Kode/Nama : 362 / Bidang Kesehatan Umum Rumpun Ilmu Lain yang belum tercantum Tema : Kesehatan, penyakit tropis, gizi dan obat-obatan PROPOSAL PENELITIAN STRATEGIS NASIONAL LAMA WAKTU KOLONISASI LACTOBACILLUS SP F213 PADA SALURAN PENCERNAAN DIANALISIS MENGGUNAKAN SIDIK DNA MIKROBIOMIK FESES DALAM PENGEMBANGAN PROBIOTIK UNTUK MENURUNKAN KOLESTEROL Ketua/Anggota Tim Ir. I Nengah Sujaya, M.Agr.Sc., Ph.D. NIDN: 0012316651 (Ketua) Drs. Yan Ramona, M.App.Sc, Ph.D. NIDN: 0022106401 (Anggota) Ir. K. Ayu Nocianitri, M.Agr.Sc. NIDN: 0008036801 (Anggota) UNIVERSITAS UDAYANA April 2014 - 1 - - 2 - RINGKASAN Konsumsi pangan mengandung lemak hewani dan kolesterol tinggi merupakan penyebab terjadinya penyakit jantung koroner (PJK). Data WHO menunjukkan bahwa pada tahun 2002 diperkirakan PJK menyebabkan 7 juta kematian di seluruh dunia dan pada tahun 2020 diperkirakan akan naik menjadi 11 juta jiwa. Di Indonesia diperkirakan 150 orang dalam 10.000 penduduk meninggal akibat PJK (Anon. 2008). Oleh karena itu upaya-upaya pemanfaatan biodivesitas Indonesia guna menurunkan PJK sangat diperlukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen Indonesia dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian kandungan kolesterol darah. Serangkaian penelitian in vitro dan in vivo (hewan coba) untuk mengembangkan probiotik Lactobacillus sp F213 yang meliputi aspek ketahanan pada saluran pencernaan, keamanan dan toksisitas, serta efek fungsional untuk menurunkan kolesterol telah dilakukan (Nocianitri dan Permana, 2008; Yustiantara, 2009; Artati, 2009, Nursini et al., 2010). Penelitian pada subjek manusia menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 dapat betahan pada saluran pencernaan, menurunkan 6,29% kolesterol, menurunkan 35,87%, TNF alfa, meningkatkan kenyamanan buang air besar dan tidak menstimulasi bakteri patogen (Sujaya et al., 2012, 2013). Walaupan Lactobacillus sp F213 terdeteksi dalam DNA mikrobiomik feces tetapi hal ini tidak dapat dipakai untuk menentukan aktivitas dan kolonisasi Lactobacillus sp F213 di dalam saluran pencernaan. Mengingat probiotik harus mampu bertahan dan berkembang biak pada saluran pencerrnaan guna memunculkan efek fungsional menyehatkan, maka tujuan khusus dari penelitian ini adalah untuk menganalisis lama waktu kolonisasi serta populasi Lactobacillus sp F213 dan dalam saluran pencernaan. Kendala yang dihadapi dalam melakukan analisis bakteri saluran pencernaan adalah spesies yang sangat beragam pada saluran pencernaan (300-400 species dominan) sehingga menyulitkan bila menggunakan teknik konvensional. Untuk menelusiri lama waktu kolonisasi serta jumlah Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan diusulkan dilakukan melalui dua tahapan yaitu: tahap 1 (tahun 1), merancang pendeteksi dengan target gen spesifik pada genom Lactobacillus sp F213. Spesifisitas primer/pelacak ini akan dicek reaksi silangnya (cross hybridization) terhadap beberapa strain yang sejenis. Untuk mengukur jumlah DNA yang berkorelasi dengan jumal sel setiap satuan berat DNA dilakukan dengan menggunakan Real Time PCR (RT-PCR). Selanjutnya, tahap 2 adalah aplikasi sistem deteksi spesifik untuk menelusiri lama kolonisasi dan jumlah Lactobacillus sp F213 pada feses subjek manusia. Subjek manusia sehat (n=30) diberikan Lactobacillus sp F213 sebanyak 108 sel/hari selama 4 minggu diikuti 2 minggu washed out. Sampel darah dan feces diambil sebelum, sesudah, dan 2 minggu setelah pemberian Lactobacillus sp F213. Lama kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213 dianalisis dengan RT-PCR sementara pengukuran profile lipid (total kolesterol, HDL, LDL, TG) pada darah dilakukan secara enzimatis. Dari hasil penelitian ini akan diperoleh data potensi Lactobacillus sp F213 sebagai probiotik fungsional untuk mencegah PJK melalui penuruan kolesterol darah. - 3 - BAB I. PENDAHULUAN Latar Belakang Modernisasi memberikan andil pada pergeseran pola makan masyarakat dari makanan tradisional berserat tinggi ke makanan gaya barat dengan lemak tinggi dan rendah serat. Konsumsi makanan dengan kandungan asam lemak jenuh (asal hewani) yang tinggi merupakan salah satu faktor resiko penyebab penyakit jantung koroner (PJK), pembunuh nomor satu di dunia, sebagai akibat penimbunan kolesterol pada pembuluh darah. Data WHO menunjukkan bahwa pada tahun 2002 diperkirakan PJK menyebabkan 7 juta kematian di seluruh dunia dan pada tahun 2020 diperkirakan akan naik menjadi 11 juta jiwa. Dan di Indonesia diperkirakan 150 orang dalam 10.000 penduduk meninggal akibat PJK (Anon, 2008). Pembentukan asam empedu merupakan mekanisme utama untuk megekskresikan kolesterol dari tubuh. Garam empedu (tauro-kolat dan gliko-kokolat) merupakan produk antara metabolisme kolesterol. Hidrolisis garam empedu oleh mikroorganisme saluran pencernaan yang mempunyai enzim bile salt hidrolase (BSH) menghasilkan taurin atau glisin serta asam empedu bebas. Asam empedu bebas ini berisfat tidak larut dan tidak direabsorbsi tubuh sehingga akan diekskresikan melalui feses (Kurdi et al., 2000). Semakin banyak asam empedu yang dibuang melalui siklus enterohepatik semakin banyak pula kolesterol darah digunakan untuk sintesis asam empedu baru (Brisson, 1981). Penurunan kolesterol darah dilaporan dapat dilakukan dengan mengkonsumsi susu terfermentasi oleh Lactobacillus (Agerbaek et al., 1995; Bertolami et al, 1999; Larsen et al, 2000; Schaafsma et al., 1998), walaupun secara mekanistik belum diketahui secara pasti bagaiaman Lactobacillus berperan dalam proses ini di dalam tubuh (De Rose dan Katan, 2000). Dari serangkaian hasil penelitian in vitro, diduga bahwa mekanisme penurunan kolesterol oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium meliputi efek fisiologis dari asam lemak rantai pendek (short chain fatty acids) dalam saluran pencernaan (Kurdi et al, 2000; 2003), asimilasi kolesterol oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium (Klaver et al., 1993; Gilliland et a.l, 1985), pengikatan 2 kolesterol pada permukaan sel Lactobacillus dan Bifidobacterium (Lin dan Cheh, 2000) serta dekonjugasi enzimatis garam empedu oleh Lactobacillus dan Bifidobacterium (Tahri et al., 1985; Tahri et al., 1996). Mengingat bahaya dari kandungan kolesterol yang terlalu tinggi pada darah sebagai penyebab utama penyempitan pembuluh darah dan PJK sementara di terapi medis yang dilakukan dengan mempergunakan obat-obatan yang sangat mahal, maka dipandang perlu dilakukan penelitian untuk menggali potensi mikrobial alam Indonesia guna menanggulangi masalah kolesterol dan PJK. Probiotik merupakan salah satu pilihan yang menjanjikan. Serangkaian penelitian untuk mengembangkan probiotik telah dilakukan secara in vitro dan in vivo. Penelitian in vitro dari aspek ketahan pada kondisi saluran pencernaan meliputi ketahan Lactobacillus sp F213 pH rendah, enzim pencernaan, dan asam empedu. Dari aspek keamanan meliputi bahwa Lactobacillus sp F213 tidak melakukan transformasi asam empedu primer (tidak memicu kolon kanker), tidak menyebabkan kerusakan pada saluran pencernaan, sifat tidak beracun (tidak me-lisis sel darah meras) serta Lactobacillus sp F213 tidak akut pada larva udang. Aspek fungsional meliputi kemampuan Lactobacillus sp F213 melekat pada epitel saluran pencernaan mencit untuk mencegah diare dan stimulasi sistem imun serta Lactobacillus sp F213 mampu menghidrolsisi garam empedu sebagai potensi dalam menurunkan kolesterol darah. Potensi in vitro telah teruji dalam penelitian in vivo seperti kemampuan berkompetisi untuk melekat apda saluaran pencernaan mencit yang diinfeksi dengan E coli O157, sehingga Lactobacillus sp F213 berpotensi untuk mencegah diare (Sujaya et al. 2010); Lactobacillus sp F213 mampu bertahan dalam saluran pencernaan tikus putih (Nocianitri et al., 2010) dan menurunkan 35% dari total kolesterol tikus (Nursini et al., 2010). Penelitian pada subjek manusia menujukkan bahwa Lactobacillus sp F213 terdeteksi pada sidik DNA mikrobiomik feces, serta dapat menurunkan 6,29% kolesterol dan dapat menurunkan TNF alfa sebanyak 35,87% (dari 9,2 pg menjadi 0,59 pg, sebelum dan setelah pemberian Lactobacillus sp F213). Disamping itu pemberian Lactobacillus sp F213 dapat 3 meningkatkan kenyamanan buang air besar (mencegah konstipasi) (Sujaya et al., 2012, 2013). Rumusan Masalah Setelah melakukan serangkaian penelitian untuk mengembangankan Lactobacillus sp F213 sebagai probiotik dengan potensi dapat menurunkan kolesterol, serta berdasarkan persyaratan WHO bahwa probiotik adalah mikroorganisme hidup yang dikonsusmsi dan dapat memberikan manfaat kesehatan bagi host, maka probiotik harus mampu bertahan dan berkembang biak pada saluran pencernaan. Oleh karena itu, rumusan masalah dalam penelitian ini adalah : Apakah Lactobacillus sp F213 dapat tumbuh pada saluran pencernaan dan berapakah populasi Lactobacillus sp F213 pada feses? Berapa lamakah Lactobacillus sp F213 dapat berada pada saluran pencernaan manusia sehat ? Bagaimankan efek pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap profile lipid darah subjek yang diberikan Lactobacillus sp F213 ? Tujuan Penelitian Tujuan Umum : Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan probiotik endogen Indonesia dalam pencegahan PJK melalui penurunan dan atau pengendalian kandungan kolesterol darah. Tujuan khusus penelitian : Untuk mengembangkan metode deteksi spesifik yang dapat diperguankan untuk diagnostik Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan ? Untuk mengetahui lama waktu kolonisasi dan populasi Lactobacillus sp F213 pada saluran pencernaan (feses)? Untuk mengetahui efek fungsional pemberian Lactobacillus sp F213 terhadap profile lipid darah. 4 Manfaat khusus: Manfaat dari penelitian ini adalah,