Untersuchungen Zur Vermehrung Und Mykorrhiza Von Eleutherococcus Maxim

Untersuchungen zur Vermehrung und Mykorrhiza von Eleutherococcus Maxim. (Araliaceae)

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)

dem Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg vorgelegt von Matthias Döring aus Meißen (Freistaat Sachsen)

Marburg/Lahn 2007

Vom Fachbereich Biologie der Philipps-Universität Marburg als Dissertation am 07.02.2007 angenommen.

Erstgutachter: Prof. Dr. Hans Christian Weber

Zweitgutachter: Prof. Dr. Roland Brandl

Tag der mündlichen Prüfung am 08.02.2007.

Meinen lieben Eltern

gewidmet

iii INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung...... 1 1.1. Name...... 1 1.2. Verbreitung und Artenschutz...... 2 1.3. Morphologie und Anatomie ...... 4 1.4. Nutzen...... 5 1.5. Kultivierung und Vermehrung ...... 10 1.6. Mykorrhiza ...... 12 1.7. Zielsetzung ...... 26

2. Material und Methoden ...... 27 2.1. Untersuchtes Pflanzenmaterial...... 27 2.2. Entnahme, Fixierung und Lagerung der Wurzelproben ...... 27 2.3. Anatomische Untersuchungsmethoden ...... 28 2.3.1. Lichtmikroskopie...... 28 2.3.2. Trypanblaufärbung ...... 28 2.3.3. Herstellung von Semidünnschnitten in Technovit...... 28 2.3.4. Herstellung von Paraffinschnitten...... 29 2.3.5. Nachweis verschiedener Inhaltsstoffe ...... 30 2.3.6. Nachweis der Zellkerne...... 30 2.3.7. Nachweis von aktiv bewegenden Mikroorganismen...... 30 2.3.8. Rasterelektronmikroskopie (REM)...... 30 2.4. Kultivierung von Laubblättern und Sprossstecklingen ...... 30 2.4.1. Bewurzelung von Laubblättern und Fiederblättchen...... 30 2.4.2. Behandlungen mit Rotlicht...... 31 2.5. Etablierung einer Pflanzengewebekultur von Eleutherococcus sieboldianus (Makino) Koidz...... 31 2.6. Isolation und Kultivierung von Mikroorganismen ...... 32 2.7. Topfkultivierung und Inokulation mit Glomus intraradices in vivo ...... 33 2.7.1. Inokulumgewinnung...... 33 2.7.2. Inokulationsexperiment mit Eleutherococcus sieboldianus...... 33 2.7.3. Inokulationsexperiment mit Eleutherococcus gracilistylus ...... 33 2.8. Kultur von Gigaspora margarita und Inokulation in vitro ...... 34 2.8.1 Inokulumgewinnung...... 34 2.8.2. Desinfektion ...... 34 2.8.3. In vitro Kulturmedien für Gigaspora margarita...... 34 2.8.4. Inokulation von in vitro vermehrten Eleutherococcus sieboldianus mit Gigaspora margarita ...... 34 2.9. Wachstumsparameter...... 35 2.10. Statistik...... 35 2.11. Molekularbiologische Bestimmung der Glomeromyzeten an Wurzeln aus dem Frei- land ...... 35

3. Ergebnisse...... 38 3.1. Morphologische Merkmale von verschiedenen Eleutherococcus-Arten...... 38 3.2. Bewurzelungsexperimente mit Laubblättern von Eleutherococcus gracilistylus ...... 53 3.3. Bewurzelungsexperimente mit Laubblättern von verschiedenen Eleutherococcus- Arten ...... 57 3.4. Ausbildung von Adventivsprossen bei verschiedenen Eleutherococcus-Arten...... 64

iv 3.5. Stecklingsvermehrung von Sprossachsen verschiedener Eleutherococcus-Arten ...... 67 3.6. Pflanzengewebekultur von Eleutherococcus sieboldianus...... 71 3.6.1. Somatische Embryoidogenese von Eleutherococcus sieboldianus...... 71 3.6.2. Deformationen des Pflanzenmaterials in der Pflanzengewebekultur...... 80 3.6.3. Mikroorganismen in der Pflanzengewebekultur...... 83 3.7. Wurzelanatomie bei Eleutherococcus ...... 90 3.8. Mykorrhiza bei Wurzeln aus dem Freiland und Adventivwurzeln von Blattrisslingen von Eleutherococcus gracilistylus...... 94 3.9. Molekularbiologische Untersuchungen der mit Eleutherococcus-Arten assoziierten Glomeromyzeten...... 98 3.10. Experimente mit Sporen von Gigaspora margarita Becker & Hall ...... 100 3.11. Experiment zum Gravitropismus bei Gigaspora margarita ...... 107 3.12. Inokulation von mikrovermehrten Pflanzen der Art Eleutherococcus sieboldianus mit Gigaspora margarita...... 109 3.13. Inokulationsexperiment mit Glomus intraradices bei mikrovermehrten Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus ...... 111

4. Diskussion ...... 117 4.1. Morphologische Beschreibungen der Sträucher...... 117 4.2. Anatomische Beschreibungen der Wurzeln ...... 117 4.3. Bewurzelung von Laubblättern und Stecklingsvermehrung verschiedener Eleutherococcus-Arten ...... 117 4.4. Somatische Embryoidogenese von Eleutherococcus sieboldianus...... 120 4.5. Deformationen von Wurzelhaaren und Pflanzen und Mikroorganismen assoziiert mit Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus aus Pflanzengewebekultur ...... 121 4.6. Mykorrhiza von Eleutherococcus...... 125 4.7. Molekularbiologische Charakterisierung der Glomeromyzeten an Wurzeln von verschiedenen Eleutherococcus-Arten ...... 131 4.8. In vitro Experimente mit Gigaspora margarita ...... 134 4.9. Inokulationsexperiment mit Eleutherococcus sieboldianus und Glomus intraradices 137

5. Anhang ...... 141 5.1. Anhang A - Drehbuch ...... 141 5.2. Anhang B – Inokulationsexperiment von Eleutherococcus sieboldianus mit Glomus intraradices...... 151

6. Zusammenfassung ...... 153

7. Literaturverzeichnis...... 154

8. Publikationsliste des Autors...... 185

9. Danksagung...... 186

10. Erklärung ...... 187

v Einleitung

1. Einleitung 1.1. Name Die Familie Araliaceae besteht aus 47 Gattungen und über 1350 Arten. Darunter befindet sich auch die Gattung Eleutherococcus. Wenn man in der botanischen Literatur nach diesem Namen sucht, so findet man zwei Gattungsnamen: Eleutherococcus und Acanthopanax. Eleutherococcus Max. leitet sich aus dem Griechischen ab: „eleutheros“ bedeutet „frei“ und „kokkos“ bedeutet „Same, Korn“. Houtman (2000) interpretiert den Namen als „freie Früchte“ – reife Früchte fallen ab von ihren Fruchtstielen. Acanthopanax leitet sich ebenfalls aus dem Griechischen ab: „akanthos“ bedeutet „dornig“ oder „stachelig“, „panax“ steht für die Gattung Panax (Soejarto und Farnsworth, 1978), leitet sich aber ursprünglich aus dem Wort „Panacea“ für „Allheilmittel“ ab. Volkstümlich werden die Pflanzen zum Beispiel unter den deutschen Namen „Stachelheil“ (Voss, 1896) „Stachelkraftwurz“ (Bonstedt, 1932), „Stachelpanax“ (Encke, 1960; Paulus und Ting, 1987; Brockhaus, 2001) und „Fingeraralie“ (Bärtels, 2001) geführt.

Abb. 1: Eleutherococcus senticosus (Rupr. & Maxim.) Maxim. als Gattungstypus

1 Einleitung

Carl Johan Ivanovich Maximowicz ist der Erstbeschreiber der Gattung Eleutherococcus (Maximowicz, 1859). Der Gattungstypus ist die Art Eleutherococcus senticosus (Abb.1). Nach den aktuellen Regeln des „International Code of Nomenclature“ (ICBN) (Greuter et al., 2000) besitzt der jüngere Gattungsname Acanthopanax keine Gültigkeit gegenüber dem älteren Eleutherococcus. Zepernick et al. (1984) veröffentlichen den alten Namen Panax sessiliflorus Planchon für Eleutherococcus sessiliflorus als Beispiel für Verfälschungen von medizinischen Wurzelmaterial von Panax ginseng C. A. von Meyer. Bei der Veröffentlichung des Namens Eleutherococcus sollte man stets auf die Orthographie achten. Ein Fehlen des Buchstabens „h“ hat zur Folge, dass dadurch eine Untergattung des Phycobionten Cladonia in Flechten gemeint ist (Warén, 1920). In der chinesischen Namensbenennung konnte ebenfalls keine exakte Bezeichnung verschiedener Eleutherococcus-Arten gefunden werden. So werden mit dem chinesischen Namen „Wu Jia Pi“ in der Pharmazie und Medizin gleichzeitig 4 Eleutherococcus-Arten bezeichnet: E. gracilistylus, E. henryi, E. senticosus und E. sessiliflorus (Bensky und Gamble, 1986). Huang (1999) fand heraus, dass in chinesischen Apotheken außerhalb der Provinzen Sichuan, Yunnan und Guizhou unter diesem Namen E. setchuenensis, E. leucorrhizus und E. giraldii geführt werden. Weiterhin werden mit diesem Namen die Arten E. senticosus und E. verticillatus bezeichnet (Paulus und Ting, 1987). In klassischen Texten der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) wird „Wu Jia Pi“ in 2 Arten unterteilt: „Nan Wu Jia“ (E. giraldii) und „Bei Wu Jia“ (Periploca sepium (Asclepiadaceae) (Xu und Wang, 2002). E. chiisanensis und E. seoulensis werden auch unter dem Namen „Wu Jia Pi“ gehandelt (Ishidoya, 1934).

1.2. Verbreitung und Artenschutz Die Gattung Eleutherococcus beinhaltet 35 endemische Arten, die ihr Hauptver- breitungsgebiet in Nordostasien (Korea, China und Japan) besitzen. Vereinzelt sind sie auch in Südwestasien (Malaysia, Vietnam) heimisch (Abb. 2) (Kim, 1997; Sun und Kim, 1997). In Sibirien kommen die beiden Arten E. senticosus und E. sessiliflorus vor (Poyarkova, 1950).

2 Einleitung

China weist allein 26 Eleutherococcus-Arten auf (Ye et al., 1995). Unter ihnen ist die gattungsbezeichnende Art E. senticosus, die in der Roten Liste der gefährdeten Pflanzen von China veröffent- licht ist, als Charakterart in Mischwäldern. Exzessive Abholzungen der Wälder und Ausgrabungen der Wurzeln für die pharmazeutische Industrie verursachten den Rückgang ihrer natürlichen Populationen. Eine natürliche Regeneration dieser Eleu-

Kim (1997) therococcus-Art ist gering, weil ihre Samen häufig keinen Embryo besitzen. Es ist Abb. 2: Verbreitung von Eleutherococcus deshalb wünschenswert, diese Pflanzenart in Kultur zu nehmen (Fu, 1992).Weitere angeborene Faktoren für einen Rückgang dieser Art sind das hohe Verhältnis von fruchtlosen Pflanzen, geringe Samenproduktion, schwache Kraft der Samenverbreitung, die angeborene Samendormanz. Somit ist ihre vegetative Verbreitung die Haupttriebkraft ihrer Vermehrung, gekoppelt mit einer abnehmenden genetischen Diversität. Daraus ergibt sich wiederum eine verminderte Resistenz zu der sich verändernden Umwelt (Zhu et al., 1998). Zhang (1998) sieht hier ebenfalls eine Gefahr im Rückgang der Pflanzenpopulationen und stuft sie als schützenswert ein. In Korea ist diese Art auf der Roten Liste veröffentlicht (Kim et al., 2002b; Ahn, 2003). E. brachypus ist eine zweite Art, welche ebenfalls als gefährdet in der VR China eingestuft wird. Sie kommt ausschließlich in China vor und wächst auf Lössplateaus in der Provinz Shaanxi (Yue et al., 2001). In der VR Vietnam sind E. gracilistylus und E. trifoliatus nur noch selten in der Natur zu finden. Aufgrund der starken Ausbeutung ihrer pflanzlichen Ressourcen wurden sie in die dortige Rote Liste für den Erhalt aussterbender Pflanzen aufgenommen (Truyên, 1999). In den US-amerikanischen Bundesstaaten Massachusetts, Connecticut, Pennsylvania, New York State und Utah wurde in der Natur E. sieboldianus gefunden. Diese

3 Einleitung

Eleutherococcus-Art wurde aus der VR China eingeführt und breitet sich offensichtlich weiter aus (Lamont und Young, 2002; Welsh et al., 1987).

1.3. Morphologie und Anatomie Morphologisch sind die Vertreter von Eleutherococcus wie folgt charakterisiert: Sie sind Nanophanaerophyten, bis 5 m hohe Sträucher mit aufrechter oder überhängender Wuchsform (Frodin, 2003). An den Blattstielen von ihren fingerförmig 3 - 5 fach gefiederten Laubblättern, Zweigen und Stämmen befinden sich je nach Art unterschiedlich viele Stacheln, die die Form einer Nadelspitze oder eines Rosenstachels haben. Die Form des Blütenstandes variiert von Art zu Art von einfacher Dolde bis zum zusammengesetzten Blütenstand. Einzelne Blüten bestehen aus 5 Kronblättern mit verwachsenen Kelchblättern, 5 Staubblättern, 2 oder 5 Fruchtblättern. Ihre Farbe ist violett bis weiß (Kim, 1997). Harms (1918) beschreibt als erster deutscher Botaniker morphologisch die kultivierten Eleutherococcus-Arten im Botanischen Garten Berlin-Dahlem, welche von botanischen Exkursionen als Samen - bzw. Stecklingsmaterial mitgebracht worden. Anhand der Ergebnisse stellte er wie Kim (1997) mehrere Sektionen innerhalb der Gattung Eleutherococcus (hier Acanthopanax) auf. Viguier (1906), Kano (1936), Wee (2001) untersuchten anatomisch die Sproßachsen, Blattstiele, Blattfiederstiele und Laubblätter verschiedener Eleutherococcus-Arten. Dabei fanden sie heraus, dass einige anatomische Merkmale nützlich sind für die Bestimmung der Pflanzenart. Rasterelektronenmikroskopische Analysen von Stomata der Laubblätter verschiedner Eleutherococcus-Arten beschrieben den anomozytischen Typus von Spaltöffnungen. Wachsornamente und Kutikulamembranstrukturen sind hier Merkmale für die taxonomische Bestimmung unterschiedlicher Eleutherococcus-Arten (Bai et al., 2001). Jahn (1980) beschreibt strukturell sekundärverdickte Wurzeln und Rhizome verschiedener Arten, um einen Art-Bestimmungsschlüssel für die Erkennung von Wurzel/Rhizomproben zu erstellen. Park et al. (1992) untersuchte Querschnitte von Zweigen verschiedener Arten. Ähnliche Untersuchungen über das sekundäre Xylem in Sproßachsen führte Lim und Soh (1993) durch. Kim et al. (1997) fand bei seinen

4 Einleitung anatomischen Untersuchungen der Zweige heraus, dass z. B. die Breite der Korkschicht, Phloems Merkmale für die Unterscheidung verschiedener Eleuthero- coccus-Arten sind. Eine Ausbildung von Rhizomen bei E. senticosus, die in der oberen Bodenschicht verlaufen, beschreiben Meng et al. (1981), Zhu und Liu (1993).

1.4. Nutzen Nutzungsmöglichkeiten von Eleutherococcus sind sehr vielfältig. Die im folgenden erwähnten Beispiele für Anwendungen in der Medizin, Lebensmittelbranche, Haushalt und in der Technik zeigen das große öffentliche Interesse an diesen Pflanzen in Asien. Verschiedene Weltpatente und wissenschaftliche medizinisch fundierte Untersuchungen unterstreichen zusätzlich ihre Bedeutung. Bereits in der Quing-Dynastie nahm Eleutherococcus einen hohen Stellwert als Nutzpflanze ein. Wujia (oder Wujiapi) als bedeutende Drogenpflanze in der chinesischen Medizin wurde erstmalig in dem Shen Nong’s Kräuterbuch „Shen Nong Ben Cao Jing“ (1 - 2. Jh) erwähnt. Tao Hongjiang (452 - 536) veröffentlichte primär die Merkmale von Wujiapi in seinem Buch „Ming Yi Bei Lu“ („Einzelne Berichte von berühmten Ärzten“, 502-530) in der Liang-Dynastie. Er stuft die Pflanzen als besondere Heilpflanzen ein. Su Song (1020- 1101) erwähnte Wujiapi in dem Buch „Tu Jing Ben Cao“ („Illustrationen von Kräutern“) aus dem Jahre 1062 während der Song-Dynastie. Er beschrieb botanisch diese Pflanzen. In der Ming-Dynastie erwähnt Li Shizhen, dass Pflanzen mit 5 Fiederblättern bessere Heilpflanzen sind und nennt dabei „Wujia“ (Eleutherococcus). In dem Buch „Jing Shi Zheng Lei Dai Guan Ben Cao“ („Dai Guan’s offizielle und nichtoffizielle Kräuter von symptomatischer Klassifikation“) von 1108 wurden erstmals Zeichnungen von Eleutherococcus veröffentlicht (Abb. 3) (Fu et al., 1981).

Heilpflanzen Viele Vertreter dieser Gattung sind Heilpflanzen, welche traditionell und schulmedizi- nisch für die Heilung und Genesung von verschiedenen Krankheiten des Menschen unterschiedlich eingesetzt werden. Hierbei sind auch die Erfolge bei der Bekämpfung der Volkskrankheiten Diabetes mellitus und Tumor/Krebserkrankungen zu beachten.

5 Einleitung

Die folgende Auflistung (Tab. 1) soll die Bedeutung dieser wichtigen Heilpflanzen von Eleutherococcus widerspiegeln.

Abb. 3: Mittelalterliche Zeichnungen von Eleutherococcus- Pflanzen

Eleutherococcus-Art Medizinische Anwendung Literaturreferenz E. divaricatus (Siebold & Chiisanoside aus Laubblättern besitzen Yook et al. (1996) Zucc.) S. Y. Hu Antitumoreffekte bei L-12 Leukämiezellen. E. divaricatus var. chiisa- Chiisanoside senken den Bluglukosegehalt Choi et al. (2001) nensis (Nakai) C. H. Kim bei Diabetes mellitus bzw. vermindern & B.-Y. Sun Nekrose von geschädigten Zellen der Leber. Kim & Hahn (1980) Hyperin isoliert aus Wurzeln besitzt ent- Lee et al. (2004) zündungshemmende Aktivität. E. giraldii (Harms) Nakai Isolierte pflanzliche Polysaccharide hem- Lu et al. (2002) men Proliferation, Lebensfähigkeit und Funktion von Magentumorzellen. Getrocknete Wurzelrinde stärkt Sehnen und Xu & Wang Knochen. (2002) E. gracilistylus (W. W. Medizinischer Wein aus getrockneter Xu & Wang Sm.) S. Y. Hu Wurzelrinde dient als Stärkungsmittel zur (2002) Heilung von Rheumatismus, Impotenz, Hexenschuss und Schmerzen in Muskeln und Knochen. Extrakte aus Laubblättern und Wurzeln Shan et al. (2000, hemmen Proliferation verschiedener 2004) Tumorzelllinien. E. henryi Oliv. Wurzelrinde wird zur Behandlung von Perry & Metzger Rheuma, Syphilis und Atemwegser- (1980); Duke & krankungen verwendet. Ayensu (1985) E. koreanus Nakai Pflanzliche Extrakte besitzen Hemmungs- Hong et al. aktivität bei Hepatitis. (2003); Lee et al. (2003a); Nan et al. (2004)

6 Einleitung

Eleutherococcus-Art Medizinische Anwendung Literaturreferenz E. koreanus Nakai Isolierte Acanthosäure unterdrückt Produk- Kang et al. (1996) tion des Tumornekrosefaktors alpha bei Tumorerkrankungen.

E. senticosus (Rupr. & Alkoholische Extrakte in einem „Fitness- Weger (1993) Maxim.) Maxim. drink“ als Immunostimmulanz erhöhen die mentale und physische Effizienz um Er- kältungen und unterdrücken bakterielle und virale Infektionen. Extrakte aus der Rinde der Sprossachsen Hibasami et al. hemmen das Wachstum von Magenkrebs- (2002) zellen und induzieren ihre Apoptose. Medizinischer Wein aus Wurzelextrakten Keys (1987) wird als Antirheumamittel und zur Stärkung sexueller Potenz eingesetzt. Fruchtextrakte hemmen signifikant das Jun et al. (2003); Zellwachstum von Lungen-, Halsadeno-, Young (2003) Brustadeno- und Leberkarzinomen. Extrakte aus Wurzeln und Laubblättern Kupin et al. aktivieren Lymphozyten und stimuliert die (1986) Immunabwehr bei Brustkrebspatienten mit zytostatischer und radioaktiver Behandlung. Tabletten mit Extrakten der Wurzelrinde Yamagami und wirken gegen Schlaflosigkeit. Yamagami (2003) Extrakte von Spross und Laubblättern Zakharov (2000) senken des Blutglukosegehalt bei Diabetes mellitus Typ 1. Wurzelextrakte besitzen eine hemmende Kim et al. (2003b) Aktivität auf Hepatitis. Isoliertes Eleutherosid B1 aus Spross- Kim et al. (2002a) material beinhaltet leberschützende und antioxidative Aktivitäten. E. sessiliflorus (Rupr. & Pflanzliche Extrakte aus Sprossachsen Perry & Metzger Maxim.) S. Y. Hu werden zur Behandlung von Arthritis (1980); Bensky & verwendet. Gamble (1986); Hsu (1986); Cho et al. (2003) Material der Wurzelrinde wirkt diuretisch Duke & Ayensu und hilft bei Entzündungen, Rheuma und (1985) Wasseransammlungen im Knie. Wurzelrinde wird auch zum Schutz und zur Kim et al. (2003a) Behandlung von Osteoporose angewendet. Polysacharide aus Früchten besitzen Anti- Kwak et al. (2003) tumor- und immunstimulierende Aktivitäten Lee et al. (2003c) an Sarkomtumorzelllinien. Wässrige pflanzliche Extrakte hemmen Son (2001) Retroviren. Wurzelextrakte hemmen das Wachstum des Chang & Woo Human immunodeficiency virus (HIV) vom (2003) Typ 1.

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Eleutherococcus-Art Medizinische Anwendung Literaturreferenz E. sessiliflorus (Rupr. & Als Roborans besitzt es verschiedene Lee (2003) Maxim.) S. Y. Hu Funktionen: Abbau von Müdigkeit, Aktivierung der Leberfunktion und Schutz vor Diabetes. E. setchuenensis (Harms) Zerstoßene Früchte, gemischt mit Mehl und Perry & Metzger Nakai gekochtem Wasser als Appetitmittel (1980); Duke & angewendet. Ayensu (1985) E. sieboldianus (Makino) Extrakte aus Laubblättern, Zweigen und Okuyama et al. Koidz. Früchten haben einen stark hemmenden Ef- (1998) fekt auf die Aktivität des Epstein-Barr- Viruses. Extrakte von Laubblättern verbessern Tabuchi et al. Glukosetoleranz bei Diabetes. (2003) Pflanzliche Extrakte mit alpha-Amylasein- Yoshizumi & hibitoren und alpha-Glucosidasen sind anti- Shigematsu diabetische und entfettende Agenzien in (2004a, 2004b) Japan. Wasserextrakte und pulverisiertes Pflanzen- Yamada (1999) material senken den Cholesteringehalt im Blut. E. trifoliatus (L.) S. Y. Hu Rinde von Wurzeln und Spross wird bei der Ling (1995) Behandlung von Rheuma, Hexenschuss und Impotenz verwendet.

Pflanzliche Extrakte enthalten einen Inhibi- Katsuyoshi et al. tor gegen Hautalterung. Dadurch wird die (2002) Konsistenz und Spannkraft der Haut erhöht. Tab. 1: Eleutherococcus-Arten, die in der Medizin verwendet werden

Chemische Bestandteile Die chemischen Bestandteile des Drogenmaterials von Eleutherococcus umfassen Benzoide, Diterpenoide, Flavonoide, Furane, Kumarine, Lignane, Lupantriterpenoide, Phenylpropanoide, Phytosterole, Polysacharide, Sesquiterpenoide, Triterpenglykoside, Phenole, Saponine (Kim, 1995; Shin und Lee, 2002). Im folgenden wollen wir auf die Substanzgruppe der Eleutheroside näher eingehen. Dieser Begriff ist nach Wichtl und Czygan (2002) und Hänsel et al. (2004) verwirrend, da er für über 15 Substanzen steht, die keiner einheitlichen Substanzklasse angehören. Es ist bisher nicht eindeutig belegbar, ob die entdeckten Inhaltsstoffe einzeln oder in Kombination für die verschiedensten Wirkungen der Droge verantwortlich zu machen sind (Frohne und Braun, 2002). Eleutherosid B = Syringin gehört zu den Phenylpropanderivaten, pharmakologisch aktivste Substanz von Eleutherococcus

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(Brekhman und Dardymov, 1969) Eleutherosid E = Acanthosid D, (+)-Syringaresinol di-O-ß-D-Glukosid gehört zu den Lignanen (Han, 1976; Shin und Lee, 2002). Diese Substanz, isoliert aus E. senticosus besitzt einen inhibitorischen Effekt auf Magengeschwüre (Fujikawa et al., 1996) und vieles mehr.

Nahrungsmittel Verschiedene Eleutherococcus-Arten gelten auch als Nahrungsmittel. Sie können als Gemüse (Uphof, 1959; Tanaka 1976; Kunkel, 1984; Facciola, 1990; Wiersema and León, 1999; Wang et al., 2000; Hanelt, 2001; Ko, 2003), Marmelade (Yamamoto, 2002), Milchprodukt (Tokumaru et al., 1987; Yoshie et al., 1988) und Nahrungsmittel- zusatzstoff (Jitsugyo, et al. 1998) verzehrt werden.

Genussmittel Verschiedene Pflanzenteile werden auch als Genussmittel wie Tee (Tanaka, 1976; Kunkel, 1984; Shibata und Kudo, 1986; Facciola, 1990; Joa et al., 2001), Kaffee (Takahashi und Kuboyama, 2000), Wein (Tanaka, 1976; Choi, 2004a), Saft (Choi, 2000; Kim et al., 2001a), Essig (Ito, 1986; Jiang, 1999; Sun, 2000), Zigaretten (Wang, 1995; Xie et al., 1995; Hee, 2001) konsumiert.

Körperpflegemittel Ein weiterer erfolgreicher Anwendungsbereich dieser Pflanzengattung sind Produkte für die Körperpflege und – hygiene (Nikitakis, 1991; Cho et al., 2001; Kim et al., 2001b; Choi, 2003).

Haushaltsmittel Pulversiertes Wurzelmaterial von E. senticosus dient als Bestandteil eines flüssigen Deodorants zur Verbesserung der Luftqualität (Yamamoto und Yokoo, 1989).

Technik Die stachelbewehrten Zweige von Eleutherococcus trifoliatus in Tukukan, Bontoc (Philippinen, nördlicher Teil) werden als eine Art Zaun um die Baumstämme von

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Obstbäumen gebunden, um das Pflücken der Früchte zu verhindern (Bodner und Gereau, 1988).

Bekleidung Unterwäsche mit verschiedenen Kräutern, darunter E. senticosus kann für Patienten mit allergischer Dermatitis hergestellt werden (Kawachi et al., 2004).

Zierpflanzen Harms zeigte bereits 1918 für verschiedene Eleutherococcus-Arten, wie E. sessiliflorus mit seinen schwarzen Früchten die Verwendung als Zierpflanzen. Siehe auch Bonstedt (1932), Encke (1960), Jenny (1964) und Raalte (1980). Eine andere Art, wie E. sieboldianus ist als Heckenpflanze ebenfalls gut geeignet (Tischler, 1889; Boerner, 1938; Harkness, 1953; Koller, 1981; Huxley, 1992; Kelly, 1993 und Houtman, 2000).

1.5. Kultivierung und Vermehrung Die Bedeutung als vielfältige Nutzpflanzen spiegelt sich auch in verschiedenen Projekten zur Kultivierung und Vermehrung wieder, so etwa die Firma Slovak Healing Plants Ltd. mit über 1000 Pflanzen von Eleutherococcus senticosus. Weitere landwirtschaftliche Kulturen gibt es in Saskatchewan (Kanada) oder Tasma- nien (Monks und Baxter et al., 1996). Das Pflanzenmaterial von Eleutherococcus senticosus für die Verarbeitung zu pharmazeutischen Präparaten in Deutschland wird aus China und aus Regionen der Taiga importiert (schriftliche Mitteilung, Galke, Hannig).

Pflanzengewebekulturen Für den großtechnischen Anbau werden verschiedene Eleutherococcus-Vertreter mittels in vitro-Techniken vermehrt, z. B. bei den Firmen „Panaxia Co., Ltd.“ oder „Panax Global Marketing Co., Ltd.” Die Vermehrung läuft über somatische Embryoidogenese von generativen und vegetativen pflanzlichem Gewebe ab, so etwa bei E. divaricatus var. chiisanensis (Choi et al., 2002c; Lee et al., 2003b), E. koreanus (Choi et al., 1997; Soung, 2001), E. senticosus (Gui et al., 1991; Choi und Soh, 1993; Yu et al. 1997; Yu, 1998; Choi et al., 1999a, b; Choi et al., 2002b; Li und Yu, 2002; Ahn et al., 2003; Han

10 Einleitung und Choi, 2003; Jung et al., 2004) oder E. sessiliflorus (Han et al., 2000; Choi et al., 2002a).

Züchtung Um die Konzentration von pharmakologischen Substanzen (Eleutheroside) in Pflanzen von E. senticosus zu erhöhen, wurde in vitro Pflanzenmaterial mittels Agrobacterium tumefaciens genetisch verändert (Seo et al., 2005). Eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte Transformation war auch bei E. sessiliflorus erfolgreich. Hier wurden Kanamycin - bzw. Hygromycinresistente Kalluskulturen als Vorstufe der somatischen Embryoide etabliert (Jeong et al., 2003; Choi, 2004c). In einem weiteren Experiment wurde das Gen für die Phosphinothricinazetyltransferase in die Zellen der pflanzlichen in vitro Kultur transformiert. Die Phosphinothricinazetyltransferase ist ein Enzym beim Aufbau einer Resistenz gegen das Herbizid Basta ® (Choi et al., 2004). Cho (2001) erzeugte eine Mutante – Eleutherococcus sessiliflorus for. goma mit einer erhöhten Anzahl von Früchten und einem verbessertem Gehalt von Zucker. Stecklinge von E. senticosus gepfropft auf E. senticosus var. subinermis produzieren in den sich entwickelnden Pflanzen höhere als auch niedrige Gehalte von verschiedenen pharmakologischen Naturstoffen (Shin et al., 1998).

Stecklingsvermehrung Verschiedene Arten von Eleutherococcus sind auch über Sprossstecklinge vegetativ vermehrbar, wie z. B. E. divaricatus var. chiisanensis (Kim, 1990), E. gracilistylus (Wang et al., 2000), E. koreanus (Ahn und Choi, 1992; Ko, 1998; Ko et al., 2003), E. senticosus (Guo et al., 1986; Park et al., 1994; Kim et al., 2000; Li, 2001; Yi et al., 2001), E. sieboldianus (Ahn und Choi, 1992; Park et al., 1994), E. trifoliatus (Osborn et al., 2002)

Vermehrung über Wurzelschnittlinge E. sieboldianus: Vermehrung über Wurzelsprosse (Huxley, 1992) möglich.

11 Einleitung

Wintersteckholzvermehrung

E. sieboldianus: Vermehrung durch Wintersteckholz (Boerner, 1938).

Vermehrung über Samen Die Samen von Eleutherococcus benötigen zwei Jahre nach der Aussaat zur Keimung, wenn reife Früchte davon geerntet werden sollen. Unreife Embryos liegen in den Samen vor. Eine Stratifikation ist somit erforderlich, um die Keimung zu verbessern.

100 ppm Gibberellinsäure (GA3) fördert die Reifung der Embryos, d. h. die Ausbildung von Kotyledonen und Prokambium im Hypokotyl im Vergleich zu unbehandelten stratifizierten (Isoda und Shoji, 1989; Ahn, 1993). Li (2001) und Meng et al. (1995) hingegen schlagen eine Wärmebehandlung der Samen mit unreifen Embryos bei E. senticosus vor. Wie schon Ahn (1993), Li et al. (2003) herausfanden, fördert hier die

Zugabe von GA3 die Keimung. Davies (1999) bemerkt dazu, dass die Keimung nach 18 Monaten im Erdboden erfolgt, in kalten Teilen von Nordeuropa und des nördlichen Amerikas nur 6 - 12 Monate dauert. Die Samendormanz bei E. senticosus beruht auf inhibitorische Substanzen, gebildet in der Samenschale. Weitere Untersuchungen hierzu führten Rice (1987), Tian et al. (1998) und Zhao et al. (2001) durch.

1.6. Mykorrhiza Das latinisierte Wort „Mykorrhiza“ kommt ursprünglich aus dem Altgriechischen und setzt sich zusammen aus „myko- mýkēs“ = Pilz und „rhíza“ = Wurzel (Vogellehner, 1983); kurz um als „Pilzwurzel“ bezeichnet. Frank (1885) prägte als erster den Begriff „Mykorrhiza“ und differenzierte bald in die physiologischen Begriffe „Ektotrophische“ und „Endotrophische“ Mykorrhiza (Frank, 1887). Die „ektotrophische Mycorhiza“ beschrieb er bereits im Zusammenhang mit der Namensgebung „Mycorhiza“, wo der sich ernährende Pilz zwischen den Wurzelzellen sich befindet und ein Pilzmantel um die Wurzeln entsteht. Bei den „endotrophischen Mycorhizen“ beschreibt er die Mykorrhizen verschiedener Vertreter der Ericaceen

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(Calluna, Vaccinium) und Orchideen (Neottia, Corallorhiza, Epipogon), wo der Pilz in das Innere bestimmter Zellen der Wurzeln eindringt (Frank, 1887). Die Mykorrhiza bezieht sich auf eine Varietät von Symbiosen zwischen Pflanzenwurzeln und Pilzen (Böhm und Hock, 1997). Wie ist wiederum die Symbiose definiert? Das Wort „Symbiose“ besteht aus 2 griechischen Wortbestandteilen „sym-“ für „mit-“, „zusammen-“ und „bios“ (biose) für „Leben“ (Vogellehner, 1983). Daraus können wir das Wort „Zusammenleben“ ableiten. In der Biologie gibt es unterschiedliche Definitionsauslegungen dieses Fachbegriffes. Anton Heinrich de Bary (1878) prägte erstmals diesen Begriff mit einer Erklärung in seinem Vortrag „Ueber Symbiose“. Er sagte dazu: „...eine Betrachtung der Erscheinungen des Zusammenlebens ungleichnamiger Organismen, der Symbiose, wie man kurz und allgemein sagen kann,...“. Saffo (1992) fand bei seinen Recherchen über die Symbiose- Definition heraus, das Symbiose heutzutage auch als Synonym für mutualistische oder nicht-parasitäre Assoziationen steht. Die Mykorrhiza ist nach Trappe (1996) wie folgt charakterisiert: Dualorgane der Absorption, gebildet wenn symbiotische Pilze gesunde Absorptionsorgane (Wurzeln, Rhizome oder Thalli) der meisten terrestrischen Pflanzen und vielen aquatischen Pflanzen und Epiphyten bewohnen. Peyronel et al. (1969) prägten die Begriffe „Ektomykorrhiza“, „Endomykorrhiza“ und „Ektendomykorrhiza“ aus den funktionell beschreibenden Wörtern „ektotrophe“, „endotrophe“ und „ektendotrophe“ Mykorrhiza. Sie definieren “Ektomykorrhiza” als „...a mycorrhiza wherein the fungus develops only outside the root cells as a Hartig net...“, “Endomykorrhiza” als “…wherein the fungus grows within the root cells and does not form a Hartig net…”, “Ektendomykorrhiza” als “…wherein the fungus forms a Hartig net outside the root cells but also penetrates to grow within them…” Wie bereits erwähnt wird die Mykorrhiza nach verschiedenen Formen eingeordnet, die übergeordnet als Ekto-, Endo – oder Ektendomykorrhiza traditionell charakterisiert werden (Schwantes, 1996; Dörfelt, 2001).

Heute unterscheiden wir folgende Mykorrhizatypen ( Peterson et al., 2004):

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Mykorrhiza-Typus Charakteristika Pilzpartner Pflanzenpartner

Hyphenmantel um Basidiomycotina, Bäume der Wurzeln, Hartig-Netz Ascomycotina, Gymno-/Angio- EKTOMYKORRHIZA (Hyphen interzellulär), Zygomycotina spermen Ausbildung von (Endogone) Rhizomorphen Hyphenmantel, Hartig- Basidiomycotina Ericaceae ARBUTOIDE Netz, intrazelluläre Noch (Arbutus und MYKORRHIZA Hyphen Handlungsbedarf Arctostaphylos), Pyrolaceae (Pyrola) Hyphenmantel, Hartig- Basidiomycotina Monotropaceae Netz paraepidermal, (Monotropa, MONOTROPOIDE kurze Hyphen aus Hartig- Sarcodes, MYKORRHIZA Netz penetrieren Pterospora) Rhizodermiszellen Hyphenmantel, Hartig- Ascomycotina Pinaceae (Pinus EKTENDO- Netz, hier intrazelluläre (Pezizales, und Larix) MYKORRHIZA Hyphen Leotiales) Ausbildung von „Haar- Ascomycotina Ericales wurzeln“, (Scytalidium) (Ericaceae, ERICOIDE Hyphenmantel(ähnlich), Oidiodendron, Epacridaceae, MYKORRHIZA intrazelluläre Hyphen in Myxotrichum, Empetraceae) Rhizodermiszellen Byssoascus Intraradikale Hyphen mit Angiospermen, VESIKULÄR- Arbuskel, Vesikel; Vertreter Gymnospermen, ARBUSKULÄRE Ausbildung von der Pteridophyten, MYKORRHIZA (VAM) Chlamydo – und Glomeromycota Bryophyten, Azygosporen Hydrophyten Peloton(Komplex von Rhizoctonia Nur Orchidaceae ORCHIDEENMYKOR- intrazellulären RHIZA Hyphenschleifen) DUNKEL SEPTIERTE Pigmentierte, septierte Ascomycotina Angiosperemen, PILZLICHE Hyphen intraradikal (Phialocephala Gymnospermen ENDOPHYTEN fortinii…) Desweiteren benennen andere Autoren weitere Mykorrhizatypen: Mykorrhiza-Typus Charakteristika Pilzpartner Pflanzenpartner Ausbildung von septierten Heterobasidio- Nur JUNGERMANNIOIDE Hyphenschleifen mycota Jungermanniidae MYKORRHIZA (Sebacinaceae, (Kottke et al., 2003) Tulasnella) Ähnelt der arbutoiden Sebacinales Cavendishia Mykorrhiza; Ausbildung nobilis Cavendishoide von „Haarwurzeln“ wie bei (Ericaceae) Mykorrhiza Vaccinioideae; lockeres (Setaro et al., 2006) Hartigsches Netz, aufgeblasene intrazelluläre Hyphen

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Mykorrhiza-Typus Charakteristika Pilzpartner Pflanzenpartner

PERITROPHE Hyphenmantel um die Vertreter von Bäume der MYKORRHIZA (Jahn Wurzel, der Pilz dringt hier Mucor, Angiospermen 1934) oder nicht in die Wurzel ein Penicillium Perimykorrhiza (Dörfelt, 2001) Merkmale wie VAM; Glomeromycota Ausgewählte „beaded“ Ausbildung von perlschnur- Angiospermen wie MYKORRHIZA artig angeordneten Wurzel- Acer platanoides, (Grand, 1969) knöllchen Cornus florida Ausbildung eines „Myce- Phialocephala Pinus resinosa, P. lium radicis atrovirens“ fortinii sylvestris durch parasitische Pilze bei mykorrhizierten Kiefern- Pseudomykorrhiza oder und Fichtenwurzeln; „Falsche Mykorrhiza“ Schädigung der Wurzel- (Melin, 1922; Lobanow, meristeme, Eindringen der 1960) Pilzhyphen in Zentral- zylinder; Hartig-Netz und Pilzmantel fehlen (Lobanow, 1960) Tab. 2: Zusammenstellung von Mykorrhizatypen

Brundrett (2004) veröffentlichte ein neues Klassifizierungssystem (Tab. 3) der Mykorrhiza, wo die Endomykorrhiza und Ektendomykorrhiza (wie bei Dörffelt, 2001) als terminologische Begriffe keinen Stellenwert besitzen (Abb.5). Die Ektendomykorrhizen arbutoide und monotropoide Mykorrhiza nach Dörfelt (2001) sind hier Subtypen der Ektomykorrhiza. Weiterhin unterteilt er in epidermale und kortikale Ektomykorrhiza. Die Orchideenmykorrhiza wird eingeteilt in Wurzel, Sproß und „Ausbeuter“-Mykorrhiza. Die vesikulär-arbuskuläre Mykorrhiza (VAM) teilt er in „linear“ und „gekeult“ ein, abgeleitet vom Verlauf der Pilzhyphen.

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Tab. 3: Klassifizierung der Mykorrhizatypen nach Brundrett (2004)

Vesikulär-arbuskuläre Mykorrhiza (VAM) Peyronel (1923) gab hier zum ersten Mal die Bezeichnung „Mykorrhizen mit Arbuskeln und Vesikeln“ oder „phykomyzetische Mykorrhizen“ ab. Davon abgeleitet entstand das Wort „Vesikulär-arbuskuläre Mykorrhiza“ (VAM).

Pilzpartner der VAM: Die Pilze, welche eine mutualistische Symbiose mit den Wurzeln der Pflanzen eingehen gehören zum Phylum Glomeromycota, Klasse Glomeromycetes mit einem monophyletischem Ursprung (Schüßler et al., 2001b) (Abb.6). Zusätzlich zu den bisher beschriebenen Gattungen in Abb. 4 wurden zwei neue Gattungen von Sieverding und Oehl (2006) beschrieben. Kuklospora in der Familie Acaulosporaceae und Intraspora in der Familie Archaeosporaceae. Beiden Gattungen besitzen als Basionym die Gattung Entrophospora. Zusätzlich zu den bisher bekannten Glomeromyzetengattungen wurde von Wu und Lin (1996, 1997) in der Familie Acaulosporaceae Jimtrappea als neue Gattung taxonomisch-systematisch beschrieben. Die neuesten molekularbiologischen Untersuchungen zur Entstehung der VAM-Pilze

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Archaeo- Ar. leptoticha spora & Ar. gerde- trappei mannii Geosiphon pyriforme

Acaulospora Paraglomus & Entropho- spora

Diversi- spora

Gigaspora & Scutellospora Paci- Glomus spora Gruppe A Glomus Gruppe B

Abb. 4: Molekulare Systematik der Glomeromyceten ergaben, dass sie etwa 1200 Millionen Jahre alt sind und somit noch vor den Landpflanzen mit 700 Millionen Jahren auf unserer Erde entstanden sind. Die terrestrischen VAM-Pilze könnten somit urprünglich in Symbiose mit Cyanobakterien gelebt haben, um an eine C-Quelle zu gelangen (Schüßler, 2004). Sie kommen global vor in den verschiedensten Biotopen, von der Arktik (Katenin, 1962) über die temperaten Zonen der beiden Hemispheren, den Tropen und bis in die Antarktis (Walker, 1987). Sie sind überwiegend ubiquitär verbreitet (Bagyaraj und Varma, 1995; Pannuri, 2002; Mukerji et al., 2003). Sie können in verschiedenen Lebensräumen gefunden werden: in Erdböden (Abbott und Robson, 1991), in Azygo- sporen von VAM-Pilzen (Koske, 1984), Pflanzensamen (Taber, 1982a,b; Arvanetes und Taber, 1984; Nasim und Edmonds, 1996), Rhizome (Taber und Trappe, 1982), Schuppenblätter (Taber und Trappe, 1982; Stasz und Sakai, 1984; Iqbal und Nasim, 1986), Laubblättern (Nasim und Zahoor, 1994b) und Wurzeln (Schenck und Smith,

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1982). Die Pilzsporen der Glomeromyceten werden per Definition beschrieben als Chlamydosporen bei Glomus, Azygosporen bei Gigaspora und Scutellospora (Morton und Benny, 1990). Eine neuere Interpretation der Sporenart veröffentlichen Goto und Maia (2006). Sie benennen alle Sporen von den Glomeromyzeten als „Glomerosporen“. Yao et al.(1996) bezeichnen hingegen die genannten Sporentypen bei Gigaspora und Glomus als Chlamydosporoide Sporen und für Acaulospora, Entrophospora und Scutellospora als zygosporoide Sporen. Die VAM-Sporen werden in der Regel einzeln oder in Sporokarpen im Boden und in Pflanzenwurzeln gebildet (Gerdemann, 1975). Die Sporen entstehen terminal oder lateral aus den Pilzhyphen (Mukerji et al., 2002). Die Sporen in Sporokarpen von Glomus versiforme werden hingegen an der Erdoberfläche (epigeisch) gebildet (Kendrick und Berch, 1985; Linderman, 1997). Ein weiterer Mechanismus der Sporenontogenie ist bei Glomus globiferum (Wu und Sylvia, 1993) und Glomus hyderabadensis (Rani et al., 2004) zu finden. Hier proliferieren Sporen auch aus bereits gebildeten Sporen. Die so gebildeten Tochtersporen ähneln in ihrer Struktur den Muttersporen. Verbreitet werden VAM-Sporen durch verschiedene Tierarten wie Ameisen (McIlveen und Cole Jr., 1976; Friese und Allen, 1993), Heuschrecken (Warner et al., 1987), Mil- ben (Rabatin und Rhodes, 1982), Regenwürmer (McIlveen und Cole Jr., 1976), Wespen (McIlveen und Cole Jr., 1976; Lakshman und Raghavendra, 1990), Vögel (McIlveen und Cole Jr., 1976) und Nagetiere (Maser et al., 1978, Allen und MacMahon, 1984, 1988; Janos et al., 1995). Gefressene und wieder ausgeschiedene Chlamydosporen von Glomus macrocarpus in verschiedenen Nagetieren waren nach der Darmpassage keimfähig (Trappe und Maser, 1976). Ein ähnliches Resultat von anderen VAM-Sporen wurde gefunden bei Isolaten aus Kot von Wespen und Regenwürmern (Rabatin et al., 1987; Lakshman und Raghavendra, 1990; Nasim und Zahoor, 1994a; Lee et al., 1996). Abiotische Faktoren wie Wind (Tommerup, 1982; Warner et al., 1985; Allen, 1987) und Wasser dienen ebenfalls der Verbreitung (Warner et al., 1987). Die Sporenanzahl im Erdboden nimmt mit zunehmender Tiefe ab (Sutton und Barron, 1972; Oehl et al., 2005). Die meisten VAM-Sporen kommen bis zu einer Tiefe von 20 cm vor (Sutton und Barron, 1972; Redhead, 1977; Sjöberg et al., 2004).

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Entwicklungszyklus (bei mykorrhizierbaren Phytobionten): Um die Lebensweise der VAM-Pilze besser zu verstehen, soll im folgenden ein allgemeiner Überblick darüber erstellt werden. VAM-Pilze sind obligat biotroph (Lewis, 1973; Azcón-Aguilar und Barea, 1998). In diesem Stadium können sie ihren Lebenszyklus unabhängig vom Phytobionten nicht abschließen. Es folgen verschiedene unterschiedliche Entwicklungsstadien.

• Asymbiotisches Wachstum: Die Sporen der VAM-Pilze sind polynucleotid und speichern Kohlenstoff meist in Form von Lipiden. Sie keimen im Erdboden, beeinflusst von verschiedenen abiotischen und biotischen Faktoren, aus. Die entstandenen Pilzhyphen werden Keimhyphen genannt. Diese können durch das Keimschild bei Acaulospora und Scutellospora, durch die Sporenwand bei Gigaspora oder durch die abgehende Hyphe bei Glomus, an derem Ende die Spore sich befindet, wachsen (Siqueira et al., 1985). Im weiterem Verlauf bilden sie ein Netzwerk aus verzweigten Pilzhyphen - dem extraradikalen Pilzmyzel, aus. Wurzelexudate (komplexes Gemisch von Flavonoiden und anderer molekularer Substanzen) des Phytobionten sind für die VAM-Pilze in dieser Phase ein bedeutender Faktor in der Erkennung ihres Partners und beeinflussen die Topologie der sich entwickelnden Pilzhyphen (Bécard et al., 2004). Bécard et al. (2004) zeigte dies eindrucksvoll in Experimenten mit Wurzel-Organ in vitro Kulturen. Einem Verfahren, wo der Ablauf der Besiedlung vollständig strukturell dokumentiert werden kann und gezielt biochemische Substanzen zur Anwendung kommen (Fortin et al., 2002). Diesem präinfektiösem Wachstum folgt der Kontakt des Pilzes zum pflanzlichem Partner.

• Ausbildung von Appressorien: Die sogenannten Laufhyphen, neben den Absorptionshyphen des extraradikalen Myzels, initiieren die Penetrationshyphen, welche die Wurzeln des Phytobionten penetrieren (Allen, 1991). „Penetration“ bedeutet bei der VAM, Pilzhyphen durch- queren Zellen (Boullard und Ferchau, 1962). An den Penetrationshyphen werden terminal Appressorien entwickelt. Das Appressorium wird nach Frank (1883) definiert als Anschwellung einer Keimhyphe

19 Einleitung oder Hyphe, speziell für die Anheftung an die Rhizodermis der Wurzel in der frühen Phase der Infektion.

• Frühe Besiedlungsphase der Wurzel: Die VAM-Pilze besiedeln unterhalb des Wurzelapex hauptsächlich die Zellen des Rindenparenchyms. Die Pilzhyphen können hierbei inter- und/oder intrazellulär verlaufen (Brundrett, 1991).

• Entwicklung von Arbuskeln und/oder Vesikeln: Pilzliche Organe wie Arbuskeln als Ort des Nährstoffaustausches werden entwickelt in der Wurzel. Sie sind durch eine periarbuskuläre Membran von der pflanzliche Zelle getrennt (Harrison, 1999). Vesikeln werden intra- und/oder interzellulär terminal bzw. interkalar entwickelt (Boullard, 1956). Beide Organe werden von verschiedenen Seneszenzerscheinungen heimgesucht. Arbuskeln werden verdaut und umgewandelt. Hierbei gibt es verschiedene Formen der Verdauung – Ptyophagie, Thamniscophagie, Tolypophagie (Burgeff, 1943). Vesikeln speichern Lipide, besitzen viele Zellkerne und können als Sporen funktionieren (Boullard, 1956).

• Entwicklung von extraradikalem Pilzmyzel und Sporen: Extraradikale Pilzmyzelien können im Erdreich Dimensionen von mehreren Metern erlangen. Giovannetti et al. (2002) veröffentlichten dazu ein Zahlenwerk von verschiedenen Messungen. Dieses Netzwerk besteht aus verschiedenen Typen von Hyphen, die weitere Wurzeln infizieren können oder auf der Oberfläche der Wurzeln entlang wachsen (Friese und Allen, 1991)

• Wurzelseneszenz: Die Wurzel stirbt ab und die darin vorkommenden Pilzhyphen können erneut Wurzeln infizieren (Tommerup und Abbott, 1981).

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Pflanzlicher Partner: Nach Vorliegen fossiler Funde von Rhynia (Kidston und Lang, 1921; Remy et al., 1994) und molekularbiologischer Analysen ribosomaler Gene (Simon et al., 1993) nimmt man an, das Glomus-ähnliche Pilze bereits vor 400 - 500 Millionen Jahren entstanden waren. Die Fossilien von Rhynia weisen in ihren Wurzeln Arbuskel, Hyphen (Remy et al. ,1994) und Vesikel (Kidston et al., 1921) von VAM-Pilzen auf. 90% aller lebenden Pflanzen sind charakterisiert durch die Mykorrhizaform VAM (Khan, 1972b; Kendrick und Berch, 1985; Mehrotra, 1997). Schaut man sich genauer einzelne Taxa und Lebensformen an, so werden verschiedene Vertreter von Pterido- phyten (Boullard, 1957; Hepden, 1960; Cooper, 1976; Berch und Kendrick, 1982; Zhao, 2000; Lee, 2002; Zhang et al., 2004), Epiphyten (Bermudes und Benzing, 1989; Janos, 1993; Rabatin et al., 1993; Rains et al., 2003), parasitische Blütenpflanzen (Khalid und Iqbal, 1992, 1996), Xerophyten und Halophyten (Khan, 1974) von verschiedenen VAM-Pilzen besiedelt und bilden verschiedene pilztypische Strukturen aus. Neben terrestrischen Pflanzen werden auch Pflanzen in Gewässern von verschiedenen VAM-Pilzen besiedelt (Iqbal et al., 1988; Bareen, 1990; Beck-Nielsen und Madsen, 2001). Weiterhin gibt es Befunde, dass bestimmte Pflanzenarten/gruppen nicht mykorrhiziert werden, z. B. Vertreter in der Familie Brassicaceae, Proteaceae (Banksia) mit proteoiden Wurzeln (Malajczuk und Bowen, 1974; Malajczuk et al., 1981), Urticaceae (Urtica dioica) (Vierheilig et al., 1996) und bei Karnivoren (Stahl, 1900).

Struktur: Es gibt verschiedene Typen, welche strukturell die VAM-Pilze in den Pflanzen näher beschreiben, um die VAM näher zu charakterisieren und um Aussagen zur Progression mycotropher Lebensweisen zu erhalten. Gallaud (1904) definiert 4 Strukturtypen : Arum- und Paris-Typ, bezeichnet nach den Pflanzenarten Arum maculatum L. und Paris quadrifolia L., wo er die Pilze in den Wurzeln näher beschreibt: Arum-Typ: 1. Pilzhyphen verlaufen intrazellulär in der Rhizo- und Exodermis und nach Passage dieser Gewebe interzellulär in der Wurzel

21 Einleitung

2. sie enden in Zellen des Rindenparenchyms im allgemeinen mit einfachen Arbuskeln, 3. deren Entstehung das Wachstum und die Ausbreitung der Pilzhyphen beendet 4. es gibt keine definierte Lokalisation der Arbuskel im Wurzelcortex Hierbei beschreibt Gallaud (1904) das einfache Arbuskel: Eine Pilzhyphe penetriert eine Zelle des Rindenparenchyms. Daraufhin verzweigt sich diese und bildet durch wiederholte regelmäßige Dichotomien immer dünnere Pilzhyphen. Wegen der allgemeinen Form, das an einen kleinen verzweigten Baum (im Französischen „arbre“) erinnert, nennt Gallaud (1904) diese Struktur „Arbuskel“. Da alle Hyphen des Arum- Typs mit einem Arbuskel enden und so das Längenwachstum der arbuskeltragenden Hyphen beendet, bezeichnet er diese als einfache Arbuskel. Paris-Typ: 1. Das Pilzmyzel ist immer intrazellulär in der Wurzel, 2. trägt in definierten Zelllagen zusammengesetzte Arbuskel („d’arbuscules composés“), lateral an den Pilzhyphen 3. die Pilzhyphen besitzen ein unbestimmtes Wachstum. Das „zusammengesetzte Arbuskel“ definiert Gallaud (1904) wie folgt: Die Pilzhyphe penetriert die Pflanzenzelle und bildet nicht sofort ein Arbuskel oder eine Sporangiole, wie der pilzliche Endophyt des Arum-Typs es zeigt. Sie verzweigt sich mehrere Male und verwickelt ihre Äste so als ob sie ein Knäuel bilden würde ohne dass der Durchmesser der Hyphen sichtbar abnimmt. Nur auf diesen dichtgedrängten Sekundärzweigen bilden sich die feinen Verzweigungen der Arbuskel und Sporangiolen. Das ganze eingebettet im Zytoplasma der Zelle bildet eine kompakte Masse aus dicken und dünnen Pilzhyphen, bei der es unmöglich ist jedes einfache Arbuskel oder Sporangiole dem Ast zu zuordnen, an dem es entstand. Sein Hauptmerkmal ist, dass es nicht terminal an der Pilzhyphe entsteht, von der es ausgeht. Diese Pilzhyphe kann somit weiterwachsen und neue Zellen des Wurzelcortex infizieren. Die zwei folgenden Strukturtypen ähneln dem Paris-Typ, Lebermoos-Typ und der Orchideen-Typ. Gallaud (1904) stellt bei verschiedenen Vertretern der Ranunculaceae Übergänge des interzellulären in den intrazellulären Verlauf der Pilzhyphen im Wurzelcortex fest. Er

22 Einleitung erstellt aber dafür keinen weiteren Strukturtyp. Smith und Smith, 1997; Yamato, 2004; Zhang et al., 2004; Ahulu et al., 2005 prägen dafür den Begriff „Intermediate type“, zu denen es unterschiedliche Interpretationen gibt (Smith und Smith, 1997; Zeuske et al., 1999; Dickson, 2004; Yamato, 2004 und Ahulu et al., 2005). Das Vorkommen der Arum- und Paris-Typen bei verschiedenen Ordnungen, Familien, Gattungen und Arten der Pflanzen ist divers. Kubota et al. (2005) und Wu et al. (2004) fanden im gleichen Wurzelsystem in verschiedenen Bereichen jeweils VAM-Pilze mit Arum- bzw. Paris-Strukturtyp ohne Merkmale des intermediären Strukturtyps.

Einflüsse des Pilzpartners auf die Pflanzen Diese meist mutualistische Lebensgemeinschaft zwischen Pilzen und Pflanzen birgt viele Vorteile für den pflanzlichen Partner in den vielfältigsten Lebensbereichen. Im folgenden möchten wir einige Bespiele dazu näher erläutern, um die Bedeutung der Pilze für die Pflanze herauszustellen.

• Erhöhte Aufnahme von lebensnotwendigen Nährstoffen: Phosphor ein Mineralelement, das stark immobil im Boden vorkommt und bei Mangelerscheinungen in Pflanzen das Wachstum und die Reproduktion limitiert, wird durch die VAM–Pilze in den Pflanzen zur Verfügung gestellt. Hierbei nimmt das extraradikale Pilzmyzel dieses Mineralelement auf und transportiert es in die Pflanze (Dodd et al., 2000). Stecklingsvermehrte Pflanzen (Taxus baccata L.) inokuliert mit VAM-Pilzen nahmen verstärkt P, K, Ca, Mg, Cu und Zn auf (Iglesias et al., 2004).

• Erhöhung der pflanzlichen Biomasse: Das gesamte Trockengewicht von Wurzeln und Spross war bei inokulierten Sämlingen von den medizinischen Pflanzen Artemisia dracunculus L., Ocimum basilicum L., Salvia officinalis L. und Thymus vulgaris L. mit Glomus mosseae nach drei Monaten signifikant erhöht als bei Pflanzen ohne VAM-Pilze (Camprubi et al., 1990). Die Konzentration von essentiellen Ölen, davon speziell Limonen und Karvon, in den wichtigen Nutzpflanzen (als Nahrungsmittel und für die Pharmazie) Anethum graveolens L. („Dill“) und Trachyspermum ammi (L.) („Ajowan“) waren signifikant

23 Einleitung erhöht bei inokulierten Pflanzen mit Glomus macrocarpum im Vergleich zu G. fasciculatum und den nichtinokulierten im Feld (Kapoor et al., 2002b). Ein weiteres Feldexperiment mit G. fasciculatum und Mentha arvensis zeigte auch erhöhte Gehalte wichtiger essentieller Öle und eine Erhöhung der gesamten Biomasse im Vergleich zu nicht-mykorrhizierten Pflanzen (Gupta et al., 2002). Versuche im Gewächshaus ergaben eine Erhöhung der Biomasse mit verschiedenen VAM-Pilzarten. Durch die Zugabe von Phosphat nahm die Biomasse im Vergleich zur Kontrolle ab (Freitas et al., 2004). In einem Topfkulturexperiment mit Coriandrum sativum L. konnte auch die Konzentration essentieller Öle durch Glomus macrocarpum und G. fasciculatum erhöht werden (Kapoor et al. 2002a). Der Gehalt an medizinisch bedeutenden Lignanen, wie Podophyllotoxin in Podophyllum peltatum L. war ebenso stark erhöht nach Inokulation mit Gigaspora ramisporophora im Vergleich zur Kontrolle (ohne VAM-Pilz) (Moraes et al., 2004). Eine erhöhte Akkumulation von lebensnotwendigen Mineralelementen N, Ca und Mg verbunden mit einem verbesserten Wachstum wurde bei Sämlingen von Coffea arabica L. mit Glomus intraradices erzielt (Vaast und Zasoski, 1992).

• Resistenz gegen Wurzelpathogene: Nutzpflanzen, die mit VAM-Pilzen assoziiert sind können ihre Resistenz gegenüber wurzelinfizierender Phytopathogene wie Phytophthora (Cordier et al., 1996; Norman et al., 1996), Fusarium und Olpidium brassicae (Schönbeck und Dehne, 1979) und wurzelinvasiver Nematoden erhöhen (Schönbeck, 1978; Linderman, 1994).

• Toleranz von Umweltstress: Bewurzelte Stecklinge von Rosmarinus officinalis L., die einem Wasserstress (Aussetzen der Bewässerung) ausgesetzt waren, wurden mit Glomus deserticola inokuliert. Sie sind durch eine verbesserte Photosyntheseaktivität, eine Verminderung des osmotischen Potentials bei vollen Turgor und einem erhöhten Chlorophyllgehalt im Vergleich zu Pflanzen ohne VAM-Pilze charakterisiert (Sánchez-Blanco et al., 2004). Höhere Frisch- und Trockengewichte und P-Gehalte konnten bei inokulierten Jungpflanzen von Triticum aestivum L. festgestellt werden, welche unter Wasserstress (hier: Wassermangel) kultiviert wurden (Al-Karaki et al., 2004). Ein ähnliches Resultat eines verbesserten Wachstums mit höheren Gehalten an Mineralelementen (wie P)

24 Einleitung wurden bei inokulierten Pflanzen von Lycopersicon esculentum L. in Böden mit erhöhten Salzkonzentrationen gefunden (Al-Karaki, 2000). Augé (2001) erstellt speziell zu trockengestressten mykorrhizierten Pflanzen einen sehr facettenreichen Überblick zu den Wirkungen bzw. Einflüssen ihrer pilzlichen Partner.

Mikrovermehrte Pflanzen aus Pflanzengewebekulturen wachsen besser und sind durch eine höhere Überlebensrate gekennzeichnet, wenn sie nach der in vitro-Vermehrung mit VAM-Pilzen inokuliert werden. Dabei wird der entstehende Transplantationsstress, womit das Umsetzen der Pflanzen in andere Kulturmedien gemeint ist, reduziert und die Akklimatisierung verbessert (Sbrana et al., 1994; Varma und Schuepp, 1995; Bingye und Shengrui, 1998; Matsubara et al., 1998). Eine Anwendung mit VAM-Pilzen ist hier auch bei kommerziell genutzten Heilpflanzen möglich (Grotkass et al., 2000; Lata et al., 2003).

• Funktion als Bioregulatoren: VAM-Pilze können das Wurzelsystem des Phytobionten modifizieren, so dass mehr verzweigte Wurzeln mit kürzeren Lateralwurzeln ausgebildet werden, die das Erdreich effizienter besiedeln (Schellenbaum et al., 1991; Tisserant et al., 1992; Berta et al., 1995). Ein weiterer Einfluss auf die Entwicklung der Pflanze kann die Erhöhung der Anzahl von Blüten sein (Gianinazzi et al., 1990).

Aus den bisher genannten Eigenschaften dieser Lebensgemeinschaft ergibt sich eine bedeutende Rolle in der praxisorientierten Anwendung der VAM-Pilze, namentlich für Zier-, Nutz- oder Heilpflanzenanbauer, was in besonderem Maße dann und für Eleutherococcus gilt. Maeda (1954), Lee und Koo (1983) und Ueda et al. (1992) fanden bereits heraus, das Wurzeln von verschiedenen Eleutherococcus-Arten (E. senticosus, E. sessiliflorus und E. spinosus), gesammelt im Freiland, durch das Vorhandensein der VAM charakterisiert sind.

25 Einleitung

1.7. Zielsetzung Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, neben allgemeinen Fragen zur Biologie von Eleutherococcus auch die zur Mykorrhizierung und zur Vermehrung von Eleutherococcus zu versuchen zu beantworten. Es sollte damit nicht nur ein Beitrag zur Erweiterung unserer Kenntnisse zur Biologie von Eleutherococcus geliefert werden, sondern darüber hinaus auch hilfreiche Unterstützungen beim Anbau und für den Artenschutz möglich sein.

26 Material und Methoden

2. Material und Methoden

2.1. Untersuchtes Pflanzenmaterial

Pflanzenart Probenmaterial Herkunft Eleutherococcus divaricatus Laubblätter, Sprossstecklinge, Botanischer Garten Marburg (Siebold & Zucc.) S.Y. Hu Wurzelproben Wurzelproben Botanischer Garten Prag (Tschechien) Wurzelproben Horsholm Arboretum (Dänemark) Wurzelproben Rogow Arboretum (Polen) E. gracilistylus (W.W. Sm.) Wurzelproben Botanischer Garten Beijing (VR S. Y. Hu China) Laubblätter, Sprossstecklinge, Botanischer Garten Marburg Wurzelproben E. henryi Oliv. Laubblätter, Sprossstecklinge, Botanischer Garten Marburg Wurzelproben Wurzelproben Rogow Arboretum (Polen) E. henryi var. nana Wurzelproben Botanischer Garten Montreal (Browicz und Bugala, 1958) (Kanada) E. lasiogyne (Harms) Laubblätter, Sprossstecklinge, Botanischer Garten Marburg S.Y. Hu Wurzelproben Wurzelproben Botanischer Garten Prag (Tschechien) E. lasiogyne x E. sessili- Laubblätter, Sprossstecklinge, Botanischer Garten Marburg florus (Frank, 1983) Wurzelproben E. leucorrhizus Oliv. Wurzelproben Rogow Arboretum (Polen) E. senticosus (Rupr. & Wurzelproben Botanischer Garten Darmstadt Maxim.) Maxim. Wurzelproben Botanischer Garten Prag (Tschechien) Wurzelproben Rogow Arboretum (Polen) E. setchuenensis (Harms) Wurzelproben Nationalpark Longchi (VR China) Nakai E. sieboldianus (Makino) Wurzelproben, Laubblätter Beal Botanical Garden, Lansing Koidz. (USA)

2.2. Entnahme, Fixierung und Lagerung der Wurzelproben

Die Wurzeln der verschiedenen Eleutherococcus-Arten für Untersuchungen zur Mykorrhiza gruben wir aus einer Bodentiefe von 10 cm aus und reinigten diese anschließend von Erdpartikeln. Die gereinigten Wurzeln wurden in FPA (37% (v/v) Formaldehyd, 96% (v/v) Ethanol und Aqua dest. im Verhältnis 1:1:9:9) fixiert. Nach 3 Wochen erfolgte die Lagerung der fixierten Wurzelproben in 70% (v/v) Ethanol.

27 Material und Methoden

2.3. Anatomische Untersuchungsmethoden

2.3.1. Lichtmikroskopie

Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen sowie die mikrophotographischen Dokumentationen der trypanblaugefärbten bzw. eingebetteten Schnitte verwendeten wir ein Leitz-Mikroskop DMRB mit Digitalkamera Leica DFC 280 (Leica, Wetzlar). Für die Interferenzkontrastmikroskopie kam ein Konfokales Laserscan-Mikroskop (Leica TCS SP2) zum Einsatz. Wir erstellten den Videofilm mit Hilfe einer Schwarz-Weiß-Videokamera (VCB- 3100P, B/W CCD Camera, Sanyo). Das Computerprogramm Adobe Premiere Pro 1.5 diente dabei zur Bearbeitung und Speicherung des Videofilms auf DVD (Digital Video Disc).

2.3.2. Trypanblaufärbung

Für den schnellen lichtmikroskopischen Nachweis einer Besiedlung von Wurzeln in Form von Pilzhyphen, Arbuskeln und Vesikeln kam die Trypanblaufärbung nach Phillips und Hayman (1970) zur Anwendung. Diese Methode kann bei Frischmaterial und fixiertem Pflanzenmaterial benutzt werden.

2.3.3. Herstellung von Semidünnschnitten in Technovit

Wir entwässerten 5 mm lange Wurzelstücke über eine dreistufige Ethanolreihe (80%, 90% und 96% (v/v)) für jeweils 30 min. Die entwässerten Wurzelproben überführten wir danach für drei Tage in eine Infiltrationslösung bestehend aus 50 ml „Basic-Resin“ und 0,5 g Aktivator aus dem Kit „Technovit 7100“ (Heraeus Kulzer GmbH & Co. KG, Wehrheim). Die Einbettung erfolgte in Teflonschälchen mit Infiltrationslösung und Härter (Dimethylsulfoxid) im Verhältnis 6 ml zu 0,4 ml. Nach drei Tagen im Wärmeschrank klebten wir die Proben mit Sekundenkleber auf Metallhalter auf und schnitten mit Glasmessern (Ultramicrotome glass, 16 Inch, 6mm) an einem Semidünnschnittmikrotom (Supercut 2065, Fa. Reichert-Jung) diese quer bzw. längs. Die Glasmesser brachen wir mit einem Messerbrecher LKB Histoknifemaker 2078. Die

28 Material und Methoden

4 bis 6 µm dicken Schnitte wurden auf einen Wassertropfen überführt, der sich auf mit Glyzerin beschichteten Objektträger befand. Der so behandelte Objektträger wurde auf einer Heizplatte (70°C) getrocknet, gefärbt mit Toluidinblau-Lösung (1g Toluidin, 1g Borax in 100 ml Aqua dest.) und anschließend in Aqua dest. gewaschen. Zur Herstellung von Dauerpräparaten tauchten wir die Schnitte für 10 min in Xylol, deckelten dann mit Corbitbalsam ein und trockneten diese im Wärmeschrank (40°C) für drei Tage.

2.3.4. Herstellung von Paraffinschnitten

5 mm lange Wurzeln wurden in einer elfstufigen Butanolreihe nach Gerlach (1984) dehydriert. Dabei blieben die Wurzelproben für jeweils eine Stunde in einer Butanolstufe. Nach der letzten Butanolstufe inkubierten wir die Proben für zwei Tage in flüssigem Paraffin (60°C). Danach erfolgte die Einbettung der Wurzelproben in mit Glyzerin beschichteten und mit Paraffin gefüllten Porzellanschälchen, die anschließend in den Kühlschrank gestellt wurden. Nach Erkalten des Paraffins schnitzten wir rechteckige Blöckchen mit einer trapezförmigen Fläche je Wurzelprobe daraus und befestigten diese mit flüssigem Paraffin auf Holzblöckchen. Mit einem Rotationsmikrotom (Leitz 1512) wurden Serienschnitte (12 µm dick) angefertigt. Die erhaltenen Serienschnitte legten wir auf einem mit Eiweiß-Glyzerin beschichteten und mit Aqua dest. benetzten Objektträger und trockneten diese dann auf einer Wärmeplatte (35°C). Die getrockneten Schnitte wurden für 10 min in Xylol entparaffiniert, in Propanol und einer absteigenden Ethanolreihe (Gerlach, 1984) für jeweils 2 min hydriert. Die hydrierten Schnitte färbten wir in Astrablau für 10 min, in Auramin für 3 min und in Safranin für 30 s (Gerlach, 1984). Nach dieser Dreifachfärbung erfolgte eine Spülung der Schnitte in Aqua dest., um die überschüssigen Farbstoffe zu entfernen. Danach dehydrierten wir die gespülten Schnitte in einer aufsteigenden Ethanolreihe für jeweils 2 min und überführten diese in Xylol. Zur Herstellung von Dauerpräparaten wurden die Schnitte mit Corbitbalsam eingedeckelt und im Wärmeschrank ( 40°C) für drei Tage getrocknet.

29 Material und Methoden

2.3.5. Nachweis verschiedener Inhaltsstoffe

Für den Nachweis von Inhaltsstoffen (Suberin, Stärke und Lipide) wurde geschnittenes Pflanzenmaterial (frisch oder mit FPA fixiert) mit spezifischen Reagenzien nach Gerlach (1984) behandelt.

2.3.6. Nachweis der Zellkerne

Die Inkubation des Untersuchungsmaterials erfolgte für 10 min in einer DAPI (4',6- Diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid)-Lösung (1 µg/ml). Die erhaltenen Präparate betrachteten wir im Fluoreszenzmikroskop (Leitz Periplan GF 12,5X TL).

2.3.7. Nachweis von aktiv bewegenden Mikroorganismen

Hier wurde der Farbstoff DASPMI (Dimethylaminostyrylmethylpyridiniumiodin) nach der Methode von Bereiter-Hahn (1976) verwendet.

2.3.8. Rasterelektronmikroskopie (REM)

5 mm lange Wurzeln dehydrierten in Ethylenglykolmonoethylether für eine Stunde. Dann erfolgte eine zweimalige Inkubation der Proben für jeweils 30 min in Azeton. Zum Trocknen der Proben wurde die „Critical-Point-Methode“ nach Anderson (1951) verwendet. Der Sputtercoater (Balzers Union) bedampfte die getrockneten Proben mit Goldstaub. Die so behandelten Proben konnten anschließend mit Hilfe des Rasterelektronenmikroskopes (Hitachi S 350) untersucht werden.

2.4. Kultivierung von Laubblättern und Sprossstecklingen

2.4.1. Bewurzelung von Laubblättern und Fiederblättchen Jeweils 50 Laubblätter bzw. Fiederblättchen von Eleutherococcus gracilistylus, E. divaricatus, E. henryi, E. lasiogyne, E. lasiogyne x E. sessiliflorus wuchsen in gewaschenen Flusssand bei 23°C in Minigewächshäusern aus Polyvinylchlorid (PVC) (Wiesauplast Kunststoff und Formenbau GmbH & Co. KG, Wiesau) und in mit abgekochtem Leitungswasser gefüllten Filmdosen.

30 Material und Methoden

Laubblätter von Eleutherococcus gracilistylus kultivierten wir weiterhin ohne Blatt- basis bzw. Fiederblättchen ohne Fiederstiel.

2.4.2. Behandlungen mit Rotlicht

Wir kultivierten Blattrisslinge von Eleutherococcus gracilistylus, E. divaricatus, E. henryi, E. lasiogyne, E. lasiogyne x E. sessiliflorus in Sand und unter Rotlicht (OSRAM L58 W/60 Red, Intensität 35 µE/m2s1) bei 23°C. In Peuke-Medium (Peuke, 1987), abgefüllt in Filmdosen, wurden Blattrisslinge unter den genannten Bedingungen zusätzlich kultiviert.

2.4.3. Vermehrung von Sprossstecklingen

Jeweils 50 Sprossstecklinge von Eleutherococcus gracilistylus, E. divaricatus, E. henryi, E. lasiogyne, E. lasiogyne x E. sessiliflorus wurden im Freiland geerntet, an der Basis schräg angeschnitten, die Fiederblättchen halbiert und in gewaschenen Flußsand bzw. Torfpellets „Jiffy-7C Peat Pellets“ (Jiffy Products GmbH, Mölln) bei 23 °C unter Weißlicht in Minigewächshäusern (Wiesauplast Kunststoff und Formenbau GmbH & Co. KG, Wiesau) kultiviert. IES (Indol-3-essigsäure) suspendierten wir in Lanolin und trugen es auf die Schnittstellen der Sprossstecklinge auf. Die Sprossstecklinge bestanden aus Teil- bzw. Kopfstecklingen. Die Kopfstecklinge sind Abschnitte der Sprossachse mit Sprossapex im Gegensatz zu Teilstecklingen.

2.5. Etablierung einer Pflanzengewebekultur von Eleutherococcus sieboldianus (Makino) Koidz.

• Pflanzenmaterial: Adulte Laubblätter von 1 Jahre alten bewurzelten Sprossstecklingen sammelten wir im März 2001 im Gewächshaus für die Etablierung einer Pflanzengewebekultur. Einzelne Fiederblättchen und Blattbasen wurden oberflächensterilisiert und auf verschiedene Nährmedien gelegt.

31 Material und Methoden

• Desinfektion: Die geernteten Laubblätter wurden für jeweils 10 min mit 0,25 % (v/v) Quecksilberchloridlösung, supplementiert mit einem Tropfen Detergens (Tween 80), gewaschen. Nach der Desinfektion erfolgte eine dreimalige Spülung der behandelten Laubblätter mit sterilem Aqua dest.. • Kultivierung auf Nährmedien: Aus oberflächengereinigten Fiederblättchen wurden in 1 x 1 cm große Explantate geschnitten und einzelne Blattbasen von Blattstielen abgetrennt. Die so erhaltenen Pflanzengewebeproben wurden auf das Nährmedium GaV (Nährmedium B5 nach Gamborg et al. (1968) mit 200 mg/l Spermidin, 1,5 mg/l 2,4-Dichlorphen- oxyessigsäure (2,4-D), 0,1 mg/l 1-Naphthylessigsäure (NAA), 0,1 mg/l Indol-3- buttersäure (IBA) und 0,25 mg/l Kinetin) für die Induktion von embryoidogenen Kallus gelegt und bei 23°C ± 2°C im Dunkeln kultiviert. Nach elf Monaten hatte sich ein embryoidogener Kallus gebildet. Dieser Kallus wurde für zwei Monate auf dem gleichen Nährmedium mit halber Konzentration von Wachstumsregulatoren weiterkultiviert. Nach Ausbildung von globulären Embryoiden subkultivierten wir diese auf dem Nährmedium A3 (Basalnährmedium nach Linsmaier und Skoog (1965) mit 0,15 mg/l 6-Benzylaminopurin (BAP) 0,03 mg/ l Kinetin, 0,001 mg/NAA und 0,5 mg/l GA3 ) im Tageslicht bei 23°C ± 2°C. Die auf diesem Nährmedium ergrünten Embryoide des Torpedostadiums (Embryoide mit gestrecktem Hypokotyl) legten wir auf Nährmedium A3 ohne Wachstumsregulatoren gelegt, um Wurzeln und Laubblätter zu induzieren. Einen Monat alte bewurzelte Pflänzchen wurden in einer Knop-Nährlösung (Knop, 1865) hydroponisch subkultiviert und nach einem Monat in aufgequollene Torfpellets „Jiffy-7C Peat Pellets“ (Jiffy Products GmbH, Mölln) gepflanzt und im Gewächshaus weiter kultiviert.

2.6. Isolation und Kultivierung von Mikroorganismen

1 cm lange Segmente von Wurzeln mit Wurzelhaaren von einem Monat alten in vitro vermehrten Eleutherococcus sieboldianus Pflanzen wurden auf 20 E Medien gelegt und

32 Material und Methoden bei 28°C für drei Tage im Dunkeln bebrütet. Die Herstellung des Mediums 20 E erfolgte nach der Rezeptur von Werner et al. (1975). 2.7. Topfkultivierung und Inokulation mit Glomus intraradices in vivo

2.7.1. Inokulumgewinnung

Drei Monate alte Pflanzen von Tagetes patula L., kultivierten wir in steriler Einheitserde Typ T (Balster Einheitserdewerk GmbH, Fröndenberg) mit Sporen des Pilzisolates Glomus intraradices H 11/3 Schenck und Smith aus der Kultursammlung von Dr. von Alten (Universität Hannover, Institut für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz, Herrenhäuserstraße 2, 30419 Hannover). Vier Monate später wurden die Pflanzen dekapitiert und nicht mehr bewässert. Nach weiteren zwei Monaten wurde aus dem trockenen mykorrhizierten Wurzelsystem und dem anhaftenden Erdsubstrat ein Inokulum für weiterführende Inokulationsexperimente hergestellt.

2.7.2. Inokulationsexperiment mit Eleutherococcus sieboldianus

Jeweils 30 mikrovermehrte zwei Monate alte Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus wurden in autoklavierten Tontöpfen (Durchmesser 10 cm), gefüllt mit steriler Einheitserde Typ T (Balster Einheitserdewerk GmbH, Fröndenberg) mit (10g) bzw. ohne Inokulum (Kontrolle), im Gewächshaus bei Temperaturen zwischen 20°C – 25°C für sechs Monate kultiviert.

2.7.3. Inokulationsexperiment mit Eleutherococcus gracilistylus

Einen Monat alte bewurzelte Blattrisslinge von Eleutherococcus gracilistylus wuchsen für ein Jahr in „Oil Dri US Special“ (Damolin GmbH, Mettmann) gemischt mit Inokulum und Knochenmehl in Minigewächshäusern aus PVC (Wiesauplast Kunststoff und Formenbau GmbH & Co. KG, Wiesau). („Oil Dri US Special“ ist ein fein granuläres Attapulgitgestein.) Die Minigewächshäuser standen im Gewächshaus bei einer Temperatur von 20°C – 25°C.

33 Material und Methoden

2.8. Kultur von Gigaspora margarita und Inokulation in vitro 2.8.1 Inokulumgewinnung Einen Monat alte Sämlinge von Plantago lanceolata L. wurden in autoklavierten Tontöpfen (Durchmesser 10 cm) mit „Oil Dri US Special“ (Damolin GmbH, Mettmann), Knochenmehl (5g/1kg Substrat) und einzelnen Sporen von Gigaspora margarita Becker und Hall für sechs Monate im Gewächshaus kultiviert. Die Kulturen der verwendeten Sporen stammen aus der Arbeitsgruppe von Prof. Smith (Department of Soil and Water, Adelaide University, Waite Campus, PMB 1, Glen Osmond, South Australia 5064, Australia)

2.8.2. Desinfektion

Wir sterilisierten die Oberfläche der isolierten Sporen aus der Inokulumkultur mit verschiedenen Antibiotika nach der Methode von Mertz et al. (1979).

2.8.3. In vitro Kulturmedien für Gigaspora margarita

Auf 1,5% (w/v) Wasseragarmedium (pH 6,8) mit und ohne Aktivkohle (5g/l) ausgelegt oberflächensterile Sporen brachten wir zur Keimung bei 30°C im Dunkeln. Experimente zum Gravitropismus wurden mit 1,5% (w/v) Wasseragarmedium durchgeführt. Für die Inokulation von einem Monat alten mikrovermehrten Pflänzchen von Eleutherococcus sieboldianus verwendeten wir das Minimal-Medium nach Bécard und Fortin (1988). Die Pflanzen wurden in Plastikpetrischalen (9 cm Durchmesser) bei 20– 25 °C im Gewächshaus kultiviert.

2.8.4. Inokulation von in vitro vermehrten Eleutherococcus sieboldianus mit Gigaspora margarita

Auf sterilen Zellglasstücken gelagerte ausgekeimte oberflächensterile Sporen wurden 1 cm von der Wurzel von Eleutherococcus sieboldianus entfernt auf das Minimalmedium gelegt und im Gewächshaus bei 20 °C – 25 °C kultiviert.

34 Material und Methoden

2.9. Wachstumsparameter

Das Frischgewicht der von Erdsubstrat befreiten Pflanzen (Wurzel und Spross) bestimmten wir direkt nach der Ernte. Für die Ermittlung des Trockengewichtes wurden die gereinigten Pflanzen drei Tage lang bei 105 °C im Wärmeschrank getrocknet. Das Gewicht blieb nach dieser Trocknung konstant. Die Zahl der Laubblätter und die Länge von Wurzel und Spross ermittelten wir unmittelbar nach der Ernte.

2.10. Statistik

Für die statistischen Auswertungen der Messungen von Wachstumsparametern verwendeten wir das Computerprogramm „Systat -Version 11“. Hierbei wurde der „T- Test“ bei zwei voneinander unabhängigen Versuchen angewendet.

2.11. Molekularbiologische Bestimmung der Glomeromyzeten an Wurzeln aus dem Freiland

Jeweils 20 Wurzeln von 1 cm Länge im primären Entwicklungsstadium wurden von E. divaricatus, E. henryi, E. lasiogyne, E. lasiogyne x E. sessiliflorus aus dem Botanischem Garten Marburg und von E. senticosus aus dem Botanischem Garten Darmstadt gesammelt, gereinigt in 2% (v/v) Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Lysispuffer (nach Weising et al., 1995), fixiert und gelagert. Die Desoxyribonukleinsäure (DNS) wurde mit Hilfe des Quiagen Dneasy Plant Mini Kit (Quiagen, Basel, Schweiz) nach der Gebrauchsanleitung extrahiert und in 100 µl Elutionspuffer eluiert. Ein Fragment (~550 bp) der ribosomalen DNS (rDNS) von der kleinen Untereinheit 18S wurde amplifiziert mit PCR (polymerase chain reaction) bestehend aus Taq-DNS-Polymerase (Fermentas, Vilnius, Litauen), einem universellen eukaryotischen Primer NS31 (Simon et al., 1992) und einen generellen pilzlichen Primer AM1 (Helgason et al., 1998). Der 50 µl Reaktionsansatz für die PCR bestand aus:

29,7 µl steriles doppelt demineralisiertes Wasser (ddH2O), 5 µl 10x PCR-Puffer ohne

MgCl2, 4 µl MgCl2 (25 mM), 6 µl dNTP’s (2 mM), 1 µl AM1 (10 pmol/µl), 1 µl NS31

35 Material und Methoden

(10 pmol/µl), 1 µl Blotto (50 mg/l), 0,3 µl Taq-DNS-Polymerase (5 u/µl) und 2 µl Template DNS. Das Temperatur-Programm für die PCR mit den Primern AM1 und NS31 lautet: 1 Zyklus mit 94°C für 3 min, 60°C für 1 min und 72°C für 1 min und 30 s. 28 Zyklen mit 94°C für 1 min, 60°C für 1 min und 72°C für 1 min und 30 s. 1 Zyklus mit 94°C für 1 min, 60°C für 1 min und 72°C für 10 min. Die amplifizierte DNS selektierten wir durch eine Gelelektrophorese (1% (w/v) Agarose ), gereinigt durch ein Quiagen MiniElute PCR Purification Kit (Quiagen, Basel, Schweiz) und direkt ligiert in den Vektor „pDrive cloning Vector“ aus dem Quiagen PCR Cloning plus Kit (Quiagen, Basel, Schweiz). Kompetente Bakterienzellen (von Escherichia coli) mit dem Produktnamen „QIAGEN EZ Competent Cells“ wurden mit der pilzlichen DNS transformiert und auf Luria Bertani – Ampicillin (LB-Amp) /5- Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galaktopyranosid (X-Gal)/ Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG)-Medium ausplattiert (nach Gebrauchsanleitung). Wir nahmen je Probe zehn Bakterienkolonien mit positiv transformierten DNS-Fragmenten vom Medium auf und transferierten diese direkt in einen weiteren PCR-Reaktionsansatz:

14,33 µl steriles ddH2O, 2,5 µl 10x PCR-Puffer, 2 µl MgCl2 (25 mM), 3 µl dNTP’s (2 mM), 1 µl AM1 (10 pmol/µl), 1 µl NS31 (10 pmol/µl) Die PCR lief nach folgenden Temperaturprogramm im Thermozykler ab: Ein Zyklus mit 94°C für 3 min, 60°C für 1 min, 72°C für 1 min und 30 s. 25 Zyklen mit 94°C für 1 min, 60°C für 1 min, 72°C für 1 min und 30 s. Ein Zyklus mit 94°C für 1 min, 60°C für 1 min und 72°C für 5 min. Die DNS-Amplifikate wurden für RFLP (Restriktionsfragmentlängen-Polymorphis- mus)-Analyse getestet durch den Verdau mit dem Restriktionsenzym Hinf I (Fermentas) (nach Gebrauchsanleitung). Verschiedene RFLP-Typen wurden durch Gelelektrophorese (3% (w/v) Agarose) selektiert und die korrespondierende DNS gereinigt mittels Quiaquick-PCR Purifi-cation Kit (Quiagen, Basel, Schweiz). Für die Sequenzierung der DNS wurde der BigDye Terminator Ready Reaction Kit v 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) benutzt. Die Sequenzierung der gereinigten Sequenzierungsreaktionen erfolgte mit den Primern NS31 und AM1 mittels Kapillarsequenzierer „ABI Prim 3100 automated sequencer“ (Applied Biosystems). Datenanalyse:

36 Material und Methoden

Wir editierten die resultierenden forward und reverse Nukleotidsequenzen mit dem Computerprogramm Sequencher 4.06 (Gene Codes, Ann. Arbor, MI, USA). Die editierten Sequenzen wurden einer BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) - Suche (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast/) in der GenBank vorgelegt ob und in welchem Umfang diese mit bekannten rDNS-Sequenzen der kleinen Untereinheit 18S von Glomeromyzeten identisch sind. Alle DNS-Sequenzen wurden manuell alignt (abgeglichen) mit Hilfe des Programms MacClade 4.0 PPC (Sinauer, Sunderland, MA, USA). Die ungefähre phylogenetische Position der DNS-Sequenzen bestimmten wir durch den Vergleich mit DNS-Sequenzen von Glomeromyzetenarten, die die Basis der neuen Taxonomie der vesikulär-arbuskulären Mykorrhizapilze repräsentieren (Schüßler et al., 2001b; Schwarzott et al., 2001). Korrespondierende DNS-Sequenzen von verschiedenen pilzlichen Vertretern jeder phylogenetischen Einheit, definiert durch Schwarzott et al. (2001), wurden aus der GenBank erhalten und in das Alignment eingeschlossen. Phylogenetische Analysen erfolgten mit der PAUP Version 4.0b10 (Swofford, 2002).

37 Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1. Morphologische Merkmale von verschiedenen Eleutherococcus-Arten

Eleutherococcus divaricatus: E. divaricatus wächst auf saurem locker humosen Erdboden im Schatten. Der Strauch ist bis 5 m hoch und bis 3 m breit, mit teilweise ausladenden Zweigen und einer rotbraunen Borke (Abb. 5a). An den Zweigen werden Kurztriebe mit endständiger Knospe und drei-, vier- oder fünffach gefingerten dunkelgrünen Laubblättern ausgebildet. Die Fiederung ist bei einigen Laubblättern unterbrochen, zwei Fiederblättchen sind dann miteinander verbunden und besitzen einen gemeinsamen Fiederstiel. Fünffach gefingerte Laubblätter sind häufiger als drei- oder vierfach gefingerte am Strauch zu finden. Das mittlere Fiederblättchen ist 10 – 10,5 cm lang, die nach außen folgenden Fiederblättchenpaare haben eine Länge von 8,5 – 9 cm und 5,5 – 6 cm. Bemerkenswerterweise sind die Laubblätter im oberen Drittel des Strauches deutlich größer (10 - 13 cm lange mittlere Fiederblättchen) als im Bereich darunter. Die

Abb. 5: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus divaricatus (a) Strauch (b) Stacheln (c) Blüten und Früchte

38 Ergebnisse

Fiederblättchen sind verkehrt eiförmig bis lanzettlich, die der Blattspitzen stachelspitzig. Die Oberseite der Fiederblättchen ist kahl, die Blattunterseite besitzt zottig behaarte Blattnerven. Der Blattrand ist meist einfach gesägt, das untere Viertel der Fiederblättchen jedoch ganzrandig. Der Blattstiel ist zottig behaart und besitzt eine Länge von 5 bis 7 cm. Die Stacheln liegen zerstreut an den Zweigen und ihre Spitzen sind leicht gekrümmt mit einer Länge von 7 mm, auf 3 mm breiter und 8 mm langer Basis (Abb. 5b). Die Blütenstände setzen sich aus 5 – 7 einzelnen Dolden an weiß behaarten Langtrieben zusammen, welche end- bzw. achselständig ausgebildet werden (Abb. 5c). Die Dolden bestehen aus 20 – 30 einzelnen Blüten mit 5 purpurfarbenen elliptischen Petalen und 5 Staubblättern auf 1 – 2 cm langen Stielen. Die Dolden stehen an 1 – 3 cm langen Stielen. Der gesamte Blütenstand ist im Vergleich zu den bereits beschriebenen Eleutherococcus-Arten longitudinal gestreckt. Die Früchte sind rundliche zweikernige 5 - 7 mm große Steinfrüchte mit einem ungegabelten Griffel, die im September reif werden. Die Anordnung der Samen gleicht der bei E. lasiogyne x E. sessiliflorus.

Eleutherococcus gracilistylus: Fünf Jahre alte Pflanzen, aufgezogen aus Samen vom Botanischen Garten Hangzhou (VR China), wurden an halbschattige lehmhaltige Standorte im Botanischen Garten Marburg gepflanzt. Die Sträucher sind teilweise überhängend (Abb. 6a). 1 m lange unverholzte Langtriebe wachsen nahezu senkrecht aus der Sprossachse. Herabhängende verholzte Zweige bilden wechselständig Kurztriebe aus. Die Kurztriebe bestehen aus Rosetten von fünf fünffach gefingerten, dunkel-grünen, leicht ledrigen Laubblättern. Die Länge der mittleren Fiederblättchen beträgt 7 – 8 cm, die nach außen folgenden Fiederblättchenpaare 6 – 6,5 cm und 4,5 – 5 cm mit einem teilweise einfach gesägten und im unteren Viertel ganzrandigen Blattrand. Die Oberfläche der Fiederblättchen ist nur vereinzelt von einzelnen Haaren bedeckt, die Unterseite wird durch ein Relief von Blattnerven geprägt. Die Achseln der Seitennerven 1. Ordnung sind zottig behaart. Die Blattspitze der Fieder ist stachelspitzig und die Blattnervatur netz- und fiedernervig. Der Blattstiel ist 5 - 8 cm lang und besitzt eine glatte Oberfläche. An Langtrieben

39 Ergebnisse stehen of deutlich größere Laubblätter. Die Länge der mittleren Fiederblättchen beträgt dort 8 - 12 cm. Die an Rosa canina erinnernden rotbraunen Stacheln werden an jungen Langtrieben ausgebildet. Sie verfärben sich an verholzten Zweigen braun. Die Stachelspitze ist stark gekrümmt, besitzt eine Länge von 7 – 10 mm und die Basis ist 10 mm lang und 4 mm breit. Die Stacheln liegen zerstreut an den Zweigen vor (Abb. 6b). Vereinzelt fanden wir an Sträuchern im Botanischen Garten Chengdu (VR China) und Wageningen (Niederlande) an der Basis von Kurztrieben Cluster von Nebenwurzeln (Abb. 6c und d). Sie wurden an Zweigen gebildet, die der Erdoberfläche auflagen (Abb. 6c) oder nicht (Abb. 6d). Die Nebenwurzeln an Zweigen in der Luft hatten das Aussehen von Crowngalltumoren, welche von Agrobacterium tumefaciens gebildet werden. Kurze verkorkte Wurzeln wurden hier angelegt (Abb. 6c). In den Erdboden eingewachsene Zweige mit Kurztrieben bildeten im apikalen Bereich eine 5 mm starke Nebenwurzel aus. Am Apex des Zweiges wurde ein neuer Trieb ausgebildet (Abb. 6e). Die Blütenstände werden bei E. gracilistylus als einzelne Dolde an Kurztrieben gebildet. Diese Dolden sind 1 – 2 cm lang gestielt und bestehen aus 15 – 25 einzelne Blüten an 1 - 2 cm langen Blütenstielen. Es gibt Dolden mit nur weiblichen oder nur männlichen Blüten (Abb. 6f und g). Die weiblichen Blüten besitzen eine tiefgespaltene Narbe, die Petalen sind elliptisch und gelblich grün (Abb. 6f). Die männlichen Blüten haben 5 Staubblätter und 5 weißliche stark zurückgebogene Petalen, die sind. Die sterilen Narben sind auch gespalten, ähnlich den weiblichen Blüten. Im August reifen die 3 – 5 mm großen, rundlichen, schwarzen zweikernigen Steinfrüchte (Abb. 6h und i). Drei Jahre alte Pflanzen weisen allorhizes Wurzelsystem mit einer 8 – 10 cm langen braunen rübenähnliche Hauptwurzel auf. Diese ist zwei bis dreimal breiter als die abgehenden Seitenwurzeln erster Ordnung, welche wiederum 20 – 40 cm lang sind. Seitenwurzeln bis zur 6. Ordnung werden ausgebildet. Seitenwurzeln vierter bis sechster Ordnung sind Feinwurzeln (Abb. 7).

Eleutherococcus henryi: Diese Eleutherococcus-Art ist ein aufrechter bis 2,50 hoher und 2,00 m breiter Strauch,

40 Ergebnisse

Abb. 6: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus gracilistylus (a) Strauch mit herabgebogenen Zweigen. (b) Stacheln (c) Langtrieb (LT) mit Nebenwurzeln, der auf dem Erdboden lag. (d) Verkorkte Wurzeln am Grund der Kurztriebe. (e) 5 mm starker bewurzelter Zweig, der mit seiner Spitze in den Erdboden einge- wachsen war. (f) Weiblicher Blütenstand (g) Männlicher Blütenstand (h) Steinfrucht (i) Halbierte Steinfrucht mit zwei Steinkernen. Maßstab in (h) ≙ 2 mm, (i) ≙ 1 mm

41 Ergebnisse

Abb. 7: Wurzelsystem von Eleutherococcus gracilistylus

42 Ergebnisse der neben E. lasiogyne am gleichen sonnigen Standort wächst (Abb. 8a). Die Zweige sind hellgelblich bis grau und rauh borstig. An den Zweigen werden wechselständig Kurztriebe bestehend aus fünf Laubblättern und einer endständigen Knospe gebildet. Die hellgrünen Laublätter sind vornehmlich fünffach gefingert, vereinzelt kommen auch dreifach gefingerte Laubblätter vor. Die Fiederblättchenn sind verkehrt eiförmig bis länglich mit einem gesägten Blattrand und einer stachelförmigen Blattspitze. Das mittlere Fiederblättchen hat eine Länge von 7,5 – 8 cm, die nach links und rechts außen folgenden sind 6,5 – 7 cm bzw. 4,5 – 5,0 cm lang, alle jedoch 3 - 5 mm lang gestielt. Die Blattnervatur ist fieder- und netznervig, die Oberseite der Fiederblättchen ist rauh behaart, die der Unterseite ist behaart. Der behaarte Blattstiel hat eine Länge von 5 – 7 cm. Einzelne Langtriebe, die im Frühjahr ausgebildet werden, zeigen extrem große Laubblätter, mit bis zu 12 cm langen Fiederblättchen. Die Stacheln besitzen eine fast gerade, 3 - 5 mm lange Spitze auf einer 10 mm langen und 3 mm breiten Basis. Die Stacheln sind auf allen Zweigen und Trieben zu finden und haben eine rauhe Oberfläche (Abb. 8b). Der Blütenstand besteht aus drei bis sieben 1 – 3 cm lang gestielten Dolden. Die Dolden besitzen 30 – 40 Einzelblüten, welche fünf weißlich grüne Petalen und fünf Staubblätter aufweisen. Sie sind end- oder achselständig. Die schwarzen Steinfrüchte mit einem dünnen 3 mm langen Griffel werden im September reif. Die Steinfrüchte der endständigen Blütendolde reifen als erstes, danach folgen die anderen Blütendolden (Abb. 8d). 4 Steinkerne stehen kreuzweise zusammen, umgeben von rötlich fleischigem Mesokarp (Abb. 8c). Der unreife herzförmige Embryo liegt dezentral, umgeben von Nährgewebe, im Samen. Reife Steinfrüchte bleiben für mehrere Wochen an der Pflanze und wirken so auf Vögel attraktiv.

Eleutherococcus henryi var. nana: Diese Eleutherococcus-Art unterscheidet sich von E. henryi durch ihre Wuchshöhe. Bis 50 cm hoch werden die Pflanzen bei dieser Varietät (Abb. 8e) Die fünffach gefingerten Laubblätter sind so wie bei E. henryi aufgebaut (Abb. 8f).

43 Ergebnisse

Die dreieckförmigen Stacheln sind 5 – 7 mm lang mit einer 3 - 5 mm breiten Basis (Abb. 8g). Die Blütenstände sind wie bei E. henryi entwickelt (Abb. 8h).

Abb. 8: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus henryi und Eleutherococcus henryi var. nana (a) Strauch von Eleutherococcus henryi. (b) Stacheln von E. henryi. (c) Halbierte Frucht von E. henryi. (d) Fruchtstand von E. henryi. (e) Strauch von Eleutherococcus henryi var. nana (f) Laub- blätter von Eleutherococcus henryi var. nana (g) Stacheln von Eleutherococcus henryi var. nana (h) Blütenstand von Eleutherococcus henryi var. nana. Maßstab in (f) ≙ 500 µm

44 Ergebnisse

Eleutherococcus lasiogyne: Die Pflanze wird bis 2,50 m und bis 1,80 m breit. Oft entwickeln sich ausladende, bogige Äste (Abb. 9a). Die Borke ist weiß bis grau und an starken Ästen geriffelt und an dünneren Ästen glatt. An den Trieben werden wechselständig Kurztriebe mit bis zu 5 rosettenförmigen Laubblättern ausgebildet, endständig befindet sich eine Knospe. Die hellgrün glänzenden Laubblätter sind stets dreifach fingerförmig gefiedert, und der Fiederstiel ist 0,5 – 1 mm lang. Das mittlere Fiederblättchen hat eine Länge von 4 – 4,5 cm, die beiden äußeren von 3 – 3,5 cm. Die einzelnen Fiederblättchen sind elliptisch, im oberen Dreiviertel gesägt und im unteren Fiederblättchenviertel ganzrandig. Die Blattspitze ist stachelförmig und die Spreitenbasis keilförmig. Ober- und Unterseite der Fiederblättchen sind netz- und fiedernervig und nur an den Hauptnerven leicht behaart. Der Blattstiel ist zwischen 2,5 und 3 cm lang und besitzt vereinzelt Haare. Die Stacheln bilden eine 6 – 8 mm lange schräge Spitze auf einer 1 cm langen und 2mm breiten Basis aus und liegen oft gegenständig an den Zweigen (Abb. 9b). Die Blütenstände sind wie bei E. lasiogyne x E. sessiliflorus aus einzelnen Dolden aufgebaut, die sich an Langtrieben befinden (Abb. 9c). Ihre Anzahl schwankt zwischen 3 – 5 an einzelnen Langtrieben. Sie sitzen auf 5 mm langen Stielen end- und blattachselständig. Die Einzelblüten sind wie bei E. lasiogyne x E. sessiliflorus aus weißlichen fünf Petalen und fünf Staubblättern sowie einen Fruchtknoten mit gespaltener Narbe auf 3 mm langen Griffel aufgebaut. Die einzelnen Blüten sind 5 mm lang gestielt und haben einen Durchmesser von 3 – 5 mm. Nach der Blütezeit im späten August werden die Blüten abgeworfen. Einen Fruchtansatz konnten wir nicht erkennen.

Eleutherococcus leucorrhizus: Dieser aufrecht wachsende junge Strauch wird bis 3,0 m hoch. Seine Zweige sind gelb bis braunfarben (Abb. 10a). Die netznervigen Laubblätter sind drei- bzw. fünffach gefingert. Das mittlere Fiederblättchen hat eine Länge von 10 – 12 cm und die daran anschließenden sind 8 – 10 cm lang. Der Blattrand ist einfach gesägt (Abb. 10b). Die Stacheln haben die Form wie bei Eleutherococcus setchuenensis. Bei dem untersuchten Exemplar wurden keine Blüten ausgebildet.

45 Ergebnisse

Abb. 9: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus lasiogyne (a) Strauch (b) Stacheln (c) Blütenstand

Abb. 10: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus leucorrhizus (a) Strauch (b) Laubblätter

46 Ergebnisse

Eleutherococcus lasiogyne x Eleutherococcus sessiliflorus: Der Hybrid von E. lasiogyne x E. sessiliflorus ist ein Strauch mit aufrechtem bis 2,50 m hohen und 1,50 m breiten Wuchs, der besonders gut an sonnigen Standorten und in lehmigem Erdboden gedeiht (Abb. 11a). Die verholzten Äste sind durch eine weißgraue Borke gekennzeichnet. Die einzelnen aufrechten Triebe besitzen wechselständig Kurztriebe mit Laubblattrosetten und einer endständigen Knospe. Die Laubblattrosetten bestehen aus fünf spiralig angeordneten Laubblättern. Die hellgrünen Laubblätter einer Rosette sind drei-, vier- oder fünffach gefingert. Die Fiederblättchen sind verkehrt eiförmig bis länglich, gesägt, fieder- und netznervig, spitz und an der Basis keilförmig. Die Ober- und Unterseite der Fiederblättchen ist nur an den Haupt- und Seitennerven behaart. Der Blattstiel ist 5 – 7 cm lang und allseits behaart, die Fiederstiele dagegen nur 3 - 5 mm lang und kahl. Das mittlere Fiederblättchen von fünffach gefingerten Laubblättern ist 7,5 – 8 cm lang, die nach außen folgenden Fiederblättchen besitzen eine Länge von 7,0 – 7,5 cm, das nächstfolgende Paar misst 4,5 – 5 cm. Vierfach gefiederte Laubblätter haben von links nach rechts folgende Blattlängen: 6 - 6,5 cm, 8 - 8,5 cm, 8,5 – 9 cm und 6,5 – 7 cm. Das mittlere Fiederblättchen von dreifach fingerförmig gefiederten Laubblättern hat eine Länge von 7,0 – 7,5 cm, das linke Fiederblättchen 6,0 – 6,5 cm und das rechte 5,5 – 6,0 cm. Diese Laubblätter sind also in ihrem Längenaufbau asymmetrisch. An allen Zweigen werden zerstreut Stacheln angelegt. Sie sind rötlich an jungen unverholzten Trieben, graufarben an älteren Zweigen, die Stachelspitze ist 5 – 10 mm lang, gerade und nahezu rechtwinklig abstehend. Die Basis ist 1 cm lang und 3 mm breit (Abb. 11b). Die Blütenstände werden an Langtrieben ausgebildet, ihre Achsen sind rotbraun behaart. 5 bis 7 einzelne Dolden stehen terminal oder in den Achseln von dreifach gefingerten Laubblättern (Abb. 11c). Die 1 - 3 cm lang gestielten Dolden bestehen aus 30 - 40 Einzelblüten. Die Stiele der einzelnen Blüten haben eine Länge von 1,5 – 2 cm. Die Einzelblüten haben einen Kreis von fünf weiß-grünen elliptisch bis zugespitzten Petalen und fünf Sepalen, die kleiner als die Petalen sind. Die Anzahl der Staubblätter beträgt fünf. Gelegentlich werden auch Blüten mit 6 oder 7 Petalen ausgebildet. Der Blütendurchmesser beträgt 5 – 6 mm.

47 Ergebnisse

Abb. 11: Biologie von Eleutherococcus lasiogyne x Eleutherococcus sessiliflorus (a) Strauch (b) Stacheln (c) Blütenstand (d) Steinfrucht (e) Halbierte Steinfrucht. Maßstab in (d) ≙ 2 mm, (e) ≙ 1 mm

48 Ergebnisse

Blütezeit dieser Eleutherococcus-Art ist August. Dabei blüht die endständige Dolde als erstes auf. Bienen und Fliegen gehören zu den Blütenbesuchern. Mitte September findet man erste Früchte zunächst an der endständigen Dolde. Es sind kugelige schwarze Steinfrüchte von 5 mm Durchmesser mit persistierendem Griffel und gegabelter Narbe (Abb. 11d). Zwei Steinkerne liegen mit ihren Längsseiten hintereinander eingebettet im rötlichen Mesokarp vor (Abb. 11e). Die Oberfläche des Endokarps ist geriffelt. Nur ein Same einer Frucht ist fertil.

Abb. 12: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus senticosus (a) Strauch (b) Stacheln (c) Blütenstand (d) Fruchtstand

49 Ergebnisse

Eleutherococcus senticosus: E. senticosus ist ein aufrecht wachsender Strauch, der bis 3 m hoch sein kann (Abb. 12a). Die Borke ist grau bis braun. Seine spitzen Stacheln sind bis 1 cm lang, 2 – 3 mm breit, abgeflacht und bedecken die Sprossachsen rings herum (Abb. 12b). Die einfach gesägten netznervigen Laubblätter sind fünffach bzw. dreifach gefingert und rau papillös. Ihre Mittelrippen sind fein behaart. Das mittlere Fiederblättchen hat eine Länge von 6 – 7 cm und einen 1 cm langen Fiederstiel, die nach rechts und links außen folgenden Fiederblättchen sind 5 - 6 und 4 - 5 cm lang. Die end - bzw. achselständigen Blütenstände bestehen aus 4 – 5 einzelnen Dolden mit 20 – 30 Einzelblüten, aufgebaut aus 5 elliptischen weiß bis rosafarbenen Petalen mit einer Länge von 3 – 5 mm und fünf 2 - 3 mm langen Kelchblättern. Das Fruchtblatt besitzt eine ungeteilte Narbe (Abb. 12c). 5 – 8 mm große schwarze kugelige vierkernige Steinfrüchte werden an 1- 2 cm langen Stielen ausgebildet (Abb. 12d). Die Steinkerne sind wie bei Eleutherococcus henryi kreuzweise angeordnet.

Eleutherococcus setchuenensis: Diese Eleutherococcus-Art wurde am natürlichen Standort im Nationalpark Longchi in der Provinz Longchi gefunden (Abb. 13a).Der Strauch besitzt einen aufrechten Wuchs mit bis zu 5 m hohen braunen bzw. grünen Zweigen. Seine hellgrünen glatten Laubblätter sind drei- bzw. fünffach gefingert. Der Blattrand der 1 – 2 cm lang gestielten Fiederblättchen mit einer glatten Oberfläche ist einfach gesägt (Abb. 13b). An den Sprossachsen werden braunfarbene 0,5 – 1 cm lange Stacheln mit einer bis 0,5 cm breiten Basis entwickelt (Abb. 13c). An dem untersuchten Exemplar wurden keine Blütenstände ausgebildet.

Eleutherococcus sieboldianus: Diese Eleutherococcus-Art hat die gleiche Wuchsform wie E. gracilistylus. Die Borke der verholzten Zweige ist weißlich bis grau. Laubblätter sind glänzend grün und fünffach fingerförmig gefiedert (Abb. 14a). Das mittlere Fiederblättchen hat eine Länge von 5 – 5,5 cm, die Fiederblättchen nach außen folgend 4,0 – 4,5 cm und 3,0 – 3,5

50 Ergebnisse

Abb. 13: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus setchuenensis

(a) Strauch (b) Laubblätter (c) Stacheln

51 Ergebnisse cm. Die Fiederblättchen sind verkehrt-eiförmig bis länglich verkehrt-eiförmig geformt mit jeweils einem 3 – 8 cm langen Blattstiel. Der Blattrand ist kerbig gesägt in der oberen Hälfte der Fiederblättchen und in der unteren Hälfte ganzrandig, die Blattspitze ist stachelspitzig. Die netz- und fiedernervige Ober- und Unterseite der Fiederblättchen ist kahl (Abb. 14c). An Kurz- und Langtrieben befinden sich paarweise oder zu dritt bis 1 cm lange dünne Stacheln (Abb. 14b). Die Blütenstände sind einzelne Dolden mit 10 – 20 Einzelblüten, bestehend aus 5 weißlich grünen elliptischen Petalen und fünf grünen Kelchblättern. Die Früchte sind zweikernige schwarz bis rotbraunfarbene Steinfrüchte (Abb. 14d).

Abb. 14: Morphologische Merkmale von Eleutherococcus sieboldianus

(a) Strauch (b) Stacheln (c) Laubblätter (d) Fruchtstand

52 Ergebnisse

3.2. Bewurzelungsexperimente mit Laubblättern von Eleutherococcus gracilistylus

In diesen Bewurzelungsexperimenten sollte überprüft werden, wie weit E. gracilistylus mit seinen Laubblattbestandteilen bewurzelt werden kann und inwieweit Kulturmedien einen Einfluss auf die Bewurzelung haben. In den verwendeten Medien Sand, Blähton und Wasser (abgekocht) entwickeln über 90% der Blattrisslinge von Kurz- und Langtrieben Adventivwurzeln (Tab. 4). An dem verletzten Blattgrund (Abb. 15a und b) sehen wir nach ein bis zwei Wochen einen festen weißen Kallus. Dieser feste Kallus ist in Sand und Blähton bis zu 3 mm und in Wasser bis zu 5 mm breit. Nach einer weiteren Woche entspringen aus dem wasserbehandelten Kallus 6 - 12 weiße Adventivwurzeln des primären Entwicklungs- zustandes (Abb. 15c und d). Bei mit Sand und Blähton behandelten Blattrisslingen werden fünf bis zehn Adventivwurzeln ausgebildet. Vier Wochen nach der Behandlung sind über 2 cm lange unverzweigte Adventivwurzeln in allen Medien erkennbar (Abb. 15c). Drei Monate später sind Seitenwurzeln erster Ordnung deutlich erkennbar. Die ursprünglich unverzweigten Adventivwurzeln verdicken sich zunehmend basal und bilden braunes Korkgewebe aus (Abb. 15e). Nach einem Jahr haben die Adventivwurzeln eine Länge von über 20 cm erreicht. Es werden Seitenwurzeln erster und zweiter Ordnung in allen verwendeten Medien ausgebildet. Die Hauptwurzeln (ursprünglich Adventivwurzeln des primären Entwicklungszustandes) sind unterschiedlich lang. Als nächstes wurde jeweils das Oberblatt geernter Laubblätter in einzelne Fiederblättchen zerteilt und in Wasser und Sand kultiviert. Fiederblättchen mit Fiederstiel bilden ebenfalls nach ein bis zwei Wochen einen weißgelbfarbenen festen Kallus aus (Abb. 16c). Der in Wasser gebildete Kallus ist locker und weich mit einer Größe 3 x 5 mm. In Sand wird ein festerer Kallus von 2 x 5 mm ausgebildet. Nach drei bis vier Wochen durchstoßen Adventivwurzeln den Kallus bei Blattrisslingen beider Kulturmethoden (Abb. 16c). Fünf Wochen später haben sich fünf bis zehn Wurzeln pro Fiederblättchen mit einer Länge von über 3 cm gebildet (Abb. 16a, 19c). Eine Verzweigung in Seitenwurzeln erster Ordnung erfolgt nach acht Wochen. Nach 16 Wochen entwickeln sich in beiden Versuchsansätzen Seitenwurzeln zweiter Ordnung.

53 Ergebnisse

Nach einem Jahr betragen die Wurzellänge der Hauptwurzeln 10 cm. Die Hauptwurzeln werden braun und bilden Korkgewebe aus. Fiederblättchen mit abgeschnittenem Fiederstiel entwickeln erst nach vier bis fünf Wochen unverzweigte Adventivwurzeln. Ein Kallus ist nicht erkennbar (Abb. 16b). Seitenwurzeln erster Ordnung werden nach acht Wochen ausgebildet. Nach einjähriger Kultur sind nur Seitenwurzeln erster Ordnung ausgebildet. Die Länge der Hauptwurzeln

Abb. 15: Bewurzelung von Laubblättern bei Eleutherococcus gracilistylus (a) Laubblatt mit Kallus. (b) Blattgrund mit Kallus. (c) Aus dem Kallus austretende Adventivwurzeln. (d) Bewurzeltes Laubblatt nach sechs Wochen. (e) Bewurzelter Blattrissling nach neun Monaten. Maßstab in (a), (c) ≙ 1 cm, (b) ≙ 500 µm, (d) ≙ 1 mm, (e) ≙ 1 cm 54 Ergebnisse beträgt 5 cm. Fiederblättchen mit Fiederstiel, die in der Nähe der Mittelrippe verletzt worden waren, bilden nach drei Wochen 5 mm lange Adventivwurzeln aus (Abb. 16d). Nach einem Jahr sind 4 cm lange unverzweigte Adventivwurzeln ausgebildet. Ritzten wir den Laubblattstiel von E. gracilistylus an, so entwickeln sich nach vier Wochen Wurzeln, die nebeneinander herauswachsen (Abb. 17a).

Abb. 16: Bewurzelung der Fiederblättchen von Eleutherococcus gracilistylus (a) Bewurzeltes Fiederblättchen mit Fiederstiel. (b) Fiederblättchen ohne Fiederstiel mit Adventivwurzeln. (c) Adventivwurzeln (Pfeile) aus Kallus des Fiederblättchens. (d) Adventivwurzeln (Pfeil) aus verletztem Blattnerv des Fiederblättchens mit Fiederstiel (F). Maßstab in (a), (b) ≙ 1 cm, (c) ≙ 2 mm, (d) ≙ 1 mm 55 Ergebnisse

Laubblattstiele mit abgeschnittenen Blattgründen in Sand und Wasser bilden nach ein bis zwei Wochen einen Kallus an der Wundfläche aus, woraus nach drei bis vier Wochen weißliche Adventivwurzeln wachsen (Abb. 17b). Die Adventivwurzeln verzweigen sich nach sechs Wochen und bilden Seitenwurzeln erster Ordnung. Nach acht Wochen zeigen sich Seitenwurzeln zweiter Ordnung. Eine einjährige Kultur in Wasser und Sand ist mit bis zu 12 cm langen Adventivwurzeln charakterisiert.

Abb. 17: Blattstiel von Eleutherococcus gracilistylus angeritzt bzw. geschnitten und in Leitungswasser kultiviert (a) Blattstiel längs angeritzt. (b) Blattgrund abgeschnitten

100 Bewurzelung der Blattrisslinge von 90 Eleutherococcus gracilistylus in 80 verschiedenen 70 Kulturmedien

30 Bewurzelung (%) abgestorben 20 bewurzelt 10

0 Sand Blähton Wasser

Tab. 4: Bewurzelungs- und Absterberaten von Eleutherococcus gracilistylus Blattrisslingen nach vierwöchiger Kultur in verschiedenen Kulturmedien

56 Ergebnisse

3.3. Bewurzelungsexperimente mit Laubblättern von verschiedenen Eleuthero- coccus-Arten

Aufgrund der vielgestaltigen Bewurzelungsmodi bei Laubblättern von Eleutherococcus gracilistylus wurden weitere Arten von Eleutherococcus zur Blattbewurzelung herangezogen. Die Blattrisslinge und Fiederblättchen verschiedener Eleutherococcus- Arten zeigen unterschiedliche Bewurzelungsraten in den Kulturmedien Sand und Leitungswasser. Die Kallus – und Adventivwurzelbildung ähnelt der von Eleutherococcus gracilistylus.

Eleutherococcus lasiogyne x Eleutherococcus sessiliflorus: Nach einem Monat Kultur der Blattrisslinge in Sand liegt die Bewurzelungsrate unter 5 % (Tab. 5). Die Kallusbildung beginnt nach zweiwöchiger Kultur in Sand. Es wird ein weißlich fester gelber Kallus mit einer Breite von 3 mm und einer Länge von 6 mm angelegt. Daraus entspringen nach vier Wochen drei bis fünf Adventivwurzeln (Abb. 18a). Seitenwurzeln erster Ordnung werden sechs Wochen später wechselständig angelegt. Nach einem Jahr Kultur in Sand haben sich Adventivwurzeln mit einer Länge von 10 cm herausgebildet. Seitenwurzeln zweiter Ordnung werden nicht entwickelt. Die Wasserkultur der Laubblätter erzielt hier keine Bewurzelung (Tab. 7), sondern die Blattstiele faulen schnell von der Basis her ab und einzelne Fiederblättchen fallen frühzeitig vom Blattstiel (Abb. 20b). Ein Kallus oder Adventivwurzeln werden nicht angelegt. Fiederblättchen zur Bewurzelung in Sand und Wasser gestellt sterben ab (Tab. 6 und 8). Sie faulen von der Basis her, Kallus oder Adventivwurzeln werden nicht ausgebildet.

Eleutherococcus lasiogyne: Die dreifach fingerförmig gefiederten Laubblätter bewurzeln nach einem Monat mit einer Rate von unter 10 % in Sand und Leitungswasser (Tab. 5 und 7). 2 - 3 cm lange Adventivwurzeln entwickeln sich aus einem 2 x 2 mm großen Kallus (Abb. 18c). Der Kallus in Leitungswasser ist weiß, kristallin und locker. In Sand wird ein fester weißer Kallus ausgebildet.

57 Ergebnisse

Nach 12 Wochen werden Seitenwurzeln erster Ordnung angelegt. Selbst nach einem Jahr kommt es zu keiner weiteren Verzweigung. Die Adventivwurzeln verdicken sich zunehmend sekundär und besitzen eine Länge von 4 bis 5 cm. Isolierte Fiederblättchen wurden nur in Leitungswasser kultiviert, da aufgrund der morphologischen Eigenschaften ein fester Halt in Sand nicht gewährleistet war. Die Kultur der Fiederblättchen in Leitungswasser erbrachte keine Bewurzelung (Tab. 8). Alle Fiederblättchen wurden braunfleckig und welkten nach zwei Wochen.

Eleutherococcus divaricatus: 38% der Blattrisslinge in Sand und 42% in Leitungswasser sind nach einem Monat bewurzelt (Tab. 5 und 7). Auffallend war hier die unterschiedlich starke Bewurzelung der Laubblattstiele und Fiederblättchen im Vergleich zu den beschriebenen Eleuthero- coccus-Arten. Nach zwei Wochen werden an den Blattstielen unterschiedlich große Kallusse gebildet. Die Größe der Kallusse variiert zwischen 2 x 2 mm bis 4 x 6 mm. Manche Blattstiele bilden auch keinen Kallus aus. Nach einem Monat werden unverzweigte 5 mm bis 4 cm lange Adventivwurzeln an einzelnen Blattstielen ausgebildet (Abb. 18d). Die Bildung von Seitenwurzeln erster Ordnung erfolgt bei allen Blattstielen in einem Zeitraum von 8 – 12 Wochen. Nach einem Jahr haben die ursprünglich angelegten Adventivwurzeln eine Länge von 5 bis 10 cm. Die Fiederblättchen bewurzeln zu 20% in Sand und zu 28% in Leitungswasser (Tab. 6 und 8). Ein 2 x 2 mm fester weißer Kallus wird nach zwei bis vier Wochen an einzelnen Fiederblättchen in Sand und Leitungswasser ausgebildet. Auch hier gibt es eine ungleichmäßige Bewurzelung und Kallusbildung, ähnlich den Blattrisslingen. Nach vier Wochen liegen Fiederblättchen ohne Adventivwurzeln und mit Adventivwurzeln von einer Länge bis 15 mm vor (Abb. 19a). Nach 10 – 14 Wochen werden Seitenwurzeln erster Ordnung angelegt, eine weitere Verzweigung erfolgt selbst nach einem Jahr nicht. Die Länge der Adventivwurzeln variiert zwischen 4 und 6 cm.

Eleutherococcus henryi: Die Bewurzelungsrate nach einem Monat beträgt bei Blattrisslingen in Sand 76 % und in Leitungswasser 0 % (Tab. 5 und 7). Ein 5 – 8 mm großer weißer fester Kallus wird

58 Ergebnisse nach zwei Wochen Kultur in Sand erkennbar. Nach 4 Wochen werden drei bis sechs Adventivwurzeln mit einer Länge von 3 – 5 cm angelegt (Abb. 18b). Seitenwurzeln erster Ordnung sind nach 8 Wochen deutlich erkennbar. Nach einem Jahr lagen Seitenwurzeln zweiter Ordnung vor. Die Länge der Adventivwurzeln beträgt 10 – 15 cm. Die behaarten Blattrisslinge in Leitungswasser verfaulen kontinuierlich bevor sie einen Kallus oder Adventivwurzeln ausbilden können. 44 % der Fiederblättchen in Sand und 0 % in Leitungswasser bewurzeln sich. Ein gelber fester Kallus mit einer Größe von 3 – 6 mm wird nach zwei Monaten ausgebildet. Die vierwöchige Fiederblättchenkultur entwickelt 3 – 10 Adventivwurzeln (Abb. 19b). Sie besitzen nach einem Jahr eine Länge von 10 – 12 cm und Seitenwurzeln 1. Ordnung. In Leitungswasser verfaulen die Fiederblättchen und verfärben sich an der Basis braun. Das Gewebe wird nekrotisch (Abb. 20a). Eine Kallus- und Wurzelbildung dieser Fiederblättchen unterbleibt.

100 Bewurzelung der Blattrisslinge von 90 verschiedenen Eleutherococcus - 80 Arten nach einem Monat in Sand 70

Bewurzelung (%) 30 abgestorben

20 unbewurzelt bewurzelt 10

0 E. lasiogyne x E. E. E. E. gracilistylus E. sessiliflorus lasiogyne divaricatus henryi

Tab. 5: Bewurzelungs- und Absterberaten von Blattrisslingen verschiedener Eleutherococcus- Arten nach vierwöchiger Kultur in Sand

59 Ergebnisse

100 Bewurzelung der Fiederblättchen von 90 verschiedenen Eleutherococcus - 80 Arten nach einem 70 Monat in Sand

Bewurzelung (%) 30 abgestorben 20 unbewurzelt bewurzelt 10

0 E. lasiogyne x E. E. E. E. sessiliflorus divaricatus henryi gracilistylus

Tab. 6: Bewurzelungs- und Absterberaten von Fiederblättchen verschiedener Eleutherococcus-Arten

100 Bewurzelung der Blattrisslinge von 90 verschiedenen 80 Eleutherococcus - Arten nach einem 70 Monat in Leitungs- wasser 60

Bewurzelung (%) 30 abgestorben 20 unbewurzelt bewurzelt 10

0 E. E. lasiogyne E. lasiogyne E. E. henryi x E. divaricatus gracilistylus sessiliflorus

Tab. 7: Bewurzelungs- und Absterberaten von Blattrisslingen verschiedener Eleutherococcus- Arten nach vierwöchiger Kultur in Leitungswasser

60 Ergebnisse

100 Bewurzelung der Fiederblättchen von 90 verschiedenen 80 Eleutherococcus - Arten nach einem 70 Monat in Leitungs- wasser 60 50 40

Bewurzelung (%) 30 abgestorben 20 unbewurzelt 10 bewurzelt 0 E. E. lasiogyne E. E. E. henryi x E. lasiogyne divaricatus gracilistylus sessiliflorus

Tab. 8: Bewurzelungs- und Absterberaten von Fiederblättchen verschiedener Eleutherococcus- Arten nach vierwöchiger Kultur in Leitungswasser

61 Ergebnisse

Abb. 18: Bewurzelte Blattrisslinge von verschiedenen Eleutherococcus-Arten in Sand nach einem Monat (a) Eleutherococcus lasiogyne x Eleutherococcus sessiliflorus (b) Eleutherococcus henryi (c) Eleutherococcus lasiogyne (d) Eleutherococcus divaricatus – Fiederblättchen eingeschnitten. Maßstab in (a) bis (d) 1 cm ≙

62 Ergebnisse

Abb. 19: Bewurzelte Fiederblättchen von verschiedenen Eleutherococcus-Arten nach vierwöchiger Kultur in Sand (a) Eleutherococcus divaricatus (b) Eleutherococcus henryi (c) Eleutherococcus gracilistylus

Maßstab in (a) bis (c) ≙ 1 cm 63 Ergebnisse

Abb. 20: Verwelkte Laubblätter und Sprossstecklinge von Eleutherococcus-Arten

(a) Verwelkte Fiederblättchen von Eleutherococcus henryi. (b) Verpilzte und verwelkte Sprossstecklinge (Pfeile) von Eleutherococcus lasiogyne x Eleutherococcus sessiliflorus in Kulturgefäß. Maßstab in (a) ≙ 1 cm.

3.4. Ausbildung von Adventivsprossen bei verschiedenen Eleutherococcus-Arten

Zusätzlich zur Bewurzelung der Laubblätter und Fiederblättchen treten auch spontane Bildungen von Adventivsprossen in den untersuchten Reihen auf. 21 % von 210 isolierten Blattrisslingen von Kurz- und Langtrieben bei Eleutherococcus gracilistylus bilden in Sand Adventivsprosse aus (Tab. 9). Jeweils ein oder zwei Adventivknospen sind nach einem Monat am Blattgrund der bewurzelten Blattstiele deutlich zu erkennen (Abb. 22a). Die Adventivknospen sind von unterschiedlich großen Deckschuppen umgeben. Nach zwei Monaten werden erste fingerförmig gefiederte Laubblätter am Adventivspross ausgebildet, die Sprossachse ist hierbei noch nicht sichtbar. Die neu gebildeten Laubblätter sind kleiner als das bewurzelte Laubblatt (Abb. 22b). Eine Adventivsprossachse mit sichtbar getrennten Nodien ist ein halbes Jahr später deutlich erkennbar (Abb. 22c). Rotlicht, welches eine wachstumssteigernde Wirkung haben soll, wurde bei einem zweiten Versuch angewendet. Rotlicht führt dabei zu einer Erhöhung der Ausbildung von Adventivsprossen bei E. gracilistylus. Hierbei entwickeln 60% von nur 50 Blattrisslingen Adventivsprosse (Tab. 9). In Peuke-Medium, einem nährstoffarmen Flüssigmedium zur Bewurzelung von Stecklingen, konnten ebenfalls Adventivsprosse bei E. gracilistylus induziert werden. Auch hier bilden 60% von 50 Blattrisslingen Adventivsprosse aus.

64 Ergebnisse

Keine Adventivsprosse entwickeln sich an Blattrisslingen, mit beschnittenem Blattgrund. Behandelten wir weitere Eleutherococcus-Arten (n=50 Blattrißlinge/Art), wie E. divaricatus, E. henryi, E. lasiogyne, E. lasiogyne x E. sessiliflorus mit und ohne Rotlicht so tritt nur eine Adventivsprossbildung bei E. divaricatus im Rotlicht auf (Abb. 21).

Bildung von Adventivsprossen bei Eleutherococcus gracilistylus 70

20 Entwicklungsrate (%)

10 n= 210 n= 50

0 Ohne Rotlicht 1 Mit Rotlicht

Tab. 9: Ausbildung von Adventivsprossen bei Eleutherococcus gracilistylus

Abb. 21: Adventivspross von Eleutherococcus divaricatus. Maßstab ≙ 1 cm 65 Ergebnisse

Abb. 22: Adventivsprosse an Blattrisslingen von Eleutherococcus gracilistylus (a) 2 Adventivknospen (Pfeile) am Blattgrund des Blattstieles (B). (b) 2 Monate alter Adventivspross (A). (c) 6 Monate alter Adventivspross (A) am bewurzelten Laubblatt (L). Maßstab in (a) ≙ 1 mm

66 Ergebnisse

3.5. Stecklingsvermehrung von Sprossachsen verschiedener Eleutherococcus- Arten

Neben der Vermehrung von Pflanzen durch Laubblätter und der Bewurzelung von Laubblättern untersuchten wir auch die Vermehrung über Sprossstecklinge in Torfsubstraten als klassisches Vermehrungssubstrat und in Sand mit und ohne dem bewurzelungsfördernden Phytohormon Indolylessigsäure (IES).

Eleutherococcus gracilistylus: Nach einem Monat sind 82% der Sprossstecklinge in Sand, 88% in Torf ohne IES- Zugabe bewurzelt. IES-behandelte Stecklinge bewurzeln zu 88% in Sand und zu 92% in Torf (Tab.10 – 13). Nach zwei Wochen hat sich ein Kallus an den Schnittflächen des Sprossstecklings unterhalb des Nodiums entwickelt. Die Zellen der Rinde teilen sich stark und bilden einen Wulst aus (Abb. 23b). Lentizellen in der Nähe der Schnittflächen, die Kontakt zum Kulturmedium hatten, bilden weiße lockere Kallusse aus (Abb. 23a). Die Adventivwurzeln entstehen aus den Kallus um die Lentizellen (Abb. 23c) und aus dem Kallus an den Schnittflächen (Abb. 23d) nach einem Monat. Nach sechs Monaten haben sich Adventivwurzeln 1. – 3. Ordnung bei Teil - bzw. Kopfstecklingen ausgebildet (Abb. 23e und f). Dieser beschriebene Bewurzelungsmodus ist auf alle untersuchten Eleutherococcus-Arten übertragbar. Experimente zur Bewurzelung in Sand zeigen, das sich E. henryi neben E. lasiogyne x E. sessiliflorus am schlechtesten nach einem Monat bewurzeln. Über 50% Bewurzelungsrate zeigen Stecklinge von E. divaricatus, E. lasiogyne und E. gracilistylus. E. gracilistylus ist in dieser Versuchsreihe die am besten sich bewurzelnde Pflanzenart (Tab. 10). Die Vermehrung in Torf zeigte ein ähnliches Ergebnis bezüglich der Bewurzelungsraten, allerdings lagen diese allgemein höher als bei der Sandkultur (Tab. 12). Eine Behandlung mit IES-Paste bewirkt eine Erhöhung der Bewurzelungsrate aller behandelten Eleutherococcus-Arten in Sand und Torf (Tab. 11 und 13). Die schlechte Vermehrung von Stecklingen bei E. henryi und E. lasiogyne x E. sessiliflorus beruht auf einem pilzlichen Pathogen (Abb. 20b) und dem daraus resultierendem Blattfall. Diese Stecklinge gingen ein.

67 Ergebnisse

Abb. 23: Bewurzelung von Sprossstecklingen bei Eleutherococcus gracilistylus (a) Kallus aus Lentizellen (Pfeil). (b) Kallus (KA) an Schnittfläche der Sprossachse, umgibt Mark (*). (c) Adventivwurzeln (Pfeile) aus Kallus um die Lentizellen. (d) Adventivwurzeln aus Kallus. (e) Bewurzelter Teilsteckling. (f) Bewurzelter Kopfsteckling.

68 Ergebnisse

100 Bewurzelung der Sprossstecklinge 90 von 80 verschiedenen Eleutherococcus - 70 Arten nach einem Monat in Sand 60

Bewurzelung (%) 30 abgestorben 20 unbewurzelt 10 bewurzelt

0 E. E. lasiogyne x E. E. lasiogyne E. henryi E. divaricatus gracilistylus sessiliflorus

Tab. 10: Bewurzelungs- und Absterberaten von Sprossstecklingen verschiedener Eleuthero- coccus-Arten nach vierwöchiger Kultur in Sand

100 Bewurzelung der Sprossstecklinge 90 von 80 verschiedenen Eleutherococcus - 70 Arten nach einem Monat in Sand mit 60 1000 ppm IES 50 40

Bewurzelung (%) 30 abgestorben 20 unbewurzelt 10 bewurzelt 0 E. E. lasiogyne E. E. lasiogyne E. henryi x E. divaricatus gracilistylus sessiliflorus

Tab. 11: Bewurzelungs- und Absterberaten von Sproßstecklingen verschiedener Eleuthero- coccus-Arten nach vierwöchiger Kultur in Sand mit 1000 ppm IES

69 Ergebnisse

100 Bewurzelung der 90 Sprossstecklinge von 80 verschiedenen Eleutherococcus - 70 Arten nach einem Monat in Torf 60

30 Bewurzelung (%) abgestorben 20 unbewurzelt

10 bewurzelt

0 E. E. lasiogyne x E. E. lasiogyne E. henryi E. divaricatus gracilistylus sessiliflorus

Tab. 12: Bewurzelungs- und Absterberaten von Sproßstecklingen verschiedener Eleuthero- coccus- Arten nach vierwöchiger Kultur in Torf

100 Bewurzelung der 90 Sprossstecklinge von 80 verschiedenen Eleutherococcus - 70 Arten nach einem Monat in Torf mit 60 1000 ppm IES

Bewurzelung (%) 30 abgestorben 20 unbewurzelt 10 bewurzelt

0 E. E. lasiogyne x E. E. lasiogyne E. henryi E. divaricatus gracilistylus sessiliflorus

Tab. 13: Bewurzelungs- und Absterberaten von Sproßstecklingen verschiedener Eleuthero- coccus-Arten nach vierwöchiger Kultur in Torf mit 1000 ppm IES

70 Ergebnisse

3.6. Pflanzengewebekultur von Eleutherococcus sieboldianus

Zusätzlich zur vegetativen Vermehrung von Eleutherococcus-Arten über Stecklinge und Adventivsprosse sollte überprüft werden, inwieweit aus Laubblattexplantaten eine Vermehrung der wichtigen Zier- und Nutzpflanze (Siehe Kapitel 1.4.) Eleutherococcus sieboldianus möglich ist. Pflanzengewebekulturen haben den Vorteil, dass eine große Anzahl von Pflanzen, die genetisch identisch sind, unabhängig von Jahreszeiten aus kleinen Gewebeexplantaten kultiviert werden. Durch diese Untersuchungen erkannten wir außerdem eine bislang nicht erfasste Mikroflora, die ebenfalls näher untersucht worden ist.

3.6.1. Somatische Embryoidogenese von Eleutherococcus sieboldianus

1 x 1 cm große oberflächen sterilisierte Fiederblättchenstücke sowie Blattbasen weisen auf dem Nährmedium GaV nach 11 Monaten Kallusse von unterschiedlicher Farbe, Form und Größe auf. Die Kallusse zeigen Farbnuancen von gelb, braun und grün (Abb. 24a und b). Auch die Oberflächenstruktur ist variabel, so treten z. B. vereinzelt noduläre Strukturen in der Nähe der Basis des Kalluses hervor (Abb. 24a). Weiterhin gibt es Oberflächenbereiche mit glatten, rauen und zerfurchten Strukturen. Die Zerfurchung ist auch in der ungleichförmigen Randstruktur des Kallus zu erkennen (Abb. 24a und b). Der größte Teil der Kallusse ist von fester Konsistenz. Daran entwickeln sich auch lockere Kallusse (Abb. 24a). Desweiteren sehen wir nebeneinander liegende Wurzeln, die ebenfalls aus dem Kallus herauswachsen (Abb. 24b). Das Explantat, hier am Beispiel der Blattbasen gezeigt, ist braun und scheint äußerlich abgestorben zu sein. Im weiteren zeitlichen Verlauf kommt es bei den Explantatkulturen zu einer stetigen Vergrößerung der Kallusse. Einzeln isolierte Kallusproben reagieren in der weiteren in vitro Kultur (Sekundärkultur) zur Induktion von embryoidogenen Kallus auf verschiedenen cytokininhaltigen Medien nach vier Wochen. Grüne undifferenzierte Kallusstrukturen und Kallusse mit Laubblättern wurden ausgebildet. Die Medien A3 und Gamborg B5 + 0,2 mg/l BAP induzieren im Vergleich zu Medium Variante 4 differenziertere Kallusstrukturen, die sich in embryoidogenen Kallus entwickeln (Tab. 14).

71 Ergebnisse

Wir verwendeten das Nährmedium A3, um gezielt embryoidogenes Pflanzenmaterial zu kultivieren. Auf dem Nährmedium A3 vereinzelt platzierte embryoidogene Kallusse sind mit dem bloßem Auge als kristalline Häufchen unterschiedlicher weißlich- gelbbrauner Farbe, Form und Größe zu erkennen (Abb. 24c). Auf der Oberfläche der Kallusse bildet sich ein Flüssigkeitsfilm aus.

Entwicklung von embryoidogenen Kallus nach vier Wochen auf verschiedenen Medien mit Weißlicht

80 A3 (LS + 0.15 mg/l BAP; 0.03 mg/l kinetin; 0.001 mg/l NAA and 0.5 mg/l GA3) Gamborg B5 + 0,2 mg/l BAP

Var. 4 (MCM + 1,5 mg/l zeatin + 0,15 mg/l kinetin) 60

40 Kallusbildung (%) 20

0 Kallus mit grünen Strukturen Kallus mit Laubblättern Kallusart

Tab. 14: Entwicklung von embryoidogenen Kallus nach vier Wochen auf verschiedenen Medien mit Weißlicht Einzelne embryoidogene Kallusse lassen sich leicht in mehrere kleine Häufchen portionieren. Lichtmikroskopisch betrachtet sind diese bröckeligen Kallusse aus einer Vielzahl von Pflanzenzellen aufgebaut, die in unterschiedlich große Cluster oder Zellklumpen irregulärer Formen regellos zusammengefügt sind. Eine Organisierung der Zellen zu Geweben erkennen wir nicht (Abb. 24f). Quetschen wir nun vorsichtig diese eingebetteten Objekte, so sehen wir mit Hilfe des Lichtmikroskopes locker aneinander gelagerte Zellen in kleinen Gruppen und einzeln liegende Zellen dieser Zellklumpen (Abb. 24d). Quetschen wir diese Kallusproben nun stärker, so vereinzelnen wir mehr und mehr die aneinander klebenden Zellen. Die gequetschten Zellen besitzen dabei eine große Elastizität. Einzelne Zellen verschiedener Zellcluster teilen sich mitotisch (Abb.

72 Ergebnisse

Abb. 24: Kultur mit Kallus von Eleutherococcus sieboldianus, etabliert aus oberflächensterilen Explantaten von Laubblättern (a) und (b) Explantate von Blattgrund (BG) mit Kallus in Primärkultur. Der Kallus zeigt noduläre Strukturen (NS) und weißfarbene Zellcluster (Pfeil). (b) Kallus mit auswachsenden Wurzeln (W). (c) bis (g) Embryoidogener Kallus aus Sekundärkultur. (c) Embryoidogener Kallushaufen (d) Einzelne Zellen des Kallus, mitotische Teilungsstadien (Pfeile). (e) Zellen mit unterschiedlicher Zusammensetzung, hier Zellen mit braunen Gebilden (Pfeil). (f) Zellaggregate mit Stärkekörnern (schwarz-braungefärbt mit Iod- Kaliumiodid). (g) Einzelne Zellen mit Zellkern (N) und Stärkekörnern.

Maßstab in (a) ≙ 2 mm, (b) ≙ 1 mm, (c) ≙ 500 µm, (d) ≙ 20 µm, (e) und (g) ≙ 10 µm, (f) ≙ 50 µm

73 Ergebnisse

24d). Sogar starkes Quetschen dieser Zellen trennt diese nicht. Die Größe der Zellen in Aufsicht schwankt zwischen 10-20 µm x 20-40 µm. Die Zellform variiert von rund bis eiförmig. Eckige Zellen oder Bestandteile von pflanzlichen Organen sehen wir bei den untersuchten Kallusproben nicht. Vereinzelte Zellen sind durch eine intrazellulär auftretende braune amorphe Substanz, die von einer Membran umgeben wird, gekennzeichnet. Ein Lipidnachweis (Oilred und Sudan 4) dieser braunen Substanz ist negativ. Andere Zellen sind hyalin und mit einigen granulären Strukturen gekennzeichnet (Abb. 24e). Eine Iodkaliumiodidbehandlung lässt schwarz-bräunliche Partikel bei tausendfacher Vergrößerung erkennen (Abb. 24f). Diese Partikel liegen in mehreren nebeneinander liegenden Zellen in unterschiedlich hoher Anzahl in den Zellen vor und sind teilweise von einem granulären goldfarbenen Zytoplasma umgeben. Außerdem erkennen wir einzelne hyaline Bereiche unterschiedlicher Form mit einer undeutlich begrenzten Membran, eingebettet in das granuläre Zytoplasma. Zellkerne als ein weiterer Zellbestandteil in Form von lichtbrechenden Kügelchen sehen wir auch ohne spezielle Anfärbung. Der Durchmesser der Zellkerne beträgt 10 – 15 µm. (Abb. 24g). Eine spezifische oder regelmäßige Anordnung der Zellen zu einem pflanzlichem Gewebe liegt in diesem Entwicklungsstadium nicht vor. In der Sekundärkultur zeigen mehrere einzelne embryoidogene Zellhaufen auf A3- Medium im weiteren Verlauf ihrer Entwicklung an mehreren Stellen der Peripherie noduläre Strukturen. Weiterhin kommen kleine stark differenzierte Strukturen in Form von kugel- bis eiförmigen Gebilden in Gruppen zusammengelagert oder vereinzelt vor, ohne dabei eine räumlich gesetzmäßige Anordnung aufzuweisen (Abb. 25a). Diese Zellhaufen sind im Vergleich zu den oben beschriebenen krümelig. Zerlegen wir diese Proben von Zellhaufen vorsichtig, erkennen wir unregelmäßig geformte feste Klümpchen und mehrere einzeln vorliegende kugel- bis eiförmige Gebilde mit einer gemusterten Oberflächenstruktur, deren Größe 100 bis 250 µm beträgt. Diese sphäroidischen Objekte sind von hyalin über weiß bis orange und gelb gefärbt, die in unterschiedlicher Anzahl und Anordnung zwischen einzelnen Zellen vorliegen. Diese Gebilde lassen sich leicht mit einer Lanzettnadel aus dem Zellhaufen frei legen. Sie werden als globuläre Embryoide bezeichnet (Abb. 25 a bis c). Die orangefarbenen lobulären Embryoide waren aus Zellen mit braunfarbenen Gebilden (Abb. 25c, Pfeil)

74 Ergebnisse

Abb. 25: Embryoidkultur von Eleutherococcus sieboldianus mit globulären Embryoiden (a) Embryoidogener Kallus mit globulären Embryoiden (Pfeil). (b) Isolierte Embryoide, darunter stärkehaltiger Embryoid (Pfeilspitze). (c) Rot-braunfarbene Embryoide (Pfeil), die nicht lebensfähig sind. (d) und (e) Gequetschte Embryoide mit extrazellulärer Matrix (EM), gefärbt mit Safranin (d) und Methylenblau (e). (f) Extrazelluläre Matrix (im Detail) aus (e). (g) Embryoid (Querschnitt mit Toluidinblau gefärbt). (h) Parenchym des Embryoids mit Zellkernen (N). (i) Parenchym des Embryoids, vereinzelte Zellen gefüllt mit brauner Masse (*) (Frischpräparat). Toluidinblau-Färbung in (g) und (h).

Maßstab in (a) ≙ 500 µm, (b) und (c) ≙ 250 µm, (d) ≙ 200 µm, (e) und (g) ≙ 100 µm; (f) ≙ 25 µm; (h) und (i) ≙ 10 µm

75 Ergebnisse zusammengesetzt. Diese globulären Embryoide entwickeln sich nicht weiter. Die globulären weißlichen bzw. hyalin aussehenden Embryoide sind vital. Hier fällt uns eine hyaline granuläre, hautähnliche bis visköse Substanz verstärkt um die analysierten globulären Embryoide im isolierten Zustand auf. Safranin und Astrablau als Farbstoffe zum Anfärben von Pektin färbten diese Substanz rot bzw. blau (Abb. 25d und 25e). Diese extraembryoidogene Matrix liegt bei einzelnen Embryoiden in unterschiedlicher Konsistenz vor, als Haut (Abb. 25d) oder als fädige Struktur (Abb. 25e und 25f). Mediane histologische Schnitte durch globuläre Embryoide sind durch polygonale Zellen von 10 bis 20 µm Länge charakterisiert (Abb. 25g). Zellkerne mit einer Größe von 5 bis 8 µm beinhalten Toluidinblau angefärbte Nukleoli. Die Nuklei nehmen in mehreren Zellen über 50% der gesamten Zellfläche ein (Abb. 25h). Eine äußere glatte Begrenzung oder eine spezifisch ausgeprägtes Gewebe beobachten wir nicht. Dafür sehen wir einen schuppenartigen Rand mit teilweise sich ablösenden Zellen (Abb. 25g und 25h). In frisch gequetschten Proben aus dem inneren Bereich von globulären Embryoiden erkennen wir Zellen mit einer gold-bräunlichen amorph erscheinenden Masse, neben Zellen mit granulären Zellbestandteilen (Abb. 25i). Diese Zellen liegen in mehreren Gewebelagen der globulären Embryoiden verstreut vor. In der weiteren Entwicklung der globulären Embryoiden erfolgt eine stärkere Differen- zierung in langgestreckte Formen. Embryoidogene Zellhaufen weisen zunehmend diese langgestreckten Objekte in unterschiedlichen Größen, Farben und Formen auf (Abb. 26a). Globuläre Embryoide sind durch eine herzförmige Form in der nächsten Stufe der Entwicklung gekennzeichnet (Abb. 26b und c). Diese Embryoide sind mehr breit als hoch entwickelt (Abb. 26b). Bezüglich der Bezeichnung von morphologischen Merkmalen bei den hier entwickelnden in vitro vermehrten Pflanzen sollen die Begriffe Embyroide, Hypokotyl, Kotyledonen als Embryo ähnliche, Hypokotyl ähnliche, Kotyledonen ähnliche Strukturen angesehen werden, da die klassische botanische Bezeichnung dieser Begriffe bei Pflanzen, entwickelt aus Samen, angewendet werden. Jeweils zwei Primordien von Kotyledonen ähnlichen Strukturen („Kotyledonen“) werden an einer Stelle der globulären Embryoide sichtbar. Die Embryoide sind von keiner Testa umgeben. Es folgt eine Bildung des „Hypokotyls“(Hypokotyl ähnliche Struktur). Durch die Kultivierung der Embryoiden mit Weißlicht ergrünen sie in lokal

76 Ergebnisse

Abb. 26: Pflanzengewebekultur der somatischen Embryoide (SE) von E. sieboldianus (a) Embryoide aus embryoidogenen Kallus. (b) Embryoid im Herzstadium. (c) bis (e) Embryoide „strecken“ sich zunehmend (c: Embryoid als Alkoholmaterial) (f) Embryoid im Torpedostadium mit Kotyledonen (K) (Längsschnitt gefärbt mit Touidinblau). (g) bis (i) Deformierte Embryoide, (g) und (h) 2 zusammengewachsene Embryoide mit „Kotyledonen“ (K) und „Plumula“ (Pfeil). (i) „Kotyledonen“ von 2 zusammengewachsenen Embryoiden. (j) „Normal“ entwickelter somatischer Embryoid mit „Kotyledonen“ und „Wurzelpol“. (k) „Keimende“ somatische Embryoide auf Nährmedium in Petrischale. Toluidinblau-Färbung in (f) und (g). Maßstab in (a), (c), (d), (e), (h) ≙ 500 µm, (b) ≙ 250 µm, (f) = 200 µm, (g) ≙ 200 µm, (i) und (j) ≙ 1 mm, (k) ≙ 1 cm

77 Ergebnisse begrenzten Bereichen - den „Kotyledonen“. Wir finden mehrere Embryoide mit unterschiedlich stark gestreckten Hypokotylen, wo die Kotyledonen kaum klar differenzierte Strukturen zum „Hypokotyl“ zeigen (Abb. 26d und e). Längsschnitte von diesen Embryoiden des Torpedostadiums (Embryoid mit gestreckten Hypokotyl) zeigen einen bipolaren Aufbau. Apikal bilden sich die zwei dorsiventral stehenden Kotyledonen heraus mit dem dazwischen liegenden Sprossapikalmeristem. Äußerlich sind die Kotyledonen an der grünen Farbe erkennbar. Weiterhin sind diese zum Sprossapikalmeristem hin gekrümmt und besitzen einen glatten Rand. Basal wird der Wurzelpol mit dem Wurzelmeristem angelegt (Abb. 26f). Leitbündel durchziehen hierbei das Hypokotyl. Neben einzeln vorkommenden Embryoiden treten auch Formen von Verwachsungen mehrerer Embryoide auf (Abb. 26g). Stark gestauchte Embryoide des Torpedostadiums bilden kleine kompakte rechteckige Cluster aus (Abb. 26h). Im Längsschnitt dieser Cluster sehen wir mehrere Embryoide, die zusammengewachsen sind (Abb. 26i). Im Anschluß an das Torpedostadium folgt das „Koyledonenstadium“. Der gesamte Embryoid verdickte sich. Eine stärkere Differenzierung der Form der Kotyledonen beginnt. Die Kotyledonen vergrößern sich und entwickeln geränderte Formen (Abb. 26j). Aus dem Bereich des Wurzelpols wächst eine weißliche „Primärwurzel“(der Primärwurzel ähnliche Struktur) aus, welche Wurzelhaare bildete. Die Kotyledonen bilden verstärkt einen Petiolus aus (Abb. 26k; 27a). In der weiteren Entwicklung entwickeln sich die „Primärblätter“ (Primärblätter ähnliche Struktur), die teilweise bereits stark gesägte Laubblattränder zeigen (Abb. 27b). Die einen Monat alten Pflänzchen produzieren weitere Laubblätter und Wurzeln in der nährstoffarmen Knop-Lösung in abgeschlossenen sterilen Plastikbehältern (Abb. 27c). Die aus der Flüssigkeit transferierten Pflanzen zwei Monate in Torfsubstrat kultiviert, besitzen 3- 5 fach fingerförmig gefiederte Laubblätter (Abb. 27d). Nach drei Monaten setzt kontinuierlich ein Längenwachstum der Sprossachse ein. Fünffach fingerförmig gefiederte hell- bis dunkelgrüne Laubblätter mit einer Blattspreitenlänge von 5 cm sind wechselständig an der aufwärts wachsenden Sprossachse einzelner Pflanzen angeordnet (Abb. 27e). Zwei Jahre alte Pflanzen, kultiviert in mit Erde gefüllten Plastiksäcken, entwickeln mehrere über 1 m lange verholzte Triebe. Der Durchmesser dieser Sprossachsen beträgt 8– 13 mm (Abb. 27f). Es treten dann verstärkt Kurztriebe neben Langtrieben auf, an

78 Ergebnisse

Abb. 27: Kultur der Jungpflanzen aus somatischen Embryoiden von E. sieboldianus (a) „Gekeimter“ somatischer Embryoid mit „Primärwurzel“ und zwei „Kotyledonen“. (b) Jungpflanze mit „Primärblättern“ (P) und „Kotyledonen“ (K). (c) Hydroponische Kultur der Jungpflanzen. (d) 4 Monate alte Jungpflanzen mit „Folgeblättern“, kultiviert in Erdsubstrat. (e) Jungpflanzen mit „Folgeblättern“ an einer Sproßachse nach 1 Jahr (rechte Pflanze), jeweils 1 Stachel (S) entwickelt sich an einem Nodium (Detailbild); (f) bis (i) Zweijährige verholzte Pflanzen, kultiviert im Freiland, mit Kurztrieben (g) und Stacheln (S) ( in h). (i) Wuchsform mit überhängenden Zweigen ausgebildet im Vergleich zu (f) aufrechte Wuchsform. Maßstab in (a) ≙ 2 mm, (b) ≙ 5mm 79 Ergebnisse denen fünffach fingerförmig gefiederte Laubblätter rosettenartig angeordnet sind (Abb. 27g). In der Nähe der Kurztriebe haben sich jeweils ein bis drei Stacheln entwickelt (Abb. 27h). Der Habitus der mikrovermehrten Pflanzen gleichen Alters weist folgende Merkmale auf: Pflanzen wachsen mit aufwärts gerichteten Sprossachsen heran, die sich apikal krümmten (Abb. 27f). Triebe anderer Pflanzen sind schon von der Basis her stark gekrümmt (Abb. 27i). Blüten oder Blütenstände werden an den mikrovermehrten zwei Jahre alten Pflanzen nicht gebildet. 3.6.2. Deformationen des Pflanzenmaterials in der Pflanzengewebekultur Wir finden Deformationen einzelner Organe bei 1 - 2 Monate alten mikrovermehrten Pflänzchen in verschiedenen Reihen neben normal (Abb. 28f) aussehenden Pflänzchen. Es treten hierbei Verbänderungen der Sprossachsen auf (Abb. 28a). Andere Pflänzchen bilden feste Wucherungen an Sprossachsen (Abb. 28b), wiederum andere Exemplare zeigen mehrere Millimeter große eiförmige, grüne, geriffelten Knöllchen an der Basis der Laubblattgrundes (Abb. 28c). An verschiedenen Bereichen der Sprossachsen erkennen wir zu dem Risse in der Epidermis aus denen lockeres Gewebe austrat (Abb. 28c). Auch Laubblätter unterliegen teilweise Verbänderungen (Abb. 28d). Die finger- förmig gefiederten Laubblätter werden hier nicht ausgebildet. Mehrere auskeimende Embryoide bleiben in der Phase der Entwicklung von Kotyledonen stecken. Dabei heften sich mehrere Embryoide zusammen und liegen in nestförmigen Strukturen mit sich entwickelnden Wurzeln auf den gelritehaltigen Nährmedien vor (Abb. 28e). 1 - 2 Monate alte mikrovermehrte Pflanzen, kultiviert auf A3 - und Minimal-Medium, weisen verschiedene Deformationen der Wurzelhaare auf. Betrachten wir die Wurzelhaare in Petrischalen mit dem Lichtmikroskop, so sehen wir neben geradlinigen Haaren auch andere Formen: • Verzweigte Wurzelhaare – es entwickeln sich lateral „Wurzelhaarseitenäste“ unterhalb des Wurzelhaarapexes (Abb. 29a) • Wurzelhaare mit gekrümmten Wurzelhaarapex (Abb. 29b) • Wurzelhaare mit blasenartigen Anschwellungen des Wurzelhaarapexes oder des intermediären Bereiches (Abb. 29c) • Sägezahnähnliche Ausbuchtungen der Wurzelhaare lokal begrenzt (Abb. 29d)

80 Ergebnisse

Abb. 28: Deformationen des Pflanzenmaterials aus der Pflanzengewebekultur von E. sieboldianus (a) Jungpflanze mit Verbänderung (Pfeil) der Sprossachse. (b) Gewebewucherungen (Pfeile) an der Sprossachse. (c) Grüne Knöllchen (Pfeilspitze) an Sprossachse mit Riss (Pfeil). (d) Pflanze mit deformierten Laublättern (Pfeile). (e) Embryoide (Pfeil) in ihrer Entwicklung zurückgeblieben mit Wurzeln (Pfeilspitze) (f) Normal entwickelte Jungpflanze. Maßstab in (a) ≙ 2 mm, (b) ≙ 4 mm, (c) ≙ 1 mm, (d) ≙ 2,5 mm, (e) und (f) ≙ 1 cm

81 Ergebnisse

Alle oben beschriebenen unterschiedlichen Typen von Wurzelhaaren können innerhalb eines Wurzelsystems vorkommen, sind aber nicht vorhersehbar. Weiterhin kommen mehrzellige geradlinig wachsende Wurzelhaare mit transversalen Zellwänden vor (Abb. 30a und b). Sie treten in einer kleineren Anzahl als die deformierten Wurzelhaare auf.

Abb. 29: Deformation der Wurzelhaare von E. sieboldianus aus Pflanzengewebekultur (a) Verzweigte Wurzelhaare (Pfeile). (b) Gekrümmte Wurzelhaare (c) Wurzelhaare mit blasenartigen Anschwellungen (Pfeile). (d) Wurzelhaare mit sägezahnartigen Ausbuchtungen (Pfeile). Maßstab in (a) ≙ 50 µm, (b), (c) und (d) ≙ 100 µm

Abb. 30: Mehrzelliges Wurzelhaar von E. sieboldianus aus Pflanzengewebekultur (a) Mehrzelliges Wurzelhaar mit Querwand. (b) Ausschnitt – Querwand. Maßstab in (a) ≙ 20 µm und (b) ≙ 10 µm 82 Ergebnisse

3.6.3. Mikroorganismen in der Pflanzengewebekultur Einzelne Stichproben vom Inneren der embryoidogenen Zellhaufen entnommen, weisen mikroorganismische Partikel auf. Diese stäbchenförmigen Objekte liegen in großen dichten Ansammlungen zwischen einzelnen Zellen und Zellaggregaten vor (Abb. 31).

Abb. 31: Mikroorganismen in embryoidogenen Kallus

Ansammlung stäbchenförmiger Mikroorganismen (Pfeil) in der Nähe von Kalluszellen. Maßstab ≙10 µm Diese untersuchten Zellhaufen, betrachtet mit dem Stereomikroskop, weisen äußerlich keinerlei Anzeichen von den stäbchenförmigen Mikroorganismen auf. Milchige trübe oder schleimige Flüssigkeiten um die Zellhaufen als Merkmal für die Anwesenheit von Mikroorganismen fehlen. Diese stäbchenförmigen Mikroorganismen aus dem Inneren der Kallusse besitzen zwei strukturell leicht veränderte angeschwollene Enden (Abb. 31). Nachweise für Stärke und Lipide dieser Objekte verlaufen negativ. Bei 1 – 2 Monaten alten in vitro vermehrten Pflänzchen weisen einzelneWurzelhaare ein intrazelluläres Granulat aus eiförmigen Körnchen. Diese Wurzelhaare liegen im Nährmedium eingebettet vor. Der Grad der Granulierung schwankt. Es liegen sowohl Wurzelhaare mit einer geringeren Dichte dieser eiförmigen Objekte vor als auch stark angereicherte (Abb. 32a, b und c). Desweiteren finden wir Wurzelhaare mit einer granulären Masse im apikalen Bereich, die eine irreguläre Form besitzt (Abb. 32f). In

83 Ergebnisse

Abb. 32: Mikroorganismen in Wurzelhaaren von Eleutherococcus sieboldianus aus Pflanzenge- webekultur (a)Vereinzelte Wurzelhaare (Pfeil), intrazellulär mit Mikroorganismen besiedelt. (b) Wurzelhaar mit ovalen Mikroorganismen (Pfeil) neben nicht besiedeltem Wurzelhaar. (c) Wurzelhaar mit sich bewegenden Mikroorganismen (Pfeil) (Filmausschnitt) und apikaler mikroorganismischer Masse. (d) und (e) heraus präparierte Mikroorganismen aus Wurzelhaar. (d) ovaler Mikroorganismus mit Geißel (Pfeil). (e) Stäbchenförmiger Mikroorganismus mit Einschnürung (Pfeil). (f) Gefüllte Wurzelhaare mit mikroorganismischer Masse. Maßstab in (a) ≙ 20 µm, (b), (d), (e) ≙ 10 µm, (f) ≙ 50 µm

84 Ergebnisse diesen granulär strukturierten Wurzelhaaren bewegen sich stäbchenförmige und ei- förmige Mikroorganismen (S. die der Printversion beigelegte DVD). Hierbei zeigen die stäbchenförmigen Mikroorganismen einen Bewegungsmodus im Wurzelhaar von basal nach apikal und zurück. Teilweise treten sie am Apex heraus. Drei Tage nach dieser ersten Beobachtung nahmen wir diese schnelle Bewegung nicht mehr war. In diesen granulierten Wurzelhaaren finden wir nach gezielter Zerlegung 2 - 2,5 µm große ovale Objekte mit einer Geißel (Abb. 32d). Der Videobeleg zeigt dazu die Bewegung dieser ovalen Körper und der Anhängsel in einem Wurzelhaar. Diese Anhängsel ähneln der Geißel von Bakterien. Weiterhin finden wir 5 – 10 µm große bananenförmige Objekte (Abb. 32e). In der Mitte dieser gekrümmten Strukturen ist eine Vertiefung zu erkennen (Abb. 32e– horizontaler Pfeil). Außerdem beobachten wir Wurzelhaare mit einer feinen körnigen Masse, die scheinbar apikal aus den Wurzelhaaren herausquillt (Abb. 32c und f). Färbungen mit dem Farbstoff DAPI für DNS ergeben bei den zuvor beschriebenen Wurzelhaaren keine eindeutigen positive Reaktionen. Färbungen mit DASPMI für den Nachweis von Zellmembranpotentialen für die Mikroorganismen in den Wurzelhaaren verlaufen negativ. Die beschriebenen Mikroorganismen fehlen in deformierten Wurzelhaaren. Im Bereich der Rhizosphäre, die unmittelbar an die Wurzelhaare und Rhizodermis angrenzt, entdeckten wir viele kleine Partikel. Diese Partikel waren häufig dicht zu halbkreis- förmigen Formationen angeordnet. Wurzelapex und darunterliegende Bereiche sind durch diese strukturelle Form gekennzeichnet (Abb. 33a und b). Die Partikel sind in einer durchscheinenden Flüssigkeit, eine Art Schleim eingebettet. Diese Partikel sind oval und begeißelt und ähneln denen in den Wurzelhaaren. Fädige und kleine stäbchen- förmige Mikroorganismen bewegen sich in den Flüssigkeiten (Abb. 33c und d). Mikroorganismische Partikel sind auch auf der Oberfläche der Wurzeln (Rhizoplane) und zwischen den Wurzelhaaren, eingebettet im Nährmedium, verstreut vorhanden. Wurzeln, die auf der Oberfläche des Festmediums wachsen, zeigen diese Merkmale nicht. In einem weiteren Experiment versuchten wir die Mikroorganismen dieser in vitro vermehrten Pflanzen auf Bakterienagarmedium 20 E anzureichern, um sie dann zu isolieren. Um einzelne isolierte Wurzelstücke, ausgelegt auf Bakterienagarmedium 20E,

85 Ergebnisse

Abb. 33: Mikroorganismen und Partikel in der Rhizosphäre von E. sieboldianus in Pflanzenge- webekultur

(a) Apikalbereich der Wurzel mit mikroorganismischen Partikeln (Pfeil). (b) Basaler Wurzelbereich mit mikro-organismischen Partikel (Pfeil). (c) und (d) sich bewegende „spaghettiförmige“ Partikel (Pfeile) in der Rhizosphäre. Maßstab in (a) ≙ 100 µm, (b) ≙ 200 µm, (c) und (d) ≙ 50 µm

86 Ergebnisse bilden sich Kolonien von Mikroorganismen mit einer stark gelappten gelbfarbenen Oberfläche. Zweifache Verdünnungsausstriche von Proben dieser Kolonien ergaben nach 3 Tagen bei 28°C weitere Kolonien von Mikroorganismen mit einer gelben und weißen Farbe. Besonders die gelappten gelbfarbenen Biofilme fallen dabei auf (Abb. 34a und b). Die Biofilme sind hier erhaben und bestehen aus zellenähnlichen Strukturen (Abb. 34c). Quetscht man diesen Biofilm (Abb. 34d), so kommen stäbchenförmige Mikroorganismen mit dauersporenähnlichen Einschlüssen (Abb. 34e) und Einschnü- rungen (Abb. 34f) zum Vorschein. Ein anderer Verdünnungsausstrich ergab eine schimmelartige Ansammlung von Mikroorganismen (Abb. 34g). Darin fanden wir ein 35 µm großes cyanobakterienähnliches Gebilde (Abb. 34h). Ein 3. Typ von Ver- dünnungsausstrich hatte eine gelbe glatte Oberfläche (Abb. 34i). Im Inneren der Kolonien kommen kurze stäbchenförmige Mikroorganismen vor (Abb. 34j und k). Von den gelbfarbenen Verdünnungsausstrichen gibt es weitere mit gelappten Biofilm und davon auslaufenden weißen Biofilm (Abb. 34l). Pyramidale Kristalle liegen nur im gelappten Biofilm vor (Abb. 34m). Kurze stäbchenförmige Mikroorganismen liegen dagegen nur im weißen Biofilm vor (Abb. 34n). Zwei weiße Verdünnungsausstriche ergeben Kulturen von Mikroorganismen mit glatter Oberfläche (Abb. 34o und r). Aneinanderliegende stäbchenförmige Mikroorganismen liegen darin vor (Abb. 34p, q und s). In einer Reihe bestehend aus fünf in vitro vermehrten Pflanzen mit verschiedenen Deformationen des Sprosses und der Laubblätter fanden wir runde und eckige Mikro- organismen ähnliche Partikel. Sie kamen intrazellulär in einzelnen Zellen von Gewebe- wucherungen vor (Abb. 35a). Sie lagen auch außerhalb der Zellen vor (Abb. 35b). Die eckigen 10 µm großen Gebilde besaßen an ihrer Peripherie kleine runde Einschlüsse (Abb. 35c und d). Die runden Gebilde waren durch eine stachelbewehrte Schale charakterisiert (Abb. 35b).

87 Ergebnisse

Abb. 34: Mikroorganismen (MO) isoliert aus Wurzelproben von E. sieboldianus aus Pflanzen- gewebekultur (a) bis (f) Mikroorganismen mit gelben Biofilm. (a) Kultur von MO. (b) Biofilmstruktur im Detail. (c) Biofilm als Scheingewebe, bestehend aus einzelnen Zellen von Mikroorganismen (d-f). (e) stäbchenförmige Zellen mit dauersporen-ähnlichen Gebilde (Pfeil). (f) MO-Zelle mit Verbindung (Pfeilspitze). (g) MO-Ausstrich, daraus einen Mikroorganismus (h) isoliert (*). (i) MO-Ausstrich mit dichten Besatz von MO-Zellen (j) Probe von MO aus (i) = (*). (k) Detail von (j).(l) MO-Ausstrich mit MO und Kristallen (m). (n) MO aus (l). (o) MO-Ausstrich. Davon stäbchenförmige Mikroorganismen (p) und (q). (r) Ausstrich von MO. (s) stäbchenförmige MO Maßstab in (a) ≙ , (b), (r ) ≙ 500 µm, (c), (d), (h), (j) ≙ 10 µm, (e), (k), (n), (p), (q), (s) ≙ 5 µm, (f) ≙ 2,5 µm, (g), (i) ≙ 2,5 mm, (l) ≙ 2mm, (m) ≙ 20 µm, (o) ≙ 1,5 mm

88 Ergebnisse

Abb. 35: Mikroorganismen in deformierten in vitro Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus (a) Vieleckige (Pfeil) und runde Mikroorganismen in Zellen von Wundkallus. (b) Runde Mikroorganismen (Pfeil) (c) Vieleckiger Mikroorganismus (Pfeil) mit runden Partikeln im Inneren – periphere (Konfokale Laserscanningmikroskopie) (d) Intermediäre Ansicht von (c). (Trypanblau-Färbung in (a) und (b)) Maßstab in (a) und (b) ≙ 10 µm, (c) und (d) ≙ 8 µm

89 Ergebnisse

3.7. Wurzelanatomie bei Eleutherococcus

Die Wurzeln aller untersuchten Eleutherococcus-Arten sind anatomisch gleich. Die primären Wurzeln sind weiß und haben einen Durchmesser von 200 – 400 µm. Die Rhizodermis besteht aus tangential 20 – 25 µm breiten Zellen und 40 – 50 µm longitudinal langen Zellen. Einzellige 50 – 100 µm lange geradlinige hyaline Wurzel- haare gehen 2 mm hinter dem Apikalmeristem aus einzelnen Rhizodermiszellen hervor. Eine einzellreihige Exodermis aus tangential 25 – 30 µm breiten und longitudinal 50 – 60 µm langen Zellen schließt sich der Rhizodermis an. Drei bis vier Zellreihen mit tangential 40 – 50 µm breiten und longitudinal 70 – 80 µm langen Rinden- parenchymzellen werden bis zur Endodermis ausgebildet (Abb. 36a). Die Endodermis besitzt schon sehr früh eine Suberinlamelle und bildet einen Casparyschen Streifen aus. Sie ist tangential 10 – 15 µm breit und longitudinal 20 – 30 µm lang. Der Perizykel schließt sich als einzelne Zellreihe der Endodermis an. Er umfasst zwei bis drei Harzkanäle. Die Harzkanäle werden von drei bis vier sezernierenden Zellreihen umschlossen. Die sezernierenden polygonalen Zellen haben radial eine Größe von 15 – 25 µm. Innerhalb des Perizykels befinden sich die Xylem- und Phloemelemente. Das Xylem besteht aus isodiametrischen Zellen mit einem Durchmesser von 10 – 15 µm. Die Wurzeln können ein di- oder triarches Leitbündel ausbilden (Abb. 36b). Das Phloem bestehend aus Geleitzellen, wird begrenzt von 4 – 6 einzeln angelegten Zellreihen von Siebröhren. Beide Phloemelemente(Geleitzellen und Siebröhren) liegen gegenüber zur Achse der Wurzel.

Die sekundär verdickten Wurzeln sind über 400 µm dick und haben eine braune bis gelbliche Farbe. Die Wurzeln besitzen ein zentrales Leitbündel mit einem Durchmesser von 900 µm bei 2 mm breiten Wurzeln (Abb. 37a). Die ovalen bis rundlichen ligninhaltigen Xylemelemente, bestehend aus Tracheen, mit einem Durchmesser von 80 bis 100 µm sind umgeben von kleinlumigen Xylemparenchym mit einem Durchmesser von 10 – 20 µm. Das Xylemparenchym ist stärkehaltig. Im Zentrum des Leitbündels werden zum

90 Ergebnisse

Abb. 36: Wurzel von Eleutherococcus im primären Entwicklungsstadium (a) Wurzelquerschnitt (b) Leitbündel im Detail R=Rhizodermis, E=Endodermis, HK=Harzkanal, P=Phloem, PZ = Perizykel, X = Xylem Toluidinblau-Färbung in (a) und (b); Maßstab in (a) ≙ 50 µm, (b) ≙ 20 µm

91 Ergebnisse

Teil noch unverholzte Xylemparenchymzellen ausgebildet (Abb. 37b). Vereinzelte primäre Holzstrahlen, bestehend aus hintereinander gereihten rechteckigen Zellen mit radial langen 20 – 30 µm im Querschnitt, verlaufen durch das Xylemparenchym in das Bastgewebe (Abb. 37b, Pfeil). Im Anschluss an das Xylem gibt es eine Zellreihe von 5 – 10 µm tangential breiten Kambiumzellen. Daran anschließend werden 20 – 25 µm breite tangential bzw. radial gestreckte Bastzellen in Reihen angelegt. 2 – 3 Zelllagen vom Kambium nach außen entfernt liegen einzelne Reihen von Geleitzellen jeweils umgeben von 4 – 6 einzelnen Zellreihen von Siebröhren, welche das Phloem ausbilden (Abb. 37d). Hier liegen auch Nester von ligninhaltigen Sklerenchymzellen vor (Abb. 37f). Danach werden weit- lumigere rundliche bis ovale Zellen mit einer tangentialen Breite von 50 µm in Richtung Periderm gebildet. Kalziumoxalatkristalle in Form von Drusen werden in rundlich bis ovalen Idioblasten, die im Bast vorliegen, gebildet (Abb. 37c). Unterhalb des Phellems und zwischen den Bastparenchymzellen werden Harzkanäle bestehend aus 3 - 6 sezernierenden Zellreihen angelegt (Abb. 37e). Ihre Lumenweite variiert zwischen 40 - 80 µm. Diese können paarweise oder einzeln vorliegen. Das Abschlußgewebe stellt ein stärkefreies Periderm dar. Es besteht aus 3 – 4 Zellreihen des Phellems bei 2 mm breiten Wurzeln. Die Anzahl erhöht sich auf 5 – 8 Reihen von Phellemzellen bei 3 – 4 mm breiten Wurzeln im Querschnitt. Die Phellemzellreihen sind strickleiterartig hintereinander zur Achse hin gereiht. Die Zellwände sind suberinisiert und lignifiziert. Sie sind 50 µm tangential breit und 60 – 80 µm longitudinal lang. Das Phellogen liegt als eine Zellreihe vor. Daran schließt sich eine Zellreihe von Phelloderm an. Vereinzelt wird das Phelloderm von Harzkanälen begrenzt (Abb. 37c). Stärke wird im Xylemparenchym und in Zellen des Bastgewebes gespeichert.

92 Ergebnisse

Abb. 37: Eleutherococcus-Wurzel, sekundäres Dickenwachstum (a) Gesamtansicht (b) Xylem (c) Rindenparenchym mit Periderm bestehend aus Phellem (P), Phelloderm (PD) und Phellogen (PG) und Drusen aus Kalziumoxalatkristallen (KK) (d) Geleitzelle (Pfeil) mit 5 Zellreihen von Siebröhren (e) Harzkanäle (f) Sklerenchymzellen (SZ) Phloroglucin-HCl-Färbung in (b) und (f); Maßstab in (a) ≙ 500 µm, (b) ≙ 100 µm, (c) ≙ 50 µm, (d) ≙ 20 µm, (e) und (f)≙ 20 µm

93 Ergebnisse

3.8. Mykorrhiza bei Wurzeln aus dem Freiland und Adventivwurzeln von Blattrisslingen von Eleutherococcus gracilistylus

Die Wurzeln der untersuchten Eleutherococcus-Arten werden in ihrer Gesamtheit von einzelnen sich verzweigenden Pilzhyphen im Erdreich umgeben (Abb. 38a). Das braun- weiße Pilzmyzel um Freilandwurzeln ist dimorph – es werden dicke und dünne Pilzhyphen ausgebildet. Die dicken Pilzhyphen besitzen einen Durchmesser von 10 – 20 µm und die dünnen 5 - 9 µm. Die dünnen Pilzhyphen sind Seitenhyphen von dicken Pilzhyphen. An den Enden der dicken Pilzhyphen werden öfters einzelne Sporen ausgebildet (Abb. 38b). 5 – 10 µm starke Pilzyhphen umgeben die Adventivwurzeln und verlaufen longitudinal oder quer auf der Rhizoplane. Nach außen stellen die einzelnen Pilzhyphen ein lockeres Pilzmyzel um diese Wurzeln dar. Die extraradikalen Pilzhyphen mit terminalen Appressorien penetrieren an verschiedenen Stellen der Wurzel einzelne Rhizodermiszellen. Dabei dringt die Pilzhyphe an der äußeren Tangentialwand in die Rhizodermiszelle ein und durchquert diese geradlinig. In der zweiten Cortexschicht bildet diese Hyphe eine oder zwei S-förmige Schleifen (Abb. 38e und f). In den darunterliegenden Rindenparenchymzellen werden vom Pilz weitere Hyphenschleifen, Arbuskeln und Vesikeln ausgebildet. Der Wurzelcortex mit Ausnahme der Endodermis wird von Pilzhyphen ausschließlich intrazellulär besiedelt (Abb. 38d). Außerdem zeigen Leitbündel und Apikalmeristem keine Besiedlung (Abb. 38c). Die sich verzweigende Haupthyphen verlaufen durch die Rindenparenchymzellen des Cortexes longitudinal und radial. Wenn die Haupthyphe eine Zellwand passiert, verringert sich ihr Hyphendurchmesser. Eine Cortexzelle kann von mehreren Nachbarzellen aus besiedelt werden. Es werden Besiedlungsnester mit einer Länge von 0,5 – 1 mm ausgebildet. Weiterhin kommen etwa 2 bis 4 Appressorien auf 1 cm Wurzellänge bei 30 Wurzelproben vor. Arbuskeln sind vielfach dichotom verzweigte laterale Seitenhyphen an mehrfach gewundenen Haupthyphen, die ab der 3. Cortexlage bis zur Endodermis intrazellulär ausgebildet wurden. Die Arbuskeln können die gesamte Cortexzelle ausfüllen (Abb. 39a bis c). Die Haupthyphen haben einen größeren Durchmesser als die daran ansetzenden Seitenhyphen. Der Verdau der Arbuskeln erfolgt von den Enden der fein verzweigenden Seitenhyphen. Diese bilden amorphe Klumpen, die dicht an ihren

94 Ergebnisse

Stammhyphen liegen. Die Klumpen vergrößern sich durch den Zusammenschluß mit weiteren Arbuskelästen (Abb. 39c bis d).

Abb. 38: Besiedlung von Eleutherococcus-Wurzeln durch Glomeromyzeten (a) Extraradikales Pilzmyzel (Pfeil) um Wurzeln. (b) Isoliertes extraradikales Pilzmyzel mit Sporen. (c) Wurzel (Längsschnitt) wird zum Apikalmeristem durch Glomeromyzeten besiedelt. (d) Wurzelquerschnitt mit Glomeromyzeten. (e) Einfache Pene- tration (Pfeil) der Hypodermis. (f) Zweifache Penetration der Hypodermis. Toluidinblau-Färbung in (c) und (d), Dreifachfärbung in (e) und (f); Maßstab in (a) ≙ 500 µm, (b) ≙ 100 µm, (c) ≙ 250 µm, (d) ≙ 50 µm, (e) ≙ 10 µm, (f) ≙ 20 µm

95 Ergebnisse

Abb. 39: Entwicklung der Arbuskeln und Vesikeln bei den Glomeromyzeten von Eleuthero- coccus ( a) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von einem zusammengesetzten Arbuskel (Pfeile). (b) Fein verzweigte Arbuskeln beginnen kleine pilzliche Zellklumpen (Pfeil) zu bilden. (c) Größere pilzliche Zellklumpen (Pfeil) im zusammengesetzten Arbuskel. (d) Einzelne Seitenhyphen (Pfeil) der Arbuskel degenerieren. (e) Stammhyphen und Seitenhyphen der Arbuskel kollabieren. (f) Intrazelluläre Vesikeln (V) in Wurzelcortexzellen. Toluidinblau-Färbung in (b) bis (f); Maßstab in (a) bis (e) 10 µm, (f) 20 µm ≙ ≙

96 Ergebnisse

Abb. 40: Intraradikale Sporen von Glomus intraradices in Adventivwurzeln von Blattriss- lingen von Eleutherococcus gracilistylus (a) Cluster von intraradikalen Sporen. (b) Isolierte intraradikale Sporen von Glomus intraradices. (c) Intraradikale Sporen in toten Wurzeln. (d) Querschnitt einer Wurzel im Zustand des primären Dickenwachstums mit intraradikalen Sporen (S). Trypanblau-Färbung in (c); Toluidinblau-Färbung in (d); Maßstab in (a) 250 µm, (b) 50 µm, (c) und (d) 100 µm

97 Ergebnisse

Schließlich kollabiert die Stammhyphe nach der Ausbildung der Konglomerate und bildet eine kompakte amorphe Masse aus (Abb. 39e). Arbuskeln liegen öfters neben verdauten in den Cortexzellen vor. Die oval geformten Vesikeln werden intrazellulär und terminal an den Haupthyphen ausgebildet. Ihre Länge beträgt 30 – 40 µm. Ältere Vesikel können die Rindenparenchymzellen vollständig ausfüllen. Vesikeln wurden im Cortex außer der Endodermis und der zweiten Cortexlage gefunden. Sie lagen verstreut neben Arbuskeln vor. Ihr Inhalt bestand aus kleinen Lipidtröpfchen (Abb. 39f). Zusätzlich zu den genannten Merkmalen wurden bei Adventivwurzeln von mykorrhizierten Blattrisslingen intraradikal Sporen von Glomus intraradices gefunden. 10 – 30 intraradikale Sporen lagen nestartig in jungen Wurzeln vor (Abb. 40a und c). Die 100 – 250 µm großen Sporen besitzen drei Zellwandschichten. Die äußere Schicht zeigt eine feine punktförmige Ornamentation (Abb. 40b). Abgestorbene Wurzeln weisen auch intraradikale Sporen mit Pilzhyphen im Cortex auf (Abb. 40d). Stirbt die Wurzel, so zerreissen die Rhizodermis und die darunterliegenden Rinden- parenchymzellen und die intraradikalen Sporen werden freigegeben.

3.9. Molekularbiologische Untersuchungen der mit Eleutherococcus-Arten assoziierten Glomeromyzeten

Eine PCR (polymerase chain reaction) von mykorrhizierten Wurzelproben verschiedener Arten von Eleutherococcus mit dem Primerpaar AM1 und NS31 war erfolgreich. Eine anschließende Klonierung und RFLP-Analyse erzielte 28 DNS-Klone mit jeweils verschiedenen RFLP-Mustern. Die Sequenzierung von E. divaricatus, E. henryi, E. lasiogyne, E. lasiogyne x E. sessiliflorus und E. senticosus ergab, dass die assoziierten Glomeromyzeten der Glomus Gruppe A angehören. Einige DNS-Sequenzen von Glomeromyzeten in E. divaricatus, E. henryi und E. lasiogyne sind sogar ähnlich zu der von Glomus hoi (AF485888). Der bootstrap beträgt hier 98%. Zusätzlich ergaben sich DNS-Sequenzen von Glomeromyceten bei E. divaricatus die Schwester zu Glomus Gruppe B sind. Die Ähnlichkeit zu Glomus Gruppe B zuordnen liegt bei einem Bootstrapwert von 53% (Abb. 41).

98 Ergebnisse

Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont

Glomus geosporum AJ245637 Glomus verruculosum AJ301858

Glomus fragilistratum AJ276085 Glomus caledonium Y17635

Glomus coronatum AJ276086 Glomus mosseae U96141 Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont

Eleutherococcus henryi Mycobiont Eleutherococcus henryi Mycobiont

Eleutherococcus divaricatus Mycobiont Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont

Glomus hoi AF485888 Eleutherococcus henryi Mycobiont Eleutherococcus henryi Mycobiont

E. lasiogyne x E. sessiliflorus Mycobiont Eleutherococcus henryi Mycobiont E. lasiogyne x E. sessiliflorus Mycobiont Glomus- Eleutherococcus henryi Mycobiont Gruppe A Eleutherococcus henryi Mycobiont E. lasiogyne x E. sessiliflorus Mycobiont

Eleutherococcus senticosus Mycobiont Eleutherococcus senticosus Mycobiont

E. lasiogyne x E. sessiliflorus Mycobiont Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont Eleutherococcus divaricatus Mycobiont Eleutherococcus lasiogyne Mycobiont

Eleutherococcus senticosus Mycobiont Glomus vesiculiferum L20824

Glomus fasciculatum Y17640 Glomus intraradices AJ536822

Glomus manihotis Y17648 Glomus clarum AJ276084

Glomus coremioides AJ249715 Glomus sinuosum AJ1337

Glomus proliferum AF21346 Eleutherococcus senticosus Mycobiont

Glomus versiforme AF276088 Diversispora spurcum AJ276077 Diversisporaceae Glomus etunicatum Y17644

Scutellospora projecturata AJ242729 Scutellospora cerradensis AB41344 Gigaspora decipiens U96146 Gigasporaceae

Gigaspora gigantea Z14010 Gigaspora albida Z14009

Entrophospora contigua Z14011 Entrophospora colombiana Z14006 Acaulospora rugosa Z14005 Acaulosporaceae Acaulospora laevis Y17633 Acaulospora scrobiculata AJ306442 Acaulospora spinosa Z14004

Eleutherococcus divaricatus Mycobiont Eleutherococcus divaricatus Mycobiont

Glomus luteum AJ276089 Glomus claroideum AJ276075 Glomus lamellosum AJ276087 Glomus- Glomus microaggregatum U96144 Gruppe B

Glomus viscosum Y17652 Archaeospora trappei Y17634

Archaeospora leptoticha AJ301861 Archaeosporales Geosiphon pyriformis Y15904

Paraglomus occultum AJ276081 Paraglomeraceae Paraglomus brasilianum AJ301862

Endogone pisiformis X58724 Outgroup Mortierella polycephala X89436 Abb. 41: Ein Maximum-Parsimonie-Baum der DNS-Sequenzen von 18S rDNS der Glomeromyzeten von verschiedenen Eleutherococcus-Arten

99 Ergebnisse

3.10. Experimente mit Sporen von Gigaspora margarita Becker & Hall

Um ausreichend Sporen für weiterführende Analysen über Gigaspora margarita Becker & Hall zur Verfügung zu haben, wurde eine Vermehrung mit Sporen des Glomero- myzeten an Wurzeln von Plantago major L. durchgeführt. Nach einem halben Jahr finden wir ein dichtes Wurzelgeflecht bestehend aus weißlich - hyalinen bis braunfarbenen Wirtswurzeln im Zustand des primären und sekundären Dickenwachstums vor. Dieses Wurzelgeflecht bildet einen festen kompakten Wurzel- ballen mit anhängenden Partikeln von Bodensubstrat. Auf der Oberfläche als auch im Inneren des Wurzelballens finden wir verstreut mehrere hellere Sporen, die sich von den braun-schwarzfarbenen Sandkörnern und Wurzeln abheben (Abb. 42a und b). Oft sehen wir mehrere Sporen nebeneinander. Die Sporen sind verbunden mit den Hyphen des verzweigten extraradikalen Pilzmyzels (Abb. 42a). Verschiedene Hyphen des extraradikalen Pilzmyzels haben an verschiedenen Stellen Kontakt zu den Wurzeln (Abb. 42a). Nach dem wetsieving-Verfahren isolierten wir 650 Sporen, die folgende Merkmale aufweisen: • Kugelförmige Gestalt • sichtbare glatte Oberfläche • Durchmesser: 300-600 µm • Farbspektrum der Sporen: weiß-gelb • Farbe der Suspensorzelle: braun • „pinzettenfeste“ Konsistenz der Sporen – d. h. mit Federstahlpinzette greifbar ohne diese zu zerstören 90% von 60 isolierten und oberflächensterilisierten Sporen keimten auf den Ober- flächen von Wassermedien und 85% auf Aktivkohlemedien in Glaspetrischalen bei 30°C im Dunkeln aus. Die Keimung der ersten Sporen beginnt bereits nach dem 1. Tag. Nach vier Tagen sind die restlichen Sporen gekeimt. In einem Umkreis von 500 µm um dem Ansatz der Suspensorzelle treten die Keimhyphen (auch als „Primärhyphen“ bezeichnet) aus (Abb.43a und b). Die Zahl der Keimhyphen variiert jeweils zwischen 1 und 8. Mehrere isolierte Sporen entwickeln nach zwei Tagen weitere Keimhyphen oder keimen erstmals nach drei Tagen.

100 Ergebnisse

Abb. 42:Gigaspora margarita assoziiert mit Wurzeln von Plantago major L. (a) Externes Pilzmyzel und Sporen. (b) Spore in Detailansicht. weißer Pfeil - Pilzhyphe; weiße Pfeilspitze - Spore; SZ – Suspensorzelle; Maßstab in (a) ≙ 1 cm, (b) ≙ 500 µm

Abb. 43: Sporen von Gigaspora margarita – Detailansicht (a) Spore ungekeimt. (b) Spore gekeimt. SZ – Suspensorzelle zerstört; schwarzer Pfeil – Keimhyphe; Maßstab in (a) und (b) ≙ 125 µm

101 Ergebnisse

Die coenocytisch dünnwandigen Keimhyphen zeichneten sich durch 20 – 23 µm breite basale Verdickungen, in der Nähe der Sporen, und abgerundete Hyphenapexe aus, die mit granulärem Zytoplasma des Pilzes gefüllt waren. Die Durchmesser betrugen zwischen 15 – 20 µm im basalen und intermediären Bereich, 10 – 13 µm im apikalen Bereich (Abb. 44a bis d). Auffallend war ein Gradient von lichtbrechenden Lipid- globuli. Deren Anzahl dieser Hyphenbestandteile nimmt zum Hyphenapex zu (Abb. 44b bis d). Im Hyphenapex der Keimhyphen liegen 10 – 20 Lipidglobuli vor. Die apikal dominanten Keimhyphen können während der weiteren Entwicklung „wechselständig“ Seitenhyphen (auch als „Sekundärhyphen“ bezeichnet) ausbilden (Abb. 49e). Der Durchmesser der Seitenhyphen beträgt 5 - 7 µm (Abb. 49f). Keim- hyphen mit Seitenhyphen höherer Ordnung kamen dabei nicht vor. Nach einem Monat hatten sich 8 – 10 cm lange Primärhyphen und 1 – 4 cm lange Sekundärhyphen ausgebildet. Die Sekundärhyphen sind im basalen Bereich der Primärhyphe länger als im apikalen Bereich. 20% der auskeimenden Sporen auf Wasseragar und 40% auf Aktivkohlemedium bilden unter in vitro Bedingungen an den Hyphen vereinzelt traubige „Auxiliarzellen“ (Siehe Diskussion 4.6.) (Abb. 45a). Es sind bläschenartige endständige Anschwellungen von gewundenen Seitenhyphen 2. Ordnung, mit einer Größe von 20 x 25 µm (Abb. 45a und b, 46c, 5d). Die Seitenhyphen 2. Ordnung werden „wechselständig“ an Seitenhyphen 1. Ordnung gebildet (Abb. 46a bis d). Die Anzahl der Auxiliarzellen in derartigen räumlichen Gebilden betrug 5 - 25. Die Oberfläche der Auxiliarzellen ist durch eine Vielzahl kleiner, schmaler, spitz zulaufender Auswüchse charakterisiert (Abb. 45b). Diese Strukturen sind hyalin. Die Entwicklung beginnt mit einer Verzweigung und Anschwellung von Seitenhyphen 2. Ordnung, wobei nicht zur gleichen Zeit alle Auxiliarzellen als Traube ausgebildet werden (Abb. 45c und d). Bereits nach 15 Stunden können wir so entwickelte Auxiliarzellen vorfinden. Neben den Auxiliarzellen fanden wir weiterhin apikal an Keimhyphen runde Gebilde, gefüllt mit einer braunen Masse und häufig abgegrenzt von transversalen Septen (Abb. 47a und b). Diese runden Gebilde treten nur bei den Sporen auf, bei denen keine Oberflächensterilisation mit Streptomyzin durchgeführt worden ist. Diese Sporen weisen mikrobielle Kontaminationen auf (Abb. 47a).

102 Ergebnisse

Abb. 44: Aufbau einer Keimhyphe von Gigaspora margarita (a) Gesamtansicht einer keimenden Spore. (b) Basaler, (c) intermediärer und (d) apikaler Bereich der Keimhyphe in (a). Pfeile – Lipidglobuli Maßstab in (a) ≙ 125 µm, (b), (c) und (d) ≙ 25 µm

103 Ergebnisse

Abb. 45: Auxiliarzellen von Gigaspora margarita – Überblick der Struktur und Entwicklung (a) Auxiliarzellcluster (Pfeile) an Hyphen von keimenden Sporen. (b) Cluster von Auxiliarzellen-Detailansicht. (c) und (d) Frühstadien der Entwicklung von Auxiliarzellen. Pfeilspitze = Auswuchs AZ = Auxiliarzelle

Maßstab in (a) ≙ 1 mm, (b), (d) ≙ 25 µm und (c) ≙ 125 µm

104 Ergebnisse

Abb. 46: Cluster von Auxiliarzellen – Aufbau. (a) Gesamtansicht (b) 1. optische Ebene (c) 2. optische Ebene (d) 3. optische Ebene. Pfeil = Hyphe einer Auxiliarzelle; Pfeilspitze = Seitenhyphe, die mit einer Auxiliarzelle verbunden ist. AZ=Auxiliarzelle Maßstab in (a) ≙125 µm, (b), (c) und (d) ≙ 25 µm

105 Ergebnisse

Transversale Septen finden wir bei Keimhyphen. Hierbei liegen Hyphen vor, die vollständig oder teilweise vom Apex zur Basis mehrfach transversal septiert sind (Abb. 48). Durch Septen abgegrenzte Hyphenabschnitte waren leer (Abb. 48). Vitale Hyphen besitzen keine Septen. Die Keimhyphen auf Wasser- und Aktivkohleagar bilden nach 4 - 6 Wochen Septen vom Apex aus. Nach Ausbildung der Septen findet kein Längenwachstum dieser Keimhyphen statt.

Abb. 47: Kugelige Gebilde an Hyphen von Gigaspora margarita (a) Unsterile Spore mit Keimhyphen, an einer Keimhyphe terminales kugeliges Gebilde mit transversalen Septen (Pfeil). (b) Kugeliges Gebilde an Keimhyphe Maßstab in (a) ≙ 250 µm, (b) ≙ 125 µm

Abb. 48: Septierte Hyphen von Gigaspora margarita

Pfeil markiert transversales Septum. Maßstab ≙ 250 µm 106 Ergebnisse

3.11. Experiment zum Gravitropismus bei Gigaspora margarita

Wenn die Sporen auf senkrecht gelagerten Wasseragarmedien so positioniert werden, dass die Suspensorzelle nach oben zeigt, wachsen die austretenden Keimhyphen fast gerade nach oben (Abb. 49a). Bei der umgekehrten Stellung wachsen sie kurzzeitig nach unten, um danach wieder nach oben zu wachsen (Abb. 49b). Verzweigende Keimhyphen zeigen ebenfalls einen negativen Gravitropismus. Die Seitenhyphen im Bereich der Basis der Keimhyphen wachsen hingegen positiv gravitrop (Abb. 49c – Nr.2). Solche im distalen Bereich zeigen wiederum einen Plagiotropismus (Abb. 49c – Nr.1). Diese Seitenhyphen wachsen dort also horizontal von der Keimhyphe weg (Abb. 49c). Wenn nun die Keimhyphe ihr Längenwachstum einstellt, übernimmt eine Seitenhyphe die Apikaldominanz und wird zur Primärhyphe. Diese Hyphe wird dann wieder negativ gravitrop (Abb. 49f). Dreht man nun die Wasseragarmedien mit den darauf aufgelegten ausgekeimten Sporen jeweils um 90°C, dann folgt diese Hyphe dieser Richtungsänderung, die Hyphe wächst wiederum fast senkrecht nach oben (Abb. 49g). Diese Charakteristik können wir nach einer weiteren Drehung um 90° erneut feststellen (Abb. 49h). Die Keimhyphen von Sporen auf horizontal gelagerten Medien wachsen senkrecht in den Luftraum. Eine Ansammlung von mehr als 10 Lipidglobuli mit einer Größe von 1 µm erkennen wir verstärkt im Apex der negativ gravitrop wachsenden Hyphen (Abb. 49e, 50a und b). Anderseits finden wir keine bzw. vereinzelt Lipidglobuli in den plagiotrop und nach unten wachsenden Seitenhyphen (Abb. 49d).

Abb. 50: Lipidglobuli im Apex gravitroper Pilzhyphen von Gigaspora margarita (a) Interferenzkontrast. (b) Autofluoreszenz (Anregungswellenlänge = 488 nm, Konfokale Laserscanmikroskopie). Pfeil =Lipid- globulus. Maßstab in (a) und (b) 10 µm

107 Ergebnisse

Abb. 49: Wachstumsmuster von Hyphen gekeimter Sporen von Gigaspora margarita in Beziehung zu ihrer Lage

(a) und (b) Gekeimte Sporen mit Keimhyphen (Pfeilspitze) auf vertikal gelagerten Medien. (a) Suspensorzelle mit Hyphe (SZ) ist nach oben ausgerichtet- benachbarte Keimhyphen (Pfeilspitze) wachsen fast senkrecht nach oben. (b) Suspensorzelle nach unten ausgerichtet – Keimhyphen (Pfeilspitze) zeigen anfänglich ein bogenförmiges Längenwachstum. (c) Spore mit einer Keimhyphe (Pfeilspitze) senkrecht gelagert, ihre Seitenhyphen verhalten sich plagiotrop (1) bzw. positiv gravitrop (2). (d) Apex der positiv gravitropen bzw. plagiotropen Hyphen mit Lipidglobuli (Pfeile). (e) Apex der negativ gravitropen Hyphe mit Lipidglobuli (Pfeile). (f) Spore mit sekundärer Laufhyphe (Pfeilspitze) (g) Spore mit sekundärer Laufhyphe aus Abb. (f) um 90° nach rechts gedreht. (h) Spore mit sekundärer Laufhyphe um weitere 90° nach rechts gedreht. Pfeil in (a) – (c); (f) – (h) ≙ Schwerkraftrichtung Maßstab in (a), (b) ≙ 250 µm, (c), (f), (g), (h), ≙ 500 µm, (d) ≙ 8 µm, (e) ≙ 10 µm

108 Ergebnisse

3.12. Inokulation von mikrovermehrten Pflanzen der Art Eleutherococcus sieboldianus mit Gigaspora margarita Hier analysierten wir, ob eine Besiedlung von Pilzhyphen aus gekeimten Sporen von G. margarita mit Wurzeln von zwei Monate alten in vitro vermehrten Pflänzchen von Eleutherococcus sieboldianus auf Agarnährmedien möglich ist. Wir beobachteten, dass von 40 Inokulationen nur in einem Fall erfolgreich eine Besiedlung des Wurzelcortexes durch Gigaspora margarita erfolgte. Bei den erfolglosen Infektionen bildeten die Keimhyphen, die Kontakt zu den Wurzeln haben, Septen aus. Die Hyphen wuchsen nicht weiter, ein Absterben dieser beginnt. Anderseits verliefen verschiedene Hyphen unter oder über die Pflanzenwurzeln. Die erfolgreich infizierte Wurzel, untersucht nach zwei Monaten, war gekennzeichnet durch die Ausbildung eines großen flächigen extraradikalen Myzels von mehreren Zentimetern (Abb. 51a und b). Das extraradikale Myzel bestand aus einer Keimhyphe, die sich in Sekundärhyphen verzweigte. Die Sekundärhyphen wiederum verzweigten sich in weitere Hyphen. Dabei fielen uns vier Hyphen mit deutlich breiteren Hyphendurchmessern auf. Sie bildeten Seitenhyphen aus, die sich wiederum bis zur 7. Ordnung verzweigten. Die Stammhyphen mit Apikaldominanz bildeten dünnere Seiten- hyphen in der Rhizosphäre aus. Andere hingegen wuchsen longitudinal ohne Kontakt zur Wurzel aufzunehmen (Abb. 51b und c). Die Infektionshyphe (Hyphe, die Appressorien ausbildet und die Wurzel besiedelt), die Kontakt zur Wurzel besaß, besiedelte den Wurzelcortex. Wir konnten das mittels Trypanblaufärbung nachweisen (Abb. 52a). In der Hypodermis bildete die Infektionshyphe eine S-förmige Hyphenschleife aus, die dann in den darunterliegenden Rindenparenchymzellen Arbuskeln ausbildete. Die Pilzhyphen mit interkalaren Arbuskeln breiteten sich intrazellulär in der Wurzel aus (Abb. 52b). Neben Arbuskeln wurden auch Hyphenschleifen ausgebildet (Abb. 52c). Wir konnten keine Vesikeln beobachten. Die Ausbildung von Sporen als ein wichtiges Merkmal für eine erfolgreiche Vermehrung des VAM-Pilzes Gigaspora margarita wiesen wir hierbei nicht nach. Hingegen wurden Auxiliarzellen als Traube außerhalb der Wurzel gebildet (Abb. 52d).

109 Ergebnisse

Abb. 51: Sterile Inokulation von Eleutherococcus sieboldianus in vitro mit Gigaspora margarita (a) Extraradikales Pilzmyzelium von G. margarita und Wurzel von E. sieboldianus-Überblick. (b) Extraradikales Pilzmyzelium von G. margarita – Detail aus (a). (c) Pilzhyphen von Gigaspora margarita an Wurzeln – Detail aus (a). Maßstab in (a) ≙ 2 cm, (b) ≙ 1 cm, (c) ≙ 500 µm

110 Ergebnisse

Abb. 52: Gigaspora margarita und Wurzeln von Eleutherococcus sieboldianus aus Pflanzenge-

webekultur (a) Besiedlung eines Wurzelabschnittes von G. margarita. (b) Arbuskel von G. maragarita. (c) Hyphenschleifen von G. margarita im Wurzelcortex. (d) Auxiliarzellen außerhalb der Wurzeln. Trypanblau-Färbung in (a) bis (d); Maßstab in (a) ≙ 50 µm, (c), (b) ≙ 10µm, (d) ≙ 20 µm 3.13. Inokulationsexperiment mit Glomus intraradices bei mikrovermehrten Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus Nach sechsmonatiger Kultivierung produzieren die mit Glomus intraradices inokulierten Pflanzen weniger Sprossfrisch- bzw. trockengewicht als die unbehandelten Pflanzen (Tab. 15a und 16a). Die inokulierten Pflanzen haben auch weniger Laubblätter an kürzeren Sprossachsen (Tab. 17c und 17b). Dagegen bleiben die Mittelwerte der Wurzelfrisch- und trockengewichte in beiden Behandlungen nahezu unverändert bei 2 bzw. 10 g pro Pflanze ohne statistisch signifikante Unterschiede (Tab. 15b und 16b). Die gemessene Wurzellänge ist bei den Kontrollpflanzen um 1 cm erhöht (Tab. 17a). Die daraus resultierenden Gesamtgewichte der entwickelten Sprosse weisen keine statistisch signifikanten Unterschiede auf (Tab. 15c und 16c). Das Wurzel-Spross- Verhältnis war bei den frisch und trocken gewogenen Sprossmaterialien von

111 Ergebnisse inokulierten Pflanzen zugunsten der Wurzel statistisch höchst signifikant erhöht (Tab. 15d und 16d). Auffallend ist die gelbe Verfärbung der Laubblätter der inokulierten Pflanzen nach dreimonatiger Kultur. Die nichtinokulierten Pflanzen behalten hingegen ihre grüne Laubblattfarbe (Abb. 53a und 53b). Am Versuchsende sind die nichtinokulierten und inokulierten Pflanzen durch eine geradlinig nach oben wachsende Sprossachse mit daran ansitzenden fingerförmig gefiederten Laubblättern und Stacheln charakterisiert. Blüten oder Blütenstände und Kurztriebe werden bei allen Versuchspflanzen diesen Alters nicht ausgebildet (Abb. 53c). Wir erkennen keine deutlichen Unterschiede im Muster der Verzweigung von Lateralwurzeln höherer Ordnung bei beiden Versuchsreihen (Kontrolle und Gint (Glomus intraradices)) (Abb. 53d und 53e).

112 Ergebnisse

18 18

16 16

14 14

12 12

10 10

8 8

6 6

4 4 Sprossfrischgewicht (g / Pflanze) Wurzelfrischgewicht (g / Pflanze)

2 2 Anzahl der Laubblätter *** n.s. 0 (P ≤ 0,001) 0 Kontrolle Gint Kontrolle Gint Behandlung Behandlung

24 4

22 3,5

) 20

18 3

16 / Pflanze 2,5 (g 14

12 2 ewicht g 10 1,5 8

6 1

Gesamtfrisch 4 Wurzel-Spross-Verhältnis pro Pflanze 0,5 2 n.s. *** 0 0 Kontrolle Gint Kontrolle Gint Behandlung Behandlung Tab. 15: Effekt der in vivo Inokulation mit Glomus intraradices (Gint) auf Frischgewichte von Spross (a) und Wurzel (b) von zwei Monate alten mikrovermehrten Eleutherococcus sieboldianus Pflanzen nach sechs Monaten. (c) Summe der Spross- und Wurzel- frischgewichte; (d) Quotient aus Wurzel- und Sprossfrischgewichten Säulen stellen die Meßdaten als Mittelwerte ± Standardabweichung (als Fehlerindikator eingezeichnet) dar. [***] statistisch höchst signifikant (P ≤ 0,001); [n.s.] – statistisch nicht signifikant (P > 0,05) von Kontrolle laut T- Test; Kontrolle = Pflanzen ohne Inokulum; n=27

113 Ergebnisse

5 5

4,5 4,5

4 4

3,5 3,5

3 3

2,5 2,5

2 2

1,5 1,5

1 1 Wurzeltrockengewicht (g / Pflanze) Sprosstrockengewicht (g / Pflanze) 0,5 0,5 *** n.s. 0 0 Kontrolle Gint Kontrolle Gint Behandlung Behandlung

5 3

4,5

2,5 4

3,5 ro Pflanze

p 2

2,5 1,5

ross-Verhältnis 1 1,5 p

1 0,5 Gesamttrockengewicht (g / Pflanze)

Wurzel-S 0,5 n.s. *** 0 0 Kontrolle Gint Kontrolle Gint Behandlung Behandlung Tab. 16: Effekt der in vivo Inokulation mit Glomus intraradices (Gint) auf Trockengewichte von Spross (a) und Wurzel (b) von zwei Monate alten mikrovermehrten Eleutherococcus sieboldianus Pflanzen nach sechs Monaten. (c) Summe der Spross- und Wurzel- trockengewichte. (d) Quotient aus Wurzel - und Sprosstrockengewichten.

Säulen stellen die Meßdaten als Mittelwerte ± Standardabweichung (als Fehlerindikator eingezeichnet) dar. [***] statistisch höchst signifikant (P ≤ 0,001); [n.s.] – statistisch nicht signifikant (P > 0,05) von Kontrolle laut T- Test; n=27; Kontrolle = Pflanzen ohne Inokulum

114 Ergebnisse

16 40

14 35

) ) 12 30

10 25

cm / Pflanze cm / Pflanze ( ( 8 20 e

e g g

6 15 zellän r

Wu 4 10 Sprosslän

2 5

* *** 0 0 Kontrolle Gint Kontrolle Gint Behandlung Behandlung

15 Tab. 17: Effekt der in vivo Inokulation mit Glomus intraradices (Gint) auf die Längen 10 von Wurzel (a), Spross (b) und Laubblatt- anzahl (c) von zwei Monate alten mikrovermehrten Eleutherococcus sieboldianus 5 Pflanzen nach sechs Monaten. Anzahl der Laubblätter pro Pflanze Säulen stellen die Meßdaten als Mittelwerte ± *** Standardabweichung (als Fehlerindikator eingezeichnet) dar. 0 statistisch signifikant [*] 0,05 ≥ P > 0,01; statistisch Kontrolle Gint höchst signifikant [***] P ≤ 0,001 von Kontrolle laut T- Behandlung Test; Kontrolle = Pflanzen ohne Inokulum; n=27;

115 Ergebnisse

Abb. 53: Morphologische Merkmale von mikrovermehrten Eleutherococcus sieboldianus Pflanzen (a) Inokulierte Pflanze und (b) nicht inokulierte Pflanze (Kontrolle) nach drei Monaten (aus einer Serie von jeweils 30 Pflanzen). (c) Pflanzen nach sechsmonatiger Kultur mit (Gint) und ohne Glomus intraradices (Kontrolle). (d) Proben von Lateralwurzeln isoliert von dickfleischigen Wurzeln aus dem Wurzelsystem von inokulierten (Gint) und nichtinokulierten (Kontrolle) (e) Pflanzen. Maßstab in (c) ≙ 5 cm, (d) und (e) ≙ 1 cm

116 Diskussion

4. Diskussion 4.1. Morphologische Beschreibungen der Sträucher Die Maße der Laubblätter und die Habitusbeschreibungen der untersuchten Eleutherococcus-Arten ähneln denen von Kim (1997). Unsere Beschreibungen der Hybride E. lasiogyne x E. sessiliflorus im Botanischen Garten Marburg stimmen mit denen von Frank (1983) überein. Diese Hybride wurde bei der Durchsicht der Eleutherococcus-Sammlung des Arboretums in Nový Dvur bei Opava (Slowakei) ursprünglich entdeckt (Frank, 1983). Die im Botanischem Garten Montreal gesammelte Varietät Eleutherococcus henryi var. nana ist nach Browicz und Bugala (1958) die einzige Zwergvariante von Eleutherococcus mit einer Höhe bis 50 cm. Sie wurde 1927 im Arboretum Kornik (Polen) aus Samen von Eleutherococcus henryi gezogen.

4.2. Anatomische Beschreibungen der Wurzeln Auffallend in den Wurzeln mit primären und sekundären Dickenwachstum der untersuchten Eleutherococcus-Arten sind die dreieckigen oder rautenförmigen Exkretgänge (Harzkanäle) im Perizykel. In den sekundär verdickten Wurzeln kommen sie auch in der Rinde vor. Jahn (1980) beschrieb diese Harzkanäle in den Wurzeln von Eleutherococcus-Arten E. divaricatus, E. sessiliflorus und E. setchuenensis ebenfalls. Die von Jahn (1980) untersuchten Wurzeln waren über 1 cm dick. Solche Wurzeln lagen nach unseren Untersuchungen nicht vor. Metcalfe & Chalk (1950), Kim (1997) und Kolalite (2001) deuten die Harzkanäle sogar als Familienmerkmal. Unsere Beschreibungen des Periderms, der sekundären Rinde, des Xylems und Phloems in Wurzeln mit sekundärem Dickenwachstum entsprechen den morphologisch- anatomischen Beschreibungen von Jahn (1980). Die Form der Kalziumoxalatkristalle in der sekundären Wurzelrinde zeigen den gleichen Aufbau wie solche in Laubblättern, Sprossachsen und Wurzeln von Panax ginseng Lee et al. (2002).

4.3. Bewurzelung von Laubblättern und Stecklingsvermehrung verschiedener Eleutherococcus-Arten

Grushvitzky et al. (1968) klassifizierte 14 Arten von Eleutherococcus (3 Arten), Schefflera Forst & Forst F., Polyscias Forst & Forst F., x Fatshedera Guillaumin, Fatsia Decne. & Planch., Hedera L., Oreopanax Decne. & Planch. und Brassaia Endl.,

117 Diskussion nach der Fähigkeit Wurzeln an Laubblättern und Blattfiedern in Sand mit und ohne Auxin zu entwickeln. Die beste Regeneration von Wurzeln zeigte Schefflera venulosa Harms. Bei Eleutherococcus lasiogyne (Synonym Acanthopanax lasiogyne Harms) beobachteten sie gar keine Wurzelregeneration. Den besten Erfolg zur Wurzelausbildung bei den Eleutherococcus-Arten hatte E. divaricatus (Synonym Acanthopanax divaricatum Seem.). In einem weiteren Bewurzelungsexperiment wurden Laubblätter von Panax ginseng C. A. Meyer mit und ohne Phytohormone bewurzelt. Durch Zugabe der Phytohormone erhöhte sich die Bewurzelungsrate (Grushvitzkaya et al., 1963; Jo, 1982, 1983; Choi et al., 1985). Der Zusatz von Auxinen beeinflusste die Quantität, aber nicht die Qualität der Ergebnisse. Auch unsere Ergebnisse zeigen, die Wurzelregeneration aus Laubblättern ist artabhängig. In unseren Studien nimmt die Fähigkeit zur Wurzelentwicklung und die Überlebensrate von Blattrisslingen und Fiederblättchen in Sand von E. lasiogyne x E. sessiliflorus über E. lasiogyne, E. henryi, E. divaricatus nach E. gracilistylus zu. In Leitungswasser bewurzeln sich am schlechtesten E. lasiogyne x E. sessiliflorus, E. henryi und E. lasiogyne im Vergleich zu E. divaricatus und E. gracilistylus, die deutlich höhere Bewurzelungs- und Überlebensraten aufweisen. Im Gegensatz zu Grushvitzky et al. (1968) konnten wir jedoch eine Wurzelentwicklung bei Eleutherococcus lasiogyne induzieren, aber deren Vitalität war begrenzt und immer niedriger als bei E. diavricatus und E. gracilistylus. Unsere Experimente mit durchtrennten Blattstielen, Fiederblättchen mit und ohne Fiederstiel und angeritzten Blattstielen von E. gracilistylus zeigen, dass kein Blattgewebe besonders zur Regeneration von Wurzeln besser geeignet ist als andere. Die Unfähigkeit Adventivsprosse aus bewurzelten Laubblättern zu bilden, nennt Goebel (1908) „unvollständige Regeneration“. Dies Phänomen ist nicht auf die Araliaceen beschränkt. Von 1204 untersuchten Arten regenerierten 41,6% Adventivwurzeln aus Blattstecklingen und nur 24% regenerierten Adventivsprosse (Hagemann, 1931). Lindemuth (1903) zählte nur 15 Arten von 123, welche Sprosse aus Laubblättern regenerierten, Stingl (1909) fand sogar nur 9 von 114 Arten. Winkler (1903) teilte die Laubblätter von Torenia asiatica L. (Scrophulariaceae) in drei Regionen (Blattbasis, untere Hälfte und obere Hälfte der Blattspreite) ein, wo Adventivsprosse entstehen könnten. Er erkannte keine konstanten Beziehungen der Punkte, an denen Sprosse

118 Diskussion entstehen, zu Spitze und Basis des Laubblattes, noch zu irgend einem äußeren Faktor. Die Sprosse können an der Basis des Blattstieles oder an diesem selbst oder an irgend einem beliebigen Punkt der Blattspreite entstehen. Adventivsprosse aus abgeschnittenen Fiederblättchen wurden nur bei Zamioculcas zamiifolia (Lodd.) Engl. (Araceae) gefunden (Cutter, 1962). Hierbei regenerierten Adventivsprosse aus Fiederblättchen ohne und mit Fiederstiel. Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl. bildete Adventivsprosse vor allem an der Blattbasis von Laubblättern mit Blattstiel und halber bzw. ganzer Blattspreite aus, wurde die Blattspreite entfernt, wurden keine Adventivsprosse an der Blattbasis entwickelt (Kumar et al., 1998). Bei Eleutherococcus gracilistylus konnten 20% von 210 Blattrisslingen Adventivsprosse regenerieren. Es könnte meristematisches Gewebe in Form von Initialzellen an der Blattbasis ausgebildet sein, das Adventivsprosse entwickelt. Entfernt man dies wird kein Adventivspross ausgebildet (Buckley, 2000). Schwarz (1933) versuchte vergeblich durch chemische und physikalische Methoden, jedoch nicht mit Rotlicht, Adventivsprosse bei Laubblättern zu induzieren. Es ist überraschend, dass Rotlicht bei einer kleineren Reihe mit 50 bewurzelten Laubblättern von Eleutherococcus gracilistylus 60% Adventivsprosse induziert. Rotlicht ist bekannt für seine positiven Effekte bei der vegetativen Vermehrung im Allgemeinen. Es fördert die Wurzelentwicklung bei Sprossstecklingen (Ruge und Brunner, 1972; Pinker et al., 1989), induziert Sprossverlängerungen bei in vitro vermehrten Pflanzen von Disanthus cercidifolius Maxim. (Marks und Simpson, 1999) und bei Kurztrieben von Larix decidua Mill. (Kretzschmar, 1993). Weiterhin stimuliert Rotlicht die Entwicklung von Seitenknospen in Asparagus officinalis L. (Kadkade und Wetherbee, 1983) und Achselsprosse von Azorina vidalii (Wats.) Feer (Moreira da Silva und Debergh, 1997), induziert eine Erhöhung in der Anzahl von somatischen Embryoiden aus Laubblattexplantaten von Cydonia oblonga Mill. (D'Onofrio et al., 1998) und kann das Wachstum von Adventivsprossen in Kalluskulturen von Daucus carota L. unterstützen (Fukuda und Kurata, 1992). Jedenfalls wurde Rotlicht bisher noch nicht bei bewurzelten Laubblättern angewendet. Rotlicht hat also einen fördernden Einfluss auf die Entwicklung von Adventivsprossen bei bewurzelten Laubblättern von Eleutherococcus gracilistylus. Diese Methode der Adventivsprossbildung stellt eine schonende Methode der Vermehrung von Eleutherococcus für die Praxis dar, da bei der Stecklingsvermehrung größere

119 Diskussion

Sprosssegmente den Sträuchern entnommen werden müssen und diese somit stärker verletzt werden als bei der Entnahme von einzelnen Laubblättern. Weiterhin könnten die regenerierten Adventivwurzeln der Laubblätter zur Produktion von Eleutherosiden dienen. Auch die Vermehrung von Sprossstecklingen ist artabhängig. Die Bewurzelungsrate nimmt von E. henryi, E. lasiogyne x E. sessiliflorus, E. divaricatus, E. lasiogyne nach E. gracilistylus zu. Durch die Zugabe des Auxins IES erhöhte sich die Bewurzelungsrate bei allen Eleutherococcus-Arten im Vergleich zu unbehandelten Stecklingen, unabhängig vom Kulturmedium. Im Kulturmedium Torf bewurzelten die Stecklinge besser als in Sand. Ahn und Choi (1992) konnten ebenfalls höhere Bewurzelungsraten von Sprossstecklingen bei verschiedenen Eleutherococcus-Arten mittels verschiedener Auxine (IES, IBA, NAA) feststellen. Der Einfluss des Kulturmediums bei der Bewurzelung von Sprossstecklingen von Eleutherococcus senticosus untersuchten Park et al. (1994) und Yi et al. (2001). Beide Autoren fanden heraus, dass Torf ein besseres Bewurzelungsmedium als Sand darstellt. Unsere Ergebnisse konnten dies bestätigen.

4.4. Somatische Embryoidogenese von Eleutherococcus sieboldianus Wir haben ein Vermehrungsverfahren für Eleutherococcus sieboldianus entwickelt, welches aus generativen Pflanzenmaterial (Laubblätter) vollständig entwickelte Pflanzen mit Sprossachsen, Laubblättern und Wurzeln regeneriert. Diese Regenerationsmethode ist unabhängig von Samendormanz oder Jahreszeit. Die somatische Embryoide von Eleutherococcus sieboldianus benötigen in unserem Vermehrungssystem keine niedrigen Temperaturen zum Keimen wie es für Panax ginseng C. A. Meyer (Lee et al., 1990), Eschscholzia californica Cham.(Kavathekar et al., 1977) und Vitis vinifera x V. rupestris (Takeno et al., 1983) beschrieben worden ist. Für Eleutherococcus sieboldianus konnten wir erstmals eine Proliferationsmethode aus Blattmaterial aufzeigen. Yang und Read (1991, 1997) zeigten eine Regeneration von E. sieboldianus aus Nodien, welche allerdings keine embryoidogene Phase durchliefen. Die somatische Embryoidogenese ist geprägt durch eine Entwicklungsreihe verschiedener Embryoidstadien, welche zu sexuell entstandenen Embryonen bei zweikeimblättrigen Angiospermen ähnlich ist. Einen großen Unterschied bei den

120 Diskussion

Entwicklungsreihen gibt es beim somatischen Embryoid. Der somatische Embryoid ist nicht von einer Samenschale umgeben und wird aus embryoidogenen Kalluszellen gebildet. Diese Regenerationsart nennt man indirekte somatische Embryoidogenese (Williams und Maheswaran, 1986). Die direkte Embryoidogenese erfolgt direkt an Pflanzengeweben ohne Kallusphase (Brown, 2004). Die Regeneration von somatischen Embryoiden von E. koreanus aus embryoidogenen Kallus von Sprosssegmenten (Choi et al., 1997) bzw. von E. senticosus aus Laubblättern (Li und Yu, 2002) ähneln unserer somatischen Embryoidogenese von E. sieboldianus. Es werden hierbei verschiedene Entwicklungsstadien (globuläre Embryoide, herzförmige Embryoide, Embryoide im Torpedostadium) ausgebildet (Brown et al., 2004). Die extraembryoidogene Matrix um die globulären Embryoide wird auch bei in vitro vermehrten Pflanzen der Art Cichorium intybus x Cichorium endivia (Dubois et al., 1992), Coffea arabica L. (Sondahl et al., 1979), Drosera spathulata Labill. (Bobák et al., 2003), Pinus nigra Arnold (Jasik et al., 1995) und Triticum aestivum L. (Konieczny et al., 2005) gebildet. Ihre Funktion ist unbekannt. Das Auxin 2,4-D ist für die Regeneration von somatischen Embryoiden aus Kallus von E. sieboldianus wichtig. Ähnliche Anforderungen sind bei in vitro Kulturen von Sorghum bicolor (L.) Moench (Wernicke und Brettell, 1980), Pennisetum americanum (L.) Leeke (Vasil und Vasil, 1982) und Allium fistulosum L. (Kim und Woong, 1996) beschrieben worden. Die Deformationen einiger in vitro vermehrten Pflanzen könnte durch das angewendete Phytohormonregime beeinflusst sein (Chengalrayan et al., 1997). Anderseits könnten auch endophytisch lebende Mikroorganismen, wie Zoosporenpilze (siehe nächster Abschnitt) die Ursache sein.

4.5. Deformationen von Wurzelhaaren und Pflanzen und Mikroorganismen assoziiert mit Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus aus Pflanzenge- webekultur

Die Deformationen der Wurzelhaare von E. sieboldianus in der Pflanzengewebekultur lässt verschiedene Interpretationen zu. Die Gabelung, die sägezahnartige Ausbuch- tungen bzw. die gekrümmten Wurzelhaarapexe ähneln denen von Rhizobien infizierten Wurzelhaaren bei Leguminosen (Nutman, 1959; Ervin und Hubbell, 1985), von

121 Diskussion

Azospirillum-Arten infizierte Wurzelhaare von Triticum aestivum L. (Jain und Patriquin, 1985; Fedonenko et al., 2001) mit Zellextrakten von Bacillus circulans behandelten Wurzelhaaren von Sojabohnen (Lian et al., 2001), von Endophyten befallene Wurzeln von Myrica gale L. (Fletcher, 1955) und von Frankia infizierte Wurzelhaare bei Alnus glutinosa (L.) Gaertn. (Ghelue et al., 1997). Die blasig angeschwollenen hypertrophierten Wurzelhaarapexe erinnern an Sorosphaera radicale (Cook und Schwartz, 1929), Ligniera pilorum, Olpidium brassicae oder Plasmodiophora brassicae infizierte Wurzelhaare (Karling, 1968). Unsere lichtmikroskopischen Untersuchungen zeigen aber keinerlei Hinweise auf diese Organismen in den Wurzelhaaren. Jedoch könnten die isolierten Mikroorganismen aus Wurzelsegmenten mit deformierten Wurzelhaaren Nod-Faktor (Chitolipooligo- saccharid) ähnliche Substanzen produzieren, die diese Wurzeldeformationen hervorrufen. Beispiele dafür zeigen Ervin und Hubbell (1985), Dazzo et al. (1996) und Kelly und Irving (2003) in ihren Arbeiten mit Nod-Faktoren von Rhizobien. Die Wurzelhaardeformationen könnten aber auch durch das Kulturmedium verursacht sein. Hill (1908) transferierte bewurzelte Sämlinge von Salicornia und Suaeda aus einer Salzlösung in Leitungswasser. Dabei veränderten sich die Form der Wurzelhaare. Angeschwollene und verzweigte Wurzelhaare wurden ausgebildet. Cormack (1935) inkubierte bewurzelte Sämlinge von Brassica napus L. var. chinensis in destilliertem Wasser. Auch hier treten Deformationen der Wurzelhaare in Form von Verzweigungen auf. Wurzeln mit Wurzelhaaren, kultiviert in Lösungen mit Kalziumchlorid mit unterschiedlichen pH-Werten zeigen ebenfalls Deformationen (Farr, 1928). Die eckigen 10 µm großen Gebilde aus deformierten Pflänzchen könnten Sporozysten von Spongospora spp. (Diriwächter, et al. 1979; Qu, et al. 2001) oder Dauersporen von Olpidium spp. sein, beides sind Plasmodiophoromyzeten. Plasmodiophoromyzeten induzieren in der Tat Hypertrophierungen und starke Zellteilungen in infizierten Geweben (Karling, 1968). Die einfach begeißelten ovalen 2-3 µm großen Mikroorganismen in geradlinigen Wurzelhaaren könnten Zoosporen von Chytridiomyzeten sein (Barr, 1978). Zum Beispiel Johnkarlingia brassicae bildet nur 0,5 - 1 µm große Zoosporen (Singh und Pavgi, 1979), Synchytrium lagenariae nur 2,5 – 5 µm große Zoosporen aus (Rao und Pavgi, 1979).

122 Diskussion

Bei den von uns isolierten Mikroorganismen aus Wurzelsegmenten ist eine nähere taxonomisch-systematische Einordnung anhand der lichtmikroskopischen Unter- suchungen schwierig. Wir können nur vermuten, dass wir Bakterien und womöglich auch eukaryotische Mikroorganismen isoliert haben. Eine molekularbiologische Analyse zur Systematik und Taxonomie ist hier empfehlenswert. Anhand von Referenz- DNS-Sequenzen der 16S rDNS für Bakterien, 18S rDNS und ITS (internal transcript spacer)-Regionen bei Eukaryoten mit denen mittels eines bestimmten Primerpaares erhaltenen DNS-Sequenzen kann eine nähere taxonomisch-systematische Einordnung erfolgen. Erste morphologische Hinweise von Bakterien könnten sein die gelben gelappten Biofilme erhalten aus Wurzelsegmenten von Eleutherococcus sieboldianus aus der Pflanzengewebekultur, welche den Biofilmen von Bacillus subtilis isoliert aus Wurzeln von Raphanus sativa L. und Beta vulgaris L. ähneln (Fall et al., 2004). Der Ursprung der nachgewiesenen Mikroorganismen ist nach den bisherigen Ergebnissen noch unbekannt. Die Mikroorganismen in den Explantaten der Laubblätter von Eleutherococcus sieboldianus können schon endophytisch vorgelegen haben. Es ist bekannt, das Pflanzen in ihren gesunden Geweben von Laubblättern, Wurzeln und Sprossachsen Bakterien (Hallmann et al., 1997; McCully, 2001) und Pilze (Saikkonen et al., 1998; Faeth und Fagan, 2002; Suryanarayanan et al., 2002) beherbergen. Durch die Subkultivierung werden diese Mikroorganismen auf weitere Zellen und Gewebe der sich in vitro regenerierenden Pflanzen übertragen. Hierbei konnten wir auch in sekundären Kallus Mikroorganismen entdecken. Als andere Herkunftsquelle wäre die Oberfläche der Laubblätter denkbar. Epiphytische Mikroorganismen, die resistent zum Oberflächensterilisationsmittel sind, könnten so in die Pflanzengewebekultur eingebracht worden sein. In unserer Pflanzengewebekultur verwendeten wir Quecksilberchlorid als Sterilisationsmittel für Blattoberflächen. Verschiedene Stämme von Pseudomonas (Barbieri et al., 1996; Sadhukhan et al., 1997), Bacillus (Kannan und Krishnamoorthy, 2006) isoliert aus der Natur, sind Quecksilberresistent. Die genannten Varianten zur Herkunft von Mikroorganismen wurden von Leifert und Cassells (2001) und Gunson und Spencer-Phillips (1994) in Arbeiten an Pflanzengewebekulturen nachgewiesen.

123 Diskussion

Ausblick:

Um die ovalen begeißelten und stäbchenförmigen Mikroorganismen in den Wurzelhaaren von Eleutherococcus sieboldianus näher zu charakterisieren sollten diese einzeln isoliert werden. Eine Isolierung und Kultivierung scheiterte bisher. Wir fanden in den bisherigen Mikroorganismenisolaten in Form von Verdünnungsausstrichen keine Isolate mit diesen Mikroorganismen. Hierbei ist die Mikromanipulation der Wurzelhaare eine passende Methode. Um die Herkunft der bisher isolierten Mikroorganismen näher zu bestimmen, sollten Embryonen, isoliert aus Samen, molekularbiologisch untersucht werden. Die Ergebnisse könnten zeigen, ob die Mikroorganismen systemisch über die Embryonen auf die sich entwickelnde Pflanze übertragen werden. In Protoplastenkulturen von Ginkgo biloba L., angelegt aus Mikrosporophyllen, wurden 3 - 4 µm große einzellige Grünalgen der Gattung Coccomyxa isoliert (Trémouillaux- Guiller et al., 2002). George (1963) isolierte aus oberflächensterilen Sproßapikal- meristemen von Kartoffeln die Xanthophycee Chlorocloster solani. Bakterien unterschiedlicher Gattungen und Familien wurden aus zahlreichen Zierpflanzenkulturen isoliert (Leifert et al., 1989) Aus Wurzeln und Laubblättern von oberflächensterilen mikrovermehrten Pflanzen Bouteloua eriopoda (Torr.) Torr. und Atriplex canescens (Pursh) Nutt. wurde der Pilz Aspergillus conidiophores nachgewiesen. Dieser Pilz wuchs nicht auf dem Pflanzennährmedium (Barrow et al., 2004). Hefepilze der Gattung Candida, Rhodotorula und Cryptococcus konnten ebenfalls in Pflanzengewebekulturen gefunden werden (Leifert et al., 1990). Diese Beispiele zeigen eine hohe Vielfalt unterschiedlichster Mikroorganismengruppen, die mit Pflanzengewebekulturen assoziiert sein können. Bei der weiteren Untersuchung der Mikroorganismen in unserer Pflanzengewebekultur sollte daher ein breites Spektrum von Primersätzen zur Anwendung kommen. Folgende Primersätze könnten z. B. eingesetzt werden: nu-SSU-0817-59 und nu-SSU-1196-39 für Ascomycota, Basidiomycota, Zygomycota und Chytridiomycota (Borneman und Hartin, 2000), Oom1F 50 und Oom1R 50 für Oomycota (Arcate et al., 2006), 799f und 1492r für Bakterien (Chelius und Triplett, 2001).

124 Diskussion

Als nächsten Schritt könnte eine Fluoreszenz-in situ – Hybridisierung durchgeführt werden. Dabei werden bestimmte DNS-Abschnitte z. B. von Bakterien mit Hilfe von DNS-Sonden markiert. Die DNS-Sonde kann dabei mit einer fluoreszierenden Probe gekoppelt sein (Amann et al., 1995). Mit Hilfe dieser Technik kann spezifisch DNS von Bakterien oder Pilzen im histologischen Schnitt nachgewiesen werden.

4.6. Mykorrhiza von Eleutherococcus

Auxiliarzellen Der Begriff „auxiliary cells“ wurde von Trappe und Schenck (1982) eingeführt und steht für die alten Begriffe „extramatrical vesicle“ und „soil-borne vesicle“. Die Funktion dieser Struktur war zu dieser Zeit jedoch nicht geklärt. Schenck und Pérez (1990) verwendeten den Begriff „auxiliary cells“ auch für vegetative Sporen bei Glomus. Nicolson und Gerdemann (1968) und Gerdemann und Trappe (1974) beschrieben die Auxiliarzellen von Vertretern der Gattung Gigaspora und Scutellospora (damals noch unter Endogone zusammengefaßt) als Vesikel. Andere Begriffe, die diese Struktur beschreiben sind „auxiliary bodies“ (Pearson und Schweiger, 1993; Braunberger et al., 1996), „accessory soil-borne vesicles“( Nicolson und Schenck, 1979) und „auxiliary vesicles“ (Peterson et al., 2004). Ihre Funktion ist möglicherweise die temporäre Speicherung von Nährstoffen (Gerdemann und Trappe, 1974) bzw. die Speicherung von Lipiden (Jabaji-Hare et al., 1986; de Souza und Declerck, 2003; Peterson, 2004) In der Phykologie gibt es ebenfalls den Begriff „Auxiliarzelle“. Wagenitz (2003) definiert wie folgt diesen Begriff: „Plasmareiche Zelle des weiblichen Gametophyten der Rotalgen, die den Zygotenkern übernimmt und vermehrt, was schließlich zur Bildung des Karposporophyten führt (Goniokarp)“. Schubert und Wagner (2000) beschreiben den Begriff als „Hilfszellen bei einigen Rotalgen, die mit sporenbildenden Zellen verschmelzen.“ Wir wollen den Begriff „Auxiliarzellen“ als „Vesikel“ bei Gigaspora und Scutellospora verstehen. Die Ähnlichkeit zu Vesikeln sind die Speicherung von Lipiden und terminale Anschwellungen von Pilzhyphen. Anderseits wird dieser Begriff in der Phykologie bereits verwendet, so dass eine Anwendung in der Mykologie fraglich ist.

125 Diskussion

VAM oder AM ?

In den 90er Jahren gab es eine Diskussion über die Terminologie von vesikulär- arbuskulärer Mykorrhiza (VAM), ob es nicht eindeutiger wäre diese Mykorrhizaform nur als Arbuskuläre Mykorrhiza (AM) zu bezeichnen (Walker, 1995). Die Begründung für „AM“ ist, das Scutellospora und Gigaspora keine Vesikel ausbilden, aber Arbuskel. Arbuskel seien somit ein eindeutiges Merkmal für diese Mykorrhizaform.

Smith (1995) argumentierte, dass der Begriff „VAM“ lange eingeführt ist und dadurch auch „Nicht-Experten“ bekannt ist, eine Veränderung in „AM“ daher zu Verwirrungen führen könnte. Weiterhin sieht sie keinen Anlass der Notwendigkeit einer Begriffsveränderung. Khan (1972a) fand in Wurzelknöllchen von Aesculus indica (Wall. ex Cambess) Hook. intrazellulär Aggregate von Vesikeln, die denen von Gigaspora gigantea gleichen. Zeichnungen belegen, dass sie auch einzeln in den Zellen vorkommen. Furlan und Fortin (1973) fanden intraradikale Vesikel von Scutellospora calospora in Wurzeln von Allium cepa. Stürmer und Morton (1999) beschrieben „auxiliary cells“ von Scutellospora rubra in Zellen des Wurzelcortexes von Inokulumpflanzen. Folgen wir den Meinungen von Nicolson und Gerdemann (1968), Gerdemann und Trappe (1974) und Peterson et al. (2004) so sind die „auxiliary cells“ Vesikel. Somit können Vertreter der Gigasporaceae und Scutellosporaceae Vesikel in Wurzeln ausbilden. Weiterhin diskriminiert „AM“ die Mykorrhiza, welche keine Arbuskeln zeigt: Z. B. die Mykorrhizen von Dicorynia guianensis Amshoff und Eperua falcata Aubl. besaßen nur Vesikel und Hyphen (Martin et al., 2001). Atriplex nummularia Lindl. bildet mit Glomus intraradices eine Mykorrhiza aus, wobei ebenfalls nur intraradikale Hyphen und Vesikel ausgebildet werden (Plenchette und Duponnois, 2005). In Sämlingen von verschiedenen Vertretern der Pinaceae am Naturstandort wurden nur Hyphen und Vesikel von Glomus-Arten beschrieben (Cázares und Trappe, 1993). Mit Glomus intradices inokulierte Pflanzen von Quercus agrifolia Née zeigten Hyphenschleifen, Hyphen und Vesikel (Egerton-Warburton und Allen, 2001). Capsella bursa-pastoris (L.) Medik. wird von VAM-Pilzen besiedelt, die extraradikale Hyphen

126 Diskussion und Chlamydosporen, interne Hyphen und Vesikel besitzen (Demars und Boerner, 1994). Bei der myco-heterophen Afrothismia winkleri (Engl.) Schlecht werden in den Wurzeln fast ausschließlich Hyphenschleifen und Vesikel von Glomeromyzeten ausgebildet (Imhof, 1999). Diese Mykorrhizen müßten somit „VM“ für vesikuläre Mykorrhiza heißen. Wir wollen den Begriff „VAM“ für vesikulär-arbuskuläre Mykorrhiza benutzen, wobei beide Organe Vesikel und Arbuskel oder einzeln nur Vesikel oder nur Arbuskel diese Lebensgemeinschaft zwischen Glomeromyzet und Pflanze charakterisieren.

Untersuchungen zur Mykorrhiza bei Eleutherococcus Unsere Untersuchungen zur Mykorrhiza von Freilandwurzeln und Adventivwurzeln bei Eleutherococcus erbrachten Merkmale einer VAM, bestehend aus Arbuskeln, Vesikeln und Pilzhyphen. Diese Ergebnisse ergänzen unser Verständnis von der Mykorrhiza bei Araliaceen. Tabelle 18 listet alle Araliaceen-Arten mit ihren Literaturreferenzen auf, wo die VAM in den Wurzeln bestimmt worden ist. Es wurden dabei keine Angaben zum Strukturtyp der VAM gemacht. Araliaceen-Art Mykorrhiza-Literaturreferenz Aralia cordata Thunb. Maeda, 1954 Aralia kerchovei Hort. ex Truff. Boullard, 1953, 1954 Aralia nudicaulis L. Malloch und Malloch, 1981; Berliner und Torrey, 1989 Aralia spinosa L. Shuffstall und Medve, 1979 Cheirodendron sp. Gemma und Koske, 1995 Dendropanax arboreus (L.) Decne. & Lodge, 1987; Lovelock et al., 2003 Planch. Dendropanax cuneatum Decne. & Planch. Carneiro et al., 1998; Siqueira und Saggin-Júnior, 2001 Didymopanax macrocarpum Seem. Bononi und Trufem, 1983 Didymopanax morototoni Decne. & Lodge, 1987 Planch. Didymopanax vinosum Marchal Thomazini, 1974; Bononi und Trufem, 1983 Eleutherococcus senticosus Maxim. Ueda et al., 1992 Eleutherococcus sessiliflorus (Rupr. & Lee und Koo, 1983 Maxim.) S.Y.Hu Eleutherococcus spinosus (L.f.) S. Y. Hu Maeda, 1954 Evodiopanax innovans Nakai Maeda, 1954 x Fatshedera lizei (Hort. ex Cochet) Boullard, 1953, 1963 Guillaumin Fatsia japonica Decne. & Planch. Maeda, 1954; Boullard, 1953, 1963

127 Diskussion

Araliaceen-Art Mykorrhiza-Literaturreferenz Hedera helix L. Boullard, 1953, 1954, 1963; Dominik, 1957; Boullard und Dominik, 1966; Harley und Harley, 1987; Gorsi, 2002; Maremmani et al., 2003 Hedera tobleri Nakai Maeda, 1954 Kalopanax pictus Nakai Maeda, 1954 Macropanax dispermus (Bl.) O. Ktze. Zhao et al., 2001 Panax ginseng C. A. Meyer Park et al., 1990 Panax japonicus (Nees.) C. A. Mey. Maeda, 1954 Panax quinquefolius L. McDougall und Liebtag, 1928 Polyscias rumphiana Harms St. John, 1980 Pseudopanax colensoi (Hook. f.) Johnson, 1976, 1977 Philipson Pseudopanax crassifolius (Sol. ex A. Hurst et al., 2002 Cunn.) K. Koch Pseudopanax laetevirens (Gay) Franch. Godoy et al., 1994; Fontenla et al., 1998 Schefflera octophylla Harms Haug et al., 1994 Schefflera paraensis Ducke Béreau et al., 1997 Schefflera sp. Kottke et al., 2004; Kottke und Haug, 2004 Schefflera spruceana (Seem.) Maguire, Moyerson, 1993 Steyerm. & Frodin Schefflera volkensii Harms (Harms) Michelsen, 1993 Tetrapanax papyriferus (Hook.) K. Koch Boullard, 1953; Maeda, 1954 Tab. 18: Araliaceen-Arten, die durch eine VAM charakterisiert sind Keine Mykorrhiza wurde in Wurzeln von Dizygotheca kerchoveana (Hort & Veitch) N. Taylor (Stanczak-Boratynska, 1954), Schefflera actinophylla (Endl.) H. A. T. Harms (Reddell et al., 1996), Stilbocarpa polaris (Homb.&Jacq.) Gray. (Laursen et al., 1997), Trevesia palmata (Roxb.) Vis. (Muthukumar et al., 2003), Trevesia palmata var. costata Li (Zhao et al., 2001) gefunden. Unsere anatomischen Untersuchungen zur VAM der Eleutherococcus-Arten stellen den Paris-Typ nach Gallaud (1904, 1905) fest. Allerdings kommen die Arbuskel in Eleutherococcus-Wurzeln in nicht definierten Zelllagen vor. Ähnlichkeiten im Strukturtyp der Mykorrhiza gibt es hierbei zu Metasequoia Miki ex Hu & W. C. Cheng (Gallaud, 1904, 1905), Solanum lycocarpum St. Hil (Thomazini, 1979), Annona coriacea Mart. (Thomazini, 1978) die ebenfalls keine Zonierung der Arbuskeln im Paris-Typ aufweist. Der Paris-Typ kommt häufiger bei Angiospermen und Gymnospermen vor als der Arum-Typ (Smith und Smith, 1997; Yamato und Iwasaki, 2002). Ein weiteres Merkmal ist, dass der Paris-Typ am häufigsten in Wurzeln von immergrünen Pflanzen gefolgt

128 Diskussion von sommergrünen (laubabwerfenden), mehrjährigen und einjährigen Pflanzen vorkommt (Ahulu et al., 2005). Imhof und Weber (1997) vermuten, dass die Paris-Typ-Mykorrhizen unter Extrembedingungen vorteilhafter für die Pflanzen sind als der Arum-Typ. Die Hyphenschleifen könnten ein Zeichen sein der Hauptkontrolle von der Pflanze über die Entwicklung des Pilzes (Weber et al., 1995) Boullard (1953) veröffentlichte folgende Merkmale zur Mykorrhiza von Araliaceen: 1. aseptierte zusammengerollte Pilzhyphen 2. intrazelluläre Vesikel 3. Abwesenheit von Arbuskel Unsere Ergebnisse zeigen aber, das Arbuskel bei Vertretern von Eleutherococcus vorhanden sind. Zeuske et al. (1997, 1999) schlagen eine Progressionsreihe mycotropher Lebensweisen bei den Araliaceen vor. Sie stellen bei Schefflera arboricola, keine Mykorrhiza, bei Hedera helix, Fatsia japonica und x Fatshedera lizei einen intermediären VAM-Typ und bei Panax ginseng und P. quinquefolius einen Paris-Typ fest. Whitbread, et al. (1995, 1996) und Schaat (1997) fanden ebenfalls einen Paris-Typ bei Panax quinquefolius. Der intermediäre VAM-Typ bei Hedera helix, Fatsia japonica und x Fatshedera lizei ist eine Mischung aus intra- und interzellular verlaufenden Pilzhyphen als auch zusammengesetzten und einfachen Arbuskeln. Ergänzt wird die Progressionsreihe durch Didymopanax angustissimum March. mit einem Arum-Typ (Andrade et al., 2000), durch den immergrünen Baum Dendropanax trifidus Makino und der immergrünen Kletterpflanze Hedera rhombea (Miq.) Bean mit einem Paris- Typ (Ahulu et al., 2005). Eine Korrelation zwischen Wuchsform und Mykorrhiza- Strukturtyp gibt es bei den bisher untersuchten Araliaceen nicht. Dies zeigt sich auch bei verschiedenen Vertretern in der Progressionsreihe der mycotrophen Lebensweisen von Vertretern der Ordnung Gentianales (Weber, 2002). Wenn wir die Arbuskeln der Mykorrhiza von Eleutherococcus mit denen von Panax miteinander vergleichen, so gibt es nur Unterschiede in der Lage der Arbuskeln innerhalb des Wurzelcortexes. Bei Panax erhöht sich die Dichte der Arbuskeln in den inneren Zelllagen des Cortexes (Zeuske et al., 1999; Zeuske, 2000). Bei Eleuthero- coccus sind diese in den Wurzelcortexlagen (außer der Endodermis und zweiten

129 Diskussion

Cortexlage) gleichmäßig verteilt. Außerdem ähneln diese Arbuskeln denen von Mejstrík (1975) beschriebenen zusammengesetzten Arbuskeln in Pseudopanax arboreus (Murray.) K. Koch.. Der Paris-Typ kommt bei ein und derselben Eleutherococcus-Art an verschiedenen Standorten in unseren Untersuchungen vor, und auch am Naturstandort in Longchi (VR China). Was könnten mögliche Ursachen sein für die Herausbildung des Paris-Types bei Eleutherococcus? Die Wurzeln der untersuchten Eleutherococcus-Arten besitzen keine Interzellularen. Ein Merkmal, welches bei Wurzeln mit VAM-Struktur Paris-Typ vorkommt. Interzellularräume sind bei Wurzeln mit dem VAM-Strukturtyp Arum ausgeprägt (Brundrett und Kendrick, 1990b). Der Einfluss der Pflanze, genauer gesagt der Genotyp der Pflanze könnte für den VAM-Strukturtyp verantwortlich sein (Gerdemann, 1965; Jacquelinet-Jeanmougin und Gianinazzi-Pearson, 1983; Brundrett und Kendrick, 1990b). Unsere Untersuchungen zeigen, dass von Wurzeln verschiedener Standorte mit einer möglichen unterschiedlichen Zusammensetzung von Mykorrhizapilzarten, bei Pflanzen inokuliert mit verschiedenen Arten von Mykorrhizapilzen der Paris-Typ vorkommt. Der Paris-Typ kommt bei Pflanzen vor, die auf Standorten mit niedriger Lichtintensität wachsen (Brundrett und Kendrick, 1990a,b; Yamato und Iwasaki, 2002; Yamato, 2004). Vertreter von Eleutherococcus wachsen an natürlichen Standorten im Halbschatten oder Schatten. Anderseits fand Cavagnaro et al. (2001) heraus, dass der Mykorrhizapilz den VAM- Strukturtyp in Tomatenpflanzen bestimmt. Dabei bildete z. B. Gigaspora margarita den Paris-Typ und Glomus intraradices den Arum-Typ aus. Bezüglich der Besiedlung von Eleutherococcus-Wurzeln durch Glomeromyzeten fiel auf, dass in der Zelllage unterhalb der Rhizodermis keine Arbuskel oder Hyphenknäule gebildet werden. Sie dient hauptsächlich des Durchtrittes der Pilzhyphen in tiefer gelegene Cortexschichten. Hierbei handelt es sich funktionell um eine Hypodermis. Das Vorkommen von intraradikalen Sporen in Wurzeln von Landpflanzen ist unter den Glomeromyzeten weit verbreitet. Beispiele dafür sind Acaulospora delicata (Walker et al., 1986), A. foveata (Schenck et al., 1984), A. myriocarpa (Schenck et al., 1986), G.

130 Diskussion aggregatum (Koske, 1985), G. antarcticum (Cabello et al., 1994), G. clarum (Nicolson und Schenck, 1979), G. fasciculatus (Nicolson und Johnston, 1979), G. diaphanum (Morton und Walker, 1984; Morton, 1985), G. intraradices (Schenck und Smith, 1982; Graham und Fardelmann, 1986; Sylvia und Hubbell, 1986), G. manihotis (Schenck et al., 1984), G. microaggregatum (Muthukumar et al., 1993), Glomus xanthium (Blaszkowski et al., 2004), Entrophospora infrequens (Sieverding und Oehl, 2006), Infraspora schenckii (Sieverding und Oehl, 2006) und Gigaspora margarita (Gadkar und Adholeya, 2000). Die Sporen überdauern auch den Tod der Wurzeln (Nicolson und Johnston, 1979; Clelland et al., 1983). Intraradikale Sporen kommen auch in den von uns untersuchten Adventivwurzeln von bewurzelten Laubblättern mit Glomus intraradices vor. Die Besiedlung von Adventivwurzeln bei Blattrisslingen von Eleutherococcus gracilistylus mit Glomus intraradices war erfolgreich. Es wurde ebenfalls der Paris- Strukturtyp wie in Freilandwurzeln ausgebildet. Dieses Inokulationssystem ist ein zweites Beispiel für die Mykorrhizierung von Blattrisslingen nach den Experimenten von Chellappan et al. (2002), wo bewurzelte Laubblätter von Lablab purpureus (L.) Sweet mit Glomus deserticola und G. mosseae inokuliert wurden. 90% der Wurzeln waren durch die Glomeromyzeten besiedelt. Allgemein stellen wir fest, dass die Inokulation von Blattrisslingen eine einfache und platzsparende Methode für die Vermehrung von Glomeromyzeten darstellt, nicht zuletzt erkennbar durch die intraradikalen Sporen in Blattrisslingen von Eleutherococcus gracilistylus.

4.7. Molekularbiologische Charakterisierung der Glomeromyzeten an Wurzeln von verschiedenen Eleutherococcus-Arten Wir wählten eine molekularbiologische Methode zur näheren Charakterisierung der Pilze aus, da die Glomeromyzeten morphologisch-anatomisch schwierig zu bestimmen sind. Außerdem benötigt man für die nähere strukturell taxonomische Einordnung der Glomeromyzeten Sporen, die nicht immer vorhanden, und nur selten direkt mit den Mykorrhizastrukturen verbunden sind. Zudem können bei älteren Sporen bestimmte morphologischen Merkmale verlorengehen bzw. bei jungen Sporen noch nicht ausgeprägt sein (Schwarzott, 2004).

131 Diskussion

Wir benutzten das Primerpaar AM1 und NS31, welches ein 550 bp großes DNS- Segment der 18S rDNS der Glomeromyzeten amplifiziert. Dieses Primerpaar wurde erfolgreich angewendet an mykorrhizierten Wurzeln von Pflanzen im tropischen Regenwald (Husband et al., 2002a, b), in einem Grasland-Ökosystem (Vanden- koornhuyse et al., 2002, 2003; Heinemeyer et al., 2003; Johnson et al., 2003), auf Feuchtwiesen (Wirsel, 2004), auf Äckern (Helgason et al., 1998; Daniell et al., 2001); in Mischwäldern (Helgason et al., 1999; Yamato und Iwase, 2005; DeBellis und Widden, 2006). Weiterhin wurden die Primer bei der Bestimmung der Mykorrhizapilze bei Farnen (Lee, 2002), Gymnostoma (Duhoux et al., 2001), Olea europaea L. (Calvente et al., 2004), Pulsatilla (Öpik et al., 2003), Pyrus (Choi, 2004b), Thymus polytrichus A.Kerner ex Borbas (Whitfield et al., 2004) eingesetzt. Allerdings versagen diese Primer bei der Gattung Archaeospora und Paraglomus (Redecker et al., 2000, Schüßler et al., 2001a). Außer AM1 und NS31 gibt es weitere Primerpaare für die gezielte DNS-Amplifikation bei Glomeromyzeten. Redecker (2000) entwickelte ARCH1311, ACAU1660, LETC1670, GLOM5.8R, GLOM1310 und GIGA5.8R in Verbindung mit ITS4 bzw. ITS1F für die Amplifikation von DNS in den Internal transcript spacer (ITS)-Bereichen 1 und 2 einzelner Vertreter der Gattungen Acaulospora, Archaeospora, Entrophospora, Glomus, Gigaspora, Paraglomus, Scutellospora. Auch hier gibt es Einschränkungen in der Amplifikation von DNS. Das Primerpaar ACAU1660 und ITS4 diskriminiert DNS von Acaulospora spinosa. Der Primer LETC1670 ist mit 17 von 18 Nucleotiden identisch mit der DNS von 2 Besingtonia – Arten (Basidiomycota) (Geue, 2002). Renker et al. (2003) synthetisierte die Primer SSU-Glom1/LSU-Glom1 die ebenfalls die ITS-Bereiche amplifizieren, außer bei den Archaeospora-Arten. Schwarzott und Schüßler (2001) ermittelten Primer für die gesamte 18S rDNS, die aber nur an oberflächensterilen Sporen getestet worden sind. Eine Anwendung mit mykorrhizierten Wurzeln von Voyria- und Polygala-Arten ergaben u. a. jedoch auch DNS-Sequenzen des Zygomyzeten Mortierella chlamydospora (Imhof, mündliche Mitteilung). Betrachten wir die vorhandenen molekularbiologischen Daten von 18S, 5.8S, ITS1+2 und 28S von verschiedenen Glomeromyzetenarten so gibt es große Defizite. Bei 42,24

132 Diskussion

% von Acaulospora-Arten, 60% von Entrophospora-Arten, 22,22% von Gigaspora- Arten, 71,03% von Glomus-Arten, 83,33% von Pacispora-Arten und 35,29% von Scutellospora-Arten sind keine molekularbiologische Datensätze über 18S rDNS, ITS- Bereiche, 5.8S rDNS und 28S rDNS bekannt. Die meisten morphologisch-taxonomisch beschriebenen Arten wurden über Topfkulturen erfolgreich vermehrt und ihre DNS ist durch mykorrhizierte Wurzeln in Topfkultur oder in flüssigem Stickstoff eingelagerte Sporen in der International Culture of Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Fungi (INVAM) verfügbar. Zu vielen dieser Glomeromyzeten gibt es leider keinerlei molekularbiologische Datensätze. Zukünftig sollten vorhandene Sporen- oder Topfkulturen von Glomeromyzeten, ebenfalls sequenziert und in vorhandene Datenbanken (z. B. Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI)) integriert werden. AM1 und NS31 ist das am meisten eingesetzte Primerpaar für die molekularbiologische Charakterisierung der Glomeromyzeten an mykorrhizierten Wurzeln aus unterschiedlichen Biotopen (Öpik et al., 2006). Hierfür liegen die meisten DNS- Sequenzen, gespeichert in der NCBI-Datenbank, vor im Vergleich zu ITS-Sequenzen erhalten von Primern von Redecker (2000) und Renker et al. (2003). Aus diesem Grund haben auch wir AM1 und NS31 verwendet. Allerdings sollten für zukünftige molekularbiologische Studien über Glomermomyzetenarten neben den Primern AM1 und NS31, auch das Primerpaar ARCH1311 und ITS4 eingesetzt werden, um die DNS von Vertretern der Paraglomeraceae und Archaeosporaceae zu identifizieren.

Unsere molekularbiologischen Ergebnisse zeigen, dass fast ausschließlich Glomero- myzeten der Glomus Gruppe A in Eleutherococcus-Wurzeln zu finden sind. Zwei weitere DNS-Sequenzen sind in die Nähe der Glomus Gruppe B einzuordnen. Zu beachten ist, dass die Gattung Glomus polyphyletisch ist. Glomus versiforme, Glomus etunicatum und Glomus spurcum sind molekularbiologisch in die Nähe der Acaulosporaceae und Gigasporaceae einzuordnen und besitzen eine eigene Gruppe C (Diversisporaceae). Weiterhin gibt es die Gruppe A und die Gruppe B (Schwarzott et al., 2001).

133 Diskussion

Innerhalb der Araliaceen wurde neben Eleutherococcus auch Panax ginseng und Dendropanax arboreus (L.) Decne. & Planch. auf wurzelassoziierte Glomeromyzeten untersucht. Eom et al. (2004) und Eo (2004) fanden mittels molekularbiologischer Methoden Glomus spurcum und Paraglomus brasilianum in Wurzeln von Panax ginseng. Lovelock et al. (2003) wiesen Glomus-Vertreter in Wurzeln von Dendropanax arboreus nach. Unsere Daten erweitern somit das Bild über die genaue systematisch- taxonomische Einordnung der wurzelassoziierten Glomeromyzeten bei den Araliaceen. Vertreter von Glomus kommen in unterschiedlichen antropogenen und natürlichen Biotopen in Pflanzen verschiedenster Lebensformen vor (Öpik et al., 2006). Aufgrund des großen Wurzelsystems der Sträucher von Eleutherococcus könnte es Wurzelstellen außerhalb der Probeentnahmestellen geben die von weiteren Glomeromyzetengattungen besiedelt sind. Auch könnten Sporen von potentiellen pilzlichen Symbionten im speziellen Substrat der untersuchten Eleutherococcus-Arten gefehlt haben. Nur eine weiterführende molekularbiologische Analyse mit mehr Wurzelproben und zusätzlichen Standorten könnte klären, ob Eleutherococcus ein noch größeres Spektrum von Symbionten besitzt als ohnehin in unseren Untersuchungen festgestellt worden ist.

4.8. In vitro Experimente mit Gigaspora margarita Die Etablierung von Pflanzengewebekulturen inokuliert mit oberflächensterilen Sporen von VAM-Pilzen ist weit verbreitet. Hierbei unterscheiden wir Wurzelorgankulturen und Kulturen mit kompletten Pflanzen. Mykorrhizierte Wurzelorgankulturen können aus isolierten Sämlingswurzeln, die autonom auf Nährmedien weiterwachsen, gewonnen werden. Diese wurden dann, z. B. bei Trifolium pratense L. inokuliert mit Glomus mosseae (Mosse und Hepper, 1975) und Glomus sinensis (Peng und Shen, 1990), bei Lycopersicon esculentum var. marglobe mit Gigaspora margarita (Miller- Wideman und Watrud, 1984), bei Zea mays L. und Arachis hypogaea L. mit Glomus intraradices und Glomus mosseae (Nopamornbodi et al., 1988) und bei Cymbopogon martinii var. motia inokuliert mit Glomus aggregatum (Janardhanan et al., 1990). Eine weitere Wurzelkultur ist die durch Agrobacterium rhizogenes transformierte Wurzel von Daucus carota L.. Hier gibt es Inokulationsexperimente mit Glomus caledonium (Karandashov et al., 2000), Glomus etunicatum (Pawlowska et al., 1999), Glomus

134 Diskussion clarum (de Souza und Berbara, 1999), Glomus intraradices (Mugnier und Mosse, 1987; Chabot et al., 1992; Tiwari und Adholeya, 2002, 2003), Glomus mosseae (Douds Jr., 1997) Glomus sinuosum (Bi et al., 2004), Glomus versiforme (Declerck et al., 1996; Plenchette et al., 1996), Gigaspora gigantea (Leu et al., 1994), Gigaspora margarita (Bécard und Fortin, 1988; Diop et al., 1992; Bi et al., 1999; Karandashov et al., 1999; Gadkar und Adholeya, 2000), Scutellospora reticulata (de Souza und Declerck, 2003), Acaulospora rehmii (Dalpé und Declerck, 2002). Desgleichen wurden Agrobakterien transformierte Erdbeerwurzeln erfolgreich mit Glomus fistulosum inokuliert (Nuutila et al., 1995). Mikrovermehrte und inokulierte Pflanzen unter sterilen in vitro Bedingungen wie Bouteloua gracilis (H.B.K.) Lag. ex Steud. mit Glomus fasciculatus (Allen et al., 1979) und Solanum tuberosum L. mit Glomus intraradices (Voets et al., 2005) bildeten ebenfalls eine Mykorrhiza aus. Die genannten Inokulationssysteme sind durch eine Mykorrhiza bestehend aus Arbuskeln, intraradikalen Vesikeln (nicht bei Gigaspora und Scutellospora) und externen Sporen charakterisiert. Das hier vorgestellte in vitro Inokulationssystem von Gigaspora margarita mit Eleutherococcus sieboldianus ist besonders für die Lebendbeoachtung von Glomeromyzeten mit Pflanzenwurzeln geeignet. Pilz und Wurzeln sind mit dem Stereomikroskop leicht zu erkennen, das externe Myzel ist als Gesamtstruktur auf dem Nährmedium im Vergleich zur Erdkultur vorhanden, und die Handhabung mit den Pilzsporen und den Pflanzen ist einfach.

Die Entwicklung von Auxiliarzellen bei dem eingesetzten Isolat von Gigaspora margarita als artspezifische Struktur kann in verschiedenen Medien induziert werden. Der Aufbau dieser besonderen Struktur ähnelt den Beschreibungen von Becker und Hall (1976), Pons und Gianinazzi-Pearson (1985) und Jabaji-Hare et al. (1986). Ein weiteres mögliches Merkmal des Pilzymzels die "branched absorbing structures" nach Bago et al. (1998) wurden hier nicht entwickelt.

Die geringe Infektionsrate in Form von fehlenden Hyphenkontakten mit den Wurzeln in diesem System wird nicht durch das Minimalmedium begründet. Wurzelorgankulturen mit Gigaspora margarita (Bécard und Fortin, 1988; Diop et al., 1992) und Kartoffel- pflanzen mit Glomus intraradices (Voets et al., 2005) wurden auf diesem Medium

135 Diskussion erfolgreich angelegt. Fehlende Wurzelexudate, die das Hyphenwachstum positiv beeinflussen, könnten eine mögliche Ursache sein. Bécard und Piché (1989) zeigten in ihren Experimenten mit Hyphen von Gigaspora margarita und Wurzelorgankulturen von Daucus carota L., dass erhöhte CO2- und Wurzelexudatgehalte das Hyphen- wachstum positiv stimulieren und somit die Besiedlung der Wurzeln durch den Pilz fördern. Pflanzliche Sequiterpene als Wurzelexudate können hierbei zu verstärkten Hyphenverzweigungen führen (Akiyama et al., 2005). Eine gezielte Besiedlung der Wurzel wie in den Inokulationsexperimenten von Koske (1982) war in den meisten Fällen in unserem Inokulationssystem nicht gegeben. Koske (1982) stellte fest, dass Pilzhyphen von auskeimenden Sporen von Gigaspora gigantea, platziert in der Nähe von Wurzeln von Phaseolus vulgaris L., gezielt die Wurzeln besiedeln ohne an der Wurzel vorbei zu wandern wie in unseren Experimenten. Miller-Wideman und Watrud (1984) beobachteten ebenfalls wenige Penetrationen von Gigaspora margarita an Wurzeln von Lycopersicon esculentum var. marglobe. Die Pilzhyphen verliefen auch hier öfters über und unter die Wurzeln. Die Pilzhyphen, die eine Verbindung mit den Wurzeln aufweisen, sind deutlich stärker verzweigt als ohne den pflanzlichen Wirt. Im isolierten Zustand bilden die Pilzhyphen frühzeitig Septen aus und das Zytoplasma bewegt sich zur Spore zurück. Ähnliche Beobachtungen machten auch Logi et al. (1998) bei den Keimungsexperimenten mit Glomus caledonium.

Den von uns beschriebenen Gravitropismus bei Pilzhyphen von Gigaspora margarita bestätigt die Ergebnisse von Watrud et al. (1978) und Hong et al. (2001). Beide Autoren führten Drehexperimente mit ausgekeimten Sporen von Gigaspora margarita durch. Die primären Keimhyphen sind bei diesen Gravitropismus negativ gravitrop. Das konnte auch bei Gigaspora gigantea (Nagahashi und Douds, 1999, 2000, 2003, 2004; Nagahashi, et al. 2000), Gigaspora rosea (Nagahashi and Douds, 2000, 2003) und bei Scutellospora reticulata (de Souza and Declerck, 2003) nachgewiesen werden. Auffallend ist der Gradient von Lipiglobuli in den negativ gravitropen Primärhyphen im Vergleich zu den Sekundärhyphen. Hierbei gibt es Parallelen zu dem Komplex von Lipidglobuli im apikalen Bereich der Sporangiophoren von Phycomyces blakesleeanus, welche wichtig für die Graviperzeption sind (Schimek et al., 1999; Grolig et al., 2004)

136 Diskussion

Entscheidend dabei ist die Größe der Lipidglobuli. Diese muß über 0,8 µm betragen (Grolig et al., 2004). Eine Kältebehandlung zerstörte den Komplex von Lipidglobuli und veränderte den Gravitropismus der Sporangiophoren (Grolig et al., 2004). Bei Gigaspora margarita liegen Lipidglobuli über 0,8 µm vor. Die Lipidglobuli in den Sekundärhyphen fehlen bzw. sind nicht als Komplex vorhanden. Daher vermuten wir, dass der Gravitropismus bei Gigaspora ähnlich verläuft wie bei Phycomyces blakesleeanus. Bago et al. (2002) fanden keine Lipiglobuli in den Hyphenapexen der Primärhyphen. Diese Aussage steht konträr zu unseren Beobachtungen. Ein weiteres anatomisches Merkmal bei den untersuchten Keimhyphen von Gigaspora margarita waren runde Gebilde, gefüllt mit einer braunen Masse und abgegrenzt durch ein Septum. Sie zeigen Parallelen zu ovalen länglichen Gebilden an Pilzhyphen von Scutellospora reticulata in dem in vitro –Inokulationssystem von de Souza und Declerck (2003) und bei Gigaspora margarita (Ka et al., 1994). Die Funktion dieser Gebilde ist unbekannt. Allgemein betrachtet ist die unter in vitro Bedingungen erzeugte VAM von Gigaspora margarita und Eleutherococcus sieboldianus ebenfalls durch den Paris-Typ nach Gallaud (1904, 1905) charakterisiert.

4.9. Inokulationsexperiment mit Eleutherococcus sieboldianus und Glomus intraradices Die Inokulation von in vitro vermehrten Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus mit Glomus intraradices hatte einen negativen Einfluss auf das Sprossfrisch- und trockengewicht und die Sprosslänge. Das Wurzelfrisch- und trockengewicht war unbeeinflusst. Ähnliche Reduktionen der Frisch- und Trockengewichte sind bei mikrovermehrten Pflanzen von Fragaria x ananassa cv. Elvira, Rubus idaeus L. cv. Glen Prosen inokuliert mit Gigaspora bzw. Scutellospora bekannt (Taylor und Harrier, 2000, 2001). Weitere Wachstumsdepressionen in Form von Reduktionen im Sprossgewicht zeigen Buwalda und Goh (1982) mit Gigaspora margarita bei Lolium perenne cv. Grasslands , Domey und Weber (1997) bei der Araliacee Panax ginseng sowie bei mikrovermehrten Pflanzen von Robinia pseudoacacia L. (Balla et al., 1998). Diese Wachs-

137 Diskussion tumsdepressionen stehen im Gegensatz zu den oft veröffentlichten Wachs- tumsverstärkungen bei VA-Mykorrhizierungen. Zum Beispiel mikrovermehrte Bananenpflanzen (Yano-Melo et al., 1999), Bäume von Argania spinosa (L.) Skeels (Nouaim und Chaussod, 1994), Guavepflanzen (Psidium guajava L.) (Estrada-Luna et al., 2000; Schiavo und Martins, 2002), Apfelpflanzen (Malus pumila P. Mill., Malus prunifolia (Willd.) Borkh.) (Schubert und Lubraco, 2000; Locatelli et al., 2002) zeigten erhöhte Spross- und Wurzelgewichte und erhöhte Sprosslängen durch Inokulation mit Glomeromyzeten. Bei Vertretern der Araliaceen gibt es auch Wachstumsförderungen in Form von zunehmendem Wurzel- und Sprossgewicht bei Panax ginseng mit verschiedenen Glomeromyzetenarten (Zeuske und Weber, 2000). Li (1995) inokulierte Sämlinge von Panax quinquefolium jeweils mit Glomus mosseae, G. intraradices, G. deserticola, wobei das Wurzelgewicht im Vergleich zu nichtinokulierten Sämlingen sich erhöhte. Es muss also nicht immer eine mutualistische Interaktion zwischen Pflanzen und Glomeromyzeten vorliegen. Das Gelbwerden von Laubblättern wie bei den inokulierten Pflanzen von Eleutherococcus sieboldianus berichtet, nennt man „Frenching“ (Steinberg, 1951). Das Frenching wurde zunächst bei Tabakpflanzen beschrieben. Dabei wird neben der Chlorose der Laubblätter auch das Längenwachstum des Sprosses eingestellt. Das Wurzelwachstum bleibt unbeeinflusst (Steinberg, 1951). Eine mögliche Ursache für das Frenching sind Bakterien wie Bacillus cereus, die Substanzen abgeben, die diese Symptome induzieren (Steinberg, 1951, 1952). Bacillus cereus wurde tatsächlich an Pilzhyphen verschiedener Glomeromyzeten nachgewiesen (Artursson und Jansson, 2003; Toljander et al., 2006). Somit ist denkbar, dass unser unsteriles Pilzinokulum diese Bacillus-Art trägt. Eine andere Erklärung für das geringe Sprossgewicht und das Gelbwerden könnten Mangelerscheinungen von wichtigen Mineralelementen wie Kalzium, Magnesium, Kalium, Phosphat und Stickstoff sein (Steinberg et al., 1950), die der Glomeromyzet Glomus intraradices der Pflanze entzieht. Taylor und Harrier (2000) wiesen geringere Konzentrationen dieser Mineralelemente in den von Gigaspora-Arten inokulierten Pflanzen mit reduzierten Sprosslängen nach. Andererseits wurden auch geringe Konzentrationen von Mineralelementen in nicht wachstumsgehemmten Sprossen gemessen. Konträr sind die Mineralementkonzentrationen in wachstumsgehemmten

138 Diskussion

Sprossen bei mikrovermehrten Erdbeerpflanzen. Hier sind die Konzentrationen erhöht im Vergleich zur Kontrolle (Taylor und Harrier, 2001). Eine weitere Ursache für die Reduktion in der Sprosslänge und im Sprossgewicht könnten erhöhte Phosphatgehalte im Substrat sein. Mit zunehmendem Phosphatgehalt im Boden nahm das Sprossgewicht und die Sprosslänge von Citruspflanzen inokuliert mit Glomus-Arten im Vergleich zur Kontrolle (nicht inokulierte Pflanzen) ab. Ab einer bestimmten Schwellenkonzentration waren die Pflanzen kleiner als die der Kontrolle (Antunes und Cardoso, 1991; Peng et al., 1993; Sena et al., 2004). Bei inokulierten Pflanzen von Glycine max (L.) Merr. traten ähnliche Effekte auf (Bethlenfalvay et al., 1982, 1983). Die eingesetzte Glomeromyzetenart könnte ebenfalls verantwortlich für die geringe Biomasse der Sprossachsen und Sprosslängen und dem unveränderten Gesamtgewicht der inokulierten Pflanzen sein. Taylor und Harrier (2000, 2001) zeigen in ihren Experimenten mit verschiedenen Glomeromyzetengattungen inokuliert an mikrovermehrten Pflanzen, dass die eingesetzten Pilzarten sich unterschiedlich auf die Biomasse und Sprosslängen der Wirtspflanzen auswirken. Auch durch verschiedene Isolate einer Art wie z. B. Glomus intraradices, eine Pilzart die wir in unserem Inokulationsexperiment verwendeten, können Unterschiede im Pflanzenwachstum auftreten. Koch et al. (2006) arbeiteten hier mit mehreren Isolaten von Glomus mosseae, G. claroideum, G. caledonium und G. geosporum und stellten Wachstums- förderungen bzw. Wachstumshemmungen bei den inokulierten Pflanzen fest. Munkvold et al. (2004) bestätigte dies für andere Glomeromyzetenarten. Somit kann in unserem Experiment die Pilzart G. intraradices bzw. ihr eingesetztes Pilzisolat sich negativ auf das Sprosswachstum von E. sieboldianus ausgewirkt haben. Einheimische am Naturstandort vorhandene Glomeromyzeten scheinen das Pflanzen-wachstum effektiver zu fördern als standortfremde Isolate. Sainz und Arines (1988) inokulierten mit einzelnen fremden Glomus-Arten und mit Inokulum vom Ursprungsstandort Pflanzen von Trifolium pratense L.. Die Biomasse von Wurzel und Spross war bei dem Inokulum vom Standort signifikant erhöht gegenüber den anderen Glomus-Arten. In einem anderen Beispiel waren einheimische Isolate von Glomus intraradices und G. mosseae effektiver im Biomassezuwachs von Conyza bilbaoana Remy als nicht- einheimische Isolate dieser Glomus-Vertreter (Oliveira et al., 2005). Ein weiteres

139 Diskussion

Inokulationsexperiment mit Glomus mosseae und einem Inokulum vom Naturstandort inokuliert mit mikrovermehrten Pflanzen von Citrus limon (L.) Burm. f. erbrachten ebenfalls bessere Biomassezuwächse durch das indigene Inokulum im Gegensatz zu G. mosseae (Quatrini et al., 2003). Somit sollten die in Asien vorkommenden Glomeromyzeten bei Eleutherococcus sieboldianus einen größeren positiven Effekt auf die Biomasse im Inokulationsexperiment aufweisen. In gewerblichen Anwendungen sollten daher vorher Inokulationsexperimente mit indigenen Inokulum durchgeführt werden.

140 Anhang

5. Anhang 5.1. Anhang A - Drehbuch Titel: „Partikel in Wurzelhaaren von Eleutherococcus sieboldianus in vitro Pflänzchen – Beobachtungsergebnisse - “ Drehort: Philipps-Universität Marburg, Fachbereich Biologie, Arbeitsgruppe Prof. Weber

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar 00:00:00 Totale EINSTELLUNG 1 - Standtitel: --- Standtitel „Partikel in Wurzelhaaren von Eleutherococcus sieboldianus in vitro Pflänzchen – Beobachtungsergebnisse Autor: Matthias Döring“ erscheint auf blauer Farbfläche (Hintergrund)

00:02:20 (Schriftart: Arial Bold; Schriftgröße: 49,1%; Schriftfarbe: gelb; Text zentriert)

00:02:21 Überblende: Additive Blende wird verwendet – Standtitel verschwindet, blauer Hintergrund erscheint 00:04:00 00:04:00 Makroauf- EINSTELLUNG 2 – Standbild: nahme Petrischale mit 2 Monate alten in vitro Pflänzchen Nach 1 Sekunde folgt der von Eleutherococcus sieboldianus auf blauem Hintergrund. Das verzweigte Wurzelsystem ist in Sprachtext: ein transparentes Nährmedium eingebettet. Außer- „Für die lichtmikros- dem ist ein Maßstab in Form einer 1 cent Münze rechts unten, neben der Petrischale zu erkennen. kopischen Untersuchungen verwendeten wir 2 Monate

alte Pflänzchen von Eleu- therócoccus sieboldianus

aus unserer in vitro Kultur. Die Pflanzenkulturen ent-

wickelten nach mehreren Wochen ein verzweigtes

Wurzelsystem. Folgende Beobachtungen

konnten gemacht werden.“ 00:26:00 Harter Schnitt

141 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar 00:26:00 Mikro- EINSTELLUNG 3 –Video: aufnahme Halbseitiger Ausschnitt eines Wurzelabschnittes „Einzelne Wurzelhaare, mit verschiedenartig gestalteten Wurzelhaaren, die welche eingebettet im im Nährmedium eingebettet sind. Ein Maßstabs- balken 50 µm in Form einer schwarzen Linie mit Festmedium vorlagen, dem Text „50 µm“ als Standbild ist rechts unten waren verschiedenartig im Videobild eingeblendet. (Schriftgröße: 23; Schriftfarbe: schwarz; Schriftttyp: Arial gestaltet. “ Regular; Linienbreite: 88,1; Linienhöhe: 5; Linienfarbe: schwarz)

Nach 2 Sekunden wird zusätzlich der Standtitel

„Wurzelhaare“ links oben eingeblendet. (Schriftart: Arial Regular; Schriftgröße: 30%; Schriftfarbe:

schwarz)

Nach 14 Sekunden wird ein Standbild in Form „Wir entdeckten durch- eines schwarzen rechteckigen Rahmens um das scheinende Wurzelhaare.“ durchscheinende Wurzelhaar, rechts unten,

eingeblendet.

Nach 23 s ein vieleckiger Rahmen als Standbild in „Wurzelhaare mit schwarzer Farbe wird um das Wurzelhaar mit mehreren Partikeln.“ einzelnen Partikeln eingeblendet.

„Wurzelhaare mit einer Nach 31 s erscheint um das Wurzelhaar mit granu- dunkelfarbenen lärer Masse ein Standbild in Form eines schwarzen granulären Masse.“ 01:03:03 6-eckigen Rahmens. Harter Schnitt

01:03:04 Mikro- EINSTELLUNG 4 –Video: Nach 1 s folgt der aufnahme Apikaler Bereich des Wurzelhaares mit einzelnen Sprachtext: Partikeln bei höherer Vergrößerung gefilmt. Diese Partikel bewegen sich unterschiedlich schnell. „Eine nähere Betrachtung Daneben sieht man einen Teil des Wurzelhaares der Wurzelhaare mit mit granulärer Masse. Der Standtitel mit dem Text „Apikaler Bereich“ und das Standbild mit dem einzelnen Partikeln ergab, Text „25 µm“ auf schwarzer Linie als dass verschiedene Partikel Maßstabsbalken sind links oben bzw. rechts unten im Video eingeblendet. innerhalb der Wurzelhaare

durch unterschiedliche

Bewegungsmodi charak-

terisiert waren.“

142 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar Mikro- aufnahme

Nach 16 s Einblendung eines rechteckigen „Partikel, die eine Bewe- schwarzen Rahmens als Standtitel, der einen gung auf der Stelle durch- kleinen Abschnitt des Wurzelhaares unterhalb des führten.“ Apexes einschließt. Dieser Standtitel soll als Fokus dienen, um auf die genannten Partikel hinzuweisen.

Nach 26 s Einblendung eines rechteckigen Nach 31 s folgt der schwarzen Rahmens als Standbild, der einen Sprachtext: Abschnitt des Wurzelhaares einschließt, links „Partikel, die sich schnell neben dem vorher eingeblendeten Rahmen. Hier durch das Wurzelhaar sieht man schnell bewegende Partikel, die sich auf nahezu geradlinig der gesamten Länge des Rahmens bewegen. Sie bewegten.“ bewegen sich auch außerhalb des gekennzeichneten Abschnittes durch das Wurzelhaar.

In der Endphase dieser Einstellung sind keine Standtitel in Form der Rahmen erkennbar. Die schnell bewegenden Partikel bewegen sich kurzzeitig auch aus dem Apex des Wurzelhaares in das gelritehaltige Nährmedium heraus.

02:04:05 Harter Schnitt 02:04:06 Mikro- EINSTELLUNG 5 –Video: aufnahme Die vorherige Videoaufnahme wird durch diese Einstellung, die den anschließenden intermediären Bereich des Wurzelhaares zeigt, ergänzt. Hier bewegen sich Partikel durch den gekennzeichneten Bereich des Wurzelhaares. Dieser Teil des Wurzelhaarabschnittes wird ober- und unterhalb von Wurzelhaaren begrenzt.

143 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar Mikro- aufnahme

02:22:05 Harter Schnitt 02:22:06 Mikro- EINSTELLUNG 6 –Video: aufnahme Basaler Bereich des gefilmten Wurzelhaares mit einzelnen Partikeln. Darauf verweist der eingeblendete schwarze rechteckige Rahmen als Stand- titel. Mehrere Wurzelhaare, Abschnitte von Wurzelhaaren und ein Teil der Wurzel sind weiterhin erkennbar. Die Partikel bewegen sich nur innerhalb des markierten Wurzelhaares.

02:43:15 Harter Schnitt 02:43:16 Mikro- EINSTELLUNG 7 –Video: aufnahme Ein Wurzelhaar als Hauptbestandteil des Videos,

gefüllt mit einer granulären Masse vom Apex bis zur Basis, wird gezeigt. Bei genauer Betrach-tung des Wurzelhaares sieht man einzelne Partikel

dichtgedrängt im Wurzelhaar vorliegen. Oberhalb des Wurzelhaares sieht man durchscheinende Wurzelhaare und unterhalb die Spitze eines

Wurzelhaares ebenfalls mit granulärer Masse. Im Hintergrund sind durchscheinende Wurzelhaare erkennbar.

Als Standbild ist ein Maßstabsbalken 25 µm mit dem Text „25 µm“ über einer schwarzen Linie rechts unten im Video eingefügt.

Nach 1 s wird der Standtitel „Wurzelhaar mit granulärer Masse“ eingeblendet. Der Text

erscheint links oben im Video.

144 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar Mikro- Nach 3 Sekunden folgt der aufnahme Sprachtext: „Innerhalb der Wurzel- haare ist die granuläre Masse aus vielen kleinen Partikeln zusammengesetzt.“

Nach 16 s folgt der

Sprachtext:

„Wir beobachteten

einzelne sich bewegende

Partikel im Wurzelhaar.

< PAUSE >

Die nun folgenden

eingeblendeten Rahmen

markieren die Bereiche des

Wurzelhaares, wo wir

dieses Merkmal beobach-

ten.“

Unterhalb des Wurzelhaares mit granulärer Masse

werden 2 Standtitel mit den Texten „Rahmen 1“

und „Rahmen 2“ nach 29 Sekunden gleichzeitig

eingeblendet. Die Standtitel sind horizontal

nebeneinander angeordnet.

Nach 35 Sekunden wird zusätzlich zu den

Standtiteln ein schwarzer rechteckiger Rahmen

oberhalb des Standtitels mit dem Text „Rahmen 1“

eingeblendet. Der Rahmen begrenzt einen Außen- bereich des Wurzelhaares, in dem Partikel die

genannte Bewegung zeigen.

Nach 57 Sekunden Standtitel mit dem Text

„Rahmen 2“ wird ergänzt durch Standbild mit

einem schwarzen Rahmen, der länger als der

vorhergehende gezeigte Rahmen ist. Der

eingeblendete Rahmen begrenzt einen Außen-

bereich des Wurzelhaares. Dieser markierte

Bereich liegt rechts neben dem Rahmen 1, der nun

nicht mehr im Videobild sichtbar ist.

Außerhalb der Rahmen sind ebenfalls Einzelbewe-

gungen der Partikel in den Wurzelhaaren bei

genauer Betrachtung erkennbar. 03:57:21

Harter Schnitt 03:57:22 Mikro- EINSTELLUNG 8 –Video 1: aufnahme Die Einstellung 7 in Zeitrafferaufnahme 8fach. Maßstab mit dem Text „25 µm“ und einer Linie in schwarz als Standbild rechts unten im Video eingeblendet. Nach 3 s wird der Standtitel mit dem Text „Wurzelhaar mit granulärer Masse“ in schwarzer Schriftfarbe links oben im Video zusätzlich eingeblendet.

145 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar Mikro- aufnahme

Nach 5 Sekunden wird der links oben „Im Zeitraffermodus der

eingeblendete Standtitel ergänzt durch den Videokamera ließen sich

Standtitel mit dem Text „Zeitrafferaufnahme“. die Bewegungsformen der

(Hier erfolgt kurzzeitig eine Schärfenverlagerung.) einzelnen Partikel besser

darstellen.“ 04:13:14

Harter Schnitt 04:13:15 Mikro- EINSTELLUNG 8 –Video 2: aufnahme 2. Zeitrafferaufnahme 8fach von Einstellung 8. Dieser Videobeleg verstärkt die vorher genannte Aussage. Partikel, die sich schneller als andere im Wurzelhaar bewegen. Dabei ist ihre Anzahl geringer.

04:27:00

Harter Schnitt 04:27:01 Nahauf- EINSTELLUNG 9 – Video: „Als nächstes filmten wir nahme in Matthias Döring sitzt in seinem Büro auf einem Details der Morphologie Bildmitte Drehstuhl parallel zum Computer. Er stützt sich und Bewegung der Partikel mit seinem linken Unterarm auf dem Tisch vor der in den Wurzelhaaren. Die Schublade mit der Computertastatur ab. Der Wurzeln wurden dem Computermonitor zeigt ein Standbild des hier Festmedium entnommen beschriebenen Videofilms. und in autoklaviertes Leitungswasser für die Videoaufnahmen bei 1000facher Vergrößerung gelegt.“

146 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar Am Ende der Einstellung dreht er sich zum Computermonitor, stützt seine beiden Unterarme auf die blauen Polster der Schublade mit der 04:48:12 Computertastatur ab und schaut auf den Monitor. Harter Schnitt 04:48:13 Mikro- EINSTELLUNG 10 – Video: „Einzelne ovale Partikel aufnahme taumelten in den 2 Wurzelhaare, eingebettet in autoklaviertem Leitungswasser. Das obere Wurzelhaar zeigt den Wurzelhaaren.“ apikalen Bereich und das untere einen intermediären Bereich. Ovale Partikel unter 5 µm groß bewegen sich taumelnd in den Wurzelhaaren. Duch die Schärfenverlagerung werden einzelne Partikel sichtbar. Rechts unten wird ein Maßstabsbalken mit dem Text „10 µm“ über einer schwarzen Linie als Standbild eingeblendet.

Nach 3 Sekunden werden 2 Pfeile als Standbild eingeblendet. Sie verweisen auf die sich 05:08:12 bewegenden ovalen Partikel. Harter Schnitt

05:08:13 Mikro- EINSTELLUNG 11 – Video: „Wir beobachteten öfters aufnahme Apikaler Bereich eines Wurzelhaares mit ovalen polar begeißelte Partikel.“ Partikeln, die im Wurzelhaar taumeln. Je nach Lage der Partikel erkennt man, dass sie polar begeißelt sind. Daneben sieht man eine fast durchscheinende Masse in Form eines Pfropfens. Das Standbild Pfeil mit Text „Geißel“ verweist auf die Geißel eines taumelnden Partikels. Im Video ist ein Maßstab in Form einer Linie mit dem Text „10 µm“ in schwarz als ein weiteres Stand- bild rechts unten im Video eingeblendet.

147 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar Jump Cut („Sprung-Schnitt“) nach 10 Sekunden. Nach 13 Sekunden Standbild bestehend aus horizontal positionierter Pfeil gekoppelt mit dem Wort „Geißel“ zeigt auf eine Geißel. Nach 27 Sekunden Jump Cut und ein Standbild Pfeil vertikal positioniert, der nach oben zeigt mit dem Wort „Geißel“, das auf eine Geißel ausgerichtet ist , wird eingeblendet. (Jump Cut nach 42 Sekunden.) Nach 44 Sekunden Einblendung des Standbildes Pfeil horizontal, der nach rechts zeigt mit dem Wort „Geißel“, weist auf eine Geißel eines zweiten ovalen Partikels hin. Nach 50 Sekunden erscheint Standbild Pfeil vertikal positioniert, nach oben zeigend mit dem Wort „Geißel“ ist auf eine Geißel ausgerichtet. Nach 63 Sekunden Standbild Pfeil vertikal positioniert, nach oben zeigend mit dem Wort „Geißel“ ist auf eine Geißel ausgerichtet, wird 06:20:09 eingeblendet. Harter Schnitt 06:20:10 Mikro- EINSTELLUNG 12 – Video 1: „Neben den ovalen aufnahme Stäbchenförmiges Partikel, über 5 µm lang, Partikeln kamen auch bewegt sich in einem Abschnitt des Wurzelhaares. Ein schwarzer Rahmen als Standbild schließt stäbchenförmige Partikel dieses Partikel ein. vor.“ Rechts unten im Video ist ein Maßstabsbalken 10 µm mit dem Text „10 µm“ über einer schwarzen Linie als 2. Standbild eingefügt.

06:26:08 Jump Cut 06:26:09 Mikro- EINSTELLUNG 12 – Video 2: aufnahme Diese Einstellung läuft in Zeitlupe ab. Standtitel „Stäbchenförmiges Partikel Zeitlupen- aufnahme Nr. 1“ ist links oben im Video eingeblendet.

148 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar Nach 6 Sekunden erscheint ein kleiner vertikal „Die Videoaufnahme zeigt orientierter Pfeil, der auf ein stäbchenförmiges ein Partikel, das sich Partikel zeigt, das sich innerhalb des Wurzelhaarabschnittes fortbewegt. Seine Bewe- innerhalb des Wurzel- gungsrichtung wird im weiteren Verlauf des haares fortbewegt.“ Videos durch 3 eingeblendete Pfeile dargestellt. Das stäbchenförmige Partikel über 5 µm groß bewegt sich anfangs starr ( großer Pfeil nach unten zeigend wird als Standbild einge-blendet) von der einen Zellwand des Wurzelhaares zur anderen und geht dann in ein rotierende Bewegung über. Das Partikel besitzt andeutungs-weise die Form eines 06:51:17 Bummerangs 06:51:18 Mikro- EINSTELLUNG 13 – Video: „Diese Fortbewegung ist aufnahme durch eine rotierende Ein stäbchenförmiges Partikel bewegt sich rotierend durch einen längeren Abschnitt des Bewegung des Wurzelhaares. Der gezeigte Ausschnitt des stäbchenförmigen Partikels Wurzelhaares wird verschoben, um die Bewegung des stäbchenförmigen Partikels besser zu doku- charakterisiert.“ mentieren.

Der eingeblendete Pfeil am linken Rand des Wurzelhaares in Bewegungsrichtung des stäbchenförmigen Partikels markiert dies und bewegt sich nach links als animiertes Bild. Eine Schärfenverlagerung erfolgt innerhalb der Einstellung.

Nach 11 Sekunden wird ein schwarzer Pfeil als 07:12:11 animiertes Bild am oberhalb der Zellwand des Wurzelhaares eingeblendet. 07:12:12 Überblendung: Teilen (Mitte) Standtitel- und bild und bewegender Pfeil werden ausgeblendet. Am Ende der Einstellung 13 teilt sich kreuzförmig das Videobild ausgehend von der Mitte und das Hintergrundbild in Einstellung 14 wird sichtbar.

07:15:02

149 Anhang

Einstellungs- Ein- Wortlaut zum dauer [min] stellungs- Beschreibung der Einstellung gesprochenem Startzeit-Endzeit größe Kommentar 07:15:03 Totale EINSTELLUNG 14 – Standbild: Für die Videoaufnahmen verwendeten wir ein Lichtmikroskop mit Videokamera, die an einen Videorekorder und einen externen Monitor angeschlossen ist. Diese Versuchsanordnung war im Mikroskopraum der Arbeitsgruppe von Prof. Weber aufgebaut. Standtitel „VERSUCHSANORDNUNG“ und Standbild bestehend aus 2 Pfeilen und den Wörtern „Videokamera“, „Lichtmikroskop“, „Netzteil“ und „Videokassettenrekorder“ in roter Farbe

07:19:17 Überblendung: Weiche Blende 07:21:16 Totale Standtitel in blauer Schriftfarbe mit dem Text „Wir danken der Arbeitsgruppe von Prof. Weber für die Benutzung der Geräte zur Mikroskopie, der Arbeitsgruppe von Prof. Galland für die technische Unterstützung bei den Videoauf- nahmen, der Arbeitsgruppe von Dr. Ewald für die Bereitstellung von Pflanzenmaterial“ auf weißen Hintergrund.

07:27:00

Überblendung: Weiche Blende 07:30:14 Totale Standtitel in dunkelblauer Farbe mit dem Wort „FILMENDE“ erscheint auf weißen Hintergrund.

150 Anhang

5.2. Anhang B – Inokulationsexperiment von Eleutherococcus sieboldianus mit Glomus intraradices

151 Anhang

152 Zusammenfassung

6. Zusammenfassung Verschiedene Vertreter von Eleutherococcus aus Asien sind wichtige Heil-, Gemüse und Zierpflanzen. In der vorliegenden Arbeit wurden Möglichkeiten der vegetativen Vermehrung aufgezeigt und strukturelle Untersuchungen zur Mykorrhiza durchgeführt. Die vegetative Vermehrung erfolgte über Kopf- bzw. Teilstecklinge in Sand oder Torf und ist artabhängig. Durch die Zugabe von 1000 ppm Indolylessigsäure erhöht sich die Bewurzelungsrate. Neben Stecklingsvermehrung können Pflanzen auch aus Adventivsprossen von bewurzelten Laubblättern von Eleutherococcus gracilistylus induziert werden. Eine Bestrahlung der Laubblätter mit Rotlicht fördert dabei die Ausbildung von Adventivsprossen. Weitere Eleutherococcus-Arten können unterschiedlich lange Adventivwurzeln an Laubblättern und Fiederblättchen in Leitungswasser und Sand artabhängig ausbilden. In einem anderen Experiment zur Vermehrung wurde eine Pflanzengewebekultur von Eleutherococcus sieboldianus erfolgreich angelegt. Somatische Embryoide entwickeln sich aus Kalluszellen von oberflächensterilen Laubblattexplantaten, die in ihrer weiteren Entwicklung zu Pflanzen heranwachsen. Desweiteren wurde eine spezifische Mikroflora in der Rhizosphäre und in den Wurzelhaaren entdeckt. Die Mykorrhiza bei den untersuchten Eleutherococcus-Arten ist eine vesikulär- arbuskuläre Mykorrhiza (VAM). Der Strukturtyp der Mykorrhiza ist ein Paris-Typ. Mit Glomus intraradices inokulierte Blattrisslinge von Eleutherococcus gracilistylus sind in ihrer Mykorrhiza ebenfalls durch den Paris-Typ charakterisiert. Ein weiteres Merkmal ist das Vorhandensein von intraradikalen Glomerosporen in Adventiwurzeln. Molekularbiologische Untersuchungen zu den wurzelassoziierten Glomeromyzeten ergaben, dass Vertreter der Gattung Glomus, Gruppe A die Wurzeln von verschiedenen Eleutherococcus-Arten aus dem Freiland besiedeln. In vitro Experimente mit Sporen von Gigaspora margarita zeigen einen negativen Gravitropismus verschiedener Pilzhyphen. Eine Besiedlung von in vitro vermehrten Pflanzen von E. sieboldianus mit dem Glomeromyzeten ist möglich. Das Inokulationsexperiment mit Eleutherococcus sieboldianus und Glomus intraradices ergab geringe Sprossgewichte bzw. keine Unterschiede im Gesamtgewicht bei inokulierten Pflanzen im Vergleich zur Kontrolle. Außerdem waren alle mykorrhizierten Pflanzen gelb gefärbt

153 Literaturverzeichnis

7. Literaturverzeichnis

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184 Publikationsliste des Autors

8. Publikationsliste des Autors

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Döring, M., Weber, H. Chr., Imhof, S. (2003). The Mycorrhiza of the Medicinal and Ornamental Genus Eleutherococcus Max. (Araliaceae). 4th International Conference on Mycorrhizae, Montréal (Canada), August 10 - 15 2003.

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Döring, M., Imhof, S., Weber, H. Chr., Ewald, D. (2003). Propagation by leaf cuttings of Eleutherococcus gracilistylus (W. W. Sm.) S. Y. Hu (Araliaceae). 16th International Symposium "Biodiversity and Evolutionary Biology" of the German Botanical Society, Frankfurt/Main (Germany), September 21 – 27 2003.

Franke, T., Beenken, L., Döring, M., Kocyan, A., Agerer, R. (2004). Mycorrhizal Specificity in the Myco-heterotrophic Genus Afrothismia (Burmanniaceae; tribe: Thismieae). 17th Annual Meeting 2004 "Biodiversity, and dynamics in tropical ecosystems" of the Society for Tropical Ecology, Bayreuth (Germany), February 18 – 20 2004.

Döring, M., Ewald, D., Müller, P. (2005). Intracellular occurrence of bacteria in root hairs of Eleutherococcus sieboldianus (Makino) Koidz. plantlets. Symposium on Mechanisms of cellular compartmentalization of SFB 593, Marburg (Germany) April 6-8 2005.

Ewald D., Döring, M. (2005). Investigations concerning the formation of somatic embryos in Eleutherococcus sieboldianus (Makino) Koidz. (Araliaceae). COST 843 and COST 851 Joint Meeting, Stara Lesna(Slovakia) June 28 – 30 2005.

Franke, T., Beenken, L., Döring, M., Kocyan, A., Agerer, R. (2006). Arbuscular mycorrhizal fungi of the Glomus-group A lineage (Glomerales; Glomeromycota) detected from myco-heterotrophic plants from tropical Africa. Mycol. Prog. 5(1): 24-31.

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Müller, P., Döring, M. (2006). Isothermal DNA amplification renders identification of a broad spectrum of bacteria and fungi in Eleutherococcus spec. plant tissue cultures. Symbiosis (eingereicht).

185 Danksagung

9. Danksagung

Ich danke

Herrn Prof. Hans Christian Weber für die Vergabe des Themas, der Bereitstellung des Arbeitsplatzes und Materialien. Sein Vertrauen und Ratschläge waren eine wertvolle Förderung meiner wissenschaft- lichen Tätigkeit.

den Mitgliedern der AG Weber für die angenehme Arbeitsatmosphäre.

Wenying Wu für die Übersetzung asiatischer Fachtexte.

den Mitarbeitern der Botanischen Gärten Beijing, Darmstadt, Marburg, Lansing, Montreal und Prag und der Arboreten Horsholm und Rogow für die Abgabe von Pflanzenmaterial.

Herrn Dr. Dietrich Ewald (Institut für Forstpflanzenzüchtung und Forstgenetik in Waldsieversdorf) für die Hilfestellungen bei der Etablierung der Pflanzengewebekultur.

Herrn Dr. Thassilo Franke (Luwig-Maximilian-Universität München) für die kollegiale Teamarbeit bei den molekularbiologischen Untersuchungen.

meiner Mutter für die Unterstützung meines Promotionsstudiums.

186 Erklärung

10. Erklärung

Ich versichere, dass ich meine Dissertation

"Untersuchungen zur Vermehrung und Mykorrhiza von Eleutherococcus Maxim. (Araliaceae)" selbständig, ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und mich dabei keiner anderen als der von mir ausdrücklich bezeichneten Quellen und Hilfen bedient habe. Die Dissertation wurde in der jetzigen oder einer ähnlichen Form noch bei keiner anderen Hochschule eingereicht und hat noch keinen sonstigen Prüfungszwecken gedient.

______

(Ort/Datum) (Unterschrift mit Vor- und Zuname)

187