DIVERSIFICAÇÃO E RADIAÇÃO RECENTE DE Stryphnodendron Adstringens (LEGUMINOSAE) NO CERRADO: CONSEQUÊNCIAS GENÉTICAS FRENTE ÀS MUDANÇAS CLIMÁTICAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

DIVERSIFICAÇÃO E RADIAÇÃO RECENTE DE Stryphnodendron adstringens (LEGUMINOSAE) NO CERRADO: CONSEQUÊNCIAS GENÉTICAS FRENTE ÀS MUDANÇAS CLIMÁTICAS

RAMILLA DOS SANTOS BRAGA

Orientadora: Dra. Mariana Pires de Campos Telles

Goiânia - GO Brasil Setembro – 2019

RAMILLA DOS SANTOS BRAGA

Diversificação e radiação recente de Stryphnodendron adstringens (Leguminosae) no Cerrado: consequências genéticas frente às mudanças climáticas

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas, da Universidade Federal de Goiás, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Genética e Melhoramento de Plantas.

Orientadora: Dra. Mariana Pires de Campos Telles

Goiânia, GO – Brasil 2019

Goiânia - GO Brasil

DEDICATÓRIA

Ofereço

A todos que lutaram e lutam por uma Educação Pública, Gratuita e de Qualidade! Sou o que sou por causa da Educação Pública... Se cheguei onde estou foi porque tive acesso à Universidade Pública!

Dedico,

A Deus... Aos meus pais... Aos meus tios Maria e Dó Ao meu noivo... Aos meus irmãos... Aos meus sobrinhos... A todos da minha família... Que fizeram a minha busca pelo conhecimento menos árdua, pois foram minha força e sustento!

AGRADECIMENTO

Primeiramente gostaria de agradecer as instituições de fomento que foram fundamentais para viabilizar a execução desse trabalho de tese. Neste sentido, quero agradecer ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Ecologia, Evolução e Conservação da Biodiversidade (INCT – EECBio), no contexto do grupo de trabalho de Genética e Genômica Evolutiva, subsidiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – processo 465610/20145) e Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG – processo 201810267000023). Além disso, o financiamento oriundo dos projetos Universal da CNPq (processo 402178/2016-5), e ao Universal da FAPEG (Chamada nº 07/2014, Processo: nº 201410267001736), que também foram imprescindíveis para o desenvolvimento desta tese. Agradeço à Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela disponibilidade da bolsa de doutorado, durante 42 meses do doutorado, possibilitando assim a dedicação necessária para uma formação qualificada. Atualmente, recebo uma bolsa DTI vinculada ao INCT – EECBio, que é muito importante para a continuidade da minha formação e aprimoramento profissional. Sou grata à Universidade Federal de Goiás, ao Programa de Genética e Melhoramento de Plantas, aos professores e servidores que participaram da minha formação durante o acesso ao conhecimento na Universidade Pública. Agradeço também a toda equipe do Laboratório de Genética & Biodiversidade (LGBio), sediado no ICB1-UFG e coordenado pelas professoras Dra. Mariana Pires de Campos Telles, Dra. Thannya Nascimento Soares e Dra. Rosane Garcia Collevatti e Dra. Daniela de Melo e Silva. No LGBio, pude não apenas desenvolver minha tese de doutorado, mas também me aprimorar e progredir em vários aspectos como pessoa e profissional, possibilitando-me ter acesso a um ensino superior de altíssima qualidade. Agradeço a oportunidade de sempre aprender com vocês! Quero agradecer ao professor Dr. Lázaro José Chaves e a professora Dra. Mariana Pires de Campos Telles por terem coordenado as expedições de coleta e possibilitado a execução deste projeto. Esta etapa do trabalho não é fácil, pois exige apoio logístico, financeiro e disponibilidade de recursos humanos. A coleta é um momento único e rico para conhecer mais sobre a espécie de estudo, além de conhecer a rica e linda vegetação do Cerrado. Tive a oportunidade de participar de algumas coletas e pude

conhecer este trabalho de perto e sei como foi importante para o meu amadurecimento profissional. OBRIGADA! Agradeço à minha orientadora, Dra. Mariana Pires de Campos Telles, pelos ensinamentos, amizade e parceria. Você é para mim uma grande inspiração, como mulher, mãe e profissional. Tenho muita admiração pela forma como desenvolve seu trabalho. Mas queria deixar registrado aqui minha gratidão pelas oportunidades que me ofereceu. Você foi uma das pessoas que mais acreditou em meu potencial e isso pra mim é força motivadora para continuar o meu trabalho. Palavras não são suficientes para agradecer e ressaltar a sua importância em minha vida. Você, Mariana é uma excelente orientadora, pois não apenas nos dá asas para voar, mas nos ensina como voar. OBRIGADA POR TUDO! O desenvolvimento desta tese só foi possível, pois tive pessoas que disponibilizaram o seu tempo e conhecimento para me ajudar a navegar pelo mundo das análises filogeográficas. Por isso, Tati, Jac, Natácia, Maria Augusta, Rhewter e Lucas serei sempre grata, pois aprendi mais ainda com vocês que, um trabalho só acontece com o apoio e incentivo de várias pessoas, formando uma grande equipe. Agradeço também a Ariany que sempre me ajudou nas extrações de DNA e possibilitou acelerar este trabalho. OBRIGADA A VOCÊS SEMPRE! Agradeço aos meus amigos que formei ao longo desta jornada que, por vezes me ajudaram a encontrar meu ponto de equilíbrio. Durante estes 10 anos de LGBIO, eu tive a honra de aprender e dividir a bancada, os computadores... a respeitar as diferenças... diminuir preconceitos... ser melhor e mais humilde com as pessoas... e assim ser um pouco melhor a cada dia. Ao longo desta jornada quero ressaltar a importância dos meus amigos nas pessoas da Vanessa, Tati, Thais, Rejane, Kássia, Ariany, Fernanda, Rhewter, Cíntia, Ueric, Lays, Elias, Maria Augusta, Sara, Amanda e Aliane para agradecer pelos momentos que só nós entendemos e sabemos que a amizade na pós-graduação vai além de uma relação profissional. Vocês sempre me ajudaram a sorrir em meio a tempestades e foram os ombros amigos em momentos de desabafo. A companhia de todos os dias é fundamental para seguir a vida acadêmica. Ao longo dos anos tive a gratificante tarefa de auxiliar alunos de iniciação científica, seja com uma simples ajuda e até mesmo uma co-orientação. Porém, o mais importante é que todos eles foram e são essenciais para o meu crescimento, pois sei que aprendo muito mais com eles. OBRIGADA PELA AMIZADE E COMPANHEIRISMO!

Quero agradecer à minha família e dizer que só cheguei até aqui, pois tive vocês ao meu lado me apoiando e me fortalecendo emocionalmente. Aos meus Pais, Vilmar e Valdivina e aos meus irmãos Renata, Emilio e Dalila, não consigo dimensionar o amor e gratidão que tenho por vocês. Por vezes, me pego lembrando, de toda nossa história, do esforço dos meus pais em nos verem formados e felizes. Amo vocês e estarei sempre presente para o que precisar! Aos meus pequeninos sobrinhos Henrique, Cecília e Caio, sem vocês eu não seria quem sou hoje... meu amor por vocês é imensurável! Aos meus cunhados, Leandro e Gabi, obrigada por fazerem parte da minha família e trazer alegria pra nossa casa. Aos meus tios Maria e Odomias, sem palavras pra dizer tudo que fizeram e representam para mim. Vocês são anjos que tem o dom do cuidado, do zelo e amor pela família. O que seria de mim se não estivessem presente nos momentos que mais precisei... jamais conseguirei retribuir tamanho amor por mim. Vocês dois são responsáveis pela minha vida profissional! Amo vocês! Aproveito para agradecer ao tio Reginaldo e Tetê, Tia Maria e Tio Tião que também tem grande parcela para minha formação profissional. E junto a eles agradeço todos meus tios e tias, primos e primas que sempre me trouxeram paz, conforto e incentivo. Saibam que vocês foram o gatilho e incentivo na busca pelo conhecimento. Sem vocês, eu nada seria. EU TENHO A MELHOR FAMÍLIA DO MUNDO! Agradeço ao meu amor e noivo, Adriano, pois ele é a minha força motivadora, aquele que acredita no meu potencial... Você é meu porto seguro, sempre presente nos momentos alegres e tristes. Nesta reta final de doutorado você se mostrou ainda mais como é meu companheiro, meu parceiro... Sempre solícito em me ajudar no que fosse preciso, mesmo que à distância. Sei que terei a vida inteira para retribuir todo amor e carinho pra você! Te amo muito! OBRIGADA MEU AMOR! Quero finalizar reconhecendo a presença de Deus em minha vida, conduzindo- me pelo melhor caminho e sendo minha companhia diária em meus pensamentos. Todas essas pessoas são figuras fundamentais em minha vida e possibilitaram uma formação em uma Universidade Federal, Pública e Gratuita.

SUMÁRIO

RESUMO…...... 16 ABSTRACT...... 17

1 INTRODUÇÃO...... 18

2 OBJETIVOS...... 23 3 PERGUNTAS E HIPÓTESES...... 24

4 REFERENCIAL TEÓRICO...... 25 4.1 A espécie: Stryphnodendron adstringens...... 25 4.2 Biogeografia e Mudanças Climáticas na História Evolutiva do Cerrado.....31 4.3 Filogeografia: conceitos e perspectivas...... 34 4.4 Padrões Filogeográficos em Plantas Neotropicais...... 38 4.5 A Filogeografia na Conservação de Recursos Genéticos...... 42

5 MATERIAL & MÉTODOS...... 45 5.1 Amostragem e Delineamento Experimental...... 45 5.2 Análises Moleculares e Sequenciamento...... 49 5.2.1 Extração de DNA...... 49 5.2.2 Seleção e padronização de regiões cloroplastidiais e nucleares...... 49 5.2.3 Sequenciamento Sanger...... 51 5.3 Análises Estatísticas...... 53 5.3.1 Análises de Diversidade e Estrutura Filogeográfica...... 53 5.3.2 História Demográfica e Reconstrução Ancestral...... 54 5.3.3 Padrão Espacial e Ambiental da Diversidade Genética...... 56 5.3.4 Diversidade Genética e Mudanças Climáticas...... 58

6 RESULTADOS...... 60 6.1 Diversidade e estrutura genética populacional...... 60 6.2 Padrão Filogeográfico e Reconstrução Ancestral...... 70 6.3 Padrão Espacial e Ambiental da Diversidade Genética...... 73 6.4 Diversidade Genética e Mudanças Climáticas...... 75

7 DISCUSSÃO...... 80 8 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 87

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 89

10 APÊNDICES...... 107 11 ANEXOS...... 118

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Espécies do gênero Stryphnodendron, depositadas no banco de dados REFLORA. As espécies que ocorrem fora do Brasil foram relacionadas na revisão taxonômica do gênero de Scalon et al. (2007). (AM) Amazônia; (CA) Caatinga; (CE) Cerrado; (MA) Mata Atlântica...... 26

Tabela 2. Patentes registradas na plataforma PATENTSCOPE (https://patentscope.wipo.int/search/en/search.jsf) para a espécie Stryphnodendron adstringens...... 30.

Tabela 3. Programas que executam análises que atendem os principais objetivos dentro do contexto de Filogeografia. Esta lista foi baseada no trabalho de Excoffier & Heckel (2006) e complementada de acordo com aqueles utilizados na disciplina de Filogeografia da UFG. (ML) Múltiplos Locos; (S) Sequência; (CD) Marcadores codominantes...... 37

Tabela 4. Padrões filogeográficos resultantes de trabalhos da literatura com espécies ocorrentes no Cerrado. Os estudos citados fazem parte do trabalho de Leal et al. (2016) e atualizados com trabalhos depositados na base Web of Science...... 40

Tabela 6. Relação dos primers que foram testados para amplificação no genoma cloroplastidial e nuclear de Stryphnodendron adstringens para utilização em estudos filogeográficos...... 50

Tabela 7. Regiões cloroplastidiais e nucleares utilizadas para as análises filogeográficas em populações de Stryphnodendron adstringens...... 52

Tabela 8. Descrição dos componentes de variância estimados pela AMOVA para Stryphnodendron adstringens com dados haplotípicos. P - Número total de populações; N - Número de cópias de sequências; SSD (AP) - Soma dos desvios dos quadrados entre populações; SSD (WP) - Soma dos desvios dos quadrados dentro de populações; SSD (T) - Soma dos desvios dos quadrados 2 2 total; σ a - Componente de variância devido diferenças entre G populações; σ b - Componente de variância devido diferenças entre haplótipos em diferentes 2 populações dentro de um grupo; σ T - Variância molecular total...... 53

Tabela 9. Caracterização genética de cada região do genoma cloroplastidial e nuclear que foram analisadas para Stryphnodendron adstringens. As estimativas de diversidade genética foram obtidas pelo programa ARLEQUIN v.3.1. (Ts) Número total de eventos de transição nucleotídica; (Tv) Número total de eventos de transversão nucleotídica; (S) Número total de sítios polimórficos;

(k) Número total de haplótipos; (h) Diversidade haplotípica total; (π) Diversidade nucleotídica total; (SD) Desvio-padrão da diversidade nucleotídica total...... 60

Tabela 10. Diversidade genética e parâmetros demográficos das 17 populações avaliadas de Stryphnodendron adstringens, distribuídas no Cerrado do Brasil Central. As estimativas de diversidade genética foram obtidas para cada partição separadamente, cpDNA e ETS, enquanto que os parâmetros demográficos levam em conta os dados combinados das duas partições. (N) Número de indivíduos por população; (k) Número de haplótipos por população; (h) Diversidade haplotípica por população; (π) Diversidade nucleotídica por população; (SD) Desvio-padrão da diversidade nucleotídica por população; (θ) Parâmetro de coalescência e o intervalo de credibilidade de 95%; (g) Taxa de crescimento populacional e o intervalo de credibilidade de 95%...... 62

Tabela 11. Estrutura genética obtida com as 17 populações de Stryphnodendron adstringens, aplicando a Análise de Variância Molecular (AMOVA) no programa ARLEQUIN v. 3.1...... 67

Tabela 12. Classes de distâncias geográficas do correlograma de Mantel, decompondo a influência espacial sobre a distância genética das 17 populações de Stryphnodendron adstringens para a região ETS 18S...... 74

Tabela 13. Mantel parcial, descontando o efeito da distância genética sobre o espaço geográfico e as variáveis ambientais, considerando as 17 populações de Stryphnodendron adstringens para a região ETS 18S...... 74

LISTA DE FIGURAS Figura 1. A espécie Stryphnodendron adstringens e detalhamento de suas partes vegetativas. (A) Árvore de barbatimão em campo; (B) Caule da espécie e suas relações simbióticas; (C) Folhas multifolioladas; (D) Inflorescência simples do tipo espiga; (E) Frutos ainda na fase indeiscente; (F) Fruto deiscente, com as sementes no interior; (G) Frutos secos na árvore de S. adstringens. Foto: Mariana P. de C. Telles e Ramilla dos S. Braga. O registro foi realizado na Reserva Particular do Patrimônio Natural Ecocerrado Brasil, Araxá-MG. (H) Mapa de ocorrência de S. adstringens, informações disponibilizados na base de dados do REFLORA...... 27

Figura 2. Pontos de coleta de indivíduos e distribuição geográfica das 17 populações de Stryphnodendron adstringens no bioma Cerrado utilizadas para investigação de padrões filogeográficos de S. adstringens A área em cinza destaca os limites do bioma Cerrado. Para os códigos das localidades veja Tabela 5...... 48

Figura 3. Diversidade haplotípica e nucelotídica populacional de Stryphnodendron adstringens arranjadas no espaço geográfico. As diversidades haplotípica e nucleotídica de cpDNA são representadas em A e B, respectivamente. Enquanto que, as diversidades haplotípica e nucleotídica de ETS estão representadas em C e D, respectivamente...... 63

Figura 4. Rede de haplótipos para as regiões combinadas de cpDNA e para ETS 18S. As diferentes cores são relacionadas para cada população. Os passos mutacionais são indicados pelos traços em cada ligação haplotípica. O tamanho de cada círculo é proporcional ao número de indivíduos que apresentam cada haplótipo...... 64

Figura 5. Padrão de distribuição geográfica dos haplótipos encontrados para cpDNA (A) e para ETS 18S (B) em Stryphnodendron adstringens. As cores são referentes aos diferentes haplótipos...... 66

Figura 6. Agrupamentos genéticos obtidos com a análise no BAPS v. 6.0, organizados de acordo com a distribuição geográfica das 17 populações de Stryphnodendron adstringens. A estrutura genética destaca os resultados encontrados para as regiões combinadas de cpDNA (A) com a identificação de seis clusters genéticos e nove clusters para ETS 18S (B)...... 69

Figura 7. Comportamento do tamanho efetivo populacional obtido com a análise de EBSP, demonstrando equilíbrio demográfico histórico. Eventos de expansão são recentes, observado pela mudança no tempo presente a partir dos valores da média pela linha em preto. Em azul são mostrados os intervalos de credibilidade de 95%...... 70

contempla a maioria dos eventos de diversificação (subclados A, B e C) e o clado D com as populações de BAMMG, CANMG, ORIGO e SILGO. As barras em azul são os intervalos de 95% de intervalo de credibilidade, considerando a idade média de cada nó. Os valores acima de cada nó indicam a idade média de cada nó e os valores a posteriori são relacionados abaixo de cada nó. Os valores a posteriori em cinza apresentam valores abaixo de 0,7. (B) Distribuição geográfica no Cerrado dos clados colapsados na árvore de coalescência com o refúgio histórico delimitado. O refúgio histórico foi determinado a partir das análises de Barbosa et al. (2019)...... 72

Figura 9. Correlograma de Mantel obtido com sete classes de distâncias geográficas versus a distância genética de Stryphnodendron adstringens para a região ETS. O espaço geográfico é um componente significativo nas duas primeiras e na última classes de distâncias geográficas, indicando um padrão clinal da organização espacial da variação genética...... 73

Figura 10. Agrupamentos genéticos-ambientais obtidos pela análise do programa POPS v.1.2 a partir de simulações bayesianas para as regiões cpDNA e ETS combinadas. Esta análise considera tanto variáveis espaciais, genéticas e ambientais para estimar mudanças de grupos genéticos, devido às flutuações climáticas sob diferentes cenários. Os três mapas demonstram o comportamento dos grupos para variáveis do presente (A) e simuladas para os cenários futuros de RCP 4.5 (B) e RCP 6.0 (C). (D) Mudanças da coancestria para os 11 grupos genéticos obtidos para as duas regiões combinadas, indicando perda ou persistência dos grupos do presente para os cenários futuros...... 77

Figura 11. Agrupamentos genéticos-ambientais obtidos pela análise do programa POPS v.1.2 a partir de simulações bayesianas para cpDNA. Esta análise considera tanto variáveis espaciais, genéticas e ambientais para estimar mudanças de grupos genéticos, devido às flutuações climáticas sob diferentes cenários. Os três mapas demonstram o comportamento dos grupos para variáveis do presente (A) e simuladas para os cenários futuros de RCP 4.5 (B) e RCP 6.0 (C). (D) Mudanças da coancestria para os seis grupos genéticos obtidos para cpDNA, indicando perda ou persistência dos grupos do presente para os cenários futuros...... 78

Figura 12. Agrupamentos genéticos-ambientais obtidos pela análise do programa POPS v.1.2 a partir de simulações bayesianas para ETS. Esta análise considera tanto variáveis espaciais, genéticas e ambientais para estimar mudanças de grupos genéticos, devido às flutuações climáticas sob diferentes cenários. Os três mapas demonstram o comportamento dos grupos para variáveis do presente (A) e simuladas para os cenários futuros de RCP 4.5 (B) e RCP 6.0 (C). (D) Mudanças da coancestria para os 11 grupos genéticos obtidos para ETS, indicando perda ou persistência dos grupos do presente para os cenários futuros...... 79

RESUMO

BRAGA, R. S. Diversificação e radiação recente de Stryphnodendron adstringens (Leguminosae) no Cerrado: consequências genéticas frente às mudanças climáticas. 2019. 118 f. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Plantas) – Escola de Agronomia, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 20191.

A espécie Stryphnodendron adstringens (barbatimão) é considerada um recurso genético valioso do Cerrado brasileiro, principalmente em função de suas propriedades medicinais. As populações naturais desta espécie carecem de estudos de planos de manejo, devido à fragmentação do Cerrado, visando propor estratégias de conservação. Espécies deste gênero tiveram diversificação recente no Cerrado, tornando-se bons modelos para avaliar padrões genéticos intraespecíficos no bioma. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os padrões filogeográficos de S. adstringens, a fim de inferir sobre as hipóteses de diversificação de suas linhagens no tempo e espaço. Além disso, mensurar o impacto de mudanças climáticas futuras na distribuição geográfica e na variação genética desta espécie. Para tanto, o polimorfismo no DNA de regiões cloroplastidiais (psbA-trnH e trnL-F) e nuclear (ETS) foi quantificado em indivíduos de 17 localidades no Cerrado. Foram estimados os níveis de diversidade haplotípica e nucleotídica para verificar a diferenciação genética populacional. Por meio de análises de coalescência foram estimados parâmetros demográficos históricos e o tempo de divergência entre as populações de S. adstringens. A adequabilidade ambiental de S. adstringens no passado, presente e refúgio histórico foi usada para identificar padrões espaciais sobre a diversidade genética populacional. Grupos genéticos atuais e futuros foram simulados a partir de cenários climáticos. Foi encontrada uma baixa diversidade genética para cpDNA e ETS e a distribuição geográfica dos haplótipos reflete um padrão de arranjo incompleto de linhagens. Há padrões discordantes de estrutura genética interpopulacional entre as regiões do genoma, com maior efeito para cpDNA. Equilíbrio demográfico histórico foi evidenciado para S. adstringens, ao contrário do encontrado por ENM, indicando retração de áreas de ocorrência geográfica. O ancestral comum mais recente foi datado em 1,7 Ma atrás, dividindo em dois clados principais e a maioria dos eventos de diversificação datando no Pleistoceno Médio. A estrutura espacial é mais forte para ETS, sugerindo a existência de isolamento por distância e isolamento ambiental, devido variações de temperatura. Populações mais próximas da borda do refúgio histórico detêm maior diversidade genética que podem ser associadas a múltiplos refúgios históricos e transição ecológica de ambientes florestais para savânicos. Os grupos genéticos, modelados sob as condições climáticas atuais e futuras, apontam perdas e homogeneização da variação genética para a espécie. Os dados encontrados corroboram com a diversificação populacional recente de S. adstringens, reforçando o padrão filogenético em espécies deste gênero no Cerrado. Além disso, os baixos níveis de diversidade genética refletem os efeitos dos períodos glaciais e interglaciais no Pleistoceno, sugerindo a formação de múltiplos refúgios. O impacto das mudanças climáticas e o uso inadequado das populações naturais deste recurso genético indicam a necessidade de planos de manejo e conservação para a espécie.

Palavras-chave: Barbatimão; Cenários Climáticos; Coalescência; Filogeografia; Recursos Genéticos.

1Orientadora: Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles

ABSTRACT

BRAGA, R. S. Recent diversification and radiation of Stryphnodendron adstringens (Leguminosae) in the Cerrado: genetic consequences of climate change. 2019. 118 f. Thesis (PhD in Genetics and Plant Breeding) - School of Agronomy, Federal University of Goiás, Goiânia, 20191.

The species Stryphnodendron adstringens (barbatimão) is considered a valuable genetic resource of the Brazilian Cerrado, mainly due to its medicinal properties. It has been exploited in an extractive manner in its natural habitat, requiring studies of conservation and management plans. Species of this genus had recent diversification in the Cerrado, becoming interesting models for evaluating intraspecific genetic patterns in the biome. In this context, the objective of this work was to evaluate the phylogeographic patterns of S. adstringens, in order to infer about the hypotheses of diversification of their lineages in time and space. Beyond to measure the impact of future climate changes on the geographic distribution of the genetic variation of this species. For this, the DNA polymorphism of chloroplastid (psbA-trnH and trnL-F) and nuclear (ETS) regions was quantified in individuals from 17 localities in the Cerrado. Haplotype and nucleotide diversity levels were evaluated to verify the population genetic differentiation. Coalescence analyses were performed to estimate historical demographic parameters and to identify divergence time among populations of S. adstringens. The environmental suitability of S. adstringens in the past, present and historical refuge was used to identify spatial patterns on population genetic diversity. Current and future genetic clusters were simulated from climatic scenarios. Low genetic diversity was found for cpDNA and ETS and the geographical distribution of haplotypes reflects an incomplete lineage sort. There are discordant patterns of interpopulation genetic differentiation between regions of the genome, with greater effect for cpDNA. Historical demographic equilibrium was evidenced for S. adstringens, contrary by ENM, indicating retraction of range. Most recent common ancestor was dated to 1.7 Ma ago, dividing into two main clades with most of the diversification events dating to the Middle Pleistocene. The spatial structure is stronger for ETS, suggesting the existence of isolation by distance and environmental isolation due to temperature variations. Populations closer to the edge of the historic refuge have greater genetic diversity that can be associated with multiple historical refuges and ecological transition from forest to savanna environments. Genetic clusters modeled under current and future climatic conditions, indicate losses and homogenization of genetic variation for the species. The data corroborate the recent population diversification of S. adstringens in the Cerrado, reinforcing the phylogenetic pattern in species of this genus. Beyond, low levels of genetic diversity, reflecting the effects of glacial and interglacial periods in the Pleistocene, suggesting multiple refuges formation. The impact of climate change and the disorderly exploitation of the natural populations of this genetic resource indicate the need for management and conservation plans of the species. Keywords: Barbatimão; Climate changes; Coalescence; Genetic Resources; Phylogeography.

1 Orientadora: Profa. Dra. Mariana Pires de Campos Telles

1 INTRODUÇÃO

O estudo da diversidade biológica abarca pilares muito importantes que se justificam pela sua conservação, uso sustentável e utilização consciente dos recursos genéticos. O Brasil detém alta biodiversidade, entretanto, muitas espécies carecem de estudos e pesquisas que auxiliem na sua preservação e sustentabilidade (Pilon et al., 2017). Investigações científicas na área de biodiversidade, além de fornecer informações básicas, oferecem também subsídios para a sociedade na área da saúde, economia e alimentação. Como subsídio a trabalhos sobre a biodiversidade destaca-se a Convenção sobre Diversidade Biológica (CBD) que é um dos principais tratados que visa definir metas para estudar e compreender a biodiversidade da Terra (CBD, 2017). O Brasil é um país signatário da CBD e tem como objetivo maior conservar biomas e estabelecer estratégias de manejos dentro de seus domínios vegetacionais (Pacheco et al., 2018). O Brasil é um país rico em biodiversidade, contemplado por diferentes biomas que abrigam alta riqueza de espécies. Dentre estes biomas, o Cerrado se diferencia pela sua diversidade biológica, com um grande número de espécies da fauna e flora, sendo caracterizado como um hotspot de biodiversidade (Myers et al., 2000). Ele integra tipos vegetacionais que são incluídos dentro dos biomas de vegetação aberta, circundado pela Amazônia, Mata Atlântica e Caatinga, e junto com este último abrangem a região conhecida como Diagonal Seca (Werneck, 2011; Vieira et al. 2019). O Cerrado possui uma diversificação inicial datada de aproximadamente 10 milhões de anos e com a maioria das linhagens diversificando em torno de 4 milhões de anos (Simon et al., 2009). As adaptações ao fogo e atributos geológicos históricos tornam o Cerrado rico em espécies, favorecendo processos de evolução in situ (Simom et al., 2009). Investigações sobre diversidade e estrutura genética são bastante necessárias no contexto de conhecer a dinâmica evolutiva de espécies do bioma Cerrado (Werneck, 2011). A origem e evolução do bioma Cerrado envolvem fatores climáticos, edáficos e de fogo que interagiram desde os períodos do Terciário e Quaternário, influenciando na diversidade de fauna e flora (Pinheiro & Monteiro, 2008). A riqueza florística deste bioma

foi caracterizada e identificaram que a família Leguminosae (denominada também de Fabaceae), um dos grupos botânicos mais bem estudados (LPWG, 2013; Simon et al., 2016; LPWG, 2017), compreende uma das famílias com maior representação botânica no Cerrado (Mendonça et al., 2008). Atualmente, são reconhecidas seis subfamílias para esta família, definidas por abordagem molecular (LPGW, 2017). Ainda assim, um parafiletismo é encontrado para espécies do clado mimosoid, tornando um grupo interessante para novos estudos. Diferentes áreas do conhecimento fornecem suporte teórico e metodológico para avaliar padrões de evolução interespecíficos e intraespecíficos. Aspectos biogeográficos e filogenéticos permitem recontar processos históricos que moldam a distribuição de linhagens dentro do bioma Cerrado (Bueno et al., 2017; Buzatti et al., 2017). Dentro desta perspectiva, é interessante endereçar questões para avaliar a variação genética em nível populacional, identificar refúgios históricos que propiciaram diferenciação genética ao longo do tempo e auxiliar no apontamento de estratégias de conservação (Moritz & Faith, 1998; Collevatti et al., 2011). Abordagens filogeográficas já foram utilizadas com algumas espécies do Cerrado, levantando dados e inferências sobre o comportamento demográfico, níveis de hibridização e introgressão genética, além da influência de flutuações climáticas históricas (Ramos et al., 2007, 2009; Collevatti et al., 2009; Novaes et al., 2013; Leal et al., 2016). Análises filogeográficas, acopladas às metodologias de modelagem de nicho ecológico e testes de cenários demográficos, ampliaram o leque de inferências para avaliar com profundidade como a história evolutiva das populações ocorre no tempo e espaço (Knowles, 2009; Collevatti et al., 2012a, 2012b; Collevatti et al., 2015). Estas ferramentas metodológicas vêm mostrando que a organização da variação genética populacional de plantas no Cerrado tem sido uma complexa interação entre as mudanças climáticas entre os ciclos glaciais e interglaciais que ocorreram desde o início do Pleistoceno, no período Quaternário (Prado & Gibbs, 1993; Ab’Sáber, 2000; Pennington et al., 2000; Werneck et al., 2012). O impacto das repetidas glaciações ao longo do tempo leva a analisar hipóteses biogeográficas sobre populações conectadas a um único e grande refúgio histórico ou se foram isoladas historicamente em múltiplos refúgios, caracterizados por respostas específicas às condições climáticas locais. Considerando a família Leguminosae e um dos gêneros do clado mimosoid, Stryphnodendron que, apresenta importância medicinal e econômica dentro do Cerrado

teve o seu relacionamento filogenético estudado, gerando a filogenia do grupo (Simon et al., 2016). Os autores deste trabalho encontraram que as espécies do bioma Cerrado integram um grande clado que não foi bem resolvido filogeneticamente, devido à existência de politomias e relações não resolvidas para algumas espécies de Stryphnodendron. A partir do baixo suporte filogenético, há a sugestão que as espécies do Cerrado e Amazônia com influência do fogo, tiveram uma recente diversificação e rápida radiação. Este padrão evolutivo em escala interespecífica também pode ser refletido em relações intraespecíficas. Assim, a espécie Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville., considerada a espécie-tipo do grupo (Scalon, 2007) e na filogenia está incluída no clado das espécies do Cerrado (Simon et al., 2016), é um bom modelo para verificar como a dinâmica evolutiva ocorre em nível populacional para averiguar padrões filogeográficos e demográficos no Cerrado. A espécie S. adstringens é uma árvore endêmica do Brasil e ocorre predominantemente no Cerrado sensu stricto (Scalon, 2007), que pode ser considerada um bom modelo para estudos filogeográficos no contexto do Cerrado. A espécie é popularmente conhecida como barbatimão e é amplamente utilizada pelas suas propriedades medicinais, com sua casca sendo uma das principais partes vegetativas relacionadas a este tipo de uso (Souza-Moreira et al., 2018). A alta produção de metabólitos secundários, relacionada a uma série de aplicações, como antioxidante, cicatrizante, antimicrobiana, anticancerígena, fazem de S. adstringens um recurso genético valioso (veja Souza-Moreira et al., 2018 para revisão de uso medicinal). Esta espécie apresenta flores andromonoicas no mesmo indivíduo (andromonoico) e sua polinização é realizada principalmente por abelhas e outros pequenos insetos (Felfili et al., 1999; Ortiz et al., 2003). Em alguns estudos, a estrutura genética populacional de S. adstringens foi avaliada com diferentes marcadores, visando principalmente estabelecer informações para propostas de conservação genética e relacionando à sua variação fitoquímica, ao longo de sua distribuição geográfica (Zimback et al., 2011; Mendonça et al., 2012; Glasenapp et al., 2014; Barateli, 2018; Souza, 2019). Marcadores AFLP indicaram que esta espécie apresenta uma estrutura genética complexa e que populações mais centrais apresentam menor diversidade genética (Mendonça et al., 2012). A variabilidade genética encontrada com AFLP mostrou que, grupos genéticos com menor diversidade genética estão relacionados com altas concentrações de taninos, uma característica que se mostrou

influenciada por condições climáticas (Santos et al., 2006; Corrêa et al., 2011). Até então, os trabalhos acima com S. adstringens, não avaliaram a relação genética entre suas linhagens populacionais para recontar sua história evolutiva. Assim, entender a dinâmica evolutiva histórica desta espécie, relacionando à sua distribuição geográfica, permite confirmar padrões evidenciados em nível interespecífico (Simon et al., 2016) e avaliar como eventos de diversificação levaram à estrutura genética de S. adstringens. No âmbito espacial e ecológico, análises recentes de modelagem de nicho ecológico (em inglês, Ecological Niche Modeling - ENM), para S. adstringens, mostraram que retrospectivamente a área de ocorrência desta espécie foi maior quando comparada à distribuição geográfica atual (Barbosa et al., 2019). Além disso, estes autores alertaram para uma diminuição de áreas climaticamente adequadas para a ocorrência de S. adstringens, causada pelo aumento de temperatura e níveis de radiação solar até 2100. Os padrões ecológicos encontrados com a modelagem de nicho podem auxiliar na compreensão de parâmetros demográficos, avaliados com dados genéticos (Collevatti et al., 2015; Souza et al., 2017; Vittorino et al., 2018), fornecendo informações complementares para o planejamento de estratégias de conservação e manejo de populações naturais de S. adstringens. Esta abordagem torna-se importante, uma vez que é sabido que, populações viáveis são mantidas por meio da manutenção de níveis adequados de diversidade genética, permitindo manterem-se mesmo com os efeitos advindos das mudanças climáticas (Scheffers et al., 2016). Para S. adstringens, os efeitos climáticos, fragmentação do Cerrado e exploração de populações naturais a partir da sua casca para várias aplicações medicinais, são aspectos que podem impactar diretamente na estrutura genética da espécie, comprometendo sua viabilidade em longo prazo (Borges-Filho & Felfili, 2003; Klink & Machado, 2005; Scheffers et al., 2016). Sob este ponto de vista, a diversidade genética pode ser acessada a partir de perspectivas espaço-temporais, refletindo a influência histórica de processos evolutivos associados a aspectos ecológicos, biogeográficos e climáticos. Consequentemente, a informação obtida sobre padrões genéticos fornece subsídios para demandas de caracterização de recursos genéticos, embasando trabalhos posteriores de manejo, melhoramento genético, uso na biotecnologia e conservação genética in situ e ex situ, principalmente de populações naturais como S. adstringens. Nesse contexto, o presente estudo tem por objetivo inferir quais padrões filogeográficos são responsáveis por moldar a estrutura genética de S. adstringens e como

eventos de diversificação ocorreram na história evolutiva da espécie, examinando a influência espacial e temporal. Além disso, pretende-se avaliar o comportamento da diversidade genética, frente às flutuações climáticas futuras, fornecendo informações básicas para propostas de manejo e futuros programas de melhoramento genético de populações naturais desta espécie.

2 OBJETIVO GERAL

Avaliar e descrever os padrões filogeográficos que influenciaram na diversificação intraespecífica de S. adstringens, distribuída ao longo do bioma Cerrado, examinando a variação genética de regiões cloroplastidiais e nucleares. Além disso, buscou-se verificar o impacto de mudanças climáticas futuras na distribuição da variação genética desta espécie no espaço geográfico.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Selecionar regiões não-codificantes do genoma cloroplastidial e nuclear para estudar os padrões filogeográficos de S. adstringens;  Quantificar a diversidade e estrutura genética em populações de S. adstringens do Cerrado;  Identificar o processo demográfico que explica a dinâmica evolutiva e populacional de S. adstringens;  Estabelecer a relação filogenética populacional de S. adstringens e obter o tempo do ancestral comum mais recente (TRMCA) da espécie;  Avaliar a organização da diversidade genética no tempo e no espaço, a fim de compreender a estrutura filogeográfica de S. adstringens;  Simular como a diversidade genética de S. adstringens será afetada no futuro, em função de flutuações climáticas;

3 PERGUNTAS E HIPÓTESES

O presente estudo pretendeu levantar dados que permitiram responder às seguintes questões:

1) Como a estrutura filogeográfica de S. adstringens foi afetada no contexto histórico, levando em consideração a influência espaço-temporal? 2) Como a diversidade genética se comporta frente às mudanças climáticas futuras?

Para tanto, as seguintes hipóteses de trabalho foram estabelecidas:

1) Considerando a filogenia das espécies do gênero Stryphnodendron, espera-se que S. adstringens apresente origem e diversificação recente no bioma Cerrado. 2) Considerando a influência de eventos climáticos no Último Máximo Glacial (LGM) na distribuição de linhagens no Cerrado, espera-se que os padrões filogeográficos de que S. adstringens tenham sido moldados por estas alterações climáticas, no período Quaternário, com populações localizadas em refúgios históricos apresentando maiores níveis de diversidade genética, devido às áreas de estabilidade climática. 3) Tendo em vista os cenários futuros de mudanças climáticas e a modelagem de nicho ecológico de S. adstringens, espera-se que haverá alterações na distribuição geográfica dos grupos genéticos e perda significativa de variabilidade genética em relação à variação genética atual.

4 REFERENCIAL TEÓRICO

4.1 A espécie: Stryphnodendron adstringens

A família Leguminosae é alvo de muitos estudos de taxonomia filogenética e apresenta espécies com grande impacto econômico (Käss & Wink, 1996, Wojciechowski et al., 2004). Na literatura, esta família é referida como Leguminosae ou Fabaceae, porém nesta tese seguiu-se com a nomenclatura Leguminosae. Dentre as angiospermas, Leguminosae é considerada a terceira maior família, ficando atrás somente de Asteraceae e Orchidaceae, apresentando 751 gêneros e 19.500 espécies em todo mundo (Lewis et al., 2005; LPWG, 2013). Com a nova classificação das leguminosas, a extinta subfamília Mimosoideae agora é um clado que integra a subfamília Caesalpinoideae, junto com as atuais subfamílias (Duparquetioideae; Cercidoideae; Detarioideae; Dialioideae; Caesalpinioideae e Papilionoideae) (LPWG, 2017). Esta nova divisão se justifica pela incongruência do relacionamento filogenético interespecífico das leguminosas que é intensamente estudado pelo Legume Phylogeny Working Group (LPWG). O clado mimosoid compreende cerca de 80 gêneros e mais de 3300 espécies, em vários continentes com diferentes tipos de clima (Lewis et al., 2005; LPWG, 2017). No Brasil, 35 gêneros são representados e apresentam alta riqueza de espécies (Escobar et al., 2017; BFG, 2015). Entre os gêneros deste clado, destaca-se o gênero Stryphnodendron que apresenta 25 espécies (Tabela 1) e é considerado tipicamente brasileiro, pois a maioria das espécies que o compõem ocorre exclusivamente no território do Brasil (Occhioni, 1990). Suas espécies diferem, principalmente pelo hábito de vida e locais de ocorrência, separadas entre ambientes florestais e biomas de áreas abertas, tipo savânicos (Scalon, 2007). Espécies mimosoideas são encontradas em diversos ambientes e análises de padrões de evolução cariotípica indicam que as espécies destes grupos apresentam número básico cromossômico de x = 13 e eventos de diploidização mais recentes sugerem poliploidia ancestral (Santos et al., 2012). Para espécies de Stryphnodendron, o número cromossômico é 2n = 26 e com x = 13.

Nº Espécie Bioma/País 1 Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville CE e CA 2 Stryphnodendron barbatulum Rizzini & Heringer CE 3 Stryphnodendron confertum Heringer & Rizzini CE 4 Stryphnodendron coriaceum Benth. CE 5 Stryphnodendron cristalinae Heringer CE 6 Stryphnodendron fissuratum E.M.O.Martins CE 7 Stryphnodendron gracile Heringer & Rizzini CE 8 Stryphnodendron heringeri Occhioni CE 9 Stryphnodendron pumilum Glaz. CE 10 Stryphnodendron polyphyllum Mart. CA, CE e MA 11 Stryphnodendron rotundifolium Mart. CE 12 Stryphnodendron duckeanum Occhioni AM 13 Stryphnodendron foreroi E.M.O.Martins AM 14 Stryphnodendron guianense (Aubl.) Benth. AM e CA 15 Stryphnodendron microstachyum Poepp. & Endl. AM 16 Stryphnodendron occhionianum E.M.O.Martins AM 17 Stryphnodendron paniculatum Poepp. & Endl. AM 18 Stryphnodendron polystachyum (Miq.) Kleinh. AM 19 Stryphnodendron pulcherrimum (Willd.) Hochr. AM e MA 20 Stryphnodendron racemiferum (Ducke) W.A.Rodrigues AM 21 Stryphnodendron roseiflorum (Ducke) Ducke AM e MA 22 Stryphnodendron excelsum Harms Nicarágua, Costa Rica e Panamá 23 Stryphnodendron levelii R. S. Cowan Venezuela 24 Stryphnodendron moricolor Barneby & Grimes Guiana Francesa 25 Stryphnodendron porcatum D.A.Neill. & Occhioni Equador

A relação filogenética de Stryphnodendron e outras espécies do clado mimosoid foi investigada por Simom et al. (2016), sugerindo que este grupo tem origem recente no bioma Cerrado e que houve uma transição ecológica de florestas úmidas para ambientes savânicos, devido a uma rápida evolução e radiação. Neste sentido, a distribuição das espécies de Stryphnodendron ocorre em dois centros principais, Amazônia e Cerrado (Scalon, 2007). Por este motivo, avaliar padrões de distribuição tanto em nível inter quanto intraespecífico nestes biomas auxilia na compreensão evolutiva do gênero. Uma das espécies mais importantes e reconhecidas deste gênero é Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville. (Figura 1), popularmente conhecida como barbatimão (também pode ser denominada de barba-de-timão, casca-da-virgindade, faveira

e barbatimão branco), tem ocorrência no bioma Cerrado e Caatinga, nos estados do Tocantins, Bahia, Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Paraná, segundo informações depositadas no banco de dados botânico nacional REFLORA (Forzza et al., 2012; BFG, 2015).

Figura 1. A espécie Stryphnodendron adstringens e detalhamento de suas partes vegetativas. (A) Árvore de barbatimão em campo; (B) Caule da espécie e suas relações simbióticas; (C) Folhas multifolioladas; (D) Inflorescência simples do tipo espiga; (E) Frutos ainda na fase indeiscente; (F) Fruto deiscente, com as sementes no interior; (G) Frutos secos na árvore de S. adstringens. Foto: Mariana P. de C. Telles e Ramilla dos S. Braga. O registro foi realizado na Reserva Particular do Patrimônio Natural Ecocerrado Brasil, Araxá- MG. (H) Mapa de ocorrência de S. adstringens, informações disponibilizados na base de dados do REFLORA.

Plantas de barbatimão possuem porte arbóreo e suas características reprodutivas são marcadas pela existência de flores masculinas e hermafroditas em um mesmo espécime (Ortiz et al., 2003; Scalon, 2007). A polinização cruzada é mais eficiente para S. adstringens, realizada por pequenos insetos, sobretudo por abelhas Meliponinae, apresentando dispersão de semente via zoocoria por pequenos roedores (Felfili et al., 1999; Ortiz et al., 2003). A espécie em foco representa um recurso genético de grande importância econômica e medicinal, pois a partir dos elevados índices de taninos e polifenóis, diversas aplicações são derivadas de S. adstringens (Meira et al., 2013). A casca é a parte vegetativa com maior utilização no contexto medicinal, devido às suas atividades cicatrizantes, anti- inflamatória, antioxidante, antimicrobiana e anticancerígena (Souza-Moreira et al., 2018). Devido às suas propriedades medicinais, S. adstringens integra uma lista de incentivo para

a produção de fitoterápicos, refletindo a necessidade de estudos que contemplem características biológicas, níveis de toxicidade e conservação genética para a manutenção de suas populações naturais (Figueredo et al., 2014). Atualmente, uma pomada feita exclusivamente com a casca do barbartimão é registrada à ANVISA (ASPEN, 2019), comercialmente conhecida como FITOSCAR®. A composição química contém 60 mg de extrato seco desta espécie, compreendendo 50% da pomada e, assim demanda alta quantidade vegetativa. A saúde animal também aproveita destes benefícios, pois foi constatada ação inibitória do herpesvírus bovino 1 (Felipe et al., 2006). A Tabela 2 traz as patentes oriundas de metabólitos e princípios ativos que servem principalmente ao contexto médico, destacando o uso para tratamento contra o vírus HIV. Para uma revisão detalhada sobre conhecimento etnobotânico, farmacológico, bioquímico e toxicológico veja Souza-Moreira et al. (2018), disponibilizando os principais trabalhos que envolvem as diversas aplicações medicinais de Stryphnodendron. A exploração sem manejo de barbatimão em seu habitat natural, causada pelos seus atributos medicinais, é um alerta para o desenvolvimento de trabalhos que visem avaliar seu comportamento populacional em médio e longo prazo. Alguns trabalhos básicos trouxeram informações que auxiliam na conservação e domesticação desta espécie, a fim de fornecer informações para uso adequado de populações naturais (Souza-Moreira et al., 2018). Estes trabalhos compreendem características de germinação (Martins et al., 2008; Meira et al., 2013), micropropagação (Nicioli et al., 2008), caracterização de taninos (Corrêa et al., 2011), favorecendo os estudos futuros referentes ao melhoramento genético da espécie. Uma primeira inciativa de conservação da espécie foi implementada com a instalação da Reserva Particular do Patrimônio Natural (RPPN) Ecocerrado Brasil (Corrêa et al., 2012), no município de Araxá-MG. Nesta RPPN, sementes de diversas matrizes distribuídas no bioma Cerrado foram plantadas e formam o primeiro banco de germoplasma ex situ de S. adstringens, a fim de conservar este recurso genético. Alguns trabalhos foram realizados para investigar a variação genética de S. adstringens e como ela é distribuída em seus locais de ocorrência (Zimback et al., 2011; Mendonça et al., 2012; Glasenapp et al., 2014). Marcadores moleculares do tipo AFLP foram empregados para correlacionar variação genética e níveis de taninos em populações naturais de S. adstringens, indicando que tipos químicos estão mais relacionados geneticamente (Mendonça et al., 2012). Com o objetivo de fornecer estratégias de conservação de germoplasma e melhoramento, foi avaliada como a distância geográfica em

escala intrapopulacional afeta a estrutura da variação genética (Zimback et al., 2011). Os resultados mostraram que indivíduos de barbatimão próximos até 132 metros tendem a ser mais similares geneticamente, sugerindo abordagens de coleta para conservação de germoplasma. O conhecimento de linhagens com maior variação genética, ajudaria com a implementação de medidas de uso e aproveitamento natural deste recurso genético. Além disso, mudanças climáticas podem causar diminuição de áreas com alta adequabilidade para a sobrevivência da espécie, reafirmando a necessidade de estudos de conservação genética (Barbosa et al., 2019). Cenários pessimistas de flutuações climáticas afetam o nicho ecológico da espécie que podem aumentar a entropia de ecossistemas e levar à retração na distribuição geográfica. Recentemente, o genoma nuclear e cloroplastidial de S. adstringens foram caracterizados, abrindo uma nova janela de análises para a espécie e cobrir gaps de conhecimento envolvidos com informação genômica (Souza, 2019). A montagem de cerca de 70% do seu genoma nuclear possibilita identificar genes e SNPs associados às características bioquímicas, que tornam o barbatimão uma importante espécie de planta medicinal. A partir desta oportunidade, populações naturais podem ser caracterizadas quanto às principais variações genéticas que elevam a produção de metabólitos secundários. Neste sentindo, as plantas possuem uma maquinaria bioquímica muito bem desenvolvida que garante uma interação do organismo com o ambiente para a produção de compostos químicos que atuam na defesa contra predadores, bem como para a formação estrutural dos tecidos e sinalização interna (Kliebenstein, 2013). Diversos trabalhos genômicos estão sendo realizados para descrever grupos de genes que coordenam a síntese de metabólitos secundários em plantas, visto que a maioria dos compostos e genes, relacionados às vias bioquímicas, ainda é desconhecida (Nützmann & Osbourn, 2014). Esses estudos evidenciaram que os genes vinculados à síntese de metabólitos químicos em plantas encontram-se agrupados e em regiões próximas no genoma, sendo que evolutivamente, tiveram origem por meio de duplicação e aquisição de novas funções gênicas (Chu et al., 2011). Seguindo essa linha de pesquisa, muitos genes referentes à biossíntese de metabólitos em plantas, principalmente aqueles que conferem resistência às doenças e produtos químicos com potencial medicinal foram descobertos. Assim, informações genômicas e S. adstringens abrirão portas para caracterizar genes dos metabólitos secundários.

Tabela 2. Patentes registradas na plataforma PATENTSCOPE (https://patentscope.wipo.int/search/en/search.jsf) para a espécie Stryphnodendron adstringens.

Partes Número da Publicação Tipo de Patente Composto Químico Problemática País Ano utilizadas 20140023738 Composição Farmacêutica Extrato da casca Álcool e hidroálcool Infecção de HPV Estados Unidos da América 2014 PI1004542 Composição Farmacêutica Extrato da casca Álcool e hidroálcool Infecção de HPV Brasil 2012 2358751 Composição Farmacêutica Extrato da casca Fenóis Tratamento dérmico Federação Russa 2009 WO2006038690 Função antioxidante Extratos Própolis Alimentação funcional Japão 2006 PI0305658 Larvicida Favas Flavonoides Larvicida Bioquímico Brasil 2005 PI0300440 Medicamento natural Extrato da casca Polifenóis Cicatrizante, antioxidante e uso tópico Brasil 2004 PI0105968 Medicamento natural - - Tratamento anti-HIV Brasil 2003

4.2 Biogeografia e Mudanças Climáticas na História Evolutiva do Cerrado

A América do Sul é um continente que passou por diversos eventos biogeográficos e climáticos, moldando a história evolutiva de toda biodiversidade que o compõe (Behling, 1998; Turchetto-Zolet et al., 2013). Este continente abriga diferentes tipos de vegetação, conhecidos como biomas de vegetação aberta (Werneck, 2011). Dentre estes biomas, destacam o Cerrado que, assim como as outras vegetações abertas experimentaram variações climáticas e ambientais, caracterizadas por longos regimes de seca e alta biodiversidade (Myers et al., 2000). Entretanto, por razões logísticas, recursos financeiros, extensa distribuição geográfica, poucos estudos são direcionados à biota que compõe as savanas neotropicais da América do Sul quando comparado ao Hemisfério Norte (Werneck, 2011; Turchetto-Zolet et al., 2013). No que diz respeito ao bioma Cerrado, ele compreende um dos maiores biomas da América do Sul, principalmente no Brasil Central, circundado por outros biomas como a Amazônia, Mata Atlântica, Caatinga (Vieira et al., 2019). Em relação à sua topografia, é coberto por grandes chapadas e chapadões, com altitude chegando até 1.800 m com sua área core confinada ao Brasil Central (Ratter et al., 2003). A alta riqueza de espécies da fauna e flora o levaram ao status de hotspot de biodiversidade, apresentando mais de 10.000 espécies de plantas vasculares (Myers et al., 2000; Mendonça et al., 2008) com mais de 900 espécies de árvores e arbustos (Ratter et al., 2003). A origem biogeográfica do Cerrado é complexa, e diversas teorias já foram propostas, relacionadas com sua formação, devido fatores antropogêncios ou naturais (Ratter et al., 1997; Cooke, 1998; Salgado-Labouriau, 2005). Porém, muitos indícios mostram que a história evolutiva e os níveis de biodiversidade são uma intrincada combinação de processos associados às mudanças climáticas do período Quaternário, principalmente os ciclos glaciais (Ledru, 2002; Ledru et al., 2006). Notavelmente, as mudanças ambientais causadas por estas condições climáticas deixam sinais na diversidade genética das espécies, gerando padrões que podem indicar como as populações se comportam demograficamente ao longo do tempo (Excoffier, 2004, Drummond et al., 2005). O regime de fogo e a diminuição da umidade no Mioceno permitiram o avanço das savanas. Já a diversificação de linhagens de plantas vasculares no Cerrado é estimada em

aproximadamente 10 Ma de anos, mais frequentemente em torno de 4 Ma (Simon et al., 2009). As hipóteses biogeográficas de evolução no Cerrado baseiam-se tanto em eventos de vicariância e dispersão durante mudanças entre o Período Interglacial (LIG ~120 mil anos atrás) e o Último Máximo Glacial (LGM ~21 mil anos atrás), pois descrevem expansão e retração das savanas durante estas flutuações climáticas. A conexão do Cerrado com outros biomas é discutida por Prado & Gibbs (1993) e Pennington et al. (2000) que assumem a expansão savânica ocorreu devido às quedas de temperatura durante o LGM. Para Pennington et al. (2000) o aumento de áreas de Cerrado atingiu regiões amazônicas, pois as condições climáticas permitiram expansão, mas houve uma redução logo após a aclimatação do período glacial. Recentemente, análises de modelagem e distribuição geográfica do Cerrado indicaram áreas climaticamente estáveis localizadas na região nordeste deste bioma, com a Serra Geral de Goiás caracterizada como um refúgio histórico (Werneck et al., 2012). Junto a isso, estes autores sugeriram a ausência de relictos savânicos em ambientes amazônicos, contrariando a hipótese de refúgio no Pleistoceno. Assim, a expansão do Cerrado ocorre durante o LIG e não no LGM, devido ao aumento de temperatura em épocas de transição climática, chegando a extensões da Amazônia e Mata Atlântica (Bueno et al., 2017). Adicionalmente, análises genômicas com sequências cloroplastidiais mostraram que as savanas amazônicas mantiveram-se isoladas do Cerrado Central, não evidenciando a existência de corredores biológicos entre estes dois biomas (Resende-Moreira et al., 2019). As regiões de Chapada dos Veadeiros em Goiás, o complexo do Espinhaço em Minas Gerais, Chapada dos Guimarães em Mato Grosso e o Distrito Federal são grandes centros de endemismos para grupos de plantas, especificamente espécies de Mimosa spp. (Simon & Proença, 2000). Além disso, as regiões da bacia do Araguaia e o Vão do Paranã são regiões que influenciaram na dinâmica evolutiva do Cerrado (Werneck, 2011). As condições climáticas advindas de presença de fogo, características edáficas e disponibilidade hídrica definem o tipo vegetacional do Cerrado, diferenciando-o de biomas como Florestas Tropicais Estacionais Secas (Werneck, 2011; Alizadeh et al. 2015). Neste sentindo, abordagens filogenética e filogeográfica denotam que a diversificação dentro do bioma Cerrado é diferente para as diferentes fitofisionomias, assumindo que o cerrado sensu stricto é mais antigo (Werneck, 2011).

A região central do Cerrado, formada por Goiás e Chapada dos Guimarães- MT, também foi sugerida como um grande refúgio histórico que se manteve durante flutuações climáticas do Pleistoceno Superior, aproximadamente 120 mil anos atrás (Ab’Sáber, 2000). Durante este período, relevos de baixa altitude experimentaram um clima mais seco e frio, estendendo a outros biomas, como a Caatinga e os Pampas. Após uma melhora do clima, houve retração das savanas, levando tanto à manutenção de refúgios históricos, bem como vegetações que se isolaram, devido acomodações climáticas específicas (Ab’Sáber, 2000; Prado & Gibbs, 1993). Todas as características bióticas e abióticas tornam o Cerrado uma Reserva da Biosfera (UNESCO, 2008), mas apenas 2,2% de sua área total são destinados à conservação (Klink & Machado, 2005). Este panorama é preocupante tanto em âmbito biológico quanto econômico, pois mudanças climáticas futuras podem impactar diretamente os níveis de biodiversidade, bem como os níveis de produtividade alcançados por empreendimentos de agricultura e pecuária instalados no Cerrado. Esta situação é agravada mais ainda pelos índices atuais de desmatamento e fragmentação do Cerrado, elevando os eventos de extinção e diminuição da biodiversidade (Pacheco et al., 2018). Mudanças climáticas projetam aumento de até 4°C em 2100 (Moss et al., 2010), afetando, juntamente com os impactos antropogênicos, os níveis de diversidade genética intrapopulacional (Wróblewska & Mirski, 2018). Previsões ecológicas, oriundas de modelagem de nicho, aliadas a estudos de variação genética, podem mitigar taxas de extinções de populações locais, facilitando o planejamento de estratégias de conservação (e.g. Lima et al., 2017a). Aliar análises de ENM, variáveis ambientais e simulações de agrupamentos genéticos demonstra que flutuações climáticas afetam a diversidade genética e indicam quais as áreas geográficas serão mais afetadas (Jay et al., 2012; Jay et al., 2015). Em conjunto a isso, múltiplas análises que detectam mudanças climáticas históricas e combinadas às previsões futuras tornam mais consistente o conhecimento evolutivo de espécies de plantas (Wróblewska & Mirski, 2018). O impacto das mudanças climáticas pode ser medido em diversos processos ecológicos, desde genes a ecossistemas (Scheffers et al., 2016). Nesta revisão, os autores mostram um esquema de como as mudanças climáticas afetam as relações ecológicas, divididas em ecossistemas terrestres, marinhos e de água doce. Um dos principais efeitos observados está relacionado com a mudança de áreas de ocorrência geográfica e dinâmica populacional. Assim, percebe-se que estudos que levem em conta as implicações das

alterações climáticas são importantes. No Cerrado, estudos com espécies de plantas e animais (Lima et al., 2017a; Abreu-Jardim, 2018) indicam que a diversidade genética será afetada pelas mudanças climáticas futuras.

4.3 Filogeografia: conceitos e perspectivas

A área de Genética de Populações abarca teorias provenientes da Genética Mendeliana e aspectos evolutivos de uma espécie (Barrandeguy et al., 2017). Essencialmente, é uma área da Ciência que busca conhecer padrões evolutivos de populações, visando compreender a dinâmica da variação genética ao longo do tempo e espaço. A base científica de Genética de Populações remonta aos trabalhos de Wright, Fischer e Haldane no início da década de 1930 e bem estabelecida matematicamente na década de 1960, que fornecem todo arcabouço teórico para a compreensão dos processos microevolutivos sobre a variação genética (Charlesworth & Charlesworth, 2017). Por outro lado, o escopo de trabalhos nesta área foi modificado em âmbito analítico e metodológico. Essa realidade analítica permitiu expandir e empregar conhecimentos de Coalescência (Kingman, 1982) dentro de Genética de Populações e acoplar à área de Filogeografia (Avise et al., 1987) para aprofundar o conhecimento de processos demográficos históricos. Em conjunto, estas disciplinas buscam avaliar mudanças evolutivas no genoma das espécies para compreender processos demográficos históricos, a partir de sinais deixados em nível molecular (Avise, 1987; 2000; Knowles, 2002; Cutter, 2013). A observação de padrões demográficos rastreados no passado só é possível por adotar modelos que são descritos dentro da teoria de Coalescência (Kingman, 1982). Isto acontece, pois o modelo de coalescência permite utilizar dados genético-populacionais presentes para fazer inferências históricas (Templeton, 2006; Avise, 2009). Este modelo recua no tempo, para identificar a ancestralidade comum, que deu origem à variação genética existente (Kingman, 1982). O desdobramento desta teoria baseia-se no modelo de deriva genética, em que alelos podem ser fixados ou eliminados, simplesmente por eventos de amostragem aleatória (Halmiton, 2009). Esta mesma ideia pode ser construída de volta no tempo, em que uma única linhagem no passado foi responsável por formar linhagens divergentes no presente, possibilitando conhecer o ancestral comum de todas as linhagens existentes.

A análise de Coalescência permite conhecer o tempo evolutivo de divergência das linhagens, considerarando a deriva genética como um processo importante para inferir sobre processos demográficos que influenciam evolução da espécie (Hickerson, 2010; Fernandes, 2012). Dentro desta perspectiva, o polimorfismo existente é produzido via mutação e, excluindo o efeito da seleção natural, eventos como flutuações no tamanho populacional, fluxo gênico e acasalamento são as causas de padrões representados em árvores genealógicas (Rosenberg & Nordborg, 2002). Os processos demográficos são influenciados pela dinâmica de fluxo gênico e tamanho efetivo populacional, deixando marcas ao longo do genoma e refletindo a história evolutiva das espécies. A deriva genética é um processo microevolutivo que interfere na genealogia de uma espécie e no compartilhamento de informação genética entre populações, influenciando a sua história demográfica (Templeton, 2006). Flutuações no tamanho efetivo alteram a diversidade genética e podem indicar padrões demográficos históricos, resultantes de intrincada combinação de fatores biológicos, ecológicos e biogeográficos (Avise, 2009; Hickerson, 2010). O uso de análises de coalescência possibilita verificar estes padrões filogeográficos e predizer hipóteses que levaram à organização genética populacional (Knowles & Maddison, 2002). Assim, trabalhos no contexto filogeográfico foram idealizados numa escala espaço-temporal para observar a organização das linhagens filogenéticas ao longo da sua distribuição geográfica (Avise, 2000). A aplicação de análises filogeográficas foi possível a partir de metodologias que acessaram polimorfismos de bases de DNA. A obtenção de haplótipos permitiu avaliar a relação filogenética de indivíduos em nível intrapopulação (Cunha e Solé-Cava, 2012; Hickerson et al., 2010). Portanto, a escolha dos marcadores moleculares deve fornecer variação genética intraespecífica suficiente para conhecer os padrões filogeográficos. A identificação de padrões filogeográficos auxilia em diferentes contextos para responder perguntas sobre delimitação de espécies, hibridização e introgressão genética, além de isolamento geográfico (Hickerson et al., 2010). A utilização de marcadores moleculares para investigação de polimorfismos genéticos é uma maneira de conhecer padrões que são remetidos à influência de processos microevolutivos e macroevolutivos (Rosenberg & Nordborg, 2002). Regiões do genoma cloroplastidial, seguidos por regiões nucleares e microssatélites, são frequentemente escolhidas para direcionar estudos filogenéticos em plantas (Morris & Shaw, 2018). A combinação de genoma organelar e nuclear propicia o conhecimento de partes

temporalmente diferentes na história das espécies. Diversas regiões do genoma cloroplastidial estão disponíveis para avaliar variação genética em níveis taxonômicos infraespecíficos (Shaw et al., 2005, 2007). Dentre os marcadores moleculares em plantas, as regiões cloroplastidiais mais usadas em estudos de Filogeografia foram psbA-trnH, o espaçador trnL-F, trnS-trnG, íntron trnL e rpl32-trnL, enquanto ITS e ETS foram selecionados para as regiões nucleares (Morris & Shaw, 2018). Tradicionalmente, o conhecimento da variação genética permite estimar padrões demográficos históricos que levaram à distribuição atual das linhagens populacionais. A diversidade genética existente a partir das regiões genômicas utilizadas auxilia na interpretação dos sinais deixados (Excoffier et al., 2004; Excoffier & Ray, 2008). Um dos propósitos com as análises filogeográficas é conhecer o tempo de divergência intraespecífica e parâmetros demográficos. Esta área envolve todo o arcabouço teórico da Coalescência e revela padrões históricos que levaram à configuração atual das espécies (Avise, 2009; Martins & Domingues, 2011). A datação envolve diferentes abordagens, que são relacionadas com o nível de conhecimento para cada grupo específico e região molecular usada (Morris & Shaw, 2018). Datação fóssil, taxas de substituição e datação secundária auxiliam na estimativa de tempos de divergência e ancestralidade comum (Brown & Yang, 2011; Hipsley & Muller, 2014). Mudanças analíticas e interpretações estatísticas alteraram o panorama de avaliação de hipóteses na área de Filogeografia Tradicional (Knowles & Maddison, 2002; Knowles, 2009; Hickerson et al., 2010). Teste de hipóteses visam responder perguntas sobre quais modelos demográficos se aplicam aos dados analisados. Este campo é denominado de Filogeografia Estatística, e é uma abordagem crescente e que vem trazendo novas perspectivas de análise para a Filogeografia Tradicional (Knowles, 2004, 2009). Dentro deste panorama estatístico, é possível melhorar o conhecimento histórico das espécies, pois facilita avaliar hipóteses que respondem sobre especiação causada por efeito fundador, isolamento reprodutivo, barreiras biogeográficas, polimorfismo histórico, levando à estruturação genética (Knowles, 2004). Além do surgimento de novas perspectivas com o avanço estatístico, a adoção de métodos com múltiplas inferências no contexto genético e ecológico traz imensos avanços para a área de Filogeografia (Marris & Shaw, 2018). Atualmente, é comum estudos com ferramentas geográficas e modelos ecológicos para avaliar o comportamento das populações em relação às variáveis ambientais que coordenam sua distribuição (Lima-

Ribeiro & Diniz-Filho, 2013). A modelagem de nicho ecológico (ENM) é uma metodologia que propicia o conhecimento da distribuição geográfica das espécies numa escala histórica. Esta análise permite associar padrões advindos de dados genéticos e ecológicos para compreender melhor a estrutura filogeográfica das espécies em nível espacial (Collevatti et al., 2012b; Melo et al., 2016). A Tabela 3 destaca os principais programas utilizados para conhecer padrões filogeográficos, parâmetros demográficos e estrutura genética em Filogeografia.

Programa Característica de Análise Loci Referência Parâmetros genéticos e demográficos ARLEQUIN ML Excoffier et al. (2009) (AMOVA) DnaSP Parâmetros genéticos e demográficos S Librado & Rozas (2009) Kumar & Tamura MEGA Distâncias genéticas e árvores filogenéticas S (2016); Kumar et al. (2018) Wilson & Rannala BayesAss Inferência de migração recente ML (2003) Corander & Marttinen BAPS Atribuição genética ML (2006) BATWING Demografia histórica ML Wilson et al. (2003) Gaggiotti et al. (2004); COLONISE Eventos de colonização histórica ML Foll & Gaggioti, (2005) IM Parâmetros demográficos históricos ML Hey & Nielsen (2004) LAMARC Parâmetros demográficos históricos ML Khuner (2006) Tamanho efetivo populacional e taxas de Beerli & Palczewski Migrate ML migração (2010) Faurby & Pertoldi MSVAR Parâmetros demográficos históricos M (2012) Beast/Beast2 Reconstrução filogenética e filogeográfica S Suchard et al. (2018) Network Árvores filogenéticas (redes de haplótipos) S Bandelt et al. (1999) PopArt Construção de redes de haplótipos ML Leigh & Bryant (2015) DIYABC Cenários demográficos ML Cornuet et al. (2014) SPREAD Reconstrução filogeográfica ML Bielejec et al. (2011) POPS Simulação de grupos genéticos-ambientais ML Jay et al. (2015) BOTTLENE Redução do tamanho efetivo populacional Cornuet & Luikart CD CK recente (1996)

Perspectivas em estudos de filogeografia em plantas visam ampliar e aprofundar a aplicação de técnicas de sequenciamento de nova geração (NGS) para investigação em níveis mais específicos e maior cobertura do genoma. Esta vertente encoraja pesquisadores a avaliarem regiões que tenham maior influência da seleção para

averiguar padrões adaptativos. Ainda sim, o sequenciamento de Sanger é uma das ferramentas moleculares que levaram ao conhecimento de diversidade genética e padrões geográficos de espécies pouco estudadas (Morris & Shaw, 2018). A abordagem que alia múltiplos modelos de análise é uma tendência que está crescendo e fornece informações valiosas sobre os padrões demográficos das espécies. Estas análises envolvem ENM e estimativas de tempo de divergência para medir mudanças numa escala histórica (Buzzati et al., 2017; Morris & Shaw et al.; 2018). O campo da Filogeografia Comparada é uma abordagem que elucida padrões entre espécies próximas filogeneticamente, dando respaldo para delimitação de espécies (Hickerson et al., 2010).

4.4 Padrões Filogeográficos em Plantas Neotropicais

Estudos filogeográficos têm despontado nos últimos anos (Beheregaray, 2008; Turchetto-Zolet et al., 2013; Tinoco et al., 2015), porém aplicações com espécies tropicais, principalmente em plantas ainda é baixo (Leal et al., 2016). Os processos microevolutivos tais como deriva genética, seleção natural e fluxo gênico moldam a diversidade genética de populações e geram padrões que são afetados por eventos climáticos e ambientais históricos, deixando sinais demográficos e genéticos em populações e espécies (Beheregaray, 2008; Sanmartín, 2012; Leal et al., 2016). A visualização destes sinais, baseada na análise de regiões do DNA, pode ser examinada em direcionamentos analíticos, como a construção de rede de haplótipos (Bandel et al., 1999), agrupamentos genéticos (Pritchard et al., 2000; Corander et al., 2008ab), estimativas demográficas (Kuhner, 2006; Drummond et al., 2005), linhagens genéticas divergentes (Suchard et al., 2018) e modelagem de cenários evolutivos (Cornuet et al., 2010). Cada análise permite explorar um conjunto de informações e assim discorrer sobre padrões filogeogáficos que são intimamente relacionados com a dinâmica evolutiva histórica das espécies. A situação de estudos filogeográficos em regiões neotropicais vem sendo avaliada em diferentes escalas geográficas. O primeiro estudo nesta vertente analisou o impacto de estudos deste tipo em todo o mundo, até os primeiros 20 anos da área de Filogeografia (Beheregaray, 2008). Desde esta época, os trabalhos em Filogeografia cresceram exponencialmente, coincidindo com evolução de tecnologias de análise de DNA até análises estatísticas. Porém, no Hesmisfério Sul teve poucos trabalhos, mas espécies

terrestres foram as mais estudadas. Ainda neste contexto, estudos filogeográficos na América do Sul foram importantes para conhecer a diversidade e distribuição das principais linhagens deste continente (Turchetto-Zolet et al., 2013). Este trabalho trouxe elucidações bem importantes para a biodiversidade da América do Sul, evidenciando que oscilações glaciais no Pleistoceno e Plioceno influenciaram a dinâmica evolutiva das espécies. Além disso, espécies que ocorrem em biomas de vegetação aberta tiveram respostas complexas, frente às mudanças climáticas históricas. Recentemente, Leal et al. (2016) obtiveram dados sobre estrutura filogeográfica no Brasil, um país que contempla alta biodiversidade com diferentes biomas. Este estudo avaliou o status de pesquisas filogeograficas em plantas com ocorrência no país, visando discorrer sobre os padrões demográficos, hipóteses de diversificação e oscilações climáticas do Quaternário. Neste trabalho, eles encontraram que os biomas Cerrado, Mata Atlântica e Amazônia abrangem maior parte dos estudos na área de filogeografia, 34,1%, 17,1% e 14,6%, respectivamente. A escassez de trablhos filogeográficos ocorre para os domínios dos Pampas (7,3%) e Caatinga (2,4%), enquanto para Pantanal nenhum trabalho filogeográfico foi encontrado. Tendo em base que, apenas 160 espécies neotropicais foram estudadas no âmbito de Genética de Populações (Tinoco et al., 2015), investigações nesta área tornam-se necessárias. Além disso, estabelecer parcerias entre grupos de pesquisa facilita para que mais grupos sejam estudados, cobrindo maiores lacunas científicas. A Tabela 4 complementa o trabalho de Leal et al. (2016), destacando os principais trabalhos e padrões filogeográficos.

Tipo de Espécie Família Bioma Marcadores Processo demográfico Referência refúgio Manihot esculenta e M. pruino Euphorbiaceae AM; CE nDNA - - Olsen & Schaal (1999) Mnihot esculenta ssp. Euphorbiaceae AM; CE nDNA - - Olsen (2002) flabellifolia Caryocar brasiliense Caryocaraceae CE cpDNA e 10 cpSSR - Múltiplos Collevatti et al. (2003) Expansão populacional do sudeste Hymenaea stigonocarpa Leguminosae CE cpDNA Múltiplos Ramos et al. (2007) a partir do norte após LGM Astronium urundeuva Anacadiaceae CA; CE; CH cpDNA e 9 nSSR Expansão populacional - Caetano et al. (2008) Expansão durante glacial Kansan e Lychnophora ericoides Asteraceae CE cpDNA e nDNA Múltiplos Collevatti et al. (2009) retração interglacial Hymenaea courbaril e H. Expansão populacional do sudeste Leguminosae CE cpDNA Múltiplos Ramos et al. (2009) stigonocarpa a partir do norte após LGM Plathymenia reticulata Leguminosae MA; CE cpDNA Expansão populacional - Novaes et al. (2010) Cedrela fissilis Meliaceae CA; CE (SDTF) cpDNA e nDNA Expansão populacional Múltiplos Garcia et al. (2011) Expansão populacional durante Vellozia hirsuta Velloziaceae CE cpDNA Múltiplos Barbosa et al. (2012) glaciação Caryocar brasiliense Caryocaraceae CE cpDNA Retração durante LGM Múltiplos Collevatti et al. (2012a) Expansão durante a glaciação pré- Tibouchina papyrus Melastomataceae CE cpDNA e 10 nSSR Múltiplos Collevatti et al. (2012b) lininiana Handroanthus impetiginosus Bignoniaceae CA; CE (SDTF) cpDNA e nDNA Expansão durante LGM - Collevatti et al. (2012c) Dipteryx alata Leguminosae CE 8 nSSR Expansão após LGM - Collevatti et al. (2013) cpDNA; cpSSR;1 Epidendrum denticulatum Orchidaceae MA; CE Expansão após LGM Múltiplos Pinheiro et al. (2013) SNP e 9 nSSR Expansão populacional e espacial Dalbergia miscolobium Leguminosae CE cpDNA e nDNA - Novaes et al. (2013) após LGM Pilosocereus aurisetus, P. machrisii, P. vilaboensis, P. cpDNA; nDNA e 10 Expansão durante LGM e retração Cactaceae CE Múltiplos Bonatelli et al. (2014) jauruensis, P. aureispinus, P. nSSR durante período interglacial parvus e P. bohlei Mauritia flexuosa Arecaceae CE cpDNA Retração durante LGM Múltiplos Lima et al. (2014)

Continuação...

Tipo de Espécie Família Bioma Marcadores Processo demográfico Referência refúgio Tabebuia aurea Bignoniaceae CE cpDNA e nDNA Retração de range durante o LGM Único Collevatti et al. (2015) Expansão recente para sudeste Ficus bonijesulapensis Moraceae CE (STDF) cpDNA Múltiplos Vieira et al. (2015) durante Holoceno Tabebuia rosealba Bignoniaceae CE (STDF) cpDNA e nDNA Retração de range durante o LGM Múltiplos Melo et al. 2016 Annona crassiflora e Expansão demográfica e espacial do Annonaceae CE cpDNA Múltiplos Ribeiro et al. (2016) Annona coriacea sul a partir do norte depois de LGM Tamanhos constantes nos últimos 10 Dimorphandra mollis Leguminosae CE nDNA e 7nSSR Ma com recente retração Único Souza et al. (2017) demográfica Expansão populacional durante Handroanthus serratifolious Bignoniaceae CE (STDF) cpDNA e nDNA Único Vitorino et al. (2016) LGM Qualea multiflora e Q. AM; CE; Vochysiaceae cpDNA Retração de range durante LGM Múltiplos Buzatti et al. (2017) parviflora MA Eugenia dysenterica Myrtaceae CE cpDNA e nDNA Equilíbrio demográfico Único Lima et al. (2017) Byrsonima coccolobifolia Malpighiaceae CE cpDNA Expansão populacional após LGM Múltiplos Resende-Moreira et al. (2017) Hancornia speciosa Apocynaceae CE 7 nuSSR Equilíbrio demográfico Único Collevatti et al. (2018) Retração durante LGM, seguida de Bromelia balansae Bromeliaceae MA; CE cpDNA Múltiplos Leal et al. (2018) expansão populacional Expansão populacional a partir de Handroanthus ochraceus Bignoniaceae CE (STDF) cpDNA e nDNA Múltiplos Vitorino et al. (2018) LGM

4.5 A Filogeografia na Conservação de Recursos Genéticos

Espécies consideradas recursos genéticos são aquelas que apresentam valor atual ou potencial, relacionada a qualquer unidade funcional herdável (CBD, 1992), em seu sentido amplo. Sob à luz da Convenção da Diversidade Biológica, o uso dos recursos genéticos implica estabelecer procedimentos para efetividade legal de manejo das espécies (Schei & Tvedt, 2010). Neste contexto, a caracterização da biodiversidade brasileira está intimamente ligada ao conhecimento dos recursos genéticos. Porém, a maioria dos recursos genéticos cultivados no Brasil é proveniente de outros países, reforçando a necessidade de conhecer o potencial das espécies nativas, principalmente plantas que estão relacionadas à alimentação, indústria e na área medicinal (Alves & Azevedo, 2018). Estimativas de parâmetros genéticos são úteis para a caracterização de recursos genéticos botânicos e para atender objetivos de conservação e melhoramento genético (Vencovsky & Crossa, 2003). Os parâmetros obtidos com as análises de filogeográficas podem ser direcionados para tomada de decisão em uso e conservação de recursos genéticos (Médail & Baumel, 2018). Assim, torna-se necessário compreender conceitos e parâmetros genéticos para definir planos de caracterização e manejo genético em populações de plantas (Govindaraj et al., 2015). Além disso, é importante entender os fatores que podem levar à perda da diversidade genética (erosão genética), tal como o processo de deriva genética. Esta preocupação em entender como a diversidade genética é estruturada entre populações e indivíduos é coerente, pois diversidade alélica é o que promove a evolução das espécies e consequentemente a sua viabilidade em longo prazo (Väinölä & Johannesson, 2017). No que concerne às espécies de plantas, Govindaraj et al. (2015) pontuam que há dificuldades na manutenção e conservação destes recursos genéticos são associados ao intenso uso da terra, levando a elevados índices de desmatamento, urbanização e outros estresses ambientais com impacto direto no suprimento de alimentos num futuro próximo. Neste mesmo trabalho, há uma grande preocupação em fornecer alimentos para a população mundial até 2050, que atingirá cerca de 9 bilhões de pessoas. Esta preocupação está relacionada com a ausência de aprimoramento das tecnologias agrícolas atuais e uso inadequado dos recursos genéticos, visando o alto crescimento da população mundial. Portanto, a conservação e planejamento de uso e manejo de espécies de plantas possibilita mitigar impactos em diversas áreas da sociedade (Kramer & Havens, 2009).

A aplicação de análises filogeográficas em nível intraespecífico traz uma abordagem para entender padrões evolutivos que influenciam numa escala local (Médail & Baumel, 2018). Dentro de conservação genética, portanto, abordagens filogeográficas estão envolvidas em conhecer quais eventos biogeográficos e de isolamento causam diferenciação genética. Este tipo de inferência permite determinar Unidades Evolutivas Significativas (ESUs), que são prioridades para conservação genética (Moritz, 1994). O conceito de ESUs interpõe-se ao objetivo de conservação de recursos genéticos, pois é relacionado à conservação e proteção do potencial evolutivo das espécies (Moritz, 1994). A definição de ESUs está ligada diretamente ao espaço geográfico, pois prevê que populações isoladas sejam conservadas, consequentemente seu arranjo genético e histórico. Os critérios para estabelecer ESUs podem ser definidos mediante estimativas de diversidade genética, distribuição geográfica da espécie, estrutura genética espacial, níveis de endogamia, fluxo gênico e adaptação local (Kramer & Havens, 2009). Atualmente, é interessante levar em conta mudanças climáticas e outros impactos que podem levar à perda da diversidade para indicar áreas espacialmente afetadas por estas alterações (Chaudhary et al., 2016). A abordagem com estimativas de Filogeografia Comparada também promove o conhecimento de estrutura genética entre taxa próximos, permitindo evidenciar centros de diversidade para as diferentes espécies, auxiliando na delimitação de estratégias de conservação genética (Bermingham & Moritz, 1998; Moritz & Faith, 1998). Para plantas, marcadores cloroplastidiais e/ou associação com marcadores nucleares contemplam métodos robustos para acessar diversos padrões filogeográficos (estrutura genética, bottlenecks, história demográfica, mudanças de distribuição geográfica) que são essenciais para definir ESUs e promover a conservação de recursos genéticos (Morris & Shaw, 2018). Para espécies do Cerrado, análises filogeográficas indicaram baixos valores de diversidade genética e tamanho efetivo populacional para a Dipteryx alata Vogel, devido às flutuações climáticas históricas, indicando que as modificações no Cerrado intensificarão esta perda (Collevatti et al., 2013). Outra espécie savânica, que sofrerá com mudanças de distribuição geográfica frente às mudanças climáticas futuras, é Caryocar brasiliense Cambess. (Collevatti et al., 2011), uma das espécies mais conhecidas deste bioma. Mudanças climáticas também são responsáveis pela

divergência genética e morfológica em Annona crassiflora Mart., devido a isolamento ambiental ao longo de sua distribuição geográfica (Ribeiro et al., 2016b). Estes exemplos evidenciam a necessidade de estimular propostas de manejo para espécies deste bioma que vêm sofrendo com diversos impactos, diminuindo sua área de ocorrência. A espécie, S. adstringens, foco desta tese, é explorada de forma extrativista sem nenhum plano de manejo, ameaçando a viabilidade de populações naturais (Borges- Filho & Felfili, 2003; Corrêa et al., 2011). Além disso, esta espécie compõe as 270 espécies catalogadas como recursos genéticos medicinais do Cerrado (Vieira & Martins, 2000) e é uma das espécies das plantas para o futuro (Vieira et al., 2016). A iniciativa Plantas para o Futuro tem como grande objetivo mostrar para sociedade o grande potencial das espécies nativas do nosso país. A inclusão de S. adstringens nesta lista denota a relevância de trabalhos que forneçam subsídios teóricos sobre esta espécie, pois neste trabalho é destacado o seu potencial medicinal e industrial numa escala nacional (Vieira et al., 2016). Por conseguinte, é uma espécie alvo de estudos para fornecer informações básicas sobre a estrutura genética e, em seguida, definir metas de conservação genética.

5 MATERIAL E METÓDOS

5.1 Amostragem e delineamento experimental

Para este trabalho expedições de coletas foram realizadas entre os anos de 2013 e 2016 (Tabela 5) para prospectar áreas de ocorrência de Stryphnodendron adstringens no bioma Cerrado. Determinadas regiões como o Vale do Araguaia, norte do Mato Grosso, Bahia, Maranhão e Tocantins não apresentaram ocorrência ou mesmo áreas com densidade populacional suficiente para a coleta de indivíduos, visando as análises filogeográficas. A execução das coletas contou com uma equipe da Universidade Federal de Goiás e coordenada pelos professores Dr. Lázaro José Chaves, Dra. Mariana Pires de Campos Telles e apoio da professora Dra. Thannya Nascimento Soares, Msc. Ramilla dos Santos Braga, Dra. Vanessa Bernardes e Dr. Elias Emanuel Silva Mota. O apoio financeiro para as expedições e etapas laboratoriais foi disponibilizado pelo Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Ecologia, Evolução e Conservação da Biodiversidade (INCT – EECBio/CNPq - Processo: nº465610/20145 e FAPEG – Processo 201810267000023), pelos projetos Universal do CNPq (Processo 402178/2016-5) e o Universal da FAPEG (Chamada nº 07/2014, Processo: nº 201410267001736), todos com coordenação geral do Dr. José Alexandre Felizola Diniz-Filho. Folhas de indivíduos de plantas adultas de S. adstringens foram coletadas em 17 localidades ao longo do bioma Cerrado, (Tabela 5; Figura 4). As localidades amostradas abrangem o Brasil Central, região geográfica com maior ocorrência da espécie, situadas nos estados de Goiás, Minas Gerais e Mato Grosso. Diante disso, a amostragem realizada neste trabalho contempla grande parte da distribuição e ocorrência da espécie (Figura 4A), com cada localidade denominada de “população”. As populações coletadas podem ser classificadas, considerando os domínios fitogeográficos do bioma Cerrado (Ratter et al., 2003) em centro-oeste (CHGMT, CHCGO, COCGO, MOSGO e NIQGO), centrais (ORIGO, SCAGO e SILGO), nordeste (CRIGO, FORMG, JAPMG e POSGO) e sudeste (BAMMG, CANMG, PATMG e PERMG). Em cada população foram coletados 32 indivíduos, porém para as análises filogeográficas, 16 amostras foram analisadas, totalizando 272 indivíduos. Este procedimento foi adotado, pois o sequenciamento de todos os indivíduos demanda alto recurso financeiro e com 16 amostras é possível acessar a diversidade genética

populacional. Todas as amostras coletadas foram armazenadas inicialmente em sílica gel e em laboratório foram processadas e depositadas em ultrafreezer -80°C no Laboratório de Genética e Biodiversidade (LGBio) na Universidade Federal de Goiás (UFG).

Tabela 5. Localidades das 17 populações de Stryphnodendron adstringens coletadas, ao longo do bioma Cerrado. O número de indivíduos coletados e analisados neste trabalho, o período de coleta e as coordenadas geográficas estão descritos. Os códigos foram delimitados considerando o município e estado de coleta. Código da Nº de Indivíduos N° de indivíduos Nº Localidade Longitude Latitude Data de Coleta População Coletados Analisados 1 Bambuí-MG BAMMG 32 16 -45,95883 -20,10378 02/2015 2 Candeias-MG CANMG 32 16 -45,21638 -20,68917 12/2013 3 Formoso-MG FORMG 32 16 -46,55947 -15,14664 01/2015 4 Japonvar-MG JAPMG 32 16 -44,23241 -15,93348 02/2014 5 Perdizes-MG PERMG 32 16 -47,37488 -19,33652 11/2015 6 Patos de Minas-MG PATMG 32 16 -46,66003 -18,75851 11/2015 7 Chapadão do Céu-GO CHCGO 32 16 -52,54890 -18,40750 2016 8 Cocalzinho-GO COCGO 32 16 -48,61411 -15,57060 12/2014 9 Cristalina-GO CRIGO 32 16 -47,35737 -16,23155 02/2014 10 Mossâmedes-GO MOSGO 32 16 -50,21500 -16,12670 2016 11 Niquelândia-GO NIQGO 32 16 -48,59938 -14,61601 01/2016 12 Orizona-GO ORIGO 32 16 -48,29580 -17,03140 2016 13 Posse-GO POSGO 32 16 -46,34372 -14,18185 02/2014 14 Silvânia-GO SILGO 32 16 -48,37820 -16,59766 11/2015 15 Caldas Novas-GO CNOGO 32 16 -48,62500 -17,74170 2016 16 Teresina de Goiás-GO TERGO 32 16 -47,32244 -13,78579 12/2014 17 Chapada dos Guimarães-MT CHGMT 32 16 -55,68783 -15,48030 05/2015 Total - - 544 272 - - -

5.2 Análises Moleculares e Sequenciamento

5.2.1 Extração de DNA

Para acessar a informação genética de S. adstringens, o DNA total das folhas de todos os indivíduos foi isolado seguindo o protocolo descrito em Doyle & Doyle (1987) e modificado por Ferreria & Grattappallia (1998). O DNA total extraído foi quantificado via eletroforese horizontal em gel de agarose 1%, TBE 1X e corado com brometo de etídeo. Logo em seguida, o DNA foi diluído numa concentração de 2,5 ng/µL para utilização nos testes de PCR.

5.2.2 Seleção e padronização de regiões cloroplastidiais e nucleares

Após a extração de DNA, quatro indivíduos foram utilizados para realizar testes de otimização de protocolo de amplificação e sequenciamento de regiões do genoma cloroplastidial (cpDNA) e nuclear (nDNA) a partir de primers universais (Tabela 6) no genoma de S. adstringens. Estes testes tiveram como objetivo otimizar as etapas de PCR e sequenciamento, buscando regiões polimórficas para a realização das análises filogeográficas. As regiões selecionadas e testadas são comumente empregadas neste tipo de estudo para reconstruir a história evolutiva de espécies de plantas (Shaw et al., 2005). As regiões do genoma cpDNA e nDNA de S. adstringens foram testadas e otimizadas seguindo o protocolo de PCR com as seguintes condições: um volume total de reação de 15 μl com 5.625 ng DNA alvo, tampão 1X (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2), 250 μM de cada dNTP, 250 μg BSA (DMSO para primers nucleares), 1.125 μM de cada primer e 1 U Taq DNA polimerase (Phoneutria, BR). As reações de amplificações foram realizadas em termocicladores Veriti 96 Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, CA) com um ciclo de 94°C por 3 min, 35 ciclos de 94°C por 1 min, temperatura de anelamento por 1 min (X°C, variando pra cada região testada – veja Tabela 7 dos primers otimizados), 72°C por 1 min, e a extensão final de 72°C por 10 min. A verificação da amplificação foi realizada em eletroforese horizontal com TBE 1X e agarose a 1,5%, corada com brometo de etídeo. Para determinar o tamanho provável de cada região amplificada foi utilizado o marcador 1 Kb Plus (Kilobase - Invitrogen®). As regiões que apresentaram um padrão de banda nítido com boa

Tabela 6. Relação dos primers que foram testados para amplificação no genoma cloroplastidial e nuclear de Stryphnodendron adstringens para utilização em estudos filogeográficos.

Nº Região Iniciadores Sequência Nucleotídica Direção 5' → 3' Genoma Referência trnl_E (UAA) 3' éxon GGTTCAAGRCCCTCTATCCC Forward 1 trnL-trnF Taberlet et al. (1991) trnl_F (GAA) ATTTGAACTGGTGACACGAG Reverse psbAF GTTATGCATGAACGTAATGCTC Forward 2 psbA-trnH(B) Sang et al. (1997) trnHR CGCGCATGGTGGATTCACAATCC Reverse trnQ(UUG)_F GCGTGGCCAAGYGGTAAGGC Forward 3 trnQ/rpS16x1 rpS16x1_R GTTGCTTTYTACCACATCGTTT Reverse cpDNA Shaw et al. (2007) rpL32-F: CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC Forward 4 rpL32F/trnL trnL(UAG)_R CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT Reverse rpL16F71 GCTATGCTTAGTGTGTGACTCGTTG Forward 5 rpL16 Shaw et al. (2005) rpL16R1516 CCCTTCATTCTTCCTCTATGTTG Reverse rpS16F AAACGATGTGGTARAAAGCAAC Forward 6 rpS16 Shaw et al. (2005) rpS16R AACATCWATTGCAASGATTCGATA Reverse ITS 92 AAGGTTTCCGTAGGTGAAC Forward 7 ITS1 + 5.8S + ITS2 Desfeux & Lejeune (1996) ITS 75 TATGCTTAAACTCAGCGGG Reverse nDNA ETS_F (MyrtF) CTCCGTGCTGGTGCATCGAACTGC Forward Lucas et al. (2007) 8 ETS 18S (18S rRNA) ETS-18S GAGCCATTCGCAGTTTCACAG Reverse Wright et al. (2001); Cordesse et al. (1993)

intensidade e sem amplificação secundária foram consideradas ideais para otimização da reação de sequenciamento de Sanger.

5.2.3 Sequenciamento Sanger

Para o tratamento de purificação do produto amplificado para sequenciamento foi utilizado as enzimas Exo e SAP (Exonucleae I /Shrimp Alkaline Phosphatase) numa proporção de 1:9 (Exo:SAP). Essa purificação ocorreu 1 utilizando 5 µL do produto amplificado e 1 µL da solução Exo-SAP. A mistura é levada para o termociclador a 37°C durante 90 minutos e 80°C por 20 minutos. Finalizada a reação de purificação dos fragmentos amplificados, seguiu-se com a etapa de reação de sequenciamento, utilizando o kit Big Dye Terminator v.3 (Life Technologies®). O protocolo desta reação foi conduzido com volume total de 10 µL, sendo 3,5 µL de água MilliQ, 1 µL da solução purificada contendo os fragmentos de DNA, 2,5 µL de primer a 1 µM, 2 µL do tampão e 1,0 µL do pré-mix do kit Big Dye Terminator v.3. Os fragmentos sequenciados também foram purificados pelo método de precipitação com o protocolo de isopropanol-etanol. Após a precipitação, as amostras foram eluídas em 10 µL de formamida Hi-Di e posteriormente desnaturadas a 94°C e levadas para o processo de eletroforese capilar automática no equipamento ABI 3500, sediado no LGBIO- UFG. Os fragmentos foram sequenciados em ambas as direções (forward e reverse) para a obtenção das sequências consenso com maior confiabilidade no processo de sequenciamento. Quando não foi possível sequenciar em ambas as direções, uma das duas fitas foi sequenciada duas vezes. Após a otimização das etapas de PCR e de reação de sequenciamento, a existência de polimorfismo foi avaliada em 16 indivíduos oriundos de diferentes populações. A partir dos testes de amplificação de regiões cpDNA e nDNA foram obtidas três regiões polimórficas para S. adstringens. Duas regiões foram otimizadas para cpDNA, caracterizadas como regiões espaçadoras intergênicas (intergenic spacers regions): psbA-trnH e trnL-F e uma região do nDNA, ETS 18S, caracterizada como uma região espaçadora transcrita externa (external transcribed spacer) do DNA ribossomal 18S.

A Tabela 7 traz as regiões que foram otimizadas e utilizadas para análise dos 272 indivíduos das 17 populações. As regiões do genoma cloroplastidial concatenadas são referidas como cpDNA e ETS para região nuclear daqui em diante.

Tabela 7. Regiões cloroplastidiais e nucleares utilizadas para as análises filogeográficas em populações de Stryphnodendron adstringens.

Nº Região TA (°C) Tamanho (pb) 1 trnL-trnF 48 ~600 2 psbA-trnH(B) 54 ~500 3 ETS 18S 52 ~500

Todas as sequências obtidas passaram por análises de qualidade nos programas Sequencing Analysis v.6 e SeqScape v.3.0 (Applied Biosystems®). Com o último programa, foram criadas as sequências consenso, onde é possível editar e pré-alinhar as sequências de cada indivíduo. Posteriormente a esta análise visual dos dados, as sequências geradas foram alinhadas pelo algoritmo ClustalW com alinhamento múltiplo (Thompson et al., 1994), implementado no programa Mega v.6.0 e quando necessário uma inspeção manual foi conduzida. Análises secundárias, subsequentes ao alinhamento das sequências, foram realizadas para verificar a presença de heterozigotos e a existência de recombinação genética no genoma nuclear. A presença de heterozigotos primeiramente foi confirmada durante a edição visual dos eletroferogramas. Em seguida, as sequências de ETS foram submetidas no programa PHASE v.2.1 (Stephens et al., 2001; Stephens & Donnelly, 2003; Stephens & Scheet, 2005), para determinar a frequência de cada haplótipo. Esta análise gera o desmembramento das fitas e calcula a probabilidade de qual fita apresentar a base com maior frequência nos sítios heterozigotos. Quando os haplótipos de cada fita tiveram probabilidade acima de 0,90, as duas fitas de ETS foram consideradas para as análises. Os arquivos de análise no programa PHASE v.2.1 podem ser gerados por meio da plataforma no site http://seqphase.mpg.de/seqphase/ (FLOT, 2010). Além disso, a existência de eventos de recombinação genética foi avaliada no programa TOPALi v.2 (Milne et al., 2004) e verificou-se que este processo não foi evidenciado na região de ETS. Caso ocorresse ao contrário, aqueles sítios com recombinação genética deveriam ser excluídos das análises ou a recombinação genética seria considerada nas análises de coalescência.

5.3 Análises Estatísticas

As análises filogeográficas realizadas neste trabalho consideraram as sequências das regiões cloroplastidiais concatenadas (psbA-trnH e trnL-F - cpDNA) como uma partição e a região nuclear (ETS) como outra partição de análise. Isto é necessário, pois estas regiões apresentam modo de herança diferente e, portanto, podem reconstruir diferentes histórias evolutivas (Wang et al., 2014).

5.3.1 Análises de Diversidade e Estrutura Filogeográfica

A caracterização da diversidade genética populacional e total foi realizada a partir das estimativas de diversidade nucleotídica (π – probabilidade de que dois sítios homólogos sejam diferentes) e haplotípica (h – probabilidade que dois haplótipos selecionados ao acaso sejam diferentes, referente à heterozigosidade esperada) total e para cada população foram calculadas, utilizando o programa ARLEQUIN v.3.1 (Excoffier et al., 2005). A estrutura genética populacional foi avaliada a partir do componente de diferenciação genética interpopulacional (FST) com a análise de variância molecular (AMOVA, Tabela 8). A AMOVA estima os parâmetros de estrutura genética a partir da informação do número de mutações dos haplótipos entre populações (Excoffier et al., 1992). Esta análise também foi realizada no programa ARLEQUIN v.3.1 com 10.000 permutações para verificar a significância dos parâmetros.

Tabela 8. Descrição dos componentes de variância estimados pela AMOVA para Stryphnodendron adstringens com dados haplotípicos. P - Número total de populações; N - Número de cópias de sequências; SSD (AP) - Soma dos desvios dos quadrados entre populações; SSD (WP) - Soma dos desvios dos quadrados dentro de populações; SSD (T) - Soma dos desvios dos quadrados 2 total; n – Razão do número de cópias de sequências e número total de populações; σ a - 2 Componente de variância devido diferenças entre G populações; σ b - Componente de variância 2 devido diferenças entre haplótipos em diferentes populações dentro de um grupo; σ T - Variância molecular total.

Soma dos Desvios dos Esperança dos Fonte de Variação Graus de Liberdade Quadrados (SSD) Quadrados Médios 2 2 Entre populações P -1 SSD (AP) nσ a + σ b 2 Dentro de populações N -P SSD (WP) σ b 2 Total N - 1 SSD (T) σ T

A relação filogenética compartilhada entre os haplótipos de S. adstringens foi investigada pelos programas DnaSP v.6.0 e a rede de haplótipos para cada partição foi construída no programa POPART v. 1.7 (Leigh & Bryant, 2015), admitindo o método de median-joining (Bandelt et al., 1999) que busca construir uma rede a partir da busca de minimum spanning tree e com o median vector que representa, biologicamente, sequências não amostradas ou ancestrais extintas. A rede de haplótipos construída nesta análise visa avaliar a conexão evolutiva dos haplótipos, levando em consideração os passos mutacionais que os diferenciam (Mardulyn, 2012). A estrutura populacional também foi acessada pela análise bayesiana para identificar grupos genéticos, a partir das populações avaliadas de S. adstringens. Esta abordagem foi realizada no programa BAPS v.6 (Corander & Marttinen, 2006), assumindo genetic mixture com loci ligados (Corander & Tang, 2007) que é caracterizada pela análise em nível individual e populacional para encontrar sinais de migração entre os K grupos. Em seguida foi possível realizar o método de genetic admixture que procura por descendentes advindos dos grupos ancestrais, identificados na análise de genetic mixture (Corander et al., 2008a). Esta análise foi conduzida com 20 réplicas e 50 iterações com K variando de 1 a 17 para cada partição, cpDNA e ETS analisadas separadamente.

5.3.2 História Demográfica e Reconstrução Ancestral

Padrões demográficos e análises de reconstrução ancestral foram estimados para cada partição separadamente e combinadas. Neste caso, as regiões de cpDNA foram concatenadas (psbA-trnH + trnL-F) e combinadas com ETS, mas considerando como partições diferentes. Para a aplicação destas análises, o modelo evolutivo para cada partição foi estimado pelo programa JModelTest 2.1.10 (Darriba et al., 2015), seguindo o critério de hLRT (hierarchical likehood ratio tests) e selecionado pelo Critério de Informação de Akaike corrigido (AICc). A análise foi realizada pela plataforma Cyber Infrastructure for Phylogenetic Research CIPRES 3.3 (Miller et al., 2010). O modelo evolutivo escolhido para cpDNA concatenado foi F81 e para a região ETS foi TIM3 + G com gamma shape de 0,0290. As regiões cloroplastidiais separadas, psbA-trnH apresentaram o mesmo modelo evolutivo (F81). As estimativas de história demográfica populacional estão relacionadas com processos ligados à organização genética ao longo do tempo, considerando a informação

genética atual para recontar eventos demográficos que deixam sinais em regiões do genoma. Para avaliar os parâmetros demográficos históricos foi utilizada a análise de coalescência (Kingman, 1982), implementada no programa LAMARC v.2.1.10 (Kuhner, 2006), que emprega uma abordagem bayesiana para obter as estimativas de coalescência ou mutação (), taxa de crescimento exponencial (g) e taxa de migração (M). O parâmetro de coalescência foi calculado considerando genoma haploide para as duas regiões de cpDNA concatenadas ( = 2Ne) e diploide ( = 4Ne) para a região ETS. A obtenção das estimativas é baseada nas cadeias de Markov pelo método de Monte Carlo (MCMC) e seguiram as condições de 20 cadeias iniciais de 15.000 etapas e três cadeias finais com 80.000 etapas, todas amostradas a cada 100 etapas. O número de burnin foi de 10% nas cadeias iniciais e finais. As partições cpDNA e ETS foram combinadas no programa LogCombiner v.1.8.0, assumindo 10% de burn-in e a convergência foi avaliada pelo programa Tracer 1.7.1 (Rambaut et al., 2018). Os parâmetros com valores de ESS > 200 (Effective Sample Size) foram considerados como convergentes nas cadeias de MCMC. A dinâmica evolutiva do tamanho efetivo populacional histórico foi avaliada pela análise de Extended Bayesian Skyline Plot (EBSP) a partir de dados de múltiplos locos, fornecendo uma distribuição a posteriori acerca do padrão demográfico da espécie (Drummond et al., 2005). A partir do comportamento do tamanho efetivo ao longo do tempo é possível avaliar se a população está em crescimento, declínio ou equilíbrio populacional. Esta análise foi ajustada seguindo os modelos evolutivos para cada partição, admitindo o relógio molecular relaxado não-correlacionado com distribuição exponencial (exponential relaxed clock uncorrelated). A taxa de substituição para o genoma cloroplastidial (estimativa para monocotiledôneas e dicotiledôneas) foi obtida para várias regiões com uma média de 2,5 x 10-9 ± 0,8 x 10-9, oriunda de um intervalo entre 2,1 - 2,9 x 10-9 (Wolfe et al., 1987). Para a região nuclear ETS, a taxa de substituição utilizada foi de 1,90 x 10-9 ±2,2 x 10-9, calculada para espécies da família Leguminosae (Cubas et al., 2010). Duas corridas independentes foram realizadas com 100 milhões de gerações e a convergência com ESS > 200 foi verificada pelo programa Tracer 1.7.1. Logo em seguida, as corridas foram combinadas pelo LogCombiner v. 1.8.0 e o gráfico skyline plot foi obtido pela plataforma R. O tempo de divergência do ancestral comum mais recente (TRMCA) de S. adstringens foi estimado por análise Bayesiana (Rambaut, 2000; Drummond et al., 2002) com a construção de uma árvore de coalescência a partir dos haplótipos e modelos

evolutivos de cada partição, cpDNA e ETS, separadamente. Duas corridas independentes foram realizadas no programa BEAST v.1.8.0 (Suchard et al., 2018), admitindo o relógio molecular relaxado não-correlacionado com distribuição lognormal (lognormal relaxed clock – uncorrelated), utilizando as mesmas taxas de substituição para a análise de EBSP. Para os priors avaliados, foi admitida uma distribuição normal com 60 milhões de gerações. Todas as corridas foram analisadas no Tracer v.1.7.1 para a convergência com ESS > 200. As duas corridas independentes foram combinadas pelo programa LogCombiner v.1.8.0 com burn-in de 10% em cada corrida. Em seguida, o programa TreeAnnotator v.1.8.0 foi utilizado para sumarizar as árvores, assumindo 2.000 de burn-in, Maximum clade credibility tree que visa identificar a árvore com maior probabilidade a posterior e a idade média de cada nó foi estabelecido pelo critério de Mean Heights, que considera a idade de todas as árvores para cada clado. A visualização da melhor árvore a posterior se deu pelo programa FigTree v. 1.4.4 (Rambaut, 2018), em que foi possível visualizar a idade média e a posterioi de cada nó, utilizando o intervalo de credibilidade de 95% de probabilidade de maior densidade a posteriori. A árvore foi enraizada com as seguintes espécies como grupo externo: Acacia adoxa Pedley, Acacia ampliceps Maslin, Acacia drummondii Lindl., Acacia lycopodiifolia A.Cunn ex Hook., Acacia pulchella R.Br., Acacia spinescens Benth., baseando-se no trabalho de Bouchenak-Khelladi et al. (2010) que apresenta o tempo de divergência de espécies pertencentes ao clado mimosoid com regiões cloroplastidiais (psbA-trnH, trnL-F e matK) e em datação fóssil do grupo de Acacia spp. A Tabela S1 traz a relação dos acessos das sequências no Genbank utilizadas para esta análise.

5.3.3 Padrão Espacial e Ambiental da Diversidade Genética

A associação entre distância genética e geográfica foi realizada para testar a hipótese de isolamento geográfico por meio da análise do teste de Mantel (Diniz-Filho et al., 2013), relacionando as matrizes de FST par-a-par linearizado e log da distância geográfica de cada população (Rousset, 1997). Também foi investigado se há isolamento ambiental entre as populações de S. adstringens, aplicando o teste de Regressão Múltipla a partir de matrizes de distâncias para verificar a influência da altitude, sazonalidade de temperatura (BIO4) e precipitação anual (BIO12) sobre a diferenciação genética,

descontando o efeito do componente espacial (Lichstein, 2007). As duas variáveis ambientais foram selecionadas a partir do maior valor variação populacional (BIO04 = 1125,612 e BIO12 = 31736, 130) das 19 variáveis climáticas para as populações avaliadas e foram extraídas do banco de dados ecoClimate (Lima-Ribeiro et al., 2015; http://ecoclimate.org/downloads/). A altitude é importante para ocorrência e tipo de habitat de espécies de Stryphnodendron (Scalon, 2007), por isso é uma variável que pode influenciar na organização da variabilidade genética. Os dados de altitude foram acessados no banco de dados TOPODATA (http://www.dsr.inpe.br/topodata/acesso.php) a partir de um Modelo Digital de Elevação (MDE). As análises de correlação simples e múltipla foram executadas no R utilizando os seguintes pacotes: vegan com a função mantel (Oksanen et al., 2019) e a função mgram do pacote ecodist (Goslee & Urban, 2017), respectivamente. As matrizes de distância geográfica e genética, bem como as matrizes ambientais foram padronizadas, usando a função decostand do pacote vegan para a análise de regressão múltipla. Investigações de padrões espaciais na diversidade haplotípica e nucleotídica foram realizadas, procurando identificar a influência entre a borda e o centro da distribuição da espécie. Para isto, informações das análises de modelagem de nicho ecológico obtidas pelo trabalho de Barbosa et al. (2019) com S. adstringens, em diferentes cenários temporais foram utilizadas. Neste sentindo, a avaliação de estrutura genética espacial foi feita calculando a distância de cada população para o centroide e a borda da distribuição potencial tanto no passado (21 mil anos atrás – 21 k), presente pré-industrial e refúgio histórico. O refúgio histórico foi determinado pelos valores das áreas de ocorrência com adequabilidade > 0,5 tanto para o presente quanto para 21 k. Com os dados de distância geográfica e diversidade genética de cada população para o refúgio histórico, foi possível investigar se a diversidade genética é menor em populações de S. adstringens, localizadas nas bordas quando comparadas com aquelas mais centrais. A partir da diferença entre os valores de adequabilidade para cada período (presente e 21 k) foi possível determinar a estabilidade climática de S. adstringens e mensurar o seu efeito sobre a diversidade genética. Em seguida, uma análise de regressão quantil (Cade & Noon, 2003) foi aplicada para verificar a relação entre a distância geográfica com a diversidade haplotípica e nucleotídica.

5.3.4 Diversidade Genética e Mudanças Climáticas

A modelagem de nicho de S. adstringens demonstrou que, mudanças climáticas futuras poderão afetar a distribuição desta espécie, indicando a redução de áreas com adequabilidade ambiental até 2100 (Barbosa et al., 2019). Diante disso, torna-se necessário verificar como a variação genética de populações naturais se comporta espacialmente, levando em conta tanto fatores ambientais quanto modelos de flutuações climáticas. Para avaliar esta questão, simulações foram realizadas, associando estrutura genética, variáveis ecológicas e o espaço geográfico para identificar grupos genéticos, utilizando o programa POPS v.1.2 (Jay et al., 2015). Esta análise utiliza a inferência Bayesiana e assume que populações próximas compartilham tanto condições ecológicas similares e informação genética ancestral, pois além de usar variáveis ambientais, permite inserir o espaço geográfico na análise (Jay et al., 2015). Assim, as informações genéticas de cpDNA e ETS foram analisadas com as regiões combinadas e separadamente para modelar o impacto das mudanças climáticas sobre a estrutura genética, assumindo diferentes cenários. Para tanto, os agrupamentos genéticos foram definidos para o presente e futuro, a partir de modelos ambientais com as variáveis climáticas extraídas no banco de dados ecoClimate (Lima-Ribeiro et al., 2015; http://ecoclimate.org/downloads/), adicionando dados de altitude. Das 19 variáveis bioclimáticas disponibilizadas por este banco de dados, duas foram selecionadas (Sazonalidade de Temperatura -BIO04 e Precipitação Anual - BIO12) para a análise de agrupamentos genético-ambientais. A seleção das variáveis bioclimáticas buscou aquelas que tiveram maiores valores de variação populacional (BIO04 = 1125,612 e BIO12 = 31736, 130) entre as populações analisadas. Além disso, as variáveis ambientais foram extraídas para os períodos do presente (pré-industrial, ~1760) e duas previsões climáticas futuras intermediárias em relação à emissão de gases de efeito estufa, sendo o cenário RCP 4.5 com o aumento máximo de temperatura de 1,8°C até 2100 (diminuição da emissão de CO2 a partir de 2040 e níveis de radiação solar alcançando 4,5 W m-2 e estabilizando em 2100) e o outro cenário RCP 6.0 com a temperatura elevando até 2,2°C até 2100 (diminuição da -2 emissão de CO2 a partir de 2080 e níveis de radiação solar alcançando 6,0 W m estabilizando após 2100). Estas variáveis estão distribuídas espacialmente numa resolução de 0,5°, seguindo o modelo CCSM (community climate system model) que é integrado aos

modelos de AOGCM (Athmosphere-ocean General Circulation Models). Os dados de altitude não foram alterados para as simulações futuras, assumindo que esta variável se manterá constante até 2100. Os dois cenários climáticos para o futuro coincidem com aqueles investigados com a modelagem de nicho de S. adstringens (Barbosa et al., 2019, veja Anexo 1), a fim de comparar os resultados encontrados. As condições de corridas no POPS foram 20.000 passos com 2.000 de burn-in, admitindo modelos de admixture, o número de K variando de 2 a 17 com três replicações para cada K. Primeiramente, os grupos genéticos foram simulados para o presente com a informação geográfica, as variáveis climáticas e altitude. Logo em seguida, as corridas que apresentaram o menor valor de DIC (Deviance Information Criterion, Spiegelhalter et al., 2002) foram selecionadas para estender as simulações para os dois cenários futuros. Mudanças dos valores de coancestria estimados para o presente foram avaliadas para verificar alterações no comportamento da variação genética ao longo do espaço geográfico entre o presente e as previsões futuras (intraspecific turnover, Jay et al., 2012).

6 RESULTADOS

6.1 Diversidade e estrutura genética populacional

As sequências geradas foram alinhadas e após a edição um total de 1115 pb foram obtidos, sendo 404 pb para psbA-trnH, 360 pb para trnL-F e 351 pb para ETS. A Tabela 9 descreve a caracterização genética de cada região avaliada em S. adstringens. As Tabelas S2 e S3 mostram os sítios polimórficos para cada haplótipo encontrado.

Composição nucleotídica Diversidade nucleotídica Região Tamanho (pb) C T A G Ts Tv S Indel SP k h π SD psbA-trnH 404 12,7 39,4 36,7 11,2 0 1 1 4 5 7 0,652 0,0028 0,0020 trnL-trnF 360 15,6 39,7 31,6 13,1 0 1 1 2 3 2 0,296 0,0025 0,0019 ETS 351 32,7 19,1 13,1 35,1 4 5 2 11 11 12 0,439 0,0016 0,0015

As estimativas de diversidade genética foram baixas tanto para cpDNA e ETS (Tabela 11). As diversidades nucleotídica (π) e haplotípica (h) total foram de 0,0027 e 0,6521 para cpDNA e 0,0016 e 0,4395 para ETS, respectivamente, com cpDNA apresentando maior diversidade genética total para cpDNA. Em nível populacional, a maior diversidade haplotípica (0,5250) e nucelotídica (0,0010) foi encontrada para a população de MOSGO e BAMMG com cpDNA, respectivamente. Enquanto que para ETS, a população de CHCGO obteve maiores valores de diversidade haplotípica (0,6673) e nucleotídica (0,0028). Para cpDNA, nove populações e três para ETS apresentaram apenas um haplótipo (Tabela 10). Mesmo a região de cpDNA exibindo menor número de haplótipos, houve maior diversidade haplotípica total comparada a região ETS. Isto pode ser

justificado pelo fato de que ETS apresenta um haplótipo com alta frequência (H2) e a maioria dos haplótipos são raros nas populações, influenciando os níveis de diversidade haplotípica total para esta região. A distribuição geográfica das diversidades haplotípica e nucleotídica (Figura 3), indica que populações centrais apresentam baixos níveis de diversidade para ambas as regiões.

cpDNA nDNA cpDNA + ETS combinados Pop N k h π SD k h π SD θ θ 95% IC g g 95% IC BAMMG 16 2 0.1250 0.0010 0.0009 2 0.4436 0.0013 0.0013 0.000432 0.0000102 − 0.0014582 291.023 -409.014 − 999.700 CANMG 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 2 0.4312 0.0012 0.0013 0.000349 0.0000100 − 0.0014670 278.857 -415.609 − 999.965 FORMG 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 4 0.3783 0.0017 0.0015 0.001966 0.0000100 − 0.0072530 306.447 -406.517 − 999.853 JAPMG 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 4 0.2359 0.0009 0.0010 0.001944 0.0000100 − 0.0074133 339.792 -395.348 − 999.979 PATMG 16 2 0.3250 0.0004 0.0005 4 0.4899 0.0015 0.0014 0.001962 0.0000100 − 0.0072441 314.512 -406.337 − 999.948 PERMG 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 2 0.4839 0.0014 0.0014 0.000347 0.0000100 − 0.0012845 279.523 -412.783 − 998.382 CHCGO 16 2 0.3250 0.0004 0.0005 4 0.6673 0.0028 0.0022 0.001289 0.0000100 − 0.0044150 313.599 -401.400 − 999.823 COCGO 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 2 0.1754 0.0005 0.0008 0.000299 0.0000100 − 0.0010879 282.873 -413.428 − 999.888 CRIGO 16 2 0.3250 0.0004 0.0005 3 0.5448 0.0017 0.0016 0.000651 0.0000100 − 0.0026213 285.719 -413.077 − 999.993 MOSGO 16 2 0.5250 0.0007 0.0007 1 0.0000 0.0000 0.0000 0.000108 0.0000100 − 0.0003953 268.475 -419.728 − 999.872 NIQGO 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 1 0.0000 0.0000 0.0000 0.000077 0.0000100 − 0.0003156 264.004 -421.345 − 996.491 ORIGO 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 2 0.1287 0.0007 0.0009 0.000128 0.0000100 − 0.0005160 271.952 -426.809 − 991.994 POSGO 16 2 0.2333 0.0003 0.0004 4 0.5020 0.0021 0.0018 0.001584 0.0000100 − 0.0055131 297.399 -409.863 − 999.861 SCAGO 16 2 0.1250 0.0002 0.0003 3 0.1794 0.0005 0.0008 0.001278 0.0000100 − 0.0048871 318.873 -403.566 − 999.702 SILGO 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 1 0.0000 0.0000 0.0000 0.000115 0.0000100 − 0.0004685 266.883 -430.227 − 989.449 TERGO 16 1 0.0000 0.0000 0.0000 2 0.4436 0.0013 0.0013 0.000292 0.0000100 − 0.0011297 276.729 -415.962 − 998.816 CHGMT 16 3 0.2417 0.0003 0.0004 2 0.3117 0.0009 0.0011 0.000299 0.0000100 − 0.0011259 279.774 -413.997 − 999.940 Mean 16 1.529 0.1309 0.0002 0.0002 2.529 0.3186 0.0011 0.0011 - - - - SD - 0.606 0.1619 - - 1.091 0.2026 ------Overall - 7 0.6521 0.0027 0.0017 12 0.4395 0.0016 0.0015 0.003233 0.0000100 − 0.0092435 372.654 -378.624 − 999.996

Foram encontrados sete haplótipos para cpDNA e 12 haplótipos para ETS (Figura 4). Para cpDNA, o haplótipo H1 foi o mais frequente, observado em 138 indivíduos e compartilhado entre 11 populações, indicando ser o haplótipo ancestral. Para a rede haplotípica de ETS, o haplótipo mais frequente foi o H2, presente em todas as populações de S. adstringens, apresentando um aspecto de rede em forma de estrela. Esta configuração da rede haplotípica de ETS pode ser relacionada com a baixa frequência da maioria dos haplótipos que são originados de um único haplótipo principal.

A partir da distribuição geográfica dos haplótipos (Figura 5) pode ser observado que, para cpDNA, as populações localizadas a centro-leste apresentam uma constituição genética diferente das regiões sudeste e nordeste e a região central possui uma configuração haplotípica distinta entre todas as regiões. As populações FORMG, JAPMG,

PERMG e TERGO foram monomórficas para o haplótipo H1 de cpDNA. Para a população de CANMG o haplótipo H2 foi compartilhado apenas com BAMMG. O haplótipo H3, compartilhado com oito populações, foi único para as populações de COCGO e NIQGO. O haplótipo H5 foi compartilhado entre as populações de ORIGO e SILGO. Os haplótipos H4, H6 e H7 foram exlusivos para as populações, MOSGO, SCAGO e CHGMT, respectivamente. Para ETS o haplótipo H2 ocorreu em todas as populações, com as populações de MOSGO, NIQGO e SILGO compostas por este único haplótipo. Os outros haplótipos compartilhados foram o H1 em cinco populações (BAMMG, CANMG, PATMG, PERMG e SCAGO), H3 em duas populações (FORMG e POSGO), H4 (CHCGO, FORMG, PATMG e POSGO) e H5 (CHCGO, FORMG, JAPMG e POSGO) em quatro populações cada e H8 (CHCGO, PATMG e SCAGO) e H9 (COCGO, CHGMT e CRIGO) também compartilhados cada um em três populações. Os haplótipos H6 e H7 foram exclusivos para a população de JAPMG, enquanto o haplótipo H10 foi exclusivo em CRIGO, H11 ocorrendo apenas em ORIGO e o H12 em TERGO. Neste caso, todos os haplótipos tiveram baixa frequência nas populações que ocorrem. O padrão de distribuição geográfico dos haplótipos nucleares sugere que populações a leste do Cerrado têm maior diversidade haplotípica e a oeste populações como CHCGO e CHGMT têm um arranjo genético diferente.

Figura 5. Padrão de distribuição geográfica dos haplótipos encontrados para cpDNA (A) e para ETS 18S (B) em Stryphnodendron adstringens. As cores são referentes aos diferentes haplótipos.

A AMOVA (Tabela 11) demonstrou que existe estruturação genética populacional significativa e que a região cpDNA apresentou alto valor de FST (0,921; p <

0,0001) quando comparado com ETS (0,341; p < 0,0001). Este resultado, decomposto nos componentes de variação genética demonstra que, para cpDNA, a diferenciação genética entre populações representa 92% da variação genética total, enquanto para ETS o componente genético dentro de populações (65%) tem maior influência na estrutura genética desta região nas populações de S. adstringens.

Tabela 11. Estrutura genética obtida com as 17 populações de Stryphnodendron adstringens, aplicando a Análise de Variância Molecular (AMOVA) no programa ARLEQUIN v. 3.1.

Graus de Soma dos Componentes Porcentagem Região Fonte de Variação F Liberdade Quadrados de Variância de Variância ST

Entre populações 16 253,61 0,985 92,14 0,921* cpDNA Dentro de populações 255 21,438 0,084 7,86 Total 271 275,048 1,069 - - Entre populações 16 51,217 0,099 34,14 0,341* nDNA Dentro de populações 501 95,543 0,198 65,86 Total 517 146,761 0,289 - -

Sob perspectivas evolutivas, este resultado indica que o modo de herança maternal e biparental para cpDNA e ETS, respectivamente, são influenciados de maneiras diferentes para a organização da variação genética populacional. Neste caso, para cpDNA, a dispersão de sementes aumenta a diferenciação genética interpopulacional e o fluxo gênico dentro das populações tem maior efeito para a região nuclear de S. adstringens. Ao

observar os valores de FST par-a-par de cpDNA (Tabela S4), as populações de CANMG, NIQGO, ORIGO e SILGO apresentaram valores máximos, denotando alta diferenciação genética interpopulacional. Já para a região ETS (Tabela S5) as duas populações CHCGO e CHGMT são mais diferentes quando comparadas ao restante das populações, refletindo um

padrão diferente entre as duas regiões genômicas. Além disso, os valores de FST par-a-par de ETS apresentaram menores índices de diferenciação genética interpopulacional. A análise de agrupamentos genéticos do BAPS (Figura 6) indicou a formação de seis grupos (K = 6) para cpDNA e nove grupos (K = 9) para ETS. A região ETS teve mais grupos e consequentemente menor estruturação genética, refletida pelos maiores níveis de mistura genética dentro das populações. Os agrupamentos genéticos tanto para cpDNA e ETS não refletem a distribuição geográfica, pois populações de diferentes localidades estão alocadas no mesmo agrupamento. Para a região cpDNA algumas populações foram exclusivas para grupos específicos como foi o caso de SILGO e ORIGO

(grupo 1), FORMG, JAPMG, PERMG e TERGO (grupo 2), COCGO e NIQGO (grupo 3) e CANMG (grupo 4). Estes agrupamentos genéticos são coerentes com a estruturação genética obtida com a AMOVA e a rede de haplótipos. Para ETS, este padrão ocorreu apenas em três populações: SILGO, MOSGO e NIQGO exclusivas do grupo 3. A região nuclear apresentou maiores níveis de mistura genética em indivíduos de diferentes populações.

6.2 Padrão Filogeográfico e Reconstrução Ancestral

Os parâmetros demográficos estimados pelo programa LAMARC v. 2.1.10 (Tabela 10) indicaram que a taxa de crescimento g total foi positiva, porém não significativa para os dados combinados de cpDNA e ETS (g = 372,642; IC 95% = -378,552 – 999,996). Este mesmo padrão da taxa g foi observado para cada população (veja Tabela 10), indicando que existe um equilíbrio demográfico constante. O fluxo gênico entre as populações foi negligenciável, pois o número de migrantes observado foi menos que um (Tabela S6). O valor total e para cada população do parâmetro de mutação  foi baixo ( = 0,003233; IC 95% = 0,000010 – 0,0092435). A dinâmica demográfica, estimada pela análise de EBSP, não identificou um processo de expansão demográfica histórico de S. adstringens, mas um tamanho constante (Figura 7), congruente com a taxa g. Porém, ao observar o gráfico da Figura 7 é possível perceber que no tempo recente há um aumento do tamanho efetivo populacional, indicando provavelmente que eventos de expansão são muito recentes e que os marcadores moleculares utilizados não detectaram o tempo em que tenha iniciado. Isto pode ser relacionado com o valor positivo de g, que mesmo não significativo foi positivo e alto.

O tempo de divergência foi estimado com 28 haplótipos a partir dos dados de cpDNA e ETS combinados em partições diferentes (Figura 8 e Figura S1). O TRMCA de S. adstringens, considerando as populações e áreas amostradas, apresenta uma idade média de aproximadamente de 1,70 ± 2,00 Ma, datando no Pleistoceno, dividindo esta espécie em dois clados principais. O maior clado de S. adstringens abrange a maioria dos eventos de diversificação populacional (subclados A, B, C), começando por volta de 1,05 ± 1,16 Ma e com uma probabilidade a posterior igual a 0,99. Este ponto de divergência envolve grande parte das populações e haplótipos, mas não possui padrão espacial, devido arranjo incompleto de linhagens. Porém, ao observar a distribuição geográfica dos clados no mapa (Figura 8-B) percebe-se que a região da Serra Geral-GO entre POSGO e FORMG apresenta maior diversificação de linhagens. O subclado mais divergente (subclado D) em relação aos demais é datado em torno de 0,78 ± 1,11 Ma, formado pelos haplótipos H03, H04, H05, H22, H23, H24. Este subclado contempla as populações de CANMG, BAMMG, ORIGO e SILGO que são as populações que apresentaram configuração genética distinta nas análises haplotípicas e de agrupamento genético. Junto a isso, as populações ORIGO e SILGO estão localizadas no centro da distribuição geográfica e CANMG na borda de transição do bioma Cerrado com a Mata Atlântica (Figura 8-B). A coalescência entre as populações de S. adstringens e os grupos externos de Acacia spp. ocorreu em torno de 26,45 ± 27,57 Ma. Vale ressaltar aqui, que os clados foram interpretados, admitindo aqueles com valor a posterior superior a 0,7.

Figura 8. Tempo do ancestral comum mais recente (TRMCA) com os haplótipos de Stryphnodendron adstringens. (A) Árvore de coalescência obtida com 28 haplótipos das regiões combinadas de cpDNA e ETS, avaliadas em 272 indivíduos de 17 populações de S.adstringens. O TRMCA ocorre a partir dos haplótipos que dividem as populações em dois clados principais. O maior clado contempla a maioria dos eventos de diversificação (subclados A, B e C) e o clado D com as populações de BAMMG, CANMG, ORIGO e SILGO. As barras em azul são os intervalos de 95% de intervalo de credibilidade, considerando a idade média de cada nó. Os valores acima de cada nó indicam a idade média de cada nó e os valores a posteriori são relacionados abaixo de cada nó. Os valores a posteriori em cinza apresentam valores abaixo de 0,7. (B) Distribuição geográfica no Cerrado dos clados colapsados na árvore de coalescência com o refúgio histórico delimitado. O refúgio histórico foi determinado a partir das análises de Barbosa et al. (2019).

6.3 Padrão Espacial e Ambiental da Variabilidade Genética

Geograficamente, as regiões cpDNA e ETS também possuem padrão espacial discordante, pois apenas para ETS existe uma influência do espaço. Assim, o teste de Mantel obteve um valor positivo de correlação entre distância geográfica e genética para ETS (rm = 0,511; p < 0,05). Portanto, o componente geográfico responde por 26% (r² = 0,261) da estrutura genética espacial encontrada com ETS. Para cpDNA, a associação com a distância genética e geográfica não foi significativa (rm = -0,126; p > 0,05). O correlograma de Mantel (Figura 9) foi construído para avaliar o comportamento da variação genética de ETS no espaço geográfico decomposto e sugere um padrão clinal na diferenciação genética, indicando isolamento geográfico.

A decomposição deste correlograma (Tabela 12) mostra que nas duas primeiras classes de distância, as populações até 200 km tendem a ser mais próximas geneticamente, sendo que o contrário ocorre na última classe de distância em 1000 km. A ausência de estrutura espacial ocorre cerca de 500 km, onde o intercepto no correlograma passa pela correlação igual a zero, ou seja, a variação genética está distribuída de forma aleatória no espaço geográfico.

Classes de Nº Populações Nº rm Valor de p Limite Inferior Limite Superior distâncias Conectadas 1 85,8 20 0,206 0,022 0,167 0,267 2 201,2 19 0,204 0,038 0,168 0,254 3 274,1 19 0,164 0,083 0,114 0,212 4 354,7 20 0,021 0,862 -0,264 0,123 5 436,8 19 0,065 0,498 -0,085 0,120 6 575,0 19 -0,101 0,384 -0,271 0,045 7 971,9 20 -0,552 0,039 -0,673 -0,075

Este resultado pode indicar que variação genética para cpDNA passou por uma dispersão mais restrita ao longo do tempo e espaço, enquanto que para ETS o fluxo de pólen tem a influência do componente espacial, facilitando a troca entre populações mais próximas geograficamente. A análise de regressão múltipla (Tabela 13) mostrou que o coeficiente de regressão parcial foi significativo, explicando 57% da variação genética nuclear no espaço (R² = 0,578; p < 0,001). Vale ressatar, que esta correlação foi positiva apenas entre distância geográfica e sazonalidade de temperatura (BIO4). Este padrão sugere um isolamento ambiental, devido variações na temperatura ao longo da distribuição geográfica.

MRM FST par-a-par padronizado Valor de P Intercepto -0.1814 0.1210 Distância geográfica padronizada 1.5423 0.0001 Altitude padronizada -0.0133 0.8556 Sazonalidade de Temperatura (BIO4) 0.4083 0.0080 Precipitação Anual (BIO12) -0.0761 0.5042 MRM Total 0.5785 0.0001

O padrão espacial histórico da diversidade genética foi mais consistente e com uma relação mais clara para a diversidade haplotípica com a região ETS, pois para cpDNA não houve padrão espacial. Assim, para ETS foi observado maior diversidade haplotípica para as populações mais distantes do centroide, tanto para o refúgio histórico quanto para o

presente e há 21 k (Figuras S2-S5). A análise com delta suitability indica que a diversidade genética de ETS foi maior em áreas com maior instabilidade ambiental.

6.4 Diversidade Genética e Mudanças Climáticas

Os agrupamentos genéticos com diferentes condições climáticas para os dados combinados, cpDNA e ETS são visualizados nas Figuras 10, 11 e 12, respectivamente. O melhor número de grupos para as regiões genéticas combinadas (DIC = 1.827,64) e para ETS analisada separadamente (DIC = 152,701) foi de K = 11. Enquanto que, para cpDNA o número de grupos genéticos que melhor representa a variação genética foi de K =6 (DIC = 171,227). Assim, os resultados dos grupos genético-ambientais são similares ao encontrado com o BAPS. A correlação entre os grupos estimados e preditos foi de 0,97, 0,92 e 0,94 para as regiões combinadas, cpDNA e ETS, respectivamente, denotando a confiabilidade dos agrupamentos encontrados a partir das variáveis geográficas e ambientais. A análise de turnover (Figuras 10-12-D) dos grupos genéticos-ambientais indica que as mudanças climáticas levarão a uma homogeneização e perda genética dos grupos observados para S. adstringens. Porém, para cpDNA e ETS separadamente, a probabilidade de coancestria dos grupos genéticos será mais afetada com o cenário RCP 4.5. Para os dados combinados, a simulação do presente (Figura 10-A) indica que o grupo seis apresenta o maior valor de coancestria (0,408 ±0,362), diminuindo com os cenários de RCP 4.5 (0,338 ±0,358 – Figura 10-B) e RCP. 6.0 (0,343 ±0,008 - Figura 10- C). Entretanto, as populações centrais e nordeste serão alocadas em um único grupo (grupo oito), nos dois cenários futuros. O gráfico da Figura 10-D indica que há a probabilidade de perda de todos os grupos genéticos nos dois cenários futuros de RCP 4.5 e RCP 6.0, mais acentuada neste último, pois dos 11 grupos, nove serão perdidos. Examinando as regiões genéticas separadamente, observa-se que para cpDNA e ETS o cenário RCP 4.5 é mais severo (Figuras 11 e 12-D). Assim, para cpDNA o grupo seis tem maior valor de coancestria (0,318 ±0,385) no presente (Figura 11-A), com redução no cenários RCP 4.5 (Figura 11-B). Porém, tanto os grupos dois (0,271 ±0,368) e seis (0,416 ±0,396) terão maiores níveis de coancestria no cenário futuro RCP 6.0 (Figura 11- C) quando comparados com o presente e RCP 4.5. O grupo cinco será reduzido em ambos os cenários futuros (Figura 11-D). As simulações para ETS mostram que o grupo oito

apresenta o maior valor de coancestria no presente (0,647 ±0,225), com uma redução maior no cenário RCP 6.0 (0,591 ±0,411). Diferentemente de cpDNA que não houve perda de grupos, para ETS com o cenário RCP 4.5 haverá perda de três grupos, enquanto que com o cenário RCP 6.0 apenas um grupo será perdido. Estas respostas indicam que as mudanças climáticas terão um impacto sobre a variação genética de S. adstringens, pois a maioria das populações da região central da sua distribuição geográfica será alocada em um único grupo genético, levando à homogeneização genética. E para os dados combinados, a perda e realocação de grupos são mais perceptíveis em todos os cenários futuros. Tanto para cpDNA e ETS, as populações centrais, nordeste e sudeste perderão grande diversidade genética, pois haverá maior homogeneização genética dos grupos nestas regiões geográficas.

7 DISCUSSÃO

Existe uma maior diferenciação genética (FST) para as regiões plastidiais quando comparada a ETS, indicando que há padrões incongruentes entre as regiões. Este padrão sugere que a dispersão restrita de sementes em relação ao fluxo de pólen tem maior efeito sobre a estrutura filogeográfica de S. adstringens. Outras espécies de plantas do Cerrado apresentaram este padrão genético (Novaes et al., 2013; Lima et al., 2017b), refletindo que a deriva genética é um processo microevolutivo dinâmico e que age muito mais devagar em locos nucleares do que em regiões citoplasmáticas para aumentar a diferenciação genética interpopulacional (Hare, 2001; Hickerson, 2010). A diferenciação genética interpopulacional de S. adstringens com locos AFLP (Mendonça et al., 2012) e microssatélites (Barateli, 2018) foi similar ao encontrado no presente trabalho, indicando que o genoma nuclear apresenta uma estrutura genética com menor efeito da deriva genética. As redes de haplótipos mostram a existência de um haplótipo mais ancestral, dando origem aos outros haplótipos com menor frequência, apresentando um formato tipo estrela, principalmente para ETS. Este padrão pressupõe que eventos de expansão são relativamente recentes na história evolutiva de S. adstringens (Allcock & Strugnell, 2012). A baixa diversidade genética encontrada para S. adstringens, principalmente a diversidade nucleotídica, é condizente com outras espécies mimosóideas (Novaes et al., 2010; Ribeiro et al. 2016a; Novaes et al. 2013), pois é relatado que há baixas taxas de substituição nucleotídica para este grupo (Lavin et al., 2005; Simon et al., 2016). Os domínios fitogeográficos do bioma Cerrado, propostos por Ratter et al. (2003) classificam as populações de S. adstringens em centro-oeste (CHGMT, CHCGO, COCGO, MOSGO e NIQGO), centrais (ORIGO, SCAGO e SILGO), nordeste (CRIGO, FORMG, JAPMG e POSGO) e sudeste (BAMMG, CANMG, PATMG e PERMG). Porém a distribuição haplotípica e grupos genéticos revelam um arranjo incompleto de linhagens, processo que explica a configuração genética obtida para populações de barbatimão.

Assim, populações de diferentes localidades geográficas compartilham linhagens genéticas. Além disso, o componente espacial influencia significativamente na organização da variação genética populacional apenas para ETS, enquanto que, para as regiões cloroplastidias, outros fatores são mais importantes. Isto indica que as populações de S. adstringens estão espacialmente estruturadas de forma diferente entre cpDNA e ETS. Em relação à estrutura genética espacial em ETS, percebe-se que há um padrão clinal da variação genética, sugerindo um isolamento por distância entre populações de S. adstringens. Consequentemente, populações que se encontram próximas em distâncias de até 200 km são mais similares, à medida que populações distantes a mais de 500 km são mais distintas geneticamente. A ausência de padrão espacial para as regiões plastidiais não era esperado, pois a diferenciação genética entre as populações foi maior, sugerindo uma heterogeneidade espacial. Porém, nem sempre heterogeneidade espacial leva a padrões espaciais e assim a diferenciação genética é arranjada aleatoriamente no espaço geográfico (Diniz-Filho & Bini, 2012). Esta discrepância entre as regiões genéticas pode indicar que diferentes processos ecológicos e evolutivos (Diniz-Filho et al., 2008) podem dirigir a evolução desta espécie. Mesmo que os parâmetros demográficos mostrem que, há um equilíbrio populacional histórico, a árvore de coalescência indica uma diversificação populacional recente para esta espécie, principalmente no Pleistoceno Médio. Este padrão filogeográfico era esperado, pois recente diversificação e expansão aconteceu na história evolutiva das espécies de Stryphnodendron no Cerrado (Simon et al., 2016) e outras mimosóideas (Lavin et al., 2005). Essa perspectiva coincide também com o tempo de divergência recente de plantas do Cerrado (Simon et al., 2009), pois o TRMCA de S. adstringens foi de 1, 7 Ma durante o Pleistoceno Superior. A divergência genética entre S. adstringens e as espécies do grupo externo foi estimada em torno de 26 Ma, sugerindo que a origem da espécie pode ter ocorrido antes do Pleistoceno, mais especificamente no Oligoceno. Outras espécies mimosóideas surgiram no período Paleogeno a cerca de 42 Ma atrás (Lavin et al., 2005). Registro fóssil de pólen de Stryphnodendron foi datado no Plioceno Superior, na região da Argentina, sugerindo que esta estimativa pode recontar a origem de espécies deste gênero (Caccavari & Azotegui, 1987 apud Guinet & Caccavari, 1992). Além disso, a estimativa da idade de aproximadamente 13 Ma do grupo externo é bem próxima àquela obtida no trabalho de Bouchenak-Khelladi et al. (2010), datada no Mioceno. Neste mesmo trabalho, as espécies de S. porcatum e S. rotundifolium tiveram uma divergência recente também,

cerca de 5 Ma de anos atrás, além de indicar que a diversificação de espécies mimosóideas começou a partir de ambientes florestais para ambientes savânicos. A diversificação populacional em 1,05 Ma, durante o Quaternário no Pleistoceno Calabriano divide as populações de S. adstringens em dois clados principais. O maior clado principal compreende três subclados, com a região nordeste apresentando maior diversidade de linhagens genéticas. No Pleistoceno Médio, cerca de 700 ka anos atrás, houve a divergência entre as populações centrais ORIGO e SILGO junto com as populações do sudestes, mais próximas às zonas de transição do Cerrado, CANMG e BAMMG. Este padrão confirma que populações do centro e sudeste do Cerrado apresentam configuração genética mais diferente para S. adstringens. Isto é condizente com as redes haplotípicas e agrupamento bayesiano, pois estas populações apresentam haplótipos exclusivos, enquanto que populações do centro-oeste e nordeste do Cerrado são mais polimórficas e estão relacionadas a dois grandes refúgios do Cerrado durante o LGM, a Serra Geral de Goiás-GO (Werneck et al., 2012) e a Chapada dos Guimarães-MT (Ab’Sáber, 2000). A população de CHGMT integra o grande clado de S. adstringens, porém abriga alta diversidade genética, indicando retenção de polimorfismo ancestral, devido às influências climáticas nesta região durante o LGM. No presente trabalho, fica evidente que as populações centrais do Cerrado ficaram mais isoladas, passando por reduções populacionais com as alterações climáticas advindas das glaciações no Pleistoceno, devido aos baixos níveis de diversidade genética e alto valor de diferenciação genética. Especificamente para as populações do centro, presume-se que uma frente de expansão alélica tenha causado um efeito fundador e a força da deriva genética, em populações pequenas, foi mais forte para eliminar variação genética (Excoffier & Ray, 2008). Outro detalhe importante, é que áreas no passado com alta adequabilidade ambiental para S. adstringens foram sugeridas para os limites entre a Amazônia e o Cerrado, diminuindo a distribuição atual especificamente na região central do Cerrado (Barbosa et al., 2019). Pressupondo que isto tenha acontecido na história evolutiva da espécie, sugere-se que a colonização das áreas do Cerrado ocorreu a partir de ambientes florestais para savânicos, confirmando os trabalhos de Bouchenak-Khellad et al. (2010) e Simon et al. (2016) para espécies mimosóideas. Espécies de Stryphnodendron, que ocorrem na Amazônia, divergiram primeiro na filogenia do grupo, com linhagens tolerantes ao fogo e espécies herbáceas passando por eventos de transição ecológica de ambientes florestais para savânicos, destacando a origem recente de linhagens no bioma

Cerrado (Simon et al., 2016). Esta transição ecológica leva a pensar que regiões centrais foram colonizadas mais recentemente ao longo do tempo e por isso detêm menor diversidade genética. Os dados genéticos indicaram um tamanho constante, porém a modelagem de nicho para esta espécie sugere eventos de retração geográfica do passado para a distribuição atual (Barbosa et al., 2019). Pode-se observar que tanto pela abordagem ecológica e genética, é notável que o comportamento de S. adstringens é resultado de interações populacionais devido às alterações climáticas advindas dos períodos glaciais, refletindo padrões encontrados para outras espécies da família Leguminosae que ocorrem no Cerrado (Leal et al., 2016). As populações da borda apresentam maior diversidade genética para a região ETS, principalmente no refúgio histórico de S. adstringens, refutando a hipótese de que populações mais centrais abrigam maior diversidade genética (Soule, 1973). Isolamento geográfico histórico e colonização recente podem levar a este padrão, refletindo patches com grupos populacionais com informação genética diferente em regiões periféricas. A alta diferenciação genética interpopulacional, arranjo incompleto de linhagens e allele surfing são sinais que podem indicar múltiplos refúgios, sugerindo maior diversidade genética em áreas marginais (Excoffier & Ray, 2008; Lima et al., 2014). A relação de diversidade haplotípica com a distância geográfica do centroide é mais proeminente com a distribuição atual quando comparada à distribuição predita para 21.000 anos atrás, refletindo o impacto das mudanças climáticas do LGM. O fato de o padrão espacial da diversidade genética ter sido mais evidente para a região nuclear corrobora a correlação significativa de distância genética e geográfica. Assim, o fluxo gênico atua fortemente em populações localizadas na borda do refúgio histórico, aumentando tanto os níveis de diversidade genética e mantendo polimorfismo ancestral, pois formam áreas de refúgio. Para a espécie Handroanthus ochraceus (Cham.) Mattos também foi observado maior diversidade genética em populações na borda do refúgio histórico, sugerindo isolamento geográfico nas áreas centrais e microrefúgios em áreas marginais (Vitorino et al., 2018). Entretanto, o contrário foi observado para Eugenia dysenterica (Lima et al. 2017a) e Dimorphandra mollis (Souza et al. 2017), sugerindo um grande refúgio na área central de distribuição das espécies. Para S. adstringens, também foi revelado que existe maior diversidade genética em áreas ambientalmente instáveis. Este resultado é coerente com o encontrado por Vieira

et al. (2019), que constataram que a região do nordeste do Cerrado, distante do centro do bioma, possui uma rica composição florística, oriunda de processos evolutivos e influência dos outros biomas vizinhos, contribuindo para o compartilhamento de espécies entre formações vegetacionais. Estes autores sugerem que a interconexão do nordeste do Cerrado com os outros biomas favorece eventos de dispersão e vicariância, levando a eventos de especiação e diversificação durante as oscilações climáticas do LIG e LGM. Assim, oscilações climáticas do Quaternário mantiveram o centro do Cerrado como áreas estáveis ao longo da história evolutiva, enquanto que áreas periféricas teriam mais instabilidade, devido às relações ecológicas e mudanças ambientais direcionando a adaptação das espécies aos novos ambientes e uma evolução in situ de várias linhagens. Este padrão é refletido com a região ETS em nível específico para S. adstringens, pois há maior diversificação nesta região (veja Figura 8-B). Ainda neste contexto, as mudanças climáticas no LIG, principalmente maiores temperaturas (cerca de 2°C a mais do que no Holoceno) causaram a expansão das savanas neotropicais em novas áreas (Bueno et al., 2017). Como a temperatura é importante para S. adstringens, no nordeste do Cerrado o aumento desta variável pode ter favorecido a persistência de diferentes linhagens históricas. Portanto, os resultados encontrados levam a pressupor a existência de múltiplos refúgios históricos S. adstringens, relacionados às porções leste e oeste da distribuição desta espécie. Enquanto que, as populações mais centrais na distribuição atual foram isoladas entre estes dois grandes refúgios, durante as alterações climáticas do LIG e LGM, tornando-se populações mais diferentes geneticamente. Vale ressaltar que, as áreas do Cerrado Central apresentam maiores níveis de adequabilidade ambiental para S. adstringens na sua distribuição atual (Barbosa et al., 2019). Diferentemente, para D. mollis, foi proposta a existência de um grande refúgio histórico na porção central da distribuição, com uma abordagem de múltiplas análises filogeográficas e métodos de ENM (Souza et al., 2017). Os autores dataram o TRMCA de D. mollis de aproximadamente 3,7 Ma de anos atrás e que mudanças no período Quaternário não influenciaram a dinâmica evolutiva para a região nuclear de ITS. A hipótese de múltiplos refúgios foi sugerida para a espécie Caryocar brasiliense, devido à retração de range, avaliando sua paleodistribuição (Collevatti et al., 2012c). Os autores propõem que os múltiplos refúgios são relacionados com perdas de linhagens cloroplastidiais, devido aos eventos de retração, causando alta diferenciação entre as populações. Este padrão é similar ao encontrado para S. adstringens,

principalmente para cpDNA, reforçando que fatores históricos e ambientais estão moldando a variação genética da espécie, muito mais que o componente espacial. A perda de diversidade genética devido às mudanças climáticas futuras é perceptível para as populações de S. adstringens e é responsável por diminuir áreas de ocorrência de barbatimão, considerando a diferença das áreas preditas entre o presente e o futuro (Barbosa et al., 2019). Além disso, a adequabilidade ambiental das áreas de ocorrência diminui drasticamente na região do Cerrado Central, com as regiões do sudeste apresentando maiores níveis de adequabilidade com o cenário RCP 6.0. Por isso é um alerta para o desenvolvimento de estratégias que visem mitigar estes efeitos, principalmente para as populações centrais do bioma Cerrado. A produção de taninos e polifefenóis é a principal característica que torna S. adstringens uma planta com grande potencial medicinal. Portanto, mudanças climáticas poderão afetar não somente a diversidade genética, bem como os teores de taninos produzidos, visto que Corrêa et al. (2011) afirmam que condições climáticas afetam a composição química de S. adstringens e que maiores rendimentos de taninos são direcionados às populações centrais do Cerrado. Isto faz sentido, pois há uma relação positiva com o aumento de temperatura e precipitação para aumento de produção de taninos e fenóis totais (Santos et al., 2006). As simulações de mudanças de agrupamentos genéticos no futuro indicam que haverá uma homogeneização e até mesmo perda da diversidade genética populacional de S. adstringens para alguns grupos genéticos, principalmente quando cpDNA e ETS são analisados conjuntamente. Assim, é possível que a diversidade genética seja perdida e alterada em regiões com maior adequabilidade ambiental, devido às mudanças climáticas, diminuindo mais ainda os níveis de polimorfismos destas populações. Desse modo, o conhecimento de populações elites, tanto em nível de diversidade genética e produção de metabólitos secundários é essencial para indicar quais serão direcionadas para conservação in situ e ex situ (Corrêa et al., 2011). O estudo realizado nesta tese traz uma abordagem mais profunda do tempo, porém marcadores microssatélites foram desenhados especificamente para S. adstringens e possibilitarão recontar uma história contemporânea das populações naturais desta espécie (Barateli, 2018). Adicionalmente, os genomas cloroplastidial total e nuclear parcial de S. adstringens foram caracterizados e permitirão inferir como a seleção natural age em populações naturais para manter os níveis de taninos e diversidade genética a partir da

identificação de SNPs em genes envolvidos na cascata bioquímica desta espécie (Souza, 2019). Visto que esta área é uma das perspectivas dentro da Filogeografia para avaliar questões adaptativas numa escala local (Sork et al., 2016). Além disso, as regiões cloroplastidiais usadas neste trabalho não estão entre as regiões com maior diversidade nucleotídica, avaliadas em uma escala genômica (Souza, 2019). Por isso, a seleção de novas regiões com maior diversidade genética deste genoma torna-se válida para estudos evolutivos de S. adstringens. Em resumo, as populações de S. adstringens estão estruturadas genética e espacialmente, além de apresentar, no geral, baixos níveis de diversidade genética. Além disso, há um equilíbrio demográfico histórico para esta espécie. Porém, sugere-se que há expansão populacional recente para S. adstringens que não foi detectada pelos marcadores aqui usados, visto que recontam uma dinâmica mais ancestral. Por isso, admite-se que as respostas advindas após a última glaciação 21 k anos atrás, exploração desta espécie e fragmentação do Cerrado sejam responsáveis pela baixa diversidade genética. Assim, populações da borda, localizadas próximos aos refúgios históricos, formam uma fonte maior de diversidade haplotípica que podem ter sido relictos populacionais. Assim, presume-se a existência de múltiplos refúgios para S. adstringens, com uma grande área na região nordeste do Cerrado, próximo à Serra Geral de Goiás-GO e na região da Chapada dos Guimarães-MT. Numa perspectiva futura, a diversidade genética desta espécie será diretamente impactada com o deslocamento e perda de grupos genéticos atuais. Esta perda genética também será seguida pela diminuição de áreas com maior adequabilidade ambiental, afetando diretamente a distribuição deste recurso genético no Cerrado. Como há alta diferenciação genética populacional, medidas de conservação devem ser propostas visando a manutenção de populações que apresentam maior diversidade genética para permitir a persistência em longo prazo.

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS

No geral, os resultados encontrados nestes trabalhos denotaram uma baixa diversidade genética populacional para S. adstringens, revelando poucos haplótipos cloroplastidiais e nucleares. Porém, a diferenciação genética interpopulacional é alta, principalmente para cpDNA. Equilíbrio demográfico foi constante na história evolutiva da espécie, mas eventos de expansão foram perceptíveis recentemente. Cenários futuros impactam diretamente a variação genética de S. adstringens, alertando para a criação de estratégias de conservação, visto a importância desta espécie como recurso genético e medicinal. Em relação às hipóteses propostas, foram evidenciadas diversificação e radiação recentes para S. adstringens, assumindo um padrão advindo da transição ecológica de ambientes florestais para savãnicos. O acoplamento de modelagem de nicho ecológico e variação genética mostrou que a retração de áreas de ocorrência geográfica e perda da variabilidade genética serão intensificadas pelos efeitos de oscilações climáticas. Assim, para esta tese foram alcançados os seguintes objetivos:

 Foi possível validar duas regiões cloroplastidiais (psbA-trnH e trnL-F) e uma nuclear (ETS);  Foram observados baixos níveis de diversidade haplotípica e nucleotídica para as populações de S. adstringens;

 A diferenciação genética interpopulacional (FST) foi alta, com a região cpDNA revelando um nível mais alto de estruturação genética. Assim, os grupos genéticos obtidos para estas duas regiões são diferentes entre si, mas ressaltam que as populações ORIGO, SILGO e CANMG são as mais distintas geneticamente com cpDNA, enquanto CHCGO e CHGMT são mais diferentes para a região nuclear;  O padrão das redes haplotípicas e a árvore de coalescência indicam que existe um arranjo incompleto de linhagens para S. adstringens.

 Análises de coalescência identificaram um equilíbrio demográfico histórico, porém com a estimativa de EBSP há indícios de expansão recente.  O ancestral comum mais recente foi estimado no Pleistoceno Médio, em torno de 1,7 Ma atrás e a maior parte dos eventos de divergência ocorreram a partir de 1,05 Ma. Este padrão sugere que espécies de Stryphnodendron apresentam recente diversificação e rápida radiação no bioma Cerrado.  O componente espacial teve maior influência para a região nuclear, indicando isolamento por distância e isolamento ambiental. A regressão quantil indicou que populações presentes na borda do refúgio histórico (obtido com ENM) de S. adstringens, apresentam maior diversidade genética.  O padrão filogeográfico de S. adstringens pode ser explicado por mudanças climáticas do Quaternário, sugerindo a existência de múltiplos refúgios históricos no Cerrado durante o LGM para a manutenção da diversidade genética.  No cenário de mudanças climáticas, a composição da diversidade genética será afetada, pois grupos genéticos em diferentes cenários ambientais mostram que

mudanças de temperatura e níveis de CO2 levarão à perda de diversidade genética.  Os efeitos advindos das mudanças climáticas futuras poderão impactar diretamente as populações que apresentam menor diversidade genética. Portanto, delimitar estratégias de conservação tanto in situ quanto ex situ para esta espécie tornam-se emergentes, visando populações com alta diversidade genética.  As propostas de conservação da diversidade genética deve prever a manutenção de maior número de populações, pois a alta diferenciação genética interpopulacional indica que cada população compõem uma informação genética única e exclusiva.

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106

10 APÊNDICES

Tabela S1. Acessos das sequências do GenBank utilizados para a construção da árvore de coalescência com inferência Bayesiana no programa BEAST v. 1.8.0. Estas espécies foram selecionadas como grupo externo de acordo com os resultados da árvore filogenética de Bouchenak-Khelladi et al. (2010).

Espécies psbA-trnH trnL-trnF ETS18S Código Nexus Acacia adoxa AF195716.1 ausente KC283698.1 ACAAD Acacia ampliceps AF525003.1 AF522983.1 Ausente ACAAM Acacia drummondii AF195714.1 ausente KC283371.1 ACADR Acacia lycopodiifolia AF195715.1 ausente Ausente ACALY Acacia pulchella AF195724.1 AF195673.1 HM800426.1 ACAPU Acacia spinescens AF195725.1 ausente EF638090.1 ACASP

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Tabela S2. Caracterização dos polimorfismos genéticos em cada haplótipo de cpDNA para as populações de Strypnhodendron adstringens.

psbA/trnH trnL-F Haplótipos N Frequência Relativa População 177 178 278 279 369 550 733 748

BAMMG, FORMG, JAPMG, PATMG, PERMG, CHCGO, CRIGO, POSGO, Hap01 A - - - C A T A 138 0.507 SCAGO, TERGO, CHGMT

Hap02 - - A - A - - C 17 0.063 BAMMG, CANMG

Hap03 . - A - . . . . 74 0.272 PATMG, CHCGO, COCGO, CRIGO, MOSGO, NIQGO, POSGO, CHGMT

Hap04 . - A A . . . . 9 0.033 MOSGO

Hap05 - - - - A - - C 32 0.118 ORIGO, SILGO

Hap06 . A - - . . . . 1 0.004 SCAGO

Hap07 . A A - . . . . 1 0.004 CHGMT

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Tabela S3. Caracterização dos polimorfismos genéticos em cada haplótipo de ETS para as populações de Strypnhodendron adstringens.

ETS 18S Frequência Haplótipos N População 47 48 86 102 116 128 182 213 217 275 287 Relativa Hap01 T C G G G C G C C T C 50 0.097 BAMMG, CANMG, PATMG, PERMG, SCAGO BAMMG, CANMG, FORMG, JAPMG, PATMG, PERMG, CHCGO, Hap02 . . . C ...... 383 0.739 COCGO, CRIGO, MOSGO NIQGO,ORIGO, POSGO, SCAGO, SILGO, TERGO, CHGMT Hap03 . . . C . . C . . . . 3 0.006 FORMG, POSGO Hap04 . . . C . A . . . . . 12 0.023 FORMG, PATMG, CHCGO, POSGO Hap05 . . . C . A . . T . . 19 0.037 FORMG, JAPMG, CHCGO, POSGO, Hap06 . . . C ...... T 2 0.004 JAPMG Hap07 . . . C . . . T . . . 1 0.002 JAPMG Hap08 . . . C . . . . T . . 4 0.008 PATMG, CHCGO, SCAGO Hap09 . . . C . . . . . C . 25 0.048 COCGO, CRIGO, CHGMT, Hap10 . . . C C ...... 7 0.014 CRIGO Hap11 - - . C ...... 2 0.004 ORIGO Hap12 . . T C ...... 10 0.019 TERGO

109

Tabela S4. Distância genética para as regiões combinadas do genoma cloroplastidial (cpDNA – psbA-trnH/trnL-F) entre os pares de populações de Stryphnodendron adstringens obtida com a estimativa de FST par-a-par com o programa ARLEQUIN v. 3.1. (*) Valores significativos com p < 0,05.

BAMMG CANMG FORMG JAPMG PATMG PERMG CHCGO COCGO CRIGO MOSGO NIQGO ORIGO POSGO SCAGO SILGO TERGO CHGMT BAMMG 0,000

CANMG 0,933* 0,000

FORMG 0,000 1,000* 0,000

JAPMG 0,000 1,000* 0,000 0,000

PATMG 0,003 0,972* 0,133 0,133 0,000

PERMG 0,000 1,000* 0,000 0,000 0,133 0,000

CHCGO 0,505* 0,969* 0,800* 0,800* 0,533* 0,800* 0,000

COCGO 0,700* 1,000* 1,000* 1,000* 0,800* 1,000* 0,133 0,000

CRIGO 0,003 0,972* 0,133 0,133 -0,067 0,133 0,533* 0,800* 0,000

MOSGO 0,648* 0,953* 0,832* 0,832* 0,691* 0,832* 0,433* 0,533* 0,691* 0,000

NIQGO 0,700* 1,000* 1,000* 1,000* 0,800* 1,000* 0,133 0,000 0,800* 0,533* 0,000

ORIGO 0,921* 1,000* 1,000* 1,000* 0,969* 1,000* 0,972* 1,000* 0,969* 0,960* 1,000* 0,000

POSGO -0,015 0,980* 0,067 0,067 -0,051 0,067 0,620* 0,867* -0,051 0,736* 0,867* 0,977* 0,000

SCAGO 0,000 0,990* 0,000 0,000 0,100 0,000 0,743* 0,941* 0,100 0,800* 0,941* 0,988* 0,044 0,000

SILGO 0,921* 1,000* 1,000* 1,000* 0,969* 1,000* 0,972* 1,000* 0,969* 0,960* 1,000* 0,000 0,977* 0,988* 0,000

TERGO 0,000 1,000* 0,000 0,000 0,133 0,000 0,800* 1,000* 0,133 0,832* 1,000* 1,000* 0,067 0,000 1,000* 0,000

CHGMT 0,603* 0,976* 0,875* 0,875* 0,656* 0,875* 0,005 0,000 0,656* 0,436* 0,000 0,979* 0,729* 0,822* 0,979* 0,875* 0,000

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Tabela S5. Distância genética para a região do genoma nuclear (ETS 18S) entre os pares de populações de Stryphnodendron adstringens obtida com a estimativa de FST par-a-par com o programa ARLEQUIN v. 3.1. (*) Valores significativos com p < 0,05.

BAMMG CANMG FORMG JAPMG PATMG PERMG CHCGO COCGO CRIGO MOSGO NIQGO ORIGO POSGO SCAGO SILGO TERGO CHGMT BAMMG 0,000 CANMG 0,243* 0,000 FORMG 0,490* 0,165* 0,000 JAPMG 0,554* 0,179* 0,030 0,000 PATMG 0,299* -0,016 0,080* 0,088* 0,000 PERMG 0,152* -0,022 0,231* 0,254* 0,026 0,000 CHCGO 0,535* 0,363* 0,168* 0,319* 0,298* 0,399* 0,000 COCGO 0,604* 0,227* 0,083* 0,032 0,124* 0,297* 0,383* 0,000 CRIGO 0,502* 0,206* 0,129* 0,124* 0,157* 0,264* 0,341* 0,102* 0,000 MOSGO 0,677* 0,299* 0,092* 0,013 0,142* 0,355* 0,418* 0,065 0,176* 0,000 NIQGO 0,677* 0,299* 0,092* 0,013 0,142* 0,355* 0,418* 0,065 0,176* 0,000 0,000 ORIGO 0,571* 0,196* 0,070* 0,023 0,108* 0,268* 0,361* 0,048 0,133* 0,038 0,038 0,000 POSGO 0,483* 0,214* 0,001 0,113* 0,134* 0,268* 0,062 0,176* 0,185* 0,198* 0,198* 0,159* 0,000 SCAGO 0,549* 0,129* 0,057 0,008 0,040 0,209* 0,364* 0,043 0,142* 0,022 0,022 0,030 0,154* 0,000 SILGO 0,677* 0,299* 0,092* 0,013* 0,142* 0,355* 0,418* 0,065 0,176* 0,000 0,000 0,038 0,198* 0,022 0,000 TERGO 0,556* 0,276* 0,187* 0,198* 0,216* 0,326* 0,384* 0,238* 0,226* 0,290* 0,290* 0,212* 0,235* 0,228* 0,290* 0,000 CHGMT 0,743* 0,664* 0,595* 0,682* 0,613* 0,657* 0,587* 0,691* 0,510* 0,841* 0,841* 0,704* 0,567* 0,739* 0,841* 0,658* 0,000

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Tabela S6. Número de migrantes obtidos para as 17 populações de Stryphnodendron adstringens com o programa LAMARC v. 2.1.10, utilizando a taxa de migração escalonada. A diagonal superior são as populações receptoras e a inferior as populações doadoras.

BAMMG CANMG FORMG JAPMG PATMG PERMG CHCGO COCGO CRIGO MOSGO NIQGO ORIGO POSGO SCAGO SILGO TERGO CHGMT BAMMG - 0.023 0.022 0.022 0.022 0.023 0.022 0.022 0.022 0.022 0.022 0.023 0.022 0.022 0.023 0.022 0.022 CANMG 0.019 - 0.017 0.018 0.018 0.018 0.017 0.017 0.017 0.018 0.017 0.018 0.017 0.018 0.018 0.018 0.017 FORMG 0.096 0.098 - 0.099 0.099 0.099 0.116 0.100 0.100 0.101 0.101 0.100 0.108 0.100 0.099 0.100 0.096 JAPMG 0.095 0.097 0.099 - 0.097 0.097 0.102 0.099 0.098 0.099 0.100 0.100 0.103 0.100 0.098 0.098 0.096 PATMG 0.108 0.100 0.103 0.099 - 0.103 0.108 0.100 0.099 0.100 0.100 0.099 0.102 0.103 0.099 0.099 0.097 PERMG 0.019 0.018 0.017 0.018 0.018 - 0.017 0.018 0.017 0.018 0.018 0.017 0.017 0.018 0.017 0.018 0.018 CHCGO 0.063 0.064 0.067 0.065 0.068 0.065 - 0.066 0.065 0.065 0.066 0.065 0.067 0.068 0.064 0.065 0.063 COCGO 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 - 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.017 CRIGO 0.032 0.033 0.033 0.033 0.033 0.033 0.032 0.034 - 0.033 0.033 0.033 0.033 0.033 0.033 0.033 0.037 MOSGO 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 - 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 0.005 NIQGO 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 - 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 ORIGO 0.006 0.007 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 - 0.006 0.006 0.007 0.006 0.006 POSGO 0.078 0.079 0.091 0.080 0.079 0.080 0.093 0.081 0.080 0.081 0.081 0.081 - 0.080 0.080 0.080 0.079 SCAGO 0.069 0.065 0.064 0.065 0.070 0.067 0.067 0.065 0.065 0.065 0.065 0.064 0.064 - 0.064 0.065 0.063 SILGO 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 0.006 - 0.006 0.006 TERGO 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 - 0.015 CHGMT 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015 -

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Figura S1. Árvore de Coalescência dos 28 haplótipos de S. adstringens, oriundos da combinação dos dados genéticos de cpDNA e ETS. Os valores a posteriori apresentados são para os clados com valor maior que 0,7. Aqui os clados são apresentados sem utilizar a ferramenta para colapsar.

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Figura S2. Regressão quantil para avaliar a associação de diversidade haplotípica e nucleotídica de cpDNA entre as 17 populações de Stryphnodendron adstringens com a distância do centroide para a distribuição atual (Presente 0k) e o centroide para distribuição do passado (Passado 21 k). As estimativas de distâncias geográficas dos dois períodos foram baseadas na modelagem de nicho ecológico desta espécie, desenvolvida por Barbosa et al. (2019). As figuras mostram envelopes triangle-shaped (A, C, E e G) de 0,05 (linha inferior) e quantis de 0,95 (linha superior). O slope para os quantis (B, D, F e H) 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 0,9, 0,95, 0,975 e 0,99 (área em cinza indica intervalo de confiança de 95% em torno das estimativas) mostram o comportamento da variável resposta.

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Figura S3. Regressão quantil da associação de diversidade haplotípica e nucleotídica de cpDNA entre as 17 populações de Stryphnodendron adstringens com a distância do centroide do refúgio histórico, distância da borda e a estabilidade de habitat (delta suitability). As estimativas de distâncias geográficas para o refúgio histórico, borda e os valores de delta suitability foram baseadas na modelagem de nicho ecológico desta espécie, desenvolvida por Barbosa et al. (2019). As figuras mostram envelopes triangle-shaped (A, C, E, G, I e K) de 0,05 (linha inferior) e quantis de 0,95 (linha superior). O slope (B, D, F, H, J e L) para os quantis 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 0,9, 0,95, 0,975 e 0,99 (área em cinza indica intervalo de confiança de 95% em torno das estimativas) mostram o comportamento da variável resposta.

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Figura S4. Regressão quantil para avaliar a associação de diversidade haplotípica e nucleotídica de ETS 18S entre as 17 populações de Stryphnodendron adstringens com a distância do centroide para a distribuição atual (Presente 0k) e o centroide para distribuição do passado (Passado 21 k). As estimativas de distâncias geográficas dos dois períodos foram baseadas na modelagem de nicho ecológico desta espécie, desenvolvida por Barbosa et al. (2019). As figuras mostram envelopes triangle-shaped (A, C, E e G) de 0,05 (linha inferior) e quantis de 0,95 (linha superior). O slope para os quantis (B, D, F e H) 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 0,9, 0,95, 0,975 e 0,99 (área em cinza indica intervalo de confiança de 95% em torno das estimativas) mostram o comportamento da variável resposta.

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Figura S5. Regressão quantil da associação de diversidade haplotípica e nucleotídica de ETS 18S entre as 17 populações de Stryphnodendron adstringens com a distância do centroide do refúgio histórico, distância da borda e a estabilidade de habitat (delta suitability). As estimativas de distâncias geográficas para o refúgio histórico, borda e os valores de delta suitability foram baseadas na modelagem de nicho ecológico desta espécie, desenvolvida por Barbosa et al. (2019). As figuras mostram envelopes triangle-shaped (A, C, E, G, I e K) de 0,05 (linha inferior) e quantis de 0,95 (linha superior). O slope (B, D, F, H, J e L) para os quantis 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 0,9, 0,95, 0,975 e 0,99 (área em cinza indica intervalo de confiança de 95% em torno das estimativas) mostram o comportamento da variável resposta.

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11 ANEXOS

Anexo 1. Modelagem de nicho para Stryphnodendron adstringens. (a) Distribuição das áreas de ocorrência no passado há 21.000 anos atrás (LGM). (b) Distribuição atual (simulaçãodo clima pré-industrial ~1760). Cenários futuros para (c) RCP 2.6, (d) RCP 4.5 e (d) RCP 6.0. Fonte: Figura gentilmente cedida por Barbosa et al. (2019).

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