Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Diversidade de fungos do solo da Mata Atlântica Vívian Gonçalves Carvalho Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola Piracicaba 2012 2 Vívian Gonçalves Carvalho Bacharel e Licenciada em Ciências Biológicas Diversidade de fungos do solo da Mata Atlântica versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011 Orientador: Prof. Dr. MARCIO RODRIGUES LAMBAIS Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola Piracicaba 2012 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - ESALQ/USP Carvalho, Vívian Gonçalves Diversidade de fungos do solo da Mata Atlântica / Vívian Gonçalves Carvalho. - - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2012. 203 p. : il. Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2012. 1. Biodiversidade 2. Fungos - Mata Atlântica 3. Filogenia 4. Matéria orgânica do solo 5. Microbiologia do solo 6. Reação em cadeia por polimerase 7. Redes neurais I. Título CDD 631.46 C331d “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor” 3 Dedico este trabalho aos meus pais, Célia e Afrânio , por me ajudarem a realizar meus sonhos, pelo apoio incessante aos meus estudos, pelo amor que sempre deram. Aos meus irmãos, Ana Cláudia, Vinícius e Afrânio, pelo apoio, amor e por entenderem minha ausência. Aos meus sobrinhos, Isabella, Felipe e Samira, minhas alegrias. À vó Ana (in memorian), pelas orações, carinho, e força sempre. Vocês foram essenciais para que eu chegasse até aqui. Amo vocês! 4 5 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Marcio Rodrigues Lambais, pela orientação, incentivo e confiança ao longo desses quatro anos. Ao programa de Microbiologia Agrícola e à Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ-USP) pela oportunidade de crescimento profissional e por fornecer estrutura para realização do trabalho. À FAPESP pela bolsa concedida por três anos de curso e auxílio financeiro para desenvolvimento do projeto; ao CNPq, pela bolsa concedida durante nove meses e à CAPES, pela bolsa concedida nos meses iniciais do curso. Ao Prof. Dr. Ari Jumpponem (Kansas State University- USA) pelo acolhimento no laboratório durante o doutorado sanduíche, pelos ensinamentos, pela amizade. Ao colega Shawn Brown, pela co-orientação durante o doutorado sanduíche e pela amizade. À amiga Cintya Souza, pela colaboração essencial no desenvolvimento do projeto, por realizar o método de cultivo e a identificação dos fungos. Ao Prof. Dr. Ludwig Pfenning, pela orientação no método de lavagem de solo, pela participação no exame de qualificação, pela amizade e apoio. Ao Prof. Dr. Fernando Andreote, pelas sugestões durante o exame de qualificação e pela ajuda nas análises multivariadas. À Prof.a Dra. Lara Durães Sette, pela participação no exame de qualificação e pelas valiosas sugestões. À Prof.a Dra. Siu Mui Tsai, pela oportunidade do estágio em ensino. Aos funcionários Denise Mescolotti, Luis Fernando, Wladimir Rosignolo e Luiz Silva pela valiosa ajuda nos experimentos em laboratório; ao funcionário Dorival pela ajuda nas coletas de campo e à bibliotecária Silvia Zinsly, pela ajuda na formatação. Aos colegas Armando Cavalcante e Josiane Lopes pela ajuda na execução do trabalho. Aos grandes amigos do Laboratório de Microbiologia Molecular: Alice Cassetari, Ana Lo Buono, Joze Correa, Kelly Justin, Lucas Lopes, Rafael Valadares, Sandra Montenegro, Sílvia Barrera, Winston Franz Ruiz, Wladimir Rosignolo e em especial a Eder dos Santos, Adriano Lucheta, Elisa Matos, Gisele Nunes, Giselle 6 Fracetto, Rafael Armas, Maryeimy Varon e Winston Ruiz pelas valiosas ajudas nas análises, coletas e sugestões na escrita da tese. Aos meus pais Célia e Afrânio, aos irmãos Ana Cláudia, Vinícius, e Afrânio, meus cunhados Robson Aguiar e Marta Carvalho e meus sobrinhos, por todo o amor, atenção, por terem sempre me apoiado e por se fazerem presentes em todos os momentos da minha vida. Aos amigos da pós-graduação e de Piracicaba: Geraldo Junior, Yve Corrêa, Lígia Hansen, Carlos Ribeiro, Paulo Roger, Pablo Soares, Luciano França, Arlete Barneze, Daniel Lammel, Felipe Cury, Lucas Azevedo, Simone Braga, Emiliana Romagnoli, André Nakatani, Rafael Vasconcelos, Bruna Oliveira, André Mazzetto, Luiz Fernando, Mário Aguiar, Myllene Pinheiro, Nara Gustinelli, Marcelo Vaz. Em especial a Ricardo Rodrigues que foi muito importante durante a reta final, incentivando-me sempre a prosseguir. Às minhas amigas-irmãs Elisa Matos, Layanne Souza e Fabiana Mingossi, pela amizade, carinho, conselhos, convívio, por serem minha família em Piracicaba. Sem vocês tudo seria mais difícil. Aos amigos Sílvio Henrique, Maura Inforzato e Valdir Inforzato, Beatriz Rizzardo e Carlos Rizzardo, por terem se tornado uma família para mim durante parte dessa jornada. Aos eternos amigos: Ana Paula Carvalho, Caroline Pereira, Daniélle Fernandes e Marcos Fernandes, pela amizade, força e carinho de sempre. Aos amigos que me acolheram em Manhattan: Lindsay Ratllif, Faiza Khalil, Sebastian Wendel, Hugo Remaury, Lorena Montano, Manoelita Warkentien, Patrícia Ramirez, Marina Warkentien, Gregory Bedros, Nicolas Silva, Davi Gasparini, Deisy Corredor, Juan Molina, Jaime Tobon, Martha Caldas, Lior Kamara, Gabriela Rattin, Celine Aperce e Victoria Elgina. A todos os meus queridos familiares, amigos do mestrado e da graduação, por se fazerem presente mesmo à distância. A todos que não foram mencionados, mas que contribuíram de alguma maneira para a realização deste trabalho. Muito obrigada! 7 EPÍGRAFE “Nada é suficientemente bom. Então vamos fazer o que é certo, dedicar o melhor de nossos esforços para atingir o inatingível, desenvolver ao máximo os dons que Deus nos concedeu, e nunca parar de aprender.” Ludwig Van Beethoven 8 9 SUMÁRIO RESUMO ...................................................................................................................... 11 ABSTRACT ................................................................................................................... 13 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 15 2 DESENVOLVIMENTO ............................................................................................... 17 2.1 Revisão Bibliográfica ............................................................................................... 17 2.1.1 A Mata Atlântica ................................................................................................... 17 2.1.2 Filogenia e taxonomia de fungos.......................................................................... 19 2.1.3 Fungos do solo ..................................................................................................... 23 2.1.4 Métodos de estudo da diversidade fúngica do solo.............................................. 25 2.1.4.1 Métodos tradicionais ......................................................................................... 25 2.1.4.2 Métodos moleculares ........................................................................................ 27 2.1.5 Ecologia de fungos em solos florestais ................................................................ 31 2.2 Material e métodos .................................................................................................. 35 2.2.1 Áreas de estudo ................................................................................................... 35 2.2.2 Amostragem ......................................................................................................... 39 2.2.3 Análises químicas ................................................................................................ 40 2.2.4 Fracionamento da Matéria Orgânica do Solo ....................................................... 40 2.2.5 Carbono e nitrogênio da biomassa microbiana do solo ........................................ 41 2.2.5.1 Carbono da biomassa microbiana do solo ........................................................ 42 2.2.5.2 Nitrogênio da biomassa microbiana do solo ...................................................... 42 2.2.6 Processamento das amostras pelo método dependente de cultivo ..................... 43 2.2.6.1 Lavagem de solo e cultivo de partículas ........................................................... 43 2.2.6.2 Identificação e preservação dos isolados .......................................................... 44 2.2.6.3 Índices de Diversidade de espécies de fungos ................................................. 45 2.2.7 Processamento das amostras através de métodos moleculares ......................... 45 2.2.7.1 Extração de DNA ambiental .............................................................................. 45 2.2.7.2 Amplificação da região ITS do rRNA através de PCR ....................................... 46 2.2.7.3 Separação dos amplicons das regiões ITS por DGGE ..................................... 46 2.2.7.4 Pirosequenciamento .......................................................................................... 47 2.2.7.4.1 Amplificação por PCR para sequenciamento ................................................. 47 2.2.7.4.2 Bioinformática e designação das unidades taxonômicas operacionais (UTOs) .......................................................................................................................... 49 2.2.7.4.3