A First Phylogeny of the Genus Dimocarpusand Suggestions For

www.nature.com/scientificreports

OPEN A First Phylogeny of the Genus Dimocarpus and Suggestions for Revision of Some Taxa Based on Received: 6 March 2017 Accepted: 21 June 2017 Molecular and Morphological Published: xx xx xxxx Evidence Suparat K. Lithanatudom1, Tanawat Chaowasku2, Nattawadee Nantarat2, Theeranuch Jaroenkit3, Duncan R. Smith 4 & Pathrapol Lithanatudom2

Dimocarpus longan, commonly known as the longan, belongs to the family Sapindaceae, and is one of the most economically important fruits commonly cultivated in several regions in Asia. There are various cultivars of longan throughout the Thai-Malay peninsula region, but until now no phylogenetic analysis has been undertaken to determine the genetic relatedness of these cultivars. To address this issue, 6 loci, namely ITS2, matK, rbcL, trnH-psbA, trnL-I and trnL-trnF were amplifed and sequenced from 40 individuals consisting of 26 longan cultivars 2 types of lychee and 8 herbarium samples. The sequencing results were used to construct a phylogenetic tree using the neighbor-joining (NJ), maximum likelihood (ML) and Bayesian inference (BI) criteria. The tree showed cryptic groups of D. longan from the Thailand-Malaysia region (Dimocarpus longan spp.). This is the frst report of the genetic relationship of Dimocarpus based on multi-locus molecular markers and morphological characteristics. Multiple sequence alignments, phylogenetic trees and species delimitation support that Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus and Dimocarpus longan spp. malesianus var. malesianus should be placed into a higher order and are two additional species in the genus Dimocarpus. Therefore these two species require nomenclatural changes as Dimocarpus malesianus and Dimocarpus obtusus, respectively.

Dimocarpus is a genus belonging to the family Sapindaceae, also known as the soapberry family of fowering plants (Angiospermae)1. Te major characteristics of this genus are trees or shrubs which can grow up to 25–40 meters (m) tall with pinnate leaves. Te fowers are seen as large panicles. Te edible fruit is 3–5 centimeters (cm) long containing a single seed surrounded by a layer of fruit pulp2. Dimocarpus is primarily distributed in tropical South and Southeast Asia, ranging from Sri Lanka and India to East Malaysia and Australia3–6. Te well-recognized edible fruits derived from this genus known as longan are produced from Dimocarpus longan. Te most recent revision of the genus Dimocarpus was published in 1971, with additional minor modifcation in 19942, 5. According to Leenhouts (1971 and 1994), this genus comprises of only 6 species, namely Dimocarpus australianus (1973)6, Dimocarpus dentatus, Dimocarpus foveolatus, Dimocarpus fumatus, Dimocarpus gardneri and Dimocarpus longan. Furthermore, from 1974 to 1983, an additional 3 species have been included, namely Dimocarpus yunnanensis (1977)7, Dimocarpus confnis (1979)8 and Dimocarpus leichhardtii (1983)9 giving a current total of 9 species. However, the latest three proposed new species remain unresolved and therefore further research is needed to draw defnitive conclusions about this genus. In addition, there are 6 subspecies (spp.) identifed as part of this genus. Four of them belong to Dimocarpus fumatus while the other 2 subspecies are

1Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, 50290, Thailand. 2Center of Excellence in Bioresources for Agriculture, Industry and Medicine, Department of Biology, Faculty of Science, Chiang Mai University, Chiang Mai, 50200, Thailand. 3Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Production, Maejo University, Chiang Mai, 50290, Thailand. 4Institute of Molecular Biosciences, Mahidol University, 73170, Nakorn Pathom, Thailand. Tanawat Chaowasku and Nattawadee Nantarat contributed equally to this work. Correspondence and requests for materials should be addressed to S.K.L. (email: [email protected]) or P.L. (email: pathrapol_li@ hotmail.com)

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 1 www.nature.com/scientificreports/

Figure 1. (A) Te PCR fragment amplifed using trnH-psbA primers. Te smaller trnH-psbA PCR fragment was identifed only in the Tao sample (lane no. 6) (M = 100 bp DNA marker, − = Negative control, 1–10 = longan samples). (B) Te short trnH-psbA gene fragment amplifed from 5 Tao longan cultivars compared with other longan samples. Te deletion of trnH-psbA gene was detected in all of the Tao samples (lane 3–7) as compared with other longan cultivars (M = 100 bp DNA marker, − = Negative control, 1 = E-Daw, 2 = Lychee samples, 3–7 = Tao).

from Dimocarpus longan5, 6, 10. Of these, only Dimocarpus longan has its own variety. Two varieties including var. malesianus and var. echinatus belong to spp. malesianus, the other three varieties, var. obtusus, var. longan and var. longepetiolulatus, are all members of the spp. longan10. Commonly known as longan, Dimocarpus longan is the most well-known and important species from this genus. It produces an edible fruit and is widely cultivated in tropical and sub-tropical Asian countries such as China, Taiwan, Vietnam and Tailand11. In general, longan products are exported as fresh fruit or are processed to dried fruit which can be further processed to longan juice or syrup11. Nowadays, the demand for longan is rising due not only to the recent discovery of proposed medicinal properties of this fruit such as enhancing memory, promoting blood metabolism, relieving insomnia and preventing amnesia, but also because of the proposed benefcial activities of secondary metabolites from longan such as anti-oxidative, anti-obesity, anti-cancer, anti-tyrosinase, and immune-modulatory activities12–15. In China alone, more than 400 cultivars of Dimocarpus longan have been reported16. In contrast in Tailand, one of the world’s largest exporters of longan17, 26 cultivars are commonly grown for domestic consumption and export. In particular, there are 25 cultivars of Dimocarpus longan spp. longan var. longan and one cultivar characterized as Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus (commonly referred to as “Tao” by Tai people). Te most commonly planted cultivars in Tailand are E-Daw, Chompoo, BiewKhiew Chiangmai, Haew, Baidom and Phetsakorn. Each cultivar is named according to its origin and morphological characters and/or the name of breeder or discoverer18. Given the agricultural and medicinal signifcance of longan, a number of studies have tried to develop molecular markers to assess the diversity of the numerous longan cultivars grown locally in China, Indonesia and Tailand as well as in germplasm collections from various regions. Such markers could potentially assist breeding program and facilitate authentication strategies such as, Random Amplifed Polymorphic DNA (RAPD)19, Amplifcation Fragment Length Polymorphism (AFLP)20, Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)21 and Single Nucleotide Polymorphism (SNP)17. Surprisingly however, no study has determined the genetic relationships between longan cultivars coupled with an evolutionary (phylogeny) analysis, or assessed the results in relationship to other taxa of the genus Dimocarpus. Furthermore, it should be noted that even the latest revision to genus Dimocarpus (1994) was based solely on morphological data2. Te acquisition of molecular data is therefore necessary to prove and/or support the previous taxonomic classifcation of this particular genus. In this study, we aimed to investigate the evolutionary relationship of the genus Dimocarpus including longan cultivars (Dimocarpuslongan spp. longan) commonly grown in Tailand and determine the validity of species boundaries in Dimocarpus by combining multi-gene molecular phylogeny and morphological approaches. In addition, we use species delimitation methods to gain insights into species designations of the possibly con- founding morphological characters used for Dimocarpus taxonomy. Tese results should be of high interest to academics concerned about the future genetic conservation of Dimocarpus in the Tai-Malay peninsula region. Results Data analysis. Te sizes of PCR products amplifed from ITS2, matK, rbcL, trnH-psbA, trnL-I and trnL-trnF primer were about 300, 690, 540, 520, 340 and 380 base pairs (bp), respectively. Observation of PCR products afer electrophoresis though 1.5% agarose gels revealed diferent product sizes of the trnH-psbA PCR fragment amongst the longan samples (Fig. 1A). Te diferent PCR product sizes may be due to an InDel mutation which was found only in Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus (Tao) (lane no. 6 in Fig. 1A). Te PCR amplifcation was performed with another 4 DNA samples extracted from diferent longan trees which were all Tao

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 2 www.nature.com/scientificreports/

Figure 2. Multiple sequence alignment result of trnH-psbA gene. Te InDel mutation is in the box and base substitution are indicated by black triangles.

cultivar, and the results showed a smaller trnH-psbA PCR fragment in all samples in comparison with other longan cultivars (Fig. 1B). Conservation of the matK and rbcL gene sequences was observed afer multiple sequence alignment. However, signifcant diversity was observed in the trnH-psbA gene amongst the 26 longan and 2 lychee cultivars. Tree locations of InDel mutations and 2 locations of nucleotide substitution were found afer the multiple sequence alignment. Interestingly, a 70 nucleotide deletion at position 109 to 178 was observed only in the Tao cultivar. A six nucleotide deletion at position 254 to 259 was found in Tao, Daw Kaew Yee, Baan-Hong 60, Phuen-Mueang and the 2 lychee cultivars. An adenine base insertion at position 289 was found in 4 longan cultivars, namely Tao, Daw Kaew Yee, Baan-Hong 60 and Phuen-Mueang. An adenine base substitution was detected in only 2 lychee cultivars whereas a guanine base substitution was found in the 2 lychee samples and the Tao cultivar. Moreover, a six base pair deletion was found in Tao, Daw Kaew Yee, Baan-Hong 60 and Phuen-Mueang samples. A second nucleotide substitution (guanine; G) occurred at position 277 in Tao and the 2 lychee samples. Finally the insertion of an adenine was detected in the Tao, Daw Kaew Yee, Baan-Hong 60 and Phuen-Mueang cultivars. Te result of multiple sequence alignment of trnH-psbA gene is shown in Fig. 2.

Phylogenetic analysis. A total of 40 individual samples (including out groups) consisting of 3 species 2 subspecies and 26 longan cultivars were used to reconstruct the phylogenetic trees based on the nuclear ITS2 region and 5 plastid markers (matK, rbcL, trnH-psbA, trnL-i and trnL-trnF). A partition homogeneity test by PAUP 4.0b10, using 100 replicates22 showed no signifcant diferences were found between markers (P = 0.095). Te uncorrected p-distance between the taxa ranged from 0.003 to 0.023 [inter/intraspecifc p-distances = 0.013 and 0.001, respectively]. The phylogeny based concatenate of nuDNA and chDNA showed the evolutionary relationship among Dimocarpus and its position (Fig. 3). All trees from each DNA dataset were almost congruent in topology. Te phylogenetic tree was divided into two main clades with high statistical support (Clade A and Clade B in Fig. 3) with 100, 100 of NJ and ML bootstraps and 1.00 of BI support. Dimocarpus was monophyletic and well separated from the out group. Clade A also divided into 4 sub-clades as Clade 1a, 2a, 3a and 4a with moderate to high statistical support (Fig. 3). Te 4 sub-clades consist of D. longan spp. longan var. obtusus (Tao) (Clade 1a in Fig. 3) with 99, 100 of NJ and ML bootstraps and 1.00 of BI support, the D. longan spp. longan var. longan were grouped together (Clade 2a in Fig. 3) with 0.83 of BI support, D. autralianus (from Australia) and D. fumatus (from

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 3 www.nature.com/scientificreports/

Figure 3. Combined gene phylogenetic tree for Dimocarpus. Combined gene (ITS2, matK, rbcL, trnH-psbA, trnL-i and trnL-trnF) Maximum likelihood tree for Dimocarpus. We provide neighbor-joining, maximum likelihood (bootstrap support, B) and Bayesian Inference (posterior probability, PP) support values for each node, respectively.

Malaysis) were grouped together (Clade 3a in Fig. 3) with 99, 100 of NJ and ML bootstraps and 1.00 of BI support and D. longan spp. malesianus var. malesianus (Clade 4a in Fig. 3) with 70, 73 of NJ and ML bootstraps and 0.95 of BI support. Te result shows that Dimocarpus longan was polyphyletic and separated into three sub-clades as 1a, 2a and 4a (Fig. 3). Tis result shows that the taxonomy of Dimocarpus longan is confusing and needs to be clarifed.

Species Delimitation. Te PTP analysis revealed that the likelihood of the null model in that all sequences belong to a single species was found to be signifcantly lower than the maximum likelihood species delimitation (P < 0.001). For the PTP analysis, the results revealed delimitation of fve in group PSHs, hereafer denoted PSH-A to PSH-E (Fig. 4). Dimocarpus longan sensulato was delimited as three PSHs (PSH-A, PSH-B and PSH-E in Fig. 4). Te tree showed the cryptic groups of Dimocarpus longan from both Tailand and the Malaysia region. Cryptic group designations of both PTP- and ABGD-delimited PSHs labels are almost similar, except for PSH-E that ABGD-delimited divided to be 2 sub-groups (Fig. 4). Te GMYC-delimited method resulted in recovery of 13 PSHs within Dimocarpus. Te results did not confict with PTP- and ABGD-delimited PSHs but suggested additional phylogenetic species within PTP-delimited PSHs for the Dimocarpus cultivars from Tailand (PSH-B in Fig. 4) and Dimocarpus longan spp. malesianus var. malesianus from Malaysia. Te GMYC, ABGD results were almost consistent with the fve PSHs identifed by PTP, except for PSH-B and PSH-E. Discussion Te PCR product of the trnH-psbA gene run on 1.5% agarose gels showed a smaller PCR fragment in lane number 6 which was the Tao cultivar (Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus) (Fig. 1A and B). Te diferentiation of the PCR product might be caused by an InDel mutation occurring inside this gene. Te PCR amplifcation was not only performed on one sample of a Tao cultivar, but 4 more DNA samples were extracted from other Tao cultivar trees which were used to confrm the 70 bp deletion of this gene in the Tao cultivar. Te trnH-psbA gene fragments amplifed from the 5 Tao samples all showed the same size which confrmed the unique deletion of the trnH-psbA gene in the Tao cultivar (Fig. 1B). Tis unique genetic pattern which is found only in the Tao cultivar can be applied as an easy and cost efectively genetic marker to identify the Tao cultivar.

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 4 www.nature.com/scientificreports/

Figure 4. Species delimitation analyses on the concatenated dataset. Te tree of species delimitation analyses was reconstructed using Poisson Tree Processes (PTP), Automatic Barcode Gap Discovery (ABGD), and General Mixed Yule Coalescent (GMYC) and was labeled with Bayesian (posterior probability, P; top) support values for each node on this Bayesian phylogenetic tree.

Te maximum likelihood tree based on concatenation of nuDNA and chDNA (Fig. 3) revealed the relationship and positions of Dimocarpus spp. in Tailand and nearby countries. Te examination of individual trees showed slight diferences, but results were broadly consistent with the concatenated tree topologies. Dimocarpus longan was polyphyletic and divided into 3 sub-clades, designated as Clade 1a, 2a and 4a with moderate to high statistical support (Fig. 3). Te multi-gene phylogenetic analyses, in combination with species delimitation methods, revealed evidence that Dimocarpus longan sensulato showed morphological cryptic diversity (Figs 3 and 4). Additionally, longan historically recognized as Dimocarpus longan with various subspecies and varieties (D. longan spp. longan var. obtusus (Clade 1a in Fig. 3), D. longan spp. longan var. longan (Clade 2a in Fig. 3), D. longan spp. malesianus var. echinatus (Clade 2a in Fig. 3) and D. longan spp. malesianus var. malesianus (Clade 4a in Fig. 3) segregated into diferent clades. Tis result challenges the validity of the species and subspecies of Dimocarpus. Tis cryptic diversity strongly supports the taxonomic description asa new species, albeit in concert with other characteristic such as sympatric/allopatric speciation, ecology, hybridization and morphology23. Te phylogenetic trees were supported by three of the species delimitation approaches (PTP, ABGD, GMYC in Fig. 3) which identifed additional PSHs within not only D. longan spp. longan var. longan, but also suggested that some of subspecies should be rearranged and recognized as species, especially, D. longan spp. longan var. obtusus (Clade 1a in Fig. 3 and PSH-A in Fig. 4) and D. longan spp. malesianus var. malesianus (Clade 4a in Fig. 3 and PSH-E in Fig. 4). Notably, D. longan was not monophyletic in any of our phylogenetic trees. Tese results are also supported by the diferent morphological characters between D. longan spp. longan var. longan (Clade 2a in Fig. 3 and PSH-B in Fig. 4), D. longan spp. longan var. obtusus (Clade 1a in Fig. 3 and PSH-A in Fig. 4), and D. longan spp. malesianus var. malesianus (Clade 4a in Fig. 3 and PSH-E in Fig. 4) which show large diferences in morphological

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 5 www.nature.com/scientificreports/

D. longan spp. longan D. longan spp. malesianus Characteristic D. longan spp. longan var. longan var. obtusus var. malesianus Habit tree scandent shrub tree Twigs brown to dark brown whitish grey brown Petals reduced reduced well-developed mostly pusticulate to granulate and nearly Fruits areolate, not granular smooth to warty smooth, sometimes aculeate or colliculate Petioles and rachis glabrous glabrous tomentose Apex of leafets acute obtuse to emarginate acute to acuminate Lower surface of leafets glabrous tomentose tomentose Midrib on upper surface fat fat sunken

Table 1. Te morphological characteristic comparison of 3 varieties of Dimocarpus longan2, 5, 6.

features such as habit, twigs, petals, fruits, petioles and rachis, and leafets as detailed in Table 1. According to our results based on molecular and morphological approaches, it is strongly suggested that three subspecies/varieties of the D. longan species complex should be recognized as three distinct species, two of which are elevated to species rank: D. malesianus (Clade 4a in Fig. 3) and D. obtusus (clade 1a in Fig. 3), while D. longan spp. malesianus var. echinatus is reclassifed as D. longan var. echinatus (clade 2a in Fig. 3) instead of synonymizing it with D. longan var. longan because of its unique long-spined fruits as well as some molecular autapomorphies, and when more DNA regions have been sequenced for all accessions, this taxon could end up outside other D. longan var. longan. In addition, the sample D3 which is Dimocarpus sp. is grouped in clade 2a together with other D. longan and it is sister to a clade of D. longan var. longan and D. longan var. echinatus; therefore, this taxon should be classifed in its own variety of D. longan although the material available is not sufcient to fully support this. Te longan varieties with names consisting of “Daw” such as E-Daw, Daw 20, Daw 27, Daw 75, Daw-Kaankhaeng, Daw-Luang, Daw Kaew Yee, Daw-Kaan-On, Daw-Lumnam-Ping, Daw-Sudhum and Daw 13 (Clade 2a in Fig. 3 and PSH-B in Fig. 4) might have diferent genetic backgrounds. Tis is supported by the GMYC species delimitation method, and revealed the diversity of longan cultivars in Tailand that will be useful for conservation management of this plant in the future. Finally, there is a need for more sensitive markers to be used to clarify the relationship of these longan cultivars in the future. On the basis of phylogenetic tree reconstruction (Fig. 3), species delimitation analyses (Fig. 4) and morphological diferentiation (Table 1), we propose that in the D. longan species complex three species are recognized, one of which is D. longan, corresponding to clade 2a in Fig. 3. Te other two species require nomenclatural changes as follows:

1. Dimocarpus malesianus (Leenh.) Lithanatudom & Chaowasku, comb. et stat. nov. Basionym: Dimocarpus longan ssp. malesianus Leenh. In Blumea 19: 19715. Tis species corresponds to clade 4a of Fig. 3. 2. Dimocarpus obtusus24 Lithanatudom & Chaowasku, comb. et stat. nov. Basionym: Euphoria longana var. obtusa Pierre in Fl. Forest. Cochinch.[Fasc. 20]: 1895 (t. 318)24. Homotypic synonym: Dimocarpus longan ssp. longan var. obtusus24 Leenh. In Blumea 19: 19715. Tis species corresponds to clade 1a of Fig. 3.

DNA barcoding is a tool for species identifcation25 and the result from this study showed the successfully discrimination of the Tao cultivar from other longan samples. In Tailand, the family Sapindaceae is divided into 2 species based on various characteristic such as stem, fruit and seed, etc. Te two species of longan in Tailand consist of the Euphoria longana Lamk (synonyms: Dimocarpus longan Lour., Nephelium longana Cambess) and Euphoria scandens Winit Kerr. (synonyms: Dimocarpus longan ssp. longan var. obtusus (Pierre) Leenh)26, 27. As the Tao cultivar is defned as Euphoria scandens Winit Kerr and is found only in Tailand3 the DNA barcoding result from this study supports the proposal that Tao is a longan species diferent from other longan cultivars in Tailand. Te paradoxical classifcation of longan was described by Choo and Ketsa (1991) who listed two subspecies and fve varieties of Dimocarpus longan. Te classifcation of Tao cultivar is defned as Dimocarpus longan ssp. longan var. obtusus24 Leenh whereas others longan cultivar in Tailand are the Dimocarpus longan ssp. longan var. longan. From this information the Tao cultivar is classifed to be the same subspecies as other longan cultivars but just a diferent variety3, 10. Nevertheless, the DNA barcoding result from our study make the information more clear by supporting that the Tao cultivar should be classifed as a diferent species from other longan cultivars as noted above. Tis is further supported by Jaroenkit, T.18, who noted that the special character of the Tao cultivar was due to its creeping plant-like nature as opposed to others longan cultivar which are per- ennial plants. Methods Plant Material and Sampling. A total of 40 samples used in this study consisted of young leaves collected from 26 longan cultivars and 2 types of lychee which have been maintained at Maejo University, Sansai, Chiang Mai, Tailand, and 8 herbarium samples from various locations. Te sampling locations are shown in Fig. 5. Sample code, cultivar name and herbarium voucher number of all plant samples are given in Table 2.

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 6 www.nature.com/scientificreports/

Figure 5. Map of sampling location. Location no. 1 is the location of longan cultivars no. 1–26 and 2 types of lychee (L1 and L2) which have been maintained at Maejo University, Sansai, Chiang Mai, Tailand. Location no. 2–9 represent the location of the herbarium samples. Tis fgure was modifed by using the Photoshop program. Te source of this fgure can be found at https://commons.wikimedia.org/wiki/File:White_World_Map_Blank. png which is licensed under the “Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported” that is free to share (to copy, distribute and transmit the work) and remix (to adapt the work).

DNA extraction, PCR amplifcation and sequencing. Total genomic DNA was extracted from young leaves using the cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method28. While the herbarium DNA extractions were performed using a CTAB method29 modifed as according to Bakker30. Te quantity and quality of the genomic DNA was analyzed by electrophoresis through 1% agarose gels and the 260/280 nm absorbance ratio as determined by spectrophotometry. Te genomic DNA was used as a template for PCR amplifcation using 6 spe- cifc primer pairs directed to the nuclear internal transcribed spacer (ITS2)31, 32, matK33, rbcL34, 35, trnH-psbA36, trnL (UAA) intron (trnL-i)37 and trnL-trn intergenic spacer (trnL-trnF)38. Sequences of DNA barcoding primers are shown in Table 3. Te PCR amplifcation step was an initial 95 °C for 5 min followed by 35 cycles of denaturation at 95 °C for 30 sec, annealing for 45 sec and extension at 72 °C for 1 min, and the fnal extension step was performed at 72 °C for 10 min. Te PCR products were run on 1.5% agarose gels in 0.5X TBE bufer. Te PCR fragments were visualized under UV light afer staining with SYBR SAFE DNA Gel Stain (Invitrogen, U.S.A). Te PCR products amplifed from the 6 loci were further analyzed by DNA sequencing.

Molecular Analyses. The BioEdit Sequence Aligment Editor program39 was used to analyze the DNA sequences resulting from sequence analysis of the PCR products generated with the six barcoding primer pairs. Te ClustalW program with additional manual curation was used to analyze multiple sequence alignments in order to observe the sequence conservation among longan cultivars. Te nuclear ITS2 region sequence and 5 plastid markers consist of both coding (matK and rbcL exons) and non-coding regions (trnH-psbA, trnL-trnF and trnL-i) were used to reconstruct the phylogeny. All sequences were checked for ambiguous nucleotide sites and saturation before being subjected to phylogenetic analysis. Te uncorrected pairwise distances for transition and transversion substitutions were plotted to visualize saturation and detect the taxa responsible. Analysis of genes separately and in combination was performed using the neighbor-joining (NJ), maximum likelihood (ML)40 and Bayesian inference (BI) criteria. jModeltest2.1.141 was used to calculate and determine the best evolutionary substitution model by the Akaike Information Criterion (AIC)42 and showed that HKY + G (G = 0.05) model for ITS2, HKY for matK, trnH-psbA, trnL-i and trnL-trnF, and JC for rbcL. Te incongruence length diference test43 in the partition homogeneity test in PAUP 4.0b10 using 100 repli- cates22 were performed to test the concatenated data sets. To assess support at each node, non-parametric bootstrap analyses44, 45 were performed using PAUP* version 4.0b1022. For coding genes, frst and second codon, third codon and all codon positions were tested. Te mutation rates were partitioned among genes in concatenated data sets based on model as above. Te NJ analysis and the likelihood scores of diferent data partitions were carried out using PAUP* version 4.0b1022 with bootstrap re-sampling44, 45 with 1000 replicates. Te maximum likelihood40 analysis was undertaken using RAxML v. 7.2.746, 47. Te bootstrap resampling44 with 1000 replicates were performed to support the individual branches of the ML tree. Bayesian inference (BI) analysis was undertaken using MrBayes version 3.2.548. Te 4 chains of a Markov chain Monte Carlo algorithm (MCMC) were used in this criterion. Te analysis was run for 10 million generations with

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 7 www.nature.com/scientificreports/

Sample number Name Cultivar name Voucher number (Herbarium) 1 Dimocarpus longan spp. longan var. longan E-Daw Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #1 (CMUB) 2 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Chomphoo Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #2 (CMUB) 3 Dimocarpus longan spp. longan var. longan BiewKhiew Chiangmai Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #3 (CMUB) 4 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Haew Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #4 (CMUB) 5 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Phuangthong Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #5 (CMUB) 6-1 Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus Tao-1 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #6 (CMUB) 6-2 Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus Tao-2 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #7 (CMUB) 6-3 Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus Tao-3 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #8 (CMUB) 6-4 Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus Tao-4 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #9 (CMUB) 6-5 Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus Tao-5 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #10 (CMUB) 7 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Baidam Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #11 (CMUB) 8 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Phetsakorn Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #12 (CMUB) 9 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Krob-Ka-Ti Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #13 (CMUB) 10 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Jumbo Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #14 (CMUB) 11 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw 20 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #15 (CMUB) 12 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw 27 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #16 (CMUB) 13 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw 75 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #17 (CMUB) 14 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw-Kaankhaeng Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #18 (CMUB) 15 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw-Luang Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #19 (CMUB) 16 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw Kaew Yee Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #20 (CMUB) 17 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw-Kaan-Deang Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #21 (CMUB) 18 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw-Kaan-On Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #22 (CMUB) 19 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw-Lumnam-Ping Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #23 (CMUB) 20 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw-Sudhum Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #24 (CMUB) 21 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daw 13 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #25 (CMUB) 22 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Daengklome Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #26 (CMUB) 23 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Baiyoke Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #27 (CMUB) 24 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Namphueng Tavai Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #28 (CMUB) 25 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Baan-Hong 60 Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #29 (CMUB) 26 Dimocarpus longan spp. longan var. longan Phuen-Mueang Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #30 (CMUB) D1 Dimocarpus longan spp. malesianus var. malesianus — KEP AA 2141 (Herbarium Wanariset East Kalimantan, Indonesia) D3 Dimocarpus sp. — KEP 6894 (Flora of pulau Tengah; Malaysia) D4 Dimocarpus longan spp. malesianus var. malesianus — KEP 4343 (Phytochemical Survey of Malaysia Herbarium) D5 Dimocarpus fumatus — KEP 4391 (Phytochemical Survey of Malaysia Herbarium) D6 Dimocarpus fumatus — KEP 4315 (Phytochemical Survey of Malaysia Herbarium) D8 Dimocarpus australianus — KEP 3277 (Herbarium KEP Forest Research Institute Malaysia) D9 Dimocarpus longan spp. malesianus var. echinatus — KEP 116884 (Herbarium of the Forest Department Sandakan) D10 Dimocarpus longan spp. malesianus var. malesianus — SING 2021-231 (Singapore Botanic Gardens Herbarium) L1 Litchi chinensis Brewster Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #31 (CMUB) L2 Litchi chinensis Hong Huey Jaroenkit T, Manochai P, Lithanatudom SK. #32 (CMUB)

Table 2. Sample code, cultivar name voucher number and herbarium of plant samples.

a 0.05 heating parameter. Te convergence of analysis was estimated using Tracer 1.4.149, and reliable ESS values (>200) were ensured. Te sampling was done for every 100 generations and then the frst 25% of trees were dis- carded using a burn-in procedure. Support for nodes was defned as posterior probabilities (P). Te tree topological diferences between single-gene phylogenetic trees were compared at the level of resolution obtained by each marker and its bootstrap support. Topological diferences of the trees with bootstrap support (BS) and posterior probability (P) less than 75% were not considered. Two lychee cultivars, namely Brewster and Hong Houy were used to root the tree as the out group50.

Bayesian species delimitation. Te validity of Dimocarpus sp. was re-investigated using three methods of species delimitation analyses: (i) Poisson Tree Processes (PTP)51; (ii) Automatic Barcode Gap Discovery (ABGD)52; and (iii) Generalized Mixed Yule-Coalescent (GMYC)40, 53. For ABGC52, genetic distances between samples were evaluated using the Kimura two parameters (K2P) model, a standard metric in DNA barcoding studies. Te ABGD was run via web server http://wwwabi.snv.jus- sieu.fr/public/abgd/abgdweb.html using default values, except for the relative gap width (X) that was set to 10 to avoid the capture of smaller local gaps.

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 8 www.nature.com/scientificreports/

Primer Primer sequence (5′ to 3′) Reference F:ATGCGATACTTGGTGTGAAT Chen and others31 ITS2 R:TCCTCCGCTTATTGATATGC White and others32 F:CCCRTYCATCTGGAAATCTTGGTTC matK Yu and others33 R:GCTRTRATAATGAGAAAGATTTCTGC F:ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC Levin and others34 rbcL R:GTAAAATCAAGTCCACCRCG Kress and Erickson35 F:ATTCACAATCCACTGCCTTG trnH-psbA Hajiahmadi and others36 R:ATGGCTTTCAACCTAAATGG F:CGAAATCGGTAGACGCTACG trnL-i Quemere and others37 R:GGGGATAGAGGGACTTGAAC F:GGTTCAAGTCCCTCTATCCC trnL-trnF Amundsen38 R:ATTTGAACTGGTGACACGAG

Table 3. Primers for PCR amplifcation.

For PTP and GMYC53, all samples of Dimocarpus were included. Tese methods use a phylogenetic input tree from which the ft of speciation and coalescent processes are modeled to delineate a Primary Species Hypotheses (PSHs). Te branch lengths were estimated under a relaxed log-normal clock algorithm as an implement in BEAST v1.8.2 package54. HKY + G model was applied to construct the tree. Te MCMC chains were run for 10 × 106 generations with a sampling step performed for every 100 and 10% burnin. Te MCMC output was determined by examination of traces in Tracer 1.655 and analyzed with TreeAnnotator 1.7.4 using all trees afer the burnin. A posterior probability limit of 0.5 with maximum clade credibility tree was set. Both the single-threshold and the multiple-threshold versions of the GMYC model53 were optimized onto the output tree with the help of the SPLITS v.1.0–19 package for R. Te PTP method was executed using the best-scoring ML tree produced earlier using RAxML v. 7.2.756, and was run in Python using the Environment for Tree Exploration package57. Data availbility statement. Te data sets generated and analysed during the current study are available within the paper. All GenBank accession numbers (KY174077-KY174314) o f nucleotide sequences of six loci from individual samples analysed in this study can be retrieved through the NCBI database. Conclusion Tis is the frst report of the genetic relationship of Dimocarpus based on multi-locus molecular markers and morphological characteristics. Multiple sequence alignment, phylogenetic tree analysis and species delimitation supported that Dimocarpus longan spp. longan var. obtusus and Dimocarpus longan spp. malesianus var. malesianus should be classifed to be diferent species from Dimocarpus longan spp. longan. Moreover, sequencing of the DNA barcode revealed the possibility of diferent species among Tai longan cultivar such as Daw Kaew Yee, Baan-Hong 60 and Phuen-Mueang cultivars. However, more evidence is required to confrm this proposition. References 1. Lim, T. Edible Medicinal And Non-Medicinal Plants Vol. 6 (Springer Science & Business Media, 2013). 2. Leenhouts, P. W. In Spermatophyta: Flowering Plants Vol. 11 (eds F. Adema, P. W. Leenhouts, & P. C. van Welzen) 511–519 (Leiden University, Netherlands., 1994). 3. Janick, J. Horticultural Reviews (Wiley, 2010). 4. Welzen, P. C. V. & Verheij, E. W. M. In Plant Resources of South-East Asia No. 2, Edible Fruits and Nuts. (ed. E. W. M. and Coronel Verheij, R. E.) 235–240 (Pudoc-DLO, Wageningen, 1992). 5. Leenhouts, P. W. A revision of Dimocarpus (Sapindaccar). Blumca 19, 113–131 (1971). 6. Leenhouts, P. W. A new species of Dimocarpus (Sapindaceae) from Australia. Blumea 21, 377–380 (1973). 7. Wu, C. Y. & Ming, T. L. Dimocarpus yunnanensis (W. T. Wang). Fl. Yunnan 1, 269 (1977). 8. Lo, H. S. Dimocarpus confnis (F. C. How & C. N. Ho). Acta Phytotax. Sin. 17, 32 (1979). 9. Reynolds, S. T. Dimocarpus leichhardtii (Benth.). Austrobaileya 1, 495 (1983). 10. Choo, W. K. & Ketsa, S. In Plant Resources of South-East Asia. No. 2. Edible Fruits and Nuts (eds E. W. M. Verheij and R. E. Coronel) Ch. 146–151 (1991). 11. Rangkadilok, N. et al. Evaluation of free radical scavenging and antityrosinase activities of standardized longan fruit extract. Food Chem Toxicol 45, 328–336 (2007). 12. Park, S. J. et al. Te memory-enhancing efects of Euphoria longan fruit extract in mice. J Ethnopharmacol 128, 160–165 (2010). 13. Prasad, K. N. et al. Enhanced antioxidant and antityrosinase activities of longan fruit pericarp by ultra-high-pressure-assisted extraction. J Pharm Biomed Anal 51, 471–477 (2009). 14. Zhong, K., Wang, Q., He, Y. & He, X. Evaluation of radicals scavenging, immunity-modulatory and antitumor activities of longan polysaccharides with ultrasonic extraction on in S180 tumor mice models. Int J Biol Macromol 47, 356–360 (2010). 15. Yang, L., Fu, S., Khan, M. A., Zeng, W. & Fu, J. Molecular cloning and development of RAPD-SCAR markers for Dimocarpus longan variety authentication. Springerplus 2, 501 (2013). 16. Liu, X. H. & Ma, C. L. Production and research of longan in China. Acta Hort. 558, 73–82 (2001). 17. Wang, B. et al. Developing single nucleotide polymorphism (SNP) markers from transcriptome sequences for identifcation of longan (Dimocarpus longan) germplasm. Horticulture Research 65, 1–10 (2015). 18. Jaroenkit, T. Longan cultivar in Maejo 62 (Maejo Longan Research and Development Center, Chiang Mai, Tailand, 2015). 19. Mei, Z. Q. et al. Genetic characterization and authentication of Dimocarpus longan Lour. using an improved RAPD technique. Genet Mol Res 13, 1447–1455 (2014). 20. Lin, T., Lina, Y. & Ishikib, K. Genetic diversity of Dimocarpus longan in China revealed by AFLP markers and partial rbcL gene sequences. Scientia Horticulturae 103, 489–498 (2005).

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 9 www.nature.com/scientificreports/

21. Mariana, B. D., Sugiyatno, A. & Supriyanto, A. Genetic Diversity of Local Accessions of Dimocarpus longan Revealed By ISSR Markers. Buletin Plasma Nutfah 17, 25–29 (2011). 22. PAUP*: phylogenetic analysis using parsimony, version 4.0 b10 (2003). 23. Brian, S. H., Rebecca, C. V., Sarah, K. S. & Scott, R. S. Cryptic diversity within two endemic crayfsh species of the Southeastern US revealed by molecular genetics and geometric morphometrics. Hydrobiologia 755, 283–298 (2015). 24. Pierre, L. Flore forestière de la Cochinchine [Fascicule 20] (O. Doin, Paris, 1895). 25. Hollingsworth, P. M., Forrest, L. L., Spouge, J. L., Hajibabaei, M. & Ratnasingham, S. A DNA barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci USA 106, 12794–12797 (2009). 26. Subhadrabandhu, S. Lychee and longan cultivation in Tailand (Rumthai Publ. Bangkok, Tailand, 1990). 27. Smitinand, T., Santisuk, T. & Phengklai, C. Te manual of Dipterocarpaceae of mainland Soutn-East Asia. Tai Forest Bulletin of Botany 12, 1–137 (1980). 28. Doyle, L. J. & Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12, 13–14 (1990). 29. Doyle, J. J. & Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19, 11–15 (1987). 30. Bakker, F. T., Hellbrügge, D., Culham, A. & Gibby, M. Phylogenetic relationships within Pelargonium sect. Peristera (Geraniaceae) inferred from nrDNA and cpDNA sequence comparisons. Plant Systematics and Evolution 211, 273–287 (1998). 31. Chen, S. et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One 5, e8613 (2010). 32. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. & Taylor, J. In PCR Protocols: a guide to methods and applications (eds M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky & T. J. White) 315–322 (Academic Press, New York, USA, 1990). 33. Yu, J., Xue, J. H. & Zhou, S. L. New universal matK primers for DNA barcoding angiosperms. Journal of Systematics and Evolution Special Issue: Plant DNA barcoding in China 49, 176–181 (2011). 34. Levin, R. A. et al. Family-level relationships of Onagraceae based on chloroplast rbcL and ndhF data. Am J Bot 90, 107–115 (2003). 35. Kress, W. J. & Erickson, D. L. A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region. PLoS One 2, e508 (2007). 36. Hajiahmadi, Z., Talebi, M. & Sayed-Tabatabaei, B. E. Studying genetic variability of pomegranate (Punica granatum L.) based on chloroplast DNA and barcode genes. Mol Biotechnol 55, 249–259 (2013). 37. Quemere, E. et al. A DNA metabarcoding study of a primate dietary diversity and plasticity across its entire fragmented range. PLoS One 8, e58971 (2013). 38. Amundsen, K. Agrostis Species Relationships Based on trnL-trnF and atpI-atpH Intergenic Spacer Regions. Hortscience 47, 18–24 (2012). 39. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.Nucl. Acids. Symp. Ser. 41, 95–98 (1999). 40. Pons, J. et al. Sequence-based species delimitation for the DNA taxonomy of undescribed insects. Syst Biol 55, 595–609 (2006). 41. Darriba, D., G. L., T., Doallo, R. & Posada, D. jModelTest 2: more models, new heuristics and parallel computing. Nat Methods 9, 772 (2012). 42. Akaika, H. A new look at the statistic model identifcation. IEEE 19, 716–723 (1974). 43. Farris, J. S., Kallersjo, M., Kluge, A. G. & Bult, C. Constructing a Signifcance Test for Incongruence. Systematic Biology 44, 570–572 (1995). 44. Felsenstein, J. Confdence Limits on Phylogenies: An Approach Using the Bootstrap. Evolution 39, 783–791 (1985). 45. Felsenstein, J. Bootstraps and testing trees. papers2://publication/uuid/FF574B71-EBF4-44B3-9C94-E3D6AC19ED83 (2008). 46. Stamatakis, A., Hoover, P. & Rougemont, J. A rapid bootstrap algorithm for the RAxML Web servers. Syst Biol 57, 758–771 (2008). 47. Stamatakis, A. & Ott, M. Efcient computation of the phylogenetic likelihood function on multi-gene alignments and multi-core architectures. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 363, 3977–3984 (2008). 48. Ronquist, F. et al. MrBayes 3.2: efcient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space. Syst Biol 61, 539–542 (2012). 49. Drummond, A. J. & Rambaut, A. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees. BMC Evol Biol 7, 214 (2007). 50. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A. & Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol 30, 2725–2729 (2013). 51. Zhang, J., Kapli, P., Pavlidis, P. & Stamatakis, A. A general species delimitation method with applications to phylogenetic placements. Bioinformatics 29, 2869–2876 (2013). 52. Puillandre, N., Lambert, A., Brouillet, S. & Achaz, G. ABGD, Automatic Barcode Gap Discovery for primary species delimitation. Mol Ecol 21, 1864–1877 (2012). 53. Monaghan, M. T. et al. Accelerated species inventory on Madagascar using coalescent-based models of species delineation. Syst Biol 58, 298–311 (2009). 54. Drummond, A. J., Suchard, M. A., Xie, D. & Rambaut, A. Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7. Mol Biol Evol 29, 1969–1973 (2012). 55. Rambaut, A., Suchard, M. A., Xie. D. & Drummond, A. J. Tracer v1.6 http://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer (2014). 56. Stamatakis, A. RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. Bioinformatics 30, 1312–1313 (2014). 57. Huerta-Cepas, J., Dopazo, J. & Gabaldon, T. ETE: a python Environment for Tree Exploration. BMC Bioinformatics 11, 24 (2010). Acknowledgements Te longan leave samples were kindly provided by Asst. Prof. Dr. Saengtong Pongjaroenkit and Miss Junpen Sara, Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, Tailand. Te information on longan cultivars in Maejo University was kindly provided by Asst. Prof. Pawin Manochai, Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Production, Maejo University, Chiang Mai, Tailand. Te curators of KEP and SING herbaria are acknowledged for their kindness in allowing us to extract the DNA from their valuable specimens. Tis research was supported by Te National Research Council of Tailand (NRCT) research grant fscal year 2015 and Tailand Research Fund (TRF) TRG5780196 (SKL). Author Contributions S.K.L. performed research. S.K.L. and P.L. designed the research study. S.K.L., T.C. and T.J. collected and provided samples. S.K.L., T.C. and N.N. analysed the data. S.K.L., P.L., T.C., N.N. and D.R.S. wrote the manuscript. All authors approved the fnal version of this manuscript. Additional Information Competing Interests: Te authors declare that they have no competing interests.

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 10 www.nature.com/scientificreports/

Publisher's note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional afliations. Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a link to the Cre- ative Commons license, and indicate if changes were made. Te images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons license and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

SCiEntifiC REPOrTS | 7: 6716 | DOI:10.1038/s41598-017-07045-7 11 กำรศึกษำพันธุ์ขั้นต้นและกำรเปรียบเทียบผลผลิตของสำยพันธุ์ข้ำวเหนียวหอม จำกข้ำวเจ้ำพันธุ์สุพรรณบุรี 1 และชัยนำท 80 ที่ได้จำกวิธีผสมกลับ โดยใช้เครื่องหมำยโมเลกุลช่วยในกำรคัดเลือก The Observation and Preliminary Yield Trial of Aromatic and Glutinous Rice Lines Derived from Non-glutinous Rice Suphan Buri 1 and Chai Nat 80 Using Molecular Marker-assisted Backcrossing

วรำภรณ์ แสงทอง1* สุภำรัตน์ ลีธนัชอุดม1 ทุเรียน ทำเจริญ1 สุภักตร์ ปัญญำ2 อนุชิดำ วงศ์ชื่น1 และศิรินภำ อ้ำยเสำร์1 Varaporn Sangtong1*, Suparat Lithanatudom1, Turean Thacharoen1 Supak Punya2, Anuchida Wongchuen1 and Sirinapa Aiysaow1 1คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 2คณะผลิตกรรมการเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 1Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 2Faculty of Agricultural Production, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 *Corresponding author: [email protected]

บทคัดย่อ

ได้ท าการศึกษาพันธุ์ขั้นต้นและการเปรียบเทียบผลผลิตของสายพันธุ์ข้าวเหนียวหอมจากข้าวเจ้าพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 ที่ได้จากวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือก ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมี วัตถุประสงค์เพื่อปลูกศึกษาพันธุ์ 4 แถว ในฤดูนาปี พ.ศ. 2558 และเปรียบเทียบผลผลิตภายในสถานีในฤดูนาปรัง

พ.ศ. 2559 พบว่าในการปลูกศึกษาพันธุ์ 4 แถว สายพันธุ์ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F4 จ านวน 9 สายพันธุ์ มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 92 วัน สายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC7F4 จ านวน 8 สายพันธุ์ มีอายุ วันออกดอก 75% เฉลี่ย 91 วัน และสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F8 จ านวน 3 สายพันธุ์ มีอายุวัน ออกดอก 75% เฉลี่ย 88 วัน ส่วนในฤดูนาปรัง พ.ศ. 2559 เปรียบเทียบผลผลิตภายในสถานี ณ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ วางแผนการทดลองแบบสุ่มในบล็อคสมบูรณ์ (Randomized Complete Block Design) มี 3 ซ้ า พบว่าสายพันธุ์

ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F5 จ านวน 3 สายพันธุ์ และสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F9 จ านวน 2 สายพันธุ์ มีผลผลิตเท่ากับ 760, 795, 851, 774 และ 804 กิโลกรัมต่อไร่ ตามล าดับ ซึ่งไม่มีความแตกต่าง อย่างมีนัยส าคัญกับข้าวเหนียวพันธุ์ กข-แม่โจ้ 2 แต่สูงกว่าของข้าวเหนียวพันธุ์สันป่าตอง 1 สายพันธุ์ชัยนาท 80

ข้าวเหนียวหอม BC7F5 ทั้ง 3 สายพันธุ์ มีอายุวันออกดอกเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 99-105 วัน มีความสูงเฉลี่ย 115-127 ซม. และมีจ านวนรวงต่อกอเฉลี่ย 13-14 รวงต่อกอ ส่วนสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F9 ทั้ง 2 สายพันธุ์ มีอายุวันออกดอกเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 94-95 วัน มีความสูงเฉลี่ย 142 ซม. และมีจ านวนรวงต่อกอเฉลี่ย 14 รวงต่อกอ

ค ำส ำคัญ: ข้าวเหนียว ข้าวเจ้า การผสมกลับและใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือก

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 67 Abstract

The observation and preliminary yield trial of aromatic and glutinous rice lines derived from non-glutinous using molecular marker-assisted backcrossing were observed. The objective of the study was 4-row observation of advanced breeding lines in rainy season of 2015. The results showed that the average of 75% flowering date of 9 BC7F4 lines of Chai Nat 80 which is aromatic glutinous rice lines was 92 days, 8 BC7F4 lines of Suphan Buri 1 was 91 days and 3 BC4F8 lines of Suphan Buri 1 which is semi-dwarf aromatic and glutinous rice lines was 88 days. Yield trials of 3

BC7F5 lines of Chai Nat 80 and 2 BC4F9 lines of Suphan Buri 1 which is aromatic and glutinous were performed in a randomized complete block design with 3 replications in dry season of 2016 at the intra-station, Maejo University. The yielding abilities of these advanced aromatic and glutinous lines were 760, 795, 851, 774 and 851 kg/rai, respectively and were not significantly different with glutinous rice RD-Maejo 2, however, higher than San-pah-tawng 1. The averages of 75% flowering date of 3 BC7F5 lines of Chai Nat 80 were 99-105 days, with plant height average of 115-127 cm and number of tillers per hill with an average of 13-14. All 2 BC4F9 lines of Suphan Buri 1 were 94-95 days in 75% flowering date with plant height average of 142 cm and number of tillers per hill with an average of 14.

Keywords: glutinous rice, non-glutinous rice, molecular marker-assisted backcrossing

ค ำน ำ

ประเทศไทยมีพื้นที่ปลูกข้าวทั้งหมด 57 ล้านไร่ เป็นพื้นที่ปลูกข้าวเจ้า 39 ล้านไร่ คิดเป็น 69% และเป็นพื้นที่ ปลูกข้าวเหนียว 18 ล้านไร่ คิดเป็น 31% ของพื้นที่ปลูกข้าวทั้งหมด พันธุ์ข้าวเจ้าที่มีพื้นที่ปลูกมากที่สุด คือ พันธุ์ขาว ดอกมะลิ 105 เป็นข้าวไวต่อช่วงแสง มีพื้นที่ปลูก 18 ล้านไร่ คิดเป็น 31% ของพื้นที่ปลูกข้าวทั้งหมด นอกจากนี้ยังมี ข้าวเจ้าพันธุ์ดีจ านวนมากที่มีผลผลิตสูง ไม่ไวต่อช่วงแสงจึงปลูกได้ทั้งนาปีและนาปรัง มีความต้านทานต่อโรค และ แมลงศัตรูข้าว เช่น ข้าวเจ้าพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 สุพรรณบุรี 2 สุพรรณบุรี 3 สุพรรณบุรี 60 สุพรรณบุรี 90 ปทุมธานี 1 ปทุมธานี 60 ชัยนาท 1 ชัยนาท 80 และ กข39 ฯ ซึ่งพันธุ์ข้าวเจ้าเหล่านี้ได้รับการปรับปรุงพันธุ์ และผ่านการประเมิน สายพันธุ์ตามหลักวิชาการจากกรมการข้าวมาเป็นอย่างดี จึงท าให้ชาวนาที่ปลูกข้าวเจ้ามีโอกาสที่จะเลือกพันธุ์ข้าวเจ้าที่ จะปลูกให้เหมาะสมกับสภาพพื้นที่ของตนได้ ส่วนพันธุ์ข้าวเหนียวที่มีพื้นที่ปลูกมากที่สุด คือ ข้าวเหนียวพันธุ์ กข6 เป็น ข้าวไวต่อช่วงแสง มีพื้นที่ปลูก 15 ล้านไร่ คิดเป็น 83% ของพื้นที่ปลูกข้าวเหนียวทั้งหมด และคิดเป็น 26% ของพื้นที่ ปลูกข้าวทั้งหมดของประเทศ ข้าวเหนียวที่มีพื้นที่ปลูกรองจากพันธุ์ กข6 คือ กข10 เป็นข้าวเหนียว ไม่ไวต่อช่วงแสง มี พื้นที่ปลูก 2 ล้านไร่ ซึ่งคิดเป็น 11% ของพื้นที่ปลูกข้าวเหนียวทั้งหมด ส่วนข้าวเหนียวพันธุ์อื่นๆ มีพื้นที่ปลูกเพียง 6% ของพื้นที่ปลูกข้าวเหนียวทั้งหมด พันธุ์ข้าวเหนียวอื่นๆ ได้แก่ ข้าวเหนียวสันป่าตองเป็นข้าวไวต่อช่วงแสง กข8 เป็นข้าว

68 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ไวต่อช่วงแสง ส่วนข้าวเหนียวแพร่ 1 และสันป่าตอง 1 เป็นพันธุ์ไม่ไวต่อช่วงแสง และพันธุ์พื้นเมืองเป็นข้าวไวต่อ ช่วงแสง (กรมวิชาการเกษตร, 2546) ในอดีตมีการปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวท าโดยการฉายรังสี เช่น น าเมล็ดข้าวเจ้าพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 และ กข1 มาฉายรังสีเพื่อชักน าให้เกิดการกลายพันธุ์ และปลูกคัดเลือกจนได้ข้าวเหนียวพันธุ์ดี คือ กข6 และ กข10 ตามล าดับ ใช้ระยะเวลาในการปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวเหล่านี้พันธุ์ละ 12 ปี จึงจะได้ข้าวเหนียวพันธุ์ดีออกมาสู่เกษตรกร ส่วน การปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวพันธุ์แพร่ 1 และ สันป่าตอง 1 ใช้การปรับปรุงแบบดั้งเดิม ใช้เวลาปรับปรุงพันธุ์นานถึง 19 และ 16 ปี ตามล าดับ ดังนั้นการปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวแต่ละพันธุ์ใช้เวลาเฉลี่ย 15 ปี (กรมการข้าว, 2552) เนื่องจากในปัจจุบันการปรับปรุงพันธุ์ข้าวสามารถใช้ความรู้ทางพันธุศาสตร์โมเลกุล เช่น เครื่องหมายโมเลกุล (Molecular marker) มาช่วยในการคัดเลือก เป็นการคัดเลือกในระดับยีโนไทป์หรือยีน ไม่ใช่คัดเลือกฟีโนไทป์ที่มีผล จากสภาพแวดล้อมเข้ามาเกี่ยวข้องเหมือนการปรับปรุงพันธุ์อย่างดั้งเดิม การใช้เครื่องหมายโมเลกุลมาช่วยในการ คัดเลือกยีโนไทป์ท าให้การคัดเลือกมีความแม่นย า และถูกต้องมากยิ่งขึ้น รวมทั้งยังเป็นการช่วยลดระยะเวลาในการ ปรับปรุงพันธุ์ให้สั้นลง ลักษณะความเป็นข้าวเจ้าและข้าวเหนียวถูกควบคุมด้วย waxy gene (Wx/wx) ซึ่งอยู่บนโครโมโซมที่ 6 โดยอัลลีลเด่น Wx ควบคุมความเป็นข้าวเจ้า และอัลลีลด้อย wx ควบคุมความเป็นข้าวเหนียว ความแตกต่าง ระหว่างอัลลีลเด่น Wx กับ อัลลีลด้อย wx คือ ในอัลลีลด้อย พบมีการเพิ่มขึ้นของเบสจ านวน 23 bp อีก 1 ชุดใน เอกซอนที่ 2 แต่ไม่พบการเพิ่มนี้ในอัลลีลเด่น Wx จึงมีการออกแบบ ไพรเมอร์ Glu-23 ให้เฉพาะกับ 23-bp duplication นี้ ซึ่งสามารถใช้ไพรเมอร์นี้แยกความแตกต่างของอัลลีลด้อย wx ของข้าวเหนียว จากอัลลีลเด่น Wx ของข้าวเจ้าได้ (glutinous/non-glutinous alleles) (Wanchana et al., 2003) ลักษณะความหอมในข้าว ถูกควบคุมด้วย Fgr/fgr อยู่บนโครโมโซมที่ 8 อัลลีลเด่น Fgr ควบคุมให้ข้าวไม่หอม และอัลลีลด้อย fgr ควบคุมให้ข้าวหอม เครื่องหมายโมเลกุลที่ใช้คัดเลือก Fgr/fgr คือ ไพรเมอร์ ESP, IFAP, INSP และ EAPA (Bradbury et al., 2005) ซึ่งจะเรียกว่า fragrance marker การปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวหอมจากข้าวเจ้าด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือก ท าโดยน าข้าวเจ้าพันธุ์ดี 2 พันธุ์ คือ ข้าวเจ้าพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 มาเป็นพันธุ์รับยีนข้าวเหนียวหอมจาก กข6 เพื่อปรับปรุงพันธุ์ให้เป็นข้าวเหนียวหอมพันธุ์ดี ด้วยวิธีผสมกลับ และคัดเลือกโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลจนได้สาย พันธุ์ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม และสายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม ดังนั้นการทดลองนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อ ปลูกศึกษาพันธุ์ 4 แถว ในฤดูนาปี 2558 และ เปรียบเทียบผลผลิตภายในสถานีในฤดูนาปรัง 2559

อุปกรณ์และวิธีกำร

กำรศึกษำพันธุ์ 4 แถว (4-Row Observation) ปลูกศึกษาพันธุ์ 4 แถว ในฤดูนาปี 2558 ที่มหาวิทยาลัยแม่โจ้โดยท าการปลูกสายพันธุ์ละ 4 แถว จ านวน 2 ซ้ า แถวยาวประมาณ 5 เมตร ระยะ 20x20 ซม. ปักด ากอละ 1 ต้น ทุกๆ สายพันธุ์ที่ 10 ปลูกพันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐาน

(Check) ใส่ปุ๋ยสูตร 12-6-6 กิโลกรัม N-P2O5-K2O ต่อไร่ โดยแบ่งใส่ 2 ครั้ง ครั้งแรกใส่ 6-6-6 กิโลกรัม N-P2O5- K2O ต่อไร่ หลังปักด าประมาณหนึ่งสัปดาห์ และครั้งที่ 2 ใส่ 6-0-0 กิโลกรัม N-P2O5-K2O ต่อไร่ ในระยะข้าวเริ่ม ก าเนิดช่อดอก มีการป้องกันก าจัดวัชพืชตามความจ าเป็น ท าการบันทึกข้อมูลลักษณะรูปแบบทรงต้น วันออกดอก

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 69 75% ความสูง จ านวนรวงต่อกอ และผลผลิตกิโลกรัมต่อไร่ที่ความชื้น 14% เพื่อคัดเลือกสายพันธุ์ที่มีลักษณะที่ดี ให้ผลผลิตสูง ไปทดสอบผลผลิตภายในสถานีต่อไป กำรเปรียบเทียบผลผลิตภำยในสถำนี (Intra-Station Yield Trials) ปลูกเปรียบเทียบผลผลิตภายในสถานี ในฤดูนาปรัง 2559 โดยน าสายพันธุ์ที่คัดเลือกได้จากแปลงศึกษาพันธุ์ วางแผนการทดลองแบบสุ่มในบล็อกสมบูรณ์ (Randomized Complete Block Design; RCBD) มีสิ่งทดลอง 20 สายพันธุ์ มี 3 ซ้ า มีพันธุ์มาตรฐานเปรียบเทียบ 2 พันธุ์ ในแต่ละซ้ าปลูกสายพันธุ์ละ 4 แถว แต่ละแถวยาว 5 เมตร ระยะปลูก ระหว่างกอและแถว 25x25 ซม. จ านวน 3 ต้นต่อกอ อัตราปุ๋ยที่ใช้ข้าวไม่ไวต่อช่วงแสงอัตรา 12-6-6 กิโลกรัม

N-P2O5-K2O ต่อไร่ โดยแบ่งใส่ 2 ครั้ง ครั้งแรกใส่ 6-6-6 กิโลกรัมต่อไร่ ก่อนปักด า 1 วัน และอีกครั้งใส่ 6-0-0 กิโลกรัมต่อไร่ ใส่ในระยะข้าวเริ่มก าเนิดช่อดอก มีการป้องกันและก าจัดโรค และแมลง และวัชพืชตามความจ าเป็น เก็บเกี่ยว 2 แถวกลางโดยเว้นกอหัวท้าย ชั่งน้ าหนัก และวัดความชื้นเมล็ด เพื่อค านวณผลผลิตเป็นกิโลกรัมต่อไร่ที่ ความชื้นของเมล็ด 14% แล้วน าไปวิเคราะห์ผลทางสถิติ คัดเลือกสายพันธุ์ที่ดีเด่นประมาณ 2-5 สายพันธุ์ ท าการบันทึก ข้อมูลต่างๆ ได้แก่ผลผลิตอายุวันออกดอก 75% ความสูงต้น จ านวนต้นต่อกอ จ านวนรวงต่อกอ จ านวนเมล็ดต่อรวง เปอร์เซ็นต์การติดเมล็ด เปอร์เซ็นต์เมล็ดดีและเมล็ดลีบ น้ าหนัก 1,000 เมล็ด และความชื้น

ผลกำรวิจัย

กำรศึกษำพันธุ์ 4 แถว (4-Row Observation) สายพันธุ์ ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F4 จ านวน 9 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% อยู่ระหว่าง 89-93 วัน อายุวันออกดอกเฉลี่ย 92 วัน ในขณะที่พันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐานชัยนาท 80 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 89 วัน สายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC7F4 จ านวน 8 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% อยู่ระหว่าง 87-95 วัน อายุวันออกดอกเฉลี่ย 91 วัน และสุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F8 จ านวน 3 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% อยู่ระหว่าง 87-89 วัน อายุวันออกดอกเฉลี่ย 88 วัน ในขณะที่พันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐาน สุพรรณบุรี 1 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 85 วัน กำรเปรียบเทียบผลผลิตภำยในสถำนี (Intra-Station Yield Trials) ผลการปลูกเปรียบเทียบผลผลิตภายในสถานี ในฤดูนาปรัง 2559 เมื่อน ามาวิเคราะห์ทางสถิติ พบว่าสายพันธุ์ ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F5 (entry ที่ 4-6) มีผลผลิตต่อไร่ที่ 760, 795 และ 851 กิโลกรัมต่อไร่ ตามล าดับ และสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F9 (entry ที่ 7 และ 8) มีผลผลิตต่อไร่ที่ 774 และ 804 กิโลกรัมต่อไร่ ตามล าดับ ซึ่งไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยส าคัญกับข้าวเหนียว กข-แม่โจ้ 2 ที่มีผลผลิตต่อไร่ที่ 749 กิโลกรัมต่อไร่ แต่มีผลผลิตสูงกว่าข้าวเหนียวพันธุ์สันป่าตอง 1 ที่มีผลผลิตต่อไร่ที่ 556 กิโลกรัมต่อไร่ สายพันธุ์ชัยนาท 80 เหนียวหอม BC7F5 ทั้ง 3 สายพันธุ์ มีอายุวันออกดอกเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 99-105 วัน มีความสูงเฉลี่ย 115-127 ซม. และมีจ านวน รวงต่อกอเฉลี่ย 13-14 รวงต่อกอ ส่วนสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F9 ทั้ง 2 สายพันธุ์ มีอายุวันออก ดอกเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 94-95 วัน มีความสูงเฉลี่ย 142 ซม. และมีจ านวนรวงต่อกอเฉลี่ย 14 รวงต่อกอ (Table 1)

70 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ Table1 Shows the pedigree, yield, flowering date, plant height and number of tillers per hill of

San-pah-tawng 1 (entry 1) and RD-Maejo 2 (entry 2), 3 BC7F5 lines of aromatic and glutinous rice lines of Chai Nat 80 (entry 4-6) and 2 BC4F9 lines of aromatic and glutinous rice lines of Suphan Buri 1 (entry 7-8) in the intra-station yield trial during dry season 2016 at Maejo University

Entry Pedigree Yield Flowering Plant Number of date height tillers per hill (kg/rai) (days) (cm) (tillers/hill) b 1 San-pah-tawng 1 556 117 120 14 a 2 RD-Maejo 2 749 107 127 16 2 2 a 4 Chai Nat 80 wx fgr BC7F5(3704) 760 99 115 13 2 2 a 5 Chai Nat 80 wx fgr BC7F5(3705) 795 105 127 13 2 2 a 6 Chai Nat 80 wx fgr BC7F5(3706) 851 103 120 14 2 2 a 7 Suphan Buri 1 wx fgr BC4F9(3707) 774 95 142 14 2 2 a 8 Suphan Buri 1 wx fgr BC4F9(3708) 804 94 142 14 Grand mean 662 102 124 14 F-test ** - - - CV % 10.87 - - -

Ns= Non significant; *difference is statistically significant (p <0.05); **difference is statistically significant (p<0.01); a-b letters that direct the mean in the same column that shows difference is statistically significant (p≤0.01).

(A) (B)

Figure 1 (A) The aromatic and glutinous rice line of Chai Nat 80 and (B) the aromatic and glutinous rice line of Suphan Buri 1 in the intra-station yield trial during dry season 2016 in Maejo University

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 71 วิจำรณ์ผลกำรวิจัย

เนื่องการปลูกเปรียบเทียบผลผลิตภายในสถานีครั้งนี้เป็นการปลูกที่ผิดฤดู (ตกกล้าเดือนมีนาคม และปักด า เดือนเมษายน) จึงส่งผลให้ผลผลิตต่อไร่ของข้าวเหนียวพันธุ์สันป่าตอง 1 มีผลผลิตที่น้อยลงจากปกติ 630 กิโลกรัมต่อไร่ (กรมการข้าว, 2560ก) เหลือเพียง 556 กิโลกรัมต่อไร่ แต่เมื่อน าผลผลิตมาเปรียบเทียบแล้วพบว่า สายพันธุ์ชัยนาท 80

ข้าวเหนียวหอม BC7F5 ผลผลิตต่อไร่อยู่ระหว่าง 760-851 กิโลกรัมต่อไร่ และสายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F9 มีผลผลิตต่อไร่ระหว่าง 774-804 กิโลกรัมต่อไร่ ซึ่งมีผลผลิตสูงกว่าข้าวเหนียวพันธุ์สันป่าตอง 1 แต่ผลผลิตต่อไร่ ได้ใกล้เคียงกับข้าวเจ้าพันธุ์ดีเดิมที่น ามาปรับปรุงให้เป็นข้าวเหนียวหอม คือ สุพรรณบุรี 1 ที่มีผลผลิตประมาณ 806 กิโลกรัมต่อไร่ (กรมการข้าว, 2560ข) และชัยนาท 80 ที่มีผลผลิตประมาณ 876 กิโลกรัมต่อไร่ (กรมการข้าว, 2560ค)

สรุปผลกำรวิจัย

การปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวหอมจากข้าวเจ้าด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือก เพื่อสร้างสายพันธุ์ข้าวเหนียวหอม 2 สายพันธุ์จากข้าวเจ้าพันธุ์ดี คือ พันธุ์ ชัยนาท 80 และ สุพรรณบุรี 1 ในฤดูนาปี 2558 ปลูกศึกษาพันธุ์ 4 แถว (4-Row Observation) ที่มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ปลูกสายพันธุ์ชัยนาท 80

ข้าวเหนียวหอม BC7F4 จ านวน 9 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 92 วัน ปลูกสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC7F4 จ านวน 8 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 91 วัน และสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F8 จ านวน 3 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 88 วัน ในฤดูนาปรัง 2559 ปลูกเปรียบเทียบผลผลิตภายในสถานี พบว่า สายพันธุ์ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F5 (entry ที่ 4-6) มีผลผลิตต่อไร่ที่ 760, 795 และ 851 กิโลกรัมต่อไร่ ตามล าดับ และสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม

BC4F9 (entry ที่ 7 และ 8) มีผลผลิตต่อไร่ที่ 774 และ 804 กิโลกรัมต่อไร่ ตามล าดับ ซึ่งไม่มีความแตกต่างกันอย่าง มีนัยส าคัญกับข้าวเหนียว กข-แม่โจ้ 2 ที่มีผลผลิตต่อไร่ ที่ 749 กิโลกรัมต่อไร่ แต่มีผลผลิตสูงกว่าข้าวเหนียวพันธุ์

สันป่าตอง 1 อย่างมีนัยส าคัญยิ่งที่มีผลผลิตต่อไร่ที่ 556 กิโลกรัมต่อไร่ สายพันธุ์ชัยนาท 80 เหนียวหอม BC7F5 ทั้ง 3 สายพันธุ์ มีอายุวันออกดอกเฉลี่ยอยู่ระหว่าง 99-105 วัน มีความสูงเฉลี่ย 115-127 ซม. และมีจ านวนรวงต่อกอเฉลี่ย

13-14 รวงต่อกอ ส่วนสายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F9 ทั้ง 2 สายพันธุ์ มีอายุวันออกดอกเฉลี่ยอยู่ ระหว่าง 94-95 วัน มีความสูงเฉลี่ย 142 ซม. และมีจ านวนรวงต่อกอเฉลี่ย 14 รวงต่อกอ

กิตติกรรมประกำศ

โครงการวิจัยเรื่อง การปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวหอมจากข้าวเจ้าด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุล ช่วยในการคัดเลือก (Breeding of Aromatic Glutinous Rice from Non-glutinous Rice by Marker-assisted Backcrossing) ได้ด าเนินการมาได้ด้วยดี โดยได้รับทุนอุดหนุนการท าวิจัยจากส านักวิจัยและส่งเสริมวิชาการการเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ที่ให้ทุนวิจัยแก่คณะผู้วิจัยในการท าการวิจัยในปีงบประมาณ พ.ศ. 2559 และกรมการข้าวที่มอบเมล็ด พันธุ์ข้าวเพื่อน ามาใช้ในโครงการวิจัย จนโครงการวิจัยนี้ประสบผลส าเร็จอย่างดียิ่ง

72 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เอกสำรอ้ำงอิง

กรมการข้าว. 2552. องค์ควำมรู้เรื่องข้ำว. [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://www.brrd.in.th/rkb/varieties/ index.php-file=content.php&id=76.htm (25 เมษายน 2552). กรมวิชาการเกษตร. 2546. สถิติกำรเกษตรของประเทศไทยปีเพำะปลูก 2544/45. เอกสารวิชาการข้าวและ ธัญพืชเมืองหนาวพันธุ์ดี. กรมการข้าว. 2560ก. องค์ควำมรู้เรื่องข้ำว พันธุ์ข้ำว สันป่ำตอง 1. [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://www.ricethailand.go.th/Rkb/varieties/index.php-file=content.php&id=74.htm (16 พฤษภาคม 2560). กรมการข้าว. 2560ข. องค์ควำมรู้เรื่องข้ำว พันธุ์ข้ำว สุพรรณบุรี 1. [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://www.ricethailand.go.th/Rkb/varieties/index.php-file=content.php&id=76.htm (10 สิงหาคม 2560). กรมการข้าว. 2560ค. องค์ควำมรู้เรื่องข้ำว พันธุ์ข้ำว กข29 (ชัยนำท 80). [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://www.ricethailand.go.th/Rkb/varieties/index.php-file=content.php&id=60.htm (10 สิงหาคม 2560). Bradbury L.M.T., R.J. Henry, Q. Jin, R.F. Reinke and D.L.E. Waters. 2005. A perfect marker for fragrance genotyping in rice. Molecular Breeding 16: 279-283. Wanchana S., T. Toojinda, S. Tragoonrung and A. Vanavichit. 2003. Duplicated coding sequence in the waxy allele of tropical glutinous rice (Oryza sativa L.). Plant Science 165: 1193-1199.

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 73 กำรคัดเลือกสำยพันธุ์ข้ำวที่ได้จำกกำรปรับปรุงพันธุ์ข้ำวเจ้ำพันธุ์สุพรรณบุรี 1 และชัยนำท 80 ให้เป็นข้ำวเหนียวหอมด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมำยโมเลกุลช่วยในกำรคัดเลือก Selection of Rice Lines Derived from Improvement of Suphan Buri 1 and Chai Nat 80 Rice Varieties for Aromatic and Glutinous Rice Lines from using Molecular Marker-assisted Backcrossing

อนุชิดำ วงศ์ชื่น* วรำภรณ์ แสงทอง ทุเรียน ทำเจริญ และศิรินภำ อ้ำยเสำร์ Anuchida Wongchuen*, Varaporn Sangtong, Turean Thacharoen and Sirinapa Aiysaow คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 *Corresponding author: [email protected]

บทคัดย่อ

ได้ท าการปรับปรุงพันธุ์ข้าวเจ้าพันธุ์ดี 2 พันธุ์ คือ สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 ที่มีผลผลิตสูง ต้นเตี้ย ไม่ไวต่อช่วงแสง ต้านทานต่อโรคและแมลงที่ส าคัญของข้าว งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อปรับปรุงพันธุ์ข้าวเจ้าพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 ให้เป็นข้าวเหนียวหอม ด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือกท า โดยใช้ข้าวเจ้าพันธุ์สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 เป็นพันธุ์รับ ผสมกับพันธุ์ให้ยีนข้าวเหนียวหอม คือ ข้าวเหนียว กข6 ท าการผสมกลับและใช้เครื่องหมายโมเลกุลที่ควบคุมให้เป็นข้าวเหนียว wx marker และควบคุมให้ข้าวหอม ด้วย fgr marker ช่วยในการคัดเลือกจนกระทั่งได้ลูกชั่ว BCnF2-10 จากนั้นน าไปปลูกคัดเลือกแบบสืบตระกูล ในแปลงนา ทดลองของมหาวิทยาลัยแม่โจ้ ในฤดูนาปี พ.ศ. 2559 พบว่าสายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 ปลูกจ านวน 6 สายพันธุ์ มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 85 วัน คัดเลือกต้นที่มีลักษณะทางการเกษตรดีได้จ านวน 8 สายพันธุ์ และ

สายพันธุ์ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 จ านวน 9 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 87 วัน คัดเลือก ต้นที่มีลักษณะทางการเกษตรดีได้จ านวน 8 สายพันธุ์ ในขณะที่พันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐานสันป่าตอง 1 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 86 วัน และ กข-แม่โจ้ 2 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 100 วัน ท าการตรวจสอบลักษณะทางจีโนไทป์

ด้วยเครื่องหมายโมเลกุลในสายพันธุ์ข้าวสุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 และชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 ที่คัดเลือกได้สายพันธุ์ละ 8 สายพันธุ์ มีลักษณะเป็นข้าวเหนียว และมียีนควบคุมให้มีกลิ่นหอมทุกสายพันธุ์ ซึ่งสามารถ น าไปปลูกคัดเลือกเพื่อเพิ่มความคงตัวทางพันธุกรรมในฤดูต่อไป

ค ำส ำคัญ: ข้าวเหนียว ข้าวเจ้า การผสมกลับและใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือก ค ำส ำคัญ: การคัดเลือกแบบสืบตระกูล

74 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ Abstract

The non-glutinous rice varieties, Suphan Buri 1 and Chai Nat 80 have high yield semi-dwarf, non-photoperiod sensitive and resistant to major diseases and insects were improved. This project aimed to improve Suphan Buri 1 and Chai Nat 80 in order to become aromatic and glutinous rice lines by using marker-assisted backcrossing. The research initially started by crossing Suphan Buri 1 and Chai Nat 80 rice varieties which serve as the recurrent parent. The glutinous rice (RD6) was used as the donor parent which was backcrossed from the recurrent parent and used molecular marker selection using wx marker to control glutinous gene and fgr marker to control the aromatic gene and selected BCnF2-10. The pedigree selection method was done on the trial field in Maejo University in 2016 rainy season. The selection of aromatic and glutinous rice lines of

6 BC4F10 of Suphan Buri 1 and 9 BC7F6 of Chai Nat 80 with 75% flowering date average of 85 days and 87 days were evaluated and 8 lines of each family with good agronomic characteristics were selected based on selection criteria compared with standard varieties of San-pah-tawng 1 with 75% flowering date average of 86 days and RD-Maejo 2 with average of 100 days. Molecular marker analysis of selected 8 BC4F10 lines of Suphan Buri 1 and 9 BC7F6 of Chai Nat 80 were verified to detect the gene controlling aromatic and glutinous rice and to increase genetic stability in next generation.

Keywords: glutinous rice, non-glutinous rice, molecular marker-assisted backcrossing, pedigree selection method

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 75 ค ำน ำ

ข้าวพันธุ์สุพรรณบุรี 1 เป็นข้าวเจ้าสูงประมาณ 125 ซม. ไม่ไวต่อช่วงแสง อายุเก็บเกี่ยวประมาณ 120 วัน เมล็ด ข้าวเปลือกสีฟาง ระยะพักตัวของเมล็ดประมาณ 22 วัน เมล็ดข้าวกล้อง กว้างxยาวxหนา = 22x7.3x1.8 มิลลิเมตร ปริมาณอมิโลส 29% คุณภาพข้าวสุก ร่วน แข็ง ผลผลิตประมาณ 806 กิโลกรัมต่อไร่ ลักษณะเด่น คือ มีผลผลิตสูง ตอบสนองต่อการใช้ปุ๋ย ต้านทานโรคไหม้ โรคขอบใบแห้ง โรคใบหงิก และโรคใบสีส้ม ในสภาพธรรมชาติ ต้านทาน เพลี้ยกระโดดสีน้ าตาล และเพลี้ยกระโดดหลังขาว (กรมการข้าว, 2560ก) ลักษณะประจ าพันธุ์ข้าวพันธุ์ชัยนาท 80 (กข29) เป็นข้าวเจ้าไม่ไวต่อช่วงแสง อายุเก็บเกี่ยว 103 วัน ในฤดูนาปี และ 99 วัน ในฤดูนาปรัง ทรงกอตั้ง ต้นแข็งไม่ล้มง่าย ใบสีเขียวเข้ม ใบธงตั้งตรง รวงแน่นปานกลาง คอรวงยาว ข้าวกล้อง สีขาว เป็นท้องไข่น้อย รูปร่างเรียว ยาว 7.3 มิลลิเมตร กว้าง 2.2 มิลลิเมตร หนา 1.8 มิลลิเมตร มีปริมาณอมิโลสสูง (26.6-29.4%) ผลผลิตเฉลี่ย 876 กิโลกรัม/ไร่ ลักษณะเด่น คือ อายุสั้น ผลผลิตสูง (เฉลี่ย 876 กิโลกรัมต่อไร่) ค่อนข้าง ต้านทานต่อเพลี้ยกระโดดสีน้ าตาลในภาคเหนือตอนล่าง และโรคขอบใบแห้ง มีปริมาณธาตุเหล็กในข้าวกล้อง 15.7 มก. ต่อ 1 กิโลกรัม ในข้าวสาร 6.7 มิลลิกรัมต่อ 1 กิโลกรัม แต่มีข้อควรระวังโดยไม่ควรปลูกในช่วงกลางเดือนกันยายน ถึงปลายเดือนพฤศจิกายน ซึ่งมีอากาศเย็น ท าให้เมล็ดลีบมาก ผลผลิตต่ า ชัยนาท 80 อ่อนแอต่อเพลี้ยกระโดดสีน้ าตาล ในเขตจังหวัดนครปฐม ปทุมธานี ราชบุรี และฉะเชิงเทรา (กรมการข้าว, 2560ข) การปรับปรุงพันธุ์พืชแบบมาตรฐาน (conventional plant breeding) เน้นการคัดเลือกฟีโนไทป์ที่ดีที่สุด ในประชากรที่มีการกระจายตัวที่ได้มาจากการผสมพันธุ์ ซึ่งประสบปัญหาว่าเกิดปฏิกิริยาสัมพันธ์ระหว่างพันธุกรรม และสภาพแวดล้อม (genotype x environment interaction ; G x E) ประกอบกับการคัดเลือก และการทดสอบฟีโนไทป์ ต้องใช้ค่าใช้จ่ายสูง และใช้เวลานาน การปรับปรุงพันธุ์โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลมาช่วยคัดเลือก (Marker-Assisted Selection; MAS) เน้นการคัดเลือกที่ยีนไม่ใช่ฟีโนไทป์ ดังนั้นการคัดเลือกด้วยเครื่องหมายโมเลกุลจึงไม่ขึ้นกับ สภาพแวดล้อม และสามารถคัดเลือกได้ในทุกช่วงอายุของพืช เนื่องจากมีรายงานเกี่ยวกับเครื่องหมายโมเลกุล (molecular marker) และแผนที่ทางพันธุกรรม (genetic map) จึงท าให้การใช้ MAS มีความเป็นไปได้ ทั้งลักษณะที่ เป็นเชิงคุณภาพ (qualitative trait) และลักษณะเชิงปริมาณ (quantitative trait) (Francia et al., 2005) วิธีการปรับปรุงพันธุ์พืชแบบผสมกลับแบบมาตรฐาน (conventional backcrossing) เป็นการถ่ายทอด ยีนที่ต้องการจากพันธุ์ให้ (donor parent) ซึ่งส่วนใหญ่เป็นพันธุ์ที่มีลักษณะการเกษตรไม่ดีไปสู่พันธุ์รับ (recipient parent) ซึ่งเป็นพันธุ์ดี (elite variety) เริ่มโดยผสมพันธุ์รับกับพันธุ์ให้เพื่อผลิต F1 ต่อจากนั้นน า F1 ผสมกลับไป หาพันธุ์รับ ต้องท าการผสมกลับไปหาพันธุ์รับถึง 6 ครั้ง จึงจะได้เปอร์เซ็นต์จีโนมของพันธุ์รับเท่ากับ 99.2 จึงจะอยู่ ในระดับที่ยอมรับได้ และพันธุ์ที่ได้จากการปรับปรุงพันธุ์แบบผสมกลับจะมีพันธุกรรมเหมือนกับพันธุ์รับ ยกเว้นยีน ในต าแหน่งที่ต้องการ (target gene) ที่จะได้มาจากพันธุ์ให้ (Allard, 1960) เนื่องจากในปัจจุบันการปรับปรุงพันธุ์ข้าวสามารถใช้ความรู้ทางพันธุศาสตร์โมเลกุล เช่น เครื่องหมายโมเลกุล (Molecular marker) มาช่วยในการคัดเลือก เป็นการคัดเลือกในระดับยีโนไทป์หรือยีน ไม่ใช่คัดเลือกฟีโนไทป์ที่มีผล จากสภาพแวดล้อมเข้ามาเกี่ยวข้องเหมือนการปรับปรุงพันธุ์อย่างดั้งเดิม การใช้เครื่องหมายโมเลกุลมาช่วยในการ คัดเลือกยีโนไทป์ท าให้การคัดเลือกมีความแม่นย า และถูกต้องมากยิ่งขึ้น รวมทั้งยังเป็นการช่วยลดระยะเวลาในการ ปรับปรุงพันธุ์ให้สั้นลง

76 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ลักษณะความเป็นข้าวเจ้าและข้าวเหนียวถูกควบคุมด้วย waxy gene (Wx/wx) ซึ่งอยู่บนโครโมโซมที่ 6 โดยอัลลีลเด่น Wx ควบคุมความเป็นข้าวเจ้า และอัลลีลด้อย wx ควบคุมความเป็นข้าวเหนียว ความแตกต่างระหว่าง อัลลีลเด่น Wx กับอัลลีลด้อย wx คือ ในอัลลีลด้อยพบมีการเพิ่มขึ้นของเบสจ านวน 23 bp อีก 1 ชุดใน เอกซอนที่ 2 แต่ไม่พบการเพิ่มนี้ในอัลลีลเด่น Wx จึงมีการออกแบบ ไพรเมอร์ Glu-23 ให้เฉพาะกับ 23-bp duplication นี้ ซึ่งสามารถใช้ไพรเมอร์นี้แยกความแตกต่างของอัลลีลด้อย wx ของข้าวเหนียว จากอัลลีลเด่น Wx ของข้าวเจ้าได้ (glutinous/non-glutinous alleles) (Wanchana et al.,2003) ลักษณะความหอมในข้าว ถูกควบคุมด้วย Fgr/fgr อยู่บนโครโมโซมที่ 8 อัลลีลเด่น Fgr ควบคุมให้ข้าวไม่หอม และอัลลีลด้อย fgr ควบคุมให้ข้าวหอม เครื่องหมายโมเลกุลที่ใช้คัดเลือก Fgr/fgr คือ ไพรเมอร์ ESP, IFAP, INSP และ EAPA (Bradbury et al., 2005) ซึ่งจะเรียกว่า fragrance marker ดังนั้นในการทดลองนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อคัดเลือกสายพันธุ์ข้าวที่ได้จากการปรับปรุงพันธุ์ ข้าวเจ้าพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 ให้เป็นข้าวเหนียวหอม ด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือก จนกระทั่งคัดเลือกได้ลูกชั่ว BCnF2-10 จากนั้นน าไปปลูกคัดเลือกแบบสืบตระกูล ในแปลงนาทดลองของมหาวิทยาลัยแม่โจ้ ในฤดูนาปี 2559

อุปกรณ์และวิธีกำร

อุปกรณ์ พันธุ์ข้าวเจ้าพันธุ์ดี 2 พันธุ์ คือ สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 ที่มีผลผลิตสูง ต้นเตี้ย ไม่ไวต่อช่วงแสง ต้านทานต่อโรคและแมลงที่ส าคัญของข้าว ผสมกับพันธุ์ให้ยีนข้าวเหนียวหอมคือพันธุ์ข้าวเหนียว กข6 ท าการผสมกลับ และใช้เครื่องหมายโมเลกุลที่ควบคุมให้เป็นข้าวเหนียว wx marker และควบคุมให้ข้าวหอม ด้วย fgr marker ช่วยใน การคัดเลือกจนกระทั่งได้ลูกชั่ว BCnF2-10 วิธีกำร กำรปลูกคัดเลือกแบบสืบตระกูล (Pedigree Method) ในฤดูนาปี 2559 ปลูกสายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 จ านวน 6 สายพันธุ์ และสายพันธุ์ ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 จ านวน 9 สายพันธุ์ โดปลูกคัดเลือกเป็นแถวยาวประมาณ 2.5 เมตร ปลูก 6 แถว ต่อสายพันธุ์ จ านวน 1 ต้นต่อหลุม ระยะ 25x25 ซม. ทุกๆ สายพันธุ์ที่ 10 ปลูกพันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐาน (Check) แบบ Systematic Design ใส่ปุ๋ยสูตร 12-6-6 กิโลกรัม N-P2O5-K2O ต่อไร่ โดยแบ่งใส่ 2 ครั้ง ครั้งแรกใส่ 6-6-6 กิโลกรัม N-P2O5-K2O ต่อไร่ หลังปักด าประมาณหนึ่งสัปดาห์ และครั้งที่ 2 ใส่ 6-0-0 กิโลกรัม N-P2O5-K2O ต่อไร่ ในระยะข้าว เริ่มก าเนิดช่อดอก มีการป้องกันก าจัดวัชพืชตามความจ าเป็น ท าการคัดเลือกต้นข้าวที่มีลักษณะทางฟีโนไทป์ที่ต้องการ ได้แก่ รูปแบบทรงต้น การแตกกอ แข็งแรง ความสูง ใบธงตั้งและ V-shape ใบใหญ่ คอรวงยาวพอพอดี รวงยาวและ ใหญ่ ติดเมล็ดเยอะ ขนาดและรูปร่างเมล็ดเรียวยาว ไม่ได้รับความเสียหายจากโรคและแมลง กำรตรวจสอบจีโนไทป์ในต้นที่คัดเลือกได้ด้วยเครื่องหมำยโมเลกุล น าต้นที่คัดเลือกได้จากการคัดเลือกแบบสืบตระกูล ในสายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 จ านวน 6 สายพันธุ์ และสายพันธุ์ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 จ านวน 9 สายพันธุ์ เก็บใบบนต้นที่คัดเลือกท า การสกัดดีเอ็นเอโดยดัดแปลงจากชุดสกัดของบริษัท Fermentas เพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอด้วยเทคนิค Polymerase chain reaction, (PCR) ด้วยเครื่องหมายโมเลกุล wx marker และ fgr marker และวิเคราะห์ลักษณะทางจีโนไทป์ (แถบดีเอ็นเอ) ด้วยเทคนิค Gel electrophoresis ส่องภายใต้แสงยูวี

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 77 ผลกำรวิจัย

กำรปลูกคัดเลือกแบบสืบตระกูล (Pedigree Method)

ปลูกสายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 จ านวน 6 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% อยู่ระหว่าง 84-85 วัน อายุวันออกดอกเฉลี่ย 85 วัน คัดเลือกต้น BC4F10 ที่มีลักษณะทางการเกษตรดีได้จ านวน 8 สายพันธุ์ ในขณะที่พันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐานสันป่าตอง 1 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 86 วัน และ กข-แม่โจ้ 2 มีอายุ วันออกดอก 75% เฉลี่ย 100 วัน (Table 1)

ปลูกสายพันธุ์ ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 จ านวน 9 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% อยู่ระหว่าง 85-91 วัน อายุวันออกดอกเฉลี่ย 87 วัน คัดเลือกต้น BC7F6 ที่มีลักษณะทางการเกษตรดีได้จ านวน 8 สายพันธุ์ ในขณะที่พันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐานสันป่าตอง 1 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 86 วัน และ กข-แม่โจ้ 2 มีอายุ วันออกดอก 75% เฉลี่ย 100 วัน (Table 2)

Table 1 Shows the pedigree, flowering date and number of hill selected of Suphan Buri 1 which is aromatic and glutinous rice lines using pedigree selection method during rainy season 2016 at Maejo University

Pedigree Flowering date (days) Number of hill selected San-pah-tawng 1 86 - RD-Maejo 2 100 - 2 2 Suphan Buri 1 fgr wx BC4F10(61512) 84 1 2 2 Suphan Buri 1 fgr wx BC4F10(61513) 84 1 2 2 Suphan Buri 1 fgr wx BC4F10(61514) 84 1 2 2 Suphan Buri 1 fgr wx BC4F10(61515) 84 2 2 2 Suphan Buri 1 fgr wx BC4F10(61516) 85 2 2 2 Suphan Buri 1 fgr wx BC4F10(61517) 85 1 Total 8

Flowering date average 85

78 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ Table 2 Shows the pedigree, flowering date and number of hill selected of Chai Nat 80 which is aromatic and glutinous rice lines using pedigree selection method during rainy season 2016 at Maejo University

Pedigree Flowering date (days) Number of hill selected San-pah-tawng 1 86 - RD-Maejo 2 100 - 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61503) 85 2 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61504) 87 2 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61505) 88 1 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61506) 87 1 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61507) 91 - 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61508) 87 - 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61509) 87 - 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61510) 87 1 2 2 Chai Nat 80 fgr wx BC7F6(61511) 88 1 Total 8

Flowering date average 87

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 79

(A) (B)

Figure 1 Rice plants at flowering stage in Maejo University during 2016 rainy season of (A) Chai Nat 80 Figure 1 aromatic and glutinous rice lines; (B) Suphan Buri 1 aromatic and glutinous rice lines with Figure 1 comparable standard varieties; (C) San-pah-tawng 1 and (D) RD-Maejo 2

กำรตรวจสอบจีโนไทป์ในสำยพันธุ์ข้ำวที่คัดเลือกได้ด้วยเครื่องหมำยโมเลกุล ท าการตรวจสอบลักษณะทางจีโนไทป์ด้วยเครื่องหมายโมเลกุล ในสายพันธุ์ข้าวสุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม

BC4F10 และชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 ที่คัดเลือกได้สายพันธุ์ละ 8 สายพันธุ์ ตรวจด้วย wx marker ที่เป็น ส่วนหนึ่งของยีน Wx/wx ซึ่งควบคุมความเป็นข้าวเจ้าข้าวเหนียว บนโครโมโซมที่ 6 พบว่าต้นข้าวทุกสายพันธุ์ มียีโนไทป์ เป็น wxwx แสดงว่าทุกสายพันธุ์มีลักษณะเป็นข้าวเหนียวมีสีขาวขุ่น

(A) (B)

80 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ (A) (B)

Figure 2 DNA band size under UV light to compare DNA band from PCR products when using wx Figure 2 marker as primer and DNA template of rice variety and rice lines, where M is standard Figure 2 100 bp ladder, (A) lane 1 = San-pah-tawng 1, lane 2 = RD-Maejo 2, lane 3 = Suphan Buri 1 Figure 2 and lane 4-11 = Suphan Buri 1 aromatic and glutinous rice lines (B) lane 1 = Figure 2 San-pah-tawng 1, lane 2 = RD-Maejo 2, lane 3 = Chai Nat 80 and lane 4-11 = Chai Nat 80 Figure 2 aromatic and glutinous rice lines

ท าการตรวจสอบลักษณะทางจีโนไทป์ด้วยเครื่องหมายโมเลกุล ในสายพันธุ์ข้าวสุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียว

หอม BC4F10 และชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 ที่คัดเลือกได้สายพันธุ์ละ 8 สายพันธุ์ ตรวจด้วย fgr marker ที่ เป็นส่วนหนึ่งของยีน Frg/fgr ซึ่งควบคุมความหอม บนโครโมโซมที่ 8 พบว่าต้นข้าวทุกสายพันธุ์ มียีโนไทป์เป็น fgrfgr แสดงว่าทุกสายพันธุ์มียีนควบคุมให้ข้าวมีกลิ่นหอม

(A) (B)

Figure 3 DNA band size under UV light to compare DNA band from PCR products when using fgr marker as primer and DNA template of rice variety and rice lines, where M is standard 100 bp ladder, (A) lane 1 = San-pah-tawng 1, lane 2 = RD-Maejo 2, lane 3 = Suphan Buri 1 and lane 4-11 = Suphan Buri 1 aromatic and glutinous rice lines (B) lane 1 = San-pah-tawng 1, lane 2 = RD-Maejo 2, lane 3 = Chai Nat 80 and lane 4-11 = Chai Nat 80 aromatic and glutinous rice lines

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 81 วิจำรณ์ผลกำรวิจัย

จากผลการศึกษาในครั้งนี้พบว่าในการปรับปรุงพันธุ์ข้าวเจ้า พันธุ์สุพรรณบุรี 1 และชัยนาท 80 จากข้าวเจ้า ให้เป็นข้าวเหนียวหอม โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุล wx marker และ fgr marker ช่วยในการคัดเลือก สามารถคัดเลือก

แบบสืบตระกูลได้สายพันธุ์สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 85 วัน และสายพันธุ์ ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 87 วัน ซึ่งเมื่อเปรียบเทียบกับพันธุ์ข้าวเจ้าพันธุ์เดิม ที่น ามาปรับปรุงพันธุ์ คือสุพรรณบุรี 1 มีอายุวันออกดอกประมาณ 90 วัน (กรมการข้าว, 2560ก) และพันธุ์ชัยนาท 80 มีอายุวันออกดอกประมาณ 73 วัน ในฤดูนาปี (กรมการข้าว, 2560ข) สอดคล้องกับงานวิจัยของมหาวิทยาลัยแม่โจ้ และกรมการข้าว (2558) ที่ปรับปรุงพันธุ์ข้าวเจ้าหอมปทุมธานี 1 ให้เป็นข้าวเหนียวด้วยวิธีผสมกลับและใช้เครื่องหมาย โมเลกุล wx marker ช่วยในการคัดเลือก จนได้พันธุ์ กข-แม่โจ้ 2 ซึ่งใช้เพียงเครื่องหมายโมเลกุลเดียวเท่านั้น (กรมการข้าว, 2560ค) ส่วนเครื่องหมายโมเลกุลที่ควบคุมความหอมของข้าว fgr marker ที่น ามาคัดเลือกสอดคล้องกับงานวิจัยของ Bradbury et al., (2005) ที่พบว่าเครื่องหมายโมเลกุลที่เป็นส่วนหนึ่งของยีนเด่น BADH2 จะควบคุมให้ข้าวไม่หอม และยีนด้อย badh2 จะควบคุมให้ข้าวสร้างสารหอม 2AP ซึ่งอยู่บนโครโมโซมที่ 8 และสอดคล้องกับงานวิจัยของ จันทร์จิราและคณะ (2557) ที่ใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอช่วยคัดเลือกลักษณะความหอมและปริมาณอะมิโลสต่ าในการ ปรับปรุงพันธุ์ข้าวแบบบันทึกประวัติในประชากรชั่วที่ 2 โดยคัดเลือกแบบทีละลักษณะ โดยคัดเลือกลักษณะความหอมก่อน จากนั้นคัดเลือกต้นที่มีพันธุกรรมคงตัวของปริมาณอะมิโลสต่ าเช่นเดียวกับพันธุ์ปทุมธานี 1 เพื่อให้ได้ต้นที่มีพันธุกรรมที่ ต้องการทั้ง 2 แบบ ดังนั้นสายพันธุ์ข้าวที่ได้จากการคัดเลือกแบบสืบตระกูลในการทดลองครั้งนี้เมื่อน ามาตรวจสอบจีโนไทป์ ด้วยเครื่องหมายโมเลกุลที่ควบคุมลักษณะข้าวเหนียว และความหอม พบว่าทุกสายพันธุ์มียีโนไทป์เป็น wxwx ซึ่ง ควบคุมความเป็นข้าวเหนียว และ fgrfgr ซึ่งควบคุมให้ข้าวหอม ส่วนลักษณะทางฟีโนไทป์ต้องน าไปวิเคราะห์ ปริมาณอะมิโลส เพื่อยืนยันความเป็นข้าวเหนียว และสารหอมในข้าว 2-Acetyl-1-pyrroline (2AP) เพื่อยืนยัน ความหอมของข้าว

สรุปผลกำรวิจัย

การปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวหอมจากข้าวเจ้าด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลช่วยในการคัดเลือก เพื่อสร้างสายพันธุ์ข้าวเหนียวหอม 2 สายพันธุ์ จากข้าวเจ้าพันธุ์ดี คือ พันธุ์ชัยนาท 80 และ สุพรรณบุรี 1 ในฤดูนาปี

2559 ปลูกคัดเลือกสายพันธุ์ สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 จ านวน 6 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 85 วัน คัดเลือกต้นที่มีลักษณะทางการเกษตรดีได้จ านวน 8 สายพันธุ์ ในขณะที่พันธุ์เปรียบเทียบมาตรฐาน สันป่าตอง 1 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 86 วัน และ กข-แม่โจ้ 2 มีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 100 วัน สายพันธุ์

ชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 จ านวน 9 สายพันธุ์ พบว่ามีอายุวันออกดอก 75% เฉลี่ย 87 วัน คัดเลือกต้นที่มี ลักษณะทางการเกษตรดีได้จ านวน 8 สายพันธุ์ และเมื่อตรวจสอบลักษณะทางยีโนไทป์ด้วยเครื่องหมายโมเลกุลในสาย

พันธุ์ข้าว สุพรรณบุรี 1 ข้าวเหนียวหอม BC4F10 และชัยนาท 80 ข้าวเหนียวหอม BC7F6 ที่คัดเลือกได้สายพันธุ์ละ 8 สายพันธุ์ มียีโนไทป์เป็น wxwx ซึ่งควบคุมความเป็นข้าวเหนียว และ fgrfgr ซึ่งควบคุมให้ข้าวหอมทุกสายพันธุ์ สามารถน าไปปลูก คัดเลือกเพื่อเพิ่มความคงตัวทางพันธุกรรมในฤดูต่อไป

82 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ กิตติกรรมประกำศ

โครงการวิจัยเรื่อง การปรับปรุงพันธุ์ข้าวเหนียวหอมจากข้าวเจ้าด้วยวิธีผสมกลับโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุล ช่วยในการคัดเลือก (Breeding of Aromatic Glutinous Rice from Non-glutinous Rice by Marker-assisted Backcrossing) ได้ด าเนินการมาได้ด้วยดี โดยได้รับทุนอุดหนุนการท าวิจัยจากส านักวิจัย และส่งเสริมวิชาการ การเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ที่ให้ทุนวิจัยแก่คณะผู้วิจัยในการท าการวิจัยในปีงบประมาณ พ.ศ. 2560 และ กรมการข้าวที่มอบเมล็ดพันธุ์ข้าวเพื่อน ามาใช้ในโครงการวิจัย จนโครงการวิจัยนี้ประสบผลส าเร็จอย่างดียิ่ง

เอกสำรอ้ำงอิง

กรมการข้าว. 2560 ก. องค์ควำมรู้เรื่องข้ำว พันธุ์ข้ำว สุพรรณบุรี 1. [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://www.ricethailand.go.th/Rkb/varieties/index.php-file=content.php&id=76.htm (10 สิงหาคม 2560). กรมการข้าว. 2560ข. องค์ควำมรู้เรื่องข้ำว พันธุ์ข้ำว กข29 (ชัยนำท 80). [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://www.ricethailand.go.th/Rkb/varieties/index.php-file=content.php&id=60.htm (10 สิงหาคม 2560). กรมการข้าว. 2560 ค. องค์ควำมรู้เรื่องข้ำว พันธุ์ข้ำว กข-แม่โจ้ 2. [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://brrd.in.th/ rkb/contents/view/category:17/title:index.php- file=content.php&id=148.htm (13 ตุลาคม 2560). จันทร์จิรา โรหิตเสถียร ธานี ศรีวงศ์ ประภา ศรีพิจิตต์ และรังสฤษดิ์ กาวีต๊ะ. 2557. การใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ ช่วยคัดเลือกลักษณะความหอม และปริมาณอะมิโลสต่ า ในการปรับปรุงพันธุ์ข้าวแบบบันทึกประวัติ. วำรสำรวิจัย มข. (บศ.) 14(2): 15-22. มหาวิทยาลัยแม่โจ้ และกรมการข้าว. 2558. เอกสำรประกอบกำรพิจำรณำรับรองพันธุ์ กข-แม่โจ้ 2. เชียงใหม่: มหาวิทยาลัยแม่โจ้. 67 น. Allard, R.W. 1960. Principles of plant breeding. New York: Wiley. 485 p. Bradbury, L.M.T., R.J. Henry, Q. Jin, R.F. Reinke and D.L.E. Waters. 2005. A perfect marker for fragrance genotyping in rice. Molecular Breeding 16: 279-283. Francia, E., G. Tacconi, C. Crosatti, D. Barabaschi, D. Bulgarelli, ’A.E. Dall and G. Vale. 2005. Marker assisted selection in crop plants. Plant Cell Tissue and Organ Culture 82: 317-342. Wanchana S., T. Toojinda, S. Tragoonrung and A. Vanavichit. 2003. Duplicated coding sequence in the waxy allele of tropical glutinuous rice (Oryza sativa L.). Plant Science 165: 1193-1199.

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 83 Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8

Development of allele-specific SNP markers for PPR10 gene at Rf4 locus of Fertility Restorer Gene for Identification of Maintainer and Restorer lines

Saengtong Ponjaroenkit*, Kanokwan Janpen, Chotipa Sakulsingharoj and Varaporn Sangtong

1Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai 50290, Thailand.

*Corresponding author: [email protected]

ABSTRACT INTRODUCTION Cytoplasmic male sterility (CMS) -associated Cytoplasmic male sterility (CMS) is maternal genes are located in the mitochondrial genome whereas inheritance. CMS-associated genes are located in the restorer of fertility (Rf) genes are located in the nuclear mitochondrial genome whereas restorer of fertility (Rf) genome. Two major restorer gene loci of Wild genes are located in the nuclear genome. CMS plant is abortive-CMS (WA-CMS), Rf3 and Rf4, are required unable to produce functional pollen. Several CMS for the production of viable pollen. The Rf4 locus of systems with different cytoplasmic/nuclear combination indica rice cultivars were reported, which contains four have been used in hybrid rice production and wild RNA-binding pentatricopeptide repeat protein (PPR) abortive-CMS (WA-CMS) system has been widely encoding genes. Preliminary sequence analysis of used. WA-CMS system, which consists of CMS, reported PPR gene at Rf4 locus from maintainer and maintainer and fertility restorer lines, has been applied restorer lines revealed the difference in size of protein for the commercial production of hybrid seeds. Two only PPR10 protein that resulted from single major restorer gene loci of WA-CMS, Rf3 and Rf4, nucleotide polymorphism (SNP). In this study, PPR10 which are required for the production of viable pollen gene was isolated from four Thai rice cultivars by were mapped to chromosome 1 and 10 respectively Polymerase Chain Reaction (PCR) of genomic DNA. (El-Namaky et al., 2016). The Rf4 locus plays slightly The nucleotide sequences of cloned PPR10 gene from more important role than Rf3 locus in restorer ability Khao Dawk Mali 105, Nahng Mon S-4, Pathum Thani (Cai et al., 2013). The majority of restorer fertility (RF) 1 and Suphan Buri 1 were analyzed by ClustalX or restorer fertility like (RFL) proteins belongs to the program. One of fifteen SNPs at position 1,392 caused RNA-binding pentatricopeptide repeat protein (PPR) nonsense mutation and classified PPR10 protein into family. Nuclear encoded RF proteins are imported into two groups by the length. Tetra-primer amplification mitochondria and bind to the CMS transcripts, refractory mutation system-polymerase chain reaction preventing translation or inducing RNA cleavage. The (ARMS-PCR) is fast, reliable and low cost. Then, four PPR proteins can be divided into P and PLS subfamilies. primers of ARMS-PCR were developed to use as an PLS-class proteins are involved in RNA editing allele-specific DNA marker for Rf4 locus. The tetra- whereas P-class proteins are involved in stability of primer ARMS-PCR products of five maintainer organelle transcripts and intron splicing. The RF or cultivars and four restorer cultivars were G allele (416 RFL proteins belong to the P-class PPR subfamily and bp) and T allele (242 bp), respectively. Therefore, tetra- are characterized by the presence of tandem array of primer ARMS-PCR could be allele specific PPR10 gene 15-20 PPR motif (Melonek et al., 2016). marker and used to identify maintainer and restorer Thai Presently, Rf4 locus of indica rice cultivars, rice cultivars of WA-CMS. These allele-specific PPR10 IR24 Minghui63 and 93-11, were cloned and gene markers will be used for germplasm genotyping sequenced. This Rf4 locus contains four PPR encoding and hybrid rice breeding program. genes which are PPR7/PPR458, PPR8/PPR782b, PPR9/PPR782a and PPR10/PPR454 (Kazama and Keywords: allele-specific SNP marker; tetra-primer Toriyama 2014; Tang et al., 2014). Then, genomic amplification refractory mutation system-polymerase fragments of each PPR gene of IR24 and Minghiu63 chain reaction (ARMS-PCR); restorer of fertility (Rf) (restorer) were introduced into Taichung 65 and gene; pentatricopeptide repeat (PPR) protein; wild Jin23A (CMS), respectively by Agrobacterium- abortive- cytoplasmic male sterility (WA-CMS) mediated transformation. Only transgenic lines of

Ponjaroenkit et al. Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8

PPR9/PPR782a showed partially restored male MATERIALS AND METHODS fertility (Kazama and Toriyama 2014; Tang et al., Plant Materials 2014). This result indicated that PPR9/PPR782a gene The maintainer and restorer lines for WA- may be a major restorer gene at Rf4 locus and other CMS were classified by crossing between CMS lines PPR genes may play a minor role. They may exhibit (IR58025A) as a female parent and Thai rice cultivars additive effect in restorer fertility ability. However, Rf4 as a male parent. The F1 pollen was stained with 2% can often restore fertility of other CMS systems (BT- IKI2 solution. If F1 had sterile pollen, male parents were

CMS, HL-CMS) and encodes PPR proteins which are identified as a maintainer line. In contrast, if F1 had highly identical to these of Rf1a gene of BT-CMS fertile pollen, male parents were identified as a restorer (Huang et al., 2014). Therefore, other PPR genes such line. In this study, Khao Dawk Mali 105 (KDML105), as PPR10 gene could be restorer lines in other CMS Jao Hom Nin (JHN), Nahng Mon S-4 (NMS4) and Pin lines or other CMS systems. Gaew 56 (PG56) were classified as maintainers. DNA markers that enable to determine Rf3 Pathum Thani 1 (PTT1), Suphan Buri 1 (SPR1), Look and Rf4 loci of maintainer and restorer lines are mostly Daeng Pattani (LDP) and RD47 were classified as SSR markers (Fan et al., 2015; Kiani 2015; Waza and restorers (Pantuli 2013). Moreover, the hybrid of Jaiswal 2016). The RM171 and RM 258 were used to IR58025A x PTT1 was used to validate the allele detect Rf4 locus for WA-CMS in 300 rice cultivars. specific gene marker. Currently, one set of PCR-based codominant markers of Rf4 locus that could distinguish maintainers from DNA extraction restorers was reported (Pranathi et al., 2016). A specific Genomic DNA was extracted from the leaves gene marker has not been reported for any Rf gene. of seedlings by the cetyl trimethylammonium bromide Single nucleotide polymorphisms (SNPs) are method with minor modifications (Hwang and Kim the most common form of DNA variation. SNPs can be 2000). used in plants as gene markers for many breeding applications, population studies, and germplasm Cloning and Sequence analysis of PPR10 gene screening. Tetra-primer amplification refractory A comparison of rice PPR10 genes from mutation system-polymerase chain reaction (ARMS- Minghui63 (KJ680251), 93-11 (KJ680253) and IR24 PCR) is a simple and economical method to detect (AB900791) reported in GenBank was performed to SNPs. This technique is based on the use of four identify conserved regions. These two regions were primers in a single reaction and followed by agarose used to design primers for amplification of PPR10 gene gel electrophoresis (Medrano and de Oliveira 2014). from four Thai rice cultivars which were KDML105, This method was used for SNP genotyping in barley NMS4, PTT1 and SPR1. (Chiapparino et al., 2004). Our preliminary sequence The PCR reaction was performed in total analysis of reported PPR7, PPR9 and PPR10 genes volume of 20 µl containing 50 ng of genomic DNA, from maintainer and restorer lines revealed the 1X of Thermo Scientific Phusion High-Fidelity PCR difference of protein size of these lines only in PPR10 Master Mix (Thermo Fisher Scientific), 0.5 µM of each protein that resulted from SNP whereas the size of primer. The PCR condition was as follows: 98 C for PPR7 and PPR9 proteins was the same in both rice 30 sec, followed by 35 cycles of 98 C for 10 sec, 60 lines (data not shown). Therefore, PPR10 gene could C for 10 sec and 72 C for 90 sec, and final 72 C for be a first candidate gene for gene specific DNA marker 5 min. PCR products were analyzed by 1% (w/v) development of Rf4 locus from Thai rice cultivars. agarose gel electrophoresis. Compared with other methods for SNPs genotyping, The expected bands about 2.2 kb of PPR10 tetra-primer ARMS-PCR is fast, reliable and low cost. gene were purified from gel and cloned into In this study, the tetra-primer ARMS-PCR was used to pBluescript II SK vector. Two recombinant clones of develop allele-specific DNA markers for PPR10 gene, each rice cultivar PPR10 gene were sequenced by 1st which is one of fertility restorer genes at Rf4 locus. The BASE (Malaysia) using universal primers and PPR10 PPR10 genes were isolated from Thai rice cultivars specific primer (Os10g0495100R). The 2.2 contiguous which may different from the previous reported PPR10 sequence of each rice cultivar PPR10 gene was gene. Then, sequences of isolated PPR10 genes were assembled by BioEdit program. used to develop the PPR10 specific gene marker that The nucleotide and amino acid sequences of can classify maintainer and restorer lines of Thai rice cloned PPR10 gene from KDML105, NMS4, PTT1, cultivars. and SPR1 were analyzed and compared with PPR10

-2- Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8 Ponjaroenkit et al.

genes reported in GenBank (Minghui63, 93-11 and primer and outer reverse primer. The G specific allele IR24). Multiple sequence alignments were performed was amplified from inner forward primer and outer using ClustalX2.1 program (Larkin et al., 2007). The reverse primer whereas the T specific allele was InterProScan from https://www.ebi.ac.uk/interpro/interproscan amplified from outer forward primer and inner reverse was used to find PPR motif within PPR10 protein. primer (Figure 1). The tetra-primer ARMS-PCR reaction was Primer design and validation of SNP genotyping performed in total volume of 20 µl containing 20 ng of The nucleotide sequence comparison genomic DNA, 1X MYTAQ RED MIX (BIOLINE, revealed one SNP (G/T) causing nonsense mutation UK), 0.125 µM of each inner primer, 0.5 µM of each where GAA was changed to TAA (stop codon). outer primer. The PCR condition was as follows: 94 Then, tetra-primer ARMS-PCR was employed to C for 5 min, followed by 45 cycles of 94 C for 30 identify this SNP. In this method four primers were sec, 60 C for 15 sec and 72 C for 30 sec, and final used to amplify a target fragment from DNA 72 C for 5 min. PCR products were analyzed by 2% containing the SNP, generating amplicons representing (w/v) agarose gel electrophoresis. The PCR products each of the two allelic forms. Primers were used to were purified and sequenced to verify the amplicons. amplify fragments of different sizes for each allele Then, primer set was tested on five maintainer that can be resolved by agarose gel electrophoresis. cultivars, four restorer cultivars and one hybrid of Tetra -primers were designed using BatchPrimer3 v1.0 IR58025A x PTT1 to validate the accuracy of the program (http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/). tetra-primer ARMS-PCR. The gene fragment was amplified from outer forward

Figure 1. Diagram representation of tetra- primer ARMS-PCR for allele-specific SNP genotyping. Four primers are used: the two outer primers amplify a gene fragment that contains an SNP (white box). The inner primers are designed to amplify the G or T allele. The outer forward primer and inner reverse primer were used to amplify an amplicon representing the T allele whereas the inner forward primer and outer reverse primer were used to amplify an amplicon representing the G allele. The two allele specific amplicons differ in length that can be discriminated by gel electrophoresis. (Adapted from (Chiapparino et al., 2004).

-3- Ponjaroenkit et al. Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8

RESULTS AND DISSCUSSIONS was performed using PCR of genomic DNA. Cloning and sequence analysis of PPR10 gene The PPR10 nucleotide sequence from Our preliminary study of PPR7, PPR9 and GenBank comparison revealed conserved region PPR10 genes from maintainer (93-11 and Nipponbare) which was used to design primers of PPR10 gene, and restorer (IR24 and Minghui63) lines revealed that PPR10-Forward and PPR10-Reverse primers as shown the difference in size of protein was only found in in Table 1. The PPR10-Forward and PPR-Reverse PPR10 protein that resulted from SNP. On the other primers were located 29 nucleotides upstream of start hand, PPR7 and PPR9 protein sizes were the same in codon and 149 nucleotides downstream of stop codon both rice lines. Therefore, PPR10 gene could be a first of PPR10 gene, respectively and covered full-length candidate gene for DNA marker development of Rf4 coding region of PPR10 gene. These primers were used locus from four Thai rice cultivars. However, PPR10 to amplify PPR10 gene from Thai rice cultivars. Then, gene from Thai rice cultivars may be not the same as the 2.2 kb expected band was cloned and sequenced. reported in GenBank. In this study, the isolation of The nucleotide sequences of cloned PPR10 gene from PPR10 gene was performed from Thai rice cultivars. KDML105 and NMS4 were 2,188 bp whereas those Since PPR10 gene is intronless gene. Then, gene amplification from PTT1 and SPR1 were 2,194 bp.

Table 1 List of primers used in this study. Primer set Name Sequence (5->3) Allele Amplicon size (bp) PPR10 PPR10-Forward TGCTGCTGCACCTGTCAGC - 2,200 gene PPR10-Reverse GCCGATTAGGGTAGTATCGGGG - Os10g0495100R CCTCAGCCTTCTCCCATTTG - - Tetra PPR10- Inner AGAAGGCTGAGGAGTTAATTTTTG G 416 primers forward PPR10- Inner CTGGACAGATGCCTTGATCCAACATTTA T 242 reverse PPR10- Outer CAAAATGAGGCAGCAAGGAT 603 forward PPR10- Outer CCGATCGATGCACATATGAC reverse

The nucleotide sequences of PPR10 genes 2) which may influence RNA binding specificity. The from four rice cultivars were compared with three study of RF gene at the same locus in different Oryza PPR10 gene sequences from GenBank. The nucleotide species showed diverse amino acid sequences that had sequence comparison of maintainers and restorers different functions because they could bind different revealed 15 base substitutions or SNPs in coding region RNA targets (Melonek et al., 2016). Moreover, based (position 29-1,745) which were nine transition and six on SNP at position 1,392 (G1392 to T1392), PPR10 transversion mutations. However, only five SNPs that protein was classified into two groups which were 454 caused missense or neutral mutations. One SNP at (T allele) and 569 (G allele) amino acids in length. position 1,392 (G to T) caused nonsense mutation Since PPR10 was PPR protein, then PPR motif was which resulted from transversion mutation as shown in searched by InterProScan program. The PPR10 protein Table 2. The SNP (T791-to-A) that caused nonsense of restorers contained ten PPR motifs whereas mutation (TAT to TAA) was also observed in Rf5/rf5 maintainers contained thirteen PPR motifs (Figure 2b). gene in the HL-CMS line (Huang et al., 2014). The The median number of PPR motifs per protein of P- InDel mutation was found only at position 1,504 class and RFLs were nine and thirteen motifs, (downstream of stop codon) which did not affect respectively (Melonek et al., 2016). From the number PPR10 protein from restorers (Figure 2a). The high of PPR motifs, PPR10 protein of maintainers and frequency of transversion mutations may suggest that restorers may have different function. Therefore, maintainers were diverged from restorers for a long PPR10 gene of maintainers and restorers could have time. The comparison of amino acids of PPR10 protein restorer ability in different CMS lines or CMS systems. revealed that all of maintainers and restorers had the There was reported that restorer lines containing Rf4 same amino acid sequences (Figure 2b). The missense can often restore the fertility of BT-CMS and HL-CMS mutation happened more frequently than others (Table (Huang et al., 2014)

-4- Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8 Ponjaroenkit et al.

Moreover, male sterile restore ability of seven were 416 and 242 bp, respectively. Then, the primer rice cultivars were analyzed with PPR10 gene as set was tested on five maintainer cultivars, four shown in Table 3. The result showed that G and T allele restorer cultivars and one hybrid of IR58025A x PTT1 belong to maintainer and restorer lines, respectively. to validate the accuracy of the tetra-primer ARMS-

Therefore, this result suggested that SNP1,392 could be PCR. The PCR products of five maintainer cultivars associated with male sterile restoration ability and and four restorer cultivars were 416 bp and 242 bp could be used as a gene marker for PPR10 gene. As which were G and T alleles, respectively (Table 4). well as the SNP A/C at +474 in the CDS was converted Moreover, the hybrid of IR58025A x PTT1 showed to an allele-specific PCR marker for PPR9 gene (Chen both G allele from IR58025A and T allele from PT1 et al., 2017). (Figure 3b). Then, PCR products of 416 bp from KDML105 and these of 242 and 603 bp from LDP, Primer design and validation of allele specific SNP were purified and sequenced. The nucleotide marker sequences of these fragments were as expected (data The 1,170-1,780 bp region of IR24 PPR10 not shown). Therefore, tetra-primer ARMS-PCR gene sequence containing SNP1,392 was used in tetra- could be the first allele specific PPR10 gene marker primer ARMS-PCR primer design (Figure 3a) and the and could be used to classify maintainer or restorer sequence of these four primers were shown in Table 1. Thai rice cultivars of WA-CMS. The SSR markers PPR10-Outer forward and PPR10- Outer reverse were used to identify maintainer and restorer lines of primers were used to amplify gene fragment of 603 bp. WA-CMS which most of them were the linked part of The G allele was amplified from PPR10-Inner forward Rf4 locus. Then, they were not suitable across species and PPR10- Outer reverse primer whereas T allele was (Miah et al., 2013). This allele specific PPR10 gene amplified from PPR10-Outer forward and PPR10- marker will be used for germplasm genotyping and Inner reverse primers. The amplicons of each allele the hybrid rice breeding program.

Table 2 Five SNPs in coding region that affected amino acids of PPR10 genes from 7 rice cultivars. The sequences of maintainers were used as reference lines. Number (#) Position SNPs Type of base substitution Change in Type of mutation amino acid 3 216 A to G Transition T to A Missense 4 261 C to G Transversion H to D Missense 7 438 C to T Transition R to C Missense 8 868 A to T Transversion K to M Missense 10 986 G to T Transversion W to C Neutral 12 1,392 G to T Transversion E to Stop Nonsense

Table 3 Male sterile restore ability and PPR10 gene of each rice cultivar. Rice cultivar Restore ability SNP at position 1,392 Length (amino acids) Nipponbare Maintainer G 569 93-11 G 569 KDML105 G 569 NMS4 G 569 IR24 Restorer T 454 Minghui63 T 454 PTT1 T 454 SPR1 T 454

-5- Ponjaroenkit et al. Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8

Figure 2. Nucleotide and amino acid sequence comparison of PPR10 gene. The isolated PPR10 genes were from KDML105, NMS4, SPR1, and PTT1 cultivars. The reported PPR10 gene were from 93-11, IR24 and Minghui63. The KDML105, NMS4 and 93-11 were maintainers whereas SPR1, PTT1, IR24 and Minghui63 were restorers. (a) Schematic representation of 2.2 kb PPR10 gene and grey boxes were coding regions. The nucleotide sequence comparison revealed five SNPs in coding region and six base pair deletion (InDel). (b) Amino acid comparison revealed five point mutations indicated by * and box indicated PPR motif.

-6- Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8 Ponjaroenkit et al.

Figure 3. Primer design and validation of allele specific SNP marker. (a) The 1,170-1,780 bp region of IR24 PPR10 gene sequence that was used in tetra primer-ARMS -PCR primer design, Outer forward, Outer reverse, Inner forward and Inner reverse primers. (b) Agarose gel electrophoresis for tetra-primer ARMS-PCR of five maintainer cultivars, four restorer cultivars and one hybrid of IR58025A x PTT1. Lane M was GeneRuler 100 bp DNA plus DNA ladder (Thermo Scientific). Lane 1-12 were PCR products from KDML105, JHN, NMS4, PG56, PTT1, SPR1, LDP, RD47, IR58025A, PTT1 and hybrid of IR58025A x PTT1, respectively. Lanes 1-5 were maintainers whereas lanes 6-9 were restorers. The G allele (maintainer allele) was 416 bp whereas T allele (restorer allele) was 242 bp.

Table 4 The allele specific genotyping by tetra-primer ARMS-PCR.

Rice cultivar Restore ability SNP1,392 IR58025B Maintainer G KDML105 G JHN G NMS4 G PG56 G PTT1 Restorer T SPR1 T LDP T RD47 T

F1 (IR58025Ax PTT1) - G/T

ACKNOWLEDGEMENTS This study was supported by the grant from National Research Council of Thailand.

-7- Ponjaroenkit et al. Genomics and Genetics 2017, 10(1&2): 1–8

REFERENCES Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, Cai J, Liao QP, Dai ZJ, Zhu HT, Zeng RZ, Zhang ZM, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace Zhang G-Q (2013) Allelic differentiations and IM, Wilm A, Lopez R, et al. (2007) Clustal W and effects of the Rf3 and Rf4 genes on fertility Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23: 29472948. restoration in rice with wild abortive cytoplasmic Medrano RFV, de Oliveira CA (2014) Guidelines for male sterility. Biol Plant 57: 274280. the tetra-primer ARMS–PCR technique Chen L-K, Yan X-C, Dai J-H, Chen S-P, Liu Y-Z, development. Mol Biotechnol 56: 599608. Wang H, Chen Z-Q, Guo T (2017) Significant Melonek J, Stone JD, Small I (2016) Evolutionary association of the novel Rf4-targeted SNP marker plasticity of restorer-of-fertility-like proteins in with the restorer for WA-CMS in different rice rice. Sci Rep 6: 35152. backgrounds and its utilization in molecular Miah G, Rafii MY, Ismail MR, Puteh AB, Rahim HA, screening. J Integr Agric 16: 21282135. Islam KN, Latif MA (2013) A review of Chiapparino E, Lee D, Donini P (2004) Genotyping microsatellite markers and their applications in rice single nucleotide polymorphisms in barley by tetra- breeding programs to improve blast disease primer ARMS–PCR. Genome 47: 414420. resistance. Int J Mol Sci 14: 2249922528. El-Namaky R, Sedeek S, Moukoumbi YD, Ortiz R, Pantuli S (2013) Selection Thailand rice varieties for Manneh B (2016) Microsatellite-Aided Screening maintainer lines and restore lines and improvement for Fertility Restoration Genes (Rf) Facilitates Thailand rice varieties for cytoplasmic male Hybrid Improvement. Rice Sci 23: 160164. sterility lines. Special project Bachelor of Science Fan F, Li N, Wang J, Liu X, Liu J, Zhu Y, Li S (2015) Program in Agriculture (Agronomy) (Maejo Molecular marker-directed development of a novel University.). cytoplasmic male sterile line in rice. Mol Breed 35: 212. Pranathi K, Viraktamath BC, Neeraja CN, Huang J-Z, E Z-G, Zhang H-L, Shu Q-Y (2014) Balachandran SM, Hari prasad AS, Koteswara RP, Workable male sterility systems for hybrid rice: Revathi P, Senguttuvel P, Hajira S K, Genetics, biochemistry, molecular biology, and Balachiranjeevi C H, et al. (2016) Development and utilization. Rice 7: 13. validation of candidate gene-specific markers for Hwang S-K, Kim Y-M (2000) A simple and reliable the major fertility restorer genes, Rf4 and Rf3 in method for preparation of cross-contamination-free rice. Mol Breed 36: 145. Tang H, Luo D, Zhou D, plant genomic DNA for PCR-based detection of Zhang Q, Tian D, Zheng X, Chen L, Liu YG (2014) transgenes. J Biochem Mol Biol 33: 537546. The Rice Restorer Rf4 for wild-abortive Kazama T, Toriyama K (2014) A fertility restorer gene, cytoplasmic male sterility encodes a PPR protein Rf4, widely used for hybrid rice breeding encodes a that functions in reduction of WA352 transcripts. pentatricopeptide repeat protein. Rice 7: 28. Mol Plant 7:14971500. Kiani G (2015) Validation of SSR Markers Linked to Waza SA, Jaiswal HK (2016) Identification of elite Restoring Fertility (Rf) Genes and Genotyping of grain quality restorers and maintainers for wa cms Rice Lines at Rf Loci. J Agric Sci Technol 17: lines of rice (Oryza sativa L.). SABRAO J Breed 19311938. Genet 48: 145153.

-8- Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8

Expression analysis and nucleotide variation of OsC1 gene associated with anthocyanin pigmentation in Thai rice cultivars

Lalita Na Rachasima1, Roypim Sukkasem1, Saengtong Pongjaroenkit1, Varaporn Sangtong1, Srimek Chowpongpang2 and Chotipa Sakulsingharoj1*

1Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai 50290, Thailand 2National Science and Technology Development Agency, Pathum Thani 12120, Thailand

*Corresponding author: [email protected]

ABSTRACT to the coloration of most flowers, fruits, and seeds, and OsC1 gene, encoding a R2R3-Myb transcription are synthesized via the phenylpropanoid pathway factor, regulates expression of structural genes in (Koes et al., 2005). To plants, different anthocyanin anthocyanins biosynthesis pathway in rice. It plays an accumulations in their tissues and organs have diverse important role in rice coloration. Expression of this gene physiological functions, including hormone responses, in both leaf and seed tissues was examined in three rice ultra-violet radiation, and defenses to biotic and abiotic cultivars covering white (Khao Dawk Mali 105; 105), red stresses (Reddy et al.,1994; Ithal and Reddy, 2004). To (Sukhothai Hom Dang; SKHD) and black (Kham; KN) humans, they provide several biological activities such rice. Expression of the OsC1 gene was found in young as antioxidants, prevention and reduction of risk of leaves and seeds in all rice cultivars in this study. Higher coronary heart disease and cancer, reduction of blood level of gene expression was observed in seed tissues of cholesterol and being antiviral, antimicrobial, and anti- Kham black rice at 25 days after flowering, associated inflammatory (Geekiyanage et al., 2012). Antioxidant with dark anthocyanin pigmentation on the pericarps. efficacy of anthocyanins is higher than that of vitamin C However, the expression patterns of this gene in leaves and E (Bagchi et al., 1998 Cossins et al., 1998; Shi et al., and seeds in white and red rice were stable and appeared 2003). at similar level, not corresponding with the phenotypic Rice is global staple food and the most important traits of red rice color at the late stage of development economic crop in the world. More than 40,000 varieties compared with the white one. Comparisons of nucleotide were reported under cultivated rice. Several of them have sequences in the exon 3 of the OsC1 gene among those various important pigmented grain colors, with white, red, three cultivars revealed a 10-bp deletion in white and red and black pericarp tissues due to anthocyanin pigment rice, resulting in frameshift mutation in R3 region of Myb synthesis and accumulation (Reddy et al., 1994). DNA binding domain, but not in the black. This deletion Anthocyanin synthesis in rice involves two major classes caused the functional loss in white (105) rice, leading to of genes, the structural genes and the regulatory ones. The their anthocyanin pigment accumulation loss at all stages first group encodes anthocyanin biosynthesis enzymes and tissue types. For red (SKHD) rice, although the such as chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase expression of OsC1 was detected at all stages, its similar (CHI), flavanone 3-hydroxylase (F3H), flavonoid 3'- 10-bp deletion in exon 3 of the OsC1 gene indicated an hydroxylase (F3'H), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), alternative pathway for anthocyanin pigment to be and anthocyanidin synthase (ANS) (Shih et al., 2008). accumulated in the pericarp tissues. The result from this The other encodes transcription factors which are divided study constitute a basis on how pigment would be into two groups, Myc / basic helix-loop-helix (bHLH) and developed in these three Thai rice cultivars and are Myb type families. applied to rice improvement by developing molecular In rice, Myc type bHLH transcription factors, markers for selection of rice anthocyanin pigmentation in OSB1 and OSB2 genes had been identified to be on the future. Plw locus on chromosome 4 (Hu et al, 1996; Sakamoto Keywords: OsC1 gene, rice, anthocyanins, transcription et al., 2001; Inta et al., 2013; Sakulsingharoj et al., factor 2014). Dynamic response of the OsB1 gene in black rice revealed a possible role in anthocyanin biosynthesis INTRODUCTION (Sakulsingharoj et al., 2016). However, the regulatory Anthocyanins are water soluble pigments, genes of Myb type in most plant belong to R2R3 Myb classified as a major class of flavonoid. They contribute transcription factors. Previously, the rice OsC1 gene

Na Rachasima et al. Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8 encoding Myb factors for anthocyanin synthesis had for the basis on the allelic variation linking to their been identified (Martin and Paz-Ares, 1997). It was a phenotypic attributes. homolog of the C1 gene in maize and provided C1/Pl proteins for Myb DNA binding domains regulating MATERIALS AND METHODS downstream gene expression in the flavonoid pathway Plant materials and RNA extraction (Chandler et al., 1989). Several studies on rice coloration Three Thai rice cultivars Khao Dawk Mali showed that the OsC1 gene was located on the short arm 105 (kindly provided by Maejo University), Sukhothai of chromosome 6 where 3 exons and 2 introns were Hom Dang (kindly provided by Khao Thammachad, designated (Saitoh et al, 2004). The 10-bp deletion in the Co, Ltd, Sukhothai, Thailand), and Kham (collected R3 domain of exon 3 caused frameshift mutation, from Nong-Tao-Kham village, Sansai district, Chiang leading to truncated transcription factor of OsC1 which, Mai, Thailand) were employed in this study (Figure 1). in turn, halting of anthocyanin pigmentation eventually Phenotypic traits were recorded from rice in the (Saitoh et al., 2004; Chin et al., 2016; Choudhury et al., vegetative and reproductive stages. The seedlings were 2014). Although OsC1 gene make-up was unravelled, collected two weeks after germination. The rice plants there was still rare information concerning the OsC1 were grown in greenhouse and developing seeds were gene in Thai color rice. collected at 15 and 25 days after flowering. At maturity, The present study was carried out to the seeds were harvested. The seeds were dehulled and investigate the relationship between the expression of pericarp colors were observed at different developmental OsC1 regulatory gene and the anthocyanin pigmentation stages. RNA was extracted from leaves and seeds at in three cultivars of Thai rice in different tissues. In corresponding stages using the TRIzol reagent addition, nucleotide sequences of OsC1 in exon 3 (ThermoFisher Scientific, USA) and treated with among those cultivars were compared and investigated DNaseI (New England Biolabs, USA) before use.

Figure 1 Phenotypic traits of seedlings and seeds of three rice cultivars. (A-C) Khao Dawk Mali 105 seedlings at the age of 5, 15 and 25 days, respectively. (D-F) Sukhothai Hom Dang seedlings at the age of 5, 15 and 25 days, respectively. (G-I) Kham seedlings at the age of 5, 15 and 25 days, respectively. Developing seeds at 15 days (left) and 25 days (right) after flowering. Mature seed, (lower row) and pericarp colors of dehulled seeds (upper row).

-2- Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8 Na Rachasima et al.

Investigation of OsC1 gene expression at the early Sukhothai Hom Dang (SKHD) and Kham (KN) were stage of development quantified. Fifty milligrams of fresh tissues were RNA from seedlings 2-week after germination homogenized with 1 ml of 1 % HCl in 80 % methanol and 5-day-old developing seeds were investigated for (V/V) as modified from Chin et al. (2016). The their OsC1 gene expressions. Two micrograms of total supernatant was collected after centrifugation at 12,000 RNA of each sample were reverse transcribed using rpm for 5 min and absorbances at 530 nm and 675 nm oligo (dT) primers in 20 uL reaction by High-Capacity were measured using a spectrophotometer (Meterech cDNA Reverse Transcription Kit according to SP-830 plus, Taiwan). The anthocyanin contents were manufacturer’s instructions (Applied Biosystems, determined as follow: (A530-A675)/gram fresh USA). Gene-specific primers were designed based on weight. Three replicates were analyzed for each nucleotide sequence of the OsC1 gene (Y15219.1), sample. Statistical analysis was performed using R- OC1_F: 5´-CGGGTTCTTCTTCCACGAC-3´ and 3.4.0 program (http://www.r-project.org). OC1_R: 5´-CCCGCAACTGCACTTAAAAT-3´ to provide the expected length of about 360 bp products. The PCR analysis and comparison of OsC1 gene OsActin gene was used as an internal control and its sequences primer set was OsActinF 5´-TGATGCGCCCAGGGCTGTCT- Genomic DNA was extracted from young rice 3´ and OsActinR 5´-CGATTGGCCTTGGGGTTGAG- seedlings using modified CTAB method (Hwang and 3´. Amplification of target cDNA was performed with Kim, 2000). The extracted DNA was subjected to PCR MyTaq Red Mix (Bioline, USA). Both PCR profiles using primers specific to a partial exon 3 region of were 95 ºC for 3 min, 35 cycles at 95 ºC for 30 sec, 55 OsC1 gene (OC1ex3_F: 5´-GATCGATCGTGTATAT ºC for 30 sec, and 72 ºC for 30 sec, and 5 min at 72 ºC ATGTTGTCAGGT-3´ and OC1ex3_R: 5´-GTTGCTG for final extension. Aliquots of PCR products were TGTCGGTGTCGGCG-3´) (Saitoh et al., 2004). The analysed on a 1.8 % (w/v) agarose gel by electrophoresis. PCR amplification was carried out in a 20 uL reaction using Phusion Flash High-Fidelity PCR Master Mix Examination of OsC1 gene expression in different (ThermoFisher Scientific, USA) with temperature tissues by semi-quantitative RT-PCR profile as following, 98 ºC for 30 sec, 35 cycles at 98 RNA from leaf and seed tissues at the age of ºC for 10 sec, 55 ºC for 15 sec, and 72 ºC for 45 sec, 15 and 25 days was extracted (Figure 1). The DNase I- and 5 min at 72 ºC for final extension. Aliquots of PCR treated RNA samples were reverse transcribed using products were analysed on a 1.8 % (w/v) agarose gel oligo (dT) primers by High-Capacity cDNA Reverse by electrophoresis. The amplified fragments of about Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). For the 250 bp were cut, purified and subjected to sequencing template, 2 ug of total RNA was employed in a 20 uL by the 1st BASE (Malaysia). The nucleotide and Reverse Transcription (RT) reaction, according to deduced amino acid sequences of exon 3 region of rice manufacturer’s instructions. Gene-specific primers cultivars were analyzed and compared with OsC1 gene were OC1_F and OC1_R, generating the expected RT- available in GenBank via the ClustalX 1.83 and PCR products of about 360 bp. The primers of OsActin GeneDoc 2.7 programs. gene (OsActinF and OsActinR) were also used as an internal control. Amplification of target cDNA was RESULTS AND DISCUSSION performed with My Taq Red Mix (Bioline, USA). The Phenotypic traits of anthocyanin pigmentation in PCR profile was 95 ºC for 3 min, 28 cycles at 95 ºC for rice tissues at different growth stages 30 sec, 55 ºC for 30 sec, and 72 ºC for 30 sec, and 5 Three Thai rice cultivars, differing in mature min at 72 ºC for final extension. Aliquots of PCR pericarp colors, white (Khao Dawk Mali 105; 105), red products were analysed on a 1.8 % (w/v) agarose gel (Sukhothai Hom Dang; SKHD) and black (Kham; by electrophoresis. The expression levels of OsC1 gene KN), provided no drastic phenotypic variants in tissues were determined by the program GelAnalyzer 2010 related to anthocyanin pigmentation except for the (http://www.GelAnalyzer.com). The relative expression seeds (Figure 1). After germination, the 105 and SKHD levels were based on the expression ratios of a target had green seedlings and remained green to whole OsC1 gene to a reference OsActin gene. stages, including at 15 and 25 days while the black rice KN accumulated low amount of anthocyanins on leaf Measurement of anthocyanin contents sheath at 15 days of age and gained increasing Total anthocyanin contents of 2-week-old anthocyanin accumulation at the 25-day-old stage seedlings extracts from Khao Dawk Mali 105 (105), (Figure 1). Similarly, the developing seeds of 105 and

-3- Na Rachasima et al. Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8

SKHD were green at 15 and 25 days after flowering rice varieties as compared with that of the internal while the KN appeared to accumulate small amount of OsActin gene (Figure 2). In several cultivars of rice, the anthocyanins at the first 15 days followed by the rapid C locus of the OsC1 gene on chromosome 6 was increasing at 25 days (Figure 1). When the seeds responsible for anthocyanin accumulation in apiculus reached the maturity stage, their pericarps turned (Saitoh et al., 2004; Choudhury et al., 2014) and leaf white, red, and black, referring to different rice sheath (Chin et al., 2016). Previous semi-quantitative cultivars used in this experiment. RT-PCR analysis revealed that the OsC1 expression was light-inducible in both colored and non-colored Expression of the OsC1 gene in leaves and seeds rice, including seedlings of japonica Taichung 65 (Shin The spatial distribution of the OsC1 gene et al., 2008). In this study, the OsC1 gene expression expression in leaf and seed tissues at the early stage of was found in young leaves and seeds of all three Thai development of white, red, and black rice cultivars rice cultivars, regardless of their colors. These revealed a similar pattern of expression among leaves provided a clue on OsC1 regulation in Thai rice in and seeds. The expression was rather stable in all three general.

Figure 2 Expression analysis of the OsC1 gene in rice by RT-PCR technique. The cDNA from young leaves (L) and developing seeds (S) were used as templates. Expression of the OsActin gene was used as an internal control. Khao Dawk Mali 105 (105), Sukhothai Hom Dang (SKHD) and Kham (KN).

Expression levels of the OsC1 gene in tissues at and consistent with high anthocyanin contents in seeds different growth stages at 25 days of age of black rice in previous reports To examine whether expression levels of (Jiamyangyuen et al., 2017; Rahman et al., 2015). OsC1 genes from different tissues at various growth In leaf tissues, the relative expression of OsC1 stages was correlated with the phenotypes of anthocyanin gene in KN at 15 days after germination showed accumulations, the cDNA was prepared from RNA slightly increased level of 1.13 fold relative to that of samples extracted from seedlings and developing seeds white 105 rice (Figure 3B). The OsC1 expression was at 15 and 25 days of development and subjected to associated with higher athocyanin contents of 15.01 per semi-quantitative RT-PCR. As shown in Figure 3, in gram fresh weight of KN seedlings at 15 days of age leaves and seeds, the expression patterns of OsC1 (Figure 4). Although the phenotypic traits of KN transcripts in white and red rice were stable and seedlings at 15 days were slightly different from those appeared at similar level. However, expression of OsC1 at 25 days (Figure 1), the anthocyanin contents of gene in KN, black rice, was slightly different especially seedlings at 15 and 25 days of 15.01 and 10.37 per at late development. The relative expression levels of gram fresh weight, respectively, (Figure 4) were OsC1 gene in seed tissues of KN at 15 and 25 days of correlated with the relative levels of OsC1 gene development showed 3.36 and 5.0 folds, respectively, expression (Figure 3B). The result in KN was in relative to those of white 105 rice (Figure 3D). Higher consistent with that of anthocyanin enhancement in level of gene expression was observed in KN seed other rice cultivars, having a dark purple leaf sheath as tissues at 25 days after flowering, associated with dark previously investigated by real-time RT-PCR (Chin et anthocyanin pigmentation on the pericarps (Figure 1) al., 2016).

-4- Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8 Na Rachasima et al.

Figure 4 Anthocyanin contents of seedling extracts from Khao Dawk Mali 105 (105) , Sukhothai Hom Dang

(SKHD) and Kham (KN). Anthocyanin contents were calculated as follow: [(A530-A675)/gram fresh weight]. Bar represented standard deviation. The anthocyanin content in KN black rice at 15 and 25 days showed significant difference (p < 0.05) using paired t-test.

As described earlier, expression of OsC1 gene with the white one. Thus, for red rice, care should be could be induced by seveal factors including light, taken to identify further factor (s) that timely control stress, and plant growth regulator treatments. Semi- anthocyanin biosynthesis and accumulation. Likewise, quantitative RT-PCR analysis in seedlings of japonica for the 105, more investigations on the OsC1 gene rice confirmed that OsC1 gene expression was induced makeup and its role for the loss control of anthocyanin by light exposure in both pigmented and nonpigmented accumualtion would be needed. ones (Shih et al., 2008). In indica rice, it was found that OsC1 transcripts levels analyzed by northern blot were Comparisons of nucleotide and amino acid sequences increased in rosponsive to dehydration stress, high salt, of OsC1 genes and abscisic acid (ABA) treatments (Ithal and Reddy, For further investigation on the allelic 2004). The OsC1 which is Myb factor was thought to variation linking with their anthocynanin be a potential transcription activator, especially for biosynthesis and accumulation, nucleotide sequence OsDFR and OsANS, the late structural genes in the and the deduced amino acid prediction were anthocyanin biosynthesis pathway. In this study, determined. Nucleotide sequence analysis of exon 3 expression level of OsC1 was enhanced in seed tissues of OsC1 gene showed 10-bp deletion at position at late stage of development, suggesting a possible 796-805 in white and red rice, 105 and SKHD, major role of regulatory OsC1 gene that might regulate respectively (Figure 5), but not of the black (KN) the structural genes spatially and temporally in rice. and Purpleputtu, a reference purple rice from Although the above results did imply OsC1 GenBank (BAD04024.1). The white (105) and red role in anthocyanin accumulation in black rice, similar (SKHD) rice had 10-bp deletion in the R3 Myb level of OsC1 expressions between the 105 and SKHD domain which was a core domain in exon 3 of OsC1 was not in corresponding with the phenotypic traits of gene. This deletion caused a frameshift mutation, red color rice at late stage of development compared leading to a premature stop codon (Figure 6).

-5- Na Rachasima et al. Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8

Figure 3 Semi-quantitative RT-PCR expression analysis of the OsC1 gene in rice leaves (A) and seeds (C) at different ages of 15 and 25 days. OsActin expression was used as an internal control. The white, red and black rice were Khao Dawk Mali 105 (105), Sukhothai Hom Dang (SKHD) and Kham (KN), respectively. The relative expression levels of OsC1 gene (the expression ratios of OsC1 gene to OsActin gene) in leaves (B) and seeds (D) at different ages of 15 and 25 days. The values represented the expression levels of each sample relative to that of white rice (105).

Figure 5 Comparison of nucleotide sequences of exon 3 of OsC1 gene among different rice cultivars. Exons and introns were indicated by open boxes and thin lines, respectively. The numbers 1-1294 indicated the positions of full-length genomic sequences of OsC1 gene. The red box showed the 10-bp deletion in exon 3 in white (105C1_300) and red (SKHDC1_300) rice, comparing with that in black (KNC1_300) rice cultivar. SA3 was the OsC1 gene from purple rice Purpleputtu (AB111869.1) showing sequence of exon 3.

-6- Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8 Na Rachasima et al.

Figure 6 Alignment of deduced amino acid sequences of exon 3 of OsC1 gene from different rice cultivars. The red box showed the frameshift mutation caused by the 10-bp deletion in exon 3 of white (105C1) and red (SKHDC1) rice, comparing with that in black (KNC1) rice cultivar. Purpleputtu was the amino acid sequences of exon 3 of OsC1 gene from purple rice Purpleputtu (BAD04024.1).

This finding agreed with the report of Saitoh regulator. Thus for Kham cultivar, the result suggested et al., (2004), at same location and deletion type for the that OsC1 was a key role for anthocyanin accumulation. colorless apiculus lines. In addition, most colorless The presence of a 10-bp deletion in exon 3 of OsC1 gene apiculus rice varieties (Choudhury et al., 2014) and that caused functional loss in white rice led to their loss green rice varieties (Chin et al., 2016) were reported to of anthocyanin pigment accumulation at all stages and have similar deletion, suggesting a key role of OsC1 tissue types. For red (SKHD) rice, although the gene in genetic makeup of anthocyanin accumulations. expression of the OsC1 gene was detected at all stages, The result here was consistent with the previous ones, its similar 10-bp deletion in exon 3 of OsC1 gene suggesting a loss-of function mutation by the OsC1 indicated an alternative pathway for anthocynanin alleles in 105, SKHD, affected directly to R3 Myb pigment to be accumulated in the pericarp tissues. domain, leading to no anthocyanin biosynthesis. Further conclusive demonstrations on OsC1 expression Although SKHD had mutated OsC1 gene, the and nucleotide variations with different alleles at the C accumulation of red pigment still appears in their locus linked to phenotypes of anthocyanin accumulation pericarps, suggesting an alternative pathway for this among various colored rice varieties need to be control. For red color rice, proanthocyanidins, a branch investigated. These will not only constitute a basis on of anthocyanin biosynthesis pathway has been how pigment would be developed but also beneficial for proposed. It shares common structural genes encoding understanding genetic diversity in rice toward a goal for biosynthesis enzymes comparably. This proanthocyanidin marker development for rice breeding in the future. biosynthesis is controlled by other regulators containing basic helix-loop-helix transcription factor ACKNOWLEDGEMENTS (Furukawa et al., 2007; Sweeny et al., 2006), This research is supported by the National Although the results in the present study Research Council of Thailand (NRCT). We are thankful suggested that the OsC1 gene plays a key role in to The Graduate School, Maejo University, Chiang Mai, anthocyanin pigmentation in Thai rice, mutations in Thailand for the financial assistance to Miss Lalita Na other genes linked with no anthocyanin pigmentation Rachasima, Master program in Genetics, Faculty of were also confirmed (Sakamoto et al., 2001; Inta et al., Science, Maejo University, Chiang Mai, Thailand. 2013; Sakulsingharoj et al., 2016). Therefore, further studies on other genetic makeups and their controls REFERENCES especially on regulatory genes or on structural genes in Bagchi D, Garg A, Krohn R, Bagchi M, Bagchi D, anthocyanin biosynthesis need to be carried out. Balmoori J, Stohs S (1998) Protective effects of In conclusion, expression of regulatory OsC1 grape seed proanthocyanidins and selected antioxidants gene was found in young leaf and seed tissues of all against TPA-induced hepatic and brain lipid three Thai indica rice independent of the colors. peroxidation and DNA fragmentation, and However, only in the leave and seeds of black rice, peritoneal macrophage activation in mice. Gen Kham, had an enhanced expression of the OsC1 gene, Pharmacol 30: 771–776. which in turn appeared to associate with the phenotypic Chandler VL, Radicella JP, Robbins TP, Chen J, Turks traits of anthocyanin accumulation directly with OsC1 D (1989) Two regulatory genes of the maize

-7- Na Rachasima et al. Genomics and Genetics 2017, 10(3): 1–8

anthocyanin pathway are homologous: isolation of Koes R, Verweij W, Quattrocchio F (2005) B utilizing R genomic sequences. Plant Cell 1: Flavonoids: a colorful model for the regulation and 1175–1183. evolution of biochemical pathways. Trends Plant Chin H-S, Wu Y-P, Hour A-L, Hong C-Y, Lin Y-R Sci 10: 236–242. (2016) Genetic and Evolutionary Analysis of Martin C, Paz-Ares J (1997) MYB transcription factors Purple Leaf Sheath in Rice. Rice 9: 8. doi: in plants. Trends Genet 13: 67–73. 10.1186/s12284-016-0080-y. Rahman MM, Lee KE, Kang SG (2015) Studies on the Choudhury BI, Khan ML., Dayanandan S (2014) effects of pericarp pigmentation on grain Patterns of nucleotide diversity and phenotypes of development and yield of black rice. Indian J. Genet two domestication related genes (OsC1 and Wx) in 75: 426–433. indigenous rice varieties in Northeast India. BMC Reddy VS, Goud KV, Sharma R, Reddy AR (1994) Genetics 15: 71. doi: 10.1186/1471-2156-15-71. Ultraviolet-B-responsive anthocyanin production Cossins E, Lee R, Packer L (1998) ESR studies of in a rice cultivar is associated with a specific phase vitamin C regeneration, order of reactivity of of phenylalanine ammonia lyase biosynthesis. Plant natural source phytochemical preparations. IUBMB Physiol 105: 1059–1066. Life 45: 583–597. Saitoh K, Onishi K, Mikami I, Thidar K, Sano Y (2004) Furukawa T, Maekawa M, Oki T, Suda I, Iida S, Allelic diversification at the C (OsC1) locus of wild Shimada H, Kadowaki K (2007) The Rc and Rd and cultivated rice. Genetics 168: 997–1007. genes are involved in proanthocyanidin synthesis in Sakamoto W, Ohmori T, Kageyama K, Miyazaki C, rice pericarp. Plant J 49: 91–102. Saito A, Murata M, Maekawa M (2001) The Purple Geekiyanage H, Jicha GA, Nelson PT, Chan C. (2012) leaf (Pl) locus of rice: The Plw allele has a complex Blood serum miRNA: non-invasive biomarkers for organization and includes two genes encoding basic Alzheimer's disease. Exp Neurol 235: 491–496. helix-loop-helix proteins involved in anthocyanin Hu J, Anderson B, Wessler SR (1996) Isolation and biosynthesis. Plant Cell Physiol 42: 982–991. characterization of rice R genes: evidence for Sakulsingharoj C, Inta P, Sukkasem R, Pongjaroenkit distinct evolutionary paths in rice and maize. S, Chowpongpang S. Sangtong V (2014) Genetics 142: 1021–1031. Overexpression of OSB2 gene in transgenic rice up- Hwang S-K., Kim Y-M (2000) A simple and reliable regulated expression of structural genes in method for preparation of cross-contamination-free anthocyanin biosynthesis pathway. Thai J Genet 7: plant genomic DNA for PCR-based detection of 173–182. transgenes. J Biochem Mol Biol 33: 537–546. Sakulsingharoj C, Inta P, Sukkasem R, Pongjaroenkit Inta P, Phongburaphat W, Pongjareankit S, S, Chowpongpang S, Sangtong V (2016) Cloning Chowpongpang S, Sangtong V, Sakulsingharoj C and characterization of OSB1 gene controlling (2013) Cloning and Characterization of OSB2 Gene anthocyanin biosynthesis from Thai black rice. Controlling Anthocyanin Biosynthesis in Rice. Genomics Genet 9: 7–18. Thai J. Genet 6: 25–29. Shi J, Yu J, Pohorly JE, Kakuda Y (2003) Ithal N, Reddy AR (2004) Rice flavonoid pathway Polyphenolics in grape seeds—biochemistry and genes, OsDfr and OsAns, are induced by functionality. J Med Food 6: 291–299. dehydration, high salt and ABA, and contain stress Shih CH, Chu H, Tang LK, Sakamoto W, Maekawa M, responsive promoter elements that interact with the Chu IK, Lo C (2008) Functional characterization of transcription activator, OsC1-MYB. Plant Sci 166: key structural genes in rice flavonoid biosynthesis. 1505–1513. Planta 228: 1043–1054. Jiamyangyuen S, Nuengchamnong N, Ngamdee P Sweeney MT, Thomson MJ, Pfeil BE, McCouch S (2017) Bioactivity and chemical components of (2006) Caught red-handed: Rc encodes a basic Thai rice in five stages of grain development. J helix-loop-helix protein conditioning red pericarp Cereal Sci: 74 136–144. in rice. Plant Cell 18: 283–294.

-8- การประชุมวิชาการ พันธุศาสตรแหงชาติ ครั้งที่ 20 “พันธุศาสตรบูรณาการ : จากการคนพบสูนวัตกรรม ”

%&0*-,&+($(,(0*'/(#-,)(.(,'((!1 "( %$#!1 " “Integrative Genetics: from Discovery to Innovation”

15-17 มิถุนายน 2560 โรงแรมโนโวเทล กรุงเทพฯ สุขุมวิท 20 http://ngc2017.sc.chula.ac.th

กำหนดการ การประชุมวิชาการพันธุศาสตรแหงชาติ ครั้งที่ 20 National Genetics Conference 2017 (NGC2017) “พันธุศาสตรบูรณาการ : จากการคนพบสูนวัตกรรม ” Integrative Genetics: From Discovery to Innovation

วันพฤหัสบดีที่ 15 มิถุนายน 2560 เวลา หองเบญจสิริ บอลรูม ชั้น 5 8.00-9.00 ลงทะเบียน 9.00-9.45 พิธีเปดการประชุม กลาวรายงาน โดย ศ.ดร . เพทาย เย็นจิตโสมนัส นายกสมาคมพันธุศาสตรแหงประเทศไทย กลาวเปดการประชุม โดย ฯพณฯ อำพล เสนาณรงค อดีตประธานที่ปรึกษาสมาคมพันธุศาสตรแหงประเทศไทย กลาวตอนรับ โดย ศ. นพ . เกียรติ รักษรุงธรรม รองอธิการบดีจุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย พิธีมอบโลเชิดชูเกียรติจากสมาคมพันธุศาสตรในฐานะผูทำคุณประโยชนใหแกวงวิชาการพันธุศาสตร และสมาคมพันธุศาสตรแหงประเทศไทย พิธีมอบของที่ระลึกสำหรับผูมีอุปการคุณในการจัดการประชุมฯ ถายภาพหมู 9.45-10.25 The NIH undiagnosed diseases program and network: diagnoses and discoveries Prof. William A. Gahl (NIH, USA) 10.25-10.40 พักรับประทานอาหารวาง 10.40-11.20 Functional discovery through genome manipulation Prof. Luca Comai (University of California, Davis, USA) 11.20-12.00 Natural non-antibiotic antibacterials for food safety and medicine Prof. Yuri Gleba (Nomad Bioscience Gmbh) 12.00-13.00 พักรับประทานอาหารกลางวัน หองอาหาร Food Exchange ชั้น 7 13.00-14.30 เสวนา Genetics and ethics toward Thailand 4.0 : พันธุศาสตรกับจริยธรรมในยุคประเทศไทย 4.0 - รศ .ดร . เจษฎา เดนดวงบริพันธ (คณะวิทยาศาสตร จุฬาลงกรณมหาวิทยาลัย ) - รศ .พญ . ทิพาพร ธาระวานิช (คณะแพทยศาสตร มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร) - ดร . ภัทรวีร สรอยสังวาลย ( ผูอำนวยการสำนักมาตรฐานหองปฏิบัติการ ) - ดร . ศิษเฎศ ทองสิมา (ศูนยพันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแหงชาติ)

ii วันพฤหัสบดีที่ 15 มิถุนายน 2560 เวลา หองเบญจสิริ บอลรูม ชั้น 5 14.30-14.45 พักรับประทานอาหารวาง 14.45-15.30 Integrative genetics: from cancer genetics to cellular immunotherapy ศ.ดร . เพทาย เย็นจิตโสมนัส (คณะแพทยศาสตร ศิริราชพยาบาล ) 15.30-16.00 Poster talk PT-HM01 นิภาพร ดีใจ High-resolution melting analysis of Solute Carrier Family 4 Member 1 ( SLC4A1 ) mutations in children with distal renal tubular acidosis PT-HM02 ชูชัย เนตรธุวกุล Mutation of PDZ Binding Kinase ( PBK ) in a Thai family with kidney stone disease PT-HM03 ภุมรินทร ทิพประมวล Investigation of the TEK germline mutation in a Thai patient with suspected multiple cutaneous and mucosal venous malformations (VMCM): preliminary results PT-HM04 สุชาดา สมมะลวน MLPA Technique for detected common genetic alterations in multiple myeloma patients PT-HM05 นิวัฒน ศักดิ์สิทธิ์ Comparison between the HLA-B*58:01 allele and the rs9267326 single nucleotide polymorphism as markers for prediction of allopurinolinduced severe cutaneous adverse reactions in a Thai population PT-AB01 พัฒนา ศรีฟา ฮุนเนอร Catalase gene, an oxidative stress-related gene, in rice response to arsenic exposure PT-AB02 จุฑารัตน ปญจขันธ Rice genome comparison of chromosome substitution line and characterization of drought tolerant gene in Arabidopsis model PT-AB03 รัชตา โชควิวัฒนกุล Identification of genes involving in salt tolerance using GWAS data based on Na + content in local Thai rice leaves PT-AB04 ธีรพร จิรธรรมคุณ QTL mapping of powdery mildew resistant gene in bitter gourd PT-AB05 สิริกร คุมแวน Genetic differentiation between Quercus rubra provenances at gene-based and non-genic microsatellite markers 16.00-16.15 พัก 16.15-17.45 ประชุมใหญสามัญประจำป 2560 ของสมาคมพันธุศาสตรแหงประเทศไทย 18.30-21.00 งานเลี้ยงรับรอง การบรรยายเรื่อง TALENT MOBILITY โดย รศ .ดร . ธิติ บวรรัตนารักษ (สำนักงานคณะกรรมการนโยบายวิทยาศาสตร เทคโนโลยีและนวัตกรรมแหงชาติ)

iii วันศุกรที่ 16 มิถุนายน 2560 เบญจสิริ บอลรูม 1 ขั้น 5 เบญจสิริ บอลรูม 2-3 ชั้น 5 เวลา Human and medical research Agricultural and biotechnology research บรรยายโดยวิทยากรรับเชิญ 8.30-9.00 Clinical exome: technologies, Omic science for abiotic stress tolerant gene applications and implications identification and mechanism studies (ศ.นพ .วรศักดิ์ โชติเลอศักดิ์) (รศ .ดร .ศุภจิตรา ชัชวาลย) 9.00-9.30 Epigenomic roles of repetitive Thirteen years of RD-Maejo 2 rice variety from sequences in cancer: possible novel molecular breeding to Thai farmers targeting therapy and screening (ผศ .ดร .วราภรณ แสงทอง ) (ศ.นพ .ดร .อภิวัฒน มุทิรางกูร ) 9.30-10.00 Implications of exome to patients with Using genome SNPs for genetic improvement neurological disorders of cattle (ผศ .นพ .ทายาท ดีสุดจิต ) (ผศ .ดร .ศกร คุณวุฒิฤทธิรณ ) 10.00-10.30 Inherited retinal diseases: what’s on the Linking genotype to phenotype through horizon modeling of the cellular regulation: an (ศ.พญ .ละอองศรี อัชชนียะสกุล ) application in cassava starch biosynthesis (ผศ .ดร .ตรีนุช สายทอง ) 10.30-12.00 พักรับประทานอาหารวาง การนำเสนอแบบโปสเตอร หองเอกมัย ทองหลอ ชั้น - 8 12.00-13.00 พักรับประทานอาหารกลางวัน หองอาหาร Food Exchange ชั้น 7 การนำเสนอแบบปากเปลา เบญจสิริ บอลรูม 1 ขั้น 5 เบญจสิริ บอลรูม 2-3 ชั้น 5 Human and medical research Agricultural and biotechnology research ประธาน ดร .วรรณา ทองนพคุณ ประธาน รศ .ดร .สุภาวดี พุมพวง กรรมการ ดร .ศิษเฎศ ทองสิมา กรรมการ รศ .ดร .ธีระชัย ธนานันต ดร.ภัทรา ยี่ทอง ผศ.เตือนใจ โกสกุล 13.00-13.15 O-HM1 ปติชัย พรสรายุทธ O-AB1 ชัยวรกุล ไชยปญญา Analysis of chromosome abnormalities Dissection of broad-spectrum resistance of the in multiple myeloma patients using Thai rice variety Jao Hom Nin conferred by two karyotyping, fluorescence in situ resistance genes against rice blast hybridization, and array comparative genomic hybridization 13.15-13.30 O-HM2 ศรินทิพ สุกใส O-AB2 อธิภัทร เงินหมื่น Cytotoxicity of cecropin A and B against Screening of BILs introgressed the rice blast lung cancer, ChoGo-K1 resistant QTLs from Jao Hom Nin (JHN) rice variety by InDel and SSR markers 13.30-13.45 O-HM3 วรากร บูชาชาติ O-AB3 ธรรมพร โคจรนา Russell-Silver Syndrome with uniparental Genome-wide association study for root disomy : 7 a case report biomass under salt stress at seedling stage in local Thai rice varieties 13.45-14.00 O-HM4 เบญญานันทน พิมพกรรณ O-AB4 ลลิตา ณ ราชสีมา Novel mutations of TBX 5 gene in Thai Expression analysis and nucleotide variation patients with Holt-Oram syndrome of OsC1 gene associated with anthocyanin pigmentation in rice

iv วันศุกรที่ 16 มิถุนายน 2560 เบญจสิริ บอลรูม 1 ขั้น 5 เบญจสิริ บอลรูม 2-3 ชั้น 5 เวลา Human and medical research Agricultural and biotechnology research 14.00-14.15 O-HM5 ลลิตา ลำกูล O-AB5 พลสิทธิ์ สถาผลเดชา Diversity of gene encoding Apical Molecular characterization and functional Membrane Antigen-1 of the human study of leucine-tyrosine motif containing malaria parasite, Plasmodium protein 5 (LYRM5) in female banana shrimp falciparum, in Thailand 14.15-14.30 O-HM6 ชวิญญา ตระกูลสุนทร O-AB6 อนุภาพ ประชุมวัด Novel amino acid unit and arrangement A genomic and transcriptomic aspect of the in glutamate-rich protein gene of the emerging shrimp pathogen Enterocytozoon human malaria parasite Plasmodium hepatopenaei falciparum in Thailand 14.30-14.45 O-HM7 วรนิษฐา ไชยนา O-AB7 ปฐมฤกษ อิงสันเทียะ Effects of intracellular iron accumulation Evolution of chemosensory related genes in and tumor necrosis factor-! on functions the common ancestor of hexapods: a of astrocytes transition from aquatic to terrestrial life 14.45-15.00 พักรับประทานอาหารวาง บรรยายโดยวิทยากรรับเชิญ 15.00-15.30 Current genetic diagnosis for autism Advantages and challenges of genosensor in (รศ .นพ .ดร .พรพรต ลิ้มประเสริฐ ) genetics: the experience at a glance (ผศ .ดร .ปยะศักดิ์ ชอุมพฤกษ) 15.30-16.00 Pre-implantation genetic diagnosis: state Development of rapid diagnostic flow strip of the art tests for detection of biological markers (รศ .นพ .ดร .วีรวิทย ปยะมงคล ) (รศ .ดร .โกสุม จันทรศิริ) 16.00-16.30 Genetic history of Thai people From actinomycete genome to novel drug (ผศ .ดร .วิภู กุตะนันท) discovery (รศ .ดร .อรินทิพย ธรรมชัยพิเนต ) 16.30-17.00 พิธีมอบรางวัล และปดการประชุม

วันเสารที่ 1 มิถุนายน 7 2560 เวลา กิจกรรม 8.30-12.00 Excursion: museum tour : Chulalongkorn University museum and Museum of Human Body

v Table of Contents ! กำหนดการ ii คำกลาวรายงาน vi คำกลาวเปด vii คำกลาวตอนรับ viii คำประกาศเกียรติคุณผูไดรับโลเชิดชูเกียรติ ix Table of Contents xiii

Invited Speaker Abstracts The NIH Undiagnosed Diseases Program and Network: Diagnoses and Discoveries 2 William A. Gahl Functional discovery through genome manipulation 3 Luca Comai Natural non-antibiotic antibacterials for food safety and medicine 4 Yuri Gleba Integrative Genetics: From Cancer Genetics to Cellular Immunotherapy 5 Pa-thai Yenchitsomanus Clinical Exome: Technologies, Applications and Implications 7 Vorasuk Shotelersuk Epigenetic editing human repetitive sequences: Novel models for cancer treatment 10 Apiwat Mutirangura Whole Exome Sequencing in Intractable Pediatrics Epileptic Patients: King Chulalongkorn Memorial Hospital Experiences 11 Tayard Desudchit, Chupong Ittiwut, Ponghatai Damrongphol, Kanya Suphapeetiporn and Vorasuk Shotelersuk Current Genetic Diagnosis for Autism 12 Pornprot Limprasert Pre-Implantation Genetic Diagnosis: State of the Art 13 Wirawit Piyamongkol Genetic history of Thai people 16 Wibhu Kutanan, Jatupol Kampuansai, Metawee Srikummool, Daoroong Kangwanpong, Silvia Ghirotto, Andrea Brunelli and Mark Stoneking Omic science for abiotic stress tolerant gene identification and mechanism studies 17 Supachitra Chadchawan Thirteen Years of RD-Maejo 2 Rice Variety from Molecular Breeding to Thai Farmers 18 Varaporn Sangtong Using genomic SNP for genetic improvement of cattle 20 Skorn Koonawootrittriron Linking genotype to phenotype through modeling of the cellular regulation: an application in cassava starch biosynthesis 23 Treenut Saithong

xiii Advantages and Challenges of Genosensor in Genetics: the Experiences at a Glance 24 Piyasak Chaumpluk Development of rapid diagnostic flow strip tests (SMART Dx) for detection of biological markers 25 Kosum Chansiri, Supatra Areekit, Thayat Sriyapai, Pichapak Sriyapai, Thongchai Kaewphinit, Tunyawat Somjaitaweeporn, Nareerat Viseshakul and Somchai Santiwatanakul From actinomycete genome to novel drug discovery 27 Arinthip Thamchaipenet

Agricultural and Biotechnology Research DNA-based identification of the lichen-forming genus Pertusaria (Pertusariales, Ascomycota) in the mangrove ecosystem of eastern Thailand 30 Achariya Rangsiruji, Mattika Sodamuk, Kawinnat Buaruang, Kansri Boonpragob, Pachara Mongkolsuk, Sutheewan Binchai and Sittiporn Parnmen Investigation of SNPs of SSII a gene and resistant starch content in forty Thai rice cultivars 37 Nittaya Laosat, Rungarun Sasanatayart, Kongkiat Kespechara and Siam Popluechai The expression of LRR gene in response to mechanical wounding in Jatropha leaves 44 Lucsame Gruneck, Anuphurb Seesangboon, and Siam Popluechai The potential florigen-encoding genes in oil palm 52 Sukhuman Whankaew, Li Xu and Amornrat Phongdara Evaluation of a Prevention Activity on DNA Damage of Highland Black Rice Extracts 61 Methi Wathikthinnakon, Jatupol Kampuansai, Pathrapol Lithanatudom and Suraphon Chaiwongsar Identification of litchi cultivars ( Litchi chinensis Sonn.) in germplasm field of Maejo University using ISSR markers 68 Sirima Suwarat, Winai Wiriya-Alongkorn, Junpen Sara, Saran Cheenacharoen and Yuppayao Kophimai Interspecific hybrid detection of Siam tulip and its relatives using chromosome counting 76 Sathaporn Sukjit, Chalermsri Nonthasawatsri and Naruemon Khemkladngoen An in silico mining pipeline for long non-coding RNAs in shrimp transcriptomes with WSSV infection 82 Kanyanat Kasetsuntorn, Anuphap Prachumwat, Patompon Wongtrakoongate, Kallaya Sritunyalucksana-Dangtip and Ornchuma Itsathitphaisarn Entity-relationship model and database design for contents in research articles involved with anti-inflammatory effects of active ingredients 96 Jarinee Kongtrub and Pitak Sootanan Dissection of broad-spectrum resistance of the Thai rice variety Jao Hom Nin conferred by two resistance genes against rice blast 104 Chaivarakun Chaipanya, Bo Zhou and Chatchawan Jantasuriyarat Screening of BILs introgressed the rice blast resistant QTLs from Jao Hom Nin (JHN) rice variety by InDel and SSR markers 105 Athipat Ngernmuen and Chatchawan Jantasuriyarat Genome-wide association study for root biomass under salt stress at seedling stage in local Thai rice varieties 106 Thammaporn Kojonna, Nopphakhun Khunpolwattana, Teerapong Buaboocha, Monnat Pongpanich, Duangjai Suriya-aroonroj and Supachitra Chadchawan

xiv Molecular characterization and functional study of leucine-tyrosine-motif containing protein 5 (LYRM5) in female banana shrimp 107 Ponsit Sathapondecha and Wilaiwan Chotigeat A genomic and transcriptomic aspect of the emerging shrimp pathogen Enterocytozoon hepatopenaei 108 Anuphap Prachumwat, Dominic W. Boakye, Bryony A. P. Williams, Grant D. Stentiford, Pattana Jaroenlak, Ornchuma Itsathitphaisarn, Timothy W. Flegel and Kallaya Sritunyalucksana Evolution of chemosensory related genes in the common ancestor of hexapods: a transition from aquatic to terrestrial life 109 Patamarerk Engsontia Catalase gene, an oxidative stress-related gene, in rice response to arsenic exposure 110 Pattana Srifah Huehne, Kisana Bhinija, Skorn Mongkolsuk, Nuchanart Rangkadilok, Sumontha Nookabkaew and Jutamaad Satayavivad Rice genome comparison of chromosome substitution line and characterization of drought tolerant gene in Arabidopsis mode 111 Chutarat Punchkhon, Jonaliza Seingliw, Teerayut Toojinda and Supachittra Chadchawan QTL mapping of powdery mildew resistant gene in bitter gourd 112 Theeraporn Jiratammakun, Venus Salutan, Eliot Cline and Darush Struss Genetic differentiation between Quercus rubra Provenances at gene-based and non-genic microsatellite markers 113 Sirikorn Khumwan and Oliver Gailing Over-expression of OsCam1-1 in KDML105 rice confers salt tolerance by enhancing key enzymes in glyoxylate cycle under salt stress 114 Worawat Yuenyong, Luca Comai, Supachitra Chadchawan and Teerapong Buaboocha Expression analysis of OsVTC1 genes in ascorbic acid biosynthesis pathway during rice and rice blast fungus interaction 115 Kanyanat Loedkunchotiphat, Mantira Suksirt and Chatchawan Jantasuriyarat Loss of function in rice blast resistance of Jao Hom Nin rice variety 116 Kasirapat Ariya-anandech, Chaivarakun Chaipanya, Bo Zhou and Chatchawan Jantasuriyarat Identification and cultivation of duckweeds collected from Burapha University, Chonburi Province, Thailand 117 Aornpilin Jaiprasert and Salil Chanroj Genetic relationship assessment and identification of strap-leaf Paphiopedilum using HAT-RAPD markers 118 Pornprapa Siriteptawee, Somchit Damrianant, Theerachai Thanananta and Narumol Thanananta Molecular identification of rice Odonata in the central plain of Thailand by DNA barcoding 119 Jiraporn Ruangsittichai, Suchada Sumruayphol and Apisit Thipaksorn Phylogenetic relationships of lichen-forming fungi genus Pyrenula (Pyrenulales, Ascomycota) in Thailand 120 Theerapat Luangsuphabool, Jittra Piapukiew and Ek Sangvichien Genetic relationship among Paphiopedilum subgenus Brachypetalum section Brachypetalum using HAT-RAPD Markers 121 Teepaka Meesangiem, Somchit Damrianant, Theerachai Thanananta and Narumol Thanananta

xv Genetic relationship assessment and identification of orchids in the Genus Eria using HAT-RAPD markers 122 Jutamas Jiemjuejun, Somchit Damrianant, Theerachai Thanananta and Narumol Thanananta Identification and assessment of genetic relationship of Dendrobium section Callista using HAT-RAPD 123 Thitaporn Maneenet, Theerachai Thanananta and Narumol Thanananta Genetic variation of Siamese crocodile ( Crocodylus siamensis ) and saltwater crocodile (Crocodylus porosus ) in Thai captive crocodiles using microsatellite DNA markers 124 Sorravis Lapbenjakul, Watcharaporn Thapana, Panupon Twilprawat, Narongrit Muangmai, Thiti Kanchanaketu, Yosapong Temsiripong, Sasimanas Unajak, Kiattawee Choowongkomon, Surin Peyachoknagul and Kornson Srikulnath Environmental change influenced on speciation and karyotype evolution in Crocodylia infer from phylogenetic and historical data 125 Tulyawat Prasongmaneerut, Jirasak Wong-ekkabut , Surin Peyachoknagul and Kornsorn Srikulnath Analysis of metabolic bone disease responsible genes in Siamese crocodile (Crocodylus siamensis) 126 Prapatsorn Areesirisuk, Aorarat Suntronpong, Worapong Singchat, Tanawut Srisuk, Narongrit Muangmai, Sasimanas Unajak, Yosapong Temsiripong, Surin Peyachoknagul, Chinae Thammarongtham, Seyoung Mun, Kyudong Han and Kornsorn Srikulnath An identification of female sexual specific by CTNNB1 gametologous gene marker in snake 127 Tassika Koomgun, Nararat Laopichienpong, Panupong Tawichasri, Narongrit Muangmai, Lawan Chanhome, Sunutcha Suntrarachun, Surin, Peyachoknagul and Kornsorn Srikulnath Evolutionary of snake gametologous gene on Z and W chromosome of Henophidian and Caenopidian snakes 128 Nararat Laopichienpong, Narongrit Muangmai, Lawan Chanhome, Sunutcha Suntrarachun, Panupon Twilprawat, Surin Peyachoknagul and Kornsorn Srikulnath The distribution of BovB LINE nLTR retrotransposon in snakes 129 Weerada Puinongpo, Narongrit Muangmai, Lawan Chanhome, Surin Peyachoknagul and Kornsorn Srikulnath Characterization and molecular cloning of repeated DNA elements in the genome of snakes 130 Ratchaphol Thongchum, Nararat Laopichienpong, Panupon Twilprawat, Weerada Puinongpo, Tassika Koomgun, Surin Peyachoknagul, Lawan Chanhome and Kornsorn Srikulnath Identification of heat shock proteins from collembola, Folsomia candida , transcriptome 131 Chutimon Tang-iad and Patamarerk Engsontia VSAREP satellite DNA family related to chromosomal rearrangements in monitor lizards 132 Ornjira Prakhongcheep, Kampee Pattanatanang, Rattanin Phatcharakullawarawat, Surin Peyachoknagul, Kazumi Matsubara, Tariq Ezaz and Kornsorn Srikulnath Complete mitochondrial genome of three curve-toed gecko using control region to identified Cyrtodactylus species 133 Prapatsorn Areesirisuk, Narongrit Muangmai, Kirati Kunya, Sudarath Baicharoen, Surin Peyachoknagul, Budsaba Rerkamnuaychoke and Kornsorn Srikulnath Characterization of a novel family of centromeric repetitive DNA sequences isolated from Asian swamp eel ( Monopterus albus ) 134 Aorarat Suntronpong, Ornjira Prakhongcheep, Narongrit Muangmai, Suthasinee Somyong, Surin Peyachokanagul, Kyudong Han and Kornsorn Srikulnath

xvi Isolation of new repetitive DNA sequence family from Varanus acanthurus 135 Kornsuang Jangtarwan, Ornjira Prakhongcheep, Aorarat Suntronpong, Narongrit Muangmai, Suthasinee Somyong, Surin Peyachoknagul, Kyudong Han, Tariq Ezaz and Kornsorn Srikulnath Optimal condition for studying metaphase karyotype of medically-importantblow fly, Achoetandrusrufifacies (Diptera: Calliphoridae), by using solution of dried Gloriosa superba Linn seed powder 136 Wannacha Nakhonkam, Supapan Ekurapan, Atiporn Saeung, Damrongpan Thongwat and Nophawan Bunchu Partial mitochondrial genome sequence of the Betta siamorientalis 137 (Osphronemidae) Jatupong Ponjarat, Ornjira Prakhongcheep, Narongrit Muangmai, Surin Peyachoknagul and Kornsorn Srikulnath Pattern of genetic diversity of mitochondrial D-loop multi hybrid cattle between genus Bos taurus and Bos indicus in Thailand 138 Attachai Kantachumpoo, Danai Jattawa, Prapatsorn Areesirisuk, Narongrit Muangmai, Surin Peyachoknagul, Thanathip Suwanasopee, Skorn Koonawootrittriron and Kornsorn Srikulnath Mitochondrial genome of Himantura chaophraya (Chondrichthyes: Dasyatidae) 139 Panupong Tawichasri, Narongrit Muangmai, Sahabhop Dokkaew, Weerakit Joerakate, Surin Peyachoknagul and Kornsorn Srikulnath Inhibitory effects of Tiliacora triandra (Colebr.) Diels and Pandanus amaryllifolius Roxb crude extracts on activities of alpha-amylase, lipase and trypsin 140 Adchara Sangchan and Salil Chanroj ACC deaminase producing endophytic Streptomyces enhances salt tolerance of rice plants 141 Ratchaniwan Jaemsaeng, Chatchawan Jantasuriyarat and Arinthip Thamchaipenet Isolation, structure elucidation and antimicrobial activity of new dimer of oxazolomycin A from “ Streptomyces subflavus subsp. irumaensis ” AM-3603 142 Wilaiwan Koomsiri, Yuki Inahashi, Yoko Takahashi, Kazuro Shiomi, Satoshi !mura, Takuji Nakashima and Arinthip Thamchaipenet Using V5 region in 18S rRNA gene for identification of biocatalyst secreting fungi associated with native termite in Southern of Thailand 143 Pimprapa Chaijak, Monthon Lertworapreecha, Supachai Nitipan and Chontisa Sukkasem

Human and Medical Research Effects of intracellular iron accumulation and tumor necrosis factor-! on functions of astrocytes 145 ! Woranittha Chaiyana, Chalisa Louicharoen Cheepsunthorn and Poonlarp Cheepsunthorn ! Investigation of the TEK germline mutation in a Thai patient with suspected multiple cutaneous and mucosal venous malformations (VMCM): preliminary results 154 ! Pummarin Tippramuan, Benjaporn Panichareon, Wanna Thongnoppakhun, Thawornchai Limjindaporn, Ekkapong Roothumnong, Chanin Limwongse and Manop Pithukpakorn ! Disruption of the E2 gene of HPV-16 is not associated with high-grade cervical dysplasia in Thai population 166 ! Ukrit Thongphoom, Suthat Sangchuwong, Yong Poovorawan and Sunchai Payungporn ! Association of CYP3A4*1G polymorphism and lipid-lowering efficacy of simvastatin therapy in type 2 diabetes patients at Thasala Hospital, Nakhon Si Thammarat, Thailand 173 ! Narissara Kaewboonlert, Witsawat Thitisopee, Sureerut Porntadavity and Nutjaree Jeenduang !

xvii Association between VDR Taq I polymorphism and serum 25-hydroxyvitamin D levels and obesity in Southern Thai population 183 ! Boonnisa Sangkaew, Manit Nuinoon, Chutima Jantarat, Thunyalak Plyduang, Dararut Horpet and Nutjaree Jeenduang ! Unbalanced chromosome translocation detected by next-generation sequencing based on low- pass genome coverage 194 ! Tantip A, Wimonrat T, Jintana R, Sunisa P, Siriporn B and Verayuth P ! Decreasing of Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Activity inhibits proliferation and migration of Non-Small-Cell Lung Cancer 198 ! Pornchai Anuntasomboon, Poonlarp Cheepsunthorn and Chalisa Louicharoen Cheepsunthorn ! Effect of butyrate on colorectal cancer stem cells surface marker genes expression analysis by qRT-PCR 209 ! Tittinat Pokawattana, Anupharb Seesangboon, Metawee Srikummool, Damratsamon Surangkul, Kongkiat Kespechara, Art Hiranyakas and Siam Popluechai ! Prognostic role of circulating miR -122 in patients with hepatocellular carcinoma treated with transarterial chemoembolization 217 ! Piyawan Chailapakul, Natthaya Chuaypen, Nutcha Pinjaroen, Sunchai Payungporn and Pisit Tangkijvanich ! Correlation between concentration of butyrate producing genes and butyrate in fecal samples using different extraction methods 225 ! Vasana Jinatham, Niwed Kullawong and Siam Popluechai ! Analysis of chromosome abnormalities in multiple myeloma patients using karyotyping, fluorescence in situ hybridization, and array comparative genomic hybridization 234 Pitichai Phornsarayuth, Veerawat Korkiatsakul, Nisakorn Klinkularb, Teeraya Puavilai, Suporn Chuncharunee, Takol Chareonsirisuthigul and Budsaba Rerkamnuaychoke Cytotoxicity of cecropin A and B against lung cancer, ChoGo-K1 235 Songchan Puthong, Sirin Sarunyutanon, Preeraya Singkhaimuk, Sajee Noitang, Anumart Buakeaw, Kittinan Komolpis and Sarintip Sooksai Russell -Silver syndrome with uniparental disomy 7: a case report 236 Warakorn Buchachat, Veerawat korkiatsakul, Rachanee Parinayok, Jittima Shotivaranon, Duangrudee Wattanasirichaigoon, Takol Chareonsirisuthigul and Budsaba Rerkamnuaychoke Novel mutations of TBX5 gene in Thai patients with Holt-Oram syndrome 237 Benyanan Phimphakan, Piyobol Kornrat, Thawornchai Limjindaporn, Manop Pithukpakorn, Wanna Thongnoppakhun and Chairat Turbpaiboon Diversity of gene encoding Apical Membrane Antigen-1 of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum , in Thailand 238 Lalita Lumkul, Pongchai Harnyuttanakorn, Morakot Kaewthamasor and Sittiporn Pattaradilokrat Novel amino acid unit and arrangement in glutamate-rich protein gene of the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Thailand 239 Chawinya Trakoolsoontorn, Pongchai Harnyuttanakorn and Sittiporn Pattaradilokrat High-Resolution Melting Analysis of Solute Carrier Family 4 Member 1 (SLC4A1) Mutations in Children with Distal Renal Tubular Acidosis 240 Nipaporn Deejai, Suwannee Wisanuyotin, Choochai Nettuwakul, Sookkasem Khositseth, Nunghathai Sawasdee, Kiattichai Saetai, Pa-thai Yenchitsomanus and Nanyawan Rungroj Mutation of PDZ Binding Kinase (PBK ) in a Thai Family with Kidney Stone Disease 241

xviii Choochai Nettuwakul, Nanyawan Rungroj, Nunghathai Sawasdee, Oranud Praditsap, Suchai Sritippayawan, Wipada Chaowagul, Santi Rojsatapong and Pa-thai Yenchitsomanus MLPA technique for detected common genetic alterations in multiple myeloma patients 242 Suchada Sommaluan, Preyaporn Onsod, Pitichai Pornsarayuth, Budsaba Rerkamnuaychoke, Takol Chareonsirisuthigul, Suporn Chuncharunee, Teeraya Puavilai, Veerawat Korkiatsakul, Teerapong Siriboonpiputtana Comparison between the HLA-B*58:01 allele and the rs9267326 single nucleotide polymorphism as a marker for prediction of allopurinol-induced severe cutaneous adverse reactions in a Thai population 243 Niwat Saksit, Nontaya Nakkam, Parinya Konyoung, Sirimas Kanjanawart, Pansu Chumworathay, Alisara Sangviroon, Patcharee Kanjanawat, Wanida Maungmingsook, Supinya Phoomwanitchakit and Wichittra Tassaneeyakul Molecular detection of SF3B1 mutations involving in the initiation of myelodysplastic syndrome 244 Punchita Rujirachaivej, Sutada Magmuang, Budsaba Rerkamnuaychoke, Takol Chareonsirisuthigul, Suporn Chancharunee, Paisarn Boonsakan and Teerapong Siriboonpiputtana Study of microdeletions in the Y chromosome of infertile men seeking IVF treatment 245 Sivadatch Chooduang, Pawonrat Patipipat, Pornwaratt Niyomrattanakit The prevalence of HLA pharmacogenetic markers associated with adverse drug reactions in a Northeastern Thai population 246 Nontaya Nakkam, Wichittra Tassaneeyakul, Sirimas Kanjanawart and Wongwiwat Tassaneeyakul Mutation analysis of DAX-1 gene in Thai patients with X-linked Adrenal Hypoplasia Congenita (X-linked AHC) 247 Chanisara Suthiworachai, Rachaneekorn Tammachote, Taninee Sahakitrungruang and Vorasuk Shotelersuk DNAJC3 p.H238N as a causative variant for early-onset type 2 diabetes mellitus in Thais 248 Sirikul Kulanuwat, Watip Tangjittipokin, Prapaporn Jungtrakoon, Chutima Chanprasert, Jatuporn Sujjitjoon, Ninareeman Binnima, Pa-thai Yenchitsomanus and Nattachet Plengvidhya Novel metaphase karyotypes of Anopheles kochi (Diptera: Culicidae) in Thailand 249 Watchara Jatuwattana, Kritsana Taai, Kittipat Aupalee, Wichai Srisuka, Adulsak Wijit, Petchaboon Poolphol, Sorawat Thongsahuan and Atiporn Saeung Troubleshooting in paternity testing in a case of breast feeding 250 Jittima Shotivaranon, Watcharapa Jaranasaksakul, Tawat Rinthachai, Preyaporn Onsod, Napat Thanachokrungruang, Nittaya Limsuwannachot, Saran Poolsawat, Teerapong Siriboonpiputtana and Budsaba Rerkamnuaychoke Development of multiplex PCR for Y-Chromosome microdeletions for male infertility diagnosis 251 Pawonrat Patipipat, Sivadatch Chooduang and Pornwaratt Niyomrattanakit Automatic karyotyping application 252 Thanat Lapthawan and Pat Tientongdee Development of RNA-seq pipeline for CRC subtype classification 253 Tongta Sae-Ong, Peerada Prommeenate, Kanthida Kusonmano, Jittisak Senachak, Supapon Cheevadhanarak and Sawannee Sutheeworapong Application of Micro Array Technology in Molar Pregnancy 254 Wimonrat Taweesan, Tantip Arigul, Jintana Rattanasri, Sunisa Pongkam and Verayuth Praphanphoj

xix

List of Research Titles published in Genomics and Genetics Expression analysis and nucleotide variation of OsC1 gene associated with anthocyanin pigmentation in rice 256 Lalita Na Rachasima, Roypim Sukkasem, Saengtong Pongjaroenkit, Varaporn Sangtong, Srimek Chowpongpang and Chotipa Sakulsingharoj Identification of genes involving in salt tolerance using GWAS data based on Na + content in local Thai rice leaves 256 Ratchata Chokwiwatkul, Natthaya Tantipirom, Nopphakhun Khunpolwattana, Apichart Imyim, Duangjai Suriya-aroonroj, Teerapong Buaboocha, Monnat Pongpanich, Luca Comai and Supachitra Chadchawan Development of allele-specific SNP markers for PPR10 gene at Rf4 locus of Fertility Restorer Gene USING for IDENTIFICATION of MAINTAINER AND RESTORER lines 256 Saengtong Ponjaroenkit, Kanokwan Janpen, Chotipa Sakulsingharoj and Varaporn Sangtong Influence of single nucleotide polymorphisms in the BCL11A, HBS1L-MYB intergenic region, and HBB gene cluster on the fetal hemoglobin levels in Bangladeshi patients with "-thalassemia/hemoglobin E disease 257 Jenjira Chalerm, Mahmood Ahmed Chowdhury, Chayanon Peerapittayamongkol, Kittiphong Paiboonsukwong, Suthat Fucharoen and Orapan Sripichai

APPENDIX รายชื่อผูนำเสนอแบบโปสเตอร การประชุมวิชาการพันธุศาสตรแหงชาติ ครั้งที่ 20 259 ประกาศแตงตั้งคณะกรรมการจัดการประชุมวิชาการพันธุศาสตรแหงชาติ ครั้งที่ 20 264 รายชื่อผูทรงคุณวุฒิพิจารณาผลงานวิจัย การประชุมวิชาการพันธุศาสตรแหงชาติ ครั้งที่ 20 273 ขอขอบคุณผูสนับสนุน การประชุมวิชาการพันธุศาสตรแหงชาติ ครั้งที่ 20 276

P-AB17 Identification of litchi cultivars ( Litchi chinensis Sonn.) in germplasm field of Maejo University using ISSR markers Sirima Suwarat 1, Winai Wiriya-Alongkorn 2, Junpen Sara 3, Saran Cheenacharoen 4 and Yuppayao Kophimai 1* 1Department of Genetics, Faculty of science, Maejo University, 50290, Thailand 2Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Production, Maejo University, 50290, Thailand 3Division of Genetic improvement and Development of Plants and Animal, The Office of Agricultural Research and Extension, Maejo University, 50290, Thailand 4Department of Biology, Faculty of Science and Technology, Chiang Mai Rajabhat University, 50300, Thailand *Corresponding author: [email protected] ABSTRACT Identification of litchi cultivars is based mainly on morphology, which is influenced by environmental factors. Moreover, the same cultivar is named differently because of translation to another language. Identification using genetic markers is more realizable because of no environment influence. This study aimed to genetically identify 23 litchi cultivars in germplasm field of Maejo University using inter simple sequence repeat (ISSR) markers and to test reproducibility of the primers. Of seven primers used, all could successfully amplified DNA of all litchi cultivars when annealing temperature was 50 #C. Total number of scored bands was 47, average 6.71 bands/primer. However, ten DNA bands, including all DNA bands of primer 841, were not reproducible, and hence were excluded from the successive analyses. The results warn researcher to always check the reproducibility of markers even high annealing temperature is used. Six primers gave 4-9 reproducible bands/primer with 50-85.71 percent polymorphism. A phylogram generated by neighbor-joining algorithm based on Nei and Li genetic distance showed distinct two clusters; one cluster consisted of four cultivars; Jeen Daeng, Chorrakham, Kaloke Baimai and Khiaowwan. All the rest cultivars were grouped to another cluster. Most of the cultivars were separated from each other, except two pair of cultivars; Saraekthong and Samphaokhaeo, Honghuai and Samphaothong. These results indicate rather high efficiency of six ISSR primers for litchi identification. Keywords: DNA marker; genetic diversity; lychee

INTRODUCTION Litchi ( Litchi chinensis Sonn.), a member of the Sapindaceae family, is an important fruit tree in tropical and subtropical areas of the world . The litchi is native to southern China, northern Vietnam, and the Malay Peninsula, where it has been cultivated for centuries (Menzel and Simpson, 1986) . Litchi is an edible fruit and source of traditional medicine. As a traditional medicine, litchi fruit and its secondary metabolic products have been reported to have anticancer (Wang e t al., 2006; Hsu e t al., 2012 ), anti- inflammatory (Huang e t al., 2014 ) and antioxidant activities (Yang e t al., 2006 ). 68

Genotype discrimination in this species is generally based on the study of morphological traits (Menzel et al., 2005) . However, the tree phenotype is influenced by environmental factors and it is even more difficult to distinguish between closely related germplasm using only morphological characters. Therefore, litchi cultivar names must be standardized. In different locations, the same cultivar may have different names and different cultivars may have the same name because of their translation into English and other languages (Madhou et al., 2013). It is, therefore, important to know genetic diversity in litchi and standardize identification of the cultivars. This is required for germplasm management and accelerate breeding programs. So far, many attempts have been made to fingerprint and classify litchi cultivars using genetic data such as isozymes (Aradhya et al., 1995; Degani et al., 1995), DNA polymorphism using random amplified polymorphic DNA (RAPD; Anuntalabhochai et al., 2002; Tongpamnak et al., 2002; Kumar et al., 2010), simple sequence repeat (SSR; Viruel and Hormaza, 2004; Mingfang et al., 2006; Madhou et al., 2013;), inter simple sequence repeat (ISSR; Degani et al., 2003), and amplified fragment length polymorphism (AFLP; Tongpamnak et al., 2002; Ganjun et al., 2003). All markers showed polymorphism among litchi accessions but their discriminatory powers were different and hence number of primers used were differ, for example, seven AFLP primers gave the same identification result as 14 RAPD primers. ISSR markers were used widely in plant identification. Among litchi cultivars they showed high polymorphism (Degani et al., 2003). Polymorphisms occur whenever one genome lacks the repeated sequence or has a deletion or insertion that modifies the distance between repeat. In this study we used ISSR markers to identify litchi cultivars in the germplasm field of Maejo University and test reproducibility of the ISSR markers.

MATERAILS AND METHODS Plant materials and DNA extraction. Twenty three litchi cultivars as listed in Table 1 were collected from the litchi germplasm field Maejo University, Chaing Mai, Thailand. Total DNA was extracted from young leaves of each cultivar using the modified CTAB method (Doyle and Doyle, 1987) . The extraction buffer contained 2% (w/v) CTAB, 0.98 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 1% (w/v) PVP-40 and 0.5% (w/v) sodium metabisulfite. One percent (v/v) of !-mercaptoethanol was added to the extraction buffer just before use. DNA quality was checked by 1% agarose gel electrophoresis in 0.5X TBE buffer and DNA quantity was measured using a NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.). The final concentration of all DNA sample was adjusted to 10-20 ng/µl for PCR and stored at -20 #C. ISSR fingerprinting PCR was performed in 10 µl reaction volumes consisted of 10-20 ng of DNA template, 0.4 µM primer and 1X MyTaq HS Red mix (Bioline). Seven ISSR primers (Table 2 ) were used according to their

polymorphism among litchi cultivars (Degani et al ., 2003). The PCR condition was as follows: Initiation denaturation at 95 #C for 3 min, followed by 45 cycles of 15s at 95 #C, 15s at 50 #C, 45s at 72 # C, and final extension of 5 min at 72 #C. Amplification was performed in an T100™ Thermal Cycler (Bio-Rad). Amplification products were separated by electrophoresis on a 3% agarose gel in 0.5X TBE buffer. The size of amplification products were estimated using a GeneRuler 100 bp plus DNA Ladder (Thermo Scientific). DNA fragments were photographed using Molecular Imager Gel Doc TM XR+ with Image Lab TM Software (Bio-Rad). To test reproducibility of markers, PCR amplification and gel electrophoresis of each primer were repeated one time.

Table 1 List of litchi cultivars used in the current study. Number Cultivar 1 Kwangjao 2 Saraekthong 3 O-hia 4 Jeen Yai 5 Kaloke Bai-or 6 Kimjeng 7 Chakraphat 8 Chorrakham 9 Honghuai 10 Samphaothong 11 Thai 12 Krobkaeo 13 Samphaokhaeo 14 Nakhon Phanome 1 15 Brewster 16 Kaloke Baimai 17 Haeojeen 18 Khiaowwan 19 Kratone Thongphraronge 20 Khom 21 Kaloke Baiyao 22 Jeen Daeng 23 Komin

Data analysis All clear DNA bands were scored as 1 (present ) or 0 (absent ) but only data of reproducible DNA fragments (same presence or same absence in both gels) were used for further analyses. It is impossible to determine whether a band is homozygous or heterozygous. The genetic similarity matrix was calculated

among the examined 23 litchi cultivars based on Nei and Li (1979) genetic distance as implemented in the FreeTree software. The phylogram based on the genetic distances among the litchi cultivars was constructed using neighbor-joining algorithm with 2000 bootstrap replicates as implemented in the FreeTree software and figure was generated in TreeView software. Table 2 List of ISSR primers for litchi identification and DNA fragment produced by them. Primer Sequence Total no. of No. of No. of No. of %Polymorphism 5’-3’ scored reproducible useable polymorphic band band band band 807 )GA 8(T 6 6 6 4 66.67 822 )TC 8(A 5 4 4 3 75 826 )AC 8(C 8 6 6 3 50 841 )GA 8(YC 5 0 NA NA NA 849 )GT 8(TA 7 7 7 6 85.71 881 )GGGTG 3( 7 5 5 3 60 891 HVH)TG 7( 9 9 9 7 77.78 Total 47 37 37 26 415.16 Mean 6.71 5.29 6.17 4.33 69.19 Primer numbers follow those UBC set 9 )no. 801-900 ( Y=C, T; H=A, C, T; V=A, C, G; NA = not available

RESULTS AND DISCUSSION ISSR amplification All seven primers used successfully amplified DNA of the 23 litchi cultivars. Total numbers of scored bands ranged from 5-9 with average of 6.71 bands/primer. However, some DNA bands of three primers, 822 826 and 881, and all DNA bands of primer 841 were not reproducible (Table 2). These data indicate that even high annealing temperature as 50 ๐C is not enough for specific annealing and higher annealing temperature should be used for these primers. Researchers working with ISSR markers should aware of the reproducibility. Numbers of reproducible bands ranged from 0-9 with average of 5.29 bands/primer. Primer 841 was excluded from further analyses because of its unrepeatability. Another six reproducible primers gave 3-7 polymorphic bands, on average 4.33 bands/primer. Percent polymorphisms were 50-85.71, average 69.19 percent/primer. The data suggested high polymorphism and these primers are suitable for identification or detection genetic diversity of litchi. Representative banding patterns obtained with primer 891 are shown in Figure 1.

Figure 1 Inter simple sequence repeat (ISSR) banding pattern of 23 litchi cultivars generated by primer 891. The cultivars are numbered in the same order as in Table 1. M = DNA standard size markers, N=negative control. Genetic similarity and cultivar identification Genetic similarity indices between each cultivar pair were rather high, ranging from 0.72-1.00 (Table 3). A phylogram generated by neighbor-joining algorithm using Nei and Li genetic distance showed two main clusters (Figure 2). One cluster consisted of four cultivars; Jeen Daeng, Chorrakham, Kaloke Baimai and Khiaowwan. This result corresponded with the finding by Tongpamnak et al. (2002) who worked on 14 RAPD primers and resulted in close similarity between Jean Daeng and Chorrakham. Another cluster consisted of all the rest cultivars. Clustering to two groups is very statistical significance as is supported by 100 percent bootstrap value. We constructed phylogram with neighbor-joining algorithm because it is the best among the distance matrix method (Weir, 1996)

Figure 2 A phylogram of 23 litchi cultivars generated by neighbor-joining algorithm with 2000 bootstrap resamplings using Nei and Li genetic distance based on six ISSR primers.

Table 3 Genetic similarity indices between each pair of the 23 litchi cultivars based on six ISSR primers. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 2 0.90 3 0.98 0.88 4 0.87 0.89 0.85 4 0.87 0.89 0.85 0.89 6 0.83 0.81 0.81 0.81 0.85 7 0.85 0.82 0.82 0.86 0.94 0.91 8 0.86 0.87 0.84 0.84 0.8 0.79 0.81 9 0.86 0.8 0.84 0.8 0.8 0.79 0.81 0.79 10 0.86 0.8 0.84 0.8 0.8 0.79 0.81 0.79 1.00 11 0.88 0.9 0.86 0.90 0.94 0.86 0.88 0.81 0.81 0.81 12 0.89 0.87 0.87 0.98 0.91 0.83 0.88 0.81 0.81 0.81 0.9 13 0.91 1.00 0.89 0.89 0.89 0.81 0.82 0.87 0.8 0.8 0.91 0.87 14 0.95 0.89 0.93 0.93 0.86 0.78 0.83 0.84 0.89 0.88 0.87 0.91 0.89 15 0.84 0.78 0.81 0.72 0.78 0.77 0.82 0.8 0.87 0.87 0.75 0.79 0.78 0.82 16 0.84 0.89 0.85 0.85 0.85 0.77 0.82 0.87 0.76 0.76 0.82 0.83 0.89 0.82 0.74 17 0.84 0.81 0.81 0.81 0.85 0.72 0.82 0.84 0.76 0.76 0.78 0.79 0.81 0.86 0.78 0.78 18 0.83 0.88 0.81 0.88 0.89 0.84 0.86 0.87 0.76 0.75 0.9 0.86 0.88 0.81 0.77 0.88 0.77 19 0.91 0.89 0.89 0.81 0.93 0.85 0.90 0.87 0.8 0.8 0.9 0.83 0.89 0.86 0.78 0.85 0.81 0.85 20 0.91 0.88 0.88 0.88 0.92 0.84 0.85 0.79 0.76 0.75 0.94 0.9 0.88 0.85 0.73 0.81 0.81 0.88 0.88 21 0.86 0.95 0.84 0.90 0.87 0.75 0.81 0.86 0.82 0.82 0.88 0.89 0.95 0.91 0.8 0.84 0.84 0.83 0.84 0.83 22 0.87 0.89 0.85 0.93 0.85 0.81 0.86 0.91 0.87 0.87 0.86 0.91 0.89 0.93 0.81 0.89 0.81 0.88 0.85 0.81 0.90 23 0.89 0.83 0.87 0.79 0.83 0.82 0.84 0.81 0.93 0.93 0.8 0.81 0.83 0.87 0.83 0.79 0.79 0.78 0.83 0.78 0.80 0.80 The cultivars are numbered in the same order as in Table 1.

Interestingly, DNA data from six ISSR primers could distinguish among most of litchi cultivars. Only two pairs of litchi are genetically identical; Saraekthong and Samphaokhaeo, Honghuai and Samphaothong. However, morphology of Saraekthong and Samphaokhaeo differed in leaf characters (Sukviboon, 2015 ). Differences in morphology was also found between Honghuai and Samphaothong (personal observation). The genetic indistinguishability between litchi cultivars may attribute to the low numbers of primers used comparing to Degani et al . (2003) who used 32 ISSR primers to identify 66 litchi accessions. High number of primers can detect mutation in more regions and, therefore, may reveal more genetic dissimilarity between cultivars. Indeed, there are many molecular markers reported to be able to identify or study genetic diversity of litchi, for example, isozyme (Degani et al., 1995), RAPD (Anantalabhochai et al., 2002; Tongpamnak et al., 2002; Kumar et al., 2010), ISSR (Degani et al., 2003), AFLP (Ganjun et al., 2003) and SSR markers (Madhou et al., 2013) but we chose ISSR markers because of its high efficiency in identification of litchi cultivars, easiness to conduct and high reproducibility comparing to RAPD. Dominant markers such as RAPD and ISSR were found to detect hybrid of litchi cultivars (Degani et al., 2003; Chundet et al., 2007). Komin is a hybrid of Honghuai x Chakraphat. The three cultivars were separated from each other in the phylogram but Komin was more similar to Honghuai than to Chakrapat. This raises the possibility of hybrid investigation using DNA profile of the studied ISSR primers in the future.

ACKNOWLEDGEMENTS This study was supported by grants from the National Research Council of Thailand and grants from graduate school of Maejo University.

REFERENCES Anuntalabhochai R, Chundet R, Chiangda J, Apavatjrut P (2002) Genetic diversity within lychee based on RAPD analysis. Acta Hort 575:253–259. Aradhya, MK, Zee FT, and Manshardt RM (1995) Isozyme variation in lychee ( Litchi chinensis Sonn.). Sci Hort 63:21–35. Chundet R, Cutler RW, Tasanon M, Anuntalabhochai S (2007) Hybrid detection in lychee ( Litchi chinensis Sonn.) cultivars using HAT-RAPD markers. Sci Asia 33:307–311. Degani, C, Beiles A, El-Batsri R, Goren M, Gazit S (1995) Identifying lychee cultivars by isozyme analysis. J Amer Soc Hort Sci 120:307–312. Degani C, Deng J, Beiles A, El-Batsri R, Goren M, Gazit S (2003) Identifying lychee ( Litchi chinensis Sonn.) cultivars and their genetic relationships using inter simple sequence repeat (ISSR) markers. J Amer Soc Hort Sci 128(6): 838–845. Doyle JJ and Doyle JL (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19: 11–15. Ganjun Y, Heqiang H, Dacheng C, Ziran H, Changhd C, Yanping Q (2003) Studies on genetic relationship among litchi varieties by using AFLP. Acta Hort Sinica 30:399–403. Hsu CP, Lin CC, Huang CC, Lin YH, Chou JC, Tsia YT, Su JR, Chung YC (2012) Induction of apoptosis and cell cycle arrest in human colorectal carcinoma by Litchi seed extract. J Biomed Biotechnol 2012:341479. Huang F, Zhang R, Yi Y, Tang X, Zhang M, Su D, Deng Y, Wei Z (2014) Comparison of physicochemical properties and immune modulatory activity of polysaccharides from fresh and dried litchi pulp. Molecules 19:3909–3925. Kumar M, Gupta M, Shrivastava D, Prasad M, Prasad US, Sarin NB (2010) Genetic relatedness among Indian litchi accessions ( Litchi chinensis Sonn.) by RAPD markers. Intl J Agr Biol 5:805–815. Madhou M, Normand F, Bahorun T, Hormaza JI (2013) Fingerprinting and analysis of genetic diversity of litchi (Litchi chinensis Sonn.) accessions from different germplasm collections using microsatellite markers. Tree Genet Genomes 9:387–396. Menzel CM, Huang X, Liu C (2005) Cultivars and plant improvement. In: Menzel CM, Waite GK (eds) Litchi and longan: botany, production and uses. CAB International, Wallingford, UK, pp 59–86. Menzel CM, Simpson DR (1986) Description and performance of major lychee cultivars in subtropical Queensland. Qld Agric J 112:125–136. Mingfang L, Xueqing Z, Yongqiang Z, Xiangshe W, Suyu L, Lei L, Xingrong W (2006) Development and

characterization of SSR markers in lychee ( Litchi chinensis ). Mol Ecol Res 6:1205–1207. Nei M, Li WH (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci USA 76: 5269–5273. Sukviboon N (2015) Varietal development of litchi. Research report. Department of Agriculture, Thailand. Tongpamnak P, Patanatara A, Srinives P, Babprasert C (2002) Determination of genetic diversity and relationships among Thai litchi accessions by RAPD and AFLP markers. Kasetsart J Natural Sci 36:370– 380. Viruel MA, Hormaza JI (2004) Development, characterization and variability analysis of microsatellites in lychee ( Litchi chinensis Sonn., Sapindaceae). Theor Appl Genet 108:896–902. Wang X, Yuan S, Wang J, Lin P, Liu G, Lu Y, Zhang J, Wang W, Wei Y (2006) Anticancer activity of litchi fruit pericarp extract against human breast cancer in vitro and in vivo. Toxicol Appl Pharmacol 215:168– 178. Wier, BS (1996) Genetic data analysis II. Sinauer Assoc. Inc., Publ., Sunderland, Mass. Yang B, Wang J, Zhao M, Liu Y, Wang W, Jiang Y (2006) Identification of polysaccharides from pericarp tissues of litchi ( Litchi chinensis Sonn.) fruit in relation to their antioxidant activities. Carbohydr Res 341:634– 638.

การประชุมวิชาการ พันธุศาสตร์แห่งชาติ ครั้งที่ 20 “พันธุศาสตร์บูรณาการ: จากการค้นพบสู่นวัตกรรม”

National(Genetics(Conference(2017( NGC2017 “Integrative Genetics: from Discovery to Innovation”

15-17 มิถุนายน 2560 โรงแรมโนโวเทล กรุงเทพฯ สุขุมวิท 20 http://ngc2017.sc.chula.ac.th

กำหนดการ การประชุมวิชาการพันธุศาสตร์แห่งชาติ ครั้งที่ 20 National Genetics Conference 2017 (NGC2017) “พันธุศาสตร์บูรณาการ : จากการค้นพบสู่นวัตกรรม” Integrative Genetics: From Discovery to Innovation

วันพฤหัสบดีที่ 15 มิถุนายน 2560 เวลา ห้องเบญจสิริ บอลรูม ชั้น 5 8.00-9.00 ลงทะเบียน 9.00-9.45 พิธีเปิดการประชุม กล่าวรายงาน โดย ศ.ดร. เพทาย เย็นจิตโสมนัส นายกสมาคมพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย กล่าวเปิดการประชุม โดย ฯพณฯ อำพล เสนาณรงค์ อดีตประธานที่ปรึกษาสมาคมพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย กล่าวต้อนรับ โดย ศ. นพ. เกียรติ รักษ์รุ่งธรรม รองอธิการบดีจุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย พิธีมอบโล่เชิดชูเกียรติจากสมาคมพันธุศาสตร์ในฐานะผู้ทำคุณประโยชน์ให้แก่วงวิชาการพันธุศาสตร์ และสมาคมพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย พิธีมอบของที่ระลึกสำหรับผู้มีอุปการคุณในการจัดการประชุมฯ ถ่ายภาพหมู่ 9.45-10.25 The NIH undiagnosed diseases program and network: diagnoses and discoveries Prof. William A. Gahl (NIH, USA) 10.25-10.40 พักรับประทานอาหารว่าง 10.40-11.20 Functional discovery through genome manipulation Prof. Luca Comai (University of California, Davis, USA) 11.20-12.00 Natural non-antibiotic antibacterials for food safety and medicine Prof. Yuri Gleba (Nomad Bioscience Gmbh) 12.00-13.00 พักรับประทานอาหารกลางวัน ห้องอาหาร Food Exchange ชั้น 7 13.00-14.30 เสวนา Genetics and ethics toward Thailand 4.0 : พันธุศาสตร์กับจริยธรรมในยุคประเทศไทย 4.0 - รศ.ดร. เจษฎา เด่นดวงบริพันธ์ (คณะวิทยาศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย) - รศ.พญ. ทิพาพร ธาระวานิช (คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยธรรมศาสตร์) - ดร. ภัทรวีร์ สร้อยสังวาลย์ (ผู้อำนวยการสำนักมาตรฐานห้องปฏิบัติการ) - ดร. ศิษเฎศ ทองสิมา (ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ)

ii วันพฤหัสบดีที่ 15 มิถุนายน 2560 เวลา ห้องเบญจสิริ บอลรูม ชั้น 5 14.30-14.45 พักรับประทานอาหารว่าง 14.45-15.30 Integrative genetics: from cancer genetics to cellular immunotherapy ศ.ดร. เพทาย เย็นจิตโสมนัส (คณะแพทยศาสตร์ ศิริราชพยาบาล) 15.30-16.00 Poster talk PT-HM01 นิภาพร ดีใจ High-resolution melting analysis of Solute Carrier Family 4 Member 1 (SLC4A1) mutations in children with distal renal tubular acidosis PT-HM02 ชูชัย เนตรธุวกุล Mutation of PDZ Binding Kinase (PBK) in a Thai family with kidney stone disease PT-HM03 ภุมรินทร์ ทิพประมวล Investigation of the TEK germline mutation in a Thai patient with suspected multiple cutaneous and mucosal venous malformations (VMCM): preliminary results PT-HM04 สุชาดา สมมะลวน MLPA Technique for detected common genetic alterations in multiple myeloma patients PT-HM05 นิวัฒน์ ศักดิ์สิทธิ์ Comparison between the HLA-B*58:01 allele and the rs9267326 single nucleotide polymorphism as markers for prediction of allopurinolinduced severe cutaneous adverse reactions in a Thai population PT-AB01 พัฒนา ศรีฟ้า ฮุนเนอร์ Catalase gene, an oxidative stress-related gene, in rice response to arsenic exposure PT-AB02 จุฑารัตน์ ปัญจขันธ์ Rice genome comparison of chromosome substitution line and characterization of drought tolerant gene in Arabidopsis model PT-AB03 รัชตา โชควิวัฒน์กุล Identification of genes involving in salt tolerance using GWAS data based on Na+ content in local Thai rice leaves PT-AB04 ธีรพร จิรธรรมคุณ QTL mapping of powdery mildew resistant gene in bitter gourd PT-AB05 สิริกร คุ้มแว่น Genetic differentiation between Quercus rubra provenances at gene-based and non-genic microsatellite markers 16.00-16.15 พัก 16.15-17.45 ประชุมใหญ่สามัญประจำปี 2560 ของสมาคมพันธุศาสตร์แห่งประเทศไทย 18.30-21.00 งานเลี้ยงรับรอง การบรรยายเรื่อง TALENT MOBILITY โดย รศ.ดร. ธิติ บวรรัตนารักษ์ (สำนักงานคณะกรรมการนโยบายวิทยาศาสตร์ เทคโนโลยีและนวัตกรรมแห่งชาติ)

iii วันศุกร์ที่ 16 มิถุนายน 2560 เบญจสิริ บอลรูม 1 ขั้น 5 เบญจสิริ บอลรูม 2-3 ชั้น 5 เวลา Human and medical research Agricultural and biotechnology research บรรยายโดยวิทยากรรับเชิญ 8.30-9.00 Clinical exome: technologies, Omic science for abiotic stress tolerant gene applications and implications identification and mechanism studies (ศ.นพ.วรศักดิ์ โชติเลอศักดิ์) (รศ.ดร.ศุภจิตรา ชัชวาลย์) 9.00-9.30 Epigenomic roles of repetitive Thirteen years of RD-Maejo 2 rice variety from sequences in cancer: possible novel molecular breeding to Thai farmers targeting therapy and screening (ผศ.ดร.วราภรณ์ แสงทอง) (ศ.นพ.ดร.อภิวัฒน์ มุทิรางกูร) 9.30-10.00 Implications of exome to patients with Using genome SNPs for genetic improvement neurological disorders of cattle (ผศ.นพ.ทายาท ดีสุดจิต) (ผศ.ดร.ศกร คุณวุฒิฤทธิรณ) 10.00-10.30 Inherited retinal diseases: what’s on the Linking genotype to phenotype through horizon modeling of the cellular regulation: an (ศ.พญ.ละอองศรี อัชชนียะสกุล) application in cassava starch biosynthesis (ผศ.ดร.ตรีนุช สายทอง) 10.30-12.00 พักรับประทานอาหารว่าง การนำเสนอแบบโปสเตอร์ ห้องเอกมัย ทองหล่อ ชั้น-8 12.00-13.00 พักรับประทานอาหารกลางวัน ห้องอาหาร Food Exchange ชั้น 7 การนำเสนอแบบปากเปล่า เบญจสิริ บอลรูม 1 ขั้น 5 เบญจสิริ บอลรูม 2-3 ชั้น 5 Human and medical research Agricultural and biotechnology research ประธาน ดร.วรรณา ทองนพคุณ ประธาน รศ.ดร.สุภาวดี พุ่มพวง กรรมการ ดร.ศิษเฎศ ทองสิมา กรรมการ รศ.ดร.ธีระชัย ธนานันต์ ดร.ภัทรา ยี่ทอง ผศ.เตือนใจ โก้สกุล 13.00-13.15 O-HM1 ปิติชัย พรสรายุทธ O-AB1 ชัยวรกุล ไชยปัญญา Analysis of chromosome abnormalities Dissection of broad-spectrum resistance of the in multiple myeloma patients using Thai rice variety Jao Hom Nin conferred by two karyotyping, fluorescence in situ resistance genes against rice blast hybridization, and array comparative genomic hybridization 13.15-13.30 O-HM2 ศรินทิพ สุกใส O-AB2 อธิภัทร เงินหมื่น Cytotoxicity of cecropin A and B against Screening of BILs introgressed the rice blast lung cancer, ChoGo-K1 resistant QTLs from Jao Hom Nin (JHN) rice variety by InDel and SSR markers 13.30-13.45 O-HM3 วรากร บูชาชาติ O-AB3 ธรรมพร โคจรนา Russell-Silver Syndrome with uniparental Genome-wide association study for root disomy :7a case report biomass under salt stress at seedling stage in local Thai rice varieties 13.45-14.00 O-HM4 เบญญานันทน์ พิมพกรรณ์ O-AB4 ลลิตา ณ ราชสีมา Novel mutations of TBX 5gene in Thai Expression analysis and nucleotide variation patients with Holt-Oram syndrome of OsC1 gene associated with anthocyanin pigmentation in rice

iv วันศุกร์ที่ 16 มิถุนายน 2560 เบญจสิริ บอลรูม 1 ขั้น 5 เบญจสิริ บอลรูม 2-3 ชั้น 5 เวลา Human and medical research Agricultural and biotechnology research 14.00-14.15 O-HM5 ลลิตา ลำกูล O-AB5 พลสิทธิ์ สถาผลเดชา Diversity of gene encoding Apical Molecular characterization and functional Membrane Antigen-1 of the human study of leucine-tyrosine motif containing malaria parasite, Plasmodium protein 5 (LYRM5) in female banana shrimp falciparum, in Thailand 14.15-14.30 O-HM6 ชวิญญา ตระกูลสุนทร O-AB6 อนุภาพ ประชุมวัด Novel amino acid unit and arrangement A genomic and transcriptomic aspect of the in glutamate-rich protein gene of the emerging shrimp pathogen Enterocytozoon human malaria parasite Plasmodium hepatopenaei falciparum in Thailand 14.30-14.45 O-HM7 วรนิษฐา ไชยนา O-AB7 ปฐมฤกษ์ อิงสันเทียะ Effects of intracellular iron accumulation Evolution of chemosensory related genes in and tumor necrosis factor-α on functions the common ancestor of hexapods: a of astrocytes transition from aquatic to terrestrial life 14.45-15.00 พักรับประทานอาหารว่าง บรรยายโดยวิทยากรรับเชิญ 15.00-15.30 Current genetic diagnosis for autism Advantages and challenges of genosensor in (รศ.นพ.ดร.พรพรต ลิ้มประเสริฐ) genetics: the experience at a glance (ผศ.ดร.ปิยะศักดิ์ ชอุ่มพฤกษ์) 15.30-16.00 Pre-implantation genetic diagnosis: state Development of rapid diagnostic flow strip of the art tests for detection of biological markers (รศ.นพ.ดร.วีรวิทย์ ปิยะมงคล) (รศ.ดร.โกสุม จันทร์ศิริ) 16.00-16.30 Genetic history of Thai people From actinomycete genome to novel drug (ผศ.ดร.วิภู กุตะนันท์) discovery (รศ.ดร.อรินทิพย์ ธรรมชัยพิเนต) 16.30-17.00 พิธีมอบรางวัล และปิดการประชุม

วันเสาร์ที่ 1 มิถุนายน 72560 เวลา กิจกรรม 8.30-12.00 Excursion: museum tour : Chulalongkorn University museum and Museum of Human Body

P-AB22 Interspecific hybrid detection of Siam tulip and its relatives using chromosome counting Sathaporn Sukjit1, Chalermsri Nonthasawatsri2 and Naruemon Khemkladngoen1* 1Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai 50290 Thailand 2Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Production, Maejo University, Chiang Mai 50290 Thailand *Corresponding author: [email protected] ABSTRACT ! Siam tulip (Curcuma alismatifolia Gagnep.) is the economically important flowers of Thailand. It is widely used as cut flowers in Thailand and exported both as cut flowers and flower rhizomes to many countries. Recently, C. alismatifolia Gagnep. has been crossed to various relative species in order to create novel characteristics which are attractive to flower market. However, the process to produce interspecific hybrids usually create immature embryos that cannot survive naturally. Therefore, embryo rescue is required to recover the embryos and obtain viable interspecific hybrids. Somehow, embryo rescue may generate new plantlets from somatic cells of a mother plant. Thus, detection of true interspecific hybrids is necessary. Here, an interspecific hybrid between C. alismatifolia Gagnep. (2n = 32) and C. aurantiaca Van Zip. (2n = 42) was studied using cytogenetic technique. Chromosome preparation from flower buds/anthers was optimized. Meiotic chromosomes were prepared by enzymatic digestion, stained with DAPI and counted under fluorescence microscope. It is showed that the number of chromosomes of the hybrid was 37 as expected. Therefore, chromosome counting is able to use as an alternative method for interspecific hybrid detection. The results reported here is an initial characterization of interspecific hybrids of Siam tulip and its relatives. Genome composition of this hybrid and others will be further analyzed using genomic in situ hybridization (GISH).

Keywords: Interspecific hybrid detection; Curcuma alismatifolia; chromosome counting; Curcuma"

INTRODUCTION Curcuma alismatifolia Gagnep, commonly known as Siam tulip, and C. aurantiaca Van Zip. belong to family Zingiberaceae. The genus Curcuma is classified into 2 groups depending on inflorescence form and stamen form, which are Paracurcuma and Eucurcuma. C. alismatifolia Gagnep. and C. aurantiaca Van Zip. belong to Paracurcuma and Eucurcuma, respectively. Siam tulip is the commercially important flowers in Thailand. It is used both as cut flowers and pot plants in Thailand and is exported to many countries. To date, demands of Siam tulips in global market continuously increase (Ruamrungsri, 2013). Nowadays, C. alismatifolia Gagnep. has been crossed to many relative species to create novel features more attractive to flower markets. To create interspecific hybrids, cross pollination is performed between two different species. The hybrid embryos, unfortunately, usually cannot survive naturally. Thus, tissue culture technique

called embryo rescue is applied to rescue embryos and generate new hybrid plantlets. However, method for embryo rescue may induce new plantlets from somatic cells of mother plant and it is sometime difficult to differentiate between true hybrid plantlets and the mother plantlets. Therefore, it is necessary to confirm whether the new plantlets are the real hybrid or not. Nowadays, many techniques have been developed for interspecific hybrid detection such as DNA markers and cytogenetic technique like genomic in situ hybridization (GISH). RAPD and AFLP markers were applied to examine interspecific hybrids of carrots (Daucus carota) (Grzebalus et al., 2001). Genetic relationship among Heliconia was studied using RAPD marker (Marouelli et al., 2010). Moreover, genome composition of interspecific hybrids of sugarcane was able to analyze using GISH (Piperidis et al., 2010). The study on hybrid evolution in camellia was also reported using GISH (Liu et. al., 2011). In general, interspecific hybrids is crossed from 2 different species. Chromosome number of the hybrid should be half of parents’ chromosome number in total. Therefore, chromosome counting might be used for interspecific hybrid detection. This article reported the optimized condition for chromosome preparation from flower buds/anther of C. alismatifolia Gagnep. , C. aurantiaca Van Zip and their hybrid. Later on, the optimized method was applied to interspecific hybrid detection using chromosome counting. The results reported here was initial information for interspecific hybrid characterization and the method reported might be useful for interspecific hybrid detection in other species.

MATERIALS AND METHODS Plant materials Plant samples used in this study were Curcuma alismatifolia Gagnep., C. aurantiaca Van Zip. and an interspecific hybrid that was produced from those 2 species above. Flowering stems of each sample were collected in the morning (8-11.00 am.) from nursery of Dr. Chalermsri Nonthasawatsri, Maejo University. Chromosome preparation using squash technique Flower buds from the flower stems were collected and treated with 0.002 M 8-hydroxyquinoline at room temperature for 3 h. The flower bud samples were then fixed in Carnoy’s solution (acetic acid:ethanol = 1:3) at 4 C for overnight. The samples were stored at -20 C until use. To examine suitable sizes of flower buds and anthers that possess meiotic cells with good chromosome spreads, meiotic chromosomes were prepared using squash technique as described in Sharma and Sharma (1980) with some modification. Sizes of flower buds and the corresponding sizes of anthers were measured and recorded. Anthers dissected from flower buds was hydrolyzed with 1N HCl for 1 min and immediately squashed in a drop of aceto-orcien (2% w/v orcein powder, 50% v/v acetic acid). The prepared chromosomes were observed under a Nikon Eclipse 80i microscope equipped with DS-2mV CCD camera. Chromosome preparation for chromosome counting

The suitable sizes of flower buds/anthers were subjected to chromosome preparation using the method reported previously (Murata and Motoyashi, 1995) with some modification. Anthers dissected from flower buds were digested with enzyme mixture (7% Cellulase, 3% pectinase in citrate buffer) for either 20 min or 40 min at 37 °C. After that the flower buds were squeezed with end of pipette tips and then filtrated through nylon membrane (40 µm ⌀). The cell suspension was centrifuged for 30 second at 10000 rpm. The cell pellet was collected and resuspended again in fresh prepared Carnoy’s solution. Then, the suspension was precipitated again by centrifugation for 30 second at 10000 rpm. The pellet was resuspended in Carnoy’s solution. The cell/protoplast suspension was dropped on a clean slide. To evaluate digestion efficiency, the prepared slides were subjected to Giemsa staining. For chromosome counting, meiotic chromosomes were prepared as described above. After that, the chromosomes were stained with DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole) and observed under a Nikon Eclipse 80i fluorescence microscope equipped with DS-2mV CCD camera. Chromosome number was counted from 5-10 diakinesis cells with well spreading chromosomes.

! RESULTS AND DISCUSSION Optimization of chromosome preparation Flower buds were used as plant materials in this study. Different sizes of flower buds provided different stages of meiotic cell division. Meiotic phases found in each size of flower bud/anther were examined using squash technique. The suitable size of flower buds/anthers of each plant sample and meiotic phase found were listed in Table 1. It was found that the suitable sizes of flower bud and anther of C. alismatifolia Gagnep. were 4 mm and 2 - 3 mm, respectively. Most stages found in this size of flower buds/anthers were stages in meiosis I including diakinesis. For C. aurantiaca Van Zip. and the hybrid, the suitable size of flower bud was approx. 4 - 4.5 mm and the corresponding anther sizes were 2-3 mm. Meiotic phases that were found in the anther were diplotene and diakinesis. Meiotic cells were prepared from the suitable size of flower buds using enzymatic digestion. Two digestion times as 20 and 40 min were compared. It was found that both digestion times at 20 and 40 min provided lots of single meiotic cells and less cell debris. Thus, 20 min was an optimum condition for enzymatic digestion and was used to prepare chromosome samples.

Chromosome counting for interspecific hybrid detection Meiotic cells were prepared from each plant sample using the optimized condition explained above. The meiotic chromosome were stained with Giemsa solution and shown in figure 1A-C.To count the chromosomes, the prepared cells were stained with DAPI solution, observed and pictured under fluorescence microscope. Diakinesis cells stained with DAPI was shown in figure 1D-E. Number of chromosomes was counted from ten diakinesis cells with well spreading chromosomes. Chromosomes in most diakinesis cells of the hybrid were interspersed over cytoplasm and usually behaved as univalent as shown in figure 1E. Number of chromosomes in the hybrid was 2n = 37. The previous studies reported that number of chromosomes in C. alismatifolia Gagnep. was 2n = 32 (Khamtang et al., 2014) and number of chromosomes in C. aurantiaca Van Zip was 2n = 42 (Leong-Škorničková et al., 2007). Therefore, the chromosome number of the hybrid studied here was consistent with that of its parent. Overall, chromosome counting could be used for identification of interspecific hybrids especially between C. alismatifolia Gagnep. and its relatives.

Table 1 the optimum sizes of flower buds and anthers of each sample used in this study, and meiotic phase that observed in the flower buds/anthers.

Plant samples Flower bud sizes Anther sizes observed meiotic phases Curcuma alismatifolia Gagnep. 4 mm. 2-3 mm. - pachytene - diplotene - diakinesis - metaphase I - telophase I Curcuma aurantiaca Van Zip. 4-4.5 mm. 2-3 mm. - diplotene - diakinesis The interspecific hybrid 4-4.5 mm. 2-3 mm. - diplotene - diakinesis

In this study, flower buds/anthers were used for chromosome preparation. Because it is easy in preparation and chromosomes in late prophase I, especially in diakinesis, are interspersed, so it is suitable for chromosome counting and other cytogenetic analysis. Here, it is the first report that used flower buds for chromosome preparation in Curcuma spp. The developed method was able to apply for chromosome counting in interspecific hybrid between C. alismatifolia Gagnep. and its relative. The results also showed that chromosome counting could be used for interspecific hybrid detection in Curcuma spp. However, the results in this study were an initial characterization of interspecific hybrids. Chromosome composition of

interspecific hybrids of C. alismatifolia Gagnep. and their relatives will be further analyzed using genomic in situ hybridization (GISH).

Figure 1 A-C) Diakinesis cells stained with Giemsa. D-F) Diakinesis cells stained with DAPI. A, D) C. alismatifolia Gagnep. B, E) C. aurantiaca Van Zip. C, E) the interspecific hybrid. Arrows indicated diakinesis cells. Bars = 10 µm

ACKNOWLEDGEMENTS! This research was granted by the National Research Council of Thailand (NRCT) in 2016. We are thankful for financial support from Graduate School of Maejo University, Chiang Mai, Thailand for Mr. Sathaporn Sukjit.

REFERENCES Anuntalabhochai S, Sitthiphrom S, Thongtaksin W, Sanguansermsri M and Cutler R.W. (2007) Hybrid detection and characterization of Curcuma spp. using sequence characterized DNA markers. Sci. Hortic. 111: 389- 393. Grzebelus, D., Baranski, R., Jagosz, B., Michalik, B. and Simon, P.W (2001) comparison of rapd and aflp technique used for the evaluation of genetic diversity of carrot breeding materials. Acta Hortic.413- 416. Khamtang L, Saensouk S, Saensouk P and Thanonkeo S (2014) Chromosome numbers of Zingiberaceae in Phu Laenkha National Park, Chaiyaphum Province. Proceeding in the 10th Mahasarakam University Research Conference. 11-12 Sep 2014 at Mahasarakam University: 367-372. Leong-Škorničková J, Šída O, Jarolímová V, Sabu M, Fér T, Trávníček P, and Suda J (2007) Chromosome 80

Numbers and Genome Size Variation in Indian Species of Curcuma (Zingiberaceae). Ann Bot. 100(3): 505–526. Liu LQ and Gu ZJ (2011) Genomic in situ hybridization identifies genome donors of Camellia reticulate (Theaceae). Plant Sci. 180(3): 554-559. Marouelli L.P., Inglis P.W., Ferreira M.A., Buso G.S. (2010) Genetic relationships among Heliconia (Heliconiaceae) species based on RAPD markers. Genet. Mol. Res. 9(3):1377-1387. Murata M and Motoyoshi, F (1995) Floral chromosomes of Arabidopsis thaliana for detecting low-copy DNA sequences by fluorescence in situ hybridization. Chromosoma 104: 38-43 Piperidis G, Piperidis N and D’Hont A (2010) Molecular cytogenetic investigation of chromosome composition and transmission in sugarcane. Mol. Genet. Genomics. 284: 65-73. Ruamrungsri S (2013) Development of Thai Flowers toward ASEAN Market Competition. Khon Kaen Agr. J.41:209-212. Sharma AK and Sharma AS (1980) Chromosome Techniques: Theory and Practice. 3rd ed. Butterworths Co. Ltd., London, 9-27.

การตรวจสอบลูกผสมข้ามชนิดระหว่างปทุมมาและพลอยทักษิณ (Curcuma alismatifolia Gagnep. x C. aurantiaca Van Zip.) ด้วยเครื่องหมาย ISSR Detection of an Interspecific Hybrid between Curcuma alismatifolia Gagnep. and C. aurantiaca Van Zip. using ISSR Marker

1* 2 นฤมล เข็มกลัดเงิน และเฉลิมศรี นนทสวัสดิ์ศรี 1* 2 Naruemon Khemkladngoen and Chalermsri Nonthasawatsri 1สาขาวิชาพันธุศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 2หลักสูตรพืชสวน คณะผลิตกรรมการเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 1Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 2Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Production, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 *Corresponding author: [email protected]

บทคัดย่อ

ปทุมมาและกระเจียวเป็นไม้ดอกเศรษฐกิจที่ส าคัญของไทย ในปัจจุบันมีการปรับปรุงพันธุ์ปทุมมาและ กระเจียวให้มีความหลากหลายมากยิ่งขึ้นโดยการผสมข้ามระหว่างพืชภายในสกุล Curcuma หรือผสมข้ามระหว่าง สกุลย่อย แต่อย่างไรก็ตามการผสมข้ามท าให้เกิดอุปสรรคหลายอย่างและอาจก่อให้เกิดลูกที่เหมือนต้นแม่ได้ ดังนั้นจึง จ าเป็นต้องตรวจสอบลูกผสมที่แท้จริงจากการผสมข้ามชนิด ในงานวิจัยนี้เครื่องหมายดีเอ็นเอชนิด ISSR ถูกประยุกต์ใช้ เพื่อตรวจสอบการเป็นลูกผสมข้ามชนิดระหว่างปทุมมาและพลอยทักษิณ พบว่าลายพิมพ์ดีเอ็นเอจากการใช้ไพรเมอร์ ISSR ทั้งหมด 10 สาย ท าให้เกิดแถบดีเอ็นเอทั้งหมด 72 แถบ และให้แถบที่มีความแตกต่างระหว่างตัวอย่าง 62 แถบ (ร้อยละ 83) นอกจากนี้ยังพบว่าไพรเมอร์ 811 และ 818 เป็นไพรเมอร์ที่ท าให้เกิดแถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะต่อต้นพ่อแม่ และปรากฏในลูกผสมด้วย ดังนั้นไพรเมอร์นี้จึงเหมาะสมในการตรวจสอบการเป็นลูกผสมของคู่ผสมนี้ งานวิจัยนี้เป็น การศึกษาเบื้องต้นที่ท าให้ทราบว่าเครื่องหมาย ISSR มีศักยภาพที่จะใช้ในการตรวจสอบลูกผสมระหว่างพืชกลุ่มปทุมมา และกระเจียวได้ และอาจมีประสิทธิภาพที่จะตรวจพบแถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะต่อพันธุ์และชนิดของพืชกลุ่มนี้ เพื่อพัฒนา เป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอในการตรวจสอบพันธุ์หรือลูกผสมต่อไป

ค าส าคัญ: ปทุมมา กระเจียว ลูกผสมข้ามชนิด เครื่องหมาย ISSR

Abstract

Ornamental Curcuma, especially Siam tulip, is an economically important flower in Thailand. Currently, Siam tulip has been crossed to other Curcuma sp. both in subgenus Paracurcuma and Eucurcuma to create novel and attractive characteristics. The process for interspecific breeding frequently faces many barriers and may cause offsprings that are generated from selfing cross or from somatic cells of a maternal plant. Therefore, detection of the interspecific hybrids is 256 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

necessary. In this study, ISSR marker was applied to detect the interspecific hybrid between Siam tulip (Curcuma alismatifolia) and Ploytaksin (C. aurantiaca). DNA fingerprints generated from 10 ISSR primers provided 72 amplified bands and 62 bands out of total (83%) were polymorphic. Primer 811 and 818 also provided the amplified bands specific both to Siam tulip and Ploytaksin and the bands presenting in the hybrid DNA fingerprint as well. Thus, these two primers were suitable for detection of the hybrid studied here. The results elucidated that ISSR marker is an efficient technique to detect interspecific hybrids between Curcuma species, and the specific bands obtained from ISSR has probably been potential to generate the specific marker and ultimately identify cultivars, species and the hybrids.

Keywords: Curcuma alismitifolia, Curcuma aurantiaca, interspecific hybrid, ISSR marker

ค าน า

ปทุมมา (Curcuma alismatifolia Gagnep, common name; Siam tulip) และพลอยทักษิณ (C. aurantiaca Van Zip.) เป็นพืชใบเลี้ยงเดี่ยวจัดอยู่ในวงศ์ขิง (Zingiberaceae) ที่มีหัวสะสมน้ าและอาหารใต้ดิน พืชวงศ์นี้ถูกน ามาใช้ประโยชน์หลายด้านทั้งใช้เป็นอาหาร ยารักษาโรค และประดับตกแต่ง โดยปทุมมาและพลอย ทักษิณจัดอยู่ในสกุลขมิ้น (Curcuma) พืชในสกุลนี้มีอยู่ไม่น้อยกว่า 65 ชนิด พบกระจายพันธุ์ตั้งแต่ทวีปออสเตรเลีย ประเทศอินโดนีเซีย จนถึงทวีปแอฟริกา ในประเทศไทยพบพืชสกุลนี้กระจายอยู่ในภาคต่างๆ กว่า 30 ชนิด พืชสกุลนี้มี ความหลากหลายทางพฤกษศาสตร์มากจึงสามารถแบ่งออกเป็น 2 สกุลย่อยตามลักษณะของใบประดับ ช่อดอกและ อับเรณู และลักษณะสีของปาก คือ สกุลย่อย Eucurcuma หรือกลุ่มกระเจียว มีลักษณะเด่นคือปากกลีบของดอกจริง มักมีสีขาวหรือเหลือง ตัวอย่างพืชในกลุ่มนี้ได้แก่ ฉัตรทิพย์ อุษา พลอยทักษิณ เป็นต้น สกุลย่อย Paracurcuma หรือ กลุ่มปทุมมา เป็นกลุ่มที่ปากกลีบของดอกจริงจะมีสีขาวหรือม่วง ตัวอย่างพืชในกลุ่มนี้ได้แก่ ปทุมมา พลอยมยุรา แววอุบล เทพอัปสร เป็นต้น (สุรวิช, 2539) พืชกลุ่มปทุมมาและกระเจียวมีลักษณะดอกที่สวย แปลกตา และสีสันสดใสจึงถูกน ามาใช้เป็นไม้ดอกไม้ ประดับ และกลายเป็นไม้ดอกเศรษฐกิจที่ส าคัญของไทยเป็นอันดับสองรองจากกล้วยไม้ มีการส่งออกพืชกลุ่มนี้ในรูป ของไม้ตัดดอก ไม้กระถาง และหัวพันธุ์ไปยังหลายประเทศ เช่น ญี่ปุ่น อเมริกา และประเทศในแถบยุโรป เป็นต้น มีมูลค่าการส่งออกรวมปีละ 10-20 ล้านบาท และมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นทุกปี (ยุทธศาสตร์การพัฒนางานวิจัยปทุมมา พ.ศ. 2559-2563, มปป และโสรยา, 2549) เพื่อเพิ่มการแข่งขันทางการตลาดและตอบสนองต่อความต้องการของ ตลาด นักปรับปรุงพันธุ์พยายามปรับปรุงพันธุ์พืชกลุ่มนี้ให้ได้ลักษณะที่หลากหลายมากยิ่งขึ้น โดยการผสมพันธุ์ข้าม ระหว่างพืชภายในสกุล Curcuma ท าให้ได้ลูกผสมข้ามชนิด (สปีชีส์) การผสมพันธุ์ระหว่างพืชต่างชนิดหรือการผสม ข้ามชนิด เป็นวิธีที่นิยมมากในการปรับปรุงพันธุ์ไม้ดอก มีจุดประสงค์เพื่อรวมยีนที่แตกต่างกันไว้ด้วยกัน มีผลท าให้ฐาน พันธุกรรมของพืชที่สนใจนั้นกว้างและหลากหลายมากยิ่งขึ้น แต่อย่างไรก็ตามวิธีนี้มักท าให้เกิดอุปสรรคหลายประการ ได้แก่ อุปสรรคที่เกิดก่อนการปฎิสนธิ (pre-fertilization barriers) เช่น ละอองเกสรตัวผู้ไม่งอก หรืองอกผิดทิศทางท า ให้สเปิร์มเซลล์ (sperm cells) ไม่สามารถเข้าไปผสมกับไข่ได้ และอุปสรรคที่เกิดหลังการปฏิสนธิ (post-fertilization barriers) มีผลท าให้ไม่เกิดการพัฒนาของลูกผสมหรือเอ็มบริโอของลูกผสม (Kuligowska et al., 2016) ข้อจ ากัดที่ รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 257 เกิดก่อนการปฏิสนธิอาจแก้ไขโดยการใช้เกสรของต้นแม่ร่วมผสมด้วย หรือใช้เทคนิคเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อเพื่อช่วยชีวิต เอ็มบริโอ (embryo rescue) เพื่อแก้ปัญหาการไม่เจริญของเอ็มบริโอลูกผสม แต่อย่างไรก็ตามวิธีการเหล่านี้อาจท าให้ เกิดต้นที่ไม่ใช่ลูกผสมที่แท้จริงขึ้นได้ ดังนั้นจึงมีความจ าเป็นที่จะต้องตรวจสอบการเป็นลูกผสมที่แท้จริงของลูกที่เกิดขึ้น ในปัจจุบันมีรายงานเกี่ยวกับการตรวจสอบลูกผสมในพืชดอกหลายชนิดด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอ เช่น การ ตรวจสอบลูกผสมข้ามสกุลระหว่างกล้วยไม้สกุล Ascocenda และ Phalaenopsis ด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิด RFLP ร่วมกับเทคนิค GISH (Liu et al., 2016) การตรวจสอบลูกผสมข้ามชนิดระหว่างพืชในสกุล Jatropha โดยใช้ เครื่องหมาย SSCP (Suwannoi et al., 2012) นอกจากนี้มีการรายงานเกี่ยวกับการตรวจสอบลูกผสมของปทุมมาโดย ใช้เครื่องหมาย HAT-RAPD และ sequence characterized amplified regions (SCAR) พบแถบดีเอ็นเอ (600 คู่เบส) ที่จ าเพาะต่อปทุมมาสามารถใช้จ าแนกลูกผสมที่มีพ่อหรือแม่พันธุ์เป็นปทุมมาได้ แต่ไม่สามารถจ าแนกได้ว่า ลูกผสมเกิดจากปทุมมากับสปีชีส์ใด (Anuntalabhochai et al., 2007) เครื่องหมายดีเอ็นเอ ISSR (inter simple sequence repeats) เป็นเครื่องหมายที่นิยมมากในปัจจุบัน เนื่องจากไม่จ าเป็นต้องทราบข้อมูลล าดับนิวคลีโอไทด์ของ พืชที่ศึกษา สามารถท าซ้ าได้ ท าให้เกิดความแตกต่างของแถบดีเอ็นเอสูง ใช้เวลาน้อยและมีวิธีการที่ไม่ยุ่งยากซับซ้อน ดังนั้น เครื่องหมายนี้จึงถูกน ามาใช้ในการตรวจสอบลูกผสมระหว่างปทุมมา และพลอยทักษิณในงานวิจัยนี้ ซึ่งพบว่า เครื่องหมาย ISSR ให้ค่าความแตกต่างกันของแถบดีเอ็นเอที่สูง ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นสามารถใช้ตรวจสอบการเป็น ลูกผสมของประชากรที่ศึกษาได้ และพบไพรเมอร์ที่เหมาะสมในการตรวจสอบลูกผสมอีกด้วย

อุปกรณ์และวิธีการ

ตัวอย่างพืชและการเก็บตัวอย่างใบ ตัวอย่างพืชที่ใช้ในงานวิจัยนี้ได้แก่ ปทุมมา (C. alismatifolia Gagnep.) พันธุ์ Snow white และพันธุ์ Big red พลอยทักษิณ (C. aurantiaca Van Zip.) ซึ่งเป็นพืชกลุ่มกระเจียว และลูกผสมข้ามชนิดระหว่างปทุมมา พันธุ์ Snow white และพลอยทักษิณ เก็บใบอ่อนจากตัวอย่างที่ศึกษาในตอนเช้า โดยต้นตัวอย่างนี้จะถูกคลุมด้วยถุงด าในตอนเย็นเพื่อลดการ สังเคราะห์แสงและสะสมแป้งในตอนเช้าก่อนเก็บใบ ซึ่งช่วยลดปริมาณแป้งที่จะปนเปื้อนในขั้นตอนสกัดดีเอ็นเอลงได้

การสกัดดีเอ็นเอ สกัดดีเอ็นเอจากใบอ่อนของพืชตัวอย่างด้วยชุดสกัดดีเอ็นเอ DNAsecure Plant Kit (Tiangen, China) ตาม ค าอธิบายของชุดสกัด หลังจากนั้นจึงตรวจสอบคุณภาพดีเอ็นเอที่สกัดได้ด้วยเทคนิคเจลอิเลคโทรโฟรีซีส (0.8% อะกาโรสเจลใน 0.5X TBE) ตรวจสอบปริมาณดีเอ็นด้วยเครื่อง NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., USA)

การตรวจสอบลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้วยเครื่องหมาย ISSR ดีเอ็นเอจากพืชตัวอย่างที่ศึกษาถูกน ามาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยเทคนิคพีซีอาร์ด้วยเครื่อง PCR T100TM Thermal Cycler (Bio-Rad) โดยใช้ไพรเมอร์ทั้งหมด 12 สาย (Taheri et al., 2012) ปฏิกิริยาพีซีอาร์ถูกเตรียมใน ปริมาตรทั้งหมด 10 ไมโครลิตร ประกอบด้วยดีเอ็นเอต้นแบบ 10 นาโนกรัม (กรณีรวมดีเอ็นเอ ใช้ดีเอ็นเอจากพันธุ์ พ่อและแม่ผสมกันให้มีความเข้มข้นสุดท้าย 10 ng/l แล้วจึงน ามาใช้เป็นดีเอ็นเอต้นแบบ) 1X DreamTaq Green

258 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

o PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) และ 0.4 M ไพรเมอร์ สภาวะของปฎิกิริยาพีซีอาร์คือ 95 ซ. 3 นาที แล้วจึงตามด้วย 95oซ. 30 วินาที 50-60oซ. 30 วินาที และ 72oซ. 1 นาที จ านวน 35 รอบ และเข้าสู่รอบ สุดท้ายคือ 72oซ. 10 นาที จากนั้นแยกแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นด้วยเทคนิคอะกาโรสเจลอิเลคโทรโฟรีซีส (2% อะกาโรสเจล ใน 0.5X TBE, ความต่างศักย์ 100 โวลต์, 35 นาที) ขนาดของแถบดีเอ็นเอที่ได้ถูกเปรียบเทียบโดยใช้ GeneRuler 100 bp Plus DNA ladder (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) หลังจากนั้นจึงตรวจสอบแถบดีเอ็นเอด้วยเครื่อง Gel Doc XR+ (Bio-Rad, USA) การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอและการตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นจากแต่ละไพรเมอร์ ท าการทดลองซ้ า 2 ครั้ง เพื่อตรวจสอบความสามารถในการท าซ้ า และความน่าเชื่อถือของแถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้น และ แถบดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นทั้ง 2 ครั้งนั้นจะถูกน ามาใช้ในการวิเคราะห์ต่อไป

ผลการวิจัย

การคัดเลือกไพรเมอร์ที่เหมาะสม งานวิจัยนี้ต้องการประยุกต์ใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอชนิด ISSR เพื่อตรวจสอบลูกผสมข้ามชนิดระหว่างปทุมมา พันธุ์ Snow white และพลอยทักษิณ (C. alismatifolia Gagnep. x C. aurantiaca Van Zip.) ในขั้นแรกไพรเมอร์ ทั้งหมด 12 สาย ถูกน ามาใช้เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอจากพืชตัวอย่างที่ศึกษาทั้งหมดที่ผสมรวมกัน (pooled DNA) เพื่อหา ไพรเมอร์ที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ พบว่ามีไพรเมอร์เพียง 10 สาย ที่เหมาะสมจะน ามาศึกษาต่อไป โดย ไพรเมอร์อีก 2 สาย ให้แถบดีเอ็นเอที่ไม่ชัดเจน หรือไม่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในอุณหภูมิที่ใช้ได้ หลังจากนั้นจึง หาอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเข้าคู่กันของไพรเมอร์กับดีเอ็นเอแม่พิมพ์ (annealing temperature, Ta) พบว่า อุณหภูมิที่เหมาะสม คือ 52 และ 56oซ. ดังแสดงใน Table 1 การตรวจสอบลูกผสมด้วยเครื่องหมาย ISSR การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยปฏิกิริยาพีซีอาร์โดยใช้ไพรเมอร์ ISSR ที่คัดเลือกไว้ในพืชตัวอย่างที่ศึกษา พบว่า ไพรเมอร์ทั้ง 10 สายสามารถเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอที่มีขนาดอยู่ในช่วง 200-2000 คู่เบส (Figure 1) ท าให้เกิดแถบดี เอ็นเอทั้งหมด 72 แถบ จ านวนแถบอยู่ในช่วง 4-12 แถบต่อไพรเมอร์ และมีแถบที่ให้ความแตกต่างกันระหว่างตัวอย่าง อยู่ในช่วง 2-12 แถบ โดยพบว่า ไพรเมอร์ชุดนี้สามารถให้แถบดีเอ็นเอที่มีความแตกต่างกัน (polymorphic band) เฉลี่ยคิดเป็นร้อยละ 83.60 ซึ่งไพรเมอร์ที่ให้แถบที่แตกต่างกันมากที่สุดคิดเป็นร้อยละ 100 คือ ไพรเมอร์ 812 และ 816 และไพรเมอร์ที่ให้แถบที่หลากหลายรองลงมาคือไพรเมอร์ I2 คิดเป็นร้อยละ 91.70 ส่วนไพรเมอร์ที่ให้แถบที่ แตกต่างน้อยที่สุด คือ ไพรเมอร์ P3 คิดเป็นร้อยละ 40 (Table 1) แต่อย่างไรก็ตามจากผลการทดลองพบว่า ไพรเมอร์ I2 ซึ่งให้แถบดีเอ็นเอมากที่สุดคือ 12 แถบ และให้แถบที่แตกต่างกันมากถึงร้อยละ 91.60 ไม่เหมาะสมในการน ามา ตรวจสอบการเป็นลูกผสมข้ามชนิดที่ศึกษานี้ เนื่องจากไพรเมอร์นี้ให้แถบดีเอ็นเอที่มีขนาดใกล้เคียงกัน และมีความเข้ม ของแถบไม่ชัดเจนจ านวนมาก ซึ่งถ้าน าไปตรวจสอบการเป็นลูกผสมอาจท าให้วิเคราะห์ได้ยาก แต่ไพรเมอร์นี้อาจ เหมาะสมที่จะใช้ในการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของพืชกลุ่มนี้ได้ เพราะให้แถบจ านวนมากและหลากหลาย

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 259

Figure 1 ISSR fingerprints of 3 Curcuma sp. and the hybrid generated from primer 811, 812, 818,

816, 817 and 826. M: 100 bp Plus DNA ladder, - : negative control (dH2O), SW: C. alismatifolia Gagnep. cv. Snow white, BR: C. alismatifolia Gagnep. cv. Big red, F1EPL: Ploytaksin (C. aurantiaca Van Zip.) and SWF1EPL: the hybrid between Snow white and Ploytaksin.

Table 1 Lists of primers used in this study, their sequences, annealing temperature (Ta), amplified band sizes and percent of polymorphism

Primer Sequence Ta (°C) Approx. Total no. Total no. of % Polymorphism code (5'-3') fragment size of bands polymorphic (bp) bands

811 (GA)8C 52 400-1,200 7 6 85.71

812 (GA)8A 52 400-1,200 6 6 100.00

818 (CA)8G 52 400-2,000 7 6 85.71

P3 (AG)8TG 52 500-1,500 5 2 40.00

850 (GT)8YC 56 700-2,000 9 8 88.89

I2 (GA)9T 56 200-1,500 12 11 91.67

P8 (CAC)5 56 600-2,000 4 3 75.00

816 (CA)8T 56 500-1,500 9 9 100.00

817 (CA)8A 56 400-1,200 7 6 85.71

826 (AC)8C 56 300-2,000 6 5 83.33

260 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

Table 1 (Continue)

Primer Sequence Ta (°C) Approx. Total no. Total no. of % Polymorphism code (5'-3') fragment size of bands polymorphic (bp) bands

Total - - - 72 62 -

Mean - - - 7.2 6.2 83.60

Range - - 200-2000 4-12 2-11 40-100

Primer code 850; Y = C, T (Primer sourc; Taheri et al., 2012)

จากลายพิมพ์ดีเอ็นเอของพืชตัวอย่างที่เกิดจากไพรเมอร์ ISSR แต่ละชนิด พบว่า ไพรเมอร์ทั้งหมด 6 ชนิด ที่สามารถระบุการเป็นลูกผสมได้ คิดเป็นร้อยละ 60 โดยพบว่าไพรเมอร์ 811 และ 818 ให้แถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะต่อ ปทุมมา และพลอยทักษิณ และพบแถบที่จ าเพาะนั้นในลูกผสมด้วย ไพรเมอร์ 812 และ 816 ให้แถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะ ต่อปทุมมา และพบแถบนั้นในลูกผสมด้วย ไพรเมอร์ 817 และ 826 ให้แถบที่จ าเพาะต่อพลอยทักษิณ และพบใน ลูกผสมด้วย ซึ่งขนาดของแถบดีเอ็นเอที่สามารถใช้บอกการเป็นลูกผสมของไพรเมอร์แต่ละชนิดแสดงใน Table 2 ดังนั้นจึงสามารถใช้ไพรเมอร์เหล่านี้เพื่อตรวจสอบการเป็นลูกผสมในพืชกลุ่มนี้ได้โดยสังเกตจากขนาดของแถบที่เกิดขึ้น เช่น เมื่อใช้ไพรเมอร์ 811 ตรวจสอบลูกผสม ถ้าเป็นลูกผสมระหว่างปทุมมาพันธุ์ Snow white และพลอยทักษิณ จะต้องปรากฎแถบดีเอ็นเอขนาด 1,200 คู่เบส (ได้รับจากปทุมมาพันธุ์ Snow white) 1,000 และ 450 คู่เบส (ได้รับ จากพลอยทักษิณ) นอกจากนี้ยังพบว่าลายพิมพ์ดีเอ็นเอจากไพรเมอร์ 812 บริเวณ 400-500 คู่เบส ให้แถบดีเอ็นเอ ที่แตกต่างกันระหว่างปทุมมาพันธุ์ Snow white ปทุมมาพันธุ์ Big red และพลอยทักษิณ (ขนาดประมาณ 450, 500 และ 400 คู่เบส ตามล าดับ) เนื่องจากแถบดีเอ็นเอบริเวณนี้ให้ความแตกต่างกันระหว่างปทุมมาพันธุ์ Snow white และพันธุ์ Big red ดังนั้นจึงมีความเป็นไปได้ที่จะน าแถบดีเอ็นเอนี้ไปอ่านล าดับเบสและพัฒนาเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอ ที่จ าเพาะต่อพันธุ์ Snow white และพันธุ์ Big red ได้

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 261 Table 2 Summary of primers and their band sizes that were common in 1) C. alismatifolia Gagnep. cv. Snow white and the hybrid, and 2) Ploytaksin (F1EPL) and the hybrid

Band sizes (bp) Primer code Snow white-hybrid F1EPL-hybrid 1,200 1,000 811 - 450 812 450 - 1,100 2,000 818 1,000 - 900 - 816 850 - 800 - 817 - 500 826 - 1,000

วิจารณ์ผลการวิจัย

เครื่องหมาย ISSR ที่ใช้ในพืชตัวอย่างที่ศึกษานี้สามารถให้แถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกันจ านวนมาก โดยมีค่าเฉลี่ย ของแถบดีเอ็นเอที่ให้ความแตกต่างกัน (% polymorphism) ร้อยละ 83.6 ซึ่งเป็นค่าที่สูง และเป็นลักษณะเด่นของ เครื่องหมายนี้ มีการรายงานจากงานวิจัยก่อนหน้านี้ที่ใช้เครื่องหมาย ISSR ในพืชกลุ่ม Curcuma sp. ก็ให้ผลที่ ใกล้เคียงกัน โดย Das et al. (2011) ใช้เครื่องหมาย ISSR ร่วมกับเครื่องหมาย RAPD และ AFLP ในการวิเคราะห์ ความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของ Curcuma sp. ทั้งหมด 7 ชนิด ที่รวบรวมจากภาคตะวันออกเฉียงเหนือของอินเดีย พบว่าเครื่องหมาย ISSR ให้ค่า %polymorphism เฉลี่ยร้อยละ 98.55 ซึ่งเป็นค่าที่สูงที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับ เครื่องหมาย RAPD และ AFLP นอกจากนี้มีการศึกษาความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมของ Curcuma sp. 4 ชนิดในเขต Tripura ซึ่งตั้งอยู่ทางตะวันออกเฉียงเหนือของภูเขาฮิมาลัย พบว่าเครื่องหมาย ISSR ให้ความแตกต่างของแถบดีเอ็นเอ ถึงร้อยละ 86.3 (Saha et al., 2016) และการศึกษาของ Taheri et al. (2012) ซึ่งศึกษาความสัมพันธ์ทางพันธุกรรม ของปทุมมา 5 สายพันธุ์ ได้แก่ Sweet Pink, Doi Tung 554, Chiang Mai Pink, Chiang Mai Red และ Kimono Pink ที่รวบรวมมาจากจังหวัดเชียงใหม่ด้วยเครื่องหมาย ISSR พบว่ามีค่าเฉลี่ยของ %polymorphism ร้อยละ 77 ซึ่ง น้อยกว่ารายงานวิจัยนี้ อาจเป็นเพราะงานวิจัยของ Taheri et al. (2012) ศึกษาในพืชสปีชีส์เดียวกันทั้งหมด อาจมี ความแตกต่างกันของสารพันธุกรรมน้อยจึงท าให้เกิดแถบที่แตกต่างกันน้อยด้วย การตรวจสอบลูกผสมข้ามชนิดของปทุมมาพันธุ์ Snow white และพลอยทักษิณสามารถใช้ไพรเมอร์ 811 และ 818 ตรวจสอบได้ โดยทั้ง 2 ไพรเมอร์นี้ให้แถบดีเอ็นเอที่เป็นแถบเฉพาะส าหรับปทุมมาพันธุ์ Snow white และ พลอยทักษิณ ส่วนไพรเมอร์ 812 และ 816 ให้แถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะต่อปทุมมาพันธุ์ Snow white เท่านั้น ไพรเมอร์ 817 และ 826 ให้แถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะต่อพลอยทักษิณ นอกจากนี้ยังพบแถบดีเอ็นเอที่พบในทุกตัวอย่างที่ใช้ และพบ

262 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

แถบที่บ่งบอกความแตกต่างระหว่างปทุมมาพันธุ์ Snow white และ Big red ได้ ดังนั้นจึงมีความเป็นไปได้ที่จะพัฒนา แถบดีเอ็นเอเหล่านี้ให้เป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอที่จ าเพาะต่อตัวอย่างที่ศึกษา และเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอที่แยกความ แตกต่างระหว่างปทุมมาพันธุ์ Snow white และ Big red ได้ แต่อย่างไรก็ตามตัวอย่างที่ใช้ในการศึกษานี้มีจ านวนน้อย อาจมีผลท าให้การใช้ไพรเมอร์หรือเครื่องหมายดีเอ็นเอที่พัฒนาได้นี้จ าเพาะเจาะจงกับกลุ่มประชากรนี้เท่านั้น ดังนั้นใน งานวิจัยต่อไปอาจจะต้องใช้จ านวนตัวอย่างของพืชแต่ละสายพันธุ์ให้มากขึ้นเพื่อให้เป็นตัวแทนของสายพันธุ์นั้นๆ ได้ ซึ่งอาจท าให้ได้ไพรเมอร์หรือเครื่องหมายดีเอ็นเอที่พัฒนาได้สามารถใช้งานได้ในหลายประชากรหรือกว้างขวางมากขึ้น ส าหรับการตรวจลูกผสมในพืชกลุ่ม Curcuma sp. มีรายงานการใช้เครื่องหมาย HAT-RAPD เพื่อตรวจลูกผสมระหว่าง ปทุมมาพันธุ์ต่างๆ (C. alismatifolia) กับ พืชสกุล Curcuma อื่นๆ โดยพบแถบที่จ าเพาะต่อปทุมมาและสามารถ พัฒนาเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอ และใช้ตรวจลูกผสมที่เกิดจากปทุมมาได้ แต่ไม่สามารถระบุว่าเป็นลูกผสมระหว่างพืช ในสกุล Curcuma ชนิดใด (Anuntalabhochai et al., 2007) แต่จากผลการทดลองของงานวิจัยนี้พบไพรเมอร์หลาย ชนิดที่จ าเพาะต่อปทุมมา และพลอยทักษิณ ดังนั้นหากใช้ประชากรที่จ านวนมากขึ้น และศึกษาชนิดของพืชสกุลนี้มาก ขึ้นอาจมีความเป็นไปได้ที่จะใช้เครื่องหมาย ISSR เพื่อหาแถบที่จ าเพาะเจาะจงกับพืชในสกุลนี้ได้ และพัฒนาเป็น เครื่องหมายดีเอ็นเอในการจ าแนกชนิดของพืชสกุลนี้และตรวจสอบลูกผสมข้ามชนิดต่อไปได้

สรุปผลการวิจัย

เครื่องหมาย ISSR เป็นเทคนิคที่เหมาะสมในการศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมของพืชสกุล Curcuma เพราะให้ค่าเฉลี่ยของแถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกันสูง นอกจากนี้ลายพิมพ์ดีเอ็นเอที่เกิดขึ้นสามารถใช้ ตรวจสอบการเป็นลูกผสมของกลุ่มตัวอย่างที่ศึกษาได้ โดยพบว่าไพรเมอร์ 811 และ 818 เหมาะสมส าหรับใช้ในการ ตรวจสอบลูกผสมได้ โดยจะให้แถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะเจาะจงต่อต้นพ่อและแม่ทั้ง 2 ชนิด งานวิจัยนี้เป็นข้อมูลเบื้องต้นที่ ท าให้ทราบว่ามีความเป็นไปได้ที่จะตรวจสอบลูกผสมด้วยเทคนิค ISSR และหากใช้ประชากรที่หลากหลาย และมี จ านวนมากขึ้นอาจมีความเป็นไปได้ที่จะพบแถบดีเอ็นเอที่จ าเพาะต่อพืชชนิดต่างๆ ในสกุล Curcuma ได้ และใช้ ตรวจสอบลูกผสมต่อไปได้

กิตติกรรมประกาศ

งานวิจัยนี้ได้รับทุนสนับสนุนจากส านักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ ปีงบประมาณ 2559

เอกสารอ้างอิง

สุรวิช วรรณไกรโรจน์. 2539. ปทุมมาและกรเจียว (Curcuma) ไม้ดอกไม้ประดับ. พิมพ์ครั้งที่ 1. กรุงเทพฯ: ส านักพิมพ์บ้านและสวน. 128 น. โสระยา ร่วมรังษี. 2558. สรีรวิทยา ไม้ดอกประเภทหัว. เชียงใหม่: ส านักพิมพ์มหาวิทยาลัยเชียงใหม่.

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 263 ยุทธศาสตร์การพัฒนางานวิจัยปทุมมา พ.ศ. 2559-2563. ม.ป.ป. [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา https://www.google.co.th/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad =rja&uact=8&ved=0ahUKEwiHsK6sz5rVAhVBGpQKHVnJBJIQFgghMAA&url=http%3A%2F%2Fw ww.doa.go.th%2Fhortold%2Fimages%2Fstories%2Fstrategyplanthort%2Fstrategypratumma. doc&usg=AFQjCNGSQzvtGJkwYzNxK_28OQFgmtJlOw (15 สิงหาคม 2560). Das, A., Kesari, V., Satyanarayana, V.M., Parida, A. and Rangan, L. 2011. Genetic relationship of Curcuma species from Northeast India using PCR-based markers. Molecular biotechnology 49(1): 65-76. Kuligowska, K., Lutken, H., Christensen, B. and Muller, R. 2016. Interspecific hybridization among cultivars of Hibiscus species section Muenchhusia. Breeding Science 66: 300-308 Liu, W.L., Shih, H.C., Weng, I.S., Ko, Y.Z., Tsai, C.C., Chou, C.-H. and Chiang, Y.-C. 2016. Characterization of Genomic Inheritance of Intergeneric Hybrids between Ascocenda and Phalaenopsis Cultivars by GISH, PCR-RFLP and RFLP. PloS one 11(4): e0153512. Saha, K., Kumar, R., Basak, S. and Sinha, S. 2016. ISSR Fingerprinting to ascertain the genetic relationship of Curcuma sp. of Tripura. American Journal of Plant Sciences 7: 259-266. Suwannoi, S., Kanchanaketu, T., Kusolkumbot, P., Sangduen, N. and Hongtrakul, V. 2012. DNA methylation and genetic study of interspecific hybridization in Jatropha curcas L. Genomics and Genetics 4(2): 94-105. Taheri, S., Abdullah, T., Abdullah, N. and Ahmad, Z. 2012. Genetic relationships among five varieties of Curcuma alismatifolia (Zingiberaceae) based on ISSR markers. Genet. Mol. Res 11(3): 3069-3076. Anuntalabhochai, S., Sitthiphrom, S., Thongtaksin, W., Sanguansermsri, M. and Cutler, R. 2007. Hybrid detection and characterization of Curcuma spp. using sequence characterized DNA markers. Scientia horticulturae 111(4): 389-393.

264 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

การถ่ายยีน Rc ที่ควบคุมการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดินเข้าสู่ข้าว Transformation of Rc Gene Regulating Proanthocyanidin Biosynthesis into Rice

รอยพิมพ์ สุขเกษม1 แสงทอง พงษ์เจริญกิต1 ศรีเมฆ ชาวโพงพาง2 วราภรณ์ แสงทอง1 และช่อทิพา สกูลสิงหาโรจน์1* Roypim Sukkasam1, Saengtong Pongjaroenkit1, Srimek Chowpongpang2, Varaporn Sangtong1 and Chotipa Sakulsingharoj1* 1สาขาวิชาพันธุศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 2ส านักงานพัฒนาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีแห่งชาติ อุทยานวิทยาศาสตร์ประเทศไทย ปทุมธานี 12120 1Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 2National Science and Technology Development Agency, Thailand Science Park, Pathum Thani, Thailand 12120 *Corresponding author: [email protected]

บทคัดย่อ

ข้าวที่มีเยื่อหุ้มเมล็ดสีแดงเกิดจากยีนควบคุมที่ส าคัญ คือ ยีน Rc ซึ่งเป็นรหัสของโปรตีนทรานสคริปชันแฟคเตอร์ ควบคุมการแสดงออกของยีนโครงสร้างในวิถีการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดิน งานวิจัยนี้ศึกษาการถ่ายยีน Rc จากข้าวพันธุ์หอมแดงสุโขทัย 1 ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ dual P35S และเทอร์มิเนเตอร์ Tnos เข้าสู่แคลลัส ข้าวพันธุ์ Kitaake (เยื่อหุ้มเมล็ดสีขาว) ด้วยอะโกรแบคทีเรียม ท าการตรวจสอบประสิทธิภาพการถ่ายยีนด้วยวิธี GUS assay พบแคลลัสเกิดสีฟ้าสูงสุดร้อยละ 30 แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพการถ่ายยีนเข้าสู่แคลลัสข้าวไม่สูงเท่าที่ควร และการ รอดของแคลลัสบนอาหารคัดเลือกสูงสุดร้อยละ 76.19 เมื่อน าแคลลัสที่รอดจากการคัดเลือกมาเพาะเลี้ยงบนอาหาร สูตรชักน าให้เกิดต้น พบการเกิดจุดเขียวคิดเป็นร้อยละ 5 และพัฒนาเป็นต้นได้ทั้งหมด 7 ต้น แต่ต้นที่ได้ไม่สามารถ พัฒนาต่อไปได้ อาจเกิดจากความเข้มข้นของสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซินที่ใช้คัดเลือกในการถ่ายยีนไม่เหมาะสม เมื่อน าจีโนมิกดีเอ็นเอจากแคลลัสที่เกิดจุดเขียวมาตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์พบว่า มีการแทรกตัวของชุดยีน Rc ที่ถ่ายเข้าสู่ข้าว ลักษณะแคลลัสที่ได้เกิดจุดเขียวแต่ไม่เกิดสีแดงจากการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดิน ผลที่ได้แสดง ให้เห็นว่าการท างานของยีน Rc อาจต้องท างานร่วมกับยีนโครงสร้างอื่นๆ เพื่อท าให้เกิดการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดิน

ค าส าคัญ: ข้าว การถ่ายยีน อะโกรแบคทีเรียม ยีน Rc โปรแอนโทไซยานิดิน

Abstract

The red pericarp in rice is controlled by a regulatory Rc gene encoding transcription factor that regulates expression of structural genes in proanthocyanidin biosynthesis pathway. In this study, cloning of the Rc gene from Hom Dang Sukhothai 1 was constructed under the control of dual 35S Promoter and nos Terminator and transformed into calli of rice cv. Kitaake (white pericarp rice). The transformed calli showed 30% GUS positive, indicating quite low efficiency of transformation.

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 273 Hygromycin-resistant calli of 76.19% survived on selection medium. Five percent of surviving calli could develop green spots and regenerate to seven plantlets. However, the transformed rice plants could not survive, probably due to inappropriate concentration of hygromycin during selection. The genomic DNA of calli developing green spots were subjected to PCR. The results showed that the transformed Rc gene was integrated into rice calli; however, calli with the red color resulting from proanthocyanidin biosynthesis were not found. The result suggested that proanthocyanidin biosynthesis might require the functional Rc gene and other structural genes for red pigmentation.

Keywords: rice, transformation, Agrobacterium, Rc gene, proanthocyanidins

ค าน า

ข้าวที่มีเยื่อหุ้มเมล็ดสีด าและแดงมีสารแอนโทไซยานินและโปรแอนโทไซยานิดินเป็นส่วนประกอบ ซึ่งจัดเป็น สารฟลาโวนอยด์ โดยกระบวนการสังเคราะห์ฟลาโวนอยด์แบ่งออกเป็นการสังเคราะห์สารกลุ่มแอนโทไซยานิน ได้แก่ cyanidin-3-O-glucoside และ peonidin-3-glucoside (P3G) ที่ท าให้เกิดการสะสมสารสีด าหรือม่วงในเยื่อหุ้มเมล็ด (Rahman et al., 2016) นอกจากนั้น ยังมีการสังเคราะห์สารกลุ่มโปรแอนโทไซยานิดิน ได้แก่ procyanidin ในเยื่อ หุ้มเมล็ดสีแดง โดยข้าวที่มีเยื่อหุ้มเมล็ดเป็นสีต่างๆ เช่น น้ าตาล แดง และม่วง มีคุณสมบัติในการต้านการเกิดปฏิกิริยา ออกซิเดชัน (antioxidant) ช่วยการหมุนเวียนของกระแสโลหิต ต้านอนุมูลอิสระ ชะลอการเสื่อมของเซลล์ร่างกาย ช่วยป้องกันโรคหัวใจและท าให้ดูอ่อนกว่าวัย (Sweeney et al., 2006) การสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดินในข้าวเกี่ยวข้องกับยีนควบคุม คือ ยีน Rc ตั้งอยู่บนโครโมโซมคู่ที่ 7 มีรหัสสร้างทรานสคริพชันแฟคเตอร์ชนิด basic helix-loop-helix (bHLH) ส่วนใหญ่ในข้าวขาวพบยีน rc เป็นอัลลีลด้อย เนื่องจากเกิดการขาดหายไป 14 คู่เบส (Furukawa et al., 2007; Lim and Ha, 2013; Sweeney et al., 2006) การศึกษาในข้าวไทยพบว่า ยีน Rc ในข้าวขาวและด า เกิดการขาดหายไป 14 คู่เบส ในบริเวณเอกซอน ที่ 7 ท าให้เกิดรหัสหยุดก่อนก าหนดซึ่งมีผลต่อบริเวณ DNA-binding domain ที่เป็น bHLH ท าให้ยีนท าหน้าที่ไม่ได้ ในขณะที่ยีน Rc สามารถท างานได้ในข้าวที่มีเยื่อหุ้มเมล็ดสีแดง (รอยพิมพ์ และคณะ, 2558) การเกิดสีแดงในเยื่อหุ้ม เมล็ดข้าวเกิดจากการท างานร่วมกันของยีน Rc ซึ่งเป็นยีนควบคุม และยีน Rd ซึ่งเป็นยีนโครงสร้างที่มีรหัสสร้าง เอนไซม์ dihydroflavonol 4-reductase (DFR) ยีน Rc ท าให้เกิดเยื่อหุ้มเมล็ดข้าวสีน้ าตาล นอกจากนี้ ยีน Rd ช่วย ส่งเสริมให้มีการเพิ่มการสร้างสีในเมล็ดข้าวท าให้เกิดสีแดง (Furukawa et al., 2007) ในระบบการส่งถ่ายยีนมีการใช้ยีนต้านสารปฏิชีวนะและยีนต้านสารปราบวัชพืช มาใช้เป็นยีนเครื่องหมาย คัดเลือก ซึ่งท าให้เกิดข้อกังวลในหลายด้าน ดังนั้น จึงมีการพัฒนาระบบการถ่ายยีน เช่น การใช้ยีนสร้างสีเพื่อช่วยใน การคัดเลือกเซลล์พืชที่ได้รับยีน ซึ่งจะเป็นการลดข้อกังวลในเรื่องของการถ่ายทอดยีนต้านสารปฏิชีวนะและสารปราบ วัชพืช ในพืชที่ท าการดัดแปลงพันธุกรรมออกไปสู่สิ่งแวดล้อม (Sah et al., 2014) ดังนั้น การศึกษาหน้าที่ของยีนควบคุมการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดิน เพื่อท าให้เข้าใจการสังเคราะห์ โปรแอนโทไซยานิดินในข้าว จะเป็นประโยชน์ต่อการปรับปรุงพันธุ์ข้าว โดยใช้เป็นยีนเครื่องหมายส าหรับการคัดเลือก ในระบบการถ่ายยีนและในการระบุพันธุ์ข้าวท าให้สามารถคัดเลือกข้าวได้ตั้งแต่ยังไม่ออกดอกติดเมล็ด และช่วยเพิ่ม สารอาหารโดยเฉพาะสารต้านอนุมูลอิสระ เป็นสารที่มีประโยชน์และช่วยเพิ่มมูลค่าของผลผลิตข้าวได้ 274 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

อุปกรณ์และวิธีการ

การสร้าง construct ของยีน Rc น ายีน Rc ซึ่งแยกได้จากเมล็ดอ่อนของข้าวพันธุ์หอมแดงสุโขทัย 1 ที่มีเยื่อหุ้มเมล็ดสีแดง มาสร้างชุดยีน โดย โคลนยีน Rc เข้าสู่พลาสมิด p2CA ซึ่งมีส่วนของ dual 35S promoter ท าให้มีการแสดงออกของยีนอย่างสูงและ ตลอดเวลาในทุกเนื้อเยื่อพืช (constitutive expression) และส่วนของ nos terminator ส่วนประกอบทั้งหมดนี้จะใช้ สร้างชุดยีน (expression cassette) ของยีน Rc ซึ่งประกอบด้วยยีน Rc ท างานภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ dual 35S และเทอร์มิเนเตอร์ nos (dual P35S::Rc::Tnos) แล้วโคลนชุดยีนที่ได้เข้าสู่ T-DNA vector คือ pCAMBIA 1305.1 เพื่อสร้างพลาสมิด construct ชื่อ p1305.1SKHDSRc 2.57.1.1 (Figure 1) และน า construct ที่มีชุดยีน Rc ถ่ายฝากเข้าสู่อะโกรแบคทีเรียม เพื่อใช้ส าหรับการถ่ายยีนเข้าสู่ข้าวโดยใช้อะโกรแบคทีเรียม การถ่ายยีนเข้าสู่แคลลัสของข้าว น าเมล็ดแก่ของข้าวพันธุ์ Kitaake ซึ่งเป็นข้าว indica ที่มีเยื่อหุ้มเมล็ดสีขาว มาชักน าให้เกิดแคลลัส โดย เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร N6D ดัดแปลง (Toki, 1997) ในที่มืด อุณหภูมิ 28±2oซ. เป็นเวลา 4-5 สัปดาห์ แล้วย้าย แคลลัสมาเพาะเลี้ยงบนอาหารใหม่สูตรเดิมเป็นเวลา 3 วัน และน าไปถ่ายยีนโดยใช้อะโกรแบคทีเรียมสายพันธุ์ EHA105 ที่มีพลาสมิด p1305.1SKHDASRc 2.57.1.1 ซึ่งมีชุดยีน dual P35S::Rc::Tnos มียีน hptII ซึ่งเป็นยีน ต้านทานสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซินเป็นยีนเครื่องหมายส าหรับการคัดเลือกเนื้อเยื่อพืชที่ได้รับยีน และยีน gusA เป็นยีน รายงานผล ท าการถ่ายยีนตามวิธีดัดแปลงจาก Endo et al. (2002) และ Sakulsingharoj et al. (2015) สุ่มแคลลัส หลังผ่านการเพาะเลี้ยงร่วม มาตรวจสอบการแสดงออกของยีน gusA ด้วยเทคนิค GUS assay (Jefferson, 1987) น า แคลลัสมาเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรคัดเลือกที่มีสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซิน ร่วมกับไทแมนทิน เป็นเวลา 1 เดือน แล้ว ย้ายแคลลัสที่รอดบนอาหารคัดเลือก เพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรชักน าให้เกิดต้นที่มีสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซิน ร่วมกับ ไทแมนทิน และน าแคลลัสที่รอดจากการคัดเลือกมาตรวจสอบการแสดงออกของยีน gusA ด้วยเทคนิค GUS assay การวิเคราะห์แคลลัสที่ได้รับยีน Rc โดยเทคนิคพีซีอาร์ น าแคลลัสที่ได้รับการถ่ายยีนมาสกัดจีโนมิกดีเอ็นเอด้วยวิธี CTAB ดัดแปลง (Hwang and Kim, 2000) และ วิเคราะห์ด้วยเทคนิคพีซีอาร์โดยใช้ไพรเมอร์ที่จ าเพาะต่อยีน Rc คือ OsRc1450 rev_F: GCCTTGTCACTCTTGGCATT และที่จ าเพาะต่อบริเวณ Tnos คือ Tnos_R: GCGTATTAAATGTATAATTGCG GGAC ซึ่งมีส่วนประกอบของ ปฏิกิริยาพีซีอาร์ คือ 1x MyTaq™ Red Mix (Bioline, USA), 0.5 µM OSRc1450 rev_F, 0.5 µM Tnos_R และ 50-100 ng จีโนมิกดีเอ็นเอ โดยสภาวะของพีซีอาร์ มีดังต่อไปนี้ โดยที่อุณหภูมิ 95oซ. เป็นเวลา 3 นาที ปฏิกิริยา จ านวน 30 รอบ โดยที่อุณหภูมิ denaturation 95oซ. เป็นเวลา 1 นาที annealing 55oซ. เป็นเวลา 1 นาที extension 72oซ. เป็นเวลา 1 นาที และ final extension 72oซ. เป็นเวลา 5 นาที หลังจากนั้น น าผลผลิตของ พีซีอาร์มาวิเคราะห์ด้วยเทคนิคอะกาโรสเจลอิเล็กโทรฟอริซิส โดยแถบดีเอ็นเอที่คาดหวังมีขนาดประมาณ 800 คู่เบส

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 275 ผลการวิจัย

การถ่ายยีน Rc เข้าสู่แคลลัสของข้าว จากการโคลนยีน Rc ได้จากข้าวพันธุ์หอมแดงสุโขทัย 1 แล้วน ามาสร้างชุดยีน dual P35S::Rc::Tnos และ เชื่อมชุดยีนเข้ากับพลาสมิด pCAMBIA1305.1 ท าให้ได้ construct คือ p1305.1 SKHDASRc 2.57.1.1 (Figure 1) และถ่ายฝากเข้าสู่อะโกรแบคทีเรียมสายพันธุ์ EHA105 เพื่อน าไปใช้ถ่ายยีนเข้าสู่แคลลัสของข้าวต่อไป

Figure 1 Schematic representation of T-DNA region of p1305.1 SKHDASRc 2.57.1.1 plasmid harboring the Rc gene expression cassette which was cloned in the binary vector pCAMBIA1305.1. LB: left border, RB: right border, dual 35SP: dual 35S Promoter, Tnos; nos terminator, 35ST: 35S terminator, hptII: hygromycin phosphotransferase gene, GUSPlus: β -glucuronidase gene. H and E: HindIII and EcoRI restriction sites

เมื่อท าการถ่ายยีน Rc เข้าสู่แคลลัสข้าวพันธุ์ Kitaake ซึ่งมีเยื่อหุ้มเมล็ดสีขาวด้วยอะโกรแบคทีเรียมทั้งหมด 4 ครั้ง หลังจากท าการเพาะเลี้ยงร่วมเป็นเวลา 3 วัน น าแคลลัสมาท าการตรวจสอบประสิทธิภาพการถ่ายยีนด้วยวิธี GUS assay พบว่า แคลลัสที่เกิดจุดสีฟ้าสูงสุดร้อยละ 30 (Table 1 และ Figure 2) เมื่อท าการเพาะเลี้ยงแคลลัสข้าว บนอาหารคัดเลือกที่มีสารปฎิชีวนะไฮโกรมัยซิน เป็นเวลา 4 สัปดาห์ พบว่า แคลลัสรอดบนอาหารคัดเลือกสูงสุดคิด เป็นร้อยละ 76.19 (Table 2) และน าแคลลัสที่รอดจากการคัดเลือกมาเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรชักน าให้เกิดต้น พบ การเกิดจุดเขียวคิดเป็นร้อยละ 5 จากจุดเขียวพัฒนาเป็นยอดใช้เวลาประมาณ 4 สัปดาห์ (Figure 3A) และยอดพัฒนา เป็นต้นได้ทั้งหมด 7 ต้น แต่ต้นที่พัฒนาไม่เจริญและมักตายในช่วงสัปดาห์ที่ 8 ( Figure 3B)

Table 1 Efficiency of transformation into rice cv. Kitaake after 3-day co-cultivation tested by GUS assay

Total number of calli Number of GUS- Percentage of GUS- Experiments tested positive calli positive calli 1 10 2 20 2 10 3 30 3 10 2 20 4 10 3 30

276 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

Figure 2 Transient GUS expression in calli of rice cv. Kitaake after 3-day co-cultivation. A: untransformed (control) callus. B: transformed callus.

Table 2 Transformation efficiency of rice cv. Kitaake mediated by Agrobacterium strain EHA105 harboring plasmid p1305.1SKHDASRc 2.57.1.1

Total The number of The number of Total number of Experiments number of survivng calli on calli developing regenerated inoculated selection medium greeen spots plantlets calli 1 120 80/120 (66.67) 2/80 (2.50) 1/80 (1.25) 2 105 73/105 (69.52) 1/73 (1.37) 1/73 (1.37) 3 105 80/105 (76.19) 4/80 (5) 4/80 (5) 4 90 68/90 (75.56) 1/68 (1.47) 1/68 (1.47)

The numbers in parenthesis were percentage.

Figure 3 Regeneration of shoots from transformed calli of rice cv. Kitaake. A and B were calli Figure 3 cultured on regeneration medium for 4 and 8 weeks, respectively (subcultured every Figure 3 two weeks). Bar = 1 cm

ถึงแม้ว่าลักษณะแคลลัสและต้นข้าวที่ได้จากการถ่ายยีนมีลักษณะปกติเหมือน wild-type คือ แคลลัสมี ลักษณะสีเหลือง เมื่อชักน าให้เกิดเป็นต้นแคลลัสพัฒนาเกิดจุดสีเขียว และไม่พบจุดสีแดง แต่เมื่อน าแคลลัสที่เพาะเลี้ยง บนอาหารชักน าให้เกิดต้น ที่มีไฮโกรมัยซินความเข้มข้น 30 มิลลิกรัมต่อลิตร และไทเมนทินความเข้มข้น 150 มิลลิกรัม

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 277 ต่อลิตร เป็นเวลา 4 สัปดาห์ มาทดสอบด้วยวิธี GUS assay พบว่า แคลลัลที่เกิดจุดสีเขียวติดสีฟ้า แสดงให้เห็นว่า แคลลัสได้รับยีนจากการถ่ายยีน (Figure 4)

Figure 4 GUS expression on transformed calli of rice cv. Kitaake on regeneration medium Figure 4 containing 30 mg/l hygromycin and 150 mg/l timentin. A-D: transformed rice calli Figure 4 from experiments 1-4 respectively. Control: untransformed rice calli.

การวิเคราะห์แคลลัสที่ได้รับยีนโดยเทคนิคพีซีอาร์ เมื่อน าจีโนมิกดีเอ็นเอของแคลลัสที่รอดและเจริญบนอาหารชักน าให้เกิดยอดที่มีสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซิน ร่วมกับไทเมนทิน และมีการแสดงออกของยีน gusA (Figure 4) มาตรวจสอบการแทรกตัวของชุดยีน Rc โดยใช้ ไพรเมอร์ที่จ าเพาะต่อยีน Rc และที่จ าเพาะต่อบริเวณ Tnos ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่า แคลลัลข้าวที่เกิดจุดสีฟ้าที่ น ามาตรวจสอบเกิดแถบดีเอ็นเอขนาดประมาณ 800 คู่เบส (Figure 5) แสดงว่า มีการแทรกตัวของชุดยีน Rc ใน แคลลัสข้าวที่ได้รับการถ่ายยีน

Figure 5 PCR analysis of transformed calli of rice cv. Kitaake using primers specific to Rc gene and Tnos. Lane M: 1 kb DNA Ladder, Lane P: plasmid p1305.1 SKHDASRc 2.57.1.1 (positive control), Lanes 1-3: transformed calli from experiments# 1-3, respectively. Lane Kit: wild- type plant of Kitaake (negative control). Lane N: distilled water

278 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

วิจารณ์และสรุปผลการวิจัย

จากการสร้าง construct คือ p1305.1 SKHDASRc 2.57.1.1 ซึ่งมีชุดยีน dual P35S::Rc::Tnos ที่ ประกอบด้วยยีน Rc จากเมล็ดอ่อนของข้าวพันธุ์หอมแดงสุโขทัย 1 ภายใต้การควบคุมของ dual 35S Promoter และ nos Terminator ที่มียีนต้านทานสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซิน (hptII) เป็นยีนเครื่องหมายส าหรับคัดเลือกแคลลัสที่ได้รับ ยีน และยีน gusA เป็นยีนรายงานผล แล้วส่งถ่ายเข้าสู่อะโกรแบคทีเรียม ท าการถ่ายยีน Rc เข้าสู่แคลลัสข้าวพันธุ์ Kitaake ซึ่งมีเยื่อหุ้มเมล็ดสีขาวด้วยอะโกรแบคทีเรียม เมื่อตรวจสอบประสิทธิภาพการถ่ายยีนด้วยวิธี GUS assay พบว่า แคลลัสข้าวมีการแสดงออกของยีน gusA ค่อนข้างน้อย ซึ่งมีแคลลัสที่เกิดจุดสีฟ้าร้อยละ 30 ซึ่งแสดงให้เห็นถึง ประสิทธิภาพการถ่ายยีนเข้าสู่แคลลัสข้าวไม่สูงเท่าที่ควร และเมื่อท าการเพาะเลี้ยงแคลลัสบนอาหารคัดเลือกที่มี สารปฎิชีวนะไฮโกรมัยซิน เป็นเวลา 4 สัปดาห์ พบว่า แคลลัสรอดบนอาหารคัดเลือกสูงสุดคิดเป็นร้อยละ 76.19 จากนั้นย้ายแคลลัสที่รอดมาเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตรชักน าให้เกิดต้น แคลลัสที่ต้านทานสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซินเกิด จุดเขียวสูงสุดคิดเป็นร้อยละ 5 การชักน าจากจุดเขียวพัฒนาเป็นต้นใช้เวลา 4 สัปดาห์ แต่ต้นที่พัฒนาขึ้นมักตายในช่วง สัปดาห์ที่ 8 โดยคาดว่าอาจเกิดจากความเข้มข้นของสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซินที่ใช้ในการคัดเลือกในการถ่ายยีนไม่ เหมาะสมกับพันธุ์ข้าว Kitaake สอดคล้องกับการศึกษาของ Li et al. (2015) พบว่า ประสิทธิภาพการถ่ายยีนและ ความสามารถชักน าให้เกิดต้นของข้าว Japonica ในตอนเหนือของจีน จ านวน 6 สายพันธุ์ มีความแตกต่างกันในการ คัดเลือกแคลลัสที่ได้รับการถ่ายยีนบนอาหาร N6D-S medium ที่มีสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซิน 30 มิลลิกรัมต่อลิตร และความสามารถชักน าให้เกิดต้นที่มีสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซิน 25 มิลลิกรัมต่อลิตร เหมาะส าหรับข้าวพันธุ์ SN9816 มากกว่าพันธุ์อื่น นอกจากนี้ ยังมีการทดสอบความเข้มข้นสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซินที่เหมาะสมต่อการคัดเลือกของ ข้าวพันธุ์ Taichung 65 โดยความเข้มข้นสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซิน 50 มิลลิกรัมต่อลิตร เหมาะสมต่อการคัดเลือก ข้าวพันธุ์ Taichung 65 ที่ได้รับการถ่ายยีน (Asanori et al., 2001; Sakulsingharoj et al., 2015) เมื่อน าจีโนมิกดีเอ็นเอของแคลลัสที่ต้านทานต่อสารปฏิชีวนะไฮโกรมัยซินและเกิดสีฟ้า จากการทดสอบด้วย วิธี GUS assay มาตรวจสอบด้วยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่า มีการแทรกตัวของชุดยีน Rc ในแคลลัส แต่แคลลัสที่ได้รับการ ถ่ายยีนมีลักษณะจุดเขียวไม่มีสีแดงจากการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดิน อาจเนื่องมาจากข้าวพันธุ์ Kitaake มียีนด้อย rd ซึ่งเป็นยีนโครงสร้างส าคัญที่มีรหัสส าหรับสร้างเอนไซม์ DFR ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดิน จึงท าให้ไม่สามารถสร้างสีแดงที่เกิดจากโปรแอนโทไซยานิดิน สอดคล้องกับการศึกษาของ Sweeney et al. (2006) ที่ ศึกษาถึงความสัมพันธ์ของการท างานร่วมกันระหว่างยีน Rc และ Rd กรณีที่ยีนทั้ง 2 ท างาน (จีโนไทป์แบบ Rc_Rd_) ท าให้เกิดเยื่อหุ้มเมล็ดสีแดงในข้าว ในขณะที่ยีน rd เป็นอัลลีลด้อยไม่สามารถท างานร่วมกับยีน Rc ได้ (จีโนไทป์แบบ Rc_rdrd) จะผลิตสารสีน้ าตาลที่เยื่อหุ้มเมล็ด ดังนั้น แสดงว่ายีน Rd ช่วยส่งเสริมการท างานของการสร้างสารสีแดงให้ มีการแสดงออกมากขึ้น มีรายงานว่า ยีน Rd ที่สูญเสียหน้าที่หรือไม่สามารถท างานได้นั้นส่งผลกระทบต่อการเกิดสีแดง (Furukawa et al., 2007) ดังนั้น ควรศึกษาการท างานของยีน Rc และ Rd ในการควบคุมหรือส่งผลต่อการแสดงออกของยีนโครงสร้าง ต่างๆ ในการสังเคราะห์โปรแอนโทไซยานิดิน เพื่อน าไปใช้ประโยชน์ส าหรับเป็นยีนรายงานผลหรือเป็นยีนเครื่องหมาย ส าหรับการคัดเลือกในระบบการถ่ายยีนในข้าว และน าไปประยุกต์ใช้เป็นยีนเครื่องหมายในการปรับปรุงพันธุ์ข้าว ในระดับโมเลกุลให้มีคุณค่าทางโภชนาการสูงขึ้นในอนาคต

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 279 กิตติกรรมประกาศ

ขอขอบพระคุณทุนอุดหนุนวิจัยจากส านักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ ผ่านส านักวิจัยและส่งเสริมวิชาการ การเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ประจ าปี พ.ศ. 2559 และขอขอบพระคุณส านักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ ที่ให้ ทุนอุดหนุนการวิจัย ประเภทบัณฑิตศึกษา ประจ าปี พ.ศ. 2558 แก่นางสาวรอยพิมพ์ สุขเกษม

เอกสารอ้างอิง

รอยพิมพ์ สุขเกษม แสงทอง พงษ์เจริญกิต ศรีเมฆ ชาวโพงพาง วราภรณ์ แสงทอง ยุพเยาว์ คบพิมาย และช่อทิพา สกูลสิงหาโรจน์. 2558. การขาดหายของนิวคลีโอไทด์ 14 คู่เบสในยีน Rc ท าให้เกิดการกลาย พันธุ์แบบเฟรมชิฟท์ในข้าวขาวและด า. น. 282-288. ใน รายงานการประชุมวิชาการพันธุศาสตร์แห่งชาติ ครั้งที่ 19. “พันธุศาสตร์และจีโนมิกส์; จากการศึกษาระดับโมเลกุลสู่การประยุกต์” 15-17 กรกฎาคม 2558. โรงแรมเซ็นทารา แอนด์ คอนเวนชั่นเซนเตอร์ ขอนแก่น จ.ขอนแก่น. Asanori, Y. A. R. A., Otani, M., Kusumi, K., Matsuda, O., Shimada, T., and Koh, I. B. A. 2001. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant biotechnology 18(4): 305-310. Endo, S., K. Sugita and H. Ebinuma. 2002. Single-step transformation for generating marker-free transgenic rice using the ipt-type MAT vector system. Plant J. 30: 115-122. Furukawa, T., Maekawa, M., Oki, T., Suda, I., Iida, S., Shimada, H. and Kadowaki, K. I. 2007. The Rc and Rd genes are involved in proanthocyanidin synthesis in rice pericarp. The Plant Journal 49(1): 91-102. Hwang, S.K. and Y.M. Kim. 2000. A simple and reliable method for preparation of cross- contamination-free plant genomic DNA for PCR-based detection of transgenes. J Biochem Mol Biol. 33: 537-546. Jefferson, R.A. 1987. Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5: 387-405. Li, D., Xu, H., Sun, X., Cui, Z., Zhang, Y., Bai, Y. and Chen, W. 2015. Differential transformation efficiency of Japonica rice varieties developed in northern China. Crop Breeding and Applied Biotechnology 15(3): 162-168. Lim, S. H., and Ha, S. H. 2013. Marker development for the identification of rice seed color. Plant Biotechnology reports 7(3): 391-398. Sah, S. K., Kaur, A. and Singh, J. 2014. High frequency embryogenic callus induction and whole plant regeneration in Japonica rice cv. kitaake. Rice Research: (Open Access) 2: 125.

280 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

Sakulsingharoj, C., Phanlumpak, K., Inta, P., Pongjaroenkit, S., and Sangtong, V. 2015. Transformation of rice (Oryza sativa) cultivar Taichung 65 mediated by Agrobacterium tumefaciens. pp. 189-196. In Biology Education and Research in a Changing Planet. Singapore: Springer. Sweeney, M. T., Thomson, M. J., Pfeil, B. E., and McCouch, S. 2006. Caught red-handed: Rc encodes a basic helix-loop-helix protein conditioning red pericarp in rice. The Plant Cell 18(2): 283-294. Rahman, M. M., Lee, K. E., and Kang, S. G. 2016. Allelic Gene Interaction and Anthocyanin Biosynthesis of Purple Pericarp Trait for Yield Improvement in Black Rice. Journal of Life Science 26(6): 727-736. Toki, S. 1997. Rapid and efficient Agrobacterium–mediated transformation in rice. Plant Mol Biol. 15: 16-21.

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 281 ปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกในข้าวไทย Amylose Content and Gel Consistency of Thai Rice

ยุพเยาว์ คบพิมาย1* ปณิธาน คงเทศ2 อรพิณ พะเก่พอ2 เจษฎา สายสุภา2 ศักรินทร์ ชัยทา2 ภานุวัฒน์ สะทองปา2 ศิริกัญญา สวัสชัย2 กฤษฎา โนวะ2 สิริมา สุวรัตน์1 วิวัฒน์ หวังเจริญ3 วราภรณ์ แสงทอง1 และศรัณย์ จีนะเจริญ4 Yuppayao Kophimai1*, Panitan Kongted2, Orrapin Pakaepor2, Jessada Saisupa2, Sakkarin Chaita2, Panuwat Sathongpa2, Sirikanya Sawatchai2, Kritsada Nowa2, 1 3 1 4 Sirima Suwarat , Wiwat Wangcharoen , Varaporn Sangtong and Saran Cheenacharoen 1สาขาวิชาพันธุศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 2สาขาวิชาพืชไร่ คณะผลิตกรรมการเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 3สาขาวิชาวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีการอาหาร คณะวิศวกรรมและอุตสาหกรรมการเกษตร มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 4ภาควิชาชีววิทยา คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี มหาวิทยาลัยราชภัฏเชียงใหม่ เชียงใหม่ 50300 1Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 2Department of Agronomy, Faculty of Agricultural Production, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 3Department of Science and Food Science, Faculty of Engineering and Ago-Industry, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 4Department of Biology, Faculty of Science and Technology, Chiang Mai Rajabhat University, Chiang Mai, Thailand 50300 *Corresponding author: [email protected]

บทคัดย่อ

ปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกเป็นตัวก าหนดคุณภาพการหุงต้มและเนื้อสัมผัสของข้าว งานวิจัยนี้จึงต้องการศึกษาปริมาณอะไมโลส ค่าความคงตัวของแป้งสุก และความสัมพันธ์ระหว่างสองลักษณะนี้ในข้าว พันธุ์ต่างๆ จ านวน 114 ตัวอย่าง และเปรียบเทียบปริมาณอะไมโลสและค่าความคงตัวของแป้งสุกระหว่างข้าวที่ปลูก ฤดูนาปีและนาปรังจ านวน 35 ตัวอย่าง พบว่าข้าวเหนียวมีปริมาณอะไมโลสต่ า (4.15-8.52 เปอร์เซ็นต์) และมีค่า ความคงตัวของแป้งสุกอ่อน (ระยะทางการไหลของแป้งสุก 97.67-125.67 มม.) ส่วนข้าวเจ้ามีการกระจายตัวของ ค่าทั้งสองในช่วงกว้าง โดยมีปริมาณอะไมโลส 12.40-31.80 เปอร์เซ็นต์ และมีความคงตัวของแป้งสุกตั้งแต่ 24.67- 150.67 มม. ปริมาณอะไมโลสกับค่าความคงตัวของแป้งสุกมีความสัมพันธ์กันในเชิงบวก (ข้าวเหนียว r=0.359, p=0.0137 และข้าวเจ้า r=0.135, p=0.0258) และพบว่าปริมาณอะไมโลสและค่าความคงตัวของแป้งสุกของข้าว ที่ปลูกนาปีและนาปรังไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยส าคัญทางสถิติ ผลการวิจัยที่ได้สามารถน าไปใช้เป็นข้อมูล ในการคัดเลือกพันธุ์ข้าวส าหรับการศึกษายีนที่ควบคุมปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกในข้าวไทย

ค าส าคัญ: ข้าว อะไมโลส ความคงตัวของแป้งสุก

282 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

Abstract

Amylose content and gel consistency influence on cooking quality and texture of cooked rice. This research aimed to study amylose content, gel consistency and a correlation between amylose content and gel consistency among 114 rice samples. Moreover, we also compared those two traits among 35 rice samples planted in season and off season. The results showed that waxy rice samples had low amylose content (4.15-8.52%) and soft gel consistency (length of gel 97.67-125.67 mm), while the two traits varied widely among samples of nonwaxy rice with amylose content ranging from 12.40-31.80% and gel consistency ranging from 24.67-150.67 mm. The correlations between amylose content and gel consistency were positive with r=0.359 (p=0.0137) in waxy rice and r=0.135 (p=0.0258) in nonwaxy rice. Furthermore, amylose content and gel consistency of rice grown in season and off season were not significantly different. These data are helpful in selecting of rice samples for determining gene controlling amylose content and gel consistency of Thai rice.

Keywords: rice, amylose content, gel consistency

ค าน า

ข้าวเป็นพืชอาหารหลักและพืชเศรษฐกิจที่ส าคัญของประเทศไทย และมีผลผลิตประมาณปีละ 25 ล้านตัน (สมาคมผู้ส่งออกข้าวไทย, 2560) ข้าวยังเป็นพืชอาหารที่ส าคัญของโลก โดยพลังงานจากข้าวคิดเป็น 21% ของปริมาณ พลังงานที่ได้จากการบริโภคอาหารของคนทั้งโลก และคิดเป็น 76% ของชาวเอเชียตะวันออกเฉียงใต้ คุณภาพการหุงต้มและการรับประทานของข้าวแต่ละพันธุ์ เป็นปัจจัยส าคัญต่อการตัดสินใจเลือกบริโภคของผู้ ซื้อและเป็นตัวก าหนดราคาข้าว โดยเฉพาะปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกเป็นตัวก าหนดลักษณะเนื้อ สัมผัสของข้าวสุก ข้าวที่มีปริมาณอะไมโลสสูงเมื่อหุงต้มต้องการน้ ามาก เมล็ดข้าวขยายตัวมาก ข้าวร่วนไม่ติดกัน จึงหุง ขึ้นหม้อ ส่วนข้าวที่มีปริมาณอะไมโลสต่ าต้องการน้ าน้อยเมื่อหุง เมล็ดข้าวขยายตัวน้อย ข้าวนุ่มเหนียว หุงขึ้นหม้อน้อย กว่าข้าวที่มีปริมาณอะไมโลสสูง (งามชื่น, 2547) ปริมาณอะไมโลสในเมล็ดข้าวแบ่งออกเป็น 4 ระดับ คือ 0-9% เป็นข้าว เหนียว 10-19% เป็นข้าวเจ้าอะไมโลสต่ า เมื่อหุงสุกจะเหนียวนุ่ม แต่แฉะง่าย 20-25% เป็นข้าวเจ้าอะไมโลสปานก ลาง เมื่อหุงสุกข้าวค่อนข้างอ่อน และอะไมโลสมากกว่า 25% เป็นข้าวเจ้าอะไมโลสสูง เมื่อหุงสุกข้าวจะร่วนไม่ติดกัน (เชาวนีพร และคณะ, 2558) แม้ว่าปริมาณอะไมโลสจะมีผลต่อความแข็งของข้าวสุก แต่ข้าวที่มีปริมาณอะไมโลสเท่ากันอาจมีความแข็ง แตกต่างกันเนื่องจากแป้งสุกมีอัตราการคืนตัวไม่เท่ากัน ค่าที่ใช้เปรียบเทียบระดับความแข็งของข้าวที่มีปริมาณ อะไมโลสเท่ากันคือ ความคงตัวของแป้งสุก โดยพิจารณาจากระยะทางที่แป้งสุกไหลในขณะที่แป้งเย็นตัว ข้าวที่มี ระยะทางไหลของแป้งมากจะอ่อนนุ่มกว่าข้าวที่มีระยะทางไหลของแป้งน้อย ความคงตัวของแป้งสุก แบ่งออกเป็น 3 ระดับ

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 283 คือ ระยะทางแป้งไหลน้อยกว่า 40 มม. จะมีความคงตัวแป้งสุกแข็ง ระยะทางแป้งไหล 40-60 มม. ความคงตัวแป้งสุก ปานกลาง และหากแป้งไหลมากกว่า 60 มม. จัดเป็นความคงตัวแป้งสุกอ่อน (Cuevas and Fitzgerald, 2012) Zhang et al. (2012) รายงานว่ายีน Waxy ควบคุมลักษณะปริมาณอะไมโลสในข้าว และมี 5 รูปแบบ (อัลลีล) คือ Wxa Wxb Wxop Wxin และ wx โดยปริมาณอะไมโลสในข้าวจะมีมากเมื่อมีอัลลีล Wxa Wxin Wxb Wxop และ wx ตามล าดับ (Mikami et al., 2008) นอกจากนี้จากการศึกษาของ Su et al. (2011) และ Tran et al. (2011) พบว่ายีน Waxy ยังควบคุมลักษณะความคงตัวของแป้งสุกในข้าวอีกด้วย โดยบริเวณที่มีผลมากต่อความคงตัว ของแป้งสุกคือการแทนที่เบสในเอกซอนที่ 10 ของยีน Waxy (G/T) นอกจากปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้ง สุกจะถูกควบคุมด้วยยีนต าแหน่งเดียวกันแล้ว ยังพบความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุก ในข้าวต่างประเทศอีกด้วย (ละมุน, 2555) งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกในข้าวตัวอย่างต่าง ๆ ของ ประเทศไทย ทั้งข้าวพันธุ์การค้า ข้าวพื้นเมือง และข้าวไร่ รวมถึงศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณอะไมโลสและ ความคงตัวของแป้งสุกในข้าวไทย เพื่อเป็นข้อมูลในการเลือกข้าวเพื่อศึกษายีนที่ควบคุมปริมาณอะไมโลสและความคง ตัวของแป้งสุกในข้าวไทยต่อไป และเนื่องจากสภาพแวดล้อม เช่น อุณหภูมิ ปริมาณแสง ความชื้น มีผลต่อคุณภาพ เมล็ดข้าว (Chen et al., 2012) จึงได้ศึกษาผลของสภาพแวดล้อมในการปลูกข้าวต่อปริมาณอะไมโลสและความคงตัว ของแป้งสุก โดยปลูกข้าวในฤดูนาปรังเทียบกับฤดูนาปีอีกด้วย

อุปกรณ์และวิธีการ

ตัวอย่างข้าวที่ศึกษา ตัวอย่างข้าวที่ศึกษาคือ ข้าวที่ปลูกในฤดูนาปรัง พ.ศ. 2558 จ านวน 35 ตัวอย่าง เป็นข้าวเหนียว 10 ตัวอย่าง และข้าวเจ้า 25 ตัวอย่าง และข้าวที่ปลูกในฤดูนาปี พ.ศ. 2559 จ านวน 114 ตัวอย่าง เป็นข้าวเหนียว 49 ตัวอย่าง ข้าว เจ้า 65 ตัวอย่าง การเตรียมตัวอย่างข้าว น าเมล็ดข้าวมาสีและขัดให้เป็นข้าวสารขาว แล้วบดด้วยโกร่งบด น ามาร่อนด้วยตะแกรงร่อนขนาด 80 เมช (mesh) ได้ผงแป้งข้าวละเอียดเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส เพื่อใช้ในการทดลองต่อไป การวัดปริมาณอะไมโลส การวัดปริมาณอะไมโลสดัดแปลงจากวิธีของมาตรฐานสินค้าเกษตรและอาหารแห่งชาติ (มกอช 4000-2546) โดยมีขั้นตอนโดยสังเขปดังต่อไปนี้ 1. ชั่งแป้ง 0.100±0.0005 กรัม ใส่ในขวดวัดปริมาตรขนาด 100 มล. 2. เติมเอธิลแอลกอฮอล์ 95% จ านวน 1 มล. และเติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ความเข้มข้น 2 นอร์มัล จ านวน 9 มล. 3. ผสมตัวอย่างบนเครื่องผสมสารโดยใช้แท่งแม่เหล็กเป็นเวลา 10 นาที 4. ปรับปริมาตรด้วยน้ ากลั่นให้ได้ 100 มล.

284 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

5. น าขวดวัดปริมาตรขนาด 100 มล. ใบใหม่เติมน้ ากลั่นประมาณ 70 มล. เติมกรดอะซิติกเข้มข้น 1 นอร์มัล จ านวน 2 มล. และเติมสารละลายไอโอดีน 2 มล. ดูดตัวอย่างสารละลายน้ าแป้งที่ได้จากข้อ 4 จ านวน 5 มล. และปรับ ปริมาตรด้วยน้ ากลั่นเป็น 100 มล. เขย่าแล้วตั้งทิ้งไว้ 10 นาที 6. เตรียมสารตามวิธีในข้อ 5 แต่ไม่ต้องใส่ตัวอย่างสารละลายน้ าแป้งเพื่อใช้เป็น blank 7. วัดความเข้มข้นของสารละลายตัวอย่างที่เตรียมได้ในข้อ 5 ด้วยเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ที่ความยาวคลื่น 620 นาโนเมตร 8. ท าการทดลอง 3 ซ้ า ส าหรับข้าวแต่ละตัวอย่าง แต่ละซ้ าวัดค่าการดูดกลืนแสง 2 ครั้ง ค านวณหา ปริมาณอะไมโลส โดยเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐานของอะไมโลส 9. การท ากราฟมาตรฐาน 9.1 ชั่งอะไมโลส 0.040±0.0005 กรัม ใส่ในขวดแก้วปริมาตรที่แห้งสนิทแล้วด าเนินการตามข้อ 2 ถึงข้อ 4 9.2 เตรียมขวดแก้วปริมาตรขนาด 100 มล. จ านวน 5 ขวด เติมน้ ากลั่นขวดละ 70 มล. เติม กรดเกลเชียลอะซิติก ปริมาตร 0.4 มล. ในขวดที่ 1 ปริมาตร 0.8 มล. ในขวดที่ 2 ปริมาตร 1.2 มล. ใน ขวดที่ 3 ปริมาตร 1.6 มล. ในขวดที่ 4 และปริมาตร 2.0 มล. ในขวดที่ 5 ตามล าดับ แล้วเติมสารละลาย ไอโอดีน 2 มล. ลงในแต่ละขวด 9.3 ดูดสารละลายข้อ 9.1 ปริมาตร 1 มล. 2 มล. 3 มล. 4 มล. และ 5 มล. ซึ่งเทียบเท่าปริมาณอะไมโลส 8, 16, 24, 32 และ 40% ตามล าดับ ใส่ในขวดที่เตรียมไว้ในข้อ 9.2 เติมน้ ากลั่นเพื่อปรับปริมาตรให้เป็น 100 มล. และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 620 นาโนเมตร หลังปรับเครื่องด้วย blank ให้ได้ค่าการดูดกลืนแสง เท่ากับ 0 9.4 น าค่าการดูดกลืนแสง กับปริมาณอะไมโลสในสารละลายมาตรฐานตามข้อ 9.3 มาเขียนเป็น เส้นกราฟมาตรฐาน การวัดความคงตัวของแป้งสุก การวัดความคงตัวของแป้งสุกดัดแปลงจากวิธีของ Cagampang et al. (1973) โดยมีขั้นตอนดังนี้ 1. ชั่งแป้ง 0.100±0.0005 กรัม ใส่หลอดทดลองขนาด 16 × 150 มม. 2. เติม Thymol blue 0.025 % ปริมาตร 200 ไมโครลิตร 3. เติม KOH ความเข้มข้น 0.2 นอร์มัล ปริมาตร 2 มล. 4. เขย่าให้เข้ากันด้วย vortex mixture ประมาณ 10 วินาที 5. ปิดปากหลอดทดลองด้วยลูกแก้ว น าไปต้มในน้ าเดือดเป็นเวลา 8 นาที 6. เขย่าให้เข้ากันด้วย vortex mixture ประมาณ 10 วินาที 7. แช่หลอดทดลองในน้ าแข็งเป็นเวลา 20 นาที 8. วางหลอดทดลองแนวนอนในกระดาษกราฟเป็นเวลา 30 นาที 9. บันทึกระยะทางการไหลของแป้งเป็นมิลลิเมตร หมายเหตุ: ท าการทดลอง 3 ซ้ า ส าหรับข้าวแต่ละตัวอย่าง

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 285 การวิเคราะห์ทางสถิติ การวิเคราะห์ข้อมูลใช้โปรแกรม R (R core team, 2016) ทดสอบค่าความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณอะไมโลส และความคงตัวของแป้งสุกโดยใช้วิธี Spearman และทดสอบความแตกต่างระหว่างข้าวนาปีและนาปรังโดยใช้วิธี Wilcoxon

ผลการวิจัย

ข้าวนาปี จากการศึกษาปริมาณอะไมโลสของข้าวที่ปลูกในฤดูนาปีพบว่า ข้าวเหนียวมีปริมาณอะไมโลสต่ า กระจายตัว อยู่ในช่วงแคบคือ 4.15-8.19 % ส่วนข้าวเจ้ามีปริมาณอะไมโลสกระจายตัวในช่วงกว้างคือ 13.74-31.80 % ความคงตัว ของแป้งสุกของข้าวเหนียวมีค่าระยะทางการไหลของแป้งมาก โดยมีค่ากระจายตัวอยู่ในช่วงแคบคือ 97.67-125.67 มม. ส่วนข้าวเจ้ามีการกระจายตัวของค่าระยะทางการไหลของแป้งสุกเป็นช่วงกว้างคือ 24.67–150.67 มม. ดังแสดงใน Figure 1

Figure 1 Boxplot of average amylose content (A) and gel consistency (B) in 114 Thai rice samples grown in season 2016

เมื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกในข้าวนาปี โดยการวิเคราะห์ สหสัมพันธ์เชิงเส้นตรงพบว่าปริมาณอะไมโลสกับค่าความคงตัวของแป้งสุกสัมพันธ์กันเชิงบวกในระดับต่ า โดยมีค่า สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เท่ากับ 0.359 และ 0.135 และค่า p เท่ากับ 0.0137 และ 0.0258 ในข้าวเหนียวและข้าวเจ้า ตามล าดับ ดังแสดงใน Figure 2

286 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

Figure 2 Correlations between amylose content and gel consistency of Thai rice samples grown in season 2016. N = 49 for waxy rice samples (A) and N = 65 for nonwaxy rice samples (B)

ข้าวนาปรัง ปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกของข้าวที่ปลูกในฤดูนาปรังมีรูปแบบการกระจายตัวคล้ายกับใน ข้าวนาปี คือ ปริมาณอะไมโลสของข้าวเหนียวมีค่าน้อยและมีการกระจายตัวในช่วงแคบ คือ 4.65-8.52% ส่วนข้าวเจ้า มีการกระจายตัวของปริมาณอะไมโลสกว้างคือในช่วง 12.40-31.44% ค่าความคงตัวของแป้งสุกในข้าวเหนียวมีค่า ระยะทางการไหลของแป้งมาก คือในช่วง 92.00-123.67 มม. ส่วนข้าวเจ้ามีการกระจายตัวของระยะทางการไหลของ แป้งมากกว่าข้าวเหนียว คือในช่วง 46.00-125.67 มม. ดังแสดงใน Figure 3

Figure 3 Boxplot of average amylose content (A) and gel consistency (B) in 35 Thai rice samples grown off season in 2015

ความสอดคล้องของปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกระหว่างข้าวที่ปลูกฤดูนาปีกับนาปรัง เมื่อเปรียบเทียบปริมาณอะไมโลส (Figure 4A) และค่าความคงตัวของแป้งสุก (Figure 4B) ระหว่างข้าวที่ ปลูกในฤดูนาปีและนาปรังจ านวน 35 ตัวอย่าง พบว่าปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกโดยส่วนใหญ่มีค่า ใกล้เคียงกัน และไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ (p = 0.6135 และ p = 0.7026 ส าหรับปริมาณอะไมโลสและความ คงตัวของแป้งสุกตามล าดับ)

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 287

Figure 4 Physiochemical properties of 35 Thai rice samples grown in season (asterisk) and off Figure 4 season (triangle). Amylose content (A) and gel consistency (B)

วิจารณ์ผลการวิจัย

จากผลการวิจัยปริมาณอะไมโลสในข้าว พบว่าตัวอย่างข้าวเหนียวมีอะไมโลสในปริมาณต่ า (0-9%) ส่วนข้าว เจ้าสามารถแบ่งได้เป็น 3 กลุ่ม ได้แก่ ข้าวเจ้าอะไมโลสต่ า (10-19%) ข้าวเจ้าอะไมโลสปานกลาง (20-25%) และข้าว เจ้าอะไมโลสสูง (>25%) และจากการศึกษาความคงตัวของแป้งสุก พบว่ามีทั้งข้าวที่มีความคงตัวของแป้งสุกแข็ง (<40 มม.) ความคงตัวของแป้งสุกปานกลาง (40-60 มม.) และความคงตัวของแป้งสุกอ่อน (>60 มม.) ในงานวิจัยนี้พบว่าข้าวที่มีปริมาณอะไมโลสต่ า เช่น ข้าวเหนียวทุกตัวอย่างมีความคงตัวของแป้งสุกอ่อน ส่วน ข้าวเจ้าซึ่งมีปริมาณอะไมโลสแตกต่างกันเป็นช่วงกว้างมีความคงตัวของแป้งสุกเป็นช่วงกว้างตั้งแต่แข็งไปถึงอ่อน และ ยังพบความสัมพันธ์เชิงบวกระหว่างปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกทั้งในข้าวเหนียวและข้าวเจ้า ซึ่ง แตกต่างจากการรายงานของละมุน (2555) ที่พบว่าข้าวที่มีอะไมโลสสูงมีแนวโน้มของค่าความคงตัวของแป้งสุกแข็ง แต่สอดคล้องกับรายงานของ Cuevas and Fitzgerald (2012) ที่พบว่าข้าวเจ้ามีค่าความคงตัวของแป้งสุกตั้งแต่แข็ง ไปถึงอ่อน ทั้งนี้ความสัมพันธ์ทางสถิติที่ตรวจพบอาจเนื่องจากข้าวที่น ามาทดลองเป็นข้าวที่ผ่านการปรับปรุงพันธุ์หรือ คัดเลือกพันธุ์ข้าวให้เหมาะกับความชอบของผู้บริโภค ดังนั้นแม้มีปริมาณอะไมโลสสูงแต่ข้าวหุงสุกไม่แข็งเนื่องจากมี ความคงตัวของแป้งสุกอ่อน และเนื่องจากความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกเป็น ความสัมพันธ์ในระดับต่ า ดังนั้นจึงไม่สามารถใช้ปริมาณอะไมโลสในการท านายค่าความคงตัวของแป้งสุกได้ จากการเปรียบเทียบค่าปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกระหว่าง 2 ฤดูปลูก พบว่าไม่แตกต่างทาง สถิติ ดังนั้นความแตกต่างระหว่างข้าวแต่ละตัวอย่างน่าจะเป็นผลจากพันธุกรรม ซึ่งน่าจะมีความหลากหลายทาง

288 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

พันธุกรรมของยีน Waxy ถ้ายึดตามการศึกษาของ Mikami et al. (2008) และ Zhang et al. (2012) พบว่าข้าวไทย ที่ศึกษาน่าจะประกอบด้วยอัลลีล Wxa (ปริมาณอะไมโลส 26 - 30 %) เช่น กข 57 กข 47 กข 31 สุพรรณบุรี 90 เป็น ต้น อัลลีล Wxin (ปริมาณอะไมโลส 22 - 25 %) เช่น หันตรา 60 และนางมลเอส-4 เป็นต้น อัลลีล Wxb (ปริมาณอะ ไมโลส 12-16 %) เช่น ปทุมธานี 1 กข 39 กข 21 และเจ้าหอมนิล เป็นต้น อัลลีล Wxop (ปริมาณอะไมโลส 12-13 %) เช่น กข 33 เป็นต้น และอัลลีล wx ซึ่งเป็นข้าวเหนียว เช่น เหนียวเขี้ยวงู สันป่าตอง 1 และ กข 6 เป็นต้น ความ แตกต่างของ ปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุกระหว่างฤดูของข้าวบางพันธุ์อาจเกิดจากอายุในการเก็บรักษา ข้าว เนื่องจากข้าวแต่ละตัวอย่างมีองค์ประกอบทางเคมี เช่น ปริมาณไขมัน และโปรตีน แตกต่างกันจึงเกิดปฏิกิริยาการ เปลี่ยนแปลงในเมล็ดข้าวแตกต่างกัน ซึ่งสอดคล้องกับการรายงานของ อลิษา และคณะ (2556) ที่พบว่าข้าวแต่ละพันธุ์ มีการเปลี่ยนคุณสมบัติทางเคมีตามระยะเวลาในการเก็บรักษาไม่เหมือนกัน และอุณหภูมิในการเก็บรักษาก็ส่งผลท าให้ มีการเปลี่ยนแปลงของข้าวเช่นเดียวกัน โดยเมื่อเก็บข้าวที่อุณหภูมิสูง ท าให้การเปลี่ยนแปลงจากข้าวใหม่เป็นข้าวเก่า เกิดได้เร็วขึ้น (เพลงพิณ, 2541; อลิษา และคณะ, 2556) ซึ่งในการทดลองนี้ได้ปลูกข้าวนาปรังเร็วกว่าข้าวนาปี 6 เดือน และเก็บเมล็ดไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาประมาณ 9 เดือน ส่วนเมล็ดข้าวนาปีถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 3 เดือน ดังนั้นระยะเวลาและอุณหภูมิในการเก็บรักษาจึงน่าจะส่งผลให้ข้าวบางตัวอย่างมีการเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติทางเคมี นอกจากนี้สภาวะการปลูกที่แตกต่างกันระหว่างข้าวทั้ง 2 ฤดู ก็อาจจะส่งผลต่อคุณสมบัติทางเคมีของข้าวบางตัวอย่าง เช่นเดียวกัน (Chen et al., 2012)

สรุปผลการวิจัย

ข้าวไทยที่ศึกษามีความหลากหลายทั้งในปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุก โดยสภาพแวดล้อมใน การปลูกข้าว เช่น อุณหภูมิ ช่วงแสง ความชื้นสัมพัทธ์ในอากาศ เป็นต้น ไม่มีผลหรือมีผลน้อยต่อปริมาณอะไมโลสและ ความคงตัวของแป้งสุกในข้าวไทยส่วนใหญ่ ดังนั้นข้าวไทยจึงน่าจะมีความหลากหลายของยีนที่ควบคุมลักษณะ ปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุก ข้อมูลที่ได้นี้จะเป็นประโยชน์ในการเลือกตัวอย่างข้าวเพื่อศึกษายีนที่ เกี่ยวข้องกับปริมาณอะไมโลสและความคงตัวของแป้งสุก เพื่อใช้ในการปรับปรุงพันธุ์ข้าวต่อไป

กิตติกรรมประกาศ

งานวิจัยนี้ได้รับทุนสนับสนุนจากส านักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ ปีงบประมาณ พ.ศ. 2559 ขอขอบคุณ ดร.กฤษณะ ลาน้าเที่ยง ที่ช่วยให้ค าแนะนาในการวิเคราะห์ผลทางสถิติ

เอกสารอ้างอิง

งามชื่น คงเสรี. 2547. คุณภาพข้าวสวย. น. 41-62. ใน คุณภาพและการตรวจสอบข้าวหอมมะลิไทย. กรุงเทพฯ: กรมวิชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ์. เชาวนีพร ชีพประสพ ฤทัยทิพย์ อโนมุณี และหาสันต์ สาเหล็ม. 2558. องค์ประกอบทางเคมีและปริมาณอะไมโลส ในข้าวพันธุ์พื้นเมือง จังหวัดพัทลุง. 40 น. ใน รายงานผลการวิจัย. สงขลา: มหาวิทยาลัยราชภัฏสงขลา.

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 289 เพลงพิณ ศิวาพรรักษ์. 2541. ผลของอุณหภูมิและระยะเวลาการเก็บรักษาต่อการเปลี่ยนแปลงปริมาณอะไมโลส คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของข้าวสารพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105. วิทยานิพนธ์ปริญญาโท. มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. 56 น. ละมุน วิเศษ. 2555. ปัจจัยที่ส่งผลกระทบต่อคุณภาพด้านการหุงต้มของข้าว. วารสารวิทยาศาสตร์บูรพา 17(1): 172-180. สมาคมผู้ส่งออกข้าวไทย. 2560. ผลผลิตข้าว. [ระบบออนไลน์]. แหล่งที่มา http://www.thairiceexporters.or.th/ production.htm (14 สิงหาคม 2560). อลิษา ชมพูพล้อย เบญจวรรณ ฤกษ์เกษม ศันสนีย์ จ าจด และชนากานต์ เทโบลต์ พรมอุทัย. 2556. ผลของอุณหภูมิ ในการเก็บรักษาต่อการเปลี่ยนแปลงความหนืดของข้าวพันธุ์ต่างๆ. แก่นเกษตร 41(4): 411-418. Cagampang, G.B., CM. Perez and B.O. Juliano. 1973. A gel consistency test for eating quality in rice. J. Sci. Food Agr. 24: 1598-1594. Chen, Y., M. Wang and P. B. F. Ouwerkerk. 2012. Molecular and environmental factors determining grain quality in rice. Food and Energy Security 1(2): 111-132. Cuevas, R.P. and M. A. Fitzgerald. 2012. Genetic Diversity of Rice Grain Quality. pp. 285-310. In Çalişkan, M. (ed.). Genetic Diversity in Plants. Fitzgerald, M.A., S.R. McCouch and R.D. Hall. 2009. Not just a grain of rice: the quest for quality. Trends in Plant Science 14: 133-139. Mikami, I., N. Uwatoko, Y. Ikeda, J. Yamaguchi, H.Y. Hirano, Y. Suzuki and Y. Sano. 2008. Allelic diversification at the wx locus in landraces of Asian rice. Theor. Appl. Genet. 116:979-989. R Core Team. 2016. R: A language and environment for statistical computing. [Online]. Available http://www.R-project.org/ (14 August 2017) Su, Y., Y. Rao, S. Hu, Y. Yang, Z. Gao, G. Zhang, J. Liu, J. Hu, M. Yan, G. Dong, L. Zhu, L. Guo, Q. Qian and D. Zeng. 2011. Map-based cloning proves qGC-6, a major QTL for gel consistency of japonica/indica cross, responds by Waxy in rice (Oryza sativa L.). Theor.Appl. Genet. 123: 859-867 Tran, N.A., V.D. Daygon, A.P. Resurreccion, R.P. Cuevas, H.M. Corpuz and M.A. Fitzgerald. 2011. A single nucleotide polymorphism in the Waxy gene explains a significant component of gel consistency. Theor Appl Genet. 123: 519-525. Zhang, Z., M. Li, Y. Fang, F. Liu, Y. Lu, Q. Meng, J. Peng, X. Yi, M. Gu and C. Yan. 2012. Diversification of the Waxy gene is closely related to variations in rice eating and cooking quality. Plant Mol. Biol. Rep. 30: 462-469

290 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

การจัดกลุ่มข้าวไทยด้วยยีนแก้ความเป็นหมันของเรณูในระบบข้าวลูกผสมสามสายพันธุ์ Classification of Thai Rice Cultivars Using Fertility Restoring Genes in Three- Line Hybrid Rice System

ทุเรียน ทาเจริญ กนกวรรณ จันทร์เพ็ญ ช่อทิพา สกูลสิงหาโรจน์ วราภรณ์ แสงทอง และแสงทอง พงษ์เจริญกิต* Turean Thacharoen, Kanokwan Janpen, Chotipa Sakulsingharoj, Varaporn Sangtong and Saengtong Pongjaroenkit* สาขาวิชาพันธุศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์มหาวิทยาลัยแม่โจ้ เชียงใหม่ 50290 Program in Genetics, Faculty of Science, Maejo University, Chiang Mai, Thailand 50290 *Corresponding author: [email protected]

บทคัดย่อ

ลักษณะเรณูเป็นหมันที่ควบคุมด้วยยีนในไซโทพลาสซึมจะมียีนแก้ความเป็นหมันของเรณู (Rf) อยู่ในนิวเคลียส ในระบบ Wild abortive–cytoplasmic male sterility สามารถจัดกลุ่มของพันธุ์ข้าวด้วยเปอร์เซ็นต์ความมีชีวิตของเรณู และเปอร์เซ็นต์เมล็ดดีของลูกผสมโดยยีนแก้ความเป็นหมันของเรณูต าแหน่ง Rf4 ใช้เป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอ ในการจัดกลุ่มสายพันธุ์ การศึกษาวิจัยครั้งนี้ได้จัดกลุ่มข้าวไทยพันธุ์ ปทุมธานี 1 ชัยนาท 1 และ กข47 ด้วยเปอร์เซ็นต์ ความมีชีวิตของเรณู เปอร์เซ็นต์เมล็ดดี ร่วมกับการคัดเลือกด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอต่อต าแหน่ง Rf4 ทั้งชนิด SSR และ ที่จ าเพาะกับยีนโดยจากผลของเปอร์เซ็นต์ความมีชีวิตของเรณู แสดงว่าข้าวทั้ง 3 พันธุ์นี้เป็นกลุ่มแก้ความเป็นหมัน ของเรณูและพบเครื่องหมาย RM6100, RMS_PPR9_4 และPPR_9InDel สัมพันธ์กับความสามารถในการแก้ ความเป็นหมันของเรณู แสดงว่าข้าวไทยนั้นมียีนแก้ความเป็นหมันที่ต าแหน่ง Rf4 แตกต่างกัน

ค าส าคัญ: ยีนแก้ความเป็นหมันของเรณู ความมีชีวิตของเรณู เมล็ดดี เครื่องหมายดีเอ็นเอ

Abstract

Cytoplasmic Male Sterility (CMS) -associated genes are located in mitochondrial genome whereas restorer of fertility (Rf) genes are located in nuclear genome. Lines of Wild Abortive– Cytoplasmic Male Sterility (WA–CMS) system could be classifiedby percentage of pollen fertility (%PF) and percentage of spikelet fertility (%SF) of hybrid. Restorer of fertility locus (Rf4) was used as DNA marker for classification of WA–CMS lines. In this study, three Thai rice cultivars (Pathum Thani 1, Chai Nat 1 and RD47) were classified by %PF, %SF and DNA markers which were SSR and specific gene markers. The high percentage of PF indicatedthat the three cultivars were restorer lines. The identification of DNA makers revealed that RM6100, RMS_PPR9_4 and PR_9InDelmarkers were associated with Rf4 locus and suggested that the three Thai rice cultivars have different Rf genes.

Keywords: fertility-restoring gene, pollen fertility, spikelet fertility, DNA marker

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 291 ค าน า

เทคโนโลยีข้าวลูกผสมในไทยใช้ระบบ 3 สายพันธุ์ คือ สายพันธุ์เรณูเป็นหมัน (A line หรือcytoplasmic male sterility; cms) สายพันธุ์รักษาพันธุ์เรณูเป็นหมัน (B line; maintainer) และสายพันธุ์แก้ความเป็นหมันของ เรณู (R line; restorer) โดยที่ลักษณะเรณูเป็นหมันที่นิยมใช้เป็นระบบที่ควบคุมด้วยยีนที่อยู่ในไซโทพลาสซึม (cytoplasmic male sterility; cms) และมียีนแก้ความเป็นหมันของเรณู (fertility-restoring; Rf/rf) อยู่ในนิวเคลียส ในระบบ Wild abortive-CMS (WA-CMS)มียีนแก้ความเป็นหมันของเรณูที่ต าแหน่ง Rf4 บนโครโมโซมแท่ง ที่ 10 เป็นยีนของโปรตีนกลุ่ม pentatricopeptide repeat protein (PPR protein) ซึ่งประกอบด้วยยีน PPR จ านวน 4 ยีน ได้แก่ ยีน PPR7, PPR8, PPR9 และ PPR10 โดยพบว่ายีน PPR9 เป็นยีนหลักที่ท าให้ความสามารถของ การแก้ความเป็นหมันของเรณู (Kazama and Toriyama, 2014; Tanget al., 2014.) และได้รายงานเครื่องหมายดี เอ็นเอที่จ าเพาะกับยีน PPR9 ที่สามารถใช้ในการจ าแนกกลุ่มสายพันธุ์ข้าวได้ (Pranathi et al., 2016) การศึกษาความสามารถในการแก้หมันของเรณูสามารถท าได้ด้วยการน าสายพันธุ์ที่ต้องการทดสอบผสมกับ

สายพันธุ์ A ให้ได้ลูกชั่วที่ 1 น าละอองเรณูของลูกชั่วที่ 1 ไปย้อมด้วยสารละลาย I2-KI นับจ านวนละอองเรณูที่มีชีวิต เพื่อค านวณเปอร์เซ็นต์ความมีชีวิตของเรณู (%pollen fertility; PF) แล้วปล่อยให้ลูกชั่วที่ 1 ผสมตัวเองได้เป็นเมล็ด แล้วนับจ านวนเมล็ดดีจากจ านวนเมล็ดทั้งหมด เพื่อค านวณเปอร์เซ็นต์เมล็ดดี (%Spikelet fertility; SF) ซึ่งพบว่าข้าว สายพันธุ์ต่างๆ มีความสามารถในการแก้ความเป็นหมันของเรณูแตกต่างกันสามารถแบ่งกลุ่มสายพันธุ์จากค่า PF และ SF ได้ออกเป็น 4 กลุ่ม คือ Restorer (PF มากกว่า 80 %, SF มากกว่า 75 %), Partial restorer (PF เท่ากับ 50.1 ถึง 80 %, SF เท่ากับ 50.1 ถึง 75 %), Partial maintainer (PF เท่ากับ 1.1 ถึง 50 %, SF เท่ากับ0.1 ถึง 50%) และ maintainer (PF เท่ากับ 0 ถึง 1%, SF เท่ากับ 0%) ( Waza and Jaiswal, 2016) ปัจจุบันมีรายงานเครื่องหมายดีเอ็นเอที่ใช้ในการจ าแนกสายพันธุ์ maintainerและ restorer ของระบบ WA-CMS โดยส่วนมากจะเป็นเครื่องหมาย simple sequence repeat (SSR) ที่เป็นเครื่องหมายแสดงความแตกต่าง ในจ านวนซ้ าของล าดับเบสซ้ าเช่น RM171, RM258 (Kiani, 2015; El-Namaky et al., 2016) และ RM6100 (Waza and Jaiswal, 2016) ส่วนเครื่องหมายจ าเพาะต่อยีนต าแหน่ง Rf4 นั้นมีรายงานเพิ่มขึ้น (Pranathi et al., 2016; Pongjaroenkit et al. (In Press)) โดยเครื่องหมายเหล่านี้น่าจะใช้ในการศึกษาความสามารถในการแก้ความเป็นหมัน ของเรณูได้ ในการศึกษาวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาการจัดกลุ่มข้าวโดยใช้ความสามารถในการแก้ความเป็นหมันของ เรณูของข้าวไทยด้วยค่า PF และ SF ร่วมกับการคัดเลือกด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอต่อต าแหน่ง Rf4 ทั้งชนิด SSR และ ที่จ าเพาะกับยีน

292 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

อุปกรณ์และวิธีการ

พันธุ์ข้าวที่ใช้ในการศึกษา การศึกษาความมีชีวิตของเรณูและเปอร์เซ็นต์เมล็ดดีใช้ลูกผสมที่ได้จากการผสมระหว่างพันธุ์ข้าวไทยที่ ต้องการทดสอบกับข้าวสายพันธุ์เรณูเป็นหมัน จ านวน 3 คู่ผสม ได้แก่ IR58025A x ปทุมธานี 1, IR58025A x ชัยนาท 1 และ IR58025A x กข47 ส่วนการศึกษาจีโนไทป์ใช้ข้าวพันธุ์ปทุมธานี 1 (Pathum Thani 1; PTT1) ชัยนาท 1 (Chai Nat 1; CN1) และกข47 (RD47) ที่เป็นข้าวกลุ่มพันธุ์แก้ความเป็นหมันของเรณู (R-line; restorer) และ สายพันธุ์ IR58025B ที่เป็นข้าวกลุ่มพันธุ์รักษาพันธุ์เรณูเป็นหมัน (B line; maintainer) การศึกษาฟีโนไทป์ความสามารถในการแก้หมันของเรณู ในการศึกษาฟีโนไทป์ความสามารถในการแก้ความเป็นหมันของเรณู โดยการน าข้าวไทยพันธุ์ดีที่ต้องการ

ทดสอบไปผสมกับข้าวสายพันธุ์เรณูเป็นหมัน จ านวน 3 คู่ผสมเพื่อให้ได้เมล็ด F1 แล้วน าไปปลูก แล้วสุ่มเรณูจากรวง ข้าว 3 รวงมาย้อมด้วยสารละลาย I2–KI ค านวณเปอร์เซ็นต์ความมีชีวิตของเรณู (%pollen fertility; PF) จากนั้นคลุม ช่อดอก รอให้ติดเป็นเมล็ด นับจ านวนเมล็ดดีต่อจ านวนเมล็ดทั้งหมด เพื่อค านวณค่าเปอร์เซ็นต์เมล็ดดี (%spikelet fertility; SF) และเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยที่ได้ด้วยวิธี F-test การศึกษาจีโนไทป์ของยีนแก้ความเป็นหมันของเรณูต าแหน่ง Rf4 ในการศึกษาจีโนไทป์โดยน าดีเอ็นเอที่สกัดได้จากใบอ่อนมาคัดเลือกด้วยเครื่องหมาย SSR จ านวน 3 เครื่องหมาย ได้แก่ RM171, RM258 และ RM6100 ที่มีรายงานว่าสัมพันธ์กับยีนแก้ความเป็นหมันต าแหน่ง Rf4 และ เครื่องหมายจ าเพาะต่อยีนต าแหน่ง Rf4 จ านวน 4 เครื่องหมาย ได้แก่ RMS_PPR9_1, RMS_PPR9_4, PPR9_InDel และ PPR10_SNP (Table 1) ที่ออกแบบจากยีน PPR9 และยีน PPR10 ซึ่งเป็นเครื่องหมายที่เพิ่มจ านวนดีเอ็นเอด้วย เทคนิค PCR ซึ่งปฏิกิริยาปริมาตรสุดท้าย 20 ไมโครลิตร ประกอบด้วยดีเอ็นเอ 20 นาโนกรัม, 1X MYTAQ RED MIX (BIOLINE, USA), ไพรเมอร์ที่ความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 ไมโครโมลาร์ สภาวะอุณหภูมิที่ใช้ คือ 94oซ. นาน 5 นาที ตาม ด้วย 35 รอบ ของ 94oซ. นาน 30 วินาที 55oซ. นาน 30 วินาที และ 72oซ. นาน 45 วินาที จากนั้น 72oซ. นาน 5 นาที วิเคราะห์ผลการท า PCR ด้วย 3% agarose gel electrophoresis

Table 1 List of primers used in this study

Primer set Name Sequence (5->3) Reference RM171 RM171F AACGCGAGGACACGTACTTAC Kiani (2015) and RM171R ACGAGATACGTACGCCTTTG El-Namaky et al. (2016) RM258 RM258F TGCTGTATGTAGCTCGCACC RM258R TGGCCTTTAAAGCTGTCGC RM6100 RM6100F TCCTCTACCAGTACCGCACC Waza and Jaiswal (2016) RM6100R GCTGGATCACAGATCATTGC RMS_PPR9_1 RMS_PPR9_1F GAGTTTTGAATAGATTTACGTGTGGA Pranathi et al. (2016) RMS_PPR9_1R AGTGTCCAGATTCGTAGTAATGC

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 293 Table 1 (Continue)

Primer set Name Sequence (5->3) Reference RMS_PPR9_4 RMS_PPR9_4F AACGTTACTATTCACCTC RMS_PPR9_4R AGCTTTGCTAGTCTTCCAG PPR9_InDel PPR9_InDel F TTCAGCAAAATGAGGCAGCA This study PPR9_InDel R GAAGTGCCTCGTCAGTGAG PPR10_SNP Inner-F AGAAGGCTGAGGAGTTAATTTTTG Pongjaroenkit et al. Inner-R CTGGACAGATGCCTTGATCCAACATTTA (In Press) Outer-F CAAAATGAGGCAGCAAGGAT Outer-R CCGATCGATGCACATATGAC

ผลการวิจัย

ความสามารถในการแก้หมันของเรณู การศึกษาเปรียบเทียบความสามารถในการแก้ความเป็นหมันของเรณูของลูกผสมระหว่างข้าวไทยพันธุ์ดี กับข้าวสายพันธุ์เรณูเป็นหมัน (A line) จ านวน 3 คู่ผสม ด้วยการย้อมละอองเรณูด้วยสารละลาย I2–KI พบว่าข้าวไทย พันธุ์ดีสามารถแก้ความเป็นหมันของเรณูได้ โดยพบว่าเรณูของข้าวลูกผสมทั้ง 3 คู่ผสมติดสี แสดงว่าเรณูมีชีวิต(Figure 1B-D) ในขณะที่ละอองเรณูของข้าวสายพันธุ์เรณูเป็นหมัน (IR58025A) ไม่ติดสี (Figure 1A) และจากการวิเคราะห์ ทางสถิติพบว่าเปอร์เซ็นต์ความมีชีวิตของเรณู (%pollen fertility) ของคู่ผสมระหว่าง IR58025A x ชัยนาท 1 และ IR58025A x กข47 มีค่าสูงกว่า IR58025A x ปทุมธานี 1 ในขณะที่เปอร์เซ็นต์เมล็ดดี (%Spikelet fertility) ของข้าว ทั้ง 3 คู่ผสม มีค่า 35-43 % ซึ่งไม่มีความแตกต่างกันอย่างมีนัยส าคัญทางสถิติ (Table 2)

Figure 1 Pollen staining with I2–KI ofIR58025A(A) and 3 hybrids betweenIR58025A X PTT1 (B), Figure 1 IR58025A X CN1(C) and IR58025A X RD47 (D)

294 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

Table 2 Pollen and spikelet fertility of hybrids in this study

Hybrid % pollen fertility* % spikelet fertility (mean±SD) (mean±SD) IR58025A X Pathum Thani 1 87.17b±1.0 40.18a±11.7 IR58025A X Chai Nat 1 96.02a±2.6 35.03a±4.8 IR58025A X RD47 96.58a±4.9 43.93a±14.2

*Significant at P= 0.05

ยีนแก้ความเป็นหมันของเรณูต าแหน่ง Rf4 ในการศึกษาจีโนไทป์ด้วยเครื่องหมาย SSR จ านวน 3 เครื่องหมาย ได้แก่ RM171, RM258 และ RM6100 โดยที่เครื่องหมาย RM171, RM258 และ RM6100 ที่ใกล้ชิดกับยีนต าแหน่ง Rf4 บนโครโมโซมแท่งที่ 10 เป็น 6.3, 3.1 และ 1.2 เซนติมอร์แกน (cM) ตามล าดับและเครื่องหมายจ าเพาะต่อยีนต าแหน่ง Rf4 จ านวน 4 เครื่องหมาย รวมทั้งหมดเป็น 7 เครื่องหมาย พบว่าข้าวพันธุ์ปทุมธานี 1 และ กข47 ให้แถบดีเอ็นเอแก้ความเป็นหมันของเรณู (R) จ านวน 5 และ 6 เครื่องหมายตามล าดับ ส่วนข้าวพันธุ์ชัยนาท 1 ให้แถบดีเอ็นเอ R จ านวน 4 เครื่องหมาย (Figure 2 และ Table 3) แสดงให้เห็นว่าข้าวทั้ง 3 พันธุ์มีความแตกต่างกันของยีนที่เกี่ยวข้องกับการแก้ความเป็นหมันที่มี รายงานมาก่อนหน้านี้ นอกจากนี้ยังพบว่าเครื่องหมาย SSR คือ RM6100 และเครื่องหมายที่จ าเพาะต่อยีน คือ RMS_PPR9_4 และ PPR_9InDel สามารถแยกกลุ่ม maintainer และ restorer ได้ โดย RMS_PPR9_4 เป็น เครื่องหมายที่ออกแบบจากบริเวณหลังรหัสหยุดของยีน PPR9ไป 43 กิโลเบส และเครื่องหมาย PPR_9InDel เป็นบริเวณขาดหายไปในบริเวณรหัสของยีน PPR9

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 295

Figure 2 Agarose gel electrophoresis for 3 SSR markers which are RM171 (A), RM258 (B) and RM6100 (C) and 4gene specific markers which are RMS_PPR9_1 (D), RMS_PPR9_4 (E), PPR_9InDel (F)and PPR10_SNP (G) of rice cultivars. Lane M: GeneRuler 100 bp DNA plus DNA ladder (Thermo Scientific, USA). Lane 1:IR58025B (B line), Lane 2-4: R lines which were PTT1,CN1 and RD47, respectively.

Table 3 Molecular screening of rice cultivarsby SSR markers and genespecific markers of Rf4 locus

Cultivars/ SSR markers Rf4 specific markers Types RM171 RM258 RM6100 RMS_PPR RMS_PPR PPR_9In PPR10_S 9_1 9_4 Del NP IR58025B/B B B B B B B B PT1/R B B R R R R R CN 1/R B R R B R R B RD47/R R B R R R R R

B = maintainer or B line band, R= restorer or R line band

296 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้

วิจารณ์และสรุปผลการวิจัย

การจัดกลุ่มข้าวไทย 3 พันธุ์ โดยความสามารถในการแก้ความเป็นหมันของเรณูของข้าวไทยด้วยค่า PF และ SF ของข้าวลูกผสมระหว่าง IR58025A กับข้าวไทย พบว่าพันธุ์ปทุมธานี 1 ชัยนาท 1 และ กข47 มีค่า PF มากกว่า 80 % โดยเรณูของข้าวลูกผสมของพันธุ์ชัยนาท 1 และ กข47 มีชีวิตมากกว่าข้าวพันธุ์ปทุมธานี 1 ส่วนค่า SF ของข้าว ลูกผสมทั้ง 3 คู่ผสมนั้นมีค่าไม่แตกต่างกัน คือ 35-43% ในการจัดกลุ่มข้าว 3 พันธุ์นี้จัดเป็นกลุ่มRestorer ตามค่า PF ซึ่งให้ผลการจัดกลุ่มเช่นเดียวรายงานก่อนหน้านี้ที่จัดกลุ่มข้าวไทยพันธุ์ ชัยนาท 1 สุพรรณบุรี 1 และ กข31 เป็น restorer ด้วยการตรวจสอบความมีชีวิตของเรณูของลูกผสมระหว่างพันธุ์ข้าวไทยที่ต้องการทดสอบกับข้าวสายพันธุ์ เรณูเป็นหมัน (Seesang et al., 2014) ในขณะที่ค่า SF นั้นอาจจะไม่เหมาะสมในการจัดกลุ่มเนื่องจากค่าที่ได้นั้น เป็นของกลุ่ม Partial maintainer โดยอาจจะเป็นเกิดจากสภาวะอากาศไม่เหมาะสมกับการติดเมล็ด การคัดเลือกด้วยเครื่องหมายดีเอ็นเอต่อต าแหน่ง Rf4 ทั้งชนิด SSR จ านวน 3 เครื่องหมาย และที่จ าเพาะกับยีน จ านวน 4 เครื่องหมาย ที่มีรายงานว่าสัมพันธ์กับความสามารถแก้ความเป็นหมันของเรณูพบว่า เครื่องหมาย RM6100 สัมพันธ์กับความสามารถในการแก้ความเป็นหมันของเรณู แสดงให้เห็นว่าเครื่องหมาย RM6100 นั้นใกล้ชิดกับยีนแก้ ความเป็นหมัน Rf4 ของข้าวไทยมากกว่าเครื่องหมายอื่น ซึ่งก็สอดคล้องกับการวิจัยก่อนหน้านี้ คือ 1.2 เซนติมอร์แกน (Waza and Jaiswal, 2016) จากการศึกษาข้าวจากกลุ่มวิจัยอื่นจะพบเครื่องหมายที่สัมพันธ์กับความสามารถในการ แก้ความเป็นหมันแตกต่างกัน ส่วนเครื่องหมายที่จ าเพาะกับยีน พบว่าเครื่องหมาย RMS_PPR9_4 และเครื่องหมาย PPR_9InDel สัมพันธ์กับความสามารถในการแก้ความเป็นหมัน แสดงให้เห็นว่าข้าวไทยนั้นมียีนแก้ความเป็นหมันที่ ต าแหน่ง Rf4 แตกต่างกัน และแตกต่างจากข้าวที่มีการศึกษามาก่อนหน้านี้ (Kiani, 2015; El-Namaky et al., 2016; Waza and Jaiswal, 2016 และ Pranathi et al., 2016)

กิตติกรรมประกาศ

การวิจัยนี้ได้รับการสนับสนุนงบประมาณการวิจัยจากทุนอุดหนุนวิจัยจากส านักงานคณะกรรมการวิจัย แห่งชาติ ผ่านมหาวิทยาลัยแม่โจ้ ประจ าปีงบประมาณ พ.ศ. 2560

เอกสารอ้างอิง

Kiani, G. 2015. Validation of SSR markers linked to restoring fertility (Rf) genes and genotyping of rice lines at Rf Loci. Journal of Agricultural Science and Technology 17: 1931-1938. Pranathi, K., Viraktamath, B.C., Neeraja, C., Balachandran, S.M., Prasad, A.S. Hari, Rao, P. Koteswara, P. Revathi, P. Senguttuvel, S.K. Hajira, and C.H. Balachiranjeevi. 2016. Development and validation of candidate gene-specific markers for the major fertility restorer genes, Rf4 and Rf3 in rice. Molecular Breeding 36: 145.

รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้ 297 Ponjaroenkit, S., K. Janpen, C. Sakulsingharoj and V. Sangtong. 2017. Development of allele- specific SNP markers for PPR10 gene at Rf4 locus of Fertility Restorer Gene using for Identification of Maintainer and Restorer lines. In Press. Raafat, El-Namaky, Sedeek, Saber, Moukoumbi, Yonnelle Dea, Ortiz, Rodomiro and Manneh, Baboucarr. 2016. Microsatellite-aided screening for fertility restoration genes (Rf) facilitates hybrid improvement. Rice Science 23: 160-164. Seesang J., Sripichitt P. and Sreewongcha, T. 2014. Heterosis and inheritance of fertility-restorer genes in rice. ScienceAsia 40: 48-52 Tang, H., D., Luo, D., Zhou, Q., Zhang, D., Tian, X., Zheng, L., Chen and YG, Liu. 2014. The Rice Restorer Rf4 for wild-abortive cytoplasmic male sterility encodes a PPR protein that functions in reduction of WA352 transcripts. Mol Plant 7: 1497-1500. Tomohiko, Kazama and Toriyama, Kinya. 2014. A fertility restorer gene, Rf4, widely used for hybrid rice breeding encodes a pentatricopeptide repeat protein. Rice 7: 28. Waza, S.A., and H.K., Jaiswal. 2016. Identfication of elite grain quality restorers and maintainers for WA CMS lines of rice (Oryza sativa L.). SABRAO. Journal of Breeding & Genetics 48: 145-153.

298 รายงานการประชุมวิชาการ ประจ าปี 2560 7-8 ธันวาคม 2560 ณ อาคารเฉลิมพระเกียรติสมเด็จพระเทพรัตนราชสุดา มหาวิทยาลัยแม่โจ้