- 1 - To who belives in the dreams … - 2 - INDEX INDEX ……………………………………………...………………………...…………….… 3 SOMMARIO ……………………………………………………….………...…...….……… 9 1 - INTRODUCTION ……………………………………………………..….……….…… 13 1.1 - PHYTOPLASMAS …………………………………………….…………………..…. 14 1.1.1 - Introduction ………………………………………………………………….……... 14 1.1.2 - Morphology and structure ………………………………………………..………... 15 1.1.3 - Symptoms in phytoplasma infected plants …………..………………………….… 16 1.1.4 - Transmission and spread of phytoplasmal diseases ……………..……………..… 17 1.1.5 - Detection, identification, and classification of phytoplasmas ………………..…... 17 1.1.5.1 - Serological and DNA-DNA Hybridization Assays ………………….......………… 17 1.1.5.2 - Polymerase Chain Reaction ……………………………………..….……………… 18 1.1.5.3 - RFLP analysis ……………………………………………………..….…………..... 19 1.1.6 - Taxonomy and Phylogenesis ……………………………………………..….….…. 19 1.1.6.1 - Phytoplasma taxonomy ………………………………………………………..……. 19 1.1.6.2 - Phylogenetic position of phytoplasmas …………………………………………….. 22 1.1.7 - Phytoplasma genome …………………..…………………………………….…….. 24 1.1.7.1 - Base composition of genome …………………………………………..……….…. 24 1.1.7.2 - Genes ………………………………………………………….……………………. 25 1.1.8 - Ecology of phytoplasmas …………………………………..………………………. 26 1.1.8.1 - Distribution of Phytoplasmas ………………………………..………………….…. 26 1.1.8.2 - Host specificity of phytoplasmas ……………………………………………….….. 28 1.2 - APPLE PROLIFERATION …………………………………………….……….…… 28 1.2.1 - The phytoplasma …………………………………………..……………………….. 28 1.2.2 - Strain ……………………………………………………..…………………...…….. 29 1.2.3 - Symptoms ……………………………………………………………….....…….….. 31 1.2.4 - Transmission ………………………………………..………………………..….….. 35 - 3 - 1.2.5 - Diffusion and situation of Ca. Phytoplasma mali in Trentino …………..……..... 36 1.3 - PSYLLIDS ………………………………………………………...………..………… 36 1.3.1 - Evolution …………………………………………………………..…………...…… 37 1.3.2 - Reproduction and ecology ………………………………………..……………..…. 37 1.3.3 - Psyllid damage …………………………………………………..………….…….… 39 1.3.4 - Psyllids vector of Ca. Phytoplasma mali ……………………..………………..….. 39 1.3.4.1 - Cacopsylla melanoneura Förster ……………………………………..…………… 39 1.3.4.2 - Cacopsylla picta Förster ………………………………………………..…………. 42 1.4 - APHIDS ……………………………………………………..………..……….………. 44 1.4.1 - Anatomy ……………………………………………………………....….….……… 44 1.4.2 - Diet and feeding ecology ………………………………………..……………..…… 45 1.4.3 - Reproduction ……..…………………………………………………..…………….. 46 1.4.4 - Evolution ………..……………………………………………………..……….…… 48 1.4.5 - Aphids as Pests ..…………………………………………………….……………… 48 1.4.6 - Main aphids analysed .…………………….…………………….…………………. 48 1.4.6.1 - Green apple aphid (Aphis pomi de Geer) …………………………………...……... 49 1.4.6.1.1 - Description ………………………………………………………..…...… 49 1.4.6.1.2 - Biology ………………………………………………………………..…. 49 1.4.6.1.3 - Life Cycle ……………………………………………………….....…….. 49 1.4.6.1.4 - Damage ……………………………………………………..…….……… 50 1.4.6.2 - Rosy apple aphid (Dysaphis plantaginea Passerini) …………………………...….. 50 1.4.6.2.1 - Description ………………………………………………….......…….….. 50 1.4.6.2.2 - Biology ………………………………………………………….…..….… 50 1.4.6.2.3 - Life Cycle …………………………………………………..………....…. 51 1.4.6.2.4 - Damage …………………………………………………………………… 51 1.4.6.3 - Woolly aphid (Eriosoma lanigerum Hausmann) ……………………………….….. 52 1.4.6.3.1 - Description ………………………………………………...……………… 52 1.4.6.3.2 - Biology ……………………………………………………………………. 52 1.4.6.3.3 - Life Cycle ………………………………………………..………...…….. 52 1.4.6.3.4 - Damage …………………………………………………..…………...….. 52 1.5 - QUANTITATIVE PCR ………………………………………………..………..….… 53 - 4 - 1.5.1 - What is q-PCR? .......................................................................................................... 53 1.5.2 - How q-PCR works ………………………………..…………………….……..……. 54 1.5.3 - Hallmarks of an optimized q-PCR assay ………………..………………..………. 55 1.5.4 - Chemistry selection ………………………………………..…………………...…… 58 1.5.4.1 - DNA-Binding Dyes (SYBR Green I) …………………………………..……….…. 58 1.5.4.2 - Fluorescent primer- and probe-based chemistries …………………………..……… 60 1.5.4.2.1 - TaqMan Assays ……………………………………...………..…………. 60 1.6 - MODEL REGIONS ……………………………………..…………………………… 61 1.7 - AIMS OF THE WORK …………………………………………………..………….. 65 2 - MATERIALS AND METHODS ………………………..……………………..……… 67 2.1 - PLANT SAMPLE COLLECTION ………………………..……………...………… 67 2.1.1 - First collection ……………………………………………..…………………..…… 68 2.1.2 - Second collection ……………………………………………..…………….………. 69 2.1.3 - Third collection ……………………………………………..……………..……….. 71 2.2 - PSYLLID SAMPLE COLLECTION ………………………..………………...….… 71 2.2.1 - First collection ………………………………………………………………...……. 72 2.2.2 - Second collection ……………………………………………………………..…….. 72 2.2.3 - Third collection …………………………………………………………….....……. 73 2.3 - APHID SAMPLE COLLECTION ……………………………………..…………… 73 2.3.1 - 2003 collection …………………………………………………………...……..…… 74 2.3.2 - 2004 collection ………………………………………………………………....……. 74 2.3.3 - 2005 collection ………………………………………………………………….….…. 74 2.3.4 - 2006 collection …………………………………………………….…………..….…. 75 2.4 - SAMPLE LYOPHILIZING ………………………………………………………….. 75 2.5 - DISRUPTION OF SAMPLES ………………………..…………………….……….. 76 - 5 - 2.6 - DNA EXTRACTION …………………………………….………………………..…. 77 2.7 - PCR AMPLIFICATION ………………………………………….……………....…. 77 2.8 - PCR-RFLP ANALYSIS …………………………………………………….….….…. 78 2.9 - CAPILLARY ELECTROPHORESIS ( SNaPshotTM) …………………….……..… 80 2.10 - QUANTITATIVE PCR ………………………………………………….……...….. 82 2.11 - CLONING OF PHYTOPLASMA FRAGMENT DNA ………………..……….… 85 2.11.1 - TOPO® Cloning reaction …………………………………………………....….… 85 2.11.2 - Transformation by chemically competent cells ………..………………….…….. 86 2.11.2.1 - Preparation of LB (Luria-Bertani) medium ……………………..…….……….…. 86 2.11.2.2 - Preparation of LB agar plates ……………………..………………….……...…… 86 2.12 - ISOLATION OF PLASMID DNA …………………………………………..….…. 88 2.13 - SEQUENCING ………………………………………………………………......….. 89 3 - RESULTS AND DISCUSSIONS ……………………………………….……………… 90 3A - POPULATION STRUCTURE OF AP IN TRENTINO ………………...…………. 90 3A.1 - PHYTOPLASMA DETECTION …………………………..…………………..….. 90 3A.1.1 - Plant samples …………………………..…………………………….…………… 91 3A.1.1.1 - First collection ………………………………..…………………….……………. 91 3A.1.1.2 - Second collection …………………………………….……..………...………….. 92 3A.1.1.3 - Third collection …………………………………………………..…..………….. 93 3A.1.2 - Psyllid samples ……………………………………………………..………….….. 94 3A.1.2.1 - First collection …………………………………..………….………………..…... 94 3A.1.2.2 - Second collection ……………………………………………..………...…….….. 95 3A.1.2.3 - Third collection ……………………………..……………………………...……. 96 - 6 - 3A.2 - STRAIN ANALYSIS …………………………………………………..…………... 96 3A.2.1 - Plant samples …………………………………………………………...………… 98 3A.2.1.1 - First collection …………………………………………………………….…...… 98 3A.2.1.2 - Second collection ………………………………………………..………………. 106 3A.2.1.2.1 - Areas …………………………………………………..…..………..…. 106 3A.2.1.2.2 - Micro-areas ……………………………………………..…….….…… 107 3A.2.1.3 - Third collection …………………………………………………….….……..… 116 3A.2.2 - Psyllid samples ………………………………………………………..……..…… 119 3A.2.2.1 - First collection ………………………………………………..…..………….…. 119 3A.2.2.2 - Second collection ……………………………………………………..…..…….. 121 3A.2.2.3 - Third collection ………………………………………………………………… 122 3A.3 - QUANTITATIVE ANALYSIS …………………………………….…….…….…. 123 3A.3.1 - Plant samples ………………………………………………………….....……… 123 3A.3.1.1 - Strains ……………………………………………………………….…..……… 127 3A.3.1.2 - Cultivars …………………………………………………………………..……. 128 3A.3.1.3 - Rootstocks ………………………………………………………………………. 129 3A.3.1.4 - Age ………………………………………………………………..……….……. 130 3A.3.2 - Psyllid samples ……………………………………………………..……….…… 132 3B - AP TRANSMISSION CAPACITY OF APHIDS IN TRENTINO ……….…...….. 136 3B.1 - PHYTOPLASMA DETECTION ……………………………………………….... 136 3B.1.1 - 2003 collection …………………………………………………....…………..….. 136 3B.1.2 - 2004 collection ……………………………………………....……..…..….……… 136 3B.1.3 - 2005 collection ………………………………………………..…..……………… 137 3B.1.4 - 2006 collection ……………………………………………………..…..………… 137 3B.2 - QUANTITATIVE ANALYSIS …………………………...……………………….. 138 3B.2.1 - 2003 collection ………………………………………………….………………… 138 3B.2.1.1 - Areas ……………………………………………………...………………….….. 141 3B.2.1.2 - Species ……………………………………………………………..……….…… 141 3B.2.2 - 2004 collection …………………………………………..………………….….…. 142 3B.2.2.1 - Areas ………………………………………………….…………………….…… 143 - 7 - 3B.2.2.2 - Species …………………………………………………………………….....…. 143 3B.2.3 - 2005 collection ……………………………………………………………...……. 144 3B.2.3.1 - Areas ………………………………………………………………..…….…….. 146 3B.2.3.2 - Species ……………………………………………………..….…………….…... 146 3B.2.4 - 2006 collection ……………………………………………………………………. 147 4 - CONCLUSIONS ……..…………………………………………………….……..…… 150 4.1 - POPULATION STRUCTURE OF AP IN TRENTINO ……………………..……. 150 4.2 - AP TRANSMISSION CAPACITY OF APHIDS IN TRENTINO ……..…...…… 153 REFERENCES …………………………………………………………………..…..…… 156 - 8 - SOMMARIO Apple Proliferation (AP) è una grave malattia del melo diffusa in tutti i paesi frutticoli d’Europa causata dal fitoplasma Candidatus Phytoplasma mali. Questo organismo è un procariote della classe Mollicutes che mostra pleomorfismo, cioè variazioni di forma, per la mancanza di parete cellulare. A differenza degli altri mollicuti non è coltivabile in vitro. Le piante infette mostrano una vegetazione apicale affastellata, simile a scope a causa dall’anticipato germogliamento delle gemme laterali e successiva emissione di getti. Per questo la malattia è nota anche come “Scopazzi del melo”. La colorazione anticipata in tarda estate e la produzione di frutti piccoli e di valore organolettico nullo sono altri sintomi primari della malattia. Si ha quindi la perdita del raccolto con notevoli ripercussioni economiche. La presenza dell’infezione