Ministère de J 'Enseignement Supérieur REPUBLIQUE DE COTE D'IVOIRE

Union-Discipline-Travail Année académique 2012-2013

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UFR des Sciences de la Nature Laboratoire de Biologie et Cytologie Animales

MEMOIRE DE DIPLOME D'ETUDE APPROFONDIE EN GESTION ET VALORISATION DES RESSOURCES NATURELLES

Option : Biologie et Production Animales

Thème: DIVERSITE GENETIQUE DE TROIS ESPECES DE : Ethmalosa fimbriata (Bowdich, 1825), aurita (Valencienne, 1847) ET Sardinella maderensis (Lowe, 1839) EN LAGUNE EBRIE (COTE D'IVOIRE).

Présenté par KOUAME Akoua Michèle

Soutenu le ~4 Octobre 2012, devant le jury composé de : Monsieur N'Da Konan, Maître de Conférences Président Madame Adépo-Gourène Béatrice, Maître de Conférences Directeur scientifique Madame N'Dri Aya Lydie, Maitre- Assistant Examinateur Monsieur Zoro Bi Arsène, Professeur Titulaire Rapporteur TABLE DES MATIERES

Pages

DEDICACE i

REMERCIEMENTS 11

LISTE DES TABLEAUX iv

LISTE DES FIGURES V

LISTE DES ABREVIATIONS vi

RESUM"E Vil

INTRODUCTION 1

I GENERALITES 3

1.1 Milieu d'étude 3

1.2 Espèces étudiées ...... •...... 3

1.2.1 Ethmalosa fimbriata 3

1.2.1.1 Systématique et distribution ...... •...... •...... 3

1.2.1.2 Biologie et écologie 5

1.2.1.3 Génétique d 'Ethmalosa fimbriata 6

1.2.2 Sardine/la aurita et Sardine/la maderensis 6

1.2.2.1 Systématique et distribution ...... •...•...... 7

1.2.2.2 Biologie et écologie ...... •.....•...... 9

1.2.2.3 Génétique des Sardinelles 10

1.2.3 Importance socioéconomique des poissons étudiés 10

II MATERIEL ET METHODES 12

2.1 Matériel 12 2. 1. 1 Matériel biologique 12

2.1.2 Matériel technique 13

2.2 Méth.odes 14

2.2.1 Echantillonnage des tissus 14

2.2.2 Technique de l'électrophorèse enzymatique 14

2.2.2.1 Préparation des extraits enzymatiques , .••.•...... • , .•...... 15

2.2.2.2 Préparation des tampons et du gel 16

2.2.2.3 Migration électrophorétique 17

2.2.2.4 Révélation des électrophorégrammes 17

2.2.2.5 Lecture des électrophorégrammes 18

2.2.3 Traitement des données 18

2.2.3.1 Mesure de la variabilité génétique 18

2.2.3.2 Divergence génétique , 20 - Di. stance gé' né' ti. que . 20 - Analyse factorielle de correspondances (AFC) 20

-Arbre phylogénétique 20 ID RESULTATS ET DISCUSSION 22

3 .1 Résultats 22

3 .1.1 Diversité génétique 22

3 .1.1.1 Description du polymorphisme enzymatique 22

3 .1.1.2 Evaluation de la diversité génétique 25

3 .1.2 Divergence génétique 26

3.1.2.1 Distance génétique ...... ••...... , 26

3.1.2.2 Répartition des individus par l'AFC ...... •...... 26 3 .1.2 .3 Structure phylogénétique 2 7

3 .2 Discussion 29

CONCLUSION ET PERSPECTIVES 31

REFERENCES BIBLIOGRAPWQUES 32

AN'NEXES 38 DEDICACE

Je dédie ce mémoire au DIEU TOUT PUISSANT qui m'a soutenue, fortifiée et affermie durant ce travail. QUE L'HONNEUR ET LA GLOIRE LUI SOIENT RENDUS A JAMAIS.

A mes très chers parents qui m'ont soutenue et qui ont su canaliser mon avenir, même dans les moments les plus difficiles. Que DIEU leur accorde une Jongue vie afin qu'ils bénéficient des fruits de leurs efforts. REMERCIEMENTS

L'élaboration de ce mémoire a certes requis des efforts personnels, mais sa réalisation n'a été possible que grâce au dévouement et à la disponibilité de certaines personnes. Il m'est donc particulièrement agréable de leur adresser mes remerciements. Je remercie le Professeur Germain GOURENE, Directeur du Laboratoire d'Environnement et de Biologie Aquatique (LEBA) de m'avoir acceptée dans son laboratoire. Son attention et sa rigueur scientifique font de lui un modèle. Je voudrais exprimer mes sincères remerciements au Professeur Béatrice ADEPO-GOURENE, Directeur de ce mémoire; non seulement pour m'avoir accueillie au sein de son équipe de recherche, mais également pour son encadrement et l'intérêt particulier qu'elle a porté à ce travail en m'initiant patiemment à la génétique des populations. J'exprime ma profonde gratitude au Professeur Konan N'DA pour avoir accepté de présider le jury de la soutenance de ce mémoire. Je remercie le Professeur Arsène ZORO BI pour avoir accepté d'être rapporteur et membre du jury de ce mémoire. Sa lecture critique et ses suggestions ont permis d'améliorer ce travail. Je remercie infiniment le Docteur Lydie N'DRI pour avoir accepté de juger ce travail. J'exprime toute ma reconnaissance au Professeur Alassane OUAITARA Enseignant-Chercheur à l 'UFR des Sciences et Gestion de l'Environnement de l'Université d' Abobo-Adjamé; chef du Laboratoire

ii Mes remerciements vont aussi à l'endroit de tous les Docteurs du Laboratoire de Biologie et Cytologie Animales pour leurs conseils et leurs encouragements. Je remercie également tous les Docteurs du Laboratoire d'Envirormement et de Biologie Aquatique (LEBA) pour leurs encouragements. Je suis très reconnaissante envers tous les étudiants du Laboratoire

iii LISTE DES TABLEAUX

Tableau I: Nombre de spécimens par espèce étudiée 12

Tableau II : Systèmes enzymatiques, tissus et tampons utilisés dans l'étude du polymorphisme enzymatique des trois espèces étudiées 16

Tableau ID: Fréquences alléliques des locus dans les trois espèces étudiées 23

Tableau IV : Allèles spécifiques aux genres Ethmalosa et Sardine/la 24

Tableau V : Valeurs des différents indices de diversité génétique des trois espe' ces e' tu die' es . 25

Tableau VI: Distances génétiques de Nei (1978) entre les espèces étudiées 26

iv LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Spécimen de Ethmalosafimbriata 5

Figure 2 : Spécimen de Sardinella aurita 7

Figure 3 : Spécimen de Sardine/la maderensis 8

Figure 4: Localisation du site d'échantillonnage des espèces étudiées dans la lagune Ebrié 13

Figure 5: Déroulement schématique d'une séance d'élèctrophorèse des proté,i. nes enzymati· ques . 15

Figure 6: Analyse factorielle des correspondances des échantillons à partir des génotypes des individus aux locus considérés 27

Figure 7: Arbre phylogénétique des échantillons des trois espèces de Clupéidés étudiées, construit à partir des distances génétiques de Nei (1978) .... 28

V 1 LISTE DES ABREVIATIONS

AAT . Aspartate Aminotransférase

IDH . Isocitrate Déshydrogénase

LDH . Lactate Déshydrogénase

LS . Longueur Standard

MDH . Malate Déshydrogénase

PGM . Phosphoglucomutase

SOD . Superoxyde Dismutase

vi RESUME

La diversité génétique de trois espèces de Clupeidae, Ethmalosa f. imbriata, Sardine/la aurita et Sardine/la maderensis, a été analysée par électrophorèse enzymatique en vue de déterminer les relations génétiques entre ces espèces. Six systèmes enzymatiques codant pour douze locus ont été analysés au cours de cette étude. Tous les locus analysés se sont révélés polymorphes entre les espèces. Ces poissons se caractérisent par une faible diversité génétique. Les douze locus analysés sont diagnostiques entre E. fimbriata et S. maderensis, tandis que neuf le sont entre E. f. imbriata et S. aurita. S. maderensis quant à elle, se différencie de S. aurita par deux locus diagnostiques. Les deux espèces du genre Sardine/la sont proches l'une de l'autre et éloignées de E. fimbriata. Les résultats de cette étude pourraient être utilisés pour l'établissement d'un programme de gestion de ces espèces en particulier et des ressources halieutiques en général.

Mots clés: Clupeidae / Ethmalosa fimbriata / Sardine/la aurita / Sardine/la maderensis / diversité génétique/ lagune Ebrié.

vii INTRODUCTION Les clupéiformes constituent un groupe de poissons d'une grande importance économique (Conand, 1978). Ils comptent 402 espèces regroupées en 5 familles : les Denticipitidae, les Pristigasteridae, les Engraulidae, les Chirocentridae et les Clupeidae (Li & Orti , 2007). Cette dernière famille a été signalée par Albaret (1994) dans la lagune Ebrié. Elle renferme 66 genres dont les genres Ethmalosa et Sardinella (Grande, 1985). Le genre Ethmalosa est monospécifique tandis que le genre Sardinella renferme plusieurs espèces (Whitehead, 1985) dont trois sont présentes en Afrique occidentale (Gourène & Teugels, 2003). Il s'agit de Sardine/la aurita, Sardine/la maderensis et Sardinella rouxi. E. fimbriata représente 75% des captures en lagune Ebrié (Ecoutin et al., 1994) et serait l'espèce la plus exploitée par la pêcherie artisanale (Durand & Skubich, 1982). S. aurita et S. maderensis représentent 80% des captures de la pêche artisanale maritime et lagunaire (FAO, 2008). Plusieurs travaux ont contribué à la connaissance de la systématique (Gourène & Teugels, 2003 ; Teugels, 2007), de la biologie et de l'écologie (Albaret & Gerlotto, 1976 ; Charles-Dominique, 1982 ; Boely, 1979 ; Boely et al., 1982 ; Charles-Dominique & Albaret, 2003) de ces espèces. Des recherches en génétique ont également contribué à la connaissance de ces espèces (Baron, 1971 ; Kinsey et al., 1994 ; Gourène et al., 1993. Chikhi, 1995 ; Chikhi et al., 1998; Adépo-Gourène, 2008). Cependant, les relations de phylogénie au sein de cette famille font l'objet de controverse (Li & Orti, 2007 ; Lavoué et al, 2007). Selon Agnèse (1989) la phylogénie est importante pour une meilleure classification des espèces. L'objectif général de ce travail est d'étudier les relations phylogéniques entre E. fimbriata, S. aurita et S. maderensis. Il vise spécifiquement à caractériser la diversité génétique de chacune de ces espèces, puis à déterminer les relations de parenté entre ces dernières. Le présent mémoire s'articule autour de trois parties. La première

1 partie comporte les généralités sur le milieu d'étude et les espèces étudiées. La seconde présente le matériel et les méthodes utilisés dans cette étude. La troisième partie est consacrée aux résultats obtenus et à la discussion. Ce mémoire s'achève par une conclusion et des perspectives.

2 I GENERALITES

1.1 Milieu d'étude

Le système lagunaire Ebrié est situé au sud de la Côte d'Ivoire entre les longitudes 3°47 et 5°29 Ouest et les latitudes 5°02 et 5°42 Nord. Il s'étend sur une superficie de 566 knr', avec une longueur de 130 km et une largeur de 7 km (Albaret, 1994). La lagune Ebrié est en communication permanente avec l'océan Atlantique par le canal de Vridi. Elle reçoit des apports d'eau douce du fleuve Comoé et de la rivière Mé à l'Est, puis de I'Agnéby à l'Ouest (Durand et al.; 1994; Durand & Chantraine, 1982). Elle est soumise au climat équatorial de transition. Les précipitations moyennes annuelles atteignent 2100 mm et sont reparties sur deux saisons de pluies : d'avril à juillet et d'octobre à novembre (Dufour et al., 1994). La lagune Ebrié est constituée de deux lagunes annexes (Aghien et Potou) et de plusieurs baies (Biétri, Koumassi, Cocody, Boulay et Banco) d'où son appellation de système lagunaire (Tastet, 1971). Les baies de Biétri, Koumassi, Cocody et Banco, situées dans les zones urbaines, présentent un degré élevé de pollution (Pagès et al., 1980; Ar:fi & GuiraJ, 1994; Yao et al., 2009). En revanche, les baies de Boulay et Layo, situées en zone rurale apparaissent comme des aires relativement peu polluées de la lagune Ebrié, Cette lagune reçoit des polluants d'origine anthropiques provenant principalement de la région d'Abidjan (Chantraine & Dufour, 1983; Durand et al., 1994).

1.2 Espèces étudiées

1.2.1 Ethmalosa fimbriata

.2.1.1 Systématique et distribution La position systématique de Ethmalosa fimbriata, appelée aussi ethmalose, se présente comme suit selon Gourène & Teugels (2003) :

3 Règne Animalia Embranchement Chordata

Sous-embranchement Vertebra

Super-classe Osteichthyes Classe Sous-classe, Neopterygii Infra-classe Teleosteii Super-ordre Clupeomorpha Ordre Sous-ordre Clupeoidei Famille Clupeidae Sous-famille Alosinae Genre Ethma/osa Espèce Ethmalosa fimbriata Les poissons du genre Ethmalosa se distinguent des autres Clupeidae par une échancrure médiane nette dont est pourvue la mâchoire supérieure. E. fimbriata (Figure 1) présente un corps plutôt élevé et assez comprimé latéralement. La paupière adipeuse est très développée. La nageoire dorsale possède 16 à 19 rayons, la nageoire anale 19 à 23 et les nageoires ventrales huit. Les écailles, au bord distal lacinié, sont au nombre de 37 à 42 le long de la ligne longitudinale. E. fimbriata présente un corps argenté avec le dos brunâtre ou verdâtre. Il existe une tache noire arrondie en arrière de la partie supérieure de 1 'opercule. EUe est parfois suivie d'une ou plusieurs autres taches moins visibles le long de la ligne longitudinale. La taille maximale observée est de 350 mm LS.

4 Figure 1 : Spécimen de Ethmalosa fimbriata (Kouamé, 2010)

Ethmalosa fimbriata est une espèce qui fréquente les milieux estuariens le long des côtes Ouest africaines de la Mauritanie à l'Angola (Charles• Dominique, 1982; Lévêque et al., 1990; Teugels, 2007).

1.2.1.2 Biologie et écologie

E. fimbriata, espèce euryhaline et eurytherme, se reproduit dans les eaux de salinité comprise entre 3,5 et 35 %o et de température variant entre 22 et 31 °C (Welcomme, 1972 ; Charles-Dominique, 1982). Selon Charles-Dominique & Albaret (2003), elle tolère aussi bien les eaux oligohalines des rivières que les eaux hyperhalines des estuaires du Saloum et de la Casamance au Sénégal. Les sexes sont séparés, mais il n'existe pas de caractère apparent de dimorphisme sexuel. La détermination des sexes se fait par identification des gonades. L'ethmalose est une espèce à reproduction continue, avec des pics saisonniers (Albaret & GerJotto, 1976 ; PanfjJj et al., 2004). La reproduction est externe et se déroule dans la colonne d'eau. Elle a lieu d'août à juin dans la lagune Ebrié avec des poussées en janvier-février, avril-mai et août-septembre (Gerlotto, 1979). Selon Scbeffers et al. (1972), les œufs sont pélagiques et au moment de la ponte, ces poissons forment des bancs visibles en surface.

5 L' ethmalose est un poisson migrateur et les principaux facteurs de cette migration sont la salinité, la température et la reproduction (Gerlotto, 1979). Ethmalosa fimbriata se nourrit de phytoplancton et de zooplancton. Cette espèce devient de plus en plus phytophage au cours de sa croissance. Cependant, ce régime alimentaire pourrait plutôt être lié aux disponibilités en nourriture du milieu, indépendamment de la taille du poisson (Fagade & Olanyan, 1972). En lagune Ebrié, E. fimbriata se nourrit par filtration de phytoplancton (diatomées, péridiniens) et de zooplancton (copépode) (N'Goran, 1995).

1.2.1.3 Génétique d' Ethmalosa fimbriata L'analyse de la diversité génétique de l'ethmalose par électrophorèse enzymatique a révélé que cette espèce est caractérisée par une faible variabilité génétique (Gourène et al., 1993; Adépo-Gourène, 2008). L'analyse des échantillons prélévés sur la côte ouest africaine (Dakar, Conakry, Sassandra, Abidjan, Adiaké et Pointe-Noire) a révélé que des paramètres tels que le nombre moyen d'allèle (1,08-1,21), l'hétérozygotie moyenne (0,004-0,25) et le taux de polymorphisme (0-8,33 %) sont faibles (Gourèoe et al., 1993). L'étude du flux génique chez cette espèce a confirmé ce que laissait présager sa biologie. En effet, E. fimbriata, espèce migratrice à fécondité élevée et à œufs pélagiques, se caractérise par de forts flux géniques. Par ailleurs, la répartition des spécimens d 'ethmalose dans la lagune Ebrié semblerait être liée aux conditions environnementales (Adépo-Gourène, 2008).

1.2.2 Sardine/la aurita et Sardine/la maderensis Les espèces du genre Sardine/la se distinguent des autres Clupeidae par la présence à la mâchoire supérieure de deux supramaxillaires dont l'une antérieure et l'autre postérieure (Gourène & Teugels, 2003).

6 1.2.2.1 Systématique et distribution

Sardinella aurita (Figure 2) présente un corps allongé, subcylindrique, parfois assez comprimé avec un ventre arrondi. Le nombre de rayons est de 9 à la nageoire ventrale. Il varie de 17 à 19 à la nageoire dorsale et de 17 à 21 à la nageoire anale. Les écailles sont cycloïdes et varient de 42 à 4 7 le long de la ligne longitudinale. La taille maximale observée est de 280 mm LS (Gourène & Teugels, 2003).

_, =--.--=-- . .. ,_, Figure 2: Spécimen de Sardinella aurita (Kouamé, 2010)

S. aurita (sardinelle ronde) est présente tout le long des côtes africaines de l'océan Atlantique; de Gibraltar jusqu'en Afrique du sud. Elle est également connue de la Méditerranée et des côtes Atlantiques européennes (Gourène & Teugels, 2003 ; Teugels, 2007).

Sardinella maderensis (sardinelle plate) (Figure 3) a un corps allongé. La nageoire dorsale possède 18 à 21 rayons, l'anale 17 à 23 et la ventrale 8. Les écailles, cycloïdes sont au nombre de 44 à 4 7 le long de la ligne longitudinale. La partie inférieure du premier arc branchial possède 70 à 166 branchiospines. La taille maximale observée est de 300 mm LS (Gourène & Teugels, 2003).

7 Figure 3: Spécimen de Sardinella maderensis (Kouamé, l010)

Ce poisson, (espèce à affinité tropicale (Ould Taleb Ould Sidi, 2005)), se rencontre en Méditerranée et le long des côtes atlantiques africaines de Gibraltar jusqu'en Namibie (Gourène & Teugels, 2003; Teugels, 2007). C'est une.

S. aurita et S. maderensis présentent la position systématique suivante (Gourène & Teugels, 2003):

Règne Anirnalia Embranchement Chordata Sous-embranchement V ertebra Super-classe Osteichthyes Classe Actinopterygii Sous-classe Neopterygii Infra-classe Teleosteii Super-ordre Clupeomorpha Ordre Clupeiformes Sous-ordre Cl upeoidei Famille Clupeidae Sous-famille Clupeinae Genre Sardine/la

8 1.2.2.2 Biologie et écologie La sardinelle ronde est un clupéidé marin capable de longues migrations côtières et de distribution très étendue (Postel, 1960). EJle est sensible aux conditions environnementales (Cury & Fontana, 1988). Sardinella aurita vit sur le plateau continental et préfère les eaux salées (> 35%o) non troubles et de température inférieure à 24 °C (Boely et aL, 1982). Les juvéniles ont une répartition côtière, puis gagnent le large et participent aux déplacements saisonniers des adultes. Chez cette espèce, le sexe ne se discerne qu'à partir de la taille de 16 cm. A l'intérieur d'une même cohorte, les mâles sont plus petits que les femelles. La taille de la première maturité sexuelle se situe vers 18,5 cm (Boely, 1979). Sur les côtes sénégalaises, deux périodes de reproduction intenses sont observées, de février à juin et de septembre à novembre. En Côte d'Ivoire, la reproduction a Heu pendant les périodes d'upwelling, de juillet à septembre et en janvier-février (Cury & Fontana, 1988). Sardine/la aurita a un régime alimentaire mixte. Les juvéniles sont planctonophages. Au fur et à mesure de la croissance, le régime devient plus carnivore (Boely, 1979).

La sardinelle plate est une espèce à croissance rapide qui atteint 18 cm en une année. Cette espèce est euryhaline et eurytherme (Camarena-Luhrs, 1986). Selon Cury & Fontana (1988), cette espèce tolère les fluctuations de l'environnement. Le dimorphisme sexuel s'observe à partir de 16 cm. La taille de la première maturité sexuelle est d'environ 16,5 cm (Boely, 1979). Ces poissons se reproduisent toute l'année. Cependant, un maximum d'activité sexuel est observé d'avril à octobre et un minimum de novembre à janvier. Le maximum de ponte se situe entre mai et août. Chez Sardine/la maderensis, la croissance des juvéniles est rapide. Dans la journée, les poissons de cette espèce sont proches du fond et s'assemblent en bancs denses. Pendant la nuit, ils remontent vers la surface et se dispersent. Toutefois, la phase de dispersion n'est pas totale et les poissons restent groupés en petits bancs. Cette espèce est côtière

9 et relativement sédentaire car elle effectue le long des côtes des migrations de faibles amplitudes. Dans la lagune Ebrié, S. maderensis est planctonophage mais se nourrit aussi de crustacés, d'annëlides, d'œufs de poissons et de débris organiques (Albaret, 1994).

1,2,2.3 Génétique des Sardinelles

La différenciation génétique de S. aurita et S. maderensis a été analysée à l'aide de deux types de marqueurs génétiques : les allozymes et 1 'ADN mitochondrial (Chikhi, 1995). L'analyse des allozymes a mis en évidence une variabilité génétique faible chez S. aurita (He = 0,011) et relativement forte (He = 0, 105) chez S. maderensis. Les marqueurs allozymique et mitochondrial ont permis de mettre en évidence l'existence d'une différenciation génétique entre les populations ouest africaines de S. maderensis. L'analyse de l' ADN mitochondrial a révélé que les échantillons provenant de l'Atlantique et de la Méditerranée sont génétiquement très différenciés. Par ailleurs, les échantillons américains sont génétiquement très proches des échantillons méditerranéens bien que la différenciation génétique entre ces deux régions soit significative. Aucune différenciation nette n'a été mise en évidence le long des côtes africaines.

1.2.3 Importance socioéconomique des poissons étudiés

E. fimbriaJa est d'une grande importance commerciale en Afrique de l'ouest. Débarquée en grande quantité le long des côtes africaines, elle permet d'assurer la sécurité alimentaire des populations. Aussi, la pêche et Je conditionnement de ce poisson génèrent des revenus qui permettent aux populations rurales d'améliorer leurs conditions de vie (Jallow, 1994). Les sardinelles (S. aurita et S. maderensisï représente 80 % des captures de la pêche

10 artisanale maritime et lagunaire. La pêche artisanale maritime fournie 4729 emplois et la pêche artisanale lagunaire génère 3239 emplois (FAO, 2008).

11 II MATERIEL ET METHODES

2.1 Matériel 2. 1. 1 Matériel biologique

Au total, 87 spécimens appartenant à trois espèces ont été analysés au cours de cette étude. Le nombre de spécimens par espèce est consigné dans le tableau I.

1 Tableau 1 : Nombre de spécimens par espèce étudiée.

Espèces étudiées Nombre de spécimens Ethmalosa fimbriata 66 Sardine/la aurita 4 Sardine/la maderensis 17

Les échantillons de poissons ont été prélevés dans la lagune Ebrié (Figure 4), précisément à l'Île Boulay et à Biétri en 2003. Ils proviennent tous de la pêche commerciale. Après leur achat, ils ont été conservés dans une glacière, puis transportés au laboratoire et conservés au congélateur à -20°C pour leur utilisation ultérieure.

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Figure 4: Localisation des sites d'échantillonnage des espèces étudiées dans la lagune Ebrié (Wango et al.; 2008) *= Site d'échantillonnage

2.1.2 Matériel technique Le matériel technique utilisé comprend : - une trousse à dissection pour le prélèvement du foie et du muscle ; - un mortier en porcelaine pour broyer les organes; - une centrifugeuse réfrigérée Jouan CR 412 pour la centrifugation des broyats ; - des tubes Eppendorfs pour la conservation de l'organe et pour recueillir les surnageants; - une balance de précision 0,001g pour les pesées;

13 - des erlenmeyers et une plaque chauffante avec agitateur magnétique pour la préparation du gel ; - des moules en plexiglas dans lesquels le gel est coulé ; - du papier Wattman n°3 de forme rectangulaire (10 mm de long sur 5 mm de large) pour l'imbibition des extraits enzymatiques; - des éponges et des électrodes pour la migration ; - des générateurs de courant pour la migration.

2.2 Méthodes 2.2.1 EcbantiUonnage des tissus

Pour l'électrophorèse des protéines enzymatiques, le foie et un morceau de muscle blanc ont été prélevés sur chaque poisson et mis dans différents tubes Eppendorf préalablement numérotés. Les échantillons de tissu sont ensuite conservés au congélateur, à une température de -20°C.

2.2.2 Technique de l'électrophorèse enzymatique

L'électrophorèse est une technique qui permet de séparer les protéines d'un mélange soumis à un champ électrique. L'électrophorèse des protéines enzymatiques permet d'analyser un grand nombre d'individus ainsi que plusieurs dizaines d'enzymes pour chaque individu (Agnèse, 1989). Cette technique se déroule en plusieurs étapes résumées sur la figure 5.

14 Conservation-Congélation 3

Broyage-Centrifugation 2 lf 1:f / Extraits~

Recongélation Décongélation Prélèvement d'organe 4 1

Prélèvement d'un échantillon Révelation d'une seule protéine grêce à de chaque extrait ses caractéristiques enzymatiques 5 8

- - -- . --· -- --.•. - Languette ··----·----- de papier LectuCre des Gdénotypes Wathman 9 Disposition des papiers Migration de toutes Wathman dans le gel les protéines de chaque échantillon d'amidon 7 6

Figure 5: Déroulement schématique d'une séance d'électrophorèse des protéines enzymatiques (Agnèse, 1989).

2.2.2.1 Préparation des extraits enzymatiques

Les échantillons de tissu ont été broyés dans de l'eau distillée pour obtenir un extrait de l'ensemble des enzymes en solution. Le broyat a été centrifugé à 6000 tours zmn pendant 30 à 45 mn à 4°C. Le surnageant a été recueilli dans un tube Eppendorf étiqueté, puis conservé à ·20°C. Tous les extraits obtenus ont été analysés pour 6 systèmes enzymatiques (AAT, IDH, LDH, MDH, PGM, SOD). Les systèmes enzymatiques recherchés, les tissus et les tampons utilisés sont indiqués dans le tableau II. La préparation des extraits enzymatiques s'est faite selon le protocole utilisé par Adépo-Gourène (2008).

15 Tableau Il : Systèmes enzymatiques, tissus et tampons utilisés dans l'étude du polymorphisme enzymatique des trois espèces étudiées. SYSTEMES ENZYMATIQUES LOCUS TISSUS TAMPON

Aspartate aminotransférase AAT-1 F* TC 6,7*

(EC 2.6.1.1) AAT-2 F TC 6,7

AAT-3 F TC6,7

lsocitrate déshydrogénase IDH-1 F TC6,7

(EC 1.1.1.42) IDH-2 M* TC 6,7

Lactate déshydrogénase LDH-1 F MC2*

(EC 1.1.1.27) LDH-2 F MC2

LDH-3 F MC2

Malate déshydrogénase MDH-1 F PC 6,3*

(1.1.1.37) MDH-2 M

Phosphoglucomutase PGM F TC 6.7

(EC 5 .4.2.2)

Superoxyde dismutase SOD F TC 6,7

(EC 1.15 .1.1)

* F : foie ; M : muscle ; TC : Tris-Citrate ; MC : Morpholine-Citrate ; PC : Phosphate-Citrate.

2.2.2.2 Préparation des tampons et du gel

Deux types de tampons ont été utilisés pour l'électrophorèse sur gel d'amidon. L'un a servi à la préparation du gel tandis que l'autre, le "tampon de migration", a servi à l'immersion des électrodes. Ces tampons

16 Le gel a été obtenu à partir de 50 g d'amidon hydrolysé de pomme de terre, mis en suspension homogène dans 380 ml de tampon approprié. Le mélange a été porté à ébullition jusqu'à apparition de grosses bulles. Il a été constamment agité de façon magnétique. Le gel ainsi obtenu a été dégazé à l'aide d'une pompe à vide, puis coulé dans un moule en plexiglas (20 x} 7 xI cm) et débarrassé des bulles d'air restantes. Il se prend en masse en une heure puis est recouvert d'un film de cellophane pour éviter la dessiccation. Ce gel peut refroidir à l'air libre sur la paillasse ou être mis au réfrigérateur trois heures après. 2.2.2.3 Migration électrophorétique

La migration a été réalisée horizontalement sur le gel d'amidon. Des petits rectangles de papier Wattman n°3, imprégnés des extraits enzymatiques décongelés ont été déposés dans une fente (ligne de départ) pratiquée dans le gel du côté de la cathode. Le front de migration a été matérialisé par quelques gouttes de bleu de bromophénol insérées dans la fente. Le gel couvert a été disposé sur des bacs contenant la solution tampon de migration où baignent les électrodes et les éponges. Ces éponges appliquées sur Je gel assurent le contact électrochimique. Le tampon permet d'assurer l'ionisation permanente du gel durant l'électrophorèse. La migration s'effectue pendant 3 à 5 heures sous 1 'effet d'un courant continu de 85 à 95 mA et200 à 380 mV. L'échauffement du gel est évité en le recouvrant d'un sac de glace pilé renouvelable.

2.2.2.4 Révélation des électrophorégrammes

Après la migration, le gel a été démoulé et découpé en quatre tranches fines. Une tranche donnée ne sert qu'à la révélation d'un seul système enzymatique. La révélation se fait en laissant séjourner le gel dans une solution spécifique donnant une réaction colorée à 1 'endroit où se trouve la protéine recherchée. La coloration s'obtient par réduction d'un colorant accepteur

17 d'électrons. Les produits utilisés sont les systèmes formés par le nitro bleu de tétrazolium (NBT) ou le bromure de diméthylthiazol diphényltétrazolium (MTT) et le méthosulfate de phénazine (PMS). Dans cette réaction, le cofacteur de l'enzyme (NADP ou NADPH) réduit le NBT ou le MTI. Ce dernier, de couleur jaune se transforme en bleu. L'activité de l'enzyme est révélée par la présence d'une ou plusieurs bandes de couleur blanche, bleue ou noire qui représente le phénotype de la protéine. La solution de coloration comprend alors le substrat, le colorant (NBT ou MTI), le PMS, le cofacteur et parfois un catalyseur enzymatique. Les réactifs de révélation de chaque système enzymatique sont mentionnés en annexe 2.

2.2.2.5 Lecture des électrophorégrammes

La nomenclature des différents locus est celle proposée par Shaklee et al. (1990). La nomenclature des différents locus d'un système enzymatique est fonction de sa mobilité. Le numéro 1 est affecté au locus le plus proche de la cathode. Pour chaque locus, l'allèle le plus fréquent qui servira de référence dans l'étude de l'espèce reçoit l'indice 100. Les autres allèles sont désignés en fonction de leur mobilité par rapport à l'allèle 100, le point O étant considéré comme la ligne de départ.

2.2.3 Traitement des données

Les données génotypiques des individus des différentes populations sont transformées en fréquences alléliques afin de calculer des paramètres statistiques. Ces paramètres caractérisent chaque population grâce à l'analyse de la variabilité génétique. Ils servent aussi à caractériser les populations les unes par rapport aux autres par la mesure de la divergence génétique.

2.2.3.1 Mesure de la variabilité génétique

Trois indices permettent de mesurer la variabilité génétique :

18 - Le taux de polymorphisme P qui correspond au nombre de locus polymorphes par rapport au nombre de locus étudiés. On considère qu'un locus est polymorphe lorsque l'allèle le plus commun a une fréquence inférieure ou égale à 95 ou 99%. La valeur de p est affectée par la taille de l'échantillon. Le taux de polymorphisme s'exprime selon la formule 1 : n. p = _!3!_

n1 ( 1) où Ilpj représente le nombre de locus polymorphes et nt le nombre total de locus analysés. - La diversité allélique (A) qui est le nombre moyen d'allèle par locus. - La diversité génétique ou hétérozygotie théorique qui s'exprime par deux indices (Hi et I-L,). L'indice H. est l'hétérozygotie attendue sous Hardy-Weinberg pour un locus i et est déterminée par la formule 2:

H, = 1- L (ij} (2) où Pj représente la fréquence de l'allèle j du locus i. Quant à He, il représente l 'hétérozygotie attendue pour l'ensemble des locus étudiés et s' établie selon la formule 3 :

He= LTH, (3) où L représente le nombre total de locus

étudiés. Ce paramètre est sensible aux variations d'effectifs. En plus de l'hétérozygotie attendue, l 'hétérozygotie observée (Ho) est calculée pour mesurer la variabilité génétique à l'intérieur de la population. Pour les petits échantillons, la formule de calcul proposée par Nei (1978) a été utilisée. Elle est déterminée par la formule ( 4) :

2 2N(1- L(P ) ) H = ( { (4) où N représente le nombre total 0 2N-1 d'individus.

19 2.2.3.2 Divergence génétique

- Distance génétique

La distance génétique mesure le degré de différenciation génétique de deux unités taxonomiques (espèces). Différents indices permettent d'estimer les divergences génétiques entre unités taxonomiques proches, à partir des données de fréquences alléliques. Dans le présent travail, l'indice de Nei (1978) dont la formule est la suivante (5) a été utilisée :

Dans cette formule, n I représente le nombre de locus analysés et p; la fréquence du locus.

- Analyse factorielle de correspondances (AFC)

L'analyse factorielle de correspondances (AFC) est un type d'analyse canonique particulièrement bien adapté pour décrire les associations génotypiques au sein des populations (Benzécri, 1973). Le but est de révéler les corrélations entre caractères ( allèles, locus) et de proposer une structure de la population. Un des intérêts majeurs de cette analyse est de fournir une méthode de représentation d'une population décrite par un ensemble de caractères dont les modalités sont qualitatives. L'AFC a été fait à l'aide du logiciel GENETIX version 4.05 .2 (Belkhir et al, 2004).

- Arbre phylogénétique

L'arbre phylogénétique est un type d'analyse qui permet de classer les objets analysés en fonction de leurs ressemblances, mais aussi en fonction de leur lien de parenté. Il rend ainsi compte des évènements évolutifs au sein des

20 familles, des genres ou des espèces. La construction d'arbres phylogénétiques est un moyen pour traduire les relations entre les distributions d'allèles, les fréquences alléliques ou les génotypes d'une part et Jes taxons (genres, espèces) d'autre part (Agnèse, 1989). L'arbre phylogénétique a été construit à partir de la matrice des fréquences alléliques. Cette matrice de départ est modifiée aléatoirement 100 fois à J'aide du logicieJ SEQBOOT. Ces matrices sont ensuite transformées en matrice de distances génétiques de Nei (1978) en utilisant le logiciel GENEDIST. Les 101 matrices de distances sont ensuite traitées par le programme NEIGHBOR et l'ensemble des réseaux ainsi obtenus est résumé en un seul par le programme CONSENSE. Tous ces programmes sont inclus dans le logiciel PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3 .Sc (Felsenstein, 1991).

21 1

ID RESULTATS ET DISCUSSION

3.1 Résultats

3.1,1 Diversité génétique

3.1.1.1 Description du polymorphisme enzymatique

Douze locus (AAT-1, AAT-2, AAT-3, IDH-1, IDH-2, LDH-1, LDH-2, LDH-3, MDH-1, MDH-2, PGM, et SOD), codant pour 6 systèmes enzymatiques (AAT, IDH, LDH, MDH, PGM et SOD), ont été analysés au cours de cette étude. Les différents allèles identifiés, leur mobilité et leur fréquence sont présentés dans le tableau m. Tous les locus analysés sont polymorphes entre les trois espèces. Parmi ces locus, huit présentent chacun deux allèles. Il s'agit des locus AAT-1, AAT-2, AAT-3, IDH-2, LDH-1, LDH-21 LDH-3 et PGM. Deux (IDH-1, MDH-2) sont représentés par quatre allèles. Quant aux locus SOD et MDH-1, ils sont caractérisés respectivement par trois et cinq allèles. Chez Ethmalosa fimbriata, cinq locus (AAT-3, IDH-1, MDH-1, MDH-2 et SOD) sont polymorphes. Les locus AAT-3, IDH-1 et MDH-1 sont polymorphes au seuil de 99% tandis les locus MDH-2 et SOD le sont au seuil de 95%. Trois locus sont polymorphes chez Sardine/la maderensis. Il s'agit des locus IDH-1, LDH-3 et MDH-1. Les locus IDH-1 et MDH-1 sont polymorphes au seuil de 95% alors que LDH-3 est polymorphe au seuil de 99%. Au niveau de l'espèce S. aurita, tous les locus analysés se sont révélés monomorphes. Certains des locus analysés permettent de distinguer les espèces les unes des autres. Ce sont des locus diagnostiques. Les allèles spécifiques des espèces à ces locus sont appelés allèles diagnostiques. Ces allèles diagnostiques sont consignés dans le tabJeau IV. Tous les douze locus analysés sont diagnostiques entre E. fimbriata et S. maderensis ( cf. tableau ID).

22 Tableau Ill : Fréquences alléliques des locus polymorphes dans les trois espèces étudiées.

Locus E. fimbriata S. maderensis S. aurita

N 66 17 4 MT-1 100 1 - 1 105 - 1 AAT-2 80 1 - 1 100 - 1 AAT-3 100 - 1 1 105 1 IDH-1 80 - 0,94 1 100 0,98 0,06 105 0,01 110 0,01 IDH-2 80 - 1 1 100 1 LDH-1 100 I 105 - 1 1 LDH-2 100 1 102 - 1 1 LDH-3 90 - 0,03 100 I 0,97 1 MDH-1 80 0,01 90 - 0,12 100 0,97 105 - 0,88 1 110 0,02 MDH-2 75 0,15 80 - 1 1 100 0,83 105 0,02 PGM 80 - 1 1 100 1 SOD 80 - 1 1 90 0,11 100 0,89 23 E. fimbriata présente les allèles diagnostiques suivants : AA T-1*100, AA T- 2 * 80, AAT-3*105, IDH-1*100, IDH-2*100, LDH-1*100, LDH-2*100, MDH- 1*100, MDH-2* 100, PGM* 100 et SOD* 100, tandis que Sardinella. maderensis présente les allèles AAT-1 *105, AAT-2*100, AAT-3*100, IDH-1 *80, IDH- 2*80, LDH-1*105, LDH-2*102, LDH-3*90, MDH-1*90, MDH-1*105, MDH- 2*80, PGM*80, S0D*80. Neuf locus sont diagnostiques entre Ethmalosa. fimbriata et S. aurita. 11 s'agit des locus AAT-3, IDH-1, IDH-2, LDH-1, LDH-2, MDH-1, MDH-2, PGM et SOD. Au niveau de ces locus, E. fimbriata présente les allèles AAT-3*105, IDH-1*100, IDH-2*100, LDH-1*100, LDH-2*100, MDH-1*100, MDH-2*100, PGM*lOO et SOD*lOO, alors que les allèles AAT- 3*100, IDH-1*80, IDH-2*80, LDH-1*105, LDH-2*102, MDH-1*105, :MDH- 2*80, PGM*80 et S0D*80 sont caractéristiques de S. aurita. Au sein du genre Sardine/la, deux locus (AAT-1, AAT-2) sont diagnostiques malgré la faible taille des échantillons analysés. S. maderensis se caractérise par les allèles AA T- 1 * 105 et AAT-2*100, tandis que les allèles AAT-1*100 et AAT-2*80 sont observés chez S. aurita.

Tableau IV : Allèles spécifiques aux genres Ethmalosa et sardinelia. Locus E. fimbriata S. maderensis Allèles spécifiques au enre Sardine/la AAT-1 105 AAT-2 100 AAT-3 105 100 IDH-1 105 80 110 IDH-2 100 80 LDH-1 100 105 LDH-2 100 102 LDH-3 90 90 MDH-1 80 90 90 100 105 110 MDH-2 75 80 100 105 PGM 100 80 SOD 90 80 100

24 Certains allèles dits ''privés'' sont présents exclusivement dans une espèce. Pannis ces allèles, ceux dont la fréquence est inférieure ou égale à 0,5 % sont dits "rares". Chez I'ethmalose, les allèles privés sont MDH-2*75, S0D*90, IDH-1*105, IDH-1*110 MDH-1*80, MDH-1*110 et MDH-2*105; les cinq derniers étant des allèles rares. Chez S. Maderensis, les allèles privés sont LDH- 3*90 et MDH-1 *90, le premier étant rare.

3.1.1.2 Evaluation de la diversité génétique

La diversité génétique calculée est faible dans l'ensemble (Tableau V). Le nombre moyen d'allèles (A) varie entre l (Sardine/la aurita) et 1,66 (Ethmalosa fimbriata). En ce qui concerne les taux d'hétérozygotie moyenne attendue et observé, ils oscillent entre O (S. aurita) et 0,047 (E. fimbriata.) et entre O (S. aurita) et 0,045 (E. fimbriata). Le taux de polymorphisme (P9s%) varie de O (S. auritaï à 16,67% (E. fimbriata et S. maderensis ).

Tableau V: Valeurs des différents indices de diversité génétique des trois espèces étudiées.

Espèces A He Ho P9s -- E. fimbriata 1,66 0,047 0,045 16,67

S. maderensis 1,25 0,031 0,034 16,67

S. aurita 1 0 0 0

A : nombre moyen d'allèle ; He : taux d 'hétérozygotie théorique ; Ho : taux d 'bétérozygotie observé ; P9s : taux de polymorphisme à 95%.

25 3.1.2 Divergence génétique 3.1.2.1 Distance génétique

Les distances génétiques calculées entre les trois espèces de poissons sont consignées dans le tableau V. Ces distances sont grandes dans l'ensemble et varient de 0, 187 à 2,4. La distance génétique la plus faible relie S. aurita à S. maderensis (0, 187), tandis que la plus grande (2,4) est observée entre E. fimbriata et S. maderens is.

Tableau VI : Distances génétiques de Nei (1978) entre les espèces étudiées.

Espèces E. fimbriata S. maderensis S. aurita

E. fimbriata 2,400 1,356 S. maderensis 0,187 S. aurita

3.1.2.2 Répartition des individus par I' AFC

La répartition, par l 'Analyse Factorielle de Correspondance (AFC), des individus des différentes espèces étudiées est représentée par la figure 6. L 'AFC montre que les trois espèces étudiées sont nettement distinctes les unes des autres. Les axes 1 et 2 contribuent respectivement à 66,77 et 4,82 dans la distribution des individus, soit 71,69% de la variabilité génétique totale. L'axe l contribue Je pJus dans la répartition des individus. La répartition de S. aurita, et S. maderensis se fait selon les coordonnées positives de l'axe 1. Quant aux individus d'E. fimbriata, ils se disposent suivant les coordonnées négatives de ce même axe. L 'AFC montre que les espèces S. aurita et S. maderensis sont proches l'une de l'autre.

26 .o .... "·"· ... 6 ·····. ® ®®

0

~ : Sardine/la aurita ; ® : Sardine/la maderensis ; 0: Ethmalosa fimbriata Figure 6: Analyse factorielle des correspondances des échantillons à partir des génotypes des individus aux locus considérés.

3.1.2.3 Structure phylogénétique L'arbre phylogénétique obtenu à partir de la matrice des distances génétiques repartit les espèces en deux groupes (Figure 7). Le premier groupe est constitué d 'Ethmalosa fimbriata, tandis que le second groupe renferme Sardine/la aurita et S. maderensis, c'est à dire les espèces du genre Sardine/la. Tout comme l'AFC, l'arbre phylogénétique montre que les trois espèces étudiées sont génétiquement distinctes. Les deux espèces du genre Sardine/la (S. aurita et S. maderensis) sont proches l'une de l'autre.

27 1

E. jlmbrlata

0, 1 S. aurita

Figure 7 : Arbre phylogénétique des échantillons des trois espèces de Clupéidés étudiées, construit à partir des distances génétiques de Nei (1978).

28 3.2 Discussion L'analyse de la diversité génétique a révélé que Ethmalosafimbriata est caractérisée par une faible diversité (A= 1,66 ; He- 0,05 ; Ho= 0,04 ; P9s% = 16,67). Ces valeurs corroborent la faible variabilité observée par Gourène et al. (1993) chez cette espèce (1,08 < A <1,2; 0,004

29 • Les pressions de pêche, très fortes, subies par ces trois espèces. En effet, Ethmalosa fimbriata est l'espèce la plus exploitée par la pêcherie artisanale (Durand & Skubicb, 1982) et les sardinelles représentent 80% des captures de la pêche artisanale maritime et lagunaire (FAO, 2008). • Enfin, les goulots d'étranglement ayant affecté par le passé la plupart des espèces. En effet, il y a environ 6 millions d'années, le climat de la terre a subi d'importantes modifications liées au phénomène de glaciation. En Afrique, les périodes glaciaires coïncident avec le développement d'un climat aride et ces périodes sont marquées par l'extension de la savane (Lévêque, 2006). Les glaciations du pléistocène ont entrainé l'abaissement du niveau de la mer, conduisant ainsi à l'assèchement des lagunes. Ces évènements ont entrainé l'effondrement des populations. Ce qui pourrait être à l'origine de la diminution de la diversité génétique. Les distances génétiques obtenues entre les trois espèces sont dans l'ensemble élevées. La plus petite distance est celle obtenue entre S. aurita et S. maderensis. Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait que dans cette étude, ces espèces ne diffèrent que par deux allèles. Cela dénote de la proximité génétique entre ces deux espèces et confirme la systématique qui les renferme dans le même genre. E. fimbriata se différencie des deux premières espèces par les allèles AA T- 3 * 105, IDH-2*100~ LDH-1*100, LDH-2*100, MDH-1*100, MDH.2*100, PGM* l 00, et SOD* l 00. Le nombre élevé d'allèles diagnostiques chez cette espèce expliquerait les regroupements au niveau de l 'AFC et de l'arbre phylogénétique. L' AFC et l'arbre phylogénétique montrent la grande proximité entre S. aurita et S. maderensis.

30 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

La présente étude a permis d'évaluer la relation génétique entre Ethmalosa fimbriata, Sardine/la aurita et Sardine/la maderensis en lagune Ebrié. L'analyse de la diversité génétique indique que dans l'ensemble, les espèces E. fimbriata, S. aurita et S. maderensis présente une faible diversité génétique. Les douze locus analysés (AAT-1, AAT-2, AAT-3, IDH-1, IDH-2, LDH-1, LDH-2, LDH-3, MDH-1, MDH-2, PGM et SOD) permettent de différencier E.fimbriata de S. maderensis. Neuf locus (AAT-3, IDH-1, IDH-2, LDH-1, LDH-2, MDH-1, MDH-2, PGM et SOD) sont diagnostiques entre E. fimbriata et S. aurita. Deux locus (AAT-1, AAT-2) sont diagnostiques entre S. maderensis et S. aurita. Par ailleurs, la plus petite distance génétique relie S. maderensis à S. aurita et la plus grande relie E. fimbriata et S. maderensis. L'AFC et l'arbre phylogénétique indiquent que les espèces étudiées sont bien différenciées et que S. aurita et S. maderensis sont plus proches l'une de l'autre qu'elles ne le sont de E. fimbriata. Pour une meilleure analyse de la diversité génétique, ce travail devra se poursuivre par l'analyse d'un nombre plus important de spécimens (50 au moins par espèce), d'espèces et de locus. Il devra également utiliser des techniques moléculaires.

31 1

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37 ANNEXE 1 : Composition des tampons de migration et de gel (Pasteur et al., 1988). Tampons de migration Tampon gel

TC 6,7 (Tris- Citrate pH 6,3) 0, 77 g Tris (0,08M), 0,5 g acide

16 g Tris (0,22M), 10,8 g d'acide citrique (0,003M), 400 ml d'eau citrique, 600 ml d'eau distillée. distillée. Ajuster le pH à 6,3 avec le Ajuster le pH 6,3 avec le Tris (lM) ou Tris (lM) ou l'acide citrique (lM). l'acide citrique (IM).

MC 2 6,2 (Morpholine-Citrate pH 6,2) 21 ml du tampon de migration avec 400 ml d'eau distillée. 11,5 g d'acide citrique, 600 ml d'eau distillée. Ajuster le pH avec le morpholine.

PC 6,3 (Phosphate-Citrate pH 6,3) Dilution au 1/39 du tampon de migration ( 10 ml à 400 ml d'eau 44,1 g d'acide citrique (sel trisodique) distillée). Ajuster le pH à 6,3 avec le (0,15M), 37,4 g sodium dihydrogène NaOH(lM). phosphate (0,24M) ; NaH2P04, 100 ml d'eau distillée. Ajuster le pH à 6,3 avec le NaOH (1 M) ou l'acide citrique.

TC : Tris-Citrate MC : Morpholine-Citrate PC : Phosphate-Citrate ANNEXE 2 : Système enzymatique et réactifs de révélation.

Systèmes enzymatiques Réactifs de révélation AAT 40 ml Tris- HCL (0,2 M) pH 8,0 ; 10 mg acide aspartique; 160 mg acide kétoglutarique; 80 mg fast Blue BB. IDH 3 ml Tris-HCL (0,2 M) pH 8,0 ; 1 ml NAD ; 0,5ml MgCh ; 0,5 ml NADP ; 2 ml acide isocitrique ; 0,5 ml NBT ; 0,5 PMS ; 1 ml MTI. LDH 4 ml Tris- HCL (0,2 M) pH 8,0 ; 1 ml NAD, 6 ml acide lactique ; 0,5 ml NBT ; 0,5 PMS. MDH 35 ml Tris- HCL (0,2 M) pH 8,0; 0,5 ml MgCh; 2 ml NAD ; 5 ml acide malique; 15 mg pyruvate, 1 ml NBT, 0,5 ml PMS, 1 ml MTI. PGM 4 ml Tris- HCL (0,2 M) pH 8,0 ; 1 ml MgCb; 1 ml NAD ; 0,5 ml NADP ; 200 mg glucose- l-phosphate ; glucose-ô- phosphate déshydrogénase (1, 7 unités) ; 0,5 ml NBT ; 0,5 ml PMS ; 0,5 ml MTT ; 10ml agar. SOD 40 ml Tris- HCL (0,2 M) pH 8,0 ; 0,5 ml MgCh; 1 ml NAD ; 1 ml NBT ; 0,5 PMS.