Study of Hypericum perforatum defense mechanisms UMinho 2009 Luís Eduardo Fernandes Rodrigues da Conceição against Colletotrichum gloeosporioides: Relevance of phenolic metabolism and hypersensitive response. Escola deCiências Univer Se Luís Eduar me gloeosporioides mechanisms against Study of t embr t abolism andh o de2009 sidade doMinho Hypericum perforatum do F ernande : R yper ele s Rod v Colletotrichum ance ofphenolic sensitive response. rigues daC defense onceição Universidade do Minho Escola de Ciências Luís Eduardo Fernandes Rodrigues da Conceição Study of Hypericum perforatum defense mechanisms against Colletotrichum gloeosporioides: Relevance of phenolic metabolism and hypersensitive response. Doutoramento em Ciências Área de Conhecimento em Biologia Trabalho efectuado sob a orientação do Prof. Dr. Alberto Dias e do Prof. Dr. Rui Tavares Setembro de 2009 É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA TESE APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE; Universidade do Minho, ___/___/______ Assinatura: ________________________________________________ Acknowledgments/Agradecimentos The work presented in this PhD thesis was carried out under the supervision of Prof. Dr. Alberto Carlos Pires Dias and Prof. Dr. Rui Tavares, both from Departamento de Biologia, Escola de Ciências da Universidade do Minho. The work was performed at Centro de Biologia, Escola de Ciências da Universidade do Minho, in Braga, Portugal, between October 2003 and February 2009. Funding was provided by the FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia), Lisboa, Portugal, as a PhD grant ref. SFRH/BD/13318/2003. Study of Hypericum perforatum defense mechanisms against Colletotrichum gloeosporioides: Relevance of i phenolic metabolism and hypersensitive response. Luis Eduardo F.R. Conceição Acknowledgments/Agradecimentos Gostaria de agradecer ao Prof. Doutor Alberto Dias, pela orientação e apoio ao longo desses anos, não só na realização do meu doutoramento mas também do estágio de licenciatura (os anos que ele já me atura…), estando sempre presente não só para nortear mas também para batalhar pelos seus alunos, característica essa que, não fazendo parte das sua obrigações, nunca se negou a realizar, abnegadamente. Por esse e muitos outros motivos que levariam tempo a enumerar, cabe também agradecer, ainda mais, ao Alberto, amigo que estimo e incluo num grupo muito restrito de pessoas que merecem a minha total consideração e confiança nos seus princípios. Agradeço também ao Prof. Doutor Rui Tavares, por aceitar a co-orientação do meu doutoramento (como também já o fizera durante o estágio), concedendo-me livre acesso a metodologias e condições laboratoriais indispensáveis para a realização e conclusão de inúmeras etapas apresentadas nesta tese. De uma forma geral, aos restantes professores do Departamento de Biologia, em especial os das plantas que, de alguma forma, contribuíram para esse trabalho, fica aqui o meu agradecimento. Ao Herlânder, pelo grande profissionalismo, paciência e orientação de bancada incondicional, que me foram indispensáveis na fase inicial do doutoramento. Trabalho à parte, pelo óptimo ambiente que soube criar e manter à sua volta mesmo quando este, pontualmente, faltava no resto do laboratório. Ao Minos, Rui e Manu, amigos de tão longa data que já não mais distingo de irmãos. Obrigado pela vossa presença e boa disposição mas, mais que isso, pelo vosso carácter irrepreensível, qualidade cada vez mais rara de se encontrar. Por isso mesmo, poucos (muito poucos) são aqueles por quem, como vocês, seria capaz de pôr a mão no fogo. Chegar aqui seria muito mais difícil sem o vosso apoio, amizade e paciência, principalmente daqueles que aguentaram o barco durante as minhas paragens para escrita, incentivando-me sempre sem fazer quaisquer cobranças, ainda que de direito. Ao Paulo, pela amizade, boa disposição e, mais que isso, pela forma abnegada como se apresentou disponível para ajudar na execução de alguns trabalhos laboratoriais. Tenho a certeza que esse agradecimento vale também por um departamento inteiro com o qual colaboraste, inúmeras vezes fora do âmbito das tuas funções, algumas delas em prejuízo próprio. Força. Polish style! Study of Hypericum perforatum defense mechanisms against Colletotrichum gloeosporioides: Relevance of ii phenolic metabolism and hypersensitive response. Luis Eduardo F.R. Conceição Acknowledgments/Agradecimentos My appreciation also to Franklin, who came to Braga as a group colleague but soon became good a friend of mine. My inestimable gratitude for all your help and backup in the lab, especially in the time-consuming/boring/nerve-breaking maintenance of suspension cell cultures, the most crucial material I needed for the work presented here. Equally important, thanks for contributing in a daily basis, along with others, to a most needed good environment in the lab. Muito obrigado, pá! I would also like to express my gratitude to Erich, Katja, Lucie and Brigitte, for accepting me as your guest in Max-Planck and making it so easy for me to adapt to a new environment. Besides the professional support (and patience), essential for overcoming many of the technical problems I was facing in Braga, your friendship, shown during all my stay in Cologne, shall not be forgotten, no matter how far you may be (especially in Katja’s case). By the way, the Greek recipes and choreography shall not be forgotten also… My appreciation also to Elke, Bekir, Mario and Rainer, for you support and valuable opinions. À Ana pela boa disposição constante e por mostrar rapidamente independência no laboratório, não tendo dado trabalho nenhum, permitindo-me assim ter mais tempo para terminar esse trabalho. Aos outros bolseiros das plantas (Marta, Mafalda, Ana Patrícia, Alice, Rosa, Sara, Vítor, Sérgio, Briolanja…) mas também do restante DB (JP, Raul, Sofia, Isabel, Rita, Jorge, Clara…) que, entre outros, ajudaram no trabalho e/ou tornaram o departamento num local agradável ao longo desses anos. Aos funcionários do departamento que, ao trabalhar nos bastidores, são peças indispensáveis para o bom funcionamento dos laboratórios. Assim, um obrigado especial para o Amaro, Manuela, Paula, Liliana, para a recém-chegada Cristina mas também a quem já não está no DB, como o Carlos e D. Rosa. A quem chegou há menos tempo e não tive a oportunidade de conhecer melhor (Teresa, Marta, André, Fábio…) mas que criaram um bom ambiente no curto período em que ainda estive no lab. Meu agradecimento (e pedido de desculpas) a quem possa ter esquecido de referir aqui. E porque não agradecer a quem, não atrapalhando, ajudou indirectamente a que pudesse chegar aqui com o trabalho concluído. Study of Hypericum perforatum defense mechanisms against Colletotrichum gloeosporioides: Relevance of iii phenolic metabolism and hypersensitive response. Luis Eduardo F.R. Conceição Acknowledgments/Agradecimentos Fora do âmbito profissional (porque o trabalho não faz o homem, apenas o completa), mas também indispensáveis para que chegasse até aqui com alguma sanidade mental, o meu sincero agradecimento à malta da Póvoa (Tiago, Pontes, Luís e Ruben) mas também o meu pedido de desculpas pelo distanciamento ao longo destes últimos tempos. Voltaremos em breve à programação normal… O meu agradecimento aos familiares que, de múltiplas formas, ajudaram-me nesse capítulo da vida que fica, finalmente, concluído. Em especial à Cláudia, Cristina e Manuel, por compreenderem o distanciamento desses últimos tempos, sempre na torcida, a incentivarem-me a levar esse projecto até ao fim. Tudo que sou, tudo o que faço e tudo em que acredito não seriam sem o irrepreensível exemplo de vida, a presença constante, a amizade e o apoio abnegado dos meus pais, pedras basilares na formação do que sou. Obrigado, simplesmente por tudo. À minha Aninha, a pedra basilar que faltava e que trouxe o equilibro na minha construção, obrigado pelo apoio e compreensão incondicionais em todas as minhas decisões, em todos os meus riscos. Obrigado, de quem te ama, pela alegria, pelo motivo, pelo sentido, por nós. Por último, e por pouco ortodoxo que seja, agradeço a mim mesmo, pela paciência e perseverança que descobri ter para fechar esse capítulo após encontrado novo rumo, nova vida e objectivos. Sem saber se serão mudanças para melhor, faço-as à mesma, revendo-me nas palavras de Paul Anka: “Regrets, I’ve had a few, But then again, too few to mention. I did what I had to do And saw it through without exemption. I planned each charted course, Each careful step along the byway But more, much more than this, I did it my way.” “My Way” (1968), Paul Anka Study of Hypericum perforatum defense mechanisms against Colletotrichum gloeosporioides: Relevance of iv phenolic metabolism and hypersensitive response. Luis Eduardo F.R. Conceição Resumo Mecanismos de defesa de Hypericum perforatum contra Colletotrichum gloeosporioides: Relevância da resposta hipersensível e do metabolismo fenólico. H. perforatum (HP) é uma planta medicinal encontrada em todo o mundo, sendo nativa da Europa, norte de África, Oriente Médio e grande parte da Ásia. Introduzida também noutras regiões do globo devido ao seu elevado valor terapêutico, essa planta é descrita desde tempos imemoriais para o tratamento de diversas maleitas. Actualmente, sua principal aplicação consiste no tratamento de depressões leves e moderadas sendo que, em diversos países, a prescrição de produtos à base de Hipericão é superior a dos medicamentos antidepressivos mais comuns. Devido à grande procura daí resultante,