Sviluppo Di Metodiche Basate Sulla Caratterizzazione Molecolare Per L’Identificazione Di Frodi Nel Comparto Ittico

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA

SCUOLA DI DOTTORATO IN SCIENZE AGRARIE E VETERINARIE SSD:VET04

PROGRAMMA DI DOTTORATO IN: PROBLEMATICHE ISPETTIVE E SANITARIE DELLE PRODUZIONI ANIMALI NEGLI SCAMBI TRA UNIONE EUROPEA E REPUBBLICA POPOLARE CINESE

Sviluppo di metodiche basate sulla caratterizzazione molecolare per l’identificazione di frodi nel comparto ittico

Dottorando: Dr.ssa Tinacci Lara

Relatore: Dr. Lorenzo Castigliego

Presidente del Programma di Dottorato : Prof.ssa Alessandra Guidi

RIASSUNTO

L’aumento dell’attività di pesca a livello mondiale e il depauperamento delle risorse nazionali in risposta all’incremento della domanda di mercato dei prodotti ittici hanno determinato il progressivo aumento delle importazioni, sia da Paesi Comunitari che da Paesi Terzi, in particolar modo dalla Cina. Nel settore ittico, la Cina produce, allo stato attuale, oltre il 38% del fatturato mondiale, grazie soprattutto alla promozione di strategie commerciali estremamente concorrenziali. Tali livelli produttivi non sono supportati, però, dalla messa in atto di procedure efficienti, ai fini di una corretta tracciabilità dei prodotti alimentari lungo la filiera produttiva, con notevoli ripercussioni a livello commerciale e sanitario. Inoltre, in risposta alla crescente domanda da parte del consumatore di alimenti pronti al consumo e di facile utilizzo, negli ultimi anni si è assistito ad un aumento della commercializzazione di prodotti ittici trasformati e precotti. Il riconoscimento di specie assume un’importanza fondamentale per la prevenzione di fenomeni di falsificazione e contraffazione a tutela e protezione del consumatore. Considerando che la tecnica di identificazione di specie su base morfologica, unica riconosciuta in Italia in sede legale, risulta inapplicabile in tali tipologie di prodotto, l’attenzione è stata rivolta all’individuazione di strumenti analitici alternativi.

Le metodiche analitiche basate sull’analisi del DNA finalizzate all’identificazione di specie sono quelle maggiormente utilizzate in virtù dell’elevato grado di resistenza dell’acido nucleico a trattamenti fisico-chimici e a fenomeni di degradazione, offrendo un valido strumento per il controllo della tracciabilità nelle diverse tipologie di prodotto (fresco, trasformato, conservato).

In quest’ottica, i progetti di studio sviluppati sono stati rivolti sia al miglioramento delle tecniche per l’estrazione del DNA in matrici fresche o conservate, in grado di garantire soddisfacenti caratteristiche quali-quantitative dell’acido nucleico ottenuto ed un minore impegno dell’operatore, sia allo sviluppo di strumenti analitici basati sull’utilizzo della PCR per la discriminazione di specie diretta o post sequenziamento del target selezionato. Sono state sviluppate con successo metodiche per la discriminazione diretta tra specie di provenienza cinese e specie mediterranee o atlantiche di maggior valore commerciale e realizzati studi di caratterizzazione di prodotti ittici reperibili in esercizi commerciali etnici e di mangimi per animali domestici, ai fini del controllo di conformità su quanto dichiarato in etichetta. Infine, le metodiche sviluppate sono state utilizzate per effettuare controlli su prodotti commerciali acquistati presso la piccola e grande distribuzione, evidenziando come il fenomeno di sostituzione di specie, volontaria o involontaria, rappresenti una problematica reale, la cui entità suggerisce la necessità di potenziare le attività di controllo da parte degli organi ufficiali e ulteriori studi. In questo contesto, un adeguato livello di tutela del consumatore non può prescindere dallo sviluppo di metodiche analitiche sempre più rapide e performanti.

PAROLE CHIAVE: prodotti ittici, tracciabilità, frode, DNA, PCR, RFLP, analisi BLAST , FINS

ABSTRACT

The global increase of fishing activities, together with the depletion of national marine resources, in response to the rising demand for seafood, led to a progressive growth in imports, both from European Union countries and Third countries, particularly from China. In the fishery sector, China produces, at present, over 38% of the world output, thanks to the promotion of very competitive commercial strategies. These production rates are not supported, however, by the implementation of efficient systems of traceability of food products along the supply chain, with significant repercussions on trade and health issues. In addition, in recent years the commercialization of processed and precooked fish products has increased, in response to the growing demand for ready to cook and ready to eat food products. Thus, species identification acquires fundamental importance in the prevention of phenomena of counterfeiting and adulteration for consumer protection. Considering that the morphological identification of seafood species, the only official method approved in Italy, is inapplicable in these types of products, alternative analytical tools are needed. DNA-based analytical methods are the most applied for species identification due to the high resistance of nucleic acid to physical-chemical treatments and degradation, representing a valuable tool for traceability in different types of products (fresh, processed, canned).

In this perspective, the research activities were aimed: I) to the improvement of DNA extraction techniques in fresh or processed matrices , in order to ensure satisfactory qualitative and quantitative characteristics of the obtained nucleic acid and simplify the laboratory workflow, II) to the development of analytical tools based on PCR for direct or post sequencing species discrimination using selected targets.

Methods for direct discrimination between Chinese fish species and Mediterranean or Atlantic species of higher commercial value have been successfully developed, as well as studies on the identification of fish products sold in ethnic shops and of pet food, with the aim of evaluating the label correctness. Finally, the developed methods have been used to carry out analysis on commercial products directly purchased in small and large retailers, highlighting that the phenomenon of species substitution, whether deliberate or accidental, represents a real problem, suggesting the need for the implementation of further Official control activities and research studies. In this context, the development of rapid and performing analytical tools is essential to ensure an adequate level of consumer protection.

Key words: seafood products, traceability, fraud, DNA, PCR based methods, RFLP, BLAST analysis, FINS

INDICE

PARTE GENERALE

CAPITOLO 1: I PRODOTTI DELLA PESCA

1.1 CONSUMO DEI PRODOTTI ITTICI 9

1.2 QUALITÀ DEI PRODOTTI DELLA PESCA 10

1.3 RISCHI ASSOCIATI AL CONSUMO DEI PRODOTTI ITTICI 11

1.3.1 Pericoli microbiologici di origine batterica e virale 11

1.3.2 Biotossine algali e sindromi associate 13

1.3.3 Agenti parassitari 15

1.3.4 Istamina e sindrome sgombroide 16

1.3.5 Pericoli abiotici 17

CAPITOLO 2: RISCHI SPECIFICI ASSOCIATI ALL’IMPORTAZIONE DEI PRODOTTI ITTICI DALLA CINA 18

CAPITOLO 3: SICUREZZA ALIMENTARE APPROCCIO INTERNAZIONALE E QUADRO NORMATIVO EUROPEO E CINESE

3.1 IL CONTESTO INTERNAZIONALE 23

3.1.1 OMS (WHO) Organizzazione Mondiale della Sanità

3.1.2 FAO (Organizzazione delle Nazioni Unite per l’alimentazione e l’agricoltura e CFS (Commissione sulla Sicurezza Alimentare Mondiale) 24

3.1.3 Codex Alimentarius 25

3.2 APPROCCIO EUROPEO ALLA SICUREZZA ALIMENTARE 26

3.3 ESCURSUS NORMATIVO RELATIVO AL CONTROLLO DEL SETTORE ALIMENTARE NELLA REPUBBLICA POPOLARE CINESE: 29

CAPITOLO 4: SISTEMI DI CONTROLLO ISPETTIVO E GESTIONE DELLE RISORSE ITTICHE

4.1 CONTROLLI UFFICIALI 32

4.1.1 Esami sulle caratteristiche organolettiche 33

4.1.2 Indicatori di freschezza 34

4.1.3 Criteri microbiologici e presenza di agenti parassitari 35

4.1.4 Prodotti della pesca velenosi 36

4.1.5 Biotossine algali e residui di metalli pesanti

4.2 SOSTENIBILITÀ DELLA PESCA E LOTTA ALLE PRATICHE DI PESCA ILLEGALE 36

CAPITOLO 5: FRODI NEL COMPARTO ITTICO

5.1 CONCETTO DI FRODE ALIMENTARE 39

5.2 FRODI NEL SETTORE ITTICO 43

CAPITOLO 6: RINTRACCIABILITÀ ED ETICHETTATURA

6.1 CONCETTO DI RINTRACCIABILITÀ’ 45

6.2 ETICHETTATURA DEGLI ALIMENTI 46

6.3 ETICHETTATURA DEI PRODOTTI ITTICI 48

6.3.1 Etichettatura dei prodotti trasformati 51

CAPITOLO 7: APPROCCIO ANALITICO ALL’IDENTIFICAZIONE DI SPECIE NEL SETTORE ITTICO

7.1 RICONOSCIMENTO MORFOLOGICO 52

7.2 ANALISI DEL PROFILO PROTEICO 53

7.3 APPROCCIO BASATO SULL’ANALISI DEL DNA 54

7.3.1 Selezione del target analitico: DNA mitocondriale, nucleare e ribosomiale 54

7.3.2 Isolamento del DNA 56

7.3.2.1 Metodiche convenzionali 57

7.3.2.2 Tecniche cormatografiche 59

7.3.2.3 Kit di ultima generazione: biglie magnetiche 60

7.3.3 Analisi quali-quantitativa del DNA estratto 60

7.3.4 PCR (Polymerase Chain Reaction) 62

7.3.4.1 PCR Real Time 63

7.3.5 Metodiche analitiche POST-PCR 66

7.3.5.1 FINS e Analisi filogenetica 66

7.3.5.2 DNA Barcoding 68

7.3.5.3 RFLP 69

CAPITOLO 8: OBIETTIVI DELL’ATTIVITA’ DI RICERCA 72

BIBLIOGRAFIA PARTE GENERALE 74

PARTE SPERIMENTALE

CAPITOLO 9: PRESENTAZIONE DEI PROGETTI RELATIVI ALL’ATTIVITÀ DI STUDIO 94

9.1 SVILUPPO DI UNA METODICA RAPIDA PER L’ESTRAZIONE DEL DNA DA TESSUTO MUSCOLARE DI PESCE MEDIANTE L’UTILIZZO DI BEADS METALLICHE 95

9.2 SVILUPPO DI METODICHE MOLECOLARI PER L’IDENTIFICAZIONE DELLE SETTE SPECIE APPARTENENTI AL GENERE LOPHIUS 98

9.2.1 Sviluppo di una metodica RFLP per la discriminazione diretta delle sette specie di Lophius 101

9.2.2 Sviluppo di due strumenti analitici alternativi in PCR multiplex end point ed analisi delle curve di melting in protocollo PCR Real Time per l’identificazione delle sette specie di Lophius 103

9.3 SVILUPPO DI METODICHE PER IL CONTROLLO DELL’ETICHETTATURA DI SPECIALITA’ CULINARIE TIPICHE DELLA TRADIZIONE ITALIANA E MANGIMI D’ELITE RIPORTANTI IN ETICHETTA PRODOTTI ITTICI SOTTOPOSTI A TUTELA 107 9.3.1 Individuazione di una metodica di PCR multiplex classica e Real Time per la discriminazione tra specie appartenenti alla famiglia Salangidae di importazione cinese correntemente utilizzate per la preparazione di piatti tipici della tradizione italiana e due specie nostrane sottoposte a tutela e restrizione di pesca 107

9.3.2 identificazione di specie in petfoods per gatti attraverso l’analisi BLAST e filogenetica (FINS) di un frammento del gene mitocondriale codificante per la subunità 16S dell’RNA ribosomiale ( 16S rRNA ) 112

9.4 CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI UN PRODOTTO TIPICO DELLA TRADIZIONE CULINARIA CINESE “MEDUSA IN SALAMOIA” ATTRAVERSO L’ANALISI FILOGENETICA SU UN FRAMMENTO DEL GENE MITOCONDRIALE CODIFICANTE PER LA CITOCROMO OSSIDASI I ( COI) 120

BIBLIOGRAFIA PARTE SPERIMENTALE 127

RINGRAZIAMENTI 142

APPENDICE 143

PARTE GENERALE

CAPITOLO 1: I PRODOTTI DELLA PESCA

1.1 CONSUMO DEI PRODOTTI ITTICI Dai dati riportati a livello mondiale, il consumo dei prodotti ittici in questi ultimi anni ha subito un aumento significativo al punto che, compatibilmente con le risorse naturali disponibili, ad oggi il settore della pesca e dell’acquacoltura costituisce uno dei mercati trainanti del contesto produttivo alimentare globale ed è destinato a crescere in modo continuo anche negli anni a venire, (Sidhu 2003; Keaney 2010). Tale dato è stato confermato anche dal rapporto FAO redatto nel 2014 sullo stato della pesca e dell’acquacoltura a livello internazionale, che ha attestato un raddoppio del consumo medio procapite di prodotti ittici, supportato dalla rapida espansione dei sistemi di acquacoltura (http://www.fao.org/documents/card/en/c/097d8007-49a4-4d65-88cd-fcaf6a969776/). I trend di crescita del settore possono essere individuati nei seguenti punti: - velocizzazione dei sistemi di distribuzione globale verso la piccola e grande distribuzione (Popkin, 2006; Swartz et al ., 2010); - introduzione di tecnologie di produzione e conservazione innovative con un miglioramento della qualità e freschezza dei prodotti ittici e un allungamento della shelf life (Reddy et al ., 1991; Taoukis et al., 1999; Koutsoumanis 2001); - crescente convinzione delle migliori proprietà nutritive dei prodotti ittici rispetto alle carni di mammifero (http://www.fao.org/docrep/015/i2534e/i2534e.pdf) - progressivo invecchiamento della popolazione e maggior consapevolezza delle funzioni terapeutiche e preventive di una corretta alimentazione contro l’insorgenza di ipertensione, cardiopatie ischemiche, obesità e diabete mellito non insulino- dipendente ed altre patologie a decorso cronico (Popkin, 2001); - cambiamento degli stili di vita, delle abitudini alimentari e aumento del tasso di sedentarietà, condizionamento dei consumi alimentari per esigenze salutistiche, promozione di prodotti su misura ( novel food ) e dietetici (light ).(http://www.fao.org/docrep/015/i2534e/i2534e.pdf ); - aumento del consumo dei pasti fuori casa, alla predilezione per cibi di rapida preparazione e con elevate quote di servizio. L’ultimo aspetto infine è rappresentato dalla crescita sullo scenario europeo di società multi- etniche che insieme al fenomeno della globalizzazione dei consumi ha contribuito alla

9 diffusione di tendenze alimentari alternative e all’aumento, soprattutto tra le nuove generazioni, del consumo di alimenti extra-nazionali ed extra-europei, quali “sushi” o altre specialità orientali a base di pesce (http://www.fao.org/docrep/015/i2534e/i2534e.pdf). In questo contesto, i prodotti ittici e, in particolar modo, il pesce, grazie all’elevato grado di digeribilità per la presenza di proteine di elevato valore biologico e alle proprietà terapeutiche e nutraceutiche derivanti dalla presenza acidi grassi essenziali insaturi (omega 3 e 6), minerali (calcio, ferro, selenio, zinco, ecc) e vitamine (A, B3, B6, B12 e d-tocoferolo), si candidano come alimenti ottimali per una dieta salutare e per la prevenzione di numerose patologie (Kris-Etherton et al., 2003; Mozaffarian & Rimm 2006).

1.2 QUALITA’ DEI PRODOTTI DELLA PESCA Partendo dalla definizione generale di qualità di un prodotto (UNI EN ISO 8402-95) ovvero “l’insieme delle caratteristiche che ne determinano la capacità di soddisfare le esigenze espresse e implicite dell’acquirente ”, gli aspetti fondamentali di qualità per un prodotto ittico risiedono nelle caratteristiche organolettiche, chimiche, nutrizionali e merceologiche, nelle potenzialità tecnologiche (attitudine alla lavorazione e trasformazione) e nella durabilità/deperibilità nel tempo ( shelf life ). La qualità e la durabilità dei prodotti ittici sono condizionate primariamente da un notevole grado di deperibilità chimica e microbiologica, che risiede in alcuni fattori endogeni relativi alla composizione naturale del tessuto: - elevato tenore in acqua che nei pesci può arrivare all'80-85%; - scarso contenuto in glicogeno muscolare, che determina un minor abbassamento del pH post mortem e offre un ottimo pabulum di crescita per microrganismi alteranti, i quali crescono bene intorno a valori di pH prossimi alla neutralità (pH 6.6-6.8), con conseguente decadimento della qualità del pesce; - prevalenza di acidi grassi insaturi maggiormente esposti a fenomeni di irrancidimento ossidativo ed enzimatico, quest’ultimo persistente anche a temperature di congelamento (-18°C); - elevato tenore in sostanze azotate non proteiche (TMAO, urea, ammoniaca); - attività degli enzimi endogeni: enzimi litici liberati dai lisosomi in seguito alla loro alterazione strutturale per mancanza di ATP (che fornisce l'energia necessaria al mantenimento dell'integrità strutturale).

Tutti questi fattori sono direttamente influenzati da caratteri intrinseci ed estrinseci di tipo ambientale e nutrizionale (habitat naturale o d’allevamento, qualità della acque), legati alla cattura (rispetto del benessere in fase di cattura, refrigerazione e controllo delle temperature, mantenimento della catena del freddo) e alla trasformazione fino all’ottenimento del prodotto finale (Poli & Scappini 2004). Condizioni di stress al momento della cattura e della macellazione producono un rapido depauperamento dell’ATP disponibile e del glicogeno muscolare, un abbassamento del pH muscolare, un precoce sviluppo e risoluzione del rigor in post-mortem e la conseguente perdita di compattezza del muscolo, dovuto a una drastica riduzione della capacità di ritenzione dell’acqua a danno della qualità finale e della conservabilità del prodotto (Poli et al. 2005). Al momento della filettatura, gli effetti di uno stordimento e macellazione scorretti si manifestano spesso con la comparsa di ematomi, soffusioni e petecchie emorragiche e fenomeni di gaping , vere e proprie fratture all’interno del muscolo, causate dalla separazione tra miotomi e miosetti, che rendono la superficie del filetto poco attraente agli occhi del consumatore e del trasformatore, comportando un declassamento del prodotto finale (Poli & Scappini 2004).

1.3 RISCHI ASSOCIATI AL CONSUMO DEI PRODOTTI ITTICI

1.3.1 Pericoli microbiologici di origine batterica e virale Tutti i prodotti ittici possono essere esposti a diverse forme di contaminazione di origine fisica, chimica e microbiologica. I rischi biotici associati al consumo di prodotti ittici sono molteplici e derivano principalmente dalla presenza di microrganismi patogeni, responsabili di infezioni e tossinfezioni alimentari, e virus ( Norovirus , Virus dell’epatite A, Calicivirus ) (Croci & Suffredini 2003), riscontrabili per lo più in molluschi bivalvi allevati in acque inquinate con feci di individui infetti (Fusco et al . 2013). Le fonti di contaminazione possono essere suddivise in primarie, derivanti dall’habitat naturale, e secondarie, le quali si verificano nelle fasi di cattura/raccolta a seguito di errate modalità di manipolazione, eviscerazione e dissanguamento del pesce e inadeguate condizioni igieniche delle strutture di lavorazione e stoccaggio dei prodotti. Per quanto riguarda invece le patologie ad eziologia batterica i microrganismi presenti nei prodotti della pesca e nei molluschi bivalvi possono essere classificati in autoctoni (Aeromonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Moraxella, Vibrio , Clostridium botulinum ) o

11 alloctoni, derivanti da una contaminazione fecale delle acque ( E.coli , Salmonella sp., Shigella, Campylobacter ) o da contaminazioni post mortem durante le fasi di lavorazione del pescato ( Lysteria monocitogenes , Staphilococcus aureus, Salmonella ) (Feldhusen 2000, Croci & Suffredini 2003). Lo stoccaggio a temperatura di refrigerazione favorisce la selezione di specie psicrofile Gram-negative aerobie, quali Pseudomonas , Alteromonas, Moraxella, Acinetobacter, Shewanella e per prodotti provenienti da ambienti tropicali o anche temperati nei mesi estivi Vibrio , Flavobacterium , Acinetobacter (Feldhusen, 2000). Ritardi nella refrigerazione dei prodotti o il controllo non adeguato delle temperature possono favorire inoltre la colonizzazione esponenziale ad opera di Bacillus e Aeromonas (Orefice, 1997). Batteri frequentemente coinvolti nell’induzione di patologie appartengono alla famiglia delle Vibrionaceae e sono responsabili di forme gastroenteriche più o meno gravi (Croci & Suffredini 2003). I fenomeni di contaminazione post mortem del tessuto muscolare sono favoriti da enzimi cellulari (catepsine e peptidasi) che attraverso reazioni litiche possono accelerare l’invasione batterica del muscolo sia ad opera della flora intestinale e cutanea naturalmente presente sia ad opera di microrganismi presenti nell’ambiente di lavorazione e stoccaggio (Croci & Suffredini 2003). Inoltre, le peculiari caratteristiche del tessuto muscolare dei pesci (pH relativamente elevati (> 6)); presenza di elevate concentrazioni di azoto non proteico) favoriscono la moltiplicazione batterica velocizzando i processi alterativi (Croci & Suffredini 2003; Tiecco, 2000). Organismi filtratori come i molluschi bivalvi possono agire da bioaccumulatori e vettori di alcuni virus patogeni per l’uomo a tropismo epatico ed enterico. Il rischio di infezione è legato primariamente all’abitudine di consumare tali prodotti crudi o leggermente marinati (Hewitt & Greening, 2004; Bozkurt et al., 2014). Il virus dell’epatite A (HAV) e il Norovirus costituiscono il pericolo più considerevole per i consumatori di molluschi, poiché questi animali possono concentrare la carica virale fino a 900 volte rispetto alla concentrazione ambientale (Cattaneo, 2010). HAV ( Hepatitis A virus ), un Enterovirus appartenente alla famiglia dei Picornaviridae, è responsabile di una forma entero-epatica a sintomatologia acuta e iperacuta. Il Norovirus , virus a RNA appartenente alla famiglia dei Caliciviridae, è il secondo agente eziologico correlato al consumo di molluschi bivalvi e pettinidi, responsabile di una gastroenterite acuta conosciuta come “winter vomiting bug”, accompagnata da diarrea, vomito e forti contrazioni addominali (Butt et al., 2004). Dal momento che il virus si

12 trasmette attraverso il consumo di alimenti o acqua inquinati da materiale fecale, i molluschi bivalvi allevati o pescati in acque ad elevato tasso di inquinamento possono rappresentare una fonte di pericolo (Terio et al., 2010), ma costituiscono anche un organismo sentinella per il monitoraggio della distribuzione virale di una determinata area geografica (Savini et al., 2009; Verhoef et al., 2010). Tra i virus a minor diffusione troviamo il virus dell’epatite E (HEV), unico esponente del genere Hepevirus famiglia Hepeviridae, il cui maggior vettore di diffusione è rappresentato ancora una volta dalla contaminazione fecale di fonti idriche (Crossan et al., 2012) ; virus della famiglia Rotaviridae e Astrovirus anch’essi responsabili di una sintomatologia gastroenterica più o meno acuta (Guyader et al., 2000).

1.3.2 Biotossine algali e sindromi associate Il rischio di intossicazione da biotossine algali è principalmente legato al consumo di molluschi bivalvi filtratori (in primo luogo mitili quali Mytilus edulis e Mytilus galloprovincialis ), che possono accumulare tali sostanze a seguito del proliferare nell’acqua di particolari alghe unicellulari tossiche (fitoplancton) (Isbister & Kiernan 2005, Watkins et al .,2008). Tale problema ha assunto dimensioni maggiori conseguentemente all’eutrofizzazione delle aree marine costiere e, dall’altro, alla progressiva diffusione di fitoplancton in nuove aree geografiche (Anderson et al., 2002). In funzione del tropismo delle diverse biotossine e della sintomatologia predominante, si riconoscono: una sindrome paralitica, Paralytic Shellfish Poisoning (PSP), una sindrome a decorso gastroenterico, Diarrethic Shellfish Poisoning (DSP), una sindrome di tipo amnesico Amnesic Shellfish Poisoning (ASP) e una sindrome neurotossica (NSP). Paralytic Shellfish Poisoning (PSP): la sindrome consegue alla presenza di saxitossina, una molecola idrosolubile prodotta da alcune alghe appartenenti al genere Alexandrium , le cui fioriture determinano i noti fenomeni delle maree rosse (“red tide ”) (Taylor, 1989). Il nome della tossina deriva dal nome del mollusco bivalve ( Saxidomus giganteus ) da cui la molecola è stata estratta e caratterizzata per la prima volta da Schantz nel 1984. L’azione tossica si esplica attraverso il blocco dei canali del sodio con conseguente blocco della trasmissione nervosa a livello delle terminazioni periferiche e delle placche neuromuscolari fino a indurre la paralisi respiratoria e morte (Poletti et al ., 2003). Amnesic Shellfish Poisoning (ASP): l’Acido Domoico, con i suoi isomeri (idrosolubili), è responsabile di questo tipo di avvelenamento. Le fioriture algali delle Diatomee del genere Nitzschia, che producono questa tossina, avvengono essenzialmente nelle acque costiere del

Nord Europa. La sintomatologia dell’intossicazione è indotta dall’azione eccitatoria dell’Acido Domoico a livello delle membrane cellulari e delle sinapsi neuronali, a seguito del legame con i recettori per il glutammato e l’apertura dei canali Ca 2+ (Jeffery et al ., 2004). L’attivazione persistente dei recettori Glu determina la comparsa di una sintomatologia tipicamente gastroenterica, con vomito e diarrea seguiti dalla comparsa di sintomi neurologici più o meno marcati: stato confusionale, disorientamento, perdita di memoria fino all’insorgenza, in casi particolarmente gravi, di perdita di coscienza e coma (Poletti et al., 2003; Lefebvre & Robertson 2010). Diarrethic Shellfish Poisoning (DSP): Le biotossine responsabili della sindrome DSP sono composti lipofili che si dividono in classi strutturali completamente diverse per effetti tossicologici, meccanismo d’azione e lesioni biochimiche: Acido okadaico (OA) e i suoi derivati che sono stati isolati da microalghe, molluschi bivalvi e crostacei in Asia, Europa, Nord Sud America e Oceania (Yasumoto & Murata, 1993; Torgensen et al., 2005; Mak et al., 2005; Suzuki et al., 2009 ); le Yessotossine (YTXs) e le Pectenotossine (PTXs), segnalate nel Mar Adriatico (Draisci et al .,1999; Pistocchi et al ., 2012) che sembra non svolgano azione tossica sull’uomo e azaspiracidi (AZA) presenti prevalentemente nelle aree costiere del Nord Europa (Irlanda, Norvegia, Inghilterra) (James et al , 2002). NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning ): la tossina responsabile è detta anche brevitossina, poiché prodotta dall’alga Dinoflagellata detta Ptycodiscus breve (già Gymnodinium); agisce bloccando la trasmissione neuromuscolare a livello di muscoli scheletrici. Diversi casi sono stati registrati in Florida, Golfo del Messico, paesi Caraibici, Spagna (Watkins et al ., 2008). La sintomatologia si manifesta con parestesie dell’estremità degli arti, nausea, vertigine, vomito e l’intossicazione può essere mortale (Watkins et al ., 2008). La Ciguatera , un’altra categoria di tossine algali, comprende un complesso di polieteri anch’essi prodotti da organismi dinoflagellati e isolati da organismi acquatici della zona tropicale e sub tropicale (Dickey and Lakas 2010). Il CFP ( Ciguatera Fish Poisoning ) è un grave problema soprattutto dal punto di vista economico, in quanto costituisce un grosso ostacolo alla libera commercializzazione del pesce a livello internazionale (Lehane & Lewis, 2000). Le ciguatossine sono composti liposolubili e termoresistenti, con una struttura ad anelli che richiama quella delle brevitossine. A livello cellulare determinano un aumento della permeabilità delle membrane cellulari agli ioni Na +, causandone la depolarizzazione con l’insorgenza di sintomi sia a livello neurologico, che gastrointestinale e cardiocircolatorio (Lewis, 2000). Tra gli effetti associati all’intossicazione sono stati segnalati: mialgia, debolezza muscolare, tremori, inversione sensitiva di caldo e freddo,

14 ipersalivazione, nausea, diarrea, vomito, dolori addominali ipotensione, bradicardia alternata a tachicardia fino alla comparsa di fenomeni aritmici (Lewis, 2001).

1.3.3 Agenti parassitari A livello mondiale le zoonosi parassitarie di origine ittica sono numerose, in particolar modo in Estremo Oriente ed in paesi in via di sviluppo, ma in misura minore anche nei paesi “occidentali”, compresa l’Europa. Tra gli agenti, sempre meno occasionali, all’origine di malattie legate al consumo di pesce, troviamo alcuni parassiti, nematodi, trematodi, protozoi responsabili di forme patologiche acute e croniche a morbilità variabile. Il consumo di pesce crudo o insufficientemente cotto determina l’insorgenza della malattia nell’uomo. Le diverse patologie sono causate dal consumo di alcuni prodotti della pesca, quali teleostei, cefalopodi, crostacei, molluschi gasteropodi e lamellibranchi con ruolo di vettore ospite intermedio o ospite definitivo. L’uomo, a sua volta, può entrare nel ciclo come ospite definitivo in patologie quali la Difillobotriasi/Plerocercosi, sostenuta dal cestode Diphyllobothrium latum , e la Opistorchiasi, indotta dal digeneo Opistorchis sp ., oppure come ospite accidentale in patologie quali la Clinostomiasi e l’Anisakiasi. L’Opistorchiasi da O. felineus in Italia è stata recentemente evidenziata in laghi del centro Italia ( Armagnacco et a l. 2008; De Liberato et al ., 2011, Pozio et al., 2013 ), con la segnalazione di oltre 100 casi clinici accertati dal 2004 ad oggi. Sul versante asiatico una parassitosi particolarmente diffusa è la Clonorchiasi. (Nawa et al., 2005). In Cina, è stato riscontrato che 15 milioni di persone sono infestate da Clonorchis sinensis , parassita che è trasmesso all’uomo attraverso il consumo di molte specie di pesci d’acqua dolce, tra cui la carpa ( Cyprinus carpio , Ctenopharyngodon idella, Hypophtalmichtys nobilis, H.molitrix) (Sripa et al., 2010; Lin et al., 2005; Lun et al., 2005). Infine l’anisakiasi/anisakidosi è sostenuta da parassiti appartenenti alla famiglia Anisakidae, del phylum Nematoda (Valinas et al .,2001) appartenenti ai generi Anisakis e Pseudoterranova . Entrambi i generi continuano a suscitare un notevole interesse ispettivo e di impatto per la salute pubblica, sia per la presenza costante di larve Anisakidae in alcuni dei teleostei più frequentemente pescati nei mari e negli oceani di tutto il mondo e durante tutto l’anno (Clupeidi, Engraulidi, Lophidi, Gadidi) (Takahashi et al., 1998; Mattiucci et al ., 2007; Mladineo et al ., 2012) sia per la crescente abitudine al consumo di prodotti ittici crudi, che espone il consumatore a un maggior rischio di contrarre la parassitosi (Audicana et al ., 2002; Puente et al ., 2008).

Il maggior rischio associato alla presenza di forme parassitarie è costituito dalla possibilità che dopo la pesca i parassiti possano migrare nelle carni del pesce a seguito di un’eviscerazione tardiva associata a una refrigerazione insufficiente, rimanendo vivi e vitali per tutto il tempo di conservazione del prodotto fino al consumo. Un secondo aspetto da valutare oltre al problema delle infezioni è legato all’aumento di fenomeni allergici riconducibili alla presenza di parassiti devitalizzati per consumo di prodotti ittici infestati; è ormai comprovato infatti l’effetto allergizzante di alcune porzioni della cuticola della larva ingerita con l’insorgenza di fenomeni di ipersensibilità (Moreno- Ancillo et al ., 1998; Valinas et al ., 2001; Audicana & Kennedy 2008). Per quanto riguarda invece il Phylum protozoa, tra gli agenti parassitari più strettamente associati al settore ittico troviamo i generi Giardia sp.,Cryptosporidium sp. e Toxoplasma sp., che rappresentano gli agenti zoonosici più diffusi. Le cisti di Giardia e Cryptosporidium , in modo particolare, sono molto resistenti in ambiente acquatico e possono persistere in molluschi bivalvi vivi anche dopo cicli di depurazione (Fayer et al., 2004). Come per le biotossine algali tali organismi costituiscono quindi un bioaccumulatore perfetto e un buon indicatore epidemiologico del grado di contaminazione dei siti di pesca e acquacoltura (Smith et al., 2006).

1.3.4 Istamina e sindrome sgombroide La sindrome sgombroide è frutto di un’intossicazione acuta causata dall’ingestione di prodotti con un elevato contenuto di istamina. Le specie ittiche maggiormente coinvolte appartengono alla famiglia Scombridae (sgombro, tonno, palamita) e all’ordine Clupeiformes (sardina, acciuga, alaccia, aringa) e presentano tutte un quantitativo elevato dell’amminoacido istidina in forma libera (Hungerford, 2010; Cattaneo, 2011). L’istamina, infatti, non presente nel pesce al momento della pesca, si forma per decarbossilazione dell’istidina ad opera di Enterobacteriaceae isolabili dall’ambiente marino e da altre specie batteriche (Clostridium sp ., Vibrio sp ., Morganella morganii , Klebsiella pmeumoniae ), mediante una reazione catalizzata dall’enzima istidindecarbossilasi. (Emborg et al., 2006; Visciano et al.,2012). Il tasso di conversione da istidina a istamina non è identico per tutte le specie batteriche e dipende, oltre che dalla tipologia della flora batterica, anche dalle condizioni di conservazione dei prodotti ittici (temperatura, umidità, pressione parziale di ossigeno) (Lehane & Olley 2000); la temperatura minima di formazione dell’istamina da parte dei batteri produttori è di circa 0 °C, mentre il range ottimale è compreso tra 0 °C e 10 °C (Cattaneo, 2011). La presenza di istamina in relazione alle quantità di prodotto consumato

16 e alla sensibilità individuale determina l’insorgenza di una forma di intossicazione che prende il nome di sindrome sgombroide. L’intossicazione è caratterizzata da una sintomatologia acuta simil-allergica conseguente alla degranulazione mastiocitaria con la comparsa di nausea, vomito, diarrea, prurito e arrossamenti; può essere seguita da sintomi di tipo nervoso centrale (vertigini, cefalea) e respiratorio (asma). Raramente si osservano disturbi più gravi come ipotensione arteriosa e shock. La comparsa della sintomatologia avviene a breve distanza dall’assunzione dell’alimento (20-30 minuti) e i disturbi si risolvono mediamente entro le 24 ore dall’esordio con la somministrazione eventuale di antinfiammatori e cortisonici nei soggetti maggiormente sensibili o a rischio (Attaran & Probst,, 2002; Schicherer & Sampson 2010 ). La formazione di istamina in quantità tossiche precede la perdita delle caratteristiche sensoriali di freschezza, per cui prodotti apparentemente commestibili possono contenere elevati livelli di istamina e, al contrario, la presenza di odori della decomposizione non sono utili indicatori della presenza di istamina (Cattaneo, 2011). La cottura, l’affumicatura e la conservazione tramite inscatolamento non eliminano la tossina prodotta. Secondo quanto stabilito dal Codex Alimentarius per i prodotti freshi sono fissate due soglie limite: la prima, a 100 mg/kg, che rappresenta l’indice di alterazione del prodotto; la seconda, a 200 mg/kg, che rappresenta il limite di salubrità del prodotto. Per i prodotti fermentati e per le salse a base di pesce i limiti sono fissati a 400mg/kg a norma del Reg UE 1019/2013 che modifica l’allegato I del Reg UE 2073/2005.

1.3.5 Pericoli abiotici Tra i pericoli abiotici assumono particolare importanza quelli associati alla presenza di sostanze chimiche di origine naturale o di sintesi diffusi accidentalmente o intenzionalmente nell’ambiente acquatico, quali metalli pesanti (Hg, Cr, Pb), pesticidi e policlorobifenili (PCBs), di cui organismi acquatici e pesci costituiscono ottimi bioaccumulatori e biomagnificatori attraverso la catena trofica (Van Der Oost et al .,2003). La pericolosità dei metalli pesanti è rappresentata dalla loro capacità di imitare l’azione di elementi essenziali, e quindi sostituirsi ad essi, interferendo con i processi metabolici del corpo umano (Lane, 2000). In assenza di appositi impianti di depurazione, l’entità della contaminazione può essere anche molto rilevante in corrispondenza di specifiche fonti d’emissione, legate ad attività estrattive o industriali, a smaltimento o incenerimento di rifiuti, a particolari pratiche agricole e zootecniche (es. utilizzo di fertilizzanti, antiparassitari e mangimi contenenti metalli) (Storelli, 2008). Fonti alternative di introduzione dei metalli

17 pesanti negli alimenti sono da ricercarsi nell’utilizzo di alcuni additivi e conservanti con funzioni tecnologiche specifiche contenenti ioni metallici. Un esempio è rappresentato dal solfato di alluminio (E520) utilizzato come agente agglomerante e rassodante (Yokel, 2012). L’aggiunta di conservanti in modo non controllato oltre a comportare il superamento dei limiti tollerabili stabiliti a livello europeo può comportare fenomeni di accumulo a livello organico con la comparsa di sintomatologie subcliniche a carattere cronico di tipo allergico (reazioni oriticarioidi e asma) e circolatorio (vasodilatazione, angioedema) (Parke & Lewis, 1992; Grattan et al ., 2001; Grattan et al ., 2002; Ritz et al ., 2012).

CAPITOLO 2 RISCHI SPECIFICI ASSOCIATI ALL’IMPORTAZIONE DEI PRODOTTI ITTICI DALLA CINA

La diminuzione delle risorse di pesca nelle acque europee continua a far registrare da alcuni anni un rapporto deficitario negli scambi dei prodotti ittici con l’estero, questo anche per effetto della globalizzazione, che vede il mondo asiatico e quello africano in una veste concorrenziale. Secondo i dati Eurostat, le catture totali europee si sono ridotte di circa 3 milioni di tonnellate di peso vivo in meno di quindici anni, passando dal valore di 8 milioni di tonnellate relativo al 1995 a quello di circa 5 milioni del 2008. Nello stesso intervallo di tempo, le importazioni dai Paesi terzi sono passate da poco meno di 4 milioni di tonnellate a circa 6 milioni (http://epp.eurostat.ec.europa.eu). Negli ultimi decenni e fino a fine anni ‘90, a seguito del rapido sviluppo economico della Cina, il settore del commercio d’esportazione ha subito un vertiginoso incremento grazie anche alla messa in atto di strategie commerciali (dumping ) mirate alla facilitazione delle esportazioni cinesi con l’immissione sui mercati europei di prodotti a prezzi molto più bassi dei costi reali di produzione (Van & Tong 2009; Santamaria, 2003). Nel solo quinquennio 2005-2010, il fatturato d’importazione di prodotti ittici dalla Cina è raddoppiato passando da 900 milioni di euro del 2005, agli oltre 1,5 miliardi del 2010 (http://epp.eurostat.ec.europa.eu). Secondo quanto riportato nell’ultimo rapporto FAO Fish 2030 , nel prossimo decennio la Cina raggiungerà il 37% della produzione ittica globale e una domanda pari al 38% del consumo ittico annuo a livello mondiale. Date le proiezioni di crescita, si appresta quindi a rimanere al vertice dei Paesi esportatori e consumatori dei prodotti ittici (Fish 2030: http://www.fao.org/docrep/019/i3640e/i3640e.pdf). I principali mercati europei importatori sono rappresentati dalla Germania, Spagna, Regno Unito, Olanda e Italia, in cui si osserva una netta differenziazione nel consumo delle diverse tipologie di prodotto. I Paesi Nord europei, infatti, sono maggiori importatori di filetti di pesce, mentre la richiesta di crostacei e molluschi è diretta per lo più al mercato centro-sud europeo. Infine, è interessante notare che l’aumento vertiginoso del fatturato d’esportazione è legato in larga misura proprio all’aumento della domanda d’importazione di molluschi (seppie, calamari e totani) dei Paesi del Sud Europa ed in particolare di Spagna e Italia (Blomeier e t al ., 2012).

Oltre il 90% delle attività di trasformazione è concentrato nelle cinque province che si affacciano sulle coste del Mar Giallo e del Mar Cinese Orientale: Shandong, Liaoning, Zhejiang, Fujian and Guangdong e in poche altre città principali. In particolare, le due province Shandong e Liaoning con 171 e 109 stabilimenti rispettivamente, distribuiti in gran parte intorno alle due città principali, Qin Dao e Dalian, costituiscono l’epicentro dell’industria di trasformazione ittica, raggiungendo da sole il 52% della capacità produttiva annuale media del settore (Blomeier et al ., 2012). A dispetto del vertiginoso sviluppo economico, la filiera agroalimentare appare però ancora molto frammentaria e la realtà produttiva, soprattutto nelle province dell’entroterra, assume un carattere prettamente familiare. Il sistema produttivo delle piccole e medie imprese è condotto in territori ad elevato tasso d’inquinamento, spesso in assenza dell’applicazione di corrette pratiche di lavorazione e l’esecuzione di adeguati piani di controllo. A questo si associa un sistema produttivo finalizzato alla massimizzazione della resa e la minimizzazione dei costi, supportato da un fiorente mercato illecito di farmaci, ormoni e prodotti chimici (Lancet, 2012) vietati nei paesi comunitari e condotto su territori ad elevato inquinamento ambientale, imputabile alla completa mancanza di sistemi di gestione dei reflui e dei residui industriali, agricoli e urbani (Guidi et al ., 2006; Sarmah et al., 2006 Chen 2007 ). Tale fenomeno, in assenza di sistemi di autocontrollo, corrette pratiche produttive e adeguati sistemi di controllo lungo tutta la filiera alimentare, porta all’immissione in commercio di prodotti di scarsa qualità igienica e ad alto rischio per la salute del consumatore, a causa della presenza di elevate concentrazioni di contaminanti biotici (batteri, virus, parassiti) (Zhou et al., 2008; Wang et al., 2008) ed abiotici (residui farmaci veterinari e ormoni, pesticidi, additivi non autorizzati, metalli pesanti, PCB) (Chan, 1999; Su et al., 2001; Holmstrom et al., 2003; Maoqi et al., 2002; Zheng et al., 2007; Liu et al., 2013), introdotti più o meno volontariamente nel processo produttivo (Lam et al., 2013). Ciò ha determinato negli anni un susseguirsi di allerte, restrizioni ed embarghi transitori all’importazione di prodotti alimentari di origine cinese (Decisione della Commissione 2002/994/CE; Decisione della Commissione 2005/573/CE; Guidi et al ., 2006). Analizzando le numerose problematiche del settore alimentare cinese, alla luce dei principi generali di igiene e sicurezza contenuti nel Codex Alimentarius e nella normativa Europea, è possibile evidenziare: - la mancanza di una definizione e quantificazione dei pericoli e delle fonti di rischio per la salubrità di un alimento; - l’assenza di una metodologia codificata per l’analisi del rischio;

- assenza di un sistema di coordinamento tra gli organismi centrali di controllo e gli uffici operativi distribuiti sul territorio; - l’assenza di programmi gestionali reali di monitoraggio, gestione del rischio e di trasparenza nei confronti della cittadinanza. Secondo i dati RASFF raccolti nel 2013 e 2014, ancora una volta la Cina è uno degli Stati che ha ricevuto il maggior numero di notifiche per irregolarità seguita dall’India. Le notifiche riportate riguardano principalmente (https://webgate.ec.europa.eu/rasff- window/portal/?event=SearchForm&cleanSearch=1): - prodotti ittici contenenti residui di farmaci veterinari banditi dall’Unione Europea (nitrofurani e cloramfenicolo), con l’emanazione del Reg CE n.1442/95, per la comprovata tossicità acuta sulle cellule ematiche e l’attività cancerogena; - l’utilizzo indiscriminato di auxinici (verde malachite) e promotori della crescita per ridurre i tempi di accrescimento e finissaggio di numerose specie animali; - l’utilizzo di additivi coloranti ad elevato potere cancerogeno (Sudan Red) per il miglioramento dell’appetibilità commerciale di crostacei; - il rilevamento di livelli inaccettabili di metalli pesanti (principalmente cromo, nichel, cadmio e piombo) in prodotti ittici pescati e allevati in corsi e bacini ad elevato tasso di inquinamento ambientale; - mislabeling di prodotto e non conformità di etichettatura con sostituzione di specie; - la presenza di micotossine oltre il limite massimo accettabile in frutta secca e spezie e OGM non autorizzati e prodotti destinati a venire a contatto; - l’utilizzo di additivi e sostanze chimiche più o meno autorizzate in grado di alterare la composizione analitica apparente di un alimento (Hau et al., 2009; Bhalla et al., 2009). Un ultimo aspetto da tenere in considerazione riguarda l’utilizzo di antibiotici in acquacoltura e il ritrovamento di residui di farmaci per uso veterinario e umano in concentrazioni superiori ai limiti massimi consentiti e l’impiego di molecole sottoposte a divieto, quali cloranfenicolo e nitrofurani (Reg (CE) n.1442/1995) utilizzati sugli animali in allevamento a scopo terapeutico e auxinico, che hanno portato negli ultimi anni all’emanazione di numerose allerte e divieti e restrizioni all’importazione di gamberi e prodotti ittici provenienti dalla Cina (Decisione 2002/69/CE e successive modifiche 2002/994/CE, 2003/72/CE, 2004/621/CE, 2005/573/CE, 2008/463/CE). La Cina a tutt’oggi detiene il primato nella produzione e consumo annuali di antibiotici impiegati prevalentemente a scopo zootecnico (Zhu et al., 2013). Numerosi studi condotti su

21 microrganismi isolati da prodotti di acquacoltura, latte a animali in produzione zootecnica hanno mostrato un tasso molto elevato di antibiotico resistenza ai più comuni antimicrobici con fenomeni di cross-trasmissione e multi-resistenza verosimilmente correlabili a un utilizzo non controllato dei diversi principi attivi, per lo più a scopo auxinico e preventivo (Song et al., 2008; Yan et al ., 2010; Yang et al., 2011). Dal 2006 al 2011 gli Stati Membri dell’UE e la Commissione Europea hanno prodotto notifiche per oltre 335 allerte relative a prodotti ittici di origine cinese a causa di non conformità con gli standard di sicurezza europei in relazione alla presenza di sostanze chimiche illegali conservanti e additivi ampiamente utilizzati, sia sui prodotti d’acquacoltura che in fase di lavorazione e trasformazione di pesci, molluschi e crostacei di cattura (Blomeyer et al., 2012). A tutt’oggi, nonostante la riapertura totale all’importazione di prodotti ittici di origine cinese, per i prodotti d’acquacoltura e crostacei è richiesto un certificato d’analisi che attesti l’assenza di cloramfenicolo e nitrofurani sulla partita in oggetto.

CAPITOLO 3: SICUREZZA ALIMENTARE, APPROCCIO INTERNAZIONALE E QUADRO NORMATIVO EUROPEO E CINESE

3.1 IL CONTESTO INTERNAZIONALE In un’ottica di Globalizzazione dei Mercati la sicurezza alimentare si qualifica come una materia multidimensionale ed extra-territoriale, la cui regolazione non può più essere affidata esclusivamente ad amministrazioni nazionali e non può far riferimento alle sole norme di diritto interno ai singoli Stati. Si delinea la necessità di stabilire un sistema di controllo alimentare nazionale ed internazionale efficace, attraverso la creazione di un sistema normativo obbligatorio con strategie preventive ed educative, a garanzia della sicurezza alimentare (Bevilacqua, 2012). Anche la FAO, in una nota, precisa che la predisposizione di piani di controllo efficaci e condivisi a livello mondiale sono quanto mai necessari soprattutto in un ottica di globalizzazione dei mercati e devono essere coordinati da organismi che operano a livello internazionale (FAO & WHO., 2003).

3.1.1 OMS (WHO) Organizzazione Mondiale della Sanità Le attività dell’OMS in materia di sicurezza alimentare, dieta e nutrizione sono svolte da due dipartimenti distinti: Nutrizione e salute e Sicurezza alimentare e zoonosi. Attraverso linee guida e piani di sviluppo mirati, il Dipartimento per la Nutrizione e salute, deputato ad aumentare le conoscenze riguardo la malnutrizione, promuove politiche internazionali per migliorare la sicurezza alimentare, coordina le attività di sorveglianza sulla crescita e lo sviluppo, dall’infanzia all’età adolescenziale, promuove attività per la prevenzione di patologie associate all’alimentazione e il miglioramento della qualità di vita in tutte le fasce d’età. Gli obiettivi principali promossi dal dipartimento includono: la nutrizione materna e dei bambini, il controllo della malnutrizione e dell’obesità, la tutela delle persone anziane, la formulazione di raccomandazioni alimentari e la sicurezza alimentare. Il dipartimento, infine, coordina le attività di supporto tecnico in stato di crisi (guerra e calamità naturali), con l’obiettivo di prevenire la denutrizione e aumentare la sicurezza alimentare anche in stato di emergenza. Il dipartimento per la sicurezza alimentare e le zoonosi è deputato invece allo sviluppo di politiche per la protezione della salute del consumatore, per la prevenzione, il monitoraggio e il contenimento dei pericoli e dei fattori di rischio associati all’alimentazione, per il

23 coordinamento internazionale delle emergenze alimentari e per il supporto tecnico nella prevenzione e gestione di zoonosi e intossicazioni associate agli alimenti. Il flusso informativo internazionale in tema di sicurezza alimentare è gestito attraverso l’INFOSAN (International Food Safety Authorities Network ), un organismo informale di cooperazione composto da 177 autorità nazionali del settore della sicurezza alimentare, coordinate dall’OMS, che ha lo scopo di promuovere a livello internazionale lo scambio di informazioni concernenti emergenze alimentari in tempo reale, progetti di collaborazione tra i Paesi Membri per prevenire l’occorrenza di pericoli associati alle produzioni alimentari e rafforzarne la capacità di fronteggiare potenziali rischi associati (Bevilacqua, 2012). Tra le attività ordinarie, il Segretariato INFOSAN provvede alla diffusione di Note informative su tematiche di sicurezza alimentare nelle sei lingue ufficiali OMS (Inglese, Francese, Spagnolo, Russo, Cinese, Arabo). (http://www.who.int/foodsafety/fs_management/infosan/en/).

3.1.2 FAO (Organizzazione delle Nazioni Unite per l’alimentazione e l’agricoltura) e CFS (Commissione sulla Sicurezza Alimentare Mondiale ) La FAO nasce nel 1945 come agenzia specializzata delle Nazioni Unite e allo stato attuale rappresenta la maggiore organizzazione intergovernativa operante nel settore dell’agricoltura, della pesca e forestale. La Conferenza della FAO, che riunisce tutti i membri dell'Organizzazione (187 effettivi) è coadiuvata da comitati sussidiari amministrativi e giuridici (Comitato finanziario, Comitato del programma, Comitato sulle questioni costituzionali e giuridiche) e Comitati tecnici (per l’agricoltura, la pesca, le foreste, e la sicurezza alimentare mondiale). I comitati sono chiamati periodicamente per revisionare in maniera sostanziale la struttura, i programmi, il rendimento, la gestione e le operazioni dell'Organizzazione. I risultati di tali analisi vengono in seguito trasmessi al Consiglio della FAO, che si riunisce con cadenza annuale, e quindi presentati alla Conferenza biennale con l’obiettivo di promuovere il benessere globale, migliorare lo situazione e l’accessibilità delle risorse alimentari, contribuendo così alla crescita dell’economia Mondiale (Capelli et al., 2006). Allo scopo di potenziare canali di comunicazione attraverso la creazione di un organismo specifico, nel 1974 prendono avvio i lavori della Commissione sulla Sicurezza Alimentare Mondiale (CFS), una vera e propria piattaforma intergovernativa per il confronto aperto tra i paesi delle Nazioni Unite, per la revisione e il follow-up delle politiche in materia di sicurezza alimentare mondiale, tra cui la produzione e l'accesso fisico ed economico al cibo.

A partire dal 2009, l’accesso alla piattaforma è stato ampliato anche ad organizzazioni non governative, organizzazioni della società civile, altri organismi ONU, istituzioni finanziarie, cooperative private e rappresentanti di enti filantropici, trasformando la piattaforma iniziale in un punto di riferimento centrale della governance mondiale per quanto riguarda il settore agricolo e la sicurezza alimentare. La CFS, seppur strettamente legata alla FAO, è dotata di un ufficio di presidenza autonomo, un gruppo consultivo composto da rappresentanti delle 5 diverse categorie di partecipanti CFS (Agenzie delle nazioni Unite e altri organismi delle Nazioni Unite; Organizzazioni civili e associazioni di categoria, istituti di ricerca in campo agroalimentare; istituzioni finanziarie tra cui la Banca Mondiale, il Fondo Monetario Internazionale e l'Organizzazione mondiale del commercio (OMC); fondazioni filantropiche) e un Panel tecnico scientifico, l’HLPE (High Level Panel of Experts on Food Security and Nutrition), che riveste un ruolo assimilabile a quello dell’Autorità per la Sicurezza Alimentare (EFSA) all’interno della UE.

3.1.3 Codex Alimentarius Con lo scopo di giungere all’elaborazione di linee guida internazionali e definire Standard di sicurezza alimentare per l’armonizzazione dei flussi commerciali dei prodotti alimentari a livello globale, nel 1963, in seguito a numerose conferenze internazionali congiunte FAO/OMS, si è giunti alla costituzione della Commissione del Codex Alimentarius (CAC), un organo giuridicamente autonomo con sede a Roma e Ginevra (Bevilacqua, 2012). La Commissione ha origine quindi da un programma comune tra due delle maggiori organizzazioni intergovernative coinvolte nel settore alimentare e costituisce il principale forum d’incontro internazionale in materia di sicurezza e commercio dei prodotti alimentari (Capelli et al. , 2006). L’attività principale demandata alla CAC risiede nella definizione di standard e linee guida per assicurare la massima protezione della salute dei consumatori, garantendo al contempo politiche commerciali eque e leali nel rispetto del principio di libera circolazione delle merci (Bevilacqua, 2012). Le procedure standard e i manuali operativi elaborati nei 35 anni di attività della CAC attraverso i comitati Scientifici dei Paesi Membri sono raccolti nel Codex Alimentarius , un testo unico in continua evoluzione contenente linee guida per l’analisi di processi produttivi, per la tracciabilità dei prodotti, l’etichettatura, l’igiene delle strutture e i piani di controllo e certificazione per l’importazione ed esportazione delle merci, nonché per l’effettuazione di campionamenti e controlli analitici standard (Capelli et al ., 2006).

3.2 APPROCCIO EUROPEO ALLA SICUREZZA ALIMENTARE Alcune gravi crisi alimentari che si sono verificate in Europa negli anni ‘90 e culminate con l’emergenza BSE hanno indotto la Commissione Europea ad avviare una profonda revisione della normativa sulla sicurezza alimentare attraverso l’individuazione di principi generali e procedure condivise a livello comunitario sono state riassunte in due documenti fondamentali: - il “Libro verde”, pubblicato nel 1997, che definisce i principi generali della legislazione alimentare e introduce il concetto di analisi del rischio come “una procedura sistematica composta da tre aspetti distinti e interconnessi: valutazione, gestione e comunicazione”; - il “Libro Bianco” sulla sicurezza alimentare, pubblicato nel 2000, nel quale sono riassunti i principali impegni posti dalla Commissione Europea per la modernizzazione e l’elevazione degli standard della legislazione comunitaria in materia di sicurezza alimentare (Signorini et al ., 2001). Con la promulgazione del Libro Bianco sono stati posti in primo piano alcuni punti imprescindibili tra cui: la revisione completa del quadro giuridico normativo finalizzato ad un controllo globale e integrato (“ from farm to fork ”) degli aspetti connessi con i prodotti alimentari dalla produzione al consumo; l’esigenza dell’individuazione di un sistema di rintracciabilità lungo tutta la filiera produttiva; la centralità dell’analisi del rischio come strumento di prevenzione e controllo dei pericoli connessi alla produzione e consumo degli alimenti; la possibilità di ricorrere al principio di precauzione nelle decisioni di gestione del rischio; la creazione di un sistema di controllo armonizzato; l’obbligo di trasparenza nei confronti del consumatore e tra le parti interessate; la necessità della creazione di un’Autorità alimentare incaricata di elaborare pareri scientifici indipendenti su tutti gli aspetti inerenti la sicurezza alimentare, la gestione di sistemi di allarme rapido e la comunicazione dei rischi. Come applicazione del Libro Bianco, il Reg.(CE) n. 178/2002 del Parlamento Europeo e del Consiglio costituisce il primo caposaldo della sicurezza alimentare, stabilendo i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, attraverso la completa integrazione della filiera alimentare, la definizione delle responsabilità degli operatori del settore alimentare, l’obbligo di rintracciabilità e dell’analisi del rischio e l’obbligo di trasparenza nei confronti del consumatore o utilizzatore finale dei prodotti alimentari. Al fine di garantire il regolare funzionamento del mercato Unico Europeo e il monitoraggio sui flussi internazionali, si sanciscono l’istituzione dell’Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA), quale

26 punto di riferimento scientifico nell’analisi del rischio, nell’emanazione di pareri scientifici e nella promozione di attività di ricerca in materia di sicurezza alimentare e la creazione di un sistema coordinato d’allarme rapido per alimenti e mangimi (RASFF Rapid Alert System for Food and Feed ), come strumento informativo coordinato unico tra Commissione Europea, Stati Membri e EFSA, per la gestione e la comunicazione del rischio in corso di allerte ed emergenze alimentari. La partecipazione al RASFF, ai sensi dell'Art. 50, par. 6, può essere aperta ai paesi candidati ad entrare nella UE, a paesi terzi e ad organizzazioni internazionali sulla base di appositi accordi da stipulare con la UE nel rispetto del principio di reciprocità. Attualmente vi hanno aderito tre dei quattro Stati aderenti all’EFTA ( European Free Trade Association ) che fanno parte della European Economic Area (EEA): Norvegia, Islanda e Liechtenstein. Secondo quanto riportato dal Reg (CE) n. 16/2011, le informazioni trasmesse in forma di notifica sono ascrivibili a quattro tipologie distinte: - “notifiche di allerta” ( alert notifications ), inviate ad opera di uno Stato membro che rinvenga sul mercato interno un prodotto altamente pericoloso o che richieda la messa in atto di procedure urgenti di ritiro e richiamo. L’obiettivo della notifica è di dare a tutti i membri del RASFF l’informazione per verificare se il prodotto in questione sia sui loro mercati, affinché possano prendere le misure necessarie; - “notifiche informative” ( information notifications ), emesse nel caso in cui il pericolo associato a un alimento o un mangime sul mercato non richieda un’azione rapida dagli altri Stati membri, in quanto il prodotto in oggetto non è uscito dallo Stato notificante o perché la natura del rischio semplicemente non richiede tale azione. - “notifiche di respingimento alle frontiere” ( border rejections notification s): sono emesse a seguito di un respingimento di un alimento o mangime a causa del riscontro di un rischio per la salute umana e animale. L’avviso è diramato a tutti i posti di frontiera dell’EEA, al fine di intensificare i controlli e di impedire che i prodotti rientrino abusivamente attraverso altri punti. 4) news , informazioni correlate alla sicurezza di alimenti e mangimi che non costituiscono motivo di allerta, ma sono comunque ritenute d’interesse per le autorità di controllo nazionali. Con lo scopo di tradurre in legge gli obiettivi individuati all’interno del Libro Bianco secondo quanto già riportato nel regolamento quadro del 2002, la Commissione Europea ha avviato un complesso lavoro di aggiornamento normativo culminato con la pubblicazione del cosiddetto

“Pacchetto Igiene” costituito nel complesso da: - Reg. (CE) 852/2004 del 29.04.2004, sull’igiene del prodotti alimentari; - Reg. (CE) 853/2004 del 29.04.2004, norme specifiche in materia di igiene per gli alimenti di origine animale; - Reg. (CE) 854/2004 del 29.04.2004, norme specifiche per l’organizzazione dei controlli ufficiali sui prodotti di origine animale destinati al consumo umano; - Reg. (CE) 882/2004 del 29.04.2004, controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali; - Reg. (CE) n. 183/2005 del 12.01.2005, requisiti per l’igiene dei mangimi; - Reg. (CE) n. 2073/2005 del 15.11.2005, criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari; - Reg. (CE) n. 2074/2005 del 05.12.2005, modalità di attuazione relative a taluni prodotti di cui al Reg. 853/2004 e all’organizzazione dei controlli ufficiali a norma dei Reg.(CE) N. 854/2004 e 882/2004, deroga al Reg. 852/2004 e modifica dei Reg. (CE) n. 853/2004 e 854/2004; - Reg. (CE) n. 2075/2005 del 05.12.2005, norme specifiche applicabili ai controlli ufficiali relativi alla presenza di Trichine nelle carni; - Reg. (CE) N.2076/2005 del 05.12.2005, disposizioni transitorie per l’attuazione dei Reg. (CE) n. 853/2004, 854/2004 e 882/2004 e modifica dei Reg. 853/2004 e 854/2004; - Direttiva 2004/41/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, del 21.04.2004, che abroga alcune direttive recanti norme sull’igiene dei prodotti alimentari e le disposizioni sanitarie per la produzione e la commercializzazione di determinati prodotti di origine animale destinati al consumo umano e che modifica le direttive 89/662/CEE e 92/118/CEE e la decisione 95/408/CE del Consiglio. Con l’emanazione del nuovo impianto normativo si assiste ad un netto spostamento delle responsabilità della filiera produttiva sull’Operatore del Settore Alimentare (OSA), che diviene garante della salubrità degli alimenti e all’estensione del regime di autocontrollo anche alla produzione primaria. In questo nuovo scenario normativo i controlli ufficiali ad opera delle Autorità competenti svolti attraverso la valutazione delle attività produttive e la categorizzazione del rischio associato assumono un ruolo di supervisione di “parte terza” a tutela della salute pubblica e degli interessi del consumatore.

Per l’importazione di prodotti animali e materie prime da Paesi Terzi, ai sensi del Reg (CE) n.853/2004, si rende obbligatoria la stesura di elenchi dei Paesi autorizzati all’esportazione verso l’UE. L'autorizzazione per l’esportazione di una o più categorie merceologiche è rilasciata e rinnovata periodicamente a seguito di una visita ispettiva preliminare da parte dell’ufficio alimentare e veterinario della Commissione Europea (FVO- Food and Veterinary Office ). La visita ispettiva FVO ha lo scopo di verificare aspetti relativi alla salute animale e alla diffusione di malattie trasmissibili, aspetti relativi allo standard di sicurezza alimentare negli stabilimenti di produzione e trasformazione, il quadro legislativo in materia di sicurezza alimentare e l’organizzazione del sistema di controllo del Paese esportatore; l’applicazione di piani di sorveglianza su residui e contaminanti biotici e abiotici conformi alle normative UE, l’applicazione di controlli specifici per TSE e BSE (Reg. (CE) n. 999/2001) e la categorizzazione del rischio associato (trascurabile, controllato, indeterminato), in accordo con la Decisione della Commissione 2007/453/CE; la presenza di un sistema di allerta analogo al RASFF per la notifica e la risoluzione di emergenze sanitarie. All’autorizzazione segue la redazione e la comunicazione da parte del Paese Terzo dell’elenco degli stabilimenti presenti sul territorio ai fini del riconoscimento da parte della Commissione Europea (Tasselli, 2010). Ciascun Paese Terzo interessato ad esportare verso il territorio comunitario, infine, oltre ad ottenere il riconoscimento comunitario sulla base delle garanzie generali esistenti nei settori di sanità pubblica e sanità animale, è tenuto a produrre garanzie specifiche su ciascun prodotto da esportare attraverso un certificato sanitario sottoscritto dalle competenti autorità del Paese Terzo che seguirà il prodotto fino al destinatario finale.

3.3 ESCURSUS NORMATIVO RELATIVO AL CONTROLLO DEL SETTORE ALIMENTARE NELLA REPUBBLICA POPOLARE CINESE

Analogamente a quanto accaduto nei primi anni del 2000 in Europa a seguito dell’emergenza BSE, lo scandalo melammina occorso tra 2008-2009 ha portato il governo cinese ad un’accelerazione della riforma normativa del settore alimentare. Il processo è culminato nel 2009 con la promulgazione della “Food Safety Law ” (FSL), in vigore dal 1° giugno dello stesso anno. Il primo obiettivo del nuovo pacchetto normativo è stato quello di offrire una nuova immagine del Governo cinese cercando di superare la frammentazione delle responsabilità pubbliche coinvolte nel controllo ed adeguare l’organizzazione interna agli

29 standard internazionali dettati dall’OMS (Jia and Jukes, 2013). I tratti salienti del processo sono costituiti da: una rivalutazione complessiva della filiera agroalimentare, l’istituzione del Consiglio di Stato sulla Sicurezza Alimentare, la creazione di un ente unico di Accreditamento e Certificazione per il rilascio delle autorizzazioni alla produzione nel rispetto del modello HACCP, l’individuazione delle competenze dei Ministeri e degli organismi supervisori della filiera agroalimentare nei diversi settori, l’istituzione di una nuova autorità a livello statale, la Commissione Nazionale per la Sicurezza Alimentare, con sede a Pechino, con il compito di coordinare e supervisionare le diverse autorità incaricate, ciascuna per gli aspetti di propria competenza, della vigilanza e del controllo sui prodotti alimentari. Con la ridefinizione delle competenze, la produzione primaria e la gestione della qualità dei processi ricadono rispettivamente sotto la responsabilità del Ministero dell’Agricoltura (Agriculture Department ) e dell’Autorità di Stato per i controlli di qualità, alle ispezioni e alla quarantena (AQSIQ), mentre il controllo dei flussi di distribuzione alimentare e la vigilanza in fase di somministrazione sono affidati agli uffici dell’Amministrazione di Stato per l'Industria e il Commercio (SAIC) e al Ministero della Salute (MOH). Parallelamente a questi enti troviamo infine l’ufficio della Food and Drug Administration di Stato, che riveste il ruolo di supervisore su tutto il mercato alimentare. La seconda innovazione risiede in un ulteriore avvicinamento dell’ordinamento cinese agli standard internazionali in tema di sicurezza alimentare attraverso l’applicazione di piani di controllo e analisi del rischio (Liu et al .,2013). Seguendo le linee guida fornite dal Codex Alimentarius internazionale, l’attenzione del nuovo assetto normativo è volta formalmente all’istaurazione di un sistema completo di tracciabilità, dalla produzione e trasformazione alla distribuzione, con l’obiettivo di portare un completo risanamento dell’intera filiera agroalimentare con un approccio integrato dai “campi alla tavola”, al fine anche di rilanciare una nuova immagine delle produzioni. A tale scopo, le nuove disposizioni riportano un accentramento delle attività di controllo e l’abbandono del sistema delle trusted companies , società a larga partecipazione statale precedentemente esentate dal controllo delle autorità alimentari ispettive. Per quanto riguarda i flussi import-export , sono fissati i termini e le modalità di riconoscimento e certificazione per tutte le tipologie d’impresa coinvolte nel settore alimentare, le modalità ispettive, i certificati e i marchi obbligatori per il licenziamento al libero consumo e le procedure di import-export per le materie prime e i prodotti lavorati.

Per la gestione dell’analisi del rischio a partire dal 2009 è stato istituito un comitato con funzioni analoghe a quelle dell’EFSA, il National Expert Committee for Food Safety Risk Assessment . Il panel scientifico originariamente costituito da 42 esperti provenienti da diversi settori disciplinari, oltre a gestire la pianificazione dell’analisi del rischio nel settore alimentare deteneva la conduzione di tutte le fasi di comunicazione del rischio in corso di emergenze sanitarie e partecipava attivamente allo sviluppo di metodiche ufficiali su interrogazioni specifiche del MOH. A partire dal 2011, il comitato è stato assorbito da un nuovo ufficio il National Center for Food Safety Risk Assessment (NCFSRA), suddiviso in 4 dipartimenti autonomi: amministrativo, tecnico, dipartimento per il risk-assessment a il segretariato nazionale per la creazione di Standard per la sicurezza alimentare ( National Review Committee for Food Safety Standard ) (http://www.chinafoodsafety.net/index.jsp). Il nuovo NCFSRA, ancora in fase di sviluppo, avrà il ruolo di coordinamento nei seguenti campi applicativi (Liu et al ., 2013): - Analisi e gestione del rischio; - Comunicazione del Rischio; - Ruolo consultivo e di ricerca attiva; - Supporto tecnico nelle emergenze sanitarie in cooperazione con il centro per il controllo e Prevenzione delle Malattie ( Chinese Center of Disease Control and Prevention ).

CAPITOLO 4 : SISTEMI DI CONTROLLO ISPETTIVO E GESTIONE DELLE RISORSE ITTICHE

4.1 CONTROLLI UFFICIALI In conformità con quanto stabilito dalla nuova normativa comunitaria, anche nel settore ittico l’OSA è il primo responsabile dell’idoneità al consumo dei prodotti, la cui commercializzazione non è più vincolata alla visita veterinaria, e di tutte le informazioni relative alla tracciabilità ed etichettatura del prodotto finale. Le Autorità di Controllo, in questo contesto, sono però tenute a coordinare un’attività di vigilanza programmata basata sulla valutazione del rischio, assicurando una corretta gestione della qualità igienico- sanitaria e commerciale lungo tutta la filiera ittica. Tutte le attività produttive inerenti la pesca e l’acquacoltura, dalla raccolta fino all’immissione sul mercato e alla vendita, sono ascrivibili alla produzione primaria e post- primaria. Alla produzione primaria appartengono tutte le attività connesse ad allevamento, pesca, raccolta di prodotti vivi della pesca e tutte le operazioni connesse svolte a bordo delle navi da pesca, compresa la procedura di incassettamento, intesa come “collocamento di un prodotto alimentare in un involucro a diretto contatto con il prodotto alimentare” (Reg CE n. 852/2004). La produzione post primaria comprende invece tutte le fasi successive allo sbarco del prodotto (trasporto, vendita all’asta, preparazione, trasformazione confezionamento e commercio all’ingrosso o al dettaglio). I controlli ufficiali nella filiera della pesca abbracciano aspetti relativi sia ai requisiti strutturali e gestionali delle aziende di settore (registrazione/riconoscimento, dotazioni strutturali e gestione igienico sanitaria) che ai requisiti specifici dei prodotti della pesca (dotazione del marchio di identificazione, valutazione delle caratteristiche organolettiche merceologiche e di freschezza del prodotto). I controlli sugli aspetti strutturali e gestionali includono attività di vigilanza allo sbarco, ispezione programmata e attività di audit presso le navi officina, gli stabilimenti a terra (vendita all'asta e mercati all'ingrosso) e i punti vendita al dettaglio, per la verifica delle condizioni igieniche delle strutture, del rispetto delle buone pratiche di lavorazione, dei requisiti igienici, del piano di autocontrollo, delle modalità di stoccaggio e trasporto, e vigilanza e sorveglianza a livello delle piattaforme di smistamento. Ai sensi del Reg (CE) n.

854/2004, modificato dal Reg (CE) n. 1021/2008, devono essere eseguiti controlli programmati, in funzione degli elementi di rischio correlati, sulle condizioni igieniche ai punti di sbarco, nei quali non è consentita, ad esclusione della ghiacciatura, alcuna manipolazione o incassettamento dei prodotti pescati. Oltre ai controlli generali, i prodotti della pesca sono oggetto di controlli ufficiali al momento dello sbarco o, prima della prima vendita, in un luogo d'asta o in un mercato all'ingrosso. Tali controlli effettuati a campione comprendono in particolare: - test di sorveglianza organolettica; - test di azoto basico volatile totale; - test di controllo dell'istamina; - test di sorveglianza del tenore di contaminanti, come ad esempio i metalli pesanti; - test microbiologici; - test di individuazione di parassiti; - controlli della presenza di pesci tossici o contenenti biotossine. La non idoneità al consumo umano è decretata nel caso in cui si riscontrino: non conformità relative ai requisiti organolettici, microbiologici o parassitari, il superamento dei limiti previsti dalla normativa per contaminanti o residui specifici, la presenza di specie tossiche, la presenza di biotossine in quantità superiori ai limiti previsti, le autorità competenti ritengano che il prodotto possa rappresentare un rischio per la salute pubblica (applicazione del principio di precauzione). In particolare, per quanto riguarda i requisiti specifici del prodotto, sono valutati la presenza del marchio di identificazione ed elementi relativi a caratteri organolettici, indicatori di freschezza, presenza di contaminanti biotici e abiotici, livelli di istamina, presenza di prodotti della pesca velenosi (ai sensi del Reg (CE) n. 2074/2005 e successive modifiche).

4.1.1 Esami sulle caratteristiche organolettiche I controlli devono essere effettuati a campione in tutte le fasi della produzione, lavorazione e distribuzione, al fine di verificare la reale idoneità del prodotto al consumo umano. Il metodo ufficiale per la valutazione sensoriale dello stato di freschezza segue lo schema di categorizzazione in tre classi (Extra, A, B), riportato nel Reg CE 2406/1996, attraverso la valutazione dello stato di rigor mortis , odore, aspetto della cute, occhio, orifici naturali, opercolo e colore delle branchie, compattezza del muscolo. Nell’allegato I del Reg (CE) 2406/1996 sono riportate le tabelle contenenti i criteri applicabili per la categorizzazione dei prodotti in funzione dei gruppi di appartenenza:

A. Pesce bianco: Eglefini, Merluzzi bianchi, Merluzzi carbonari, Merluzzi gialli, Scorfani del Nord o Sebasti,Merlani, Molve, Naselli, Pesci castagna, Rane pescatrici, Merluzzi francesi e Merluzzi capellani, Boghe, Menole, Gronghi, Caponi, Cefali, Passere di mare, Rombi gialli, Sogliole, Limande, Sogliole limande, Passere pianuzze, Pesci sciabola; B. Pesce azzurro: Tonni bianchi o alalunga, Tonni rossi, Tonni obesi, Melù o potassoli, Aringhe, Sardine, Sgombri, Suri, Acciughe , Spratto; C. Selaci: Spinaroli, Gattucci, Razze. D. Cefalopodi: Seppie. E. Crostacei: Gamberetti; Scampi. La valutazione condotta esclusivamente attraverso un esame morfologico totalmente soggettivo costituisce un limite alla validità del metodo, per cui, da alcuni anni, è stato proposto un metodo di tipo descrittivo per la determinazione di qualità della freschezza dei prodotti ittici (QIM-Quality Index Method ) (Alasalvar et al ., 2001; Barbosa & Vaz-Pires, 2004). Alla valutazione fisica di alcuni parametri morfologici è associato un punteggio a demerito (da 3 a 0), riportato su una scheda analitica dalla quale sarà estrapolato il punteggio totale su tutti i parametri considerati. Sono inoltre disponibili metodiche per la misurazione di parametri fisici correlati allo stato di freschezza dei prodotti ittici: la conducibilità e impedenza elettrica muscolare. Man mano che il prodotto fresco deperisce, la sua conducibilità elettrica aumenta a seguito della liberazione di molecole polari a basso peso molecolare in grado di abbassare la resistenza elettrica del mezzo. Tra gli strumenti maggiormente utilizzati per la misurazione di tali parametri troviamo il Fish-Test, l’Rt Freshmeter, il Torrymeter (Bonaccorsi et al ., 2012).

4.1.2 Indicatori di freschezza Gli indicatori di freschezza sono dei parametri chimici selezionati a complemento dell’analisi organolettica sensoriale, utilizzati come indici della degradazione e della colonizzazione microbica del tessuto muscolare post-mortem . Da Regg (CE) n. 853/2004 e 2074/2005, ai fini del controllo ufficiale i parametri chimici valutati sono: (ABVT- Azoto Basico Volatile Totale) e trimetilamina (TMA). La trimetilamina (TMA) è una delle basi azotate volatili che si formano durante i processi alterativi; è prodotta ad opera di alcuni batteri o gruppi enzimatici per riduzione dell’ossido di trimetilamina (TMAO), un composto azotato non proteico sintetizzato per via enzimatica e presente sia nelle masse muscolari che a livello viscerale. Il tenore di TMA aumenta nel corso del periodo di conservazione, mentre

34 subisce una graduale diminuzione nella fase di putrefazione del prodotto parallelamente alla riduzione di TMAO (Olafsdottir et al ., 1997; Fazio, 2007). Nonostante il Reg. CE 854/2004 consideri la ricerca della TMA un metodo ufficiale per la valutazione del grado di freschezza del pescato, nel regolamento non sono specificate né le metodiche analitiche ufficiali né i valori limiti di accettabilità. Altri parametri di degradazione proteica sono costituiti dalle ammine biogene prodotte a seguito dall’attività aminoacido-decarbossilica di batteri durante lo stoccaggio e la conservazione dei prodotti.

4.1.3 Criteri microbiologici e presenza di agenti parassitari Per quanto riguarda il controllo dei criteri microbiologici a norma del Reg. CE n. 1441/2007 sono definiti i paramentri e le modalità operative per l’isolamento e l’analisi della presenza di batteri patogeni Salmonella , Listeria , E. coli e Stafilococchi coagulasi positivi. L’indice di contaminazione da E.coli nei molluschi bivalvi è utilizzato come parametro discriminante anche per l’attribuzione delle classi A, B e C delle zone di produzione. Molluschi di classe A, sia che provengano da impianti naturali che artificiali, potranno essere destinati al consumo diretto, mentre quelli di classe B o C saranno sottoposti a un trattamento preliminare in un centro di depurazione o a stabulazione in zona A, fino al raggiungimento degli standard igienici minimi per l’immissione in commercio. Il controllo visivo, volto alla ricerca di parassiti visibili, si effettua sulle porzioni edibili al momento dell’estrazione dei visceri prima dell’immissione sul mercato (Reg CE 2074/05), prevedendo l’eventuale esclusione dal consumo umano dei prodotti manifestamente infetti. Dalle prescrizioni contenute nella normativa comunitaria, gli OSA che commercializzano prodotti della pesca interi non eviscerati non sono tenuti all’esecuzione del controllo visivo per la ricerca dei parassiti e poiché in tal modo i prodotti della pesca ceduti freschi al consumatore finale possono contenere parassiti, è necessario esporre alla vendita al dettaglio tutte le informazioni relative ai trattamenti necessari per l’inattivazione degli stessi (Reg CE n 853/2004). Inoltre, gli OSA che in produzione post-primaria ricevano prodotti ittici freschi già eviscerati e sfilettati, pur non essendo tenuti al controllo visivo di cui al Reg (CE) n 2074/2005, devono comunque richiedere garanzie al fornitore rispetto alla presenza di parassiti visibili sul lotto in ingresso nello stabilimento.

4.1.4 Prodotti della pesca velenosi Proprio a tale proposito, nell’allegato III, SEZIONE VIII, CAPITOLO V del Reg (CE) 853/2004 è fatto divieto all’importazione e vendita di tutte le specie appartenenti alle famiglie Tetraodontidae, Canthigasteridae, Diodontidae, Molidae. A norma del Reg (CE) n.853/2004 sono inoltre soggetti a restrizione al consumo tutti i prodotti della pesca freschi, preparati e trasformati appartenenti alla famiglia Gempylidae e in particolare alle specie Ruvettus pretiosus e Lepidocybium flavobrunneum . Per questi ultimi l’immissione sul mercato è condizionata all’apposizione in etichetta di una nota informativa chiaramente visibile sulle modalità di preparazione e cottura e sul rischio connesso alla presenza di sostanze con effetti gastrointestinali avversi.

4.1.5 Biotossine algali e residui di metalli pesanti I test sono condotti su organismi filtratori, bivalvi edibili e la tecnica analitica adottata come metodo di riferimento in applicazione del Reg (UE) n. 15/2011 è la LC-MS/MS (cromatografia liquida e spettrometria di massa) o metodi analoghi comparabili (HPLC) standardizzati. In particolare il Regolamento (CE) n. 1881/06 stabilisce i tenori massimi di alcuni contaminanti e fissa i limiti per le quantità di Piombo (Pb), di Cadmio (Cd) e di Mercurio (Hg) contenute nei molluschi bivalvi.

4.2 SOSTENIBILITA’ DELLA PESCA E LOTTA ALLE PRATICHE DI PESCA ILLEGALE Attività illecite, come l’approvvigionamento di specie ittiche eseguite in regime di ipersfruttamento delle risorse naturali, possono determinare la compromissione degli ecosistemi marini e l’esaurimento degli stock ittici ai danni della stabilità socioeconomica del mercato di settore e della trasparenza nei confronti del consumatore (Condoleo et a l. 2001). Il valore complessivo stimato della pesca INN (Illegale, Non regolamentata e Non dichiarata) è di circa 10 miliardi di euro l’anno e rappresenta circa il 19% del valore registrato delle catture. Ogni anno vengono catturate illegalmente tra gli 11 e i 26 milioni di tonnellate di pesce, quantità che corrisponde almeno al 15% delle catture mondiali. Si stima che il 16% di tutto il pesce catturato in mare importato nell’UE sia frutto della pesca illegale (Risoluzione Parlamento Europeo 17/11/2011). In risposta al piano d’azione internazionale promosso dalla FAO, a livello europeo sono stati promulgati il Reg (CE) n. 1005/2008 e il Reg CE n. 1224/2009 con l’intento di combattere

36 le forme di illegalità, impedendo la vendita delle catture illegali sui mercati comunitari, attraverso l’istituzione di un regime coordinato di prevenzione e rispetto delle norme della politica comune della pesca. Il campo di applicazione per entrambi i regolamenti prende in considerazione tutti gli scambi commerciali di prodotti della pesca marittima, trasformati o non trasformati, provenienti sia da pescherecci di Paesi terzi ed esportati nell’ UE con ogni mezzo di trasporto, sia da catture effettuate all’interno della Comunità Europea e destinate all’esportazione in Paesi Terzi. I due regolamenti individuano una serie di misure di contrasto alla pesca INN attraverso l’istituzione di un dispositivo di ispezione dei pescherecci dei Paesi Terzi, di un sistema comunitario di allerta e di identificazione dei pescherecci coinvolti nella pesca INN e un sistema di controllo delle catture (catch certification scheme ), secondo il quale tutti i prodotti della pesca marittima, compresi i prodotti trasformati, devono essere accompagnati da certificati di cattura sul modello riportato nell’allegato IV del Reg CE 1010/2009, allo scopo di garantire la tracciabilità dei prodotti marini che entrano a far parte dell’import-export del mercato comunitario. In aggiunta al catch certification scheme , il Reg CE 1005/2008 indirizza l’interesse verso forme di mutual assistance (cooperazione) tra Paesi Membri e Paesi Terzi, per favorire un sistema internazionale di controllo e gestione dei flussi e delle triangolazioni commerciali nel settore ittico. A tale proposito, a norma dell’articolo 18, in assenza delle certificazioni necessarie o dell’ottemperanza del piano d’azione internazionale FAO 2001 per la lotta alla pesca illegale (http://www.fao.org/docrep/003/y1224e/y1224e00.htm), possono essere avviate procedure di diniego formale all’importazione a carico di uno o più Paesi Terzi riconosciuti come non cooperanti. I principali riferimenti normativi relativi al contrasto di fenomeni IUU sono riportati in ordine cronologico nella tabella seguente.

DOCUMENTO OBIETTIVI PUNTI CHIAVE NORMATIVO V Obbligo di prenotifica di attracco Istituzione di un V Istituzione di punti di ispezione per i pescherecci in regime attracco da Paesi Terzi Reg. (CE) n. comunitario per la V Istituzione di un sistema di certificazione delle catture 1005/2008 prevenzione e (APEO) l’eliminazione di V Identificazione dei pescherecci dediti a pesca INN fenomeni INN V Identificazione e creazione di un elenco dei Paesi non cooperanti Descrizione delle V Modulo ufficiale notifica preventiva d’attracco; modalità operative V Registrazione dei pescherecci Reg. (CE) n. per l’applicazione V Definizione strumenti operativi per la certificazione delle 1010/2009 del Reg (CE) n. catture e modalità di rilascio del certificato APEO 1005/2008 V Definizione delle condizioni d’accesso alle risorse ittiche: licenza di pesca; sistema di identificazione delle Istituzione di un imbarcazioni e degli attrezzi da pesca regime di controllo V Controllo delle fasi di pesca: compilazione giornale di comunitario per bordo e trasmissione elettronica dei dati relativi alle Reg. (CE) n. garantire il catture al trasbordo e allo sbarco del pescato; 1224/2009 rispetto delle V Monitoraggio dello sforzo di pesca e previsione della norme della possibilità di chiusure periodiche o straordinarie politica comune dell’accesso alle risorse ittiche; detrazioni dello sforzo di della pesca pesca sui singoli territori nazionali V Uso degli attrezzi di pesca V Controllo della commercializzazione V Marcatura delle imbarcazioni e attrezzature da pesca V Disposizioni e linee guida per la compilazione giornale di bordo e trasmissione elettronica dei dati relativi alle catture al trasbordo e allo sbarco del pescato; V Modalità di controllo flussi di commercializzazione e Descrizione delle tracciabilità delle partite Reg. di modalità V Linee guida per il monitoraggio delle attività : modalità Esecuzione (UE) applicative del dei campionamenti di controllo, ispezione e sorveglianza 404/2011 Reg (CE) n. sugli operatori a tutti i livelli della filiera ittica 1005/2008 V Individuazione e redazione elenco ispettori europei per l’armonizzazione delle attività di vigilanza e controllo V ALLEGATI: codici di presentazione alfa-3; modello giornale di bordo e dichiarazione di sbarco; elenco codici identificativi degli attrezzi da pesca

Tabella 4.1: sintesi dei principali documenti normativi emanati all’interno dell’Unione Europea in accordo con le linee guida e le azioni condotte a livello internazionale

CAPITOLO 5: FRODI NEL COMPARTO ITTICO

Il comparto ittico proprio per effetto della globalizzazione dei mercati risulta allo stato attuale tra i settori maggiormente esposti a pratiche di commercio illegale ed, in primis, a frodi per sostituzione di specie. L’espansione e la diversificazione dell’offerta dei prodotti supportata dallo sviluppo di nuove tecniche di lavorazione e trasporto ha portato infatti alla crescita esponenziale del numero di specie ittiche commerciabili e alla nascita di triangolazioni commerciali molto complesse. La presenza di numerosi intermediari di filiera e il reperimento di materie prime in aree geografiche in cui la pesca non è regolata da sistemi integrati di tracciabilità conduce alla sempre maggior diffusione di fenomeni di mislabeling , spesso favoriti da operazioni di pesca illegale e non controllata (Roheim, 2008). a tal proposito Il controllo sui prodotti d’importazione gioca un ruolo determinante nel controllo di fenomeni di pesca illegale e overfishing nei confronti di specie sottoposte a tutela o per i quali è stato imposto il veto alla pesca sia a livello comunitario che internazionale.

Uno dei fattori che sicuramente contribuisce alla diffusione di mislabeling e misleading dei prodotti ittici è legato al grado di lavorazione dei prodotti, che spesso sono importati direttamente in forma di filetto o pronti per il consumo (panati, ready to eat ), con perdita di caratteri morfologici distintivi essenziali per il riconoscimento visivo specie specifico (Armani et al., 2012).

In questo contesto, quindi, si evince la necessità di mettere in atto sistemi di tracciabilità e rintracciabilità armonizzati a livello internazionale, volti a garantire la trasparenza sull’identità e l’origine dei prodotti commercializzati e la conformità della informazioni riportate in etichetta.

5.1 CONCETTO DI FRODE ALIMENTARE Pur non esistendo ancora in ambito di Diritto Comunitario una definizione univoca e completa di “frode alimentare”, nell’accezione comune il termine fa riferimento alla produzione e all’immissione in commercio di alimenti non conformi alla normativa vigente in piena consapevolezza e dolo ai danni del consumatore o utilizzatore finale dell’alimento (Colavita et al., 2012). Volgendo uno sguardo a livello internazionale, l’accezione di frode assume un significato ancora più preciso facendo riferimento a qualsiasi pratica illecita perpetrata in modo deliberato a fini di lucro attraverso la sostituzione, aggiunta, manomissione od errata

39 presentazione di un alimento in toto, di un ingrediente e del confezionamento relativo. (Spink and Moyer 2011) In relazione a tali definizioni, è possibile mettere in evidenza alcuni punti fondamentali relativi al concetto di frode: - si configura sempre e comunque come un atto doloso lesivo del dovere di correttezza nei confronti del consumatore e in violazione dei principi fondamentali di trasparenza definiti dal Reg (CE) 178/2002; - è indipendente dall’inizio di una contrattazione con il cliente, dal momento che si realizza già alla messa in commercio del prodotto; - si realizza anche in assenza di un effettivo pregiudizio economico per l’acquirente, anche alla consegna, quindi, di un bene di qualità superiore rispetto al dichiarato (Semeraro, 2011).

In funzione del danno arrecato al consumatore, le frodi possono essere suddivise in frodi sanitarie e frodi commerciali. Le prime si verificano nel caso in cui l’illecito costituisca una minaccia diretta per la salute dell’utilizzatore finale dell’alimento. Il reato si configura anche nei momenti precedenti la vendita, in tutte le fasi di distribuzione, sino all’esposizione in commercio al dettaglio prima della cessione al consumatore finale. Le frodi commerciali sussistono se il danno arrecato coinvolge esclusivamente gli interessi economici dell’acquirente, senza costituire necessariamente un elemento di nocività per la salute pubblica (Colavita et al ., 2012). Dal punto di vista giuridico, le due tipologie di frode fanno capo a due titoli distinti del Libro secondo del Codice Penale, il titolo VI “Dei delitti contro l’incolumità pubblica”, e il titolo VIII “Dei delitti contro l'economia pubblica, l’industria e il commercio”. Al Capo II - titolo VI relativo ai “delitti di comune pericolo mediante frode” - le frodi sanitarie sono classificate in frodi per: - Avvelenamento di acque o sostanze alimentari (Art. 439); - Adulterazione e contraffazione (Art 440) ; - Commercio di sostanze alimentari adulterate o contraffatte, ovvero alterazione della natura genuina di una sostanza attraverso un procedimento con cui si sottraggono, aggiungono o si sostituiscono elementi (Art.442); - Commercio di sostanze alimentari nocive, la cui nocività è intrinseca nell’alimento e non deriva da adulterazione o contraffazione successive (Art. 444);

I riferimenti per le frodi commerciali sono contenuti invece al capo II –Titolo VIII relativo ai “delitti contro l’industria e il commercio” in cui si riportano le definizioni di: - Frode nell’esercizio del commercio (Art. 515); - Vendita di sostanze non genuine per genuine (Art. 516). In questo caso, il termine genuinità fa riferimento alla composizione naturale dell’alimento, rimandando alla definizione riportata all’art 5 della Legge 283 del 1962 sulla tutela igienico sanitaria degli alimenti e delle bevande. Con il termine “frode alimentare” si fa quindi riferimento ad un insieme di condotte illecite a fini di lucro volte alla “adulterazione”, “sofisticazione”, “alterazione” degli alimenti durante le fasi produttive associate e in fase di commercializzazione, a fenomeni di “contraffazione” e “falsificazione” e manomissione (Spink and Moyer 2011) . L’adulterazione di un prodotto consiste nella variazione non dichiarata della composizione analitica di un prodotto per aggiunta o sottrazione di una o più componenti (es. diminuzione del tenore di grasso o aggiunta di acqua nel latte), al fine di aumentarne la resa economica. La sofisticazione si realizza piuttosto apportando modifiche alla composizione di un prodotto attraverso la sostituzione parziale o totale di elementi costitutivi con altri di valore o qualità inferiore oppure attraverso l’utilizzo di sostanze chimiche (additivi e conservanti) non consentite o non dichiarate, per migliorare l’aspetto, con lo scopo di migliorarne l’appeal o mascherare eventuali difetti. Con il termine “alterazione”, infine, si fa riferimento a fenomeni degenerativi che portano alla modifica delle caratteristiche organolettiche e nutrizionali del prodotto (es. irrancidimento), pur senza pregiudicarne la salubrità. Tali fenomeni sono spesso involontari e legati frequentemente a una cattiva gestione della conservazione degli alimenti. In fase di commercializzazione, inoltre, si possono riscontrare azioni di “falsificazione” (un esempio emblematico è rappresentato dalla sostituzione di denominazione delle specie ittiche sul banco di vendita) e “contraffazione”, nei casi in cui l’azione fraudolenta sia finalizzata a far apparire un prodotto alimentare come dotato di caratteristiche diverse da quelle realmente possedute, attraverso l’applicazione indebita di marchi o denominazioni registrate (Colavita et al ., 2012). All’atto pratico, il confine tra le tipologie di frode e il limite tra frode sanitaria e commerciale non è sempre netto, in quanto, trattandosi di prodotti alimentari, anche illeciti, perpetrati a scopo puramente commerciale, possono avere ripercussioni anche dal punto di vista sanitario o nutrizionale (Colavita et al ., 2012). In tal caso, si prefigura una frode mista in cui l’illecito perpetrato espone contemporaneamente il consumatore a un danno materiale e a un pericolo effettivo per la salute.

A livello nazionale, le attività di prevenzione e repressione delle frodi alimentari sono demandate a organi di controllo ufficiale distinti e diversificati, in funzione dell’ambito di competenza e delle attività di vigilanza prefisse: - Controllo aspetti igienico-sanitari sulla produzione e la commercializzazione dei prodotti agroalimentari e sui mezzi tecnici di produzione a tutela della salute pubblica; - Controllo sulla genuinità e lealtà negli scambi commerciali e della concorrenza nel rispetto della normativa vigente nel rispetto del principio di trasparenza e libero mercato; - Prevenzione e repressione delle infrazioni di natura merceologica e finanziaria; - Controllo di tipo finanziario diretto alla tutela del bilancio comunitario, finalizzato a verificare il corretto utilizzo dei fondi erogati dalla Comunità europea, in numerosi settori del comparto agroalimentare, allo scopo di garantire la salvaguardia degli interessi finanziari comunitari. Ai fini dell'applicazione dei Regolamenti (CE) n. 854/2004 e 882/2004, gli organismi pubblici incaricati dei controlli ufficiali in materia di igiene, profilassi e vigilanza sugli animali destinati all'alimentazione umana, controllo dei prodotti agroalimentari e somministrazione di alimenti e bevande fanno capo al Ministero della Salute, al Ministero delle Politiche Agricole e Forestali (MIPAAF), al Ministero dell'Economia e delle Finanze e, a livello territoriale, alle giurisdizioni Comunali e Regionali o delle Province autonome. Infine, oltre alle Amministrazioni pubbliche, partecipano attraverso reparti specializzati, l’Arma dei Carabinieri, il Corpo forestale dello Stato e la Guardia di Finanza (D.lgs 193/07). Per l’importazione di alimenti di origine animale da Paesi Terzi, la verifica della conformità alle normative comunitarie è demandata ad Uffici Veterinari Periferici, i Posti di Ispezione Frontaliera (PIF), chiamati ad effettuare controlli di tipo documentale, d’identità, fisici o materiali e analitici sulle partite di animali e prodotti inclusi nella Decisione 2007/275/CE, come modificata dalla Decisione di esecuzione 2012/31/UE e dal Regolamento (UE) n. 28/2012.

5.2 FRODI NEL SETTORE ITTICO In conseguenza dell’aumento delle importazioni da Paesi Terzi, la corretta identificazione delle specie ittiche poste in commercio è andata progressivamente complicandosi con l’arrivo sul mercato di specie completamente nuove e prive di una denominazione commerciale valida. A causa di queste difficoltà, non è raro che sul mercato europeo e nazionale siano immessi prodotti a prezzi superiori rispetto al reale valore commerciale sotto falsa denominazione commerciale e in contravvenzione con quanto previsto dalla normativa vigen te. La sostituzione di specie a scopo fraudolento generalmente determina un danno di tipo economico-commerciale, attraverso l’attribuzione di un valore di mercato non rispondente alla qualità effettiva del prodotto in vendita. Nel settore ittico, frodi ascrivibili a questa categoria riguardano ad esempio l’indicazione di provenienza errata, la sostituzione di una specie pregiata con specie di minor pregio più o meno filogeneticamente vicine o la vendita di prodotti decongelati come freschi. In questo caso, l’azione costituisce esclusivamente un illecito profitto a danno del consumatore senza comportare di per sé alcun rischio per la salute pubblica. L’azione illecita assume i caratteri della frode sanitaria allorquando il prodotto immesso in commercio erroneamente etichettato o mal conservato, costituisca un pericolo potenziale per la salute del consumatore. Un esempio di frode sanitaria è rappresentato da episodi di avvelenamento a seguito dell’immissione in commercio di specie velenose della famiglia Tetraodontidae (pesce palla) vendute al posto della rana pescatrice ( Lophius sp .- Lophidae). Segnalazioni d’avvelenamento ad esito più o meno infausto riconducibili all’ingestione di Lagocephalus scleratus sono riportate negli Stati Uniti, in Bangladesh (Homaria et al., 2010) in Egitto (Zaki & Mossa, 2005), Israele (Kheifets et al., 2012) e in Italia, in cui si riporta un caso di avvelenamento con decesso occorso nel 1977 conseguente all’immissione in commercio di tranci di pesce palla congelato in sostituzione di code di rana pescatrice (Palese e Palese 1992). Il controllo dell’immissione in commercio di queste specie sta diventando sempre più pressante, anche a causa dei cambiamenti climatici che stanno determinando un innalzamento della temperatura delle acque marine e la conseguente colonizzazione dei nostri mari di specie tossiche, normalmente assenti nelle nostre acque (Rinaldi, 2007; Bentur et al., 2008). La modificazione degli habitat e delle popolazioni marine non esclude più la possibilità che tali specie entrino nei circuiti commerciali, non solo per importazione, ma anche attraverso la pesca locale (Milazzo et al., 2012). A tale proposito, proprio negli ultimi

43 anni, si sono susseguite numerose segnalazioni e allerte per la presenza accertata anche in Italia di Lagocephalus scleratus e Sphoeroides pachygaster , con avvistamenti lungo le coste siciliane e dell’isola di Lampedusa (Giordano et al., 2012). Il confine tra le due tipologie di frode, però, può non essere sempre così netto e una frode originariamente annonaria può assumere risvolti sanitari. Un esempio di tale fenomeno potrebbe essere dato, ad esempio, dall’errata indicazione di provenienza: si pensi alla sostituzione di bivalvi sgusciati precotti nostrani con bivalvi esotici, non sempre raccolti in aree controllate per la presenza di biotossine (http://www.fao.org/docrep/015/i2356e/i2356e.pdf). La sostituzione di specie, inoltre, potrebbe comportare la maggior esposizione all’ingestione di ammine attive come l’istamina, con la comparsa di fenomeni simil-allergici (prurito, comparsa di eritema diffuso orticarioide, difficoltà respiratorie (Cattaneo, 2012). Infine, da non sottovalutare la possibilità di commercializzazione di preparazioni alimentari contenenti crostacei o molluschi non indicati in etichetta, esponendo così la categoria dei consumatori allergici per queste tipologie di prodotti a possibili rischi per la loro salute (http://www.izsvenezie.it/index.php?option=com_content&view=article&id=1082:frodi- alimentari-tra-problemi-economici-e-sanitari&catid=159).

CAPITOLO 6: RINTRACCIABILITÀ ED ETICHETTATURA

6.1 CONCETTO DI RINTRACCIABILITÀ’ I termini “tracciabilità” e “rintracciabilità”, usati spesso come sinonimi, rappresentano, in realtà, due concetti autonomi e tra loro differenti, espressione di due diversi momenti della filiera produttiva. La tracciabilità (tracking ) include tutti i criteri e sistemi operativi messi in atto per identificare tutti i soggetti e le aziende che intervengono a vari livelli nella filiera dalla produzione e distribuzione, fino alla commercializzazione di ciascuna unità di prodotto (lotto), allo scopo di “tracciarne” il percorso seguito. La rintracciabilità (tracing ) invece, identifica l’operazione compiuta a ritroso lungo tutti gli anelli della filiera, allo scopo di garantire un pronto e puntuale prelievo dal mercato di qualsiasi prodotto non conforme e un’adeguata e rapida informativa alle autorità di controllo. Gli aspetti fondamentali per la creazione di una rete efficiente e puntuale di track-tracing dovranno necessariamente prendere in considerazione la creazione di: - Un sistema condiviso di requisiti tecnici per tracciare i flussi di prodotto negli scambi tra operatori; a tale scopo, tutte le aziende e strutture coinvolte dovranno essere opportunamente censite attraverso un numero di riconoscimento e/o un numero di registrazione presso l’Autorità Competente sul territorio (Art. 6 del Reg.(CE) 852/2004) e ogni prodotto dovrà essere univocamente identificato da un bollo o da un marchio che ne certifichi la provenienza da uno stabilimento riconosciuto e il lotto di produzione (Art.18 Reg (CE) 178/2002) ; - Una procedura condivisa per la gestione di eventi accidentali e intenzionali e dei processi di ritiro e richiamo di prodotto non conforme. Al fine della valutazione del grado di rischio associato, il primo aspetto da tenere in considerazione è mirato all’individuazione dell’origine, la natura esatta e l’estensione dell’evento secondo la seguente classificazione: - Evento accidentale di carattere normativo (requisiti normativi non sono soddisfatti, ma la sicurezza del consumatore non è a rischio); - Evento accidentale legato alla qualità del prodotto (la sicurezza del consumatore non è a rischio ma il prodotto non soddisfa gli standard qualitativi e non risulta all’altezza delle aspettative del cliente); - Evento accidentale legato alla sicurezza del prodotto (la sicurezza del consumatore è a rischio).

In funzione del potenziale di rischio, l’azione da intraprendere può variare da un’azione di richiamo pubblico del prodotto al consumatore ad un ritiro del prodotto dalla vendita o una sospensione transitoria delle consegne del prodotto alla distribuzione. Tutte le decisioni relative al ritiro/richiamo dei prodotti ricadono sotto la responsabilità dell’OSA, il Reg. (CE) n° 178/2002 configura l’obbligo di ritiro/richiamo del prodotto nei soli casi di non conformità che costituiscono un rischio per la sicurezza del consumatore .

6.2 ETICHETTATURA DEGLI ALIMENTI In generale, l’etichettatura costituisce uno strumento chiave per la rintracciabilità e per la verifica dell’identità di un prodotto alimentare, costituendo inoltre un insostituibile mezzo informativo per il consumatore. L’identificazione univoca di un prodotto, oltre alla valenza sanitaria e commerciale, si pone inoltre a garanzia del rispetto di usi alimentari peculiari di alcune religioni, quali, ad esempio, quelli contenuti nella Torah , che nega il consumo di pesci senza pinne e squame come le anguille, gli squali e tutti i crostacei e molluschi o nel Corano , che vieta il consumo di animali morti, sangue, carne di maiale, pesci privi di squame e molluschi (Mengoli, Siconolfi 2010). Nel corso degli anni, il quadro normativo in materia di etichettatura, nato con l’intento di unificare i sistemi di tracciabilità e informazione tra tutti gli Stati membri per favorire la libera circolazione degli alimenti all’interno del territorio comunitario, è stato modificato, ponendo sempre maggior attenzione alla tutela dei diritti dei consumatori e alla sicurezza alimentare. Il primo atto verso l’armonizzazione dell’etichettatura dei prodotti alimentari è rappresentato dalla Direttiva 79/112/CEE del 18 dicembre 1978, “relativa al riavvicinamento delle legislazioni degli Stati Membri concernenti l’etichettatura e la presentazione dei prodotti alimentari destinati al consumatore finale, nonché la relativa pubblicità recepita a livello nazionale con il D.P.R. n. 322 del 18 maggio 1982. Di seguito sono riportate a partire dal 1989 fino al 2011, le numerose Direttive recepite a livello nazionale con decreti legislativi appositi, sia in forma di Regolamenti a carattere orizzontale, promulgati nell’ambito dell’etichettatura e rintracciabilità dei prodotti alimentari: - Decreto Legislativo 27 gennaio 1992 n. 109 dal titolo “Attuazione delle direttive 89/395/CEE e 89/396 CEE concernenti l'etichettatura, la presentazione e la pubblicità dei prodotti alimentari”;

- Direttiva 2000/13/CE del Parlamento Europeo e del Consiglio del 20 marzo 2000 relativa al ravvicinamento delle legislazioni degli Stati membri concernenti l’etichettatura e la presentazione dei prodotti alimentari, nonché la relativa pubblicità; - Decreto Legislativo 23 giugno 2003, n. 181 dal titolo "Attuazione della direttiva 2000/13/CE concernente l'etichettatura e la presentazione dei prodotti alimentari, nonchè la relativa pubblicità; - Regolamento (CE) N. 2081/1992 del Consiglio del 14 luglio 1992, relativo alla protezione delle indicazioni geografiche e delle denominazioni d’origine dei prodotti agricoli ed alimentari; - Regolamento (CE) N. 1830/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio del 22 settembre 2003, concernente la tracciabilità e l’etichettatura di organismi geneticamente modificati e la tracciabilità di organismi e mangimi ottenuti da organismi geneticamente modificati, nonché recante modifica della direttiva 2001/18/CE; - Reg. (CE) N. 1169, del 25 ottobre 2011 relativo alla fornitura di informazioni sugli alimenti ai consumatori, che modifica i regolamenti (CE) n. 1924/2006 e (CE) n. 1925/2006 del Parlamento europeo e del Consiglio e abroga la direttiva 87/250/CEE della Commissione, la direttiva 90/496/CEE del Consiglio, la direttiva 1999/10/CE della Commissione, la direttiva 2000/13/CE del Parlamento europeo e del Consiglio, le direttive 2002/67/CE e 2008/5/CE della Commissione e il Regolamento (CE) n. 608/2004 della Commissione Testo rilevante ai fini del SEE. Dopo aver definito le responsabilità degli OSA in termini di etichettatura, trasparenza e lealtà nei confronti del consumatore (Art. 8), all’art 9 sono enumerati tutti i dati da riportare obbligatoriamente in etichetta: denominazione del prodotto, ingredienti, allergeni, quantità netta, termine minimo di conservazione o data di scadenza, condizioni particolari di conservazioni e/o impiego, nome o ragione sociale e indirizzo dell’operatore, paese di origine o luogo di provenienza, istruzioni per l’uso. L’apposizione del numero di lotto di produzione, già enunciata dalla Direttiva 396/89 CEE, è ribadita nel Reg CE 178/2002 e resa obbligatoria al fine di identificare univocamente un prodotto ai fini della tracciabilità (Sciarroni, 2012).

6.3 ETICHETTATURA DEI PRODOTTI ITTICI La crescente attenzione verso gli aspetti igienico-sanitari dei prodotti ittici e la necessità di armonizzare le legislazioni vigenti nei singoli Stati Membri hanno portato all’ elaborazione di un sistema normativo verticale di settore con la promulgazione del Reg CE 104/2000 del 17 dicembre 1999, in materia di informazione per il consumatore, di rintracciabilità di filiera e di origine dei prodotti ittici e il successivo Regolamento applicativo (Reg CE 2065/2011), contenente Linee Guida per la tracciabilità e l’etichettatura dei prodotti ittici. Di seguito, è riportato un excursus cronologico sintetico del quadro normativo comunitario in materia di commercializzazione e controllo dei prodotti ittici: - Reg. CE 104/2000 relativo all’organizzazione comune dei mercati nel settore dei prodotti della pesca e dell’acquacoltura; - Reg. CE 2065/01 modalità d’applicazione del Reg. 104/2000; - Reg. CE 2318/01 applicazione del Reg. 104/2000 inerenti ai riconoscimenti connessi agli obblighi di tracciabilità e registrazione della pesca e dell’acquacoltura; - Reg. CE 2369/02 che modifica il Reg. 2792/99 che definisce modalità e condizioni delle azioni strutturali comunitarie nel settore della pesca; - Reg. CE 2371/02 relativo alla conservazione e allo sfruttamento sostenibile delle risorse della pesca nell’ambito della Politica Comune della Pesca (PCP); - Reg. CE 1198/06 relativo al Fondo europeo per la pesca (FEP). Strumento di intervento finanziario nel quadro degli interventi strutturali di sostegno della Comunità a favore dello sviluppo sostenibile del settore della pesca e dell’acquacoltura; - Reg. CE 1967/06 relativo alle misure di gestione per lo sfruttamento sostenibile delle risorse della pesca nel mar Mediterraneo; - Reg. CE 498/07 recante modalità di applicazione del Reg. 1198/06; - Reg. CE 1005/08 del 29 settembre 2008 che istituisce un regime comunitario per prevenire, scoraggiare ed eliminare la pesca illegale, non dichiarata e non regolamentata, che modifica i regolamenti (CEE) n. 2897/1993, (CE) n. 1936/2001 e (CE) n. 601/2004 e che abroga i regolamenti (CE) n. 1093/1994 e (CE) n. 1447/1999; - Reg. CE 889/2008 della Commissione del 5 settembre 2008 recante modalità di applicazione del regolamento (CE) n. 834/2007 del Consiglio, relativo alla produzione biologica e all'etichettatura dei prodotti biologici, per quanto riguarda la produzione biologica, l'etichettatura e i controlli;

- Reg. CE 710/2009 modalità di applicazione del Reg. (CE) 834/2007 per i prodotti dell’acquacoltura biologica; - Reg. CE 1224/2009 istituisce un regime di controllo comunitario per garantire il rispetto delle norme della politica comune della pesca; - Reg. CE 404/2011 recante modalità di applicazione del regolamento (CE) n. 1224/2009; - Reg CE 1379/2013 relativo all'organizzazione comune dei mercati nel settore dei prodotti della pesca e dell'acquacoltura, recante modifica ai regolamenti (CE) n. 1184/2006 e (CE) n. 1224/2009 del Consiglio e che abroga il regolamento (CE) n. 104/2000 del Consiglio. Ai sensi del Reg CE 1379/2013 di abrogazione del precedente Reg 104/2000, la disciplina sull’etichettatura introdotta si applica a tutti i prodotti ittici commercializzati all’interno del territorio comunitario, pesci crostacei e molluschi siano essi vivi, freschi, refrigerati, congelati salati o essiccati, provenienti da attività di pesca o acquacoltura sia in territorio europeo che extraeuropeo (Paesi Terzi), mentre dal campo di applicazione del regolamento sono esplicitamente esclusi prodotti trasformati e conservati. Fatto salvo il Regolamento (UE) n. 1169/2011, l’Articolo 35 del Regolamento fissa i parametri e le modalità di etichettatura di tutti i prodotti della pesca sopra indicati, rendendo obbligatorie le seguenti informazioni: - denominazione commerciale e denominazione scientifica associata (ciascuno Stato Membro è tenuto a redigere e aggiornare una lista ufficiale delle denominazioni commerciali ammesse e il nome scientifico di ciascuna specie, quale riportato nel sistema d'informazione FishBase o nel database ASFIS dell'organizzazione per l'alimentazione e l'agricoltura (FAO); - modalità di produzione e zona di cattura. La zona di cattura può essere espressa in codice o per esteso facendo riferimento alla divisione FAO. Nel caso di prodotti della pesca catturati in acque dolci, la menzione del corpo idrico di origine dello Stato membro o del paese terzo di origine del prodotto; - eventuale trattamento di scongelamento; - termine minimo di conservazione.

Fig 6.1: Codici identificativi delle aree di pesca a norma del Reg (CE) n. 1345/2008

Fra le informazioni che obbligatoriamente devono essere fornite al consumatore rientrano: la denominazione commerciale nella lingua del Paese Membro di destinazione; la denominazione scientifica; il metodo di produzione (pescato o allevato); il luogo di provenienza, riportando o la zona di cattura (area FAO) o il paese in cui si è effettuata l’ultima fase dell’allevamento; codice FAO alfa3 di ogni specie; numero identificativo del peschereccio o numero di riconoscimento dell’allevamento d’acquacoltura; data di cattura o data di produzione; eventuale congelamento del prodotto. In caso di vendita di miscugli di specie diverse, la denominazione commerciale della specie, il metodo di produzione e la zona di cattura devono essere fornite per ciascuna specie (Reg (CE) 2065/2001 e Reg (CE) 1224/2009). Per quanto riguarda la denominazione commerciale, nel Reg (CE) 2065/2001 si impone l’obbligo della pubblicazione da parte di ogni stato Membro di una lista di denominazioni commerciali autorizzate. Tale obbligo, a livello italiano, è stato assolto nel 2002 dal Ministero delle Politiche Agricole Alimentari e Forestali (MIPAAF) con l’emanazione di un Decreto sull’etichettatura dei prodotti della pesca e acquacoltura (Decreto 27 marzo), successivamente integrato e modificato. Dai Decreti MIPAAF del 14 gennaio e 25 luglio 2005, del 31 gennaio 2008, 10 marzo 2010: - Decreto MIPAF 14gennaio 2005, successivamente modificato dal Decreto MIPAF 25 luglio 2005, relativo alla “Denominazione in lingua italiana delle specie ittiche di interesse commerciale ai sensi del Reg CE 2065/2001 della Commissione; - Decreto MIPAF del 31 gennaio 2008 contenete modifiche e integrazioni dell’elenco di cui al decreto del 25 luglio 2005; - Decreto MIPAF 5 marzo 2010 contenente modifiche e integrazioni dell’elenco di cui al decreto del 31 gennaio 2008

6.3.1 Etichettatura dei prodotti trasformati I prodotti trasformati sono definiti dal Reg. (CE) n. 852/2004 come i “prodotti alimentari ottenuti dalla trasformazione di prodotti non trasformati. Tali prodotti possono contenere ingredienti necessari alla loro lavorazione o per conferire loro caratteristiche specifiche” e, nello specifico, i prodotti della pesca trasformati sono definiti dal Regolamento n. 853/2004 come “i prodotti trasformati risultanti dalla trasformazione di prodotti della pesca o dall’ulteriore trasformazione di detti prodotti trasformati”. Attualmente, con il termine di conserve si indicano i prodotti alimentari sottoposti a processi fisici, chimici o chimico-fisici, tali da assicurare la distruzione di tutti gli agenti biologici in grado di svolgere effetti alteranti sull’alimento o di nuocere alla salute del consumatore. Tali trattamenti ne permettono la conservazione a temperatura ambiente per lunghi periodi di tempo. Secondo quanto stabilito dal Reg UE n. 1169/2011 per i prodotti trasformati a base di pesce in semi-conserva sono previste le seguenti indicazioni obbligatorie: la denominazione dell'alimento; l’elenco degli ingredienti e coadiuvanti tecnologici; la quantità netta dell'alimento, il termine minimo di conservazione o la data di scadenza, il nome o la ragione sociale e l'indirizzo dell'operatore del settore alimentare; il paese d'origine, informazioni sulle condizioni di conservazione e le modalità d'impiego; una dichiarazione nutrizionale.

CAPITOLO 7 APPROCCIO ANALITICO ALL’IDENTIFICAZIONE DI SPECIE NEL SETTORE ITTICO

7.1 RICONOSCIMENTO MORFOLOGICO In Italia, la metodica attualmente riconosciuta a livello legale per l’identificazione di specie ittiche consiste nell’identificazione morfologica macroscopica del pesce intero, secondo chiavi dicotomiche proposte dalla Food and Agriculture Organization (FAO). I parametri presi in esame sono di tipo morfometrico e meristico . I caratteri morfometrici (misurabili) sono solitamente espressi con un rapporto fra grandezze (altezza massima/lunghezza totale, diametro dell’occhio/ lunghezza della testa). Per ogni carattere è definito un range , in quanto la variabilità intraspecifica determina quasi sempre un numero variabile delle strutture prese in esame, anche nell’ambito di una stessa popolazione. I parametri di tipo meristico comprendono invece tutti caratteri che possono essere contati e identificati da grandezze finite. Tra i principali contemplati dal sistema dicotomico FAO troviamo: numero e posizione delle pinne, numero di raggi della pinna dorsale, numero di raggi della pinna anale, numero di branchiospine sul primo arco branchiale e numero di vertebre. Esistono, infine, caratteri definiti qualitativi o alternativi, quali la presenza/assenza di barbigli orali, di scaglie, di denti, di pinna adiposa. Tuttavia, per quanto riportato in precedenza, in risposta alla crescente domanda da parte del consumatore di maggiori contenuti di servizio e praticità associati al consumo alimentare, la commercializzazione di prodotti interi costituisce solo una fetta marginale del fatturato di settore caratterizzato piuttosto da una fiorente gamma di alimenti a base di pesce: filettati, cubettati e parzialmente trasformati o precotti e pronti all’uso (prodotti panati, spiedini, insalate di mare e sughi pronti). Per effetto di tali lavorazioni, l’identificazione attraverso l’utilizzo di chiavi morfologiche è spesso del tutto inefficace e inapplicabile allo scopo (Civera 2003; Rasmussen 2009) . In tal caso, si renderà necessario il ricorso a tecniche di laboratorio alternative di tipo molecolare, attraverso l’analisi della componente proteica e del DNA (Rasmussen & Morrisey, 2008; Armani et al., 2012.)

7.2 ANALISI DEL PROFILO PROTEICO Le metodiche più diffuse per l’analisi proteiche sono basate su tecniche elettroforetiche, cromatografiche e immunologiche per l’identificazione di profili proteici e amminoacidici caratteristici. L’approccio elettroforetico è probabilmente il più conosciuto e applicato nel controllo del settore ittico e prevede l’utilizzo di tecniche differenti in funzione del prodotto oggetto d’analisi (fresco congelato, affumicato o sottoposto a trattamenti al calore) (Civera, 2003). Ai fini dell’identificazione di specie, sono state sviluppate tecniche elettroforetiche mono dimensionali in SDS-PAGE ( Sodium Dodecyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electroforesis ) (Chen & Hwang, 2002, Etienne et al ., 2001) o bidirezionali (Pineiro et al ., 1998) e tecniche di isoelettrofocalizzazione (IEF), sia in condizioni native che denaturanti (Etienne et al., 1999, Etienne et al., 2001 and Mackie et al ., 2000). La tecnica di isoelettrofocalizzazione (IEF) offre la possibilità di determinare la specie di appartenenza attraverso la separazione e la caratterizzazione delle proteine sarcoplasmatiche del tessuto muscolare in funzione del loro punto isoelettrico (pI). L’identificazione di specie si realizza comparando il profilo proteico dei campioni in analisi con pattern ottenuti da esemplari identificati estratti alle stesse condizioni analitiche (Mackie et al ., 2000). Tale tecnica, già utilizzata per l’identificazione di diverse varietà di cereali o in campo alimentare per l’analisi di uova, latte e carne, già a partire dal 1995, è stata adottata dalla Food & Drug Administration (FDA), negli Stati Uniti, come metodica ufficiale per l’identificazione delle specie ittiche (AOAC Official Methods of Analysis (1995) , AOAC Official Method 980.16: "Identification of Fish Species - Thin Layer Polyacrylamide Gel Isoelectric Focusing Method"). Seppur utilizzabile sia su prodotto fresco che congelato la metodica in condizioni native perde di efficienza e riproducibilità in presenza di prodotti cotti e conservati a seguito dell’effetto denaturante di temperatura, pressione e fattori chimici, quali l’abbassamento del pH, che determinano la perdita della conformazione delle proteine (Mackie et al., 1999; Akasaki et al ., 2006). Per questo motivo, sono stati sviluppati protocolli in condizioni denaturanti (urea-IEF), in modo da ottenere pattern modificati confrontabili tra i campioni oggetto d’analisi e gli standard identificati di riferimento (Rehbein et al., 1999; Mackie et al., 2000; Etienne et al., 2000; Etienne et al., 2001). Pur essendo stata proposta e utilizzata anche più recentemente con successo in alcuni studi per la discriminazione di specie ittiche (Chen et al., 2003; Berrini et al., 2005; Ataman et al., 2006; Ortea et al., 2010), la metodica presenta alcuni limiti applicativi legati alla sua inapplicabilità in presenza di preparazioni a base di pesce e prodotti trasformati (Rehnbein et al., 1995; Applewhite & Bennet, 2007).

Approcci alternativi prevedono l’utilizzo di test immunologici di tipo ELISA e tecniche cromatografiche in HPLC ( High Pressure Liquide Chromatography ) (Civera, 2003; Teletchea, 2009). I due limiti maggiori nell’individuazione di metodiche ELISA standardizzabili sono rappresentati dalla difficoltà nel selezionare anticorpi ad elevato grado di specificità, ovvero dall’elevato potere discriminante tra epitopi di specie affini, così da diminuire sensibilmente l’incidenza di cross-reazioni con specie non target, e dalla termostabilità dei determinati antigenici, che limita l’applicabilità di tali metodiche all’analisi dei soli prodotti freschi (Mackie et al., 1999). Ciò nonostante, in letteratura sono riportati alcuni studi per lo sviluppo di metodiche ELISA e Strip Immunoassay con anticorpi mono e policlonali per la discriminazione di alcune specie comunemente oggetto di sostituzione a livello internazionale quali cernia, pesce persico africano e pangasio (Asensio et al ., 2003; Asensio et al., 2008; Gajewski et al., 2009),.

7.3 APPROCCIO BASATO SULL’ANALISI DEL DNA Le maggiori caratteristiche che rendono il DNA lo strumento di elezione ai fini dell’identificazione di specie rispetto all’analisi proteica sono: - L’ubiquitarietà; molecole di DNA sono isolabili da tutti i tessuti e fluidi biologici contenenti cellule, cosicché l’analisi può essere condotta su qualsiasi tipo di substrato; - Un maggior grado di informazione, dato dalla degenerazione del codice genetico e dalla presenza di numerose regioni non codificanti; - L’elevato grado di resistenza a stressor fisico-chimici di varia natura (temperatura, variazioni di pH, variazioni di pressione), caratteristica, quest’ultima, fondamentale nell’analisi di matrici complesse, prodotti alimentari processati e campioni biologici conservati (Teletchea, 2009; Pereira et al., 2008).

7.3.1 Selezione del target analitico: DNA mitocondriale, DNA nucleare e ribosomiale Nella scelta del target molecolare a cui far riferimento per la messa a punto di una metodica devono essere presi in considerazione molteplici aspetti, tra cui la variabilità inter e intraspecifica del target stesso, la disponibilità, la numerosità e l’integrità delle molecole di DNA su cui effettuare l’analisi in funzione della matrice di partenza (Teletchea et al ., 2005). Il DNA mitocondriale (mtDNA) è una molecola circolare di dimensioni comprese tra 16 e 18kb; è costituita da due filamenti complementari a decorso antiparallelo definiti

54 rispettivamente filamento pesante ( Heavy strand ) e leggero ( Light strand ), in virtù del contenuto differenziale di guanine e citosine (Onori, 2010). Priva di introni, la molecola è costituita solo per un 5-7% da regioni nucleotidiche non codificanti e porta 37 geni per la sintesi di: - proteine funzionali, enzimi che presiedono alle reazioni di fosforilazione ossidativa mitocondriale ( ATPas i, Citocromo c ossidasi , citocromo b) ; - subunità del complesso NADH deidrogenasi (ND1-6; ND4); - RNA di trasporto (tRNA) ; - RNA ribosomiali (12S e 16S rRNA ). Con poche eccezioni, le molecole di mtDNA provenienti da organismi vertebrati e invertebrati hanno un contenuto genico omologo, seppur con variazioni nella disposizione dei geni all’interno dei filamenti. Un esempio di tale fenomeno è stato evidenziato negli uccelli, il cui mtDNA ha un allineamento simile a quanto riscontrato in mammiferi e anfibi, fatta eccezione per i geni codificanti per il cytb, tRNA pro ,tRNA thr , ND6 e tRNA glu , che sono trasposti gli uni con gli altri (Wostenholme, 1992). L’unica regione della molecola non codificante è rappresentata dalla regione di controllo contenente i promotori e i fattori di regolazione per la trascrizione di entrambi i filamenti, tre blocchi di sequenze ( CSB-1, -2, - 3) associate con l’inizio della sintesi del DNA e il sito d’origine di replicazione del filamento pesante. Dal momento che la replicazione del DNA mitocondriale si realizza secondo il modello asincrono dello spostamento dell’ansa, tale regione è conosciuta anche con il nome di regione contenente il D-Loop (Displacement Loop ) (Onori, 2010; Wostenholme, 1992). Ai fini dell’identificazione di specie, il DNA mitocondriale (mtDNA) è generalmente il DNA d’elezione, poiché presenta dimensioni minori rispetto al DNA nucleare ed un tasso di sostituzione nucleotidica maggiore rispetto al genoma nucleare. Quest’ultimo aspetto comporta la presenza di un numero maggiore di polimorfismi a livello interspecifico, facilitando l’identificazione di specie strettamente correlate (Waugh, 2007). Un secondo fattore a favore del mtDNA risiede nella sua conformazione circolare che conferisce una maggior resistenza all’insorgenza di fenomeni di degradazione e frammentazione (Teletchea, 2009). Allo stato attuale, i geni mitocondriali codificanti la citocromo ossidasi I (COI ), il citocromo b ( Cyt b ) e l’RNA ribosomiale 16S (16S rRNA ) sono tra i marcatori genetici più utilizzati per gli studi di caratterizzazione molecolare delle specie ittiche (Armani et al ., 2012). Target genici alternativi sono stati individuati in alcuni geni nucleari codificanti proteine strutturali come la rodopsina (Sevilla et al., 2007) e la β-actina (Lee and Gye, 2001) e le subunità ribosomiali 5S-rRNA , 18S-rRNA , 5,8S rRNA e 28S rRNA . Negli

55 organismi eucarioti, e quindi anche nei pesci, i geni ribosomiali sono organizzati in sequenze ripetute di numero variabile in relazione al grado di evoluzione dell’organismo (Vera et al ., 2003, Pisano & Ghigliotti, 2009). All’interno di ogni unità di trascrizione sono presenti due regioni principali codificanti per la subunità 18S e 28S e una regione minore codificante per la subunità 5.8S, intercalate da due regioni di trascrizione interna (Internal Trascribed Spacer ) ITS-1 e ITS-2. Mentre le regioni del 18S e del 28S sono molto conservate lungo le varie linee filetiche, le regioni ITS-1 e ITS-2 presentano un rilevante polimorfismo sia inter che intraspecifico (Hillis and Dixon 1991). Lo spacer ITS-1, che separa la sequenza codificante per il 18S da quella per la subunità 5.8S (Fig 7.1), è stato selezionato come marker alternativo sia in studi filogenetici (Colleman & Vacquer, 2002; Wyatt et al., 2006, Chow et al., 2006) che per la discriminazione di specie affini, in associazione con uno o più geni mitocondriali (Fernandez et al . 2001; Hideyuki et al . 2004; Vinas & Tudela, 2009), proprio in virtù dell’elevato grado di polimorfismo (Nwakanma et al., 2003).

Fig 7.1 : schema disposizione frammenti genici ribosomiali

7.3.2 Isolamento del DNA Il primo passo per qualsiasi approccio analitico di tipo molecolare non può prescindere dall’isolamento e purificazione del DNA totale dalla matrice oggetto d’analisi. L’ottenimento di un campione di DNA quali-quantitativamente utilizzabile è direttamente influenzato dalla metodica applicata e dalla presenza di potenziali inibitori co-purificati durante le fasi estrattive che possono costituire un ostacolo per le successive fasi analitiche, riducendo l’efficienza della reazione di PCR a vari livelli (Di Pinto et al ., 2007). La selezione della metodica di estrazione sarà quindi strettamente legata alla tipologia e allo stato di conservazione della matrice iniziale. Tra i possibili contaminanti si possono annoverare componenti di derivazione cellulare, quali proteine istoniche e di membrana, RNA, enzimi nucleasici, residui organici, sali e sostanze residue dal protocollo estrattivo. I metodi di estrazione del DNA dovrebbero idealmente essere semplici, veloci, efficienti e riproducibili,

56 riducendo al minimo il rischio di contaminazione crociata. Alla luce di quanto detto, il metodo estrattivo ideale dovrebbe produrre un campione di DNA totale di purezza elevata e in buona quantità, essendo al contempo privo di rischi, economico e di rapida esecuzione, anche in assenza di una particolare formazione dell’operatore. Classicamente, le tecniche di estrazione del DNA possono essere suddivise in macro-categorie, in funzione del principio utilizzato per l’isolamento dell’acido nucleico dalla matrice tissutale: - metodiche convenzionali: schematicamente suddivise in una prima fase di frammentazione e lisi delle membrane cellulari per il rilascio degli acidi nucleici in soluzione acquosa, una seconda fase di denaturazione delle proteine e allontanamento dei residui proteici ed altri residui organici e sali e un’ultima fase di precipitazione del DNA (Onori, 2010). - metodiche cromatografiche: dopo una prima fase di lisi tissutale, il DNA è raccolto selettivamente dal campione - metodiche alternative: utilizzo di biglie in campo magnetico

7.3.2.1 Metodiche convenzionali A) Omogeneizzazione e lisi tissutale

La preparazione del campione e la fase di lisi tissutale costituiscono il primo elemento chiave di ogni protocollo estrattivo e devono essere condotti con la massima cura, valutando attentamente la qualità della matrice di partenza e i punti critici di ciascun passaggio (pesatura, omogeneizzazione e introduzione di soluzioni di lisi), al fine di minimizzare il rischio di cross-contaminazioni del campione in analisi con DNA eterologo (Verollet, 2008). In questa fase, il campione è posto ad incubare in una soluzione contenente alcuni sali in concentrazioni variabili, che esplicano un’azione tampone mantenendo il pH intorno a 8.0, e detergenti (SDS, Tween), che favoriscono la lisi delle membrane cellulari, essendo in grado di solubilizzare i lipidi e denaturare le proteine di membrana. Generalmente, si aggiungono alcune proteasi di origine fungina (proteinasi k), per la digestione delle proteine istoniche, e l’acido Etilendiaminotetraacetico (EDTA), un chelante degli ioni metallici divalenti tra cui il Mg2+ libero, un cofattore essenziale di attivazione delle DNA asi cellulari.

B) Denaturazione e allontanamento di proteine e altre molecole contaminanti

B1) Estrazione organica

Al termine della fase di lisi, il campione conterrà acidi nucleici, detriti cellulari ed altri componenti organici rappresentati principalmente da proteine e residui lipidici disciolti, in miscela o in sospensione nella soluzione. Uno dei primi protocolli messi a punto per la purificazione e l’estrazione degli acidi nucleici prevede l’utilizzo di alcuni reagenti organici, fenolo (tamponato a pH 8), cloroformio e alcool isoamilico, utilizzati da soli e in miscela (25:24:1 e 24:1) in step successivi. Le molecole contenute nel campione si raccolgono in funzione della loro solubilità nella fase acquosa (acidi nucleici), nella fase organica (proteine, lipidi) o nello strato sottile che si forma all’interfaccia tra le due fasi, contenente per lo più proteine denaturate (Sambrook 1989). A partire dal protocollo inizialmente individuato da Sambrook et al ., per l’estrazione organica di DNA da matrici di origine animale, sono state proposte alcune metodiche alternative per l’estrazione di acidi nucleici da tessuto di pesce apportando alcune modifiche, aggiungendo una fase di incubazione ad elevate concentrazioni di urea (Asahida et al ., 1996) alla fase di lisi (Nishiguchi et al ., 2002). Gli aspetti negativi associati all’estrazione organica, oltre alla tossicità dei reagenti utilizzati (fenolo e cloroformio), includono il fatto che il protocollo richiede trasferimenti multipli del campione prima della precipitazione finale del DNA, con un notevole allungamento tempi di esecuzione e l’impiego cospicuo di materiale consumabile. (Cattaneo et al ., 2000; Rasmussen and Morrisey 2008).

B2) Metodica salting out La metodica salting out prevede l’utilizzo di soluzioni ad elevata concentrazione salina per determinare la precipitazione delle proteine compresenti nel campione lisato. La metodica si basa sulla solubilità delle proteine in soluzione direttamente dipendente dalla polarità del solvente, dalla sua forza ionica, dal suo pH e dalla temperatura del sistema. Le proteine sono scarsamente solubili in acqua pura. In soluzioni a bassa concentrazione salina la loro solubilità aumenta all’aumentare della forza ionica per effetto dell’interazione e il mascheramento dei gruppi ionici delle proteine ad opera degli ioni salini e la diminuzione delle forze d’attrazione tra le proteine (effetto salting in ) (Voet et al., 2001). Ad elevate concentrazioni ioniche, la solubilità delle proteine tende invece a diminuire bruscamente per effetto della competizione di legame che si istaura per il solvente, portando all’aggregazione ed alla precipitazione delle molecole proteiche (effetto salting out ) (Miller, 1988). A differenza dell’estrazione con solventi organici, la metodica non prevede alcun rischio per l’operatore e permette una riduzione dei costi relativi al materiale di consumo.

C) Precipitazione e concentrazione del DNA totale La precipitazione con alcooli è il metodo più comunemente utilizzato per l’isolamento del DNA. In presenza di un sale monovalente, la precipitazione si realizza per aggiunta di una percentuale di alcool etilico o isopropanolo. Le soluzioni saline maggiormente utilizzate sono l’acetato di Sodio a pH 5.2 (a una concentrazione molare finale di 0.3), il cloruro di sodio o di potassio (a una concentrazione finale pari a 0.2M) e l’ammonio acetato (2-2,5M). Per l’induzione della precipitazione sono necessari da 2 a 2,5 volumi di alcool etilico rispetto al volume del campione e 2/3 volume di isopropanolo. La miscelazione delle fasi e la successiva centrifugazione a temperatura controllata determinano la formazione di un pellet di DNA generalmente ben visibile, omogeneo e compatto sul fondo della provetta. La fase di precipitazione è seguita da uno o più lavaggi con etanolo al 70% per la rimozione dei sali residui (Sun, 2009).

7.3.2.2 Tecniche Cromatografiche Cromatografia a scambio anionico Lo scambiatore di ioni è costituito da una matrice, che può essere una resina sintetica, una cellulosa o un destrano, la quale porta legati covalentemente dei gruppi in grado di ionizzarsi . Il principio si basa sull’interazione delle molecole di DNA cariche negativamente con particelle silicee caricate positivamente (Esser et al., 2006). In presenza di elevate concentrazioni di sali caotropici (idrocloruro e isotiocianato di guanidina) e a pH controllato (pH 6.5-7.5), le molecole di DNA interagiscono con matrice silicea attraverso la creazione di ponti idrogeno relativamente stabili, mentre tutte le altre molecole fluiscono dalla colonna (Melzak et al ., 1996; Berensmeier, 2006). L’eluizione degli acidi nucleici si ottiene quindi variando la forza ionica e il pH del sistema attraverso l’utilizzo di soluzioni tampone o acqua distillata. Cromatografia per affinità Le molecole di interesse sono separate in funzione della loro affinità per un gruppo chimico o una macromolecola immobilizzata sulla matrice inerte della colonna. Il principio di legame si basa sull’interazione specifica dell’acido nucleico con la molecola adsorbita su una matrice inerte e l’eluizione, anche in questo caso, avverrà variando le condizioni di pH del sistema (Tan & Yiap 2009).

7.3.2.3 Kit di ultima generazione: biglie magnetiche Alcuni metodi commerciali utilizzano particelle magnetiche che agiscono come fase solida di legame per l’acido nucleico in particolari condizioni e non necessitano quindi di alcun passaggio di centrifugazione e filtrazione. Infatti, dopo una fase iniziale di lisi, il campione è mescolato con una soluzione ad elevata concentrazione di sali caotropici, tamponata a pH basico e contenente le biglie magnetiche (ricoperte con particelle silicee). Alla miscela è applicato un campo magnetico così da ottenere la separazione delle biglie leganti l’acido nucleico dalla soluzione contenente tutti gli altri residui cellulari che possono essere allontanati direttamente per aspirazione. Le biglie sono sottoposte a una serie di lavaggi con tamponi contenenti una percentuale variabile di alcool etilico al fine di allontanare ulteriori contaminanti e sali residui. Il DNA è quindi eluito dalle biglie utilizzando tamponi a pH basico o acqua deionizzata microfiltrata sterile (Sun, 2004; Tan & Yiap 2009).

7.3.3 Analisi quali-quantitativa del DNA estratto La prima valutazione quali-quantitativa del DNA è generalmente effettuata attraverso la misurazione spettrometrica dell’assorbimento UV del campione a 230, 280 e 260 nm. Gli acidi nucleici sono in grado di assorbire luce nello spettro UV con l’assorbimento massimo λmax = 260 nm, grazie agli anelli eterociclici dei nucleotidi; tale valore è comunemente utilizzato per calcolarne la concentrazione in soluzione con l’applicazione dell’equazione di Beer-Lambert, secondo cui la radiazione assorbita è proporzionale alla concentrazione delle molecole e dal cammino ottico nel quale avviene l’assorbimento. Attraverso l’analisi spettrofotometrica sarà quindi possibile effettuare una valutazione qualitativa sul campione in studio attraverso l’osservazione diretta della curva di assorbimento e la misurazione dei rapporti A260/280 e A260/230. (Luebbenhusen, 2010). La presenza di residui proteici determina infatti la comparsa di un picco di assorbanza intorno a 280 nm mentre l’innalzamento dei valori e la comparsa di picchi d’assorbanza tra 220 e 230 nm può essere associato alla presenza di residui organici (fenoli, nucleotidi liberi) o peptidi a basso peso molecolare. Valori A260/280 compresi tra 1.8 e 2 e valori A260/230 maggiori uguali a 2 sono generalmente considerati indici di un DNA di ottima qualità.

A B

Fig 7.2: visualizzazione curva di assorbimento di un campione di DNA solubilizzato in H 2O deionizzata, lettura microspettrofotometro tipo Nanodrop ND1000. A) campione di ottima qualità, B) presenza picco di assorbimento a 230nm e di un allargamento della base della curva di assorbimento

Al fine di verificare l’integrità delle molecole di DNA estratte è possibile effettuare una corsa di DNA totale e stabilire un grading indicativo di frammentazione, attraverso l’osservazione della presenza/assenza dell’anello di DNA genomico (perfettamente visibile in un DNA non sottoposto ad alcuna frammentazione) poco al di sotto dei pozzetti di caricamento e la distribuzione dello smear prodotto dalle molecole di DNA durante la corsa elettroforetica (Georgiou & Papapostolou, 2006; Khasibatha et al. , 2006 ).

1000pb

500pb 250pb

L 1 2 3 4 5 6 Fig 7.3: Esempio pattern elettroforetico di alcuni campioni di DNA totale estratti da tessuto di pesce decongelato. Corsa su Gel d’Agarosio 0,8%; staining con GelRed 10000X (Biotium) . L: ladder 50-1200 pb;( Sharp MASS 50 Euroclone ); 1-2:DNA integro; 3-4-5-6: frammentazione parziale del DNA

7.3.4 PCR (Polymerase Chain Reaction)

La tecnica di PCR, che oggigiorno rappresenta lo strumento principe per numerose applicazioni in campo scientifico, si basa sull’utilizzo di un enzima, la Taq Polimerasi, in grado di catalizzare la reazione di amplificazione in vitro di una particolare sequenza nucleotidica, anche in presenza di una minima quantità di DNA stampo, a partire da brevi sequenze nucleotidiche (primer ) complementari alle due estremità della porzione target. La reazione si compone di tre fasi ripetute per un numero variabile di 30-45 cicli: denaturazione tra 90-95 °C che determina la separazione della doppia elica del DNA; riconoscimento e appaiamento (annealing ) dei primer alle sequenze complementari per l’innesco della reazione di polimerizzazione; allungamento delle sequenze oligonucleotidiche ad opera della Taq polimerasi per la sintesi del filamento complementare. Nella messa a punto del protocollo di PCR risiederà quindi nella scelta e disegno delle sequenze primer per l’innesco di reazione e successivamente nell’individuazione della temperatura ottimale per l’ annealing e il conseguente innesco della polimerizzazione. In funzione delle varie applicazioni possono essere maggiormente indicati primer specie-specifici, primer degenerati o primer universali.

Primer specie specifici sono progettati in zone ad elevato polimorfismo, in modo da garantire l’appaiamento solo al target di DNA selezionato in una data specie (Lockley and Barsley, 2000). Il disegno di primer specie specifici è alla base di una metodica analitica PCR multiplex, ampiamente utilizzata nel settore ittico per la messa a punto di metodiche rapide per la discriminazione di specie oggetto di sostituzione. L’utilizzo in un’unica reazione di PCR di coppie di primer specifiche consente l’analisi simultanea e la determinazione della presenza/assenza di più specie attraverso la semplice comparsa delle bande di interesse (Edwards & Gibbs; 1994). Uno dei limiti della metodica può essere rappresentato dalla difficoltà nell’individuazione di siti di annealing che permettano una risoluzione adeguata degli ampliconi (Bottero, Dalmasso; 2011). L’utilizzo simultaneo di numerose coppie di primer può risultare inoltre nella comparsa di cross-dimeri con la riduzione significativa della sensibilità e della performance di reazione (Markoulatos et al ., 2002). Tra le metodiche in PCR multiplex, si riportano studi per l’identificazione di filetti di sogliola e halibut (Cespedes et al ., 1999), l’identificazione di specie in filetti di “cernia” (Trotta et al ., 2005) e la discriminazione di specie ascrivibili alla denominazione commerciale di “cernia” dal pesce persico africano ( Lates niloticus ) (Asensio et al ., 2001); per la discriminazione tra numerose specie appartenenti all’ordine Carchariniformes (Clarke et al ., 2006; Magnussen

62 et al ., 2007; Caballero et al ., 2012); per l’identificazione della specie Xiphia gladius in prodotti lavorati. (Hisieh et al., 2004)

Alternativi ai primer specie-specifici, i primer universali sono disegnati in aree ampiamente conservate tra gruppi di specie anche filogeneticamente distanti, a monte e a valle di un frammento altamente variabile. (Carrera et al., 2000). Queste tipologie di oligonucleotidi sono spesso degenerati, ovvero primer la cui sequenza non è determinata in modo univoco: in corrispondenza di posizioni stabilite all’interno della sequenza si potranno avere da due a quattro basi alternative (Tab 7.1), che ridurranno la specificità e aumenteranno la probabilità di annealing del primer (Compton, 1990).

Codice Combinazione Nucleotidi corrispondenti N A/C/G/T B C/G/T D A/G/T H A/C/T V A/C/G K G/T M A/C R A/G S C/G W A/T Y C/T Tab7.1: Schema dei codici per la sintesi di primer degenerati

7.3.4.1 PCR Real Time

Nel caso della Real-Time PCR (Lee et al., 1993; Livak et al., 1995) è possibile monitorare l’andamento della reazione e l’accumulo di prodotti di PCR durante il suo svolgimento, attraverso l’impiego di marcatori fluorescenti in grado di interagire con gli acidi nucleici. La fluorescenza emessa è misurata in tempo reale da un apposito rivelatore e convertita in un grafico di amplificazione che riflette l’andamento cinetico della reazione. La reazione di n amplificazione può essere rappresentata con la seguente formula Pn = P 0 x (1+E) , dove P n corrisponde alla quantità di prodotto di PCR a termine della reazione, P0 quantità del templato iniziale, n il numero di cicli ed E l’incremento relativo di amplificato per ciclo di PCR (Raeymaekers, 2000). In un’amplificazioneideale, senza alcun vincolo di reazione in cui l’incremento relativo E è pari al massimo (E=1), la quantità finale di prodotto di PCR può essere espressa con la

63 formula semplificata P= (2) n T, dove n corrisponde al numero di cicli applicati e T al numero di molecole iniziali del templato target. Il grafico visibile a termine della reazione real-time è costituito da una linea di base iniziale che costituisce il background di reazione, una fase di crescita esponenziale e una fase di plateau a termine della reazione. Per l’interpretazione del grafico si definisce una linea soglia (“ threshold ”) di reazione, che interseca tutte le curve di amplificazione ad un valore di fluorescenza arbitrario, generalmente corrispondente a 10 volte la deviazione standard della fluorescenza background. Il punto di intersezione tra la retta threshold e la curva di amplificazione prende il nome di ciclo Threshold (Ct), corrispondente al numero di cicli da cui prenderà avvio la fase esponenziale di reazione (Fig xx). Il numero di cicli necessari affinché un campione raggiunga il suo Ct è inversamente proporzionale al numero di copie target presenti nel templato iniziale. La quantificazione può essere effettuata in modo assoluto o relativo. Per la quantificazione assoluta (applicata ad esempio nella titolazione virale di un campione) è necessario costruire una retta di taratura di riferimento riportando sull’asse delle ascisse quantità note dei campioni di riferimento e sull’asse delle ordinate i valori di Ct corrispondenti. La quantificazione dei campioni ignoti sarà effettuata quindi per interpolazione del valore di Ct ottenuto nella retta di riferimento.

Fig 7.5: rappresentazione schematica di una curva di amplificazione

Per la quantificazione dei prodotti di PCR possono essere applicati reagenti fluorofori con funzione intercalante (Bromuro d’etidio Sybr Green® I, Syto) o sonde a ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti (sonde TaqMan, sonde FRET : Fluorescent Resonance Energy Transfer; Molecular beacons) e sonde associate ai primer d’innesco (Scorpion primers ) (Gudnason et al., 2007, Rasmussen, 2008). Il SYBR® Green I è un colorante fluorescente con caratteristiche di legame simili all’etidio bromuro che, intercalandosi nella doppia elica, incrementa di circa cento volte la sua fluorescenza, generando quindi un segnale visibile dal rilevatore e proporzionale al numero di copie presenti (Zipper et al., 2004). A termine della PCR è condotta un’analisi della curva di dissociazione che consiste in un graduale innalzamento della temperatura, a partire da una temperatura prefissata (ad esempio 60°C), fino al raggiungimento della temperatura di denaturazione del DNA (90-95°C). Lo strumento rileva il segnale di fluorescenza per tutta la durata dell’analisi: all’aumentare della temperatura il SYBR® Green si separa lentamente dalle molecole di DNA, ma al momento della denaturazione dei due filamenti si ha un drastico calo della fluorescenza. Un software apposito trasforma i dati, relativi alla curva di melting, nella derivata prima negativa della funzione descritta dal segnale: ne risulta un grafico che mostrerà un picco nel punto di massima pendenza della curva di melting, e tale picco sarà in corrispondenza della temperatura di melting di quello specifico amplicone.

Le sonde a ibridazione possono costituire una valida alternativa all’utilizzo degli intercalanti aspecifici. Uno dei saggi più diffusi per PCR real-time e utilizzati anche in studi di identificazione di specie è il sistema “TaqMan”. Tale sistema si basa sull’utilizzo di una sonda contenete due fluorocromi: il primo (reporter ) legato all’estremità 5’ dell’oligonucleotide e il secondo (quencer ) all’estremità 3’. Il Reporter è un fluorocromo ad elevata energia, responsabile dell’emissione della fluorescenza, mentre il Quencer ha bassa energia e agisce come inattivatore della fluorescenza del reporter. Durante la fase di annealing si avrà l’appaiamento dei primer e l’ibridazione della sonda sul DNA stampo; la Taq polimerasi, che è dotata di attività esonucleasica, disgrega la sonda durante la fase di allungamento e determina l’allontanamento del reporter dal quencer , consentendo di emettere fluorescenza. Anche in questo caso, l’aumento di fluorescenza del reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati. Inoltre, la possibilità di utilizzare diversi tipi di fluorofori per la marcature di sonde diverse consente di rilevare contemporaneamente più di una sequenza

65 target in un’unica reazione (reazione in multiplex). Studi di identificazione applicando questo tipo di approccio sono stati effettuati per l’identificazione simultanea di merluzzo (Gadus morhua) , Eglefino e melù (Taylor et al., 2002); due specie di tonno ( Lopez & Pardo, 2005); la discriminazione di uova di pesce (Bayha et al., 2008).

7.3.5 Metodiche analitiche POST-PCR

Ad eccezione dell’utilizzo della PCR real-time, a termine della reazione di PCR i prodotti di amplificazione non sono di per sé informativi e devono essere ulteriormente analizzati al fine di verificare la presenza effettiva del target di interesse. A questo scopo sono disponibili numerosi strumenti analitici. L’ interpretazione di una PCR specie specifica o multiplex può essere effettuata attraverso una corsa elettroforetica su gel d’agarosio o poliacrilammide a concentrazione più o meno elevata, in funzione della lunghezza e della distanza delle sequenze specie specifiche. Spesso, però, la prima amplificazione costituisce lo step preliminare di analisi più complesse.

7.3.5.1 FINS e analisi filogenetica

L’acronimo FINS corrisponde al termine inglese Forensically Informative Nucleotide Sequencing, una procedura descritta per la prima volta da Bartlett e Davidson nel 1992. L’identificazione di specie avviene in seguito all’amplificazione di un target genico specifico con primer universali più o meno degenerati e disegnati in zone filogeneticamente conservate del DNA genomico o mitocondriale. Alla prima amplificazione consegue il sequenziamento del prodotto di PCR ottenuto utilizzando metodiche tipo Sanger, Next generation o Pyrosequencing ; la sequenze ottenute sono confrontate attraverso l’utilizzo di software di l’allineamento multiplo, fra i più noti si annoverano Clustal X e Clustal W (Thompson & Higgins 1994; Thompson & Higgins 1997) per la costruzione di un’analisi filogenetica. Attraverso la procedura d’allineamento sono visualizzate mutazioni puntiformi, inserzioni o delezioni geniche che insistono all’interno del target selezionato. Prima di procedere con la creazione dell’albero filogenetico, al fine di inserire tutte le possibili sostituzioni sui siti di mutazione individuati (multiple hits) si costruisce una matrice di probabilità delle sostituzioni attraverso l’applicazione di modelli matematici tra cui i più noti sono: Jukes & Cantor, Kimura, Tamura (Jukes & Cantor, 1969; Kimura 1980, Tamura 1992; Tamura & nei 1993). A questo punto è possibile procedere alla costruzione degli alberi

66 filogenetici molecolari applicando due tipologie di approccio distinte: il criterio di clustering o il criterio di ottimizzazione. Gli algoritmi di clustering sono i maggiormente applicati ai fini dell’identificazione di specie ed in particolar modo sono applicati l’ UPGMA ( Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) e il Neighbor-Joining . (Terol et al ., 2002; Jerome et al., 2003; Espineira et al ., 2010; Sarri et al., 2014). Il metodo UPGMA si basa su un algoritmo iterativo che raggruppa due unità tassonomiche o gruppi di unità partendo da quelle che inizialmente appaiono come le più simili in relazione alle matrici pairwise prodotte nell’allineamento preliminare. L'algoritmo itera procedendo all'identificazione della coppia di sequenze che ha distanza minima, tale coppia costituisce un cluster che, allo step successivo, sarà considerato come una singola unità con la quale confrontare le altre sequenze fino all’esaurimento della popolazione campionaria e all’individuazione di un progenitore comune. Il metodo Neighbor-Joining (NJ) utilizza un algoritmo di clustering iterativo in cui, come accade nell’UPGMA, ad ogni iterazione vengono determinate le relazioni tra coppie di singole unità. A differenza, però, del precedente, tale metodo parte da un albero senza radice e con una topologia a stella, in cui inizialmente non vi è alcuna relazione esplicita tra le unità (Swofford & Sullivan 2003). L’attendibilità di un’analisi filogenetica può essere valutata attreverso l’applicazione di test che valutano la significatività statistica dei vari nodi che compongono l’albero filogenetico prodotto. La tecnica più utilizzata a questo scopo è il bootstrapping ( Felsenstein, 1985) o ricampionamento casuale dei siti del multi allineamento in studio analizzato con gli stessi metodi utilizzati per il multiallineamento reale. Il sistema produce allineamenti simulati e per ciascuno di essi un albero filogenetico così da avere, a termine del processo, un numero di alberi pari al numero di multiallineamenti simulati effettuati. A termine parallelamente all’albero reale sarà prodotto un albero consenso riportante per ciascun nodo la percentuale (Van Der Peer, 2009) di alberi simulati in cui è stato riprodotto lo stesso nodo. La percentuale così calcolata o valore di bootstrap corrisponde alla significatività statistica del nodo considerato. La metodica FINS è stata applicata con successo in studi sperimentali per l’identificazione di prodotti a base di sardina (Jerome et al., 2008), specie di squalo (Greig et al., 2005; Blanco et al ., 2008), cefalopodi (Chapela et al., 2003, Espineira et al., 2010), gadidi (Calo Mata et al., 2003) . Pur essendo considerato ad oggi il metodo più affidabile per ottenere un’identificazione di specie accurata, la metodica FINS può risultare lunga e costosa e difficilmente applicabile per le analisi routinarie finalizzate alla rintracciabilità e al controllo

67 di qualità, soprattutto per alimenti deperibili come i prodotti della pesca (Lockley and Barsley, 2000; Chapela et al., 2002; Dooley et al., 2005) e in prodotti lavorati contenenti più specie. (Lenstra, 2003; Bottero & Dalmasso, 2011).

7.3.5.2 DNA Barcoding

Il DNA barcoding, una metodica molecolare proposta per la prima volta da Hebert e collaboratori, sfrutta la variabilità di un marcatore molecolare per l'identificazione di identità biologiche attraverso l’amplificazione e il sequenziamento di un frammento genico target (barcode ) proveniente da un campione ignoto e la successiva comparazione della sequenza ottenuta a un database preesistente (Hebert et al ., 2003). Il Barcode genico (frammento genico selezionato) ideale dovrebbe possedere alcuni caratteristiche fondamentali tra cui:

-l’universalità, ovvero la presenza di porzioni sufficientemente conservate da permettere l’amplificazione con una sola coppia di primer di un’amplissima gamma di taxa anche filogeneticamente distanti, con possibilità di standardizzare la metodica e produrre database di riferimento uniformi ( Hebert et al., 2003) ;

- una variabilità interspecifica superiore a quella intraspecifica ovvero l’esistenza di una distanza definita tra le distribuzioni della variabilità inter e intraspecifica ( Barcoding gap ) (Goldstein et al., 2000; Meyer & Paulay, 2005; Wiemers & Fielders, 2005 ); - un’elevata risoluzione, divergenza anche tra specie vicine in modo tale da consentire un’identificazione specie-specifica univoca. Lo studio molecolare è efficiente a condizione che possa essere effettuato il confronto tra l’esemplare sconosciuto oggetto dello studio ed esemplari di riferimento ben descritto dal punto di vista tassonomico, morfologico ed ecologico (Dupont et al. , 2007), attraverso l’applicazione di algoritmi per l’analisi delle distanze o la divergenza delle sequenze. Un elemento imprescindibile per l’applicazione della metodica, quindi, risiede nella creazione e controllo di database accreditati contenenti sequenze di riferimento per il maggior numero di specie possibile relativamente al barcode selezionato. A tale scopo, negli anni sono sorti consorzi dedicati, tra cui il Barcoding of Life (BOLD), che si pone l’obiettivo di raccogliere le sequenze del gene della citocromo-ossidasi subunità I (COI), eletto a “target ufficiale”, in quanto particolarmente promettente per l’identificazione delle specie animali. La tecnica standardizzata a livello internazionale prevede l’amplificazione di un frammento di circa 650 pb posto all’estremità 5’ del gene COI (Hebert et al., 2003) ed è stata applicata

68 con successo per l’identificazione di numerosi gruppi tassonomici, tra cui numerosi uccelli del Nord America (Hebert et al., 2004; Hajibabaei et al., 2006), pesci (Ward et al., 2005, Wong et al., 2008, Wong et al, 2009; Holmes et al., 2009), le falene (Hebert et al., 2004b), i crostacei (Lefebure et al., 2006). Uno degli algoritmi applicabili per l’analisi barcode e il BLASTn ( Basic Local Alignment Search Tool ) per la ricerca di similarità accedendo alle sequenze di riferimento depositate sulla piattaforma GenBank NCBI (http://blast.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) o uno strumento identificativo contenuto all’interno del portale BOLD, l’IDs ( Identification System ).

7.3.5.3 RFLP

Il termine RFLP è l’acronimo inglese della metodica analitica basata sul Polimorfismo della lunghezza di Frammenti di Restrizione ( Restriction Fragment Length Polymorphism ).

Gli enzimi utilizzati per l’ottenimento dei frammenti appartengono alla classe delle endonucleasi, enzimi in grado di produrre un taglio all’interno su entrambi i filamenti di una molecola di DNA lineare o circolare, a seguito del riconoscimento di brevi (4-6 pb) sequenze nucleotidiche palindrome. Gli enzimi di restrizione sono classificati in tre categorie distinte in funzione della distanza del sito di taglio dal sito di riconoscimento dell’enzima sulla sequenza nucleotidica:

Tipo I-III: l’enzima taglia la sequenza nucleotidica ad una distanza di circa 1000 paia basi (Tipo I) o 25 pb (III) dal sito di riconoscimento; gli enzimi appartenenti alle due classi sono generalmente costituiti da più subunità e la reazione di taglio avviene solo in presenza di molecole di ATP disponibili.

Tipo II: il taglio viene prodotto all’interno della sequenza di riconoscimento. La reazione non necessita di ATP e può generare due estremità piatte o coesive “ sticky ends ” in relazione al fatto che il taglio sia prodotto al centro della sequenza di riconoscimento coinvolgendo entrambi i filamenti oppure separatamente in corrispondenza della fine del sito di riconoscimento su ciascuno dei due filamenti.

A termine della digestione, i prodotti della frammentazione possono essere separati e visualizzati mediante una corsa elettroforetica su gel d’agarosio o poliacrilammide in presenza di etidio bromuro o altri intercalanti fluorescenti ai raggi ultravioletti. L’esecuzione

69 di una metodica finalizzata all’identificazione di specie tramite RFLP prevede una prima reazione di PCR per la selezione del/dei frammento/i target sui quali verrà eseguita l’analisi di restrizione successiva. I principali svantaggi e i limiti d’impiego di tale metodica risiedono nella comparsa occasionale di variazioni intraspecifiche con la scomparsa o la creazione di siti di restrizione aggiuntivi ed il costo elevato degli enzimi impiegati nell’analisi di restrizione. Uno dei geni più frequentemente utilizzati per questa tipologia di approccio analitico è il cytb , in relazione al suo livello di variabilità intraspecifica sensibilmente superiore rispetto a quella interspecifica (Sanjuan et al. , 2002).

CAPITOLO 8: OBIETTIVI DELL’ATTIVITA’ DI RICERCA

L'attualità del problema delle frodi nel comparto ittico è testimoniata dalle numerose segnalazioni relative a fenomeni di sostituzione di specie in prodotti freschi, decongelati, conservati, riportate nel corso degli ultimi anni (Miller & Mariani 2010; Cawthorn et al., 2012; Huxley-Jones et al., 2012; Helyar et al., 2014 ). L’aumento di tali fenomeni è stato inoltre confermato da numerosi studi patrocinati e promossi a livello internazionale per la tutela dell’ecosistema marino da organizzazioni di settore per il controllo dei prodotti ittici destinati alla grande distribuzione (http://oceana.org/sites/default/files/reports/National_Seafood_Fraud_Testing_Results_FI NAL.pdf; http://oceana.org/our-campaigns/seafood_fraud/campaign).

Le metodiche analitiche basate sull’analisi del profilo genetico sono ad oggi quelle maggiormente utilizzate per identificare le specie che costituiscono i prodotti alimentari, in virtù del maggior contenuto informativo e della maggior resistenza delle molecole di DNA a fenomeni di degradazione rispetto alle proteine (Rasmussen & Morrisey 2008). Esse rappresentano un valido sistema per contrastare le frodi, in quanto permettono di recuperare sufficienti informazioni “genetiche” da prodotto sia fresco che conservato e, pertanto, possono offrire un valido strumento per il controllo della tracciabilità dei prodotti di importazione. In particolare, per quanto riguarda il comparto ittico, settore in cui si inserisce lo studio relativo a questo corso di dottorato, è importante sottolineare l’impatto dei prodotti provenienti dalla Cina, la quale detiene oltre il 38% del fatturato di produzione ed esportazione a livello mondiale (Fish2030; http://www.fao.org/docrep/019/i3640e/i3640e.pdf), oltre a costituire uno degli anelli fondamentali della catena di lavorazione del pescato ed esportazione di prodotti sfilettati e/o ricomposti (Clarke 2009).

In quest’ottica, i progetti seguiti nel triennio hanno avuto due obiettivi distinti:

- il primo ha riguardato lo sviluppo di tecniche di estrazione del DNA da tessuto di pesce fresco/decongelato, finalizzate ad ottimizzare tempo d’esecuzione e costi operativi, attraverso la standardizzazione della prima fase di omogeneizzazione e lisi del campione ed attraverso l’individuazione di protocolli sperimentali in grado di apportare un miglioramento delle caratteristiche quali-quantitative dell’acido nucleico estratto;

- il secondo è stato quello di sviluppare strumenti analitici per contrastare fenomeni di contraffazione di prodotti d’importazione asiatica e differenziare specie di provenienza cinese da specie nostrane o atlantiche di maggior valore commerciale, attraverso l’applicazione di studi filogenetici e l’analisi dei polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (PCR-RFLP) o lo sviluppo e la successiva applicazione di metodiche biomolecolari in PCR classica e real-time PCR.

Nello specifico, sono stati sviluppati:

- un progetto per la messa a punto di una metodica rapida di estrazione del DNA attraverso l’applicazione della tecnica di bead-milling nella fase di omogeneizzazione e lisi del tessuto e la successiva valutazione dell’efficienza del metodo per comparazione con un protocollo salting out classico e con un kit commerciale di tipo cromatografico;

- due progetti per l’identificazione delle sette specie appartenenti al genere Lophius , il primo finalizzato allo sviluppo di un’analisi in PCR-RFLP e il secondo all’allestimento di una PCR specie specifica in multiplex endpoint e real-time;

-un progetto finalizzato all’allestimento di una PCR multiplex end point e real-time per la discriminazione specie specifica di prodotti ittici nostrani, Bianchetto (novellame di Sardina pilchardus ), Rossetto ( Aphia minuta ), di notevole pregio commerciale e soggetti a restrizioni di pesca, e Acciuga, da prodotti d’acqua dolce di importazione asiatica, appartenenti alla ordine Osmeriformes, famiglia Salangidae, di minor pregio commerciale ( Neosalanx tangkahkeii taihuensis ), conosciuti con il nome di “Pesce Ghiaccio”. La metodica messa a punto con campioni morfologicamente identificati è stata quindi utilizzata per l’analisi del prodotto crudo, fresco e congelato, e prodotti sottoposti a varie tipologie di lavorazione, al fine di validare l’efficacia della metodica anche in presenza di DNA parzialmente degradato;

- un progetto sull’analisi della composizione di alcuni mangimi a base di pesce destinati ad animali da compagnia, prodotti e confezionati in Paesi Asiatici per brand commerciali distinte, al fine di verificare la conformità delle diciture “bianchetto”, “tonno” e “sgombro”, riportate in etichetta. A tal fine sui campioni di DNA estratti con metodica salting out (Armani et al., 2014) da ciascun prodotto commerciale in studio è stata applicata l’analisi molecolare BLAST sul target mitocondriale 16SrRNA . Lo studio è stato pensato alla luce di

72 quanto specificato dai Regg CE N. 767/2009 e CE 1169/2011, per i quali tutti i petfood immessi sul mercato devono sottostare a specifiche norme in termini di tracciabilità ed etichettatura, analogamente a quanto previsto per i prodotti alimentari destinati al consumo umano. Anche per tali prodotti sono vietate diciture che potrebbero indurre in errore l’acquirente all’origine delle materie prime di tali tipologie alimentari;

- Un progetto di caratterizzazione molecolare di tipo filogenetico su prodotti a base di medusa in salamoia, tramite amplificazione e sequenziamento del gene mitocondriale COI , utilizzato a livello internazionale per la creazione di banche dati molecolari di classificazione degli organismi viventi ( Barcode Of Life ). Lo scopo è stato quello di contribuire alla corretta tracciabilità del prodotto ittico correntemente venduto in esercizi commerciali etnici diffusi sul territorio nazionale.

BIBLIOGRAFIA PARTE INTRODUTTIVA

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234. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., & Vitzthum, F. (2004). Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic acids research , 32(12), e103-e103.

PARTE SPERIMENTALE

CAPITOLO 9: PRESENTAZIONE PROGETTI RELATIVI ALL’ATTIVITÀ DI STUDIO

Nella sezione sono riportati individualmente i progetti oggetto dell’attività di Dottorato con una sintesi del lavoro svolto. Copie conformi dei singoli manoscritti oggetto di pubblicazione sono stati inseriti in appendice previa autorizzazione Springer Science, Springer Media e Elsevier per gli scopi dell’elaborato. La bibliografia della parte sperimentale è riportata singolarmente in ciascun manoscritto.

9.1 SVILUPPO DI UNA METODICA RAPIDA PER L’ESTRAZIONE DEL DNA DA TESSUTO MUSCOLARE DI PESCE MEDIANTE L’UTILIZZO DI BEADS METALLICHE

Armani A., Castigliego L., Tinacci L., Titarenko E., Xiong X. (2014) Development of a simple and cost-effective bead-milling method for DNA extraction from fish muscles Food Analytical Methods 7(4): 946-955

Le principali metodiche d’estrazione del DNA disponibili sono generalmente ascrivibili a due tipologie d’approccio distinte: 1) allontanamento di molecole proteiche e acidi grassi attraverso l’utilizzo di solventi organici e del fenomeno salting out seguiti da una fase di concentrazione del DNA per precipitazione con alcoli (etanolo, isopropanolo) 2) legame selettivo delle molecole di DNA per cromatografia su matrici silicee o supporti magnetici (vedi Par 7.3 ). In entrambi gli approcci l’estrazione del DNA è preceduta da una fase di lisi cellulare per la liberazione degli acidi nucleici in soluzione acquosa. L’iniziale omogeneizzazione e lisi cellulare costituiscono il passaggio preliminare e fondamentale dell’intera procedura estrattiva e sono in grado di condizionarne l’esito, sia in termini di qualità che di resa in DNA totale estratto (Burden, 2012). Le tecniche di omogeneizzazione più comunemente utilizzate, che prevedono l’utilizzo di mortai, forbici, lame ( cutter e blender), sonicatori, pur costituendo un ottimo mezzo per l’omogeneizzazione di tessuti anche complessi, sono difficilmente standardizzabili, richiedono un training specifico preliminare all’utilizzo e possono essere maggiormente esposte a fenomeni di contaminazione (Verollet 2008). In quest’ottica i sistemi di omogeneizzazione attraverso l’utilizzo di beads silicee o d’acciaio possono costituire una valida alternativa e la tecnica di bead-milling e sono già stati applicati con successo in numerosi protocolli di estrazione del DNA da matrici unicellulari, da suolo e da tessuti di origine vegetale e animale (artropodi e insetti). Il presente studio ha avuto lo scopo di individuare una metodica alternativa per l’estrazione del DNA basata sulla procedura bead-milling con sfere metalliche, senza il ricorso alla digestione enzimatica con proteinasi. Il nuovo metodo è stato confrontato sia con un protocollo salting out , sviluppato all’interno del laboratorio in uno studio precedente (Armani et al., 2011), sia con il kit commerciale Eurogold Tissue DNA minikit (Euroclone SpA).

Per lo studio sono state utilizzati esemplari freschi di 38 specie ittiche selezionate in funzione del tenore lipidico e suddivise in quattro categorie, secondo la classificazione proposta da Ackman 1990. Inoltre, allo scopo di valutare l’efficacia della metodica estrattiva anche su tessuti provenienti da collezioni museali o da enti di ricerca, solitamente preservati in etanolo, nello studio sono stati inclusi campioni di tessuto delle specie soprariportate pretrattati e stoccati in soluzioni di etanolo al 70% per almeno 30 gg. Per il setting della fase di omogeneizzazione sono state valutate biglie silicee di diametro crescente (0.1 e 0.5 mm) e biglie d’acciaio con diametro di 2.5 mm, variando i rapporti tra tessuto e peso/numero di biglie utilizzate. La lisi tissutale è stata effettuata in agitazione continua su T-shaker (Euroclone SpA) per 60 minuti a 60°C senza l’aggiunta di proteinasi K. Il prodotto della fase di omogeneizzazione è stato quindi estratto con metodica salting out secondo Armani et al., (2012). Sono state selezionate le beads d’acciaio in quanto già nei test preliminari hanno mostrato un effetto di omogeneizzazione e rottura del tessuto maggiore e una resa in DNA sensibilmente superiore rispetto alle biglie silicee. Per l’ottimizzazione del protocollo sono stati valutati: l’applicazione di due tempi di incubazione (30 e 60 minuti), l’introduzione di un doppio step di precipitazione della componente proteica e l’utilizzo di pesi decrescenti di tessuto iniziale (da 200 a 10 mg) con la riduzione proporzionale del numero di beads utilizzate (da 7 a 3 beads per campione di tessuto). L’efficienza estrattiva del protocollo finale è stata valutata in comparazione con il metodo salting-out originale e il kit commerciale Tissue DNA Mini kit Euroclone. Per il test di comparazione sono stati valutati parametri relativi a: qualità spettrometrica e resa, attravesro la misurazione con spettrofotometro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, USA) del DNA estratto, il livello di integrità attraverso l’allestimento di una corsa elettroforetica su gel d’agarosio 1% e amplificabilità del DNA in PCR endpoint e Real- time. La valutazione dell’amplificabilità è stata effettuata su tre specie per ogni categoria lipidica, per un totale di 12 specie tra quelle incluse nello studio e 36 campioni (tre individui per ogni specie). La PCR end point è stata allestita su due target mitocondriali 16SrRNA e COI attraverso l’utilizzo di primer universali disegnati da Palumbi (1996) e Handy et al., (2011). Le immagini dei prodotti di PCR visualizzati al termine della corsa elettroforetica sono stati acquisite ed elaborate con software ImageJ 1.47 (NIH, Bethesda, USA), al fine di produrre una stima normalizzata dell’intensità di amplificazione.

La PCR real-time è stata allestita su un frammento corto del target mitocondriale 16S rRNA , attraverso l’utilizzo di una coppia di primer disegnata in uno studio precedente (vedi Par. 9.2.1) andando a registrare e valutare il take-off di amplificazione di ciascun campione. Dai risultati e la valutazione statistica dei parametri considerati è emerso che, sebbene il metodo salting out rimanga un protocollo più efficiente in termini di purezza, la procedura basata sul bead-milling può essere considerata una valida alternativa, soprattutto in virtù delle ridotte esigenze in termini di costi e manodopera e l’elevato potenziale di standardizzazione della procedura analitica.

CAPITOLO 9.2: SVILUPPO DI METODICHE MOLECOLARI PER L’IDENTIFICAZIONE DELLE SETTE SPECIE APPARTENENTI AL GENERE LOPHIUS

La famiglia Lophidae, comunemente nota a livello internazionale con i termini inglesi Monkfish, Goosefish o Anglerfish, è costituita da quattro generi distinti: Sladenia, Lophiodes, Lophiomus e Lophius, a distribuzione cosmopolita (Oceano Atlantico settentrionale e Meridionale, Mar Mediterraneo, Oceano Indiano e Pacifico) (Farina et al ., 2008). Il genere Lophius, di maggior pregio commerciale a livello internazionale, è costituito da sette specie distinte ciascuna delle quali presenta una distribuzione geografica caratteristica ed è comunemente posto in vendita con la denominazione comune di “Rospo o Rana Pescatrice”. Eccezion fatta per la specie Lophius vaillanti , che non ha interesse di mercato, a ciascuna specie è associata una denominazione commerciale specifica (Decreto MIPAAF 31 Gennaio 2008 e successive modifiche): rospo o rana pescatrice ( L. budegassa e L. piscatorius ); rana pescatrice sudafricana ( L. vomerinus ); rana pescatrice americana ( L. americanus ); rana pescatrice atlantica ( L. gastrophysus ), rana pescatrice orientale ( L. litulon ). Tale distinzione è nata in relazione alle differenze organolettiche e merceologiche tra le specie che si riflettono direttamente sul valore commerciale attribuito sul mercato, con notevoli variazioni di prezzo. Considerata a tutt’oggi un prodotto ittico di elevato valore commerciale, nonostante la morfologia e la texture peculiari, può essere esposta a frode per sostituzione, in relazione soprattutto alla tipologia di presentazione sul banco di vendita (esemplare decapitato, privo di pelle, in trancio/filetto o cubettato), sia intragenere che con specie filogeneticamente distanti (Espineira et al., 2008). La discriminazione morfologica in tal caso non sarà più possibile per effetto della rimozione di parametri discriminanti (Fig 9.1) sono rimossi. Con l’aumento del grado di lavorazione aumenta anche la probabilità della sostituzione di specie con prodotti morfologicamente simili, quali ad esempio gallinella ( Chelidonichthys lucerna ) e pesce prete ( Uranoscopus scaber ) (Palese; 1992), alcune specie normalmente vendute in tranci e che possono ricordare la morfologia in sezione della rana pescatrice ( Squaliformes , Carcharinidae ) (Vicari et al., 2001; Espineira et al., 2008) o specie tossiche appartenenti alla famiglia Tetraodontidae e Diodontidae (vedi Par 3.1.5 ).

Fig 9.1: Valutazione macroscopica di alcuni parametri morfologici discriminanti: A) illicio, modificazione del primo raggio della pinna dorsale di forma e lunghezza specie specifiche; B) colore della cavità peritoneale, pigmentata, parzialmente pigmentata o incolore .

Negli ultimi anni, sono stati proposti protocolli in PCR-RFLP su frammenti del gene 16srRNA e cytb e COI mitocondriali per la discriminazione di due (Vicari et al., 2001; Sanjuan et al, 2002) o tutte le specie appartenenti al genere (Espineira et al., 2008). In linea con quanto riportato in letteratura, in considerazione del notevole “ gap commerciale” tra le specie L. piscatorius e L. budegassa e le altre specie d’importazione e in relazione all’elevata probabilità dell’occorrenza di fenomeni di sostituzione di specie per prodotti decapitati e filettati, il nostro studio è stato rivolto all’individuazione di metodiche discriminanti per le sette specie appartenenti al genere Lophius , sia all’interno del genere che soprattutto da prodotti ittici filogeneticamente distanti, ma morfologicamente simili e potenzialmente sostituibili a scopi fraudolenti. I due progetti sviluppati nell’arco dell’attività di studio hanno portato allo sviluppo di un protocollo PCR-RFLP su un frammento di 566pb del cytb mitocondriale e di un protocollo di discriminazione in PCR multiplex end-point e Real-Time su un’altra porzione dello stesso gene. In entrambi gli studi, per la selezione dei target di studio, sono state considerate tutte le specie appartenenti al genere Lophius e due specie appartenenti alla famiglia Lophidae ( Lophiomus setigerus, Lophiodes caulinaris ), che dispongono già di una denominazione ufficiale e sono particolarmente diffuse sul mercato asiatico. Gli elementi innovativi rispetto agli studi precedenti sono le caratteristiche relative alla rapidità e ai costi contenuti, che permettono un’applicazione routinaria dei metodi

99 sviluppati per il controllo della qualità e dell’etichettatura dei prodotti commerciali. Tali metodiche sono state quindi utilizzate per effettuare un’indagine di mercato attraverso il campionamento casuale di prodotti in tranci e filettati, direttamente acquistabili presso la piccola e grande distribuzione, per la verifica della presenza di non conformità relative all’etichettatura. Nella selezione dei campioni per entrambi gli studi sono state considerate tutte le specie appartenenti al genere Lophius e due specie appartenenti alla famiglia Lophidae, che dispongono già di una denominazione ufficiale nell’ambito dell’UE ( Lophiodes caulinaris ) e sono diffuse sul mercato asiatico ( Lophiomus setigerus ). Per tutte le specie sono stati reperiti esemplari interi o campioni di tessuto provenienti de esemplari morfologicamente identificati. Infine, sulla base delle somiglianze macroscopiche dei filetti e dei tranci ottenibili dal sezionamento dei pesci interi, sono stati inclusi nello studio esemplari di 21 specie filogeneticamente più distanti (Tab 9.1) Ordine Famiglia Denominazione Denominazione commerciale scientifica 1 Squaliformes Lamnidae Isurus oxyrhincus SMERIGLIO 2 Carcharinidae Prionace glauca VERDESCA 3 Triakidae Mustelus manazo PALOMBO 4 Gadiformes Merluccidae Merluccius productus NASELLO 5 Perciformes Bramidae Brama brama PESCE CASTAGNA 6 Cichlidae Oreochromis niloticus TILAPIA 7 Haemulidae Plectorhincus PESCE BURRO mediterraneus 8 Latidae Lates niloticus PESCE PERSICO AFRICANO 9 Lutjanidae Lutjanus sp. LUCIANO 10 Mugilidae Liza aurata CEFALO 11 Pomatomidae Pomatomus saltatrix PESCE SERRA 12 Serranidae Epinephelus costae CERNIA DORATA 13 Uranoscopidae Uranoscopus scaber PESCE PRETE 14 Scorpaeniformes Scorpaenidae Scorpaena scrofa SCORFANO 15 Triglidae Chelidonichthys lucerna GALLINELLA 16 Siluriformes Pangasiidae Pangasianodon PANGASIO hypophthalmus 17 Zeiformes Zeidae Zeus faber PESCE S.PIETRO 18 Pleuronectiformes Pleuronectidae Atheresthes stomias PASSERA DEL PACIFICO 19 Reinhardtius HALIBUT DELLA hippoglossoides GROENLANDIA 20 Soleidae Solea solea SOGLIOLA 21 Scophtalmidae Scophtalmus maxmus ROMBO CHIODATO Tab 9.1: Elenco delle specie non appartenenti alla famiglia Lophidae incluse negli studi Per ciascuna specie di riferimento sono state ottenute sequenze di riferimento del gene Cytb , selezionato come target per il metodo. Tali sequenze, successivamente depositate su Gen Bank, sono state utilizzate in entrambi gli studi in fase di progettazione dei primers.

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9.2.1 Sviluppo di una metodica RFLP per la discriminazione diretta delle sette specie di Lophius

Armani, A. , Castigliego, L. , Tinacci, L., Gandini G., Gianfaldoni D., Guidi A. (2012) A rapid PCR-RFLP method for the identification of Lophius species. European Food Research and Technology 235(2): 253-263 (MANOSCRITTO 2 in APPENDICE)

L’allineamento delle sequenze ottenute e delle sequenze già presenti su GenBank per i generi appartenenti alla famiglia Lophidae ha permesso di individuare due regioni interne con un buon grado di omologia all’interno del solo genere Lophius , sulle quali è stata progettata una coppia di primer genere specifici LOP1FOR/LOP6 REV 5’per l’amplificazione di un frammento genico di 566pb, selezionato come target per la successiva analisi di restrizione. Per verificare la specificità di genere dei primer individuati sono stati effettuati test di amplificazione sui campioni di DNA estratto dagli esemplari identificati e su campioni di DNA provenienti dalle 21 specie ittiche sopraelencate. Dalle sequenze di riferimento, precedentemente allineate per il disegno dei primer genere specifici, è stato individuato e isolato il frammento LOP1-6 sul quale è stata effettuata un’analisi di restrizione virtuale con il software REBsite (http://tools.neb.com/REBsites/index.php ), al fine di individuare l’enzima di restrizione in grado di produrre pattern specie specifici all’interno del genere Lophius e dei generi correlati appartenenti alla famiglia Lophida e. L’analisi si è conclusa con la selezione di BfaI, in quanto in grado di produrre mappe di restrizione uniche. L’applicazione della metodica sul DNA delle specie di riferimento, ha confermato i risultati ottenuti in analisi virtuale, ad eccezione della specie Lophius budegassa , per la quale è stata individuata la comparsa occasionale di una mutazione in corrispondenza di un sito di taglio e l’ottenimento di due pattern di restrizione distinti per la stessa specie (Fig 9.2).

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Fig 9.2: Analisi elettroforetica dei Pattern di restrizione ottenuti sul frammento target di 566pb del gene Cytb mitocondriale per le sette specie del genere Lophiu s.

La metodica proposta è stata quindi utilizzata per la verifica delle informazioni sulla specie di appartenenza riportate in etichetta su 48 prodotti commerciali freschi, decongelati o essiccati (snack salati essiccati), acquistati sia presso rivenditori locali nazionali ed etnici che presso la grande distribuzione. Per la validazione dei risultati è stata infine effettuata un’analisi delle distanze filogenetiche per la costruzione di un dendrogramma Neighbour- Joining con modello statistico Kimura 2-parametri all’interno della famiglia Lophidae, a partire dalle sequenze ottenute dai campioni di riferimento e dai campioni commerciali. Relativamente ai dati ISMEA sulle specie di Lophius importate e commercializzate in Italia, l’indagine condotta sui campioni commerciali ha confermato la presenza esclusiva di 4 specie appartenenti al genere Lophius, L. piscatorius , L. budegassa , L. vomerinus e L. litulon . Dall’analisi delle informazioni riportate sui prodotti commerciali sono emerse alcune non conformità di etichettatura per la mancanza della denominazione scientifica o la non corretta dicitura della denominazione commerciale in contravvenzione con quanto richiesto dalla normativa cogente. Sui prodotti freschi sono state rilevate alcune contraffazioni di cui 1 per sostituzione della specie L. americanus con la specie L. piscatorius ed alcune per sostituzione della specie L.piscatorius con L.litulon . Nel primo caso dal momento che il valore commerciale e il pregio della specie L. piscatorius è sensibilmente superiore a quello della specie L. americanus la sostituzione è riconducibile probabilmente ad un errore di etichettatura non a scopo fraudolento. Nel secondo caso, al contrario, dal momento che la specie L. litulon d’importazione asiatica ha un valore commerciale significativamente inferiore alla specie L. piscatorius la sostituzione si configura come un’azione fraudolenta a scopo di lucro. Dal momento inoltre che la specie L. litulon è importata in forma congelata

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si configura una doppia frode, per contraffazione e adulterazione del prodotto. Relativamente ai prodotti essiccati acquistati presso esercizi commerciali cinesi ed etichettati come L.litulon o L. setigerus , tutti i campioni analizzati sono risultati appartenere alle specie L. litulon e L. piscatorius . In tal caso le non conformità di etichettatura per sostituzione della specie L. setigerus con L. litulon è plausibilmente riconducibile non tanto ad un’azione fraudolenta quanto ad un deficit nel sistema di tracciabilità dei prodotti alimentari (Guidi et al., 2010).

9.2.2 Sviluppo di due strumenti analitici alternativi in PCR multiplex end point ed analisi delle curve di melting in protocollo PCR realtime per l’identificazione delle sette specie di Lophius

Castigliego, L., Armani, A., Tinacci, L., Gianfaldoni, D., & Guidi, A. (2015). Two alternative multiplex PCRs for the identification of the seven species of anglerfish (Lophius spp.) using an end-point or a melting curve analysis real-time protocol. Food chemistry, 166, 1-9. (MANOSCRITTO 3 in appendice)

Lo studio è nato con l’intento di sviluppare un metodo discriminante rapido e competitivo alternativo al precedente, riducendo il costo e il tempo analitico per l’ottenimento della discriminazione delle sette specie di Lophius. L’allineamento delle sequenze di riferimento ha permesso di individuare una porzione sul gene cytb con minima variabilità interspecie, utilizzata per il disegno di un primer forward comune e sette regioni distinte con elevato grado di variabilità inter-specifica, così da ridurre il numero totale dei primer all’interno della reazione. Per il disegno di primer reverse specie specifici sono stati valutati il numero di mismatches rilevati sulle singole specie, la lunghezza degli ampliconi prodotti a partire dal forward comune e, per il setting della reazione in Real-Time, la loro temperatura di melting . La valutazione dei diversi parametri è stata effettuata attraverso l’utilizzo di software specifici allo scopo di determinare l’efficienza teorica e livellare le temperature di annealing degli oligonucleotidi individuati. Ciascun primer è stato comparato con la regione corrispondente sulle sequenze di riferimento della specie target, al fine di mettere in evidenza l’occorrenza di mutazioni occasionali nel sito di aggancio. In totale, per le due reazioni di PCR multiplex endpoint e Real time sono stati individuati 11 primer di cui 1 primer forward e 10 primer reverse (primer forward e 3 primer reverse in comune tra le due reazioni di PCR).

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Infine, sono stati progettati due primer COILfor/COILrev specifici per l’ottenimento di un controllo positivo di reazione solo sul genere Lophius, al fine di aumentare la specificità della metodica. I primer sono stati disegnati su un secondo gene target rispetto a quello selezionato per il disegno della multiplex, così da ridurre la comparsa di interferenze di reazione a discapito dell’amplificazione specie specifica; il gene COI è stato selezionato in virtù dell’elevato numero di sequenze disponibili in banca dati. Per valutare la specificità di reazione e la lunghezza degli ampliconi specie-specifici, le singole coppie di primer sono state testate in PCR singleplex . Sono stati effettuati test di efficienza su diverse polimerasi e per il protocollo definitivo sono state testate diverse concentrazioni di primer, così da equilibrare l’efficienza di amplificazione dei reverse specie specifici sulle singole specie, variando inoltre le concentrazioni di cofattori (MgCl2) e reagenti facilitatori di reazione (BSA, DMSO). Infine sono state effettuate prove con quantità decrescenti di DNA totale nella mix di reazione, per valutare l’influenza della quantità di DNA iniziale sulla reazione. Nel protocollo in end-point la coppia COILfor/COILrev è stata inserita direttamente nella mix di reazione con i primer specie specifici, mentre nel protocollo Real-Time è stata predisposta una miscela separata posta in amplificazione alle stesse condizioni della PCR multiplex. Per quanto riguarda la reazione in end point sono state ottenute sette bande distinte di lunghezza crescente specie specifica e una banda comune alle sette specie corrispondente al frammento del gene COI mitocondriale individuato dai primer di controllo (Fig 9.3).

Fig 9.3: Elettroforesi su gel d’agarosio 2% dell’applicazione del protocollo end-point per l’amplificazione delle sette specie di Lophius. MW: Sharp Mass 50® Euroclone S.p.A.

Il protocollo è stato testato su Lophiodes caulinaris , Lophiomus setigerus e sulle specie riportate in Tab 9.1 per verificare la specificità della reazione.

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La validità del risultato del test con i controlli negativi è stata confermata attraverso l’amplificazione contemporanea degli stessi campioni con la coppia di primer universali GluFish- 4R (Sevilla et al., 2009) per l’amplificazione di un frammento del Cytb mitocondriale più lungo dell’amplicone massimo ottenibile con l’applicazione della multiplex (Fig 9.3). Per quanto riguarda la reazione sviluppata in Real-Time, il protocollo finale ha restituito curve di melting distinte con picchi non sovrapposti per ciascun amplicone specie specifico (Fig 9.4) permettendo la discriminazione netta intragenere. La reazione eseguita con la coppia COILfor/COILrev ha prodotto picchi differenti per ciascuna delle sette specie in un range di temperatura limitato (81,5-83,1°C) (Fig 9.4).

Fig 9.4: A) Analisi della curva di melting post amplificazione con protocollo in PCR Real-Time sulle sette specie di Lophius. a L. gastrophysus , b: L. litulon ; c: L. americanus ; d. L. budegassa ; e : L. vaillanti ; f: L.vomerinus ; g: L. piscatorius . B) Metà sinistra: Analisi delle curve di melting post amplificazione di campioni di DNA di h: Solea solea ; i: Liza aurata ; j: Lophiodes caulinaris ; controlli negativi. Metà destra: analisi delle curve di melting dei prodotti di PCR ottenuti sulle sette specie di Lophius utilizzando i primer di controllo COILfor/COILrev (Immagine tratta dal manoscritto 3 in appendice.)

Al contrario, l’applicazione del protocollo di PCR multiplex su campioni di DNA provenienti dalle specie di controllo negativo non ha prodotto alcun picco specifico e le curve di visibili a termine dell’analisi di melting sono plausibilmente imputabili a fenomeni di dimerizzazione dei primer o alla comparsa di reazioni aspecifiche.

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Dai risultati ottenuti quindi è stata confermata l’applicabilità di entrambe le metodiche messe a punto e ottimizzate per la discriminazione delle sette specie di Lophius. La disponibilità di un protocollo end-point e Real-Time di pari efficienza offrono la possibilità di condurre l’analisi in funzione degli strumenti a disposizione riducendo, in entrambi i casi, costi e tempi analitici rispetto alla metodica precedentemente proposta.

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9.3.1 Individuazione di una metodica di PCR multiplex classica e Real Time per la discriminazione tra specie appartenenti alla famiglia Salangidae di importazione cinese correntemente utilizzate per la preparazione di piatti tipici della tradizione italiana e due specie nostrane sottoposte a tutela e restrizione di pesca.

Armani A., Castigliego L., Tinacci L., Gianfaldoni D., Guidi A (2012). Multiplex conventional and real-time PCR for fish species identification of Bianchetto (juvenile form of Sardina pilchardus), Rossetto (Aphia minuta), and Icefish in fresh, marinated and cooked products. Food Chemistry 133(1):184-192 . (Manoscritto 4 in APPENDICE)

Nell’ambito del fiorente commercio ittico euro-asiatico, una delle frodi che coinvolge direttamente le produzioni tradizionali italiane riguarda la sostituzione di “Bianchetto”, novellame di sardina e Rossetto (forma adulta di Aphia minuta), che rientrano nelle c.d. Pesche speciali, con alcune specie di acqua dolce o salmastra, appartenenti alla famiglia Salangidae, dal minor pregio commerciale e organolettico, tutte poste in vendita con la denominazione commerciale di “ Icefish ” o “Pesce Ghiaccio” (Fig 9.5).

Fig 9.5 : A) “Rossetto”: Aphia minuta ; B) “Bianchetto”: Sardina pilchardus ; C) “Pesce ghiaccio”: Neosalanx tangkakeii taihuensis

Il presente progetto oltre alla finalità primaria di tutela del consumatore da possibili frodi di tipo annonario, in virtù dei Regolamenti (CE) n.1967/2006 sulla tutela delle risorse del Mediterraneo e (CE) n.1005/2008 sull’applicazione di un regime comunitario per la prevenzione e eliminazione di ogni forma di illegalità nella pesca, ha assunto una nuova connotazione, ponendosi come un valido ausilio nella lotta contro la pesca illegale, elemento

107 estremamente importante, alla luce delle innumerevoli segnalazioni di sequestri effettuati dal 2011 all’inizio del 2014 (http://www.guardiacostiera.gov.it/). Dal momento che la cattura del Bianchetto costituisce un apporto economico fondamentale per alcune marinerie nazionali, per il solo 2013, ed in virtù dell’Autonomia della Regione Sicilia, la pesca del novellame di sardina e acciuga è stata transitoriamente autorizzata, con decreto Assessoriale (DA n.9 2013), limitatamente ad alcune aree di pesca chiaramente identificate. Se, pur con carattere di eccezionalità, tale fenomeno si ripetesse anche negli anni a venire e in altre regioni italiane, produrrebbe un incremento dei prezzi rendendo la pratica della sostituzione fraudolenta di specie ancora più allettante. Lo studio è stato quindi mirato allo sviluppo di una metodica PCR multiplex classica e in Real-time per la discriminazione rapida delle specie nostrane dalle specie d’importazione asiatica precedentemente caratterizzate. In fase di progettazione, sono stati selezionati due target genici, il Cytb e il 16S rRNA mitocondriali per la progettazione rispettivamente di primer specie specifici e di una coppia di primer universali da utilizzare come controllo di reazione. Per ciascuna delle quattro specie target di studio ( Aphia minuta, Sardina pilchardus, Neosalanx tangkakeii taihuensis, Encraulis encrasicolus ) sono stati raccolti e identificati morfologicamente esemplari interi successivamente sottoposti ad estrazione del DNA secondo la metodica proposta nello studio precedente (Armani et al., 2011). Sono stati reperiti, inoltre, esemplari morfologicamente identificati di Clupeiformi appartenenti alla famiglia Clupeidae ( Sprattus sprattus, Sardinella aurita, Alosa fallax ) e Engraulidae ( Engraulis japonicus ) Perciformi della famiglia Scombridae ( Scomber japonicus ) e Carangidae ( Decapterus spp ); Osmeriformi della famiglia Argentinidae ( Argentina sphyraena ) e della famiglia Salangidae ( Protosalanx chinensis, Neosalanx anderssoni ). Il DNA estratto da ciascuna specie è stato successivamente amplificato con coppie di primer universali (Sevilla et al., 2007, Palumbi 1996) per l’amplificazione di frammenti genici del Cytb e 1 6SrRNA mitocondriali. I prodotti di PCR sono stati inviati al sequenziamento e le sequenze ottenute sono state confrontate con sequenze disponibili su database pubblici, utilizzando il programma Clustal W, validate e depositate su GenBank e successivamente utilizzate per il disegno dei primer. Dall’allineamento delle sequenze prodotte e delle sequenze già disponibili in banca dati relative al Cytb per le famiglie Clupeidae, Engraulidae e Salangidae, sono state individuate una zona ampiamente conservata, posta nella porzione terminale del gene, selezionata per il disegno di un primer reverse comune (REV Yellow) e aree ad elevata variabilità interspecifica selezionate individualmente per il disegno di 13 forward specie specifici. Per valutare la specificità di annealing sono state allestite prove in

108 singleplex sulle quattro specie target fino all’individuazione dei quattro forward definitivi AP74, ACC129, NEO212A, SAR304 in grado di produrre quattro ampliconi di lunghezza diversa (74 pb per Aphia minuta, 129 pb per Engraulis encrasicolus , 212 pb per Neosalanx tangkakeii taihuensis e 304 pb per Sardina pilchardus ) solo sulla specie target (Fig 9.6). All’interno del frammento del 16S rRNA individuato dalla coppia di primer Palumbi (1996) (16Sar/16Sbr) sono state messe in evidenza e selezionate due regioni ampiamente conservate per il disegno della coppia, FOR16s-pc/REV16SPC-2, per l’amplificazione di una sequenza di circa 330pb, successivamente utilizzata come controllo di reazione con le stesse condizioni individuate per la multiplex.

Fig 9.6: Visualizzazione dei mismatch (evidenziati in grigio) dei quattro primer forward specie specifici selezionati per l’allestimento della PCR multiplex endpoint

Nelle prove di specificità per la selezione dei primer definitivi sono state incluse anche la specie Sardinella aurita , Sprattus sprattus , Engraulis japonicus , Neosalanx anderssoni e Protosalanx chinensis in quanto potenziali by-catched e potenziali sostituti delle specie Sardina pilchardus e Neosalanx tangkakeii taihuensi s (Castiglione et al., 2010; Armani et al., 2011). Per valutare la sensibilità della metodica sono state effettuate prove di amplificazione con miscele a coppia di DNA target in rapporto 1/1, 1/2, 1/5, 1/10 (Fig 9.7).

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Fig 9.7: applicazione del protocollo PCR multiplex per l’amplificazione su miscele sperimentali di DNA target in rapporto 1/1. AP A. minuta ; ACC: E. encrasicolus ; NEO: N. t. taihuensis ; SAR: S. pilchardus ; 5: A. minuta/N. t. taihuensis; 6: N. t. taihuensis/ S. pilchardus; 7: E. encrasicolus/ N. t. taihuensis; 8: A. minuta/ S. pilchardus; 9: E. encrasicolus/ S. pilchardus; 10: A. minuta/E. encrasicolus La metodica è stata quindi applicata, ai fini delle validazione, su prodotto crudo, fresco e congelato e successivamente su prodotto sottoposto a varie tipologie di cottura. Nel protocollo è stato inserito anche un controllo di reazione dato dall’amplificazione di un frammento del 16S rRNA. I risultati ottenuti sia in PCR classica (Fig 9.9) che in PCR Real- Time seppur con una riduzione significativa della sensibilità, hanno confermato la validità della metodica anche su prodotti cotti.

Fig 9.8: applicazione protocollo multiplex per l’amplificazione del DNA estratto dalle preparazioni gastronomiche riprodotte sperimentalmente. A) DNA estratto da prodotti pastellati e fritti. AP A. minuta ; ACC: E. encrasicolus ; NEO: N. t. taihuensis ; SAR: S. pilchardus 1-6: prodotti a base di S. pilchardus ; 7-12: prodotti a base di A. minuta ; 13-18: prodotti a base di N. t. taihuensis; B) DNA estratto da prodotti marinati preparati con e senza prebollitura. AP A. minuta ; AC: E. encrasicolus ; N: N. t. taihuensis ; S: S. pilchardus 1-4; 5-8: prodotti a base di S. pilcharduspreparati co ; 9-12; 13-16: prodotti a base di A. minuta ; 17-20; 21-24: prodotti a base di N. t. taihuensis.

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La metodica individuata ha permesso di identificare correttamente le quattro specie sia partendo da prodotti freschi che processati, anche se per i secondi è stata messa in evidenza una riduzione dell’efficienza di amplificazione plausibilmente attribuibile alla parziale degradazione del DNA durante la marinatura e la cottura.

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9.3.2 identificazione di specie in “petfoods” per gatti attraverso l’analisi BLAST e filogenetica (FINS) di un frammento del gene mitocondriale codificante per la subunità 16S dell’RNA ribosomiale (16S rRNA).

Il mercato dei mangimi per cani e gatti è caratterizzato da un miriade di prodotti che costituiscono la trasposizione in campo animale delle mode alimentari umane in termini di selezione delle materie prime, proprietà nutrizionali e nutraceutiche e costituiscono sempre più l’elemento di spicco del marketing mangimistico (Swanson, 2013). La maggior consapevolezza e attenzione dell’acquirente nella selezione delle materie prime ha portato allo sviluppo di mangimi d’élite, premium e superpremium che, in relazione alla selezione delle materie prime e ai nutrienti aggiunti (antiossidanti, fibre, acidi grassi polinsaturi, etc.), si collocano ad un livello qualitativo più elevato (Crane 2000, Combelles 2004). I “ superpremium ” gatto, che si collocano a pieno diritto nella categoria, sono mangimi ad elevato contenuto proteico per lo più a base di pesce. Le materie prime maggiormente utilizzate per la loro formulazione sono filetti di salmone trota pesce bianco (orata, branzino e gadidi) o pesce azzurro (sgombridi e clupeidi) provenienti solo parzialmente dal mercato locale e per la maggior parte importati da paesi comunitari o extraeuropei. Dal punto di vista normativo con l’introduzione dei Regg. CE 178/02 e CE 882/04 si è assistito a una equiparazione delle responsabilità degli Operatori del Settore Alimentare e mangimistico (OSA e OSM) e all’uniformazione dei metodi di controllo ufficiale sui prodotti destinati sia al consumo umano che animale. Per il settore mangimistico il quadro normativo è stato ulteriormente ampliato con l’introduzione del Reg CE 183/05 sull’igiene delle produzioni, da cui, però, erano esplicitamente esclusi tutti i prodotti destinati agli animali non produttori di alimenti. L’emanazione del Reg CE 767/09 ha risolto definitivamente questa lacuna normativa sancendo l’estensione di tutti i principi dei Regg. CE n. 178/02, CE n. 882/04 e CE n. 183/2005 a tutte le tipologie di mangime, comprese quelle destinate agli animali d’affezione. I petfood immessi sul mercato devono sottostare a specifiche normative in termini di tracciabilità ed etichettatura e la responsabilità dell’etichettatura ricade interamente sull’Operatore del Settore Alimentare (OSA) che è tenuto a riportare tutte le informazioni necessarie come la specie di destinazione, il tempo e modo di impiego del prodotto e la composizione analitica, per consentire un acquisto consapevole. Come specificato dal codice di buona etichettatura dei mangimi a livello europeo (FEDIAF), lo scopo principale di un’etichetta è quello di facilitare l'atto di acquisto

112 da parte dell'acquirente fornendo informazioni chiare e concise sulla composizione, le caratteristiche e il modo di impiego del prodotto. A norma del Reg. UE 767/2009 sono vietati claims e diciture che potrebbero indurre in errore l’acquirente. Nonostante questo e considerando che la selezione di determinati ingredienti influenza direttamente il costo del prodotto, è plausibile che alcuni in alcuni casi siano utilizzate denominazioni di vendita che non corrispondono agli ingredienti utilizzati e in particolar modo in prodotti a base di pesce in cui fenomeni di mislabeling e sostituzione sono già ampiamente riportati per alimenti destinati al consumo umano (Pepe et al., 2007; Armani et al ., 2012). In sede di controllo di conformità anche per i mangimi inscatolati e sterilizzati la sola ispezione visiva è spesso inefficace a causa della perdita dei caratteri morfologici identificativi e tecniche di biologia molecolare sono state già applicate con successo anche su tali prodotti (Ardura et al ., 2012). Nonostante allo stato attuale il gene COI costituisca il target mitocondriale d’elezione per l’identificazione specie specifica (FISH-BOL, www.fishbol.org) i geni codificanti per il Cytb e 16S rRNA possono rappresentare target alternativi altrettanto validi per l’identificazione di specie (Armani et al ., 2012). Il presente studio condotto su alcuni mangimi per gatto ha avuto lo scopo di verificare la conformità della composizione riportata in etichetta con una particolare attenzione alle diciture “bianchetto”, ovvero novellame di Sardina pilchardus e “tonno, tonnetto e sgombro”. Le analisi BLAST ( Basic Local Alignment Search Tool ) e filogenetica sono state effettuate su un frammento del gene mitocondriale per il 16srRNA , target già selezionato e testato come marker universale in alcuni studi di identificazione di prodotti ittici (Cawthorn 2012; Ardura et al.(2012). Per lo studio sono stati acquistati e analizzati 43 mangimi inscatolati, riportanti in etichetta le diciture “bianchetto”,“tonno”, “sgombro”, tutti di importazione asiatica provenienti da stabilimenti distribuiti nelle province Samut Prakan- Samut Sakhon nell’interland di Bangkok o nella provincia di Songkhla, ad elevata vocazione industriale) per 13 marchi commerciali, destinati alla grande distribuzione e a circuiti di vendita specializzati. Sono stati reperiti, inoltre, 107 campioni provenienti da esemplari morfologicamente identificati di specie appartenenti alla famiglia Scombridae. Per i prodotti commerciali il DNA totale è stato estratto/con una metodica salting out a partire da 3 esemplari interi e due porzioni da 100-150mg di filetto prelevati da ciascuna confezione in modo casuale. Sul DNA estratto sono state effettuate una misurazione della concentrazione con micro-spettrofotometro (NanoDrop-ND1000) e la valutazione del pattern di degradazione attraverso elettroforesi in gel d’Agarosio 1%, dalla quale è emerso un forte grado di frammentazione (Fig 9.9), con pattern elettroforetici difficilmente visibili

113 al di sopra delle 500 pb e generalmente concentrati tra 50 e 250 pb, in accordo con quanto già evidenziato in altre tipologie di conserve (Chapela et al., 2007; Jerome et al., 2003) e pet food (Hird et al., 2006).

Fig 9.9: pattern elettroforetico di una selezione di campioni di DNA totale estratto da quattro confezioni distinte. CATF3: 1-4; CATF4: 5-8; CATF5: 9-11; CATF7: 12-14; Campioni 1,2,5,6,9,10,12,13: DNA totale estratti da pescetti interi; 3,4,7,8,11,14: DNA totale estratto da aliquote di filetto. L: marker molecolare SHARPMASS 50® Euroclone S.p.A, Milano.

Da 2 a 5 campioni di DNA relativi alle specie Euthynnus affinis, Euthynnus alletteratus, Euthynnus lineatus, Sarda chiliensis, Sarda orientalis, Sarda australis, Thunnus maccoyii, Auxis rochei, Auxis thazard e Allothunnus fallai, per le quali una sola sequenza o nessuna sequenza erano presenti in banca dati, sono stati amplificati con la coppia di primer universali disegnati da Palumbi (1996) per l’ottenimento di 28 sequenze di riferimento, che sono state immediatamente depositate in banca dati, ai fini della successiva analisi BLAST. Per l’individuazione dei primer , in considerazione degli effetti del trattamento termico sul DNA in queste tipologie di prodotto, il target massimo di amplificazione è stato settato su un frammento di circa 335 pb, individuato dalla coppia dei primer progettati nello studio precedente ( Par 9.3.1 ). Attraverso l’allineamento di 819 sequenze di specie appartenenti alle famiglie Clupeidae, Engraulidae e Salangidae e Scombridae, già disponibili su Genbank o depositate nel presente studio, sono stati individuati quattro primer, FOR 16s-1, FOR16S-2, REV16S-1, REV16S-2, interni alla sequenza iniziale per l’ottenimento di frammenti di lunghezza decrescente da 231 a 77 pb. (Fig 9.10).

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TGCCCGTGCAGAAGCGGGCATACCGCCACAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAGACGCTAACC AACCCCGAAAAGCACCCTACACCAGGGCCCAAACAACGTGGTTTTGGCACAACCGTCTTCGGTTGG GGCGACCGCGGGAGATAGCACAGCTCCCGAGTGGATGGGGGAAACCCTAAAACCAAGAGCTACAGC TCGAAGTCACAAAACATTTGACCAACAATGATCCGGCTTCATGCCGACCAACGGACCAAGTTACCC TAGGGATAACAGCGCAATCCCCTCCCAGAGTTCATATCGACGAGGGGGTTTACGACCTCGATGTTG

Fig 9.10: visualizzazione del frammento mitocondriale del gene 16S rRNA individuato dalla coppia FOR16s-pc/REV16Spc-2 sulla sequenza di riferimento FR849595 (Sardina pilchardus). In evidenza le cinque zone di annealing dei primers selezionate: in verde For16s-pc; in azzurro For16s-1; in rosso For16S-2/Rev 16s-1; in grigio Rev 16S-2 ed in giallo REV16Spc-2.

La verifica del potere discriminante dei frammenti selezionati è stata effettuata tramite un’analisi BLAST in vitro . I primer disegnati sono stati testati nelle diverse combinazioni sui campioni di DNA estratti dagli esemplari identificati e, al fine di ottimizzare il protocollo di PCR, sono state condotte prove in gradiente di annealing . Infine, sono stati selezionati i forward FOR16S-1 e FOR16S-2 da utilizzare alternativamente in combinazione con REV16S-2 per l’amplificazione di due frammenti di circa 213 e 118 pb. Le due coppie sono state applicate per l’amplificazione e il successivo sequenziamento del DNA estratto dai prodotti commerciali. In totale sono state analizzate 213 sequenze (relative ai DNA di 129 pescetti e 84 aliquote di filetti) di cui 34 ottenute con la coppia FOR16S-1/REV16S-2 e le restanti 179 con la coppia FOR16S-2/REV16S-2. Sulle sequenze ottenute sono state applicate un’analisi BLAST (Basi Local Alignment Search Tool) utilizzando lo strumento algoritmico direttamente accessibile su Genbank e un’analisi delle divergenze filogenetiche attraverso l’applicazione di un modello Kimura 2-parametri presente sul software MEGA 6.0 sul frammento individuato dalla coppia FOR16S-2/REV16S-2, con la quale erano state ottenute l’84% delle sequenze analizzate (Fig9.11). Per la analisi delle distanze, le sequenze ottenute dai filetti e dai pescetti sono state considerate separatamente. I due pattern di clusterizzazione (Fig 9.12; Fig 9.13) sono stati prodotti con software MEGA 6.0 applicando 1000 bootstrap di ricampionamento. Per quanto riguarda l’analisi BLAST la soglia di identità per l’identificazione di specie è stata settata sul 100% e tale dato è stato raggiunto nel 97% delle sequenze analizzate. Per quanto riguarda i pescetti il 98% delle sequenze analizzate ha restituito un’identità del 99-100% per specie appartenenti al genere Encrasicholina e il restante 2% per la specie Anguilla anguilla e il genere Neosalanx.

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Fig 9.11: visualizzazione del frammento interno alla coppia FOR16S-2/REV16S-2 sulle sequenze delle specie di riferimento selezionate per la costruzione del dendrogramma di clusterizzazione per l’analisi filogenetica delle sequenze ottenute dai campioni commerciali analizzati. Dall’allineamento risulta evidente la presenza di inserzioni e delezioni geniche con una variazione significativa della lunghezza del frammento nelle diverse specie.

Dai risultati dell’analisi BLAST sui campioni di DNA estratti dai filetti: per i prodotti etichettati come “a base di tonno e bianchetto” è emersa la predominanza della specie Katsuwonus pelamis seguita dalle specie Euthynnus affin is Anguilla rochei e alcuni campioni ascrivibili al genere Thunnus sp; nei campioni di DNA estratti da filetti provenienti da prodotti a base di “ sgombro e bianchetto” o “contenenti sardina” sono state evidenziate la presenza di Trachurus novaezelandie , Katsuwonus pelamis e Sardinella fimbriata .

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In generale, per quanto riguarda il frammento genico considerato all’interno della famiglia Scombrida e è stato rilevato un minore grado di variabilità interspecifica rispetto a quanto evidenziato per l’ordine Clupeiformes. Tale dato è stato confermato dalla successiva analisi delle divergenze che ha messo in evidenza una chiara discriminazione di genere e di specie all’interno dell’ordine Clupeiformes con la formazione di cluster separati e supportati da valori di bootstrap significativi (Fig 9.12 ). Al contrario, per quanto riguarda il dendrogramma di clusterizzazione relativo ai campioni estratti dai filetti, la separazione intergenere all’interno delle famiglie Scombridae, Clupeidae e Carangidae non è sempre supportata da valori di bootstrap significativi. All’interno della famiglia è possibile visualizzare la presenza di sottogruppi comprendenti più generi i quali non sono a loro volta separati gli uni gli altri da valori di bootstrap significativi (>70%) (Fig 9.14). Dall’analisi combinata dei risultati BLAST e delle divergenze filogenetiche è stato comunque possibile confermare una non corretta etichettatura dei prodotti nel 100% dei casi, dal momento che la denominazione di bianchetto può essere associata esclusivamente alla forma giovanile di Sardina pilchardus. Per i mangimi la dichiarazione di specie nella composizione non è obbligatoria, ma al momento che è inserita in etichetta, costituendo per altro un motivo di appeal sull’acquirente, è un elemento di qualità che ricade sotto la diretta responsabilità dell’OSM ed è passibile di controllo. La denominazione “bianchetto” su un prodotto asiatico, pur non costituendo una violazione del Reg 1967/2006, in quanto tale normativa trova applicazione esclusivamente in area mediterranea, costituisce di fatto una falsificazione, dal momento che la distribuzione geografica per la specie Sardina pilchardus è limitata al Mediterraneo, Mar Nero e Atlantico (http://www.fao.org/fishery/species/2910/en ). L’utilizzo non dichiarato di novellame di Clupeiformi d’origine asiatica pone infine numerose problematiche riguardo alla sostenibilità ambientale della filiera ittica, alla tutela degli stock ittici a livello mondiale e al controllo di fenomeni di pesca INN.

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Fig 9.13 Dendrogramma Neighbour joining con modello Kimura 2 parametri per l’analisi delle sequenze dei campioni di DNA ottenuti dai pescetti.

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Fig 9.14 Dendrogramma Neighbour joining con modello Kimura 2 parametri per l’analisi delle sequenze dei campioni di DNA ottenuti dai filetti di ciascun prodotto commerciale in studio.

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Il progetto, nato dalla stretta collaborazione con la ASL 4 di Prato, ha avuto lo scopo di offrire uno strumento di caratterizzazione di un prodotto tipico della cucina cinese, (Hisieh Y.P., & Rudloe J. 1994; Hisieh et al.2001) “la medusa in salamoia”, conosciuto, apprezzato e promosso a livello internazionale per le proprietà condroplastica, condroprotettiva e antiossidante. I prodotti correntemente commercializzati sono ascrivibili a due categorie: prodotti preconfezionati (PC) a base di medusa salata e mantenuta in salamoie ad elevata concentrazione salina e prodotti di seconda gamma, ottenuti dalla lavorazione della prima tipologia, confezionati in porzioni monodose con l’aggiunta di quote di servizio (condimenti e salse) per il consumo immediato ( ready to eat- RE) (Armani et al . 2011). A livello nazionale, questi prodotti, fino al 2012, non disponevano di un’etichettatura ufficiale. Solo recentemente sono stati inseriti nella lista ministeriale delle denominazioni commerciali delle specie ittiche, con la denominazione provvisoria di “medusa Asiatica” (MIPAF 1278/PIF-UVAC/GE), prendendo in considerazione come unica specie commerciabile R. esculentum . Alla luce di tale evoluzione e per una corretta tracciabilità ed etichettatura del prodotto, l’identificazione specie specifica degli alimenti reperibili sul mercato nazionale ha assunto un ruolo ancora più importante, sia per offrire uno strumento d’integrazione delle liste ministeriali con le denominazioni scientifiche effettivamente importante sia come strumento di controllo di fenomeni di mislabeling . In questo contesto, il presente studio si pone come uno strumento di caratterizzazione molecolare delle principali specie diffuse nel continente asiatico e di alcune specie mediterranee, appartenenti alle famiglie Semaeostomeae e Rhizostomeae, per la creazione di una banca dati molecolare delle specie allevate o pescate destinate al consumo umano e la creazione di un modello filogenetico da applicare per l’identificazione molecolare di prodotti alimentari a base di medusa, acquistati in esercizi commerciali e ristoranti etnici. Lo studio ha previsto una fase preliminare di reperimento di campioni di tessuto provenienti da esemplari morfologicamente identificati, grazie alla creazione di un network di contatti internazionali. Una coppia di primer universali (Folmer et al. 1994) disegnata per l’amplificazione di un frammento di circa 650 del gene è stata modificata attraverso

120 l’introduzione di alcune degenerazioni e la reazione di PCR è stata quindi ottimizzata, al fine di ottenere un prodotto di PCR e una sequenza di riferimento per tutte le specie selezionate per lo studio, da utilizzare per l’analisi filogenetica successivamente applicata per l’identificazione dei prodotti commerciali reperiti sul mercato nazionale. Nella fase di campionamento sono state raccolte porzioni di tessuto provenienti da esemplari morfologicamente identificati da istituti di ricerca e musei, inviati in etanolo, in forma essiccata e liofilizzata o da esemplari interi freschi direttamente pescati lungo le coste del mar Tirreno nella stagione estiva del 2010 per un totale di 54 campioni di specie distinte (Cassiopea sp., Cassiopea andromeda; Catostylus mosaicus, Cotylorhiza tuberculata, Lychnorhiza lucerna, Rhizostoma pulmo, Nemopilema nomurai, Rhopilema esculentum, Rhopilema nomadica, Cyanea lamarckii, Cyanea capillata, Pelagia noctiluca, Aurelia aurita ) appartenenti a 5 famiglie di Rhizostomeae ( Cassiopeidae, Catostylidae, Cepheidae, Lychnorhizidae, Rhizostomatidae ) e a 3 Famiglie di Semaeostomeae ( Cyaneidae, Pelagiidae, Ulmaridae ). L’acquisto dei campioni commerciali è stato effettuato direttamente presso negozi e ristoranti cinesi presenti sul territorio nazionale e in alcuni esercizi commerciali della provincia dello Zhejiang. Sono stati acquistati 78 campioni classificati in funzione della modalità di vendita in “prodotti classici” salati e mantenuti in salamoia (PC), consumabili solo dopo una parziale desalatura del prodotto, e prodotti pronti al consumo o ready to eat (RE). A livello di etichettatura, solo 45 prodotti sul totale degli analizzati riportava in etichetta la dicitura medusa e solo in 3 era presente la dicitura corretta “medusa in salamoia” richiesta da decreto ministeriale. 7 campioni erano totalmente privi di denominazione commerciale e in 14 la denominazione riportata era riferibile a specie vegetali; nel 98% prodotti era riportata la denominazione scientifica di R. esculentum . Prima dello stoccaggio a temperatura controllata per ciascun prodotto commerciale, sono state effettuate due misurazioni del pH, una direttamente sulla salamoia di mantenimento e la seconda sul liquor tissutale ottenuto per omogeneizzazione di una porzione del tessuto. I valori di pH registrati sono risultati intorno a 3.8 per i PC e 5.9 per i prodotti RE. Infine alcune porzioni di tessuto provenienti da 10 prodotti commerciali distinti, selezionati casualmente all’interno delle due categorie (5 PC e 5 RE), sono stati inviati ad un laboratorio esterno per la determinazione dell’Alluminio totale. Dai risultati sono emersi valori compresi trai 484 e 1450mg/kg. Tutti i campioni, identificati e commerciali, sono stati sottoposti a estrazione del DNA totale con la metodica salting out sopra riportata. Per i campioni identificati conservati in etanolo

121 o essiccati è stato previsto un passaggio preliminare di lavaggio del tessuto in tampone Tris (100mM pH 7,8), mentre i prodotti commerciali sono stati sottoposti a un lavaggio preliminare di 2h per consentire un’ulteriore desalatura del tessuto. Per l’ottenimento di un frammento target del gene mitocondriale COI è stata selezionata una coppia di primer universali disegnata da Folmer et al., (1994), già testata con successo per l’amplificazione di campioni di Rhizostoma pulmo (Ramsak, 2012) e Catostylus mosaicus (Dawson 2005). Al fine di aumentarne l’efficienza di amplificazione sono state reperite sequenze di riferimento depositate su GenBank, relative alle specie commestibili delle famiglie Semaestomae e Rhizostomeae , allineate per mettere in evidenza mismatches in corrispondenza del sito di annealing dei primer sulle singole specie. Sulla base dei risultati, i primer sono stati modificati attraverso l’aggiunta di basi degenerate in diverse posizioni. I 5 nuovi primer individuati (2 primer forward e 3 primer reverse) sono stati testati in combinazioni diverse e in comparazione con i primer Folmer originali sui DNA estratti dai campioni di riferimento raccolti nella fase preliminare, fino alla selezione di una coppia di primer (FFDL/FRDL2), in grado di restituire un prodotto di PCR in tutte le specie considerate nello studio. I due primer sono stati quindi addizionati con code oligonucleotidiche (M13F/M13R) proposte da Steffens et al. (1993), per l’invio al sequenziamento dei prodotti di PCR ottenuti dai campioni identificati e l’ottenimento di sequenze di riferimento successivamente depositate su GenBank . L’applicazione dello stesso protocollo per l’amplificazione dei prodotti commerciali ha restituito amplificati sequenziabili solo in 5 campioni sui 78 in analisi ponendo forti dubbi sull’integrità del DNA estratto e la presenza di inibitori della reazione di PCR Dall’elettroforesi in gel d’agarosio effettuata sul DNA totale estratto è emerso un grado variabile di frammentazione degli acidi nucleici. Tale frammentazione particolarmente evidente nei PC in cui il pattern elettroforetico difficilmente raggiungeva la soglia delle 500 pb è indotta plausibilmente dal processo di lavorazione e dallo stoccaggio dei tessuti in soluzioni a forte concentrazione salina e medio alto tenore di acidità (Armani et al., 2012; Bauer, 2003), associata a una conservazione inadatta dei prodotti e a temperatura ambiente non idonea al prolungamento della loro shelf life (Hsieh et al., 2011; Armani et al., 2012).

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Figura 9.14: Elettroforesi su gel d’agarosio di alcuni campioni di DNA estratto da una selezione di prodotti commerciali preconfezionati (PC) e ready to eat (RE ). A e B: SharpMass 1-kb e SharpMass 50bp ; 1: DNA totale estratto da campione identificato di N.nomurai; 2-10: DNA totale da campioni PC; 11-16: DNA totale da campioni RE. A sinistra riportati pattern elettroforetici dei due marker con relative scale molecolari.

Considerando il pattern di frammentazione osservato, sono stati disegnati primer reverse all’interno del target Folmer da utilizzare in combinazione con il primer forward FFDL per l’amplificazione di frammenti di lunghezza crescente da 133 a 514 pb. Al fine di valutare la presenza di fattori inibitori della reazione di PCR sono stati effettuati: test di spiking su DNA estratto da campioni identificati addizionato con percentuali crescenti di DNA estratto da campioni commerciali; test di diluizione seriale di DNA ottenuto da prodotti commerciali e campioni di controllo identificati; un protocollo di purificazione del DNA estratto con kit commerciale di purificazione su matrice silicea con beads in campo magnetico. I campioni dei vari test sono stati amplificati applicando le coppie di primer individuate in funzione del pattern di degradazione riscontrato a livello elettroforetico. Dai risultati sono emersi un miglioramento dell’amplificabilità dei campioni di DNA sottoposti a diluizione seriale a conferma della presenza di inibitori presenti all’interno del campione di DNA estratto. Inoltre la totale inefficacia del trattamento di purificazione con kit ha confermato lo stretto legame tra inibitore e DNA suggerendo un’associazione diretta trai due. L’effetto inibitorio ipotizzato dati i livelli di alluminio riscontrati all’interno dei tessuti è stato quello esercitato da ioni Al3+ in grado di complessarsi con le molecole del DNA contribuendo al fallimento della reazione di PCR.

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In condizioni di neutralità o scarsa basicità (pH 7-8), essenziali per il mantenimento in soluzione delle molecole di DNA, gli ioni Al 2+ hanno la proprietà di legarsi piuttosto stabilmente ai gruppi fosfato degli acidi nucleici, interferendo con la valutazione quali- quantitativa del DNA estratto e inibendo l’attività polimerasica in fase di amplificazione. (Wu et al., 2005). L’ottimizzazione del protocollo di estrazione è stata quindi mirata la rimozione dell’eccesso di sali e dei residui di alluminio presenti nel tessuto prolungando la fase di lavaggio-desalatura con acqua corrente fino a 48h da una fase di incubazione in una soluzione contenente EDTA per attraverso l’azione chelante propria della molecola. A tale scopo, prima dell’applicazione della metodica estrattiva proposta da Armani et al., (2011), sono stati condotti: lavaggi preliminari del tessuto in acqua corrente per 24, 48 e 72h e test di incubazione per 1h a temperatura ambiente con soluzioni a concentrazione crescente di EDTA (da 50 a 400mM). Dai risultati in termini di amplificabilità sui campioni ottenuti dalle prove, il protocollo d’estrazione finale è stato settato introducendo un prelavaggio di 48h in acqua corrente e la successiva incubazione del tessuto in una soluzione EDTA 400mM per 1h a temperatura ambiente. Tutti i prodotti commerciali sono stati sottoposti ad amplificazione purificazione e sequenziamento per l’ottenimento di sequenze da utilizzare per l’analisi BLASTe filogenetica con le sequenze di riferimento. Dato l’elevato grado di frammentazione riscontrato l’analisi filogenetica Neighbour-Joining con modello Kimura 2 parametri è stata condotta su un target di 142 pb (Fig 9.15). In particolare, le specie appartenenti all’ordine delle Semaestomeae hanno formato clusters corrispondenti alle famiglie Pelagidae, Ulmaridae, Cyaneida e Drymonematidae . Le specie appartenenti all’ordine delle Rhizostomeae sono state raccolte in sottordini, fatta eccezione per la specie Lychnorhiza lucerna e tutte le specie appartenenti all’Ordine delle Kolpophore (Famiglia Cepheidae, Mastigidae, Cassiopeidae ) si sono raggruppate insieme e separatamente dalla specie appartenenti al subordine delle Daktylophorae (Rhizostomatidae e Catostylidae ). Nonostante il dendrogramma prodotto non abbia mostrato una clusterizzazione risolutiva tra tutte le famiglie, il frammento considerato ha comunque consentito di identificare univocamente il 96% dei prodotti commerciali a livello di specie con valori di bootstrap altamente significativi (> 95%). Dalle analisi molecolari, al contrario di quanto riportato in bibliografia, Nemopilema nomurai è risultata essere la specie più utilizzata per la preparazione di tali specialità gastronomiche seguita dalle specie Rophilema esculentum tradizionalmente utilizzata per la

124 preparazione di medusa in salamoia. Dalle analisi inoltre sono stati identificati prodotti a base di Rizostoma pulmo e a base di Pelagia noctiluca quest’ultima mai riportata in bibliografia tra le specie edibili. Tale riscontro è plausibilmente associato al blooming di tale specie soprattutto lungo le coste del Mar Giallo e della baia di Liaodong e il conseguente declino delle popolazioni delle altre specie. Per quanto riguarda le non conformità d’etichettatura è stato rilevato un tasso di mislabeling elevatissimo in particolare per i prodotti RE sottolineando l’affermazione di tali fenomeni anche in prodotti tradizionali. In linea generale l’approccio molecolare selezionato per lo studio, associato all’ottimizzazione del protocollo di estrazione del DNA ha consentito il raggiungimento dell’identificazione specie specifica nel 96% dei prodotti commerciali, rivelandosi un valido strumento analitico per prodotti non morfologicamente riconoscibili. I dati ottenuti sui prodotti commerciali hanno infine confermato il livello elevato di non conformità associato ai prodotti etnici e ai prodotti d’importazione cinese e l’efficacia dell’applicazione di strumenti analitici di supporto a dei controlli ufficiali. Al di là della necessità di estendere la denominazione commerciale “medusa Asiatica” anche ad altre specie ampiamente utilizzate quali N. nomurai , il riscontro di prodotti a base di Rhizostoma pulmo , specie a diffusione per lo più Mediterranea, pone un ragionevole dubbio sulla reale origine dello stabilimento di produzione delle salamoie con la possibile immissione sul mercato di prodotti processati e confezionati in Italia a partire da animali pescati a livello locale, senza alcuna tracciabilità e controllo, sia sulla materia prima che sul procedimento produttivo.

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Fig 9.15: Dendrogramma ottenuto utilizzando 192 sequenze di 142pb del gene COI con il metodo Neighbour-joining e modello Kimura 2-p. Immagine tratta dal manoscritto 6 (Armani et al., 2013 Food Research international 54, 1383-1393).

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BIBLIOGRAFIA DELLA PARTE SPERIMENTALE

Di seguito si riportano i riferimenti bibliografici relativi ai manoscritti oggetto del lavoro di studio del percorso di dottorato

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161. Ward, R. D., Hanner, R., & Hebert, P. D. N. (2009). The campaign to DNA barcode all fishes, FISH-BOL. Journal of Fish Biology , 74, 329–356. 162. Wasko, A. P., Martins, C., Oliveira, C., & Foresti, F. (2003). Non ‐destructive genetic sampling in fish. An improved method for DNA extraction from fish fins and scales. Hereditas , 138(3), 161-165. 163. Weese, J. S., Rousseau, J., & Arroyo, L. (2005). Bacteriological evaluation of commercial canine and feline raw diets. Canadian Veterinary Journal , 46(6), 513. 164. Wells, D. L. (2009). The Effects of Animals on Human Health and Well ‐Being. Journal of Social Issues , 65 (3), 523-543. 165. Wilcock, A., Pun, M., Khanona, J., & Aung, M. (2004). Consumer attitudes, knowledge and behaviour: a review of food safety issues. Trends in Food Science & Technology , 15 (2), 56-66. 166. Wong, W. W. K., Chung, S. W. C., Kwong, K. P., Yin Ho, Y., & Xiao, Y. (2010). Dietary exposure to aluminium of the Hong Kong population. Food Additives & Contaminants , 27(4), 457- 463. 167. Wu J., Du F., Zhang P., Khan, I. A., Chen J., & Liang Y. (2005). Thermodynamics of the interaction of aluminum ions with DNA: Implications for the biological function of aluminum. Journal of inorganic biochemistry 99 , 1145-1154. 168. Xu, W., Zhai, Z., Huang, K., Zhang, N., Yuan, Y., Shang, Y., & Luo, Y. (2012). A novel universal primer-multiplex-PCR method with sequencing gel electrophoresis analysis. PLoS ONE , 7, e22900. 169. Yang, X. Q., Li, L., Wu, Y. Y., Diao, S. Q., Li, L., Chen, P., & Hao, S. (2005). Studies on the processing technology and formula of ready-to-eat jellyfish. South China Fisheries Science, 1(2) , 46-50. 170. Yoneda M, Tokimura M, Fujita H, Takeshita N, Takeshita K, Matsuyama M, Matsuura S(1998). Ovarian structure and batch fecundity in Lophiomus setigerus. J Fish Biol 52: 94–106

140

171. Zhang, J., & Hanner, R. (2012). Molecular approach to the identification of fish in the South China Sea. PloS one , 7(2), e30621.

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141

RINGRAZIAMENTI

Vorrei ringraziare la Prof.ssa Daniela Gianfaldoni e la Prof.ssa Alessandra Guidi per avermi dato l’opportunità di proseguire la mia attività di ricerca post laurea in un percorso di studi articolato e stimolante. Un grazie sincero e infinito al Dr. Lorenzo Castigliego e al Dr. Andrea Armani che mi hanno guidato con pazienza e attenzione nei diversi progetti sostenendomi attivamente e spronandomi a maturare con costanza e fiducia. Ringrazio i colleghi e amici che mi hanno affiancato e con i quali ho condiviso piccole delusioni e grandi traguardi sia professionali che personali in questi anni di studio e lavoro. Rivolgo infine un pensiero particolare ai miei genitori che in questi anni mi hanno sostenuta una volta di più con affetto e passione incrollabili in tutte le mie scelte, dedico a loro il raggiungimento di questo traguardo.

142

APPENDICE Gli abstract dei sei manoscritti relativi all’attività di ricerca del percorso di dottorato sono raccolti nella presente sezione e nell’ordine sotto riportato

MANOSCRITTO 1 Armani A., Castigliego L., Tinacci L., Titarenko E., Xiong X. (2014) Development of a simple and cost-effective bead-milling method for DNA extraction from fish muscles. Food Analytical Methods 7(4): 946-955

MANOSCRITTO 2 Armani, A. , Castigliego, L. , Tinacci, L., Gandini G., Gianfaldoni D., Guidi A. (2012) A rapid PCR-RFLP method for the identification of Lophius species. European Food Research and Technology 235(2): 253-263

MANOSCRITTO 3 Castigliego, L., Armani, A., Tinacci, L., Gianfaldoni, D., & Guidi, A. (2015). Two alternative multiplex PCRs for the identification of the seven species of anglerfish (Lophius spp.) using an end-point or a melting curve analysis real-time protocol. Food Chemistry, 166, 1-9.

MANOSCRITTO 4

MANOSCRITTO 5 Armani A., Tinacci L., Xiong X., Castigliego L., Gianfaldoni D., Guidi A. Fish species identification in canned petfood by BLAST and Forensically Informative Nucleotide Sequencing (FINS) analysis of short fragments of the mitochondrial 16s ribosomial RNA gene (16S rRNA). Food control 50, 821-830

143

MANOSCRITTO 6 Armani A., Tinacci L., Giusti A., Castigliego L., Gianfaldoni D., Guidi A. (2013) “What is inside the jar? Forensically informative nucleotide sequencing (FINS) of a short mitochondrial COI gene fragment reveals a high percentage of mislabeling in jellyfish food products Food Research International . 54 (2), 1383-139

144

Food Anal. Methods (2014) 7:946 –955 DOI 10.1007/s12161-014-9792-z

Development of a Simple and Cost-Effective Bead-Milling Method for DNA Extraction from Fish Muscles

Armani Andrea & Tinacci Lara & Xiong Xiong & Titarenko Evgeniya & Guidi Alessandra & Castigliego Lorenzo

Received: 22 October 2013 /Accepted: 7 January 2014 /Published online: 23 January 2014 # Springer Science+Business Media New York 2014

Abstract In the fish food sector, due to a growing globalization bead-milling procedure can be considered a valid alternative, in of the market, where intentional and unintentional frauds reach the light of its lower demand in terms of labor and costs. alarming levels, the molecular analysis is increasingly used by both official agencies, to enforce the law on traceability, and Keywords DNA extraction . Bead milling . Fish muscle private companies, to verify the quality of goods. DNA extraction represents a necessary and critical step for all types of DNA analysis. Among the drawbacks associated with this procedure, Introduction there are handling of toxic materials, low DNA yield, and low throughput, due to time-consuming manual procedures. In this The several cases of fraudulent substitution often reported by work, to overcome some of these problems, we developed an media have made the unique identification of food a key alternative method based on a bead-milling procedure without factor. Consequently, especially in the fishery sector, the proteinase K digestion. The new method was then compared DNA-based analytical methods have become increasingly with both a salting-out protocol, developed in a previous work, important and are nowadays applied for routine controls, also and a commercial kit. Yield, spectrophotometric purity, electro- at the official level. They represent a valid support not only to phoretic degradation pattern, and amplificability of the extracted improve the compliance and traceability of goods, encourag- DNA were assessed. In particular, DNA amplificability was ing the enforcement of the law, but also to raise the protection evaluated by comparing the band intensity on the gel, after level of consumers against fish allergies and of endangered amplification of the 16S rRNA and cytochrome oxidase I genes animal species (Armani et al. 2012a ). with a conventional PCR, and the take-off cycles, after amplifi- In order to meet the demand for reliable and sustainable cation of the 16S rRNA gene with a real-time PCR. The results food traceability systems, any DNA-based analytical ap- showed that the bead-based method allowed to obtain acceptable proach should be both effective and low cost (Galimberti amounts of DNA, with good purity and good characteristics of et al. 2013 ). Effectiveness is mainly based on the possibility amplificability. Although the salting-out method remains the to rely on a successful PCR amplification, which greatly most effective protocol in terms of pure performances, the depends on the achievement of a sufficient amount of high- quality DNA. In fact, it is fundamental that every extraction method be able to maximize the removal of contaminants that may inhibit PCR. For this reason, DNA extraction is consid- Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1007/s12161-014-9792-z) contains supplementary material, ered the most critical step in the processing of samples for which is available to authorized users. PCR-based analysis. Especially in the fishery sector, which deals with thousands of different species, the choice of the A. Andrea ( *) : T. Lara : X. Xiong : T. Evgeniya : G. Alessandra : C. Lorenzo most appropriate technique should be accurately assessed. FishLab, Department of Veterinary Sciences, University of Pisa, The fundamental step of the DNA extraction method is the Via delle Piagge 2, 56124 Pisa, Italy tissue disruption and the cell lysis. Many chemical and phys- e-mail: [email protected] ical disruption methods, followed by enzymatic digestion A. Andrea using proteinase K, have been proposed for tissue lysis. e-mail: [email protected] Among those available, the rapid shaking of the samples in Author's personal copy

Eur Food Res Technol (2012) 235:253–263 DOI 10.1007/s00217-012-1754-3

ORIGINAL PAPER

A rapid PCR–RFLP method for the identi Wcation of Lophius species

Andrea Armani · Lorenzo Castigliego · Lara Tinacci · Gabriele Gandini · Daniela Gianfaldoni · Alessandra Guidi

Received: 20 December 2011 / Accepted: 6 May 2012 / Published online: 25 May 2012  Springer-Verlag 2012

Abstract The seven Angler Wsh species, which belong to Lophius ) and 25 species [ 1]. The genus Lophius is the most the genus Lophius , have a di Verent value on the market, important from an economic point of view, and its seven worldwide. If whole Wshes can be identi Wed by their mor- species, Lophius piscatorius (Angler), L. budegassa phological characteristics, they become indistinguishable (Black-bellied angler), L. vomerinus (Devil angler Wsh), when prepared or processed. In this study, a rapid method L. vaillanti (Shortspin African angler), L. americanus based on polymerase chain reaction–restriction fragment (American angler), L. gastrophysus (Black Wn goose Wsh), length polymorphism (PCR–RFLP) was developed for the and L. litulon (Yellow goose Wsh), are exploited worldwide authentication of the seven Lophius species, using a cyto- for commercialization [ 1–3]. The world catch of angler Wsh chrome b gene fragment of 566 bp. After a genus-speci Wc has increased with the improvements in Wshing technology PCR, a fast digestion with the restriction enzyme BfaI , fol- [4], and landings of the three main species, L. americanus , lowed by agarose gel electrophoresis, allowed a clear spe- L. piscatorius , and L. vomerinus , have reached more than cies identi Wcation by producing speci Wc restriction patterns. 100,000 tons in 2007 [ 5]. The total time required was as low as 6 h, DNA extraction The seven species of the genus Lophius may be easily included. The method was then used to analyse 48 commer- di Verentiated from most of the other commercial Wshes, due cial samples, whose phylogenetic analysis con Wrmed the to their peculiar dorso-ventrally Xattened body and wide PCR–RFLP response at 100 %. Results showed that misla- upwardly facing mouth. On the contrary, identi Wcation at belling occurs on the market regardless the kind of processing. species level is not straightforward. In fact, only subtle morphological and meristic di Verences exist [ 6]. Neverthe- Keywords PCR–RFLP · Species identi Wcation · Lophius · less, when still whole, some of them can be recognized Cytochrome b from details, such as the darkly pigmented peritonea in L. budegassa , the black spot on the posterior margin of the pectoral Wns in L. gastrophysus , and the pigmented dorsal Introduction and ventral surfaces in L. vaillanti . However, angler Wsh is often marketed without head and skin, in form of tails, The Lophidae Wsh family, commonly known as angler Wsh, Wllets, or slices. Such processing makes them indistinguish- includes four genera ( Sladenia , Lophiodes , Lophiomus , and able. When Wshes are distributed by a global network of oper- ators, substitutions become very easy and convenient of the more valuable species with those less appreciated and less A. Armani ( &) · L. Castigliego · L. Tinacci · D. Gianfaldoni · A. Guidi priced. For this reason, there is the need of reliable analyti- Department of Animal Pathology, Prophylaxis and Food Hygiene, cal methods to ensure the authenticity and the origin of the University of Pisa, Via delle Piagge 2, 56124 Pisa, Italy product and verify the enforcement of the Council Regula- e-mail: [email protected] tion (EC) No. 104/2000 and the Commission Regulation G. Gandini (EC) No. 2065/2001 of 22 October 2001 [ 7, 8]. The Ministry of Health DGSAN UVAC Veneto-PIF, Veneto, Italy molecular methods based on DNA analysis are the most 123 Food Chemistry 166 (2015) 1–9

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Food Chemistry

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Analytical Methods Two alternative multiplex PCRs for the identiﬁcation of the seven species of anglerﬁsh ( Lophius spp.) using an end-point or a melting curve analysis real-time protocol ⇑ Lorenzo Castigliego , Andrea Armani, Lara Tinacci, Daniela Gianfaldoni, Alessandra Guidi

Department of Veterinary Sciences, University of Pisa, Via delle Piagge 2, 56124 Pisa, Italy article info abstract

Article history: Anglerfish (Lophius spp.) is consumed worldwide and is an important economic resource though its seven Received 18 July 2013 species are often fraudulently interchanged due to their different commercial value, especially when sold Received in revised form 31 January 2014 in the form of fillets or pieces. Molecular analysis is the only possible mean to verify traceability and Accepted 5 June 2014 counteract fraud. We developed two multiplex PCRs, one end-point and one real-time with melting curve Available online 12 June 2014 post-amplification analysis, which can even be run with the simplest two-channel thermocyclers. The two methods were tested on seventy-five reference samples. Their specificity was checked in twenty Keywords: more species of those most commonly available on the market and in other species of the Lophiidae fam- Lophius ily. Both methods, the choice of which depends on the equipment and budget of the lab, provide a rapid Seafood frauds Species-identification and easy-to-read response, improving both the simplicity and cost-effectiveness of existing methods for Multiplex PCR identifying Lophius species. Real-time PCR Ó 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved. Melting curve analysis

1. Introduction of its seven species ( Lophius piscatorius, Lophius budegassa, Lophius vomerinus, Lophius vaillanti, Lophius americanus, Lophius gastrophy- Species substitution in the food sector represents a very com- sus, and Lophius litulon). Anglerfish is often sold as fillets, tails or mon fraud, and has been reported extensively both in the media pieces, so a morphological identification is sometimes impossible and the scientific press. The fish sector is widely affected by this and its different species, living in different sea areas, which occa- problem, mainly due to the sharp increase in the demand for fish sionally partially overlap (Fariña et al., 2008 ), may be intentionally products worldwide; the globalization of food chains; illegal, or unintentionally confused. unregulated and unreported (IUU) fishing; stock depletion; and Valuable fish are usually replaced with a species belonging to the increasing preference for prepared products, which lose the different genera or families. However, the most typical fraud for morphological characteristics that are essential for correct spe- substitution regarding anglerfish is the replacement of high-cost cies-identification by simple visual analysis. local species with others of the same genus, which are usually This is a serious threat for economies based on fishery, and con- imported, fresh or defrosted ( Armani, Castigliego, Tinacci, sumers become victims of the disregard of fair trade. Most com- Gandini et al., 2012 ). The closer the species, the more challenging mercialized fish may be potentially involved in such frauds it is to set up a discrimination technique that is reliable, easy to (Armani, Castigliego, & Guidi, 2012; Rasmussen & Morrissey, use, and not too expensive. 2008; Teletchea, 2009). Alternatives to morphological recognition are being developed, Anglerfish (fam Lophiidae, gen Lophius) have acquired great mainly based on protein or DNA analysis, in order to provide reli- importance from a commercial point of view ( Fariña et al., 2008 ) able tools for authentication in the light of the legal provisions, and are very frequently subject to substitution fraud ( Armani, such as the EU Commission Implementing Regulation No. 404/ Castigliego, Tinacci, Gandini et al., 2012; Espiñeira, Gonza ´lez- (2011) on the traceability of both the fish and the fishery. Laviń, Vieites, & Santaclara, 2008 ). This is mostly due to the consid- Of the DNA analysis-based methods, multiplex PCR is the pre- erable difference in commercial value and the marked resemblance ferred technique, due to its rapidity and simplicity of execution, and to the fact that it can identify more than one species with a single reaction. Multiplex PCR methods have been validated with ⇑ Corresponding author. Tel.: +39 0502210211; fax: +39 0502210213. both end-point (Gonçalves, Pereira, Amorim, & van Asch, 2012; E-mail address: [email protected] (L. Castigliego). Matsunga et al., 1999; Rodríguez et al., 2004 ) and real-time http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.06.014 0308-8146/Ó 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved. Food Chemistry 133 (2012) 184–192

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Food Chemistry

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Analytical Methods Multiplex conventional and real-time PCR for fish species identification of Bianchetto (juvenile form of Sardina pilchardus ), Rossetto ( Aphia minuta ), and Icefish in fresh, marinated and cooked products ⇑ Andrea Armani , Lorenzo Castigliego, Lara Tinacci, Daniela Gianfaldoni, Alessandra Guidi

Department of Animal Pathology, Prophylaxis and Food Hygiene, University of Pisa, Viale delle Piagge 2, 56124 Pisa, Italy article info abstract

Article history: A conventional and a realtime multiplex PCR were developed to detect fraudulent substitutions of Bian- Received 3 May 2011 chetto (juvenile form of Sardina philcardus) and Rossetto ( Aphia minuta) with Icefish ( Neosalanx spp.), Received in revised form 28 October 2011 which show similar morphological characteristics. Since it is the major by-catch species, Engraulis encra- Accepted 31 December 2011 sicolus was also included in the analytical procedure. A common reverse primer and forward species-spe- Available online 9 January 2012 cific primer were designed on the mitochondrial cytochrome b gene to amplify sequences of different lengths by conventional PCR. Specific peaks were therefore also provided after melting temperature anal- Keywords: ysis in real-time PCR, thus enabling each species to be clearly differentiated. The two PCR methods were Sardina pilchardus validated on fresh and processed products after preparing four typical dishes: two marinades (from raw Aphia minuta Engraulis encrasicolus or lightly boiled fish), a pasta sauce, and batter-fried fish cakes. All samples were correctly identified, Icefish although there was some DNA degradation after processing. Multiplex PCR Ó 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved. Cytochrome b

1. Introduction up to 60–70% of the by-catch during summer ( Cavallaro, Cavallaro, La Pera, Di Bella, & Dugo, 2007; European Union Mediterranean The increase in international trade and of fish consumption Fisheries and Exploited Resources, 2004; Romanelli et al., 2002 ). worldwide has led to the introduction in Western Countries of sev- Despite the fact that Special Fisheries were banned in 2010 as a eral exotic species. Considerable concern has arisen due to the mis- consequence of the EC Council Regulation No. 1967/2006 (2006) , labelling or fraudulent commercial use of these exotic species. some products can be imported from other fishing areas. Further- In Italy, due to their high demand, the juvenile form of Sardina more, there is the opportunity to obtain a temporary local exemp- pilchardus (named ‘‘Bianchetto’’) and Aphia minuta (‘‘Rossetto’’), are tion after the presentation of management plans aimed at ensuring very expensive (from 20 to 40 Euro per kg) ( Armani, Castigliego, the sustainable exploitation of specific resources. However, a Tinacci, Gianfaldoni, & Guidi, 2011; La Mesa, Arneri, Caputo, & Igle- reduction in total quantities will likely produce a further increase sias, 2005). They can be easily and fraudulently substituted mainly in the price of these sea products, thus making fraudulent substitu- with the less valuable Chinese Icefish (Armani et al., 2011; Tepedi- tions with less valuable species even more attractive. no, Manzoni, & Piscitelli, 2001 ). Chinese Icefish is one of the most Food and Health Inspectors face new challenges when identify- commonly exported fish to Europe ( Hu, Liu, Peng, & Yu, 2001 ) ing non-traditional species by means of morphological characteris- and, in a previous survey, we found that more than 90% of Icefish tics. This is more complicated when these characteristics are not marketed in Italy belongs to the Neosalanx taihuensis species easily discernible, as in the case of very small fish types ( Akasaki, (Armani et al., 2011 ). Saruwatari, Tomonaga, Sato, & Watanabe, 2006 ), or when the char- Bianchetto and Rossetto are considered ‘‘Special Fisheries’’ and acteristics are altered, as with processed products ( Catanese, they can be caught during their two-month coastal migration in Manchado, Fernàndez-Trujillo, & Infante, 2010 ). In fact, fraud the winter (La Mesa et al., 2005; Romanelli, Colloca, & Giovanardi, may involve fresh, frozen (Armani et al., 2011 ), preserved ( Castigli- 2002). More than 90% of the catch during the official season is one et al., 2010 ) and also processed products according to typical made up of the two aforementioned species with a strong preva- catering recipes (Author’s note). In all such cases morphological lence of S. pilchardus . The by-catch is generally quite low and is modifications make it extremely difficult to identify the species. mostly the juvenile form of Engraulis encrasicolus, which can be Moreover, DNA degradation due to heating can further complicate authentication by molecular methods, which nowadays are the ⇑ Corresponding author. Tel.: +39 502210207; fax: +39 502210213. most common approach for detecting fraudulent substitutions in E-mail address: [email protected] (A. Armani). sea products (Teletchea, 2009).

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Food Control

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Fish species identi ﬁcation in canned pet food by BLAST and Forensically Informative Nucleotide Sequencing (FINS) analysis of short fragments of the mitochondrial 16s ribosomal RNA gene (16S rRNA )

A. Armani *, L. Tinacci, X. Xiong, L. Castigliego, D. Gianfaldoni, A. Guidi

FishLab, Department of Veterinary Sciences, University of Pisa, Via delle Piagge 2, 56124 Pisa, Italy article info abstract

Article history: Nowadays, pet food claiming high-valued fish among ingredients is largely available on the market. Received 16 September 2014 Unfortunately, the modi fications induced by processing make species identi fication by visual inspection Received in revised form difficult and hinder the enforcement of the legislation on traceability. In this work, after aligning 819 11 October 2014 sequences of Clupeidae, Engraulidae, Salangidae and Scombridae families, we developed new universal Accepted 14 October 2014 primers for the ampli fication and sequencing of 2 short fragments ( ±118 and ±213) of the mitochondrial Available online 23 October 2014 16s ribosomal RNA ( 16S rRNA ) gene. Once tested on 130 DNA reference samples, these primers were used in the analysis of highly degraded DNA extracted from 43 canned cat food containing whole minnows Keywords: fi Species identification (whitebait) (M) and tuna, or bonito or mackerel llets (F). Three M and 2 F samples were analyzed for Pet food each can. A BLAST and a FINS analysis, the latter performed only on the 118 bp fragment, were performed BLAST analysis separately on the sequences obtained from M and F samples. All the M samples were identi fied at the FINS analysis species or genus level by both BLAST and FINS analysis. This allowed to highlight an impressive rate of 16S ribosomal RNA gene mislabeling (100%). F samples, for which FINS was less performing in species identi fication, resulted Mislabeling mislabeled in 40% of the products. © 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction size, life stage and high quality feed, in relation to the nutrient content (antioxidants, fibers, polyunsaturated fatty acids, etc.), are The awareness that pets can contribute to human well-being has increasingly assuming greater appeal to the buyer, who is prone to led to an increase of their number all around the world ( Wells, pay for a higher price ( Swanson, Carter, Yount, Aretz, & Buff, 2013 ). 2009 ). In the US, from 1970 to 2010, the number of dogs and cats Even though the ingredients' selection is a key element for pet food, has been estimated to be increased from 67 to 164 millions ( http:// tastiness and palatability also represent an important characteristic www.humanesociety.org/issues/pet_overpopulation/facts/pet_ for the owner. In particular, the initial perception of quality and ownership_statistics.html#.Up8y0cTuImE ). In the EU, in 2012, the nutritional need satisfaction has evolved according to socio- total number of registered pets was 204.947.400 and 72 million cultural, environmental and ethical factors. This has brought to a homes had companion animals (FEDIAF, 2012 ). further increase of the variety of the offer on the market, nowadays In this new social contest, the relationship among pets and representing a signi ficant share of the international food industry, humans has completely changed and the owner has assumed with an estimated value of 13.8 billion of euros in Europe alone personal responsibility even for their proper dietary management. (FEDIAF, 2012 ). The pet food available on the market may be mainly Pet anthropomorphization and the rising of many food related dry, moist, semi-moist, frozen chilled, and treats. In general, they pathologies (i.e obesity and food intolerances) have pushed the can be grouped in two categories: “Popular”, usually sold in grocery feed sector to search for solutions to satisfy pets nutritional needs stores or large-format pet retailers and “Premium ”, typically sold in (Lund, Armstrong, Kirk, & Klausner, 2006 ). Speci fic food for breed, veterinary practices, and pet stores ( Lund et al., 2006 ). The latter are elite products that often recall recipes and typical dishes of the culinary tradition, which are able to meet food trends and prefer- * Corresponding author. Tel.: þ390502210207; fax: þ390502210213. E-mail address: [email protected] (A. Armani). ences of the owners at the same time ( Swanson et al., 2013 ). Among URL: http://fishlab.vet.unipi.it them, the super-premium fish-based cat food, containing different http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.10.018 0956-7135/ © 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved. Food Research International 54 (2013) 1383 –1393

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Food Research International

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What is inside the jar? Forensically informative nucleotide sequencing (FINS) of a short mitochondrial COI gene fragment reveals a high percentage of mislabeling in jelly ﬁsh food products

Andrea Armani ⁎, Lara Tinacci, Alice Giusti, Lorenzo Castigliego, Daniela Gianfaldoni, Alessandra Guidi

FishLab, Department of Veterinary Sciences, University of Pisa, Via delle Piagge 2, 56124 Pisa, Italy article info abstract

Article history: The jelly fish belonging to the Rhizostomeae order are a typical Asian seafood and are nowadays also marketed in Received 4 June 2013 the Western countries. The jelly fish species used for food cannot be identi fied due to the loss of the morphological Accepted 1 October 2013 characteristics during processing. In this work, a pre-extraction treatment consisting of desalting under running water for 48 h, followed by incubation in 400 mM EDTA solution for 1 h, was developed for products containing Keywords: high concentration of salts. Moreover, considering the DNA degradation observed in both classical (CPs) and DNA sequencing ready to eat (RE) commercial samples, five sets of primers for the ampli fication of fragments with different COI gene barcoding Mislabeling lengths belonging to the mitochondrial COI gene were designed and used to obtain the sequences from 54 refer- Jelly fish ence specimens and 70 market samples. A phylogenetic analysis was then performed using the neighbor-joining PCR inhibitors method. It was found that a fragment of 142 bp was enough informative to allow identi fication at the species Degraded DNA level. The results showed that most of the products were made of Nemopilema nomurai (94% of RE and 45.5% Seafood identi fication of CPs). The analysis permitted to uncover an alarming level of mislabeling which reaches 79% for CPs and Ethnic food 100% for ready-to-eat products. © 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

1. Introduction Omori & Nakano, 2001 ). Currently, more than 15 species belonging to the Cepheidae , Catostylidae , Lobonematidae , Rhizostomatidae and The phylum Cnidaria comprises four classes: Anthozoa, Cubozoa, Stomolophidae families can be used as food, even though Rhopilema Hydrozoa and Scyphozoa. The latter, commonly called jelly fish, includes esculentum has been the most exploited for human consumption approximately 200 morphospecies, which inhabits seas and oceans (Omori & Nakano, 2001 ). Moreover, some jelly fish belonging to the worldwide ( Marques & Collins, 2004; Mayer, 1910 ). The jelly fish are fa- Semaeostomeae order have been tested for food production ( Lu, Dai, & mous due to their aggregations and blooming, which negatively affect Yan, 2003 ). Finally, we are aware that Chinese people use to collect fisheries, human enterprises and ecosystem ( Dong, Liu, & Keesing, jelly fish from beaches and to buy jelly fish from fishermen along the 2010 ). However, in some Asian countries, edible jelly fish have been Tyrrhenian coast of Italy (author's note). largely caught and exploited as food for over a thousand years ( Dong The jelly fish mainly consist of water and protein and its conserva- et al., 2010; Hsieh, Leong, & Rudloe, 2001; Omori & Nakano, 2001 ). tion can be achieved only by dehydration. This procedure, tradition- Due to their organoleptic characteristics and big dimensions, most of ally performed with a mixture of salt and alum, eliminates the the edible jelly fish belong to the Rhizostomeae order. In fact, the market compounds responsible for the sting and confers the typical elastic price of the processed jelly fish varies according to different characteris- and crispy texture ( Hsieh et al., 2001 ). Currently, two different tics, such as color, consistency, texture, and size: usually, the larger the kinds of products are available in the market: the classical one, jelly fish the higher the price ( Hsieh et al., 2001; Omori & Nakano, which, due to the high salt concentration needs a long washing 2001 ). The increased demand for jelly fish, which started from the 70s, before consumption, and the new “ready to eat ” (RE) jelly fish together with a reduction in the stock size of the Asian species, has products. While in the past these products were available only in determined the explosive development of fisheries in many other the Asian countries, nowadays the worldwide spreading of Chinese Western countries ( Hsieh et al., 2001 ). While the most part of the jelly- communities has led to their exportation even towards Western fish were initially caught in the Paci fic and Indian Oceans, starting from markets. 1969, this activity expanded all over the seas and the jelly fish actually In a previous work, we assessed the labeling conformity of some enters into commerce from all over the world ( Hsieh et al., 2001; dry-salted jelly fish products sold within the Italian Chinese communities and we found many incongruence and shortfalls mainly referable ⁎ Corresponding author. Tel.: +39 0502210207; fax: +39 0502210213. to the trade name ( Armani, D'Amico, et al., 2012 ). The inspection of E-mail address: [email protected] (A. Armani). this kind of seafood is complicated by both processing and the presence