0 Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Estudo dos perfis transcricionais em resposta ao estresse biótico e abiótico em cana-de-açúcar Fabiana Bombonato Mingossi Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas Piracicaba 2013 0 Fabiana Bombonato Mingossi Bióloga Estudo dos perfis transcricionais em resposta ao estresse biótico e abiótico em cana-de-açúcar versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011 Orientador: Prof. Dr. MARCIO DE CASTRO SILVA FILHO Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas Piracicaba 2013 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - DIBD/ESALQ/USP Mingossi, Fabiana Bombonato Estudo dos perfis transcricionais em resposta ao estresse biótico e abiótico em cana-de-açúcar / Fabiana Bombonato Mingossi.- - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2013. 175 p: il. Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2013. 1. Cana-de-açúcar 2. Herbivoria 3. Diatraea saccharalis 4. Estresse hídrico 5. Parâmetros fisiológicos 6. RNA-Seq I. Título CDD 633.61 M664e “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor” 3 Dedico: Aos meus pais Luciana e Rubens, Pela confiança, constante apoio e amor incondicional. 4 5 AGRADECIMENTOS Primeiramente gostaria de agradecer ao meu orientador, Marcio de Castro Silva Filho, pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório, pela confiança e amizade. À minha querida orientadora Rosanne Casu por acreditar e confiar plenamente no meu trabalho. Sua dedicação e ensinamentos foram essenciais durante meu doutorado sanduíche. À gloriosa ESALQ/USP e CSIRO Plant Industry, foi uma honra poder trabalhar em lugares com alta qualidade de ensino e pesquisa. À FAPESP (nº processo da bolsa no país 2009/15.920-2 e nº processo da bolsa BEPE 2011-21.364-5) e CAPES pelas concessões das bolsas de estudo. Ao Prof. Daniel Scherer de Moura e Marcelo Brandão por estarem sempre dispostos a ajudar, pelas sugestões de trabalho e amizade. Ao Rafael Colombi por sempre manter a organização do laboratório. Aos queridos amigos do laboratório de Biologia Molecular de Plantas: Thaís, Larissa, Flávia, Renata, Poliene, Elaine, Aline, Wellington, Horácio, Marcelo, Lucas, Marcos e Williane, e aos ex-alunos, Celso, Lígia, Christine, Marcela, Luíza, Ane e Ricardo, pelo ótimo convívio nesses anos de doutorado, pela troca de experiências e amizade. Aos amigos da CSIRO Plant Industry, especialmente Rosalie Sabburg, Johann Pierre, Jai Perroux, Jonathan Powel, Paul Melloy, Cass Guilfoyle, Thomas Parker e Anca e aos pesquisadores Donna Glassop, Anne Rae, Graham Bonnett, Jiri Stiller por tornarem o ambiente de trabalho um lugar prazeroso, pelo apoio, incentivo e amizade. As queridas flatmates Merran Anderssen e Leilani Alvarez por se tornarem uma família para mim na Austrália, e aos queridos amigos, Gabi Ferraz, Elisa Van Sluys Menck, Leonardo Neves, Tatiana Teixeira, Marina Braga, Henrique Junqueira, Flávia e Daniel 6 Botelho, Renato Crouzeilles, Angela Billar, Débora, Annica Carberry, Júlia McMurray, Guta Fretes, Ana Jelinic, sem vocês meu doutorado sanduíche não teria sido tão especial. Aos amigos pós-graduandos da ESALQ, Layanne, Ana Cláudia, Luciano, Vívian, Elisa, Bruna, Alice, Fábio Paulino, Fábio Pértille, Keini, Paulo, Ju Deganello, Paulinho, Adriano, Gisele Nunes e Giselle pelos ótimos anos de convívio e amizade em Piracicaba. Gostaria de agradecer também as minhas queridas amigas de Sertãozinho, especialmente, Tati, Vivi, Lívia, Livinha, Tânia e Júlia, amigas assim são para sempre! As minhas avós Nilce e Luíza e meus avôs Osvaldo e Rubens (in memoriam), tias, tios, primas e primos por todo carinho, incentivo e por compreenderem os momentos de ausência. Em especial gostaria de agradecer aos meus pais por não medirem esforços para me fazer feliz, pela confiança depositada em mim e eterno amor; e ao meu irmão Marcelo e à minha cunhada Lívia por todo incentivo e carinho. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste sonho, muito obrigada! 7 “Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas também sonhar; não apenas planejar, mas também acreditar.” Anatole France 8 9 SUMÁRIO RESUMO ............................................................................................................................ 11 ABSTRACT ........................................................................................................................ 13 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 15 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 17 2.1 Cana-de-açúcar .............................................................................................................. 17 2.2 Estresse biótico .............................................................................................................. 19 2.2.1 Interação planta-inseto................................................................................................. 19 2.2.2 Resposta de defesa das plantas aos insetos ................................................................... 19 2.2.3 Inibidores de protease e proteases de plantas ............................................................... 21 2.3 Estresse Abiótico............................................................................................................ 23 2.3.1 Déficit hídrico ............................................................................................................. 23 2.3.2 Mecanismos de regulação das respostas de defesa da planta ........................................ 24 2.3.3 Sequenciamento de nova geração (SNG): RNA-Seq .................................................... 26 3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 29 3.1 Estresse biótico .............................................................................................................. 29 3.1.1 Material biológico e desenho experimental .................................................................. 29 3.1.2 Extração de RNA total e síntese de cDNA ................................................................... 30 3.1.3 Monitoramento dos transcritos através de PCR em tempo real ..................................... 30 3.1.4 Análise Filogenética .................................................................................................... 31 3.2 Estresse abiótico ............................................................................................................. 32 3.2.1 Material biológico ....................................................................................................... 32 3.2.2 Parâmetros fisiológicos ............................................................................................... 32 3.2.3 Extração de RNA total e confecção do cDNA.............................................................. 33 3.2.4 PCR quantitativo em tempo real .................................................................................. 34 3.2.5 RNA-Seq .................................................................................................................... 34 3.2.6 Análises de bioinformática .......................................................................................... 35 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 37 4.1 Estresse biótico .............................................................................................................. 37 4.1.1 Genes de cana-de-açúcar diferencialmente expressos em resposta à herbivoria e selecionados para validação ................................................................................................. 37 4.1.2 Inibidores de protease do tipo Bowman-Birk (BBI) ..................................................... 40 4.1.3 Inibidores de protease: MPI e inibidor de subtilisina .................................................... 43 10 4.1.4 Serina proteases ........................................................................................................... 45 4.2 Estresse abiótico ............................................................................................................. 49 4.2.1 Parâmetros fisiológicos e monitoramento de transcritos por PCR quantitativo ............. 49 4.2.2 RNA-Seq..................................................................................................................... 53 4.2.3 Validação do RNA-Seq por PCR em tempo real .......................................................... 63 5 CONCLUSÕES ................................................................................................................ 67 REFERÊNCIAS................................................................................................................... 69 ANEXOS..................................................................................................................................81 11 RESUMO Estudo dos perfis transcricionais em resposta ao estresse biótico e abiótico em cana-de- açúcar A cana-de-açúcar é uma gramínea C4 de alta biomassa que acumula grandes quantidades de sacarose e é utilizada para