Modifikation des Nortropanalkaloid-Stoffwechsels in Solanum tuberosum L. durch Knockdown und Überexpression von Biosynthesegenen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Naturwissenschaftlichen Fakultät I Biowissenschaften der Martin-Luther Universität Halle-Wittenberg vorgelegt von Frau Diplom-Pharmazeutin Nadine Küster geboren am 19.10.1985 in Halle (Saale) Gutachter/in 1. Prof. Dr. Birgit Dräger 2. Prof. Dr. Dierk Scheel 3. Prof. Dr. Uwe Sonnewald Halle (Saale), 26.07.2016 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................. VI ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................... IX TABELLENVERZEICHNIS ....................................................................................... XII A 1. EINLEITUNG ..................................................................................................... 1 A 1.1. Solanum tuberosum L. – wirtschaftliche Bedeutung, Genom und Sekundärmetaboliten ................................................................................. 1 A 1.2. Tropanalkaloid- und Calysteginbiosynthese ........................................... 3 A 1.2.1 Allgemeine Übersicht ............................................................................ 3 A 1.2.2 Wichtige Enzyme der Tropanalkaloid- und Calysteginbiosynthese ....... 8 A 1.2.3 Regulation der Tropanalkaloid- und Calysteginbiosynthese ................. 9 A 1.2.4 Modifikation der Tropanalkaloid- und Calysteginbiosynthese ............. 11 A 1.3. Spezifische Eigenschaften der Tropinonreduktasen ........................... 13 A 1.4. Calystegine ............................................................................................... 17 A 1.4.1 Struktur und Vorkommen .................................................................... 17 A 1.4.2 Eigenschaften und mögliche natürliche Funktion ................................ 18 A 1.5. Ziele der Arbeit ......................................................................................... 20 B 2 MATERIAL UND METHODEN ........................................................................ 23 B 2.1 Material ...................................................................................................... 23 B 2.1.1 Solanum tuberosum L. ........................................................................ 23 B 2.1.2 Phytophthora infestans ........................................................................ 23 B 2.1.3 Eschericha coli .................................................................................... 23 B 2.1.4 Agrobacterium tumefaciens ................................................................. 23 B 2.1.5 Chemikalien, Oligonukleotide, Enzyme und Kits ................................. 24 B 2.1.6 Medien, Puffer und Lösungen ............................................................. 24 B 2.1.7 Datenbanken und Internetprogramme ................................................ 27 B 2.2 Kultivierung, Transformation und Selektion der Organismen ............. 27 B 2.2.1 Kultivierung von P. infestans ............................................................... 27 B 2.2.2 Kultivierung von S. tuberosum ............................................................ 27 B 2.2.3 A. tumefaciens-vermittelte, stabile Transformation von S. tuberosum 28 B 2.2.4 Herstellung und Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen 29 B 2.2.5 Herstellung und Transformation chemisch kompetenter A. tumefaciens- Zellen .................................................................................................. 29 B 2.3 Phänotypische Untersuchungen der transgenen Pflanzen ................. 30 I Inhaltsverzeichnis B 2.3.1 Pflanzenwachstum ............................................................................... 30 B 2.3.2 Kartoffelknollen .................................................................................... 30 B 2.3.3 Kartoffelkeime ...................................................................................... 30 B 2.4 Molekularbiologische Methoden ............................................................. 31 B 2.4.1 RNA-Isolation (Trizol-Methode) ........................................................... 31 B 2.4.2 DNase Verdau ..................................................................................... 31 B 2.4.3 cDNA Synthese ................................................................................... 32 B 2.4.4 DNA-Isolation (für Southern-Blot) ........................................................ 32 B 2.4.5 Plasmidpräparation aus E. coli Bakterien ............................................ 32 B 2.4.6 Plasmidpräparation aus A. tumefaciens Bakterien .............................. 33 B 2.4.7 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ........................... 33 B 2.4.8 Klonierungen ........................................................................................ 33 B 2.4.9 Restriktionsverdau von Vektoren ......................................................... 34 B 2.4.10 Auftrennung von DNA-Fragmenten durch Elektrophorese .................. 34 B 2.4.11 PCR mit Plasmid-DNA, cDNA .............................................................. 34 B 2.4.12 Kolonie-PCR für E. coli ........................................................................ 34 B 2.4.13 Kolonie-PCR für A. tumefaciens .......................................................... 35 B 2.4.14 Quantitative Reverse Transkriptase-PCR (qRT-PCR) zur Transkriptmengenquantifizierung ........................................................ 35 B 2.4.15 Southern-Blot ....................................................................................... 36 B 2.4.16 Northern-Blot ....................................................................................... 36 B 2.4.17 Southern- und Northern-Hybridisierungen ........................................... 37 B 2.5 Bioassays .................................................................................................. 38 B 2.5.1 Infektion von Kartoffelblättern mit P. infestans und Biomassebestimmung durch q-PCR ................................................... 38 B 2.5.2 Sporenkeimungsassay mit P. infestans und Calysteginen sowie Keimextrakten von StTRII RNAi Pflanzen ........................................... 38 B 2.6 Isolation und Analytik pflanzlicher Sekundärstoffe .............................. 39 B 2.6.1 Fütterungsversuche mit Tropinon ........................................................ 39 B 2.6.2 Extraktion von Tropinon, Tropin und Pseudotropin ............................. 39 B 2.6.3 GC-MS Analyse von Tropinon, Tropin, Pseudotropin .......................... 39 B 2.6.4 Extraktion von Polyaminen .................................................................. 40 B 2.6.5 Dansylierung von Polyaminen ............................................................. 41 B 2.6.6 HPLC-Analyse von Polyaminen ........................................................... 41 B 2.6.7 Extraktion von Calysteginen ................................................................ 42 B 2.6.8 Silylierung von Calysteginen ................................................................ 43 B 2.6.9 GC-MS Analyse von Calysteginen ...................................................... 43 II Inhaltsverzeichnis B 2.6.10 Extraktion von Jasmonaten ................................................................. 44 B 2.6.11 UPLC-MS/MS Analyse von Jasmonaten ............................................. 44 B 2.6.12 Herstellung des Cucurbinsäure-Standards ......................................... 45 C 3 ERGEBNISSE .................................................................................................. 46 C 3.1 Expression der DsPMT in S. tuberosum ................................................ 46 C 3.1.1 Insertionsereignisse und Transkriptabundanz in DsPMT exprimierenden Linien ......................................................................... 46 C 3.1.2 Polyamin-Gehalt der DsPMT exprimierenden Linien .......................... 47 C 3.1.3 Intermediate der Calysteginbiosynthese und Calystegine .................. 50 C 3.1.4 Wachstum von P. infestans auf den DsPMT exprimierenden Linien .. 52 C 3.2 Modulierung der StTRI-Expression in S. tuberosum ............................ 53 C 3.2.1 Herstellung und Charakterisierung der StTRI RNAi Linien und StTRI Überexpressionslinien ......................................................................... 53 C 3.2.2 Tropinon-Fütterung an StTRI RNAi- und StTRI ÜE Linien .................. 55 C 3.2.3 Calystegin-Gehalt der StTRI ÜE Linien ............................................... 58 C 3.2.4 StTRII-Transkriptabundanz der StTRI RNAi Linien ............................. 59 C 3.2.5 Calystegin-Gehalt der StTRI RNAi Linien ........................................... 60 C 3.2.6 StPin2-Transkriptabundanz in StTRI RNAi Linien nach Verwundung . 60 C 3.2.7 Quantifizierung von Jasmonaten in StTRI RNAi- und StTRI ÜE Linien ............................................................................................................ 62 C 3.2.8 Methyljasmonat-Fütterung an StTRI ÜE Linien ................................... 65 C 3.3 Reduktion der StTRII-Expression in S. tuberosum ............................... 66 C 3.3.1 Herstellung und Charakterisierung der StTRII RNAi Linien ................ 66 C 3.3.2 StTRI-Transkriptabundanz der StTRII RNAi Linien ............................