Gene Editing-Based Protocols for the Ex Vivo Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa
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Gene editing-based protocols for the ex vivo correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Jose Bonafont Aragó A dissertation submitted by in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in BIOMEDICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Universidad Carlos III de Madrid Advisors: Fernando Larcher Laguzzi Marcela Del Rio Nechaevsky Rodolfo Murillas Angoiti Tutor: Fernando Larcher Laguzzi July 2020 This thesis is distributed under license “Creative Commons Attribution – Non Commercial – Non Derivatives”. A Francisca Climent Darás, Mi persona favorita. Acknowledgments Nunca pensé que llegaría este momento. Pero aquí estamos. Bueno, realmente no estamos, al menos físicamente… Este fin de tesis pilla con todo el país confinado en sus casas en estado de alarma. Para que digan que acabar una tesis no es para tanto… sumémosle tiempos de cuarentena históricos por COVID-19, el famoso Coronavirus. En este punto que estamos más proactivos que nunca, aprendiendo a cocinar, haciendo ejercicio en el salón de casa, juegos de mesa y aniquilando el catálogo de Netflix, aprovecho para agradecer a todos los que se han cruzado en mi camino hasta el final de esta etapa, que de alguna manera u otra han influido en el desarrollo de este trabajo, a nivel profesional, personal o, algunos kamikazes, en ambos. Para empezar, dado que ser un tío práctico me ha caracterizado bastante, iré directo al final. Hacer la tesis ha sido probablemente una de las mejores decisiones de mi vida, y nunca podría haber caído en un sitio mejor. A nivel profesional he tenido la suerte de formar parte de esta superdivisión, referente en terapia génica en toda Europa. Hemos ido testando todos los formatos CRISPR habidos y por haber, juntos, en consenso, en equipo, haciendo todo mucho más productivo y eficiente. Pero ahora viene lo fuerte. La parte personal… Esto ha sido el detonante y el motor de que los experimentos funcionaran, de venir cada día con una sonrisa a enfrentarte a micoplasma, bacterias, bandas fantasmas, qPCR ‘subidas al árbol’ y demás amenazas contra el correcto funcionamiento de esta tesis. He encontrado personas inteligentes y encantadoras que me han apoyado, asesorado, estorbado, molestado, hecho reír y llorar, incluso de risa, disfrazarme, bailar, viajar y soñar. Llegué a Madrid con un ‘acentazo’ de valenciano tremendo y probablemente sin saber freír un huevo, limpiar la casa o descifrar los programas de la lavadora, y a día de hoy, no sé en qué medida ha cambiado esto… pero he crecido mucho, he cambiado mucho y a fin de cuentas, sigo vivo, mucho, con parámetros bioquímicos en sangre correctísimos (incluso subiendo cada día al comedor de este centro…). En fin… me he convertido en el tío que soy ahora y que por suerte o por desgracia muchos de los aquí citados tenéis que aguantar cada día, así que no hace falta que os diga más. Ahora, paso a contar intimidades y cotilleos de todos. Cómo os gusta esta parte… El Sálvame Deluxe científico. Bueno, primero, remontándonos al origen de esta etapa, empezaré por nombrar a Marcela. Corría el año 2014 y cursaba el Máster en la UPV y llegaba el momento de encaminar un poco tu vida, dejando progresivamente los jueves universitarios y fin de semanas al estilo ‘valenciano’ que tanto nos caracteriza. Una tarde de primavera, llegó una clase que nos dejó sin palabras. Los niños mariposa. Cuando la Dra. Del Río terminó sus dos horas de clase, sentí que esa era mi opción uno de futuro. Era lo que quería. Definitivamente… Tras unos meses de avasallarla a emails y con una serie de coincidencias, fui galardonado con una beca para empezar la tesis en su grupo y me mudé a Madrid. Con la espontaneidad que caracteriza epitelios, el día antes de empezar, recibí una llamada de mi otro argentino, Fernando Larcher. Me dijo que apuntara la dirección del CIEMAT y que nos reuníamos el día siguiente para comer juntos. Y 4.5 años después, sigo comiendo en el mismo comedor… Muchas gracias a los dos por esta oportunidad. Marcela, gracias por asegurarnos siempre en el grupo y por ofrecer oportunidades de este calibre. Fernando, has estado siempre al pie del cañón conmigo, me he sentido muy apoyado por ti y considerado como parte del equipo en todo momento. Siempre has tenido la puerta de tu despacho abierta para escuchar mis locuras y experimentos locos, y me has dado rienda suelta, siempre, aunque eso te haya traído algún dolor de cabeza, pero bueno, no nos ha ido mal juntos tampoco… En este punto sigues al pie del cañón conmigo y siempre voy a estarte agradecido. Ha sido un placer jefe. Hablando de jefazos, aquí llega mi pareja en campo de batalla. Al igual que Watson y Crick, Batman y Robin, Chino y Nacho, e innumerables parejas que han hecho de éste un mundo mejor, yo he tenido a Mr. Murillas, Rodolfo para los amigos. Madre mía tío… me acuerdo de empezar proyectos llenando toda la mesa con mapas de plásmidos en papel, mientras todos usaban SnapGene, y tu diseñabas estrategias ‘simples’ de cloning que sólo llevaban 145 pasos de cloning, con rellenos con la Klenow, cortes en romo, en Roma, en Berlín y en mil sitios. Has sido los dos hemisferios de mi cerebro al principio de esta tesis y me has dado las herramientas para ir creciendo como científico y empezar a pensar, de manera algo correcta. Me tendiste la mano para saltar al gene editing en EB, que ha dado lugar a todo esto. Has estado en todo momento para ayudarme, darme protocolos escritos cuando yo aún no existía en el mundo y enseñarme los trucos de la fosfatasa de gamba versus la de ternera. No bastaba con eso, probé contigo el mítico vermut madrileño en el Vinos II, metro Bilbao. Tu Bilbao… Eres una de las personas más inteligentes que conozco y uno de mis mayores descubrimientos en Madrid. Gracias por todo lo que has hecho y haces por mí. Incluso por pelearte con mi inglés ‘macarrónico’ y darle un poco de elegancia a esta tesis con tu influencia ‘Shakespereana’. Eres gigante jefe. Y como esto no puede decaer en sus inicios, vamos al punto más alto. BLANCA DUARTE. Podría escribir 300 páginas de esta tesis de todo lo que he aprendido de ti desde que te conocí. Lo tuyo no tiene nombre. Eres el motor de epitelios. Nos alegras los días y tu ayuda es de otro planeta. Has estado y estás siempre dispuesta a echar un cable a quien sea, cuando sea. Aprendí que no hay que quedarse con las ganas de decir lo que uno siente o piensa, y por eso soy tan pesado que muchos días te digo lo que te quiero. Esto es una guerra constante con el pesado de Esteban, pero yo sé que a mí me quieres más. Que gracias… por ser como eres, porque hacen falta más personas como tú en esta vida y es una suerte para los que hemos dado contigo. Eres un ejemplo de mujer, en todos los aspectos que se le ocurran a nadie y yo espero que pase lo que pase la vida no me prive de ti. He aprendido muchísimo de ti y contigo, gracias por todos los consejos, por escuchar mis locuras, por estar mano a mano en esta batalla, por todos los cultivos que te he hecho sufrir e histologías, por los trasplantes, por las cervezas en el CienPorCien, por Copacabana y claqué. Que siempre te lo digo, que contigo a donde la vida nos quiera escupir. Te quiero jefa. Saltamos de continente y me voy a… Costa Rica. Uf, la de dolores de cabeza que me das… Probablemente una de mis personas favoritas en la vida, aunque te haya llevado lo tuyo dar el salto de compañero de trabajo a amigo. Mi moderno de Malasaña favorito, amante del arte y de la ciencia, compañero de inicios de profesor, de malas y buenas tardes, de malas noches en Barceló y de paseos por Londres. Eres único. Tienes mil taras que te hacen ultra especial y quien te dedica algo de tiempo para conocerte (y tú le dedicas el tuyo, rebelde) acaba enamorado de ti. Eres un tío integro, inteligente, respetuoso, amable y digno de admirar. Somos tan diferentes pero tan complementarios que si algún día surge eso de montar algo juntos, seré el tío más encantado del mundo. Estebitan, te guste o no, esto es para siempre. Te quiero mucho Tico, gracias por todo amigo. Corazón, Ángeles. Otra pieza clave de este puzle. Mi genetista favorita. Gracias por enseñarme una de las cosas más importantes en la vida de un científico en biología molecular: la PCR. Fácil decían… Gracias por todo el apoyo técnico y personal en esta etapa. La de cafés tontos que nos hemos sacado intentando arreglar nuestro mundo. Eres esencial en este equipo y es un placer contar contigo para todo. Gracias, de verdad. Mi ancla al Ciemat, Vic. Gracias a tu magnífico expediente conseguiste la prestigiosa FPU, dejando un hueco para aquí un mundano. Eres una de las personas más asombrosas que he conocido. Tienes una sonrisa capaz de cambiar el mundo y capaz de hacer que los del comedor te mezclen los platos a tu antojo… Hemos compartido juntos todo el período de esta tesis y no te cambiaría por nada. He recibido cumplidos y toques de atención según mi aspecto físico del día, pero al final siempre tienes un abrazo que dar. No sé, tienes una salsa, bachata, merengue, llámalo X, que genera bienestar al que está a tu lado. Gracias por todo mi epi… Siempre, Marichocho. Ahora paso a alguien que debería ser inventariable del CIEMAT, mi Garci.