TOBIAS JANKE MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUR PILZDIVERSITÄT IN STALL - UND HAUSSTAUBPROBEN MITTELS PCR-SSCP UND PARALLELSEQUENZIERUNG Technische Universität München Lehrstuhl für Tierhygiene Molekularbiologische Untersuchungen zur Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben mittels PCR-SSCP und Parallelsequenzierung Tobias Janke Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. S. Scherer Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. J. Bauer 2. Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. E. von Mutius (Ludwig-Maximilians-Universität München) Die Dissertation wurde am 22.05.2013 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernäh- rung, Landnutzung und Umwelt am 05.09.2013 angenommen. © 2014 by Tobias Janke, München, Deutschland Alle Rechte, auch die der Übersetzung und des Nachdrucks sowie jede Art der photomechanischen Wiedergabe oder der Übernahme auf Datenträger, auch auszugsweise, bleiben vorbehalten. Technische Universität München Lehrstuhl für Tierhygiene Weihenstephaner Berg 3 D-85354 Freising Herstellung: Hieronymus Verlag, Neuried Eine elektronische Version der Dissertation ist im Netz der Universitätsbibliothek der Technischen Universität München veröffentlicht und unter der Internetadresse http://mediatum.ub.tum.de zu finden. Im Gedenken an meine Mutter 24.08.1949 – 21.01.2012 „Ja, das Alles auf Ehr‘, Das kann ich und noch mehr, Wenn man kann’s ungefähr, Ist’s nicht schwer – ist’s nicht schwer!“ Zigeunerbaron, Johann Strauss, 1885 INHALTSVERZEICHNIS I Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. V II Tabellenverzeichnis .............................................................................................. VIII III Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... XIII 1 Einleitung ....................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht ........................................................................................... 3 2.1 Pilze ............................................................................................................... 3 2.1.1 Biologie und systematische Klassifizierung ............................................ 3 2.1.2 Pilze in der Umwelt ................................................................................. 6 2.1.3 Pilze als Humanpathogene ..................................................................... 9 2.1.4 Zusammenhänge zwischen Pilzexposition und Asthmaprävalenz ........ 15 2.2 Qualitativer und quantitativer Nachweis von Pilzen ..................................... 17 2.2.1 Direktmikroskopie ................................................................................. 17 2.2.2 Kulturelle Nachweisverfahren ............................................................... 18 2.2.3 Kulturunabhängige Nachweisverfahren ................................................ 18 3 Material und Methoden ................................................................................ 31 3.1 Material ........................................................................................................ 31 3.1.1 Pilzspezies ............................................................................................ 31 3.1.2 Probenmaterial ...................................................................................... 33 3.1.3 Technische Geräte ................................................................................ 34 3.1.4 Verbrauchsmaterial ............................................................................... 36 3.1.5 Chemikalien .......................................................................................... 37 3.1.6 Herstellung der Gebrauchsmedien ....................................................... 39 3.2 Methoden .................................................................................................... 43 3.2.1 Allgemeine mikrobiologische Methoden ................................................ 43 3.2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden ......................................... 44 II INHALTSVERZEICHNIS 3.2.3 Adaption der Basismethoden an die Untersuchung von Pilzgemeinschaften in der Matrix Staub ................................................ 52 3.2.4 PCR-SSCP zur Untersuchung von Pilzgemeinschaften in Staubproben (Darstellung der validierten Endmethode) ............................................. 60 3.2.5 Untersuchung der Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben ........... 62 3.2.6 Molekularepidemiologische Untersuchungen zur Assoziation zwischen Schimmelpilzexposition und Asthmarisiko bei Schulkindern (GABRIEL) .............................................................................................................. 63 4 Ergebnisse .................................................................................................. 69 4.1 Adaption der PCR-SSCP Basismethode an die Untersuchung von Pilzgemeinschaften in Stall- und Hausstaubproben .................................... 69 4.1.1 Gezielte Auswahl und Evaluierung eines geeigneten Primerpaares ..... 69 4.1.2 Auswahl eines geeigneten DNA-Extraktionsverfahrens ........................ 78 4.1.3 Entwicklung eines PCR-SSCP-Pilz-Speziesstandards („Spec“) ........... 81 4.1.4 Reproduzierbarkeit der entwickelten PCR-SSCP-Methode .................. 82 4.2 Untersuchung der Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben .................. 86 4.2.1 PCR-SSCP-Analyse ............................................................................. 86 4.2.2 Kulturelle Untersuchungen .................................................................... 88 4.2.3 Parallelsequenzierung .......................................................................... 89 4.2.4 Vergleich von PCR-SSCP-Analyse, Parallelsequenzierung und kulturellen Untersuchungen von Stall- und Hausstaubproben .............. 93 4.3 Molekularepidemiologische Untersuchungen zur Feststellung von Assoziationen zwischen Schimmelpilzexposition und Asthmarisiko bei Schulkindern (GABRIEL) ............................................................................. 94 4.3.1 PCR-SSCP-Analyse von Matratzenstaubproben (GABRIEL) ............... 94 4.3.2 Parallelsequenzierung von Matratzenstaubproben (GABRIEL) – Pilotversuch ........................................................................................ 123 INHALTSVERZEICHNIS III 5 Diskussion ................................................................................................. 131 5.1 Adaption der PCR-SSCP-Analysemethode und der Parallelsequenzierungstechnologie an die Untersuchung von Stall- und Hausstaubproben ...................................................................................... 131 5.1.1 DNA-Extraktionsverfahren .................................................................. 131 5.1.2 Primerauswahl .................................................................................... 133 5.1.3 Kulturunabhängige Untersuchungen von Pilzgemeinschaften mittels PCR-SSCP ......................................................................................... 138 5.1.4 Quantitative Bestimmung der Pilzexposition ....................................... 142 5.2 Untersuchungen zur Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben ............ 143 5.2.1 Kultivierungsversuche ......................................................................... 143 5.2.2 PCR-SSCP-Analyse und Sanger-Sequenzierung ............................... 144 5.2.3 Parallelsequenzierung zur Bestimmung der Pilzdiversität in Stall- und Hausstaubproben ................................................................................ 146 5.3 Molekularepidemiologische Untersuchungen zur Feststellung von Assoziationen zwischen Schimmelpilzexposition und Asthmarisiko bei Schulkindern (GABRIEL) ........................................................................... 150 5.3.1 PCR-SSCP-Analyse und Sequenzierung ........................................... 151 5.3.2 Parallelsequenzierung von Matratzenstaubproben zur Ermittlung der Diversität und der Assoziation spezifischer Sequenzen bezüglich Asthma ............................................................................................................ 162 6 Schlussfolgerungen und Ausblick .............................................................. 167 7 Zusammenfassung .................................................................................... 169 8 Summary ................................................................................................... 171 9 Literaturverzeichnis ................................................................................... 173 IV INHALTSVERZEICHNIS 10 Anhang ...................................................................................................... 207 10.1 Anhang A: Tabellen ................................................................................... 207 10.1.1 Anhang A1: Bestimmung der Ähnlichkeiten von SSCP-Bandenprofilen (Pearson Korrelations-Koeffizient (%)) von jeweils einer Staubprobe unterschiedlicher Herkunft) ................................................................. 207 10.1.2 Anhang A2: Darstellung