Bruno Madio Purificação e caracterização da fração neurotóxica da peçonha da anêmona do mar Anthopleura cascaia Purification and characterization of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaia São Paulo 2012 Bruno Madio Versão corrigida conforme a Resolução CoPGr: 5890 Original encontra-se disponível no Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo Purificação e caracterização da fração neurotóxica da peçonha da anêmona do mar Anthopleura cascaia Purification and characterization of the neurotoxic fraction from the venom of the sea anemone Anthopleura cascaia Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, para a obtenção do Título de Mestre em Ciências, na Área de Fisiologia Geral. Orientador: José Eduardo Pereira Wilken Bicudo São Paulo 2012 Bruno Madio Madio, Bruno Purificação e caracterização da fração neurotóxica da peçonha da anêmona do mar Anthopleura cascaia. 169 páginas. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo. Departamento de Fisiologia Geral. 1. Toxinologia 2. Neurotoxinas 3. Anêmonas do mar. Universidade de São Paulo. Instituto de Biociências. Departamento de Fisiologia. Comissão Julgadora: Prof. Dr. José Eduardo Pereira Wilken Bicudo Prof.(a) Dr. (a) Prof.(a) Dr. (a) “...se alguém pensa que sabe alguma coisa, não a conhece ainda como convém conhecer...” I Corinthios 8:2 Por ter a certeza de que ciência não é construída de forma solitária e por ter obtido os resultados da minha dissertação por meio de favores e colaborações. Por esses e outros motivos gostaria de agradecer: Primeiramente a minha família, que sempre me amaram e me apoiaram incondicionalmente. Mesmo distantes do meu trabalho, em outras palavras, sem entender nada sempre me apoiaram e confiaram nas minhas metas. Ao Prof. José Carlos de Freitas, inicialmente meu orientador, por ter aberto as portas de seu laboratório. Mesmo ausente, me incentivou pela excelência de seus trabalhos publicados. Ao meu atual orientador, Prof. José Eduardo Pereira Wilken Bicudo, muito obrigado por assumir a complicada obrigação de me orientar. Ao Diego Jose Orts y Belato obrigado por desde a graduação estar ao meu lado nessa batalha. Não vejo como seria possível enfrentar tudo o que passamos sozinho. Ao professor Dr. Jan Tytgat e ao Laboratório de Toxicologia por me receber tão bem em seu país e por dar suporte para conseguir realisar tantos experimentos em tão pouco tempo. Ao Álvaro Rossan de Brandão Prieto da Silva, mesmo sem “vínculo” institucional, sempre esteve disposto em me ajudar. Obrigado por ser uma referência para mim como cientista e pessoa. A todos os amigos do departamento de fisiologia, não preciso citar nomes, pois quem me apoiou, compartilhou discussões, cafés, festas, almoços, etc. sabe que sou grato e terei muitos como amigos pelo resto da vida. Aos funcionários do Instituto de Biociências e do Departamento de Fisiologia Geral, muito obrigado por darem suporte para poder desenvolver meu trabalho. Ao CNPq e ao Instituto de Biociências da USP, obrigado pelo apoio financeiro. Agradeço a todos aqueles que de forma direta e indireta contribuíram para realização deste trabalho. Muito Obrigado! Índice Lista de Figuras ............................................................................................................................ I Lista de Tabelas........................................................................................................................... X Lista de Símbolos e Abreviaturas ............................................................................................ XI Lista de abreviaturas ............................................................................................................... XII Lista de símbolos ................................................................................................................... XIII Lista de abreviatura dos aminoácidos ................................................................................... XIV 1. Introdução ............................................................................................................................ 1 1.1 Anêmonas do mar – aspectos zoológicos .................................................................... 2 1.1.1 Cnidocitos .............................................................................................................. 4 1.2 Peçonha de anêmonas do mar ..................................................................................... 6 1.3 Neurotoxinas de anêmonas do mar .............................................................................. 7 1.4 Toxinas de anêmonas do mar e canais para potássio sensíveis à voltagem ............... 8 1.4.1 Toxinas de canal de potássio do tipo 1. ................................................................ 8 1.4.2 Toxinas de canal se potássio do tipo 2. ................................................................ 8 1.4.3 Toxinas de canal se potássio do tipo 3. ................................................................ 9 1.4.4 Toxinas de canal de potássio do tipo 4. ................................................................ 9 1.5 Canais para potássio dependentes de voltagem ........................................................ 10 1.5.1 Gating no segmento S6 ....................................................................................... 15 1.5.2 Inativação N-type (Gate “Ball-and-chain”) ........................................................... 18 1.5.3 Gating no filtro seletivo ........................................................................................ 18 1.5.4 Sensor de voltagem ............................................................................................. 20 1.5.5 Subfamílias de canais KV .................................................................................... 21 1.6 Toxinas de anêmonas do mar e canais para sódio sensíveis à voltagem.................. 26 1.6.1 Toxinas de canal de sódio tipo 1. ........................................................................ 27 1.6.2 Toxinas de canal de sódio tipo 2. ........................................................................ 29 1.6.3 Toxinas de canal de sódio tipo 3. ........................................................................ 30 1.6.4 Toxinas de canal de sódio tipo 4. ........................................................................ 30 1.6.5 Superfície bioativa de toxinas de anêmonas do mar que atuam em canal de sódio sensível à voltagem. .................................................................................................. 30 1.7 Canais para sódio sensíveis a voltagem ..................................................................... 33 1.7.1 Canais NaV de mamíferos ................................................................................... 37 1.7.2 Canais NaV de insetos versus mamíferos ........................................................... 40 1.8 Novas classes de toxinas de anêmonas do mar ......................................................... 43 1.9 Considerações finais ................................................................................................... 45 2. Objetivos ............................................................................................................................ 46 2.1 Objetivo geral .............................................................................................................. 47 2.2 Objetivos específios .................................................................................................... 47 3. Material e Métodos ............................................................................................................ 48 3.1 Reagentes ................................................................................................................... 49 3.2 Captura e manutenção das anêmonas do mar ........................................................... 49 3.3 Obtenção da peçonha de Anthopleura cascaia .......................................................... 49 3.4 Determinação do conteúdo protéico ........................................................................... 50 3.5 Purificação da peçonha de Anthopleura cascaia ........................................................ 50 3.5.1 Purificação por gel-filtração em gel de Sephadex G-50 ...................................... 50 3.5.2 Purificação por cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) da fração neurotóxica da peçonha .......................................................................................................................... 50 3.6 Determinação dos espectros de massa ...................................................................... 51 3.7 Determinação da sequência N-terminal ...................................................................... 51 3.8 Pesquisa de homologia dos peptídeos neurotóxicos .................................................. 52 3.9 Análise estatística........................................................................................................ 52 3.10 Medidas eletrofisiológicas em oócitos de Xenopus laevis – Técnica de voltage clamp com dois microeletrodos ......................................................................................................... 53 3.10.1 Isolamento e preparação dos oócitos ................................................................. 53 3.10.2 Eletrofisiologia ....................................................................................................