Biochemische Charakterisierung und bioinformatische Sequenzanalyse plasmamembrangebundener Peroxidasen aus Maiswurzeln (Zea mays L.) Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades im Department Biologie der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der Universität Hamburg vorgelegt von Angela Mika aus Bargteheide Hamburg 2005 INHALTSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis IV 1. Einleitung 1 1.1 Peroxidasen . 1 1.1.1 Klassifizierung und Lokalisierung . 1 1.1.2 Struktur . 3 1.1.3 Reaktionsmechanismen und Substratspezifität . 5 1.1.4 Peroxiredoxine . 7 1.1.5 Funktionen . 8 1.1.5.1 Allgemeine Funktionen . 8 1.1.5.2 Stressinduzierte Funktionen . 11 1.1.6 Peroxidaseaktivitäten an der pflanzlichen Plasmamembran . 17 1.2 Zielsetzung . 19 2. Material und Methoden 21 2.1 Material . 21 2.2 Anzucht des Pflanzenmaterials . 21 2.3 Isolierung von Plasmamembranen . 21 2.4 Proteinbestimmung . 22 2.5 Waschen von Plasmamembranen. 23 2.6 Solubilisierung von Membranproteinen . 23 2.7 Konzentrieren von Proteinlösungen . 23 2.8 Chromatographie . 24 2.8.1 Entsalzung und Pufferaustausch . 24 2.8.2 High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) . 24 2.8.2.1 Ionenaustauschchromatographie . 24 2.8.2.2 Gelfiltration . 25 2.8.2.3 Affinitätschromatographie . 26 2.9 Analytische Gelelektrophorese . 26 2.9.1 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) . 26 2.9.2 Isoelektrische Fokussierung . 28 2.10 Western Blotting . 29 2.11 Enzymaktivitäten . 30 II 2.12 Massenspektrometrie . 31 2.12.1 Elektrospray-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) . 31 2.12.2 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization with Time of Flight Detector (MALDI-TOF) . 31 2.12.3 Computergestützte Sequenzanalyse . 32 3. Ergebnisse und Diskussion 34 3.1 Prosthetische Gruppe . 34 3.2 Charakterisierung der H2O2-abbauenden Enzymaktivitäten . 34 3.2.1 Einfluss von Effektoren auf die Peroxidaseaktivitäten . 34 3.2.2 Substratspezifität der Peroxidaseaktivitäten . 36 3.3 Charakterisierung der AOS-produzierenden Enzymaktivitäten . 38 3.3.1 pH-Optima der Peroxidase-Oxidaseaktivitäten . 38 3.3.2 Effektorsensitivitäten und Substratspezifität der Peroxidase-Oxidase- aktivitäten . 39 3.3.3 Untersuchungen zur Existenz eines putativen gp91phox-Homologs (ZmRboh1) in der PM von Zea mays L.. 44 3.4 Isoelektrische Punkte . 49 3.5 Identifizierung einer vierten pmPOX . 50 3.6 Relative molekulare Massen . 51 3.7 Glykosylierung . 53 3.8 Identifizierung der Sequenzen und bioinformatische Sequenzanalyse . 55 3.8.1 Massenspektrometrische Peptidanalyse . 55 3.8.2 In silico Cloning und bioinformatische Sequenzanalyse von pmPOX1, pmPOX2b und pmPOX3 . 57 3.8.2.1 Identifizierung und Analyse der Nukleotidsequenzen . 57 3.8.2.2 Partielle bioinformatische Analyse der Genstruktur . 67 3.8.2.3 Analyse der Aminosäuresequenzen . 68 3.8.2.3.1 Länge der Aminosäuresequenzen . 68 3.8.2.3.2 Theoretische isoelektrische Punkte, molekulare Massen und putative Glykosylierungsstellen . 68 3.8.2.3.3 Targeting . 71 3.8.2.3.4 Topologie . 74 3.8.2.3.5 Disulfidbrücken . 78 3.8.2.3.6 Aktives Zentrum und konservierte Bereiche . 78 3.8.2.3.7 Strukturelles Calcium . 78 3.8.2.3.8 Dreidimensionale Struktur . 79 III 3.8.2.3.9 Homologien . 81 3.8.3 In silico Cloning und bioinformatische Sequenzanalyse von pmPOX2a . 85 3.8.4 In silico Northern-Blot-Analyse . 90 3.9 Funktionen der pmPOX . 92 3.9.1 Eine gewebe- und/oder entwicklungsspezifische Expression . 92 3.9.2 Eine Lokalisierung der aktiven Zentren auf verschiedenen Seiten der Plasmamembran bei gleicher Funktionalität . 92 3.9.3 Eine Grob- und Feinregulierung der gleichen Substratspezifität durch verschiedene Isoenzyme . 92 3.9.4 Die Enzyme erfüllen unterschiedliche Funktionen und/oder werden in Abhängigkeit verschiedener endogener oder exogener Reize reguliert . 93 4. Ausblick 98 5. Zusammenfassung 101 6. Literaturverzeichnis 104 7. Anhang 133 8. Danksagung 134 9. Lebenslauf 135 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS A Adenin ABTS 2,2’-Azino-bis-(3-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonsäure) AOS Active oxygen species (Aktive Sauerstoffverbindungen) APX Ascorbatperoxidase ARE Antioxidant-responsive elements (cis-Regulatorisches Element, welches die Regulation eines Gens durch oxidativen Stress vermittelt) AtPrx Arabidopsis thaliana peroxidase AU Absorbance unit (Einheit für die Extinktion) bp Basenpaar BSA Bovine serum albumin (Rinderserumalbumin) C Cytosin cDNA Complementary desoxyribonucleic acid (von einer RNA-Matrize in vitro synthetisierte Desoxyribonukleinsäure) CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat Con A Concanavalin A DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DPI Diphenylenjodonium EDTA Ethylendiamin-N,N,N`,N`-tetraessigsäure ER Endoplasmatisches Retikulum ESI-MS/MS Electrospray Ionisation Hybrid Tandem Mass Spectrometry (Elektrospray-Massenspektrometrie) EST Expressed sequence tag (teilsequenzierte cDNA in Datenbanken) FAD Flavinadenindinukleotid FMN Flavinmononukleotid G Guanin GDPD Glycerophosphodiester-Phosphodiesterase gp91phox gp, glycosylated protein; 91, ungefähres MW des Proteins in kDa; phox, phagocyte oxidase (Coreprotein des NADPH- Oxidasekomplexes aus humanen Phagozyten) GPI Glycosylphosphatidylinositol GPX Glutathionperoxidase GSS Genome survey sequence (teilsequenzierte genomische DNA in Datenbanken) V HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure HPLC High Pressure Liquid Chromatography (Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie) HRP Horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) IEF Isoelektrische Fokussierung IEPexp experimentell ermittelter Isoelektrischer Punkt IEPtheor theoretischer Isoelektrischer Punkt kDa kiloDalton Konz. Konzentration MALDI-TOF Matrix-assisted laser-desorption ionization, spezielle Form der Massenspektroskopie mit time-of-flight-(Flugzeit-)Analysator MES 2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure MWexp experimentell ermittelte molekulare Masse MWtheor theoretische molekulare Masse mRNA Messenger ribonucleic acid (Boten-RNA) NADH Nikotinsäuramid-adenin-dinukleotid, reduzierte Form NADPH Nikotinsäuramid-adenin-dinukleotid-phosphat, reduzierte Form n.d. nicht detektierbar n.m. not measured (nicht ermittelt) Nox2 NADPH-Oxidase 2; gp91phox (aus Homo sapiens) OsPrx Oryza sativa peroxidase (Datenbankeintrag von PeroxiBase) PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS Phosphate buffered saline (standardisierter Phosphatpuffer) pCMB p-Chloromercurybenzoate (4-Hydroxyquecksilberbenzoesäure) PM Plasmamembran(en) pmPOX plasmamembrangebundene Peroxidase bzw. Peroxidaseaktivität PO-ox-I,-II,-III Redoxzustände von Peroxidasen Rboh Respiratory burst oxidase homolog (Pflanzliches Homolog zu humanen NADPH-Oxidasen) RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat SNP Single nucleotide polymorphism (Einzelnukleotidpolymorphismen) SOD Superoxiddismutase SPB Soybean seed coat peroxidase (Peroxidase aus Soja) SV Säulenvolumen T Thymin VI TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin TMB Tetramethylbenzidin TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Tritonâ X-100 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol UTR Untranslated region (Nicht-translatierte Region) UV Ultraviolettes Licht XTT 2,3-bis(2-Methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid ZmGDPD1 Zea mays Glycerophosphodiester-Phosphodiesterase 1 ZmPox1 Zea mays peroxidase 1 (Trivialname) ZmPrx Zea mays peroxidase (Datenbankeintrag von PeroxiBase) ZmRboh1 Zea mays respiratory burst oxidase homolog 1 3D Dreidimensional 1. EINLEITUNG Peroxidasen (EC 1.11.1.7) sind Enzyme, die in Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Vertebraten weit verbreitet sind. Sie enthalten in der Regel Ferriprotoporphyrin IX (Häm) als prosthetische Gruppe und oxidieren die verschiedensten Substrate unter Reduktion von Wasserstoffperoxid (Welinder et al., 1996). Da ihre Katalysen häufig von auffälligen Farbreaktionen begleitet werden, wurden bereits 1855 die ersten Peroxidaseaktivitäten beschrieben (Saunders et al., 1964). Die Bezeichnung „Peroxidase“ wurde bereits 1898 durch Linossier vorgeschlagen (Gaspar et al., 1982). Inzwischen gehören diese Enzyme zu den am intensivsten und umfangreichsten untersuchten überhaupt (Acosta et al., 2002; Shigeoka et al., 2002; Hiraga et al., 2001; Obinger et al., 1996a, Penel et al., 1992). Aufgrund der Fülle an Literatur beschränkt sich die folgende Einführung in den meisten Punkten auf pflanzliche Peroxidasen. 1.1 Peroxidasen 1.1.1 Klassifizierung und Lokalisierung In höheren Pflanzen existiert eine sehr hohe Anzahl von Isoformen dieser Enzyme, d. h. Peroxidasen, welche die gleichen Reaktionen katalysieren können, sich aber in ihrer Struktur unterscheiden. So wurden in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH, Ackerschmal- wand) allein 73 Gene identifiziert, welche für Peroxidasen kodieren (EC 1.11.1.7; Tognolli et al., 2002; Welinder et al., 2002). Zusätzlich werden jedoch durch posttranskriptionale und posttranslationale Modifikationen noch sehr viel mehr Isoenzyme gebildet (Tognolli et al., 2002; Jackson et al., 1996; Welinder et al., 1996). Neben dem Klassifizierungssystem der Internationalen Biochemischen Vereinigung, die einige Peroxidasen wie Ascorbat- (EC 1.11.1.11) oder NADH-Peroxidasen (EC 1.11.1.1) aufgrund ihrer Charakteristika aus der oben genannten Klasse ausgliedert, wurde ein übersichtlicheres und eindeutigeres System entwickelt: Nach Welinder et al. (1992) wurde die Superfamilie der bakteriellen, pflanzlichen und aus Pilzen stammenden Peroxidasen (Superfamilie 1) auf der Basis von Sequenzvergleichen in drei Klassen eingeteilt. Der Klasse I werden die intrazellulären Peroxidasen zugeordnet, welche nicht dem sekretorischen Stoffwechselweg angehören.