UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

CAMPUS BAIXADA SANTISTA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPRODUTOS E

BIOPROCESSOS

ALTERAÇÕES EM CONCHAS DE LOTTIA SUBRUGOSA COMO

POSSÍVEIS BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO PARA ÁREAS

COSTEIRAS MULTI-IMPACTADAS

NAYARA GOUVEIA DOS SANTOS

Santos

2018 2

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

CAMPUS BAIXADA SANTISTA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPRODUTOS E

BIOPROCESSOS

ALTERAÇÕES EM CONCHAS DE LOTTIA SUBRUGOSA COMO

POSSÍVEIS BIOMARCADORES DE CONTAMINAÇÃO PARA ÁREAS

COSTEIRAS MULTI-IMPACTADAS

Dissertação apresentada como requisito à obtenção do

título de mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em

Bioprodutos e Bioprocessos pela Universidade Federal

de São Paulo.

Orientador: Ítalo Braga de Castro

NAYARA GOUVEIA DOS SANTOS

Santos

2018 3

À minha mãe por ser a razão e o motivo por eu lutar com tanto amor e determinação para tornar todos os meus sonhos em realidade. 4

Agradecimentos

Agradeço primeiramente a Deus por ter me sustentado até aqui, por não permitir que eu desistisse, mesmo quando as adversidades pareciam tão grandese por ter colocado em meu coração um sonho tão especial que é ter o título de mestre em uma Universidade Federal.

Agradeço a minha mãe por ser a minha maior incentivadora, por ter depositado em mim todo amor e carinho durante toda a minha vida acadêmica, mesmo que as crises de ansiedade tenham sido muitas. Como todos os êxitos da minha vida, sem ela nada seria possível.

Agradeço à minha família pelo apoio, por sempre estarem ao meu lado em qualquer situação, por acreditarem em meu potencial e torcerem por todas as minhas conquistas

Agradeço ao meu grande amigo e orientador Dr.Ítalo Braga de Castro, por ter aceitado me orientar durante o mestrado, pela paciência, incentivo e principalmente por “rabiscar” todo o meu referencial, fazendo com que eu me apaixonasse cada vez mais pelo mundo acadêmico. Com certeza, ele é uma das minhas maiores inspirações.

Agradeço ao meu namorado Rafael Mota por ter me ajudado muito durante o tempo do mestrado, pelo apoio, dedicação e cuidado, assim como por sempre acreditar nesse sonho comigo.

Agradeço as minhas grandes companheiras de vida acadêmica e também amigas para a vida toda Carolina Rocha Moreira de Oliveira e Camila Pratalli

Martins, por me ajudarem intensamente em todas as análises do dado trabalho, bem 5 como a interpretação de artigos e todo o desenvolvimento do projeto. Esse trabalho com certeza, também é delas, afinal formamos um time de peso

Agradeço a minha grande amiga Monique Carvalho por ter estudado à distância comigo e por ter me enviado muitas atividades para que eu sanasse minhas dificuldades com o inglês e obtivesse êxito na prova de proficiência.

Agradeço à professora Dr. Manoela Romanó de Orte por ter me ajudado incansavelmente durante as análises elementares quase intermináveis, com muita paciência e carinho.

Agradeço à professora Dra. Luciane Maranho por ter me ajudado com as análises de biomarcadores e ao professor Dr. Sérgio Almeida por ter me auxiliado com as análises morfológicas.

6

“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”

(Arthur Schopenhauer) 7

Lista de Figuras

Figura 1: Figura 1: Vista Dorsal (a), Ventral (b) e Lateral (c) da concha de

Lottiasubrugosa ...... 19

Figura 2: Localização das áreas de amostragemao longo litoral Brasileiro com indicação das principais fontes de contaminação para cada sistema...... 23

Figura 3: Localização dos pontos de amostragem identificando as principais atividades que apresentam potencial para lançamento de substâncias químicas perigosas na Baía de Todos os Santos...... 25

Figura 4: Localização dos pontos de amostragem identificando as principais atividades que apresentam potencial para lançamento de substâncias químicas perigosas no complexo estuarino de Santos-São Vicente...... 27

Figura 5: Localização dos pontos de amostragem identificando as principais atividades que apresentam potencial para lançamento de substâncias químicas perigosas na Baía de Paranaguá...... 29

Figura 6: Comparação entre as concentrações de danos ao DNA em L. subrugosa obtidas no SESS (A), CEP (B) e BTS (C). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn...... 38

Figura 7: Figura 7: Comparação entre os níveis de peroxidação lipídica em L. subrugosa obtidas no SESS (A), CEP (B) e BTS (C). as letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn.

...... 39

Figura 8: Regressões lineares entre comprimento, Altura (A) e Espessura do ápice

(B) das conchas de L. subrugosa obtidas ao longo das localidades amostradas no litoral brasileiro...... 44 8

Figura 9: Comparação entre comprimentos das conchas de L. subrugosa obtidas ao longo das localidades amostradas no litoral brasileiro. Valores de p se referem a teste comparativo por localidade (Kruskal-Wallis). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn.

...... 45

Figura 10: Comparação entre as Alturas / Comprimento de conchas de L. subrugosa obtidas no SESS (A), CEP (B) e BTS (C). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn...... 47

Figura 11: Comparação entre as Espessuras do ápice / Comprimento de conchas de

L. subrugosa obtidas no SESS (A), CEP (B) e BTS (C). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn.

...... 48

Figura 12: Gráficos de pontuação de análise de componentes principais (EFA-PCA) dos padrões de variação no formato de concha de Lottiasubrugosa coletados em

TSB (A), SSES (B) e PEC (C). As reticências representam o intervalo de confiança de 95% em cada local de amostragem...... 51

Figura 13: Razões entre as concentrações de Cd e Ca em conchas de

Lottiasubrugosa amostradas em SESS, PEC e BTS. As letras (A, B E C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn.

...... 58

9

Lista de Tabelas

Tabela 1: Valores da curva de calibração utilizada com BSA para quantificação das proteínas totais...... 33

Tabela 2: Valores da curva de calibração utilizada no ensaio de LPO...... 36

Tabela 3: Média e desvio padrão (DP) dos parâmetros biométricos das conchas de

Lottiasubrugosa coletadas em locais distribuídos em três sistemas aquáticos da costa Brasileira...... 44

Tabela 4: Concentrações médias (mg g-1) e desvio padrão (sd) de elementos selecionados em conchas de Lottia subrugosa coletadas em áreas distribuídas em três sistemas aquáticos (BTS, SESS e CEP) da costa brasileira. Os valores em negrito indicam diferenças estatisticamente significativas entre os pontos de acordo com o teste de comparação múltipla de Dunn (p <0,05)...... 57

10

Lista de abreviaturas e siglas utilizadas

BTS – Baia de todos os Santos

CEP – Complexo Estuarino de Paranaguá

SESS – Sistema Estuarino Santos-São Vicente

CC - Comprimento da concha

AC - Altura da concha

EA - Espessura do ápice da concha

11

Sumário

RESUMO...... 13

1. INTRODUÇÃO ...... 15

2. OBJETIVOS ...... 21

3. MATERIAIS E MÉTODOS ...... 22

3.1. AMOSTRAGEM ECARACTERIZAÇÃO DAS ÁREAS DE ESTUDO ...... 22

3.1.1 Baía de Todos os Santos (BTS) ...... 23

3.1.2 Sistema Estuarino de Santos-São Vicente (SESS) ...... 26

3.1.3 Complexo Estuarino de Paranaguá (CEP) ...... 28

3.2. Processamento inicial das amostras ...... 29

3.3. Análise Morfométricas das Conchas ...... 30

3.4. Análise Elementar ...... 31

3.5. Biomarcadores bioquímicos ...... 32

3.5.1 Proteínas Totais ...... 32

3.5.2 Dano ao DNA ...... 33

3.5.3 Lipoperoxidação Lipídica ...... 34

3.7. Análise Estatística ...... 35

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES ...... 36

4.1. Biomarcadores bioquímicos tradicionais em Lottia subrugosa ...... 36

4.2Análises biométricas ...... 43

4.3 Análises morfométricas ...... 50

4.4. Composição elementar de conchas ...... 53 12

6. CONCLUSÕES ...... 59

REFERÊNCIAS ...... 60

13

RESUMO

Moluscos têm sido amplamente empregados no biomonitoramento de ambientes aquáticos por apresentarem alta sensibilidade aos efeitos dos compostos químicos perigosos e possuírem a capacidade de armazenar em sua concha, o histórico das alterações ambientais ocorridas em seu habitat. O molusco Lottia subrugosa (d'Orbigny, 1846), pertencente à classe dos gastrópodes é uma espécie encontrada na zona entre marés do litoral da costa brasileira, com potencial para se tornar uma promissora ferramenta para análise de impactos e no monitoramento da qualidade ambiental. Sendo assim, o presente estudo teve como objetivo relacionar biomarcadores bioquímicos tradicionais com alterações biométricas, morfométricas, bioquímicas e da composição elementar das conchas de Lottia subrugosa ao longo de gradientes de contaminação. O estudo foi realizado em áreas costeiras multi- impactadas do litoral brasileiro como a baía de Todos os Santos (BA), o Sistema estuarino de Santos-São Vicente (SP) e a baía de Paranaguá (PR). Os resultados mostraram que todos os biomarcadores avaliados responderam à contaminação ambiental, independentemente da presença (SESS e CEP) ou ausência (BTS) de um gradiente de contaminação. De fato, a resposta encontrada pelos novos biomarcadores propostos (parâmetros biométricos e morfométricos) é consistente com a exposição e efeitos indicados pelos biomarcadores tradicionais (peroxidação lipídica e danos no DNA). As mudanças na composição elementar de conchas de L. subrugosa sugerem que a exposição a ambientes contaminados é provavelmente responsável pelas alterações detectadas. Devido à simplicidade e menor custo das análises biométricas e morfométricas, esses parâmetros parecem ser uma ferramenta promissora para futuras avaliações, especialmente em áreas onde os recursos tecnológicos são escassos. Os achados do presente estudo foram observados em três sistemas aquáticos distribuídos em uma ampla faixa de latitudes, o que indica fortemente que as conchas dos gastrópodes refletem os efeitos resultantes da contaminação ambiental.

PALAVRAS CHAVE: Alterações Morfológicas; Moluscos; Lottia subrugosa;

Biomarcadores 14

ABSTRACT

Molluscs have been widely used in biomonitoring of aquatic environments because they are highly sensitive to the effects of hazardous chemicals and have the capacity to store in shells the history of environmental changes in their habitat. Lottia subrugosa is a patelliform gastropod specie found in tidal zones from Brazilian coast.

This organism is a promising tool to be used in environmental assessments in monitoring studies. The present study evaluated the association among traditional biochemical biomarkers with biometric, morphometric, and elemental composition of

L. subrugosa shells from three multi-impacted coastal areas in Brazil. The study was carried out in Todos os Santos Bay (TSB), Santos/São Vicente Estuarine System

(SSES) and Paranaguá Estuarine Complex (PEC), using three sampling sites to seek contamination gradients on each area. Results showed that all biomarkers evaluated responded to environmental contamination, regardless the presence (SESS and

CEP) or absence (TSB) of a gradient of contamination. In fact, the response found by the new proposed biomarkers (biometric and morphometric parameters) are consistent to the traditional biomarkers exposure and effects (lipid peroxidation and

DNA damage). Indeed, changes in elemental composition of L. subrugosa shells suggest that exposure to contaminated environments is probably responsible for the alterations detected. Due to the simplicity and lower cost of biometric and morphometric analyzes, these parameters seem to be a promising tool for future assessments, especially in areas where technological resources are scarce. The findings from the present study were observed in three aquatic systems distributed over a wide range of latitudes, which strongly indicates that gastropod shells reflect effects resulting from environmental contamination.

KEYWORDS: Morphological alteration; Molluscs; Lottiasubrugosa; Biomarkers. 15

1. INTRODUÇÃO

As atividades antrópicas interferem nas condições ambientais marinhas, principalmente devido à grande quantidade de substâncias químicas perigosas que têm sido lançadas diariamente nesse ecossistema. Essas substâncias podem colocar em risco a manutenção da vida marinhaalterando assim os ecossistemas.

Nesse sentido, estudos recentes demonstraram que a poluição é uma das principais causas contemporâneas de perda de biodiversidade (Young et al., 2016). Entretanto, a variedade e a complexidade das substâncias químicas que são atualmente despejados nas zonas costeiras ao redor do mundo tornam extremamente complexa a tarefa de estabelecer uma relação causal entre níveis e efeitos da contaminação

(Backhaus et al., 2012).

Os organismos que habitam ambientes marinhos multi-impactados estão sujeitos a alterações biológicas por estarem expostos a contaminantes. Devido à pressão produzida pelos poluentes, os organismos costumam sofrer variações de seus fenótipos às mudanças do ambiente para manterem seu ciclo de vida

(Hollander et al., 2006). Muitas dessas alterações, têm sido rotineiramente utilizadas como biomarcadores de contaminação (Galloway et al., 2004) sobretudo em invertebrados marinhos (Depledge e Billinghurst, 1999). Sendo assim, o monitoramento biológico desempenha papel importante nas estratégias para identificar, avaliar e controlar estressores (Cheung et al., 1998). Biomarcadores são, portanto, definidos como indicadores bioquímicos, fisiológicos ou histológicos podendo ser de exposição ou efeito a xenobióticos presentes no ambiente. Dessa maneira, o uso de biomarcadores é uma ferramenta consagrada para detectar in situ, os efeitos adversos de substâncias químicas perigosas sobre organismos 16

(Depledge et al., 1993). Os biomarcadores de efeito (ou dano) são aqueles que evidenciam dado comprometimento do devido funcionamento de vias metabólicas ou processos fisiológicos (Lafontaine et al., 2000). Tais perturbações podem ser detectadas em níveis subcelulares, além de serem consideradas marcadores de alerta precoce de alterações patológicas pertinente ao estresse (Moore et al., 1996).

Essas respostas podem, portanto, ser utilizadas como um sinal precursor de efeitos tóxicos, uma vez em que todos os efeitos causados por xenobióticos envolvem perturbações de efeitos bioquímicos e moleculares no interior das células, que podem afetar níveis maiores de organização (Cheung et al., 1998).

Entre os invertebrados, o filo Mollusca ocupa nichos em quase todos os habitats conhecidos, até mesmo nos micronichos ecológicos mais especializados

(Barnes, 1996). Portanto, é considerado o segundo maior filo do Reino Animal, perdendo apenas para os Artrópodes e apresentando diversidade estimada de

200.000 espécies (Lindberg e Ponder, 2001). Adicionalmente, esses organismos têm grande importância econômica e ecológica, ocupando frequentemente, posições chave nas cadeias tróficas ou sendo utilizados como fonte de proteínas para dieta humana (Laitano et al., 2013). Muitos estudos têm sido desenvolvidos utilizando esses organismos como bioindicadores de contaminação em sistemas aquáticos

(Mattos et al., 2017; Petracco et al., 2015; Rotchell e Ostrander, 2003). Além disso, muitas espécies são utilizadas como matriz ambiental, servindo de modelo em estudos com substâncias químicas perigosas (Sericano et al., 1995).

A preferência pelo uso de moluscos como modelos para estudos de contaminação ambiental está diretamente relacionada à sua ampla distribuição geográfica, abundância, comportamento sedentário, facilidade na amostragem, além de apresentarem elevada capacidade de bioacumular contaminantes (Morcillo et al., 17

1999). Dessa forma, o emprego desses organismos em estudos de monitoramento da poluição causada por substâncias químicas perigosas tem se tornado cada vez mais frequente (Begliomini et al., 2017).Adicionalmente, grande parte das espécies de moluscos é vulnerável a ações antropogênicas, apresentando alterações morfológicas, comportamentais ou reprodutivas mensuráveis, quando expostos a xenobióticos (Porte et al., 2006).

A concha dos moluscos, secretada pelo epitélio do manto, apresenta composição organo-mineral, comumente de carbonato de cálcio integrando minerais como a aragonita, calcita e em casos específicos, a vaterita (Marin et al., 2012). Esses compostos inorgânicos estão profundamente conectados a uma matriz orgânica, que representa apenas 0,1-5% do peso total da concha (Marin et al., 2007). As conchas desses organismos possuem a capacidade de armazenar informações importantes sobre seu histórico de vida, além de exibirem mudanças na estrutura, morfologia e composição química quando expostos a alterações ambientais (Avaca et al., 2013;

Nuñez et al., 2012). Estudos recentes realizados com gastrópodes sugerem que a exposição à poluentes pode induzir alterações morfológicas em suas conchas

(Begliomini et al., 2017; Márquez et al., 2016; Nuñez et al., 2012). Nesse aspecto,

Nuñez et al. (2012) investigaram malformações em conchas da lapa Siphonaria lessoni (Blainville, 1827) ao longo de um gradiente de contaminação em Mar del

Plata (Argentina). Esse estudo verificou alterações no peso seco dos tecidos, na espessura, formato, microestrutura e composição elementar das conchas relacionadas aos níveis de contaminação ambiental. Similarmente, estudos morfométricos realizados comparando conchas recentes da espécie Buccinanops globulosus (Kiener, 1834) com amostras obtidas antes de 1970, mostraram que os organismos atuais apresentam conchas mais globulares que as do passado 18

(Márquez et al., 2016). Esse estudo, realizado no Golfo Nuevo (Patagônia

Argentina), atribuiu às alterações temporais observadas a contaminação resultante do aumento da atividade portuária na região no mesmo período. No litoral brasileiro, estudos realizados por Begliomini et al., (2017) revelaram alterações nas conchas do gastrópode pateliforme Lottia subrugosa (d'Orbigny, 1846), relacionadas a um gradiente de contaminação distribuído ao longo do canal de acesso ao porto de

Santos (São Paulo). Esse trabalho sugeriu as alterações de conchas emL. subrugosa, como possíveis biomarcadores da contaminação costeira por substâncias químicas perigosas, visto que, as respostas observadas foram altamente relacionadas com biomarcadores bioquímicos tradicionais. Entretanto, nenhum dos estudos realizados até o momento avaliou sistematicamente essas respostas ao longo de gradientes latitudinais. Sendo assim, antes que essa ferramenta de avaliação possa ser globalmente utilizada, deve ser validada através de estudos realizados em diferentes cenários de contaminação.

Lottia subrugosa é uma espécie de molusco gastrópode pateliforme encontrada em substratos consolidados, de regiões entre marés desde o litoral do

Ceará até o Uruguai (Rios, 2009). Esse organismo costuma também ser encontrado em associação com bancos de mitilídeos. Contudo, a distribuição e a variedade morfológica da espécie nosdiferentes tipos de substratos podem sofrer interposição de fatores como temperatura, radiação solar, marés e energia de ondas (Tanaka et al., 2002). A Lottia subrugosa é um organismo herbívoro, possui concha cônica de até 30 mm sem perfurações sendo bilateralmente simétrica (Figura 1), uma vez que, não apresenta torção durante seu estágio larval (Rios, 2009). Além disso, a L. subrugosa apresenta também hábito de “homing”, que é o regresso do animal ao mesmo local posteriormente à saída para alimentação (Ferreira-Junior et al., 2016). 19

São organismos dióicos sem dimorfismo sexual externo, sendo possível a identificação do gênero por meio da análise histológica das gônadas (Rocha-

Barreira, 2002). Por se tratar de uma espécie que habita áreas costeiras altamente contaminadas, ser abundante, apresentar baixa mobilidade e ampla distribuição geográfica, a L. subrugosa apresenta elevado potencial para ser utilizada em estudos de monitoramento ambiental dentro da sua zona de distribuição (Begliomini et al., 2017).

Figura 1: Vista Dorsal (a), Ventral (b) e Lateral (c) da concha de Lottia subrugosa

Apesar dos vários estudos propondo alterações conquiliológicas como biomarcadores generalistas de contaminação costeira (Alzieu, 1998; Márquez et al., 20

2016; Nuñez et al., 2012), poucos trabalhos relacionaram essas alterações como biomarcadores tradicionais de exposição e/ou efeito. Adicionalmente, nenhum estudo verificou essas respostas ao longo de diferentes latitudes e em gradientes de contaminação com diferentes intensidades. Portanto, antes que as modificações de conchas de moluscos possam ser validadas como uma ferramenta aceitável para essa finalidadedevem ser avaliadas experimentalmente, temporalmente e em ampla escala espacial (Begliomini et al., 2017) incluindo gradientes de contaminação com intensidades distintas.

Além disso, considerando que ambientes costeiros, em especial os sistemas semi-fechados, tais como baías, estão submetidos a estresse rigoroso causado por atividades antrópicas, o biomonitoramento desempenha papel importante nas estratégias para identificar, avaliar e controlar estressores (Cheung et al., 1998).

Nesse aspecto, os biomarcadores de efeito (ou dano) são aqueles que evidenciam dado comprometimento do funcionamento de vias metabólicas ou processos fisiológicos (Lafontaine et al., 2000). Tais perturbações podem, em alguns casos, ser detectadas em níveis subcelulares, além de serem consideradas marcadores de alerta precoce de alterações patológicas pertinente ao estresse (Moore et al., 1996).

Portanto, as alterações causadas nas conchas podem ser utilizadas como um sinal precursor de efeitos tóxicos, uma vez que todos os danos causados por xenobióticos envolvem perturbações de efeitos bioquímicos e moleculares, que costumam ter consequências em níveis maiores de organização (Cheung et al., 1998). Dessa forma, presente estudo visa contribuir com a validação dessas alterações, investigando a ocorrência de anomalias em conchas de Lottia subrugosa oriundas de zonas costeiras do litoral brasileiro que se encontram sob diferentes níveis de impacto e situados em diferentes latitudes. 21

2. OBJETIVOS

O presente estudo tem como objetivo avaliar, em ampla escala espacial, o uso de alterações em conchas de Lottia subrugosa como possíveis biomarcadores de contaminação costeira.

22

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. AMOSTRAGEM ECARACTERIZAÇÃO DAS ÁREAS DE ESTUDO

Indivíduos da espécie Lottia subrugosa são facilmente encontrados nas regiões entre marés de substratos rochosos em zonas costeiras do litoral brasileiro

(Ferreira-Junior et al., 2016). Visando avaliar a relação entre alterações em conchas de L. subrugosa e a intensidade da contaminação por substâncias químicas perigosas no ambiente, foram escolhidas três áreas costeiras localizadas em diferentes latitudes do litoral brasileiro. Tais áreas (Figura 2 - Baía Todos os Santos,

Estuário Santos-São Vicente e baía de Paranaguá) estão entre as mais bem estudadas do país no que tange aos impactos químicos relacionados ao aporte de poluentes. Além disso, estão sujeitas a diferentes níveis de pressões antrópicas resultantes de adensamentos urbanos, atividades turísticas, industriais e portuárias.

Em cada área foi identificado um gradiente de contaminação com base na literatura científica especializada, estabelecendo três pontos de coleta distribuídos ao longo deste gradiente. Em cada ponto, aproximadamente 100 organismos adultos da espécie L. subrugosa foram coletados manualmente ou por mergulho livre.

Adicionalmente todas as amostras foram obtidas em praias protegidas evitando influências da exposição às ondas e outros fatores físicos reconhecidos por interferir na morfologia de conchas de organismos habitantes de substratos consolidados

(Tanaka et al., 2012). Além disso, os locais de amostragem foram escolhidos dentro de uma pequena escala espacial (menos de 5 km) para minimizar a influência da salinidade, pressões predatórias e tipo de substrato.

23

Figura 2: Localização das áreas de amostragem ao longo litoral Brasileiro com indicação das principais fontes de contaminação para cada sistema.

3.1.1 Baía de Todos os Santos (BTS)

A Baía de Todos os Santos (BTS) está localizada a leste do Estado da Bahia, com área aproximada de 1.100km² (Queiroz, 1997), centrada entre a latitude de

12°50’S e a longitude de 38°38’W (Hatje e Andrade, 2009a). É o segundo maior acidente geográfico da costa brasileira, sendo menor apenas que a baía de São

Marcos no Maranhão. Além disso, o sistema da BTS é composto por duas outras baías menores (Iguape e Aratu), 56 ilhas (incluindo a ilha de Itaparica que é a maior 24 ilha marítima do Brasil), estuários de rios, manguezais, restingas e matas que compõem a diversidade dos ecossistemas locais (Agostinho, 2011). Atualmente, a

BTS possui em seu entorno um contingente populacional superior a três milhões de habitantes (Hatje e Andrade, 2009a).

A BTS é a única baía da costa brasileira que abriga dez terminais portuários de grande porte, além de um canal de acesso navegável e canais internos profundos. Essas características contribuem substancialmente para o desenvolvimento regional (Hatje e Andrade, 2009a). Os impactos antrópicos na BTS tiveram início no século XVI, com a construção da cidade de Salvador, a implantação dos primeiros engenhos de cana-de-açúcar e o aparecimento da indústria da construção naval. Entretanto na metade do século XX, a atividade petroleira se instalou no Recôncavo com a finalidade de sistematizar as suas pesquisas e explorar petróleo, resultando no maior polo petroquímico do hemisfério sul. Tais atividades desencadearam alterações econômicas e sociaisnos municípios localizados no entorno da BTS promovendo a aceleração dos processos de degradação ambiental (Hatje e Andrade, 2009a). Há também três emissários submarinos, que estão localizados na plataforma continental adjacente, ao norte da desemborcadura da baía, sendo dois destinados à efluentes industriais e um ao esgotamento doméstico (Hatje e Andrade, 2009a). Desde o ano de 1988 existem registros de contaminação por substâncias químicas perigosas na Baía de Todos os

Santos (Tavares et al., 1988). A BTS tem como principais fontes geradoras de contaminação o lançamento de resíduos industriais, a queima de combustíveis fósseis, atividades portuárias, emissão de efluentes domésticos, queima de biomassa, mineração e resíduos doméstico (Artifon et al., 2016; Hatje e Andrade,

2009b). Essas atividades geram ou utilizam produtos químicos diversos, incluindo 25 metais, ácidos, sulfetos, óleos vegetais, petróleo e derivados, soda, naftaleno, benzeno, fenol, polipropileno, cloro, hexano, óxidos, celulose, sisal, brita, amônia, entre outros (Hatje e Andrade, 2009a). A região conta também com dois dos mais extensos centros industriais do Nordeste (Subaé e Aratú) (Silva, 2010; Sousa, 2009).

Dessa forma, os contaminantes oriundos destas diferentes fontes alcançam os sistemas aquáticos da BTS sendo distribuídos pela baía através de sua circulação interna, que é governada principalmente pela ação das marés (Cirano e Lessa,

2007).

Considerando o exposto, foram estabelecidos três pontos de amostragem na saída na BTS conforme apresentado na Figura 3. Estes pontos [Mercado (B1), Iate

Clube (B2) e Farol (B3) foram escolhidos com base na presença de organismos da espécie Lottia subrugosa assim como a distribuição espacial das fontes potenciais de contaminação na BTS.

Figura 3: Localização dos pontos de amostragem identificando as principais atividades que apresentam potencial para lançamento de substâncias químicas perigosas na Baía de Todos os

Santos. 26

3.1.2 Sistema Estuarino de Santos-São Vicente (SESS)

O sistema estuarino de Santos-São Vicente (SESS), localizado na costa sudeste do Brasil é formado por três grandes canais estuarinos (São Vicente, Santos e

Bertioga) conectados na porção interna da área. Os canais estuarinos de Santos e

São Vicente cobrem aproximadamente 44,1km2 (Moser et al., 2005). O SESS apresenta complexa geomorfologia, sendo formado por oito bacias e apresentando um gradiente pluviométrico crescente em direção à Serra do Mar. Essas características, resultam em um regime hídrico extremo produzindo uma diluição gradativa dos contaminantes lançados no sistema (Schmiegelow e Gianesella,

2014).

A proximidade com a região metropolitana de São Paulo, a construção de uma desenvolvida infraestrutura de transporte rodoviário e portuário, assim como a disponibilidade local de água e energia elétrica, fizeram com que a partir da década de 50, diversas indústrias de diferentes eixos (siderurgia, petroquímica e de fertilizantes), se consolidassem em meio a uma ampla rede de canais estuarinos e extensos manguezais que ficam confinados entre o oceano e as escarpas da Serra do Mar (CETESB, 2001). Assim, a área se tornou um grande centro urbano e possui um histórico centenário de degradação ambiental (Martins et al., 2010a).

Na região sob a influência do SESS ocorrem diversas atividades ambientalmente impactantes. Devido à intensa atividade industrial do Município de Cubatão e a grande movimentação de embarcações no Porto de Santos (o maior da América

Latina), a região é conhecida como um dos maiores exemplos brasileiros de degradação ambiental por poluição hídrica em ambientes costeiros (CETESB, 2001).

Além do porto e do polo industrial, as atividades turísticas e os grandes 27 adensamentos urbanos existentes nas margens do sistema são também geradores de impactos ambientais na região da Baixada Santista. Portanto, o SESS é um exemplo de área sujeita a intensos e múltiplos impactos antrópicos incluindo o lançamento de substâncias químicas perigosas oriundas das diferentes atividades desenvolvidas na região. Nesse aspecto, vários estudos disponíveis na literatura especializada reportam a existência de um gradiente de contaminação na área

(Buruaem et al., 2013; Cesar et al., 2014; Martins et al., 2010b). Dessa forma, foram estabelecidos 3 pontos de amostragem distribuído ao longo do referido gradiente e localizados na Balsa (S1), Praia do Goés (S2) e Ilha das Palmas (S3) conforme indicado na Figura 4.

Figura 4: Localização dos pontos de amostragem identificando as principais atividades que apresentam potencial para lançamento de substâncias químicas perigosas no complexo estuarino de

Santos-São Vicente. 28

3.1.3 Complexo Estuarino de Paranaguá (CEP)

O Complexo estuarino de Paranaguá (CEP) possui área de 612 km² e 105km de extensão linear no sentido norte-sul, formando um dos menores litorais entre os estados litorâneos do Brasil (Angulo, 1999). A área é formada por 180km de perímetro e é constituída por uma gama diversificada de ecossistemas, como ilhas, enseadas, manguezais, entre outros (Barcelos et al., 2004). O Complexo estuarino de Paranaguá apresenta profundidade média de 5,4m com volume total de água de

1.4109m³ (Mantovanelli et al., 2004). O CEP é composto pelas baías de Paranaguá e Antonina no eixo Leste-Oeste e das Laranjeiras no eixo norte-sul. Esse corpo d’água se conecta com o oceano através dos dois canais que se localizam em torno da Ilha do Mel (Angulo, 1999). Outros segmentos menores interligam-se a esses dois corpos aquosos de maior porte, como as baías de Guaraqueçaba, Antonina,

Pinheiros, Itaqui, Benito e rio Medeiros (Lamour et al., 2004).

O CEP conta com a presença de polos industriais que atuam na área de fertilizantes e outros produtos químicos. Adicionalmente, nas margens do estuário estão instalados dois terminais portuários (Portos de Antonina e Paranaguá) que movimentam principalmente granéis sólidos e líquidos além de produtos de mineração. Esse conjunto de atividades antrópicas lança, diariamente nos estuários grande volume de resíduos que se espalham com facilidade, podendo provocar contaminação da área. Mais além, existem na região diversas comunidades de pescadores e adensamentos urbanos no entorno da cidade de Paranaguá (Angulo,

1999). Os pontos amostrados no interior no CEP foram distribuídos ao longo de um possível gradiente de contaminação sendo localizados na Ponta do Poço (P1), Ilha do Mel (P2) e Ilha Galheta (P3), sendo o ponto mais próximo das fontes de 29 contaminação o mais contaminado, o segundo com contaminação intermediária e o terceiro o menos contaminado, como indicada na (Figura 5).

Figura 5: Localização dos pontos de amostragem identificando as principais atividades que apresentam potencial para lançamento de substâncias químicas perigosas na Baía de Paranaguá.

3.2. Processamento inicial das amostras

Durante as campanhas de amostragem, os organismos foram acondicionados em sacos plásticos e mantidos em gelo seco durante todo o transporte até o laboratório. Posteriormente, no laboratório, as partes moles de 10 organismos escolhidos aleatoriamente, foram separadas das conchas com o auxílio de pinça e bisturi. Esses tecidos foram individualmente armazenados em tubos criogênicos e destinados a determinação de biomarcadores de genotoxicidade e estresse 30 oxidativo. Essas amostras foram acondicionadas em ultra freezer (-80ºC) até o momento das análises.

3.3. Análise Morfométricas das Conchas

Para as análises biométricas, as 100 conchas coletadas em cada ponto foram secas em estufa a 75°C por 12 horas, pesadas em balança analítica de precisão

(±0,00001 g) e medidas (comprimento, largura e altura) com auxílio de um paquímetro digital (±0,01 mm). Adicionalmente, a espessura de cada concha foi determinada no ápice usando um micrômetro digital de precisão (±0,001 mm).

Posteriormente, todas as conchas dos organismos obtidos nos 9 pontos amostrais foram analisadas pela técnica de morfometria geométrica 2D. Para isso, as conchas foram individualmente fotografadas através do uso de câmera digital profissional

(CANON T6i equipada com lente 100mm F/2.8l EF Macro USM) com o auxílio de estativa portátil para obtenção de imagens de forma padronizada, alcançando o mesmo plano lateral tangente (Zelditch et al., 2012). Para todos os indivíduos a imagem foi registrada o mesmo plano lateral direito, com distância fixa, em paralelo ao plano da câmera fotográfica. Os softwares tpsUTIL e tpsDIG (SB Morphometrics,

2015) foram utilizados para marcação dos outlines (100 pontos equidistantes em cada concha) da curvatura dorsal das conchas. A matriz de dados gerada foi analisada através dos programas da série tps (SB Morphometrics, 2015) e PAST

(Hammer et al., 2001). Para verificar eventuais diferenças conquiliológicas entre as populações dos pontos amostrados foram realizadas Análises de Componentes

Principais das coordenadas harmônicas (ou coeficientes harmônicos) obtidas pela análise elíptica de Fourier. Para visualização de diferenças na conformação da 31 concha, foram analisados os “PartialWarps” (PW) e as grades de deformação do

“RelativeWarps”.

3.4. Análise Elementar

As concentrações dos elementos Cálcio (Ca), Fósforo (P), Enxofre (S), Cloro

(Cl), Cromo (Cr), Manganês (Mn), Ferro (Fe), Níquel (Ni), Cobre (Cu), Zinco (Zn),

Estrôncio (Sr), Cádmio (Cd), Chumbo (Pb) foram determinadas a partir de 10 conchas, oriundas de cada ponto amostrado, escolhidas aleatoriamente. A metodologia empregada seguiu o descrito em ISO / TS 18507 (2015). Para tanto, as conchas foram previamente descontaminadas com solução de hipoclorito de sódio

(5%), pulverizadas manualmente em gral, peneirados através de uma malha de

0,063 μm e 50 mg do pó obtido foram pesados em tubos de vidro. Posteriormente, foram adicionados 2,5 mL de detergente não iónico (Triton® X-100) e 100 μL de solução de Ga (10 mg L-1), como padrão interno (PI). Após os tubos foram agitados em vórtex por 5 min. Para cada leitura, 10 μL da amostra preparada conforme descrito acima foi depositado em porta amostras de quartzo e secos em estufa

(60ºC) para proporcionar a formação de uma película fina. As medições foram realizadas por meio de um espectrômetro TXRF (S2 Picofox - Bruker AXS

MicroanalysisGmbH, Berlim, Alemanha) utilizando um tempo de leitura de 1000 s

(Towett et al., 2013).Os dados de raios-X foram adquiridos e processados pelo

Software Spectra7 fornecido com o instrumento. O controle de qualidade foi baseado em avaliações do padrão interno de Ga e medições de materiais de referência certificados (PACS 2).

32

3.5. Biomarcadores bioquímicos

Os biomarcadores de efeito empregados no presente estudo avaliaram danos genéticos (DNA strand breaks) e oxidativos (peroxidação lipídica). Em ensaio preliminar, uma amostra de cada tecido foi testada para avaliação da diluição a ser utilizada evitando extrapolar a faixa quantificação estabelecida pela curva de calibração. Para tecidos do molusco L. subrugosa (homogeneizado e centrifugado) foi estabelecida uma diluição com água ultrapura de 1:4 (Tecido:Solução tampão)

3.5.1 Proteínas Totais

O conteúdo de proteína total foi determinado nos extratos para normalizar os dados ao DNA e LPO. O teor de proteínas totais foi determinado para cada extrato de acordo com o método de Bradford (1976). Para a quantificação do teor de proteínas totais nos tecidos estudados foi construída uma curva de calibração usando uma solução estoque de Albumina de Soro Bovino (BSA 2 mgL-1), diluída progressivamente em água ultrapura. Sendo assim, os pontos da referida curva foram: 0, 0,21 mgL-1, 0,42 mgL-1, 0,7 mgL-1 e 1,04 mgL-1(Tabela 1)

Tabela 1: Valores da curva de calibração utilizada com BSA para quantificação das proteínas totais.

33

Para montagem das placas, foram necessários 20 µL da amostra de tecido previamente diluído na solução tampão de homogeneização em duplicata e 180 uL do reagente Bradford, que foram depositadas em placa transparente, juntamente com o “branco”, composto pela solução tampão de homogeneização, também em duplicata. Incubou-se a placa no escuro por 20 minutos à temperatura ambiente antes da leitura no equipamento Synergy HT-Biotek®, onde foi realizada a leitura em absorbância de 595 nm. Os resultados foram expressos por mgmL-1.

3.5.2 Dano ao DNA

Danos em DNA foram avaliados pelo ensaio de precipitação alcalina proposto por Olive (1988), utilizando fluorescência para quantificar vestígios de DNA (Gagné e

Blaise, 1993). Técnica essa que separa vestígios livres de DNA do DNA genômico.

Uma alíquota do tecido homogeneizado (25 μL) foi misturado com 200 μL de 2%

SDS contendo 10 mM EDTA, 10 mM Tris–base e 40 mMNaOH. Após a centrifugação por 1 min, 200 μL de 0,12 M KCl foram adicionados e a solução aquecida a 60º C por 10 min, misturado por inversão e resfriado a 4º C por 30 min para precipitar o DNA genômico ligado ao SDS associado a nucleoproteínas. Esta mistura foi centrifugada a 8.000 g por 5 min (4ºC). Em microplaca (96) 50 μL de sobrenadante foi adicionado a 150 μL de corante Hoescht, na concentração de 1

μg/mL (diluído em tampão contendo 0,4 M NaCl, 4 mMcolato de sódio e 0,1 M Tris– acetato, pH 8,5–9,0). Após agitação por 5 min, a fluorescência foi medida utilizando filtro de 360 nm (excitação) e 450 nm (emissão). O padrão de DNA genômico de esperma de salmão (Sigma) foi adicionado para calibração e os resultados foram expressos em micrograma (μ) de DNA sobrenadante por miligrama (mg) de proteína.

34

3.5.3 Peroxidação Lipídica

A peroxidação lipídica é o processo de peroxidação de ácidos graxos insaturados nas membranas lipídicas. Tal processo promove graves alterações da membrana celular, causando perda da fluidez, alteração da função secretora e dos gradientes iônicos transmembrana. Além disso, têm sito observada a perda da seletividade de troca iônica, com liberação do conteúdo de organelas, que levam à formação de produtos citotóxicos até que ocorra a morte da célula (Ferreira e

Matsubara, 1997). O ensaio para avaliação da peroxidação lipídica foi realizado de acordo com o que foi proposto por Wills’ (1987).

Para a realização deste ensaio, foram preparadas seis soluções, identificadas com letras de A à E. A primeira solução (A), de HCl (0,1M), preparada com 3,64 mL de HCl diluídos em 996,36 mL de água Mili-Q®. A segunda solução (B), de tetrametoxipropano (TMP), com 10 µL de TMP diluídos em 9,99 mL da solução A.

Tal solução foi diluída para chegar a diluição de 0,001%, ou seja, 10 µL da solução B diluídos em 990 µL de água Mili-Q. A solução C foi preparada com 0,279 g de

FeSO4 diluídos em 1L de água Mili-Q. A quarta solução (D) foi preparada com 250 mg de tricloroacético (TCA) diluídos em 225 mL da solução C. A sexta solução (E) foi preparada com 1,675 g de ácido tiobarbitúrico (TBA) diluídos em 250 mL de água

Mili-Q®.

Em seguida, foi preparada uma curva de calibração, com as soluções de

TMP, TCA e TBA. Todas as concentrações foram montadas em microtubos e incubadas em banho maria a 70°C por 20 min. Após, as amostras foram dispostas em uma placa preta para leitura (Tabela 2).

35

Tabela 2: Valores da curva de calibração utilizada no ensaio de LPO

Para a preparação das placas com amostras, foram necessários 150 µL da fração homogeneizada dos tecidos estudados, 300 µL da solução de TCA e 150 µL da solução de TBA, dispostos diretamente nos microtubos. As amostras foram incubadas em banho maria a 70°C por 20 min e em seguida colocadas 200 µL do sobrenadante em placa preta para leitura por fluorescência a 530 nm de excitação e

590 nm de emissão. Os resultados foram expressos em pmol TBARS mg-1.min-

1 proteína total.As análises de LPO e Dano ao DNA desse projeto foram realizadas utilizando a infraestrutura do laboratório do Núcleo de Estudos em Poluição e

Ecotoxicologia Aquática (NEPEA), localizado na UNESP- Campus Litoral Paulista na cidade de São Vicente.

3.7. Análise Estatística

Inicialmente a normalidade e a homocedasticidade de todos os dados obtidos por biometria (comprimento, altura e espessura do ápice das conchas), análise elementar (concentrações de Ca, P, S, Cl, C, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Sr, Cd e Pb) e análise de biomarcadores (LPO e danos ao DNA) foram avaliadas usando os testes

Shapiro-Willk e Levene respectivamente. As relações entre comprimento de conchas e os demais parâmetros biométricos obtidos foram determinadas através de 36 regressões lineares. Posteriormente, comprimentos das conchas (CC) obtidas em cada estação foram então comparados empregando testes de Kruskal-Wallis seguidos de análises multicomparativas de Dunn. Os dados biométricos foram normalizados pelos comprimentos de concha e comparados, entre estações, usando testes de Kruskal-Wallis seguidos de avaliações a posteriori de Dunns. Todos os testes anteriormente descritos foram realizados utilizando o software Statistica®

12.0.Os dados obtidos por morfometria geométrica 2D foram avaliados através de uma análise de efeito alométrico, seguida de análise de componentes principais sobre a matriz covariância dos coeficientes normalizados elípticos de Fourier utilizando o software PAST.3.14 conforme recomendado por Hammer et al., (2001).

Uma regressão multivariada foi testada usando um MANOVA para avaliar as diferenças entre formas de conchas de L. subrugosa obtidas nos três locais de amostragem.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1. Biomarcadores bioquímicos tradicionais em Lottia subrugosa

Os indivíduos de uma mesma população podem responder de maneiras distintas ao mesmo cenário de exposição a contaminantes. Dessa forma, as respostas observadas em cada indivíduo podem ser distintas em virtude da variabilidade genética, estados nutricionais e/ou variação de microambientes

(Branch, 1981). Biomarcadores tradicionais, tais como lipoperoxidação (LPO) e danos ao DNA, tem se mostrado altamente eficientes para monitorar respostas biológicas em moluscos expostos a diferentes contaminantes ambientais ou até mesmo a misturas de contaminantes (Begliomini et al., 2017). A exposição a 37 contaminantes da água pode induzir a formação de espécies reativas de oxigênio

(ERO) que produzem efeitos tóxicos por geração de radicais livres. Sendo assim, muitas alterações biológicas são resultado da interação com radicais de oxigênio ou de processos de apoptose/necrose (Viarengo et al., 2007).Portanto, a peroxidação lipídica (LPO) tem sido utilizada como biomarcador de exposição a uma variedade de substâncias perigosas em vários estudos ambientais (Barni et al., 2014; Lin et al.,

2016). Similarmente, as rupturas da cadeia de DNA podem resultar da exposição a poluentes orgânicos persistentes (Fenstad et al., 2014), nanocompostos (Forbes e

Calow, 2002), hidrocarbonetos de petróleo (Xiong et al., 2015), pesticidas (Li et al.,

2015), entre outros. No presente estudo, esses biomarcadores tradicionais foram utilizados para testar possíveis gradientes de contaminação nas áreas costeiras estudadas. De fato,a intensidade de danos ao DNA (Figura 6) e LPO (Figura 7) diminuíram com o aumento da distância de potenciais fontes de contaminação,tanto no Sistema Estuarino Santos/São Vicente (SESS) como no Complexo estuarino de

Paranaguá (CEP). Por outro lado, na Baía de todos os Santos (BTS) não foram observados gradientes nas respostas a esses biomarcadores. 38

Figura 6: Comparação entre as concentrações de danos ao DNA em L. subrugosa obtidas no SESS

(A), CEP (B) e BTS (C). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn. 39

Figura 7: Figura 7: Comparação entre os níveis de peroxidação lipídica em L. subrugosa obtidas no

SESS (A), CEP (B) e BTS (C). as letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn. 40

No Sistema Estuarino Santos/São Vicente (SESS), as respostas da LPO foram de 20,793 ± 9900, 8459 ± 4731 e 4068 ± 2856µgTBARS (por mg-1 proteína) em S1, S2 e S3 respectivamente (figura 7). Adicionalmente, um padrão semelhante para o dano ao DNA foi observado em S1 (15.8 ± 4.1µg DNAmg-1proteína), S2 (12.3

± 3.3µg DNAmg-1proteína) e S3 (9.8 ± 1.6 µg DNAmg-1proteína). Para os biomarcadores avaliados, os pontos amostrados no SESS mostraram diferenças estatisticamente significativas quando comparados de forma conjunta (Kruskal-

Wallis, p <0,05). Entretanto, a análise multicomparativa indicou que S1 (ponto mais contaminado) difere significativamente dos demais pontos no que tange as respostas de LPO (Dunn, p <0,01) e dano ao DNA (Dunn, p <0,0007). As principais fontes de produtos químicos perigosos para o SESSsão o complexo industrial, os estaleiros navais e terminais portuários, que estão localizados nas margens do canal de acesso ao porto (Abessa et al., 2005). Após a liberação para o estuário, esses contaminantes são drenados para a baía de Santos e progressivamente diluídos

(Camargo, 1998). Portanto, esse padrão hidrodinâmico local pode explicar as respostas observadas aos biomarcadores em SSES (Figura 6A e 7A) os quais são responsáveis pelo conhecido gradiente de contaminação e toxicidade existente nessa área.

No Complexo Estuarino de Paranaguá (CEP), a peroxidação lipídica também foi também mais intensa no ponto mais contaminado P1 (proteína 241 ±

65μgTBARS mg-1) seguida de P2 (169 ± 48 μgTBARS mg-1/proteína) e P3 (121 ± 31

μgTBARS mg-1 proteína). Nesta área, apenas P3 foi estatisticamente diferente do P1 e P2 (teste de Dunn, p <0,05). Por outro lado, o dano do DNA no CEP variou de 22 ±

9,0 μg DNAmg-1/proteína em P1 a 16 ± 4,1 μg de proteína DNAmg-1 em P3 (Figura

6B e 7B). As respostas de dano ao DNA detectadas em P1 diferiram 41 estatisticamente de P2 e P3 (teste de Dunn, p <0,05). Conforme observado em

SESS, as respostas de biomarcadores, provavelmente relacionado aos níveis de contaminantes em um gradiente, assemelharam-se às respostas observadas em

CEP sugerindo uma dispersão progressiva de produtos químicos em direção ao

Oceano Atlântico. Esses achados estão de acordo com uma avaliação da qualidade dos sedimentos integrados realizada na mesma área, o qual indicou maiores níveis de contaminação e toxicidade em locais situados no estuário superior (Choueri et al.,

2009).

Não foram observados gradientes espaciais de respostas de biomarcadores na Baía de Todos os Santos (BTS) (Figuras 6C e 7C). Os valores detectados para

LPO foram 101 ± 76, 52 ± 44 e 120 ± 52 μgTBARS mg-1 proteína em B1, B2 e B3, respectivamente (Figura 7C). As respostas de danos ao DNA em B1 (44 ± 15 μg de proteína DNAmg-1), B2 (23 ± 7,8 μg de proteína DNAmg-1) e B3 (23 ± 15 μg de proteína DNAmg-1) apresentaram o mesmo padrão (Figura6C). Além disso, não foram observadas diferenças estatísticas entre os pontos de estudos na BTS

(Kruskal-Wallis, p> 0,05). A ausência de gradientes espaciais para biomarcadores na

BTS pode ser explicado pelo fato dos contaminantes oriundos de diferentes fontes alcançarem os sistemas aquáticos, sendo distribuídos pela baía através de sua circulação interna que é governada principalmente pela ação das marés. Além disso, o tempo de descarga na BTS durante o inverno, quando os rios adjacentes drenam grandes volumes de água para baía, é de apenas 38 dias (Cirano e Lessa, 2007).

Esses mecanismos de circulação e transporte somados a outras características físicas da BTS (tamanho da áreae vento) impulsionam a circulação gravitacional e a difusão turbulenta que são os processos principais para controlar o transporte de substâncias (Uncles et al., 1986). Nesse aspecto, é sabido que assimetrias de maré, 42 geradas dentro de estuários e baías, podem promover transporte de resíduos induzido pela circulação da maré (Mantovanelli et al., 2004). Assim, essas características oceanográficas são provavelmente responsáveis por uma alta mobilidade de contaminantes eventualmente lançados na região, impedindo o estabelecimento de gradientes espaciais na área. Confirmando essa hipótese, investigações sobre a distribuição da contaminação química na BTS usando diferentes matrizes (sedimentos superficiais e biota) não tem demonstrado variações espaciais progressivas nas concentrações medidas (Artifon et al., 2016; Felizzola et al., 2008; Tavares et al., 1988).

Os resultados obtidos pela análise das respostas a biomarcadores bioquímicos tradicionais em Lottia subrugosa corroboram com o apresentado em estudos prévios realizados nos três sistemas aquáticos. Dessa forma observa-se um gradiente mais intenso no SESS seguido de respostas moderadas no CEP, enquanto que na BTS nenhum gradiente espacial foi observado. Essas características fazem desses sistemas aquáticos em conjunto, áreas de interesse particularmente estratégico para os objetivos do presente estudo. Nesse sentido, as variações biométricas e morfométricas em conchas de L. subrugosa foram avaliadas em áreas com diferentes taxas de contaminação permitindo verificar as intensidades das repostas biológicas em diferentes cenários de contaminação costeira.

43

4.2Análises biométricas

Um total de 816 espécimes adultos de L. subrugosa foram coletados ao longo dos novepontos de amostragem. Considerando todas as áreas de amostragem, os comprimentos da concha variaram de 9 a 21,9 mm. Indivíduos de L. subrugosa maiores que 5 mm são considerados adultos e habitam preferencialmente os níveis superiores da costa (zona intermareal) (Tanaka et al., 2002). Esta observação é particularmente relevante para os propósitos do presente estudo, uma vez que os organismos adultos certamente foram expostos à contaminação local por mais tempo. As médias de comprimento da concha (CC) variaram de 13,5 a 17,6 mm,

11,3 a 12,7 mm e 16,1 a 18,4 mm na baía de Todos os Santos (BTS), o Sistema

Estuarino Santos/São Vicente (SESS) e o Complexo Estuarino de Paranaguá (CEP), respectivamente (Tabela 2).Variações semelhantes também foram observadas para a altura da concha (AC) e a espessura do ápice da concha (EA) das três localidades estudadas como mostrado na Tabela 3.

Tabela 3: Média e desvio padrão (DP) dos parâmetros biométricos das conchas de Lottiasubrugosa coletadas em locais distribuídos em três sistemas aquáticos da costa Brasileira

Comprimento Espessura do Altura da concha Sistema da concha ápice da concha área (AC)± sd Aquático (CC) ± sd (EA) ± sd (mm) B1 17.4 ± 2.3 5.8 ± 1.2 0.5 ± 0.2 BTS B2 13.5 ± 2.3 3.9 ± 0.8 0.4 ± 0.1 B3 17.6 ± 2.3 5.7 ± 1.1 0.5 ± 0.2 S1 11.3 ± 1.5 2.6 ± 0.5 0.2 ± 0.1 SESS S2 12.2 ± 0.8 3.3 ± 0.5 0.3 ± 0.1 S3 12.7 ± 0.9 3.8 ± 0.7 0.4 ± 0.2 P1 16.1 ± 1.7 4.5 ± 0.7 0.4 ± 0.2 CEP P2 18.4 ± 1.9 5.6 ± 0.8 0.6 ± 0.2 P3 17.2 ± 2.4 5.4 ± 0.7 0.7 ± 0.2

44

A biometria das estruturas biológicas tem sido amplamente utilizada como ferramentas para avaliações ambientais baseadas em alterações morfológicas

(Alzieu et al., 1986; Castro et al., 2008; Márquez et al., 2016). No entanto, esses parâmetros são frequentemente influenciados pelo tamanho do organismo produzindo vieses nos resultados obtidos (Batista et al., 2016; Castro et al., 2012;

Petracco et al., 2015). Assim, no presente estudo, a influência de CC na altura da concha (AC) e na espessura do ápice (AE) foi avaliada por regressões lineares usando os dados obtidos a partir dos organismos de todos os pontos amostrados.

Nossos resultados mostraram uma influência significativa e forte dos valores de CC sobre AC e EA (p <0,001, R = 0,85) (Figura 8).

Figura 8: Regressões lineares entre comprimento, Altura (A) e Espessura do ápice (B) das conchas de L. subrugosa obtidas ao longo das localidades amostradas no litoral brasileiro. 45

De fato, a relação estatística entre CC e AC em L. subrugosa já foi relatada por Tanaka et al., (2002) durante um estudo de dinâmica de acmeídeos realizado na costa brasileira. Além disso, conforme relatado anteriormente por Begliomini et al.,

(2017),a análise de regressão mostrou que EA também é dependente do tamanho da concha (p <0,01, R = 0,47) (Figura 8B). Sendo assim, buscando evitar a interferências resultante dessas relações, os comprimentos das conchas foram comparados estatisticamente dentro de cada área de amostragem. Conforme apresentado na Figura 9, diferenças estatísticas significativas foram observadas entre os CC obtidas no SESS, CEP e BTS (Kruskal-Wallis, p <0,0001).

Figura 9: Comparação entre comprimentos das conchas de L. subrugosa obtidas ao longo das localidades amostradas no litoral brasileiro. Valores de p se referem a teste comparativo por localidade (Kruskal-Wallis). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn. 46

Portanto, buscando eliminar os efeitos desta covariável (CC) e evitar interpretações tendenciosas, as variações AC e EA entre os pontos foram avaliadas como razões individuais por CC. Essa abordagem tem sido recomendada por vários estudos recentes que empregam medidas de estruturas biológicas para obtenção de

índices de contaminação (Batista et al., 2016; Begliomini et al., 2017; Grimón et al.,

2016; Paz-Villarraga et al., 2015; Petracco et al., 2015).

Em SESS, as razões de AC e EA por CC diminuíram progressivamente dos pontos menos (S3) para os pontos mais (S1) contaminados (Figura 10A e 11A).

Essas observações foram confirmadas pela análise de Kruskal-Wallis, seguidas dos testes multicomparativos de Dunn (p <0,0001), que indicaram que as razões AC e

EA em Palmas (S1) apresentam diferenças significativas dos outros pontos amostrados (S2 e S3).O mesmo padrão, também foi detectado no Complexo

Estuarino de Paranaguá, onde o ponto mais contaminado (P1) apresentou as proporções AC e EA menores, diferindo significativamente (teste multicomparativo de Dunn, p <0,001) de P2 e P3 (Figura 10B e 11B). Por outro lado, na baía de Todos os Santos (BTS), não foram observados gradientes para esses parâmetros biométricos de conchas de L. subrugosa (Figura 10C e 11C). Embora, as proporções obtidas nos organismos coletados no Iate (B2) tenham diferido marginalmente de B1 e B3 (teste multicomparativo de Dunn, p <0,05).

47

Figura 10: Comparação entre as Alturas / Comprimento de conchas de L. subrugosa obtidas no SESS

(A), CEP (B) e BTS (C). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn. 48

Figura 11: Comparação entre as Espessuras do ápice / Comprimento de conchas de L. subrugosa obtidas no SESS (A), CEP (B) e BTS (C). As letras (A, B e C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn. 49

Os parâmetros biométricos medidos nas conchas seguiram as mesmas tendências demonstradas pelos biomarcadores tradicionais (LPO e dano do DNA) em todas as áreas estudadas. Considerando todos os pontos em conjunto, as razões AC/CC (Spearman, p <0.005, R = -0.82) e EA/CC (Spearman, p <0.03, R = -

0.65) foram significativamente correlacionadas com as respostas de

Lipoperoxidação. Além disso, foram observadas correlações moderadas entre o dano ao DNA e as relações AC (Spearman, p <0,05, R = -0,51) e EA (Spearman, p

<0,05, R = -0,48). Embora essas correlações negativas não provem uma relação causa-efeito, elas sugerem que as alterações nas conchas de Lottia subrugosa podem ser usadas como biomarcadores alternativos da contaminação costeira. Além disso, assumindo as razões AC e EA como respostas morfológicas para a contaminação química, em SESS a discriminação entre os pontos amostrados foi mais evidente do que no CEP. De fato, existem várias fontes de contaminação

(indústrias, terminais portuários, aportes de esgoto e estaleiros navais) no SESS que produzem gradiente acentuado, resultado do lançamento de produtos químicos perigosos que são drenados em direção à baía de Santos (Laitano et al., 2013).

Enquanto no CEP, um estudo multi-molecular baseado em biomarcadores sedimentares, detectou a ocorrência de um ligeiro gradiente de contaminação (de

Abreu-Mota et al., 2014), relacionados com as alterações observadas nas conchas.

Por outro lado, na BTS, a circulação interna é fortemente influenciada por parâmetros físicos, predominantemente forçados pelas marés. Além disso, as águas dentro da baía apresentam características oceânicas no verão e são fortemente influenciadas por fluviais de água doce durante o inverno. A coluna d’água é caracteristicamente bem misturada e condições estuarinas são observadas apenas próximo às saídas dos rios (Hatje e Andrade, 2009b). 50

Os biomarcadores são variações mensuráveis em aspectos bioquímicos, fisiológicos, histológicos ou de parâmetros estruturais como consequência da exposição a substâncias perigosas (Forbes et al., 2006). Sendo assim, considerando as relações observadas com biomarcadores tradicionais, as avaliações biométricas apresentadas no presente estudo podem potencialmente ser utilizadas como biomarcadores alternativos e de baixo custo. Uma iniciativa semelhante foi proposta por Nuñez et al., (2012) usando o gastrópode pateliforme Siphonaria lessoni em zonas costeiras do litoral Argentino.

4.3 Análises morfométricas

As análises por morfometria geométrica 2D foram realizadas usando 85 a 100 conchas de cada ponto amostrado (totalizando 816 conchas). As regressões lineares multivariadas, entre comprimento total das conchas e as demais variáveis morfométricas, mostraram efeitos alométricos insignificantes (r² <0,08 e p <0,0001) para as conchas de todos os sistemas aquáticos. Além disso, quaisquer efeitos residuais relacionados ao crescimento desproporcional foram removidos pela padronização de dados realizada no software PAST. Portanto, nenhuma correção em virtude de alometria foi necessária.

Diferenças significativas nas formas das conchas foram observadas entre os locais de BTS, SESS e CEP (MANOVA, p <0,0003) (Figura 12). 51

Figura 12: Gráficos de pontuação de análise de componentes principais (EFA-PCA) dos padrões de variação no formato de concha de Lottiasubrugosa coletados em TSB (A), SSES (B) e PEC (C). As reticências representam o intervalo de confiança de 95% em cada local de amostragem.

52

As análises de componentes principais (EFA-PCA) indicaram a altura da concha como principal descritor das variâncias observadas no BTS (PC - 01 =

83,5%), SESS (PC - 1 = 86,2%) e CEP (PC - 01 = 82,3%); enquanto os valores de

PC-02 corresponderam às variações do comprimento total (BTS = 6,6%, SESS =

4,7% e CEP = 7,1%). Na BTS (Figura 12A), as diferenças observadas não acompanharam nenhum padrão de gradiente de ponto mais interno (B1) para o ponto mais externo (B3). Padrões relacionados a gradientes de contaminação e análises biométricas foram observados em SESS (Figura 12B) e CEP (Figura 12C).

Como resultado, as conchas de locais próximos a fontes de contaminação e que apresentavam lipoperoxidação e respostas ao dano ao DNA mais intensas, como S1 e P1, mostraram uma forma achatada em comparação com conchas de locais menos impactados (S3 e P3).

De acordo com (Tanaka et al., 2002) conchas de L. subrugosa provenientes de zonas mais hidrodinâmicas apresentam comprimento e altura maiores que as de locais menos expostos, devido à necessidade de uma força adesiva maior, exercida por um pé muscular mais volumoso. Além disso, outros parâmetros ambientais como a salinidade e a ocorrência de predadores podem influenciar as formas das conchas desses moluscos (Crothers, 1983). Portanto, para evitar vieses interpretativos resultantes de diferenças no grau de exposição a ondas, salinidade e pressões predatórias, a grade de amostragem foi estabelecida em escalas menores que 5 km visando garantir homogeneidade entre os parâmetros ambientais de cada ponto.

Para tanto, todos as coletas foram realizadas dentro de pequenas baías com características homogêneas, tais como salinidade e hidrodinamismo. De fato, os valores não normalizados da comprimento, altura e espessura do ápice das conchas dos organismos obtidos em cada sistema aquático não apresentaram relação com a 53 distância da abertura dos estuários (Tabela 3), sugerindo que esses vieses foram adequadamente evitados pela estratégia amostral.

Estas observações somadas à ausência de respostas guiadas por gradientes

(biométricos e morfométricos) registrados na BTS indicam que as alterações de conchas observadas no presente estudo são consistentes com as variações bioquímicas mensuráveis resultantes da exposição a substâncias perigosas. De fato, com base em estudos similares realizados na costa argentina (Laitano et al., 2013;

Primost et al., 2015), as mudanças de concha podem ser relacionadas à contaminação costeira e ocorrem em todo o Atlântico Sul Ocidental, sugerindo que, essa ferramenta tem potencial para uso global.

Nesse sentido, embora as análises morfométricas avaliem um maior número de parâmetros e sejam mais robustas, a biometria, por ser mais simples, rápida e apresentar menor custo envolvido parece ser uma ferramenta promissora para esse tipo de avaliação. Portanto, caso as alterações de conchas venham a ser universalmente aceitas como ferramentas de avaliação para zonas costeiras multi- impactadas, as avaliações biométricas poderiam ser usadas como método complementar principalmente em localidades pobres e ou isoladas onde recursos tecnológicos não estejam facilmente disponíveis.

4.4. Composição elementar de conchas

As análises da composição elementar das conchas mostraram que o Ca está presente em proporção, de 15 % (B1) a 38% (S3) em massa nas conchas analisadas (Tabela 3). Em SESS e CEP, as concentrações de Ca decresceram de

(S3 e P3) em direção aos pontos mais impactados (S1 e P1) sugerindo uma perda 54 de matriz inorgânica ao longo dos gradientes. Estas variações nos níveis de Ca foram estatisticamente significativas (Dunn, p <0,01) e já foram relatadas na SESS em um estudo preliminar realizado por (Begliomini et al., 2017). As conchas dos moluscos são compostas por diferentes moléculas, sendo o CaCO3 dominante

(Suzuki et al., 2010). O mineral mais frequentemente encontrado em conchas de moluscos adultos é a aragonita seguido da calcita, e em certos organismos, a mesma concha pode conter camadas dos dois minerais (Lowenstam e Weiner, 1989;

Marin e Luquet, 2004; Simkiss e Wilbur, 1989.). Em todos os casos, o Ca é o elemento mais abundante na composição dessas estruturas e a perda observada nos organismos oriundos dos pontos mais contaminados possivelmente está relacionada com as alterações biométricas e morfométricas observadas. Durante o crescimento, os íons inorgânicos encontrados no fluído da cavidade palial de moluscos são incorporados na estruturadas conchas(Marin et al., 2012). Assim, a redução observada nas concentrações de Ca, próximo aos locais mais poluídos, pode ter sido induzida pela exposição a poluentes liberados nessas áreas e que afetam as vias metabólicas de incorporação deste elemento. Esta hipótese é corroborada por achados realizado por estudos experimentais e de campo que também verificaram a diminuição dos níveis de Ca em conchas de moluscos expostos a meios contaminados (Cariou et al., 2017; Faubel et al., 2008; Laitano et al., 2013). 55

Tabela 4: Concentrações médias (mg g-1) e desvio padrão (sd) de elementos selecionados em conchas de Lottia subrugosa coletadas em áreas distribuídas em três sistemas aquáticos (BTS, SESS e CEP) da costa brasileira. Os valores em negrito indicam diferenças estatisticamente significativas entre os pontos de acordo com o teste de comparação múltipla de Dunn (p <0,05).

Sistema Ponto Ca P S Cr Fe Ni Cd B1 151.034,8 ± 18456,3 30,5 ± 13,9 166,2 ± 24,0 178,2 ± 86,1 467,6 ± 110,3 184,5 ± 79,0 586,8 ± 102,8

BTS B2 257.555,8 ± 6271,8 822,8 ± 279,2 372,9 ± 42,9 254,9 ± 9,4 1033,7 ± 9,4 282,3 ± 25,8 475,8 ± 17,6

B3 201.645,5 ± 12354,4 666,6 ± 159,1 261,4 ± 44,7 9,7 ± 0,8 31,9 ± 7,2 129,0 ± 27,7 654,5 ± 185,3

S1 311.360,1 ± 8764,3 1363,6 ± 126,7 453,0 ± 32,9 30,7 ± 15,3 513,3 ± 98,4 359,7 ± 34,6 722,3 ± 157,8

SESS S2 324.080,3 ± 7451,8 1328,7 ± 98,4 630,0 ± 53,2 45,9 ± 16,8 378,3 ± 77,3 386,0 ± 20,3 607,7 ± 108,8

S3 380.465,7 ± 10.345,5 2293,2 ± 112,4 1037,0 ± 89,0 23,0 ± 3,6 223,0 ± 42,4 264,8 ± 18,4 274,0 ± 56,8

P1 226.427,6 ± 21828,2 619,733 ± 81,5 185,0 ± 15,6 26,9 ± 16,9 136,8 ± 47,3 225,4 ± 11,4 916,9 ± 95,2

CEP P2 246.898,9 ± 6898,4 877,7 ± 203,3 278,3 ± 58,0 16,0 ± 0,5 78,1 ± 8,5 180,5 ± 36,0 358,7 ± 49,4

P3 321.762,2 ± 22496,3 830,7 ± 63,6 260,8 ± 17,9 18,7 ± 5,2 98,5 ± 18,1 135,7 ± 30,0 340,4 ± 11,9 56

Além disso, as concentrações medidas de P e S em conchas obtidas no

SESS e CEP também foram maiores (testes multicomparativo de Dunn, p <0,01) em locais com baixas respostas de biomarcadores (Tabela 3). Portanto, também é possível que as variações biométricas e morfométricas observadas possam estar relacionadas a danos na matriz orgânica. Essa matriz, composta prioritariamente por proteínas representa de 1 a 5 % da massa das conchas (Marin et al., 2012). Apesar do padrão de diminuição nos teores de Ca, P e S registrados em SESS e CEP, as mesmas respostas não foram observadas em conchas do BTS (Tabela 3), evidenciando a ausência de gradientes locais como já observado para respostas da biometria, morfometria e biomarcadores anteriormente. De qualquer forma, antes que as alterações observadas em conchas possam ser atribuídas a algum xenobiótico, estudos experimentais devem ser realizados.

Mais além, elementos tóxicos, costumam ser incorporados nessas estruturas seja na matriz inorgânica ou na matriz orgânica (Cariou et al., 2017). Algumas formas iônicas desses elementos são absorvidas a partir do ambiente pelo organismo e expulsos para concha por células epiteliais como resultados de uma supersaturação nos fluidos presentes no tecido do manto (Marin et al., 2012).

Quando expostos a substâncias nocivas e oligoelementos tóxicos, ocorrem alterações de biodisponibilidade ou vias metabólicas que podem afetar sua composição. Em ambientes naturais, as conchas têm um papel na proteção das partes moles dos moluscos contra predadores e outras ameaças externas (Suzuki e

Nagasawa, 2013). Portanto, mobilização e partição de elementos tóxicos para as conchas funciona como uma estratégia de desintoxicação reconhecidamente usada pelos moluscos(Nicholson e Evans, 1997). Nesse sentido, diferenças significativas

(testes multicomparativo de Dunn, p <0,05) foram detectados por comparação entre 57 as concentrações de metais tóxicos selecionados (Cr, Fe, Ni e Cd) em conchas obtidas nos pontos amostrados no SESS, CEP e BTS (Tabela 4). Nesse caso, os níveis foram maiores em locais altamente contaminados (S3 e P3) e diminuíram gradualmente em direção a S1 e P1. Em geral, os locais mais poluídos estão mais próximos de potenciais fontes de produtos químicos perigosos, como portos, marinas, indústrias, esgoto e estaleiros (Buruaem et al., 2013; Hatje e Andrade,

2009b), justificando as concentrações detectadas. Mais uma vez, os gradientes de acumulação de metal em conchas não foram observados no BTS.

Entre os metais tóxicos analisados, as concentrações de Cd foram as mais elevadas variando de 274 mg g-1 em S3 até 916,9 mg g-1 P1. Potencialmente tóxico para a vida selvagem aquática, o Cd é introduzido no meio ambiente por fontes antropogênicas bioconcentrantes em vários organismos aquáticos (Apeti et al.,

2009). Sua incorporação em conchas, provavelmente se deve à similaridade de seu raio atômico com o do Ca, que acessa o meio intracelular através da competição direta por trocas e canais (Matsuo et al., 2005). Assim, a relação Cd/Ca demonstra de forma bastante acurada o que foi originalmente observado pelos demais parâmetros avaliados (biomarcadores tradicionais, biometria e morfometria geométrica) no presente estudo (Figura 13). Portanto, considerando que após sua incorporação os elementos inorgânicos podem permanecer indefinidamente nas conchas, a razão Cd/Ca pode ser sugerida como um bom descritor temporal de contaminação por esse elemento. Nesse contexto, razões entre Ca e Pb medidas em conchas de moluscos bivalves, têm sido utilizadas como marcadores geoquímicos da contaminação por esse elemento no litoral Francês (Cariou et al.,

2017). 58

Figura 13: Razões entre as concentrações de Cd e Ca em conchas de Lottia subrugosa amostradas em SESS, PEC e BTS. As letras (A, B E C) indicam diferenças entre pontos amostrais de acordo com o teste multicomparativo de Dunn.

59

6. CONCLUSÕES

O presente estudo mostrou que as alterações biométricas, morfométricas e na composição elementar de conchas de Lottia subrugosa são consistentes com respostas observadas por biomarcadores tradicionais de contaminação, tais como

Lipoperoxidação e danos ao DNA. Adicionalmente, as ferramentas empregadas no presente estudo se mostraram responsivas mesmo em situações onde os gradientes de contaminação apresentaram intensidades diferentes (Sistema estuarino

Santos/São Vicente e Complexo Estuarino de Paranaguá) ou foram ausentes (Baía de Todos os Santos). Nesse contexto, a utilização da biometria, por sua rapidez simplicidade e menor custo parece ser uma ferramenta promissora para avaliações futuras, sobretudo em locais onde recursos tecnológicos estejam menos disponíveis.

Mais além, evidencias de alterações na composição elementar das conchas sugerem que a exposição a ambientes contaminados provavelmente é responsável pelas más formações detectas em conchas. Essas observações, realizadas em sistemas aquáticos distribuídos ao longo de uma ampla faixa de latitudes são uma indicação forte de que as conchas de gastrópodes refletem efeitos resultantes da contaminação ambiental. De fato, com base em estudos similares realizados no litoral argentino, alterações de concha relacionadas a contaminação costeira ocorrem ao longo de todo Atlântico Sul Ocidental, sugerindo que essa ferramenta tem potencial para utilização global. Entretanto, antes que possa ser universalmente utilizada, avaliações temporais e experimentais devem ser realizadas a fim de validar essa promissora ferramenta.

60

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