UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA, GENÉTICA Y FISIOLÓGICA DE CIANOBACTERIAS DOMINANTES EN SISTEMAS FLUVIALES TESIS DOCTORAL Esther Berrendero Gómez Madrid, 2008 Memoria presentada para optar al Grado de Doctor de Ciencias Madrid a 1 de Marzo de 2008 Fdo. Esther Berrendero Gómez Licenciada en Bioquímica DIRECTORA Fdo. Dra. Pilar Mateo Ortega Profesora Titular Dpto. Biología Universidad Autónoma de Madrid Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Biología de la Universidad Autónoma de Madrid, bajo la dirección de la doctora Pilar Mateo Ortega (Profesora Titular. UAM). Para ello se contó con una beca de formación del profesorado universitario del Ministerio de Educación y Ciencia (FPU-MEC) Gracias a toda la gente a la que quiero y me quiere Por regalarme amor, cariño, respeto, critica, consejos y apoyo Por calmar mi ansiedad y controlar mis nervios Por entender como soy y aclarar mis dudas. En especial a: Mi familia, el eterno apoyo ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS AA – medio Allen y Arnon ADN – ácido desoxirsibonucleico ARNr – ácido ribonucleico ribosómico Bis-pNPP – bis (para-nitrofenil) fosfato BLAST – acrónimo del inglés Basic Local Alignment and Search Tool BSA – albúmina de suero bovino del inglés “bovine suerum albumine” BTP – bis tris propano Chl a – clorofila a CI – Cromatografía iónica. cpcBA-IGS - espacio intergénico y las regions flanqueantes del operon de la ficocianina del inglés “the phycocyanin intergenic spacer and flanking regions” CTAB - N-Cetil-N,N,N-Trimetilamonio bromuro DGGE – electroforesis en geles desnaturalizantes por gradiente químico del inglés Desnaturing gradient gel electrophoresis dNTPs – desoxinucleótidos trifostatos EDTA - ácido etileno diamino tetra acético, acrónimo del inglés ethylene diamine tetra acetic acid g - gramo h - hora HEPES - N-(2-Hidroxietil) piperazina- N’-(2-ácido etanosulfónico) kb – kilo bases KM – constante de Michaelis-Menten l - litro LB – iniciales de las palabras inglesas Lysogeny broth (caldo lisogénico) min - minuto mg - miligramo ml - mililitro µg - microgramo µl - microlitro ML – maximum likelihood Abreviaturas y Acrónimos _______________________________________________ MP – maximum parsimony MU – 4 – metil umbeliferona MUP – 4 – metil umbeliferil fosfato NCBI – acrónimo del inglés Nacional Center for Biotechnology Information NID – nitrógeno inorgánico disuelto NJ – neighbor-joining nmol - nanomoles PAR – radicación activa fotosintética PCR - reacción en cadena de la polimerasa, del inglés polymerase chain reaction PDEase - fosfodiesterasa PMEase - fosfomonoesterasa pNP - para-nitrofenol pNPP - para-nitrofenil fosfato. POS – fósforo orgánico soluble PRS - fósforo reactivo soluble PTF - fósforo reactivo total filtrado RFLPs - polimorfismo de los fragmentos de restricción del ADN, del inglés restriction fragment length polymorphisms rpm - revoluciones por minuto S - Sustrato SIDI - Servicio Interdepartamental de Investigación. Tª agua – temperatura del agua Tª amb – temperatura ambiente TAE – tris acético tampon TEMED – N,N,N’,N’ - tetrametiletilenediamina TGGE - electroforesis en geles desnaturalizantes por gradiente térmico del inglés temperature gradient gel electrophoresis Tt – tiempo de transformación del sustrato o “turn over” V – velocidad Vmax – velocidad máxima ÍNDICE INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1 I. CIANOBACTERIAS. CARACTERÍSTICAS GENERALES ......................... 1 I.1. Ecologia. Distribución de las cianobacterias .............................................. 2 I.2. Organización celular. ................................................................................... 4 I.2.1. Células vegetativas ............................................................................ 4 I.2.2. Células especializadas ....................................................................... 6 II. DIVERSIDAD MORFOLÓGICA. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA .... 7 II.1. Orden Oscillatoriales. Subsección III ..................................................... 13 II.1.1. Clasificación taxonómica ............................................................... 15 II.2. Orden Nostocales. Subsección IV. ........................................................... 17 II.2.1. Clasificación taxonómica ............................................................... 18 II.2.2. Género Nostoc. ............................................................................... 21 II.2.3. Género Calothrix ............................................................................ 21 II.2.4. Género Rivularia ............................................................................ 22 II.2.5. Género Tolypothrix ........................................................................ 22 III. DIVERSIDAD GENÉTICA. INCORPORACIÓN DE MÉTODOS MOLECULARES EN LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CIANOBACTERIAS. ................................................................................. 23 III. 1. Métodos moleculares empleados para la caracterización de cianobacterias. ............................................................................................ 24 III.1.1. Operon de la ficocianina (cpcBA-IGS). ........................................ 25 III.1.2. Subunidad del ARN ribosómico 16S (ARNr 16S). ...................... 27 III.1.3. Técnicas de perfiles genéticos o “finger printing”. ....................... 28 IV. DIVERSIDAD FISIOLÓGICA ...................................................................... 30 IV.1. Metabolismo de las cianobacterias ......................................................... 30 IV.1.1. Actividad fosfatasa ....................................................................... 31 IV.1.1.1. Enzimas fosfatasas. Localización. ............................................. 34 IV.1.1.2. Factores que influyen en la síntesis y degradación de la enzima fosfatasa. ............................................................................................ 35 IV.1.1.3. Factores ambientales que regulan la actividad fosfatasa. .......... 37 IV.1.1.4. Medida de la actividad fosfatasa. ............................................... 39 i IV.1.1.5. Ventajas adaptativas relacionadas con el metabolismo del P y la actividad fosfatasa. ............................................................................ 40 Formación del pelo ............................................................................ 40 Polifosfatos ........................................................................................ 41 IV.1.2. Fijación de N2 ............................................................................... 42 IV.1.2.1. Estructura del complejo enzimatico nitrogenasa.. ..................... 43 IV.1.2.2. Estrategias adoptadas por los diferentes organismos para la fijación del nitrógeno. ........................................................................ 44 IV.1.2.3. Mecanismo de fijación del nitrógeno y asimilación. ................. 46 ANTECEDENTES Y OBJETIVOS DEL TRABAJO ............................................ 48 DESCRIPCIÓN DEL MEDIO ................................................................................. 50 I. Río Alberche. ...................................................................................................... 51 II. Río Alhárabe. .................................................................................................... 52 III. Río Amir. .......................................................................................................... 53 IV. Río Blanco. ....................................................................................................... 54 V. Río Endrinales. .................................................................................................. 55 VI. Río Guadarrama. ............................................................................................. 55 VII. Río Matarraña. ............................................................................................... 57 VIII. Arroyo Mediano ........................................................................................... 58 IX. Arroyo Tejada Y Arroyo Cereal .................................................................... 59 X. Arroyo Red ........................................................................................................ 60 XI. Río Muga. ......................................................................................................... 61 XI.1. Descripción del punto de muestreo ........................................................ 62 XI.2. Características fisico-químicas del agua ............................................... 66 MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 70 I. MATERIAL BIOLÓGICO. .............................................................................. 70 II. TÉCNICAS DE CULTIVO DE CIANOBACTERIAS. ................................ 72 II.1. Medios de cultivo ..................................................................................... 72 II.2. Condiciones de cultivo y siembra ............................................................ 73 III. TÉCNICAS DE AISLAMIENTO DE CIANOBACTERIAS...................... 74 III.1. Aislamientos de cianobacterias del epiliton .......................................... 74 III.2. Aislamientos de cepas a partir de colonias de Rivularia ...................... 75 IV.TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA