Rickettsia spp. Con la evidencia molecular descrita con anterioridad, se confirma el primer acercamiento hacia esta especie de garrapata; sin embargo, se necesitan estudios complementarios para explorar a profundidad su actividad como vector y poder confirmar la misma.

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ENCUESTAAnexo 1 . Los datos proporcionados son tratados de forma confidencial y con fines de investigación

CÉDULA INDIVIDUAL POR ANIMAL

Fecha: FOLIO:

Ubicación RG: Ubicación GPS: Código postal: Municipio: Comunidad: Teléfono: Dirección:

Nombre del propietario:

Nombre o ID del animal: Hato:

Especie: Raza:

Sexo: Macho ( ) Hembra ( ) Edad:

Tipo de alimentación: Forraje ( ) Alimento procesado ( ) Otro ( )

Pastoreo: Si ( ) No ( )

¿De dónde se toma el agua proporcionada a los animales? Río ( ) Agua potable ( ) Pozo ( ) Represa ( ) Otro ( )

¿cuál es el fin zootécnico del animal? Pie de cría ( ) Reproducción ( ) Consumo propio ( ) Venta ( )

Otro ( )

¿Ha abortado algún animal? Si ( ) No ( )

¿Cuáles ID?

¿cuántas veces?

Descripción del feto:

Procedencia del animal

( ) Misma comunidad ( ) Mismo municipio ( ) Diferente comunidad ( ) Otro municipio

¿Presta sus animales a otro productor? Si ( ) No ( )

Ha introducido animales de otro rebaño? Si ( ) No ( )

Otro ( )

¿Ha abortado algún animal? Si ( ) No ( )

¿Cuáles ID?

¿cuántas veces?

Descripción del feto:

UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

ENCUESTA

Los datos proporcionados son tratados de forma confidencial y con fines de investigación

Procedencia del animal

( ) Misma comunidad ( ) Mismo municipio ( ) Diferente comunidad ( ) Otro municipio

¿Presta sus animales a otro productor? Si ( ) No ( )

¿Ha introducido animales de otro rebaño? Si ( ) No ( )

Programa de salud

¿Lleva un programa de desparasitación? Si ( ) No ( ) De ser si, ¿cuál utiliza?

¿Han sido vacunados los animales? Si ( ) No ( ) De ser si, ¿Qué vacunas ha aplicado?

¿Han enfermado los animales? Si ( ) No ( ) ¿Conviven con otros animales? Si ( ) No ( ) De ser si, ¿Cuál? Perro ( ) Caballo ( ) Otro: Bovino ( ) Cabra ( ) Oveja ( )

GARRAPATAS

¿Ha tenido garrapatas? Si ( ) No ( )

¿Ha aplicado algún baño garrapaticida? Si ( ) No ( ) De ser si, ¿con que producto?

¿Con qué frecuencia lo baña?

¿Ha utilizado algún otro método para eliminar la garrapata? Si ( ) especifique cuál: No ( )

Colecta de garrapatas en animal muestreado

¿Tiene garrapatas? Si ( ) No ( )

Grado de infestación: Moderado ( ) Medio ( ) Alto ( )

Lugar de localización y colecta de garrapatas.

OBSERVACIONES:

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ENCUESTA

Los datos proporcionados son tratados de forma confidencial y con fines de investigación

Anexo II.

ENCUENSTA GENERAL DE UNIDAD DE PRODUCCIÓN BOVINA

Fecha:______Folio:

UBICACIÓN Municipio:______Localidad:______

Ubicación GPS:______

Dirección:______

DATOS DEL PROPIETARIO Nombre:______

Teléfono:______

MANEJO Fin zootécnico: Leche ( ) Carne ( ) Doble propósito ( ) Pie de cría ( )

Otro:______

Procedencia de los animales ( ) Misma comunidad

( ) Misma municipio, diferente comunidad

( ) Diferente municipio, ¿cuál?______

( ) Diferente estado, ¿Cuál?______

Manejo zoosanitario Programa de vacunación: SI ( ) NO ( )

¿Cuál?______

Programa de desparasitación: SI ( ) NO ( )

¿Cuál?______

Alimentación Forraje ( ) Concentrado ( ) Pastoreo ( ) Otro ( ) Observaciones:______

AGUA: Potable ( ) Rio ( ) Pozo ( ) Presa ( ) Otro ( )

Observaciones:______

¿Conviven con otros animales? SI ( ) NO ( )

De ser si, ¿Cuáles?

Perro ( )

Gato ( )

Caballo ( )

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ENCUESTA

Los datos proporcionados son tratados de forma confidencial y con fines de investigación

Cerdo ( )

Borrego ( )

Cabra ( )

Otro: ______

SALUD Problemas reproductivos ______

Problemas respiratorios ______

Problemas dermatológicos ______

Problemas metabólicos ______

Observaciones:______

GARRAPATAS SI ( ) NO ( )

Control de las garrapatas:

Baño de inmersión ( ) Aspersión ( ) Inyección ( ) Otro ( )

______

¿Con que frecuencia?______

INSTALACIONES

“Lis de Veracruz: Arte, Ciencia, Luz” www.uv.mx