Université du Québec INRS-lnstitut Armand-Frappier Étude sur la biogenèse et le mouvement des usines virales induites par le virus de la mosaïque du navet Par Romain Grangeon Thèse présentée pour l’obtention du grade de philosophiae doctor (PhD) Jury d’évaluation Président du jury Patrick Labonté Examinateurs externes Peter Moffett (université de Sherbrooke) Guy Lemay (Université de Montréal) Directeur de recherche Jean-François La liberté RÉSUMÉ La capacité infectieuse d’un virus réside dans les interactions qu’il doit réaliser avec des protéines hôtes cibles. Sans ces interactions, il ne peut accomplir son cycle viral qui lui permettra d’infecter son hôte. Les virus à ARN de polarité positive (+) se répliquent en association avec des membranes et provoquent des changements cellulaires. Ces changements conduisent à la formation d’usines virales impliquées dans la réplication des virus. Le virus de la mosaïque du navet (TuMV, turnip mosaic virus), un virus à ARN(+) dont la taille du génome est d’environ 10kb, n’échappe pas à cette règle. Dans ce projet de doctorat, je me suis intéressé à la biogenèse de ces usines virales induites par le TuMV et de l’impact sur la cellule de la formation de telles structures. Je me suis également attardé au rôle que pouvaient jouer ces usines dans le transport intercellulaire du virus. Dans des travaux publiés dans Journal of Virology (Oct. 2009, Vol.83 n° 20 p. 10460— 10471), en collaboration avec Sophie Cotton, nous avons montré que la protéine virale 6K2 est responsable de la formation des usines et que plusieurs protéines de l’hôte impliquées dans la traduction sont présentes dans celles-ci. Nous y avons aussi identifié des protéines virales impliquées dans la réplication et la présence d’ARN viral. J’ai contribué à montrer que les usines virales sont mobiles et localisées le long des microfilaments d’actines. Le mouvement intracellulaire de ces vésicules est inhibé lorsque les cellules sont traitées avec de la latrunculin B, une drogue qui dépolymérise les microfilaments. Les résultats obtenus dans cet article suggèrent un couplage de la réplication et de la traduction. Dans un deuxième article publié également dans Journal of Virology (Sept. 2012 vol. 86 no. 17 p. 9255-9265), j’ai ensuite observé minutieusement la formation des usines virales au cours de l’infection. II existe deux types de structures bien distinctes: une structure périnucléaire d’environ lOpm de diamètre et de nombreuses vésicules de petites tailles. La structure périnucléaire est un amalgame de membranes issues du système sécrétoire, tandis que les vésicules de petites tailles sont localisées le long du réticulum endoplasmique (RE) du cortex et bougent rapidement. Il existe un lien fonctionnel entre ces deux types de structures, la structure périnucléaire est à l’origine des usines virales mobiles. Bien que les membranes du système sécrétoire se retrouvent dans la structure périnucléaire, le réseau du RE et les corps de Golgi ne semblent pas affectés. La structure périnucléaire est cependant en continuité avec les membranes du système sécrétoire. De plus, nous avons constaté que le TuMV bloque la sécrétion des protéines dans l’apoplaste. L’implication des usines virales dans le mouvement intercellulaire du TuMV a été étudiée et les résultats ont été soumis pour publication dans le journal “Proceedings of the National Academy of Sciences. J’ai observé que les vésicules 6K2 traversent les plasmodesmes pour se rendre dans les cellules adjacentes. Ce phénomène est rendu possible par l’action de facteurs viraux qui augmentent la taille limite d’exclusion des plasmodesmes et facilitent le passage des vésicules. En collaboration avec Juan Wan, nous avons retrouvé des agrégats membranaires marqués avec 6K2 et contenant de l’ARN viral dans le xylème. Ces données suggèrent que le transport symplasmique et vasculaire implique un complexe viral associé à des membranes. Un clone infectieux permettant de visualiser le site de la réplication virale a été inséré dans un plasmide qui exprime un marqueur du RE. Cette construction permet de suivre les mouvements intercellulaires du TuMV. Grâce à cet outil, avec la collaboration de Maxime Agbeci, nous avons déterminé que le système sécrétoire précoce et tardif est requis pour le mouvement du TuMV. L’endocytose n’est en revanche pas sollicitée. Dans ce travail qui a été soumis à PLoS Pathogens, j’ai calculé que la vitesse de migration du virus est d’une cellule infectée en moyenne toutes les 3 heures. Dans son ensemble, ce projet apporte des avancées significatives sur la compréhension des mécanismes de réplication des phytovirus et des virus à ARN(+). Romain grangeon Jean-François Laliberté Directeur de recherche 11 REMERCIEMENTS pr Tout d’abord, je tiens à remercier chaleureusement le Jean-François Laliberté, d’une aide mon directeur de recherche, de m’avoir accueilli dans son laboratoire. Il a été constante, sans sa disponibilité et sa patience je ne pense pas que j’aurais pu mener à bien garde, en ce projet. Quand j’ai commencé en septembre 2008, il m’a tout de suite mis en me disant que je ne m’étais pas engagé dans une course de sprinteurs, mais plutôt dans à chaque moment où une course de fond, un marathon. Il a su me pousser et m’encourager j’en avais besoin. Je me rappelle notamment une de ses fameuses phrases qu’il m’a souvent répétée “If it’s ain’t broken, DON’T fix it”. Sa bonne humeur, et son enthousiasme perpétuel face aux difficultés que l’on a pu rencontrer, ont été pour moi une source de sur ce point il a été bien plus motivation. Il m’a aussi fait découvrir un pays, une culture, et qu’un simple directeur de recherche. Je tiens également à remercier les nombreux collègues du laboratoire, Sophie Cotton, Isabelle Mathieu qui étaient déjà présentes dans le laboratoire à mon arrivée. Mais également les collègues avec qui j’ai cohabité plusieurs années en partageant leur quotidien, Maxime Agbeci, Jun Jiang, Juan Wan, et plus récemment Daniel Garcia. Je remercie également les collaborateurs qui ont contribué à ce projet notamment le pr Hugo Zheng de l’université McGill, Gilles Grondin de l’université de Sherbrooke, ainsi que Marcel Desrosiers et Jessy Tremblay de l’IAF pour leur aide irremplaçable au microscope confocal. Un grand merci aux étudiants du campus avec qui j’ai partagé de bons moments, dans le bus en se rendant à l’IAF le matin, au détour d’un couloir, ou bien tout simplement autour d’un café. Finalement, je tiens à remercier les membres de ma famille dont le soutien a été sans faille depuis le début dans mes études universitaires. 111 TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ REMERCIEMENTS III TABLE DES MATIÈRES IV TABLE DES ILLUSTRATIONS VIII LISTE DES ABRÉVIATIONS X CHAPITRE 1: INTRODUCTION I 1. Généralités sur les virus de plantes 2 2. Les Potyvirus 6 2.1 Généralités et taxonomie 6 2.2 Structure génomique 8 2.3 Interaction protéines-protéines 13 3. Remodelage cellulaire par les phytovirus 16 3.1 Morphologie générale d’une cellule végétale 16 3.2 Réplication des virus de polarité positive chez les plantes 17 3.3 Les usines virales 21 a) Usines associées aux peroxisomes et aux mitochondries 22 b) Usines associées aux chloroplastes 22 c) Usines dérivées du réticulum endoplasmique 23 d) Protéines virales impliquées dans la biogenèse des usines virales 25 3.4 Cibles cellulaires 27 3.5 Impact sur le métabolisme de la cellule végétale 29 3.6 Mouvement intracellulaire des virus 29 3.7 Modification des PD 31 3.8 Couplage entre la réplication et mouvement du virus 34 3.9 Modèle de réplication et de transport viral 35 4. Problématique, hypothèses et objectifs de travail 37 CHAPITRE 2: PUBLICATIONS 39 Publication n°1 40 Contribution 41 Résumé 41 iv Summary .42 Introduction .43 Materials and Methods 45 Plasmid constructions 45 Antibodies 45 Protein expression in plants 46 Drug treatments 46 Protoplast isolation and immunofluorescence labeling 46 In vivo RNA labeling 47 Immunoblot analysis 47 Confocal microscopy 48 Resuits 48 Movement of replication complex vesicles 48 Vesicle alignment with microfilaments 51 TuMV infection is inhibited by LatB treatment 53 Vesicles derive from single genome 54 Localization of host and viral proteins within virus replication complexes 54 Discussion 56 Acknowledgements 59 References 60 Figures legends 65 Figures 68 Publication n°2 75 Contribution 76 Résumé 76 Summary 77 Introduction 77 Materials and Methods 80 Fluorescent proteins and molecular clones 80 Protein expression in plants 81 Confocal microscopy 81 Electron microscopy 82 Resu Its 82 ER, Golgi bodies, COPII coatamers, and chloroplasts are amalgamated in a perinuclear globular structure during TuMV infection 82 TuMV infection inhibits protein secretion at the ER-Golgi interface 84 The globular structure is not an isolated subcellular compartment 85 The globular structure is functionally linked (o motile peripheral 6K2 vesicles 87 Brefeldin A does not abrogate the formation of the perinuclear globular structure 87 Discussion 89 Acknowledgements 92 References 92 Figures legends 97 Figures 101 Publication n°3 109 Contribution 110 Résumé 110 V Summary .111 Introduction .111 . 113 Resuits 6K2-induced vesicles use transvacuolar strands to reach the plasma membrane and dock at plasmodesmata 113 TuMV infection leads to an increase of PD size exclusion limit 114 2-tagged vesicles move intercellularly 115 TuMV-induced 6K The viral RNA-dependent RNA polymerase is found within cortical motile 6K2 vesicles 116 Membranous viral complexes associated with 6K2 are found in xylem vessels 116 Discussion 117 Materials