Etablierung des E2F1-Interaktoms metastasierungsrelevanter Faktoren durch Integration bioinformatischer und experimenteller Methoden Dissertation Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) der Mathematisch‐Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Rostock vorgelegt von Stephan Marquardt, geboren am 05.07.1981 in Berlin Rostock, Oktober 2019 https://doi.org/10.18453/rosdok_id00003004 Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung-Nicht kommerziell 4.0 International Lizenz. Gutachter: Frau Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. Brigitte M. Pützer, Institut für Experimentelle Gentherapie und Tumorforschung an der Universitätsmedizin Rostock Herr Prof. Dr. rer. nat. Lars Kaderali, Institut für Bioinformatik der Universität Greifswald Jahr der Einreichung: 2019 Jahr der Verteidigung: 2020 Vorwort „Ich werde Pflanzen und Tiere sammeln, die Wärme, die Elastizität, den magnetischen und elektrischen Gehalt der Atmosphäre untersuchen, sie zerlegen, geografische Längen und Breiten bestimmen, Berge messen – aber alles dies ist nicht Zweck meiner Reise. Mein eigentlicher, einziger Zweck ist, das Zusammen- und Ineinander-Weben aller Naturkräfte zu untersuchen, den Einfluss der toten Natur auf die belebte Tier- und Pflanzenschöpfung.“ Alexander von Humboldt (1769 ‐ 1859) in „Versuch über den politischen Zustand des Königreichs Neu‐ Spanien“ (1813) Inhaltsverzeichnis I. Einleitung ..................................................................................................................... 1 I.1. Der Transkriptionsfaktor E2F1 ..................................................................................... 5 I.1.1. E2F1 als Schlüsselprotein im Zellzyklus ................................................................ 6 I.1.2. E2F1 als Tumorsuppressor ‐ Regulator der DNA‐Integrität und Auslöser der Apoptose ...................................................................................................................... 10 I.1.3. E2F1 als Onkogen – Auslöser von Tumorwachstum und Metastasierung ......... 12 I.1.4. E2F1 ist in zahlreiche weitere zelluläre Prozesse involviert ............................... 14 I.2. Genregulatorische Netzwerke ................................................................................... 16 I.3. Zielsetzung ................................................................................................................. 19 II. Material und Methoden ............................................................................................ 21 II.1. Material .................................................................................................................... 21 II.1.1. Geräte ................................................................................................................ 21 II.1.2. Chemikalien und Enzyme ................................................................................... 22 II.1.3. Kits ...................................................................................................................... 23 II.1.4. Plasmide ............................................................................................................. 23 II.1.5. Adenovirale Vektoren ........................................................................................ 23 II.1.6. Lentivirale Vektoren ........................................................................................... 24 II.1.7. Zelllinien ............................................................................................................. 25 II.1.8. Antikörper .......................................................................................................... 26 II.1.9. Oligonukleotide .................................................................................................. 27 II.1.10. Online‐Datenbanken und Software ................................................................. 27 II.2. Methoden ................................................................................................................. 30 II.2.1. RNA‐Arbeitstechniken ........................................................................................ 30 II.2.2. DNA‐Arbeitstechniken ....................................................................................... 31 II.2.3. Protein‐Arbeitstechniken ................................................................................... 33 II.2.4. Zellbiologische Arbeitstechniken ....................................................................... 35 II.2.5. Konstruktion und Analyse des E2F1‐Interaktionsnetzwerkes ........................... 38 II.2.6. Akquisition von Daten aus bioinformatischen Datenbanken ............................ 39 III. Ergebnisse ................................................................................................................ 47 III.1. Das E2F1‐Interaktom ............................................................................................... 47 III.1.1. Modellierung des E2F1‐Interaktions‐Netzwerkes zur E2F1‐Map ..................... 47 III.1.2. Systembiologische Analyse der E2F1‐Map ....................................................... 54 III.1.3. Validierung der Ergebnisse der in silico‐Simulationen in Tumorzelllinien ....... 57 III.1.4. Analyse von Brust‐ und Blasenkrebs‐Patientendaten der TCGA‐Datenbank ... 69 III.2. Das Koregulom von E2F1 und TGFβ ........................................................................ 73 IV III.2.1. Screening bekannter und potentieller Zielgene von E2F1 und SMAD2‐4 mithilfe von ChIP‐seq‐Daten ..................................................................................................... 74 III.2.2. Sequenzbasierte Suche von TFBS im Humangenom durch PWM .................... 75 III.2.3. Identifizierung von E2F1‐ und SMAD2‐4‐regulierten Genen in humanen Zelllinien mit Hilfe von Transkriptomdaten ................................................................. 76 III.2.4. Zuordnung der potentiellen Zielgene zu TGFβ‐assoziierten Signalwegkaskaden 77 III.2.5. Überlappung der potentiellen Zielgene mit bekannten EMT‐Markern und EMT‐ assoziierten Faktoren ................................................................................................... 77 III.2.6. Korrelations‐Analyse von Expressionsdaten der TCGA‐Datenbank ................. 80 III.2.7. Zusammenfassung und Auswertung der gesammelten Daten mithilfe einer multi‐objektiven Optimierungsfunktion ...................................................................... 81 IV. Diskussion ............................................................................................................... 85 IV.1. Beispiele systembiologischer und bioinformatischer Arbeiten .............................. 86 IV.2. Die kombinierte Netzwerkanalyse als Werkzeug für die Identifizierung tumorrelevanter Mechanismen/Signaturen – E2F1 als EMT‐induzierender Faktor ....... 88 IV.3. TGFβ als EMT‐induzierender Faktor ........................................................................ 94 IV.4. Das Koregulom zweier potentieller Onkogene ....................................................... 96 IV.5. Zusammenfassung ................................................................................................... 99 V. Anhang ........................................................................................................................ i V Abkürzungsverzeichnis 4‐OHT 4‐Hydroxy‐Tamoxifen AK mk/pk Antikörper, monoklonal/polyklonal BLCA TCGA Bladder Cancer Kohorte bp Basenpaare BRCA TCGA Breast Cancer Kohorte BS Binding Site/Bindestelle cDNA komplementäre DNA CMV Cytomegalovirus DBD DNA Bindedomäne DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DNA Desoxyribonukleinsäure ECM Extracellular Matrix/Extrazelluläre Matrix EGFR Epidermal Growth Factor Receptor EMT epithelial‐mesenchymale Transition FBL Feedback Loop FBS fetal bovin Serum FC Fold Change FFL Feedforward Loop FGFR1 Fibroblast Growth Factor Receptor 1 GEO Gene Expression Omnibus GFP Green Fluorescent Protein GO Gene Ontology GRN Genregulatorisches Netzwerk HRP Horseradish Peroxidase iPC induced pluripotent cells mRNA messenger Ribonukleinsäure MOI Multiplicity of Infection NES Nuclear Export Signal/Sequence NLS Nuclear Localization Signal/Sequence VI PBS phosphatgepufferte Saline PCR Polymerase‐Kettenreaktion PPI Protein‐Protein‐Interaktion PWM Position Weight Matrix RIPA Radio‐Immun‐Präzipitations‐Assay‐Puffer Rb Retinoblastoma Protein rpm rounds per minute RPMI Roswell Park Memorial Institute‐Medium RT Raumtemperatur TBS(T) Tris‐gepufferte Saline (mit 0,1% Tween 20) TCGA The Cancer Genome Atlas TF Transkriptionsfaktor TFBS Transkriptionsfaktor‐Bindestelle TGFβ(R1/2) Tumor Growth Factor beta (Receptor 1 und 2) Tm primerspezifische Schmelztemperatur TME Tumormicroenvironment/Tumormikromilieu TSS Transcription Start Site UV Ultraviolett VII I. Einleitung Krebs ist zur zweithäufigsten Erkrankung des Menschen avanciert. Die Zahl der Neuerkrankungen im Jahr 2018 wird 18,1 Millionen übersteigen, die Todesfallrate liegt mit 9,6 Millionen bei mehr als der Hälfte (IARC, 2018). Diese Entwicklung ist auf eine Vielzahl von Ursachen zurückzuführen. Zum einen sind es äußere Faktoren, die die Tumorentstehung hervorrufen oder zumindest begünstigen. Dazu zählen Lebens‐ und Ernährungsgewohnheiten wie Rauchen, Alkoholkonsum, Übergewicht, mangelnde körperliche Bewegung, Dysstress und Umwelteinflüsse wie die UV‐Belastung und Luftverschmutzung, die das Risiko an Krebs zu erkranken besonders in Industrienationen erhöhen.