“EXTRACTION AND PURIFICATION OF ANTIOXIDANT FRACTIONS FROM FOREING SPECIES” EUROPEAN DOCTORAL THESIS María Parada Casas Ourense, julio 2017 International Doctoral School María Parada Casas “EXTRACTION AND PURIFICATION OF ANTIOXIDANT FRACTIONS FROM FOREIGN SPECIES” Dª Herminia Domínguez González, D. Andrés Moure Varela, Dª Enma Conde Piñeiro 2017 International Doctoral School Dª Herminia Domínguez González, Dr. Andrés moure Varela and Dr. Enma Conde Piñeiro, DECLARE that the present work, entitled “EXTRACTION AND PURIFICATION OF ANTIOXIDANT FRACTIONS FROM FOREIGN SPECIES” to obtain the title of Doctor, was carried out by Dª MARIA PARADA CASAS, under our supervision in the PhD programme “RD 1393/2007” Ourense, July 2017 Dr. Herminia Domínguez González Dr. Andrés Moure Varela Dr. Enma Conde Piñeiro AGRADECIMIENTOS‐ACKNOWLEDGMENTS Me gustaría que estas líneas sirvieran para expresar mi más profundo y sincero agradecimiento a todas aquellas personas que me han ayudado de una u otra manera en la realización del presente trabajo el cual ha significado un reto tanto personal como profesional… Quisiera agradecer a mis directores de tesis, Dra. Herminia Domínguez, Dr. Andrés y Dra. Enma Conde por haberme facilitado tanto la realización de este trabajo, muy especialmente a Herminia, por haberme aceptado primero como proyectista y después como estudiante de doctorado, por la confianza que me ha dado, por su ayuda infinita, y apoyo y palabras de ánimo constante y hasta el último momento. Un punto y aparte merece Enma, de la cual he aprendido muchísimas cosas, tanto a nivel profesional como personal, por su capacidad de trabajo, templanza y paciencia conmigo (sobre todo al principio) por sus consejos, risas y charlas entre experimental y párrafos…te admiro. Gracias al grupo de investigación de Ingeniería Química, muy especialmente a Jose Luis Alonso, por brindarme la oportunidad de formar parte de un gran equipo. Gracias también al grupo de investigación da FRAU (free radicals and antioxidants unit) de Química Aplicada do Departamento de Ciências Químicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, a la Dra. Eduarda Fernandes, por haberme permitido trabajar y aprender en su laboratorio, por su hospitalidad desde antes incluso de que llegara. Gracias a las Dras. Marisa Freitas y Daniela Ribeiro por haberme hecho sentir como en casa, por su ayuda en todos los ámbitos, por crear ese ambiente de trabajo tan genial. También a Carina y a Priscilla y al resto de doctorandas de Brasil sin todas vosotras no habría sido lo mismo. Quiero dar las gracias a mis compañer@s del grupo de investigación de Ingeniería Química, a Carlos, Mª Jesús Susana, Belén, Sandra, Miguel, Elena, Noelia…a los que están y a los que ya se han ido, por su ayuda y colaboración y con los cuales también he compartido muy buenos momentos. Gracias a todos mis amigos y amigas, a los de la infancia y a los que habéis llegado más tarde, por vuestro interés, porque de todos he recibido constantes palabras de ánimo, por vuestro empuje en los momentos más complicados y las palmaditas en el hombro tras cada pequeño logro. Gracias a Carmen por ayudarme siempre en todo y en todos los aspectos de mi vida sin importar día, hora o lugar. Gracias a mi familia, empezando por mi abuelo, por sus sabios consejos, el que siempre me ha inculcado el estudio y la capacidad de trabajo, te siento siempre conmigo y sé que me sigues ayudando. A mi abuela por escucharme siempre, por ayudarme en todo, por su risa contagiosa… A mi tío, el cual siempre me lo ha dado todo y me lo sigue dando, por su preocupación, consejos y palabras de reconocimiento. A mi madre, por su amor incondicional, por su vida dedicada a nosotras, como no, por sus consejos, porque siempre acertaste y porque en el fondo nunca me dejaste. A mi hermana porque a pesar de su juventud es una de las personas más fuertes y con más fuerza de voluntad que conozco, un ejemplo para mi en muchas aspectos de la vida. A mi madre INDEX INDEX PREFACE ………………………………………………………………………………………………….…….…………….I SUMMARY…………………………………………………………………………………………………….…………….II RESUMEN………………………………………………………………………………………………..……….…………IX 1.INTRODUCTION 1.1 Antioxidants……………………………………………………………………………………………………………1 1.1.1. Definition of antioxidant………………………………………………………………….……..1 1.1.2. Natural and synthetic antioxidants………………………………………………………...2 1.1.3. Antioxidant activity…………………………………………………………………………..….…3 1.1.4. Measurement of antioxidant activity…………………………………………………......5 1.2 Natural phenolic compounds………………………………………………………………………………….7 1.2.1. Origin and formation of phenolic compounds………………………………….……..7 1.3 Natural compounds with antioxidant activity and major sources…………………………..7 1.3.1. Natural compounds with antioxidant activity……………………………..………..…7 1.3.2. Classification………………………………………………………………………………………..…9 1.3.3. Environmentally friendly extraction technologies…………………………………14 1.3.3.1. Hydrothermal processes for extraction…………………………………..14 1.3.3.2. Enzyme assisted extraction…………………………………………………….15 1.3.3.3. Microwave assisted extraction…………………………………………....…16 1.3.3.4. Supercritical fluids……………………………………………………….………….18 1.3.4. Recovery, concentration and purification of phenolic compounds…….….26 1.3.4.1. Adsorption-desorption processes………………………………….……….26 2. OBJECTIVES AND WORK PLAN 2.1. Objectives……………………………………………………………………………………………………………33 2.2. Work plan……………………………………………………………………………………..……………..……..33 3. MATERIALS AND METHODS 3.1. Raw materials…………………………………………………………………………………..…………………35 3.2. Experimental procedures……………………………………………………………………..……………..36 3.2.1. Extraction methodologies……………………………………………………………………..36 3.2.1.1. Hydrothermal treatments: autohydrolysis …………………………..…36 3.2.1.2. Enzyme-assisted extraction………………………………………………….…37 3.2.1.3. Solvent fractionation……………………………………………………...........38 3.2.1.4. Supercritical fluid extraction…………………………………………………..38 3.2.1.5. Microwave hydrogravity extraction (MHG)………………………….…39 3.2.2. Recovery, fractionation and purification of extracts………………………………39 3.2.2.1. Static adsorption and desorption studies………………………………..40 3.2.2.2. Determination of adsorption‐desorption properties ………………41 3.2.2.3. Dynamic adsorption and desorption studies…………………………..45 3.3. Analytical methods……………………………………………………………………………………………..45 3.3.1. Moisture content and total solids determination …………....................…..45 3.3.2. Extraction yield determination………………………………………………..……………46 3.3.3. Total phenols determination…………………………………………………………..….…46 3.3.4. Floroglucinol equivalents………………………………………………………………………47 3.3.5. Chromatographic techniques……………………………………………………….……....48 3.3.5.1 High performance liquid chromatography (HPLC) ……………….....49 3.3.5.2. Gas chromatography (GC)……………………………………………………….50 3.3.6. In vitro antioxidant activity methods…………………………………………………….50 3.3.6.1. DPPH radical scavenging capacity assay ………………………………..51 3.3.6.2. Trolox equivalent antioxidant capacity assay or ABTS radical scavenging capacity assay ………………………………………………………………………………………….52 3.3.6.3. Ferric reducing antioxidant power assay ……………..……………..…54 3.3.6.4. Antitumoral activity…………………………………………………………..……55 3.3.6.5. Anti-inflammatory activity………………………………………………….…..56 3.3.6.6. COX-1 and COX-2 assays………………………………………………………...57 3.4. Scanning electron microscopy (SEM)…………………………………………………………………..58 3.5. Mathematical procedure…………………………………………………………………………………….58 3.5.1. Calculation of adsorption capacity and adsorption ratio………………...…….58 3.5.2. Adsorption kinetics……………………………………………………………………………....59 3.5.3. Adsorption isotherms……………………………………………………………………….…..60 3.5.4. Desorption process……………………………………………………………………….………62 3.5.4.1. Calculation of desorption ratio……………………………………………….62 3.5.4.2. Dynamic desorption studies…………………………………………………...62 3.5.4.3. Dynamic adsorption modeling………………………………………………..62 3.5.4.3.1. Modelo of Thomas……………………………………………………63 3.5.4.3.2. Modelo of Adams–Bohart ………………………………….……64 3.5.4.3.3. Modelo dof Yoon–Nelson…………………………….…………..65 4. RESULTS 4.1. Enzyme aided aqueous procesing of Sargassum muticum…………………………………..67 4.2. In vitro bioactive properties of phlorotannins recovered from hydrothermal treatment of Sargassum muticu………………………………………………………………………………...85 4.3. Solvent fractionation of ethanolic extracts from Acacia dealbata flowers…………119 4.4. Supercritical CO2 extracts from Acacia dealbata flowers……………………………………131 4.5. Sequential extraction of Hericium erinaceus using Green…………………………….……145 5. GENERAL CONCLUSIONS………………………………………………………………………………….….161 6. REFERENCES………………………………………………………………………………………………………...163 7. APPENDIX…………………………………………………………………………………………………………….179 PREFACE This PhD Thesis has been conducted at the Department of Chemical Engineering at the University of Vigo (Faculty of Science, Ourense Campus) under the supervision of Dr. Herminia Domínguez González, Dr. Andrés Moure Varela and Dr. Enma Conde Piñeiro. During my PhD Thesis period my research work has been based on the optimization of the conditions for the extraction and purification of bioactive products of three different types of plant biomass: Sargassum muticum macroalga, Acacia dealbata flowers and Hericium erinaceus, using clean extraction technologies such as enzyme assisted extraction, subcritical water extraction, supercritical CO2 extraction and microwave assisted extraction. Purification using resins and gels served to obtain high purity concentrates and the possible application of the fractions obtained in the cosmetic and pharmaceutical field was evaluated by in vitro cell cultures to assess the anti-inflammatory