Programa cooperativo entre la Universidad Católica del Norte y la Universidad de La Serena

Análisis de factores intrínsecos y extrínsecos en el éxito reproductivo de Myrcianthes coquimbensis, una especie amenazada del Desierto de Atacama, Chile.

Por

Patricio Andrés García Guzmán

Tesis presentada al Programa de Doctorado en Biología y Ecología Aplicada, como uno de los requisitos para optar al grado de Doctor en Biología y Ecología Aplicada.

Profesor Guía: Dr. Francisco A. Squeo

Comisión de Tesis: Dra. Andrea P. Loayza Dra. Mary K. Arroyo Dr. Rodrigo S. Rios Dra. Alexandra Stoll

La Serena, diciembre de 2020

Programa cooperativo entre la Universidad Católica del Norte y la Universidad de La Serena

Universidad de La Serena Facultad de Ciencias Departamento de Biología

La Defensa Final de la Tesis Titulada:

Análisis de factores intrínsecos y extrínsecos en el éxito reproductivo de Myrcianthes coquimbensis, una especie amenazada del Desierto de Atacama, Chile.

Presentada por el Candidato a Doctor: Patricio Andrés García Guzmán

Ha sido aprobada por la comisión de calificación, constituida por los profesores abajo firmantes, calificándose con nota final _____

Dr. Francisco A. Squeo Dra. Andrea P. Loayza Profesor Director de Tesis Miembro Comité Tutorial Universidad de La Serena Universidad de La Serena

Dr. Rodrigo S. Rios Dra. Alexandra Stoll Dra. Mary K. Arroyo Miembro Comité Tutorial Miembro Comité Tutorial Miembro Comité Tutorial Universidad de La Serena CEAZA Universidad de Chile

Dra. Amelia Ramírez Rivera Dr. Cristian A. Ibáñez Gutiérrez Decano Facultad de Ciencias Director Dirección de Postgrado y Postítulo Universidad de La Serena Universidad de La Serena

Fecha:

Programa cooperativo entre la Universidad Católica del Norte y la Universidad de La Serena

Declaración del autor

Se permiten citas breves sin permiso especial de la Institución o del autor, siempre y cuando se otorgue el crédito correspondiente. En

cualquier otra circunstancia, se deberá solicitar permiso de la

Institución o del autor.

Patricio Andrés García Guzmán

Agradecimientos

Este doctorado y tesis no hubiesen sido posibles sin la Beca CONICYT

(21120854) y Beca Doctoral del Instituto de Ecología Biodiversidad (IEB), la cual fue financiada por los proyectos P05-002 Iniciativa Científica Milenio y PFB 23

(CONICYT, Chile).

Quiero agradecer a mi profesor tutor Francisco A. Squeo por haberme dado nuevamente la oportunidad de seguir avanzando en mi formación científica, mediante la entrada al programa de doctorado y al permitir desarrollar la temática de esta tesis. También le agradezco su apoyo en momentos complicados, que, junto a su confianza, determinación y paciencia, me permitieron finalizar este proceso.

De igual forma me siento enormemente agradecido de Andrea Loayza. Por su generosidad para entregar conocimiento y experiencia; además de su compromiso y paciencia cada vez que solicité su ayuda. Me siento muy afortunado de haber trabajado a su lado en otras investigaciones aparte de esta tesis, donde pude contemplar su liderazgo y profesionalidad.

Este trabajo no hubiese sido posible tampoco, sin la ayuda en las labores de terreno. Gracias Andy Caballero, Claus Westphal, Felipe Muñoz, y en especial a

Paloma Gachón, quien con su amistad y alegría (p.ej. canción de “avecillas de colores”) hizo que los terrenos fuesen más entretenidos; además, agradezco su buena disposición para ayudarme en los ensayos de la presentación final.

Agradezco a todo el equipo del laboratorio de Ecofisiología Vegetal y Conservación, por todo el apoyo académico, logístico y moral entregado. Además de los buenos momentos durante congresos y reuniones. Profe Gina, Lutty, Marco, Nancy, Sra.

Mónica, Cristian, Myriam, Claudia, Felipe, Álvaro y Javier. Particularmente destaco la ayuda de Danny Carvajal, quien fue un soporte importante en varias actividades de terreno y siempre una mente dispuesta a la discusión de temas académicos y varios.

Finalmente, dedico todo el esfuerzo hecho en este trabajo a mi paciente y amada esposa Lucila, y a mis hijos Tomás y Samanta.

Tabla de Contenidos

TABLA DE CONTENIDOS ...... I LISTA DE FIGURAS ...... II LISTA DE TABLAS ...... III LISTA DE ANEXOS ...... IV RESUMEN ...... 6 ABSTRACT ...... 8 CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN GENERAL ...... 9

1.1. FALLO REPRODUCTIVO EN LAS PLANTAS ...... 10 1.2. ESTRUCTURA DE LA TESIS ...... 16 1.3. ESPECIE DE ESTUDIO ...... 17 CAPÍTULO 2: SISTEMA REPRODUCTIVO DE MYRCIANTHES COQUIMBENSIS...... 20 CAPÍTULO 3: LIMITACIÓN POR POLEN EN MYRCIANTHES COQUIMBENSIS Y SU ASOCIACIÓN CON EL AMBIENTE DE POLINIZADORES...... 26

3.1. RESUMEN ...... 27 3.1. INTRODUCCIÓN ...... 28 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 33 3.3.1. Especie de estudio ...... 33 3.3.2. Área de estudio ...... 34 3.3.3. Experimento de limitación por polen ...... 38 3.3.4. Observaciones de polinizadores ...... 39 3.3.5. Análisis estadísticos ...... 40 3.3. RESULTADOS ...... 43 3.4. DISCUSIÓN ...... 54 3.5. CONCLUSIÓN ...... 57 3.6. ANEXOS ...... 59 CAPÍTULO 4: DEPRESIÓN POR ENDOGAMIA TEMPRANA Y SU DEPENDENCIA CON LA DISPONIBILIDAD DE AGUA EN MYRCIANTHES COQUIMBENSIS...... 66

4.1. ABSTRACT...... 67 4.2. INTRODUCTION ...... 68 4.3. MATERIALS AND METHODS ...... 71 4.3.1. Study species ...... 71 4.3.2. Study site ...... 71 4.3.3. Irrigation field experiments ...... 72 4.3.4. Controlled pollination experiments ...... 73 4.3.5. Seed and fruit production ...... 74 4.3.6. Seedling performance ...... 74 4.3.7. Statistical analyses ...... 75

I

4.3.8. Inbreeding depression ...... 76 4.4. RESULTS ...... 77 4.5. DISCUSSION ...... 85 4.6. CONCLUSION ...... 88 4.7. APPENDIX ...... 89 CAPÍTULO 5: RESUMEN Y COMENTARIOS FINALES...... 93 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 95

Lista de Figuras

Figura 1.1: Esquema de los diferentes procesos reproductivos (enumerados en cuadros con línea discontinua) que llevan a la producción de frutos y semillas. Se señalan además diferentes factores (cuadros con línea continua y delgada) organizados a su vez, en diferentes ámbitos de acción que se indican por diferentes colores; contexto climático (azul), ambiente de polinización (amarillo), rasgos maternos (verde) y rasgos de la progenie (rojo)...... 16 Figura 1.2: Distribución geográfica de Myrcianthes coquimbensis. Se indica la ubicación de los sitios de estudio utilizados en esta tesis...... 18 Figura 1.3: Imágenes representativas del a) hábitat rocoso típico de Myrcianthes coquimbensis b) patrón de floración en individuos c) flor en antesis d) frutos maduros...... 19 Figura 3.1: Ramilla de Myrcianthes coquimbensis correspondiente a crecimiento de la temporada con botones florales, delimitada con corchete rojo...... 33 Figura 3.2: Aspecto general del área de estudio: a) destrucción de hábitat por nivelación de suelos en El Panul b) viviendas en El Panul con flora alóctona c) Myrcianthes coquimbensis en zonas intervenidas de El Panul d) aspecto general de la quebrada Juan Soldado y d) el crecimiento de M. coquimbensis en las laderas bajas y fondos...... 37 Figura 3.3: Porcentaje de frutos formados por flores y número de semillas por frutos resultantes de polinizaciones manuales (P) y naturales (C, CE1 y CE2) en Myrcianthes coquimbensis. Letras minúsculas diferentes indican diferencias significativas entre las diferentes niveles de tratamiento (p<0.05)...... 46 Figura 3.4: Promedio ± error estándar de tasas de visita totales observadas en el sitio con intervenciones antrópicas (El Panul) y en el sitio sin intervenciones (Juan Soldado). Letras diferentes indican diferencias significativas...... 47 Figura 3.5: Curvas de acumulación de especies de visitantes florales de Myrcianthes coquimbensis, observados en a) El Panul y b) Juan Soldado. Líneas continuas indican promedios de riqueza de especies observadas mientras que líneas discontinuas indican promedios de riqueza estimada por extrapolación. Áreas alrededor de las líneas indican intervalos de confianza (95%). Líneas rojas y áreas rosadas corresponden al periodo de inicio, mientras que líneas azules y áreas celeste corresponde a periodo final en ambos sitios...... 51

II

Figura 3.6: Frecuencia de visita (visitas /flores) relativa (%) por cada grupo funcional y especie en Myrcianthes coquimbensis. Observadas en el sitio con intervenciones antrópicas (EL Panul) y sin intervenciones (Juan Soldado), en ambos periodos de la temporada (I: inicio; F: Final)...... 52 Figure 4.1: Monthly (bars) and accumulated (dashed line) rainfall observed during 2015 at El Panul. Arrows indicate the months when irrigation treatments were applied to Myrcianthes coquimbensis plants...... 73

Figure 4.2: Means ± standard errors of predawn stem Water Potential (pdWP) measure in watered and control plants, two days before (whiter bars) and two days after (gray bars) the irrigations were applied to watered plants of Myrcianthes coquimbensis. Significant differences of pdWP were observed between before and after the irrigations in watered plants...... 78 Figure 4.3: Mean (± 1 standard deviation) of the percentages of fruit production resulting from outcrossing and selfing, in watered and control plants of Myrcianthes coquimbensis. Percentages correspond to the different transitions: flower to developing fruit (T1); developing fruit to ripe fruit (T2) and flower to ripe fruit (Fset). The numbers outside the squares indicate the initial number of flowers and the number of shoots with at least one fruit (for T1 and T2)...... 80 Figure 4.4: Mean (± 1 standard error) mass of seeds resulting from outcrossing (black bars) and selfing (grey bars) treatments in irrigated and control Myrcianthes coquimbensis plants. Different lower-case letters indicate statistical differences pollination treatment levels...... 81

Lista de Tablas

Tabla 3.1: Temperatura promedio del aire y desviación estándar (ds) registrados diariamente en las observaciones de visitantes florales, para cada sitio y periodo. N: Número de registros (días)...... 40 Tabla 3.2: Resultados obtenidos de modelos lineales generalizados mixtos ajustados para examinar el efecto de la polinización manual, sitio e interacciones el porcentaje de frutos producidos (%Fr) y número de semillas por fruto (SFr) en Myrcianthes coquimbensis. Valores en negrita indican efectos significativos a una probabilidad menor que 0,05...... 45 Tabla 3.3: Valores promedios ± desviación estándar de índices de limitación por polen para Myrcianthes coquimbensis. Se presentan valores para el sitio con intervención antrópicas (El Panul) y el sitio sin intervenciones (Juan Soldado)...... 45 Tabla 3.4: Resultados de Modelo lineal mixto para evaluar los efectos de Sitio, Periodo y su interacción sobre las tasas de visitas totales de visitantes florales de Myrcianthes coquimbensis. Valores en negrita indican efectos significativos a una probabilidad menor que 0.05...... 47 Tabla 3.5: Promedio ± desviación estándar de la Diversidad relativa de Shannon (H’) estimada para los sitios y periodos. Se indica el número de plantas (N) a partir del cual se calculó el promedio y desviación...... 48 Tabla 3.6: Visitantes florales de Myrcianthes coquimbensis registrados en los sitios de estudio durante dos periodos de observación (temporada floración 2014-2015). Se muestra el promedio de las tasas de visitas

III

(visitas/flor/hora) ± deviación estándar para cada morfo-especie, también se indica el grupo funcional asignado para los análisis de regresión (ver texto)...... 49 Tabla 3.7: Resumen de resultados de selección de modelos (AICc, ΔAICc y wi), construidos para explicar la variación de limitación por polen para la producción de frutos por flores (PL %Fr) y para el número de semillas por fruto (PL SFr) en Myrcianthes coquimbensis. Para cada variable dependiente se presentan sus respectivos resultados de regresión lineal...... 53 Table 4.1: Results from the generalized linear mixed models examining the effects of irrigation, pollen source (outcrossing vs. selfing) and plant size (m3) on seed production response variables of Myrcianthes coquimbensis. Fruit transition percentages: T1: Flower to developing fruit; T2: Developing fruit to ripe fruit; Fset: Flower to ripe fruit. Values in bold indicate significant effects at the 0.05 level...... 79 Table 4.2: Results from GLMs and LMs (*) examining the effect of the pollen source (outcrossing - selfing), seed mass and the environmental temperatures experienced through sowing and emergence [Tª 1] and from emergence until the time of the seedling’s final measurements [Tª 2]), on the percentages of seed germination, seedling emergence , seedling survival, emergence time, number of leaves formed per day and height per day of seedling of Myrcianthes coquimbensis. Values in bold indicate significant effects at the 0.05 level...... 82 Table 4.3: Total percentages of seed germination, seedling emergence and seedling survival of Myrcianthes coquimbensis’s seeds resulting from outcross and self-pollination. Ni denotes the initial number of sowed seeds...... 82 Table 4.4: Mean ± 1 standard deviation of seedling performance indicators observed for Myrcianthes coquimbensis resulting from outcross and self-pollination...... 83 Table 4.5: Reproductive performance index (RP) calculated for a) pre-dispersal and b) pos-dispersal traits of the Myrcianthes coquimbensis’s progeny. Seed production response variables are presented for irrigated and control plants, and for both treatments combined (All)...... 84

Lista de Anexos

Anexo 3.1: Resultados de los contrastes de AICc entre modelos completos (modelo con factor aleatorio) y modelos simples (modelo sin factor aleatorio), observados para los modelos que examinaron: a) el efecto de Sitio y polinización sobre el porcentaje de frutos (%Fr) por flores y semillas por fruto (SFr), b) el efecto de sitio y periodo sobre tasas de visita totales. Los valores de ΔAICc representan diferencias entre los modelos completos y simples. El modelo completo fue soportado si presentó menor AIC y un ΔAICc mayor a 2. En negrita se indica a) un efecto significativo de la varianza entre las plantas y entre periodos y para b) un efecto significativo de la varianza de las observaciones dentro de las plantas. Subíndices entre paréntesis indican grados de libertad de los modelos...... 65 Anexo 3.2: Coeficientes de correlación de Pearson y valores de probabilidad (inmediatamente abajo) entre variables candidatas a ser consideradas como independientes en modelos de regresión para limitación por

IV

polen. En cada sitio se presentan dos grupos de variables. Se indican en negrita los valores significativos de coeficientes de correlación (t-test p<0.05)...... 59 Anexo 3.3: Resultados de regresiones lineales generales entre las variables de limitación por polen (dependientes) y variables independientes seleccionadas para ambos sitios. Se indican los coeficientes de regresión para cada variable independiente. Valores en negrita indican p<0.05. (S: Riqueza especies; TV: Tasas de visitas; H’: Diversidad relativa)...... 60 Appendix 4.1: Histogram of frequencies for the seed mass (g) resulted from the irrigation and hand pollination experiments in Myrcianthes coquimbensis...... 89 Appendix 4.2: Results from the AICc contrast between full models (models with a random variable) and reduced models (models without the random variable) performed for seed production response variables and seedling performance response variables. Values of ΔAICc>2 (in bold) indicate a significant effect of the variance among plants, branch and pollination treatments (seed production) and variance among plants (seedling performance). Subscripts in parentheses indicate the degrees of freedom...... 90 Appendix 4.3: Relations between seed mass (g) and a) Germination probability, b) Seedling survival probability, c) number of leaves produces per day and d) Height gained per day of seedling of Myrcianthes coquimbensis...... 91

V

Resumen

La producción de semillas en las plantas depende de la acción conjunta de factores intrínsecos y extrínsecos. El conocimiento de estos factores puede, eventualmente, ser clave para entender las causas de la extinción de las especies. Un fallo en la producción de semillas puede ser ocasionado por un servicio de polinización insuficiente; sin embargo, un factor intrínseco como el sistema reproductivo mixto, permite asegurar la producción de semillas en condiciones cuando el servicio de polinización falla. No obstante, la producción de semillas por autofecundación puede fallar si estas presentan depresión por endogamia, y más aún, este fallo puede potenciarse por una asignación insuficiente de recursos por parte de las plantas madre. En esta tesis se estudiaron diferentes procesos reproductivos en

Myrcianthes coquimbensis, examinando el rol de su sistema reproductivo, el ambiente de polinización y la disponibilidad de recursos. Primero, si bien la producción de semillas ocurre principalmente por fecundación cruzada, también pude ocurrir por autofecundación y agamospermia; sin embargo, la autofecundación autónoma interfiere con la fecundación cruzada en las flores. Segundo, la producción de frutos y semillas en dos poblaciones estuvo limitada por la disponibilidad de polen; esta limitación se asoció negativa y positivamente con diferentes componentes del ambiente de polinización. Tercero, las semillas presentaron depresión por endogamia y su magnitud fue mayor en de plantas madre sujetas a una mayor disponibilidad de agua; la depresión por endogamia afectó negativamente desempeño de plántulas, pero de forma indirecta a través del tamaño de las semillas. La producción de semillas en M. coquimbensis puede estar comprometida por la disponibilidad de polen y la autofecundación no puede asegurarla, debido a la interferencia

(intra-flor) y depresión por endogamia. Esta última, pudiese ser más perjudicial en

6

situaciones con mayor disponibilidad de agua, como en años de precipitación extrema.

Futuros estudios debiesen enfocarse al mantenimiento y conservación de condiciones ambientales que no fomenten la incidencia y magnitud de autofecundación en las plantas.

7

Abstract

Seed production in plants depends on the joint action of intrinsic and extrinsic factors.

Knowledge of these factors may, eventually, be key to understanding the causes of species extinction. A failure in seed production can be caused by an insufficient pollination service; although, an intrinsic factor such as the mixed reproductive system, can ensure seed production in conditions when pollination service fails. This reproductive assurance, however, may disappear if seeds produce by selfing presents inbreeding depression, which can be enhanced by an insufficient allocation of resources by mother plants. In this thesis, different reproductive processes were analyzed in Myrcianthes coquimbensis, by examining the role of its reproductive system, the pollination environment, and the availability of resources. First, although seed production occurs mainly by outcrossing, it can also occur by selfing and agamospermia; however, autonomous selfing interferes with outcrossing in the flowers. Second, seed production was pollen limited in two populations; the degree of pollen limitation was negatively and positively associated with different components of the pollination environment. Third, the seeds produced presented inbreeding depression and its magnitude was greater in mother plants subject to greater water availability. Inbreeding depression negatively affected seedling performance, but indirectly through the initial seed size. Seed production in M. coquimbensis may be compromised pollen limitation and selfing cannot ensure it, due to interference (intra-flower) and inbreeding depression. The latter could be even more harmful in situations with high water availability, such as in years of extreme precipitation. Future studies should focus on the maintenance and conservation of environmental conditions that do not promote the incidence and magnitude of selfing in plants.

8

Capítulo 1: Introducción general

Durante las últimas décadas la conservación de la biodiversidad ha ido cobrando cada vez más relevancia en la investigación científica, debido a la creciente evidencia de que el planeta está enfrentando un nuevo evento de extinción masiva (Ceballos et al. 2015).

Particularmente en las plantas, Humphreys et al. (2019) estimaron la tasa de extinción de estas entre (18.3 – 25.6 E/MSY), cifra que es aproximadamente 500 veces mayor a la tasa de extinción de fondo en la naturaleza para las plantas (0.05 – 0.35 E/MSY) (tomando en cuenta registros de especies desde 1900-2018). Para hacer frente a estos escenarios, la conservación a escala de especies se ha propuesto como objetivo prevenir la extinción de las especies o disminuir su riesgo de extinción, a través de la mantención de la viabilidad de sus poblaciones y la recuperación de aquellas que se encuentran disminuidas (Dunning Jr. et al. 2006).

La conservación de especies se basa en diferentes teorías que entregan una explicación al fenómeno de extinción (Armstrong 2005; Ouborg et al. 2006). Desde el paradigma de la genética de la conservación, se plantea que una población puede llegar a su extinción mediante los efectos negativos que ejercen características de las poblaciones

(tamaño, el grado de aislamiento, tasas de crecimiento y/o fluctuaciones de estas) y/o procesos que ocurren escala poblacional (endogamia y de deriva genética) sobre la diversidad genética (Ouborg et al. 2006). La reducción de la diversidad genética de las poblaciones, puede a su vez, disminuir el potencial evolutivo de una población o aumentar las fluctuaciones en su tasa de crecimiento (Ouborg et al. 2006; Mace et al. 2008). Sin embargo, al momento de aplicar esta teoría a una especie en particular, es necesario conocer además, aspectos de su historia de vida (Brussard 1991); esta forma, se puede

9

tener mayor precisión y realismo al momento de estudiar los procesos que pueden llevar a la extinción de alguna de sus poblaciones, pero también, al momento de aplicar el conocimiento para crear estrategias de conservación (Vázquez et al. 2011).

Los estudios de la historia natural de las plantas, centrados en su reproducción, pueden contribuir al entendimiento de los procesos de extinción de una especie. Por ejemplo, en especies donde el crecimiento poblacional es sensible a variaciones en el número de semillas producidas, el entendimiento de los procesos y factores que generan variación en la producción de semillas, son relevantes para explicar variaciones en las tasas de crecimiento de sus poblaciones (Ward and Johnson 2005), variaciones que, como se indicó anteriormente, pueden a su vez, llevar a la extinción de una especie (Mace et al.

2008). Por otra parte, el conocimiento de los diferentes modos por los cuales las plantas pueden producir sus semillas (de aquí en adelante, modos reproductivos) es también un aspecto importante para entender los procesos de extinción de una especie. Particularmente, la autofecundación, ya que esta puede resultar en depresión por endogamia, reduciendo tanto el vigor de la progenie como la diversidad genética de las poblaciones (Hamrick and

Godt 1996; Dickinson et al. 2003).

1.1. Fallo reproductivo en las plantas

En los ambientes naturales, es común observar que un alto porcentaje de las plantas no alcanza el máximo de producción de frutos y semillas permitido por el número de flores y óvulos (Stephenson 1981). Existen múltiples causas para este fenómeno, las cuales son dirigidas tanto por rasgos y/o procesos que ocurren en la planta (factores intrínsecos) como por condiciones ambientales (factores extrínsecos). Este conjunto de factores intervienen en una cadena de procesos lineales que van desde la polinización hasta el desarrollo de los frutos y semillas (Box 1) (Lloyd 1980; Vamosi et al. 2013; Barrett and Harder 2017); en

10

general, la producción de las semillas depende del suministro de polen y recursos, el cual es modulado por diferentes rasgos de las plantas (Figura 1.1). .

Box 1: Resumen de los procesos involucrados en la producción de semillas de las

plantas.

1) Polinización (deposición de polen en estigma): Este proceso inicia la

producción de semillas y es influenciado por factores extrínsecos como el ambiente de

polinización (vectores de polinización, densidad de conespecíficos y heteroespecíficos),

el cual determina el éxito de la polinización, es decir, la cantidad y calidad (tipo y

procedencia) del polen depositado en los estigmas (Wilcock and Neiland 2002). En las

plantas hermafroditas, el éxito de la polinización puede ser influenciado también por

rasgos florales como la dicogamia y herkogamia, los cuales pueden influenciar la

cantidad de auto-polen depositado en la flor. (Lloyd and Webb 1986; Webb and Lloyd

1986).

2) Una vez ocurrida la polinización, diferentes procesos de interacción

entre el polen y genotipo materno ocurren previo a la fecundación de los óvulos. La

competencia entre los tubos polínicos y así como las interacciones de estos con el

genotipo materno, determinaran los tubos que alcanzarán finalmente los óvulos

(Shaanker et al. 1988). Uno de estos procesos de interacción, es el sistema de auto-

incompatilibilidad, el cual determina finalmente la ocurrencia de autofecundación

(Busch and Schoen 2008). En esta fase, la formación de zigotos puede llevarse a cabo

11

también sin la presencia (o con la presencia indirecta) de polen mediante apomixis

(Richards 2003).

3) Desarrollo de los frutos y semillas: En esta etapa, la disponibilidad de

recursos (fotosintatos y agua) entregados por la planta madre, puede determinar la

sobrevivencia de los embriones o la cantidad de reservas con las que contará cada uno

de ellos en la semilla (Stephenson 1981). Los recursos asignados, determinarán el

tamaño final tanto de la semilla como el fruto. Por otra parte, la depresión por

endogamia puede comenzar a expresarse en esta etapa del desarrollo de los embriones,

afectando su sobrevivencia o la calidad de la semilla resultante (p. ej. Tamaño de la

semilla) (Charlesworth and Willis 2009).

4) Desempeño post-dispersión: Posterior a la dispersión de semillas, el

desempeño de las semillas (germinación) y de las consecuentes plántulas (crecimiento

y sobrevivencia), pueden depender aún las reservas energéticas entregadas por la planta

madre (Moles and Westoby 2006), así como también de la expresión de depresión por

endogamia en estos estadios (Baskin and Baskin 2015).

Un déficit en el suministro de polen puede estar determinado por la cantidad de polen que llega a los estigmas como también por el tipo de polen, es decir, polen no compatible o polen heteroespecífico; de esta forma, la producción de semillas puede estar limitada por polen en un aspecto cuantitativo y cualitativo (Ashman et al. 2004; Knight et al. 2005). Esta limitación por polen depende a su vez, de las condiciones ambientales que influyen en el transporte del polen (i.e. ambiente de polinización), ya sea que este último se lleve a cabo por condiciones abióticas (p.ej. viento, agua) o por vectores bióticos

(polinizadores). Este ambiente de polinización puede ser alterado por las variaciones

12

naturales en las condiciones ecológicas locales dentro de una comunidad de plantas, pero también puede ser alterado producto de actividades de origen antrópicos que ocurren en los ambientes naturales. Ejemplos de estas actividades son la fragmentación y urbanización, las cuales pueden alterar el ambiente de polinización, ya sea reduciendo la abundancia y diversidad de la fauna de polinizadores o alterando la comunidad de plantas (Aguilar et al.

2006; Gonzalez-Varo et al. 2009).

La producción de semillas también puede ser limitada por un déficit en el suministro de recursos. Estos recursos consisten principalmente en agua y fotosintatos de suministrados por las plantas madre a las semillas y frutos. El déficit en la disponibilidad de recursos, particularmente el agua, puede ser causada bajas precipitaciones, limitando la adquisición de recursos por parte de las plantas madre y su posterior asignación a la producción de frutos y semillas (Pol et al. 2010). Por otra parte, un déficit de recursos puede limitar la producción de flores y óvulos, causando así limitación de óvulos para la producción de semillas (Haig and Westoby 1988; Harder and Aizen 2010).

Factores intrínsecos de las plantas pueden modular el accionar de los factores extrínsecos. Por ejemplo, la limitación por polen, puede ser contrarrestada por la presencia de un sistema reproductivo mixto, donde la autofecundación como la agamospermia pueden asegurar la producción de semillas en condiciones cuando la llegada de polen cruzado es insuficiente (Kalisz et al. 2004; Eckert et al. 2006). Sin embargo, la autofecundación puede tener costos como la expresión de depresión por endogamia en la progenie, llevando a una menor producción de semillas o la producción de semillas de menor calidad (p.ej. menor tamaño) (Charlesworth and Willis 2009). De este modo, el éxito o fallo en la producción de

13

semillas en las plantas, dependerá de cómo factores intrínsecos particulares de las especies, interactúan con el contexto ambiental (factores extrínsecos) en el cual estas habiten.

En esta tesis se examinan los factores intrínsecos y extrínsecos que influyen en el

éxito reproductivo de Myrcianthes coquimbensis. Esta especie es un arbusto con una distribución geográfica restringida a una franja costera en el Desierto de Atacama. En los

últimos años su hábitat natural ha sido alterado y destruido debido a la presencia de actividades humanas, por lo que está catalogada como En Peligro de Extinción

(MINSEGPRES 2008; Garcia-Guzman et al. 2012). Los pocos estudios auto ecológicos que hay de esta especie, dos fenómenos observados en sus poblaciones hacen suponer la presencia de un fallo reproductivo: Primero, a pesar de que las flores de esta especie poseen múltiples óvulos por flores, generalmente sus frutos solo presentan una semilla por fruto

(Landrum and Grifo 1988); segundo, en sus distintas poblaciones se han observado abortos masivos de frutos (García-Guzman et al. 2012). De este modo, la pregunta central de esta tesis es ¿Cómo los diferentes factores intrínsecos y extrínsecos, que intervienen en los procesos reproductivos de M. coquimbensis, influencian su éxito reproductivo? Para responder esta pregunta, se plantean tres objetivos que abarcan la mayor parte de la fase reproductiva en M. coquimbensis: 1) Examinar el sistema reproductivo de Myrcianthes coquimbensis, 2) evaluar la asociación entre la limitación por polen y el ambiente de polinización en Myrcianthes coquimbensis y 3) evaluar el efecto conjunto de la depresión por endogamia y la disponibilidad de agua de plantas madre, en el desarrollo de semillas y plántulas de Myrcianthes coquimbensis.

14

1) Producción Planta de Flores

Contexto climático Ambiente de polinización Sistema 2) Polinización reproductivo Precipitaciones Polinizadores

3) Fecundación

Cantidad y calidad del polen

Semillas Depresión por 4) Desarrollo de Recursos endogamia frutos y semillas

Semillas

Reservas 5) Desempeño de semillas y plántulas maternas dependientes de reservas maternas

15

Figura 1.1: Esquema de factores (círculos) intrínsecos y extrínsecos involucrados en los diferentes procesos reproductivos (enumerados, en cuadros con línea discontinua), que influencian la producción de frutos y semillas de las plantas. Factores extrínsecos: contexto climático, ambiente de polinización; factores intrínsecos: rasgos de planta madre (Planta) y rasgos de la progenie (Semillas).

1.2. Estructura de la tesis

Esta tesis doctoral se estructuró en tres capítulos cubriendo los objetivos antes expuestos. A continuación, se presentan el contenido y finalidad de cada uno de ellos:

• En el Capítulo 2, Sistema reproductivo de Myrcianthes coquimbensis, se determinan los diferentes modos reproductivos de Myrcianthes coquimbensis, así como también la variación en el momento de ocurrencia de las funciones reproductivas masculinas y femeninas de sus flores hermafroditas.

• En el Capítulo 3, Ambiente de polinización y limitación por polen en

Myrcianthes coquimbensis, se analiza la relación entre el ambiente de polinizadores de

Myrcianthes coquimbensis, con el grado de limitación por polen para la producción de frutos y semillas.

• Finalmente, en el Capítulo 4, Depresión por endogamia temprana y su dependencia en la disponibilidad de agua de las plantas madre, se evalúa si existe depresión por endogamia y si esta es dependiente de la disponibilidad de agua, tanto en la fase de producción de frutos y semillas como en la fase de desempeño temprano de plántulas.

16

1.3. Especie de estudio

Myrcianthes coquimbensis (Barnéoud) Landrum & Grifo (Myrtaceae) es un arbusto endémico de la Región de Coquimbo en Chile. Esta especie se distribuye desde la localidad de las Tacas (30°05’ S – 71°22’ O) por el sur hasta Punta Barrancones (29°25’ S - 71°19’

O) en el norte, con una extensión latitudinal de aproximadamente 83 km. Habita en una franja costera de entre 1 y 2 km de ancho, principalmente en zonas de requeríos costeros

(Figura 1.2). Las poblaciones se encuentran compuestas principalmente de individuos adultos (Garcia-Guzman et al. 2012), con una muy baja representatividad de plántulas y juveniles, y solo se ha observado un pequeño número plántulas bajo rocas y bajo plantas adultas en algunas localidades (Garcia-Guzman et al. 2012; Loayza et al. 2014). A lo largo de su rango de distribución, el creciente desarrollo inmobiliario y la creación de parcelas de agrado constituyen una importante amenaza debido a la destrucción de su hábitat (Garcia-

Guzman et al. 2012). Por este motivo, esta especie ha sido catalogada como En Peligro de extinción (MINSEGPRES 2008).

Myrcianthes coquimbensis es un arbusto perenne, de hojas coriáceas que mide entre

1 a 4m (Figura 1.3a). Florece de forma abundante (Figura 1.3b) desde mediados de octubre hasta mediados de febrero, pero el periodo de máxima floración generalmente ocurre entre noviembre y diciembre (Peña 2014). Sus flores son hermafroditas y se disponen en las como inflorescencias con pedúnculos uniflorales (inflorescencias basales) o triflorales

(inflorescencia del ápice). Solo se observan flores en ramas con crecimiento nuevo de la temporada. La flor está compuesta de cinco pétalos de color blanco y contiene más de 50 estambres (Figura 1.3c), los cuales rodean al gineceo que consta de un pistilo y un ovario súpero, bilocular con 5 a 11 óvulos por lóculo (Landrum & Griffo 1988, Squeo et al. 2001).

Los frutos de M. coquimbensis son bayas carnosas (Figura 1.3d), pero gran parte de su

17

biomasa corresponde a una o dos semillas de tipo recalcitrante (Luna et al. 2016). Si bien esta especie no tiene dispersores conocidos, algunos roedores que depredan sus semillas pueden ocasionalmente dispersarlas (Luna et al. 2016; Loayza et al. 2020).

Área de distribución de Myrcianthes coquimbensis

Figura 1.2: Distribución geográfica de Myrcianthes coquimbensis. Se indica la ubicación de los sitios de estudio utilizados en esta tesis.

18

a) b)

c) d)

Figura 1.3: Imágenes representativas del a) hábitat rocoso donde generalmente crece Myrcianthes coquimbensis b) patrón de floración en individuos c) flor en antesis d) frutos maduros.

19

Capítulo 2: Sistema reproductivo de Myrcianthes coquimbensis. 1

c)

García-Guzmán P, Loayza AP, Squeo FA (2020) Multiple reproductive modes of Myrcianthes coquimbensis (Myrtaceae), an endangered shrub endemic to the Atacama Desert. Flora 263:151537. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.flora.2020.151537

20

Flora 263 (2020) 151537

Contents lists available at ScienceDirect

Flora

journal homepage: www.elsevier.com/locate/flora

Multiple reproductive modes of Myrcianthes coquimbensis (Myrtaceae), an endangered shrub endemic to the Atacama Desert T

Patricio García-Guzmána,b,*, Andrea P. Loayzab,c, Francisco A. Squeoa,b,d a Departamento de Biología, Universidad de La Serena, Casilla 554, La Serena, Chile b Instituto de Ecología y Biodiversidad (IEB) c Instituto de Investigación Multidisciplinario en Ciencia y Tecnología, Universidad de La Serena, La Serena, Chile d Centro de Estudios Avanzados en Zonas Áridas (CEAZA), La Serena, Chile

ARTICLE INFO ABSTRACT

Edited by Fei-Hai Yu Many plants can produce seeds via multiple reproductive modes, such as selfing and outcrossing. Having mul- Keywords: tiple reproductive modes can be advantageous if it assures seed production when outcrossing fails, which is Breeding system important for species inhabiting environments where pollinators are scarce or variable. However, it can also be Agamospermy disadvantageous due to the fitness costs associated to selfing. Consequently, plants have mechanisms to reduce Selfing the incidence of selfing. Here we examined the breeding system of Myrcianthes coquimbensis; this threatened Mix-Mating Atacama Desert shrub is the last species to bloom in the community and exhibits low visitation rates per flower Protandry because pollinators are less abundant. Our aim was to determine whether this plant can produce fruits by modes Reproductive assurance other than outcrossing, and whether it possesses floral traits to prevent sexual interference. We conducted ex- Sexual interference perimental flower treatments in two localities to determine whether fruits were produced by outcrossing, selfing, autonomous selfing and agamospermy. We also evaluated stigma receptivity and pollen viability during a flower’s lifespan. M. coquimbensis developed fruits and seeds by all the reproductive modes assessed, including selfing and agamospermy. Flowers presented partial segregation of sexual functions, with the peak of pollen viability occurring before the peak of stigma receptivity. Selfing is unavoidable in M. coquimbensis and likely interferes with outcrossing. Coupled with possible early inbreeding depression, it probably results in a cost for seed production. Our results suggest that this species may be vulnerable in scenarios where pollinators are scarce; however, agamospermy may provide an alternative route of seed production in these scenarios.

1. Introduction viability (Richardson et al., 2016). Plants exhibit remarkable variation in their reproductive strategies, Understanding how different traits contribute to the reproductive and many species have multiple modes of reproduction including output of plants is a central topic in ecology (Eckert et al., 2010). Plant selfing and agamospermy (Vogler and Kalisz, 2001; Richards, 2003; traits that directly determine the means by which a plant produces Goodwillie et al., 2005; Moreira et al., 2017). Having multiple modes of seeds (i.e., the modes of reproduction) constitute its breeding system reproduction is advantageous if it increases seed production when (Neal and Anderson, 2005; Barrett, 2014). For threatened and rare outcrossing fails (reproductive assurance) (Eckert et al., 2006). For plants, breeding system studies are an essential first step to identify example, lack of seed production in environments where pollinator factors that reduce seed production (Johnson and Steiner, 2000; abundance, activity or effectiveness is variable, can be compensated by Davidson et al., 2014; Pérez et al., 2018), particularly for species living autonomous agamospermy (Bierzychudek, 1987) or autonomous in harsh environments, where pollinators are scarce or their abundance selfing (e.g., Fausto et al., 2001; Kalisz and Vogler, 2003). However, variable (Castro et al., 2008). Moreover, knowledge of the breeding having multiple reproductive modes can also be disadvantageous due to system of threatened plants can allow managers to infer how changes in the costs associated to agamospermy (asexuality) and selfing. In au- the pollinator environment may affect their reproductive output tonomous agamospermy, the egg cell that forms the embryo bypasses (Larson and Barrett, 2000; Young et al., 2012), their risk of inbreeding meiosis and recombination. This results first in seeds that are clones of depression (Bellanger et al., 2015) and ultimately, their population the mother plant (Richards, 2003; Hörandl and Hojsgaard, 2012),

⁎ Corresponding author at: Departamento de Biología, Universidad de La Serena, Casilla 554, La Serena, Chile. E-mail address: [email protected] (P. García-Guzmán). https://doi.org/10.1016/j.flora.2020.151537 Received 1 August 2019; Received in revised form 28 November 2019; Accepted 1 December 2019 Available online 07 January 2020 0367-2530/ © 2020 Elsevier GmbH. All rights reserved. P. García-Guzmán, et al. Flora 263 (2020) 151537 which do not bring new allelic combinations to the population and reproduce by modes other than outcrossing? and 2) is the sexual hence make the species vulnerable to environmental changes (Richards, function within a flower segregated during its lifespan? 2003) and second, in deleterious mutations accumulating over gen- erations (Hojsgaard and Hörandl, 2015). Selfing (autonomous and fa- 2. Materials and methods cilitated) may also lead to reproductive costs because individuals re- sulting from several generations of selfing are homozygous and have 2.1. Study species higher chances of expressing deleterious mutations, which reduce the fitness of selfed progeny (i.e., inbreeding depression) (Kephart et al., Myrcianthes coquimbensis (Barnéoud) Landrum and Grifo is an 1999; Herlihy and Eckert, 2002), particularly during the seed devel- evergreen shrub narrowly distributed along a coastal fringe of < 100 opment stage (i.e., early-acting inbreeding depression) (Husband and km2 in the Atacama Desert (García-Guzman et al., 2012). This species Schemske, 1996). Moreover, if autonomous selfing within a flower has hermaphrodite flowers that have one pistil surrounded by over fifty occurs in conjunction with outcrossing, it uses ovules and pollen that stamens. The ovary has two locules, each of which contains five to would otherwise be available for outcrossing (i.e., ovule and pollen eleven ovules (Landrum and Grifo, 1988; Arancio et al., 2001). In discounting, respectively) (Eckert and Herlihy, 2004). Pollen and ovule contrast to co-occurring shrubs, flowers of M. coquimbensis are pre- discounting can also occur when selfing is mediated by pollinators sented in large displays (> 100 flowers per shrub). The flowering (both within and among flowers) (Lloyd and Schoen, 1992). season extends from October until February and peaks in November. Because of its cost, many plant species have mechanisms that pre- During this period, flowers are visited by 17 species of insects (Cortés, vent or reduce the incidence of selfing (Barrett, 2003), self-incompat- 2010). Fruits are fleshy berries that develop over eight months and that ibility being the main mechanism that prevents fecundation by self- typically contain a single, recalcitrant seed (Loayza et al., 2015). M. pollen (Hiscock and McInnis, 2003; Busch and Schoen, 2008). None- coquimbensis is classified as endangered due to habitat loss by urbani- theless, even in self-incompatible plants, self-pollen deposited on the zation (MINSEGPRES, 2008; García-Guzman et al., 2012). stigmas can interfere with cross-pollination (i.e., sexual interference), ultimately decreasing seed production (Barrett, 2002). Therefore, 2.2. Study sites plants also possess floral traits to prevent sexual interference. Two such traits are 1) the temporal separation in the maturation time of the We conducted this study in two localities within the distribution stigma and pollen, which allows a segregation of the sexual functions range of M. coquimbensis separated by approximately 50 km: Totoralillo within the flower (dichogamy) and 2) the spatial separation of the (30°04′S - 71°22′ W) and Juan Soldado (29°39′S - 71°18′W). In stigma and anthers (herkogamy), which prevents self-pollen from ar- Totoralillo, M. coquimbensis grows up to 500 m inland from the coast- riving to the stigma (either autonomously or mediated by pollinators) line and is associated to rocks; in Juan Soldado, this species also grows (Lloyd and Webb, 1986; Webb and Lloyd, 1986; Dai and Galloway, associated to rocks, but within a ravine that extends five kilometers 2011). inland from the coastline. Mean annual temperatures in both sites range From a conservation perspective, there is an urgent need to un- between 15 ± 0.5 °C and 14 ± 0.4 °C, and mean accumulated annual derstand more about the reproductive dependency of endangered plant precipitation is 78 ± 45 mm and 57 ± 56 mm for Totoralillo and Juan species on pollen availability (Wilcock and Neiland, 2002; Fernandez Soldado, respectively (16 year means (CEAZAMET, 2019)). However, et al., 2012), particularly of outcross-pollen (Gonzalez-Varo and because M. coquimbensis blooms at the end of the spring and during the Traveset, 2010; Gélvez-Zúñiga et al., 2018). The first step in achieving summer months, there is no rainfall during the flowering season. this understanding is to elucidate their breeding system (Castro et al., 2008). In this study, we investigated the breeding system of Myrcianthes 2.3. Reproductive modes coquimbensis (Myrtaceae), a rare and endangered shrub endemic to a narrow strip of the Atacama Desert in Chile (García-Guzman et al., We experimentally assessed the modes of reproduction of M. co- 2012). Three lines of evidence suggest that seed production in M. co- quimbensis using standard protocols (Kearns and Inouye, 1993) during quimbensis is limited by pollen availability. First, this species exhibits two flowering seasons: in December 2012 in Totoralillo (hereafter To- one of the lowest visitation rates per flower of the plant community (3.6 toralillo) and in Juan Soldado during January 2015 (hereafter Juan − ×10 3 visits / flower / min; 0.6 % of the community total) (Cortés, Soldado). On each occasion, we performed five floral treatments. First, 2010). Second, it blooms during the late spring and early austral to determine natural pollination levels, we randomly selected and summer; that is, in the beginning of the driest period of the year (Peña, marked buds and designated them as control flowers (C). Second, to 2016), when all other plant species in the community are no longer determine outcrossing (O), we emasculated developing flowers (stage flowering (Cortés, 2010). In harsh environments, pollinator activity [2], see next section), hand pollinated them with pollen from plants at often decreases towards the end of the blooming season (Arroyo et al., least 10 m away and then excluded each individual flower with a mesh 1985; Totland, 1994). Third, individual plants have large floral dis- bag (mesh size 0.3 mm). Third, to test for self-compatibility (S), we plays; although this trait can attract more pollinators (e.g., Galloway followed the same procedure described above, but pollinated flowers et al., 2002), insects visiting plants with large floral displays are more with pollen from the same plant. Fourth, to determine whether plants likely to probe more flowers in sequence, but ultimately probe only a were able to autonomously self-pollinate (i.e., autogamy; AS), we ex- small proportion of the available flowers (Mitchell et al., 2004). Seed cluded individual buds with mesh bags before they opened. Finally, to production in this species could also be restricted by sexual interference test for the ability to produce embryos without pollen (agamospermy; of self-pollen deposited by pollinators because its brush-type flower A), we emasculated individual flowers at the bud stage and then ex- (characteristic of Myrtaceae) may facilitate self-pollination (Webb and cluded them with mesh bags. Because we found evidence of agamos- Lloyd, 1986). Moreover, although fully developed flowers are herko- permy in Totoralillo during the 2012 flowering season, we added a new gamous (i.e., the stigma is longer than the stamens), the distance be- experimental treatment during the 2015 season in Juan Soldado, which tween anthers and stigma is small in relation to pollinator movements, consisted of carefully emasculating the flower at the bud stage, re- which leads to frequent contact between them in an unordered se- moving its style and excluding the bud with a mesh bag. Style removal, quence (i.e., unordered herkogamy) (Webb and Lloyd, 1986). As a re- prevents casual arrival of pollen to the stigma; thus, seed development sult, only dichogamy can restrict facilitated self-pollination, particu- from this treatment would constitute additional evidence of autono- larly if the stigma is receptive before pollen is shed from the anthers mous agamospermy (AA; i.e., the ability to produce embryos and en- (i.e., protogyny) (Lloyd and Webb, 1986). In light of all this, in this dosperm without pollen). Each flower treatment was applied to one study we address two specific questions: 1) Is M. coquimbensis able to flower within a single plant (N = 52 Totoralillo,N=61Juan Soldado,

2 P. García-Guzmán, et al. Flora 263 (2020) 151537

Fig. 1. Phenological stages of Myrcianthes co- quimbensis. Flower stages: A) buds [stage 0], B) developing flower [stage 1], C) full open flower [stage 2], D) mature flower [stage 3], E) non-pollinated (dead) flower. Fruit stages: F) developing fruit, G) green fruits, and H) ripe fruits. Stage numbers, used for floral treat- ments, are indicated within square brackets. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article).

plants). pistil, stamens and petals (Fig. 1A – D): buds [0]; developing flowers We first monitored flowers between four and six weeks after con- with partially elongated petals and stamens, but closed anthers [1]; ducting the experimental procedures (i.e., in January 2013 in open flowers with a fully elongated pistil and petals, and dehiscent Totoralillo and in February 2015 in Juan Soldado); during this mon- anthers [2]; flowers without petals and stamens [3]. We then marked a itoring period we considered dead flowers (Fig. 1E, dried ovary) as single branch in each of 25 plants and daily monitored the transition of evidence of reproductive failure and developing fruits (Fig. 1F, green all flowers from stage [0] to stage [3]. and swollen ovary) as evidence of reproductive success. We considered developing fruits, instead of ripe fruits, as a more accurate indicator of 2.4.1. Stigma receptivity reproductive success, because throughout their development (which We determined whether stigmas were receptive via manual polli- expands for ca. 8 months) a high percentage of fruits abort, particularly nation of flowers in stages [0] through [3]. In December 2013, we se- in dry years (Peña, 2016); therefore, many fruits in their initial stage lected 15 plants in Totoralillo and marked, emasculated and bagged abort due to water shortage. Furthermore, given that partenocarpy (i.e., four buds per plant. On the first day, we selected one of these emas- fruit production without seeds) has never been observed in this species, culated buds (stage [0]) and pollinated it with pollen from two to three nor reported in other Neotropical Myrtaceae (Picarella and Mazzucato, plants located at a distance of at least 10 m; following pollination, the 2019), it is unlikely that developing fruits are simply the result of ovary bud was immediately bagged. We repeated this procedure on the fol- enlargement. lowing days with each of the remaining emasculated buds as they Developing fruits recorded during the first census were kept within successively entered the following floral stage (i.e., [1] to [3]), which mesh bags and monitored a second time in June 2013 in Totoralillo, was calculated based on the previously determined floral schedule. and in June 2015 in Juan Soldado to determine the probability of fruit Once they were manually pollinated, bud/flowers remained bagged for maturation (Fig. 1F) and the number of seeds per fruit. Finally, the two days and then collected and stored in a formaldehyde, acetic acid percentage of aborted fruits was calculated for all treatments as the and ethanol solution (FAA) (Dafni, 1992). To determine whether difference between the percentage of ripe and developing fruits in re- stigmas from collected buds/flowers were receptive at the time of lation to the percentage of developing fruits. manual pollination, their pistils were digested overnight in an 8 N so- To determine levels of self-compatibility and autogamy in M. co- lution of NaOH at room temperature, rinsed three times with distillated quimbensis, we calculated indices of self-compatibility (ISI) and auto- water and dyed with 0.2 % aniline blue diammonium salt (SIGMA) gamy (IAS), respectively (modified from Ruiz Zapata and Arroyo, diluted in a 0.1 M phosphate buffer (Dafni, 1992; Shivanna and Tandon,

1978). The ISI index was calculated using developing fruits (ISIfruits) 2014). Finally, dyed pistils were mounted and observed under a and the number of seeds (ISIseeds) per fruit as: ISI = fS/fO, where fS and fluorescence microscope (Leica DM2500) with an ultraviolet filter fO are the percentage of fruits or the number of seeds per fruit formed (excitation: 320−380 nm, emission: 425 nm) and the number of ger- by selfing and outcrossing, respectively. The IAS index was calculated minated pollen grains (i.e., those with pollen tubes attached; hereafter using developing (IASDfruits) and ripe (IASRfruits) fruits as: IAS = fAS/fS, pollen tubes) on each stigma was counted. where fAS and fS are the percentage of developing or ripe fruits formed by autogamy and selfing, respectively. Both indices range from 0 to 1: 2.4.2. Pollen viability ISI values close to 1 indicate self-compatibility, values ranging between To determine whether the percent of viable pollen varied during the 0.2 and 1 indicate incomplete self-compatibility, and values between 0 days when anthers were dehiscent (stage [2]), in December 2013 we and 0.2 indicate self-incompatibility; in turn, an IAS value of 1 re- selected 17 plants in Totoralillo and marked and bagged three buds presents a fully autogamous plant, whereas values greater than 0 in- (stage [0]) per plant. On the day anthers started to deshice, we began dicate partial autogamy (Ruiz Zapata and Arroyo, 1978). collecting a few stamens from each flower and deposited a sample of their pollen in Eppendorf tubes filled with 1 ml of 2,3,5-trifenil-2H- 2.4. Timing of the sexual functions within a flower tetrazolium chloride (Tetrazolium hereafter), which dyes red the pol- len’s cytoplasm in the presence of dehydrogenase enzymes (Vieitez, To determine whether sexual functions in M. coquimbensis are 1952). After stamens were collected, flowers were once again bagged temporally segregated (dichogamy), we examined stigma receptivity and the procedure was repeated daily until anthers had released all and pollen viability at different times during a flower’s lifespan. We their pollen (typically occurring by the fourth day). Pollen samples calculated on which days to manually pollinate emasculated buds or were transported in a warm case (40 °C) to the laboratory for analysis. flowers, by first determining the duration of each stage. In December In the laboratory, samples were re-suspended and a drop of each sus- 2012, we defined four floral stages based on the development of the pension was deposited on a slide. Then, we recorded the total number

3 P. García-Guzmán, et al. Flora 263 (2020) 151537 of pollen grains, as well as the number of dyed (i.e., viable) grains per sample using a light microscope (100X magnification). We observed five drops per sample, summed the counts and calculated the propor- tion of viable grains.

2.5. Statistical analyses

To assess 1) the effects of the flower treatments on fruit and seed formation and 2) differences in stigma receptivity among floral stages, we fitted generalized linear mixed models (GLMMs) (Bolker et al., 2009). For these analyses, floral treatments and floral stages were used as fixed factors and individual plants as the random factor. We used binomial error distributions and logit link functions for the fruit and seed formation response variables (success and failure) and a negative binomial error distribution with a log link function for counts of pollen tubes. To determine if the ISI and IAS indices were statistically different from 1, we used the respective comparisons between treatments (O v/s S and S v/s AS) from the GLMM’s post hoc test (see below). Daily variation in the percent of viable pollen was examined by fitting a general linear model where sampling day was used as the fixed factor, and the percent data was square root arcsine transformed before the analysis. The statistical inference used for the fixed factors was a Likelihood ratio test (LRT, χ2) with single term deletions in the pairwise compar- isons. To assess the significance of the random factor (i.e., each in- dividual plant), we used the corrected Akaike's Information Criteria (AICc) to compare the full model (with the random variable) with a reduced model in which the random variable was removed. The random factor was considered relevant when the full model had a lower AICc than the reduced model and ΔAICc > 2 (Burnham and Anderson, 2002). Multiple comparisons among levels of each fixed factor were assessed with Tukey post hoc tests. Statistical analyses were performed using the R statistical environment (Crawley, 2012; R Development Fig. 2. Percentages of developing fruits (A) and seeds (B) (equivalent to ripe Core Team, 2016). fruit formation) of Myrcianthes coquimbensis, formed by each mode of re- production in Totoralillo and Juan Soldado. Percentages are relative to the total fl 3. Results number of owers per treatment (Totoralillo: 52; Juan Soldado: 60). Modes of reproduction: Control (C), outcrossing (O), selfing (S), autogamy (AS), aga- mospermy (A), and autonomous agamospermy (AA). Different lowercase letters 3.1. Reproductive modes show significant differences among treatments within a site (P < 0.05).

Developing M. coquimbensis fruits were formed by all modes of re- production assessed, including autonomous selfing and agamospermy. random factor (i.e., the individual plant) (Table 1). The only exception However, in both localities the number of developing fruits produced was for seed production in Juan Soldado, in which case the two models Δ differed among reproductive modes and individual plants (Table 1). In (full and reduced) were equally parsimonious ( AICc < 2). In both fl almost all cases, the best fit models, where those that considered the localities, control owers (i.e., those naturally pollinated; Fig. 2) pro- duced the highest number of developing fruits. When ripe, all experi- Table 1 mental fruits contained only one seed; therefore, the percentage of ripe Results from the generalized mixed models examining the effects of flower fruits is equivalent to the percentage of seeds formed. In Totoralillo, the treatments on the percentage of developing fruits and seeds. The effect of the highest percentage of seed production was via outcrossing, but it did random variable (the individual plant) was examined by comparing the full not differ significantly from the percentage of seeds produced by con- model (with the random variable) to the reduced model (without the random trol, self-compatible and autogamous treatments; less than 10 % of the variable) using differences in Akaike's Information Criteria. Values of flowers produced seeds via agamospermy. In Juan Soldado, only out- ΔAICc > 2 indicate a significant effect of the variance between plants. crossed and control flowers ultimately produced seeds, with a higher Subscripts in parentheses indicate the degrees of freedom. percentage of seed production resulting from the former (Fig. 2). Fruits Fixed factor Random factor formed by outcrossing had the lowest probability of abortion in both sites (Table 2). Floral treatments Individual plant The ISIfruits differed between study sites: in Totoralillo an ISIfruits =

2 0.9 coupled with non-significant differences in fruit production be- Response χ P AICc Reduced AICc Full ΔAICc variable model model tween the self-compatible and outcross treatments, reveals complete self-compatibility; in contrast, in Juan Soldado an ISIfruits = 0.7 coupled Developing with significant differences between the self-compatible and outcross fruits treatments, indicates only partial self-compatibility. In Totoralillo, Totoralillo (4) 11.8 0.01 (5) = 357.6 (6) = 351.8 5.7 ISI = 0.6 and was coupled with non-significant differences between Juan Soldado (5) 65.2 < 0.001 (6) = 466.1 (7) = 440.9 25.1 seeds Seeds the self-compatible and outcross treatments. The IASDfruits was equal to Totoralillo (4) 12.92 0.01 (5) = 254.4 (6) = 241.9 12.5 0.9 in both sites and, coupled with non-significant differences between Juan Soldado (1) 2.3 0.128 (2) = 110.8 (3) = 112.6 1.8 the self-compatible and autogamous treatments, indicates that selfing

4 P. García-Guzmán, et al. Flora 263 (2020) 151537

Table 2 via autonomous selfing and are similar to those of the Eugenia species Percentage of abortions of developing fruits recorded from each of the re- mentioned above (Proença and Gibbs, 1994; da Silva and Pinheiro, productive modes assessed in both localities. 2009). We caution, however, to interpret with care the autogamy ca- Fruit abortion (%) pacity of M. coquimbensis given by the IAS index (AS/S) because it may have been overestimated. This is because manual pollinations were Reproductive mode Totoralillo Juan Soldado conducted when stigma receptivity was not at its peak. Thus, fruit and seed production by manual selfing may have been under estimated, Control 67 84.3 Outcrossing 47 66 leading in turn to an overestimation of the IAS index. Selfing 66 100 Evidence of autonomous selfing in M. coquimbensis suggests that this Autogamy 68 100 species may ensure reproduction when outcross pollination fails; Agamospermy 82 100 however, three conditions must be met for this to occur (Lloyd, 1992). Autonomous agamospermy – 100 First, selfing should boost seed production when outcrossing fails (i.e., reproductive assurance) (Eckert and Herlihy, 2004). In this study, we were unable to estimate values of reproductive assurance (RA) because can be carried out autonomously within a flower. The IASRfruits had value of 0.8 and was also coupled with non-significant differences be- it is necessary to compare fruit or seed production from emasculated fl tween the self-compatible and autogamous treatments. open owers (which lack the capacity to autonomously self) to open flowers (Eckert et al., 2006, 2010). For M. coquimbensis, however, this method can lead to a biased estimation of RA because removing large 3.2. Timing of the sexual functions within a flower quantities of stamens from the flowers strongly reduces their attrac- tiveness to pollinators (especially those looking for pollen) (Eckert The flowers of M. coquimbensis had a mean lifespan of 9.3 ± 3 s.d. et al., 2010). Nonetheless, we can approximate a value of RA by com- days (N = 167; from the day a bud opened until the beginning of stage paring seed production by autonomous selfing to seed production in [4], when no stamens or petals remained. The majority of the anthers control flowers. In Totoralillo, the difference in seed production be- started to release pollen around the third day (stage [2]) and lasted tween these two treatments was only 8 % (being lower for autono- until approximately the sixth day (Table 3). mously selfed flowers). This suggests that autogamy may indeed boost The mean number of pollen tubes present per stigma (Fig. 3A) dif- seed production in a scenario where pollinators are absent. fered among flower stages and was better explained by the model that Second, progeny resulting from autogamy should have no or low included the random factor (Table 3). Stigmas in the bud [0] and de- inbreeding depression (ID) (Kalisz et al., 2004). Although we did not veloping flower [1] stages had a very low number of pollen tubes; these formally assess ID in this study, abortion of all the developing fruits increased in stage [2] and reached their maximum in stage [3] produced by both selfing treatments in Juan Soldado, and a lower (Fig. 4B). The percent of viable pollen (Fig. 3B) also differed among percentage (∼20 %) of aborted fruits resulting from outcrossing in days (Table 4); in general, pollen viability decreased as the days pro- comparison to selfing and natural pollination in Totoralillo, suggest that gressed, from a mean of 90 % of viable pollen on the first day to 24 % ID in M. coquimbensis may express itself during the seed development on the fourth day (Fig. 4B). These results reveal that during stage [2], stage. There are few reports of early-acting ID in Myrtaceae (Pound which lasted approximately four days (Table 3), there is a temporal et al., 2003; Gonzalez-Varo and Traveset, 2010), however, some studies coincidence of the sexual functions within a flower. Nonetheless, pistil suggest ID as a factor in the significant reduction of fruit and seed set in receptivity significantly increased once pollen viability began to decline this family (Kennington and James, 1997; Yates et al., 2007), which (stage [2]) and disappear from anthers (stage [3]). may partially result from the abortion of selfed fruits. Because angios- perms invest maternal resources into seed development following fer- 4. Discussion tilization (Obeso, 2002), and M. coquimbensis inhabits an extremely water- and nutrient-poor environment, it is also possible that ID is ex- Here we show that M. coquimbensis produces fruits and seeds by pressed as outcross embryos having a higher competitive ability for the multiple modes of reproduction, including modes that not require limited resources compared to self-produced ones (Korbecka et al., pollinators; seeds, however, are produced mainly by outcrossing. We 2002). also observed a partial segregation of sexual functions within the The third condition for RA by autonomous selfing is that it must fl ower, with the peak of pollen viability (male phase) occurring before occur when outcrossing is no longer possible (i.e., delayed selfing) the peak of stigma receptivity (female phase). (Kalisz et al., 1999), thus preventing ovule discounting (Lloyd and The high ISIfruits values reported here are comparable to those re- Schoen, 1992). For M. coquimbensis, we suspect that self-pollination ported in other Neotropical Myrtaceae (Lughadha and Proenca, 1996; may occur during stage [1] (Fig. 1B and C), when some dehiscent an- Arroyo and Humaña, 1999); likewise, ISIseeds values were similar to thers have contact with the slightly receptive stigma, and before all fl those of Eugenia unici ora (ISI = 0.4) and E. punicifolia (ISI = 0.6), a stamens are extended and anthers dehiscent. During stage [2] (when genus closely related to Myrcianthes (da Silva and Pinheiro, 2009). pollen is abundant), anther contact with the stigma is unlikely because Values of the IAS index suggest that M. coquimbensis can produce seeds of herkogamy and the probability of contact decreases even more in later stages because “old” stamens fall away from the pistil. Therefore, Table 3 autonomous selfing likely occurs prior to, or at most, parallel with, Mean ± standard deviation (std) of flower life span (days) and estimated day of outcrossing (i.e., prior and competing selfing, respectively), and not occurrence (from anthesis) of each flower stage of Myrcianthes coquimbensis (N after this period. Moreover, for delayed autonomous selfing to occur, = 167 flowers). flowers should exhibit incomplete protogyny (Goodwillie and Weber, Floral stages flower life span (days) Day of occurrence 2018). Nonetheless, considering jointly levels of pollen viability and stigma receptivity, the pattern of sexual functions within M. co- mean ± std. quimbensis’ flowers indicate incomplete protandry, which is the 0 –– 1 common form of dichogamy in the Myrtoideae subfamily (Lughadha 1 1.5 0.9 1 and Proenca, 1996). Consequently, unless outcross pollen has higher 2 3.7 1.4 3 growth rates than self-pollen in the style (i.e., pollen prepotency) (Lloyd 3 4.0 2.4 7 fi 4 –– 11 and Schoen, 1992), in M. coquimbensis autonomous sel ng probably results in ovule discounting (i.e., unavailable for cross‐fertilization). In

5 P. García-Guzmán, et al. Flora 263 (2020) 151537

Fig. 3. (A) Fluorescent germinated pollen with pollen tubes attached (indicated by the arrow), observed on the stigma of a flower of Myrcianthes coquimbensis (100X). (B) Viable (red) and non-viable pollen of M. coquimbensis (100X) (indicated by arrows). (For interpreta- tion of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web ver- sion of this article).

Our results suggest that facilitated selfing (Lloyd and Schoen, 1992) is an inevitable mode of selfing in M. coquimbensis. This is because in- complete protandry is unlikely to prevent pollinators from self-polli- nating flowers (Lloyd and Webb, 1986). Facilitative selfing can nega- tively impact seed production via ovule discounting and sexual interference (Owen et al., 2007). The incidence and intensity of ovule discounting due to facilitated selfing may be low if pollinators deposit a mix of outcross and self-pollen on the stigmas (Wilcock and Neiland, 2002). In this scenario, having multiple ovules within a flower, such as the case of M. coquimbensis (Landrum and Grifo, 1988), can increase the chances of outcross fecundation (Rosenheim et al., 2016). Because this species is self-compatible, sexual interference can occur when pollina- tors deposit low viability pollen grains (Wilcock and Neiland, 2002), which can occur on the final days of stage [2]. Sexual interference can also occur if viable self-pollen is deposited on self-incompatible plants (Galen et al., 1989). This scenario may occur in the Juan Soldado po- pulation where plants had the highest self-incompatibility levels. In either case, sexual interference can result in a clogged stigma, and ul- timately in the “loss” of a flower that would otherwise be available for outcross pollination (Barrett, 2002). The formation of fruits and seeds by autonomous agamospermy was an unexpected result in this study. In Myrtaceae, agamospermy has been reported in Syzygium jambos and S. cumini (Lughadha and Proenca, 1996) and in the genus Callistemon (Hojsgaard et al., 2014), however, in all these species, seeds were formed by adventitious embryony, a type of agamospermy that requires pollination (selfing or outcrossing) to form a sexual embryo, which develops in parallel to an asexual embryo (from somatic cells) (Whitton et al., 2008; but see Mangla et al., 2015). Hojsgaard et al. (2014) reported gametophytic agamospermy by apospory for the Syzygium species mentioned above, but no details are given on whether it is autonomous or pseudogamous (i.e., when pollen is needed to form the endosperm). In our study, 36 % of the flowers with their style removed produced developing fruits, thus we discard the possibility of accidental pollination of bagged fl owers. To our knowledge, this is the first study to provide empirical evidence of seed formation from autonomous agamospermy in Myrtaceae. Fig. 4. A) Number of pollen tubes observed in the stigma of flowers at different Reproductive assurance provided by agamospermy is not necessa- fi stages. B) Percentage of viable pollen observed throughout a stamens’ life span rily analogous to RA provided by sel ng, because autonomous aga- [stage 2] in a flower of Myrcianthes coquimbensis. There were significant dif- mospermy can occur in parallel with outcrossing at three different ferences in the number of pollen tubes among all the stages, and also in pollen scales: 1) at the population level, with populations composed only by viability for all days considered (P < 0.05). outcrossed or by obligate agamospermic individuals (Bierzychudek, 1990; Mráz et al., 2019); 2) at the individual level (within population), summary, even though autonomous selfing in this species may boost with plants being agamospermic or outcrossed (Mangla et al., 2015); 3) fl seed production, the costs imposed by this reproductive mode (ID and within individuals, with owers capable of reproducing by agamos- ovule discounting) suggest it does not ensure reproduction when out- permy and outcrossing (Whitton et al., 2008). In our study, we observed cross pollination fails. agamospermy alongside other reproductive modes within individuals,

6 P. García-Guzmán, et al. Flora 263 (2020) 151537

Table 4 Results from the generalized mixed model (GLMM) examining the effect of manual pollination on the number of pollen tubes and from the linear model (LM) examining the daily change in the percent of viable pollen. In the GLMM, the effect of the random variable was examined by comparing the full model (with the random variable) to the reduced model (without the random variable) using differences in Akaike's Information Criteria. Values of ΔAICc > 2 indicate a significant effect of the variance between plants. Subscripts in parentheses indicate the degrees of freedom.

Fixed factors Random factor

Manual pollination Days Individual plant

Response variable χ2 (GLMM) P F (LM) P AICc Reduced model AICc Full model ΔAICc

Pollen tubes (3) 243.58 < 0.001 ––(8) = 324.2 (9) = 319.6 4.6

Pollen viability –– (3, 64) 190.3 < 0.001 ––– however, the four plants that produced seeds by agamospermy, did so 2] and the Instituto de Ecología y Biodiversidad (IEB) [Project only via this reproductive mode (i.e., agamospermy at the individual CONICYT PIA support CCTE AFB170008]. PGG received a PhD level; see Table A.1 in the Appendix). Therefore, if sexual plants fail to Fellowship from CONICYT [21120854]. reproduce due pollinator scarcity, obligate and/or agamospermy fa- cultative plants may boost seed production (Mangla et al., 2015). Fi- Appendix A. Supplementary data nally, although agamospermy may provide RA in M. coquimbensis, fruit abortion was 35 % higher in fruits resulting from agamospermy relative Supplementary material related to this article can be found, in the to those resulting from outcrossing (Table 2). Abortion of agamos- online version, at doi:https://doi.org/10.1016/j.flora.2020.151537. permic fruits and seeds may result from the expression of deleterious mutations (Hojsgaard and Hörandl, 2015; Hodac et al., 2019). How- References ever, in agamospermy facultative species, such as M. coquimbensis, the mutation load should be low because mutations are purged during the Arancio, G., Muñoz, M., Squeo, F.A., 2001. Descripción de algunas especies con pro- development of the gametophyte (pre-fecundation) (Hodac et al., blemas de conservación en la IV región de Coquimbo, Chile. In: Squeo, F.A., Arancio, G., Gutierrez, J.R. (Eds.), Libro Rojo de Flora Nativa y de los Sitios Prioritarios para su 2019). Fruit abortions in our system likely result from resource lim- Conservación: Región de Coquimbo. Ediciones Universidad de La Serena: La Serena, itation because approximately a half of the plants that aborted devel- pp. 63–103. oping fruits from A and AA treatments, also aborted the developing Arroyo, M.T.K., Armesto, J.J., Primack, R.B., 1985. Community studies in pollination ecology in the high temperate Andes of central Chile II. Effect of temperature on fruits resulting from outcrossing (Totoralillo: 39 % A; Juan Soldado: 47 visitation rates and pollination possibilities. Plant Syst. Evol. 149, 187–203. % A, 50 % AA; see Tables A.1 and A.2 in the Appendix). Arroyo, M.T.K., Humaña, A.M., 1999. Breeding systems of two endemic rainforest species in Southern Chile: Amomyrtus meli (Phil.) Legr. et Kaus (Myrtaceae) y Luzuriaga polyphylla(Hook.) Macbr. (Phylesaceae). Gayana Bot. 56, 31–37. 5. Conclusions Barrett, S.C.H., 2002. Sexual interference of the floral kind. Heredity 88, 154–159. Barrett, S.C.H., 2003. Mating strategies in flowering plants: the outcrossing-selfing In this study we provide empirical evidence that M. coquimbensis can paradigm and beyond. Philos. Trans. R. Soc. L. B Biol Sci 358, 991–1004. fi reproduce via at least three reproductive modes. Selfing is almost un- Barrett, S.C.H., 2014. Evolution of mating systems: outcrossing versus sel ng. In: Losos, J. (Ed.), The Princeton Guide to Evolution. Princeton University Press, pp. 356–362. avoidable in this species, and very likely interferes with outcrossing. Bellanger, S., Guillemin, J.-P., Touzeau, S., Darmency, H., 2015. Variation of inbreeding Coupled with possible early inbreeding depression, selfing probably depression in Centaurea cyanus L., a self-incompatible species. Flora - Morphol. – results in a cost for seed production. Our results suppose a vulnerability Distrib. Funct. Ecol. Plants 212, 24 29. Bierzychudek, P., 1987. Pollinators increase the cost of sex by avoiding female flowers. of this endangered species in scenarios where pollinators are scarce. Ecology 68, 444–447. However, agamospermy may provide an alternative route of seed pro- Bierzychudek, P., 1990. Demographic consequences of sexuality and apomixis in duction in these scenarios, but given that seed production by this re- Antennaria. In: Kawano, S. (Ed.), Biological Approaches and Evolutionary Trends in Plants. Academic Press, London, pp. 293–307. productive mode was observed only in one site and in low frequency, Bolker, B.M., Brooks, M.E., Clark, C.J., Geange, S.W., Poulsen, J.R., Stevens, M.H.H., further studies should explore its incidence along M. coquimbensis dis- White, J.-S.S., 2009. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology tribution range and the fitness of the resulting seeds. and evolution. Trends Ecol. Evol. 24, 127–135. Burnham, K.P., Anderson, D.R., 2002. Model Selection and Multimodel Inference: a Practical Information-theoretic Approach. Springer-Verlag, New York. CRediT authorship contribution statement Busch, J.W., Schoen, D.J., 2008. The evolution of self-incompatibility when mates are limiting. Trends Plant Sci. 13, 128–136. Castro, S., Silveira, P., Navarro, L., 2008. How flower biology and breeding system affect Patricio García-Guzmán: Conceptualization, Methodology, Formal the reproductive success of the narrow endemic Polygala vayredae Costa analysis, Investigation, Writing - original draft, Visualization. Andrea (Polygalaceae). Bot. J. Linn. Soc. 157, 67–81. P. Loayza: Methodology, Writing - review & editing, Funding acquisi- CEAZAMET, 2019. Red de estaciones meteorológicas. Available URL:. http://www. ceazamet.cl/. tion. Francisco A. Squeo: Supervision. Cortés, F., 2010. Diversidad y estructura de las asociaciones planta-polinizador del sitio prioritario Punta Teatinos – Juan Soldado, región de Coquimbo. Universidad de La Declaration of Competing Interest Serena, Chile Unpublished Master Thesis. Crawley, M.J., 2012. The R Book. John Wiley & Sons Ltd, Chichester. da Silva, A.L.G., Pinheiro, M.C.B., 2009. Reproductive success of four species of Eugenia L. The authors declare that they have no known competing financial (Myrtaceae). Acta Bot. Brasilica 23, 526–534. interests or personal relationships that could have appeared to influ- Dafni, A., 1992. Pollination Ecology: a Practical Approach. Oxford University Press Inc, New York. ence the work reported in this paper. Dai, C., Galloway, L.F., 2011. Do dichogamy and herkogamy reduce sexual interference in a self-incompatible species? Funct. Ecol. 25, 271–278. Acknowledgments Davidson, J.B., Durham, S.L., Wolf, P.G., 2014. Breeding system of the threatened en- demic Primula cusickiana var. maguirei (Primulaceae). Plant Spec. Biol. 29, E55–E63. Eckert, C.G., Herlihy, C.R., 2004. Using a cost–benefit approach to understand the evo- We thank Danny Carvajal and Rodrigo Rios for their valuable lution of self-fertilization in plants: the perplexing case of Aquilegia canadensis comments on earlier versions of this manuscript. We also thank Paloma (Ranunculaceae). Plant Spec. Biol. 19, 159–173. fi Eckert, C.G., Samis, K.E., Dart, S., 2006. Reproductive assurance and the evolution of Gachón and Julio Caballero for helping with eld experiments, and uniparental reproduction in flowering plants. In: Harder, L.D., Barrett, S.C.H. (Eds.), Rodrigo Vasquez (CEAZA) who aided with the fluorescence microscope. The Ecology and Evolution of Flowers. Oxford University Press, Oxford, pp. 183–203. This work was supported by the Rufford Small Grant Foundation [9531- Eckert, C.G., Kalisz, S., Geber, M.A., Sargent, R., Elle, E., Cheptou, P.O., Goodwillie, C.,

7 P. García-Guzmán, et al. Flora 263 (2020) 151537

Johnston, M.O., Kelly, J.K., Moeller, D.A., Porcher, E., Ree, R.H., Vallejo-Marin, M., Germination, seedling performance, and root production after simulated partial seed Winn, A.A., 2010. Plant mating systems in a changing world. Trends Ecol. Evol. 25, predation of a threatened Atacama desert shrub. Rev. Chil. Hist. Nat. 88, 10. 35–43. Lughadha, E.N., Proenca, C., 1996. A survey of the reproductive biology of the Fausto Jr., J.A., Eckhart, V.M., Geber, M.A., 2001. Reproductive assurance and the evo- Myrtoideae (Myrtaceae). Ann. Mo. Bot. Gard. 83, 480–503. lutionary ecology of self-pollination in Clarkia xantiana (Onagraceae). Am. J. Bot. 88, Mangla, Y., Chaudhary, M., Gupta, H., Thakur, R., Goel, S., Raina, S.N., Tandon, R., 2015. 1794–1800. Facultative apomixis and development of fruit in a deciduous shrub with medicinal Fernandez, J.D., Bosch, J., Nieto-Ariza, B., Gomez, J.M., 2012. Pollen limitation in a and nutritional uses. AoB Plants 7, plv098. narrow endemic plant: geographical variation and driving factors. Oecologia 170, MINSEGPRES, 2008. Decreto supremo n° 50 de 2008. Aprueba y oficializa nómina para el 421–431. Segundo proceso de clasificación de especies según su estado de conservación. Galen, C., Gregory, T., Galloway, L.F., 1989. Costs of self-pollination in a self-in- Ministerio Secretaría General de la Presidencia de la República. Santiago. compatible plant, Polemonium viscosum. Am. J. Bot. 76, 1675–1680. Mitchell, R.J., Karron, J.D., Holmquist, K.G., Bell, J.M., 2004. The influence of Mimulus Galloway, L.F., Cirigliano, T., Gremski, K., 2002. The contribution of display size and ringens floral display size on pollinator visitation patterns. Funct. Ecol. 18, 116–124. dichogamy to potential geitonogamy in Campanula americana. Int. J. Plant Sci. 163, Mráz, P., Zdvořák, P., Hartmann, M., Štefánek, M., Chrtek, J., 2019. Can obligate apo- 133–139. mixis and more stable reproductive assurance explain the distributional successes of García-Guzman, P., Loayza, A.P., Carvajal, D.E., Letelier, L., Squeo, F.A., 2012. The asexual triploids in Hieracium alpinum (Asteraceae)? Plant Biol. 21, 227–236. ecology, distribution and conservation status of Myrcianthes coquimbensis: a globally Moreira, M.M., Miranda, A.S., Lima, H.A., 2017. Agarista revoluta (Ericaceae): a generalist endangered endemic shrub of the Chilean Coastal Desert. Plant Ecol. Divers. 5, plant with self-compatible and self-incompatible individuals. Flora 234, 7–14. 197–204. Neal, P.R., Anderson, G.J., 2005. Are “mating systems”“breeding systems” of inconsistent Gélvez-Zúñiga, I., Neves, A.C., Teixido, A.L., Fernandes, G.W., 2018. Reproductive and confusing terminology in plant reproductive biology? Or is it the other way biology and floral visitors of Collaea cipoensis (Fabaceae), an endemic shrub of the around? Plant Syst. Evol. 250, 173–185. rupestrian grasslands. Flora 238, 129–137. Obeso, J.R., 2002. The costs of reproduction in plants. New Phytol. 155, 321–348. Goodwillie, C., Kalisz, S., Eckert, C.G., 2005. The evolutionary enigma of mixed mating Owen, K., Vaughton, G., Ramsey, M., 2007. Facilitated autogamy and costs of selfing in systems in plants: occurrence, theoretical explanations, and empirical evidence. the perennial herb Bulbine bulbosa (Asphodelaceae). Int. J. Plant Sci. 168, 579–585. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 36, 47–79. Peña, M., 2016. Fenología reproductiva de Myrcianthes coquimbensis y su relación con los Goodwillie, C., Weber, J.J., 2018. The best of both worlds? A review of delayed selfing in patrones de, precipitación en todo su rango de distribución (Barrancones - Totoralillo, flowering plants. Am. J. Bot. 105, 641–655. Región de Coquimbo, Chile). Unpublished Licenciate Thesis. Universidad de La Gonzalez-Varo, J.P., Traveset, A., 2010. Among-individual variation in pollen limitation Serena. and inbreeding depression in a mixed-mating shrub. Ann. Bot. 106, 999–1008. Pérez, M.E., Meléndez-Ackerman, E.J., Monsegur-Rivera, O.A., 2018. Breeding system Herlihy, C.R., Eckert, C.G., 2002. Genetic cost of reproductive assurance in a self-ferti- and pollination of Gesneria pauciflora (Gesneriaceae), a threatened Caribbean species. lizing plant. Nature 416, 320–323. Flora 242, 8–15. Hiscock, S.J., McInnis, S.M., 2003. The diversity of self-incompatibility systems in flow- Picarella, M.E., Mazzucato, A., 2019. The occurrence of seedlessness in higher plants; ering plants. Plant Biol. 5, 23–32. insights on roles and mechanisms of parthenocarpy. Front. Plant Sci. 9, 11. Hodac, L., Klatt, S., Hojsgaard, D., Sharbel, T., Hörandl, E., 2019. A little bit of sex pre- Pound, L.M., Wallwork, M.A.B., Potts, B.M., Sedgley, M., 2003. Pollen tube growth and vents mutation accumulation even in apomictic polyploid plants. BMC Evol. Biol. 19. early ovule development following self- and cross-pollination in Eucalyptus nitens. Hojsgaard, D., Klatt, S., Baier, R., Carman, J.G., Hörandl, E., 2014. Taxonomy and bio- Sex. Plant Reprod. 16, 59–69. geography of apomixis in angiosperms and associated biodiversity characteristics. Proença, C.E.B., Gibbs, P.E., 1994. Reproductive biology of eight sympatric Myrtaceae Crit. Rev. Plant Sci. 33, 414–427. from Central Brazil. New Phytol. 126, 343–354. Hojsgaard, D., Hörandl, E., 2015. A little bit of sex matters for genome evolution in R Development Core Team, 2016. R: a Language and Environment for Statistical asexual plants. Front. Plant Sci. 6, 82. Computing, Version 3.13. R Foundation for Statistical Computing, Vienna. https:// Hörandl, E., Hojsgaard, D., 2012. The evolution of apomixis in angiosperms: a re- www.r-project.org/. appraisal. Plant Biosyst. 146, 681–693. Richards, A.J., 2003. Apomixis in flowering plants: an overview. Philos. Trans. R. Soc. Husband, B.C., Schemske, D.W., 1996. Evolution of the magnitude and timing of in- Lond. B Biol. Sci. 358, 1085–1093. breeding depression in plants. Evolution 50, 54–70. Richardson, M.L., Keathley, C.P., Peterson, C.L., 2016. Breeding system of the critically Johnson, S.D., Steiner, K.E., 2000. Generalization versus specialization in plant pollina- endangered Lakela’s Mint and influence of plant height on pollinators and seed tion systems. Trends Ecol. Evol. 15, 140–143. output. Popul. Ecol. 58, 277–284. Kalisz, S., Vogler, D., Fails, B., Finer, M., Shepard, E., Herman, T., Gonzales, R., 1999. The Rosenheim, J.A., Schreiber, S.J., Williams, N.M., 2016. Does an ‘oversupply’ of ovules mechanism of delayed selfing in Collinsia verna (Scrophulariaceae). Am. J. Bot. 86, cause pollen limitation? New Phytol. 210, 324–332. 1239–1247. Ruiz Zapata, T., Arroyo, M.T.K., 1978. Plant reproductive ecology of a secondary de- Kalisz, S., Vogler, D.W., 2003. Benefits of autonomous selfing under unpredictable pol- ciduous tropical forest in Venezuela. Biotropica 10, 221–230. linator environments. Ecology 84, 2928–2942. Shivanna, K.R., Tandon, R., 2014. Pollen–Pistil interaction. In: Shivanna, K.R., Tandon, R. Kalisz, S., Vogler, D.W., Hanley, K.M., 2004. Context-dependent autonomous self-fertili- (Eds.), Reproductive Ecology of Flowering Plants: A Manual. Springer, India, New zation yields reproductive assurance and mixed mating. Nature 430, 884–887. Delhi, pp. 97–105. Kearns, A., Inouye, D.W., 1993. Techniques for Pollination Biologists. University Press, Totland, Ö., 1994. Intraseasonal variation in pollination intensity and seed set in an al- Niwot. pine population of Ranunculus acris in southwestern Norway. Ecography 17, Kephart, S.R., Brown, E., Hall, J., 1999. Inbreeding depression and partial selfing: evo- 159–165. lutionary implications of mixed-mating in a coastal endemic, Silene douglasii var. Vieitez, E., 1952. Use of 2,3,5 - trifeniltetrazolium to determinate vitality of pollen. An. oraria (Caryophyllaceae). Heredity 82, 543–554. Edafol. y Fisiol. Veg. 11, 297–308. Kennington, W.J., James, S.H., 1997. The effect of small population size on the mating Vogler, D.W., Kalisz, S., 2001. Sex among the flowers: the distribution of plant mating system of a rare clonal mallee, Eucalyptus argutifolia (Myrtaceae). Heredity 78, systems. Evolution 55, 202–204. 252–260. Webb, C.J., Lloyd, D.G., 1986. The avoidance of interference between the presentation of Korbecka, G., Klinkhamer, P.G.L., Vrieling, K., 2002. Selective embryo abortion hy- pollen and stigmas in angiosperms II. Herkogamy. New Zeal. J. Bot. 24, 163–178. pothesis revisited - A molecular approach. Plant Biol. 4, 298–310. Whitton, J., Sears, C.J., Baack, E.J., Otto, S.P., 2008. The dynamic nature of apomixis in Landrum, L.R., Grifo, F.T., 1988. Myrcianthes (Myrtaceae) in Chile. Brittonia 40, 290–293. the angiosperms. Int. J. Plant Sci. 169, 169–182. Larson, B.M.H., Barrett, S.C.H., 2000. A comparative analysis of pollen limitation in Wilcock, C., Neiland, R., 2002. Pollination failure in plants: why it happens and when it flowering plants. Biol. J. Linn. Soc. 69, 503–520. matters. Trends Plant Sci. 7, 270–277. Lloyd, D.G., 1992. Self-fertilization and cross-fertilization in plants. II. The selection of Yates, C.J., Elliott, C., Byrne, M., Coates, D.J., Fairman, R., 2007. Seed production, ger- self-fertilization. Int. J. Plant Sci. 153, 370–380. minability and seedling growth for a bird-pollinated shrub in fragments of kwongan Lloyd, D.G., Schoen, D.J., 1992. Self-fertilization and cross-fertilization in plants. I. in south-west Australia. Biol. Conserv. 136, 306–314. Functional dimensions. Int. J. Plant Sci. 153, 358–369. Young, A.G., Broadhurst, L.M., Thrall, P.H., 2012. Non-additive effects of pollen limita- Lloyd, D.G., Webb, C.J., 1986. The avoidance of interference between the presentation of tion and self-incompatibility reduce plant reproductive success and population via- pollen and stigmas in angiosperms I. Dichogamy. New Zeal. J. Bot. 24, 135–162. bility. Ann. Bot. 109, 643–653. Loayza, A.P., Gachon, P.R., García-Guzmán, P., Carvajal, D.E., Squeo, F.A., 2015.

8

Capítulo 3: Limitación por polen en Myrcianthes coquimbensis y

su asociación con el ambiente de polinizadores.

26

3.1. Resumen

La limitación por polen ha sido históricamente reconocida como una de las principales causas del fallo reproductivo en las plantas. Dada la relevancia reproductiva, demográfica y evolutiva de la polinización biótica para las plantas, el estudio de la variación de la estructura comunitaria de los polinizadores es clave para entender las causas de la limitación por polen. Sin embargo, es necesario también considerar la influencia de las actividades humanas en el hábitat de plantas y polinizadores. Utilizando experimentos de suplementación por polen y observaciones de polinizadores, en este estudio se analizó la relación entre la limitación por polen con el ambiente de polinización en dos poblaciones de

Myrcianthes coquimbensis. Para ello, se compararon dos localidades con niveles de impacto antrópico contrastantes en diferentes momentos de la temporada. En ambas localidades, la producción de frutos/flores y de semillas/frutos fue mayor en flores polinizadas manualmente que en los controles; no obstante, este efecto no varió entre periodos de la temporada. La localidad con perturbaciones antrópicas presentó una menor riqueza de visitantes florales, así como cambios en las dominancias. En esta localidad, los niveles de limitación por polen se relacionaron negativamente con la riqueza de especies y positivamente con las tasas de visita del grupo funcional hormigas nativas; mientras que en la otra localidad, el grado de limitación por polen solo presentó una asociación lineal negativa con el grupo funcional de moscas. Se discuten los resultados en relación con los posibles mecanismos por los cuales los impactos de la urbanización pueden afectar el éxito reproductivo de esta especie a través del impacto en el ambiente de polinización. Estos hallazgos complementan la vulnerabilidad reproductiva de esta especie dado su sistema reproductivo y ponen de manifiesto la importancia de la conservación de su hábitat natural para evitar una futura extinción.

27

3.1. Introducción

La limitación en la producción de frutos y semillas debido a la falta de polen (de aquí en adelante limitación por polen), ha sido históricamente reconocida como una de las principales causantes del fracaso reproductivo en plantas (Stephenson 1981; Haig and

Westoby 1988; Burd 1994). Estudios recientes han mostrado que, en más del 60% de las especies analizadas (N=258-306 especies), la producción de semillas está limitada en algún grado por una inadecuada cantidad o calidad del polen depositado en los estigmas de las flores (Burd 1994; Knight et al. 2005) mientras que la reducción en la producción de semillas puede llegar en promedio hasta el 42% (revisado en Ashman et al. 2004). De esta forma resulta clave el entendimiento de las causas de la limitación por polen en las plantas.

La limitación por polen puede tener múltiples causas ecológicas, las que en su mayoría corresponden a perturbaciones ecológicas (naturales y antrópicas) que causan un fallo en el servicio de polinización biótica (Ashman et al. 2004; Knight et al. 2005; Gomez et al. 2010). En este sentido, se estima que la polinización biótica es necesaria para la producción de frutos y semillas en un 78 a 94% de todas las especies de angiospermas

(352.000 especies) (Ollerton et al. 2011). Más aún, un fallo en la polinización por biótica puede tener un efecto cascada que va más allá de la producción de semillas, pudiendo repercutir en la etapa de reclutamiento de plántulas y eventualmente en el crecimiento poblacional (Ward and Johnson 2005; Gomez et al. 2007). Por consiguiente, el entendimiento de las causas de la limitación por polen en las plantas pasa necesariamente por el estudiar la relación entre el ambiente de polinizadores y el grado de limitación polínica.

28

Tanto el éxito reproductivo de las plantas como la limitación por polen pueden responder a cambios producidos en el ambiente de polinizadores, concretamente en los componentes de la estructura comunitaria de los visitantes florales (potenciales polinizadores) (Moeller and Geber 2005; Gomez et al. 2010). Por lo general, las plantas son visitadas por múltiples especies de insectos o aves (Waser et al. 1996; Johnson and Steiner

2000) por lo que es posible observar relaciones positivas y negativas, entre la riqueza y diversidad relativa de las especies de visitantes florales, con el éxito reproductivo de las plantas y/o el grado de limitación por polen (Gomez et al. 2007; Hoehn et al. 2008;

Albrecht et al. 2012). No obstante, ya que las especies de visitantes florales difieren en su frecuencia de visita, también ha sido posible relacionar la variación en frecuencia de visita de especies de visitantes en particular (o grupos de estas), con el grado de limitación por polen. Por ejemplo, Koski et al. (2018) encontraron una relación lineal y positiva entre las tasas de visita de un grupo funcional de abejorros y la limitación por polen, pero también pudieron observar una relación negativa entre las tasas de visitas de un grupo funcional de abejas pequeñas (halíctidos) y la limitación por polen. La diversidad de relaciones observadas entre el ambiente de polinizadores y el grado de limitación polínica de las plantas, se debe en gran medida a la variación espacio-temporal de los componentes de comunidad de visitantes florales (Gomez et al. 2010; Fernandez et al. 2012).

En los ambientes naturales, la estructura comunitaria de los visitantes florales suele presentar una marcada variación espacio-temporal (Arroyo et al. 1982; Price et al. 2005;

Valverde et al. 2016). A escalas locales, las variaciones espaciales pueden estar causadas por: a) diferencias en las características del suelo (p.ej. granulometría, materia orgánica), que pueden traducirse a diferencias en la calidad y disponibilidad de sitios de nidificación para los insectos (Cane 1991; Li et al. 2011; Howell et al. 2017); b) diferencias en

29

variables ambientales como la temperatura y el viento (Arroyo et al. 1985; Lee and Kang

2018), las cuales también pueden generar cambios en el nivel de actividad y comportamiento de forrajeo de los insectos (Hennessy et al. 2020; Crall et al. 2020); y finalmente c) diferencias en la abundancia y composición de plantas, que pueden llevar a variaciones en el tipo, calidad y cantidad de las recompensas para los visitantes florales

(Vrdoljak et al. 2016). Por otra parte, a medida que la temporada de floración avanza, las tasas de visitas de los visitantes florales pueden aumentar o disminuir en respuesta a los patrones de floración de las especies de plantas dentro de la comunidad (Price et al. 2005;

Kehrberger and Holzschuh 2019) o más específicamente, a cambios en la disponibilidad de recompensas florales (Waser and Price 2016). Ya que la floración y las recompensas florales pueden responder a cambios en variables abióticas, como la disponibilidad de agua en el suelo, precipitaciones o temperatura (Phillips et al. 2018; Mueller et al. 2020), es de esperar que en ambientes extremos donde las variables abióticas tienen una gran importancia para la floración de las plantas (Vidiella et al. 1999), la estructura comunitaria de los visitantes florales presente una fuerte variación dentro de la temporada.

En ambientes extremos como los desiertos, las precipitaciones y la consecuente disponibilidad de agua en el suelo, pueden restringir el periodo de floración a una ventana de tiempo de unos pocos meses, con un término abrupto previo al periodo de sequía estival

(Vidiella et al. 1999). Por consiguiente, es de esperar que el periodo de actividad de los visitantes florales disminuya rápidamente hacia el final del periodo, aumentando en consecuencia, el grado de limitación por polen para las flores producidas al final de la temporada.

30

En las últimas décadas se ha visto como los hábitats naturales han experimentado una disminución y fragmentación debido a la creciente actividad humana, como la agricultura y la urbanización (Groom and Vynne 2006; McKinney 2006), lo cual supone nuevos factores que pueden alterar la estructura comunitaria de los visitantes florales

(Winfree et al. 2009; Harrison and Winfree 2015; Wenzel et al. 2020). Por ejemplo, se ha demostrado que la magnitud de superficie urbanizada (suelo impermeable) puede afectar la composición y frecuencia de visita de polinizadores (Ahrné et al. 2009; Burdine and

McCluney 2019; Hou et al. 2019); mientras que Gonzalez-Varo et al. (2009) encontraron que el tamaño de parches remanentes de hábitat natural, puede afectar la composición y frecuencia de visitas de determinadas especies. En estos nuevos escenarios de cambio global, al examinar la relación entre la estructura comunitaria de los visitantes florales con el grado de limitación polínica en las plantas (Donaldson et al. 2002; González-Varo et al.

2013; Brudvig et al. 2015), sería una forma de evaluar si es que el cambio global constituye una nueva amenaza para éxito reproductivo de las plantas.

Este estudio examina la presencia de limitación por polen del arbusto desértico

Myrcianthes coquimbensis (Myrtaceae) y su relación entre la estructura comunitaria de sus visitantes florales. Dos características de esta especie sugieren que podría presentar limitación por polen: a) en distintas poblaciones de esta especie, se ha observado un importante porcentaje de individuos presentando un fallo en la producción de frutos (Peña

2016); b) si bien esta especie es parcialmente auto-compatible, la producción de frutos y semillas se ve favorecida por la fecundación cruzada y además, la fecundación cruzada presentó un mejor éxito reproductivo frente a la polinización natural (García-Guzmán et al.

2020). Por otra parte, la limitación por polen podría estar asociada a la variación

31

espaciotemporal en algunos componentes de la estructura comunitaria de sus visitantes florales. Al respecto, algunas poblaciones de esta especie presentan degradación del hábitat natural debido a la creciente urbanización (MINSEGPRES 2008; Garcia-Guzman et al.

2012). Además, en este sistema, M. coquimbensis florece a finales de primavera y es una de las últimas especies en hacerlo dentro de la comunidad antes del periodo de sequía estival

(Cortés 2010; Peña 2016). Para determinar la limitación por polen y su posible asociación con componentes de la estructura comunitaria de sus visitantes florales se compararon dos sitios con contrastante intervención antrópica y dos periodos dentro de la temporada de floración (al inicio y final de esta).

Se hipotetiza que un fallo en la polinización biótica producido por las perturbaciones antrópicas y la floración tardía, limita la producción de frutos y semillas en Myrcianthes coquimbensis. Esta hipótesis asume que la diversidad y frecuencia de visita de los polinizadores será más pobre tanto en ambientes perturbados que prístinos, así como también, al final del periodo de floración. Por otra parte se predice de la hipótesis que a) en las plantas presentes en el sitio perturbado se observará una relación negativa más intensa, entre la diversidad y frecuencia de visita de los polinizadores con su grado de limitación por polen, respecto de plantas presentes en el sitio no perturbado; b) en las plantas que florecen al final de la temporada, se observará una relación negativa más intensa, entre la diversidad y frecuencia de visita de los polinizadores con su grado de limitación por polen, respecto de plantas que florecen al inicio.

32

3.2. Materiales y Métodos

3.3.1. Especie de estudio Myrcianthes coquimbensis Landrum & Grifo (Myrtaceae) es un arbusto siempreverde. Florece desde Octubre a Febrero, con el máximo de floración entre

Noviembre y Diciembre (Peña 2016). Las flores se disponen en inflorescencias con pedúnculos uniflorales o triflorales que se forman únicamente en ramas con crecimiento de la temporada (de aquí en adelante, ramillas) (Figura 3.1).

Figura 3.1: Ramilla de Myrcianthes coquimbensis correspondiente a crecimiento de la temporada con botones florales, delimitada con corchete rojo.

Sus flores son hermafroditas y compuestas por una corola con cinco pétalos de color blanco más un pistilo rodeado de más de 50 estambres (Landrum and Grifo 1988; Arancio et al. 2001). M. coquimbensis es parcialmente auto-compatible y sus flores exhiben

33

protandría incompleta. La duración de las flores (desde antesis hasta caída de todos los estambres y pétalos) es de aproximadamente nueve días y el polen está disponible desde el tercer hasta el sexto día (García-Guzmán et al. 2020). El néctar es visualmente escaso en las flores abiertas y sólo se puede visualizar cuando se acumula en flores dentro de mallas de exclusión; no obstante, es difícil de colectar debido a su consistencia viscosa. Basado en la observación de forrajeo de los insectos visitantes, éste está disponible desde el cuarto al noveno día (P. García, observaciones personales).

3.3.2. Área de estudio Este estudio se llevó a cabo en las localidades de El Panul (29°59’ S – 71°22’ O) y

Juan Soldado (29°39′S - 71°18′W), ubicadas en el sur y centro de la distribución de M. coquimbensis respectivamente. La localidad de El Panul corresponde a una explanada costera, donde M. coquimbensis crece directamente en el suelo o asociado a pequeños roqueríos. Esta localidad se encuentra casi totalmente intervenida por parcelaciones de 0.5 ha y caminos de tierra. Por lo general, los terrenos con casas o edificaciones menores han sido previamente nivelados (Figura 3.2a) y la vegetación natural fue reemplazada por vegetación ornamental y/o huertos (Figura 3.2b). En esta localidad, M. coquimbensis se encuentra en terrenos sin construcciones (Figura 3.2c). La vegetación natural remanente está compuesta principalmente por Heliotropium stenophyllum, Ophryosporus triangularis,

Eulychnia breviflora, Fuchsia lycioides y Oxalis gigantea. De éstas, sólo las dos últimas tenían individuos en floración mientras M. coquimbensis estaba en flor. El Panul registra una precipitación promedio de 78 ± 55mm (2003-2019); sin embargo, en la temporada

2014 sólo se registraron 17,4 mm (estación EL Panul; CEAZAMET 2020).

34

La localidad de Juan Soldado corresponde a una quebrada que nace en la cordillera de costa hasta el borde costero (Figura 3.2d). Aquí M. coquimbensis es un de las especies dominantes y crece tanto en las laderas rocosas, como en los fondos de quebrada, asociada también a pequeños roqueríos (Figura 3.2e). Entre las especies de plantas acompañantes más abundantes están Heliotropium stenophyllum, Ophryosporus triangularis, Lobelia excelsa,

Fuchsia lycioides, Oxalis gigantea, Senecio planiflorus, Bahia ambrosioides y Cestrum parqui. Entre éstas, L. excelsa, F. lycioides y O. gigantea tenían individuos con flor junto a

M. coquimbensis. En comparación con El Panul, esta quebrada presenta muy poco impacto antrópico; sólo se encuentran algunos árboles frutales y de Eucaliptus globulus en el acceso a la quebrada. Si bien, existen zonas con evidencias de presencia de ganado caprino en temporadas anteriores, durante el periodo de estudio no se observó ganado. Juan Soldado registra una precipitación promedio de 57 ± 55 mm (2003-2019) y en la temporada 2014 se registraron 43,2 mm (CEAZAMET 2020).

a)

35

b)

c)

36

d)

e)

Figura 3.2: Aspecto general del área de estudio: a) destrucción de hábitat por nivelación de suelos en El Panul b) viviendas en El Panul con flora alóctona c) Myrcianthes coquimbensis en zonas intervenidas de El Panul d) aspecto general de la quebrada Juan Soldado y d) el crecimiento de M. coquimbensis en las laderas bajas y fondos.

37

3.3.3. Experimento de limitación por polen Para examinar si la producción de frutos y semillas en M. coquimbensis se encuentra limitada por la disponibilidad de polen cruzado, se compararon los frutos producidos por flores (%Fr) y el número de semillas por frutos (SFr) producidos por polinizaciones manuales (P), con aquellos producidos en flores polinizadas naturalmente

(C). Debido a que diferencias en estos porcentajes pueden resultar también de la redistribución de recursos desde flores controles a flores suplementadas (Wesselingh 2007), se midió el %Fr y SFr en flores polinizadas naturalmente en plantas diferentes (control externo, CE). Se consideró evidencia de limitación por polen en %Fr y SFr, si estos indicadores de éxito reproductivo eran mayores en P que en C y CE, y si además, C no difería de CE (Wesselingh 2007; Gomez et al. 2010; Fernandez et al. 2012).

Antes del periodo de floración, se seleccionaron en cada sitio, plantas con abundantes botones florales y en cada una se marcaron dos ramas; una con botones florales en estado fenológico avanzado para el periodo de “Inicio” y la otra con botones en estado fenológico temprano para el periodo “Final” (ver definición de los periodos abajo). En cada rama se seleccionaron a su vez dos ramillas en las cuales se encontraban los botones florales (Figura 3.1). De forma aleatoria, una de las ramillas fue asignada P y la otra C.

Para los CE, se realizó el mismo procedimiento de selección y marcaje de ramillas, pero en plantas diferentes. Todos los botones presentes en ramillas distintas a las seleccionadas para

C, P y CE fueron eliminados en ambas ramas. En todas las flores correspondientes a P, se suministró polen durante las fase floral 2 (Figura 1 (García-Guzmán et al. 2020)), saturando los estigmas con polen procedente de tres plantas ubicadas a al menos 10 m de la planta focal. Los experimentos de suplementación de polen correspondientes al periodo de inicio en El Panul se realizaron entre el 25 de noviembre y 2 de diciembre de 2014, mientras que

38

los correspondientes al segundo periodo, se realizaron entre el 15 y 19 de diciembre de

2014. En Juan Soldado, los experimentos correspondientes al primer periodo se llevaron entre el 30 de diciembre del 2014 y el 16 de enero de 2015, mientras que los del segundo periodo se llevaron a cabo entre el 2 y 11 de febrero. Para C y P, se seleccionaron 15 plantas en El Panul y 16 en Juan Soldado; mientras que para CE se seleccionaron 11 y 16 plantas en El Panul y Juan Soldado, respectivamente.

A medida que los frutos producidos a partir de los experimentos fueron madurando

(abril a junio 2015), éstos eran recolectados y llevados al laboratorio para contar el número de semillas por fruto. Con los resultados de %Fr y SFr se calculó un índice de limitación por polen (LP) como: LP= 1- (C / P) (Eckert et al. 2010). Este índice va de -1 a 1, donde valores positivos indican un mayor éxito reproductivo en las flores suplementadas y por lo tanto limitación por polen, mientras valores de cero o negativos indican la ausencia de limitación polínica.

3.3.4. Observaciones de polinizadores Se realizaron observaciones de polinizadores en ambas localidades y durante los dos periodos considerados para la limitación por polen (ver arriba). Las observaciones fueron realizadas mediante grabaciones de video con cámaras GoPro Hero3. Éstas se instalaron a una distancia de aproximadamente 30 cm de un grupo flores, que incluyó a las ramas seleccionadas para limitación polínica (ver arriba). Las grabaciones comenzaron cada día una vez disipada la neblina costera. Generalmente, en El Panul se realizaron entre las 11:00 y 16:00 horas, mientras que, en Juan Soldado, entre las 13:00 y 17:00 horas. En cada día de observación se registró la temperatura del aire aproximadamente a 1.5 m sobre el suelo. Los valores se muestran a continuación:

39

Tabla 3.1: Temperatura promedio del aire y desviación estándar (ds) registrados diariamente en las observaciones de visitantes florales, para cada sitio y periodo. N: Número de registros

(días).

Sitio Periodo Tª ± ds N

Inicio 15.2 0.3 6 El Panul Final 15.5 0.2 5

Inicio 16.4 0.3 9 Juan Soldado Final 16.5 0.4 9

Las grabaciones fueron revisarlas en laboratorio; para cada video (correspondiente a la filmación de una cámara en una planta determinada) se registró: el total de flores abiertas, la identidad de cada visitante floral y el número total de visitas realizadas. A partir de estos datos, se calculó una frecuencia de visita para cada especie de visitante como:

(número de flores visitadas/número de flores) / duración en minutos del video. La duración de los videos varió de 2 a 4 hr según la memoria de las cámaras. Finalmente, durante y después del periodo de grabación de los videos se realizaron capturas de visitantes florales

(insectos). Los insectos capturados fueron montados e identificados siguiendo las identificaciones hechas por (Cortés 2010) y también apoyadas en (González et al. 2017).

3.3.5. Análisis estadísticos Se ajustaron modelos lineales generalizados mixtos (GLMM) para evaluar los efectos de la polinización (P, C y CE), el sitio (Panul-Juan Soldado, periodo (Inicio-Final) y sus interacciones sobre %Fr y SFr. El GLMM para %Fr utilizó una distribución de errores binomial (éxitos y fallos) con función de unión logística, mientras que para SFr, se utilizó una distribución de errores gamma. Las plantas y el periodo se definieron como factores

40

aleatorios (interceptos). La inferencia de los factores e interacciones (factores fijo) se evaluó con un test de cociente de verosimilitud (LRT), utilizando reducciones de un término a la vez, hasta llegar al modelo mínimo adecuado (Bolker et al. 2009; Crawley

2012). La comparación entre los niveles del factor polinización se llevó a cabo mediante un test de Tukey. Para evaluar si la inclusión de factores aleatorios en los modelos fue relevante, se compararon los modelos mínimos adecuados con y sin los factores aleatorios

(modelo completo y modelo simple respectivamente) mediante el criterio de información de Akaike corregido (AICc). Los factores aleatorios fueron considerados relevantes, si en el modelo completo (con factores aleatorios) presentó un AICc menor al modelo simple

(GLM sin factores aleatorios), y si la diferencia (ΔAICc) entre estos fue mayor a 2

(Burnham and Anderson 2002).

Para evaluar el efecto del sitio, periodo y su interacción sobre la frecuencia de visita total de los visitantes florales, se ajustó un modelo lineal mixto (LMM). Los datos de frecuencia de visita fueron previamente transformados con raíz cuadrada para cumplir con supuesto de homocedasticidad. Se consideraron las tasas de visitas por observación

(archivo de video), y dado que algunas de estas provenían de la misma planta, se utilizó como factor aleatorio a las observaciones anidadas en las plantas. Tal como se describió arriba, la inferencia de los factores fijos se evaluó con un LRT, mientras que el apoyo del modelo con el factor aleatorio se evaluó utilizando ΔAICc. Por otra parte, las diferencias entre sitios y periodos para la riqueza de especies de visitantes florales se analizaron comparando curvas de acumulación de especies. Las curvas de riqueza de especies fueron construidas mediante rarefacción basada en muestras y extrapolación, con sus respectivos intervalos de confianza (95%) y utilizando métodos analíticos sin re-muestreo (Colwell et al. 2004, 2012). La extrapolación se realizó hasta el número más alto de unidades

41

muestréales observadas entre ambos sitios y periodos. Todos estos análisis fueron llevados a cabo utilizando el programa EstimateS 9.1 (Colwell 2013). También se calculó la diversidad relativa de Shannon (H’) con las tasas de visita de cada morfoespecie para cada sitio/periodo.

La relación entre el ambiente de polinización y la limitación por polen se evaluó en cada sitio ajustando modelos de regresión lineal entre los valores, por planta, de índices de

LP para %Fr y S/Fr (variables dependientes) y los valores observados, por planta, de la estructura comunitaria de los visitantes florales (variables independientes; tasas de visita general, S, H’, tasas de visitas por sp.). Dado que la mayoría las morfo-especies no fueron observadas consistentemente en todas las plantas de M .coquimbensis, sus tasas de visitas se promediaron en grupos, tomando en cuenta la similitud taxonómica, tamaño y comportamiento de forrajeo observado en los videos (de aquí en adelante “grupos funcionales”). Para los modelos se consideraron las tasas de visitas de los grupos funcionales más importantes en términos de su frecuencia de visita relativa. Con estos grupos funcionales seleccionados más tasas de visita general, S y H’ se construyeron modelos para cada variable de forma independiente y también modelos con dos variables, compuestos estos de las tasas de visita de grupos funcionales. Para evitar multicolinealidad en los modelos de dos variables

(Harrison et al. 2018), estos constaron solo de variables no correlacionadas entre ellas

(correlación de Pearson) (Anexo 3.1). Tomando en cuenta el %Fr y SFr y un total de seis variables independientes en El Panul y ocho en Juan Soldado, se crearon seis modelos de una variable y tres con dos variables en El Panul, mientras que en Juan Soldado ocho y diez respectivamente (Anexo 3.2).

Dado que en más de un modelo se observaron efectos significativos de variables independientes, se realizó una selección de estos modelos basado en la Teoría de la

42

Información, utilizando el criterio de información de Akaike corregido (AICc). El o los modelos con mayor soporte fueron aquellos con un ΔAICc menor a dos (Burnham and

Anderson 2002). Todos los análisis, excepto curvas de acumulación de especies, fueron realizados en el programa estadístico R statistical environment (R Development Core

Team, 2014).

3.3. Resultados

Se observó un aumento significativo en las %Fr y SFr resultantes de las polinizaciones manuales; en promedio, las polinizaciones manuales aumentaron, respecto de las flores controles, al doble el %Fr y cuatro veces el SFr, (Tabla 3.2;Figura 3.3). Este aumento fue independiente del Sitio y Periodo ya que ninguna de las interacciones fue significativa (Tabla 3.2). Por otra parte, se observaron leves diferencias significativas entre

C y CE para %Fr (dif. 5.2%) pero no para SFr (Figura 3.3). En conjunto, estos resultados indican que la producción de frutos y semillas en Myrcianthes coquimbensis fue limitada por la disponibilidad de polen (Tabla 3.3), aunque el aumento en %Fr estaría también por una reasignación de recursos desde C a P. Finalmente, los modelos mínimos adecuados

GLMM, presentaron un mayor soporte que sus contrapartes sin factor aleatorio (Anexo

3.3), lo cual indica que los resultados anteriores toman en cuenta la variación significativa de %Fr y SFr entre las plantas y entre los periodos.

Las tasas de visita presentaron diferencias significativas entre los dos sitios; en el sitio con presencia de intervención antrópica (El Panul), las tasas de visitas fueron en promedio un 30% más altas que en el sitio sin intervenciones (Juan Soldado) (Figura 3.4).

Por el contrario, las tasas de vistas no mostraron diferencias significativas entre los dos

43

periodos ni tampoco en la interacción Sitio x Periodo. A diferencia de lo observado con las tasas de visita, la riqueza de especies y la diversidad relativa (H’) fue mayor en Juan

Soldado respecto de El Panul (Figura 3.5 y Tabla 3.5 respectivamente). La riqueza de visitantes florales no varió entre los dos periodos en ninguno de los sitios. En total se registraron 27 morfoespecies de visitantes florales, 21 de ellas se agruparon en seis grupos funcionales (Tabla 3.6). En El Panul, la mayor parte de las visitas por flor (>80%) fueron llevadas a cabo por el grupo hormigas nativas, mientras que en Juan Soldado 50% fueron hechas por el grupo moscas (50%) (Figura 3.6).

La relación entre la limitación por polen para %Fr y SFr, se evaluó considerando un total de seis variables independientes en El Panul y ocho en Juan Soldado. Con estas variables se crearon seis modelos de una variable y tres con dos variables en El Panul, mientras que en Juan Soldado, ocho y diez respectivamente (). De estos modelos, dos en cada sitio presentaron variables dependientes significativas (Tabla 3.7). Finalmente, tras la comparación de estos modelos con AICc, los modelos con mayor soporte estadísticos indicaron: Para el sitio El Panul el grado de limitación por polen se asoció de forma positiva a las tasas de visita del grupo hormigas nativas; mientras que en el sitio Juan

Soldado, el grado de limitación por polen se asoció de forma negativa con las tasas de visita de avispas (Tabla 3.7;Anexo 3.2).

44

Tabla 3.2: Resultados obtenidos de modelos lineales generalizados mixtos ajustados para examinar el efecto de la polinización manual, sitio e interacciones el porcentaje de frutos producidos (%Fr) y número de semillas por fruto (SFr) en Myrcianthes coquimbensis. Valores en negrita indican efectos significativos a una probabilidad menor que 0,05.

%Fr SFr

Factores LR P LR P

Sitio 2,3 0,1 1,7 0,2

Polinización 50,4 < 0,001 46,9 < 0,001 Periodo 3,5 0,06 0,2 0,6 Polinización*Sitio 5,7 7,1 3,1 0,4 Polinización*Periodo 1,2 0,8 3,4 0,3 Polinización*Sitio*Periodo 5.6 0,2 1,2 0,9

Tabla 3.3: Valores promedios ± desviación estándar de índices de limitación por polen para Myrcianthes coquimbensis. Se presentan valores para el sitio con intervención antrópicas (El Panul) y el sitio sin intervenciones (Juan Soldado).

LP

Éxito reproductivo El Panul Juan Soldado

%Fr 0,63 ± 0,24 0,35 ± 0,42

SFr 0,29 ± 0,34 0,11 ± 0,27

45

Figura 3.3: Porcentaje de frutos formados por flores y número de semillas por frutos resultantes de polinizaciones manuales (P) y naturales (C, CE1 y CE2) en Myrcianthes coquimbensis. Letras minúsculas diferentes indican diferencias significativas entre los diferentes niveles de tratamiento (p<0.05).

46

Tabla 3.4: Resultados de Modelo lineal mixto para evaluar los efectos de Sitio, Periodo y su interacción sobre las tasas de visitas totales de visitantes florales de Myrcianthes coquimbensis.

Valores en negrita indican efectos significativos a una probabilidad menor que 0.05.

Factores LR P

Sitio 15,6 0,01

Periodo 2,4 0,09

Sitio * Periodo 0,12 0,7

Figura 3.4: Promedio ± error estándar de tasas de visita totales observadas en el sitio con intervenciones antrópicas (El Panul) y en el sitio sin intervenciones (Juan Soldado). Letras diferentes indican diferencias significativas.

47

Tabla 3.5: Promedio ± desviación estándar de la Diversidad relativa de Shannon (H’) estimada para los sitios y periodos. Se indica el número de plantas (N) a partir del cual se calculó el promedio y desviación.

Sitio Periodo N H' Inicio 15 1 ± 0,5 El Panul Final 15 0,7 ± 0,5 Inicio 18 1,9 ± 0,4 Juan Soldado Final 16 2,2 ± 0,1

48

Tabla 3.6: Visitantes florales de Myrcianthes coquimbensis registrados en los sitios de estudio durante dos periodos de observación (temporada floración 2014-2015). Se muestra el promedio de las tasas de visitas (visitas/flor/hora) ± deviación estándar para cada morfoespecie, también se indica el grupo funcional asignado para los análisis de regresión (ver texto).

El Panul Juan Soldado Inicio Final Inicio Final Grupo funcional Morfoespecie ± σ ± σ ± σ ± σ Insecta Coleoptera Cleridae Epiclines sp. 0.46 0.21 0.55 0.18 Diptera Calliphoridae Moscas Chrysomyia albiceps 0.94 1.02 2.21 2.43 Moscas Lucilia sp. 1.98 4.18 0.86 0.81 1.81 2.82 1.96 2.29 Sarcophagidae Moscas Sarcophaga sp. 1.02 0.97 0.48 0.43 0.76 0.60 Muscidae Moscas Musca domestica 0.86 1.71 0.57 0.46 1.09 1.69 0.63 0.56 Chamaemyiidae Moscas pequeñas Chamaemyiidae sp.1 0.73 0.86 0.50 0.39 0.39 0.39 0.32 0.33 Syrphidae Moscas florícolas Allograpta sp. 0.21 0.09 0.47 Moscas florícolas Copestylum scutellatum 0.66 0.38 0.60 0.52 Moscas florícolas Eristalis sp. 1.40 1.76 0.63 1.09 Moscas florícolas Villa sp. 0.86 0.41 0.80 0.50 Bombyillidae Moscas florícolas Lyophlaeba consobrina 0.78 0.12 0.56 0.27 Nemestrinidae Moscas florícolas Hirmoneura sp. 0.11 0.01 Acroceridae Moscas pequeñas Megalybus sp. 0.09 0.05 Hymenoptera Apidae Apis mellifera 1.34 0.68 Bombus terrestris 0.64 0.37 0.35 0.19 Halictidae Abejas nativas Caenohalictus pupurisus 0.27 0.24 0.27 0.74 0.89 Abejas nativas Corynura chloris 0.58 0.66 0.68 0.96 0.83

49

Abejas nativas Lasioglossum sp. 0.65 0.58 1.26 0.65 0.50 0.29 1.03 1.53

Colletidae Abejas nativas Leioproctus sp. 0.86 0.71 0.79 0.32 Formicidae Hormigas nativas Camponotus morosus 3.91 9.13 4.48 6.29 1.03 1.35 0.75 0.55 Hormigas nativas Dorymyrmex sp. 0.63 0.66 0.24 0.18 Linepithema humile 0.67 0.84 0.59 0.49 Vespidae Avispas Polistes sp. 0.95 0.12 1.14 0.71 2.69 1.87 Pompillidae Avispas Pepsis limbata 0.25 0.05 Avispas Pompilldae sp.1 0.45 0.06 Lepidoptera Nymphalidae Cosmosatyrus chilensis 0.29 0.19 0.84 0.96

Aves Apodiformes Trochilidae Sephanoides sephanoides 1.48 0.86

50

Figura 3.5: Curvas de acumulación de especies de visitantes florales de Myrcianthes coquimbensis, observados en a) El Panul y b) Juan Soldado. Líneas continuas indican promedios de riqueza de especies observadas mientras que líneas discontinuas indican promedios de riqueza estimada por extrapolación. Áreas alrededor de las líneas indican intervalos de confianza (95%). Líneas rojas y áreas rosadas corresponden al periodo de inicio, mientras que líneas azules y áreas celeste corresponde a periodo final en ambos sitios.

51

Figura 3.6: Frecuencia de visita (visitas /flores) relativa (%) por cada grupo funcional y especie en Myrcianthes coquimbensis. Observadas en el sitio con intervenciones antrópicas (EL Panul) y sin intervenciones (Juan Soldado), en ambos periodos de la temporada (I: inicio; F: Final).

52

Tabla 3.7: Resumen de resultados de selección de modelos (AICc, ΔAICc y wi), construidos para explicar la variación de limitación por polen para la producción de frutos por flores (PL %Fr) y para el número de semillas por fruto (PL SFr) en Myrcianthes coquimbensis. Para cada variable dependiente se presentan sus respectivos resultados de regresión lineal.

Variable Coeficiente Error Sitio de Factor t-student Pr (>|t|) AICc ΔAIC wi de regresión estándar Respuesta H -0.334 0.150 -2.224 0.04 6.5 0.9 El PL SFr tv_hormigas 5.8 Panul nativas + tv 0.047 0.020 2.262 0.04 1.7 0.05 moscas chicas tv_abejas + 0.133 0.064 2.07 0.05 -21.74 0.98 Juan tv_moscas PL %Fr 8 Soldado tv_abejas + 0.118 0.051 2.281 0.04 -31.07 0.01 tv_avispas

53

3.4. Discusión

La producción de frutos y semillas en Myrcianthes coquimbensis fue claramente limitada por la disponibilidad de polen; no obstante, los niveles de la limitación fueron similares entre el sitio con y sin presencia de intervención antrópica, así como también entre ambos periodos analizados, inicio y final de la temporada. Esto fue contrario a lo esperado, en especial para los sitios, ya que estos presentan claras diferencias en el grado de intervención y como mostró este estudio, también presentaron diferencias en la riqueza y composición de especies de visitantes florales. Por lo tanto, el grado de limitación por polen observado podría tener una explicación independiente del ambiente de polinizadores, como una estrategia de “bet-hedging” en respuesta a un servicio de polinización altamente variable. Esta estrategia consiste en la presencia de flores con múltiples óvulos, lo cual les permite a las plantas (individuos) sacar partido de la variación en la deposición de polen entre las flores, donde la mayoría presenta cargas bajas de polen y solo unas pocas una carga elevada; de esta forma, la planta asegura la fecundación a costo de perder

óvulos en las flores sin polinizar (Burd 1994, 1995). Esta hipótesis tiene dos premisas: la primera es una polinización variable entre las flores de un individuo; si bien esta información no se encuentra descrita para M. coquimbensis, las raras ocasiones donde se han encontrado frutos con más de una semillas por fruto (25% de los frutos analizados en este estudio) podría ser un indicativo de una polinización variable; por otra parte, la polinización variable es un fenómeno común en plantas con una alto número de flores y alta longevidad de esta (Burd et al. 2009), como es el caso de esta especie (García-Guzmán et al. 2020). Segundo, un aumento en el número de semillas no debiese elevar los costos de “empaquetamiento” de estas (los frutos), por lo que idealmente esto se cumple en especies con frutos secos; si bien M. coquimbensis es una especie con frutos carnosos, una gran parte de la biomasa del fruto corresponde a las semillas y un aumento de en el número de semillas no necesariamente aumenta el tamaño del fruto, ya que se

54

ha observado que cuando estos tienen más de una semilla, las semillas extras son de menor tamaño (ver capítulo 4). Adicionalmente, las semillas pequeñas tienen una chance de reclutar, si es que en años secos, son transportadas a microhábitats entre rocas (Loayza et al. 2020). De este modo, futuros estudios debiesen examinar esta hipótesis

Tras examinar la estructura comunitaria de los visitantes florales en los dos sitios con y sin presencia de perturbación antrópica, se pudieron observar diferencias marcadas entre estos.

Como era de esperar en el sitio sin intervenciones antrópicas, se observó una mayor riqueza de visitantes florales y una mayor diversidad relativa, respecto del sitio con intervenciones. Ya que en este estudio no se replicaron los sitios (con y sin intervención), los resultados anteriores podrían explicarse por diferencias idiosincráticas entre diferentes sitios y no necesariamente por la presencia de intervención antrópica en uno de ellos; sin embargo, Cortés (2010) observó en una localidad sin intervenciones antrópicas (Punta Teatinos), valores de riqueza y diversidad relativa (S=17; H’= 2.5) similares al sitio sin intervenciones en este estudio, lo cual sugiere que la reducción en S y H’ podría ser resultado de la intervención antrópica.

Los resultados de las tasas de visita totales fueron en contra de lo esperado ya que el sitio con intervenciones presentó en promedio una mayor tasa de visita total. Sin embargo, la contribución relativa de las tasas de visitas correspondió principalmente al grupo de hormigas nativas (que, a su vez, estuvo compuesto principalmente por la especie Camponotus morosus. No existen estudios acerca de esta especie que puedan asociar su abundancia relativa con la presencia de intervención antrópica. Por otra parte, basándose en su dieta omnívora, la que incluye además de néctar de flores, restos vegetales e insectos (Grez et al. 1986; Cerpa et al. 2015; Cepeda-

Pizarro et al. 2018), es posible sugerir que las bajas precipitaciones observadas en el sector y ese año en particular (17mm 2014 v/s 80mm, año normal) (CEAZAMET 2020), hayan reducido la disponibilidad de restos vegetales e insectos, como suele ocurrir en años secos en estos sistemas

55

(Holmgren et al. 2001), provocando una preferencia por parte de esta especie hacia las flores de

M. coquimbensis. Por otra parte, la dominancia del grupo de hormigas contrastó con la baja dominancia de grupos como los de abejas nativas (principalmente hálícidos), como importantes polinizadores. Esto coincide con lo observado en otros estudios donde la urbanización influye negativamente en su abundancia de halíctidos, debido a la destrucción de zonas de nidificación en el suelo (Cane 2015; Wilson and Jamieson 2019). De este modo, las diferencias entre los sitios, respecto a la estructura comunitaria de los visitantes florales, podría deberse a un efecto negativo sobre ciertos grupos (abejas nativas) pero también a condiciones ambientales de los sitios que pudiesen favorecer a otros (hormigas nativas).

Al contrario de las diferencias observadas entre los sitios de estudio respecto del ambiente de polinizadores, no se observaron diferencia entre los dos periodos analizados. Particularmente se esperaba menores tasas de visitas y diversidad de los polinizadores hacia el periodo final, aduciendo a una disminución de los recursos florales. Sin embargo, aunque cantidad de flores totales no fue medida en las plantas, no se observó tampoco una disminución en el número de flores de las ramillas para de los experimentos florales (GLM LRT=0.8; P=0.3) y el promedio de flores presentes en las observaciones de visitantes florales, fueron solo levemente menores en el periodo final (23 v/s 20; GLM LRT=139.9, P<0.001). Por otra parte, el ambiente de polinizadores disminuya hacia al final del periodo de floración en la comunidad, como M. coquimbensis casi la única especie en floración y dado la cantidad de flores presentada por cada individuo, es posible que las visitas de los insectos se concentren en esta especie, no pudiendo detectar una disminución en el ambiente de polinizadores. Futuros estudios en este sentido debiesen realizar por separado mediciones directas de la abundancia de los polinizadores en los sitios y mediciones de las visitas las especies de planta particulares.

56

A pesar de no variar la limitación por polen entre sitios, fue posible encontrar asociaciones entre la limitación por polen y las tasas de visita de algunos grupos. En el sitio con presencia de intervenciones (El Panul), mientras más visitadas fueron las flores por el grupo de hormigas nativas, más limitada por polen resultó la producción de frutos. Esto sugiere una baja efectividad de polinización por parte de este grupo; al respecto Chacoff and Aschero (2014) encontraron que hormigas del grupo Camponotus, a pesar de poseer una alta frecuencia de visita, tuvieron una baja efectividad de polinización y consecuentemente una baja producción frutos. La baja efectividad de polinización de las hormigas hace más probable que este grupo genere una interacción antagonista ya sea como ladrones de néctar (Galen and Butchart 2003; Valdivia et al.

2018), o afectando las visitas de otras especies mediante competencia por recursos o competencia por interferencia. Mientras tanto en el sitio sin intervenciones también se observó un efecto negativo de las visitas, en este caso del grupo avispas y abejas nativas, cuya actividad aumentó la limitación por polen en la producción de semillas. Esto contrasta con otros estudios donde las avispas del género Polistes tienen un efecto positivo sobre la producción de semillas (Coombs et al. 2009; Hallett et al. 2017). Una posible explicación es que las avispas contribuyan a la autopolinización de las flores debido a su manipulación y tamaño relativo al de las flores. El efecto positivo sobre la limitación por polen tanto de las visitas de los grupos de hormigas y avispas hacen necesario examinar la efectividad por visita de las especies de visitantes florales dominantes (en términos de tasas de visitas).

3.5. Conclusión

La producción de frutos y semillas de Myrcianthes coquimbensis puede ser limitada por la disponibilidad de polen cruzado; sin embargo, ya que esta no varió entre los sitios y periodos analizados, no es posible asociarla a una variación en el ambiente de polinizadores. Por otra

57

parte, las diferencias entre sitios en componentes comunitarios del ambiente de polinizadores sugieren una posible respuesta negativa de este ante la intervención humana. Futuros estudios debiesen examinar causas a la limitación por polen independientes del contexto de polinizadores, como una estrategia de bet hedging frente a una polinización variable.

58

3.6. Anexos

Anexo 3.1: Coeficientes de correlación de Pearson y valores de probabilidad

(inmediatamente abajo) entre variables candidatas a ser consideradas como

independientes en modelos de regresión para limitación por polen. En cada sitio se

presentan dos grupos de variables. Se indican en negrita los valores significativos de

coeficientes de correlación (t-test p<0.05).

El Panul (N = 15)

Moscas Abejas Hormigas Moscas Avispas pequeñas nativas Hormigas 1 0.77 -0.17 -0.02 -0.10 p= 0.00 0.54 0.94 0.72 Moscas 1 0.35 0.34 -0.10 p= 0.20 0.22 0.71 Moscas pequeñas 1 0.69 -0.19 p= 0.01 0.51 Abejas nativas 1 -0.14 p= 0.62 Avispas 1

Juan Soldado (N=18)

Moscas Abejas Moscas Hormigas Moscas Avispas pequeñas nativas florícolas Hormigas 1 0.47 0.23 0.18 0.48 0.29 p = 0.05 0.35 0.48 0.05 0.25 Moscas 1 0.80 0.74 0.67 0.65 p = 0.00 0.00 0.00 0.00 Moscas pequeñas 1 0.69 0.71 0.42 p = 0.00 0.00 0.86 Abejas nativas 1 0.57 0.83 p = 0.01 0.00 Avispas 1 0.30 p = 1.00 Moscas florícolas 1

59

Anexo 3.2: Resultados de regresiones lineales generales entre las variables de limitación por polen (dependientes) y variables independientes seleccionadas para ambos sitios. Se indican los coeficientes de regresión para cada variable independiente. Valores en negrita indican p<0.05. (S:

Riqueza especies; TV: Tasas de visitas; H’: Diversidad relativa).

El Panul

Variable independiente Variable tv tv moscas Error Modelo S tv H tv moscas t Student p Dependiente hormigas chicas estándar 1 -0.013 0.036 -0.348 0.73

2 0.022 0.038 0.574 0.57

3 -0.051 0.122 -0.415 0.68 4 0.008 0.022 0.350 0.73 5 0.097 0.096 1.011 0.33 %Fr 6 0.196 0.345 0.567 0.58 0.175 0.210 0.833 0.42 7 -0.018 0.043 -0.425 0.68 0.088 0.103 0.854 0.41 8 0.117 0.362 0.323 0.75 0.240 0.357 0.672 0.52 9 0.016 0.021 0.751 0.47

60

Variable tv tv moscas Error Modelo S TV H tv moscas t Student P Dependiente hormigas chicas estándar 10 -0.027 0.014 -1.855 0.09 11 0.026 0.015 1.664 0.12 12 -0,103 0,046 -2,222 0,04 SFr 13 0.012 0.009 1.293 0.21 14 0.057 0.036 1.578 0.14 15 -0.068 0.139 -0.496 0.63 -0.046 0.071 -0.647 0.53 16 0.024 0.015 1.640 0.13 SFr 0.066 0.038 1.773 0.11 17 -0.129 0.132 -0.978 0.35 0,047 0,020 2,262 0,04 18 -0,111 0,352 -0,317 0,75

61

Juan Soldado Variable independiente tv Var. tv moscas tv Error Modelo S TV H’ moscas tv_abejas tv_moscas t Student P Dep. pequeñas avispas estándar florícolas 1 -0.009 0.008 -1.091 0.29 2 0.047 0.059 0.806 0.43 3 -0.102 0.092 -1.111 0.29 4 -0.062 0.076 -0.816 0.42 5 0.144 0.153 0.935 0.36 6 -0.064 0.083 -0.767 0.455 7 0.049 0.054 0.907 0.38 8 0.082 0.053 1.559 0.15 -0,198 0,099 -2,005 0,06 9 %Fr 0,133 0,064 2,073 0,05 -0,125 0,090 -1,387 0,19 10 0,118 0,051 2,281 0,04

0.107 0.060 1.769 0.10 11 -0.148 0.086 -1.719 0.11 0.025 0.060 0.306 0.76 12 0.089 0.239 0.373 0.71 0.022 0.076 0.297 0.77 13 0.067 0.074 0.910 0.38 14 0.195 0.158 1.232 0.24

62

-0.089 0.078 -1.146 0.27 0.169 0.209 0.812 0.44 15 0.040 0.068 0.685 0.51 0.342 0.179 1.909 0.08 16 -0.174 0.096 -1.823 0.09 0.092 0.053 1.746 0.11 17 -0.085 0.077 -1.112 0.29 -0.128 0.137 -0.205 0.84 18 -0.042 0.126 -0.333 0.75

tv Var. tv moscas tv Error Modelo S TV H’ moscas tv_abejas tv_moscas t Student P Dep. pequeñas avispas estándar florícolas 1 -0.0001 0.006 -0.027 0.98 2 -0.058 0.040 -1.462 0.17 3 0.027 0.067 0.400 0.70 4 -0.04 0.054 -0.742 0.47 5 -0.106 0.109 -0.979 0.34 6 -0.022 0.060 -0.374 0.71 SFr 7 -0.054 0.036 -1.498 0.17 8 -0.025 0.035 -0.731 0.48 -0.056 0.045 -1.232 0.24 9 0.004 0.065 0.069 0.94 -0.060 0.056 -1.067 0.31 10 0.023 0.162 0.142 0.89 -0.044 0.048 -0.927 0.37 11 0.003 0.047 0.082 0.94

63

-0.078 0.048 -1.614 0.13 12 0.057 0.075 0.765 0.46 -0.090 0.116 -0.776 0.45 13 -0.027 0.057 -0.481 0.64 -0.104 0.138 -0.753 0.47 14 -0.003 0.045 -0.085 0.93 -0.128 0.141 -0.906 0.38 15 0.019 0.075 0.255 0.80 -0.026 0.036 -0.695 0.50 16 0.002 0.053 0.051 0.96 0.030 0.097 0.309 0.76 17 -0.061 0.090 -0.690 0.50 0.036 0.064 0.556 0.59 18 -0.035 0.040 -0.883 0.40

64

Anexo 3.3: Resultados de los contrastes de AICc entre modelos completos (modelo con factor aleatorio) y modelos simples (modelo sin factor

aleatorio), observados para los modelos que examinaron: a) el efecto de Sitio y polinización sobre el porcentaje de frutos (%Fr) por flores y

semillas por fruto (SFr), b) el efecto de sitio y periodo sobre tasas de visita totales. Los valores de ΔAICc representan diferencias entre los

modelos completos y simples. El modelo completo fue soportado si presentó menor AIC y un ΔAICc mayor a 2. En negrita se indica a) un

efecto significativo de la varianza entre las plantas y entre periodos y para b) un efecto significativo de la varianza de las observaciones dentro

de las plantas. Subíndices entre paréntesis indican grados de libertad de los modelos. a)

Variable de respuesta AICc modelo completo AICc modelo simple ΔAICc

%Fr (7) = 829.3 (5) = 844.6 15.5

SFr (8) = -274.4 (6) = -270.9 3.8 b)

Variable de respuesta AICc modelo completo AICc modelo simple ΔAICc

Tasas de visita (6) = 2094.6 (4) = 2334.9 240.2

65

Capítulo 4: Depresión por endogamia temprana y su dependencia

con la disponibilidad de agua en Myrcianthes coquimbensis.

66

4.1. Abstract

Inbreeding depression and resource scarcity are recognized as two causes of reproductive failure in plants; however, their influence can often extend beyond the seed production stage, affecting seed and seedling vigor. Because both factors act during the seed development stage, they can interact and have synergistic effects on seed production, especially in resource limited environments such as deserts. In this study, we assess the conjunct effect of resource and inbreeding depression on seed production and early seedling performance of Myrcianthes coquimbensis. We carried out field experiments to examine the effect of pollen source (outcross-self) and water availability on seed production in M. coquimbensis plants. High seed production resulted from outcrossing than for selfing, and seed mass were higher in outcross- produced than in self-produced seeds; surprisingly, this difference was higher in plants with high water availability. On the other hand, we found no evidence of inbreeding depression at seedling stage, but some performance traits, varied positively with the seed size. Overall, our results suggest that seed production by selfing, result in high cost for this species even in conditions of high-water availability.

67

4.2. Introduction

Inbreeding depression and resource scarcity have been historically recognized as two causes for reproductive failure in plants (Stephenson 1981; Wiens et al. 1987; Charlesworth

1989). Their negative effects on plant reproduction begin after fecundation, when typically cause reductions in the number seeds and in their final size (Husband and Schemske 1996; Naito et al.

2005; Wesselingh 2007; Ida et al. 2013). However, the reproductive failure caused by inbreeding depression and resource availability, can often extend beyond the seed production stage, affecting seedling vigor (Brown and Kephart 1999; Baskin and Baskin 2015) and ultimately, plant population dynamics (Luijten et al. 2002; Ramula et al. 2007). For threatened species, such effects can be particularly harmful as they lead to declines in population size and further increase their vulnerability (Brook et al. 2002; Nielsen et al. 2007; Hill et al. 2008). Furthermore, these effects may be even more negative for threatened species that occur in extreme environments such as deserts, where plant growth and reproduction are strongly limited due to resource scarcity

(Schwinning and Sala 2004; Pol et al. 2010; Peña 2016).

Inbreeding depression and resource scarcity can have similar consequences to fruit and seed production. If inbreeding depression is caused by lethal mutations (Hokanson and Hancock

2000; Charlesworth and Willis 2009) can lead to a higher abortion rate of self-embryos (Kephart et al. 1999; Hokanson and Hancock 2000) and ultimately to a smaller brood size of self-produced fruits, relative to outcrossed ones (Severns 2003; Gonzalez-Varo and Traveset 2010).On the other hand, if inbreeding depression results from the expression of only partially deleterious mutations, can manifested as smaller self-seeds in comparison to those produced by outcrossing (Vaughton and Ramsey 1997; Severns 2003; Naito et al. 2005). Similarly, when resources are scarce, the incidence of fruit and seed abortions in higher (Shi et al. 2005; Yang et al. 2005; Pearse et al.

2016; Chen and Zhao 2017) and seed size is reduced (Drenovsky and Richards 2005; Breen and

68

Richards 2008). Due to both inbreeding depression and resource availability have similar effects on fruit and seed production, they can exert synergistic effects. In this sense, studies that have simultaneously manipulated both pollen source (outcross and self-pollen) and resources, have found higher rates of seed abortion and lower seed-set in self-pollinated flowers than in outcrossed ones, but only in plants with diminished resources (Martin and Lee 1993; Eckert and

Herlihy 2004; Ida et al. 2013) (but see Shi et al. 2005). Hence, to fully understand the impact of inbreeding depression on the reproductive output of plants it is important to simultaneously consider resource availability (Breen and Richards 2008).

The negative effects of both inbreeding depression and resource availability on seed production, can also have cascading effects to the successive stages such as, seedling development stage; moreover, these effects can be direct or indirect (Husband and Schemske

1996). For example, inbreeding depression can directly reduce the germination rates of selfed seeds relative to outcross ones (reviewed in Baskin and Baskin 2015), as well as reducing the relative growth rates (RGR) of self-produced seedlings, relative the outcrossed ones (Gonzalez-

Varo and Traveset 2010). On the other hand, a deficient provision maternal resources to developing seeds can indirectly impact the seedling performance, via reducing the seed size; in turn, seedlings from small seeds grow more slowly and have lower survival rates than those from large ones (Moles and Westoby 2006; Benard and Toft 2007, 2008). Therefore, by considering the effects of inbreeding depression and resource availability on seed and seedling development, is possible to gain a better understanding of how these factors can impact the fitness of plants.

To assess how the effect of inbreeding depression in the early life stages of plants can be modulated by resource availability, studies should be conducted in species living in resource- poor environments such as deserts. In deserts, water is the most limiting resource and can

69 strongly impact fruit production (Pol et al. 2010). Water scarcity can affect the fruit and seed production in different ways. First, can directly interfere with the fruit expansion phase and cause fruit abortions and fruit size reductions (Mpelasoka et al. 2001; Akhalkatsi and Lösch 2005;

Matthews and Shackel 2005; Ghassemi-Golezani et al. 2009). Additionally, water scarcity can indirectly reduce final seed size via genetic signaling on maternal and zygotic tissues of seeds (Lv et al. 2019) and also indirectly, by decreasing the photosynthetic activity and the carbon assimilation rates (Chaves et al. 2002; Flexas and Medrano 2002); ultimately, both mechanisms affect the allocation of photoassimilates to seeds (seed filling phase) (Akhalkatsi and Lösch

2005). In this way, due to its multiple roles in the fruit and seed development stage, water is a key factor for the reproductive success of desert plants.

In this study, we first assessed the joint effects of inbreeding depression and water availability on fruit and seed production of Myrcianthes coquimbensis (Myrtaceae) and then, joint effects of inbreeding depression and seed size on early seedling performance. M coquimbensis is a threatened shrub of the Atacama Desert, Chile. This is a self-compatible species that produces fleshy fruits with recalcitrant (i.e., desiccations-sensitive) seeds (Loayza et al. 2015). In contrast to orthodox seeds (i.e., desiccation-tolerant), recalcitrant seeds do not undergo a desiccation period and remain connected to the mother plant until abscission thus, they are highly dependent on the physiological condition of the mother plant (Berjak and Pammenter 2013). In M. coquimbensis, fruits produced by selfing have higher abortion rates, than those produced by outcrossing (García-Guzmán et al. 2020), which suggests a degree of inbreeding depression.

Moreover, fruit abortion is also more frequently observed in dry years (Peña 2016), suggesting an influence of water availability on fruit and seed production. Thus, we hypothesized that if the joint action of inbreeding depression and water availability affect the fruit and seed production in

M. coquimbensis, then, fruits and seeds resulting from self-pollinated flowers should exhibit a

70 higher failure than fruits and seeds from outcross-pollinated flowers, but the strength of these effects will depend on the amount of water available the mother plants. We also hypothesized that if joint action of inbreeding depression and water availability is expressed during seedling stage, the performance of seedlings should increase with their initial seed size, but the strength of this effect should be lower in seedlings produced by selfing than seedlings produced via outcrossing.

4.3. Materials and Methods

4.3.1. Study species Myrcianthes coquimbensis (Myrtaceae) (Barnéoud) Landrum & Grifo is an endangered, evergreen shrub endemic to southern edge of the Atacama Desert (Chile), where it grows along a coastal fringe of <100 km2 (Garcia-Guzman et al. 2012). The growing season of M. coquimbensis starts after the first winter rains (June or July) and extends through October. Flowering occurs between October and February, with a peak in November (Peña 2016); floral buds form only on the current year's shoots. Fruits and seeds can be produced via self-pollination, however, most of the fruit/seed set results from outcrossing (García-Guzmán et al. 2020). Fruits are fleshy drupes that develop over eight months and typically bear only one recalcitrant seed (Loayza et al. 2015).

4.3.2. Study site We conducted this study during the 2015-2016 growing season at El Panul (29°59’ S –

71°22’ O), located in the southern edge of M. coquimbensis’ distribution (Garcia-Guzman et al.

2012). This locality is influenced by a Mediterranean climate with rains typically falling between

May and August. Annual rainfall is 86 mm ± 55 (2004-2019; mean ± sd), but 2015 was a particularly wet year due to an El Niño event, and reached120 mm of accumulated rainfall.

Nonetheless, this corresponded to winter rainfall, and no precipitation was recorded during M. coquimbensis’ flowering period. Annual temperature at the study site is 14°C ± 2.2 (2004-2019;

71 mean ± sd) (CEAZAMET 2020). The vegetation is dominated by a shrub formation and in this particular area, M. coquimbensis is distributed in parches but not necessarily associated to a rocky formations, as occurs in their main coastal habitat (Garcia-Guzman et al. 2012).

4.3.3. Irrigation field experiments To assess the effect of water availability on fruit and seed production of M. coquimbensis, in March 2015 we selected 20 similar-sized adult plants that evidenced having been reproductive in past seasons (indicated by the presence of dried flowers or fruits). Ten plants were randomly assigned to an irrigation treatment and the other 10 to a control group. Plants in the irrigation group received four water pulses (P) before the onset of the growing season (2015): May 1 (P1),

June 1 (P2), September 1 (P3) and 22 (P4) (Figure 4.1). The last pulse was administered before an unusual 20 mm rainfall event that occurred at the end of September. In each pulse, we applied

30 L of water to a 1 m2 area under each shrub, which is equivalent to 30 mm of rainfall. Control plants received only natural rainfall. By December 2015, plants in the irrigation treatment had received an equivalent of 250 mm water, while control plants received an accumulated of 120 mm.

To determine if irrigations affected the physiological response of experimental plants, we compared predawn stem water potential (pdWP) before and after the application of each pulse

(measurement timing). These comparisons were made in ten watered plants and in ten control plants. Specifically, pdWP was measured in an apical branch before daybreak (i.e., between 04:00 and 05:00 h) two days before and two days after applying the four water pulses. Individual branches were placed in sealed Whirl-Pak® bags, stored in a cooler with ice and taken to the laboratory where pdWP was measured using a Scholander pressure chamber.

72

Figure 4.1: Monthly (bars) and accumulated (dashed line) rainfall observed during 2015 at El

Panul. Arrows indicate the months when irrigation treatments were applied to Myrcianthes coquimbensis plants.

4.3.4. Controlled pollination experiments To assess the effect of pollen source on fruit and seed production, we conducted controlled hand-pollinations using self and outcross-pollen. Early in December 2015, we marked two to four branches from each of the 20 plants used in the irrigation experiments. Within each branch, we selected two adjacent yearly shoots and counted all their floral buds; all buds from other shoots within the branch were removed. The selected shoots were then randomly assigned to one of two manual pollination treatments: outcross pollination (O) or self-pollination (S). For these experiments, all floral buds that were about to open were emasculated and individually

73 covered with mesh bags (mesh size 0.3 mm) to prevent insect visits. For the outcross pollination treatment (O), emasculated buds were hand-pollinated with pollen from plants at least 10 m away, whereas, for the selfing treatment (S), we used pollen from the same plant. Hand pollinations were carried out during two consecutive days after emasculation to ensure stigma receptivity (García-Guzmán et al. 2020). After being manually pollinated, buds were again covered with mesh bags. Because plant size can influence fruit and seed production (Cheplick

2005), we estimated the size of all plants by calculating their volume (m3) as a semi-sphere; plant volume did not differ between control and watered plants (F1,18=0.002; P=0.96).

4.3.5. Seed and fruit production Four weeks after the pollination experiments, developing fruits could be visually differentiated from unfecundated flowers. At this time, we began recording, on a monthly basis, the number of developing and ripe fruits in each shoot until March 2016. We then calculated three fruit transition percentages for each shoot: 1) developing fruit per flower ratio (T1), 2) ripe fruit per developing fruit ratio (T2) and 3) ripe fruit to flower ratio (Fset). From May 2016 to

October 2016, we harvested all ripe fruits and recorded fresh weight, number of seeds and individual seed mass (g) for each fruit. We calculated brood size per plant by dividing the total number of seeds by the total number of fruits.

4.3.6. Seedling performance To examine if inbreeding depression is expressed during the seedling stage, we sowed all resulting seeds from the irrigation-pollination experiments as they became available (the sowing period extended from May 2016 to October 2016). Seeds were sowed in plastic pots filled with soil from the study site, which were placed in a shaded greenhouse and administered ad libitum water. Pollen source (outcrossing or selfing), mass, the identity of mother plant and sowing date was recorded for every seed. Pots were monitored daily for emergence. We calculated the

74 percentage of germinated seeds from each pollination treatment, the proportion of emerged seedlings relative to the number of germinated seeds and the percentage of seedlings that survived for at least one month relative to the number of emerged seedlings. A month after the last seedling had emerged (March 2017), we recorded seedling height (from the soil to the base of last leaf) and leaf number. We also calculated emergence time (i.e., number of days between the sowing date and seedling emergence) and two measures of relative growth rate, height, and leaf number, by dividing final seedling height and number of leaves, respectively by the number of days since emergence. During these experiments, we recorded mean daily air temperature experienced by each seed and seedling from the day it was sown until the day when seedling traits were measured (March 2017) (CEAZAMET 2020).

4.3.7. Statistical analyses We fitted a linear mixed model (LMM) to assess the effects of measurement timing

(Before - After) on pdWP, independently for control and watered plants. We included individual plants and pulse dates as two random intercept factors.

We assessed the effects of the irrigation, pollen source and its interaction on a) the three fruit transitions (proportions), by fitting generalized linear mixed models (GLMMs) with binomial error distributions and a logit link function; b) seed mass and brood size by fitting

LMMs. For the fruit transitions models, we included branches and plants as intercept random factors, with branches nested within plants. For the seed mass and brood size models, we include plants as intercept random factors. Plant size (m3) was used as a covariable in all these models.

To assess the effects of seed size, pollen source and its interaction on a) germination, emergence (proportions) and seedling survival (incidences), we fitted GLMMs with binomial

75 error distributions and a logit link function; b) for emergence time, leaves/day and height/day, we fitted LMMs. The environmental temperature experience by each sowed seed and emerged seedling (see details above) was used as covariable in these models. Also, in these models, plants were included as intercept random factors.

We assessed significance of the fixed factors with an F-test in the LMM models and in all

GLMM models, with Likelihood ratio tests (LRT, χ2), using single term deletions in the pairwise comparisons (Bolker et al. 2009; Crawley 2012). Because the LMM models compared with LR tests had different fixed factors, we used Maximum likelihood (ML) in these models. To assess the significance of the random factor (i.e., individual plants, individual plant/branch/pollen source), we used the corrected Akaike's Information Criteria (AICc) to compare the full model

(with the random variable) with a reduced model in which the random variable was removed. The random factor was considered relevant when the full model had a lower AICc than the reduced model and ΔAICc>2 (Burnham and Anderson 2002).Statistical analyses were performed using the using lme4, and car packages in the R statistical environment (R Development Core Team

2020).

4.3.8. Inbreeding depression We quantified the magnitude of ID in M. coquimbensis by calculating an index of relative performance (RP) for all pre- and post-dispersal traits:

RP = (Wo – Ws) / Wmax

Where, Ws and Wo represent the mean trait values of the progeny (seeds or seedlings) produced by self- and outcross-pollen respectively, and Wmax corresponds to the larger of two values. The values of RP are equidistant from zero and range from -1 (maximum selfing performance) to 1 (maximum outcrossing performance). This index is analogous to classical δ index, but it is more suitable when fitness values from selfing are higher than from outcrossing

76 ones (Barringer and Geber 2008; Baskin and Baskin 2015). The RP index was calculated for seed production and seedling performance results.

4.4. Results

The pdWP decreased on average by a third in watered plants (F1,72 = 43.6; P < 0.001, taking into account the effects of the variances between plants and between periods,

ΔAICc=165.9) (Figure 4.2). The pdWP measured before and after irrigations on control plants showed no significant differences (F1,71 = 0.28; P = 0.6; ΔAICc=174.5).

77

Figure 4.2: Means ± standard errors of predawn stem Water Potential (pdWP) measure in watered and control plants, two days before (whiter bars) and two days after (gray bars) the irrigations were applied to watered plants of Myrcianthes coquimbensis. Significant differences of pdWP were observed between before and after the irrigations in watered plants.

When controlling for plant size, T1 was significantly affected by pollen source (Table

4.1); of the flowers pollinated with outcross- and self-pollen, 79% ± 20 and 72% ± 30, respectively became developing fruits. On the other hand, the ratio of developing fruit that became ripe fruits (T2) was affected by the interaction between irrigation and pollen source

(Table 4.1); in watered plants, T2 was higher by a 33% in fruits resulted from outcrossing than from self-pollination (Figure 4.3). Similarly, Fset in watered plants from outcrossed pollination, was higher by 29 % than Fset from selfing (Figure 4.3). Brood size was not affected by any of the factors assessed (Table 4.1).

Mean brood size was 1.2 ± 0.3 for both outcross and for self-pollinated flowers; while 1.2

± 0.3 and 1.3 ± 0.3 for control and watered plants, respectively; of the 135 fruits collected, only

25% had more than one seed (N=174 total seeds). Fruit and seed size were highly correlated (r

=0.87, P =5.6-10), therefore we show results only for seed mass. Seed mass ranged between 0.02

- 3.1g, with 80% of seeds weighing < 1 g (Appendix 4.1). The interaction of irrigation and pollen source significantly affected seed mass (Table 4.1); in watered plants, outcrossed seeds were approximately 300 mg heavier than selfed ones (Figure 4.4). For all seed production response variables, the best fit models were those that considered a random factor (i.e., variation among pollination treatments within branches and within plants) (Appendix 4.2).

78

Table 4.1: Results from the generalized linear mixed models examining the effects of irrigation, pollen source (outcrossing vs. selfing) and plant size (m3) on seed production response variables of Myrcianthes coquimbensis. Fruit transition percentages: T1: Flower to developing fruit; T2: Developing fruit to ripe fruit; Fset: Flower to ripe fruit. Values in bold indicate significant effects at the 0.05 level.

Seed production response T1 T2 Fset Brood Size Seed mass (g) variables

Factors LR P LR P LR P LR P LR P

Irrigation 0.4 0.5 1.4 0.2 1.8 0.2 0.1 0.7 0.4 0.5

Pollen source 6.8 0.009 63.4 < 0.001 80.7 < 0.001 0.7 0.4 0.006 0.9

Irrigation * Pollen source 3.5 0.06 4.4 0.03 5.4 0.01 3.3 0.07 4.2 0.04

Plant Size 7.1 0.007 1.0 0.3 0.2 0.7 0.1 0.7 0.8 0.4

79

Figure 4.3: Mean (± 1 standard deviation) of the percentages of fruit production resulting from outcrossing and selfing, in watered and control plants of Myrcianthes coquimbensis. Percentages correspond to the different transitions: flower to developing fruit (T1); developing fruit to ripe fruit

(T2) and flower to ripe fruit (Fset). The numbers outside the squares indicate the initial number of flowers and the number of shoots with at least one fruit (for T1 and T2).

Seed germination was not affected by pollen source when controlling for seed size (Table

4.2); seeds had a 90% probability of germination if they weighed at least 0.78 g (Appendix 4.3).

Seedling emergence and emergence time were not affected by any of the factors assessed.

Seedling survival was significantly affected by pollen source, with outcross seedling having 4% higher survival than selfed ones (Table 4.3, Table 4.4); Seed mass also positively influenced seedling survival; in greenhouse conditions, resulting seedlings had a 90% probability of survival if seed weighed at least 0.24 g (Appendix 4.3).

80

Figure 4.4: Mean (± 1 standard error) mass of seeds resulting from outcrossing (black bars) and selfing (grey bars) treatments in irrigated and control Myrcianthes coquimbensis plants. Different lower-case letters indicate statistical differences pollination treatment levels.

Almost no variation in seedling growth rate was observed between outcross and self- produced seedlings (Table 4.4), however, both measures significantly and positively varied with the seed mass and with the mean temperature, registered along their growth time (Table

4.2;Appendix 4.3). All mixed models for seedling performance, except for emergence probability, were equally parsimonious (ΔAICc<2) than their reduced counterparts; consequently, we considered the simplest ones (GLM and LM) for the inference of fixed factors (Appendix

4.2).

81

Table 4.2: Results from GLMs and LMs (*) examining the effect of the pollen source (outcrossing - selfing), seed mass and air temperature experienced during sowing and emergence [Tª 1] and from emergence until the time of the seedling’s final measurements [Tª 2]), on the percentages of seed germination, seedling emergence, seedling survival, emergence time, number of new leaves and height per day in

Myrcianthes coquimbensis seedlings. Values in bold indicate significant effects at the 0.05 level.

Seedling Seed Seedling Emergence Seedling Nº leaves/day* Height/day* performance germination emergence time survival Factors LR P LR P LR P LR P F P F P

Pollen source 1.1 0.3 0.7 0.4 0.1 0.7 3.3 0.06 0.2 0.6 0.04 0.8

Seed mass 34.6 <0.01 0.9 0.3 2.1 0.3 7.0 0.007 15.6 <0.01 31.8 <0.01

Seed mass*Pollen 0.05 0.8 2.2 0.1 1.9 0.1 0.5 0.4 0.4 0.5 1.3 0.2 Tª 1 - - - - 1.1 0.2 ------Tª 2 ------2.9 0.08 19.4 <0.01 10.2 0.01

Table 4.3: Total percentages of seed germination, seedling emergence and seedling survival of seeds from Myrcianthes coquimbensis resulting from outcross and self-pollination. Ni denotes the initial number of sowed seeds.

Seedling Pollen source Ni Germination Emergence survival Outcrossing 134 81 93 91 Selfing 40 78 97 87

82

Table 4.4: Mean ± 1 standard deviation of seedling performance indicators observed for

Myrcianthes coquimbensis resulting from outcross and self-pollination.

Emergence Height (cm) / Pollen source Nº Leaves / day time (days) day Outcrossing 51.4 ± 19.9 0.10 ± 0.05 0.15 ± 0.06 Selfing 49.3 ± 17.1 0.11 ± 0.04 0.15 ± 0.05

Excepting the first fruit transition, all the RP indexes for pre-dispersal reproductive success were higher in watered plants. Indicating a higher performance of the outcrossing relative to selfing (Table 4.5a). Seedling performance RP indexes resulted in general, lower than pre- dispersal with most of values negatives indicating a slightly better performance in self-produced seedlings (Table 4.5b).

83

Table 4.5: Reproductive performance index (RP) calculated for a) pre-dispersal and b) pos- dispersal traits of the progeny of Myrcianthes coquimbensis. Seed production response variables are shown for irrigated and control plants, and for both treatments combined (All).

a)

Seed production Reproductive performance index

response variables Control Watered All

T1 0.2 ± 0.3 0.0 ± 0.4 0.1 ± 0.3

T2 0.4 ± 0.6 0.6 ± 0.4 0.5 ± 0.5

Fruit-set 0.5 ± 0.6 0.6 ± 0.5 0.5 ± 0.5

Brood Size -0.05 ± 0.1 0.21 ± 0.4 0.08 ± 0.3

Seed mass 0.2 ± 0.5 0.6 ± 0.3 0.4 ± 0.5 b)

Seedling Reproductive performance performance index

Germination 0.05

Emergence -0.04

Survival 0.04

Emergence time -0.12 ± 0.4

Height/day -0.2 ± 0.4

Leaves/day -0.06 ± 0.3

84

4.5. Discussion

In this study we found that pollination with outcross pollen coupled with high water availability increases fruit production in Myrcianthes coquimbensis. Moreover, this combination also results in higher seed mass. Seedling performance did not differ between those produced from seeds resulting outcross and self-pollination, however, some performance traits varied positively with seed size.

Our results suggest some degree of inbreeding depression in M. coquimbensis, but its magnitude is higher in plants in conditions of high-water availability. In the first stage (T1) only the effect of pollen source was significant, as we expected because the initial phase of fruit development (four weeks) relies less on resources than the next transition (T2), which accumulate more resources (sugar) (Matthews and Shackel 2005). Is important to note, however, that at this stage other pre-fecundation process can act, explaining this differences: 1) the pre-fecundation filters imposed by the self- incompatibility systems (including late-acting self-incompatibility)

(Takayama and Isogai 2005; Hao et al. 2012) and 2) a possible pollen competition inside the pistil (Armbruster and Gobeille Rogers 2004). In the next stage (T2), the higher fruit production found in watered plants are opposed to the classical vision of magnified inbreeding depression in stressful conditions (Montalvo 1994; Fox and Reed 2011); in this study the abortion rate of selfing fruits were similar in both irrigation, while the outcrossed fruits have a higher survival in watered plants. This suggest that the ability of seeds to take advantage on high resource conditions is affected by inbreeding depression, possible due to the action of non-lethal mutations

(Charlesworth and Willis 2009; Cheptou and Donohue 2011). Consequently, self-produced seed, although not aborted, may anyway constitute weaker resource sinks, altering hormonal signaling within fruits and ultimately causing their abortion. (Stephenson 1981).

85

Neither irrigation, nor pollen source affected brood size (the number of seeds per fruit).

This result has been previously reported in a previous study of this species (García-Guzmán et al.

2020). It is intriguing because flowers of this species present multiple ovules (Landrum and Grifo

1988) and, by saturating the stigmas with pollen loads, we should expect higher brood sizes, at least in cross-pollinated flower of the watered plants. Nonetheless, although outcross manual pollination in this species can lead to a high number of pollen tubes on the style (García-Guzmán et al. 2020), it may also result in low fecundation due to high competition among the pollen tubes

(Holland and Chamberlain 2007). Future studies should study the behavior of pollen tubes in their travel to the ovule to confirm this hypothesis. A low brood size can also be caused by post- fecundation processes such as competition among embryos; this may occur when fecundation is carried out by different paternal genotypes (Diggle et al. 2010). However, it is unlikely that this is the case in our study since we should have observed low brood sizes only in outcross pollinated flowers, for which we used multiple pollen donors, and not in the self-pollinated. Other post fecundation causes for low brood size, is seed abortion due to pre-dispersal seed predation

(Sutherland 1986). Lepidopteran larvae has been recorded in seeds of M. coquimbensis (García-

Guzman et al. 2012), however, we did not find larvae, nor evidence of damage by predation in the harvested seeds in this study. Moreover, the size of M. coquimbensis seeds confers resistance to damage by predation, and if the embryo is kept intact, the seeds can conserve it germination capacity (Loayza et al. 2015).

Seeds produced via outcrossing were larger than those produced via selfing. This result also suggests that the effects of inbreeding depression are magnified in favorable conditions. On the other hand, seed mass in plants can decrease due to a size-number trade-off operating at the fruit scale (Venable 1992; Gonzalez-Varo and Traveset 2010). However, we found no correlation

86 between seed number and size (r=0.2; P=0.07) in those plants (N=8) that produced at least one fruit with more than one seed. Therefore, we suggest that seed size variation in this species is related more to inbreeding depression and maternal control of resources.

Early acting inbreeding depression and resource scarcity can impact plant fitness if their effects are correlated among the different life stages (Grueber et al. 2010). In this study, inbreeding depression in the seed development stage appears to disappear in seedling stage, where pollen source does not affect most of the seedling performance indicators Husband and

Schemske (1996) found a similar pattern between seed production and germination, suggesting that fruit or seed abortions may purge the genetic load from the population, avoiding the expression of inbreeding depression on the subsequent stages. On the other hand, seed size was positively related to some of the indicators of seedling performance measured (germination, survival and growth rate). This associations occurs although in general, seeds presented low sizes compare to the size range (2-11g.) observed by this species in other studies (Loayza et al.

2020). Is worth mention that in our study, seedlings growth favorable condition (i.e., water ad libitum) which may explain the high level of germination, emergence, and survival of seedlings despite coming from small seeds. In fact, high percentage of germination, emergence and survival were also observed in seeds of M. coquimbensis maintained in similar conditions

(Loayza et al. 2015). In natural environment, particularly under dry conditions, seed size may be more relevant for seedling performance, due to recalcitrant seeds are vulnerable to desiccation

(Tweddle et al. 2003). In these sense, a recent study which compare seed sizes of M. coquimbensis, found that small seeds, although have lowest recruitment probability, can recruit in dry conditions if are dispersed by native rodents (Loayza et al. 2020).

87

4.6. Conclusion

In conclusion inbreeding depression can have negative consequences in the seed production of Myrcianthes coquimbensis, an endemic shrub of the Atacama Desert. Nonetheless, these negative consequences depend on the water availability experienced by mother plants.

Surprisingly, conditions of water abundance can lead selfing to limit the seed production. The constant level of fruit abortion and relative low seed size presented by selfing both water conditions, confirm that this reproductive mode suppose a vulnerability in term of seed production in this species. But now, besides the unavoidable presence of selfing, due to lack of floral mechanism to avoid it (García-Guzmán et al. 2020), water dependent inbreeding depression add a reproduction cost. These results stressed the necessity maintain the conditions that favor outcrossing, which for this species are in the line of conserving their natural habitat. On the other hand, in the population study, inbreeding depression was not present at seedling stage and the indirect effect via seed size, were minimum. However, studies further studies should evaluate inbreeding depression sowing seeds in natural condition experienced on his recruitment microhabitats.

88

4.7. Appendix

Appendix 4.1: Histogram of frequencies of Myrcianthes coquimbensis seed mass (g) from the irrigation and hand pollination experiment.

89

Appendix 4.2: Results from the AICc contrast between full models (models with a random variable) and reduced models (models without the random variable) performed for seed production response variables and seedling performance response variables. Values of ΔAICc>2 (in bold) indicate a significant effect of the variance among plants, branch and pollination treatments (seed production) and variance among plants (seedling performance). Subscripts in parentheses indicate the degrees of freedom.

Response variable AICc Reduce model AICc Full model ΔAICc

Seed Production

T1 (5) = 545.6 (8) = 465.4 80.6

T2 (5) = 515.4 (8) = 363.9 182.3

T3 (5) = 532.6 (8) = 386.5 146.8

Seed size (4) = 299.3 (6) = 281.4 18.2

Brood size (4) = 78 (8) = 83.3 4 Seedling performance

Seed germination (3) = 139.2 (4) = 141.0 1.7

Seedling emergence (4) = 58.7 (5) = 62.9 3.7

Seedling survival (4) = 34.2 (5) = 36.4 2

Emergence time (5) = 1125.7 (6) = 1126.1 0.2

Nº leaves/day (5) = -375.8 (6) = -375.5 0.1

Height/day (5) = -398.8 (6) = -398.2 0.4

90

Appendix 4.3: Relations between Myrcianthes coquimbensis seed mass (g) and a) germination probability, b) seedling survival probability, c) number of new leaves per day and d) seedling height gained per day.

a)

b)

91

c)

d)

92

Capítulo 5: Resumen y comentarios finales.

A continuación, se presenta un resumen de los principales resultados de los estudios llevados a cabo en esta tesis doctoral.

Capítulo 2: Myrcianthes coquimbensis puede producir frutos y semillas mediante fecundación cruzada, autofecundación y agamospermia. La autofecundación es inevitable en las flores de esta especie y probablemente interfiera con la polinización cruzada. La presencia de la autofecundación, sumada a una posible depresión por endogamia confiere a esta especie una vulnerabilidad más que la posibilidad de asegurar la producción de semillas frente a un fallo en la polinización. Por el contrario, la agamospermia si es una posible alternativa de aseguramiento reproductivo en la población donde fue observada.

Capítulo 3: La producción de frutos y semillas de Myrcianthes coquimbensis puede ser limitada por la disponibilidad de polen cruzado; sin embargo, ya que esta no varió entre los sitios y periodos analizados, no fue posible asociarla a una variación en el ambiente de polinizadores. Por otra parte, las diferencias entre sitios en componentes comunitarios del ambiente de polinizadores sugieren una posible respuesta negativa de este ante la intervención humana.

Capítulo 4: La autofecundación en M. coquimbensis puede resultar en depresión por endogamia para la producción y el tamaño de semillas. Un posible mecanismo sería que a diferencia de las semillas de fecundación cruzada, las de autofecundación no podrían aprovechar una alta disponibilidad de agua durante su desarrollo. Si bien no se observó depresión por endogamia en el desempeño temprano de plántulas, sus efectos sobre el tamaño de las semillas podrían verse reflejados de forma indirecta en la fase de plántulas.

93

Al analizar en conjunto los resultados anteriores en es posible destacar que la producción de semillas depende de la interacción de factores intrínsecos con factores ambientales. La presencia de limitación por polen para la producción de frutos y semillas puede estar presente en distintas poblaciones de esta especie. Sin embargo, la autofecundación, no puede asegurar la producción de semillas frente a una limitación por polen, sino más bien, constituir un costo reproductivo, que sorprendentemente, puede incrementarse en circunstancias ambientales de alta disponibilidad hídrica.

Con excepción de la depresión por endogamia, que solo fue analizada en una población, las características de su sistema reproductivo y del ambiente de polinización fueron particulares de ciertas poblaciones. Esto hace necesario abordar las vulnerabilidades reproductivas de forma particular en cada población, pero aplicando en general medidas tendientes evitar la autofecundación. Por ejemplo, una reducción de la densidad de plantas conespecíficas puede hacer que el comportamiento de forrajeo de ciertos polinizadores favorezca la geitonogamia, por lo que las poblaciones protegidas debiesen procurar un número mínimo de individuos en flor.

En relación con fututos estudios relacionados con el éxito reproductivo de esta especie debiese analizarse el rol de la disponibilidad de recursos sobre el número de

óvulos por flores, una variable que fue asumida como constante en esta tesis. Por otra parte, también es importante examinar la deposición de polen en las flores, para comprobar la existencia de un ambiente variable de polinización que promueva una estrategia de bet-hedging; así como también para evaluar una posible incorporación de polen heteroespecífico en poblaciones con presencia de jardines y especies exóticas en floración simultánea con M. coquimbensis.

94

Referencias bibliográficas.

Aguilar R, Ashworth L, Galetto L, Aizen MA (2006) Plant reproductive susceptibility to habitat fragmentation: Review and synthesis through a meta-analysis. Ecol. Lett.

Ahrné K, Bengtsson J, Elmqvist T (2009) Bumble Bees (Bombus spp) along a Gradient of Increasing Urbanization. PLoS One 4:e5574

Akhalkatsi M, Lösch R (2005) Water limitation effect on seed development and germination in Trigonella coerulea (Fabaceae). Flora - Morphol Distrib Funct Ecol

Plants 200:493–501. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.flora.2005.06.001

Albrecht M, Schmid B, Hautier Y, Müller CB (2012) Diverse pollinator communities enhance plant reproductive success. Proc R Soc B Biol Sci 279:4845–4852.

Arancio G, Muñoz M, Squeo FA (2001) Descripción de algunas especies con problemas de conservación en la IV región de Coquimbo, Chile. In: Squeo FA, Arancio G,

Gutierrez J (eds) Libro Rojo de Flora Nativa y de los Sitios Prioritarios para su

Conservación: Región de Coquimbo. Ediciones Universidad de La Serena, La Serena, pp 63–103

Armbruster WS, Gobeille Rogers D (2004) Does pollen competition reduce the cost of inbreeding? Am J Bot 91:1939–1943.

Armstrong DP (2005) Integrating the Metapopulation and Habitat Paradigms for

Understanding Broad-Scale Declines of Species. Conserv Biol 19:1402–1410.

Arroyo MTK, Armesto JJ, Primack RB (1985) Community studies in pollination ecology in the high temperate Andes of central Chile II. effect of temperature on visitation rates and pollination possibilities. Plant Syst Evol 149:187–203.

95

Arroyo MTK, Primack R, Armesto JJ (1982) Community studies in pollination ecology in the hight temperate andes of central Chile.I. Pollination mechanism and altitudinal variation. Am J Bot 69:82–97

Ashman T-L, Knight TM, Steets JA, et al (2004) Pollen limitation of plant reproduction: Ecological and evolutionary causes and consequences. Ecology 85:2408–

2421.

Barrett SCH, Harder LD (2017) The Ecology of Mating and Its Evolutionary

Consequences in Seed Plants. Annu Rev Ecol Evol Syst 48:135–157.

Barringer BC, Geber MA (2008) mating system and ploidy influence levels of inbreeding depression in Clarkia (Onagraceae). Evolution (N Y) 62:1040–1051.

Baskin JM, Baskin CC (2015) Inbreeding depression and the cost of inbreeding on seed germination. Seed Sci Res 25:355–385.

Benard RB, Toft CA (2007) Effect of seed size on seedling performance in a long-lived desert perennial shrub (Ericameria nauseosa: Asteraceae). Int J Plant Sci 168:1027–

1033

Benard RB, Toft CA (2008) Fine-scale spatial heterogeneity and seed size determine early seedling survival in a desert perennial shrub (Ericameria nauseosa: Asteraceae).

Plant Ecol 194:195–205

Berjak P, Pammenter NW (2013) Implications of the lack of desiccation tolerance in recalcitrant seeds. Front Plant Sci 4:478.

Bolker BM, Brooks ME, Clark CJ, et al (2009) Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution. Trends Ecol Evol 24:127–135.

96

Breen AN, Richards JH (2008) Irrigation and fertilization effects on seed number, size, germination and seedling growth: implications for desert shrub establishment.

Oecologia 157:13–19.

Brook BW, Tonkyn DW, O’Grady JJ, Frankham R (2002) Contribution of Inbreeding to

Extinction Risk in Threatened Species. Conserv Ecol 6:

Brown E, Kephart S (1999) Variability in Pollen Load: Implications for Reproduction and Seedling Vigor in a Rare Plant, Silene douglasii var. Oraria. Int J Plant Sci

Brussard PF (1991) The Role of Ecology in Biological Conservation. Ecol Appl 1:6–12.

Burd M (1994) Bateman’s principle and plant reproduction: The role of pollen limitation in fruit and seed set. Bot Rev 60:83–139.

Burd M (1995) Ovule packaging in stochastic pollination and fertilization environments. Evolution (N Y) 49:100–109.

Burd M, Ashman T-L, Campbell DR, et al (2009) Ovule number per flower in a world of unpredictable pollination. Am J Bot 96:1159–1167.

Burdine JD, McCluney KE (2019) Interactive effects of urbanization and local habitat characteristics influence bee communities and flower visitation rates. Oecologia

190:715–723.

Burnham KP, Anderson DR (2002) Model Selection and Multimodel Inference: A

Practical Information-Theoretic Approach, 2nd edn. Springer-Verlag, New York

Busch JW, Schoen DJ (2008) The evolution of self-incompatibility when mates are limiting. Trends Plant Sci 13:128–136.

Cane JH (1991) Soils of Ground-Nesting Bees (Hymenoptera: Apoidea): Texture,

Moisture, Cell Depth and Climate. J Kansas Entomol Soc 64:406–413

97

Cane JH (2015) Landscaping pebbles attract nesting by the native ground-nesting bee

Halictus rubicundus (Hymenoptera: Halictidae). Apidologie 46:728–734.

CEAZAMET (2020) Red de estaciones meteorológicas

Ceballos G, Ehrlich PR, Barnosky AD, et al (2015) Accelerated modern human– induced species losses: Entering the sixth mass extinction. Sci Adv 1:e1400253.

Cepeda-Pizarro J, Pizarro-Araya J, Bravo-Naranjo V (2018) The assemblage of epigean ants (Formicidae) inhabiting altered patches found in a latitudinal transect of coastal matorral of semiarid Chile . Idesia (Arica) 36:193–201

Cerpa P, Medrano F, Segura B (2015) Introducción a la ecología de las hormigas de la

Región Metropolitanahormigas de la Región Metropolitanahormigas de la Región

Metropolitanahormigas de la Región Metropolitana. La Chiricoca 20

Chacoff NP, Aschero V (2014) Frequency of visits by ants and their effectiveness as pollinators of Condalia microphylla Cav. J Arid Environ 105:91–94.

Charlesworth D (1989) evolution of low female fertility in plants - pollen limitation, resource-allocation and genetic load. Trends Ecol Evol 4:289–292.

Charlesworth D, Willis JH (2009) Fundamental Concepts in Genetics: The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet 10:783–796.

Chaves MM, Pereira JS, Maroco J, et al (2002) How Plants Cope with Water Stress in the Field? Photosynthesis and Growth. Ann Bot 89:907–916.

Chen M, Zhao X-Y (2017) Effect of pollen and resource limitation on reproduction of

Zygophyllum xanthoxylum in fragmented habitats. Ecol Evol 7:9076–9084.

98

Cheplick GP (2005) 4 - The Allometry of Reproductive Allocation A2 - Reekie,

Edward G. In: Bazzaz FA (ed) Reproductive Allocation in Plants. Academic Press,

Burlington, pp 97–128

Cheptou P-O, Donohue K (2011) Environment-dependent inbreeding depression: its ecological and evolutionary significance. New Phytol 189:395–407.

Colwell RK (2013) EstimateS: Statistical estimation of species richness and shared species from samples. User’s guide and application.

Colwell RK, Chao A, Gotelli NJ, et al (2012) Models and estimators linking individual- based and sample-based rarefaction, extrapolation and comparison of assemblages. J

Plant Ecol 5:3–21.

Colwell RK, Mao CX, Chang J (2004) Interpolating, extrapolating, and comparing incidence-based species accumulation curves. Ecology 85:2717–2727

Coombs G, Peter CI, Johnson SD (2009) A test for Allee effects in the self- incompatible wasp-pollinated milkweed Gomphocarpus physocarpus. Austral Ecol

34:688–697.

Cortés FA (2010) Diversidad y estructura de las asociaciones planta-polinizador del

Sitio Prioritario Punta Teatinos – Juan Soldado, Región de Coquimbo, Chile.

Universidad de La Serena

Crall JD, Brokaw J, Gagliardi SF, et al (2020) Wind drives temporal variation in pollinator visitation in a fragmented tropical forest. Biol Lett 16:20200103.

Crawley MJ (2012) The R Book, 2 edition. John Wiley & Sons Ltd, The Atrium,

Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, United kingdom

99

Dickinson HG, Hiscock SJ, Crane PR, Charlesworth D (2003) Effects of inbreeding on the genetic diversity of populations. Philos Trans R Soc London Ser B Biol Sci

358:1051–1070.

Diggle PK, Abrahamson NJ, Baker RL, et al (2010) Dynamics of maternal and paternal effects on embryo and seed development in wild radish (Raphanus sativus). Ann Bot

106:309–319.

Drenovsky RE, Richards JH (2005) Nitrogen addition increases fecundity in the desert shrub Sarcobatus vermiculatus. Oecologia 143:349–356.

Dunning Jr. JB, Groom MJ, Pulliam HR (2006) Species and Landscape Approaches to

Conservation. In: Groom M, Meffe GK, Carroll CR (eds) Principies of Conservation

Biology. Sinauer Associates, pp 419–466

Eckert C, Samis K, Dart S (2006) Reproductive Assurance and the Evolution of

Uniparental Reproduction in Flowering Plants. Ecol Evol Flowers

Eckert CG, Herlihy CR (2004) Using a cost–benefit approach to understand the evolution of self-fertilization in plants: the perplexing case of Aquilegia canadensis

(Ranunculaceae). Plant Species Biol 19:159–173.

Eckert CG, Kalisz S, Geber MA, et al (2010) Plant mating systems in a changing world.

Trends Ecol Evol 25:35–43.

Fernandez JD, Bosch J, Nieto-Ariza B, Gomez JM (2012) Pollen limitation in a narrow endemic plant: geographical variation and driving factors. Oecologia 170:421–431.

Flexas J, Medrano H (2002) Drought-inhibition of photosynthesis in C3 plants: stomatal and non-stomatal limitations revisited. Ann Bot 89:183–189.

100

Fox CW, Reed DH (2011) Inbreeding depression increases with environmental stress: an experimental study and meta-analysiS. Evolution (N Y) 65:246–258.

Galen C, Butchart B (2003) Ants in your plants: effects of nectar-thieves on pollen fertility and seed-siring capacity in the alpine wildflower, Polemonium viscosum. Oikos

101:521–528.

García-Guzman P, Loayza AP, Carvajal DE, et al (2012) The ecology, distribution and conservation status of Myrcianthes coquimbensis: a globally endangered endemic shrub of the Chilean Coastal Desert. Plant Ecol Divers 5:197–204.

García-Guzmán P, Loayza AP, Squeo FA (2020) Multiple reproductive modes of

Myrcianthes coquimbensis (Myrtaceae), an endangered shrub endemic to the Atacama

Desert. Flora 263:151537.

Ghassemi-Golezani K, Ghanehpoor S, Mohammadi-Nasab AD (2009) Effects of water limitation on growth and grain filling of faba bean cultivars. J Food Agric Environ

7:442–447

Gomez JM, Abdelaziz M, Lorite J, et al (2010) Changes in pollinator fauna cause spatial variation in pollen limitation. J Ecol 98:1243–1252.

Gomez JM, Bosch J, Perfectti F, et al (2007) Pollinator diversity affects plant reproduction and recruitment: the tradeoffs of generalization. Oecologia 153:597–605.

Gonzalez-Varo JP, Arroyo J, Aparicio A (2009) Effects of fragmentation on pollinator assemblage, pollen limitation and seed production of Mediterranean myrtle (Myrtus communis). Biol Conserv 142:1058–1065.

Gonzalez-Varo JP, Traveset A (2010) Among-individual variation in pollen limitation and inbreeding depression in a mixed-mating shrub. Ann Bot 106:999–1008.

101

González CR, Llanos L, Oses C, et al (2017) Calliphoridae from Chile: Key to the genera and species (Diptera: Oestroidea). An del Inst la Patagon 45:19–27.

Grez A, Simonetti J, Ipinza-Regla J (1986) Hábitos alimenticios de Camponotus morosus (Smith, 1858) (Hymenoptera: Formicidae) en Chile Central. Rev Chil Entomol

13:51–54

Groom M, Vynne C (2006) Habitat degradation and loss. In: Groom M, Meffe G,

Carroll C (eds) Principles of Conservation Biology. Associates, Sinauer, Sunderland, pp

173–212

Grueber CE, Laws RJ, Nacawaga S, Jamieson IG (2010) Inbreeding Depression

Accumulation across Life-History Stages of the Endangered Takahe. Conserv Biol

24:1617–1625.

Haig D, Westoby M (1988) On Limits to Seed Production. Am Nat 131:757–759

Hallett AC, Mitchell RJ, Chamberlain ER, Karron JD (2017) Pollination success following loss of a frequent pollinator: the role of compensatory visitation by other effective pollinators. AoB Plants 9

Hamrick JL, Godt MJW (1996) Effects of life history traits on genetic diversity in plant species. Philos Trans R Soc London Ser B Biol Sci 351:1291–1298.

Hao YQ, Zhao XF, She DY, et al (2012) The Role of Late-Acting Self-Incompatibility and Early-Acting Inbreeding Depression in Governing Female Fertility in Monkshood,

Aconitum kusnezoffii. PLoS One 7:7.

Harder LD, Aizen MA (2010) Floral adaptation and diversification under pollen limitation. Philos Trans R Soc B-Biological Sci 365:529–543.

102

Harrison T, Winfree R (2015) Urban drivers of plant-pollinator interactions. Funct Ecol

29:879–888.

Harrison XA, Donaldson L, Correa-Cano ME, et al (2018) A brief introduction to mixed effects modelling and multi-model inference in ecology. PeerJ 6:e4794.

Hennessy G, Harris C, Eaton C, et al (2020) Gone with the wind: effects of wind on honey bee visit rate and foraging behaviour. Anim Behav 161:23–31.

Hill LM, Brody AK, Tedesco CL (2008) Mating strategies and pollen limitation in a globally threatened perennial Polemonium vanbruntiae. Acta Oecologica 33:314–323.

Hoehn P, Tscharntke T, Tylianakis JM, Steffan-Dewenter I (2008) Functional group diversity of bee pollinators increases crop yield. Proc R Soc B-Biological Sci 275:2283–

Hokanson K, Hancock J (2000) Early-acting inbreeding depression in three species of

Vaccinium (Ericaceae). Sex Plant Reprod 13:145–150.

Holland JN, Chamberlain SA (2007) Ecological and evolutionary mechanisms for low seed: ovule ratios: need for a pluralistic approach? Ecology 88:706–715

Holmgren M, Scheffer M, Ezcurra E, et al (2001) El Nino effects on the dynamics of terrestrial ecosystems. Trends Ecol Evol 16:89–94

Hou Q, Pang X, Wang Y, et al (2019) Urbanization threaten the pollination of Gentiana dahurica. Sci Rep 9:583.

Howell AD, Alarcón R, Minckley RL (2017) Effects of Habitat Fragmentation on the

Nesting Dynamics of Desert Bees. Ann Entomol Soc Am 110:233–243.

Humphreys AM, Govaerts R, Ficinski SZ, et al (2019) Global dataset shows geography and life form predict modern plant extinction and rediscovery. Nat Ecol Evol 3:1043–

103

Husband BC, Schemske DW (1996) Evolution of the magnitude and timing of inbreeding depression in plants. Evolution (N Y) 50:54–70.

Ida TY, Harder LD, Kudo G (2013) Demand-driven resource investment in annual seed production by a perennial angiosperm precludes resource limitation. Ecology 94:51–61

Johnson SD, Steiner KE (2000) Generalization versus specialization in plant pollination systems. Trends Ecol Evol 15:140–143.

Kalisz S, Vogler DW, Hanley KM (2004) Context-dependent autonomous self- fertilization yields reproductive assurance and mixed mating. Nature 430:884–887

Kehrberger S, Holzschuh A (2019) How does timing of flowering affect competition for pollinators, flower visitation and seed set in an early spring grassland plant? Sci Rep

9:15593.

Kephart SR, Brown E, Hall J (1999) Inbreeding depression and partial selfing: evolutionary implications of mixed-mating in a coastal endemic, Silene douglasii var. oraria (Caryophyllaceae). Heredity (Edinb) 82:543–554

Knight TM, Steets JA, Vamosi JC, et al (2005) Pollen limitation of plant reproduction:

Pattern and process. Annu Rev Ecol Evol Syst 36:467–497.

Koski MH, Ison JL, Padilla A, et al (2018) Linking pollinator efficiency to patterns of pollen limitation: small bees exploit the plant–pollinator mutualism. Proc R Soc B Biol

Landrum LR, Grifo FT (1988) Myrcianthes (Myrtaceae) in Chile. Brittonia 40:290–293.

Lee H, Kang H (2018) Temperature-driven changes of pollinator assemblage and activity of Megaleranthis saniculifolia (Ranunculaceae) at high altitudes on Mt.

Sobaeksan, South Korea. J Ecol Environ 42:31.

104

Li XR, Jia RL, Chen YW, et al (2011) Association of ant nests with successional stages of biological soil crusts in the Tengger Desert, Northern China. Appl Soil Ecol 47:59–

66.

Lloyd DG (1980) Sexual strategies in plants .I. An hypothesis of serial adjustment of maternal investment during one reproductive session. New Phytol 86:69–79.

Lloyd DG, Webb CJ (1986) The avoidance of interference between the presentation of pollen and stigmas in angiosperms I. Dichogamy. New Zeal J Bot 24:135–162.

Loayza AP, Carvajal DE, García-Guzmán P, et al (2014) Seed predation by rodents results in directed dispersal of viable seed fragments of an endangered desert shrub.

Ecosphere 5:.

Loayza AP, Gachon PR, García-Guzmán P, et al (2015) Germination, seedling performance, and root production after simulated partial seed predation of a threatened

Atacama Desert shrub. Rev Chil Hist Nat 88:10.

Loayza AP, Luna CA, Calviño-Cancela M (2020) Predators and dispersers: Context- dependent outcomes of the interactions between rodents and a megafaunal fruit plant.

Sci Rep 10:6106.

Luijten SH, Kéry M, Oostermeijer JGB, Den Nijs HCM (2002) Demographic consequences of inbreeding and outbreeding in Arnica montana: a field experiment. J

Ecol 90:593–603.

Luna CA, Loayza AP, Squeo FA (2016) Fruit size determines the role of three scatter- hoarding rodents as dispersers or seed predators of a fleshy-fruited Atacama Desert shrub. PLoS One.

Lv MJ, Wan W, Yu F, Meng LS (2019) New Insights into the Molecular Mechanism

Underlying Seed Size Control under Drought Stress. 67:9697–9704.

105

Mace GM, Collar NJ, Gaston KJ, et al (2008) Quantification of extinction risk: IUCN’s system for classifying threatened species. Conserv Biol 22:1424–1442.

Martin ME, Lee TD (1993) Self pollination and resource availability affect ovule abortion in Cassia fasciculata (Caesalpiniaceae). Oecologia 94:503–509.

Matthews MA, Shackel KA (2005) 9 - Growth and Water Transport in Fleshy Fruit. In:

Holbrook NM, Zwieniecki MA (eds) Vascular Transport in Plants. Academic Press,

Burlington, pp 181–197

McKinney ML (2006) Urbanization as a major cause of biotic homogenization. Biol

Conserv 127:247–260.

MINSEGPRES (2008) Decreto supremo n° 50 de 2008. Aprueba y oficializa nómina para el Segundo proceso de clasificación de especies según su estado de conservación. 2

Moeller DA, Geber MA (2005) Ecological context of the evolution of self-pollination in

Clarkia xantiana: Population size, plant communities, and reproductive assurance.

Evolution (N Y) 59:786–799

Moles AT, Westoby M (2006) Seed size and plant strategy across the whole life cycle.

Oikos 113:91–105.

Montalvo AM (1994) Inbreeding Depression and Maternal Effects in Aquilegia caerulea, a Partially Selfing Plant. Ecology 75:2395–2409.

Mpelasoka BS, Behboudian MH, Mills TM (2001) Water relations, photosynthesis, growth, yield and fruit size of “Braeburn” apple: Responses to deficit irrigation and to crop load. J Hortic Sci Biotechnol 76:150–156.

106

Mueller AL, Berger CA, Schittenhelm S, et al (2020) Water availability affects nectar sugar production and insect visitation of the cup plant Silphium perfoliatum L.

(Asteraceae). J Agron Crop Sci n/a:

Naito Y, Konuma A, Iwata H, et al (2005) Selfing and inbreeding depression in seeds and seedlings of Neobalanocarpus heimii (Dipterocarpaceae). J Plant Res 118:423–430.

Nielsen LR, Siegismund HR, Hansen T (2007) Inbreeding depression in the partially self-incompatible endemic plant species Scalesia affinis (Asteraceae) from Galápagos islands. Evol Ecol 21:1–12.

Ollerton J, Winfree R, Tarrant S (2011) How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos 120:321–326.

Ouborg NJ, Vergeer P, Mix C (2006) The rough edges of the conservation genetics paradigm for plants. J Ecol 94:1233–1248.

Pearse IS, Koenig WD, Kelly D (2016) Mechanisms of mast seeding: resources, weather, cues, and selection. New Phytol 212:546–562.

Peña M (2016) Fenología reproductiva de Myrcianthes coquimbensis y su relación con los patrones de, precipitación en todo su rango de distribución (Barrancones -

Totoralillo, Región de Coquimbo, Chile). Universidad de La Serena

Phillips BB, Shaw RF, Holland MJ, et al (2018) Drought reduces floral resources for pollinators. Glob Chang Biol 24:3226–3235.

Pol RG, Pirk GI, Marone L (2010) Grass seed production in the central Monte Desert during successive wet and dry years. Plant Ecol 208:65–75.

Price M V, Waser NM, Irwin RE, et al (2005) Temporal and spatial variation in pollination of a montane herb: a seven-year study. Ecology 86:2106–2116.

107

R Development Core Team (2020) R: A Language and Environment for Statistical

Computing

Ramula S, Toivonen E, Mutikainen P (2007) Demographic Consequences of Pollen

Limitation and Inbreeding Depression in a Gynodioecious Herb. Int J Plant Sci

168:443–453.

Richards AJ (2003) Apomixis in flowering plants: an overview. Philos Trans R Soc

London B Biol Sci 358:1085–1093.

Schwinning S, Sala OE (2004) Hierarchy of responses to resource pulses in and and semi-arid ecosystems. Oecologia 141:211–220.

Severns P (2003) Inbreeding and small population size reduce seed set in a threatened and fragmented plant species, Lupinus sulphureus ssp. kincaidii (Fabaceae). Biol

Conserv 110:221–229.

Shaanker RU, Ganeshaiah KN, Bawa KS (1988) Parent-offspring conflict, sibling rivalry, and brood size patterns in plants. Annu Rev Ecol Syst 19:177–205

Shi XJ, Michaels HJ, Mitchell RJ (2005) Effects of self-pollination and maternal resources on reproduction and offspring performance in the wild lupine, Lupinus perennis (Fabaceae). Sex Plant Reprod 18:55–64.

Stephenson AG (1981) Flower and Fruit Abortion: Proximate Causes and Ultimate

Functions. Annu Rev Ecol Syst 12:253–279.

Sutherland S (1986) Patterns Of Fruit-Set: What Controls Fruit-Flower Ratios In Plants?

Evolution (N Y) 40:117–128.

Takayama S, Isogai A (2005) Self-incompatibility in plants. Annu Rev Plant Biol

56:467–489.

108

Tweddle JC, Dickie JB, Baskin CC, Baskin JM (2003) Ecological aspects of seed desiccation sensitivity. J Ecol 91:294–304.

Valdivia CE, Orellana JI, Morales-Paredes C (2018) Ant-Mediated Nectar Robbing from the Chilean Firetree Embothrium coccineum (Proteaceae): No Effect on Seed

Production. Ann Bot Fenn 55:217–226.

Valverde J, Gómez JM, Perfectti F (2016) The temporal dimension in individual-based plant pollination networks. Oikos 125:468–479.

Vamosi JC, Steets JA, Ashman TL (2013) Drivers of pollen limitation: macroecological interactions between breeding system, rarity, and diversity. Plant Ecol Divers.

Vaughton G, Ramsey M (1997) Seed Mass Variation in the Shrub Banksia spinulosa

(Proteaceae): Resource Constraints and Pollen Source Effects. Int J Plant Sci 158:424–

431.

Vázquez D, Gianoli E, Gonzales W, et al (2011) ¿Es necesaria la teoría ecológica para la conservación de la biodiversidad? Is ecological theory necessary for biodiversity conservation? Rev Boliv Ecol y Conserv Ambient 29:62–72

Venable DL (1992) Size-Number Trade-Offs and the Variation of Seed Size with Plant

Resource Status. Am Nat 140:287–304.

Vidiella PE, Armesto JJ, Gutierrez JR (1999) Vegetation changes and sequential flowering after rain in the southern Atacama Desert. J Arid Environ 43:449–458

Vrdoljak SM, Samways MJ, Simaika JP (2016) Pollinator conservation at the local scale: flower density, diversity and community structure increase flower visiting insect activity to mixed floral stands. J Insect Conserv 20:711–721.

109

Ward M, Johnson SD (2005) Pollen limitation and demographic structure in small fragmented populations of Brunsvigia radulosa (Amaryllidaceae). Oikos 108:253–262.

Waser NM, Chittka L, Price M V, et al (1996) Generalization in pollination systems, and why it matters. Ecology 77:1043–1060

Waser NM, Price M V (2016) Drought, pollen and nectar availability, and pollination success. Ecology 97:1400–1409.

Webb CJ, Lloyd DG (1986) The avoidance of interference between the presentation of pollen and stigmas in angiosperms II. Herkogamy. New Zeal J Bot 24:163–178.

Wenzel A, Grass I, Belavadi V V, Tscharntke T (2020) How urbanization is driving pollinator diversity and pollination – A systematic review. Biol Conserv 241:108321.

Wesselingh RA (2007) Pollen limitation meets resource allocation: towards a comprehensive methodology. New Phytol 174:26–37.

Wiens D, Calvin CL, Wilson CA, et al (1987) Reproductive success, spontaneous embryo abortion, and genetic load in flowering plants. Oecologia 71:501–509.

Wilcock C, Neiland R (2002) Pollination failure in plants: why it happens and when it matters. Trends Plant Sci 7:270–277

Wilson CJ, Jamieson MA (2019) The effects of urbanization on bee communities depends on floral resource availability and bee functional traits. PLoS One 14:e0225852

Winfree R, Aguilar R, Vazquez DP, et al (2009) A meta-analysis of bees’ responses to anthropogenic disturbance. Ecology 90:2068–2076.

Yang C-F, Sun S-G, Guo Y-H (2005) Resource limitation and pollen source (self and outcross) affecting seed production in two louseworts, Pedicularis siphonantha and P. longiflora (Orobanchaceae). Bot J Linn Soc 147:83–89.

110