MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Diplomová práce
BRNO 2019 MARIE KRÁTKÁ MASARYKOVA UNIVERZITA
PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
Adaptivní evoluce genu CenH3 u rostlin s holocentrickými chromozómy Diplomová práce Marie Krátká
Vedoucí práce: Mgr. František Zedek, Ph.D. Brno 2019 Bibliografický záznam
Autor: Bc. Marie Krátká Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce: Adaptivní evoluce genu CenH3 u rostlin s holocentrickými chro mozómy Studijní program: Experimentální biologie
Studijní obor: Molekulární biologie a genetika
Vedoucí práce: Mgr. František Zedek, Ph.D.
Akademický rok: 2018/2019
Počet stran: 54
Klíčová slova: CenH3; CENP-A; holocentrické chromozomy; adaptivní evo luce, centromerický tah; asymetrická meióza; CENP-C; Cypera- ceae; kodon-substituční modely; MEME; aBSREL Bibliographic Entry
Author: Be. Marie Krátká Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology
Title of Thesis: Adaptive evolution of the CenH3 gene in plants with holocent- ric chromosomes Degree Programme: Experimental biology
Field of Study: Molecular biology and genetics
Supervisor: Mgr. František Zedek, Ph.D.
Academic Year: 2018/2019
Number of Pages: 54
Keywords: CenH3; CENP-A; holocentric chromosomes; centromeric drive; asymmetric meiosis; CENP-C; adaptive evolution Cyperaceae; codon-substitution models; MEME; aBSREL Abstrakt
U organismů s monocentrickým uspořádáním chromozomů probíhá centromerický tah, evoluční proces iniciovaný expanzí centromerických repetic, které jsou tak na sebe schopny navázat větší množství kinetochorových proteinů a poté být díky asymetrii dě licího vřeténka při samicí meióze preferenčně segregovány do vajíčka. V reakci na tyto sobecké centromery dochází k adaptivní evoluci kinetochorového proteinu CenH3, který dokáže zabránit tahu sobeckých centromer obnovením jejich rovnocennosti. Alternativním způsobem obrany mohou být holocentrické chromozomy, které mají v meióze kinetochor sestaven podél celé délky chromozomu, což může znemožnit rozšířeným repetitivním sek vencím získat selekční výhodu a iniciovat centromerický tah. V takovém případě proto nedochází k adaptivní evoluci CenH3. Tato práce popisuje evoluci genu CenH3 v 34 dru zích rostlin z holocentrické čeledi Cyperaceae. Selekční analýzou byla nalezena pozitivní selekce CenH3 srovnatelná s monocentrickými organismy s asymetrickou samicí meiózou, z čehož vyplývá, že uspořádání kinetochorů během meiózy v této čeledi nebrání centrome- rickému tahu. To by se dalo vysvětlit možným polycentrickým uspořádáním kinetochorů během meiózy, které však zatím bylo pozorováno pouze v druhu Rhynchospora pubera. Abstract
In organisms with monocentric chromosome morphology, an evolutionary process called centromere drive takes place. This process is initiated by centromeric repeats ex• pansion, which leads to the recruitment of excess kinetochore proteins. This allows the expanded centromere to be preferentially segregated to the egg during asymmetric female meiosis. In response to the selfish centromeres, kinetochore protein CenH3 adaptively evol• ves. The evolution of CenH3 can avert the centromere drive by restoring the centromere parity. Alternative protection from the centromere drive can be provided by holocentric chromosomes, which have their kinetochore assembled along an entire chromosome du• ring meiosis. This can prevent expanded centromeres from acquiring selective advantage and initiating the centromere drive. In such a case, no adaptive evolution of CenH3 occurs. This thesis describes the evolution of the CenH3 gene in 34 species from the Cyperaceae family. Positive selection of CenH3 comparable with monocentric organisms with asym• metric female meiosis was found using selection analysis, which suggests that the structure of kinetochores in the Cyperaceae family doesn't prevent the centromere drive. This could be explained by the possible polycentric structure of the kinetochore in this family during meiosis which has so far been observed only in Rhynchospora pubera species. MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta
ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE
Akademický rok: 2017/2018
Ustav: Ústav experimentální biologie
Studentka: Bc. Marie Krátká
Program: Experimentální biologie
Obor: Molekulární biologie a genetika
Ředitel Ústavu experimentální biologie PřF MU Vám ve smyslu Studijního a zkušebního řádu MU určuje diplomovou práci s názvem:
Název práce: Adaptivní evoluce genu CenH3 u rostlin s holocentrickými chromozómy
Název práce anglicky: Adaptive evolution of the CenH3 gene in plants with holocentric chromosomes
Oficiální zadání: Adaptivní evoluce centromerického histonu H3 (CenH3) je u monocentrických eukaryot důsledkem obrany proti centro- merickému tahu, jehož negativní důsledky mohou být mutacemi CenH3 potlačeny. Holocentrická struktura chromozómů by měla centromerickému tahu bránit sama o sobě, což by mělo vést k nižší frekvenci positivní selekce na CenH3. Cílem práce bude tuto hypotézu testovat. Diplomantka bude izolovat gen CenH3 z holocentrických druhů rostlin (zejména če leď Cyperaceae) s využitím metod izolace RNA, DNA, reverzní transkripce, PCR (+návrh primerů), klonování do E. coli a sekvenování. Získané sekvence a selekční režimy bude analyzovat s využitím bioinformatických nástrojů (alignment, konstrukce stromu, codon substituční modely).
Jazyk závěrečné práce: čeština
Vedoucí práce: Mgr. František Zedek, Ph.D.
Datum zadání práce: 25. 9. 2017
V Brně dne: 9.10.2017
Souhlasím se zadáním (podpis, datum):
Bc. Marie Krátká Mgr. František Zedek, Ph.D. prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc. studentka vedoucí práce ředitel Ústavu experimentální biologie Poděkování
Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucímu své diplomové práce Mgr. Františku Zedkovi, Ph.D. za odborné vedení a rady, které jsem od něj obdržela během vypracovávání své práce, doc. RNDr. Petrovi Burešovi, Ph.D. a Mgr. Pavlovi Veselému, Ph.D. za určení a sběr vzorků a Ing. Jakubovi Šmerdovi, Ph.D. a Kateřině Lojdové za pomoc v laboratoři. Dále bych chtěla poděkovat organizaci MetaCentrum za poskytnutí výpočetních zdrojů.
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím infor mačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 10. května 2019 Marie Krátká Obsah
Kapitola 1. Úvod 10 1.1 CenH3 10 1.2 Centromeric ký tah 10 1.3 Adaptivní evoluce CenH3 12 1.3.1 Živočichové 12 1.3.2 Rostliny 12 1.3.3 Evoluce dalších kinetochorových proteinů 13 1.3.4 Evoluce CenH3 v organizmech se symetrickou meiózou 13 1.3.5 Vliv uspořádání centromery na evoluci CenH3 13 1.4 Holocentrické chromozomy 14 1.4.1 Monocentrické, metapolycentrické, holocentrické 14 1.4.2 Centromerické sekvence 16 1.4.3 Centromerický tah 17 1.5 Metody studia adaptivní evoluce 17
Cíl diplomové práce 19
Kapitola 2. Materiál a metody 20 2.1 Izolace RNA a DNA, příprava cDNA 20 2.2 Amplifikace genu CenH3 20 2.2.1 Návrh primerů a PCR 20 2.2.2 Agarózová elektroforéza 22 2.2.3 Optimalizace PCR 22 2.3 Sekvenace a úprava sekvencí 22 2.4 Kodonový alignment a konstrukce fylogenetického stromu 22 2.5 Selekční analýza 23
Kapitola 3. Výsledky 24
Kapitola 4. Diskuze 29 4.1 Získané sekvence a fylogenetický strom 29 4.2 Adaptivní evoluce CenH3 29 4.3 Centromerický tah 30 4.4 Symetrie meiózy 30 4.5 Adaptivní role holocentrických chromozomů 31
Souhrn 33
Summary 34
Seznam použité literatury 35
Přílohy 41 Tabulka Pl: Seznam získaných sekvencí 41 Soubor Pl: Skript pro maskování alignmentu 42 Soubor P2: Maskovaný alignment získaných sekvencí 43 Soubor P3: Fylogenetický strom získaných sekvencí 52 Kapitola 1
Úvod
1.1 CenH3
Protein CenH3 (centromerická varianta H3, u obratlovců označovaná jako CENP-A) tvoří jakýsi "základní kámen kinetochoru". CenH3 je varianta histonu H3, která se nachází pouze v oblastech centromery (představuje jakýsi marker funkční centromery) a narozdíl od klasického H3 umožňuje vazbu dalších kinetochorových proteinů a sestavení kineto choru v centromerické oblasti (Van Hooser et al, 2001; Heun et al, 2006). Strukturně je CenH3 velmi podobný histonu H3 (obzvlášť v oblasti HFD - histone fold domény na C-konci), liší se hlavně na N-konci, který zajišťuje interakci s DNA a dalšími proteiny (např. kinetochorovými) (Chen et al, 2000; Malik et al, 2002), a loop 1 oblastí uvnitř HFD, která je typicky v CenH3 o několik nukleotidů delší než v H3 a je zodpovědná za specifickou interakci s centromerickou DNA (Malik a Henikoff, 2003). CenH3 je také specifický tím, že se v průběhu evoluce oproti svému kanonickému protějšku H3 velmi rychle vyvíjí, a to obzvláště v regionech zodpovědných za vazbu DNA. Takováto rychlá evoluce proteinu naprosto nezbytného pro správný průběh buněčného dělení je velmi nezvyklá, což vede k úvaze, že adaptivní evoluce CenH3 je podmíněna rychlou evolucí centromerických sekvencí (Malik a Henikoff, 2003). Podle hypotézy centromerického tahu se CenH3 vyvíjí v reakci na negativní důsledky rozšíření sobecké centromery a tím se stává účastníkem evolučních závodů ve zbrojení.
1.2 Centromerický tah
Podle Mendelových zákonů dědičnosti je soubor alel v gametách důsledkem náhodného procesu segregace. Tato náhodnost zajišťuje, že se konkrétní alela vyskytuje v 1/2 vy tvořených gamet. Meiotický tah je proces, který tuto rovnováhu alel v gametách porušuje (Sandler a Novitski, 1957). Při asymetrické samicí meióze, která je typická pro většinu ži vočichů a vyšších rostlin (Gorelick et al., 2016), vzniká ze čtyř meiotických produktů pouze jedna funkční gameta (vajíčko). Sobecké genetické elementy, které umí využít buněčné mechanismy k tomu, aby se preferenčně segregovaly do jediné vznikající samicí gamety, tak zvyšují svou šanci uplatnění v další generaci (Obr. 1.1). Jako sobecké elementy mohou působit například zmnožené centromerické satelitní repetice, které na sebe váží nepoměrně více jednotek CenH3, což umožňuje sestavování kinetochoru na širší oblasti chromozomu,
-10- Kapitola 1. Uvod 11
symetrická centromerický tah (samčí) meióza nemůže probíhat
centromerický tah asymetrická může probíhat (samici) meióza
Obrázek 1.1: Při asymetrické meióze dochází k preferenční segregaci silné centromery (červeně) do oocytu (převzato z Chmátal et al. (2017), upraveno)
rozšíření adaptace ' ^ centromerickése ^ kinetochorových kvence N proteinů I
rovnocenne výhoda silnější rovnocenne centromery centromery centromery
Obrázek 1.2: Centromerický tah začíná rozšířením centromerické sekvence, které jí umožní prefe renční segregaci do samicí gamety. Ve druhém kroku dochází k adaptivní evoluci kinetochorových proteinů (např. CenH3), které obnoví rovnováhu centromer takže vytváří "silnějšfcentromeru (Iwata-Otsubo et al, 2017). V některých populacích dochází k přednostní interakci silné centromery s mikrotubuly vaječného pólu dělící se buňky, což vede k její přednostní segregaci do vajíčka (Chmátal et al, 2014). Centromerický tah (Obr. 1.2) tedy umožňuje rozšíření sobeckého elementu v populaci, což však s sebou nese negativní důsledky, například zachování škodlivé alely, která by se nacházela ve vazbě se sobeckou centromerou (a která by jinak byla vyřazena přiroze ným výběrem) (Malik a Henikoff, 2009; Fishman a Kelly, 2015), nebo špatné párování nerovnocenných heterozygotních centromer v průběhu samčí meiózy, způsobující nondis- junkci a vznik aneuploidních gamet (Daniel, 2002) nebo dokonce apoptózu zárodečných buněk (Eaker et al, 2001). U organismů s heterogametickým samicím pohlavím (např. ptáci, někteří plazi a motýli) by preferenční uplatnění jednoho z pohlavních chromozomů v gametách mohlo vyvolávat vychýlení poměru pohlaví (Rutkowska a Badyaev, 2007). Právě tyto škodlivé účinky centromerického tahu mohou být kompenzovány mutacemi při lehlých centromerických proteinů (např. CenH3). Adaptivní mutace, které dokáží změnit dynamiku interakce mezi centromerickou DNA a CenH3 tak, aby obnovily rovnocennost kinetochoru na běžné a silnější centromere (Obr. 1.2), by proto představovaly selekční výhodu a byly pozitivně selektovány a fixovány (Henikoff et al, 2001). Kapitola 1. Uvod 12
1.3 Adaptivní evoluce CenH3
v 1.3.1 Živočichové Selekce působící na centromerické proteiny byla poprvé zdokumentována v rodu Droso- phila, kde Malik a Henikoff (2001) nalezli pozitivní selekci působící na celý gen centro merické varianty H3 (v rodu Drosophila označovaný jako Ciď), i na jeho jednotlivé oblasti (N-konec a HFD). Při podrobnější analýze (Malik et al., 2002) bylo v HFD možné rozlišit konzervované oblasti, které odpovídají oblastem interakce mezi histony, a měnící se oblast (loop 1), která interaguje s DNA. N-konec je velmi polymorfní, nápadná je zejména vari abilita v jeho délce způsobená přítomností oligopeptidových repetitivních motivů, z nichž některé připomínají motivy vázající malý žlábek DNA. Vysoce variabilní N-konec však obsahuje také určité konzervované bloky, které by mohly být zodpovědné za interakci s dalšími kinetochorovými proteiny nebo sousedními CenH3. Malik a Henikoff (2001) dále zaznamenali absenci polymorfismů v blízkosti pozic s adaptivní mutací, což naznačuje nedávnou fixaci adaptivních změn díky silné pozitivní selekci (selective sweep). Beck a Llopart (2015) identifikovali adaptivní evoluci i u dalších komponent kinetochoru v rodu Drosophila a potvrdili pozitivní selekci působící na N-konec Cid ve všech sledovaných liních a na C-konec v některých liniích. Zedek a Bureš (2012) nalezli rezidua podléhající adaptivní evoluci na N-konci a v loop 1 oblasti CenH3 ortologu (HCP-3) také u háďátka Caenorhabditis briggsae. Tato adaptivní změna HCP-3 by mohla souviset s expanzí repetitivních sekvencí pozorovanou u tohoto druhu. Pozitivní selekce CENP-A byla nalezena i v řádu primátů (Schueler et al, 2010). Autoři zároveň poukazují na skutečnost, že některé z pozitivně selektovaných reziduí na N- konci CENP-A mohou hrát roli při posttranslačních modifikacích. V promotorové oblasti CENP-A navíc objevili časté inzerce transpozonů, což by mohlo naznačovat odlišnou regulaci genové exprese v různých druzích primátů.
1.3.2 Rostliny
Další čeledí, ve které byla evoluce CenH3 zkoumána, je Brassicaceae. Talbert et al. (2002) nalezli pozitivní selekci v ortologním genu CenH3 z Arabidopsis thaliana a A. arenosa pojmenovaném HTR12. Cooper a Henikoff (2004) popsali podrobnější strukturu loop 1. Kromě pozic, které se adaptivně vyvíjí, obsahuje loop 1 také některé pozice pod silnou purifikující selekcí, ukazující na možnou strukturní funkci některých reziduí v loop 1. popsali také adaptivně se vyvíjející pozice v HFD mimo loop 1, tato rezidua se nachází na povrchu proteinu poblíž dvoušroubovice DNA. Neumann et al. (2015) sledovali evoluci sekvence CenH3 uvnitř tribu Fabeae (čeleď Fabaceae). Tato skupina je pozoruhodná tím, že u jejího společného předka došlo k dupli kaci genu CenH3. V některých rodech (Vicia a Lens) došlo ke ztrátě nebo umlčení jedné z variant, avšak u rodů Pisum a Lathyrus byly obě varianty zachovány a podílejí se na se stavování kinetochoru. U kopie CenH3 zachované ve všech druzích Fabeae bylo nalezeno několik pozic podléhajících adaptivní evoluci uvnitř HFD, kdežto u kopie specifické pro rody Pisum a Lathyrus nebyly nalezeny žádné. Epizodická pozitivní selekce CenH3 však nebyla potvrzena v žádné fylogenetické linii a oba geny se jako celek vyvíjejí pod vlivem Kapitola 1. Uvod 13 negativní selekce. Rody lišící se počtem funkčních kopií CenH3 se liší také morfologií centromer, zatímco rody s jednou kopií si zachovaly monocentrickou strukturu, u rodů se dvěma kopiemi došlo k vývoji takzvaných metapolycentrických chromozomů (kapitola 1.4.1). Pozitivní selekce byla nalezena také v některých liniích CenH3 u diploidních a allo- tetraploidních druhů rodu Oryza (Poaceae) (Hirsch etal, 2009) a na některých kodonových pozicích v N-konci CenH3 v rodu Mimulus (Phrymaceae) (Finseth et al, 2015).
1.3.3 Evoluce dalších kinetochorových proteinů
Talbert et al. (2004) poukázali na to, že v liniích, kde není zjištěna adaptivní evoluce CenH3 může pozitivní selekce působit na další komponenty kinetochoru, které jsou v kontaktu s DNA (jako například CENP-C). Adaptivní evoluci CENP-C v řádu primátů potvrdili Schueler
1.3.4 Evoluce CenH3 v organizmech se symetrickou meiózou Vztah mezi adaptivní evolucí CenH3 a centromerickým tahem dále objasnili Zedek a Bu reš (2016b), kteří porovnávali frekvenci výskytu pozitivní selekce CenH3 ve skupinách, které mají symetrickou samčí i samicí meiózu (např. mechy, kapradiny, některé houby) se skupinami s asymetrickou samicí meiózu. Pozitivně selektované linie byly s vyšší frek vencí pozorovány ve skupinách s asymetrickou meiózou. Skupiny s asymetrickou meiózou také obsahovaly více pozitivně selektovaných pozic a vyšší průměrný podíl nesynonym- ních mutací. Všechna tato zjištění ukazují na častější výskyt adaptivní evoluce CenH3 v eukaryotických liniích s asymetrickou samicí meiózou. To je v souladu s hypotézou centromerického tahu, protože asymetrická meióza je nezbytným předpokladem pro cen- tromerický tah (Obr. 1.1) a tedy i navazující adaptivní evoluci CenH3. Absence pozitivní selekce v říši hub je ověřena i dalšími analýzami (Baker a Rogers, 2006; Talbert et al, 2004). Talbert et al. (2004) spekulují, že je absence pozitivní evoluce CenH3 a CENP-C (v rodu Saccharomyces nazvané jako Cse4p a Mif2p) může být způsobena také nezvyklou strukturou jejich centromer. Bodové centromery některých kvasinek jsou totiž složeny ze specifických konzervovaných sekvencí, na které nasedá pouze jediný nukleozom obsahu jící Cse4p (Henikoff a Henikoff, 2012).
1.3.5 Vliv uspořádání centromery na evoluci CenH3 Je tedy zjevné, že adaptivní evoluce CenH3 probíhá v mnoha taxonech. Podstata tohoto pro cesu zřejmě tkví v genetickém konfliktu s rychle se vyvíjejícími sobeckými centromerami. Existují však okolnosti, které by potenciálně mohly znemožnit sobeckým centromerickým repeticím získání evoluční výhody. CenH3 v holocentrických rostlinách rodu Luzula ne nese žádné známky pozitivní selekce (Zedek a Bureš, 2016a). Absence pozitivní selekce působící na CenH3 v těchto rostlinách by se dala vysvětlit nezvyklým uspořádáním jejich centromer. Kapitola 1. Uvod 14
Obrázek 1.3: Schéma typů uspořádání centromery (červeně znázorněn kinetochor): A) monocen- trické, B) metapolycentrické, C) holocentrické
1.4 Holocentrické chromozomy
1.4.1 Monocentrické, metapolycentrické, holocentrické Oblast funkční centromery je určena přítomností nukleozomů obsahujících CenH3, které jsou nezbytné pro sestavení kinetochoru (výjimkou jsou například některé skupiny hmyzu, ve kterých CenH3 chybí (Drinnenberg et al, 2014)) a následné navázání dělícího vře ténka. Centromerický heterochromatin je také charakteristický přítomností některých posttranslačních modifikací, jako například H2AThrl20ph, která se vyskytuje specificky v heterochromatinu funkčních rostlinných centromer a podílí se na regulaci koheze chro- matid při buněčném dělení (Demidov et al, 2014). V oblasti centromery se také často nachází jedinečná sekvence DNA, která se svou transkripcí podílí na depozici CenH3 nukleozomů do centromerického chromatinu (Quénet a Dalal, 2014) a následně napomáhá stabilizaci jejich vazby (Zhang et al, 2013). Sekvence centromerické DNA je však vysoce specifická pro blízce příbuzné druhy a podléhá rychlé divergentní evoluci (Henikoff et al, 2001). Podle počtu a rozmístění centromerických oblastí je možné určit tři typy uspořádání chromozomů (Obr. 1.3). Monocentrické chromozomy, přítomné u většiny eukaryot, se vyznačují jedinou centro- merickou oblastí nacházející se v místě primární konstrikce chromozomu. Centromerická sekvence je typicky tvořena satelitními tandemovými repeticemi nebo odvozena z retro- transposonů, celková délka této sekvence může dosahovat až několik megabází. Metapolycentrické chromozomy mohou představovat přechodný stav mezi mono- a holocentrickými chromozomy (Neumann et al, 2012). V tomto případě se uvnitř rozšířené primární konstrikce nachází 3-5 diskrétních oblastí centromery vázajících CenH3. Tento typ centromery byl nalezen u dvou rodů z čeledi Fabaceae (Neumann et al, 2015). Re petí tivní sekvence tvořící metapolycentrickou centromeru jsou neobyčejně rozmanité. Neumann et al. (2012) identifikovali 13 různých typů satelitních sekvencí a jeden typ retrotranspozonového elementu tvořící centromerickou sekvenci DNA Pisum sativum, u monocentrických druhů je centromera tvořena nejčastěji pouze jedním nebo dvěma typy satelitu (doplňkové materiály v Melters et al. (2013)) Holocentrické chromozomy mají takzvanou difuzní centromeru, která se vyskytuje v mnoha oblastech podél celé délky chromozomu. Při pozorování kondenzovaných chromo- Kapitola 1. Uvod 75
S. cereale (M) L. elegans (H) R. pubera (H) C. elegans (H)
Obrázek 1.4: Uspořádání centromery v mitóze a meióze se u některých holocentriků liší. Vyobrazen karyotyp monocentrického Secale cereale (převzato z Schubert et al. (2014)) a holocentrických Luzula elegans (difuzní centromera při obou typech buněčného dělení (Heckmann et al, 2014; Demidov et al, 2014)), Rhynchospora pubera (při meióze je centromera tvořena shluky (Marques etal, 2016)) a chromozom Caenorhabditis elegans (kinetochor (zeleně) při meióze "objímá"jeden konec chromozomu (červeně) (Howe et al, 2001; Dumont et al, 2010)) zomů ve světelném mikroskopu není zřetelná primární konstrikce a oblasti centromery, na kterých dochází k sestavení kinetochoru a navázání dělicího vřeténka typicky tvoří souvislý pás (Obr. 1.3,1.4). Toto odlišné uspořádání s sebou přináší také mnoho rozdílů v průběhu buněčného dělení. V holocentrických rostlinách rodu Luzula byla zdokumen tována takzvaná invertovaná meióza, při které dochází během I. meiotického dělení k rozdělení sesterských chromatid a při II. meiotickém dělení jsou rozděleny nesesterské chromatidy (Heckmann et al, 2014). Ne všechny organismy si však zachovávají holocent- rické uspořádání chromozomů během mitózy i meiózy (Obr. 1.4). U hlístic Caenorhabditis a Parascaris v průběhu meiózy není centromera difuzní, ale lokalizována na jednom z chro- mozomálních konců (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Navíc se při I. meiotickém dělení rozchází nesesterské chromatidy - tak, jak je zvykem u monocentriků (Maddox et al, 2004). Určitou odlišnost v meióze můžeme pozorovat i u rostliny Rhynchospora pubera z čeledi Cyperaceae, kde se sice "klasická"difuzní holocentromera vyskytuje v průběhu mitózy, ale během meiózy vytváří jakési oddělené centromerické shluky (Marques et al, 2016). U dalších rostlin z čeledi Cyperaceae zatím nebylo uspořádání kinetochoru během meiózy studováno (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Holocentrismus vznikl a zanikl několikrát v rozličných eukaryotických taxonech (Obr. 1.5), fylogenetické modely odhadují, že celkem došlo k 13 až 19 takovým vznikům (Melters et al, 2012; Escudero et al, 2016). Jenom v rámci krytosemenných pravděpodobně došlo až k 6 nezávislým přechodům z monocentrického na holocentrické uspořádání (Escudero et al, 2016). Odhaduje se, že přibližně 1,5 % (5 500) druhů krytose menných rostlin (většina z nich z čeledi Cyperaceae) má holocentrické uspořádání (Bureš et al, 2013). Holocentrický typ centromer byl potvrzen v čeledích Juncaceae (sítinovité) a Cyperaceae (šáchorovité) z řádu Poales (lipnicotvaré) a v rodu Chionographis z řádu Liliales (liliotvaré), z vyšších dvouděložných rostlin také v rodu Drosera (rosnatka) a Cuscuta (kokotice) (Bureš et al, 2013). Vzhledem k polyfyletickému původu holocent rických chromozomů není jasné, nakolik jsou si na molekulární úrovni vzájemně podobné Kapitola 1. Uvod 16
Ecdysozoa Viridiplantae Odonata Zoraptera + Dermaptera Hemiptera Psocodea Trichoptera + Lepidoptera
Remipedia + Copepoda + Brachiopoda
zbytek Crustacea
Myriapoda | ^^^^^^^^^ roztoči Dysderoidea Buthidae
zbytek Chelicerata
B Onychophora 1 Tardigrada
-ŕ Nematoda I 11 I Monocentrické nebo neurčené chromozomy Priapulida + Kinorhyncha + Lophotrochozoa ~~] Holocentrické chromozomy
Obrázek 1.5: Zjednodušený fylogenetický strom výskytu holocentrických chromozomů (převzato ze Zedek a Bureš (2018)). Holocentrické chromozomy se vyskytují v několika řádech hmyzu, stonožkách a mnohonožkách, některých roztočích, pavoucích, štírech a hlísticích. Holocentrické rostliny zahrnují především dvouděložné rody rosnatek a kokotic, jednoděložné cyperidní rostliny (sítinovité a šáchorovité) a spájivé řasy v různých liniích. Funkce a struktura holocentrických chromozomů byla nejpodrobněji prostudována u C. elegans, z rostlin potom u rodu Luzula čeledi Juncaceae.
1.4.2 Centromerické sekvence Homogenní repetitivní sekvence specifické pro oblast centromery jsou však běžným jevem pouze u monocentrických (a metapolycentrických) chromozomů (Plohl et al, 2014). V případě holocentrických chromozomů je kinetochor kolokalizující s jedinečnou repetitivní sekvencí spíše výjimkou. Žádné z repetitivních sekvencí C. elegans nemají vysokou afinitu k CenH3, na základě rozvržení repetitivních sekvencí se lze domnívat, že jedinečnou cent- romerickou DNA neobsahují ani rostliny rodu Luzula (Heckmann et al., 2013), Eleocharis (Cyperaceae) (de Souza et al, 2018) a motýl Bombyx mori (d'Alencon et al, 2010). Vý jimkou jsou některé druhy rodu Rhynchospora, kde byly nalezeny satelitní repetice Tyba tvořící centromeru (Marques et al, 2015). Tyto 3 až 16 kb dlouhé oblasti kolokalizují s CenH3 a během kondenzace chromozomu tvoří drážku (při mitóze) nebo diskrétní cen tromerické shluky (při meióze) podél celé délky chromozomu (Obr. 1.4, Marques et al. (2016)). Satelitní sekvence tvořící centromeru však nebyla nalezena ve všech druzích Rhynchospora (Ribeiro et al, 2017) a Tyba sekvence netvoří centromerickou sekvenci ani v dalších rodech Cyperaceae, zůstává proto otázkou, zda i některé další holocentrické druhy či rody z čeledi Cyperaceae mohou obsahovat repetitivní centromerické sekvence, Kapitola 1. Uvod 17 nebo zdaje Rhynchospora opravdu výjimkou.
1.4.3 Centromerický tah Vzhledem k tomu, že v holocentrických organismech nehraje centromerická DNA tak zá sadní roli jako u monocentriků, dá se usuzovat, že případné rozšíření satelitních sekvencí v podstatě neovlivní lokalizaci CenH3. Pokud by tomu tak skutečně bylo, centromerický tah by v holocentrických organismech nemohl probíhat, protože rozšíření satelitních sek vencí by nevyústilo v rozšíření kinetochoru a preferenční segregaci do samicích gamet (Talbert et al, 2009; Malik a Henikoff, 2009). Nepřítomnost centromerického tahu by tak způsobila méně častou pozitivní selekcí CenH3. Tento předpoklad je naplněn u rodu Luzula, kde nebyly nalezeny žádné stopy pozitivní selekce CenH3 (Zedek a Bureš, 2016a). Holocentrické chromozomy by tak mohly vznikat jako preventivní obrana před akumulací satelitních sekvencí v důsledku centromerického tahu (Talbert et al, 2009; Malik a Heni koff, 2009; Zedek a Bureš, 2016a). Tomu by nasvědčovala skutečnost, že se holocentrické chromozomy vyskytují pouze v organismech s asymetrickou meiózou (Zedek a Bureš, 2016a).
1.5 Metody studia adaptivní evoluce
Změny aminokyselinové sekvence vznikají nesynonymní mutací (N) sekvence genu (mu tovaný kodon kóduje jinou aminokyselinu), na tyto mutace poté na úrovni proteinu působí selekční tlak, který způsobí fixaci nebo eliminaci alely podle toho, zda je přínosná nebo škodlivá. Pozitivní selekce tak fixuje ty alely, které organismu přináší adaptivní výhodu. Další typ mutací, synonymní mutace (S), nemají vliv na aminokyselinovou sekvenci pro teinu, protože mutovaný triplet kóduje stejnou aminokyselinu, na tyto alely proto selekce typicky nepůsobí. Selekční tlak na určitý protein je možné sledovat pomocí poměru frekvence nesy- nonymních a synonymních mutací (CO — dN/dS) (který lze odhadnout ze sekvencí genu různých druhů a jejich fylogenetického stromu). Pokud na gen nepůsobí žádný selekční tlak (vyvíjí se neutrálně), je tento poměr přibližně roven 1. Pozitivní selekce zvýší frekvenci nesynonymních mutací a tedy i CO, která v tomto případě dosahuje hodnot > 1. Negativní selekce bude nesynonymní mutace odstraňovat a co proto bude < 1. Pozitivní selekce však nepůsobí na dN ve všech fylogenetických větvích a na všech kodonových pozicích sekvence. Většinou na protein působí negativní selekce a pozitivní selekční tlak se vyskytuje pouze epizodicky (například když se CenH3 adaptivně vyvíjí, aby obnovilo rovnováhu centromer), takže celková CO (napříč pozicemi a liniemi) téměř nikdy nepřesáhne 1. Identifikovat tyto epizody adaptivní evoluce je možné pomocí ko- don-substitučních modelů, které umožňují rozdělit kodony do několika tříd reprezentujích pozice vyvíjíjející se neutrálně (co — 1), pod negativní selekcí (co < 1) nebo pod pozitivní selekcí (co > 1). Pokud došlo v daném genu k epizodě pozitivní selekce, bude model ob sahující třídu pozic pod pozitivní selekcí pravděpodobnější než modely počítající pouze s třídami neutrální evoluce a negativní selekce (Kosiol a Anisimova, 2012). aBSPvEL (Adaptive Branch-Site Random Effects Model) umožňuje přiřadit každé jed notlivé linii (větvi fylogenetického stromu) až 3 hodnoty CO a rozdělit kodony do 3 tříd Kapitola 1. Uvod 18 a určit, ve kterých liniích je model obsahující třídu pozitivně selektovaných kodonů vý znamně pravděpodobnější než "nulový model"(nepovolující třídu pozitivně selektovaných kodonů) a ve kterých tedy pravděpodobně došlo k epizodické pozitivní selekci (Smith et al., 2015). MEME (Mixed Effect Models of Evolution) umožňuje každé pozici kodonu přiřadit vlastní hodnotu co, tato hodnota může lišit v jednotlivých liních. Tento model proto do káže identifikovat pozice pozitivně selektovaných kodonů i v případě epizodické selekce (selekce pouze v některých liních) (Murrell et al., 2012). Cíl diplomové práce
Předchozím studiem evoluce genu CenH3 v holocentrických organismech bylo zjištěno, že v rostlinách rodu Luzula se tento gen nevyvíjí pod působením pozitivní selekce, což je v kontrastu k poznatkům získaným z dalších eukaryotických taxonů. Tento jev lze vysvětlit holocenrickým uspořádáním jejich chromozomů, které by mohlo zabraňovat centromerickému tahu. Tato vlastnost by poskytla organismům adaptivní výhodu a mohla tak být jedním z důvodů, proč holocentrické chromozomy v průběhu evoluce vznikaly opakovaně. Pokud by holocentrické chromozomy opravdu zabraňovaly centromerickému tahu, bylo by možné očekávat nepřítomnost pozitivní selekce působící na CenH3 i u dalších skupin holocentrických organismů. Čeleď Cyperaceae (šáchorovité) je díky své velikosti a příbuznosti k rodu Luzula jasným kandidátem na ověření tohoto předpokladu. Cílem této diplomové práce je charakterizovat selekční tlaky působící na gen CenH3 v rostlinách čeledi Cyperaceae a ten porovnat s evolucí genu v dalších monocentrických a holocentrických skupinách. Získané poznatky přispějí k objasnění vlivu centromerického tahu na holocentrické organismy a k zodpovězení otázky, zda se holocentrické chromozomy mohly vyvinout jako obrana proti sobeckým centromerám.
-19- Kapitola 2
Materiál a metody
2.1 Izolace RNA a DNA, příprava cDNA
Pro izolaci genu CenH3 byly vybrány rostliny z divokých populací druhů napříč čeledí Cyperaceae (Tab. Pl). Sebrané rostliny byly uchovány v chladu a neprodleně použity k izolaci DNA nebo RNA, případně byly kultivovány ve skleníku pro pozdější izolaci. Pro izolaci byly použity báze mladých listů. RNA byla izolována pomocí kitu QIAGEN® RNeasy® Plant Mini Kit podle pokynů výrobce (použit byl RLT pufr přídavkem /3-mer- kaptoetanolu) a její orientační koncentrace změřena pomocí spektrofotometru Biochrom Libra S22. Poté byla ze vzorku reverzní transkripcí pomocí kitu QIAGEN® QuantiTect® Reverse Transcription Kit připravena cDNA podle pokynů výrobce. Genomová DNA byla izolována ze vzorků, z nichž se nepodařilo získat amplifikovatelnou RNA. DNA byla izo lována pomocí kitu MACHEREY-NAGEL Nucleospin® Plant II podle pokynů výrobce s úpravami. Lyžovaný rostlinný materiál byl po 5 min inkubaci při 0 °C centrifugován 2 min při 14 000 g a supernatant byl následně odebrán do filtrační (růžové) kolonky. Kolonky byly ve všech krocích centrifugovány pouze při 4 000 RPM. Po druhém promytí vazebné roztokem PW2 byla kolonka znovu centrifugována 2 min za účelem vysušení membrány.
2.2 Amplifikace genu CenH3
2.2.1 Návrh primerů a PCR Primery pro amplifikaci CenH3 byly navrženy na základě již známých sekvencí CenH3 čeledi Cypereceae získaných z databází (Tab. Pl). Bylo navrženo několik sekvencí forward a reverse primerů lišících se místem nasedání a přítomností degenerovaných bází (Tab. 2.1 a Tab. 2.2), čímž bylo docíleno nasedání primerů i na sekvence CenH3 těch druhů, které se od známých sekvencí do jisté míry liší. Místa nasedání primerů byla vybrána tak, aby výsledný produkt pokrýval prakticky celou protein-kódující část genu CenH3. Sekvence byly amplifikovány Taq Purple polymerázou za reakčních podmínek uvedených v Tab. 2.3 v termocycleru BIOER GenePro za použití programu rozepsaného v Tab. 2.4.
-20- Kapitola 2. Materiál a metody _ 21
Tabulka 2.1: Sekvence primerů
název směr sekvence CYP-F0R1 forward ATGRCSAGAACSAAGCACTT CYP-FOR2 forward ATGRCNAGAACSAAGCACTT CYP-FOR3 forward GCNAGAACSAAGCACTTCT CYP-REV1 reverse CCACAWTCGACGRCCACTAAT CYP-REV2 reverse TCGACGRCCACTAATRCGCCT
Tabulka 2.2: Příměrové kombinace
název forward primer reverse primer teplota nasedání [°C] A CYP-FOR1 CYP-REV1 54 B CYP-FOR1 CYP-REV2 56 C CYP-FOR2 CYP-REV1 54 D CYP-FOR2 CYP-REV2 56 E CYP-FOR3 CYP-REV1 54 F CYP-FOR3 CYP-REV2 56
Tabulka 2.3: Složení reakční směsi při amplifikaci v celkovém objemu 50 ul
reakční složka množství [ul]
ddH20 36,5 Taq Buffer complete 5 dNTPmix(lOmM) 0,5 primery (25 uM) 0,5 Purple Taq (lU/uL) 2,5 templátová DNA/cDNA 5
Tabulka 2.4: Program PCR při amplifikaci z cDNA
krok čas teplota [°C] 1 Počáteční denaturace 3 min 95 2c Denaturace 30 s 95 3c Nasedání primerů 1 min podle primerů 4c Extenze 30 s* 72 kro ty 2-4 byly opakovány 35 x * pi i amplifikaci z DNA trvala extenze 45 s Kapitola 2. Materiál a metody 22
Tabulka 2.5: Finální koncentrace složek v 1 x TBE pufru
složka koncentrace [mM] Tris báze 89
H3BO3 89 EDTA 1
dH20 -
2.2.2 Agarózová elektroforéza Produkty amplifikace byly analyzovány pomocí agarózové gelové elektroforézy. Z agarózy (PCR agarose, Top-Bio) a lx TBE pufru (Tab. 2.5) byl připraven 1% gel, do kterého byla vmíchána fluorescenční barva (GoodView Nucleic acid stain, SBS Genentech Co.). Elektroforéza byla provedena ve vaně s TBE pufrem při napětí 6,5 V/cm po dobu 30 min. Gel byl poté nasnímán pod UV světlem.
2.2.3 Optimalizace PCR V případě, že produktem amplifikace nebyl jeden proužek o očekávané délce, byly testo vány variace reakčních podmínek, a to koncetrace horečnatých iontů (1,5-4 mM) a teploty nasedání primerů (50,8-56 °C). V případě, že měl proužek produktu PCR správnou veli kost, ale byl velmi slabý, byla provedena reamplifikace. Při reamplifikaci byl jako templát použit lOOx, lOOOx nebo 10000 x zředěný produkt PCR (podle koncentrace produktu) a původní kombinace primerů.
2.3 Sekvenace a úprava sekvencí
Sekvenace amplifikovaných genů byla provedena Sangerovým sekvenováním firmou Ma- crogen. Získané sekvence byly upraveny za pomoci nástrojů MEGA X (Kumar et al., 2018) a Chromas Lite 2.6.6. (Technelysium Pty Ltd) tak, aby byly do další analýzy zahrnuty pouze exonové sekvence dobré kvality a nedocházelo ke vzniku falešných polymorfismů.
2.4 Kodonový alignment a konstrukce fylogenetického stromu
Následně byl použit software BAli-Phy 3.4.1 (Redelings a Suchard, 2005), který využívá Bayesovskou statistiku pro souběžnou tvorbu kodonového alignmentu a fylogenetického stromu. Bylo spuštěno 5 nezávislých řetězců se 100 000 iteracemi, jejichž sjednocením byl získán finální alignment a strom. Pro výpočet byl použit substituční model GY94 a indel model RS07, prvních 10 % (10 000) iterací z každého řetězce nebylo zahrnuto do vlastního výpočtu (takzvaný burn-in, Redelings a Suchard (2005)). Kromě samotného kodonového alignmentu byly vypočítány i spolehlivostní skóre správnosti alignmentu jednotlivých pozic, kodony se spolehlivostním skóre nižším než 80 % byly pomocí R skriptu (Soubor Pl) zamaskovány jako "???", stejně tak jako mezery Kapitola 2. Materiál a metody 23 sousedící s těmito nespolehlivými pozicemi. Zamaskovány byly také chybějící začátky a konce neúplných sekvencí. U fylogenetického stromu byla vypočítána spolehlivost jednotlivých větví. Do další analýzy byl použit 50% konsenzuální strom (nody s nízkou podporou jsou kolabovány do polytomie).
2.5 Selekční analýza
Analýza byla provedena pomocí kodonově-subtitučních modelů dostupných na serveru Datamonkey 2.0 (Weaver et al, 2018). Pro identifikaci konkrétních fylogenetických linií, v nichž probíhá pozitivní selekce CenH3, byl použit aBSREL (stručný princip metody v kap. 1.5, Smith etal. (2015)), pro identifikaci konkrétních kodonových pozic alignmentu, v nichž proběhla epizodická selekce a výpočet celkové CO byl použit MEME (stručný princip metody v kap. 1.5, Murrell et al. (2012)). Délka stromu (odvozená z počtu nukleotidových substitucí na kodon) byla vypočítána pomocí PAML 4.7 (Yang, 2007). Výsledky z čeledi Cyperaceae byly porovnány s dalšími taxony. Sekvence použité pro toto srovnání byly získány z doplňkových materiálů Zedek a Bureš (2012), Zedek a Bureš (2016a) a Zedek a Bureš (2016b). Kapitola 3
Výsledky
Bylo získáno celkem 34 sekvencí genu CenH3 z rodu Cyperaceae, z nichž bylo 6 dříve publikováno v databázích (GeneBank a onePK) a 28 nově sekvenováno (seznam vzorků uveden v tabulce Pl). Kodonový alignment použitý pro selekční analýzy je uveden v příloze S. P2. Pomocí selekční analýzy metodou MEME bylo v genu nalezeno 10 pozic (kodonů), které se na hladině významnosti p < 0,05 v minulosti vyvíjely pod pozitivní selekcí (Obr. 3.1). Počet pozitivně selektovaných kodonů na délku fylogenetického stromu byl tedy 1,808. Pozitivně selektované kodony se nachází převážně na N-konci proteinu (6 kodonů při p < 0,05), v HFD se nachází 4 pozitivně selektované kodony, z toho 1 v oblasti loop 1.
N-konec W HFD Obrázek 3.1: Rozložení pozitivně selektovaných kodonů v proteinu CenH3. Červeně jsou označeny pozitivně selektované kodony na hladině významnosti p < 0,05
Pomocí aBSREL bylo identifikováno 6 linií, kde je gen CenH3 pozitivně selektován na hladině významnosti p < 0,05 (Obr. 3.2), avšak po Holm-Bonferroniho korekci na mnohonásobné testování nebyla žádná z těchto linií na hladině 0,05 statisticky významná. Podíl pozitivně selektovaných větví před korekcí na mnohonásobné testování byl 7,8 %. Porovnání frekvence pozitivní selekce v Cyperaceae s dalšími taxony (Tab. 3.1, Obr. 3.3) ukazuje, že oproti organismům se symetrickou samicí meiózou a holocent- rickému rodu Luzula zde probíhá pozitivní selekce s vyšší frekvencí. Pozitivní selekce je zde srovnatelná s monocentrickými skupinami s asymetrickou meiózou, v případě počtu nalezených kodonů je dokonce nejvyšší. Celková co (Obr. 3.4) v čeledi Cyperaceae je 0,496, což je vyšší než u symetrických i asymetrických organismů, ale srovnatelné s holocentrickým rodem Luzula.
-24- Kapitola 3. Výsledky. .25
Carex acutiformis
- Carex hartmanii
H 1— Carex nigra 0.05 — Carex hirta p > 0,05 li 1— Carex rostrata p < 0,05 i- Carex panicea
— Carex pilosa
1— Carex flacca
Carex pilulifera
- Carex digitata
I— Carex caryophyllea
— Carex humilis
Carex alba
Carex muricata agg
i— Carex echinata
Carex canescens
i— Carex leporina
- Carex bohemica
r Carex elongata
— Carex remota
Eriophorum angustifolium
I— Scirpus sylvaticus
Eriophorum vaginatum
Eleocharis vivipara
Eleocharis acicularis
Eleocharis dulcis
Cyperus papyrus
Cyperus alternifolius
Cyperus textilis
Cyperus ruscus
Isolepis prolifera
Rhynchospora pubera
Lepidosperma gibsonii
Mapania palustris
Obrázek 3.2: Fylogenetický strom získaných sekvencí genu CenH3, červeně jsou označeny linie podléhající pozitivní selekci (p < 0,05) bez korekce na mnohonásobné testování Kapitola 3. Výsledky 26
Tabulka 3.1: Podíl pozitivně selektovaných větví a kodonů v čeledi Cyperaceae a dalších skupinách
větve (bez 5 1 2 4 skupina typ počet sekvencí délka stromu (O 3 větve (s korekcí) kodony korekce) Aspergillus M/S 18 8,725 0,066 0 0 0 Colletotrichum M/S 7 1,096 0,041 0 0 0 kapradiny M/S 8 7,587 0,086 0 0 0 Lycopodiophyta M/S 5 6,045 0,024 0 0 0 mechy M/S 10 2,242 0,105 0 0 1,338 Penicillium M/S 11 5,814 0,056 0,105 0 0 Plasmodium M/S 7 3,247 0,043 0 0 0 Saccharomyces M*/S 9 6,921 0,065 0 0 0,144 Trichoderma M/S 6 1,750 0,042 0,111 0 0,571 Asteraceae M/A 7 1,698 0,186 0,091 0 1,178 Brassicaceae M/A 20 3,179 0,429 0,053 0 1,573 Drosophila M/A 16 4,065 0,303 0,103 0,069 1,230 Fabaceae M/A 18 4,464 0,302 0,091 0,030 0,448 kostnaté ryby M/A 11 4,856 0,126 0,053 0 0,412 Poaceae M/A 20 3,965 0,276 0,054 0 1,513 primáti M/A 14 1,116 0,404 0,160 0 0,896 Tetrahymena M/A 13 8,465 0,036 0,043 0,043 0,118 Caeno rhabditis H/A 8 7,074 0,187 0,154 0 0,283 Luzula H/A 18 1,278 0,514 0 0 0 Cyperaceae H/A 34 5,531 0,496 0,078 0 1,808 typ centromery (monocentrická (M), holocentrická (H))/typ samicí meiózy (asymetrická (A), symetrická (S)) *kvasinky mají regionální nebo bodovou monocentrickou centromeru 2průměrná (0 všech kodonů ve všech liniích 3 podíl pozitivně selektovaných větví ze všech větví alignmentu na hladině p < 0,05 bez korekce na mno honásobné testování 4podíl pozitivně selektovaných větví ze všech větví alignmentu na hladině p < 0,05 po korekci na mnoho násobné testování 5 počet pozitivně selektovaných kodonů na délku stromu Kapitola 3. Výsledky 27
Cyperaceae
Brassicaceae
Ť
-tu Drosophila "CS
O Asteraceae S 1.0 Ü primáti 5 o "S. Trichoderma tu c/> >a> g 0.5 'on CL Saccharomyces Fabaceae -t—< kostnaté ryby CD Caenorhabditis =Oü Aspergillus Q. Tetrahymena kapradiny Penicillium Colletotrichum y 0.0 Luzula 5 Plasmodium H Lycopodiophyta 0.00 0.05 0.10 0.15 podíl pozitivně selektovaných větví
monocentrické druhy se symetrickou samicí meiózou monocentrické druhy s asymetrickou samicí meiózou holocentrické druhy s asymetrickou samicí meiózou
Obrázek 3.3: Zobrazení podílů pozitivně selektovaných větví a počtů pozitivně selektovaných kodonů na délku stromu CenH3 v čeledi Cyperaceae a dalších skupinách. Boxploty vyjadřují rozložení hodnot na obou osách, přerušovaná čára označuje hodnotu v čeledi Cyperaceae Kapitola 3. Výsledky 28
symetrická asymetrická holocentrické typ meiózy/chromozomů
Obrázek 3.4: Celková omega genu CenH3 ve třech holocentrických skupinách (červené body) v porovnání s organismy s asymetrickou a symetrickou samici meiózou Kapitola 4
Diskuze
4.1 Získané sekvence a fylogenetický strom
V některých skupinách rostlin se vyskytují paralogní varianty nebo pseudogeny CenH3 vzniklé duplikací genu nebo polyploidizací. Ve většině rostlin dochází k umlčení nebo ztrátě jedné z kopií, ale například rody Luzula, Pisum nebo Mimulus obsahují druhy, kde je více variant CenH3 zachováno a podílí se na sestavování kinetochoru (Zambrano-Mila et al, 2019). V čeledi Cyperaceae zatím nebyly takovéto varianty popsány v literatuře ani nalezeny v této práci, to však neznamená, že se zde nemohou vyskytovat (jejich sekvence se může lišit natolik, že nebyly amplifikovány použitými primery). V případě, že by získané sekvence CenH3 ve skutečnosti byly nerozpoznanými paralogními variantami nebo pseudogeny, nebyly by výsledky selekční analýzy spolehlivé. Tomu, že byly získány pouze ortologní sekvence CenH3 nasvědčuje skutečnost, že fy logenetický strom získaných sekvencí (S. P3) odpovídá druhovému stromu Cyperaceae získanému na základě 7 jaderných a chloroplastových markerů (Bureš et al., nepubliko vané). Vzhledem k tomu, že získané sekvence neobsahují stop kodony, se lze domnívat, že nedošlo ani k amplifikaci nefunkčních pseudogenů. Můžeme proto usoudit, že byly získány funkční ortologní sekvence CenH3, které jsou vhodné pro selekční analýzu.
4.2 Adaptivní evoluce CenH3
Z porovnání v rámci monocentrických organismů je zřejmé, že při jejich opětovné analýze pro tuto práci byl stejně jako v Zedek a Bureš (2016b) nalezen větší počet pozitivně selektovaných kodonů na délku stromu, podíl pozitivně selektovaných větví a celková co ve skupinách s asymetrickou meiózou než ve skupinách se symetrickou meiózou (Obr. 3.3, Obr. 3.4). Podíl pozitivně selektovaných větví a počet pozitivně selektovaných kodonů zjištěný v čeledi Cyperaceae je podobný jako u mononcentrických organismů s asymetrickou meiózou (Obr. 3.3) a celková CO je dokonce vyšší než u monocentriků (Obr. 3.4). Z těchto výsledků můžeme usoudit, že na CenH3 v Cyperaceae působí podobná pozitivní selekce jako v monocentrických organismech s asymetrickou meiózou. Pozitivně selektované kodony se navíc nachází hlavně na N-konci CenH3 a v N-kon- cové části HFD, což odpovídá rozložení pozitivně selektovaných kodonů u Brassicaceae
-29- Kapitola 4. Diskuze 30
(Cooper a Henikoff, 2004) a dalších monocentrických skupinách (kap. 1.3). Skutečnost, že pozitivní selekce působí na homologní oblasti genu v obou skupinách napovídá tomu, že se CenH3 v Cyperaceae vyvíjí podobně jako v monocentrických asymetrických skupinách. Zajímavé je srovnání hodnoty celkové CO mezi skupinami s holocentrickými chromo zomy. Zatímco v druhu Caenorhabditis je CO podobná jako u monocentrických asymetriků, rod Luzula a čeleď Cyperaceae má hodnotu co výrazně vyšší. V rodu Luzula se navíc vysoká hodnota nedá vysvětlit pozitivní selekcí, protože zde nebyly identifikovány žádné pozi tivně selektované větve ani kodony. Zedek a Bureš (2016a) spekulují, že vysoká celková CO v rodu Luzula může být způsobena relaxovanou selekcí CenH3.
4.3 Centromerický tah
Podobnost evoluce CenH3 v Cyperaceae v porovnání s monocentriky s asymetrickou meiózou a její odlišnost v porovnání s monocentriky se symetrickou meiózou (Obr. 3.3) napovídá, že v Cyperaceae probíhá centromerický tah. Tento výsledek je v rozporu s předpokladem, že holocentrické uspořádání v Cyperaceae brání centromerickému tahu. K vysvětlení tohoto výsledku je nutné vzít v potaz, že uspořádání chromozomů v holocentricích může být odlišné během mitózy a meiózy (Obr. 1.4, kap. 1.4.1). Jediný druh z čeledi Cyperaceae, u kterého bylo zatím pozorováno uspořádání kinetochoru během meiózy, je Rhynchospora pubera (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Meiotický kinetochor zde není sestavován v jedné linii podél celé délky chromozomu, ale polycentricky v oddělených shlucích (Marques etal. (2016), Obr. 1.4). Sestavování kinetochoru v několika druzích rodu Rhynchospora je navíc vázáno na specifické centromerické sekvence, satelity Tyba (Marques et al., 2015). Expanze těchto repetic by potenciálně mohla způsobit zvětšení kinetochorových shluků. Takovéto uspořádání by tedy potenciálně narozdíl od difuzní centromery podél celé délky chromozomu mohlo umožňovat centromerický tah. Podobná situace nastává i u rodu Caenorhabditis, kde je uspořádání meiotických chromozomů téměř monocentrické (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). V této skupině byla taktéž nalezena pozitivní selekce CenH3 (Zedek a Bureš, 2012). Naopak v rodu Luzula, kde byl v meióze pozorován difuzní kinetochor podél celé délky chromozomu (Heckmann et al, 2014), nebyla nalezena žádná pozitivní selekce genu CenH3 (Zedek a Bureš (2016a), Obr. 3.3). Z pozorování meiózy jediného druhu čeledi Cyperaceae však není možné posoudit, zda je polycentrické uspořádání kinetochoru v meióze charakteristické pro významnou část čeledi. K objasnění, zda se tento mechanismus skutečně může uplatňovat, by bylo nutné pozorovat meiotické uspořádání kinetochoru v různých rodech Cyperaceae.
4.4 Symetrie meiózy
Centromerický tah může probíhat v takovém typu meiózy, kdy pouze jeden ze dvou homologních chromozomů dává vzniknout gametě. U většiny krytosemenných rostlin je typický systém, kdy samicí meióza probíhá asymetricky a pouze jeden ze čtyř meiotických produktů může vytvářat megasporu (monosporie) a samčí meióza probíhá symetricky a dochází k vývoji mikrospor ze všech čtyřech meiotických produktů (tetrasporie) (Gorelick Kapitola 4. Diskuze 31 et al., 2016; Lersten, 2008). V takovém případě se tedy může centromerický tah uplatňovat pouze při megasporogenezi. Centromerický tah v čeledi Cyperaceae však může zřejmě probíhat i během mikrospo- rogeneze, protože zde dochází k zániku 3 meiotických produktů (monosporii) nejen při vzniku vajíčka, ale také při vzniku pylu (Furness a Rudall, 2011). Samčí asymetrická meióza by potenciálně mohla zvětšit výhodu silných centromer a zintenzívnit tak centro merický tah. Je však nejasné, zda by takové posílení centromerického tahu vedlo k intenzivnější po zitivní selekci CenH3. Nerovnocennost centromer během symetrické samčí meiózy totiž způsobuje vznik aneuploidních gamet (Daniel (2002), kap. 1.2) a pokud tedy nevznikají tyto negativní důsledky centromerického tahu, dá se předpokládat, že se sníží intenzita pozitivní selekce CenH3 (Elde et al, 2011). V souladu s tímto předpokladem Elde et al. (2011) v rodu prvoků s výhradně asymetrickou meiózou Tetrahymena nenalezli žádné stopy pozitivní selekce v tomto genu. Zedek a Bureš (2016b) však při požití citlivějších kodon-substitučních modelů pozitivní selekci identifikovali, ta však byla slabší než u skupin s kombinací asymetrické a symetrické meiózy (Obr. 3.3). Podle výsledků v rodu Tetrahymena se zdá, že negativní důsledky centromerického tahu nezávislé na symetrické samčí meióze jsou dostatečné pro vznik selekčního tlaku na CenH3, ale adaptivní evoluce CenH3 je méně intenzivní. Naopak v čeledi Cyperaceae se zdá, že zde pozitivní selekce působí dokonce intezivněji (alespoň co se týče počtu kodonových pozice a celkové co) než u skupin s kombinací obou typů meiózy. Intenzita selekce však v případě Cyperaceae může být ovlivněna také nezvyklým uspořádáním chromozomů, takže nelze rozhodnout, zda je intenzivnější pozitivní selekce důsledkem asymetrické samčí meiózy. Vliv samčí monosporie na intenzitu pozitivní selekce CenH3 by bylo vhodné studovat v čeledi Erica- ceae, dvouděložných rostlinách s monocentrickými chromozomy, která obsahuje druhy se symetrickou i asymetrickou samčí meiózou (Furness a Rudall, 2011). Ani monosporická tvorba zárodečného vaku není univerzální pro všechny krytose- menné. V několika nezávislých skupinách jednoděložných i dvouděložných zde došlo k vývoji bisporického (např. Allium (Amaryllidaceae)) nebo tetrasporického (např. Pepe- romia (Piperaceae), Drusa (Apiaceae), Fritillaria (Liliaceae) zárodečného vaku (Lersten, 2008). Pokud dochází ke vzniku tetrasporického zárodečného vaku, žádný z meiotických produktů nezaniká a všechny mají šanci, že dají vzniknout vajíčku. Pokud by se vajíčko vyvinulo náhodně z jednoho z těchto produktů, neměl by zde tedy probíhat centrome rický tah. Skupiny obsahující blízce příbuzné druhy s monosporickou a tetrasporickou megasporogenezi by tak byly zajímavými modely pro studium centromerického tahu.
4.5 Adaptivní role holocentrických chromozomů
Ze získaných výsledků vyplývá, že holocentrické chromozomy v čeledi Cyperaceae prav děpodobně nebrání centromerickému tahu. Je proto nepravděpodobné, že holocentrické chromozomy vznikly u společného předka Cyperaceae a Juncaceae (čeleď obsahující rod Luzula) právě za účelem potlačení centromerického tahu. Vzhledem k tomu, že všechny ne závisle vzniklé linie holocentrickými chromozomy mají velice podobnou strukturu během mitózy, ale během meiózy se liší (Marques a Pedrosa-Harand, 2016), se zdá, že hlavní evoluční výhoda holocentrických chromozomů se uplatňuje právě během mitózy. Takovou Kapitola 4. Diskuze 32 výhodou by mohla být tolerance vůči fragmentaci chromozmů (Zedek a Bureš, 2018). Kinetochory sestavené po celé délce chromozomu naopak můžou během meiózy při nášet problémy s orientací chromozomů, což vyžaduje dodatečnou úpravu struktury pro správnou segregaci v meióze (Marques a Pedrosa-Harand, 2016). Vznikají proto různé strategie pro vyrovnání se s těmito problémy. Je možné, že pokud některé z těchto strategií umožní zachování kinetochoru po celé délce chromozomu (jako v rodu Luzula), mohou zároveň zcela nebo částečně bránit centromerickému tahu. Bylo by zajímavé zjistit, zda existují i další skupiny, u nichž v meióze nezávisle vzniklo uspořádání kinetochoru brá nící centromerickému tahu, třeba v rodech Drosera, Cuscuta nebo Chionographis. Tato adaptace bránící centromerickému tahu ale nejspíše není primárním důvodem vzniku ho- locentrických chromozomů. Souhrn
Centromerický tah je evoluční proces, který je iniciován expanzí centromerických repe tic. Tato rozšířená centromera je následně schopná na sebe navázat více kinetochorových proteinů, což při asymetrické samicí meióze způsobí preferenční segregaci silné centro- mery do vajíčka. Takováto sobecká centromera tak získává významnou evoluční výhodu. Centromerický tah však také způsobuje negativní důsledky s vlivem hlavně na fertilitu organismu. Negativní účinky centromerického tahu jsou u monocentrických organismů kompenzovány adaptivní evolucí kinetochorových proteinů (jako například CenH3), které dokáží pozměnit svoji interakci s centromerickou DNA a obnovit rovnováhu centromer. Dalším způsobem obrany proti centromerickému tahu by mohly být holocentrické chromozomy, které sestavují kinetochor podél celé délky chromozomu a v nichž poloha centromery typicky není spjata se specifickým typem repetitivních sekvencí. Expanze re- petitivních sekvencí v holocentrických chromozomech proto pravděpodobně nezpůsobí rozšíření kinetochoru, které je nezbytné pro získání evoluční výhody a iniciaci centrome rického tahu. Pokud tedy v holocentrických organismech neprobíhá centromerický tah, nebude do cházet k následné adaptivní evoluci CenH3. Tomu odpovídá evoluce CenH3 v rodu Luzula, kde nebyly nalezeny žádné stopy pozitivní selekce. V této práci byla studována evoluce CenH3 v čeledi Cyperaceae za účelem zjištění, zda i v této čeledi brání holocentrické uspořádání chromozomů centromerickému tahu. Pomocí kodon-substitučních modelů bylo nalezeno podobné množství pozitivně selekto vaných fylogenetických větví a kodonů jako u monocentrických organismů s asymetrickou meiózou. Selektované kodony v Cyperaceae se navíc nachází ve stejných doménách jako u těchto monocentrických skupin. Z toho vyplývá, že v čeledi Cyperaceae stejně jako u těchto skupin pravděpodobně probíhá centromerický tah. Je možné, že narozdíl od rodu Luzula (ve kterém je kinetochor sestavován po celé délce chromozomu během mitózy i meiózy) v čeledi Cyperaceae dochází k sestavování kinetochoru v jedné linii podél celé délky chromozomu pouze během mitózy, ale během meiózy má kinetochor podobu oddělených shluků, které by potenciálně při expanzi repetic mohly vázat větší množství kinetochorových proteinů a umožňovat tak centromerický tah. Zdá se, že holocentrické chromozomy nevznikly primárně jako obrana proti centro merickému tahu, protože u mnoha holocentrických skupin (mezi které může patřit i čeleď Cyperaceae) nedochází v meióze k sestavování kinetochoru podél celého chromozomu kvůli problémům s orientací chromozomů při segregaci. Pokud by došlo k úpravě uspořá dání kinetochoru, které by umožnilo správnou segregaci v meióze a zároveň zachovalo sestavení kinetochoru podél celé délky chromozomu, mohlo by ke znemožnění centrome rického tahu dojít.
-33- Summary
The centromere drive is an evolutionary process initiated by the expansion of centromere repeats. This enlarged centromere is then capable of recruiting excess kinetochore proteins. This can cause preferential segregation of the stronger centromere into the egg during asy• mmetric female meiosis, providing the selfish centromere with a substantial evolutionary advantage. On the other hand, the centromere drive also causes deleterious consequences particularly affecting the organism's fertility. These deleterious effects are in monocentric organisms neutralized by adaptive evolution of kinetochore proteins (like CenH3), which can alter its interaction with the centromeric DNA a restore centromere parity. Another form of protection from the centromere drive could be the holocentric chro• mosomes, which have their kinetochore assembled along the entire chromosome length and in which the centromere position isn't generally tied to a specific type of repetitive sequences. Therefore the expansion of repeats in holocentric chromosomes isn't likely to cause kinetochore expansion. This denies the evolutionary advantage of the selfish centromere and prevents the initiation of centromere drive. Given that the holocentric chromosomes don't need to suppress the centromere drive, the adaptive evolution of CenH3 won't occur. This is the case in the Luzula genus, where no signs of positive selection acting on CenH3 were found. In this thesis, the evolution of CenH3 in the Cyperaceae family was studied to determine if the holocentric structure of chromosomes in this family prevents the centromere drive. Using codon-substitution models, a similar quantity of positively selected branches and codons was found in the Cyperaceae family as in monocentric organisms with asymmetric meiosis. Also, the selected codons in Cyperaceae were allocated to the same domains as in these monocentric groups. For these reasons we can infer that the centromere drive takes place in Cyperaceae, similarly to monocentric groups with asymmetric meiosis. It is possible that in contrast to the Luzula genus (where the kinetochore is assembled along the entire chromosome in both mitosis and meiosis), in the Cyperaceae family the kinetochore is assembled in continuous line only in mitosis but during meiosis the kinetochore could form discrete clusters instead. These clusters could potentially recruit excess kinetochore proteins in response to expanded repeats and facilitate the centromere drive. It seems that the holocentric chromosomes didn't primarily originate in order to prevent the centromere drive, since in many holocentric taxa (possibly including Cyperaceae) the kinetochore doesn't cover the entire chromosome length because of problems with proper chromosome segregation during meiosis. If there was a situation which allows the correct meiotic segregation and also kinetochore assembly along the entire chromosome, this arrangement could also prevent the centromere drive.
-34- Seznam použité literatury
Baker, R. E. a Rogers, K. (2006). Phylogenetic analysis of fungal centromere h3 proteins. Genetics, 174(3): 1481-1492.
Beck, E. A. a Llopart, A. (2015). Widespread positive selection drives differentiation of centromeric proteins in the drosophila melanogaster subgroup. Scientific reports, 5:17197.
Bures, P., Zedek, F., a Markova, M. (2013). Holocentric chromosomes. In Plant Genome Diversity Volume 2, pages 187-208. Springer.
Chen, Y., Baker, R. E., Keith, K. C, Harris, K., Stoler, S., a Fitzgerald-Hayes, M. (2000). The n terminus of the centromere h3-like protein cse4p performs an essen• tial function distinct from that of the histone fold domain. Molecular and cellular biology, 20(18):7037-7048.
Chmatal, L., Gabriel, S. I., Mitsainas, G. P., Martinez-Vargas, J., Ventura, J., Searle, J. B., Schultz, R. M., a Lampson, M. A. (2014). Centromere strength provides the cell biological basis for meiotic drive and karyotype evolution in mice. Current Biology, 24(19):2295-2300.
Chmatal, L., Schultz, R. M., Black, B. E., a Lampson, M. A. (2017). Cell biology of cheating—transmission of centromeres and other selfish elements through asymmetric meiosis. In Centromeres and Kinetochores, pages 377-396. Springer.
Cooper, J. L. a Henikoff, S. (2004). Adaptive evolution of the histone fold domain in centromeric histones. Molecular biology and evolution, 21(9):1712—1718. d'Alencon, E., Sezutsu, H., Legeai, F, Permal, E., Bernard-Samain, S., Gimenez, S., Gagneur, C, Cousserans, F, Shimomura, M., Brun-Barale, A., et al. (2010). Extensive synteny conservation of holocentric chromosomes in lepidoptera despite high rates of local genome rearrangements. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(17):7680-7685.
Daniel, A. (2002). Distortion of female meiotic segregation and reduced male fertility in human robertsonian translocations: Consistent with the centromere model of co-evolving centromere dna/centromeric histone (cenp-a). American journal of medical genetics, Hl(4):450-452.
-35- Seznam použité literatury 36 de Souza, T. B., Chaluvadi, S. R., Johnen, L., Marques, A., Gonzalez-Elizondo, M. S., Bennetzen, J. L., a Vanzela, A. L. (2018). Analysis of retrotransposon abundance, diversity and distribution in holocentric eleocharis (cyperaceae) genomes. Annals of botany, 122(2):279-290.
Demidov, D., Schubert, V., Kumke, K., Weiss, O., Karimi-Ashtiyani, R., Buttlar, J., Heckmann, S., Wanner, G., Dong, Q., Han, E, et al. (2014). Anti-phosphorylated his- tone h2athrl20: a universal microscopic marker for centromeric chromatin of mono-and holocentric plant species. Cytogenetic and genome research, 143(1-3): 150-156.
Drinnenberg, I. A., Henikoff, S., Malik, H. S., et al. (2014). Recurrent loss of cenh3 is associated with independent transitions to holocentricity in insects. Elife, 3:e03676.
Dumont, J., Oegema, K., a Desai, A. (2010). A kinetochore-independent mechanism drives anaphase chromosome separation during acentrosomal meiosis. Nature cell biology, 12(9): 894.
Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., a Handel, M. A. (2001). Evidence for meiotic spindle chec• kpoint from analysis of spermatocytes from robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science, 114(16):2953-2965.
Elde, N. C, Roach, K. C, Yao, M.-C, a Malik, H. S. (2011). Absence of positive selection on centromeric histones in tetrahymena suggests unsuppressed centromere- drive in lineages lacking male meiosis. Journal of molecular evolution, 72(5-6):510- 520.
Escudero, M., Marquez-Corro, J. I., a Hipp, A. L. (2016). The phylogenetic origins and evolutionary history of holocentric chromosomes. Systematic Botany, 41(3):580-585.
Finseth, F. R., Dong, Y, Saunders, A., a Fishman, L. (2015). Duplication and adaptive evolution of a key centromeric protein in mimulus, a genus with female meiotic drive. Molecular biology and evolution, 32(10):2694-2706.
Fishman, L. a Kelly, J. K. (2015). Centromere-associated meiotic drive and female fitness variation in mimulus. Evolution, 69(5): 1208-1218.
Furness, C. A. a Rudall, P. J. (2011). Selective microspore abortion correlated with aneuploidy: an indication of meiotic drive. Sexual plant reproduction, 24(1): 1-8.
Gorelick, R., Carpinone, J., a Derraugh, L. J. (2016). No universal differences between female and male eukaryotes: anisogamy and asymmetrical female meiosis. Biological Journal of the Linnean Society, 120(1): 1-21.
Heckmann, S., Jankowska, M., Schubert, V., Kumke, K., Ma, W., a Houben, A. (2014). Alternative meiotic chromatid segregation in the holocentric plant luzula elegans. Nature communications, 5:4979.
Heckmann, S., Macas, J., Kumke, K., Fuchs, J., Schubert, V., Ma, L., Novak, P., Neumann, P., Taudien, S., Platzer, M., et al. (2013). The holocentric species 1 uzula elegans shows Seznam použité literatury 37
interplay between centromere and large-scale genome organization. The Plant Journal, 73(4):555-565.
Henikoff, S., Ahmad, K., a Malik, H. S. (2001). The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving dna. Science, 293(5532): 1098-1102.
Henikoff, S. a Henikoff, J. G. (2012). "point" centromeres of saccharomyces harbor single centromere-specific nucleosomes. Genetics, 190(4): 1575-1577.
Heun, P., Erhardt, S., Blower, M. D., Weiss, S., Skora, A. D., a Karpen, G. H. (2006). Mislocalization of the drosophila centromere-specific histone cid promotes formation of functional ectopic kinetochores. Developmental cell, 10(3):303-315.
Hirsch, C. D., Wu, Y., Yan, H., a Jiang, J. (2009). Lineage-specific adaptive evolution of the centromeric protein cenh3 in diploid and allotetraploid oryza species. Molecular biology and evolution, 26(12):2877-2885.
Howe, M., McDonald, K. L., Albertson, D. G., a Meyer, B. J. (2001). Him-10 is required for kinetochore structure and function on caenorhabditis elegans holocentric chromosomes. The Journal of cell biology, 153(6): 1227-1238.
Iwata-Otsubo, A., Dawicki-McKenna, J. M., Akera, T, Falk, S. J., Chmatal, L., Yang, K., Sullivan, B. A., Schultz, R. M., Lampson, M. A., a Black, B. E. (2017). Expanded satellite repeats amplify a discrete cenp-a nucleosome assembly site on chromosomes that drive in female meiosis. Current Biology, 27(15):2365-2373.
Kosiol, C. a Anisimova, M. (2012). Selection on the protein-coding genome. In Evolutio• nary Genomics, pages 113-140. Springer.
Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., a Tamura, K. (2018). Mega x: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular biology and evolution, 35(6): 1547-1549.
Lersten, N. R. (2008). Flowering plant embryology: with emphasis on economic species. John Wiley & Sons.
Maddox, P. S., Oegema, K., Desai, A., a Cheeseman, I. M. (2004). "holo"er than thou: Chromosome segregation and kinetochore function in c. elegans. Chromosome Re• search, 12(6):641-653.
Malik, H. S. a Henikoff, S. (2001). Adaptive evolution of cid, a centromere-specific histone in drosophila. Genetics, 157(3): 1293-1298.
Malik, H. S. a Henikoff, S. (2003). Phylogenomics of the nucleosome. Nature structural & molecular biology, 10(11):882.
Malik, H. S. a Henikoff, S. (2009). Major evolutionary transitions in centromere comple• xity. Cell, 138(6): 1067-1082. Seznam použité literatury 38
Malik, H. S., Vermaak, D., a Henikoff, S. (2002). Recurrent evolution of dna-binding motifs in the drosophila centromeric histone. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(3): 1449-1454.
Marques, A. a Pedrosa-Harand, A. (2016). Holocentromere identity: from the typical mitotic linear structure to the great plasticity of meiotic holocentromeres. Chromosoma, 125(4):669-681.
Marques, A., Ribeiro, T., Neumann, P., Macas, J., Novák, P., Schubert, V., Pellino, M., Fuchs, J., Ma, W., Kuhlmann, M., et al. (2015). Holocentromeres in rhynchospora are associated with genome-wide centromere-specific repeat arrays interspersed among euchromatin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(44): 13633-13638.
Marques, A., Schubert, V., Houben, A., a Pedrosa-Harand, A. (2016). Restructuring of holocentric centromeres during meiosis in the plant rhynchospora pubera. Genetics, 204(2):555-568.
Melters, D. P., Bradnam, K. R., Young, H. A., Telis, N., May, M. R., Ruby, J. G., Sebra, R., Peluso, P., Eid, J., Rank, D., et al. (2013). Comparative analysis of tandem repeats from hundreds of species reveals unique insights into centromere evolution. Genome biology, 14(1):R10.
Melters, D. P., Paliulis, L. V., Korf, I. F, a Chan, S. W. (2012). Holocentric chromoso mes: convergent evolution, meiotic adaptations, and genomic analysis. Chromosome Research, 20(5):579-593.
Murrell, B., Wertheim, J. O., Moola, S., Weighill, T., Scheffler, K., a Pond, S. L. K. (2012). Detecting individual sites subject to episodic diversifying selection. PLoS genetics, 8(7):el002764.
Neumann, P., Navrátilová, A., Schroeder-Reiter, E., Kobližková, A., Steinbauerova, V., Chocholova, E., Novák, P., Wanner, G., a Macas, J. (2012). Stretching the rules: mono- centric chromosomes with multiple centromere domains. PLoS genetics, 8(6):el002777.
Neumann, P., Pavlíková, Z., Kobližková, A., Fuková, I., Jedličková, V., Novák, P., a Macas, J. (2015). Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of cenh3 gene in fabeae species. Molecular biology and evolution, 32(7): 1862-1879.
Plohl, M., Meštrovič, N., a Mravinac, B. (2014). Centromere identity from the dna point of view. Chromosoma, 123(4):313-325.
Quénet, D. a Dalai, Y. (2014). A long non-coding rna is required for targeting centromeric protein a to the human centromere. Elife, 3:e26016.
Redelings, B. D. a Suchard, M. A. (2005). Joint bayesian estimation of alignment and phylogeny. Systematic biology, 54(3):401^H8. Seznam použité literatury 39
Ribeiro, T, Marques, A., Novak, P., Schubert, V., Vanzela, A. L., Macas, J., Houben, A., a Pedrosa-Harand, A. (2017). Centromeric and non-centromeric satellite dna organisation differs in holocentric rhynchospora species. Chromosoma, 126(2):325-335.
Rutkowska, J. a Badyaev, A. V. (2007). Meiotic drive and sex determination: molecular and cytological mechanisms of sex ratio adjustment in birds. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 363(1497):1675-1686.
Sandler, L. a Novitski, E. (1957). Meiotic drive as an evolutionary force. The American Naturalist, 91(857): 105-110.
Schubert, V., Lermontova, I., a Schubert, I. (2014). Loading of the centromeric histone h3 variant during meiosis-how does it differ from mitosis? Chromosoma, 123(5):491-497.
Schueler, M. G., Swanson, W., Thomas, P. J., Program, N. C. S., a Green, E. D. (2010). Adaptive evolution of foundation kinetochore proteins in primates. Molecular biology and evolution, 27(7): 1585-1597.
Smith, M. D., Wertheim, J. O., Weaver, S., Murrell, B., Scheffler, K., a Kosakovsky Pond, S. L. (2015). Less is more: an adaptive branch-site random effects model for effi• cient detection of episodic diversifying selection. Molecular biology and evolution, 32(5): 1342-1353.
Talbert, P. B., Bayes, J. J., a Henikoff, S. (2009). Evolution of centromeres and kinetochores: A two-part fugue. In The Kinetochore:, pages 1-37. Springer.
Talbert, P. B., Bryson, T. D., a Henikoff, S. (2004). Adaptive evolution of centromere proteins in plants and animals. Journal of biology, 3(4): 18.
Talbert, P. B., Masuelli, R., Tyagi, A. P., Comai, L., a Henikoff, S. (2002). Centromeric localization and adaptive evolution of an arabidopsis histone h3 variant. The Plant Cell, 14(5): 1053-1066.
Van Hooser, A. A., Ouspenski, 1.1., Gregson, H. C, Starr, D. A., Yen, T. J., Goldberg, M. L., Yokomori, K., Earnshaw, W. C, Sullivan, K. F., a Brinkley, B. R. (2001). Specification of kinetochore-forming chromatin by the histone h3 variant cenp-a. Journal of Cell Science, 114(19):3529-3542.
Weaver, S., Shank, S. D., Spielman, S. J., Li, M., Muse, S. V, a Kosakovsky Pond, S. L. (2018). Datamonkey 2.0: a modern web application for characterizing selective and other evolutionary processes. Molecular biology and evolution, 35(3):773-777.
Yang, Z. (2007). Paml 4: phylogenetic analysis by maximum likelihood. Molecular biology and evolution, 24(8): 1586—1591.
Zambrano-Mila, M. S., Aldaz-Villao, M. J., a Casas-Mollano, J. A. (2019). Canonical histones and their variants in plants: Evolution and functions. In Epigenetics in Plants of Agronomic Importance: Fundamentals and Applications, pages 185-222. Springer. Seznam použité literatury 40
Zedek,F. aBureš,P. (2012). Evidence for centromere drive in the holocentric chromosomes of caenorhabditis. PLoS One, 7(l):e30496.
Zedek, F. a Bureš, P. (2016a). Absence of positive selection on cenh3 in luzula sug• gests that holokinetic chromosomes may suppress centromere drive. Annals of botany, 118(7): 1347-1352.
Zedek, F. a Bureš, P. (2016b). Cenh3 evolution reflects meiotic symmetry as predicted by the centromere drive model. Scientific reports, 6:33308.
Zedek, F. a Bureš, P. (2018). Holocentric chromosomes: from tolerance to fragmentation to colonization of the land. Annals of botany, 121(1):9—16.
Zhang, T., Talbert, P. B., Zhang, W., Wu, Y., Yang, Z., Henikoff, J. G., Henikoff, S., a Jiang, J. (2013). The cento satellite confers translational and rotational phasing on cenh3 nucleosomes in rice centromeres. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(50):E4875-E4883. Přílohy
Tabulka Pl: Seznam získaných sekvencí
druh datum izolace identifikační číslo původ primery Eleocharis ovata 26.02.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B,D,E,F Eleocharis vivipara DRR031129 databáze NCBI Eleocharis acicularis 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Eleocharis dulcis SRR1523109 databáze NCBI Isolepis prolifera 10.11.2017 sbírka ústavu A,B Cyperus textilis 26.02.2018 sbírka ústavu A,B Cyperus papyrus PWSG2039705 databáze oneKP Cyperus fuscus 26.02.2018 sbírka ústavu A,B Cyperus alternifolius 19.09.2017 sbírka ústavu A,B,C,D,F Carex hirta 10.07.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy A,B Carex rostrata 09.05.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex pilosa 10.11.2017 P. Bureš, Žďárské vrchy A,B Carex panicea 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex acutiformis 19.09.2017 sbírka ústavu A,B,C,D,E,F Carex nigra 10.07.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex alba 19.04.2018 sbírka P. Veselého A,B Carex flacca 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex digitata 10.11.2017 P. Bureš, Žďárské vrchy A,B Carex humilis 09.05.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy A,B Carex caryophyllea 19.04.2018 P. Veselý, Brněnská přehrada A,B Carex pilulifera 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex hartmanii 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Rhynchospora pubera KR029618,KR029619 databáze NCBI Lepidosperma gibsonii XPAF2052339 databáze oneKP Mapania palustris WBIB2063480 databáze oneKP Eriophorum angustifolium 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Eriophorum vaginatum 10.07.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Scirpus sylvaticus 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex remota 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex leporina 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex canescens 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex bohemica 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex elongata 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Carex muricata 19.04.2018 P. Veselý, Brněnská přehrada A,B Carex echinata 01.06.2018 P. Bureš, Žďárské vrchy B Soubor PI: Skript pro maskování alignmentu (.R)
ff ciiem SJsriptu je # zamaskovat pozice alignmentu se spolehlivostním skóre nižším než prahová hodnota # zamaskovat mezery na okrajích neúplných sekvencí # zamaskovat mezery obsahující zamaskované pozice
source("http://bioconductor.org/biocLite.R") 7 biocLite("Biostrings") install.packages("seqinr") 9 10 ############ NASTAVIT PRAHOVOU HODNOTU ############ 11 treshold <- 0.8 12 ####### NASTAVIT CESTU KE VSTUPNÍM SOUBORŮM ####### 13 alignment_dir <- "Re suits/PI-max.fasta" 14 probabilities_dir <- "Re suits/PI-max-AU.prob" 15 16 17 library(Biostrings) 18 library(seqinr) 19 20 |# načíst vstupní soubory 21 alignment <- readDNAMultipleAlignment(alignment_dir) 22 prob <- t(read.table(probabilities_dir, header=TRUE, row.names = NULL)) 23 24 # upravit vstupní soubory 25 prob2 <- prob[-nrow(prob),] 26 alignment2 <- as.matrix(alignment) 27 28 # zamaskovat nespolehlivé pozice 29 positions <- prob2<=treshold 30 31 masked<-alignment2 32 masked[positions==TRUE] <-"?" 33 34 # vytvořit funkci na maskování mezer 35 replace.gaps <- function(x) { 36 # od začátku 37 if (x [1]=="-") { 38 x[l]<-"?" 39 } 40 for (i in 1:(length(x)-1)) { 41 if (x[i]=="?") { 42 if (x[i + l]=="-M) { 43 x [i + 1] <-"?" 44 } 45 } 46 } 47 # od konce 48 if (x[length(x)]=="-") { 49 x[length(x)]<-"?" 50 } 51 for (i in length(x):2) { 52 if (x[i]=="?") { 53 if (x [i-1] =="-") { 54 x [i-l] <-"?" 55 } 56 } 57 } 58 return(x) 59 60 61 # zamaskovat mezery 62 processed <- apply(masked,1,replace.gaps) 63 processed2 <- t(processed) 64 65 # vytvořit FASTA soubor s upraveným alignmentem 66 outputprocessed <- split(processed2 , 1:nrow(processed2)) 67 write.fasta(outputprocessed,names=row.names(processed2), 68 file.out=paste("processed.",treshold,".fas",sep=""))
Soubor P2: Maskovaný alignment získaných sekvencí (.fas)
>Rhynchospora_pubera TTCTCGGTT ????????? GGAAAA AAGGCTGTCTCACGC ACCAAAGCTCGT GGTGGAGAGAGTAGCGTTCTTGTTCAGCCAGATGGATCTGAT AAC CAA GGTGACTTGAATGGCACTCCTATG AGCCAAAAT ?????? CCAAAC ACTCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGAAAGAGTGCCCGGGCCCCGCCAACT CCTAGCTTGAAAGGAAGTTCCGAT?????????????????????AAGAGA AAG ??? AAG CATCGGTATAGGCCTGGTACCGTTGCATTGAGAAAAATACGTAAATTTCAGAAA ACGACCCATTTGTTAATACCAGCTGCTCCTTTTTCCAGATTGGCGAGGGAGGTTACAGAG TTATTCAACAAAGATATG CGATGGACTCCTGCAGGTCTTCTTGCCCTTCATGAGGCA GCAGAATATTATTTAGTTGATCTCTTTGAGGATGCCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGTGCGACAGTTAGGGATAAGGATATACAGTTGGCAAGGCGC
>Lepidosperma_gibsonii AGTTCGAAG ????????? GGGACGAAA AGAGCCGCCTCACAC TTCAACGATCGT GCTAAAGGGAGCAGT TCCGGTCAGCCTGATGAACCTGAT AACCCACAA CTTGATGTCAATGGCGAACCTACT AGCCAATAT ?????? CATCGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGGTCGCAACCCTAGCCGGGTTCCTCCAAAT CCTAGACTA GGGAGTGGAGATGATCGAAGCCAGCAG?????????AGA AAG??? AAG CACCGGTATCGACCTGGTACTGTCGCCTTGCGGGAAATCCGCAAGTTTCAAAAA TCTACCAAACTATTAATACCGAATGCTGCGTTCTTCAGATTGACAAGGGAGGTATCATCG CACTACAGCAAAGATGTTACTAGATGGACACCTGGAGCTCTTCTTGGCCTTCAAGAGGCA GCAGAATACTACATAGTAGAGCTGTTAGAGGACGCCAACCAGATGGCGATCCATGCCAAG CGTGTAACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTGGTTAGGCGT >Mapania_palustris TTCTCCATC ????????? GCAAGGGCT AAA TCCAAAGCTGGT GTCGGAGGGAGCAGC TCTGCTTTGCGAGATGGATCTAGT ATTCAACAA GGTGATGTCAGTGGCACCGCCACC AGTCAAAAT ?????? CTG AGG ATCCTC ?????????????????????ACGGCCCGCAAGACTAGCCGGCCCCCTCAAACT CCTAGACTTCAAGGGAGCAGAAATGATGAAAGCCAGCAA??????GAGACA AGG??? AAGTCTCATCGATACCGGCCTGGTACCGTTGCTTTGCGGGAAATCCGCAAGTTTCAAAAA AGTACCCACTTGTTAATACCGCTTGCTGCTTTTGCCAGATTGGCAAGGGAGATCACAGAG CTTGTCTCGAAAGATGTAAATCGGTGGACACCTGGAGCTCTTATGGCCCTTCAAGAGGCG GCAGAGTACTACATTGTAGATTTGTTAGAGGATGCCAACCTATGTGCCTTGCATGCAAAG CGAGTGACAATTATGCAAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC
>Eleocharis_dulcis ???TCGAGC AGATCAGGA AAG AAGGTC???GCACGCCGCTCCATGGCTACT GCTGGAGGGACCAGCTCCTCTACCCAGCCCCACGAAACTGATGCTTTACAGAACCAACAA GGCGATATCAATGATGCTTCTACA CACCAAGTG ?????? CCGAGG ACCACA???CAA????????????AACACTGCTAGAAAGAGTTCCAGGCCCCCTTCCGCT CCTACCCTGAAAGGA GGTGGTGATGCAACCCAGAAA??????CAGACT AAG??? AAG CATCGGTTTCGGCCTGGTACTGTTGCATTGCGCGAAATACGCAAATTTCAAAAA AGTACCCTTCTGTTAATACCGGGCCTTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAA TTCTGGAATCCAAAAATAAATCGATGGACTCCTGGAGCTCTGATTGCTATCCAGGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGAACTGTTAGAAGATGCAAATCTCTGTGCCATTCATGCCAAG CGCATAACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTG?????????
>Eleocharis_acicularis TTCTCGAGC???AGATCCGCCAGGAAA AAGTCCGCCGCTCGCCGCTCCATGGCTGAT GCTAAAGGGGACAGCTCCTCCGCGCAGCCCAATGAATCTGATGCTTTGCCGAACCAACAA GGCGATGCCAATGATGCCCCTGCA GATCAAGAG ???TAC AAG ACCCCT???AAG????????????AGCACTGCTAGAAAGAGTTCCAAGCCCCCTACAAGC CGAAACCTGGATGGA GGTGGTAATGCAAGCCAGAAA??????CAGACC AAG??? AAG CATCGGTATCGGCCTGGTACTGTAGCACTGCGGGAAATACGTAAATTTCAAAAA ACAACCCATCTGTTGATACCATCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGTAAAGGAGATAACAGAA TTCTTCAACCCAGACATAACTCGATGGACACCTGGAGCTATGATTGCTCTCCAGGAGGCA GCAGAATACTACCTTGTAGAACTGTTTGAAGATGGCAATCTATGTGCCATTCATGCCAAG CGTGTGACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTGGCTAGGCGC
>Eleochari s _vivipara CTCTCGAGC ????????? GGCCGGAAA AAGGTCGCCGCTCGCCGCTCCATGGGTGCT GCTGGAGGGGACAGCTCC GCTCAGCCCAATGAAACTGAT AACCAACAA GGCGATGCCAATGATGCCCCTGCA GATCAAGAG ???TAC AAG ACCCCT ??? AAG ???????????? AACACTGCTAGAAAGAGTTCCAGGCCCCCTACTTCC CGAAACCTGGATGGT GGTGGTAATGCAAGCCAAAAA??????AAGACC AAG??? AAG CATCGGTATCGGCCTGGTACCGTAGCACTGCGGGAAATACGGAAATTTCAGAAA ACATCCCATCTGTTGATACCAGCCCTTCCTTTTGCGAGATTGGTAAAGGAGGTAGCAGCA TTCTTCAACCCAGACATAAATCGATGGACTCCCGGAGCTATGATTGCTATCCAGGAGGCA GCAGAATACTACCTTGTAGAACTGTTTGAAGATGCCAATCTCTGTGCCATTCATGCCAAG CGTGTGACAATTATGCAAAAAGATATACAGTTGGCTAGGCGC >Isolepis_prolifera TTCGCGAGC ????????? GGAAAGAAG AAGGTT GCGCGTCGCTCTATCGGTCCT GTTGGAGTTAGCCGCTCCTCCGCTCAGCCTGACGGAACTGATGCT AACCAACTA GCTGATGTCAATGGTACTCCTACT CCGCAA ?????? CAGAAG ACCCCG ?????????????????????ACCGCTAGGAAGAGTACTAGGCCTCCTTTCACT CCTAATTTGAAAGGAAACAATGGTGTTGGAAACACGACA??????CGG AAG ??? AAG CATCGATATCGGCCTGGTACTGTTGCATTGCGGGAGATCCGCACTTATCAGAAA ACAACCCATTTGTTAATACCGGCCTGTGCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACATCT TTCTTTAACCCGGAGATTAATCGGTATACTCCTGGAGCTCTTATTGCCCTGCAAGAGGCA GCAGAACACTACATTGTAGAACTGTTCGAGGACACCAATCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGTGTCACAATAATGCAAAAGGATGTATACTTGGCTAGGCGC
>Cyperus_fuscus TTCGCGAAC AGATCAGGGAGGAAGAAAAAGGTTGCCGCACGCCGCTCTCTCGCTCTT GCTGGA TCCTCTTCTCAGCCCGACGGAACTGATACT GACGAACAT
AAG ACTCCG???AAA????????????AACACTGCTAGAAAGAGCTCCAGGCCTCCTCCCACT CCTAATTTGCAAGGAAACAGCACTGATGCAAGGCAGAAA??????CAGACT AAG??? AAG CATCGATATCGGCCTGGTACTGTTGCGCTGCGGGAAATCCGCAAATATCAGAAA ACTGCTTATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAATCCAGAAATAAATCGATGGACTCCTGGAGCTCTTATGGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAACACTACTTGGTAGAACTGTTCGAGGACACCAATCTCTGTGCCATTCATGCCAAG CGTGTCACAATTATGCTAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC
>Cyperus_textilis TTCTCGAAC ????????? GCGAGGAAG AAGGCCGCCTCACGCCGCGCTCTCGCTCTT GCTGGA TCCTCCGCTCAGCCCGACGGAACTGATACT AATCAGCAT GGTGATGTCACTGGTACTCCTACA AACAAACAA ?????? CAGAAG ACTCCG?????????????????????ACCGCTAGAAAGAGTACCAGGCCTTTTGCCCCT CCTACTTTGAAAGGAAACAACAGTGATGCAAGCCGGCAA??????CAT AAG??? AAG CATCGATATCGGCCTGGTACTGTCGCACTACGGGAGATCCGTAAATATCAGAAA TCTGCCCATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAGCACAGAAATAAATCGATGGAGTCCTGCAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACTTGGTAGAACTGTTAGAGGACACCAATCTCTGCGCCATTCATGCCAAG CGTGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC
>Cyperus_alternifolius TTCTCGAAC AAATCAGCGAGGAAG AAGGCCGCCGCACGCCGCTCTCTCGCTCTT GCTGGA CCCTCCGCTCAGTCTGACGGAACCGATACT AATCAGCAT AGTGATGTCACTGGTACTCCTACA GACAAACAA ?????? CAGAAG ACTCCG ??? AAA ???????????? AACACCGCTAGAAAGAGTACCAGGCCTTTTGCCCCT CCTACTTTGAAAGGAAACAACAGTGATGCCAGCCGGCAA??????CAT AAG??? AAG CATCGATATCGGCCTGGTACTGTCGCACTACGGGAGATCCGTAAATATCAGAAA TCTGCCCATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAGCACAGAAATAAATCGATGGAGTCCTGCAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACTTGGTAGAACTGTTAGAGGACACCAATCTCTGCGCCATTCATGCCAAG CGTGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAGTTGGCTAGGCGC >Cyperus _papyrus TTCTCGAAC???AAATCAGCGAGGAAG AAGGCCGCCGCACGCCGCTCTCTCGCTCTT GCTGGA CCCTCCGCTCAGTCTGACGGAACCGATACT AATCAGCAT AGTGATGTCACTGGTACTCCTACA GACAAACAA ?????? CAGAAG ACTCCG???AAA????????????AACACCGCTAGAAAGAGTACCAGGCCTTTTGCCCCT CCTACTTTGAAAGGAAACAACAGTGATGCCAGCCGGCAA??????CAT AAG ??? AAG CATCGATATCGGCCTGGTACTGTCGCACTACGGGAGATCCGTAAATATCAGAAA TCTGCCCATCTGTTAATACCAGCCAGTCCTTTTGCAAGATTGGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTCAGCACAGAAATAAATCGATGG ????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????
>Eriophorum_ angust if olium ???????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????????????????????????????????CAGAACAAACAA GGTGAAGACAACGGCGCTTCTACA AGCCAACAC ?????? CAGCGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCTACT CCTAAATTGAAAGGAAGTGGCCCTGATGTAAGCCAGAAA??????AAGACT AAA??? AAG CATCGATTCCGGCCTGGTACGGTCGCGTTGCAGGAAATCCGCAGGTTTCAGAAA AGTACCCATCTGTTAATACCGGCCATTGCTATTGCGAGATTGGCAAGGGAGTTAACAGAG TACGTGAACCCAGCTATAACCCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTG???????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????
>Scirpus_sylvaticus TTCACGAGC ????????? GCTAGGAAA AAAGCCGTCGCGCGCAGATCCACGGCTCCT GCTGGAGGGAGCAGCTCCTCCGCTCAGCCCGATGTAACTGATGCTTCACAGAACAAACAA GGTGAAGACAACGGCGCTTCTACA AGCCATCAC ?????? CACCAG ACCCCA ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCTAAATTGAAAGGAAGTGGCCCTGATGTAAGCCAGAAA??????AAGACT AAA??? AAG CATCGATTTCGGCCTGGTACGGTCGCGTTGCAGGAAATCCGTAGGTTTCAGAAA AGTACCCATCTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCGAGATTGGCAAGGGAGATGACAGCG GACTATAACCCACATATAACCCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGCTTGAGGACACCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCTAGGCGC
>Eriophorum_vaginaturn TTCACGAGC ????????? GCTAGGAAA AAAGCCGTCGCGCGCAGATCCACGGCTCCT GCTGGAGGGAGCAGCTCCTCCGCTCAGCCCGATGTAACTGATGCTTCACAGAACAAACAA GGTGAAGACAACGGCGCTTCTACA AGCCAACAC ?????? CAGCGG ACCCCA?????????????????????ACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCTAAATTGAAAGGAAGTGGCCATGATGTAAGCCAGAAA??????AAGACT AAA??? AAG CATCGATTTCGGCCTGGTACGGTCGCGTTGCAGGAAATCCGCAGGTTTCAGAAA AGTACCCAACAGTTAATACCGGCCATTGCTTTTGCGAGATTGGCAAGGGAGATAACAATG GACATTAACCCACATATAACCCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGCTTGAGGACACCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCGAGGCGC >Carex_muricata_agg TTATCGAGC???AAATCTGCAAGAAAA AAGGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACGG ?????? CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGTGGCCATGATGCAAGACCTCAA ?????? GAGACTATGAAA ??? AAG CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATATAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC
>Carex_elongata ???TCGAGC?????????GCAAGGAAA AAGGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACGG ?????? CAGCAG ACCCCA ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGTGGCCTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACTATGAAA??? AAG CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAAAATAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCT??????
>Carex_remota ???TCGAGC???AAATCTGCAAGGAAA AAAGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGGTGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGGCGCTTCTACA ACCCAACGG ?????? CAGCAG ACCCCA ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG CATCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATATAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCT??????
>Carex_echinata ????????????????????????????????????GTAGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACGG CAGCAG ACCCCA ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAAATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTAAACCCAAAAGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC >Carex_canescens TTATCGAGC???AAATCTGCAAGAAAA AAGGCCGTCGCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACGG ?????? CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAACACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAGATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGAGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACCCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC
>Carex_leporina ???????????????????????????????????????GCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTAGA ACCCAACGG ?????? CAGCAG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGTCCCGTCCAACT CCAACACTGAAAGGAAGT???CTTGATGCAAGAGCTCAA??????GAGACT????????? AAG CGTCGATTTCGACCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAGATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGAGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC
>Carex_bohemica ???????????????????????????????????????GCGCGCAGATCAACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACTGCTCAGCCCGATGGAACGGCTGCTTTACAGAACAAACGA GGGGAAGGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACGG ???????????? ???????????????????????? AGCACTGCTCGGAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGA?????????GATGCAAGACCTCAA??????GAGACT????????? ??????CGTCGATTTCGGCCTGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATTCGAAGATTTCAGAAA AGTACCCAACTGTTAATACCGTCCATTGCTTTTGCGAGATGTGCAAGGGAGGTAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTTGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGG???????????????????????????????????????
>Carex_alba TTCTCGAGC ???ACA GCA?????????AAAGTCGCGGCTCGCAAATCCACTGCTACT GCTGGAGGGAGCAGCTCCACAGCT CCACCGCTCAGCTCCACCCAACAG??????CCGCGG ACCCCA ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGGAAGAGTACACTGGCCCGTCCAACT CCAATACTGAAAGGA ????????? CATGTAAGACCTCAA ?????? GAG ACT ????????? AAG CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTTGCTTTACAGGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTTCCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCCGAATACTACATTGTAGAATTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC >Carex_pilulifera TTCTCGAGC ???ACA GCAAAGAAA AAAGTCACCGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC ?????? GCTCAGTCCGATGGAACTGAT AACAAACGA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACAG ???????????? ???????????????????????? AGTACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAGTGCACGGA ????????? CATGTAAGACATCAA ?????? GAG ACT ????????? AAG CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACATGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTTCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCCTAAATCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATTCTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACTATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGG???
>Carex_digitata ???????????????????????????????????????????????????????????? ??????????????????????????? CCCGATGGAACTGATGATTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGATGCTTCTACA ACCCAACAG ?????? CCACGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAGTGAATGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCTCAA??????GAGACT????????? AAG CGTCGATTTAGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATAAGAAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCCTGAATCCAAATGTAAACCGGTGGACTCCTGGAGCTCTTGTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACTAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATT??????????????????????????????
>Carex_ caryophyllea TTCTCGAGC???ACA GCAAAGAAG AAAGTCACCGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCACTCAGCCTGATGGAATTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACAG ?????? CGATGG ACCCCA ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAATGAATGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCTCGA??????GAGACT????????? AAG CATCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTTCAAGATGTGCAAGGGAGATCACAGAG TTCTTGAACCCAAACGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCTAGGCGC
>Carex_humi1is TTCTCGAGC???TCA GCAAGGAAA AAAGCC??????CGCAGATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA ACC ??? CAG ?????? CCACGG ACCCCA ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAGTGAATGGAAGT ?????? CATGTAAGA ??????????????? ACT ????????? AAG CATCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATAAGGAAATTTCAGAAG AGTACCAAACTATTAATACCAGCCATTGCTTTTTCAAGATGTGCAAGGGAGATAACGGAG TTCTTAAACCCAAACGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCTAGGCGC >Carex_flacca TTCTCGAGC ??? ACA GCAAAGAAA AAAGTCACCGCG ?????? TCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC ?????? GCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTAAGGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA ATCCAACAG ?????? ACACGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCT ???????????? ACT ????????? AAG CATCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAAATTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCAGTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC
>Carex_panicea TTCTCGAGC???ACA GCAAGG?????????GTCAAAGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC ?????? GCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTAAAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTGCA ACCCAACAG ?????? CCACGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATGTAAGACCTCAA ?????? GAGAGT ????????? AAG CGTCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCTAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGG???
>Carex_pilosa TTCTCGAGC???ACA GCA???????????? GTCAAAGCG??????TCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGC ?????? GCTCAGCCCAATGGAACTGATGCTTTAAAGAAC ?????? GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACAG ?????? CCACGG ACCCCG ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAATGGA???????????????AGACCT?????????GAGACT????????? AAA CGTCGATTTCGCCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATCACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCTAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATACAATTGGCTAGGCGC
>Carex _ acut if ormi s TTCTCGAGC ACA GCAAGGAAA AAAGTCAGAGCGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCGATGGAACTGATGTTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCATTGACGCTTCTACA ACCCAACAG ?????? CGACGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAGTGAATGGAAGTGGCTATCATGCAAGACATCAA ?????? GAGACTAAGAAA ??? AAG CGACGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAGA AGTACCAGACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCG GCAGAATATTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATTCAATTGGCTAGACGC >Carex_hartmanii TTCTCGAGC ???ACA GCAAGGAAA AAAGTCAAAGTGCGCAAATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCGATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTGCCACA ACCCAACAG ?????? CCACGG ACCCCA???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAAAAGTGAATGGAAGTGGCCGTCATGCAAGACATCAA??????GAGACA AAA??? AAG CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAAATTCAGAGA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTTCTCAACCCAAATGTAAATCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTGGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATTATGCAAAAGGATATGCAATTGGCT??????
>Carex_nigra ???????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????? CAGCCCGATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGGACGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACAG ?????? CCACGG ACCCCA ?????????????????????ACTGCTCGCAAGAGTACACTATCCCGTCCAACT CCAATAGTGAATGGAAGTGGCCATCATGCAAGACATCAA??????GAGACTAAGAAA??? AAG CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAGA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCTATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAACCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTG????????????????????????????????? ??????????????????????????????????????????
>Carex_hirta ???????????????????????????????????????????????????????????? ???????????????????????????????????????????????????????????? ?????????????????????????????????????????????????????????CGG ACCCCG???AAG????????????AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGTCCCGTCCCACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATGCAAGACATCAA ?????? GAG ACT ????????? AAG CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCGATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAATCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGTGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACAATT??????????????????????????????
>Carex_rostrata TTCTCGAGC???ACA GCAAGGAAA AAAGTCAAAGCGCGAAGATCCACTGCTACT GTTGGAGGGAGCAGCTCCACCGCTCAGCCCAATGGAACTGATGCTTTACAGAACAAACAA GGGGAACGCAATGACGCTTCTACA ACCCAACAG ?????? CCACGG ACCCCG ??? AAG ???????????? AGCACTGCTCGCAAGAGTACACTGCCCCGTCCAACT CCAATAATGAACGGAAGTGGCCATCATACAAGACATCAA ?????? GAG ACT ????????? AGG CGTCGATTTCGGCCCGGCACTGTCGCTTTACAGGAAATACGGAAACTTCAGAAA AGTACCAAACTGTTAATACCAGCCATTGCTTTTGCAAGATGTGCAAGGGAGATAACAGAG TTCTTGAATCCAAATGTAAACCGATGGACTCCTGGAGCTCTTCTTGCTCTCCAAGAGGCA GCAGAATACTACATTGTAGATCTGTTGGAGGACACCAACCTCTGCGCCATCCATGCCAAG CGGGTCACTATTATGCAAAGGGATATGCAATTGGCTAGGCGC Soubor P3: Fylogenetický strom získaných sekvencí (.nwk)
(Carex_acutiformis,Carex_hartmanii,Carex_nigra, (((Carex_flacca,((Carex_alba,(((Eriophorum_angustifolium, ( Scirpus_sylvaticus ,Eriophorum_vaginatum)) , ((Rhynchospora_pubera,(Lepidosperma_gibsonii, Mapania_palustris)) ,((Isolepis_prolifera,(Cyperus_fuscus , (Cyperus_textilis,(Cyperus_alternifolius,Cyperus_papyrus)))), (Eleocharis_dulcis,(Eleocharis_acicularis, Eleocharis_vivipara))))),(Carex_muricata_agg,((Carex_echinata, (Carex_canescens,(Carex_leporina,Carex_bohémica))), (Carex_elongata,Carex_remota))))),(Carex_pilulifera, (Carex_digitata,(Carex_ caryophyllea,Carex_humilis))))), (Carex_panicea,Carex_pilosa)),(Carex_hirta,Carex_rostrata)));