UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Veterinária Tese Bacterina de Staphylococcus aureus contendo própolis como adjuvante para controle da mastite Fernando da Silva Bandeira Pelotas, 2015 Fernando da Silva Bandeira Bacterina de Staphylococcus aureus contendo própolis como adjuvante para controle da mastite Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Veterinária da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área de concentração: Sanidade Animal). Orientador: Prof. Dr. Geferson Fischer Coorientadores: Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite Prof. Dr. João Luiz Zani Pelotas, 2015 Universidade Federal de Pelotas / Sistema de Bibliotecas Catalogação na Publicação B214b Bandeira, Fernando da Silva Ba Bacterina de staphylococcus aureus contendo própolis como adjuvante para controle da mastite / Fernando da Silva Bandeira ; Geferson Fischer, orientador ; Fábio Pereira Leivas Leite, João Luiz Zani, coorientadores. — Pelotas, 2015. Ban112 f. : il. BanTese (Doutorado) — Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, 2015. Ba1. Vacina. 2. Imunidade. 3. ELISA. 4. qPCR. 5. CXCR-5. I. Fischer, Geferson, orient. II. Leite, Fábio Pereira Leivas, coorient. III. Zani, João Luiz, coorient. IV. Título. CDD : 636.214 Elaborada por Gabriela Machado Lopes CRB: 10/1842 Fernando da Silva Bandeira Bacterina de Staphylococcus aureus contendo própolis como adjuvante para controle da mastite Tese aprovada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Ciências, Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas. Data da Defesa: 25/02/2015 Banca examinadora: Prof. Dr. Geferson Fischer (Orientador) Pós-Doutor em Ciências Agrárias pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul Prof. Dr. Fábio Pereira Leivas Leite Pós-Doutor em Ciências Agrárias pela University of Idaho-Moscow. Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva Doutor em Ciência dos Alimentos pela Universidade de São Paulo Profa. Dra. Helenice Gonzalez de Lima Doutora em Zootecnia pela Universidade Federal de Pelotas Dedico esse trabalho a todos aqueles a quem não pude dar a atenção que mereciam: sejam alunos, colegas, amigos ou familiares e mesmo assim souberam entender... Dedico também, e principalmente, a todas as pessoas que não mediram esforços para colaborar... Agradecimentos A Universidade Federal de Pelotas, particularmente a Faculdade de Veterinária, por ser a minha casa em um relacionamento que já dura quase 17 anos e está apenas no início... Aos meus pais e minha companheira Daniella, por estarem presentes nos grandes momentos da minha vida. Ao meu orientador Prof. Dr. Geferson Fischer, pela confiança, seriedade, ensinamentos e sua grande amizade, acima de tudo. Ao meu comitê de orientação, prof. Dr. Fábio Leivas Leite, quem conheci nessa jornada, mas esteve sempre disposto a auxiliar sem nunca medir esforços em transmitir seus conhecimentos. Ao prof. Dr. João Luiz Zani, que além das valiosas informações que fizeram parte do sucesso desse momento, sempre demonstrou uma enorme amizade e, principalmente, por ser um dos responsáveis pela minha transferência, que entre outras coisas me possibilitou a realização do doutorado. Ao prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, responsável por contribuições valiosas desde o início de minha trajetória na vida acadêmica e que sempre esteve presente, seja fornecendo um isolado bacteriano que foi fundamental para o sucesso dos testes imunoenzimáticos, seja por esclarecer dúvidas, seja pelos momentos em que a sua experiência ajudou a nortear os caminhos de minha vida profissional. A profa Dra Helenice de Lima Gonzales, pelos seus valiosos conhecimentos sobre a produção animal e qualidade do leite, além do “empréstimo” de soro sanguíneo de vacas com mastite, fundamentais para adequação de algumas de nossas técnicas. A profa Fernanda Rezende Pinto, além de minha colega de profissão, foi a responsável por não só manter as disciplinas que ministramos, mas pelo salto de qualidade que estamos conseguindo imprimir em nossas atividades docentes. Aos professores Marcelo e Sílvia, do LABVIR, contribuindo sempre com idéias e sugestões que elevaram o nível da tese. Ao prof. Éverton Fagonde da Silva, e ao amigo Samuel Félix pelas nossas conversas técnicas despretensiosas que me permitiram encontrar alternativas quando os caminhos pareciam bem mais tortuosos. Ao prof. Schuch, onde várias dúvidas foram sanadas e, junto com suas orientadas, agradeço por dividirem o laboratório comigo. Ao prof.Niraldo, pelas instruções sobre como entender o própolis, e a profa Amarilis por me ensinarem que trabalhar com a própolis é mais do que uma técnica: é um arte. A todos os colegas de tantos laboratórios pelos quais passei, sejam na veterinária, no CDTec, no biotério, na botânica, na farmacologia da UFSC, enfim. Particularmente aos amigos Toni, Cris e Raulene, por estarem sempre perto, ajudando e aturarem minhas trapalhadas e atacações. Ao Itauá, Dênis, Mateus. Rodrigo, Cacá, Dedé, Aline, Anelise, Patrícia, Débora, Márcias... A dona Márcia, Lídio, Gancho, a Leca, ao Zeca e ao “Seu” Paulo, por suas palavras de incentivo a realização de um doutorado. A todos aqueles que esqueci momentaneamente... Ninguém nos disse quem éramos... Ninguém nos disse o que deveríamos tentar... Ninguém nos disse que seria fácil. Alguém disse: Que somos nossos sonhos, Que se não sonhamos, estamos mortos... Nossos passos seguem o instinto que nos leva ao desconhecido, Nós não olhamos os obstáculos superados: E sim aqueles que ainda vamos superar. Kílian Jornet Resumo BANDEIRA, Fernando da Silva. Bacterina de Staphylococcus aureus contendo própolis como adjuvante para controle da mastite. 2015. 112f. Tese (Doutorado em Ciências) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015. A mastite bovina é um problema sanitário mundial, com medidas de tratamento e prevenção insatisfatórias. Paralelamente, vem crescendo o interesse no uso de própolis como alternativa para tratamento das mastites, sendo ainda, objeto de estudos com finalidade de uso como adjuvante. Até o momento, porém, não foi descrito seu uso em vacinas para controle da mastite bovina. A importância do gênero Staphylococcus como agente da enfermidade é bem documentada, crescendo a necessidade de identificação da espécie do agente etiológico. A pesquisa identificou 12,6% de estafilococos coagulase positiva em mastites subclínicas na região sul do Brasil, sendo que S. aureus estando presente em 17,6% dos animais pesquisados. Dentre os isolados coagulase positiva, a frequência de S. aureus foi de 85,7%, a de S. intermedius foi de 8,5% e de S. hyicus foi 5,8%. A bactéria S. aureus utiliza vários fatores de patogenicidade para causar a infecção no hospedeiro. Foi pesquisado em bases de dados, as informações recentes sobre os principais produtos expressos e forma de atuação. Descreveu-se os principais mecanismos ligados a penetração do micro-organismo na glândula mamária, os processos que medeiam a formação do biofilme e suas estratégias de sobrevivência as respostas do hospedeiro, resultando em processos que muitas vezes tornam-se crônicos. Finalmente, é desejável a utilização de uma vacina eficiente para colaborar no controle da mastite, e dessa forma foi proposta a utilização de uma bacterina contendo extrato hidro-alcoólico de própolis verde na formulação. Comparou-se o seu efeito com uma formulação sem adição de própolis, vacina comercial e PBS esterilizado, em um trabalho conduzido em 63 bovinos. De forma semelhante, com os mesmos grupos de tratamento, mas com a adição de um grupo que recebeu apenas o extrato hidroalcoólico de própolis verde, foi conduzida uma pesquisa em 30 camundongos BALB/c. A pesquisa de anticorpos IgG em bovinos, demonstrou que tanto o tratamento contendo extrato hidroalcóolico de própolis verde quanto a bacterina sem própolis apresentaram resultados semelhantes, superiores aos tratamentos utilizando a vacina comercial e PBS, sendo que nos mesmos tratamentos, foi observada uma resposta com característica humoral inicialmente, tendendo a celular ao longo do experimento. Nos bovinos, a expressão relativa de RNAm para INF-γ, IL-2 e CXCR5 foi elevada para o grupo que recebeu a bacterina contendo extrato hidroalcoólico de própolis verde. Os resultados do teste de ELISA em camundongos, foram semelhantes aos encontrados para os bovinos. O grupo que recebeu apenas o extrato hidroalcoólico de própolis verde sem nenhuma combinação bacteriana, demonstrou resposta com predominância de IgG1 ao longo da pesquisa, semelhante aos grupos de vacina comercial e PBS. No modelo murino, a vacina comercial apresentou índices maiores de expressão de RNAm para as citocinas pesquisadas em esplenócitos. Os resultados obtidos sugerem que a bacterina contendo extrato hidroalcoólico de própolis verde apresenta potencial para atuar como ferramenta no controle da mastite bovina. Palavras-chave: vacina; imunidade; ELISA; qPCR; CXCR5 Abstract BANDEIRA, Fernando da Silva. Staphylococcus aureus bacterin containing propolis as adjuvant for mastitis control. 2015. 112f. Theses (Doctor degree in Sciences) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, 2015. Bovine mastitis is a global health problem and many scientific advances have occurred, but the treatment and prevention of disease with existing