DISS 2013 Renan Vitek.Pdf

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DA CASCA DO CAULE E FOLHAS DE Eugenia dysenterica DC. (Myrtaceae)

Renan Vitek

CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL 2013 ii

RENAN VITEK

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DA CASCA DO CAULE E FOLHAS Eugenia dysenterica DC. (Myrtaceae)

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Química, para obtenção do título de Mestre em Química, Área de concentração Produtos Naturais e Derivados.

CUIABÁ MATO GROSSO – BRASIL

iii

2013

RENAN VITEK

ESTUDO QUÍMICO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DA CASCA DO CAULE E FOLHAS Eugenia dysenterica DC. (Myrtaceae)

APROVADO: 27 de setembro de 2013

______Profa. Dr. Francisco Eduardo Aragão Catundo júnior Faculdades INTA

______Profa. Dr a. Tereza Auxiliadora Nascimento Ribeiro DQ-UFMT

______Profa. Dr a. Virgínia Cláudia Silva (Orientadora) DQ - UFMT

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho a minha família, a minha orientadora Vírginia C. Silva e aos amigos que sempre me apoiaram.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela sabedoria e principalmente pelas realizações obtidas na vida. Gostaria de agradecer também a minha orientadora Profa. Dra. Vírginia Claudia Silva, primeiramente por aceitar o desafio e segundo por compreender os momentos de dificuldades que passei durante esse tempo, se mostrando mais do que uma simples orientadora, e sim uma amiga e parceira que levo pra sempre no coração. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Quimica da UFMT, que me proporcionaram conhecimento. Um agradecimento especial ao Prof. Dr. Evandro L. D. Ogllio, pelos seus serviços frente a coordenação do programa e participação na banca de qualificação, agregando suas observações ao trabalho e a Profa. Dra. Tereza A. N. Ribeiro (DQ-UFMT), que acompanhou o fechamento deste trabalho, se mostrando sempre a disposição nas dúvidas e por também participar das bancas de qualificação e defesa dessa dissertação, assim como agradeço ao Prof. Dr. Francisco E. A. C. Júnior (Faculdades INTA) pela disponilibidade e contribuição ao trabalho final, participando da defesa final deste trabalho. Ao Prof. Dr. Mário Geraldo, por gentilmente ceder sua estrutura na UFRRJ (Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro) proporcionando assim a obtenção dos espectros de RMN que constituem a parte principal deste trabalho e ao Prof. Dr. Marcos Soares (LABEM-UFMT) por realizar a atividade antioxidante das amostras no laboratório em que coordena. Agradeço aos colegas de mestrado que me acompanharam durante a execução do trabalho. As alunas de inicação científica, Leila e Leice, pelos trabalhos prestados. Meus agradecimentos especiais aos amigos que sempre me apoiaram e não me deixaram desistir, fazendo com que eu acreditasse que tudo daria certo. Principalmente aqueles que fizeram parte da minha rotina nestes últimos anos (não citarei nomes para não esquecer de nenhum). Agradecimentos também a CAPES, CNPQ e UFMT juntamente com os outros órgãos de pesquisa (INAU, CPP), juntamente com seus representantes e técnicos, que tornaram o programa possível e principalmente no fomento a execução do meu trabalho. Por fim, gostaria de agradecer a minha família pelo suporte prestado ao longo de todos esses anos, me proporcionando tal realização.

RESUMO

VITEK, R., Universidade Federal de Mato Grosso, setembro de 2013. Estudo químico e avaliação da atividade antioxidante das substâncias isoladas da casca do caule e folhas da Eugenia dysenterica DC. (Myrtaceae) Orientadora: Vírginia Claudia da Silva.

A família Myrtaceae , representa cerca de 150 gêneros e 4.620 espécies e se destaca por conter um grande número de espécies com potencial alimentício . A Eugenia dysenterica DC. conhecida popularmente como cagaita é uma espécie frutífera nativa do cerrado e pantanal brasileiro pertencente à família Myrtaceae . Esta é popularmente indicada na medicina popular contra a disenteria, diabetes e icterícia. Estudos fitoquímicos relacionados a plantas deste gênero relatam o isolamento de flavonoides, taninos, chalconas, polifenois e constituintes de óleos essenciais sendo que muitos destes compostos têm apresentado atividades biológicas. Dessa forma, pela indicação popular no tratamento de doenças, o isolamento de compostos de plantas do gênero que são relacionados a atividades biológicas e a ausência de estudos fitoquímicos e farmacológicos da Eugenia dysenterica , o objetivo deste trabalho foi no isolamento e a identificação dos constituintes da Eugenia Dysenterica e avaliar a atividade antioxidante pelo método do DPPH desses compostos isolados. Para obtenção dos compstos isolados, o material vegetal, casca do caule e folhas coletados na rodovia Poconé-Porto Cercado km 8, município de Poconé/MT foram macerados com metanol a frio durante um ciclo de 7 dias, fornecendo assim os resíduos hidroalcóolicos das cascas do caule e folhas. Estes foram particionados para obtenção das frações com hexano (Hex), clorofórmio (CHCl 3), acetato de etila (AcOEt), butanol (ButOH) e metanol (MeOH), respectivamente. O estudo das folhas levou ao isolamento dos ésteres 3-hidroxi-4- metoxibenzoato de metila (1) , 4-hidroxifenil propionato de metila (2) , E-4-hidroxicinamato de metila (3) , 3-O-β-glicopiranosil-β-sitosterol (6) , todos estes obtidos da fração clorofórmio, além dos flavonoides 3-O-β-galactopiranosil quercetina ( 8) e quercetina 3-O- β-(6”-galoilglicopiranosídeo) ( 9), obtidos a partir da fração acetato de etila. Nas cascas do caule foram identificados o ácido 3-β-O–acetil–olean–12-en–28 óico (4) e ácido 3-β-acetil- 12-ursen-28-óico (5) e na fração butanol foi obtida a isoquercetina (7) . Para a determinação estrutural foram utilizadas técnicas de RMN de 1H e 13 C (1D e 2D), IV e comparação com dados da literatura. Todas as amostras tiveram sua atividade antioxidante testadas, entretanto somente as amostras 7, 8 e 9 que são compostos flanoidícos apresentaram alto poder antioxidante, o que pode ser justificado pela presença do anel catecol nestes compostos.

Palavras-chave: Eugenia dysenterica, antioxidante, flavonoides, triterpenos.

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ABSTRACT

VITEK, R., Federal University of Mato Grosso, September 2013. Chemical study and evaluation of the antioxidant activity of compunds isolated from the stem barks and leaves of Eugenia dysenterica DC. (Myrtaceae) Advisor: Virginia Claudia da Silva.

The family Myrtaceae, representing about 150 genera and 4,620 species and is distinguished by containing a large number of species with potential food. The Eugenia dysenterica DC. cagaita is popularly known as a fruit species native savannah and wetland Brazilian belonging to the family Myrtaceae. This is commonly indicated in folk medicine against dysentery, diabetes and jaundice. Phytochemical studies related to plants of this genus have reported the isolation of flavonoids, tannins, chalcones, polyphenols and constituents of essential oils and many of these compounds have shown biological activities. Thus, the indication popular in the treatment of diseases, the isolation of compounds from plants of the genus that are related to biological activities and the absence of phytochemical and pharmacological studies of Eugenia dysenterica, the aim of this work was the isolation and identification of the constituents of Eugenia dysenterica and evaluate the antioxidant activity by the DPPH method these isolated compounds. To obtain the compstos isolated the plant material , the stem bark and leaves collected at highway - Poconé Porto Cercado 8 km , city of Poconé / MT were cold macerated with methanol over a 7 day cycle , thus providing waste the peel hydroalcoholic stem and leaves . These were partitioned to obtain fractions with hexane ( Hex) , chloroform (CHCl 3), ethyl acetate (EtOAc) , butanol (ButOH) and methanol (MeOH), respectively. The study led to the isolation of the sheets esters of 3-hydroxy-4-methoxy methyl (1) , 4- hydroxyphenyl propionate methyl (2) , E-methyl-4-hydroxycinnamate (3) , 3-O-β- glucopyranosyl β-sitosterol (6) , all of these obtained from the chloroform fraction, and the flavonoid 3-O-β-galactopyranosyl quercetin (8 ) and quercetin 3-β-O-(6’’galloyl glycopiranosyl) (9) obtained from the ethyl acetate fraction . In the stem bark were identified acid 3-β-O-acetyl- olean-12-en-28 oic acid (4) acid and 3-acetyl-β-12-Ursen-28- oic acid (5) and the butanol fraction was isoquercetina (7) obtained. For structural determination techniques were used for 1H and 13 C NMR (1D and 2D), IR and comparison with literature data. All samples tested had its antioxidant activity, but only for samples 7, 8 and 9 which are flanoidícos compounds showed high antioxidant power, which can be explained by the presence of the catechol ring in these compounds.

Keywords: Eugenia dysenterica , antioxidant, flavonoids, triterpenes

viii

SUMÁRIO

SUMÁRIO ...... viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ...... x

LISTA DE TABELAS ...... xi

LISTA DE FIGURAS ...... xii

1. INTRODUÇÃO ...... 1

1.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 2

1.1.1. FAMÍLIA MYRTACEAE ...... 2

1.1.2. GÊNERO EUGENIA ...... 4

1.2. ASPECTOS QUÍMICO-FARMACOLÓGICOS ...... 8

1.2.1. Flavonoides ...... 8

1.2.2. Antocianinas ...... 17

1.2.3. Terpenos e Esteroides ...... 20

1.2.4 Carotenoides ...... 24

1.2.4. Taninos e Outros Polifenóis ...... 25

1.2.5. Óleos Essenciais ...... 30

1.2.6. Cromonas ...... 31

1.3. EUGENIA DYSENTERICA ...... 32

3. OBJETIVOS ...... 35

3.1. OBJETIVOS GERAIS ...... 35

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 35

4. PARTE EXPERIMENTAL ...... 35

4.1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ...... 35

4.1.1. Material botânico ...... 35

4.1.2. Solventes ...... 35

4.1.3. Evaporação de solventes ...... 36

4.1.4. Cromatografia em coluna clássica ...... 36

4.1.5. Cromatografia em camada delgada ...... 36

4.1.6. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear ...... 36

4.1.7. Espectroscopia de Infravermelho ...... 36

4.1.8. Determinação da atividade antioxidante pelo método de Sequestro do radical DPPH ...... 37

4.2. MÉTODOS ...... 37

4.2.1. Secagem e trituração do material botânico ...... 37

4.2.2. Extrato bruto metanólico (EBMeOH) ...... 37

4.2.3. Partição sólido-líquido do EBMeOH das cascas do caule ...... 37

4.2.4. Partição sólido-líquido do EBFMeOH das folhas ...... 38

4.2.5. Fracionamento da fração hexano das cascas do caule (FHex) ...... 39

4.2.6. Fracionamento fração butanol da casca do caule (FBuOH) ...... 40

4.2.6. Fracionamento da fração clorofórmio das folhas (FFCHCl 3) ...... 42

4.2.7. Fracionamento da fração Acetato de Etila das folhas (FFACoEt) ...... 43

4.2.8. Atividade antioxidante quantitativo ...... 46

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 47

5.1. Substâncias Isoladas das folhas e casca do caule de Eugenia dysenterica ...... 47

5.2. Identificação da substância 1 ...... 49

5.3. Identificação das substâncias 2 e 3 ...... 53

5.4. Identificação das substâncias 4 e 5 ...... 61

5.5. Identificação da substância 6 ...... 69

5.6. Identificação da substância 7 ...... 75

5.7. Identificação da substância 8 ...... 87

5.8. Identificação da substância 9 ...... 96

5.9. Avaliação da atividade antioxidante ...... 106

6. CONCLUSÕES ...... 108

REFERÊNCIAS ...... 109

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

CC Coluna clássica CCD Cromatografia em camada delgada CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa Hex Hexano DCM Diclorometano AcOEt Acetato de etila ButOH Butanol MeOH Metanol MeOD 4 Metanol deuterado EtOH Etanol CHCl 3 Clorofórmio CDCl 3 Clorofórmio deuterado EBEtOH Extrato bruto etanólico RMN Ressonância magnética nuclear RMN de 13 C Ressonância magnética nuclear de carbono 13 C RMN de 1H, Ressonância magnética nuclear de hidrogênio 1H UV Ultravioleta IV Infravermelho DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer DEPT-Q Distortionless enhancement by polarization transfer quantum COSY Correlated spectroscopy HMBC Heteronuclear multiple bond correlation HSQC Heteronuclear single quantum coherence s Singleto d Dubleto dd Duplo dubleto FAcOEt Fração acetato de etila FFAcOEt Fração acetato de etila das folhas FHex Fração hexano caule FFHex Fração hexano folhas FMeOH Fração metanol caule FFMeOH Fração metanol folhas FCHCl 3 Fração clorofórmio caule FFCHCl 3 Fração clorofórmio folhas FEButOH Fração butanol caule FFButOH Fração butanol folhas EBV Vírus epstein-barr HIV Vírus da imunodeficiência humana CHD Doenças coronárias no coração Rf Fator de retenção δ Descolamento químico em ppm ѵ Estiramento DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila TMS Tetramesilsilano DMSO-d6 Dimetil sulfóxido deuterado

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Sistema de eluição para a FHex das cascas do caule...... 39

Tabela 2 – Sistema de eluição para o FFCHCl 3 das folhas...... 42

Tabela 3 – Sistema de eluição para o SECHCl 3 das folhas...... 44

Tabela 4. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da substância 1 em 50 CDCl 3.

Tabela 5. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da mistura 2 e 3 em 54 CDCl 3.

Tabela 6. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (500 MHz) da mistura 4 e 5 em 62 CDCl 3.

Tabela 7. Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de 13 C (400 MHz) da substância 6 em 70 DMSO-d6.

Tabela 8. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da substância 7 em 76 MeOD 4.

Tabela 9. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da substância 8 em 88 MeOD 4.

Tabela 10 . Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de 13 C (100 MHz) da substância 9 97 em DMSO-d6.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição geográfica da família Myrtaceae…….…………...……….... 4

Figura 2 . Distribuição geográfica do gênero Eugenia ...... 5

Figura 3. Esqueleto da estrutura dos flavonoides.……………………….…………. 9

Figura 4. Diferenciação das classes flavonoidicas...... 10

Fi gura 5. Esqueleto da estrutura dos triterpenos...... 35

Figura 6. Eugenia dysenterica no período de floração...... 36

Figura 7. Fruto da Eugenia dysenterica...... 37

Figura 8. Distribuição natural da E. dysenterica (cagaita) em 110 localidades no 38 Bioma Cerrado.

Figura 9. Esquema de fracionamento do Extrato Bruto Metanólico da casca do 45 caule da Eugenia dysenterica .

Figura 10 . Esquema de fracionamento do Extrato Bruto Metanólico das folhas 46 da Eugenia dysenterica .

Figura 1 1. Esquema de fracionamento da fração hexano da casca do caule e 47 isolamento dos constituintes químicos.

Figura 1 2. Esquema de fracionamento da fração butanol da casca do caule e 47 isolamento dos constituintes químicos.

Figura 1 3. Esquema de fracionamento da fração clorofórmio das folhas e 48 isolamento dos constituintes químicos.

Figura 1 4. Esquema de fracionamento da fração acetato de etila das folhas e 52 isolamento dos constituintes químicos.

1 Figura 1 5. Espectro de RMN de H da substância 1 (CDCl 3, 500 MHz)...... 53

1 Figura 1 6. Expansão do espectro de RMN de H da substância 1 (CDCl 3, 500 53 MHz) na região entre δH 6,7 a 7,8.

Figura 1 7. Expansão do mapa de contornos HMQC da substância 1 (CDCl 3, 54 125 MHz).

Figura 1 8. Expansão do mapa de contornos HMBC da substância 1 (CDCl 3, 54 125 MHz).

2 3 Figura 1 9. Representação do acoplamento JCH e JCH de 1...... 56

Figura 20 . Espectro de infravermelho da mistura 2 e 3 em KBr (cm -1)...... 57

1 Figura 21. Espectro de RMN de H da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 500 MHz)...... 58

xiii

1 Figura 2 2. Expansão do espectro de RMN de H da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 500 58 MHz) na região entre 6,30 a 8,0 ppm.

1 Figura 2 3. Expansão do espectro de RMN de H da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 500 59 MHz) na região entre 2,4 a 4,0 ppm.

Figura 2 4. Espectro de DEPT-Q da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz)...... 59

Figura 2 5. Expansão do espectro de DEPT-Q da mistura 2 e3 (CDCl 3, 125 60 MHz) na região entre δC 105,0 a 160,0.

Figura 2 6. Mapa de contornos HMQC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz)...... 60

Figura 2 7. Expansões do mapa de contornos HMQC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 61 125 MHz).

Figura 2 8. Mapa de contornos HMBC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz)...... 62

Figura 2 9. Expansões do mapa de contornos HMBC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 65 125 MHz).

1 Figura 30 . Espectro de RMN de H da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 500 MHz)...... 67

1 Figura 3 1. Expansão do espectro de RMN de H da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 500 67 MHz) na região entre 0,5 a 5,5 ppm.

Figura 3 2. Espectro DEPT-Q da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 500 MHz)...... 68

Figura 3 3. Expansão do espectro DEPT-Q da mistura 4 e 5 (CDCl3, 500 MHz) 69 na região entre 5 a 55 ppm.

Figura 3 4. Mapa de contornos HMQC da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 125 MHz)...... 70

Figura 3 5. Mapa de contornos HMBC da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 125 MHz)...... 71

Figura 3 6. Expansões do mapa de contornos HMQC da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 71 125 MHz).

Figura 3 7. Espectro de infravermelho da mistura 4 e 5 em KBr (cm -1)...... 74

1 Figura 3 8. Espectro de RMN H (DMSO-d6, 400 MHz) da substância 6...... 75

1 Figura 3 9. Expansão do espectro de RMN H (DMSO-d6, 400 MHz) da subst. 6. 76

Figura 40 . Espectro de DEPT-Q (DMSO-d6, 100 MHz) da substância 6...... 77

Figura 4 1. Expansão do espectro de DEPT-Q (DMSO-d6, 100 MHz) da 77 substância 6 na região entre 10,0 a 78,0 ppm.

Figura 4 2. Espectro de infravermelho da substância 6 em KBr (cm -1)...... 80

Figura 43. Espectro de infravermelho da substância 7 em KBr (cm -1)...... 80

xiv

1 Figura 4 4. Espectro de RMN de H (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 7...... 81

1 Figura 4 5. Expansão do espectro de RMN de H (MeOD 4, 500 MHz) da 82 amostra 7 na região entre 6,0 a 8,0 ppm

1 Figura 4 6. Expansão do espectro de RMN de H (MeOD 4, 500 MHz) da 83 amostra 7 na região entre 0,0 a 5,5 ppm.

Figura 4 7. Espectro de RMN DEPT-Q (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7...... 84

Figura 4 8. Expansão do espectro de RMN DEPT-Q (MeOD 4, 125 MHz) da 85 amostra 7 na região entre 93,0 a 180,0 ppm.

Figura 4 9. Expansão do espectro de RMN DEPT-Q (MeOD 4, 125 MHz) da 86 amostra 7 na região entre 42,0 a 78,0 ppm.

Figura 50 . Mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 7...... 87

Figura 51. Expansões do mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da 88 amostra 7.

Figura 5 2. Mapa de contornos HSQC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7...... 89

Figura 5 3. Mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7...... 90

Figura 5 4. Expansão do mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da 93 amostra 7.

Figura 55. Espectro de infravermelho da substância 8 em KBr (cm -1)...... 93

1 Figura 5 6. Espectro de RMN H da amostra 8 (MeOD 4, 500 MHz)...... 94

1 Figura 5 7. Expansão do espectro de RMN de RMN H da amostra 8 (MeOD 4, 95 500 MHz) na região entre 6,2 a 7,8 ppm (A) e 3,0 a 5,3 ppm (B).

Figura 5 8. Espectro de RMN DEPT-Q da amostra 8 (MeOD 4, 125 MHz)...... 96

Figura 5 9. Expansão do espectro de RMN DEPT-Q da amostra 8 (MeOD 4, 125 97 MHz) na região entre 65,0 a 122,0 ppm.

Figura 60 . Mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 8...... 98

Figura 6 1. Expansões do mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da 99 amostra 8.

Figura 6 2. Mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 8...... 100

Figura 6 3. Expansões do mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da 101 amostra 8.

Figura 6 4. Mapa de contornos HSQC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 8...... 102

Figura 6 5. Expansões do mapa de contornos HSQC (MeOD 4, 125 MHz) da 105 amostra 8.

Figura 66. Espectro de infravermelho da substância 9 em KBr (cm -1)...... 105

1 Figura 6 7. Espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9...... 106

1 Figura 6 8. Expansão do espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da 106 amostra 9 na região entre 6,85 a 7,8 ppm.

1 Figura 6 9. Expansão do espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da 107 amostra 9 na região entre 4,5 a 6,5 ppm.

1 Figura 70 .Expansão do espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da 108 amostra 9 na região entre 3,0 a 4,5 ppm.

13 Figura 7 1. Espectro de RMN de C (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9...... 109

13 Figura 7 2. Expansão do espectro de RMN de C (DMSO-d6, 100 MHz) da 110 amostra 9 na região entre 115,0 a 180,0 ppm.

Figura 7 3. Mapa de contornos COSY (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9...... 111

Figura 7 4. Expansões do mapa de contornos COSY (DMSO-d6, 400 MHz) da 112 amostra 9.

Figura 7 5. Mapa de contornos HMBC (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9...... 113

Figura 7 6. Expansão do mapa de contornos HMBC (DMSO-d6, 100 MHz) da 114 amostra 9.

Figura 7 7. Mapa de contornos HSQC (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9...... 115

Figura 7 8. Expansões do mapa de contornos HSQC (DMSO-d6, 100 MHz) da 117 amostra 9.

Figura 79 . Avaliação da capacidade de redução do radical DPPH das misturas 119 2 e 3, 4 e 5, além das substãncias 6, 7 ,8, 9 e padrão de ác. Ascórbico

1. INTRODUÇÃO

É de conhecimento duma grande parte da população que, as plantas são utilizadas como agentes terapêuticos desde os primórdios da civilização humana. Durante o século XIX, a química farmacêutica passou a utilizar tais plantas como fontes de princípios ativos no desenvolvimento de fármacos (RATES, 2001). A partir disso, surgiu um grande interesse em estudos relacionando a utilização popular destas para fins medicinais, comprovando assim seus possíveis benefícios. Desta forma, uma vez que comprovada a ação farmacológica de determinada planta, haveria uma extensão do seu uso pela população e até mesmo na formulação de medicamentos pelas indústrias (CAMARGO, 1998; DAVID et al., 2004). Sabe-se que até os dias atuais, existem diversas comunidades isoladas e até mesmo regiões que são destaque na área da saúde, onde grande parte de uma determinada população cultiva plantas medicinais em suas propriedades, voltados principalmente para o uso próprio ou até mesmo para comercialização em feiras e mercados públicos, o que ainda é muito comum no Brasil, principalmente nas regiões norte e nordeste (MACIEL et al., 2002; BAG et al., 2012). Infusões e decocções de plantas medicinais são utilizadas como “remédios” populares em vários países, sendo uma alternativa no tratamento em diversas patologias tais como antiúlcera, antitumoral, antidiabetes entre outras (ELISABETSKY, 1987; BARROSO, 1991). Diversos compostos que são importantes constituintes utilizados tanto na farmacologia como fisiologia e em estudos bioquímicos, são obtidos de plantas medicinais (WILLIAMSON et al., 1996). Quando nos referimos as plantas como fontes de princípios ativos para medicamentos, se torna expressivo o número destes disponíveis na terapêutica atual ao exemplo da escopolamina (utilizada como sedativo), quinina (antimalárico), eugenol (analgésico tópico), cafeína (estimulante do sistema nervoso central) (HOUGHTON & RAMAN, 1998), morfina (analgésico), reserpina (tranquilizante) entre outros (PHILLIPSON, 2001). Além da importância na descoberta de novas moléculas, trabalhos voltados para a área da fitoquímica têm sido empregados, juntamente com testes biológicos, para que dessa forma, se torne possível identificar moléculas com potencial terapêutico (BAG et al., 2012). Usualmente, técnicas cromatográficas, como a cromatografia em coluna clássica (CC), cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP), são empregadas no estudo de produtos naturais de origem vegetal, buscando principalmente o isolamento e a purificação de metabólitos, para posterior

elucidação quando associado com as principais técnicas espectrométricas e espectroscópicas de identificação, tais como espectrometria de massas (EM), ressonância magnética nuclear (RMN), ultravioleta (UV) e infravermelho (IV) (SIMÕES et al., 2003; HOSTETTMAN et al., 2003). Dentre os estudos voltados para produtos naturais, as espécies da família Myrtaceae são frequentemente encontradas em várias florestas neotropicais. No Brasil é uma das famílias mais importantes sendo encontrada com frequência no Cerrado e Pantanal mato-grossense (STEFANELLO et al., 2011). Pode-se dizer que o gênero mais representativo desta família são as espécies do gênero Eugenia . Estas são plantas aromáticas que produzem frutos frescos, que são muito importantes para preservar a fauna das regiões onde são encontradas. Várias espécies são cultivadas, devido seus frutos comestíveis, de raro aroma e sabor, contribuindo para o desenvolvimento econômico, além de serem relatadas propriedades medicinais relevantes sendo largamente utilizadas pela população no tratamento de diarréias, diabetes e outras doenças (MUKHERJEE et al., 1998; TANWAR et al., 2011; STEFANELLO et al., 2011). Outros trabalhos também destacam o uso do gênero Eugenia na medicina popular, assim como sua importância econômica e relevância quimiossistemática (CARDOSO et al., 2011). Dessa forma, diversos estudos fitoquímicos e farmacológicos tem sido realizados neste gênero nos últimos anos, demonstrando também as atividades citotóxica, anti-inflamatória, entre outras (BALIGA, 2011; UEMATSU et al.,1999). Dentre estas, a Eugenia dysenterica DC. , que é uma árvore típica do Cerrado, também encontrada no pantanal mato-grossense, vem sendo empregada no tratamento de diversas doenças pela população dessas regiões. Como são poucos os trabalhos direcionados a esta espécie, não sendo encontrados estudos fitoquímicos, se torna importante a caracterização química desta, procurando associar sua composição e a comprovação ou não do seu emprego medicinal popular.

1.1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1.1. FAMÍLIA MYRTACEAE

A família Myrtaceae, representa cerca de 150 gêneros e 4.620 espécies (MABBERLEY, 1997), que se dividem em duas seções: a primeira contém as Myrteas, as Lepiospermeas e as Chamelauceas, e a segunda pertence às Lecythideas e as Puniceas (DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002). Dentro da Myrtaceae, as espécies dos gêneros

Eugenia (sinônimo de Syzygium) e Eucalyptus são frequentemente encontradas nas regiões tropicais e temperadas do hemisfério Sul (CHEEWANGKOON et al., 2009). A família é marcada por características como a formação de bolsas secretoras de essências, característica esta marcante na família, resultando daí a denominação Myrtaceae, derivada do grego “myron” que significa perfume (LANDROUM & KAWASAKI, 1997). A família Myrtaceae, se destaca por conter um grande número de espécies com potencial alimentício, que podem ser comercializados na sua forma em natura para a fabricação de sorvetes, sucos, iogurtes, licores, doces e compotas. Exemplos de vegetais importantes que dão frutos comestíveis são: a jaboticabeira ( Eugenia cauliflora ), a goiabeira ( Psidium guajava ), a romeira ( Punica granatum ), a uvaia ( Eugenia uvalha ), o jambo ( Eugenia jambolana ) e o castanheiro do Pará ( Bertholletia excelsa ). Há também os ditos aromáticos, como o craveiro da Índia ( Caryophillus aromatica ), a murfa ( Myrthus communis ), o cajepute ( Melaleuca cajeput ) (ROMAGNOLO & SOUZA, 2006) e ainda algumas que oferecem madeira de qualidade empregada em construção (BARROSO, 1991; DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002). Entre os frutos pertencentes a esta família, a goiaba amarela ( Psidium cattleyanum) , a guabiroba ( Campomanesia canthocarpa) e a uvaia ( Eugenia uvalha ) são exemplos que possuem indicação popular para tratamento de diversas doenças como o controle da hipertensão, diminuição do colesterol e ácido úrico, emagrecimento, potencial uso no tratamento de HIV, antitumoral, malária e processos inflamatórios (SCHMEDA- HIRSCHMANN et al., 1987). Muitas das espécies desta família são utilizadas na medicina popular, como antidiarréica, antimicrobiana, antioxidantes, antirreumática, anti-inflamatória e até mesmo na redução do colesterol no sangue (DI STASI & HIRUMA-LIMA, 2002; GLESSLER et al., 2006). A Família Myrtaceae tem sido encontrada nas regiões tropicais e subtropicais do mundo como na Austrália, África e principalmente na América do Sul e América Central (MABBERLY, 1997) conforme é representado na Figura 1. Os principais gêneros da família são: Myrtus, Psidium, Pimenta, Eugenia, Pseudo caryophyllus, Syzygium, Eucalyptus, Leptospermun, Plinia e Malaleuca .

Figura 1. Distribuição geográfica da família Myrtaceae. Fonte: Missouri Botanical Garden(http://www.tropicos.org/NamePage.aspx?nameid=42000198&tab=mapsacessado em 28/06/2012) Quimicamente, vários compostos são típicos desta família, principalmente flavonoides, taninos, derivados fenólicos entre outros (KUSKOSKI et al., 2003; FISCHER et al., 2008). Além disso, esta família representa uma importante fonte de óleos essenciais (STEFANELLO et al., 2011) com atividades biológicas que variam de bactericida, fungicida, anti-inflamatória, entre outras. Esses óleos têm sido utilizados na indústria como agentes antimicrobianos e antifúngicos (VICTORIA et al.,2012).

1.1.2. GÊNERO EUGENIA

Dentro da família Myrtaceae, o gênero Eugenia se destaca com aproximadamente 500 espécies (ROMAGNOLO & SILVA, 2006), onde muitas destas são utilizadas na medicina popular nas mais diferentes regiões, sendo muito empregadas na Argentina, Paraguai e Brasil (MABBERLEY, 1997; SCHMEDA-HIRSCHMANN et al., 1987; CONSOLINI et al., 1999). As Eugenias encontram-se bem representadas nas diversas formações vegetacionais do Brasil, não apenas quanto à riqueza específica, mas também quanto à abundância e freqüência de suas espécies, muitas destas bem conhecidas, por se tratarem na maioria das vezes de árvores frutíferas (KLEIN, 1984; PEIXOTO & GENTRY, 1990; LEITÃO FILHO, 1993; CHAGAS & SILVA et al., 1995; RODRIGUES & NAVE, 2000; ARANTES & MONTEIRO, 2002).

O gênero Eugenia (sinônimo: Syzygium ) tem 14 espécies. Entre as mais conhecidas estão a Eugenia uniflora, Eugenia punissifolia, Eugenia jambolana , Eugenia umbeliflora, Eugenia caryophyllata entre outras . Dentre estas, todas têm sido citadas possuindo efeitos fisiológicos em várias espécies, incluindo o homem (TEIXEIRA et al., 1997; CONSOLINI et al., 1999). As folhas do gênero Eugenia são utilizadas para as mais diversas finalidades, onde suas atividades têm sido associadas a compostos como flavonoides, triterpenos, taninos e óleos essenciais constituídos de monoterpenos e sesquiterpenos que tem sido isolado a partir deste gênero (PIO CORRÊA, 1984; NEVES & DONATO, 1989;; LUNARDI et al., 2001), sendo também encontrados chalconas e polifenois. Devido à abundância destes compostos, principalmente os fenólicos as espécies pertencentes ao gênero Eugenia exibem uma grande atividade antioxidante (EINBOND et al., 2004). A distribuição das espécies do gênero Eugenia é apresentada na Figura 2, onde podemos notar que a sua distribuição é similar a da família Myrtaceae, sendo abundante em países como o México, Peru e Brasil.

Figura 2. Distribuição geográfica do gênero Eugenia . Fonte: Missouri Botanical Garden(http://http://www.tropicos.org/Name/40006825?tab=maps acessado em 14/01/2013) O gênero Eugenia vem se destacando na comunidade científica, sendo crescente o número de artigos publicados ao decorrer dos anos. Para se ter uma noção, quando utilizamos a palavra chave “ Eugenia ” no indexador SciFinder Scholar para os últimos 3

anos são encontradas 1.690 referências de um total 3.606 para todos os anos. Entretanto a grande maioria destes traz isoladamente estudos farmacológicos, contra as mais diversas patologias, sendo uma grande minoria os trabalhos direcionados a fitoquímica do gênero . Dentro do gênero Eugenia , as espécies listadas abaixo, são as que mais se destacam na quantidade de informações obtidas na revisão da literatura, se tratando da composição química das mesmas e suas atividades farmacológicas. A Eugenia uniflora mais conhecida como pitanga, é uma espécie típicamente brasileira e distribuída entre os trópicos e subtrópico onde se localizam países como Brasil, Índia e região sul da China. Suas folhas são largamente utilizadas na cultura popular (SANTOS et al., 2012). Pesquisas têm mostrado que o óleo essencial das folhas desta espécie, tem sido usado como agente digestivo e carminativo, já os taninos isolados desta planta têm sido associados à atividade antiviral, anti-HIV, inibição da peroxidação lipídica e antimutagênica (LEE et al., 1997). Estudos têm relatado que seu fruto, a pitanga, é também utilizado na medicina popular no tratamento de febre, reumatismo, no combate de desordens intestinais, atividade anti-inflamatória, diurética e abaixamento do nível de glicose no sangue (MATSUMURA et al., 2003; COLE et al., 2007; FIÚZA et al., 2008) além de atividade anti-hipertensiva (ARAI et al., 1999). O chá obtido da infusão das folhas da pitanga em água é utilizado no controle da hipertensão, diminuição do colesterol e ácido úrico, emagrecimento e também como adstringente e digestivo (SCHMEDA- HIRSCHMANN et al., 1987; ARAI et al., 1999). Há relatos de que as folhas, de Eugenia uniflora assim como os frutos, possuem atividades diuréticas, efeitos anti-inflamatórios (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al., 1987), efeitos anti-hipertensivos (SCHMEDA-HIRSCHMANN, 1988), antigota, hipoglicêmicos e hipotriglicéridico. Estudos sobre a composição química desta planta têm focado principalmente os constituintes voláteis a partir das folhas (PORCU et al., 2008; CHANG et al., 2011). Mas um número de polifenois e taninos também foram isolados e caracterizados (LEE et al., 1997; LAGO et al., 2008). Ainda nas folhas da Eugenia uniflora é relatada a presença de taninos, esteroides, triterpenos, flavonoides, saponinas, antraquinonas entre outros (LEE et al., 1997; LORENZI,1998). Compostos desta espécie possuem grande importância na química de produtos naturais, pois há estudos em que os taninos podem agir como agentes antissépticos, antimicrobianos, antidiarreico e cicatrizante (SIMÕES et al., 2003).

No Brasil, a Eugenia jambolana é conhecida pelo nome comum jambolão. As formulações a partir de suas folhas têm sido associadas à ação hipotensiva (ROMERO, 1995) além de ser considerada diurética, atividade esta, que se repete em estudos com as flores do jambolão (SILVA NETO et al., 1989). A casca do fruto de Eugenia jambolana demonstrou efeitos antidiarreicos (MUKHERJEE, 1997), bem como uma ação inibidora contra a atividade de protease do HIV-1 (KUSUMOTO et al., 1995), enquanto que as sementes desta planta demonstraram efeitos anticonvulsivantes (DE LIMA et al., 1998). Uma recente revisão mostrou que mais de 1.123 plantas tem sido utilizada etnofarmacologicamente ou experimentalmente utilizadas no tratamento dos sintomas da diabetes (AYYANAR et al., 2012). Entre estas, diferentes partes da Eugenia jambolana são frequentemente utilizadas para o tratamento de diabetes, já que estudos mostraram que quando administradas em formulações farmacêuticas levam a diminuição dos níveis de glicose no sangue nos animais diabéticos (PRINCE et al., 1998). Existem estudos que correlacionam as sementes da Eugenia jambolana com atividades hipoglicêmicas, anti-inflamatória, neuropsico-farmacológico, antibacteriano, anti-HIV e antidiarreico (BAG et al., 2012). Alguns trabalhos mostram que a administração do extrato etanólico das folhas e sementes resultaram numa diminuição significativas dos níveis de glicose, uréia e colesterol no sangue, sendo que nas folhas, foi observada uma maior atividade (SHARMA et al.,2003; RAVI et al., 2004). Já quando nos referimos ao efeito hipoglicêmico testados com o fruto da Eugenia jambolana , são observados maiores efeitos terapêuticos que outras partes desta planta (ACHREKAR et al., 1991). Pesquisas também mostraram que o extrato das folhas da Eugenia jambolana possui uma grande atividade citotóxica frente a células leucêmicas (YANG et al., 2000; PEPATO et al., 2005). Estudos fitoquímicos preliminares mostraram que os taninos hidrolisáveis são os constituintes majoritários na espécie. Há estudos que correlacionam estes metabólitos a atividade antitumoral (YANG et al., 2000). As atividades anti-inflamatória, antioxidante, antialérgica, antiviral e anticarcinogênica têm sido relacionadas à presença de flavonoides. Os extratos de Eugenia jambolana tem se mostrado ricos nestes metabólitos que também possuem efeito hipoglicêmico e hipolipididêmico que podem levar ao controle da diabetes (SHARMA et al., 2008). A revisão da literatura mostrou que plantas medicinais tradicionais possuindo propriedades antidiabéticas podem ser usadas como drogas ou adjuvante dietética simples para as terapias existentes da diabetes e complicações associadas a esta doença como, por exemplo, a aterosclerose (TANWAR et al.,2011).

Baguaçu é o nome popular dado à árvore e aos frutos de Eugenia umbelliflora . Esta espécie cresce em regiões selvagens do sul do Brasil e seus frutos são semelhantes a cerejas (KUSKOSKI et al., 2003). Essa planta é utilizada principalmente na região sul do país no combate à diabetes, diarréia, infecções e na redução dos níveis de colesterol e triglicerídeos (MAGINA et al., 2009). Embora o fruto desta espécie seja popular e comestível, não há muitos estudos voltados para esta espécie. As atividades, antibacteriana e antigástrica do extrato de folhas de baguaçu estão relacionadas à presença de triterpenos característicos da espécie segundo algumas pesquisas (MEYRE-SILVA et al., 2009). As antocianinas também estão presentes, se mostrando abundantes nos frutos, caracterizando a coloração dos mesmos. Tais metabólitos trazem diversos benefícios à saúde humana, como atividade antioxidante, anti-inflamatória, efeitos antidiabéticos, prevenção da obesidade entre outras (KUSKOSKI et al, 1995; HYDAMAKA, 2009; FLORES et al., 2012). A Eugenia caryophyllata é uma planta originária das Ilhas Molucas, mas cultivada em diversas ilhas da Ásia como Madagáscar e Ilhas Maurícias, bem como nas Seychelles e as Índias Ocidentais (POURGHOLAMI et al., 1999). No Brasil o botão de sua flor seca, é amplamente empregado na culinária, sendo mais conhecido como cravo-da-índia (CHIEB et al., 2007). Os óleos essenciais desta espécie são amplamente utilizados na medicina e na cosmética. Muitos estudos têm relatado que o óleo essencial do cravo apresenta atividade antimicrobianas, antifúngica (CHAMI et al., 2004) e anticarcinogênica (ZHENG et al., 1992). O cravo-da-índia se mostrou também eficaz contra um grande número de bactérias: Escherichia coli , Salmonela entérica , Salmonela enteritidis , e Staphylococcus aureus (CHAIEB et al., 2007; OUSSALAH et al., 2007). Na medicina tradicional chinesa, o cravo tem sido usado como estimulante contra distúrbios digestivos e diarréia. Na medicina popular iraniana, os gomos do cravo são usados como remédio antiepiléptico (POURGHOLAMI et al., 1999).

1.2. ASPECTOS QUÍMICO-FARMACOLÓGICOS

1.2.1. Flavonoides

Os flavonoides são substâncias de baixo peso molecular, encontrados em todas as plantas vasculares, com uma variedade de estruturas com base em um núcleo de três anéis comum. Estes compostos compõem uma ampla classe de substâncias de origem

natural. Os flavonoides têm sido reconhecidos por possuírem atividade antiinflamatória, antioxidante, antialérgicas, hepatoprotetor, antitrombóticas, antivirais e anticancerígenas (CARROLL et al., 1998; WELTON et al., 1988; SHARMA et al., 2008). É conhecida uma grande diversidade estrutural dos flavonoides normalmente a partir de um mesmo núcleo (Figura 3). Isso pode ser explicado pelas diversas modificações que tais compostos podem sofrer, tais como: hidroxilação, metilação, acilação, glicosilação, entre outras (KOES et al., 1994).

Figura 3. Esqueleto da estrutura dos flavonoides.

Os flavonoides são metabólitos especiais podem ser subdivididos conforme a Figura 4 em seis classes: antocianidinas (a) , catequinas (b) , flavonois (c) , flavanonas (d) , flavonas (e) , isoflavonas (f) (VEITCH & GRAYER, 2008).

+ O O O

OH OH OH O (a) (b) (c)

O O

(d) (f) (e)

Figura 4. Diferenciação das classes flavonoidicas.

Consumidos em grandes proporções dentro de uma dieta humana regular, os flavonoides são encontrados em vegetais, legumes, frutas, chás de ervas, mel, entre outros produtos de consumo cotidiano (AHERNE & O’BRIEN, 2002). Tais compostos possuem uma série de propriedades farmacológicas que os fazem atuarem sobre sistemas biológicos. Consequentemente, muitas dessas propriedades atuam de forma benéfica para a saúde humana (PETERSON & DWYER, 1998). De modo geral, os polifenois e em particular os flavonoides possuem estrutura ideal para o sequestro de radicais, sendo antioxidantes mais efetivos que as vitaminas C e E. A atividade antioxidante dos flavonoides depende da sua estrutura e pode ser determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de H e elétrons, estabilidade do radical formado, reatividade em frente a outros antioxidantes, capacidade de quelar metais de transição, solubilidade e interação com as membranas. (COTELLE et al., 1992; FERRALI et al., 1997; ARORA et al., 1998; BARREIROS et al., 2006). Um dos primeiros trabalhos com o gênero Eugenia , já descreve o isolamento de flavonoide das folhas de Eugenia biflora sendo encontrado o 5-Hidroxi 4’,7-dimetoxi-6,8 dimetilflavona (eucalipitina) (1) (GOTLLIEB, 1971).

O CH3 CH3 CH3 O O

H3C OH O

(1) Eucalipitina

No gênero Eugenia, os flavonoides são um dos principais metabólitos relatados. Entre estes são encontrados a quercetina (2) , miricetina (3), kaempferol (4), galocatequina (5) e isoramnetina (6) que foram isolados em diversas espécies, sendo mais frequentemente encontradados nas folhas de Eugenia jambolana, Eugenia edulis , Eugenia caryophyllata e Eugenia uniflora (LEE et al., 2000; MAHMOUD et al., 2001; RAVI et al., 2004; ATAWODI, 2011; BALIGA et al., 2011). Um estudo feito em 1992 mostra que a quercetina (2) e caempferol (4) foram encontrados nas taxas de 88% e 25% respectivamente nas folhas de espécies do gênero Eugenia que são características do continente americano, no entanto a isoramnetina (6) é

mais encontrada em espécies que pertencem a regiões do oriente (NOORMA et al., 1992). OH OH OH OH

OH O OH O OH

OH OH OH O OH O (2) Quercetina (3) Miricetina

OH OH OH OH O OH O OH OH OH O OH OH (4) Caempferol (5) Galocatequina

CH3 O OH

OH O

OH OH O (6) Isoramnetina Tais compostos são associados a atividades anticâncer atuando em diversos mecanismos de forma benéfica a saúde humana, entre estes a apoptose das células cancerígenas e modificação do mecanismo de crescimento das mesmas (NAIR et al, 2004; KANG et al., 2010; HUANG et al., 2010; ZHANG et al., 2010). Estudos também relatam a atividade anti-inflamatória, digestiva, antimicrobiana, antibacteriana entre outras a partir das folhas de Eugenia jambolana , nas quais estes flavonoides foram isolados (SLOWING, 1994; KARLA et al., 1996; HUSSEIN et al., 2003; SHARMA et al., 2008; ATAWADE et al., 2011; BAG et al., 2012).

Muitas espécies do gênero Eugenia têm sido reportadas como plantas ricas em flavonoides glicosilados, principalmente nas posições do carbono 3, 5 e 7 (KARLA et al., 1994; SCHMEDA-HIRSCHMANN, 1995; LEE et al., 1997; NAIR et al., 1999). Como exemplo destes são descritos a miricitrina (7) e quercitrina (8) que foram isolados das folhas da pitangueira ( Eugenia uniflora ) (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al., 1987). Estes compostos possuem propriedades inibidoras da xantina-oxidase que é usada no tratamento da gota (SCHMEDA-HIRSCHMANN et al., 1987) além da possível atividade hipotensora mediada por uma vasodilatação e efeito diurético provocado pelo aumento do fluxo sanguíneo (CONSOLINI et al., 1999).

OH OH OH OH

OH O OH O CH3 OH CH 3 O O O OH OH OH O O OH O OH OH

OH (7) Miricitrina (8) Quercitrina

Outros cinco flavonoides glicosilados relatados, são encontrados principalmente nas folhas da Eugenia jambolana , estes são: Mearnsetina 3-O-(4’’-O-acetil)-α-L- ramnopiranosídeo (9) , também isolado nas folhas de Eugenia javanica , a miricetrina (10) e seus derivados, miricetrina 4’’-O-acetil-2’’-O-galato (11) , miricetina 3-O-(4’’-O-acetil)-α-L- ramnopiranosídeo (12) , miricetina 4’-metil éter 3-O-α-L-ramnopiranosídeo (13) (VAISHNAVA & GUPTA, 1990; VAISHNAVA et al., 1992; MAHMOUD, 2001).

OH O R1 OH O OH

O OH O

H3C O

R 3 O OH O R2 (9) Mearnsetina 3-O-(4’’-O-acetil)-α-L-ramnopiranosideo

R1=H, R 2=H, R 3= -COCH 3 (10) Miricetrina

R1=R 2=R 3=H (11) Miricetrina 4’’-O-acetil-2’’-O-galato

R1=H, R 3= -COCH 3, R 2=Galato (12) Miricetina 3-O-(4’’-O-acetyl)-α-L-ramnopiranosídeo

R1=R 2=H, R 3= -COCH 3 (13) Miricetina 4’-metil éter 3-O-α-L-ramnopiranosídeo

R1=Me, R 2=R 3=H

Outra espécie pertencente à família das Myrtaceae e ao gênero Eugenia está a Eugenia Kurzii, uma espécie típica da costa oeste do Himalaia, nesta, dois glicosil- flavonoides foram isolados das partes aéreas, os quais foram identificados como 3-C- metil-lapigenina-5-O-ramnosídeo (14) e 3-C-metil-luteolina-5-O-ramnosídeo (15) (PAINULY, 1982).

H OH OH OH

OH O OH O

CH3 CH3 O O O O

CH CH O 3 O 3 OH OH

OH OH OH OH (14) 3-C-metil-lapigenina-5-O-ramnosídeo (15) 3-C-metil-luteolina-5-O-ramnosídeo

A Eugenia edulis, é uma árvore típica do Brasil, conhecida popularmente como jabuticabeira. Nesta espécie foram encontrados flavonoides glicosilados e também um poli oxigenado. Três destes são descritos como gossipetina-3,8-dimetiléter-5-O-β- glicosídeo (16), gossipetina-3,5-dimetiléter (17) e miricetina-3,5,3’-trimetiléter (18). Nesta mesma espécie foram isolados também a quercetina (2) , o kaempferol (4), além da quercetina-3-O-β-galactosídeo (19) e epi-galocatequina-3-O-galato (20) (HUSSEIN, 2003). Sabe-se que os extratos obtidos a partir de espécie do gênero Eugenia são ricos em flavonoides e são muito empregados na medicina popular como agente antimicrobiano e anti-inflamatório (DJIPA et al., 2000; SLOWING et al., 1994).

R3 OH R2 OH O OH

O O CH3 R1

(16) gossipetina-3,8-dimetiléter-5-O-β-glicosídeo R1=Glc, R2= -OCH 3, R 3=H

(17) gossipetina-3,5-dimetiléter R1=CH 3, R 2=OH, R 3=H

(18) miricetina-3,5,3’-trimetiléter R1=CH 3, R 2=H, R 3= -OCH 3

OH OH OH OH

OH O OH O OH OH

OH O O O OH O OH O OH OH O OH OH OH (19) quercetina-3-O-β-galactosideo (20) epi-galocatequina-3-O-galato

Em estudos anteriores, o extrato das folhas de Syzygium aqueum , mostrou um conteúdo com seis compostos bioativos, sendo eles: miricetina-3-O-ramnosídeo (21), europetina-3-O-ramnosideo (22), 4-hidroxibenzaldeído (23), floretina (24) , mirigalona-G (25) e mirigalona-B (26) (MANAHARAN et al., 2012). Individualmente, alguns destes compostos têm sido relatados para uma variedade de propriedades benéficas; a miricetina-3-O-ramnosideo (21) por sua vez já apresentou atividade antidiabética (YOSHIKAWA et al., 1998), antioxidante (SIMIRGIOTIS et al. , 2008), e capacidade hepatoprotetora (LIU et al., 2011); floretina (24) apresentou propriedades antiinflamatória (CHANG et al., 2011) e antidiabética (MAHMOUD et al, 2012); europetina-3-O- ramnosideo (22) pela sua capacidade antioxidante (TUNG et al., 2011). Atividade anti- hiperglicêmica in vitro destes compostos também já foi relatada, sugerindo um potencial antidiabético para os extratos a partir de suas folhas, entretanto os mecanismos de atuação ainda são desconhecidos (MANAHARAN et al., 2013).

OH OH OH OH CH3 OH O O O OH OH

O O

OH O O CH3 OH O O CH3 OH OH OH OH OH OH (21) miricetina-3-O-ramnosídeo (22) europetina-3-O-ramnosideo

OH OH O O OH

H OH

OH (23) 4-hidroxibenzaldeído (24) floretina

OH OH CH3 OH OH O H3C O OH H3C

(25) mirigalona-G (26) mirigalona-B

As chalconas, que são percursoras na biossíntese de flavonoides, também são encontradas no gênero Eugenia. Tais compostos possuem atividades já comprovadas na literatura, entre estas estão atividade citotóxica, anticancerígena, antiviral, inseticida, mutagenicidade, antiinflamatória, entre outras (AYANAMAR, 2012). Nas partes aéreas da Eugenia javanica foram encontradas a 2’,6’-diidroxi-4’-metoxi-3’,5’-dimetilchalcona (27) e 4’,6’-diidroxi-2’-metoxi-3’,5’-dimetilchalcona (28) (SRISVATAVA et al.,1995).

CH3 CH3 OH OH OH O CH3

H3C H3C O O O O H H (27) 2’,6’-diidroxi-4’-metoxi-3’,5’- (28) 4’,6’-diidroxi-2’-metoxi-3’,5’- dimetilchalcona dimetilchalcona

Estudos recentes têm mostrado que os flavonoides contribuem significativamente para a atividade antioxidante total de muitas frutas e vegetais (VINSON et al., 1999; LUO et al., 2002). Estudos em humanos mostraram que os flavonoides aparecem no plasma sanguíneo, em níveis farmacologicamente ativos, após a ingestão de alimentos, mas não se acumulam no plasma (CAO et al., 1998; HOLLMAN & KATAN, 1999). Determinados

flavonoides são excretados na urina dentro de 4 horas de ingestão (MILBURY et al., 2002). O consumo regular de flavonoides pode aumentar a longevidade, reduzindo a inflamação e contribuindo uma redução de doenças coronárias no coração (CHD) (FRANKEL et al., 1993; EINBOND et al., 2004).

1.2.2. Antocianinas

Com a mesma via biossintética dos flavonoides naturais, as antocianinas são estruturalmente caracterizadas pela presença do esqueleto contendo 15 átomos de carbono na forma C 6-C3-C6, porém ao contrário dos flavonoides, as antocianinas absorvem fortemente na região visível do espectro, conferindo uma infinidade de cores, dependendo do meio de ocorrência (MARÇO & POPPI, 2008) As antocianinas podem possuir uma ou mais ligações a açúcares, geralmente ligadas aos carbonos 3, 5 e 7, sendo os mais comuns: glicose, xilose, arabinose, ramnose, galactose ou dissacarídeos constituídos por esses açúcares, os quais podem estar ligados ácidos fenólicos, como ρ-coumárico, cafêico, fenílico e vanílico. O açúcar presente nas moléculas de antocianinas confere maior solubilidade e estabilidade a estes pigmentos, quando comparados com as antocianidinas (MARÇO & POPPI, 2008; FLORES et al., 2012). O interesse neste tipo de compostos é crescente devido à característica marcante das colorações apresentadas, sua alta solubilidade em sistemas aquosos e possíveis benefícios a saúde humana, como atividade antioxidante (KUSKOSKI et al., 2003) Os principais representantes desta classe, definidina (29), malvidina (30) e petunidina (31) foram isolados do fruto de Eugenia jambolana . Também nas espécies Eugenia umbelliflora e Eugenia uniflora , tem-se se encontrado estes compostos em sua forma glicosilada, como exemplos citam-se delfinidina-3-glicosídeo (32), cianidina-3- glicosídeo (33) (REYNERTSON et al. , 2008 ) petunidina-3-O-glicosídeo (34), pelargonidina-3-O-glicosídeo (35), peonidina-3-O-glicosídeo (36) e malvidina-3-O- glicosídeo (37) (KUSKOSKI et al., 2003; CELLI et al., 2011).

OH CH3 O OH OH + OH O + OH OH O CH3 O OH OH OH OH (29) Delfinidina (30) Malvidina

OH OH

+ OH O CH3 O

OH OH (31) Petunidina

R1 OH

+ OH O R2 OH OH OH O O OH OH

(32) Delfinidina-3-O-glicosídeo (R 1= OH, R 2= OH);

(33) Cianidina-3-O-glicosídeo (R 1= OH, R 2= H);

(34) Petunidina-3-O-glicosídeo (R1= -OCH 3, R 2= OH);

(35) Pelargonidina-3-O-glicosídeo (R 1= H, R 2= H);

(36) Peonidina-3-O-glicosídeo (R 1= -OCH 3, R 2= H);

(37) Malvidina-3-O-glicosídeo (R1= -OCH 3, R 2= -OCH 3).

A Eugenia myrtifolia é encontrada nas florestas tropicais da Oceania, onde é conhecida como “mirtilo-vermelho”. Estudos mostraram apenas uma forma molecular de antocianina nas suas folhas, sendo identificada a malvidina-3,5-O-diglicosídeo (38). Tal resultado é interessante, pois a malvidina é um produto final da metoxilação da

antocianina na via, este poderia ser um útil sistema para o estudo da regulação da via, alterando a genética ou controle fisiológico da mesma (LONGO et al. , 2007).

CH3 O OH

+ OH O CH3 O OH OH OH O OH O OH OH O OH O

OH (38) Malvidina-3,5-O-diglucoside

As antocianinas também estão presentes na Eugenia brasiliensis e Eugenia jambolana , sendo estas as principais responsáveis pela coloração dos frutos das mesmas. Delfinidina-3-O-glicosídeo (39), cianidina-3-O-glucosídeo (40), cianidina-3-O- arabinosídeo (41), malvidina-3-O-glicosídeo (42), delfinidina-3-O-pentosídeo (43), cianidina-3-O-xilosídeo (44), já foram identificadas nestas espécies (FLORES et al., 2012; SIDIQI et al., 2011; BALIGA et al., 2011; CELLI et al., 2011).

+ OH O R3

OH R4

(39) Delfinidina-3-O-glicosídeo (R 1=OH, R 2=OH, R 3=OH, R 4=glicosil)

(40) Cianidina-3-O-glucosídeo (R 1=OH, R 2=OH, R 3=H, R 4=glicosil)

(41) Cianidina-3-O-arabinosídeo (R 1=OH, R 2=OH, R 3=OH, R 4=arabinosil)

(42) Malvidina-3-O-glicosídeo (R 1=OCH 3, R 2=OH, R 3=OCH 3, R4=glicosil)

(43) Delfinidina-3-O-pentosídeo (R 1=OH, R 2=OH, R 3=OH, R 4=pentosil)

(44) Cianidina-3-O-xilosídeo (R 1=OH, R 2=OH, R 3=OH, R 4=xilosil)

Provas continuam surgindo para mostrar a importância destes compostos para a saúde humana. Entre os benefícios que são associados ao consumo de antocianinas, incluem a redução de doenças cardíacas coronárias (SUMMER et al., 2005), a proteção contra a obesidade e hipoglicemia (JAYAPRAKASAM et al., 2006), melhoria da memória (ANDRES-LACUEVA et al., 2005), e proteção do tecido cerebral fetal (LOREN et al., 2005). As antocianinas são potentes antioxidantes, o que podem estar relacionadas a vários benefícios a saúde (BRITO et al., 2007).

1.2.3. Terpenos e Esteroides

Os triterpenos são metabólitos que ocorrem significativamente no reino vegetal e são formados a partir da união de unidades de isoprenos. A grande maioria destes compostos possui estrutura policíclica podendo ser tetracíclicos ou pentacíclicos que contém no máximo uma ou duas ligações duplas respectivamente (Figura 5) (GODWIN & MERCER, 1983; OLEA & ROQUE, 1990). Os triterpenos são encontrados de com estruturas diversas, podendo ser encontrados grupos, cetônicos, carboxílicos, hidroxílicos e aldeídos (DI STASI, 1996).

CH H3C 3

CH3

CH3 CH3

CH3

CH H3C 3 Figura 5. Esqueleto da estrutura dos triterpenos.

Os usos tradicionais de plantas contendo triterpenos são muitos. O uso como antiinflamatório, hepatoprotetor, analgésico, cardiotônico, sedativo e tônico, sendo muitos destes comprovados cientificamente, destacando-se a atividade antitumoral para alguns terpenos especificamente (VECHIA et al., 2009). No gênero Eugenia , o tirucallol (45) e ácido maslínico (46), foram isolados a partir do caule da Eugenia gustavioides (YOSHIKAZ et al., 1976).

H C H C 3 3 CH3 CH3

H C 3 O CH CH 3 3 CH3 CH3 OH OH CH3 OH CH3 H3C CH3 H C 3 H CH H3C 3 (45) Tirucallol (46) Ácido maslínico

O ácido betulínico (47) e o ácido maslínico (46) são encontrados nas folhas da Eugenia jambolana (GUPTA et al.,1974), já nas flores desta espécie os constituintes ácido betulínico (47) e o ácido oleanóico (48) apontaram atividade antitumoral (HSU et al., 1997; CHEN et al., 2007) e antifertilidade para o oleanóico (RAJASEKARAN et al., 1988).

CH H C 2 3 CH3

H3C

O O CH CH CH3 CH3 H 3 3 OH OH

H CH3 OH OH H H C H3C CH 3 CH3 3 (47) Ácido betulínico (48) Ácido oleanóico

Diferentes estudos relatam as atividades anti-inflamatória, analgésica e antioxidante para o ácido ursólico e o oleanóico (IKEDA et al., 2008). Estudos também mostram o emprego do ácido oleanóico (48) no tratamento de doenças hepáticas, diminuindo a necrose das células do fígado e intensificando a regeneração do mesmo (HWANG, 2005). Nas folhas da Eugenia biflora foi encontrado o β-amirina (49) (GOTLLIEB et al. , 1971) enquanto no extrato alcoólico das partes aéreas da Eugenia javanica foram identificados o metil-3-epi-betulinato (50), ácido ursólico (51), ácido arjunólico (52), ácido jacoumárico (53) que mostraram atividade imune estimulantes (SRISTAVA et al., 1995).

H C CH 3 CH3 2

H3C

O CH CH 3 3 CH3 CH3 CH3 O H3C CH CH3 CH3 3 OH OH CH3 H C H C 3 CH3 3 CH3 (49) β-amirina (50) metil-3-epi-betulinato

CH H C 3 3 CH3

H3C

O O CH CH 3 3 CH3 CH3 OH OH CH 3 CH3

OH OH H3C CH 3 H3C OH

(51) Ácido ursólico (52) Ácido arjunólico

CH3

H3C

O CH3 CH3 OH O OH CH3 O H C 3 CH3 OH (53) Ácido jacoumárico

Na Investigação química do extrato AcOEt da casca do caule de Eugenia jambolana obteve-se um grande número de triterpenos como o ácido betulínico (47), β-amirina (49) , lupeol (54) e friedelina (55) (KUIATE et al., 2007).

CH2 H3C CH3

H3C CH3

CH3 CH H CH3 3 H CH3

CH3 CH3 CH3 OH O

CH CH3 H3C 3 CH3 (54) Lupeol (55) Friedelina

É conhecido que muitos compostos, incluindo os triterpenoides, exibem atividades antimicrobianas (DJOUKENG et al., 2005). O friedelina (55) e seu derivado lactona já foram relatados com boa atividade antidermatófita o que se torna interessante uma vez que os antifúngicos (griseofulvina, derivados azólicos, alilaminas e morfinas) utilizados no tratamento de infecções de dermatófitos, pode, em alguns casos, ter efeitos colaterais adversos, incluindo distúrbios gastrointestinais, cutâneos reações de hepatotoxicidade e leucopenia (FREIXA et al., 1998; KUIATE et al., 2007). Estas infecções não são fatais mais são muito difíceis de erradicar, por vezes, devido à ineficácia dos medicamentos disponíveis comerciais (BARRET-BEE & RYDER, 1992; SELITRENNIKOFF, 1995). Outros triterpenos como os ácidos 3β-cis-p-coumaroiloxi-2α,23-diidroxiolean-12-en- 28-óico (56) , 3 β-trans -p-coumaroiloxi-2α,23-diidroxiolean-12-en-28-óico (57) e 23-trans -p- coumaroiloxi-2α,3 β-diidroxiolean-12-en-28-óico (58) também foram isolados da Eugenia sandwicensis juntamente com o ácido arjunólico (52) , ácido betulínico (47) , ácido epi- betulínico (50) entre outros.

H C 3 CH3

O CH3 CH3 OH OH CH3

R1 R2 H3C (56) 3β-cis -p-coumaroiloxi-2α,23-diidroxiolean-12-en-28-óico

(R 1=cis–p–coumaroyloxy; R 2=OH) (57) ácido 3 β-trans -p-coumaroiloxi-2α,23-diidroxiolean-12-en-28-óico

(R 1=trans–p–coumaroyloxy; R 2=OH) (58) ácido 23-trans -p-coumaroiloxi-2α,3 β-diidroxiolean-12-en-28-óico

(R 1=OH; R 2=trans–p–coumaroyloxy)

Destes o composto ácido 3 β-cis -p-coumaroiloxi-2α,23-diidroxiolean-12-en-28-óico (56) mostrou uma significante atividade quimiopreventiva no combate ao câncer de mama (GU et al., 2001).

1.2.4 Carotenoides

Outra classe de compostos que é extremamente abundante nas plantas tanto da família Myrtaceae, quanto no gênero Eugenia , são os carotenoides. Os carotenoides classificam-se como terpenos e são formados por uma cadeia de hidrocarbonetos contendo de 9 a 13 insaturações conjugadas composta por unidades denominadas isoprênicas. Essa estrutura conjugada dos carotenoides é que permite a absorção da luz ultravioleta, fornecendo as cores características destes compostos. Os compostos carotenoídicos que são formados somente por cadeias de hidrocarbonetos são denominados carotenos, e os que contêm oxigênio são conhecidos como xantofilas (DAVIES , 1976). A pitanga, fruto da Eugenia uniflora é um dos frutos do gênero onde estes compostos foram estudados. Dentre os carotenoides identificados os majoritários foram o licopeno (59), β-caroteno (60) e luteína (61) (PORCU et al., 2008 E 2009; FIUZA et al., 2008).

CH CH 3CH 3CH 3 3 CH3

3CH CH CH CH CH3 3 3 3 (59) Licopeno H C H C 3 3 CH3 CH3 CH3

CH CH H C CH 3 3 3 3 (60) β-caroteno H C OH H C 3 3 CH3 CH3 CH3

CH3 CH3 H3C CH3 OH CH3 (61) Luteína

Nos vegetais, os carotenóides exercem funções que são responsáveis pela manutenção e ações em todos os organismos vivos (OLIVER & PALOU, 2000). Em tecidos fotossintetizantes, por exemplo, exerce a função de antioxidante, podendo também contribuir para a coloração de frutos e flores (KRINSKY et al. , 2003).

1.2.4. Taninos e Outros Polifenóis

Polifenóis são substâncias caracterizadas por possuírem uma ou mais hidroxilas ligadas a um anel aromático. Os taninos são uma classe de polifenóis, amplamente distribuídos no reino vegetal. Eles são conhecidos por possuir uma série de atividades biológicas, tais como inibição da atividade da enzima conversora de angiotensina (INOKUCHI et al., 1985), atividade antiviral e anti-HIV (HATANO et al., 1988; FUKUCHI et al., 1989), inibição da peroxidação lipídica (OKUDA et al., 1983) entre outros (LEE et al., 2000). Foram isolados nas folhas da Eugenia uniflora , polifenóis como o galoil (62), ácido gálico (63), metilgalato (64) e valoneloil (65) (LEE et al., 2000). Ainda nesta espécie foram descritos taninos hidrolisados a partir das folhas que foram denominados de eugeniflorina D1 (66) , eugeniflorina D2 (67) e onoteina (68) (LEE et al., 1996).

OH OH OH

OH OH OH OH OH

H3C OH CH3

OH O OH O

(62) G aloil (63) Áci do gálico (64) M etilgalato

CH 3 CH3 O O OH

OH O OH

OH OH OH OH OH OH (65) Valoneloil OH

O OH

O O O OH OH OH O

O O OH O O O OH

OH OH OH OH OH

O OH OH O O O O O OH OH O O O O OH OH OH OH OH OH OH (66) Eugeniflorina D1

O OH O O O O OH OH O OH OH O O

O O O OH O

OH O OH

O OH OH O O O O OH OH O O O O OH OH OH OH OH OH OH (67) Eugeniflorina D2

OH OH

O OH O O O OH OH OH O

O O OH O O O OH

OH OH O OH

O OH OH O O O O OH OH O O O O OH OH OH OH OH OH OH (68) Onoteina

Estudos direcionados mostraram que os compostos eugeniflorina D1 (66) e eugeniflorina D2 (67) possuem potente atividade inibidora da DNA-polimerase do vírus Epstein-Barr (EBV) que está associado ao aparecimento de um tipo de câncer na faringe (LEE et al., 2000). Nas folhas da E. jambos também foram encontrados taninos hidrolisados, sendo denominados de 1-O-galoilcastalagina (69) e casuarinina (70) (YANG et al., 2000).

CH3 CH3 CH3 H3C O O CH3 H3C O O O O CH3 O H3C O H CH3 H C O 3 CH3 O O CH3

OH OH

OH OH OH OH

(69) 1-O-galoil castalagina

CH3 CH3 CH3 H3C O O CH3 H3C O O O OH H H3C O

O H3C O O CH3

OH OH

OH OH OH OH

(70) Casuarinina

Estudos mostraram que estes dois compostos exercem grande efeito citotóxico em células leucêmicas, supostamente provocando a apoptose das mesmas (YANG et al., 2000). Outros compostos também são encontrados no gênero Eugenia. O ácido elágico (71) também é um polifenol encontrado em diversas espécies do gênero. Este já encontrado no caule da Eugenia gustavioides (YAZAKI et al. , 1976) e das flores da Eugenia caryophyllata (ATAWODI et al., 2011). Outro composto encontrado nas flores da E. caryophyllata é o metill 2-O-(6’-O-galoil)- β-D-glicopiranolbenzoato (72) (DHAN et al. , 2010).

O CH3

OH H3C O OH O OH H3C O O CH3 O O OH O O O OH OH OH (71) Ácido elágico (72) Metill 2-O-(6’-O-galoil)- β-D- glicopiranolbenzoato

Outros constituintes foram caracterizados a partir de óleos essenciais da E. hyemalis , entre eles estão a 2-O-galoilarbutina (73), 4-O-galoilarbutina (74), 2,6-di-O- galoilarbutina (75), 2,4,6-tri-O-galoilarbutina (76) . Todos estes compostos fenólicos foram testados com o vírus HIV, entretanto nenhum deles foi capaz de inibir o efeito citopático nas doses testadas (BOKESCH et al., 2008).

R1 O O R2 O O O O R3 R4 OH

(73)2-O-galoilarbutina (R1=R 2=R 3=H, R 4=galoil);

(74)4-O-galoilarbutina (R1=R 3=R 4=H, R 2=galoil)

(75) 2,6-di-O-galoilarbutina (R 1=R 4=galoil, R 2=R 3=H);

(76) 2,4,6-tri-O-galoilarbutina (R 1=R 2=R 4=galoil, R 3=H)

1.2.5. Óleos Essenciais

Os óleos essenciais constituem os elementos voláteis contidos em muitos órgãos vegetais, e estão relacionados com diversas funções necessárias à sobrevivência vegetal, exercendo papel fundamental na defesa contra microrganismos (SIQUI et al., 2000). Os sesquiterpenos são os principais constituintes desta classe. Diversas atividades como bactericida, antifúngica, antiinflamatória e citotóxica tem sido relacionadas a estes constituintes (LAGO et al., 2011). A descrição da composição química dos óleos essenciais de diversas espécies de Eugenia é bem apresentada na literatura, para espécies como a E. brasiliensis , E. uniflora, E. caryophyllata entre outras. Entre os principais componentes desta classe para o gênero estão β-cariofileno (77), humuleno (78) e eugenol (79) e muitos outros (NAKAMURA et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2005).

H H OH H3C H3C CH3 CH3 O H3C H3C CH3

H2C H3C

CH2 (77) β-cariofileno (78) Humuleno (79) Eugenol

Trabalhos são encontrados na literatura reportando o potencial antimicrobiano dos óleos essenciais das folhas de E. stipitata (MEDEIROS et al., 2009) e E. dysenterica DC. (COSTA et al., 2000), bem como de outras partes da planta (OLIVEIRA et al., 2005). Há outros trabalhos relacionando as atividades inseticidas (YANG et al., 2000; KOKATE & CHINTALWAR, 2003) e acaricida do óleo essencial de E. caryophyllata (KIM et al., 2002). O eugenol, um dos principais constituintes destes óleos, tem sido reportado em diversos estudos farmacológicos demonstrando que este possuiatividade anticonvulsivante (DALLMEIER & CARLINI, 1981; SEN et al., 1992). Ainda se tratando deste composto, estudos da E.caryophyllata sugerem que o eugenol isolado desta planta possui potencial anticarcinogênico (GUO-QIANGZ HENG et al., 1992), também as atividades antiepiléptica, anti-convulsiva e anti-stress estão associadas a este composto (PHOURGOM, 1999; GULÇIN et al., 2011). Outros componentes de óleos essências foram detectados na análise dos frutos da E. singampattiana , revelando a presença de constituintes majoritários que foram

identificados como α- terpineol (80), canfenol (81) e O-metil eugenol (82) (KALA et al., 2011).

CH3 OH O CH3 CH3 CH3 CH3 OH

H3C CH3 CH2 CH3 CH3 (80) α- terpineol (81) Canfenol (82) O-metil eugenol

O estudo do óleo essencial obtido das folhas da E. uniflora mostrou que este é constituído majoritariamente por furanodieno (83) e curzereno (84) (CHANG et al., 2011), sendo encontrado também outros óleos, como o humuleno (74) , linalol entre outros (LAGO et al., 2011).

CH3 CH3 O O H2C

H2C CH3 CH3 CH3 CH3 (83) Furanodieno (84) Curzereno

1.2.6. Cromonas

A isobiflorina (85) e o biflorina (86) são duas cromonas muito utilizadas na China no tratamento de desordens no sistema digestivo, infecções bacterianas, fúngicas e infecções dentárias. Estes compostos são encontrados no cravo da Eugenia caryophyllata, conhecido popularmente como “cravo-da-india” (ZHANG et al., 1996).

OH O OH

O OH O OH OH O CH3 OH OH OH OH O OH O CH3 OH OH (85) Isobiflorina (86) Biflorina

1.3. EUGENIA DYSENTERICA DC.

CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA

Reino:Plantae Divisão:Magnoliophyta Classe:Magnoliopsida Ordem:Myrtales Família:Myrtaceae Gênero: Eugenia Espécie: Eugenia dysenterica DC.

A Eugenia dysenterica DC. conhecida popularmente como Cagaita é uma espécie frutífera nativa do Cerrado e Pantanal brasileiro pertencente à família Myrtaceae. É encontrada em quase toda a extensão do Cerrado, principalmente na sua área nuclear. Apresenta comportamento bem peculiar quanto à ocorrência, pois aparece com alta freqüência em algumas regiões, formando consideráveis grupamentos. No entanto, não é encontrada em muitas outras, possivelmente pelo efeito alelopático (GIOTTO et al., 2007). Tanto o nome vulgar, como o nome científico da espécie se referem à propriedade laxativa do seu fruto, fato conhecido da população nas regiões onde esta é encontrada. Esta propriedade se manifesta, principalmente, no fruto maduro e em início de fermentação (CRUZ, 1979). A planta é bem produtiva e floresce de agosto a outubro (Figura 5) e produz frutos de setembro a novembro. Em plantas individuais, o florescimento é muito rápido e intenso, durando no máximo cinco dias, com grande efeito ornamental (AGUIAR, 2005).

Figura 6. Eugenia dysenterica DC. no período de floração.

O período do florescimento à maturação dos frutos dura, no máximo, 40 dias. Os frutos possuem forma periforme e casca de cor amarela a avermelhada, quando maduros, apresentam de uma a cinco sementes, que germinam com facilidade, embora o desenvolvimento inicial das mudas seja muito lento (ALMEIDA et al.,1997). Os frutos (Figura 6) são consumidos ao natural, tanto quando ainda imaturos ou maduros. Podem, também, ser processados na forma de licores, sucos, sorvetes e geléias, de excelente sabor. Esta espécie, devido às suas qualidades adaptativas ao ambiente do Cerrado, ao potencial produtivo e, inclusive, às características ornamentais, medicinais e alimentares, merece um volume maior de estudos visando a sua incorporação ao sistema produtivo (SANO et al., 1995).

Figura 7. Fruto da Eugenia dysenterica DC.

Esta espécie é bem conhecida na medicina popular brasileira e muito utilizada pela população no tratamento de várias doenças. O chá das folhas é usado para tratar a diarréia, diabetes e icterícia, já a infusão das suas flores é usada para tratar infecções nos rins e bexiga e seu fruto é usado como laxante (COSTA et al., 2000). Atividades antimicrobianas têm sido relatadas para óleos presentes em folhas de E. dysenterica DC., os óleos podem também gerar benefícios terapêuticos na recuperação da diarréia apesar dos seus efeitos tóxicos (LIMA et al., 2011). A espécie E. dysenterica DC. ocorre naturalmente nos Estados de São Paulo, Minas Gerais, Bahia, Tocantins, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Pará, Maranhão, Piaui e Goiás, além do Distrito Federal (Figura 7) (CORRÊA, 1984; BRITO et al., 2003).

Figura 8. Distribuição natural da E. dysenterica DC. (cagaita) em 110 localidades no Bioma Cerrado. (Fonte: Ratter et al. 2003).

A principal importância do aproveitamento da cagaiteira se dá pelo potencial alimentício de seus frutos. Além do consumo fresco, há inúmeras preparações típicas que utilizam o sabor da sua polpa. Este uso é difundido entre os moradores do Cerrado, onde várias preparações regionais são feitas a partir da polpa da fruta, especialmente doces, compotas, licores, refrigerantes, sucos e sorvetes ( BRITO et al ., 2003; MARTINOTTO et al., 2008;). A polpa da cagaita possui alta umidade, também é observada em sua composição a presença de nutrientes, como proteínas, lipídios, carboidratos e fibras alimentares ( HERINGER & FERREIRA, 1974; ROESLER et al., 2007 ). O óleo essencial das folhas, rico em sesquiterpenos, como o beta-carioﬁleno e o alfa-humuleno e em monoterpenos, como o limoneno e o alfa-tujeno, que já apresentaram atividade antifúngica (COSTA et al ., 2000). O extrato etanólico das folhas apresentou atividade moluscocida contra o Biomphalaria glabrata , sugerindo que esta possui um potencial que pode ser utilizado no controle da esquistossomose (BEZERRA et al ., 2002).

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Investigar a composição química das diferentes partes da Eugenia dysenterica DC. (casca do caule e folhas) e avaliar a atividade antioxidante dos extratos e frações.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar a coleta do material botânico e preparar o extrato bruto metanólico das folhas e casca do caule de E. dysenterica DC. Preparar frações a partir do extrato bruto com diferentes solventes (hexano, clorofórmio, acetato de etila, butanol e metanol). Identificar os compostos isolados através de métodos espectroscópicos usuais (RMN-1H e RMN-13 C) uni e bidimensionais e infravermelho (IV) Avaliar a atividade atioxidante pelo método de seqüestro do radial DPPH.

4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS

4.1.1. Material botânico

O material botânico (3,345 kg de casca do caule e 2,565 kg de folhas) foi coletado no município de Poconé, Km 08, Rodovia Poconé - Porto Cercado (S16018º18’38.0’’ W056º33’25.7’’) e identificado pela Dra. Vali Potti do Departamento de Biologia da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, sendo depositado no Herbário da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul sob registro CGMS 33227.

4.1.2. Solventes

Todos os solventes utilizados possuíam grau PA. Sendo utilizados hexano (Hex) da

Dinâmica, acetato de etila (AcOEt) das marcas Dinâmica e Vetec, clorofórmio (CHCl 3), diclorometano (DCM), butanol (ButOH), etanol (EtOH) e metanol (MeOH) da marca Vetec.

4.1.3. Evaporação de solventes

Os solventes foram recuperados utilizando um aparelho rotaevaporador da marca BUCHI, modelo R3000 e estufa de secagem a vácuo UNIQUE modelo USC3380.

4.1.4. Cromatografia em coluna clássica

As colunas cromatográficas clássicas (CC) foram preparadas utilizando como fase estacionária sílica gel 60 e flash (230-400 e 60-230mesh) da Merck, Sigma - Sephadex ® LH -20 e fase reversa XAD-16 sigma aldrich.

4.1.5. Cromatografia em camada delgada

Para o emprego da cromatografia em camada delgada foram empregadas Sílica gel

60G, Sílica gel 60GF 254 , e cromatofolha de alumínio CCF-C/25 20X20 cm, todas da Merck. Já para a cromatografia em camada delgada em escala preparativa foi utilizado

Sílica gel 60G e Sílica gel 60 PF 254 , Merck.

4.1.6. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Os espectros de ressonância foram realizados em parceria com o PPGQ-UFRRJ utilizando aparelho da marca Bruker (400 e 500 MHz), utilizando TMS (tetrametilsilano) como referência interna e diferentes solventes deuterados para a análise. Os deslocamentos químicos δ foram expressos em ppm e as constantes de acoplamento J em Hz.

4.1.7. Espectroscopia de Infravermelho

Os espectros de infravermelho foram realizados em parceria com a Central Analítica de Biocombustíveis – UFMT utilizando aparelho da marca Shimadzu IR Affinity- 1. Os espectros foram expressos em termos de transmitância e cm -1.

4.1.8. Determinação da atividade antioxidante pelo método de Sequestro do radical DPPH

A medida da atividade sequestrante do radical DPPH• foi realizada de acordo com a metodologia descrita por BRAND-WILLIAMS et al. (1995), com modificações. O ensaio do DPPH• tornou-se bastante popular no estudo dos antioxidantes naturais por ser um método simples a altamente sensível. O método opera pela medida direta da doação do átomo de hidrogênio ou transferência de elétron de um antioxidante em potencial a moléculas do radical livre (DPPH•) (SHIRAHIGUE, 2008).

4.2. MÉTODOS

4.2.1. Secagem e trituração do material botânico

O material botânico foi seco à temperatura ambiente durante 7 dias. As folhas e a casca do caule foram trituradas separadamente em moinho de facas.

4.2.2. Extrato bruto metanólico (EBMeOH)

Os materiais coletados (cascas do caule e folhas) da Eugenia dysenterica DC. foram colocadas em maceração a frio com metanol, agitando ocasionalmente, utilizando-se 15 L de solvente em cada extração. Realizou-se este processo em sete ciclos de cinco dias, seguido de filtração e concentração em rotaevaporador. O extrato bruto EBMetOH foi mantido em estufa de secagem até completa secura do material, resultando em 313,14 g (R=9,36%) de extrato da casca do caule e 228,45 g (R=8,90%) das folhas.

4.2.3. Partição sólido-líquido do EBMeOH das cascas do caule

Parte do extrato bruto do caule foi submetida a fracionamento através de partição em fase sólida. Foram separados 234,92 g do extrato bruto, sendo preparada uma pastilha com sílica gel 60 na proporção aproximada de 1:1 resultando em 498,13 g de pastilha. A mesma foi submetida a partição em funil de separação com eluição isocrática com hexano (3,0 L), clorofórmio (1,5 L), acetato de etila (4,0 L), butanol (1,5 L) e metanol (4,0 L). As frações obtidas foram concentradas em rotaevaporador à pressão reduzida levando à obtenção da fração hexano (FHex; 15,19 g; 6,46%), fração clorofórmio

(FCHCl 3; 2,17 g; 0,92%), fração acetato de etila (FAcOEt; 69,04 g; 29,38%), fração butanol (FButOH; 8,3 g; 3,53%) e fração metanol (FMeOH; 43,80 g; 18,64%).

4.2.4. Partição sólido-líquido do EBFMeOH das folhas

As folhas foram submetidas ao mesmo procedimento de fracionamento do caule, sendo separados 203,07 g do extrato bruto para adsorção em 115,20 g sílica gel 60 resultando em 318,27 g de pastilha. Posteriormente a pastilha foi submetida à partição em fase sólida num funil de separação com eluição isocrática de hexano (2,0 L), clorofórmio (2,0 L), acetato de etila (2,5 L), butanol (3,0 L) e metanol (4,0 L). As frações obtidas foram concentradas em rotaevaporador à pressão reduzida levando à obtenção da fração hexano (FFHex; 19,93 g; 9,81%), fração clorofórmio (FFCHCl 3; 75,5 g; 37,17%), fração acetato de etila (FFAcOEt; 16,86 g; 8,30%), fração butanol (FFButOH; 6,12 g; 3,01%) e fração metanol (FFMeOH; 13,95 g; 6,87%).

Figura 9 - Esquema de fracionamento do Extrato Bruto Metanólico da casca do caule da Eugenia dysenterica DC.

Figura 10 - Esquema de fracionamento do Extrato Bruto Metanólico das folhas da Eugenia dysenterica DC.

4.2.5. Fracionamento da fração hexano das cascas do caule (FHex)

A FHex (15,19 g) foi submetida a coluna cromatográfica clássica de sílica gel 60 (altura da fase estacionária: 38 cm; diâmetro: 6,0 cm) utilizando como fase móvel diferentes solventes em ordem crescente de polaridade (Hex; CHCl 3; AcOEt e MeOH) em diferentes proporções (Tabela 1). A eluição resultou em 146 frações coletadas que foram reagrupadas de acordo com a similaridade em CCD, resultando em 12 novas subfrações denominadas de A (1-12).

Tabela 1 – Sistema de eluição para a FHex das cascas do caule. Sistema dos solventes Proporção Volume Frações Hex - 2 L - 8:2 500 mL 1-6

Hex:CHCl 3 1:1 500 mL 7-1 2:8 500 mL 8-15

CHCl 3 - 3 L 16-50 8:2 3 L 51-102

CHCl 3: AcOEt 6:4 500 mL 103-110 1:1 500 mL 111-117 3:7 500 mL 118-125 AcOEt - 300 mL 126-131 AcOEt:MeOH 1:1 300 mL 132-137 MeOH - 300 mL 138-146

A subfração A4 (F 65-80) resultou em 6,13 g de um precipitado branco. Uma parte deste precipitado foi submetida à separação por solubilidade, sendo filtrada com hexano. O precipitado (não solúvel em hexano) resultante foi submetido novamente a separação em coluna clássica com sílica gel 60 (altura da fase estacionária: 16 cm, diâmetro: 2,0 cm) seguindo novamente com eluição em diferentes proporções de solventes, resultando em

32 frações. Estas foram novamente reagrupadas de acordo com a similaridade de R f (fator de retenção). As frações de 2 a 8 foram reagrupadas resultando na mistura das substâncias 4 e 5 (115,0 mg; 0,75% ).

Figura 11 - Esquema de fracionamento da fração hexano da casca do caule e isolamento dos constituintes químicos.

4.2.6. Fracionamento fração butanol da casca do caule (FBuOH)

A FBuOH (8,30 g) foi submetida a coluna cromatográfica de fase reversa XAD-16 (altura da fase estacionária: 43,8 cm; diâmetro: 6,0 cm) utilizando como fase móvel diferentes solventes em ordem decrescente de polaridade, sendo 1,5 L de H 20; 2,0 L de MeOH e 2,0 L de AcOEt com eluição isocráticas. As frações foram primeiramente separadas de acordo com o solvente utilizado, resultando em quatro novas subfrações. Através de CCD determinou-se qual seria a fase mais promissora, sendo escolhida a subfração metanólica. Esta foi submetida posteriormente a separação em coluna sephadex LH20 (altura da fase estacionária: 65,0 cm; diâmetro: 2,5 cm) com eluição isocrática em MeOH sendo coletadas 77 frações. As frações 54 a 77 foram reagrupadas e submetidas novamente à purificação em sephadex resultando em novas 73 frações. Destas as frações entre 47 e 54 foram reagrupadas, resultando na substância 7 (195,8 mg; 2,34%).

Figura 12 - Esquema de fracionamento da fração butanol da casca do caule e isolamento dos constituintes químicos.

4.2.6. Fracionamento da fração clorofórmio das folhas (FFCHCl 3)

Parte da fração FFCHCl 3 (35,53 g) foi submetida a coluna cromatográfica clássica, utilizando sílica gel 60 e eluição com diferentes solventes em ordem crescente de polaridade (Hex; CHCl 3; AcOEt e MeOH) conforme tabela 2 em diversas proporções.

Tabela 2 – Sistema de eluição para o FFCHCl 3 das folhas. Sistema dos solventes Proporção Volume Frações Hex - 1 L - 7:3 500 mL 1-4

Hex:CHCl 3 1:1 500 mL 5-8 3:7 500 mL 9-10

CHCl 3 - 2 L 11-14 8:2 300 mL 15-18 7:3 600 mL 19-24 6:4 600 mL 25-30

CHCl 3: AcOEt 1:1 600 mL 31-35 4:6 400 mL 36-38 2:8 400 mL 39-42 AcOEt - 1,7 L 43-50 8:2 400 mL 52-60 6:4 400 mL 61-65 AcOEt:MeOH 4:6 400 mL 66-70 2:8 400 mL 71-79 MeOH - 1,5 L 80-111

Nas frações coletadas de 19 a 26 notou-se a formação de um precipitado branco no fundo dos frascos. Estas foram então agrupadas e esperou-se novamente a formação do precipitado, que quando em quantidade suficiente foi separado do solvente e purificado por diferença de solubilidade em MeOH, onde a fase solúvel foi descartada e o precipitado resultante (40,20 mg; 0,11%) foi determinado como composto 6. As frações resultantes foram agrupadas em 17 novos grupos denominados de B1 a B17. Através de análise em CCD, verificou-se que o grupo B13 (0,766 g) possuía poucas manchas quando revelado na lâmpada de ultravioleta, assim este foi submetido a cromatografia em camada delgada em escala preparativa. Foram realizadas a aplicação

em 5 placas (+- 50 mg) e eluidas inicialmente em CHCl 3:MeOH na proporção de 95:5, aumentando gradativamente a polaridade do solvente a cada eluição. Após 4 corridas cromatográficas, as placas apresentavam 5 manchas diferentes denominadas de A, B, C, D e E. As manhas C e E foram recuperadas e filtradas em sílica gel com clorofórmio, resultando assim na substância 1 (2,7 mg, 0,007%) e na mistura de 2 e 3 (3,3 mg; 0,01%)..

Figura 13 - Esquema de fracionamento da fração clorofórmio das folhas e isolamento dos constituintes químicos. ,

4.2.7. Fracionamento da fração Acetato de Etila das folhas (FFACoEt)

Uma parte do subextrato da fração acetato das folhas (14,36 g) foi submetida à coluna cromatográfica clássica utilizando sílica gel 60 (altura da fase estacionária: 47,0 cm; diâmetro: 6,0 cm) sendo utilizada como fase móvel diferentes solventes (Hex; CHCl 3; AcOEt e MeOH) em diversas proporções sempre em ordem crescente de polaridade (Tabela 3). Foram coletadas 108 frações que foram reagrupadas de acordo com seu perfil fitoquímico em CCD resultando em 10 subfrações denominadas de FL (1-10).

Tabela 3 – Sistema de eluição para o SECHCl 3 das folhas. Sistema dos Proporção Volume Cód Frações solventes (FL) Agrupadas Hex - 300 mL 8:2 500 mL FL1 1-8 7:3 500 mL FL1 8-16

Hex:CHCl 3 3:7 500 mL FL2 17-25 2:8 500 mL FL3 26-36

CHCl 3 - 500 mL FL4 37-42 7:3 300 mL FL4 43-45

CHCl 3: AcOEt 1:1 300 mL FL5 46-56 4:6 500 mL FL6 57-77 2:8 300 mL FL7 79-94 AcOEt - 300 mL FL8 95-102 AcOEt:MeOH 1:1 100 mL FL9 103 MeOH - 300 mL FL10 104-108

A subfração FL4 (2,05 g), foi submetida novamente a coluna cromatográfica utilizando sílica flash 230-400 mesh seguindo o modelo de eluição anterior, sempre em ordem crescente de polaridade com os mesmos solventes, resultando em 106 novas frações que foram reagrupadas em 7 grupos denominados de FL.4.1 a FL.4.7. O grupo FL.4.4 referente as frações 27 a 34 resultou em 1,32 g e foi submetido a purificação em sephadex LH20 (altura da fase estacionária: 65,0 cm; diâmetro: 2,5 cm). A eluição se iniciou com CHCl 3/MeOH na proporção 9:1 e foi aumentando a polaridade em diferentes proporções até a eluição com MeOH isolado. Dessa coluna foram coletadas novas 55 frações sendo reagrupadas por similaridade de Rf em CCD. As frações 22 a 31 (0,48 g) foram então reunidas e submetidas sucessivamente a purificação em seplhadex com eluição em MeOH. Após 2 corridas cromatográficas, obteve-se a formação de um único precipitado que foi purificado através da diferença de solubilidade em MeOH, resultando em 2 porções distintas, o precipitado denominado de substância 8 (18,0 mg; 0,12%) e o sobrenadante substância 9 (11,30 mg; 0,078%).

Figura 14 - Esquema de fracionamento da fração acetato de etila das folhas e isolamento dos constituintes químicos.

4.2.8. Atividade antioxidante quantitativo

Utilizou-se uma solução metanólica de DPPH a uma concentração de 0,05 mg/mL, onde permaneceu em ambiente escuro. Os extratos foram diluídos em eppendorf a partir da solução estoque de 2 mg/mL em concentrações de 1,6 mg/mL, 0,16 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,04 mg/mL, respectivamente. Foi usado como controle positivo o ácido ascórbico nas mesmas concentrações dos extratos, o controle negativo utilizado foi metanol. Os ensaios foram realizados em triplicatas onde foi adicionado 100 µL do extrato preparado em tubos de ensaio, 1,4 mL de metanol e 1 mL de solução de DPPH, seguido de agitação em Vortex Mixer. Após a adição da solução de DPPH, as soluções foram mantidas em repouso por 30 minutos em ambiente escuro. A atividade antioxidante foi avaliada in vitro por meio da medida da absorbância, em espectrofotômetro, em comprimento de onda de 517 nm. A porcentagem de atividade antioxidante (%AA) final foi calculada pela seguinte equação:

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Substâncias Isoladas da casca do caule de Eugenia dysenterica DC.

R1 R2 R

O CH3 CH3 O OH CH3

H3C O H3C CH3

4 – R = H; R 1 = R 2 = CH 3 5 – R = R 1 = CH 3; R2 = H

OH OH OH OH O O OH O OH OH O OH 7

5.2. Substâncias Isoladas das folhas de Eugenia dysenterica DC. O

CH3 O

H3C O OH 1 O O

CH3 CH3 O O

H3C OH O 2 3 CH H3C 3

CH3 CH OH 3 CH H 3 H C OH 3 O OH H H O OH 6 OH OH OH OH O OH O

O OH OH O OH 8 OH OH O OH OH O OH O OH O OH O OH OH OH O 9

5.2. Identificação da substância 1

A elucidação de 1, obtida da fração clorofórmio das folhas, foi realizada por métodos espectroscópicos de RMN 1H, 13 C (uni e bidimensionais). O espetro de RMN de 1 H (Figuras14 e 15) apresentou diversos sinais na região entre δH 0,5 a 3,0 que evidenciaram resquícios de uma substância com características de esqueleto triterpênico.

A substância majoritária foi identificada pela presença de um duplo dubleto em δH 7,66

(2H, J=1,85 Hz, H-6) acoplando com os dubletos em δH 7,57 com J =1,85 Hz atribuído ao

H-2 e em δH 6,96 com J=8,5 Hz relativo ao H-5, evidenciando o sistema aromático trissubstituído. Também sinais na região de frequência baixa confirmaram o éster pela presença de dois grupos carbometoxi em δH 3,98 (3H, s) e 3,91 (3H, s). Pelo mapa de contornos HMQC (Figura 16) pode-se fazer a atribuição de todos os carbonos hidrogenados δC 124,20/ δH 7,66 (C-6); δC 114,05/ δH 6,96 (C-5); δC 111,69/ δH

7,57 (C-2); δC 56,12/ δH 3,98 (4-OCH 3) e δC 52,0/ δH 3,91 (-CO 2CH 3). A posição inequívoca 2 3 das metoxilas foi possível com auxílio dos sinais de JCH e JCH mapa de contornos HMBC (Figura 17). Os espectros permitiram verificar as interações de acoplamentos dos hidrogênios da metoxila em δH 3,91 com C-7 (166,73), sinal da carboxila do éster que foi observada no espectro de HMBC e do sinal da metoxila em δH 3,97 com o C-4 (149,86), também evidenciado pelo HMBC. Outros acoplamentos vistos no HMBC como os acoplamentos entre δH 7,57 (H-2) e 7,66 (H-6) com C-7 (166,73), δH 6,96 (H-5) com C-1 (122,40), juntamente com a comparação dos dados de RMN 1H com a literatura (Tabela 4), foi possível confirmar a proposta para o 3-hidroxi-4-metoxibenzoato de metila (1) ou vanilato de metila (SCOTT, 1972).

O 6 5 7 1 OCH3

2 4 H3CO 3 OH

Tabela 4. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da substância 1 em CDCl 3.

1 C HMQC (SCOTT, 1972) * HMBC δδδ δδδ δδδ H C C 1 - 122,40 124,70 - 2 7,57 (d, 1,85 Hz) 111,69 107,05 C-6 3 - 145,71 146,87 4 - 149,86 146,87 5 6,96 ( d, 8,5 Hz) 114,05 113,48 C-3 6 7,66 ( dd , 1,85, 8,5) 124,20 131,46 C-2

7 - 166,73 166,79 3-OH - 145,71 159,30 4-OCH 3,97 ( s) 56,12 55,29 C-4 3 -CO 2CH 3 3,91 ( s) 52,0 51,74 C-7 *25,2 MHz, TMS

7.2871 3.9776 3.9139 1.5783 1.2947 1.2764 1.2461 0.0925

(C-7)-OCH 3 (C-4)-OCH 3

O 6 3.6901 5 7 OCH

1 3 0.9038

2 4 H3CO 3 1.3268 OH

1 3.7002

0.8893 6.9732 0.9171 7.5771 1.6256 5.6695

6.9561

1.7031 1.3728 3.6668 1.7252 3.6800 1.7303 7.6533 1.1837 7.6704 7.6741 1.7580 0.8654 2.1444 2.3222 0.8175 0.8553 1.5632 2.3367 2.3291 3.6536 0.1001 0.9372 0.0856 2.4678 2.6103 4.2631 1.7870 2.2573 4.0677 1.8002 3.9063

2.01 1.95 1.15 13.99 *

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 -0.5 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 15. Espectro de RMN de H da substância 1 (CDCl 3, 500 MHz). *Sinais de impureza compatíveis com o esqueleto triterpênico e/ou esteroidal.

O 6 7.2871 5 7 1 OCH3

2 4 H3CO 3 OH H5 H2 1 6.9732

7.5771 6.9561

7.5733 H6

7.6533 7.6704

7.6741 7.6571

2.00 2.01 1.95

7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 16. Expansão do espectro de RMN de H da substância 1 (CDCl 3, 500 MHz) na

região entre δH 6,7 a 7,8.

65 35

75 40

80 85 45 90

50 95 100 ppm ppm 55 C2 105 -CO 2CH 3 110 4-OCH 60 115 3

120 C5 65 125

130 70 C6 135 140 75 145

7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 4.00 3.95 3.90 3.85 ppm ppm

Figura 17. Expansão do mapa de contornos HSQC da substância 1 (CDCl 3, 125 MHz).

65 24

70 32

75 40 80 48 85 56 90 64 95

100 72

105 80

110 88 115 96 120 ppm

ppm 104 125

130 112

135 120

140 128 145 136 150 144 155 152 160

165 160

170 168

175 176

4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 ppm ppm

Figura 18. Expansão do mapa de contornos HMBC da substância 1 (CDCl 3, 125 MHz).

H O

H CH 7 3 6 O 5 1 4 2 H3C 3 O H

2 3 Figura 19. Representação do acoplamento JCH e JCH de 1.

5.3. Identificação das substâncias 2 e 3

A mistura das substâncias 2 e 3 foi obtida através de placas preparativas de subfrações obtidas da fração clorofórmio das folhas de Eugenia dysenterica DC. Esta apresentou sinais para dois compostos fenólicos. O espectro no IV (Figura 19) apresentou absorções em ѵ 3378 cm -1 devido a estiramento de O-H e as absorções em ѵ 2800 a 2950 cm -1 que são C-H de grupos, CH2 e CH3; ѵ 1634 νC=C, e ѵ 1455 cm -1de C-O-C. O espectro de RMN 1H apresentou dois dupletos em δ 7,80 ( J= 8,5 Hz) e 6,78 ( J= 8,5Hz), cada um integrando para dois hidrogênios, indicando tratar-se de um sistema AA’BB’ de um anel aromático (Figuras 20, 21 e 22). Os sinais em δ 2,90 ( t, J= 7,6 Hz) e 2,62 ( t, J=7,9 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios H-7 e H-8, respectivamente, característico de acoplamento vicinal de hidrogênios em campo alto. Observou-se, ainda, no espectro de RMN 1H um singleto em δ 3,69 (6H), indicando a presença de duas metoxilas. O espectro de DEPTQ (Figuras 23 e 24) exibiu sinais de carbonos quaternários em δ 154,01 (C-4), 131,90 (C-1), sendo visível no HMBC, absorvendo em δ 172,10 (C-9). Os carbonos metilênicos foram observados em d 30,10 (C-7) e 40,59 (C-8), metílico em δ

51,65 (4-OCH e 9-OCH3), além dos carbonos metínicos do anel aromático em δ 129,44 (C-2/6) e 115,33 (C3/5). A análise dos espectros de RMN HSQC (Figuras 25 e 26) e HMBC (Figuras 27 e 28) e comparação com literatura (ZAKIRI et al., 2008), ajudaram na comprovação da estrutura de 2 como sendo o éster 4-hidroxifenil propionato de metila. Na elucidação da segunda substância dentro da mistura ED4, observou-se no espectro de RMN 1H sinais relativos a dois dupletos em δ 7,45 ( J= 8,5 Hz) e 6,88 ( J= 7,85Hz), cada um integrando para dois hidrogênios, indicando também tratar-se de um sistema AA’BB’ de um anel aromático (Figuras 20, 21 e 22). Os sinais em δ 7,66 ( d, J= 16,10 Hz) e 6,32 ( d, J= 15,75 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios H-7 e H-8, e devido ao alto valor da constante de acoplamento sua configuração foi definida como trans . Observou-se, ainda, no espectro de RMN 1H dois singletos δ 3,80 (3H) e 3,82 (3H), indicando a presença de metoxilas substituindo no C-4 e C-9, respectivamente. Os espectros de DEPTQ (Figuras 23 e 24) exibiu sinal de carbonos relativos aos quaternários em δ 129,98 (C-1) e 157,75 (C-4), sendo que o sinal atribuído a carbonila δ 167,56 foi observada apenas nos acoplamentos do HMBC. No DEPT-Q pode-se ainda, atribuir os sinais dos carbonos olefínicos em δ 144,56 (C-7) e 115,89 (C-8), além de carbonos metínicos do anel aromático em δ 131,90 (C-2 e C-6) e 115,32 (C-3 e C-5) e metílicos relativos as metoxilas 4-OCH3 em δ 51,65 e 9-OCH3 em δ 51,96. A análise dos espectros de RMN HSQC (Figuras 25 e 26) e HMBC (Figuras 27 e 28) que são apresentados na tabela 5 e a comparação com dados da literatura (SILVA et

al, 2001), auxiliaram na identificação da estrutura de 3 como sendo o éster E-4- hidroxicinamato de metila. Estes dois ésteres estão sendo relatados pela primeira vez em Eugenia dysenterica DC.

O O 6 6 1 1 5 7 OCH 5 7 9 OCH3 9 3 8 8 2 2 HO 4 H3CO 4 3 3 3 2

Tabela 5. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da mistura 2 e 3 em CDCl 3. C 2 3 HSQC HMBC HSQC HMBC 1 - 131,90 - - 129,98 - 2 7,08 ( d, 8,5) 129,44 C-7, C-6, C4 7,45 (d, 8,5) 131,90 C-1, C-7, C-4 3 6,78 ( d, 8,5) 115,33 C-4 6,88 (d, 7,85) 115,32 C-1, C-4 4 - 154,01 - - 157,75 - 5 6,78 ( d, 8,5) 115,33 C-1, C-3, C-4 6,88 (d, 7,85) 115,32 C-1 6 7,08 ( d, 8,5) 129,44 C-1, C-4, C-7 7,45 (d, 8,5) 131,90 C-1, C-7, C-4 7 2,90 ( t, 7,6) 30,10 C-1, C-9 7,66 (d, 16,10) 144,56 C-1, C-9 8 2,62 (t, 7,9) 40,59 C-1, C-9 6,32 (d, 15,75) 115,89 - 9 - 172,10 - - 167,56 - 4-OCH 3 - - - 3,90 ( s) 51,65 - 9-OCH 3 3,69 ( s) 51,65 C-9 3,82 ( s) 51,92 -

Figura 20. Espectro de infravermelho da mistura 2 e 3 em KBr (cm -1).

7.2877

1.2770

3.6907 (2) 9 -OCH 3

(3) 4-OCH 3 (3) 9-OCH 3 3.8206

1.3413 3.9076 0.9038

2.6178 6.7897 7.0791 0.8906 6.7727 2.9040 7.0961 1.2493 1.0066 2.6336 0.8660 1.8544 0.8837 2.6021 1.7019 1.3571

2.9192 6.8773 7.4453 1.3716 7.4623 0.8433 6.3415 2.0644 6.3100 7.6792 7.6470 7.9660 2.0751 2.0518

1.282.16 3.57 3.84 1.00 5.56 3.48 3.93

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 21. Espectro de RMN de H da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 500 MHz).

O O 6 6 1 1 5 7 OCH 5 7 9 OCH3 9 3 8 8 2 2 HO 4 H3CO 4 3 3 3

7.2877 O O 6 6 1 1 5 7 OCH 5 7 9 OCH3 9 3 8 8 2 2 HO 4 H3CO 4 3 3 3 2

(2)-H3/H5

6.7897

7.0791 6.7727

7.0961

(3)-H2/H6 (2)-H3/H5

(3)-H8 6.8773

(2)-H2/H6 7.4453 (3)-H7 7.4623 6.8616 6.3415 6.3100 7.6792 7.6470 7.9660 7.9837

6.8906

1.28 1.27 2.16 3.57 3.65 3.84 1.00

8.0 7.5 7.0 6.5 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 22. Expansão do espectro de RMN de H da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 500 MHz) na região entre 6,30 a 8,0 ppm.

O O 6 6 1 1 5 7 OCH 5 7 9 OCH3 9 3 8 8 2 2 HO 4 H3CO 4 3 3 3 2 3.6907 (2) -OCH 3

(3) -OCH 3 (2)-H8 3.8206 (2) -H7 3.9076 3.7569 2.6178

2.9040 2.6336 2.6021 2.8883 2.9192 3.7128

5.56 3.48 3.93

4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 23. Expansão do espectro de RMN de H da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 500 MHz) na região entre 2,4 a 4,0 ppm.

77.2850 77.0322 76.7794 29.7247 30.1002 36.0299 (2)-C8

(2)-C7 (3)-C4 22.7188 29.3852 (2)-C4 31.9420 40.5946 112.2926 154.0099 157.7512

114.9938 142.3239 12.3762

19.1798 28.0635 51.9267 144.5628

(3)-C8 131.9017 14.1529 (3)-C2/C6 115.8894 129.9806

(3) -C7 51.6523

129.4389 115.3261 (2/3)-OCH 3 (2)-C2/C6 (2/3)-C3/C5

160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Chemical Shift (ppm)

Figura 24. Espectro de DEPT-Q da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz).

112.2926 154.0099 157.7512 114.9938 142.3239 144.5628 131.9017 115.2033 115.8894 129.9806 129.4389 115.3261

160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 Chemical Shift (ppm)

Figura 25. Expansão do espectro de DEPT-Q da mistura 2 e3 (CDCl 3, 125 MHz) na

região entre δC 105,0 a 160,0.

O O 0 6 6 1 1 8 5 7 OCH 5 7 9 OCH3 9 3 8 8 16 2 2 24 4 H3CO 4 HO 3 3 3 32 2 40 (2)-C7/C8 48

56 64 (2/3)- 4-OCH 3 72 9-OCH 3 ppm 80

88 (2/3)-C3/C5 96 104

112

120

(2)-C2/C6 128 136 (3)-C2/C6 144

152

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Figura 26. Mapa de contornos HMQC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz).

-5 65 0 70 5 75 10 80 15 85

20 90

25 95

30 100

105 35

110 40 ppm ppm

115 45

120 50

125 55

130 60

135 65

140 70

145 75

150 80

155 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 ppm 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 ppm

Figura 27. Expansões do mapa de contornos HMQC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz).

-10 0

(2)- C7-H2 20 30 40

60 70 80

100 ppm 110 120

(2/3)- C1-H5 130

(2)- C4-H2 C4-H3 140 150 160

(3)- C4-H2 170 (3)- C9-H7/H8 180 (2)- C9-H7/H8 190 200

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 28. Mapa de contornos HMBC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz).

O O 6 6 1 1 5 7 OCH 5 7 9 OCH3 9 3 8 8 2 2 HO 4 H3CO 4 3 3 3 2

10 10

20 20

30 30

40 40

50 50

60 60

70 70

80 80

90 90

100 100 ppm ppm 110 110

120 120

130 130

140 140

150 150

160 160

170 170

180 180

190 190

200 200 8.0 7.5 7.0 6.5 3.05 3.00 2.95 2.90 2.85 2.80 2.75 2.70 2.65 2.60 2.55 2.50 2.45 ppm ppm

154

156

158

160

162

164

166

168

170

172 ppm

174

176

178

180

182

184

186

188

190

4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 ppm

Figura 29. Expansões do mapa de contornos HMBC da mistura 2 e 3 (CDCl 3, 125 MHz).

O O 6 6 1 1 5 7 OCH 5 7 9 OCH3 9 3 8 8 2 2 HO 4 H3CO 4 3 3 3 2

5.4. Identificação das substâncias 4 e 5

As substâncias 4 e 5, foram obtidas da fração hexânica da casca do caule da planta e precipitaram na forma de um sólido branco com solubilidade em solventes apolares a média polaridade. O espectro de RMN 1H mostrou sinais na região δ 0,75 a 1,87, correspondentes a grupos metila considerando se tratar de uma mistura de estruturas triterpênicas: um duplo dubleto em δ 2,83 ( J = 3,8 e 13,5 Hz) atribuído ao H-18, um triplete em δ4,50 ( J =8,85) atribuído ao H-3, um sinal de singleto atribuído ao grupo metila alfa a carbonila em δ 2,06 (H-2’) e sinais relativos a dupla olefínica em δ 5,28 ( t, J = 18,3 Hz) (Figura 30). Estes dados permitiram propor a estrutura de um triterpeno e a feição do sinal do H-18 está de acordo com o da série dos oleananos com carboxila centrada em C-28. O espectro de DEPT-Q (Figuras 31 e 32) definiu sinais de grupos metílicos δ 28,0 (C–23), 16,7 (C–24), 15,4 (C–25), 17,0 (C–26), 25,9 (C–27), 33,0 (C–29), 23,2 (C–30), os sinais de carbonos olefínicos em δ 122,5 (C-12) e 143,6 (C-13) e duas carbonilas δ 171,10 (éster) e 184,4 (ácido). O sinal em δ 80,9 é compatível com o valor do deslocamento químico do C-3, sustentando o grupamento O-acila. Ainda pela análise dos dados do mapa de contornos HMQC (Figuras 33, 34 e 35) pode-se verificar a correlação entre δ 2,06 (H-3) e δ 171,10 (C-1’) permitindo confirmar o grupo acetoxila em C-3. Todos os dados espectrais e a comparação com a literatura (SOBRINHO et al., 1991; CARVALHO et al., 2001) (Tabela 6), permitiram identificar o triterpeno como sendo o ácido 3-β-O–acetil–olean–12-en–28 óico ( 4). Ainda levando em consideração a mistura, verificou-se no espectro de RMN 1H (Figuras 30 e 31) sinais para outra substância com natureza triterpênica. Este apresentou sinais semelhantes aos observados para a substância 4. No espectro de DEPT-Q (Figuras 31 e 32) notou-se a presença do valor de deslocamento em δ 17,04 que foi atribuído ao C-29 e a comparação dos sinais com dados da literatura (TAKEDA et al., 2004) permitiu verificar que o outro componente da mistura ED6, se tratava de um triterpeno da classe ursano. Nesses o grupamento metílico (C-29) está conectado ao C-19 e esta exerce efeitode proteção sobre o C-13 ( δ 137,96) e desproteção da mesma sobre o C-18 ( δ 52,42), confome apresentado na tabela 6. Esses dados são semelhantes ao do ácido 3-β-acetil-12-ursen-28-óico, substância 5. O espectro de infravermelho da mistura (Figura 36) apresentou uma banda característica de absorção em ѵ 3200 cm -1 (-COOH). Absorção em ѵ 2933 cm -1 e ѵ 2860 -1 -1 cm (CH 3). Absorção intensa em ѵ 1710 cm corresponde a C=O de éster e a banda ѵ 1245 cm -1 referente a C-O. Corroborando assim com as estruturas propostas.

29 30 30

21 19 20 29 19 20 21 12 18 22 12 18 11 OH 22 25 26 13 17 28 11 26 13 17 28 OH 1 14 25 16 1 2 9 14 16 O 10 8 O 15 2 9 O 10 8 O 27 15 4 1' 3 5 7 27 O 3 4 2' 6 1' 5 7 O 6 2' 23 24 23 24 4 5

Tabela 6. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (500 MHz) da mistura 4 e 5 em CDCl 3. C 4 5 1 2 δC δClit. δC δClit. 1 38,2 38,2 38,03 38,24 2 27,6 26,7 23,33 23,37 3 80,9 80,9 80,93 80,91 4 38,0 37,9 37,90 37,85 5 55,2 55,2 55,26 55,27 6 18,1 18,2 18,15 18,14 7 32,7 32,8 32,48 32,81 8 39,4 39,3 39,46 39,46 9 47,9 47,6 47,42 47,43 10 37,0 37,1 36,90 36,88 11 23,6 23,7 23,26 23,26 12 122,5 121,6 125,68 125,70 13 143,6 145,2 137,96 137,90 14 41,8 42,0 41,81 41,89 15 27,6 26,2 27,95 27,95 16 27,9 26,7 24,00 24,05 17 32,5 32,5 47,92 47,92 18 47,5 47,2 52,42 52,53 19 46,5 46,7 38,98 38,99 20 30,7 31,0 38,80 38,80 21 33,7 34,6 30,58 30,57 22 33,1 33,0 36,69 36,69 23 28,0 28,3 28,06 28,05 24 16,7 16,7 16,70 16,69 25 15,4 15,3 15,53 15,51 26 17,0 16,8 17,11 17,08 27 25,9 25,9 23,59 23,55 28 184,4 184,0 184,39 182,90 29 33,0 33,0 17,04 17,00 30 23,2 23,2 20,83 21,30 1’ 171,1 173,7 171,09 171,30 2’ 21,0 22,8 21,21 21,16 1 SOBRINHO et al., 1991; CARVALHO et al., 2001. (75,5 MHz, CDCl 3) 2 TAKEDA et al., 2004. (Piridina-d5)

2.0618 1.1364 0.9530 0.9379 0.9158 0.8780 0.8616 0.7513 H2’

0.9688

1.6357

1.0822

1.6244

1.6483

1.6130 1.5979

H12 1.5626 1.5853 1.8860 1.3615 5.2799 1.3155 H3 1.9131

1.7189 H18 1.2909

4.5077 1.4592 4.5254

4.4939 7.2877 2.8202 2.8397 1.2556 2.8473 5.3165 1.8002 5.2434 2.1810 2.2037

1.74 1.62 1.23 0.58 5.69 19.26 13.77 41.19

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 30. Espectro de RMN de H da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 500 MHz)

30 29 30 29 19 19 20 21 20 21

12 18 12 18 22 22 11 11 25 26 13 17 28 OH 25 26 13 17 28 OH 1 14 16 1 14 16 O 2 9 O 10 8 2 9 15 O 10 8 O 27 15 3 4 5 7 27 1' O 3 4 2' 6 1' 5 7 O 6 2' 23 24 23 24 4 5

29 19 29 30 20 21 12 18 19 20 21 22 11 12 18 26 13 17 28 OH 22 25 11 1 14 25 26 13 17 28 OH 16 9 1 O 2 10 O 14 16 8 15 9 O 2 10 O 27 8 15 4 1' 3 5 7 27 O 6 4 2' 1' 3 5 7 O 6 2' 23 24 23 24 5 21.3321 4 17.1791 16.6591

15.3880 25.9184 C3 28.0346 80.9324

55.2563 (4)-C12 33.0759 40.8401 122.5052

47.5282

23.6289 (5)-C12

125.6832 52.4179 38.9840 38.8034

41.8080 184.4312 47.9254 137.9615 23.9972 77.3067

77.0539 (5) -C13 76.8011 184.6623 41.4902 143.6239 46.5387 39.2440 36.9761 171.1056 (4)-C13 30.6708 28-C=O 1’-C=O 27.6446 22.8127 45.8092 33.7693 18.1470 38.0234 23.3761 32.4765 23.5061

180 160 140 120 100 80 60 40 20 Chemical Shift (ppm) Figura 31. Espectro DEPT-Q da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 500 MHz).

21.3321 17.1791 16.6591 C5 15.3880 25.9184

C18 28.0346 55.2563 23.5855 33.0759 40.8401 47.5282 23.6289 15.5324 21.2093 52.4179 47.4199 38.9840 38.8034 41.8080 39.4534 47.9254 27.9479 32.7509 23.9972 30.5769 36.6944 41.4902 46.5387 39.2440 36.9761 30.6708 37.6767 27.6446 22.8127 45.8092 33.7693 18.1470 38.0234 23.3761 32.4765 23.5061

55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 Chemical Shift (ppm)

Figura 32. Expansão do espectro DEPT-Q da mistura 4 e 5 (CDCl3, 500 MHz) na região entre 5 a 55 ppm.

29 29 19 30 20 21 12 18 19 20 21 22 11 12 18 26 13 17 28 OH 22 25 11 1 14 25 26 13 17 28 OH 16 9 1 O 2 10 O 14 16 8 15 9 O 2 10 O 27 8 15 4 1' 3 5 7 27 O 6 4 2' 1' 3 5 7 O 6 2' 23 24 23 24 5

16 24 32 40

ppm C3 80

104 112 120 C12 128

136

144 152 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 33. Mapa de contornos HMQC da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 125 MHz).

30 29 30 29 21 19 19 20 20 21 12 18 12 18 22 22 11 11 26 13 17 OH 25 28 25 26 13 17 28 OH 1 14 1 16 14 16 O 2 9 O 9 10 8 O 2 10 O 15 8 15 27 4 27 1' 3 5 7 3 4 O 6 1' 5 7 2' O 6 2' 23 24 23 24

4 5

-8 0

8 C24 -H3 16 C2/C23-H3 24 32

C14-H12 40 C9-H12 48 56

64 72 80

ppm 88

96 104 112

120 128 136

144 152 160 C1’-H3 C1’-H2’ 168

5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

Figura 34. Mapa de contornos HMBC da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 125 MHz).

30 29 30 29 19 19 20 21 20 21 12 18 12 18 22 22 11 11 26 13 17 OH 25 28 25 26 13 17 28 OH 1 14 1 16 14 16 O 2 9 O 9 10 8 O 2 10 O 15 8 15 27 4 27 1' 3 5 7 3 4 O 6 1' 5 7 2' O 6 2' 23 24 23 24

4 5

0 65

5 70

10 75

15 80

20 85

25 90 30 95 35 100 ppm 40 ppm 105 45

110 50

115 55

60 120

65 125

70 130

75 135

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 5.5 5.0 4.5 ppm ppm

Figura 35. Expansões do mapa de contornos HMQC da mistura 4 e 5 (CDCl 3, 125 MHz).

Figura 36. Espectro de infravermelho da mistura 4 e 5 em KBr (cm -1).

30 29 30 29 19 19 20 21 20 21

12 18 12 18 22 22 11 11 26 13 17 OH 25 28 25 26 13 17 28 OH 1 14 1 16 14 16 O 2 9 O 9 10 8 O 2 10 O 15 8 15 27 4 27 1' 3 5 7 3 4 O 6 1' 5 7 2' O 6 2' 23 24 23 24 4 5

5.5. Identificação da substância 6

A substância 6, obtida do substrato clorofórmico das folhas da Eugenia dysenterica DC , apresentou-se como um sólido branco e foi identificada através da análise dos espectros de RMN 1H e DEPT-Q. O espectro no IV (Figura 41) apresentou absorções em 3490 cm -1 devido a estiramento de O-H e as absorções em ѵ 2980 cm -1, 2925 cm -1 e 2850 cm -1 que são C-H de grupos, CH2 e CH3; ѵ 1350 a 1480 cm -1 de C=C, e ѵ 1090 cm -1 de C-O. Os dados do espectro de IV, as propriedades dessa substância e as absorções dos sinais no espectro de RMN 1H permitiram pensar no sitosterol glicosilado. O espectro de RMN 1H (Figuras 37 e 38) mostrou um sinal em δ 5,33 atribuído ao hidrogênio de carbono olefínico H-6, em δ 4,23 associado ao hidrogênio do carbono anomérico (H-1’) e um conjunto de sinais entre δ 2,90-3,66 ppm compatíveis com a unidade de carboidrato. A aparência da série de sinais entre δ 2,9 e 0,66 é compatível com o esqueleto de esteróide. O espectro de RMN DEPT-Q (Figuras 39 e 40) mostrou sinais em δ 140,90 e δ 121,67 correspondentes aos carbonos olefínicos C-5 e C-6 de esteróide, um sinal em δ 77,22 que foi atribuído ao carbono carbinólico, C-3, e o sinal em δ 101,26 representante do carbono anomérico da unidade de açúcar ligada ao esteróide. Esta unidade foi identificada como glicose devido aos deslocamentos químicos dos carbonos metínicos em δ 77,22; 73,92; 70,52 e o sinal em 61,54 do carbono metilênico C- 6’. A análise dos demais sinais do espectro de RMN DEPT-Q e comparação com dados da literatura (RIBEIRO, 2012) apresentados na tabela 7, permitiram confirmar que a substância tratava-se de 3-O-β-glicopiranosil-β-sitosterol (6) .

29 21 28 22 18 24 12 20 27 17 23 11 25 19 13 HO 6' H 16 26 HO 1 9 14 4' 5' 2 O 10 8 15 HO 3 HH 7 3' 2' O 5 4 6 OH 1'

Tabela 7. Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de 13 C (400 MHz) da substância 6 em DMSO-d6. C δC Literatura * δH 5 140,90 140,9 - 10 36,68 36,7 - 13 42,32 42,3 - CH - 3 77,22 78,3 - 6 121,67 121,7 5,33 8 31,88 31,9 - 9 50,07 50,0 - 14 56,65 56,6 - 17 55,90 55,9 - 20 35,97 35,9 - 22 - 33,8 - 23 - 25,9 - 24 45,60 45,6 - 25 29,15 29,1 - CH 2 - 1 37,31 37,3 - 2 28,28 29,7 - 4 38,77 38,7 - 7 33,85 31,8 - 11 21,07 21,0 - 12 39,90 40,0 - 15 24,34 24,3 - 16 29,73 28,2 - 22 31,34 33,8 - 23 25,87 25,9 - 28 23,07 23,1 - CH 3 - 18 12,14 12,1 0.66 (s) 19 19,40 19,5 0.97 (s) 21 19,08 19,4 0.91 (d) 26 19,57 19,1 27 20,19 20,2 29 12,25 12,2 0.83 (t) Carboidrato 1’ 101,26 101,2 4,23 (d) 2’ 73.92 73,9 3’ 77.22 77,2 3,48(m) 4’ 70.52 70,6 3,05(m) 5’ 77.38 77,2 6’ 61.54 61,5 *RIBEIRO, 2012 (125 MHz, DMSO-D6)

3.3712 0.8151

0.8327 0.9682

0.6633

0.7976 0.9211

2.5169 2.5125

2.5213 4.8967

H1’ 1.1507

H6 4.9087 4.8848 1.1814 4.9174 1.4775 1.8206 1.2348 1.2555 1.1118 4.9294 4.2199 4.2394 3.4189 3.0588 4.4533 1.9555 3.0733 3.4333 5.3358 3.0438 3.1285 3.0350 2.9008 2.9114 3.1071 1.6350 1.6488 4.4388 3.6466 2.3626 2.1355 4.4671 1.6187 2.0991

1.02 3.51 1.121.03 1.08 3.91 1.30 1.18 1.32 3.53 4.56 14.71 10.25

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 37. Espectro de RMN H (DMSO-d6, 400 MHz) da substância 6.

29 21 28 22 18 24 12 20 27 17 23 11 25 19 13 HO 6' H 16 26 HO 1 9 14 4' 5' 2 O 10 8 15 HO 3 HH 7 3' 2' O 5 4 6 OH 1'

0.9682 0.8327 0.8151 0.6633 0.7976 0.9211 0.9055 2.5169 0.8503 2.5125 2.5213 1.1507 1.1814 1.4775 1.8206 1.2348 1.2555 1.1118 1.2724 3.0588 1.0874 1.3997 1.3878 1.9555 3.0733 3.0438 3.1285 3.0350 2.9008 2.9114 3.1071 3.1398 1.6350 3.0231 1.6488 2.3626 2.1355 1.6187 1.6644 2.0991 2.8795

3.91 1.30 1.18 1.32 2.353.53 1.34 4.56 14.714.79 10.25

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 38. Expansão do espectro de RMN H (DMSO-d6, 400 MHz) da substância 6.

29 21 28 22 18 24 12 20 27 17 23 11 25 19 13 HO 6' H 16 26 HO 1 9 14 4' 5' 2 O 10 8 15 HO 3 HH 7 3' 2' O 5 4 6 OH 1'

29 21 28 22 18 24 12 20 27 17 23 11 25 19 13 HO 6' 16 26 1 9 H 14 HO 4' 5' 2 O 10 8 15 HO 3 HH 7 3' 2' O 5 4 6 OH 1'

6 C6’ 61.5340 40.3690 40.1545 39.9477 39.7409 39.5340 39.3196 23.0647

40.5758

C5 38.7680 29.7291

25.8684 42.3147 21.0654 140.9007

31.8816

55.8961 56.6468

C5’ 50.0667 35.9644 77.3828 70.5193 121.6737 C4’ 73.9204 101.2595 45.6009

29.1469 C2’ C6 C1’ 77.2143 C3’ 20.1845 19.5641 19.3955 19.0815 12.2486 12.1337 C3

144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 Chemical Shift (ppm)

Figura 39. Espectro de DEPT-Q (DMSO-d6, 100 MHz) da substância 6.

61.5340 40.5758 40.3690 40.1545 39.9477 39.7409 39.5340 39.3196 23.0647 38.7680 29.7291 25.8684 37.3049 36.6768 24.3363 28.2736 42.3147 33.8043 21.0654 31.8433 31.8816 55.8961 56.6468 50.0667 35.9644 77.3828 70.5193 73.9204 45.6009 29.1469 77.2143 20.1845 19.5641 19.3955 19.0815 12.2486 12.1337

75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 Chemical Shift (ppm)

Figura 40. Expansão do espectro de DEPT-Q (DMSO-d6, 100 MHz) da substância 6 na região entre 10,0 a 78,0 ppm.

Figura 41. Espectro de infravermelho da substância 6 em KBr (cm -1).

5.6. Identificação da substância 7

A substância 7 apresentou-se como um sólido amorfo amarelo que foi obtido da fração butanólica do caule. Este apresentou teste positivo para flavonóide. Os espectros de RMN 1D e 2D e comparação com os dados da literatura (ELDAHSHAN et al., 2011) permitiram a identificação da isoquercetina ( 7). O espectro de IV (Figura 42) exibiu bandas de absorção em ѵ 3325 cm -1 (estiramento O-H), ѵ 1670 cm -1 (estiramento C=O de carbonila conjugada), ѵ 1652, 1610 e 1560 cm -1 (estiramento de ligação dupla conjugada à carbonila). A análise do espectro de RMN 1H permitiu identificar sinais na região de hidrogênios em sistema aromático δ 6,17 a 7,57 (Figuras 43, 44 e 45). Os sinais em δ 6,96 ( sl , H-2’), 6,72 ( d, J=8,2 Hz, H-5’) e 7,57 ( d, J=10,4 Hz, H-6’) permitiram propor um sistema trissubistituído ABC. Esses acoplamentos puderam ser confirmados no mapa de contornos [ 1Hx 1H] COSY (Figuras 49 e 50). Ainda no espectro de RMN 1H verificou-se sinais na região de açúcar δ 3,25-4,36 e um dubleto em δ 5,22 (C-1”) com J=7,2 Hz atribuído a um hidrogênio de carbono anomérico (acetal), cujos acoplamentos também puderam ser confirmados pelo mapa de contornos [ 1Hx 1H] COSY. No espectro de DEPT-Q (Figuras 46, 47 e 49) mostraram sinais de carbonos quaternários δ 157,89 (C-2), 133,91 (C-3), 177,88 (C-4), 161,36 (C-5), 164,61 (C-7), 156,89 (C-9), 104,07 (C-10), 121,58 (C-1’), 144,53 (C-3’) e 148,29 (C-4’); sinais de carbonos metínicos pertencentes a sistema aromático δ 98,60 (C-6), 93,32 (C-8), 6,96 (C- 2’) e 6,72 (C-5’), 7,57 (C-6’) e sinais remanescentes de carbonos atribuídos à unidade de açúcar δ 102,88 (C-1”), 74,28 (C-2”), 76,60 (C-3”), 69,76 (C-4”), 76,68 (C-5”) e 62,91 (C- 6”), além de sinais que evidenciaram a presença de outro flavonóide na amostra HD1, porém que não teve sua estrutura elucidada. Pelo mapa de contornos HSQC (Figura 51) foram estabelecidas as correlações diretas dos carbonos metínicos da porção aglicona: C-6 [ δH/ δC 6,17/98,60], C-8 [ δH/ δC

6,32/93,52], C-2’ [ δH/ δC 6,96/114,53], C-5’[ δH/ δC 6,72/115,87] e C-6’ [ δH/ δC 7,57/121,58]; também dos carbonos metínicos de uma unidade de açúcar C-1’’ [ δH/ δC 5,22/102,89], C-

2’’ [ δH/δC 3,51/74,28], C-3’’[ δH/δC 3,52/76,60], C-4’’ [ δH/δC 3,57/69,76], C-5’’ [ δH/δC 13 3,25/76,68] e C-6’’ [ δH/δC 4,36/62,91] que pelos dados de RMN C quando comparados com a literatura (BREITMAIER & VOELTER, 1989) foi identificado como sendo a glicose. Pelo mapa de contornos HMBC (Figuras 52 e 53) pode-se confirmar a conexão da unidade açúcar através do acoplamento a três ligações ( 3JCH) entre o hidrogênio H-1” (δ 5,22) e o carbono C-3 ( δ 133,91) que permitiu concluir que a unidade de glicose estaria nesta posição. A Tabela 8 apresenta todas as atribuições dos dados de RMN 1D e 2D

(ELDAHSHAN et al., 2011). Estes se assemelham aos dados do flavonóide isoquercetina que está sendo relatado pela primeira vez no caule de E. dysenterica DC.

OH 3' 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

7 Tabela 8. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da substância 7 em MeOD 4. HSQC Literatura * 2 3 δC δH HMBC ( J, J) δC δH 2 157,89 - 156,1 - 3 133,91 - H-1” 133,3 - 4 177,88 - H-8 177,7 - 5 161,36 - H-6, H-8 161,2 - 6 98,60 6,17 ( sl ) 98,9 6,2 ( d, J=2,0Hz) 7 164,61 - 164,6 - 8 93,52 6,32 ( sl ) 93,6 6,41 ( d, J=2,0Hz) 9 156,89 - 156,4 - 10 104,07 - H-6, H-8 103,7 - 1’ 121,58 - H-2’ 121,1 - 2’ 114,53 6,96 ( sl ) 115,2 7,76 ( d, J=2,5 Hz) 3’ 144,88 - H-2’ 144,8 - 4’ 148,29 - 148,5 - 5’ 115,82 6,72 ( d, J=8,2 Hz) H-6’ 116,2 6,82 ( d, J=8,5 Hz) 6’ 121,58 7,57 ( d, J=10,4 Hz) H-1’, H-3’, H-5’ 121,6 7,54 ( d, J=8,5 e 2,5 Hz) 1’’ 102,89 5,22 ( d, J=7,2Hz) 100,9 5,34 ( d, J=7,5 Hz) 2’’ 74,28 3,51 ( m) H-1” 74,1 3,08-3,88 ( m) 3’’ 76,60 3,52 ( m) H-1’’ 76,5 3,08-3,88 ( m) 4’’ 70,02 3,57 ( m) H-2”, H-3” 69,9 3,08-3,88 ( m) 5’’ 74,41 3,25 ( m) 77,5 3,08-3,88 ( m) 6’’ 62,92 4,36 ( m) H-1” 61,0 3,08-3,88 ( m)

*ELDAHSHAN, 2011(75,6 MHz, DMSO-d6)

Figura 42. Espectro de infravermelho da substância 7 em KBr (cm -1).

7.5550 6.9650 5.0297 3.5168 3.5010 3.3314 3.5300 6.1663 6.3245 5.2169 5.2314 3.5495 7.5758 4.3136 2.1646 6.7330 6.7166 3.4834 4.3665 5.1532 6.1877 3.8257 4.2909 3.5672

2.00 1.55 0.85 0.89 1.15 1.85 0.42 4.69

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 43. Espectro de RMN de H (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 7.

H2’

6.9650

H6’ H6 7.5550 H8

6.1663 H5’ 6.3245

7.5758 6.7330 6.7166 6.1877

2.00 1.55 0.850.89 0.82

7.5 7.0 6.5 6.0 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 44. Expansão do espectro de RMN de H (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 7 na região entre 6,0 a 8,0 ppm.

OH 3' 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

OH 3'

5.0297 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH H2’’ 3 2" 5"

3.3314 6 4 10 OH 5 O H3’’ 1" 3" OH H4’’ OH O H5’’ 7

3.5168 H1’’ 3.5010 3.5300 H6’’

5.2169 5.2314 3.5495 0.0131 4.3136 2.1646

1.2713 3.4834 4.3665 5.1532

3.8257 4.2909 3.5672

1.151.85 0.42 4.69

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 45. Expansão do espectro de RMN de H (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 7 na região entre 0,0 a 5,5 ppm.

47.8315 47.6582 47.4849 47.3187 47.9977 144.8806 62.9266 47.1454 48.1710 121.5808 119.8113 148.2969 104.0661 133.9096 177.8804 157.8956 166.8299 144.3317 42.0824 156.8917 138.3515 164.6054 61.1282 161.3552 76.9167 121.8335 69.7664 47.9399 76.6855 93.4057 10.2239 93.5212 122.2091 70.0264 102.8889 74.4177 76.6061 115.8244 98.5987 74.2877 114.5316 108.7752

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Chemical Shift (ppm)

Figura 46. Espectro de RMN DEPT-Q (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7.

OH 3' 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

144.8806 121.5808 119.8113 148.2969 104.0661 133.9096 177.8804 157.8956 166.8299 144.3317 156.8917 138.3515 164.6054 161.3552 121.8335 108.7102 93.4057 93.5212 122.2091 102.8889 115.8244 98.5987 114.5316 108.7752

175 170 165 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 95 Chemical Shift (ppm)

Figura 47. Expansão do espectro de RMN DEPT-Q (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7 na região entre 93,0 a 180,0 ppm.

OH 3' 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

47.8315 47.6582 47.4849 47.3187 47.9977

C-6’’ 62.9266 47.1454 48.1710 42.0824 61.1282 76.9167 69.7664 47.9399 76.6855

C-5’’ 70.0264 74.4177 76.6061 C-3’’ 74.2877 C-2’’ C-4’’

75 70 65 60 55 50 45 Chemical Shift (ppm)

Figura 48. Expansão do espectro de RMN DEPT-Q (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7 na região entre 42,0 a 78,0 ppm.

OH 3' 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

-0.5

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 ppm 4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 49. Mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 7.

2.5 6.0

3.0

6.5

3.5

7.0 4.0 ppm ppm

4.5 7.5

5.0

8.0

5.5

8.5 6.0

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 ppm ppm

Figura 50. Expansões do mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 7.

-8 0

32 40 48

C-6’’ C-4’’ 64 C-2’’ 72 C-5’’ ppm C-3’’ 80 C-8 88 C-6 96 C-1’’ C-2’ 104

C-6’ C-5’ 112 120

128 136 144 152

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 51. Mapa de contornos HSQC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7.

OH 3' 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

-10 0 10

30 40 50

70 80 90

100 ppm

110 C-1’-H2’ 120 C-3-H1’’ 130 140

C-3’-H2’ 150

C-5-H6/H8 160 170 180 190

200

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 52. Mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7.

3' 4' OH 2' 8 OH HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

OH 48 3' 4' OH 2' 56

8 OH 64 HO 7 9 O 5' 6" 1' 4" 2 6' O OH 72 3 2" 5" 6 4 10 OH 80 5 O 1" OH 3" OH O 88 96

7 104

112

C10 -H6/H8 ppm 120 C3-H1’’ C1’/C3’-H2’ 128 136 144 152 160 168 176 C5-H6/H8 184

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm

Figura 53. Expansão do mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 7.

5.7. Identificação da substância 8

A substância 8 apresentou-se como um sólido amorfo amarelo que foi obtido da fração acetato de etila da folha. Esta também apresentou teste positivo para flavonóide. Os espectros de RMN 1D e 2D e comparação com os dados da literatura (SANTOS et al., 2005) permitiram a identificação da 3-O-β-galactopiranosil quercetina (hiperina), majoritária na amostra (8). O espectro de IV (Figura 54) exibiu bandas de absorção em ѵ 3437 cm -1 (estiramento O-H), ѵ 1660 cm -1 (estiramento C=O de carbonila conjugada) e ѵ 1592 cm -1 (estiramento de ligação dupla conjugada à carbonila). A análise do espectro de RMN 1H permitiu identificar sinais na região de hidrogênios em sistema aromático δ 6,21 a 7,78 (Figuras 55 e 56). Os sinais em δ 7,78 (sl , H-2’), 6,88 ( m, H-5’) e 7,61 ( m, H-6’) permitiram propor um sistema trissubistituído ABC. Esses acoplamentos puderam ser confirmados no mapa de contornos [ 1Hx 1H] COSY (Figuras 59 e 60). Ainda no espectro de RMN 1H verificou-se sinais na região de açúcar δ 3,44-3,67 e um dubleto em δ 5,19 (H-1”) com J=7,2 Hz atribuído a um hidrogênio de carbono anomérico (acetal) indicando a configuração β para o mesmo, cujos acoplamentos também puderam ser confirmados pelo mapa de contornos [ 1Hx 1H] COSY. No espectro de DEPT-Q (Figuras 57 e 58) identificamos sinais de carbonos quaternários δ 157,02 (C-2), 134,21 (C-3), 178,0 (C-4), 161,63 (C-5), 164,85 (C-7), 157,24 (C-9), 104,15 (C-10), 121,61 (C-1’), 144,57 (C-3’) e 148,56 (C-4’); sinais de carbonos metínicos pertencentes a sistema aromático δ 98,53 (C-6), 93,33 (C-8), 116,02 (C-2’) e 114,57 (C-5’), 121,87 (C-6’) e sinais remanescentes de carbonos atribuídos à unidade de açúcar δ 103,19 (C-1”), 69,48 (C-2”), 73,89 (C-3”), 67,75 (C-4”), 76,17 (C-5”) e 61,10 (C- 6”), além de sinais que evidenciaram a presença de 3-O-β-glicopiranosil quercetina (isoquercetina) na amostra 8. Pelo mapa de contornos HSQC (Figuras 63 e 64) foram estabelecidas as correlações diretas dos carbonos metínicos da porção aglicona: C-6 [ δH/δC 6,21/98,53], C-

8 [ δH/ δC 6,41/93,33], C-2’ [ δH/ δC 7,78/116,02], C-5’[ δH/δC 6,88/114,57] e C-6’ [ δH/δC

7,61/121,87]; também dos carbonos metínicos de uma unidade de açúcar C-1’’ [ δH/δC

5,19/103,19], C-2’’ [ δH/δC 3,44/69,48], C-3’’[ δH/δC 3,55/73,89], C-4’’ [ δH/δC 3,67/67,75], C- 13 5’’ [ δH/δC 3,44/76,17] e C-6’’ [ δH/δC 3,55/61,14] que pelos dados de RMN C quando comparados com a literatura (BREITMAIER & VOELTER, 1989) foi identificado como sendo a galactose. Pelo mapa de contornos HMBC (Figuras 61 e 62) pode-se confirmar a conexão da 3 unidade açúcar através do acoplamento a três ligações ( JCH ) entre o hidrogênio H-1” ( δ

5,19) e o carbono C-3 ( δ 134,21) que permitiu concluir que a unidade de galactose estaria nesta posição. A Tabela 9 apresenta todas as atribuições dos dados de RMN 1D e 2D (SANTOS et al., 2005). Estes se assemelham aos dados do flavonóide hiperina que está sendo relatado pela primeira vez nas folhas de E. dysenterica DC.

OH 3' 4' OH 2' 8 HO OH HO 7 9 O 5' 1' 6" 2 6' O 4" 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

Tabela 9. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13 C (125 MHz) da substância 8 em MeOD 4. HSQC Literatura* a b δC δH HMBC ( 2J, 3J) δC δH 2 157,02 - H-6’ 156,86 - 3 134,21 - H-1” 134,01 - 4 178,0 - 178,0 - 5 161,63 - H-6 161,74 - 6 98,53 6,21 ( sl ) H-8 99,28 6,20 ( d, 1,8 Hz) 7 164,85 - H-8 164,88 - 8 93,33 6,41 ( sl ) H-6 94,09 6,41 ( d, 1,8 Hz) 9 157,24 - 156,75 - 10 104,15 - H-6, H-8 104,34 - 1’ 121,61 - H-5’ 121,61 - 2’ 116,02 7,78 ( sl ) 116,50 7,54 ( d, 2,2 Hz) 3’ 144,57 - H-5’ 145,38 - 4’ 148,56 - H2’, H-5’, H-6’ 149,03 - 5’ 114,57 6,88 ( m) 115,63 6,82 ( d, 8,4 Hz) 6’ 121,87 7,61 ( m) H-2’ 122,50 7,66 ( dd , 2,2 Hz; 8,8 Hz) 1’’ 103,19 5,19 ( d, 7,9 Hz) 102,37 5,37 ( d, 7,5 Hz) 2’’ 69,48 3,44 ( m) H-1” 71,75 3,57 ( m) 3’’ 73,89 3,55 ( m) H-1” 73,73 3,38 ( m) 4’’ 67,75 3,67 ( dd , 1,85 H-2” 68,46 3,66 ( m) Hz; 8,15 Hz) 5’’ 76,17 3,44 ( m) H-3”, H-1” 76,27 3,34 ( m) 6’’ 61,10 3,55 ( m) 60,46 3,31 e 3,46 (m)

a b *SANTOS et al., 2005; BREITMAIER & VOELTER, 1989 ( 100 MHz, 400 MHz, DMSO-d6)

Figura 54. Espectro de infravermelho da substância 8 em KBr (cm -1).

6.4102 6.2180 4.9364 3.3333 0.0251 3.8364 7.7712 6.8830 7.6054 5.1917 5.1785 6.8988 7.6332 3.9215 3.5388 7.5872 5.1980 3.6744 3.4619 6.8704 5.2138 3.9360 3.1234 1.3022 3.8099 3.1455 3.1032 5.4905

2.30 1.68 1.71 1.79 2.83 1.64 0.63

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 55. Espectro de RMN H da amostra 8 (MeOD 4, 500 MHz).

OH 3' 4' OH 2' H8 8 HO OH H6 HO O 5' 7 9 6" 1' 6.4102 2 6' O 4" 6.2180 A 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" H2’ OH O

H5’ 7.7712 H6’ 8 6.8830 7.6054 6.8988 7.6332

7.5872

6.8704

1.00 2.30 1.68 1.71 1.69

7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2 Chemical Shift (ppm)

4.9364 3.3333

Açúcar

H1’’ 3.8364

5.1917 5.1785 3.9215 3.5388 5.1980 3.5237 3.4834 3.6744 3.6781 3.4619 3.8572 3.6618 5.2138 3.6573 3.4235 3.9360 3.1234 3.5558 3.8099 3.1455 3.1032

1.79 1.172.83 1.051.43 1.64 0.63 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 56. Expansão do espectro de RMN de RMN H da amostra 8 (MeOD 4, 500 MHz) na região entre 6,2 a 7,8 ppm (A) e 3,0 a 5,3 ppm (B).

47.9399 47.7738 47.6004 47.4271 47.2610 47.0876 48.1132 65.5917 65.8229 164.8509 157.0217 104.1528 121.4508 157.2384 144.5701 161.6297 148.5569 178.0393 134.2130 48.2288 47.7160 76.1655 73.8904 121.8697 69.5930 114.5749 48.0554 47.8821 121.6097 116.0266 67.7513 71.4781 114.7555 103.2428 72.7348 98.5337 93.3335

176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 Chemical Shift (ppm)

Figura 57. Espectro de RMN DEPT-Q da amostra 8 (MeOD 4, 125 MHz).

OH 3' 4' OH 2' 8 HO OH HO 7 9 O 5' 1' 6" 2 6' O 4" 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

65.8229 65.5917 104.1528 121.4508 76.1655 73.8904 103.1922 121.8697 69.5930 114.5749 115.7739 121.6097 116.0266 67.7513 71.4781 114.7555 103.2428 72.7348 98.5337 93.3335

120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 65 Chemical Shift (ppm)

Figura 58. Expansão do espectro de RMN DEPT-Q da amostra 8 (MeOD 4, 125 MHz) na região entre 65,0 a 122,0 ppm.

3' 4' OH 2' 8 HO OH HO 7 9 O 5' 1' 6" 2 6' O 4" 3 2" 5" 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" OH O

OH 3' 0 4' OH 2' 0.5 8 HO OH 1.0 HO 7 9 O 5' 1' 6" 2 6' O 4" 1.5 3 2" 5" 6 4 10 OH 2.0 5 O 1" OH 3" OH O 2.5 3.0

8 3.5

4.0 ppm

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5 7.0 7.5 8.0

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 59. Mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 8.

5.5 3.0

6.0 3.5

6.5 4.0 ppm ppm

7.0 4.5

5.0 7.5

5.5 8.0

5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 7.5 7.0 6.5 ppm ppm

Figura 60. Expansões do mapa de contornos COSY (MeOD 4, 500 MHz) da amostra 8.

OH -10 3' 0 4' OH 2' 10 8 HO OH 20 HO 7 9 O 5' 1' 6" 30 2 6' O 4" 40 3 2" 5" 6 4 10 O OH 50 5 1" OH 3" 60 OH O 70 80 8 90 C6-H8 C8-H6

100 ppm

C10-H6/H8 C1’’-H2’’/H3’’ 110 C1’-H5’ 120 130 C3-H1’’ C4’-H6’ C3’-H5’ 140 C4’-H5’ 150 C2-H6’ C5-H6 160 170 C6’-H2’ 180 190 200 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 61. Mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 8.

85 35 90 40 95 45 100 50 105 55 110 60 115 65 120 70 125 75 130 80 135 85 140 ppm ppm 90 145 95 150 100 155 105 160 110 165

115 170

120 175

125 180

130 185

135 190

140 7.5 7.0 6.5 ppm 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm

Figura 62. Expansões do mapa de contornos HMBC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 8.

-8 OH 0 3' 4' OH 8 2' 8 HO OH 16 HO 7 9 O 5' 1' 6" 24 2 6' O 4" 3 2" 5" 32 6 4 10 OH 5 O 1" OH 3" 40 OH O 48

56 8 64

ppm Açúcar 80

C8 88 96 C6 C1’’ 104 112 C2’ C5’ C6’ 120 128 136 144

152

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 63. Mapa de contornos HSQC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 8.

92 40 94 45 96

50 98

100 55

102 60 104

65 106

70 108 ppm ppm 110 75 112 80 114

85 116

118 90

120 95 122

100 124

105 7.5 7.0 6.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm ppm

Figura 64. Expansões do mapa de contornos HSQC (MeOD 4, 125 MHz) da amostra 8.

5.8. Identificação da substância 9

A substância 9 também apresentou-se como um sólido amorfo amarelo obtido da fração acetato de etila da folha e mesma subfração que a amostra 8. Assim, a substância 9 revelou teste positivo para flavonóide e quando os espectros de RMN 1D e 2D, comparados com os dados da literatura (BARAKAT et al., 1999) permitiram a identificação da quercetina 3-O-β-(6”-galoilglicopiranosídeo) ( 9). O espectro de IV (Figura 65) exibiu bandas de absorção em ѵ 3370 cm -1 (estiramento O-H), ѵ 1655 cm -1 (estiramento C=O de carbonila conjugada), ѵ 1623 cm -1 (estiramento de ligação dupla conjugada à carbonila). O espectro de RMN de 1H (Figuras 66, 67, 68 e 69) da amostra apresentou vários sinais na região de hidrogênios em sistema aromático entre δ 6,0 a 8,0; mostrando que além da substância identificada como quercetina 7-O-β-(6”-galoilglicopiranosídeo) ( 9) havia sinais que correspondiam o outro composto fenólico que não foi elucidado (possivelmente resquícios da sustância 8). Entretanto, a análise dos sinais de RMN de 1H permitiu identificar um sistema ABX de deslocamentos de hidrogênios aromáticos em δ 7,54 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’), δ 7,50 (1H, dd , J = 2,0 e 8,5 Hz, H-6’) e δ 6,91 (1H, d, J = 8,28 Hz, H-5’) devido à uma dissubstituição 3’, 4’ do anel B (catecol), um sistema de spins AB indicando um acoplamento meta para o anel A ( δ 6,37, 1H, sl , H-8 e δ 6,19, 1H, d, J =2,5 Hz, H-6) e um sistema com o sinal de um singleto largo em δ 5,48 representando o sistema trissubistituído 3”’, 4”’ e 5”’ do anel galoil. Um dubleto em δ 5,15 foi atribuído a hidrogênio anomérico e o valor da sua constante de acoplamento escalar ( J = 6,76 Hz) indicou uma posição axial do hidrogênio do açúcar, ou seja, orientação β da ligação glicosídica (SILVERSTEIN, 2000). A presença da unidade glicosídica foi confirmada pelos sinais na região de δ 3,43 a δ 3,95, que apresentaram-se sobrepostos, impossibilitando a atribuição dos mesmos (Tabela 9). Pelo experimento COSY 1H-1H (Figuras 72 e 73) pode-se estabelecer as correlações entre os sinais em δ 5,15 (H-1”) com 3,43/ 3,56 (H-2” ou H-3”) e dos sinais da região aromática δ 6,91 (H-5’) com 7,50 (H-6’) e este com 7,54 (H-2’). A análise do espectro de HSQC (Figuras 76 e 77) possibilitou a atribuição dos seguintes sinais de hidrogênios e carbonos de maneira inequívoca: C-6 [ δH/δC

6,19/98,74], C-8 [ δH/δC 6,37/93,58], C-2’ [ δH/δC 7,54/115,04], C-5’[ δH/δC 6,91/115,80] e C-

6’ [ δH/δC 7,50/121,59], C-1’’ [ δH/δC 5,15/103,39], C-6” [ δH/δC 3,51/61,14], C-2”’ [ δH/δC 5,48/108,06]. A posição do açúcar foi realizada a partir da análise do mapa de contornos HMBC (Figuras 74 e 75) devido às correlações entre os sinais em δ 134,10 com δ 5,15 (C-3/H-1”). A atribuição de todos os sinais de RMN de 13 C (Figuras 70 e 71) para a

apresentação na tabela 10 foi baseada na análise dos mapas de contornos HSQC e HMBC e relatos na literatura (BARAKAT et al., 1999). Estes se assemelham aos dados da quercetina 3-O-β-(6”-galoilglicopiranosídeo) que está sendo relatado pela primeira vez nas folhas de E. dysenterica DC. OH 2’’’ OH 3’’’ O 3’ OH 2’ OH 1’’’ 4’’’ 4’ 9 1’ 6’’ O 6’’’ 5’’’ OH 8 10 O 5’ OH 2 6’ O 5’’ 4’’ OH 7 1’’ 4 3 2’’ OH 5 O 3’’ 6 OH OH O 9

Tabela 10. Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de 13 C (100 MHz) da substância 9 em DMSO-d6. C HSQC HMBC Literatura* a b δ H δ C δ H δ C 2 - 148,47 - - 147,9 3 - 134,10 H-1” - 136,1 4 - 178,47 - - 176,0 5 - 161,51 H-6 - 160,5 6 6,19 ( d, 2,5 Hz) 98,74 H-8 6,42 ( d, 2,5 Hz) 98,6 7 - 165,28 H-6 - 162,5 8 6,37 ( sl ) 93,58 H-1”, H-6 6,80 ( d, 2,5 Hz) 94,2 9 - 156,96 H-8 - 155,8 10 - 103,97 H-8 - 104,8 1’ - 121,59 - - 121,8 2’ 7,54 ( d, 2 Hz) 115,04 H-6’ 7,30 ( d, 2,5 Hz) 115,6 3’ - 144,62 - - 145,2 4’ - 148,47 H-6’ - 147,7 5’ 6,91 ( d; 8,28 Hz) 115,80 H-6’ 6,90 ( d, 7,5 Hz) 115,5 6’ 7,50 ( dd , 2 ; 8,5 Hz ) 121,59 - 7,52 ( dd , 7,5 ; 2,0 Hz ) 120,1 1” 5,15 (d, 6,76 Hz) 103,39 H-6, H-3” 5,20 ( d, 8,0 Hz) 99,7 2” 3,43-3,56 ( m) 73,91 H-4” 3,30-3,60 ( m) 73,2 3” 3,43-3,56 ( m) 76,20 H-1” 3,30-3,60 ( m) 76,1 4” 3,43-3,56 ( m) 69,59 H-2”, H-3” 3,30-3,60 ( m) 69,1 5” 3,78-3,95 ( m) 77,25 - 3,90 ( m) 73,8 6” 3,51 ( m) 61,12 - 4,30 ( dd , 12,5; 5 Hz) 62,8 1”’ - 121,67 - - 119,4 2”’ 5,47 ( s) 108,06 - 6,97 ( s) 108,8 3”’ - 144,95 - - 145,6 4”’ - 133,98 - - 138,5 5”’ - 144,52 - - 145,5 6”’ 5,47 ( s) 108,06 - 6,97 ( s) 108,7 C=O - 165,34 H-2”’, H-6”’ - 165,8 a b *BARAKAT, et al., 1999 (400 MHz, TMS; DMSO-d6)

Figura 65. Espectro de infravermelho da substância 9 em KBr (cm -1).

4.9877 3.3305 3.3267 3.5287 1.2774 3.5230 5.4782 0.0147 3.5481 6.1883 7.5394 7.6272 6.1971 3.8354 3.8291 3.9031 5.1721 6.9046 6.9253 6.8776 3.9389 3.4559 5.1903 4.3585 3.9521 4.3636 6.8569 5.1420 6.8682 3.5694 7.7740 7.5112 7.4898 6.3733 7.4848 3.1322 3.0243

3.05 1.881.04 0.64 1.78 0.60 2.00 4.79 0.71

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 -0.5 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 66. Espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9.

H2’ H5’

7.5394 7.6272 H6’ 7.5444 7.5908 6.9046 6.9253 6.8776 7.6322 7.5852 6.8896 6.8569 6.8682

7.6115 7.7740 7.7690 7.5112 7.4898 7.5055 7.4848

0.461.69 0.43 0.48 1.88

7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 67. Expansão do espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9 na região entre 6,85 a 7,8 ppm.

OH 2’’’ OH 3’’’ O 3’ OH 2’ OH 1’’’ 4’’’ 4’ 9 1’ 6’’ O 6’’’ 5’’’ OH 8 10 O 5’ OH 2 6’ O 5’’ 4’’ OH 7 1’’ 4 3 2’’ OH 5 O 3’’ OH OH O

4.9877

H2’’’/H6’’’ H6 H1’’ 5.4782

H8 6.1883 6.1971 5.1721 5.1903 5.1589 5.1420

6.3733

0.46 1.04 0.64 1.78

6.5 6.0 5.5 5.0 Chemical Shift (ppm)

1 Figura 68. Expansão do espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9 na região entre 4,5 a 6,5 ppm.

100

3.3305 3.3267 3.3348 3.5287 3.5343 3.5230 3.5481 3.8354 3.8291 3.9031 3.9389 3.4559 3.9314 4.3585 3.9521 4.3636 3.4346 3.4986 3.4923 3.5036 3.8919 3.5694 3.8160 3.7996 3.1322 3.7871 3.1366 3.0243 3.4126

0.60 1.71 2.00 0.55 4.79 0.71

4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 69.Expansão do espectro de RMN de H (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9 na região entre 3,0 a 4,5 ppm.

2’’’ 48.0521 47.8453 47.6308 47.4163 47.2018 OH 3’’’ O 3’ OH 2’ OH 1’’’ 4’’’ 4’ 9 1’ 6’’ O 6’’’ 5’’’ OH 8 10 O 5’ OH 2 6’ O 5’’ 4’’ OH 7 1’’ 4 3 2’’ OH 5 O 3’’ OH 46.9874 48.2666 OH O 61.1203

65.8160 42.0772

103.9711 65.6704 165.2829 148.4689 121.6737 144.9529 157.8219 178.4660

157.1325 144.6235 161.5141 177.8532 157.3776 133.9759 156.9563 133.4014 144.5239 121.4439 29.3537

93.5763 93.5227

116.0665 121.5588 121.9112 76.1955 115.4077 108.0617 103.3124 115.7984 115.0400 73.9051 114.5958 69.5924 86.5826 81.8716 77.2526 98.7393

10.2340

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Chemical Shift (ppm) 13 Figura 70. Espectro de RMN de C (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9.

101

165.2829 148.4689 121.6737 144.9529 157.8219 178.4660 157.1325 144.6235 161.5141 177.8532 157.3776 133.9759 165.2369 156.9563 133.4014 144.5239 148.5532 121.4439 134.1981 165.3442 116.0665 121.5588 121.9112 115.4077 115.7984 115.0400 114.5958

180 175 170 165 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 Chemical Shift (ppm) 13 Figura 71. Expansão do espectro de RMN de C (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9 na região entre 115,0 a 180,0 ppm.

OH OH 3’’’ 2’’’ O 4’’’ 3’ OH OH 2’ 4’ 1’’’ 5’’’ 9 1’ 6’’ O OH 8 10 O 5’ 6’’’ OH 2 O 5’’ 4’’ 6’ OH 1’’ 7 4 OH 5 3 O 2’’ 3’’ 6 OH OH O 9

102

-0.5

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 ppm

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 72. Mapa de contornos COSY (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9.

2.0 6.0

2.5

6.5 3.0

3.5

7.0 4.0 ppm ppm

4.5

7.5

5.0

5.5 8.0

6.0

8.5 6.5

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm ppm

Figura 73. Expansões do mapa de contornos COSY (DMSO-d6, 400 MHz) da amostra 9.

103

-10

100 ppm

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

Figura 74. Mapa de contornos HMBC (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9.

OH 3’’’ OH 2’’’ O 4’’’ 3’ OH OH 2’ 4’ 1’’’ 5’’’ 9 1’ 6’’ O OH 8 10 O 5’ 6’’’ OH 2 O 5’’ 4’’ 6’ OH 1’’ 7 4 OH 5 3 O 2’’ 3’’ 6 OH OH O 9

104

90 ppm

100 C2’’’ -H2’’’ /H6’’’ 110

120

C3 -H1’’ 130

140

150 C9 -H8 160

170 C7 /C5 -H6

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 ppm

Figura 75. Expansão do mapa de contornos HMBC (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9.

105

OH -8 OH 0 O OH OH 8 O OH O OH 16 O OH 24 OH O OH 32 OH O 40 48

Açúcar 72 ppm 80 C8 88 96 C6 C1’’ 104 C2’ C2’’’ C5’ 112 C6’ 120 128 136 144

152

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm Figura 76. Mapa de contornos HSQC (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9.

88 40 90

45 92

50 96

55 100

102

60 104

106 ppm ppm

65 108

110

70 112

114

75 116

118

80 120

122 85 124

126 4.4 4.3 4.2 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 3.4 3.3 3.2 3.1 3.0 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 ppm ppm

Figura 77. Expansões do mapa de contornos HSQC (DMSO-d6, 100 MHz) da amostra 9.

106

5.9. Avaliação da atividade antioxidante

Os antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de lipídos ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reacções de oxidação em cadeia (MACHADO, et al., 2008). O potencial de redução do radical DPPH pelas amostras foram expressos em percentual de inibição da oxidação e estão representados na Figura 78. Nesta figura é possível verificar que todas as amostras testatadas apresentaram atividade antioxidante com exceção do 3-O-β-glicopiranosil-β-sitosterol (6) e a mistura composta por ácido 3-β- O–acetil–olean–12-en–28 óico (4) e ácido 3-b-acetil-12-ursen-28-óico (5) . É interessante ressaltar que todas as amostras que se mostraram antioxidantes possuiem anel aromático, se destacando as amostras isoquercetina (7) , 3-O-β-galactopiranosil quercetina (8) e quercetina 3-O-β-(6”-galoilglicopiranosídeo (9) . De modo geral, os polifenóis e em paticular os flavonoides possuem estrutura ideal para o sequestro de radicais livres, sendo antioxidantes mais efetivos que o padrão utilizado de ácido ascórbico (BARREIROS, et al., 2006). É também notável que a atividade se mostrou dependente da concentração para a maioria das amostras, com exceção da amostra 7 que se mostrou altamente antioxidante em todas as concentrações. De modo geral, todos os flavonoides obtiveram maior inibição na concentração de 1,6 mg/mL, apresentando taxas de 92,55; 89,16 e 88,02 % para 7, 8 e 9 respectivamente. Tal atividade pode ser justificada pela presença do sistema catecol no anel B diidroxilado em 3’ e 4’. Os flavonóides podem atuar como antioxidantes através de vários mecanismos, como quelação metais de transição, captação de radicais livres, exercerem efeitos sinergéticos com outros antioxidantes, entre outros (BEHLING, et al., 2004). A estabilidade do radical de flavonóide (flavanoil) formado depende da capacidade que o flavonóide tem para conseguir deslocar o radical livre. Em geral para que se tenha uma ótima atividade antioxidante é necessário que a extremidade 3-OH do anel C esteja livre, o que não é observado nos O-glicosídeos, o que reduz a capacidade da molécula de neutralizar radicais livres, entretanto os valores encontrados nos mostram que em altas concentrações esses compostos podem obter inibições maiores que 90% para alguns casos.

107

Figura 78. Avaliação da capacidade de redução do radical DPPH das misturas 2 e 3, 4 e 5, além das substãncias 6, 7 ,8, 9 e padrão de ác. Ascórbico.

Segundo relatos científicos alguns flavonóides são conhecidos pela sua ação antidiarréica que podem estar associadas à atividade antioxidante. Essa atividade dos flavonóides foi observada através de experimentos de diarréia crônica em ratos e na motilidade do trânsito intestinal de camundongos (GALVEZ et al., 1993; GALVEZ et al., 1996; RAO et al., 1997). Comprovando assim que os metabólitos presentes na Eugenia dysenterica DC, podem atuar no tratamento da desinteria, fato este que já vem sendo empregado pela medicina popular há tempos.

108

6. CONCLUSÕES

O estudo químico da Eugenia dysenterica DC. é relatado pela primeira vez, corfimando a presença de diferentes metabólitos encontrados em espécies da família Myrtaceae, ao exemplo de triterpenos e flavonóides. Foram isoladas 9 substâncias, obtidas das folhas e caule desta espécie, algumas das quais estão sendo relatada pela primeira vez no gênero e na família. O estudo das folhas da Eugenia dysenterica DC. a partir de fracionamento químico e separação em colunas cromatográficas levou ao isolamento de das substâncias 3- hidroxi-4-metoxibenzoato de metila (1) , éster 4-hidroxifenil propionato de metila (2), E-4- hidroxicinamato de metila (3) , 3-O-β-glicopiranosil-β-sitosterol (6) , todos estes obtidos da fração clorofórmio das folhas, além de 3-O-β-galactopiranosil quercetina ( 8), quercetina 3- O-β-(6”-galoilglicopiranosídeo) ( 9), obtidos a partir da fraçao acetato das folhas, sendo esta ultima com apenas um relato na literatura. Já o estudo da casca do caule levou a obtenção de metabólitos da classe dos triterpenos e flavonóides. Da fração hexânica do caule, foi identificado o ácido 3-β-O– acetil–olean–12-en–28 óico (4) e o ácido 3-β-acetil-12-ursen-28-óico (5), isolados em mistura devido a semelhança de suas estruturas. Na fração butanólica, foi obtida a isoquercetina (7) todas estas já conhecidas no gênero. Dentre os compostos testatos, os compostos flavonoídicos se mostraram altamente antioxidades, sendo que as sustâncias 7, 8 e 9 apresentaram valores de inibição superiores a 90 % para a concentração de 1,6 mg/mL.

109

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